MX2010011058A

MX2010011058A - Extracto de cafe.

Info

Publication number: MX2010011058A
Application number: MX2010011058A
Authority: MX
Inventors: Christophe Cavin; Rachid Bel-Rhlid; Karin Kraehenbuehl; Thomas Wolfgang Raab; Nicolas Page
Original assignee: Nestec Sa
Priority date: 2008-04-30
Filing date: 2009-03-12
Publication date: 2010-11-01
Also published as: EP2282643A1; KR20110004400A; BRPI0911496A2; PE20100130A1; AR071426A1; CN102014650A; UY31799A; AU2009242333A1; TW200944131A; CO6280593A2; CL2009001031A1; JP2011520429A; WO2009132888A1; US20110045106A1; ZA201008550B; RU2010148738A; CA2723050A1

Abstract

La presente invención se refiere a un método de producción de un extracto de café con propiedades antioxidantes y anti-inflamatorias y usos del extracto de la invención. El extracto de café comprende ácido cafeico y/o ácido ferúlico y puede ser producido por la hidrólisis de los ácidos clorogénicos presente en el extracto de café, por ejemplo, con un microorganismo o una enzima. El extracto de café de la invención puede, por ejemplo, ser utilizado como ingrediente de un producto alimenticio o bebida.

Description

EXTRACTO DE CAFÉ CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un método de producción de un extracto de café mejorado con propiedades antioxidantes y anti-inflamatorias, los métodos de producción del extracto, y el uso del extracto de la invención ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El café y los componentes activos del café como la cafeína y diterpenos (por ejemplo, cafestol, kahweol) han demostrado inducir las enzimas de desintoxicación (por ejemplo, glutatión-S-transferasas GST) en roedores y en humanos (Cavin C. et al, 1998. The coffee-specific diterpenes cafestol and kahweol protect against aflatoxin B1 -induced genotoxicity trough a dual mechanism. Carcinogenesis 19, 1369-1375; Cavin, C. et al, 2003. Coffee diterpenes prevent benzo[a]pyrene genotoxicity in rat and human culture systems. Biochemical Biophysical Research Communication 306, 488-495; Huber, W. et al. 2002a. Enhancement of the chemoprotective enzymes glucuronyl transferase and glutathione transferase in specific organs of the rat by the coffee components kahweol and cafestol. Archive of Toxicology 76, 209-217). La actividad aumentada de GST por café ha sido demostrada además en humanos tras el consumo de 800 mi de café, durante 5 días (Steinkellner, H. et al. 2005. Coffee consumption induces GSTP in plasma and protects lymphocytes against (+/-)-anti-benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide induced DNA-damage: results of controlled human intervention triáis. Mut. Res. 591 264-275). Además, Richelle et al., J. Agrie. Food Chem. 49 3438-42, (2001 ) mostró que el tiempo de demora de oxidación de las LDL in vitro está notablemente aumentada por café bajo condiciones normales de ración. Una capacidad antioxidante total aumentada se observó también en el plasma humano in vivo después de 200 mi de consumo de café (Natella et al., J. Agrie. Food Chem. 50, 621 1 -16, 2002).

Este tipo de actividad antioxidante se conoce para proteger contra el "estrés oxidativo" mediante la reducción de los radicales libres dañinos que pueden estar implicados, por ejemplo en el cáncer, las enfermedades del corazón, trastornos cerebrales degenerativos y el envejecimiento.

Para aumentar los beneficios para la salud de los alimentos y bebidas hay un deseo de producir productos con una mayor actividad antioxidante, así como otras actividades biológicas beneficiosas, y encontrar las fuentes naturales de antioxidantes y otros compuestos con actividades biológicas beneficiosas, que pueden ser utilizados para mejorar las propiedades de los productos alimenticios y bebidas, así como por ejemplo cosméticos y productos médicos. Las propiedades antioxidantes pueden ser intrínsecas a la naturaleza de la molécula por sí misma o puede estar mediada por la inducción de las defensas naturales contra el estrés oxidativo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los inventores han encontrado ahora un método para producir un extracto de café en donde la cantidad de ácido cafeico es de al menos 1 miligramo por gramo de materia seca y/o la cantidad de ácido ferúlico es al menos 0,5 miligramos por gramo de materia seca; y que tal extracto de café tiene propiedades antioxidantes y antiinflamatorias mejoradas, en comparación con los extractos de café convencionales. En consecuencia, la invención se refiere a un método de producción de un extracto de café, que comprende las siguientes etapas: a) la extracción de los granos de café con agua para producir un extracto de café; y b) el tratamiento de extracto de café para hidrolizar los ácidos clorogénicos para generar ácidos fenólicos. En modalidades adicionales la invención se refiere a los usos del extracto de café de la invención; un método de producción de un producto alimenticio o bebida; y el producto alimenticio o bebida resultante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Geles de Western Blot muestran la expresión de las subunidades de la proteína GST (GSTA4, GSTP1 ) y Hemo-Oxigenasa-1 (HO-1 ) en heptocitos primarios de rata tratadas con 200 y 400 pg/ml de NESCAFE RED CUP® (extracto de los granos de café tostado) no tratadas para hidrolizar ácidos clorogénicos, y 200 y 400 pg/ml de NESCAFE PROTECT® tratados con Lactobacillus johnsonii, así como muestras control no tratadas con extracto de café. Para más detalles, véase el ejemplo 1 .

Figura 2: Western Blot muestra la inducción de la expresión de enzimas desintoxicantes (GSTP1 ; NQ01 ) en el hígado de ratas macho alimentadas en su dieta durante 2 semanas con 5% de NESCAFE RED CUP® (extracto de los granos de café tostado) no tratados para hidrolizar ácidos clorogénicos (RN), NESCAFE PROTECT® (un co-extracto de granos de café verde y tostado) no tratados para hidrolizar ácidos clorogénicos (P); y NESCAFE PROTECT® tratados con Lactobacillus johnsonii (LA1 -P). Para más detalles, véase el ejemplo 1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención está relacionada con un extracto de café con propiedades antioxidantes y anti-inflamatorias mejoradas.

En una modalidad de la invención el extracto de café comprende al menos 1 miligramo de ácido cafeico por gramo de materia seca, tal como un mínimo de 2, al menos 5, al menos 10, o al menos 25 miligramos de ácido cafeico por gramo de materia seca. En otra modalidad el extracto de café comprende al menos 0,5 miligramos de ácido ferúlico por gramo de materia seca, tal como al menos 1 , al menos 2, al menos 5 o al menos 10 miligramos de ácido ferúlico por gramo de materia seca. En una modalidad adicional la relación entre la cantidad de ácidos cafeoil quinico y diésteres a la cantidad de ácido cafeico es menos a 100 (peso/peso), tal como menos de 50, menos que 10 o menos que 1. En una modalidad aún adicional la relación entre la cantidad de ácidos feruloil quínicos y diésteres a la cantidad de ácido ferúlico es menos que 30 (peso/peso), tal como menos que 10, menos que 5 o menos que 1 .

El extracto de café de la invención puede ser un extracto de granos de café verde y/o granos de café tostado. Numerosos métodos pára la producción de extractos de café son conocidos en la técnica.

La invención se refiere además a un método de producción de un extracto de café, que comprende las siguientes etapas: a) la extracción de los granos de café con agua para producir un extracto de café; y b) el tratamiento del extracto de café para hidrolizar los ácidos clorogénicos a ácidos fenólicos.

Los granos de café para ser extraídos pueden ser enteros o molidos. En una modalidad de la invención los granos de café verde son co-extraídos con granos de café tostado, es decir, granos de café verde y tostado se extraen simultáneamente en el mismo sistema de extracción para obtener una mezcla de extracto. Los componentes del aroma más volátiles pueden ser separados de los granos antes de la extracción, por ejemplo, si el extracto se utilizará para la producción de café soluble puro. Los métodos de separación de componentes de aroma volátiles son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir del documento PE 1078576.

La extracción de los granos de café con agua y/o vapor es muy conocida en la técnica, por ejemplo, a partir del documento PE 0916267. El extracto puede someterse a una etapa de concentración y puede ser secado antes del tratamiento para hidrolizar los ácidos clorogénicos, por ejemplo, mediante secado por aspersión o liofilización. Si el extracto ha sido secado puede ser resuspendido en caso necesario para efectuar el tratamiento de hidrolizar los ácidos clorogénicos.

Los ácidos clorogénicos son una familia de ésteres formados entre ácidos trans-cinámicos y ácido quinico. Los ácidos clorogénicos están naturalmente presentes en el café, principalmente como mono-y di-ésteres de ácido quinico y grupos fenolicos (por ejemplo, cafeico, ferúlico, cumárico, metoxicinámico) acoplados a diferentes posiciones. Por el método de la invención los ácidos clorogénicos (ésteres de ácido quinico) en el extracto de café pueden ser hidrolizados para generar ácidos fenolicos, por ejemplo, los ácidos clorogénicos 3-, 4-, o ácido 5-cafeoil quinico y diésteres, y 3-, 4-, o ácido 5-feruloil quinico y diésteres pueden ser hidrolizados para generar ácido cafeico y ácido ferúlico, respectivamente. En una modalidad preferida del método los ácidos cafeoil quinico y/o diésteres son hidrolizados para generar ácido cafeico, y/o ácido feruloil quinico y/o diésteres son hidrolizados para generar ácido ferúlico. En una modalidad de la invención el tratamiento para hidrolizar ácidos clorogénicos para generar ácidos fenolicos se realiza a fin de lograr una cantidad de ácido cafeico en el extracto tratado de al menos 1 miligramo de ácido cafeico por gramo de materia seca, tal como al menos 2, al menos 5 o al menos 10 miligramos de ácido cafeico por gramo de materia seca. En otra modalidad de la invención el tratamiento para hidrolizar ácidos clorogénicos para generar ácidos fenólicos se realiza a fin de lograr una cantidad de ácido ferúlico en el extracto de café tratado de al menos 0,5 miligramos de ácido ferúlico por gramo de materia seca, tal como al menos 1 , al menos 2 o al menos 5 miligramo de ácido ferúlico por gramo de materia seca. En una modalidad adicional al menos el 20%, tal como al menos un 30%, al menos el 50%, o al menos el 75% de ácidos cafeoil quinico y diésteres, y/o ácidos feruloil quinico y diésteres presentes en el extracto de café se hidrolizan por tratamiento para hidrolizar ácidos clorogénicos para generar ácido fenólicos.

El tratamiento del extracto para hidrolizar los ácidos clorogénicos a ácidos fenólicos se puede realizar durante o después de la extracción. El extracto puede ser separado de los granos de café extraídos antes, durante o después del tratamiento para hidrolizar ácidos clorogénicos. En una modalidad el extracto se mantiene separado de los granos de café extraídos después del tratamiento para hidrolizar los ácidos clorogénicos, es decir, el extracto no es puesto en contacto con los granos de café extraídos de nuevo después del tratamiento para hidrolizar ácidos clorogénicos. La separación del extracto desde los granos de café extraídos se puede realizar por cualquier método apropiado, por ejemplo, filtración o centrifugación. La separación puede realizarse en la medida que sea práctica y económicamente viable y necesaria en vista del uso del extracto. La separación puede no ser 100% completa, por ejemplo, una pequeña parte del material no disuelto de los granos todavía pueden estar presentes con el extracto después de la separación.

La hidrólisis del ácido clorogénico puede ser realizado por cualquier método apropiado. En una modalidad de la invención la hidrólisis se realiza por la incubación o fermentación del extracto de café con un microorganismo capaz de hidrolizar ácido clorogénico en el extracto de café. Microorganismos capaces de hidrolizar el ácido clorogénico pueden ser identificados por ejemplo como se describen en ejemplos de esta solicitud. Microorganismos apropiados pueden ser seleccionados a partir de levaduras, hongos o bacterias. Microorganismos apropiados pueden ser por ejemplo un Aspergillus; tal como por ejemplo Aspergillus oryzae, un Lactobacillus, tal como por ejemplo L johnsonii (CNCM 1-1225); un Bifidobacterium, tal como por ejemplo B. lactis (CNCM I-3446), o una levadura tal como por ejemplo Saccharomyces cerevisiae. La incubación o fermentación puede ser realizada inoculando el extracto de café con un microorganismo capaz de hidrolizar los ácidos clorogénicos en condiciones adecuadas para el crecimiento del microorganismo específico durante el tiempo necesario para alcanzar la hidrólisis requerida de los ácidos clorogénicos. Las condiciones específicas pueden ser fácilmente determinadas por la persona experta, por ejemplo, con referencia a los ejemplos que figuran en este documento. En otra modalidad de la invención la hidrólisis de los ácidos clorogénicos se realiza mediante el uso de microorganismos no replicativos, por ejemplo, células lisadas. Incubando el extracto de café con células lisadas en condiciones adecuadas, las enzimas presentes en el lisado de células pueden hidrolizar ácidos clorogénicos para generar ácidos fenólicos. Las células adecuadas pueden ser por ejemplo células de los microorganismos antes mencionados. Se conocen en la técnica métodos adecuados para la producción de lisado de células.

La cantidad de microorganismo y las condiciones de la fermentación deben ser las adecuadas para alcanzar la hidrólisis deseada de los ácidos clorogénicos, y pueden ser determinadas por la persona experta a través de métodos habituales, por ejemplo, utilizando los métodos divulgados en los ejemplos de la presente.

En otra modalidad la hidrólisis del ácido clorogénico se realiza mediante la utilización de una enzima capaz de hidrolizar los ácidos clorogénicos. Una enzima adecuada es, por ejemplo, una esterasa por ejemplo una clorogenato esterasa derivada de Aspergillus japonicus. (Comercialmente disponible desde Kikkoman, Japón), Tannasa de Aspergillus oryzae (EC 3.1.1 .20) (comercialmente disponible desde Kikkoman, Japón); Palatasa 20000L (EC 3.1 .1.3) (comercialmente disponible desde Novozymes A/S, Dinamarca). La hidrólisis enzimática puede ser realizada por los métodos convencionales de reacciones enzimáticas, por ejemplo, por disolución o suspensión de la enzima en el extracto de café en las condiciones adecuadas para la actividad de la enzima requerida. La enzima puede ser inactivada, por ejemplo, por calentamiento, después que la hidrólisis se ha llevado a cabo. La enzima también puede ser inmovilizada, por ejemplo, sobre una membrana o sobre un soporte inerte, y el extracto de café a ser tratado puede ser distribuido sobre la membrana o a través del soporte hasta que se ha logrado el grado deseado de hidrólisis.

La cantidad de enzima y las condiciones para ser utilizada deberían ser adecuadas para alcanzar la hidrólisis deseada de los ácidos clorogénicos, y puede ser determinada por la persona experta por métodos habituales, por ejemplo, utilizando los métodos divulgados en los ejemplos de este documento para determinar la hidrólisis de los ácidos clorogénicos.

La invención también se refiere a un método de producción de un producto alimenticio o bebida en donde un extracto de café de la invención se utiliza como ingrediente de dicho producto alimenticio o bebida. El extracto es usado separadamente dé los granos de café extraídos, es decir, el material no disuelto de los granos es sustancialmente removido por separación como se describe en este documento y no se utiliza en la producción de los productos alimenticios o bebidas. El producto alimenticio o bebida puede ser cualquier producto alimenticio o bebida conocidos en la técnica. En una modalidad preferida el producto alimenticio o bebida es un producto de café, por ejemplo, un producto de café soluble o un producto de café listo para beber. Un producto de café soluble puede ser producido por concentración y secado del extracto de la invención. Antes de su secado, el extracto puede ser mezclado con extracto de café que no ha sido tratado para hidrolizar los ácidos clorogénicos, por ejemplo, extracto de granos de café tostado, granos de café verde, o ambos. Los métodos para producir un producto de café soluble desde el extracto de café son bien conocidos en la técnica. Cuando el extracto se utiliza para la producción de un producto de café, los granos que se extraen pueden haber sido objeto de separación para remover los aromas volátiles antes de la extracción, por ejemplo, tal como se describe en EP-A-1078576. Los aromas volátiles pueden ser añadidos al extracto después del tratamiento para hidrolizar los ácidos clorogénicos, por ejemplo, después del secado para producir un producto de café soluble aromatizado. Un producto de café soluble producido da partir de un extracto de café de la invención pueden ser vendidos como tales, o por ejemplo, ser mezclado con un sustituto de crema y/o edulcorante y vendido para preparar una bebida de café compuesta por sustituto de crema y/o edulcorante, por ejemplo, café capuchino o café con leche.

Cuando un extracto de café de acuerdo con la invención se utiliza como ingrediente de un producto alimenticio o bebida puede ser añadido en cualquier etapa en el proceso de producción de dicho producto alimenticio o bebida para lograr el efecto deseado. El extracto se puede añadir en cualquier cantidad adecuada para lograr el efecto deseado, por ejemplo, efecto antioxidante. Un producto alimenticio o bebida producido por el método de la invención puede ser, por ejemplo, una bebida a base de café, bebida a base de té, un refresco, un producto lácteo, un producto de confitería, o un complemento alimenticio.

La presente invención se refiere también a la utilización de un extracto de café de la invención como un antioxidante, por ejemplo, como un ingrediente en un producto, por ejemplo, un producto alimenticio o bebida, en donde las propiedades antioxidantes son deseables, por ejemplo, para prevenir la oxidación de los componentes del producto durante el almacenamiento. Los antioxidantes son comúnmente utilizados en una serie de productos y el extracto de café de la invención puede ser utilizado en una forma similar a los antioxidantes convencionales.

El extracto de café de la invención también puede utilizarse para mejorar la capacidad antioxidante in vivo en un humano o animal, por ejemplo, por la inducción de enzimas desintoxicantes como glutatión-S-transferasa (GST) y por el aumento de la ruta de expresión génica mediada por Nrf2. Se ha reportado que los genes asociados a la incrementada actividad Nrf2 aumentan la desintoxicación y estimulan la defensa endógena contra el estrés oxidativo. Estos efectos pueden por ejemplo ser logrados por la administración oral de extracto de café o por la aplicación tópica a la piel de un humano o un animal.

El extracto de café de la invención puede ser utilizado para disminuir la inflamación, por ejemplo, inhibiendo el aumento en el nivel de prostaglandina E2 por agentes pro-inflamatorios (por ejemplo, ¡nterleucina 1 b, lipopolisacáridos (LPS)).

Muchos problemas y trastornos de salud están relacionados con el estrés oxidativo y la inflamación. El extracto de café de la invención puede ser utilizado para tratar o prevenir este tipo de problemas o trastornos. Los problemas y trastornos relevantes son, por ejemplo, trastornos de la piel, por ejemplo, daño por luz causado por la radiación UV, la dermatitis atópica, eczema, descamación, picazón, síntomas de alergia; trastornos cerebrales, la inflamación; la obesidad; y el cáncer, por ejemplo, cáncer de la piel y el cáncer de pulmón.

El extracto de café de la invención puede ser usado además como un agente anti-diabético, por ejemplo, mediante la reducción de los niveles de glucosa en la sangre, y/o aumentando los niveles en la sangre de leptina, insulina y/o c-péptido; como un agente de la remodelación ósea, por ejemplo, mediante el aumento de la densidad mineral ósea, por ejemplo, mediante el aumento de los niveles séricos de estrógenos y/o de progesterona y/o actividad de la fosfatasa alcalina; como agentes anti-metástasis, por ejemplo, con efecto anti-angiogénico.

El extracto de café de acuerdo con la invención puede ser utilizado para la preparación de una formulación para tratar o prevenir los trastornos de la piel, diabetes, alergias, trastornos cerebrales, inflamación, obesidad y/o cáncer. La formulación puede estar en cualquier forma adecuada, por ejemplo, para la administración oral o la administración tópica en la piel, por ejemplo, en forma de un producto alimenticio o bebida, un suplemento nutricional, una tableta, una loción o un producto cosmético. En una modalidad preferida la formulación es un medicamento.

Ejemplos Ejemplo 1 Tratamiento de NESCAFE PROTECT® con células frescas de Lactobacillus iohnsonii Células de L. johnsonii (CNCM 1-1225) fueron cultivadas (7,0 E08 ufc/ml) y centrifugadas (5000 g, 10 min), las pellas fueron suspendidas de nuevo en regulador de fosfato (50 mM, pH 7,0) a una concentración de 0,61 g/ml. Se agregaron 30 mg/ml de NESCAFE PROTECT® (un co-extracto seco de granos de café verde y tostado) y la mezcla se incubó a 37°C. Las muestras fueron retiradas en diferentes tiempos de reacción, centrifugadas (3000 g, 5 min) y filtradas a través de filtros para jeringas con tamaño de poro de 0,45 µ?t? (Millipore SLHA 025 BS) y analizadas por HPLC.

Se efectuó una reacción de control en paralelo bajo las mismas condiciones de reacción, pero sin bacterias.

Tratamiento de NESCAFE PROTECT® con extractos de Lactobacillus iohnsonii (células lisadas) Células de L. johnsonii (CNCM 1-1225) fueron cultivadas (7,0 E08 ufc/ml) y centrifugadas (5000 g, 10 min), las pellas fueron suspendidas de nuevo en regulador de fosfato (50 mM, pH 7,0) a una concentración de 0,61 g/ml. Las células fueron lisadas después utilizando el método de cuentas de vidrio. 600 µ? de la preparación de células fueron colocados en tubos con tapa de rosca y 600 µ? de cuentas, de vidrio fueron agregados a 0°C. Los tubos fueron puestos en un Mini-Beadbeater por 1 min de intensa agitación, enfriados en hielo, y colocados un minuto más en el Mini-Beadbeater. El extracto crudo de células se añadió a 900 µ? de una solución de NESCAFE PROTECT® (30 mg/ml, tampón fosfato pH 7,0) y la mezcla se incubó a 37°C. Las muestras fueron retiradas en diferentes tiempos de reacción, centrifugadas (3000 g, 5 min) y filtradas a través de filtros para jeringas con tamaño de poro de 0,45 µ?? (Millipore SLHA 025 BS) y analizadas por medio de HPLC.

Tratamiento de NESCAFE PROTECT® con preparación secada por aspersión de Lactobacillus iohnsonii 30 mg de NESCAFE PROTECT® fueron disueltos en 1 mi de regulador de fosfato (50 mM, pH 7,0) o en 1 mi de agua. A esta solución, se agregaron 10 mg de una preparación secada por aspersión de Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225) (3,3 E9 ufc/g). La mezcla fue incubada después a 37°C y las muestras fueron retiradas en diferentes tiempos de reacción. Después de la centrifugación (3000 g, 5 min) y filtración (filtros para jeringas con tamaño de poro de 0,45 µ?? Millipore SLHA 025 BS) las muestras fueron analizadas por medio de HPLC.

Tratamiento de extracto de café verde con una preparación secada por aspersión de Lactobacillus iohnsonii (CNCM 1-1225) Se disolvieron 30 mg de extracto seco de café verde en 1 mi de regulador de fosfato (50 mM, pH 7,0) o en 1 mi de agua. A esta solución, se añadieron 10 mg de una preparación secada por aspersión de Lactobacillus johnsonii (3,3 E9 ufc/g). La mezcla fue luego incubada a 37°C y las muestras fueron retiradas en diferentes tiempos de reacción. Después de la centrifugación (3000 g, 5 min) y filtración (filtros para jeringas con tamaño de poro de 0,45 µ??, Millipore SLHA 025 BS) las muestras fueron analizadas por medio de HPLC.

Tratamiento de NESCAFE® con una preparación concentrada de Lactobacillus iohnsonii (CNCM 1-1225) 400 mg de NESCAFE SPECIAL FILTRE® (un extracto seco de granos de café tostado) fueron disueltos en 1 mi de agua hirviendo y la solución fue enfriada a 37°C a temperatura ambiente. A 250 µ? de esta solución de café, se añadieron distintas cantidades de preparación concentrada de Lactobacillus johnsonii (50 µ?, 100 µ?, 350 µ?, 750 µ?) y el volumen fue ajustado a 1 mi con agua. Las mezclas fueron incubadas después a 37°C durante 2 h y 4 h. Después de la centrifugación (3000 g, 5 min) y filtración, las muestras se analizaron por medio de HPLC.

Análisis HPLC Muestras de café fueron diluidas al 1 % w/w y analizadas por RP-HPLC en una columna (Macherey-Nagel) CC 250/4 Nucleosil 100-5-C18. El sistema eluyente fue agua illipore, 0,1% TFA y CH3CN a un caudal de 1 ml/min. El método permitió la determinación simultánea de ácidos cafeoil quínicos (CQA), ácidos feruloil quínicos (FQA), ácidos di-cafeoil quínicos (diCQA), lactonas de ácido feruloil quínico, ácido cafeico (CC) y ácido ferúlico (FA) (absorbencia a 325 nm) utilizando curvas de calibración estándar externas. Los resultados se expresaron en relación a la referencia en tiempo 0 (tO) o a la referencia al mismo tiempo sin bacterias.

Ensayo de la luciferasa del elemento de respuesta antioxidante (ARE) El pGL-8xARE que contiene ocho copias de ARE presentes en la glutatión-S-transferasa A2 (GSTA2) de rata junto con el plasmido pcDNA3.1 que contiene el marcador de selección para neomicina fueron transfectados establemente en células humanas CF7 (Wang et al., Cáncer Res. 66, 10983-10994, 2006). ARE (elemento de respuesta antioxidante) es el sitio de unión del factor de transcripción Nrf2 que regula los genes implicados en la desintoxicación y defensa endógena contra el estrés oxidativo. El plasmido pGL-8xARE contiene un gen luciferasa corriente abajo de los ocho sitios de unión Nrf2 que permite el monitoreo de la actividad Nrf2.

Para el tratamiento con café, las células AREc32 se sembraron en placas de microtitulación de 96 pozos en medio de cultivo DMEM. Después del tratamiento durante 24 horas con los diferentes cafés, se determinó la actividad de luciferasa de luciérnaga.

Expresión de proteína Se obtuvieron hepatocitos primarios mediante la perfusión del hígado de ratas Sprague-Dawley con una solución de colagenasa (Sidhu et al., Arch. Biochem. Biophys. 301 , 103-1 13,1993). Se encontró que la viabilidad celular, estimada por medio del ensayo de exclusión del Azul de Tripán, oscila entre el 90-95%. Las células fueron sembradas a una densidad de 1 ,5 x 105 células/cm2 en placas plásticas de cultivo celular de 60 mm en 3 mi de medio William complementado con L-glutamina 2mM, HEPES 10 mM pH 7.4, ITS+, 15000U de Penicilina/Estreptomicina, dexametasona 100 nM y 5% de suero bovino fetal (Hi-clone). Se permitió que los hepatocitos se fijaran durante dos horas y luego se lavaron con EBSS para eliminar los desechos y las células no fijadas. Se agregó medio fresco libre de suero que contenía 25 nM de dexametasona y se aplicó un revestimiento de matrigel (233 g/ml). Se añadió matrigel fresco a los cultivos cada dos días seguido por un cambio de medio. Para estudiar el efecto del café en enzimas desintoxicantes y en la expresión de proteína antioxidante, se añadió el material de ensayo al medio de cultivo 24 horas después de la siembra de células por un período de 48 horas antes de la extracción de proteínas y el análisis por Western blot (Cavin et al., Food Chem Tox. 46, 1239-48, 2008).

Ensayo de formación de prostaglandina E2 Células de colon humano HT-29 fueron tratadas con los distintos cafés por 15h seguida por una co-incubación de 6 horas junto con un agente pro-inflamatorio TNF-a (10 ng/ml). Análisis de la producción de PGE2 en células HT-29 se determinó mediante un inmuno ensayo enzimático competitivo (EIA) (Cavin et al., BBRC 327, 742-49, 2005).

Resultados Hidrólisis de ácidos cloroqénicos para generar ácidos fenólicos Experimento 1 : Tratamiento de NESCAFE PROTECT® con células frescas de L johnsonü con diferentes tiempos de reacción y cantidad de preparación celular. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Resultados del experimento 1 Tiempo (h) 6 24 6 24 6 24 Preparación 750 750 350 350 100 100 celular (µ?_) Concentración en % relativo a referencia no tratada en t=0 CQA 3 0 14 3 39 15 FQA 8 0 17 4 42 17 diCQA 0 0 0 0 23 2 CA 13215 13238 14282 15981 101 1 1 13661 FA 7776 8845 7234 8861 4594 6691 Balance de masa (mmol/g materia seca) Acidos 0.20 0.21 0.18 0.20 0.13 0.17 clorogénicos consumidos CA y FA formados 0.20 0.20 0.21 0.24 0.14 0.20 Experimento 2: Tratamiento de N ESCAFE PROTECT® con extracto de L. johnsonii (células lisadas) con diferentes tiempos de reacción y cantidad de preparación celular. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Resultados del experimento 2.

Tiempo (h) 2 2 6 6 Preparación celular (µ?_) 350.0 100.0 350.0 100.0 Concentración en % relativo a referencia no tratada en t=0 CQA 10 32 6 14 FQA 15 36 1 1 18 diCQA 1 8 1 1 CA 13901 10729 16300 12581 FA 7771 5581 9720 6960 Experimento 3: Tratamiento de NESCAFE PROTECT® con preparación secada por aspersión de Lactobacillus johnsonii. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Resultados del experimento 3. CQA, FQA, CA y FA están dados como % relativo al control no tratado en t=0.

Tiempo (h) 2 6 24 CQA 73 67 32 FQA 82 60 34 CA 3598 6140 7879 FA 1 109 2183 3686 Experimento 4: Tratamiento de extracto de café verde con preparación secada por aspersión de Lactobacillus johnsonii. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Resultados del experimento 4. CQA, FQA, CA y FA están dados como % relativo al control no tratado en t=0.

Experimento 5: Tratamiento de NESCAFE PROTECT® con preparación concentrada de Lactobacillus johnsonii. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Resultados del experimento 5. CQA, FQA, CA y FA están dados como % relativo al control no tratado en t=0.

Cantid 50µ?_/1 ^ 00µU 350µ17 750µ? 50µ?_71 100µ?7 350µ?/ 750µ? ad de mL 1 mL 1 mL 1 mL mL 1 mL 1 mL 1 mL célula s Tiemp 2 2 2 2 4 4 4 4 0 (h) CQA 92 80 46 25 76 60 33 17 FQA 90 82 61 41 89 74 53 37 diCQA 86 68 23 6 75 56 15 6 CA 1737 2885 5752 7292 1763 2803 4491 5514 FA 1509 2468 5327 7586 786 1266 2408 3281 La tabla 6 muestra la concentración absoluta de un número de compuestos en dos muestras diferentes de extractos de granos de café verde que no han sido tratados para hidrolizar ácidos clorogénicos (muestras control).

Tabla 6. Composición de los extractos de café verde no tratados (muestras control). La concentración está dada en miligramos por gramo de materia seca.

A B Acido 3-cafeoil quínico 13,88 15,57 Ácido 4-cafeoil quínico 17,58 20,08 Ácido 5-cafeoil quínico 81 ,16 85,45 Suma de CQA 112,62 121,10 Ácido 3-feruloil quínico 0,00 0,00 Ácido 4-feruloil quínico 3,29 4,41 Ácido 5-feruloil quínico 17,70 19,77 Suma de FQA 20,99 24,18 CA 0,39 0,47 FA 0,25 0,23 Lactona del ácido 3-cafeoil quínico 0,00 0,00 Lactona del ácido 4-cafeoil 0,00 0,00 quínico Suma de Lactonas 0,00 0,00 Ácido 3,4-dicafeoil quínico 6,80 4,34 Ácido 3,5-dicafeoil quínico 5,53 8,35 Ácido 4,5-dicafeoil quínico 0,12 8,85 Suma de ácido dicafeoil quínico 12,45 21 ,55 Expresión de proteína En hepatocitos primarios de rata, NESCAFE RED CUP® (extracto de los granos de café tostado) a 200 pg/ml produjo después de 48 h de tratamiento ningún incremento en la expresión de proteínas de las subunidades GST (GSTA4, GSTP1 ) y Hemo-Oxigenasa-1 (HO-1 ) y débil inducciones de las expresiones de GSTP1 y HO-1 a 400 pg/ml mediante Western blot. En cambio, se observó una mayor inducción de las diferentes expresiones de proteínas con NESCAFE PROTECT® tratado con L johnsonii tanto a 200 µg/ml como a 400 pg/ml en GSTA4, GSTP1 y HO-1 ). Los resultados se muestran como geles de Western Blot en la fig. 1.

Los datos obtenidos en el hígado de ratas macho alimentadas en su dieta durante 2 semanas con el 5% de NESCAFE RED CUP® versus NESCAFE PROTECT® y NESCAFE PROTECT® tratados con L. johnsonii confirmaron los efectos observados en hepatocitos primarios de rata. La inducción más fuerte de la expresión de las enzimas desintoxicantes (GSTP1 ; NQ01 ) se encontró con el NESCAFE PROTECT® tratado con L. ¡ohnsonii en comparación al NESCAFE PROTECT® no tratado (GSTP1 ; NQ01 ) y NESCAFE RED CUP® no tratado (GSTP1 ; NQ01 ). Los resultados se muestran como geles de Western Blot en la fig. 2.

Ensayo de la luciferasa del elemento de respuesta antioxidante (ARE) Células humanas de cáncer de mama (AREc32) transfectadas establemente con varias copias del constructo reportero GSTA2-ARE de rata fue utilizado para demostrar la activación de la ruta de Nrf2-ARE por medio del café. Extracto de café verde no tratado para hidrolizar ácidos clorogénicos, y diferentes extractos de café verde tratados con L. johnsonii durante 24 horas produjo un aumento dependiente de dosis en la actividad del reportero Nrf2-luciferasa (véase la tabla 7).

Tabla 7. Inducción de la actividad Nrf2 por café (actividad luciferasa de luciérnaga, AU).

Ensayo de formación de prostaqlandina E2 El efecto antiinflamatorio potencial del extracto de café verde tratado con L. johnsonii se evaluó en células HT-29 de colon humano. Tras el tratamiento con un agente pro-inflamatorio TNF-a, el nivel de la prostaglandina E2 (PGE2) es inducido en las células del colon. En este estudio, las células fueron pre-tratadas durante 24 h con diferentes extractos de café (extracto de café verde no tratado para hidrolizar ácidos clorogénicos, y extracto de café verde diferente tratado con L johnsonii durante 24 h). Se añadió TNF-a (10 ng/ml) en las últimas 6 h del experimento. Los datos (véase la tabla 8) mostraron una clara disminución dependiente de la dosis por los cafés de la formación de PGE2 al compararla con células de control tratadas con TNF-a.

Tabla 8. Disminución de la formación de PGE2 como un resultado del tratamiento del extracto de café en comparación a células controles tratadas con TNF-a (UA).

Ejemplo 2 Muestras de café Extracto de café verde de granos verde Robusta 100% NESCAFE PROTECT®, un co-extracto seco de granos de café verde y tostado Enzimas y células Microorganismos Medio de cultivo Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225 MRS Bifidobacterium lactis BB12 (CNCM I-3446) MRS + cisteína Bifidobacterium longum BB536 (ATCC BAA-999) MRS + cisteína Clorogenato esterasa (24 U/g), derivada de Aspergillus japonicus (Kikkoman, Japón). Tannasa de Aspergillus oryzae (Kikkoman, Japón).

Preparación de células de bacterias Las cepas probdas fueron cultivadas (centrifugación a 5000 g durante 10 min) después de haber llegado bien a la fase estacionaria, lo que equivale a 16 horas de incubación en el medio de cultivo a 37°C en atmósfera anaeróbica sin agitación. Para una primera activación de las cepas, cultivos madre congelados fueron inoculados en medios frescos y cultivados durante la noche. Este pre-cultivo se utilizó para inocular al cultivo.

Tratamiento de los extractos de café con células de bacterias Después del cultivo y centrifugación de bacterias, las pellas fueron suspendidas de nuevo en regulador de fosfato (pH 7,0) a una concentración de 0,61 g/ml. A 200 µ? de esta preparación de células, se añadieron 800 µ? de una solución de café (3%) y la mezcla se incubó a 37°C durante 4 h, 16 h y 24 h.

Incubación de los extractos de café con Cloroqenato esterasa Una solución de clorogenato esterasa (25 mg) en 200 µ? de regulador de fosfato (pH 7,0) se añadió a 800 µ? de una solución de café (3%). La mezcla se incubó a 37°C durante 4 h, 16 h y 24 h. Después del tiempo de reacción, la actividad enzimática fue detenida por tratamiento térmico (3 min, 90°C) y la mezcla fue filtrada antes de su análisis.

Ensayo de luciferasa ARE Como en el ejemplo 1.

Resultados Se utilizaron células humanas de cáncer de mama (AREc32) transfectadas establemente con varias copias del constructo reportero GSTA2-ARE de rata para demostrar la activación de la ruta antioxidantes de Nrf2 por el café. Extracto de café verde no tratado para hidrolizar ácidos clorogénicos (no tratado), extracto de café verde tratado con Lactobacillus johnsonii (Lj) durante 24 h, extracto de café verde tratado con Bifidobacteríum ¡actis (Bl) durante 24 h, y extractos de café verde tratados con clorogenato esterasa (CE) durante 4 h, produjeron un aumento dependiente de dosis en la actividad reportero de Nrf2-luciferasa (tabla 9).

Tabla 9. Actividad reportero de Nrf2-luciferasa de extractos de café no tratados y tratados (AU).

Cafés Café verde no Café verde tratado Café verde tratado Café verde tratado tratado con Lj con Bl con CE mg/ml 0 0 0 0 0 100 0.3+/-0.1 0.5+/-0.1 0.3+/-0.1 1 .0+/-0.1 200 0.8+/-0.1 1.0+/-0.1 1 .1 +/-0.1 2.1 +/-0.2 400 1 .0+/-0.1 5.2+/-0.4 3.1 +/-0.3 8,2+/- 1 ,4 600 2,0+/-0,2 1 1 .1 +/-0.5 7.2+/-1 1 1 ,3+7-1 ,4 Extractos de café verde fueron tratados con diferentes microorganismos y clorogenato esterasa para hidrolizar ácidos clorogénicos. Los resultados se muestran en la tabla 10.

Tabla 10. Composición de los extractos de café verde como resultado de los tratamientos. CQA, FQA, CA y FA están dados en % en relación al control sin tratar a t=0.

NESCAFE PROTECT® fue tratado con diferentes microorganismos y clorogenato esterasa para hidrolizar ácidos clorogénicos. Los resultados se muestran en la tabla 1 1.

Tabla 1 1. Composición de NESCAFE PROTECT® como un resultado de los tratamientos. CQA, FQA, CA y FA están dados en % en relación al control sin tratar en t=0.

Lactobacillus Bifidobacterium lactis Clorogenato esterasa Johnsonii tiempo 4 16 24 4 16 24 4 16 24 (h) CQA 33 13 13 97 81 80 5 3 3 FQA 42 21 20 54 23 20 54 15 14 diCQA 18 2 2 91 72 67 0 0 1 CA 7942 9429 9933 968 2258 2840 10879 10198 10750 FA 4051 5226 5504 3065 4518 5144 2794 5140 5518

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir un extracto de café CARACTERIZADO porque comprende las siguientes etapas: a) extraer granos de café con agua para producir un extracto de café, y b) tratar el extracto de café hidrolizando ácidos clorogénicos para generar ácidos fenólicos.

2. El método de la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque los granos de café a ser extraídos son granos de café enteros.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADO porque el grano de café a ser extraído en la etapa a) son granos de café verdes.

4. El método de la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque los granos de café verdes son co-extraídos en la etapa a) con granos de café tostados.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, CARACTERIZADO porque el extracto de café es separado desde los granos de café extraídos antes, durante o después del tratamiento de la etapa b).

6. El método de la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque el extracto de café se mantiene separado de los granos de café extraídos después del tratamiento de la etapa b).

7. El método de la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque el extracto de café verde obtenido en la etapa a) es mezclado con un extracto de granos de café tostados, la mezcla que es tratada en la etapa b).

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, CARACTERIZADO porque la hidrólisis de ácido clorogénico en la etapa b) es ejecutada mediante fermentación con un microorganismo capaz de hidrolizar ácido clorogénico para generar ácidos fenólicos.

9. Un método para producir un producto alimenticio o bebida CARACTERIZADO porque un extracto de café es producido mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 es usado como un ingrediente de dicho producto alimenticio o bebida.

10. Uso de un extracto de café CARACTERIZADO porque la cantidad de ácido cafeico es al menos 1 miligramo por gramo de materia seca y/o la cantidad de ácido ferúlico es al menos de 0,5 miligramos por gramo de materia seca como un antioxidante.

1 1 . Uso de un extracto de café CARACTERIZADO porque la cantidad de ácido cafeico es al menos 1 miligramo por gramo de materia seca y/o la cantidad de ácido ferúlico es al menos de 0,5 miligramos por gramo de materia seca para la preparación de un medicamento.

12. Uso de un extracto de café CARACTERIZADO porque la cantidad de ácido cafeico es al menos 1 miligramo por gramo de materia seca y/o la cantidad de ácido ferúlico es al menos de 0,5 miligramos por gramo de materia seca para la preparación de una formulación para tratar o prevenir desordenes de piel, diabetes, desordenes cerebrales, inflamación, obesidad y/o cáncer.

13. Uso de un extracto de café CARACTERIZADO porque la cantidad de ácido cafeico es al menos 1 miligramo por gramo de materia seca y/o la cantidad de ácido ferúlico es al menos de 0,5 miligramos por gramo de materia seca para promover la remodelación ósea.

14. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 10-13, CARACTERIZADO porque la relación de cantidad de ácidos cafeoil quínicos y diésteres a la cantidad de ácido cafeico en el extracto de café es menor a 100 (peso/peso).

15. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 10-13, CARACTERIZADO porque la relación de la cantidad de ácidos feruloil quínicos y diésteres a la cantidad de ácido ferúlico en el extracto de café es menor a 30 (peso/peso).