MX2010009828A - Sistema autonomo de electroforesis capilar para la interconexion con espectrometria de masas. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un sistema completo de electroforesis capilar (CE) que es capaz de proporcionar un flujo continuo del efluente en la salida del vial de salida de flujo continuo. Un sistema autónomo de electroforesis capilar con un vial de salida de flujo continuo para la interconexión con espectrometría de masas incluye una capilar que tiene un extremo de entrada aguas arriba y un extremo terminal aguas abajo; una aguja hueca eléctricamente conductiva que tiene una pared interior que define una cámara interna cónica, estando la cámara interna cónica dimensionada y configurada para aceptar de manera deslizable el extremo terminal del capilar, estando el capilar longitudinalmente insertado e instalado dentro de la cámara interna cónica a una distancia mediante la cual el extremo terminal del capilar hace contacto con la pared interior de la aguja en la parte cónica; y en donde se forma un micro-depósito entre el extremo terminal del capilar y el orificio de salida aguas abajo.

Description

SISTEMA AUTÓNOMO DE ELECTROFORESIS CAPILAR PARA LA INTERCONEXIÓN CON ESPECTROMETRÍA DE MASAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un sistema completo de electroforesis capilar (CE) que es capaz de proporcionar un flujo continuo de efluente en la salida del vial de salida de flujo continuo. Más particularmente, esta invención se refiere a un sistema de electroforesis capilar autónomo con un vial de salida de flujo continuo para la interconexión con la espectrometría de masas .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La electroforesis capilar (CE) es una técnica analítica que utiliza grandes potenciales eléctricos aplicados a través de capilares de sílice fundido de orificio estrecho para separar iones en solución. En el campo eléctrico aplicado, los iones positivos y negativos migran en solución hacia el ánodo y el cátodo, respectivamente. Además, también puede presentarse un flujo electroosmótico durante los procesos de CD, dependiendo de la carga superficial de la pared capilar interior, del pH y de la composición de electrolitos.

Aunque la CE proporciona excelente eficacia en la separación, los pequeños diámetros internos capilares proporcionan longitudes de trayectoria muy cortas para - - métodos de detección óptica. Esto, junto con los pequeños volúmenes de inyección utilizados, conduce a una sensibilidad de concentración que, con frecuencia, es más baja que la que se obtiene utilizando la cromatografía líquida. Una alternativa atractiva para la detección óptica es la espectrometría de masas (MS) , la cual además de proporcionar una detección sensible ofrece la separación adicional en la fase de gas y la información estructural sobre los analitos. Sin embargo, la interconexión de los dos métodos presenta varios desafíos. A fin de ser analizados por MS, los iones en solución durante la CE deben convertirse a iones gaseosos . Además, a fin de operar en una forma en línea, el vial de salida de un instrumento típico de CE debe remplazarse por otro medio de contacto eléctrico que no reduzca significativamente la resolución de separación.

El método más popular para lograr este acoplamiento es la ionización por electroaspersión (ESI) la cual se propuso inicialmente como una fuente de iones para el análisis de masas, por Dole et al. [1] . Las diversas enseñanzas de Fenn et al. [2-4] ayudaron a demostrar el potencial de la ESI para la espectrometría de masas . Desde entonces, la ESI ha llegado a ser uno de los tipos de técnicas de ionización más frecuentemente utilizados, debido a su versatilidad, facilidad de uso y efectividad para grandes biomoléculas .

- - La ESI incluye la aplicación de un alto potencial eléctrico a una muestra líquida que fluye a través de un capilar. Se cargan pequeñas gotas de la muestra líquida y se presenta una separación de carga tipo electroforético . En la ESI en modo de ion positivo, los iones positivos migran aguas abajo hacia el menisco del líquido en la punta del capilar. Los iones negativos se repelen de regreso hacia el capilar, dando como resultado el enriquecimiento de la carga. Las fisiones subsecuentes [5] o evaporación [6] de las pequeñas gotas cargadas dan como resultado la formación de iones de fase única de gas solvatado [7]. Estos iones se transmiten después a la abertura del espectrómetro de masas para su separación basada en su proporción masa a carga y su detección.

El desafío en CE-ESI-MS es que tanto los procesos CE como ESI requieren contacto eléctrico estable de la solución con un electrodo en la salida del capilar sin interrupción del flujo electroosmótico de la separación CE. Se han propuesto muchas interconexiones diferentes, sin embargo, la mayoría sufren de problemas de dilución excesiva de la muestra, pérdida de resolución, inestabilidad y/o fragilidad de la aspersión y costo de la interconexión. Las interconexiones propuestas para CE-MS pueden dividirse en dos categorías: las que utilizan un flujo de líquido adicional el cual se mezcla con el eluente CE, y las que no lo hacen.

- - La primera categoría, conocida como interconexiones de flujo envolvente, fue el tipo más popular de interconexión en los primeros años de las aplicaciones de CE-MS [8] y también es el diseño que se encuentra en los sistemas comerciales actuales de CE-ESI-MS. El líquido envolvente que fluye, el cual rodea las terminales capilares sirve para dos propósitos. El primero es establecer contacto eléctrico con la solución capilar a fin de conducir la separación CE y el proceso ESI. El segundo propósito es modificar la composición del electrólito CE para hacerlo más compatible con la detección ESI y MS . Además, en las primeras etapas del desarrollo de CE-MS la mayoría de las interconexiones se adaptaron para ajustarse a los sistemas LC-MS existentes, los cuales requirieron tasas de flujo mucho más altas que las producidas por la CE. Por lo tanto, el líquido envolvente también sirve para incrementar el flujo de líquido a niveles comparables a los encontrados en la cromatografía líquida.

Las interconexiones de flujo envolvente también pueden dividirse adicionalmente en dos categorías: aquellas en las que el flujo de líquido envolvente es coaxial con el capilar de separación y se mezcla con el amortiguador de separación en la terminal capilar, y aquellas en las que se agrega el líquido envolvente por medio de una unión antes de la terminal de CE. Se ha demostrado que las interconexiones coaxiales de flujo envolvente proporcionan un desempeño - - mejorado sobre aquellas con una unión de líquidos [ 9 ] .

Aunque las interconexiones de flujo envolvente permiten que se utilicen condiciones más diversas durante la separación de CE, la adición de líquido envolvente diluye las muestras y conduce a una pérdida importante de sensibilidad. Debido a que los pequeños volúmenes de inyección utilizados en CE proporcionan una sensibilidad de concentración que es baja para iniciar, esta pérdida adicional es en muchos casos, un sacrificio inaceptable. Más recientemente, se han desarrollado las interconexiones de flujo envolvente que utilizan tasas de flujo aún más bajas (algunas menos de 200 nl/min) (Wahl, J.H., y col., Attomole Level Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometric Protein Analysis Using 5-µta i.d. Capillaries. Analytical Chemistry, 1991 64 : p. 3194 -3196 ; Olivares, J.A., et al., On-Line Mass Spectrometric Detection for Capillary Zone Electrophoresis . Analytical Chemistry, 1987 . 59 : p. 1231 ) . Una de estas, la unión de líquidos presurizada, es similar al diseño de unión de líquidos original, sin embargo la unión es ligeramente más ancha (hasta de 300 µp?) y está ubicada en un depósito presurizado de líquido de reposición. La adición de presión ayuda a evitar el desenfoque del efluente de CE en la región intermedia que conduciría a una resolución reducida. Para evitar el contraflujo debido a la diferencial de presión a través del capilar de separación, el vial -de entrada también - - deberá presurizarse . El líquido de reposición conductor establece contacto eléctrico entre el electrólito background (BGE) y el electrodo compartido y también provee un flujo consistente a la punta de electro-aspersión en los casos cuando la tasa de flujo de la EC es suficiente [11] . El flujo adicional introducido en estas interconexiones de 'unión presurizada' agrega un factor de dilución; sin embargo, es mucho menor que en el caso de las interconexiones de flujo envolvente más tradicionales.

También se ha desarrollado una interconexión de nanoaspersión de flujo envolvente utilizando un arreglo coaxial de capilares de sílice [10]. El extremo terminal del capilar de separación estrecha se encuentra recubierto con oro para crear un contacto eléctrico fuera de la trayectoria de separación. Después, se inserta en un capilar de sílice de diámetro mayor con el extremo jalado hacia una parte cónica. La instalación capilar coaxial se instala en una interconexión estándar de aspersión de iones. El líquido envolvente se pasa a través del capilar mayor y fluye por el extremo del capilar de separación, llevando el efluente de la EC a la punta cónica. El factor de dilución con este arreglo es menor de 1/2 y la tasa total de flujo de las soluciones combinadas es de 500 nl/min, aproximadamente.

Otra estrategia para la interconexión de electroaspersión de flujo envolvente de volumen bajo utiliza - - una punta en bisel para reducir las tasas de flujo requeridas para la operación estable de la aspersión, sin reducir significativamente el diámetro interior de la punta emisora [12] . Una aplicación de la punta biselada utiliza un arreglo nuevo de mezclado que no es ni coaxial ni una unión de líquidos tradicional. El efluente de CE y el líquido envolvente son descargados a la punta emisora en capilares paralelos y el mezclado se presenta directamente en el orificio emisor [13] .

A pesar de la dilución que es inherente a las interconexiones de flujo envolvente, estas ofrecen varias ventajas importantes. Debido a que la solución que sale de la interconexión está elaborada principalmente de líquido envolvente, es posible utilizar una variedad más amplia de electrólitos base o aditivos en el proceso de CE que podrían ser incompatibles, de otro modo, con la ESI-MS. También es conveniente utilizar el líquido envolvente para crear contacto eléctrico en el extremo capilar, mientras que este mantiene el proceso de electrólisis alejado de la trayectoria del analito. Finalmente, en general, las interconexiones de flujo envolvente son robustas y bastante apropiadas para comercialización.

A pesar de los recientes avances, las interconexiones de flujo envolvente aún tienen que igualar la sensibilidad que se logra con interconexiones sin envolvente.

- - Con frecuencia, las interconexiones sin envolvente están clasificadas por el número de piezas a través de las cuales pasa el flujo de líquido. El primer tipo, y el más común de interconexión sin envolvente incluye únicamente una sola sección del capilar la cual actúa tanto como canal de separación como emisor de electroaspersión. De hecho, la primera demostración de espectrometría de masas como un detector en línea para electroforesis capilar fue reportado por Olivares y colaboradores en 1987 [ 14 ] utilizando una interconexión fabricada por deposición de vapor de plata en un extremo capilar que sobresalía ligeramente de un electrodo con sin envolvente metálica. El metal depositado creó contacto entre el electrodo envolvente y el electrólito CE.

Se han probado otros varios materiales conductores para recubrimiento, además de la plata, incluyendo el oro [ 15-17 ] , cobre [ 18 ] , níquel [ 19 ] y grafito [ 20 -24 ] . Desafortunadamente, las puntas recubiertas tienen una corta vida de uso debido a los altos campos eléctricos que actúan en el recubrimiento metálico en la punta. En general, únicamente pueden utilizarse por unos cuantos días antes de que el deterioro del recubriendo ocasione que la operación sea inestable. La estabilidad puede mejorarse con el pre-tratamiento de la superficie capilar o al mezclar diferentes materiales en el recubrimiento [ 17 , 24 ] .

Petersson y colaboradores exploraron la posibilidad - - de utilizar una película delgada de líquido estático entre la punta del capilar y una sin envolvente metálica ligeramente jalada hacia atrás desde la punta del capilar [25] para establecer contacto eléctrico. También se ha demostrado que CE-ESI-MS puede efectuarse sin ningún electrodo en la terminal capilar. En este caso, se establece el contacto eléctrico a través del espacio entre la punta del capilar y el orificio conectado a tierra del espectrómetro de masas [26] . Aunque esto parece " ofrecer una solución extremadamente simple para la interconexión, la posición de la punta del capilar con respecto al espectrómetro de masas es crítica y no es posible controlar la separación y los voltajes de aspersión de manera independiente.

Una alternativa para recubrir la punta del capilar es insertar un electrodo de alambre en el canal capilar a fin de hacer contacto eléctrico. Para este fin se han probado diversos medios diferentes. Cuando se utilizan capilares de diámetro interior mayor, puede insertarse un electrodo de alambre en el extremo del canal capilar [27] o en un pequeño orificio perforado cerca de la terminal capilar [28] . Sin embargo, esto crea turbulencia y reduce el poder de resolución de la separación CE. La turbulencia puede reducirse utilizando un orificio lleno con epoxi conductor de oro en vez de alambre, sin embargo, como con cualquier situación en donde ocurra la electrólisis dentro del canal de - - separación, esto puede conducir a la formación de burbujas dentro del canal de separación.

Otra estrategia para crear contacto eléctrico es dividir el flujo de líquido desde el capilar, de manera que una porción del flujo entre en contacto con un electrodo exterior, conocido como interconexión de flujo dividido. La división se logra a través de un orificio perforado o de una pequeña fisura en un solo capilar, el cual sirve de igual manera como cámara de separación y como punta de electroaspersión [29] . Mientras que esto funciona bien para preservar la separación, la dificultad en esta estrategia se encuentra en crear orificios o fisuras reproducibles los cuales proporcionan la proporción deseada de divisiones entre los dos trayectos del flujo. Un proceso alternativo es el uso de ácido fluorhídrico para atacar químicamente secciones de la superficie externa del capilar de sílice fundido al punto en donde las paredes capilares se vuelven porosas . El contacto eléctrico puede hacerse después a través del lugar poroso de la pared capilar, ya sea al sumergir la porción de ataque químico del capilar en un depósito con amortiguador [30], o al insertarla en una cubierta metálica recubierta con una delgada película de líquido [25,31] . Aunque se ha demostrado que las interconexiones de este tipo son bastante exitosas, la producción es inapelablemente riesgosa y los capilares son extremadamente frágiles.

- - En dos interconexiones bicapilares sin envolvente, los extremos del capilar de separación y un capilar que actúa como la punta de aspersión se encuentran unidos a tope, en una unión. No se introduce un flujo adicional a través de la unión; sin embargo se establece contacto eléctrico a través de un electrolito circundante dentro del cual se coloca el electrodo terminal. Las intersecciones se han construido utilizando tubería para microdiálisis [32], una camisa metálica conectada a la fuente de energía [33], o una micro-T [34] para alinear los dos capilares e introducir el contacto con un electrodo. Aunque estas técnicas ofrecen la ventaja de mover la ubicación del proceso de electrólisis al exterior del circuito de CE, son difíciles de alinear de una manera que no reduzcan la resolución de la separación. De manera similar, también es posible unir el capilar de separación con una punta metálica que actúa tanto como aspersor, como electrodo; sin embargo, la alineación y la producción de burbujas continúan siendo un problema.

Está bien documentado que muchos solventes orgánicos, sales y otros aditivos que se utilizan usualmente en CE pueden tener un impacto negativo en la eficacia de la ionización de los analitos de interés [35-38] . Esto puede resolverse, en parte, por el uso de una interconexión de flujo envolvente o unión de líquidos, la cual altera la composición del efluente CE con un líquido envolvente más - ¬ compatible. También existen conceptos similares en la cromatografía líquida. Por ejemplo, se ha agregado una solución de modificación al efluente LC para contrarrestar la supresión de la ionización debido al ácido trifluoroacético en la fase móvil [39]. El ajuste de este tipo al medio amiente químico de los analitos puede incrementar significativamente la sensibilidad de detección al optimizar las condiciones de ionización.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Un objeto de un aspecto de la presente invención es proporcionar un sistema autónomo de electroforesis capilar con un vial de salida de flujo continuo para la interconexión con espectrometría de masas. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un medio para interconectar separaciones electroforéticas y/o cromatográficas capilares en línea con sistemas de detección. Los sistemas de detección pueden ser uno o más de un número de métodos para detección y/o análisis, incluyendo el análisis de espectrometría de masas. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un medio de interconectar separaciones electroforéticas capilares con sistemas de detección lo cual es simple y económico de instalar.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un acoplador para interconectar un capilar con un sistema en línea de detección aguas abajo que comprende - - una aguja hueca eléctricamente conductiva que tiene una pared interior que define una cámara interna cónica, la aguja tiene una abertura aguas arriba y una orificio de salida aguas abajo, el orificio de salida aguas abajo se opone de manera axial a la abertura aguas arriba, la cámara interna cónica dimensionada y configurada para tener un diámetro decreciente, desde un diámetro mayor en la abertura hasta un diámetro más pequeño en el orificio de salida para formar un ahusamiento en la pared interna en la dirección longitudinal desde la abertura hasta el orificio de salida, el diámetro mayor en la abertura dimensionado y configurado para aceptar de manera deslizable un extremo terminal de un capilar.

De acuerdo con un aspecto más de la presente invención se proporciona un sistema de electroforesis capilar (CE) que comprende un capilar que tiene una extremo de entrada aguas arriba y un extremo terminal aguas abajo; una aguja hueca eléctricamente conductiva que tiene una pared interna que define una cámara interna cónica, la aguja tiene una abertura aguas arriba y un orificio de salida aguas abajo, el orificio de salida aguas abajo se encuentra opuesto de manera axial a la abertura aguas arriba, la cámara interna cónica dimensionada y configurada para tener un diámetro decreciente, desde un diámetro mayor en la abertura hasta un diámetro más pequeño en el orificio de salida para formar un ahusamiento en la pared interna en la dirección longitudinal - - desde la abertura hasta el orificio de salida, el diámetro mayor en la abertura dimensionado y configurado para aceptar de manera deslizable el extremo terminal del capilar, estando el capilar insertado longitudinalmente insertado en e instalado dentro de la cámara interna cónica a una distancia en donde el extremo terminal del capilar hace contacto con la pared interna de la aguja en el ahusamiento y en donde un micro-depósito se forma entre el extremo terminal del capilar y el orificio de salida aguas abajo.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención se proporciona una interconexión CE-MS sin envolvente que comprende: una aguja hueca eléctricamente conductiva que tiene una pared de la aguja que define una cámara cónica a lo largo del eje de la aguja desde una abertura aguas arriba hasta un orificio aguas abajo; con un extremo y un diámetro exterior, el diámetro capilar exterior es mayor que el orificio aguas abajo, el capilar es adecuado para contener el electrólito de base en el mismo, el extremo capilar está colocado dentro de la cámara, el extremo capilar y la pared de la aguja definen un micro-depósito, en donde el micro-depósito es adecuado para contener el electrólito de depósito, en donde cuando el micro-depósito contiene el electrólito de depósito, el electrólito de depósito forma una conexión eléctrica entre el electrólito base y la aguja conductiva para causar la separación CE.

- - De acuerdo con otra modalidad de la presente invención se proporciona un sistema CE-MS sin envolvente que comprende un primer vial; un electrodo colocado dentro del primer vial; una aguja hueca que tiene una pared eléctricamente conductiva que define una cámara cónica a lo largo del eje de la aguja desde una abertura aguas arriba hasta un orificio aguas abajo; un capilar con un primer extremo, un segundo extremo y un diámetro exterior, el diámetro exterior es mayor que el orificio aguas abajo, el primer extremo colocado dentro del primer vial, el segundo extremo colocado dentro de la cámara, el segundo extremo en la pared interna de la aguja que define un micro-depósito; un contraelectrodo adyacente al orificio aguas abajo; un primer potencial eléctrico aplicado entre el electrodo y la aguja; un segundo potencial eléctrico aplicado entre la aguja y el contraelectrodo; y en donde el micro-depósito es adecuado para contener el electrólito de depósito, en donde el micro-depósito contiene el electrólito de depósito, el electrólito de depósito forma una conexión eléctrica entre el segundo extremo del capilar y la aguja para causar la separación CE y la electroaspersión.

Las ventajas de la presente invención incluyen la alineación automática del capilar en la aguja cónica; una interconexión simple y económica de separaciones electroforáticas capilares con sistemas de detección; - - favorable a la producción en masa; posicionamiento reproducible de los capilares dentro de la aguja en la dirección longitudinal, ; alineación coaxial de los capilares dentro de la aguja; diseñados para facilitar el remplazo de los capilares cuando se requiera; fácilmente adaptable al flujo auxiliar de solución; buena resolución de analitos entre los procesos de separación y electroaspersión.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En la presente, abajo, se proporciona una descripción detallada de las modalidades preferidas, con referencia a los siguientes dibujos en los cuales: La Figura 1(a), en vista en planta, ilustra un sistema de electroforesis capilar-espectrómetro de masas sin envolvente (CE-MS) , de acuerdo con una modalidad de la presente invención.

La Figura 1(b), en vista en planta, ilustra en detalle la conexión mecánica entre los capilares, la aguja de aspersión y los aditamentos del sistema CE-MS, sin envolvente, de la Figura 1(a) .

La Figura 2(a), en vista en planta, ilustra un sistema CE-MS sin envolvente, de acuerdo con otra modalidad de la presente invención; La Figura 2 (b) , en vista en planta, ilustra en detalle la conexión mecánica entre los capilares, la aguja de aspersión y los aditamentos del sistema CE-MS, sin - - envolvente, de la Figura 2(a); La Figura 3 (a) , en vista en planta, ilustra en detalle la inserción de los capilares de separación en la aguja de electroaspersion del sistema CE-MS, sin envolvente, de la Figura 1; La Figura 3(b), en vista en planta, ilustra en detalle la inserción de los capilares de separación en la aguja de electroaspersion del sistema CE-MS, sin envolvente, de la Figura 2 ; La Figura 4 ilustra un rastro de absorbencia que se ejemplifica de una separación electroforética obtenida con el uso de una modalidad de la presente invención operando únicamente en el modo CE; La Figura 5 ilustra una gota de líquido que se ejemplifica, que sale de la aguja de electroaspersion de una modalidad de la invención cuando se opera en modo CE únicamente; La Figura 6 ilustra un rastro espectral de masas que se ejemplifica, obtenido de una modalidad de la invención determinada para operación como una fuente de ionización de electroaspersion únicamente; La Figura 7 ilustra datos espectrales de masas que se ejemplifican, obtenidos de la operación de una modalidad de la invención para la separación de una mezcla de aminoácidos . Los electroferogramas de aminoácido son - - A) Glicina, B)Alanina, C) Serina, D) Prolina, E) Valina, F) Treonina, G) Cisteína, H) Isoleucina, I) Asparagina, J) Ácido aspártico, K) Glutamina, Lisina, L) Ácido glutámico, M) Metionina, N) Histidina, 0) Fenilalanina, P) Arginina, Q) Triptófano; La Figura 8 ilustra datos espectrales de masas que se ejemplifican, para la separación de una mezcla de péptidos utilizando una modalidad de la presente invención. Los electroferogramas son identificados como correspondientes a R) Angiotensina II (+2); S) Metencefalina (+1), T) Sustancia P (+2), U) Bradicinina (+2), V) Neurotensina (+2) , y W) ion total ; La Figura 9 ilustra la ionización de electroaspersión que se presenta a partir de una aguja que tiene una punta bicelada de una modalidad de la presente invención en tasas de flujo (a) alta y (b) baja.

En los dibujos, las modalidades preferidas de la invención se ilustran por medio de ejemplo. Se deberá entender de manera expresa que la descripción y los dibujos son sólo para propósito de ilustración y como un auxiliar para entender y no se proponen como una definición de los límites de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un capilar de separación se inserta en una aguja electro-conductiva que tiene un diámetro interior ligeramente - - mayor que el diámetro exterior del capilar. En la punta de la aguja la geometría interior de la aguja está conformada de tal manera que el diámetro interior cerca de la punta es menor que el diámetro exterior de los capilares de separación CE. Por ejemplo, la geometría interior de la aguja puede ser cónica o redondeada lo cual permite el posicionamiento reproducible de los capilares dentro de la aguja en la dirección longitudinal, ya que los capilares sólo entran a la aguja hasta el punto en donde el diámetro interno de la aguja coincide con el diámetro externo de los capilares. La alineación coaxial también se logra, ya que el ahusamiento interno simétrico mantendrá los capilares centrados dentro de la aguja. El diámetro interno de la aguja es mayor que, igual a o menor que el diámetro interior de los capilares . Los aditamentos estándar se utilizan para mantener los capilares en posición una vez que han sido insertados en la aguja. Si es necesario, el capilar CE se puede remplazar fácilmente al jalar el capilar hacia fuera e insertar uno nuevo. En el caso de la producción en masa, se pueden elaborar cartuchos CE-MS de una sola pieza, o capilares con una punta de aguja unida, a un costo razonable. Se puede utilizar una unión en T para agregar un flujo auxiliar de solución dentro de la aguja, de tal manera que la solución auxiliar fluya de manera coaxial alrededor del extremo del capilar de separación antes de salir de la aguja.

- - El volumen abierto en el extremo terminal del capilar de separación dentro de la interconexión sin envolvente constituye un micro-depósito de flujo continuo que remplaza el vial de salida utilizado en la separación tradicional CE, proporcionando contacto eléctrico con el electrodo, mientras que permite que los analitos y los productos de la electrólisis pasen a través de la punta de la aguja. El llenado o reabastecimiento del micro-depósito puede llevarse a cabo simplemente al lavar el electrolito base a través del capilar CE antes de iniciar una separación o al lavar la solución auxiliar a través de la unión en T. La presencia del volumen del micro-depósito entre el extremo capilar y la salida de la abertura de la aguja no afectan significativamente las formas de las crestas separadas en el capilar CE. Por lo tanto, es posible mantener una buena resolución de analitos entre los procesos de separación y electroaspersión .

El uso de este micro vial de flujo continuo esencialmente desacopla el proceso CE desde el detector interconectado, haciendo el proceso CE menos dependiente del tipo y el principio de operación del detector acoplado. El proceso CE puede continuar, por tanto, sin importar de qué detector se trate. La adición de solución auxiliar puede utilizarse para modificar tanto la tasa de flujo como las propiedades químicas del efluente, a fin de incrementar la - - compatibilidad con métodos analíticos subsecuentes. El efluente que sale del microvial es descargado después a la siguiente etapa del proceso, ya sea por ionización o por otro medio, para preparar el analito para la condición de detección optimizada.

La aguja de electroaspersión se encuentra conectada a una fuente de energía y actúa como el electrodo terminal de la separación CE, así como es parte del circuito eléctrico necesario para la ionización de los analitos por electroaspersión. Los potenciales relativos en el electrodo de entrada de CE, la aguja de electroaspersión y el electrodo del contador ESI dependerán de los modelos de CE y ESI que se deseen. A fin de compensar el amplio rango de tasas de flujo que pueden producirse por el uso de diferentes CE y de las condiciones del modificador, puede utilizarse una punta de aguja biselada. En este caso, las formas del ahusamiento Taylor en el punto más agudo del bisel y el tamaño del ahusamiento se auto-ajustan a la tasa de flujo que sale de la abertura de la aguja, permitiendo, la operación estable de aspersión, sin importar la tasa de flujo.

Refiriéndose a la Figura 1(a) y 1(b), se muestra como vista en planta, un sistema sin envolvente de electroforesis capilar-espectrómetro de masas (CE-MS) (1) de acuerdo con una modalidad de la presente invención. El sistema (1) comprende un primer vial (10) para retener una - - muestra de líquido (12) ; un electrodo (15) colocado dentro del primer vial (10) que tiene un primer extremo (18) colocado en la muestra de líquido (12) y un segundo extremo (20) . Se proporciona una aguja hueca eléctricamente conductiva (22) que tiene una pared interior que define una cámara cónica interna (30) (ver la Figura 3(a)), la aguja (22) tiene una abertura aguas arriba (21) y un orificio de salida aguas abajo (23) , el orificio de salida aguas abajo (23) opuesto de manera axial a la abertura aguas arriba (21) , la cámara interna cónica dimensionada y configurada para tener un diámetro decreciente desde un diámetro mayor en la abertura, a un diámetro más pequeño en el orificio de salida (23) para formar un ahusamiento en la pared interior en la dirección longitudinal desde la abertura hasta el orificio de salida (23) , el diámetro mayor en la abertura dimensionado y configurado para aceptar de manera deslizable el segundo extremo (20) del capilar (14) . Como se ilustra en la Figura 1 (b) , los aditamentos de cromatografía estándar que incluyen PEEK aguas arriba y aguas abajo o tuercas de acero inoxidable (16, 18) , una unión (19) y un ferrul (17) se proporcionan para conectar y sostener el capilar (14) y la aguja (22) en su lugar. La aguja (22) se encuentra conectada a un segundo suministro de energía (26) de manera que pueda aplicarse un primer potencial eléctrico entre el electrodo (15) y la aguja (22) . Un contraelectrodo (28) se encuentra posicionado aguas abajo del orificio de salida (23) de la aguja (22) . El contraelectrodo (28) puede ser cualquier abertura de muestra de espectrometría de masas estándar o cualquier interconexión instrumental que se encuentre conectado eléctricamente. Los voltajes relativos en el primer vial (10) , la aguja (22) y el contraelectrodo (28) dependerán del modo de electroforesis capilar e ionización por electroaspersión que se desee. La región entre el orificio de salida (23) de la aguja (22) y el contraelectrodo (28) puede mantenerse en presión atmosférica.

Como se muestra en la Figura 3 (a) , cuando el segundo extremo (20) del capilar (14) se encuentra insertado en la cámara cónica interna (30) de la aguja (22) se forma un micro-depósito de flujo continuo (32) entre el segundo extremo (20) del capilar (14) y el orificio de salida aguas abajo (23) . El micro-depósito (32) es adecuado para contener el electrólito de depósito, en donde cuando el micro-depósito (32 contiene el electrólito de depósito, el electrólito de depósito forma una conexión eléctrica entre el segundo extremo (20) del capilar (14) y la aguja (22) para causar la separación de electroforesis capilar y la electroaspersión. El micro-depósito puede tomar muchas formas además de las representados en la Figura 3 y, en un caso extremo, puede simplemente ser el volumen de la abertura de la aguja y el grosor del metal en la punta del electrodo. Una característica del micro-depósito es que éste proporciona contacto eléctrico entre la aguja metálica de aspersión y la solución dentro del capilar.

Refiriéndose a la Figura 2(a) y 2(b), se muestra como vista en planta, un sistema de electroforesis capilar-espectrómetro de masa (CE-MS) (100), sin envolvente, de acuerdo con otra modalidad de la presente invención. El sistema (100) comprende un primer vial (101) para retener una muestra de líquido (120) ; un electrodo (150) colocado dentro del primer vial (101) y conectado a un primer suministro de energía de alto voltaje (160) ; un primer capilar de sílice fundido (140) que tiene un primer extremo (180) colocado en la muestra de líquido (120) y un segundo extremo (200) . Se proporciona una aguja hueca eléctricamente conductiva (220) que tiene una pared interior que define una cámara cónica interna (300) (ver Figura 3(b)), la aguja (220) tiene una abertura aguas arriba (210) y un orificio de salida aguas abajo (230) , el orificio de salida aguas abajo (230) se encuentra opuesto de manera axial a la abertura aguas arriba (210) , la cámara cónica interna dimensionada y configurada para tener un diámetro decreciente desde un diámetro mayor en la abertura hasta un diámetro más pequeño en el orificio de salida (230) para formar un ahusamiento en la pared interior en la dirección longitudinal desde la abertura hasta el orificio de salida (230) , el diámetro mayor en la abertura dimensionada y configurada para aceptar de manera deslizable - - el segundo extremo (200) del primer capilar (140) . El sistema (100) además comprende un capilar auxiliar de sílice fundido (400) que tiene un primer extremo (480) y un segundo extremo (600) . El primer extremo (480) colocado en una muestra de líquido auxiliar (412) contenida en un vial auxiliar (410) , un electrodo auxiliar (415) colocado dentro del vial auxiliar (410) y conectado a tierra.

Como se ilustra en la Figura 2 (b) , los aditamentos de cromatografía estándar que incluyen PEEK aguas arriba o tuercas de acero inoxidable (460, 481) , una unión en T (490) , un ferrul (420) y una tuerca PEEK (421) , se proporcionan para conectar y retener el primer capilar (140) y la aguja (220) en su lugar, en una alineación lineal y para sostener y orientar el capilar auxiliar (400) perpendicularmente entre ellos. La aguja (220) (220) se encuentra conectada a un segundo suministro de energía (260) , de manera que pueda aplicarse un primer potencial eléctrico entre el electrodo (150) y la aguja (220) . Un contraelectrodo (280) se encuentra posicionado aguas abajo del orificio de salida (230) de la aguja (220) . El contraelectrodo (280) puede ser cualquier abertura muestra de espectrometría de masas estándar o cualquier interconexión instrumental que se encuentra conectada eléctricamente. , Los voltajes relativos en el primer vial (101) , la aguja (220) y el contraelectrodo (280) dependerán del modo de electroforesis capilar y - - ionización por electroaspersión que se deseen. La región entre el orificio de salida (230) de la aguja (220) y el contraelectrodo (280) puede mantenerse a presión atmosférica.

Como se muestra en la Figura 3 (b) , cuando el segundo extremo (200) del primer capilar (140) se inserta en la cámara cónica interna (300) de la aguja (220) un micro-depósito de flujo continuo (320) se forma entre el segundo extremo (200) del capilar (140) y el orificio de salida aguas abajo (230) . El micro-depósito (320) es adecuado para contener el electrólito de depósito, en donde cuando el micro-depósito (320) contiene el electrólito de depósito, el electrólito de depósito forma una conexión eléctrica entre el segundo extremo (200) del primer capilar (140) y la aguja (220) para causar la separación de la electroforesis capilar y la electroaspersión.

La muestra de líquido auxiliar (412) fluye a través del capilar auxiliar (400) desde el primer extremo (480) al segundo extremo (600) y dentro de la cámara interna (492) de la unión en T (490) rodeando de tal modo la superficie exterior del primer capilar (140) y fluyendo hacia adentro del micro-depósito (320) .

La Figura 3 demuestra las propiedades de auto-alineación de la presente invención, por medio de la cual el ahusamiento interno de la aguja de aspersión guía el capilar a la posición que se centra con respecto al orificio de - - salida de la aguja y es consistente con respecto al volumen del micro-depósito.

El micro-depósito ofrece la característica única de que la interconexión proporciona un sustituto de vial de salida completo, de manera que CE puede efectuarse en la ausencia de una electroaspersión.

Refiriéndose a la Figura 4 se ilustra un rastro de absorbencia que se ejemplifica, de una separación electroforética obtenida utilizando una modalidad de la presente invención que opera en modo CE únicamente. La Figura 4 muestra el rastro de absorbencia de la separación de una mezcla de aminoácidos y cafeína que utilizan la interconexión en modo CE únicamente. En este caso, la aguja es conectada a tierra y el líquido sale de la aguja como gotas. El modo de CE únicamente, ofrece una versatilidad mejorada, permitiendo el uso de inyección electrocinética antes de la separación CE, sin alterar la instalación de CE-MS . También hace que esté disponible la posibilidad de atomizar únicamente una parte de la separación CE, lo cual podría ser conveniente para las técnicas de enfoque en línea o de derivación que refieren amortiguadores altos en sal o agentes tensioactivos .

Refiriéndose a la Figura 5, se ilustra como una gota de líquido que se ejemplifica, que sale de la aguja de electroaspersión de una modalidad de la invención cuando se opera en el modo CE únicamente.

Refiriéndose a la Figura 6, se ilustra como un rastro espectral de masas que se ejemplifica, obtenido de una modalidad de la invención instalada para operación como una fuente de ionización por electroaspersión únicamente. La Figura 6 muestra la interconexión que opera en modo ESI únicamente sin solución auxiliar. Un tapón de cafeína (0.5M en fosfato, pH 9, 10% de metanol) es atomizado y detectado por MS, mientras es impulsado a través de la interconexión utilizando presión únicamente. La inyección fue operada a 25 kV por 0.5 s en 10 psig. El perfil simétrico de la cresta muestra que la solución en el micro depósito y la forma del micro vial no distorsiona la forma de la cresta significativamente, y que el analito que sale del capilar no es atrapado por el micro-depósito.

Refiriéndose a la Figura 7 se ilustran datos espectrales de masas que se ejemplifican, obtenidos de la operación de una modalidad de la invención. La Figura 7 muestra los datos espectrales de masas por una separación CE de una mezcla de aminoácidos con el uso de un flujo auxiliar para compensar el flujo en masa cercano a cero de la separación CE cuando se utiliza un electrólito acídico de base. Una mezcla de aminoácidos es separada por CE y separada por el MS. Se ilustra la separación de aminoácidos A) Glicina, B) Alanina, C) Serina, D) Prolina, E) Valina, F) - - Treonina, G) Cisteína, H) Isoleucina, I) Asparagina, J) Ácido aspártico, K) Glutamina, Lisina, L) Ácido glutámico, M) Metionina, N) Histideína, 0) Fenilalanina, P) Arginina, Q) Triptófano .

Refiriéndose a la Figura 8 se ilustran los datos espectrales de masas de una separación CE asistida por presión, de una mezcla de cinco péptidos con ionización por electroaspersión en linea. W ilustra el electroferograma de ion total. R es identificada como el electroferograma de Angiotensina II (+2) con un rango m/z de 449.6-450.3. S es identificada como el electroferograma de Metencefaliña (+1) con un rango m/z de 573.8 - 574.2. T es identificada como el electroferograma de la Sustancia P (+2) con un rango m/z de 672.9 - 674.4. U se identifica como el electroferograma de Bradicinina (+2) con un rango m/z de 530.0 - 531.1. V es identificada como el electroferograma de Neurotensina (+2) con un rango de 837.5 - 838.8. Ni los parámetros de separación de CE ni los parámetros de electroaspersión fueron optimizados antes del análisis. Las identidades de las crestas de los diferentes estados de carga de los péptidos analizados se encuentran registradas en la Tabla 1, abajo. Tabla 1 : Separación de una mezcla de 5 péptidos - - Carga: +1 +2 +3 +4 +5 Péptido Cresta (m/z) Angiotensina II 895.88 896.9 448.9 299.6 225. 0 180. 2 Neurotensina 1671.66 1672.7 836.8 558.2 418. 9 335. 3 Bradicinina 1058.76 1059.8 530.4 353.9 265. 7 212. 8 Metencefaliña 572.7 573.7 287.4 191.9 144. 2 115. 5 Sustancia P 1345.7 1346.7 673.9 449.6 337. 4 270. 1 Refiriéndose a la Figura 9, se ilustra la ionización por electroaspersión que se ejemplifica, que se presenta desde una punta de aguja biselada con una punta biselada en tasas de flujo (a) alto y (b) bajo. Pueden observarse las propiedades de auto ajuste del ahusamiento Taylor en respuesta a diferentes tasas de flujo. En 9 (a) se agrega un modificador en una tasa de flujo baja, lo que conduce a la formación de un pequeño ahusamiento Taylor en el punto más agudo del bisel. En 9(b) se incrementa la tasa de flujo de modificación y el tamaño del ahusamiento Taylor se incrementa de manera correspondiente. Esto demuestra las propiedades de auto ajuste de la interconexión cuando se utiliza con una punta de aguja biselada. Un rango mayor de la tasa de flujo del efluente puede manejarse por la misma interconexión sin ninguna modificación adicional del sistema.

Pueden hacerse numerosas modificaciones, variaciones y adaptaciones a las modalidades particulares de - - la invención descritas arriba sin apartarse del alcance de la invención. Se cree que todas tales modificaciones o variaciones se encuentran dentro de la esfera y alcance de la invención, según se define por las reivindicaciones anexas aquí .

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Un acoplador de microvial para electroforesis capilar (CE) para interconectar un capilar con un sistema en línea de detección aguas abajo que comprende: una aguja hueca eléctricamente conductiva que tiene una pared interior que define una cámara cónica interna, teniendo la aguja una abertura aguas arriba y un orificio de salida aguas abajo, estando el orificio de salida aguas abajo axialmente opuesto a la abertura aguas arriba, estando dimensionada y configurada la cámara cónica interna para tener un diámetro decreciente desde un diámetro mayor en la abertura hasta un diámetro más pequeño en el orificio de salida para formar un ahusamiento en la pared interior en la dirección longitudinal desde la abertura hasta el orificio de salida, estando dimensionado y configurado el diámetro mayor en la abertura para aceptar de manera deslizable un extremo terminal de un capilar..

2. un sistema de electroforesis capilar (CE) que comprende un capilar que tiene un extremo de entrada aguas arriba y un extremo terminal aguas abajo; una aguja hueca eléctricamente conductiva que tiene una pared interior que define una cámara cónica interna, teniendo la aguja una abertura aguas arriba y un orificio de salida aguas abajo, estando el orificio de salida aguas abajo axialmente opuesto a la abertura aguas arriba, estando dimensionada y configurada la cámara cónica interna para tener un diámetro decreciente desde un diámetro mayor en la abertura hasta un diámetro más pequeño en el orificio de salida, para formar un ahusamiento en la pared interior en la dirección longitudinal desde la abertura hasta el orificio de salida, estando dimensionado y configurado el diámetro mayor en la abertura para aceptar de manera deslizable el extremo terminal del capilar, estando el capilar insertado de manera longitudinal e instalado dentro de la cámara cónica interna a una distancia por medio de la cual el extremo terminal del capilar hace contacto con la pared interior de la aguja en el ahusamiento; y en donde se forma un micro-depósito entre el extremo terminal del capilar y el orificio de salida aguas abajo.

3. El sistema de la reivindicación 2, que comprende además un medio de unión aguas arriba de la aguja para proporcionar una solución auxiliar por medio de la cual la solución auxiliar se dirige al flujo de manera coaxial a lo largo del exterior del capilar desde la abertura aguas arriba de la aguja hasta el micro depósito.

4. El sistema de la reivindicación 3, en donde el medio de unión comprende una porción de cuerpo tubular que tiene una primera abertura y una segunda abertura, estando la primer abertura axialmente opuesta a la segunda abertura, estando dimensionada y configurada la porción de cuerpo tubular para permitir el paso del capilar a través de ella; medios para asegurar el capilar en la primera abertura; medios para asegurar la aguja en la segunda abertura; y una porción de derivación tubular perpendicular a la porción de cuerpo tubular, teniendo la porción de derivación tubular una abertura de derivación perpendicular a la primera abertura y provista con un medio para asegurar un capilar auxiliar dentro de la abertura de derivación.

5. El sistema de la reivindicación 2, en donde el orificio de salida aguas abajo de la aguja se adapta para utilizarse como un emisor de electroaspersión .

6. El sistema de la reivindicación 5, en donde el emisor de electroaspersión se acopla a un espectrómetro de masas .

7. El sistema de la reivindicación 2, en donde el orificio de salida aguas abajo de la aguja se acopla a un aparato de recolección de fracciones.

8. El sistema de la reivindicación 2, en donde el orificio de salida aguas abajo de la aguja se acopla a un aparato analítico externo.

9 . El microacoplador de la reivindicación 1 , en donde la aguja tiene una punta con forma de bisel aguas abaj o .

10 . El micro acoplador de la reivindicación 1 , en donde el orificio de salida aguas abajo de la aguja se adapta para utilizarse como un emisor de electroaspersion.

11 . El micro acoplador de la reivindicación 1 , en donde el sistema de detección en línea aguas abajo es un espectrómetro de masas .

12 . El micro acoplador de la reivindicación 1 , en donde el sistema CE se remplaza por un sistema para cromatografía nano-líquida .

13 . El micro acoplador de la reivindicación 1 , en donde el sistema CE se remplaza por un sistema para cromatografía líquida de micro columna de presión ultra alta.

14 . El micro acoplador de la reivindicación 1 , en donde el sistema CE se remplaza por un sistema para cromatografía electrocinética capilar.

15 . El micro acoplador de la reivindicación 1 , en donde el sistema de detección en línea aguas abajo es un sistema para inyección de flujo capilar.

16 . Una interconexión CE-MS sin envolvente que comprende : una aguja hueca eléctricamente conductiva que tiene una pared de aguja que define una cámara cónica a lo largo del eje de la aguja desde una abertura aguas arriba hasta un orificio aguas abajo; un capilar con un extremo y un diámetro exterior, siendo el diámetro exterior del capilar mayor que el orificio aguas abajo, estando el capilar adecuado para contener el electrólito base en el mismo, estando colocado el extremo del capilar dentro de la cámara, definiendo el extremo del capilar y la pared de la aguja un micro-depósito; en donde el micro depósito es adecuado para contener el electrólito de depósito, en donde cuando el micro-depósito contiene el electrólito de depósito, el electrólito de depósito forma una conexión eléctrica entre el electrólito de base y la aguja conductiva para causar la separación de CE.

17. La interconexión CE-MS sin envolvente de la reivindicación 16, en donde la aguja tiene una punta biselada, asimétrica alrededor del eje de la aguja y aguas abajo del orificio.

18. La interconexión CE-MS sin envolvente de la reivindicación 16, en donde el electrólito de depósito se proporciona a través del capilar.

19. La interconexión CE-MS sin envolvente de la reivindicación 16, en donde el electrólito de depósito se proporciona a través de la abertura aguas arriba de la aguja.

20. Un sistema CE-MS sin envolvente que comprende: un primer vial ; un electrodo colocado dentro del primer vial; una aguja hueca que tiene una pared eléctricamente conductiva que define una cámara ahusada a lo largo del eje de la aguja desde una abertura aguas arriba hasta un orificio aguas abajo; un capilar con un primer extremo, un segundo extremo y un diámetro exterior, siendo el diámetro exterior mayor que el orificio aguas abajo, estando el primer extremo dispuesto dentro del primer vial, estando el segundo extremo dispuesto dentro de la cámara, definiendo el segundo extremo y la pared interior de la aguja un micro-depósito; un contraelectrodo adyacente al orificio aguas abajo; un primer potencial eléctrico aplicado entre el electrodo y la aguja; un segundo potencial eléctrico aplicado entre la aguja y el contraelectrodo; y en donde el micro-depósito es adecuado para contener el electrólito de depósito, en donde cuando el micro-depósito contiene el electrólito de depósito, el electrólito de depósito forma una conexión eléctrica entre el segundo extremo del capilar y la aguja para causar la separación CE y la electroaspersión.

21. El sistema CE-MS sin envolvente de la reivindicación 20, en donde la aguja tiene una punta biselada.

22. El sistema CE-MS sin envolvente de la reivindicación 20, que comprende además un segundo vial en comunicación fluida con la abertura aguas arriba de la aguja, en donde el segundo vial se presuriza y en donde el segundo vial proporciona el electrólito de depósito.

23. El sistema CE-MS sin envolvente de la reivindicación 20, en donde el primer vial se presuriza y en donde el primer vial proporciona el electrólito de depósito.