MX2010009343A - Combinacion de genes marcadores para la caracterizacion de una cepa de lactobacillus sakei. - Google Patents
Combinacion de genes marcadores para la caracterizacion de una cepa de lactobacillus sakei.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a una nueva combinación de genes marcadores para la caracterización de una cepa Lactobacillus sakei. En particular, la presente invención se refiere al uso de un patrón de la presencia o ausencia de los genes marcadores en el genoma de la cepa a ser caracterizada mediante la clasificación e identificación de tal cepa.
Description
COMBINACION DE GENES MARCADORES PARA LA CARACTERIZACION DE UNA CEPA DE LACTOBACILLUS SAKEI
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a una combinación de genes marcadores para caracterizar una cepa de Lactobacillus sakei . En particular la presente invención se refiere al uso de un patrón de la presencia o ausencia de genes marcadores en el genoma de la cepa a ser caracterizada para la clasificación e identificación de la cepa.
Antecedentes de la Invención
La carne y el pescado fresco son alimentos nutritivos pero altamente perecederos. Durante la producción y almacenamiento se exponen a contaminación microbiana inevitable del entorno del procesamiento. Tal contaminación puede incluir organismos y patógenos descompuestos . Por consiguiente es una prioridad para los procesadores de alimentos restringir el crecimiento de contaminantes de tal forma que no desarrollen niveles potencialmente dañinos. Uno de los métodos utilizados es el uso de bacterias seguras para reprimir el crecimiento de microorganismos que causan putrefacción y enfermedades. La bacteria Lactobacillus sakei del ácido láctico que lleva la carne muestra en este punto de vista propiedades excelentes. Ref 213430
L. sakei tiene la habilidad de sobrevivir y crecer en carne fresca, formando la población dominante cuando se aplican técnicas selectivas. Algunas cepas se utilizan ampliamente en Europa para la fabricación artesanal y a gran escala de salchichas fermentadas debido a sus propiedades conservadoras útiles. Pero también pueden utilizarse como bioconservadores de carne al evitar el crecimiento de bacterias indeseadas (Vermeiren et al. 2004 Int. J. Food Microbiol. 96:149-164).
Las cepas de L. sakei pueden desplegar una variabilidad importante en ensayos fenotípicos y durante mucho tiempo se han considerado difíciles de clasificar. Los estudios previos han descrito métodos para la clasificación de las cepas L. sakei. Los estudios que utilizan análisis numérico de patrones RAPD (Berthier and Ehrlich 1999 Int. J. Syst. Bacteriol . 49:997-1007) o patrones de contenido de proteína soluble SDS-PAGE han sugerido la división de las cepas en dos subgrupos, aunque débilmente definida y no comparable de acuerdo con los estudios.
De esta forma, la clasificación de las cepas L. sakei obtenida a través de estos métodos aún es insatisfactoria . Un objeto de la presente invención es proporcionar mejores métodos de clasificación, caracterización e identificación de las cepas L. sakei, que podrían utilizarse en particular para identificar las cepas
L. sakei presentes en los alimentos o en un coctel de bacterias utilizado como un bioconservador .
Los inventores de la presente invención a través de la presente identificaron, con base en un estudio in silico del genoma L. sakei y sobre validación experimental en una gran colección de cepas L. sakei, una combinación de marcadores para caracterizar y detectar estas cepas. En particular, se han aislado 29 genes marcadores, cuya combinación proporciona una forma óptima de caracterizar las cepas L. sakei.
Breve Descripción de la Invención
La presente invención de esta forma se refiere a la combinación de marcadores que permiten la caracterización de una cepa L. sakei, que comprende por lo menos dos genes marcadores seleccionados del grupo que consiste en LSA1641 (SEC ID N0:1 ), LSA1182 (SEC ID N0:2), LSA1183_C (SEC ID NO: 3), LSA0172 (SEC ID NO : 4 ) , LSA1731 (SEC ID NO : 5 ) , LSA0211 (SEC ID N0:6), LSA0212 (SEC ID NO : 7 ) , LSA1579 (SEC ID N0:8), LSA1580 (SEC ID NO:9), LSA0118 (SEC ID NO:10), LSA0529 (SEC
ID NO: 11 ), LSA0439 (SEC ID NO:12), LSA0572 (SEC ID NO:13), LSA0219b (SEC ID N0:14), LSA0564_a (SEC ID NO:15), LSA0564_b (SEC ID NO:16), LSA0564_C (SEC ID NO:17), FGP21 -0001 (SEC ID N0:18), sspA (SEC ID NO:19), spiA (SEC ID NO:20), FGP332-0001 (SEC ID N0:21 ), FGP332-0002 (SEC ID NO:22), FGP332-0007 (SEC
ID NO:23), FGP332-0008 (SEC ID N0:24), FGP332-0009 (SEC ID NO:25), FGP332-0010 (SEC ID NO:26), FGP332-0011 (SEC ID N0:27), FGP332-0012 (SEC ID NO:28), y FGP332-0013 (SEC ID NO:29) .
En una modalidad preferida, tal combinación comprende todos los genes marcadores de SEC ID NO : 1 a SEC ID NO: 29.
La presente invención también se refiere a un método para caracterizar una cepa L. sakei que comprende el paso que consiste en determinar la presencia o ausencia de por lo menos un gen marcador seleccionado del grupo que consiste en LSA1641 (SEC ID N0:1), LSA1182 (SEC ID N0:2), LSA1183_c (SEC ID NO: 3), LSA0172 (SEC ID N0:4), LSA1731 (SEC ID NO:5), LSA0211 (SEC ID NO : 6 ) , LSA0212 (SEC ID NO:7), LSA1579 (SEC ID NO:8), LSA1580 (SEC ID NO:9), LSA0118 (SEC ID
NO:10), LSA0529 (SEC ID NO:ll), LSA0439 (SEC ID NO:12), LSA0572 (SEC ID NO:13), LSA0219b (SEC ID NO : 14 ) , LSA0564_a (SEC ID NO:15), LSA0564_b (SEC ID NO:16), LSA0564_C (SEC ID NO:17), FGP21-0001 (SEC ID NO:18), sspA (SEC ID NO: 19), spiA (SEC ID NO:20), FGP332-0001 (SEC ID NO:21), FGP332-0002 (SEC
ID NO:22), FGP332-0007 (SEC ID NO:23), FGP332-0008 (SEC ID NO:24), FGP332-0009 (SEC ID NO:25), FGP332-0010 (SEC ID N0:26), FGP332-0011 (SEC ID NO:27), FGP332-0012 (SEC ID NO:28), y FGP332- 0013 (SEC ID NO:29) en tal cepa L. sakei.
En una modalidad preferida, se determina la
presencia o ausencia de todos los genes marcadores de SEC ID NO: 1 a SEC ID NO: 29.
Preferiblemente, la presencia o ausencia del gen(s) marcador se determina a través de amplificación, o a través de hibridación con sondas específicas del gen(s) marcador.
En una modalidad preferida, una clasificación de tal cepa L. sakei se lleva a cabo mediante el análisis del patrón de presencia o ausencia del gen(s) marcador anterior y calculando un índice Jacquard o Coeficiente Dice o cualquier matriz de distancia binaria con respecto a un grupo de cepas
L. sakei.
La presente invención también se refiere a un arreglo de ADN que comprende una combinación de marcadores como se define anteriormente.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para comparar por lo menos dos cepas L. sakei que comprenden los pasos que consisten de
a) determinar la presencia o ausencia de por lo menos un gen marcador seleccionado del grupo que consiste en LSA1641 (SEC ID N0:1), LSA1182 (SEC ID NO : 2 ) , LSA1183_C (SEC
ID NO: 3), LSA0172 (SEC ID NO : 4 ) , LSA1731 (SEC ID NO:5), LSA0211 (SEC ID N0:6), LSA0212 (SEC ID N0:7), LSA1579 (SEC ID N0:8), LSA1580 (SEC ID N0:9), LSA0118 (SEC ID NO:10), LSA0529 (SEC ID N0:11), LSA0439 (SEC ID N0:12), LSA0572 (SEC ID NO: 13), LSA0219b (SEC ID NO: 14), LSA0564 a (SEC ID NO: 15),
LSA0564_b (SEC ID NO 16) , LSA0564__c (SEC ID NO: 17) , FGP21- 0001 (SEC ID NO: 18) sspA (SEC ID NO: 19) , spiA (SEC ID
NO: 20) , FGP332-0001 (SEC ID NO : 21) , FGP332-0002 (SEC ID
NO: 22) , FGP332-0007 (SEC ID NO:23) , FGP332-0008 (SEC ID NO: 24) , FGP332-0009 (SEC ID NO : 25) , FGP332-0010 (SEC ID
NO: 26) , FGP332-0011 (SEC ID NO : 27 ) , FGP332-0012 (SEC ID
NO:28) , y FGP332-0013 (SEC ID NO : 29) , en una primera cepa L. sakei , y
b) determinar la presencia o ausencia de al menos un gen marcador en una segunda cepa L. sakei,
en donde, si el patrón de presencia o ausencia de al menos un gen marcador es diferente de la primera y segunda cepas L. sakei, entonces las cepas L. sakei son diferentes.
En una modalidad preferida, se determina la presencia o ausencia de todos los genes marcadores de SEC ID
NO: 1 a SEC ID NO: 29.
En una modalidad particular, el método anterior para comparar por lo menos dos cepas de L. sakei además comprende el paso de analizar el patrón de la presencia o ausencia de tales genes marcadores mediante el cálculo de un índice Jacquard, o un coeficiente Dice o cualquier matriz de distancia binaria.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para cuantificar una cepa L. sakei específica en una muestra que comprende los pasos que consisten de:
a) identificar y/o caracterizar las cepas L. sakei presentes en tal muestra a través de un método como se define anteriormente ,
b) determinar el gen(s) marcador el cual está diferentemente presente en la cepa L. con respecto a otras cepas presentes en tal muestra, y
c) amplificar el gen(s) a través de PC cuantitativo.
Breve Descripción de las Figuras
La Figura 1 muestra la diversidad genómica de L. sakei. Distribución de 60 marcadores genéticos entre 73 aislados de L. sakei y los aislados de L. curvatus tomados como exogrupo de referencia. Los genes se ordenan en la izquierda de la tabla por su posición en el cromosoma 23K, es decir, LSA0088, LSA0118, LSA0157, LSA0165, LSA0172, LSA0178, LSA0212, LSA0216, LSA0217, LSA0218, LSA0219_b, LSA0306, LSA0439, LSA509, LSA510, LSA0530, LSA0564_ac, LSA0565, LSA0567, LSA0572, LSA724, LSA727, LSA1006, LSA1182/3, LSA1220, LSA1222, LSA1227, LSA1232, LSA1283, LSA1509,
LSA1510, LSA1512, LSA1510_a, LSA1510_g, LSA1572, LSA1579/80, LSA1581, LSA1584, LSA1641, LSA1640, LSA1640, LSA1720, LSA1724, LSA1730, LSA1731, LSA1806, LSA1809, LSA1874, sspT, sspA, FGP21-0001, DrsA, FGP332-0001, FGP332-0002, FGP332-0003, FGP332-0006, FGP332-0005, lacC, lacG. Colores: blanco,
ausente: negro, presente. El dendograma muestra estimados de relaciones genómicas de las cepas que se construyeron mediante análisis jerárquico de enlace completo. La escala representa la distancia entre cada nodo. Un coeficiente de 1 denotará una independencia completa, y cero indicará identidad absoluta. Los valores P en el nodo indican la confianza del agrupamiento a través del remuestreo de reemplazo multi-escala utilizando el programa PvCLUST. Las cepas se agruparon sobre las bases de ramificaciones en brotes con confianza por arriba de 90% y con una distancia máxima de 0.5 entre los aislados. Los grupos principales de cepas se indican con su porcentaje respectivo de la población total. Las cepas del tipo subespecie y la cepa L. sakei 23K de referencia se indican por un rectángulo vertical.
En las Figuras 2A-2B la Figura 2A es una distribución de histograma del tamaño del genoma entre los aislados L. sakei. Las cepas se representan por barras de alfombrilla por arriba del eje del tamaño del genoma. La barras del histograma representan el número de cepas dentro de una ventana de tamaño de genoma de 30 kb (desviación estándar promedio de las mediciones PFGE) . La distribución de la probabilidad Gaussiana del tamaño del genoma en la población (densidad estimada en el eje derecho) se muestra a través de una línea uniforme gris. Las cepas del tipo subespecie y la cepa de 23K se indican por asteriscos. La
Figura 2B es una gráfica de puntos y cuadros que muestra la distribución del tamaño del genoma de los aislados L. sakei de acuerdo con su agrupamiento genotípico. La línea negra horizontal muestra el tamaño del genoma promedio de 2,020 kb. Los brotes E y F muestran unas cuantas variaciones entre ellos cuando se agrupan juntos para el análisis. Para claridad, las cepas no clasificadas 332, LTH2070 y 21 se agruparon con el brote H.
La Figura 3 es un dendograma que muestra los estimados de las relaciones genómicas de las cepas que se construyeron por análisis jerárquico de enlace completo. La escala representa la distancia en cada nodo. Las cepas se agruparon sobre la base de ramificaciones de brotes con confianza por arriba de 90% y con una distancia máxima de 0.5 entre los aislados. En la matriz el contenido del gen, un color negro indica la presencia del gen (1) y un color blanco indica la ausencia del gen (0) . Los genes en la izquierda se ordenaron como en la Tablas 1. Más específicamente, las diferentes líneas de la matriz corresponden a los siguientes marcadores de gen: 1) LSA1641, 2) LSA1182 y LSA1183_c, 3) LSA0172, 4) LSA1731, 5) LSA0211 y LSA0212, 6) LSA1579 y LSA1580, 7) LSA0118, 8) LSA0529, 9) LSA0439, 10) LSA0572, 11) LSA0219b, 12) LSA0564_a, LSA0564_b y LSA0564_c, 13) FGP21-0001, 14) sspA y spiA, 15) FGP332-0001, 16) FGP332-0002, 17) FGP332-007, 18) FGP332-0008, 18) FGP332-0009, 19) FGP332-
0010, 20) FGP332-0011, 21) FGP332-0011, 22) FGP332-0012, 23) FGP332-0013.
Descripción Detallada de la Invención
Con el fin de identificar genes marcadores que podrían utilizarse para caracterizar específicamente una cepa L. sakei comparada con otras cepas L. sakei, la invención primero identificó islas genómicas variables en el genoma de L. sakei 23K que probablemente contenían genes variables que despliegan una diversidad de acuerdo con las especies (paso descrito en el Ejemplo 1) . Después, se llevó a cabo una clasificación de las cepas L. sakei de acuerdo con la presencia o ausencia de los genes de las islas genómicas previamente identificadas y se comparó la clasificación así obtenida con la obtenida utilizando varias otras técnicas de tipificación (paso descrito en el Ejemplo 2) . Finalmente, se identificó una combinación óptima de un número mínimo de genes de las islas genómicas que podrían utilizarse para obtener una clasificación confiable de la cepas L. sakei comparada con la obtenida con un alto número de genes variables (paso descrito en el Ejemplo 3) .
Por consiguiente, de acuerdo con la invención, una combinación de marcadores que permiten la caracterización de una cepa L. sakei comprende por lo menos dos genes marcadores seleccionados del grupo que consiste en LSA1641 (SEC ID
N0:1), LSA1182 (SEC ID NO : 2 ) , LSA1183_C (SEC ID NO : 3 ) , LSA0172 (SEC ID NO:4), LSA1731 (SEC ID NO : 5 ) , LSA0211 (SEC ID NO:6), LSA0212 (SEC ID NO:7), LSA1579 (SEC ID NO:8), LSA1580
(SEC ID NO:9), LSA0118 (SEC ID NO:10), LSA0529 (SEC ID NO:ll), LSA0439 (SEC ID NO:12), LSA0572 (SEC ID NO:13), LSA0219b (SEC ID NO:14), LSA0564_a (SEC ID NO:15), LSA0564_b
(SEC ID NO-.16), LSA0564_c (SEC ID NO:17), FGP21 -0001 (SEC ID NO:18), sspA (SEC ID NO:19), spiA (SEC ID NO:20), FGP332-0001
(SEC ID NO:21 ), FGP332-0002 (SEC ID NO:22), FGP332-0007 (SEC ID NO:23), FGP332-0008 (SEC ID NO:24), FGP332-0009 (SEC ID NO:25), FGP332-0010 (SEC ID NO:26), FGP332-0011 (SEC ID NO:27), FGP332-0012 (SEC ID NO:28), y FGP332-0013 (SEC ID NO: 29) .
Como se utiliza en la presente, el término «marcador» se refiere a cualquier medio biológico, químico físico que permite la identificación de la presencia, y posiblemente la cuantificación de la expresión de un gen objetivo en una cepa bacteriana. Tales marcadores son bien conocidos por el experto en la técnica. Ventajosamente, los marcadores de acuerdo con la invención son marcadores de gen.
La Tabla 1 da la correspondencia entre la etiqueta del sitio antes referenciado y la secuencia de genes marcadores y el nombre de los genes.
Tabla 1 : Correspondencia entre la etiqueta del sitio de un nombre de los marcadores del gen.
SEC ID NO Etiqueta del Nombre del Gen
Sitio
1 LSA1641 2-epimerasa (N- acetilmanosamina-6-fosfato 2 epimerasa) ) de N- acetilmanosamina- 6 - fosfato
2 LSA1182 Citocromo Putativo P450 (gen con marco desplazado auténtico) parte C-terminal
3 LSA1183_C Citocromo Putativo P450 (gen con marco desplazado auténtico) parte C-terminal
4 LSA0172 Proteína de superficie celular de tipo CscC con un dominio de tipo Invasina/Mucina y un dominio WxL
5 LSA1731 Proteína de superficie celular de tipo CscC con un dominio de tipo Hemaglutinina y un dominio WxL
6 LSA0211 Proteína de superficie celular de tipo CscC con un dominio de tipo adhesión y un dominio WxL (gen con marco desplazado auténtico) parte N-terminal
7 LSA0212 Proteína de superficie celular de tipo CscC con un dominio de tipo adhesión y un dominio WxL (gen con marco desplazado auténtico) parte C-terminal
SEC ID NO Etiqueta del Nombre del Gen
Sitio
8 LSA1579 Complejo putativo de exportación de proteína de ácido teicoico putativo/ polisacárido
9 LSA1580 Complejo putativo de exportación de proteína de ácido teicoico putativo/ polisacárido
10 LSA01 18 Proteína hipotética (proteína de unión a colágeno de superficie celular putativa
11 LSA0529 Regular de transcripción de tipo MarR, regulador de tensión de peróxido putativo OhrR
12 LSA0439 Lipasa extracelular hipotética/precursor de esterasa
13 LSA0572 Treonina deaminasa (treonina amoníaco- liasa)
14 LSA0219_b Proteína de transporte de cianato putativo
15 LSA0564_a Pequeño péptido hipotético
16 LSA0564_b Pequeño péptido hipotético
17 LSA0564_c Proteína inmunitaria de bacteriocina putativa
18 FGP21-0001 Proteína inmunitaria de bacteriocina putativa
SEC ID NO Etiqueta del Nombre del Gen
Sitio
19 sspA Precursor de sacacina P de bacteriocinas (Sacacina 674)
20 spiA Proteína inmunitaria de
Sakacina P
21 FGP332-0001 6-fosfo-beta-glucosidasa
putativa
22 FGP332-0002 Proteína de superficie celular de tipo CscC con dominio de tipo adhesión bacteriano y dominio WxL
23 FGP332-0007 Autotransportador putativo
24 FGP332-0008 Proteína hipotética
25 FGP332-0009 Proteína hipotética
26 FGP332-0010 Proteína hipotética
27 FGP332-0011 Regulador de transcripción putativo, familia LysR
28 FGP332-0012 Quinina oxidoreductasa putativa
29 FGP332-0013 Asparaginas sintasa putativas
La presencia o ausencia de uno o una combinación de alguno de estos genes puede utilizarse para discriminar una cepa L. sakei particular de otra cepa cercanamente relacionada
Como se describe en el Ejemplo 3, los inventores han demostrado que estos 29 genes marcadores fueron óptimos para caracterizar una cepa L. sakei entre otras
cepas L. sakei. Por consiguiente, en una modalidad preferida, tal combinación consiste en los genes marcadores de SEC ID NO: 1 a SEC ID NO: 29.
Más precisamente, la siguiente correspondencia entre el patrón de presencia o ausencia de los 29 genes marcadores definidos anteriormente y 75 cepas L. sakei se han obtenido, como se ilustra en la Figura 3:
- en la cepa DSM20019, el gen marcador SEC ID NO: 21 está presente, y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa CTC494, el gen marcador SEC ID NO: 21 está presente, y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa AG 46, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 11,
SEC ID NO: 13, SEC ID NO : 14, y SEC ID NO: 24 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 156, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16,
SEC ID NO: 17 y SEC ID NO: 24 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa AGR51, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 21 y SEC ID NO: 24 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa MF1048, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa MF2092, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 195, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO : 21, y SEC ID NO: 25 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa CIP105422, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO; 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 27 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa CTC429, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22,
SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa LTH673, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO:
11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 26 y SEC ID NO: 27 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa 14, los genes marcadores SEC ID NO: 1,
SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 18, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID N: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID
NO: 26, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa LV52, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 19,
SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 26 y SEC ID NO: 27 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa LV59, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5,
SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 19, SEC ID NO : 20, SEC ID NO : 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa LV92, los genes marcadores SEC ID NO:
1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa CRL1467, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24 y
SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa CTC335, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15,
SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa SF842, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 6,
SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO : 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa SF770, los genes marcadores SEC ID NO:
1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO : 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa SF771, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO : 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa CTC287, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 4, SEC ID NO : 6, SEC ID NO : 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16,
SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa CTC041, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO : 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11,
SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa CTC427, los genes marcadores SEC ID
NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa YME344, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO : 7, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15,
SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa V553, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC
ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 17 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa LV34, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5,
SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID N: 15, SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 17 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 23K, los genes marcadores SEC ID NO:
1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO : 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 17 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 72, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO : 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 17 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 504, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO : 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC
ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa TISTR911, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO:
5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa YM 540, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23 y SEC ID NO: 24 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 300, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO : 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC
ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21 y SEC ID NO: 23 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa LV5 , los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 6,
SEC ID NO: 7, SEC ID NO : 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21 y SEC ID NO: 23 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa LTH2070, los genes marcadores SEC ID
NO: 1, SEC ID NO: 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa JG3 , los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa LTH1764, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO : 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15,
SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa CTC6626, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO : 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO:
6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa SF841, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO:
18, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa SF843, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO : 8, SEC
ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa CTC163, los genes marcadores SEC ID NO:
1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa LTH5590, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24,
SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa CTC014, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO : 8, SEC ID NO: 9,
SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 160K, los genes marcadores SEC ID NO:
1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27 y SEC
ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa AGR48, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO : 7, SEC ID NO : 8, SEC ID NO: 9, SEC
ID NO: 10, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes. - en la cepa LTH5589, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO:
5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO : 7, SEC ID NO : 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa 112, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC
ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa YMH243, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO : 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO:
5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO : 7, SEC ID NO : 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 29 están presentes
y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 134, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24,
SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa YMW557, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12,
SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 27, SEC ID NO : 28 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa L110, los genes marcadores SEC ID NO:
1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa LTH5588, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO: 4., SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO:
17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa MF2091, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO:
5, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa MF2089, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22,
SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa MF2090, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO : 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO:
5, SEC ID NO: 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO : 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 745, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC
ID NO: 24, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa 710, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13,
SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO : 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 205, los genes marcadores SEC ID NO:
1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO : 27 y SEC ID NO : 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa MF2088, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16,
SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa CTC494, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO:
5, SEC ID NO: 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 331, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 22, SEC
ID NO: 23, SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 27 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa AGR53, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13,
SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 27 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 495, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 21, SEC
ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa Lb706, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24,
SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa LV21, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO : 4, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24,
SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa LTH677, los genes marcadores SEC ID NO: 5, SEC ID NO : 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO:
16, SEC ID N: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 29 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 332, los genes marcadores SEC ID NO:
1, SEC ID NO: 4, SEC ID NO : 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID N: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 29
están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 33, los genes marcadores SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa 64, los genes marcadores SEC ID NO : 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa CTC6469, los genes marcadores SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 27 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa LTH5728, los genes marcadores SEC ID NO: 5, SEC ID NO : 6, SEC ID NO : 7, SEC ID NO : 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO:
24 y SEC ID NO: 27 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa 21, los genes marcadores SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3, SEC ID NO : 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 18, SEC ID
NO: 22 y SEC ID NO: 24 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
- en la cepa TISTR890, los genes marcadores SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO : 7, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 28 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa ATCC15521, los genes marcadores SEC ID NO: 6, SEC ID NO : 7, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 21 y SEC ID NO: 24 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes.
- en la cepa LTH675, los genes marcadores SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 21 y SEC ID NO: 23 están presentes y los otros genes marcadores están ausentes .
La presente invención también se refiere a un método para caracterizar una cepa L. sakei que comprende el paso que consiste en determinar la presencia o ausencia de por lo menos un gen marcador seleccionado del grupo que consiste en LSA1641 (SEC ID NO:l), LSA1182 (SEC ID NO:2), LSA1183_c (SEC ID NO: 3), LSA0172 (SEC ID NO : 4 ) , LSA1731 (SEC
ID NO:5), LSA0211 (SEC ID NO : 6 ) , LSA0212 (SEC ID NO:7), LSA1579 (SEC ID NO : 8 ) , LSA1580 (SEC ID NO:9), LSA0118 (SEC ID NO:10), LSA0529 (SEC ID NO:ll), LSA0439 (SEC ID NO:12), LSA0572 (SEC ID NO:13), LSA0219b (SEC ID NO : 14 ) , LSA0564_a (SEC ID NO:15), LSA0564 b (SEC ID NO:16), LSA0564 c (SEC ID
N0:17), FGP21-0001 (SEC ID N0:18), sspA (SEC ID N0:19), spiA (SEC ID N0:20), FGP332-0001 (SEC ID N0:21 ), FGP332-0002 (SEC ID NO:22), FGP332-0007 (SEC ID NO:23), FGP332-0008 (SEC ID N0:24), FGP332-0009 (SEC ID NO:25), FGP332-0010 (SEC ID NO-.26), FGP332-0011 (SEC ID NO:27), FGP332-0012 (SEC ID NO:28), y FGP332- 0013 (SEC ID NO:29) en tal cepa L. sakei .
Numerosos métodos que permiten la determinación de la presencia o ausencia de un gen en una cepa bacteriana son bien conocidos por el experto en la técnica. Estos métodos incluyen, sin estar limitados, al uso de un anticuerpo que específicamente se une a un antígeno que está constituido por el producto de expresión del gen(s) marcador, la detección de AR m, ADNc o un polipéptido de tal gen(s) marcador, o uno de sus fragmentos. Preferiblemente, la presencia o ausencia de tal gen(s) marcador se determina de acuerdo con la invención a través de amplificación, o a través de hibridación con sondas de ADN específicas del gen(s) marcador.
Más preferiblemente, se determina la presencia o ausencia de todos los genes marcadores SEC ID NO: 1 a SEC ID NO: 29.
En una modalidad particular, la combinación de sondas de estos genes marcadores se ensambla en el mismo soporte, preferiblemente un soporte estandarizado. Estos soportes son conocidos por el experto en la técnica. Su tamaño puede variar de acuerdo con los aparatos utilizados
para detectar la presencia o ausencia de tal gen(s) marcador.
Ventajosamente, la combinación de los genes marcadores de acuerdo con la invención es en la forma de una matriz de ADN, que comprende un soporte sobre el cual los fragmentos de ácido nucleico que probablemente hibridan a los genes objetivo se desplazan, preferiblemente en una forma estandarizada. El tamaño de tales soportes varía de acuerdo con los métodos de preparación y detección utilizados. Tales pequeños soportes también son referidos como un arreglo de ADN.
Otro aspecto de la presente invención de esta forma se refiere a un arreglo de AND que comprende una combinación de marcadores como se definió anteriormente.
Como se utiliza en la presente, el término "arreglo de ADN" se refiere a un grupo de genes, fragmentos de genes, oligonucleótidos depositados en un soporte (portaobjetos de vidrio, membrana de nylon) con una alta densidad. Numerosas publicaciones científicas acerca de la preparación y el uso de arreglos de ADN están disponibles.
En otro aspecto de la invención, una clasificación de tal cepa L. sakei se lleva a cabo mediante el análisis del patrón de presencia o ausencia del gen(s) marcador anterior y calculando un índice Jacquard o coeficiente Dice o cualquier matriz de distancia binaria con respecto al grupo de cepas L. sakei de referencia. El índice Jacquard puede calcularse como
se describe en Jacquard and Feingold, 1974 (Jacquard and Feingold, 1974 Theor. Popul . Biol . 6:21-34). El coeficiente Dice puede calcularse como se describe por Van Rijsbergen, 1979 (Van Rijsbergen, 1979, Information Retrieval, London: Butterworths) .
Como se utiliza en la presente, el término "clasificación" se refiere a la organización de las cepas en diferentes subfamilias de acuerdo con su patrón genético. En particular, las cepas que despliegan el mismo patrón de genes pertenecen a la misma subfamilia.
Como se utiliza en la presente, el término "cepas L. sakei de referencia" se refiere a un grupo o colección de cepas L. sakei en las cuales la presencia o ausencia de tal gen(s) marcador ya ha sido determinado de acuerdo con la invención y a la cual tal cepa L. sakei ha ser clasificada se compara. Principalmente las cepas L. sakei de referencia se utilizaron para constituir subfamilias o brote de cepas L. sakei en donde la cepa L. sakei ha ser clasificada pretende colocarse .
Preferiblemente, el grupo de referencia de cepas L. sakei de acuerdo con la invención comprende las cepas descritas en la Tabla 2. Sin embargo, se pueden utilizar otras cepas L. sakei conocidas como cepas de referencia, y es bien conocido por un experto en la técnica.
Preferiblemente, tales subfamilias de cepas L.
sakei constituidas por las cepas L. sakei de referencia son como se definen en el Ejemplo 3. Sin embargo, un experto en la técnica sabrá que agrupamiento puede evolucionar de acuerdo con la identificación de nuevas cepas. Por consiguiente, el uso del método de acuerdo con la presente invención para clasificar cepas L. sakei en clusters que no están específicamente descritas en la presente están bajo el alcance de la presente invención.
Como se utiliza en la presente, el término "índice Jacquard" es una estadística utilizada para comparar la similitud y diversidad de grupos de muestra. El índice Jacquard se define como el tamaño de la intersección dividido por el tamaño de la unión de los grupos de muestras, de acuerdo con la siguiente fórmula: J(A,B)=|A ? B|/|A U B| .
Preferiblemente, el cálculo del índice Jacquard de acuerdo con la invención se lleva a cabo a través del software R (R Development Core Team, 2006 R: A language y environment for statistical computing. Vienna, Austria. R Foundation for Statistical Computing) que eventualmente proporciona un árbol de agrupamiento que despliega la ubicación de la cepa L. sakei entre las diferentes subfamilias de las cepas L. sakei de referencia.
Como se utiliza en la presente el término "coeficiente Dice" es una medida de similitud relacionada con el índice Jacquard. El coeficiente Dice es similar al índice
Jacquard pero da dos veces el peso de los convenios de acuerdo con las fórmulas s=2)= |? ? ?|/(|?| + |B|) .
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para comparar por lo menos dos cepas L. sakei que comprenden los pasos que consisten de:
a) determinar la presencia o ausencia de por lo menos un gen marcador seleccionado del grupo que consiste en LSA1641 (SEC ID N0:1), LSA1182 (SEC ID NO : 2 ) , LSA1183_C (SEC ID NO: 3), LSA0172 (SEC ID NO : 4 ) , LSA1731 (SEC ID N0:5), LSA0211 (SEC ID N0:6), LSA0212 (SEC ID N0:7), LSA1579 (SEC ID
NO:8), LSA1580 (SEC ID NO : 9 ) , LSA0118 (SEC ID NO:10), LSA0529 (SEC ID NO:ll), LSA0439 (SEC ID N0:12), LSA0572 (SEC ID NO:13), LSA0219b (SEC ID N0:14), LSA0564_a (SEC ID N0:15), LSA0564_b (SEC ID N0:16), LSA0564_C (SEC ID NO:17), FGP21-0001 (SEC ID NO:18), sspA (SEC ID NO:19), spiA (SEC ID
NO:20), FGP332- 0001 (SEC ID NO:21 ), FGP332-0002 (SEC ID NO:22), FGP332-0007 (SEC ID NO:23), FGP332-0008 (SEC ID NO:24), FGP332-0009 (SEC ID NO:25), FGP332-0010 (SEC ID NO:26), FGP332-0011 (SEC ID NO:27), FGP332-0012 (SEC ID NO:28), y FGP332-0013 (SEC ID NO:29), en una primera cepa L. sakei, y
b) determinar la presencia o ausencia de tal al menos un gen marcador en una segunda cepa L. sakei, como se definió anteriormente
en donde, si el patrón de presencia o ausencia de
tal al menos un gen marcador es diferente de la primera y segunda cepas L. sakei, entonces las cepas L. sakei son diferentes. Preferiblemente, en el método anterior para comparar por lo menos dos cepas L. sakei , la presencia o ausencia de todos los genes marcadores de SEC ID N0:1 a SEC
ID NO: 29 se determina.
En particular, el método anterior para comparar por lo menos dos cepas L. sakei además comprende el paso de analizar el patrón de la presencia o ausencia de tales genes marcadores mediante el cálculo de un índice Jacquard, un coeficiente Dice o cualquier matriz de distancia binaria como se define anteriormente.
Los métodos definidos anteriormente de acuerdo con la presente invención son de particular interés para identificar cepas L. sakei en un coctel de cepas que puede utilizarse como bioconservador de carne y/o pescado. Otro aspecto de la caracterización tal como el coctel de cepas es cuantificar cada cepa presente en tal coctel.
Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para cuantificar una cepa L. sakei específica en una muestra, que comprende los pasos que consisten de:
a) identificar y/o caracterizar las cepas L. sakei presentes en tal muestra a través de un método como se define anteriormente,
b) determinar el gen(s) marcador que está diferentemente presente en la cepa L. sakei específica con respecto a otras cepas presentes en tal muestra, y
c) amplificar el gen(s) a través de PCR cuantitativo.
Los métodos de PCR cuantitativas son bien conocidas en la técnica e incluyen PCR en tiempo real, PCR competitiva y PCR radioactiva.
Como se utiliza en la presente el término "muestra" abarca muestras en donde una o varias cepa(s) L. sakei están presentes, opcionalmente en combinación con otras especies bacterianas .
Por consiguiente, el método anterior para cuantificar una cepa L . sakei específica en una muestra puede incluir un paso anterior de individualización de la cepa de otra cepa presentes en la muestra.
Los siguientes ejemplos además describen la forma en las cuales los inventores de la presentes han identificado tales genes marcadores. Estos ejemplos son ilustrativos, sin estar limitados, por los métodos definidos anteriormente.
EJEMPLOS
Ejemplo 1; Detección y análisis de islas genómicas del cromosoma de 23K de Lactobacillus sakei
Este ejemplo describe la identificación de los inventores de las islas genómica en el cromosoma de 23K de L.
sakei, que lleva los genes utilizados como marcadores en la presente invención.
Se admite que los cromosomas bacterianos se dividen en dos grupos de genes: el grupo de genes centrales, que comprende genes que persistieron en las especies lo suficiente para mostrar el mantenimiento entre las especies, y el grupo de genes flexibles, que comprende genes variables y auxiliares generalmente agrupados en islas y por lo general adquiridos por la transferencia del gen horizontal (HGT) .
El objeto del presente estudio por consiguiente es identificar las islas genómica variables putativas en el genoma de L. sakei 23K y caracterizar las funciones celulares, estimadas como ecológicamente importantes, que podrían atribuirse a HGT.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Análisis de utilización de codón
La identificación del uso del codón de genes altamente expresados se investigó mediante el uso de CAI introducido por Sharp y eng-Hsiung (Sharp y eng-Hsiung
1987 Nucleic Acids Res. 15:1281 -1295). Las frecuencias de codón utilizadas como una referencia para el cálculo de CAI se estimaron en los genes que codifican proteínas ribosómicas y aminoacil -ARNt sintetasas encontradas en el genoma L. sakei 23K. En segundo lugar, el agrupamiento sin
supervisión de las secuencias de codificación (CDS) se llevó a cabo sobre la base de su uso de los codones sinónimos con un algoritmo diseñado por los inventores. Este método se basa en el uso de una mezcla de diferentes clases de genes. En resumen, una vez que el número de clases de genes se define por el usuario, el modelo se adapta a las secuencias utilizando un algoritmo repetitivo y el agrupamiento final asocia cada CDS con su clase más probable. En la presente sigue una descripción más formal de los modelos mixtos y del procedimiento de agrupamiento: dejar que n denote el número de clase de utilización de codón, o componente, del modelo mixto. Cada clase u se caracteriza por su incidencia en la mezcla gu y un grupo de probabilidades (fu,i,j) , l=i=20, l=j=Si en donde fu, i,j corresponde a la probabilidad de utilizar el
jíavo para el aminoácido i y s¿ denota el número del codón sinónimo para el aminoácido i. La máxima probabilidad se estima de los parámetros del modelo qu y fUli,j que se obtienen utilizando el algoritmo de Expectación-Maximización. Finalmente, el agrupamiento final se obtiene después de calcular la probabilidad de cada clase u para cada CDS k con la fórmula de Bayes: Pk( ) es proporcional a en donde Pk(u) denota la probabilidad de que CDS k pertenezca a la clase u y c(k,i,j) represente las ocurrencias del codón sinónimo javo para el aminoácido i en
CDS k. Una presentación detallada de la estructura del modelo mixto puede encontrarse en McLachlan y Peel (McLachlan y Peel 2000 In Finite mixture models. New York: Wiley- lnterscience ) . Finalmente, se realizó un análisis de correspondencia para aceptar el despliegue gráfico de la nube de las CDS en una forma similar como se describe en Medigue et al., 1991 (Medigue et al., 1991 J. Mol. Biol . 222:851 -856) . Las CDS cortas (menos de 300 bps - 100 aa de longitud) y los dos codones de cisteína se omitieron del análisis de correspondencia ya que no aceptan una estimación precisa de las frecuencias relativas del codón asociadas. Además, los estimados de la frecuencia del codón se facilitaron mediante la adición de un seudo-conteo de 1 para todos los conteos .
Todos los análisis se llevaron a cabo con una escritura Perl ad-hoc denominada CODONUSAGE . L responsable de calcular el contenido A+T- y CAI y también para llamar a ambos programas C++ que se llevan a cabo el nuevo análisis del brote descrito anteriormente y una escritura R que lleva a cabo el análisis de correspondencia con la función CA del paquete MULTIV (R Development Core Team 2006 R: A language y environment for statistical computing. Vienne, Austria: R Foundation for Statistical Computing) . Todos los programas pueden descargarse en URL: http : //genome . jouy . inra. fr/~pnicolas/codonmixture/ .
RESULTADOS
El uso del codón L. sakei se conformó por replicación de cromosoma y eficiencia de la traducción.
Con el fin de detectar posibles eventos HGT, se utilizó un arreglo de mediciones estadísticas para caracterizar las tendencias de composición del grupo del gen de 23K L. sakei incluyendo el análisis del contenido G+C, los cálculos del índice de Adaptación de Codón (CAI) , el análisis de correspondencia del uso del codón sinónimo y el agrupamiento sin superviso del grupo del gel con un nuevo método con base en la modelación de la mezcla del uso de los codones sinónimos como se describe anteriormente.
El agrupamiento sin supervisión del grupo del gen completo aceptó identificar cuatro grupos de genes. Los genes del primero y segundo grupos representan el 74.5% del grupo de genes total. Estos están preferencialmente localizados en la estructura de cadena principal de la replicación del cromosoma (93%) y se distinguen por su nivel de expresión como medida con el CAI (que refleja el nivel de expresión de la proteína) : los genes del grupo 1 tienen valores CAI bajos o promedio mientras los genes del grupo 2 muestran altos niveles .
Este último grupo comprende genes típicos altamente expresados tales como las proteínas de tipo capa S, chaperones de tipo Cpl y enzimas metabólicamente importantes
altamente expresadas tales como las de la trayectoria glicolítica. El grupo 3 abarca 18.5% del grupo del gen total y contiene en su mayor parte genes localizados en la estructura sub-desarrollada (87%) .
Por consiguiente, tres grupos de genes cuyo uso de codón está fuertemente moldeado por su orientación con relación a la replicación del cromosoma y por su nivel putativo de eficiencia en traducción fueron capaces de ser revelados .
De forma más importante, los modelos aceptaron la demarcación del cuatro grupo de genes (7% del grupo de genes total) con contenido rico en A+T atípico y un bajo valor CAI. El patrón de composición de este cuarto grupo puede haber sido moldeado por HGT como genes con bajo contenido G+C que se han descrito como relacionados con
HGT en muchas bacterias ( edigue al., 1991 J. Mol. Biol . 222 : 851 -856) .
Los genes de 23K L. sakei ricos en A+T atípicos se agruparon en islas genómicas
Para verificar el origen relacionado de este cuarto grupo de genes, su contexto genético correspondiente en el cromosoma además se buscó con más detalles. Actualmente primero se observó que la mayor parte de las CDS atípicas se agruparon para formar grandes islas de genes funcionalmente relacionados por lo general
localizados cerca de los elementos móviles, una característica clásica de brotes genéticos horizontalmente transferidos (Ochman et al., 2000 Nature 405:299-304) . Además, los genes con uso de codón atípico por lo general codifican productos homólogos a proteínas solamente encontradas en el género bacteriano filogenético distante.
A partir de estos datos, los inventores demostraron que el grupo de genes HGT putativos de esta forma estuvo comprendido de 27 islas genómicas (de 1.6 a 28 kb con un tamaño promedio de 7.3 kb) y de 49 genes individuales, que cubren . juntos 235 kb (12.5%) del cromosoma de 23K L. sakei. También se asumió que las 27 islas genómicas pueden pertenecer al genoma de 23K L. sakei dispensable.
Ejemplo 2; Diversidad de intra- especies genómicas y estructura de la población natural de la bacteria de ácido láctico Lactobacillus sakei que lleva la carne
Este ejemplo describe la clasificación, de los inventores, de las cepas L. sakei que utilizan genes marcadores.
En este estudio, los inventores han realizado una combinación de varios técnicas de clasificación de tipos que incluyen mapeo del genoma por electroforesis en gel de pulso-campo, detección a base de PCR de los marcadores genéticos tomados de un grupo de genes variables
identificados por los inventores (ver Ejemplo 1) para agrupamiento jerárquico de las cepas, y finalmente, una comparación proteómica para evaluar su diversidad fenotípica respectiva. Los aislados de diversas colecciones de laboratorio correspondientes a varias ubicaciones geográficas y a varias fuentes de productos relacionados con carne o pescado se han seleccionado específicamente, con base en la esperanza de que estas cepas no domesticadas representen la diversidad de la población L. sakei natural.
Estos resultados proveen una estructura con base en el genoma integrado para clasificar el repertorio de subtipos moleculares de aislados de L. sakei.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Cepas bacterianas y condiciones de cultivo
Todas las cepas L. sakei y L. curvatus utilizadas en este estudio se describen en la Tabla 2. Las cepas bacterianas se cultivaron en la fase exponencial midlog en medio de caldo MRS (Difco) (De man et al., 1960
J. Appl. Bacteriol. 23:133-135) a 30°C. Para los resultados proteómicos, las cepas bacterianas se cultivaron a 30°C en medio MCD químicamente definido (Lauret et al., 1996 Appl Environ Microbiol. 62:1922-1927) complementado con 0.5% de glucosa.
Técnicas de biología molecular
La hibridación represiva de la capa subyacente (HSS) de L. sakei 332F se llevó a cabo como sigue: para preparar la cepa de ensayo 332F, curada de su plásmido endógeno pRV500 (Alpert et al.,, 2003 Appl Environ Microbiol . 69:5574-5584), L. sakei 332 progenitor se electroporó por el método de Berthier et al., (Berthier et al., 1996 Appl. Envir. Microbiol. 62:3037-3041) con el plásmido pRV566 que lleva resistencia a eritromicina y se deriva del replicón pRV500 (Alpert et al., 2003 Appl. Envir. Microbiol. 69:5574-5584) .
Un clon resistente a eritromicina además se cultivó por 200 generaciones en caldo MRS sin antibiótico a 30°C. Se colocaron en placas varias diluciones del último cultivo en agar MRS. La réplica de la colocación en placas de 200 clones en agar MRS con o sin eritromicina (5 pg/ml) aceptó seleccionar un clon sensible a eritromicina. La pérdida del plásmido pR566 se verificó por tinción Southern (ECL™ marcación de ácido nucleico directa, Amersham Biosciences) utilizando una sonda específica del gen repA. La cepa correspondiente se denominó 332F. —— —
El experimento HSS se llevó a cabo con el kit de sustracción de genoma bacteriano Clontech PCR-selected™ de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y utilizando
L. sakei de 23K como el conductor. Esta técnica conduce a la identificación de 8 nuevos genes ausentes de L . sakei 23K. El gen FGP21-0001 de L. sakei 21 se identificó después de la secuenciacion de un producto PCR (LSA0565 aLSA566) dando un tamaño inesperado y revelando un nuevo tipo de gen que codifica una proteína de tipo inmunitaria a bacteriocina .
Tabla 2: Cepas L. sakei y L. curvatus utilizadas en este estudio.
Colección Número Nombres Aislado de Referencia
Laboratorio - País de (sinónimos)
cepas
331, 495, 504, Carne de Montel et al. ,
532, 710, 741 puerco J. Appl empacada al Bacteriol
vacio 70 : 469-472
L110 Iniciador Champomier et para al., 1987 Ann salchichas Insfc Pasteur secas Microbiol .
fermentadas 138 : 751-758 estilo
Francés
5 SF770, SF771, Salmón Joffraud et al.,
SF841, SF842, ahumado 2006, Int. J.
SF843 Microbiol .
112 : 51-61
IRTA-Monells- ESPAÑA 10 CTC014, CTC041, Varias Hugas et al . , eat Technology CTC163, CTC287, salchichas 1995 J. Appl.
Center CTC335, CTC427, secas Bacteriol .
CTC429, CTC494, fermentadas 79:332-330
CTC6469, CTC6626 estilo Hugas et al. ,
Español 1993 Int. J.
( incluyendo Food Microbiol .
Chorizo) 18: 107-113
ARC - Langford, 6 LV5, LV21, LV92 Carne de Sha et al. ,
Bristol - REINO puerco 1984 J. Appl.
UNIDO empacada al Bacteriol 56:25- Meat Research vacio-tocino 40
Institute LV52, KV59 Carne de Shaw et al . , cordero 1984 J. Appl. empacada al Bacteriol 56:25- vacio 40
LV34 Carne de res Shaw et al. , 1984 empacada al J. Appl. Bacteriol vacío 56:25-40
AgResearch 4 AGR46, AGR 8, Carne de Este estudio
Hamilton - NUEVA AGR51, AGR53 cordero
ZELANDA enfriada
Colección Número Nombres Aislado de Referencia
Laboratorio - País de (sinónimos)
cepas
Meat Science Group
Mahidol University 2 TISTR890, Nham Tanaasupawat y
Bangkok TISTR911 (salchicha de otros, 1983 J.
TAILANDIA - puerco Gen . Appl .
Faculty of Science fermentada Microbíol .
estilo Thai) 29:487-506
Noonpakdee y otros, 1996 Asia Pacific J. Mol. Biol.
Biotechnol . 4 : 229-235
Universitát 9 LTH673, LTH675, Varias Vogel et al. ,
Hohenheim LTH677, LTH5728 salchichas de 1991 FEMS
ALEMANIA tipo húmedo Microbíol Lett
Institüt für fermentadas 68:183-190
Tlibbensmitteltechnologie estilo Alemán
LETH1764 , Col Vogel et al . ,
LETH2070 fermentada 1993 J. Appl.
Bacteriol
74:295-300
LETH5588, Heces humanas alter et al . ,
LETH5589, 2001, Appl.
LTH5590 Envir.
Microbíol .
67 : 2578-2585
Universitát Berlín 1 CIP105422T Salchicha Klein et al. ,
- ALEMANIA (CCUG31331) estilo alemán 1996, Int. J.
Institute of Meal cruda Sys. Bacteriol.
Hygiene & 46 : 367-376
Technology
Kulmbach - ALEMANIA 1 Lb706 Carne de res Schillinger et
Federal Centre por fresca al . , 1987 Food
Meat Research Microbíol .
4 : 199-208
MARFORSK - Ás - 6 MF1048, MF2091, Rakfisk Este estudio
NORUEGA MF2092, MF2088, (trucha
Colección Número Nombres Aislado de Re erencia Laboratorio - País de (sinónimos)
cepas
Norwegian Food MF2089, MF209 fermentada
Research Institute Escandinavia)
CONICET - Tucumán - 1 CRL1467 Salchicha Fontana et al. , ARGENTINA seca 2005 J Microbiol
Centro de fermentada Methods 63:254- Referencia para estilo 263
Lactobacilos Argentino
(CERELA)
American Ty e 1 ATCC15521T Moto podrido Katagirl et al. , Culture Collection (DSM20017) para 1934 Bull. Agr. (Aislado original fabricación Chem. So . Jpn . de JAPON) de Saké 10:156-157
University of Tokyo 5 YMN243, YMN344, Varios Morishita et - JAPON YMN540, YMN557, productos de al., 1986 Int.
National Institute V553 carne fresca J. Food of Health Microbiol. 3:19- 29
Parte 2: Cepas de L. curvatus
American Type 1 ATCC256011' Leche Torriani et al . , Culture Collection (DS 20019) 1996
(Aislado original
de ALEMANIA)
IRTA - Monells 1 CTC424 Salchicha Hugas et al . , ESPAÑA seca 1993 Int. J.
Meat Technology fermentada Food Microbiol . Centre estilo 18 : 107-113
Español
Detección de genes con base en PCR
La presencia o ausencia del grupo de genes flexibles identificado por los inventores se investigó utilizando detección con base en PCR y verificación de islas genómicas para agrupamiento de cepas como sigue:
La plantilla PCR fueron 100 mg de ADN cromosómico extraído de 73 cepas L. sakei y de 2 cepas L. curvatus. Los experimentos se condujeron dos veces para confirmar los resultados negativos. En el caso de amplificaciones débiles o falsas, los productos PCR se secuenciaron para verificar el polimorfismo de nucleótido entre las cepas. Si es necesario, los iniciadores se rediseñaron.
La extracción del ADN cromosómico de L. sakei y L. curvatus se llevó a cabo mediante el método de Anderson & McKay
(Anderson y McKay, 1983 Appl Environ Microbiol. 46:549-552). Para cada amplificación PCR, el par de iniciadores se diseñó de tal forma que la longitud de los productos esperada fue menor de 2 kb. Las condiciones de la ciclación PCR fueron 94°C por 4 min seguido por 30 ciclos de 94 °C por 1 min, 55°C por 1 min y 72°C por 3 min. Todos los productos PCR se examinaron utilizando 1% de geles de agarosa y se tiñeron con bromuro de etidio. Para confirmar el truncamiento de algunos genes o productos de tamaños inesperados, se trataron 10 µ? de los amplicones con 0.1 de unidad de fosfatasa alcalina de Camarón
(USB corporation) y 1 U de exonucleasa I (E. coli) (Biolabs) en 20 mM de Tris-HCl pH 8.0, 10 mM de regulador de pH de MgCl2 por 1 hora a 37°C, seguido por 10 min de inactivación a 94°C. Los productos después se secuenciaron utilizando tecnología estándar (http://www.the-mwg.com).
Experimentos PFGE y análisis de patrón I-Ceul
Se llevaron a cabo la electroforesis en gel de campo pulsado y análisis de patrón de digestión I-Ceul como se describe por Dudez et al., 2002 (Dudez et al., 2002 Microbiology. 148:421-31). Se realizó un promedio de 4 geles para cada cepa. La distribución de las cepas de acuerdo con su tamaño genómico se examinó utilizando la función HIST y la función DENSITY de probabilidad del paquete estadístico R (R Development Core Team 2006 R: A language y environment for statistical computing. Vienna, Austria: R Foundation for
Statistical Computing) . Se seleccionó una distribución probabilidad Gaussiana y un allanamiento de ancho de banda de 30 (desviación estándar promedio de la estimación del tamaño del genoma) para el análisis.
Agrupamiento de las cepas
El contenido genómico de las cepas ensayado se describe mediante el uso de una matriz de dos caracteres (genes x aislados) con 0 para ausencia y 1 para la presencia de un gen. Los genes truncados por los elementos IS se consideraron como identidades genéticas diferentes a su contraparte de tipo silvestre. Las similitudes entre las cepas se determinaron utilizando el coeficiente de correlación de Jacquard (Jacquard y Feingold, 1974 Theor Popul Biol . 6:21-34). El agrupamiento jerárquico sin supervisión se realizó utilizando el enlace completo en la
matriz de similitud. Se utilizaron las siguientes funciones: DIST, HCLUST y DENDROGRAM del paquete estadístico R (R Development Core Team 2006 R: A language y environment for statistical computing. Vienna, Austria: R Foundation for Statistical Computing) para generar el dendrograma de agrupamiento. El paquete R PVCLUST (Suzuki y Shimodeira, 2006 Bioinformatics . 22:1540-1542) se utilizó para el remuestreo con reemplazo multi-escala para evaluar la estabilidad estadística de cada nodo. El número de duplicados de reemplazo fue 1,000. Se utilizaron los valores P >90% imparciales y >50% del coeficiente de similitud de Jacquard para discriminar los posibles brotes de cepas.
Electroforesis en gel 2D e identificación de proteínas mediante impresiones dactilares de masa de péptido
La preparación de extracto bacteriano, electroforesis llevaron a cabo por métodos estándar (Jofre et al., 2007 Res. Microbiol . 158:512-520). Los geles se analizaron mediante el software Image Master (Amersham Pharmacia Biotech) . Las manchas se extirparon de los geles teñidos con coomassie como se describe por Marceau et al., (Marceau et al., 2004 Appl Environ Microbiol. 70:7260-7268) y los análisis de espectrometría de Masa se realizaron como se describe previamente por Guillot et al., (Guillot et al., 2000 Int J Food Microbiol. 55:47-51). MS-Fit (University of California San Francisco Mass Spectrometry Facility;
http://prospector.ucsf.edu) y Mascot (Matrix Science Inc., Boston, MA; http : //www.matrixscience . com/search_form_select . html) , instalados en un servidor local, se utilizaron para identificar proteínas de impresiones dactilares de masa de péptido. Todas las búsquedas se realizaron contra la base de datos de L. sakei 23K (http://www.migale.jouy.inra.fr/sakei).
RESULTADOS
Selección de las cepas L. sakei
Para cuidadosamente estimar la biodiversidad de la población de L. saJcei natural, los inventores tuvieron cuidado al analizar las cepas que se aislaron de una variedad de productos alimenticios relacionados con carne o pescado (crudo o fermentado) o de otras fuentes incluyendo Col fermentada y Heces humanas. Además, ya que puede existir una posible desviación en el muestreo en colecciones bacterianas de laboratorio individuales debido al procedimiento de aislamiento utilizado o el tipo de materiales alimenticios analizados, las cepas L. sakei se seleccionaron de 14 diferentes colecciones de laboratorio geográficamente dispersas dentro de Europa, Asia y Nueva Zelanda. Se seleccionó y analizó un total de 73 cepas L. sakei (Tabla 2) así como dos cepas de Lactobacillus curvatus, un congénere cercano de las especies L. sakei tomadas como especies externas de referencia (referencia de grupo foráneo) .
Identificación de los subtipos moleculares de L. sakei principales a través de la detección del grupo de genes flexibles con base en PCR
En el Ejemplo 1 que describe el análisis in silico del cromosoma de 23K de L. sakei, los inventores identificaron su grupo de genes flexibles putativos que comprende 27 islas genómicas y 49 genes independientes. Ellos decidieron verificar la presencia o ausencia de este grupo de genes (asumiendo que son variables entre las cepas) para el análisis de agrupamiento de los aislados de L. sakei y mediante el uso de PCR convencional.
Esta estrategia primero se ensayó en un experimento PCR preliminar en un grupo de 20 cepas para demostrar la variación intra-especie de estos genes. Solamente 5 islas revelaron estar altamente conservadas y por consiguiente se eliminaron del análisis. Para evitar la alteración del agrupamiento debido a los elementos móviles altamente transíeribles altamente en forma lateral (Secuencias de inserción, fago y sistemas de restricción/modificación) , estos genes también se descartaron del análisis. Además, los inventores demostraron que la mayor parte de los genes dentro de cada isla genómica usualmente desplegaron patrones de variación similares (la isla completa está usualmente presente o ausente) . Por consiguiente, para evitar una alteración de grandes brotes genómicos (que contienen más
genes que los más pequeños) , se hizo una selección de máximo 4 genes (los que eventualmente muestran un patrón de variación diferente) para cada brote.
Además, 11 genes cromosómicamente codificados de otros cepas L. sakei que estuvieron ausentes del cromosoma de 23K de L. sakei, se incorporaron en el análisis. Estos genes se seleccionaron parcialmente de brotes previamente publicados y parcialmente tomados de la secuenciación del genoma de otras cepas L. sakei. Esta selección dio como resultado de esta forma -80% de genes originados de L. sakei 23K (que representa 21 islas genómicas y 4 genes independientes) y -20% de genes de otras cepas. Las características de estos 60 genes se resumen en las Tablas 3 Y 4.
Con base en el análisis PCR de los 60 genes, los inventores intentaron clasificar los aislados naturales de L. sakei mediante el uso del algoritmo jerárquico de enlace completo sin supervisión y mediante la estimación de los valores P a través de remuestreo de de reemplazo multi-escala para evaluar la incertidumbre del análisis de agrupamiento (Figura 1) . Del dendrograma resultante al menos 11 brotes soportados por el reemplazo de cepas divididas en tres grupos principales se identificaron claramente por los inventores.
El brote A comprende la cepa de 23K de referencia y los brotes B a D comprenden cepas cercanamente relacionadas
con este brote que forman junto el grupo 1. Los otros grupos representan brotes de cepas que están jerárquicamente menos relacionados con el grupo 1 y comprenden la cepa CIP 105422T de tipo L. sakei subsp. carnosus (brote G, grupo 2) y la cepa ATCC 15521 T de tipo sakei L. sakei subsp. (brote K, grupo
3), el anterior siendo el más distante relacionado con el grupo 1. Tres cepas (332, 21 y LTH2070) del grupo 3 no pueden agruparse con certeza entre el brote H y el brote I .
Variaciones del tamaño del cromosoma y la geometría entre los brotes genotípicos de L. sakei
Los inventores después investigaron el grado de la variación del tamaño del genoma entre los aislados L. sakei por análisis PFGE de los fragmentos digeridos con I-Ceul. El mapeo I-Ceul- de cromosoma de L. sakei da como resultado siete fragmentos de ADN (Dudez et al., 2002 Microbiology.
148:421-31) de varios tamaños y es una herramienta eficiente en la resolución del tamaño del genoma global y la geometría entre las cepas L. sakei.
Este análisis reveló diferencias importantes en el tamaño del genoma entre las cepas de L. sakei. El tamaño de cromosoma medio es de 2,020 ± 30 kb para las especies, pero el tamaño en el intervalo de 1,814 ± 30 kb (cepa CTC427) a 2,309 ± 79 kb (cepa LTH677) representa de esta forma una variación del aproximadamente -25% del genoma (-500 kb) . Más notable es la observación de que el tamaño del cromosoma de
las cepas de L. sakei no estuvo homogéneamente distribuido en todo este rango (Figura 2A) y una distribución de probabilidad Gaussiana de los datos del tamaño del genoma sugieren que posible división de las cepas en sub-poblaciones .
Para evaluar si las sub-poblaciones PGFE pudieran explicarse por la distribución de las cepas en los varios brotes genotípicos, los inventores analizaron la distribución del tamaño del genoma a través de los 11 brotes (Figura 2B) . Ellos demostraron que el tamaño del genoma fue relativamente uniforma entre los brotes de la cepa. También demostraron que los aislados de L. sakei del grupo 1 (brotes A, B, C y D) generalmente hospedan al genoma pequeño (tamaño promedio de 1,915 kb ± 79 kb) , mientras los grupos 2 (brotes E, F y G) y 3 (brotes H, I, J y K) comprenden la mayor parte de los aislados con un genoma más grande (tamaño promedio de 2,055 kb ± 80 kb y 2,080 kb ± 80 kb, respectivamente) .
Este buen arreglo encontrado entre los brotes genotípicos y las sub-poblaciones estimuló a los inventores a analizar la correlación entre el tamaño del genoma del cromosoma completo y la de cada fragmento digerido con I-Ceul en los 73 aislados de L. sakei. Se observó una buena correlación, ya que estos dos parámetros muestran un aumento proporcional del genoma de L. sakei más pequeño al más grande .
Tabla 3 : Descripción de genes del grupo de genes flexibles de la cepa L. sakei de 23K utilizado para el análisis de agrupamiento
Isla genómica Nombre del Descripción del producto No. acceso gen o de GenBank etiqueta del
sitio
Isla 1 LSA088 Adenina diaminasa CR936503
Isla 2 LSA0118 Proteína hipotética (proteína de CR936503 unión a colágeno en superficie
celular putativa)
Isla 3 LSA0157 Simportador de aminoácido de CR936503 hidroxilo/aromático putativo
Isla 5 LSA165 Oxidoreductasa putativa, familia CR936503 de deshidrogenasa/reductasa de
cadena corta
Isla 6 LSA172 Proteína de superficie celular CR936503 de tipo CscC con dominio de tipo
Invasina/Mucina y dominio WxL
LSA178 Regulador de transcripción de CR936503 tipo MarR
Isla 7 LSA0211/0212 Proteína de superficie celular CR936503 de tipo CscC con dominio de tipo
adesina y dominio de tipo WxL
(gen con desplazamiento de marco
auténtico)
LSA0216 Regulador de transcripción de CR936503 tipo MarR
Isla 8 LSA0217 Regulador de transcripción CR936503 putativo con un dominio de tipo
Rodanaso, familia ArsR
LSA0218 Tioredoxina, TrxAl CR936503 LSA219_b Proteína de transporte de CR936503 cianato putativa
Isla genómica Nombre del Descripción del producto No. acceso gen o de GenBank etiqueta del
sitio
cianato putativa
Gen LSA0306 L-aspartato-beta-descarboxilasa CR936503 independiente
Gen LSA0439 Precursor de lipasa/esterasa CR936503 independiente extracelular hipotética
Isla 11 LSA0509 Ligasa de coenzima A de 2-amino- CR936503
3 -cetrobutirato (Glicina
acetiltransferasa
LSA0510/0511 L-treonina deshidrogenasa (gen CR936503 de desplazamiento de marco
auténtico)
Gen LSA0529 Regulador de transcripción de CR936503 independiente tipo MarR, regulador de tensión
de peróxido putativo OhrR
Isla 12 LSA0564_a a Péptidos de tipo bacteriocina CD936503
_c putativa (LSA0564_ab) y proteína
inmunitaria del cognado
(LSA0564_c)
LSA0565 a Péptidos de tipo bacteriocina CR936503
0566 putativos
LSA0567 a Péptidos de tipo bacteriocina
0569_b putativos (LSA05969_ab) y CR936503 proteínas inmunitarias de
cognado (LSA0567 y LSA0568)
Gen LSA0572 Treonina deaminasa (Treonina CR936503 independiente amoníaco- liasa )
Isla 14 LSA0724 a Proteínas hipotéticas CR936503
0725
LSA0727 Precursor de superficie celular CR936503 hipotético
Isla 15 LSA1006 Zinc putativo que contiene CR936503 alcohol deshidrogenasa
Isla genómica Nombre del Descripción del producto No. acceso gen o de GenBank etiqueta del
sitio
(óxidoreductasa)
Isla 16 LSA1182/1183 Citocromo putativo P450 (gen con CR936503 desplazamiento de marco
auténtico)
Isla 17 LSA1220 Trifosforibosil-defosfo- CR936503 coenzimaA sintasa
LSA1222 Subunidad alfa de oxaloacetato CR936503 de descarboxilasa
LSA1227 Citrato (pro-3S) -liasa ligasa CR936503
(citrato liasa sintetasa)
LSA1232 Simportador de CR936503 citrato:Mg(2+) (H+)
Isla 18 LSA1283 Proteína de superficie celular CR936503 de tipo CssC con dominio WxL
Isla 19 LSA1509 Factor relacionado con factor CR936503 sigma, proteína hipotética
LS 1510_a a Complejo putativo de proteína de CR936503 _c exportación de ácido teicoico/
polisacárido
LSA1510_d a Complejo de glicosil CR936503 _f transferasas putativo
LSA1510_g Glicosiltransferasas imprimadas CR936503 putativas
LSA1512/1513 Determinación de longitud de CR936503 cadena, de proteína biosintética
de polisacárido putativa
Isla 20 LSA1572 Glicosiltransferasas putativas CR936503 de ácido teicoico/polisacárido
LSA1579/1580 Complejo putativo de proteína de CR936503 exportación de ácido teicoico/
polisacárido
LSA1581 L-alalanina amidasa de N- CR936503
Isla genómica Nombre del Descripción del producto No. acceso gen o de GenBank etiqueta del
sitio
acetilmuramoilo de unión a ácido
teico co putativa (hidrolasa de
pared celular)
LSA1584/1585 Glicosiltransferasa de ácido CR936503 teicoico/polisacárido putativa
Isla 21 LSA1640 N-acetilneuraminato liasa CR936503
LSA1641 2-epimerasa (N-acetilmanosamina- CR936503
6-fosfato 2-epimerasa) de N- acilglucosamina-6-fosfato
LSA1642 Soluto putativo : simportador CR936503 deNa ( + )
LSA1720 Proteína hipotética (gen CR936503 plasmídico E. coli)
Isla 22 LSA1724 Regulador de transcripción de CR936503 tipo MarR
LSA1730 Proteína de superficie celular CR936503 de tipo CscC con dominio de tipo
adhesina bacteriano y dominio
WxL
LSA1731 Proteína de superficie celular CD936503 de tipo CscC con dominio de tipo
adhesina bacteriano y dominio
WxL
Isla 24 LSA1806 Proteína hipotética asociada CD936503 con el brote de tipo CSC
LSA1809 Precursor de proteína CD936503 extracelular hipotética asociado
con el brote de tipo CSC
Isla 27 LSA1874 Regulador de transcripción de CD936503 tipo MarR
Tabla 4 : Descripción de los genes de otras cepas diferentes de 23K utilizadas para análisis de agrupamiento .
*La nomenclatura utilizada fue como sigue: Grupo de Genes Flexibles-cepa nam-número CDS
Variabilidad proteómica global entre los aislados de L. sakei de diferentes brotes
Los inventores después utilizaron electroforesis bidimensional para comparar los proteomas de una selección de 12 cepas seleccionadas de varios brotes genotípicos A a K como una verificación final del agrupamiento. Aunque se observó comúnmente un promedio de -400 puntos en el rango Pi de 4 a 7, observaron una variación notoria de más de 230% en este número de puntos detectados entre las cepas.
Los puntos que representan diferencias principales se identificaron mediante el uso de espectroscopia de masa MALDI-TOF. La mayor parte de las diferencias reveló que son puntos específicos de la cepa de proteínas moderada o débilmente expresadas o para proteínas probablemente codificadas por genes no presentes en L. sakei 23K, ya que no pudieron identificarse en la base de datos de proteínas de este genoma de referencia. Algunas variaciones en el patrón de la proteína 2D también se encontraron como siendo la consecuencia de las diferencias en la migración de algunas isoformas específicas de la cepa de proteínas altamente expresadas. Esta información fue particularmente interesante porque el análisis de los perfiles de la proteína SDS-PAGE, la técnica utilizada en otros estudios para definir las subespecies de L. sakei, se basa principalmente en la detección de proteínas altamente expresadas.
Estos datos además confirman el agrupamiento jerárquico mostrado en la Figura 1.
En conclusión, los inventores proporcionaron una primera perspectiva en el número posible de subtipos moleculares dentro de las especies L. sakei. De los resultados anteriores esta población natural puede observarse como tres grupos principales de cepas, cada una de ella subdividida en de 3 a 4 brotes. No hay una diferencia sustancial en el tamaño del genoma entre los aislados del grupo 1 (promedio 1,915 kb) de los de los grupos 2 y 3 (promedio ~ 2,075 kb para ambos) .
Los inventores evaluaron el grado de variación genómica intra-especies de las especies L. sakei y generaron, por primera vez, una clasificación comprensible de los aislados naturales .
Ejemplo 3
En este Ejemplo, los inventores habían realizado una detección con base en PCR de 29 marcadores genéticos de un grupo de genes variables para el agrupamiento jerárquico de las cepas .
Todas las cepas L. sakei y L. curvatus utilizadas en este estudio se describen en la Tabla 2.
El contenido genético de las cepas ensayadas se describe utilizando una matriz de dos caracteres (genes x aislados) con 0 para la ausencia y 1 para la presencia de un gen. Las similitudes entre las cepas se determinaron utilizando
el coeficiente de correlación de Jacquard (o índice Jacquard) como se define anteriormente.
Una clasificación similar a la descrita en el Ejemplo 2 se llevó a cabo por los inventores, y dio como resultado la selección de solamente 29 genes marcadores resumidos en la Tabla 1.
Con base en el análisis PCR de estos 29 genes, los inventores clasificaron los aislados naturales de L. sakei mediante el uso del algoritmo de agrupamiento jerárquico de enlace completo sin supervisión y mediante la estimación de los valores P a través del remuestreo de reemplazo muíti-escala para evaluar la incertidumbre del análisis de agrupamiento. A partir de dendograma resultante, se identificaron claramente 11 brotes soportados por el reemplazo, designados A a K (Figura 3) . Estos brotes de cepas son muy similares a los descritos en el Ejemplo 2, obtenidos utilizando aproximadamente 60 genes marcadores .
Por consiguiente, los presentes inventores fueron capaces de identificar 29 genes que fueron suficientes para clasificar correctamente los aislados naturales de L. sakei natural .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (10)
1. - Un método para caracterizar una cepa de Lactobacillus sakei caracterizado porque comprende el paso que consiste en determinar la presencia o ausencia de los genes marcadores LSA1641 (SEC ID N0:1), LSA1182 (SEC ID N0:2), LSA1183_C (SEC ID NO: 3), LSA0172 (SEC ID NO : 4 ) , LSA1731 (SEC ID NO : 5 ) , LSA0211 (SEC ID NO : 6 ) , LSA0212 (SEC ID N0:7), LSA1579 (SEC ID NO : 8 ) , LSA1580 (SEC ID N0:9), LSA0118 (SEC ID NO:10), LSA0529 (SEC ID N0:11), LSA0439 (SEC ID NO:12), LSA0572 (SEC ID NO:13), LSA0219b (SEC ID NO:14), LSA0564_a (SEC ID NO:15), LSA0564_b (SEC ID NO:16), LSA0564_c (SEC ID NO:17), FGP21-0001 (SEC ID NO:18), sspA (SEC ID N0:19), spiA (SEC ID NO:20), FGP332-0001 (SEC ID N0:21), FGP332-0002 (SEC ID NO:22), FGP332-0007 (SEC ID NO:23), FGP332-0008 (SEC ID NO:24), FGP332-0009 (SEC ID NO:25), FGP332-0010 (SEC ID NO:26), FGP332-0011 (SEC ID NO:27), FGP332-0012 (SEC ID NO:28), y FGP332-0013 (SEC ID NO.-29) en tal cepa Lactobacillus sakei.
2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la presencia o ausencia de los genes marcadores se determina a través de amplificación.
3.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la presencia o ausencia de tales genes marcadores se determina por hibridación con sondas específicas de los genes marcadores.
4. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se lleva a cabo una clasificación de tal cepa Lactobacillus sakei mediante el análisis del patrón de presencia o ausencia de los genes marcadores y el cálculo de un índice Jacquard o coeficiente Dice o cualquier matriz de distancia binaria con respecto a un grupo de cepas Lactobacillus sakei.
5.- Un método para cuantificar una cepa Lactobacillus sakei específica en una muestra caracterizado porque comprende los pasos de : a) identificar y/o caracterizar las cepas Lactobacillus sakei presentes en la muestra a través de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, b) determinar el gen(s) marcador que está diferentemente presente en la cepa Lactobacillus sakei específica con respecto a otras cepas presentes en tal muestra, y c) amplificar tal gen(s) a través de PCR cuantitativa .
6. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque incluye un paso anterior de individualización de la cepa de otras cepas presentes en la muestra .
7. - Una combinación de marcadores que permiten la caracterización de una cepa de Lactobacillus sakei caracterizada porque comprende los genes marcadores LSA1641 (SEC ID N0:1), LSA1182 (SEC ID NO : 2 ) , LSA1183_C (SEC ID NO: 3), LSA0172 (SEC ID NO : 4 ) , LSA1731 (SEC ID N0:5), LSA0211 (SEC ID N0:6), LSA0212 (SEC ID NO : 7 ) , LSA1579 (SEC ID N0:8), LSA1580 (SEC ID N0:9), LSA0118 (SEC ID NO:10), LSA0529 (SEC ID N0:11), LSA0439 (SEC ID NO:12), LSA0572 (SEC ID NO:13), LSA0219b (SEC ID NO : 14 ) , LSA0564_a (SEC ID N0:15), LSA0564_b (SEC ID N0:16), LSA0564_c (SEC ID N0:17), FGP21-0001 (SEC ID N0:18), sspA (SEC ID N0:19), spiA (SEC ID NO:20), FGP332-0001 (SEC ID N0:21), FGP332-0002 (SEC ID NO:22), FGP332-0007 (SEC ID N0:23), FGP332-0008 (SEC ID N0:24), FGP332-0009 (SEC ID N0:25), FGP332-0010 (SEC ID NO:26), FGP332-0011 (SEC ID NO:27), FGP332-0012 (SEC ID NO:28), y FGP332-0013 (SEC ID NO : 29 ) .
8. - Un arreglo de AND caracterizado porque comprende una combinación de marcadores de conformidad con la reivindicación 7.
9. - Un método para comparar por lo menos dos cepas Lactobacillus sakei caracterizado porque comprende los pasos que consisten de a) determinar la presencia o ausencia de los genes marcadores LSA1641 (SEC ID N0:1) , LSA1182 (SEC ID NO : 2 ) , LSA1183_C (SEC ID NO: 3) , LSA0172 (SEC ID NO : 4 ) , LSA1731 (SEC ID NO:5) , LSA0211 (SEC ID NO:6) , LSA0212 (SEC ID NO:7) , LSA1579 (SEC ID NO : 8 ) , LSA1580 (SEC ID NO:9) , LSA0118 (SEC ID NO:10) , LSA0529 (SEC ID NOrll) , LSA0439 (SEC ID NO-.12) , LSA0572 (SEC ID NO:13) , LSA0219b (SEC ID NO:14) , LSA0564_a (SEC ID NO:15) , LSA0564_b (SEC ID NO:16) , LSA0564_C (SEC ID NO:17) , FGP21 -0001 (SEC ID NO:18) , sspA (SEC ID NO: 19) , spiA (SEC ID NO:20) , FGP332-0001 (SEC ID NO:21) , FGP332-0002 (SEC ID NO:22) , FGP332-0007 (SEC ID NO:23) , FGP332-0008 (SEC ID NO:24) , FGP332-0009 (SEC ID NO:25) , FGP332-0010 (SEC ID NO:26) , FGP332-0011 (SEC ID NO:27) , FGP332-0012 (SEC ID NO:28) , y FGP332-0013 (SEC ID NO:29) , en una primera muestra de la cepa Lactobacillus sakei, y b) determinar la presencia o ausencia de tales genes marcadores en una segunda cepa de Lactobacillus sakei, en donde, si el patrón de presencia o ausencia de tales genes marcadores es diferente entre la primera y segunda cepas de Lactobacillus sakei, entonces las cepas Lactobacillus sakei son diferentes.
10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además comprende el paso de analizar el patrón de la presencia o ausencia de tales genes marcadores mediante el cálculo de índice Jacquard o coeficiente Dice o cualquier distancia binaria.
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