MX2010008581A - Plantas de pimiento resistentes a enfermedades. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a plantas de pimiento resistentes a la enfermedad de oídio pulverulento así como a la infección por potyvirus, particularmente el virus Y de la papa (PVY). Específicamente, la presente invención se refiere a plantas de pimiento que comprenden un alelo de resistencia viral y un alelo de resistencia del oídio pulverulento en la configuración cis sobre el mismo cromosoma, de tal forma que los dos alelos de resistencia están en fase de acoplamiento.

Description

PLANTAS DE PIMIENTO RESISTENTES A ENFERMEDADES Campo de la Invención i La presente invención se refiere a plantas de pimieríto 1! ' I i : resistentes a la enfermedad del oídio pulverulento así como la infección por potyvirus particularmente el virus Y ' dej la papa (PVY, por sus siglas en inglés) . Específicamentie , j la' presente invención se refiere a plantas de pimiento que; comprenden un alelo de resistencia viral y un ¡ aliélo resistente al oídio pulverulento en configuración cis] sobre el mismo cromosoma tal que los dos alelos de resistencia están en una fase de acoplamiento. ·; Antecedentes de la Invención El oídio pulverulento es una enfermedad de planta provocada por patógenos de parásitos fúngicos . El oídio pulverulento provocado por el hongo Leveillula táurica jes una de las enfermedades más importantes en el pimiento, particularmente en el pimiento dulce, y también afecta a 1 I otros cultivos vegetales. Desde principios de los años 90 i este patógeno se reporta como causante de epidemia eri invernaderos y en campos abiertos en la mayoría de las áreas de producción de pimiento. Considerando que la mayoría de las especies de hongos que provocan el oídio pulverulento son ectoparásitos , el micelo de L. táurica '¦ crece Ref.: 213 33 disminuida y susceptibilidad creciente al daño por . otjrjas plagas. Los esfuerzos por controlar o evitar la infección; de un cultivo por un virus de planta se han hecho, aunqúe os1 patógenos virales continúan siendo un problema importante! en: la agricultura. '¦ i¡ :¦ I¡ Los potyvirus comprenden alrededor de 30% de todos os. virus de planta conocidos, y los virus que pertenecen a este grupo provocan un daño importante a las cosechas agrícolas La familia Potyviridae se caracteriza por un genoma de ARN en sentido de hebras sencillas con una proteína codificada viral enlazada de manera covalente (VPg) unida a la terminación 5' y un tracto ply-A 3' . El genoma es de aproximadamente; 10 kb de longitud y se traduce como una poliproteína que se jdivide posteriormente en polipéptidos más pequeños por protéasas codificadas virales. El virus Y de la papa (de aquí en i: ' adelante (PVY) es un miembro del grupo de virus de plantas de potyvirus. PVY es un virus de ARN de hebra sencilla ; en sentido positivo que está rodeado por un monómero proteínico i en repetición que se denomina la proteína de recubrimiento (CP, por sus siglas en inglés). El virus dentro de lá caps ida tiene una morfología de bastoncillo flexible que | se i! I caracteriza por un grupo de potyvirus. La mayoría de j Los potyvirus incluyendo PVY se transmiten en una foirma . ; no persistente por los afidios. El intervalo hospedero ;de PVY incluye la papa, tabaco, y pimiento y la facilidad1 de | su idéntico al lugar pvr 2 (Ruffel et al., 2002. The Plánt J. 32:1067-1075; Kang.et al., 2005. The Plant J. 42:392-405) . ; Muchos de los genes involucrados en la resistencia al! virus, incluyendo el gen de resistencia al virus; pvrl: identificado en Capsicum, se han usado exitosamente' como marcadores efectivos y estables para identificar fuentes de resistencia en programas de reproducción de cultivos. Yeatri et al. (2005. Theor. Ap l . Genet . 112:178-186) reportaron la, generación y uso de marcadores moleculares que defiren lugares para la selección de las plantas de Capsicum. resistentes al potyvirus usando secuencias polimórf 1 íIcas amplificadas, escindidas, (CAPS) . Tales marcadores CAPS se desarrollaron para tres alelos de resistencia viral re,cesiva: pvrl, pvrl y pvrl . ;. j Alternativamente, se dirigen intentos hacia el usol de técnicas de ingeniería genética para producir plantas jon, resistencia al virus (por ejemplo, las patentes de EUA Nos 5,589,612; 5,939,603; 5,986,175; 6,806,400) . j ? En cuanto a la actualidad, las plantas de pimiento resistentes a los potyvirus incluyendo variedades ade 1cua!d1as para el crecimiento de cultivos comerciales ! están disponibles. No obstante, todavía se usa ampliamente) | el control químico para combatir la infección viral.

En décadas recientes, la conciencia del i'efécto perjudicial del uso extensivo de pesticidas en el ambienté ha crecido constantemente. Se dirigen esfuerzos al desarrollo! |de agricultura sostenible incluyendo el mantenimiento de juna producción de cultivos con alto rendimiento con una reducción; importante en el empleo de productos químicos ambientalmer.te perjudiciales.

El control químico del hongo L. táurica, que provoca la enfermedad del oídio pulverulento en cultivos de pimier.to involucra altos costos y es perjudicial al medio ambiente Así, existe una gran demanda para, y sería altamente ventajoso tener, plantas de pimiento, adecuadas P -RA crecimiento en una escala comercial que sean resistente1 más de un patógeno. !. , ¡ Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a plantas de pimiento (Capsicum) resistentes al oídio pulverulento provocado por el hongo Leveillula táurica así como a la infección por al!; menos un potyvirus particularmente el virus de la papa Y (PVY) j | en donde la resistencia a ambos patógenos está en la fase |' dé acoplamiento De acuerdo con un aspecto, la presente invención i J" ! proporciona una planta de pimiento que comprende dentro de , su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al oídio pulverulento (PM, por sus siglas en inglés) en donde los alelos de resistencia están presentes en la configuración cis sobre el mismo cromosoma, tal que dichos dos alelos de resistencia estíán||en. la fase de acoplamiento. » La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que las plantas de pimiento que ¡son resistentes al oídio pulverulento son susceptibles infección por PVY y viceversa. Este fenómeno resulta de ¡una ligadura fuerte entre el gen pvrl relacionado con resistencia I , j a PVY y un gen relacionado con resistencia al ;, oíjdio pulverulento. La presente invención muestra ahora que! el ! j alelo de resistencia pvrl se localiza en el mismo cromosoma como el alelo susceptible al oídio pulverulento. La presente invención se basa además en la identificación de eventos de recombinación en la región de estos genes ligados firmemente lo cual lleva al acoplamiento de ambos alelos de resistencia en una configuración cis en el mismo cromosoma.

De acuerdo con una modalidad, el al menos un alél de resistencia al potyvirus y el al menos alelo de resistencia PM se localizan eñ el cromosoma 4. ; j De acuerdo con determinadas modalidades, la planta de pimiento es substancialmente resistente a la enfermedad de PM provocada por el hongo L. táurica. De acuerdo con modalidades particularmente preferidas, la planta de pimiento i | es resistente a la enfermedad de PM provocada por el hongo | L. táurica así como a la infección por al menos un potyvirus . | De cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO : 3. El fragmento resultante de ÁDN contiene un sitio de restricción para la enzima ! de restricción BseNI . '¦ El híbrido de Capsicum annuum designado MGR10F1-3019 , y la línea de variedad Capsicum annuum designada MGR10-F6-j421 sirven como un ejemplo para las plantas reivindicadas enj la presente invención. Las semillas representativas del híbrido de pimiento MGRlO-Fl-3019 Y la variedad de pimiento MGR10-F6-421 se enviaron para depósito con NCIMB Ltd. bajo el trat'ado: de Budapest el 28 de Julio de 2010 y recibieron los números de acceso 41745 y 41746 respectivamente. Las plantas crecieron a partir de semillas de MGRlO-Fl-3019 y de semilllas de MGR10-F6-421, que comprenden dentro de. su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo' de' resistencia al oídio pulverulento (PM) , en donde los jálelos de resistencia están presentes en la configuración cisj en |,el mismo cromosoma, tal que los dos alelos de resistencia;, estián i I en la fase de acoplamiento como se describe a continuación'. i'. I j: ; I De acuerdo con una modalidad actualmente preferidá,| | la i presente invención proporciona una planta híbrida de pimiento designada MGRlO-Fl-3019. El híbrido de pimiento designado MGRlO-Fl-3019 , semillas representativas del cual han ido enviadas para depósitos con el NCIMB el 28 de Julio de ¡2010 y que recibieron el número de acceso 41745, son homocigóticos al menos a una enfermedad, resistencia a diversos tipos ! de tensiones no bióticas, esterilidad masculina y crecimiento vigoroso De acuerdo con una modalidad, las plantas o progeniél o partes de las mismas se han transformado para incluir ¡e.li |al i ; menos un aspecto adicional de manera que su material genét'ilco i. ? contenga uno o más transgenes ligados opera ivamente a j uno más elementos reguladores. Las plantas de pimiento y lijas partes de los mismos producidas de las variedades transformadas también se abarcan dentro del alcance <de!|la presente invención Las plantas de pimiento de la presente invención pueden 1 ¦ j ser líneas endogámicas estables genéticamente asíj como híbridos producidos por la cruza de dos cepas diferentíis . , Como se usa en la presente, "líneas precursoras" se refiere a I. . líneas endogámicas polinizadas abiertas, estables para los1 aspectos deseados sobre los ciclos de autopolinización , y plantación.. De acuerdo con determinadas modalidades,, |!:as plantas de pimiento de la presente invención pueden producir una cosecha de valor comercial.

De acuerdo con determinadas modalidades, las plantas de i pimiento que tienen resistencia dual de acuerdo con ! Las enseñanzas de la presente invención son homocigóticas' paral el alelo de resistencia al potyvirus y para el aleloí | de resistencia PM. ; De acuerdo con otras determinadas modalidades; las plantas de pimiento que tienen resistencia doble de aduerdo i: · j con las enseñanzas de la presente invención,] , s¡on homocigóticas para el alelo de resistencia al potyvirus v heterocigóticas para el alelo de resistencia PM.

De acuerdo todavía con otro aspecto, la presen¡te invención proporciona un cultivo de tejido regenerado partir de las plantas de la presente invención y planjtías1 regeneradas de los mismos. ! De acuerdo con una modalidad, el cultivo de tejidos comprende células o protoplastos derivados de un 'tejido seleccionado del grupo que consiste de, pero ino limitado hojas, polen, embriones, raíces, ápices radicales, anteras, flores, fruto y semillas. ¡ De acuerdo con otra modalidad, una planta regenerada] a partir de cultivo de tejidos comprende dentro de su gerioma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al oídio pulverulento (PM) , presenté en la posición cis en el mismo cromosoma tal que los dos ijá'l:eílos de resistencia están en la fase de acoplamiento. : De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona semillas de pimiento en donde las plantas ¡crecen de las semillas y comprenden dentro de su genoma al menos [un i¦ t alelo de resistencia al potyvirus y al menos un aleld | de resistencia al oídio pulverulento (PM) , en donde los jálelos tiene una secuencia de polinucleótidos como se establecen [en SEQ ID NO: 3, El fragmento de ADN que carece de un sitio |de restricción para la enzima de restricción BseNI .

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona semillas de pimiento en donde el acoplamiento |de la secuencia de ADN con susceptibilidad de potyvirus es ina plantilla para la amplificación de un fragmento de ADN, al usar una secuencia de polinucleótido como se establece en SEQ ID NO: 2, y un segundo cebador que tiene una secuencia |de polinucleótidos como se establecen en SEQ ID NO: 3, |El fragmento de ADN que contiene un sitio de restricción para | la enzima de restricción BseNI .

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona una planta de pimiento o una parte de la misma producido por crecimiento de la semilla como se detalla anteriormente De acuerdo todavía con aspecto adicional, la presente invención proporciona un fruto de una planta de pimiento que comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al oídio pulverulento (PM) , presente en la configuración [C1S sobre el mismo cromosoma de tal manera que los dos alelos de resistencia están en fase de acoplamiento, en donde la fruta es una fruta dulce comestible. De acuerdo con determinadas modalidades actualmente preferidas, el potyvirus es PVY De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de producción de una planta de pimiento que comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al oídio pulverulento (PM) en donde los alelos están presentes en la configuración cis en el mismo cromosoma que comprende las etapas de : a) proporcionar una primera planta de pimiento resistente a la infección por L. táurica y susceptible al virus de la papa Y (PVY) y una segunda planta de pimiento susceptible a la infección por L. táurica y resistente a PVY; b) cruzar al primera y la segunda plantas de pimiento de la etapa (a) para producir una progenie de planta de pimiento Fi; c) autopolinizar la planta del pimiento Fx de la etapa (b) para producir una progenie de planta de pimiento F2; d) analizar la progenie de la etapa (c) para plantas resistentes a la infección con L. táurica que comprende dentro de su genoma un alelo resistente a PVY y un alelo de susceptibilidad a PVY; e) seleccionar al menos una planta que tenga las características de la etapa (d) , que comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al oídio pulverulento (PM) en donde los alelos están presentes en la posición cis en el mismo cromosoma De acuerdo con determinadas modalidades, el método comprende además la autopolinización de la planta de la etapa (e) para obtener una progenie homocigótica para el alelo de resistencia al potyvirus y el alelo de resistencia PM.

De acuerdo con determinadas modalidades adicionales, el método como se detalla anteriormente comprende además ljas etapas de : a) aislar una muestra de ADN genómico de la planta, b) amplificar un segmento de ADN usando un primer , cebador que tenga una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO : 2 y un segundo cebador que tenga úna secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO 3; y c) someter al segmento amplificado de ADN restricción con la enzima de restricción BseNI ,- en donde la ausencia de un sitio en restricción BseNI dentro del segmento amplificado de ADN caracteriza a la planta como resistente a la infección por potyvirus y la presencia del sitio BseNI caracteriza a la planta cómo susceptible a la infección por potyvirus.

Se describe ahora que sorprendentemente, la resistencia a infecciones por potyvirus en plantas de pimiento está en fase de repulsión a la resistencia a la enfermedad del oí'dio pulverulento en la naturaleza.

Así de acuerdo con un aspecto adicional, la prese'nte invención proporciona un método para caracterizar una planta |de pimiento como resistente o susceptible a la infección por táurica, que comprende las etapas de: a) aislar una muestra de ADN genómico de la planta; b) amplificar un segmento de ADN usando un primer cebador que tenga una. secuencia de polinucleótido como |se establece como SEQ ID NO: 2, y un segundo cebador que tenga una secuencia de polinucleótido como se establece en SEQ ID NO: 3;, c) someter al segmento amplificado de ADN a restricción con la enzima de restricción BseNI; en donde la presencia de un sitio de restricción BseNI dentro del segmento amplificado de ADN caracteriza a la planta como resistente a la infección por L. táurica y la ausencia del sitio BseNI caracteriza a la planta como susceptible a la infección por L. táurica. Otros objetivos aspectos y ventajas de la presente invención se volverán claros a partir de, la siguiente descripción y las figuras.

Breve Descripción de las Figuras Con objeto de entender la invención y ver la manera en que se puede implementar en la práctica, se describirán ahora una pluralidad de modalidades preferidas a manera solamente | de ejemplos no limitativos con referencia a las figuras anexas | en donde : La figura 1 es una representación fotográfica de | la superficie inferior de las hojas obtenidas a partir ¡de plantas resistentes al pimiento y a partir de plantjas susceptibles como modalidades preferidas de la invención; La figura 2 es una representación fotográfica de la segregación del gen pvr en plantas F2 usando los marcadores de ADN como se describen en la presente. R- homocigoto |de planta resistente a pvr; S- homocigoto de planta susceptible a pvr; H- heterocigoto de planta parcialmente resistente pvr; M- marcador pPBR322 ADN/Alu; y La figura 3 es una presentación esquemática de SEQ |ID NO: 1, la cual es la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN amplificado por SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO : 3 cebadores de la presente invención al usar el gen pvr como una plantille Descripción Detallada de la Invención Definiciones Como se usa en la presente, el término planta de pimiento se refiere a una planta del género Capsiciim, específicamente a plantas de Capsicum annuum Como se usa en la presente, el término oídio pulverulento se refiere a una enfermedad provocada por el hongo Leveillula táurica. Las plantas infectadas con el hongo desplegarán puntos tipo polvo blanco en las hojas. Las hopas inferiores son las más afectadas y a medida que avanza | la enfermedad, el oídio se esparce a las hojas superiores. | El avance de la enfermedad también se asocia con puntos que |se hacen más grandes y gruesos debido a los números masivos |de esporas formadas. Las hojas infectadas con el hongo se cortían a menudo de la planta, exponiendo al fruto a la luz del sol lo que puede dañar el fruto.

Como se usa en la presente, el término potyvirus |se refiere a un virus que infecta plantas que pertenecen a |la familia Portyviridae . Los miembros de la familia Potyviri†ae incluyen: virus de la papa Y (PVY) , virus de la papa A (PVA) , virus del grabado del tabaco (TEV) y virus moteado del pimiento (PepMoV) . El término PVY se refiere a un virus de papa Y que pertenece al grupo de virus de planta de potyvirus. PVY es un virus de ARN de hebra sencilla en sentido positivo que está rodeado por un monómero proteínico de repetición el cual se denomina la proteína de recubrimiento (CP) . El virus dentro de la cápside tiene una morfología de bastoncillo flexible que es característica del grupo de potyvirus. La mayoría de los potyvirus se trasmiten en una forma no persistente por los áfidos.

Como se usa en la presente, el término alelos significa cualquiera de una o más formas alternativas de un gen en| un lugar particular, todo los cuales alelos se relacionan a| un rasgo o característica en un lugar específico. En una céljula ploide de un organismo, los alelos de un gen dado se localizan en una ubicación específica, o lugar (plural lugares) en un cromosoma. Un alelo está presente en cada cromosoma del par de cromosomas homólogos. Una especie de planta diploide puede comprender un número grande de diferentes alelos en un lugar en particular.

Como se usa en la presente, el término "lugar" (plural lugares) significa un lugar o. lugares específicos o un sitio en un cromosoma donde por ejemplo se encuentra un gen o marcador genético.

Como se usa en la presente, los términos "en cis" se refieren a una condición genética en la cual los alelos de dos lugares diferentes se presentan juntos ligados en un cromosoma (homólogo) . Por ejemplo, cuando el alelo de resistencia PVY y el alelo de resistencia PM se localizan en un cromosoma homólogo, estos alelos están "en cis" . En contraste, si el alelo de resistencia PVY y el alelo de resistencia PM se localiza en cromosomas homólogos diferentes de un par homólogo, se dice que están en "trans" .

Una "recombinación" o "evento de recombinación" como se usa en la presente, se refiere a un cruce de cromosomas sobre una selección independiente. El término "recombinante" | se refiere a una planta que tiene un nuevo repuesto genético que resulta del evento de recombinación.

Como se usa en la presente, alelos dominantes de genes ligados están presentes en el mismo cromosoma, y se refieren a fase de acoplamiento. En contraste, en la ligadura de I la fase de repulsión, el alelo dominante de un gen está presenjte con el alelo recesivo del otro gen en el mismo cromosoma.

Como se usa en la presente, el término acoplamiento es análogo a la coherencia o a la co-segregación en algun¡as modalidades de la invención.

Como se usa en la presente, los términos "alelos Ide resistencia al potyvirus" o "alelo de resistencia a PVY" se refieren a un alelo, el cual cuando está presente en el genoma le otorga resistencia o resistencia parcial a un potyvirus o al virus de la papa Y respectivamente en un planta de pimiento. De acuerdo a determinadas modalidades de la invención, el alelo de resistencia al potyvirus es el alelo de resistencia del gen pvrl (también conocido como pvr2) . El término "gen pvr" como se usa en la presente se refiere al número de acceso AY485129; Kang et al., 2005 Plánt J. 42:392-405. Una planta o plantas son resistentes cuando aparecen solamente síntomas moderados o ningunos síntomas de la enfermedad (es decir solamente unas cuantas manchas verdes tipo mosaico) después de una infección deliberada de la planta con el virus. Las plantas resistentes son homocigóticas para el alelo pvr.

El término "alelo de resistencia PM" como se usa en|la presente, se refiere a un alelo el cual cuando está presente en el genoma le otorga resistencia o resistencia parcial al oídio pulverulento provocado por el hongo L. táurica. La planta de pimiento o plantas resistentes a L. táurica caracterizan como heterocigóticas u homocigóticas para .el alelo de resistencia PM. Fenotípicamente , las plantas resistentes heterocigóticas muestran solamente síntomas menores de la enfermedad y la planta resistente homocigótica no muestra los síntomas típicos de las manchas cloróticas en la superficie superior de la hoja y la esporulación de tipo polvo blanco en el área correspondiente de la superficie inferior de la hoja.

Como se usa en la presente, el término "rasgo" se refiere a una característica o fenotipo. Por ejemplo, en el contexto de la presente invención, resistencia y susceptibilidad se refieren a los síntomas observados en una planta infectada con el hongo L. táurica o con un potyvirus como se describe en la presente. Un rasgo se puede heredar en una forma dominante y o recesiva o en una forma dominante parcial o incompleta. Un rasgo puede ser monogénico (es decir determinado por un lugar sencillo) o poligénico (es decir determinado por más de un lugar) o también puede resultar de la interacción de uno o más genes con el ambiente. Un rasgo dominante resulta en una manifestación completa fenotípica | en el estado heterocigótico u homocigótico; un rasgo recesivol se manifiesta en sí mismo solamente cuando está presente enlel estado homocigótico.

Como se usa en la presente, el término "homocigótico' significa una condición genética que existe cuando dos alelos idénticos residen en un lugar específico pero se colocan individualmente en pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula de un organismo diploide . De manera opuesta como se usa en la presente, el término heterocigótico significa una condición genética que existe cuando dos alelos diferentes residen en un lugar específico pero se colocan individualmente en pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula de un organismo diploide.

Como se usa en la presente, el término "planta" incldye la planta completa o algunas partes o derivados de la misma tales como células de planta, protoplastos de planta, cultivos de tejido de células de plantas a partir de los cuales se pueden regenerar las plantas de pimiento, callos de plantas, embriones, polen, óvulos, fruta (por ejemplo, pimiento cosechado) flores, hojas, semillas, raíces, ápices radicales, y los similares. Las semillas de la planta de pimiento que comprenden dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo |de resistencia al oídio pulverulento (PM) en donde los alelos |de resistencia están presentes en la configuración cis en |el mismo cromosoma, tal como dichos dos alelos de resistencia están en una fase de acoplamiento se obtienen con respecto a un depósito hecho bajo las disposiciones del tratado | de Budapest como se describen en la presente.

Las semillas de MGRlO-Fl-3019 designadas del híbrido |de Capsicum annuum de las cuales se enviaron para depósito el |28 de julio de 2010 con NCIMB y recibieron el número de acce'so 41745, y las semillas de Capsicum annuum designadas en la línea de variedad MGR10-F6-421 las cuales se enviaron pára depósito el 28 de Julio de 2010 con NCIMB y que recibieron el número de acceso 41746, sirven como un ejemplo de la enseñanza de la presente invención y son equivalentes a ]Jas plantas aquí descritas que comprenden al menos un alelo de resistencia PM y al menos un alelo de resistencia PVY en la configuración cis sobre el mismo cromosoma.

De acuerdo con una modalidad, la presente invención proporciona un híbrido designado MGRlO-Fl-3019 del pimiento que es homocigótico para el alelo de resistencia al potyvirus y heterocigótico para el alelo de resistencia PM. Las semillas del híbrido designado MGRlO-Fl-3019 se enviaron para depósito el 28 de Julio de 2010 con NCIMB y recibieron el número de acceso 41745. MGRlO-Fl-3019 se describe en la presente como un ejemplo de la planta reivindicada que comprende dentro de su genoma, al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al oídio pulverulento (PM) , en donde los alelos de resistencia están presentes en la configuración cis sobre el mismo cromosoma, tal que dichos dos alelos de resistencia están en una fase de acoplamiento y no significa que sea limitante pero es ilustrativo de diversos tipos de pimiento y líneas que se pueden abarcar dentro del alcance de la presente invención.

De acuerdo con una modalidad adicional, la presente invención proporciona una línea de variedad de pimiento designada MGR10-F6-421, obtenida al usar etapas sucesivas de auto polinización y selección como se describen anteriormente. Las semillas de la variedad de pimiento designada MGR10-F6-421 para depósito el 28 de Julio de 2010 con NCIMB y recibieron el número de acceso 41746 MGR10-F6-421 es homocigótico para el alelo de resistencia al potyvirus, y homocigótico para el alelo de resistencia PM. La variedad de pimiento GR10-F6-421 se describe en la presente como un ejemplo de plantas que comprenden dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al oídio pulverulento (PM) , en donde , los alelos de resistencia están presentes en la configuración cis en el mismo cromosoma, de manera que dichos dos alelos de resistencia están en la fase de acoplamiento y no significa que sea limitante pero es ilustrativo de diversos tipos de pimiento y líneas que se puede abarcar dentro del alcance de la presente invención.

Estos genomas anteriores detallados se pueden obtener a partir del material depositado pero también se pueden obtener a partir de otro material. La secuencia de los genes obtenidos de otro material puede variar de la secuencia del gen en el material depositado ("variante") . Números de depósito NCIMB 41745 y 41746 o una variante genética del mismo que se refiere esencialmente al mismo genotipo y están disponibles. Las semillas de las plantas de pimiento similares a las anteriores, comprenden además al menos un rasgo adicional seleccionado del grupo que consiste de una tasa elevada de germinaciones, resistencia a herbicidas, resistencia a insectos, resistencia al menos a una enfermedad, resistencia a diversos tipos de tensiones no bióticas, esterilidad masculina y crecimiento vigoroso que se obtiene con respecto a un depósito hecho bajo las disposiciones del tratado de Budapest. Estos genomas |se pueden obtener a partir de dicho material depositado pero también se pueden obtener a partir de otro material. †as secuencias de los genes obtenidos de otro material pueden variar de la secuencia del gen en el material depositado ("variantes"). Números de depósito NCIMB 41745 y 41746 o una variante genética del mismo que se refiere esencialmente | al mismo genotipo están disponibles.

Plantas de la Invención y Partes de las Mismas.

La presente invención se refiere a plantas de pimiento que son resistentes al oídio pulverulento y a infección ;por un potyvirus, particularmente el virus de la papa Y, cada uno de los cuales se conoce que tiene efectos perjudiciales en el crecimiento de la planta del pimiento lo que resulta en un rendimiento reducido del cultivo y pérdida económica importante .

La presente invención describe por primera vez que el alelo para la resistencia al oídio pulverulento se liga al alelo para susceptibilidad al virus de la papa Y (PVY) . En donde ambos alelos se localizan en el cromosoma 4 en el genoma de las plantas del pimiento. De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona una planta de pimiento que comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al oídio pulverulento (PM) , en donde los alelos de resistencia están presentes en la configuración cis en el mismo cromosoma, tal que dichos dos alelos de resistencia están en la fase de acoplamiento.

Las plantas de la presente invención se originan- de plantas de pimiento de resistencia a PM y susceptibles al potyvirus, y plantas de pimientos susceptibles a PM y resistentes al potyvirus cruzadas para generar una población a partir de la cual plantas recombinantes que comprenden ambos alelos de resistencia sobre el mismo cromosoma en cis se seleccionan. Las plantas precursoras para producir las plantas de la presente invención se seleccionaron a partirl de una colección de germoplasmas de material de reproducciónl de propiedad que pertenece a Genetics Ltd. (Israel) , y material de reproducción proporcionado por la Organización de Investigación Hortícola, Volcan Center (Israel) . La selecci?? para plantas resistentes a PM o a un potyvirus se basó en la evaluación de severidad de la enfermedad e infección de la planta así como en ensayos moleculares.

La resistencia fenotípica a PM se basó en la infecciorde la planta con el hongo L. táurica. La severidad de 1os síntomas de la enfermedad depende no solamente del antecedente genético sino también en la edad de la plantaj y las condiciones ambientales. Así, se midieron los síntomas de la enfermedad en réplicas en un punto de tiempo de desarrol lo específico. Las plantas que no desarrollaron ninguno de los síntomas se designaron como resistentes. Una alta presencia de hongo en la planta definió a la planta como susceptible y "plantas moderadamente resistentes" en donde aquellas plantas que muestran un bajo nivel de presencia de hongos.

Así, de acuerdo con determinadas modalidades de la presente invención, la inoculación con L. táurica resulta en una aparición menor o ninguna aparición de síntomas de la enfermedad por oídio pulverulento en las hojas de la planta del pimiento.

La resistencia fenotípica al potyvirus PVY se confirmó con los puntos verdes tipo mosaico típicos, que no | se detectaron en la hoja de la planta infectada. Así de acuerdo con la presente invención, la inoculación con PVY resulta ¡en una aparición menor o ninguna aparición de manchas verdes tipo mosaico en las hojas de la planta de pimiento Los ensayos moleculares que usan marcadores molecularjes también se usaron para discriminar entre la presencia y |la ausencia de los alelos de resistencia a PM y PVY. Estíos marcadores se pueden usar además en la selección auxiliada por marcadores, es decir, en determinar el repuesto alélico de la planta en el lugar relacionado con resistencia a PM, y en el lugar relacionado resistente al potyvirus y la selección de las plantas que tenga el alelo resistente deseado en una configuración en una configuración cis sobre el mismo cromosoma Se confirmó la resistencia al potyvirus por el análi|is del ADN extraído de plantas candidato para la presencia del alelo de resistencia pvrl . Se puede usar cualquier método conocido en la técnica para identificar la presencia del alelo de resistencia pvrl o partes del mismo dentro de | la muestra de ADN.

De acuerdo con determinadas modalidades, la presencia del alelo de resistencia ADN se confirmó por la amplificación de un segmento de ADN usando un conjunto de cebadores y sometiendo al segmento o resultado de ADN a la restricción por enzimas de restricción. De acuerdo a determinadas modalidades actualmente preferidas, el segmento de ADN | se amplificó al usar un primer cebador que tiene una secuencia de polinucléotidos como se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucléotidos como se establece en SEQ ID NO: 3, y el segmento de ADN resultados se sometió a restricción por la enzima de restricción BseNI . La ausencia del sitio de restricción BseNI dentro del segmento de ADN amplificado de alrededor de 700bp, que tiene la secuencia como se establece en SEQ ID NO : 1 (FIG.3) es indicativa de la presencia del alelo |de resistencia pvrl .

La presencia del sitio de restricción BseNI dentro del segmento amplificado de ADN es indicativa de la presencia del alelo de susceptibilidad pvrl. Se obtienen dos segmentos después de la restricción con BseNI, uno de alrededor |de 130bp y uno de alrededor de 580bp.

La resistencia a PM se confirmó por el análisis del ÁDN extraído de plantas candidato para la presencia del alelo de susceptibilidad pvrl como se describe anteriormente. Se entiende que se pueden desarrollar ensayos similares para identificar los alelos de resistencia o susceptibilidad a PM y potyvirus, usando técnicas de rutina de biología molecular como se conocen por una persona experta en la técnica. Por ejemplo, otros fragmentos del gen pvrl del gen relacionado resistente a PM adyacente se pueden usar para diseñar pares o sondas de cebador PCR para hibridación con ácidos nucleicos y para desarrollar ensayos moleculares discriminantes con base en la información del ácido nucleico de la región amplificada por tales pares cebadores, o de la secuencia de ácidos nucleicos a las cuales se hibridizan tales sondas. El tipo exacto de ensayo desarrollado no es importante con tal de que pueda discriminar entre el alelo resistente a PM y el alelo resistente al potyvirus y la homocigocidad/heterocigocidad en el lugar deseado.

Con objeto de efectuar la selección asistida por el marcador en los métodos de la presente invención, las plantas de pimiento objetivo o las partes de las plantas se someten primero por ejemplo a extracción por ADN como se describe en la sección de ejemplos en la presente a continuación o por otras técnicas como se conocen en el arte. Una vez que está terminada la extracción, se puede efectuar un ensayo molecular incluyendo pero no limitado a un ensayo de secuencia polimórfica amplificado escindido (CAPS, por sus siglas en inglés) ver por ejemplo Akopyanz et al. 19Sj2. Nucleic Acid Research 20:6221-6225; Konieczny y Ausubel 1993. The Plant J. 4:403-410) o un ensayo de región amplificada caracterizado por la secuencia (SCAR) . Un ensayo SCAR involucra amplificar el ADN en el lugar (por ejemplo, el lugar de resistencia a PVY) por PCR seguido por la digestión con enzimas de restricción. Los polimorfismos entre las secuencias de ácido nucleico se diferencian entre alelos diferentes (tal como pero no limitado a los alelos [de susceptibilidad y resistencia a pvrl) al resultar por ejemp¡lo en diferentes fragmentos de restricción en tamaño Se usaron los marcadores CAPS para la selección indirecta de la resistencia al potyvirus en Capsicum con base en la secuencia genómica de acuerdo con Yeam et al., 2005| y Ruffel et al., 2002, ambas referencias se incorporan en |la presente en su totalidad.

El examen de la segregación de las plantas de pimiento F2 que resulta de una cruza entre una línea de reproducción resistente a PM y susceptible a PVY con una línea de cn.za resistente a PVY y susceptible a PM mostró que el gen pvrl y el gen relacionado con resistencia a PM se localizan en el cromosoma 4, alrededor de 2cM separados uno del otro. Debido a que la resistencia a PM está en la configuración trans con resistencia a PVY (el alelo de resistencia PM está en el mismo cromosoma con un alelo susceptible de a PVY) , i.as plantas que son resistentes a ambos PM y PVY son el resultado de los eventos de recombinación entre los dos genes resistentes.

De acuerdo con determinadas modalidades, las plantas de pimiento de la presente invención están sustancialme:ite resistentes a infección por potyvirus particularmente PVY, así como a infección por L. táurica. La resistencia máxima a los potyvirus se obtiene cuando las plantas son homocigóticas al alelo de resistente a pvrl . Esta observación está en línea con los resultados previos que postulan que la resistencia mediada a pvrl del pimiento (especie Capsicum) a un virus de la papa Y (PVY) es recesiva (Ruffle et al., 2002 supra) . Las plantas de pimiento que muestran síntomas moderados de oídio pulverulento fueron típicamente heterocigóticas al alelo de resistencia PM mientras que las plantas resistentes fuerjon homocigóticas a este alelo Así, ya que ambos rasgos se localizan en el mismo cromosoma de acuerdo con determinadas modalidades, las plantas que comprenden el alelo resistente a pvrl y el alelo resistente a PM en la configuración cis son homocigóticas El desarrollo de una cepa de pimientos superior, comercial requiere un esfuerzo de reproducción importante. Las plantas de pimiento resistente a los potyvirus y/o al PM que pueden usarse como una fuente para generar las plantas de la presente invención no son necesariamente útiles para la producción a una escala comercial, ya que pueden tener rasgos indeseables tales como una pobre tasa de germinación, bajo vigor, bajo rendimiento de la fruta, fruta pequeña susceptibilidad a otras enfermedades etc. Tales rasgos indeseables también conocidos como síntomas de arrastre genético, afectarán adversamente la aceptación comercial de la línea de plantas híbridas o endogámicas por los cultivadores. Generalmente, la presencia de un nivel adverso de arrastre genético se puede determinar por la presencia de uno o más de estos síntomas a tal grado de que la línea de la planta se hace comercialmente inaceptable.

La presente invención abarca cualquier parte de las plantas de la presente invención que comprenden dentro de su genoma al menos un alelo con resistencia al potyvirus y al menos un alelo con resistencia al PM en la configuración cis, tal que los dos alelos de resistencia están en una fase de acoplamiento incluyendo polen, óvulos y cultivos de tejido regenerados de estas plantas. El polen y los óvulos se usan en programas de reproducción en general y como se describen por la presente invención. El cultivo de tejidos del pimiento se puede usar para la regeneración in Vitro de una planta |de pimiento como se conoce también en la técnica.

Las plantas que comprenden dentro de su pedigrí una planta de pimiento que tiene en su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un aleló de resistencia PM en la configuración cis en el mismo cromosoma también se abarcan dentro del alcance de la presente invención De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la planta de pimiento es homocigótica para el alelo | de resistencia de potyvirus y para el alelo de resistencia | al PM.

De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, la planta es homocigótica para el alelo de resistencia al potyvirus y heterocigótica para el alelo .de resistencia al PM.

De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, la planta de pimiento se selecciona del grupo que consiste de una línea pura y un híbrido.

De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención la planta de pimiento de la reivindicaci'on 1, comprende además al menos un rasgo adicional seleccionado del grupo que consiste de una tasa elevada de germinación, resistencia a herbicidas, resistencia a insectos, resistencia al menos a una enfermedad, resistencia a diversos tipos |de tensiones no bióticas, esterilidad masculina y crecimiento vigoroso De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, el rasgo adicional antes mencionado se introduce por un método seleccionado del grupo que consiste de reproducción, conversión de rasgos simples y transíormaciónj.

De acuerdo con otras modalidades, la presente invención proporciona semillas de pimiento en donde las plantas que crecen de las semillas comprenden dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia PM en la configuración cis en el mismo cromosoma tal que los dos alelos de resistencia están establemente en la fase de acoplamiento Así de acuerdo con modalidades adicionales, la presente invención proporciona semillas como se definen anteriormente en donde en al menos un alelo de resistencia al potyvirus| y el al menos un alelo de resistencia PM se localizan en |el cromosoma 4.

De acuerdo con modalidades adicionales, la preseríte invención proporciona semillas como se definen anteriormente, en donde la planta crecida de la semilla es sustancialmente resisten a la enfermedad de PM provocada por el hongo táurica.

De acuerdo con modalidades adicionales, la presente invención proporciona semillas como se definen anteriormente, en donde la planta que crece de la semilla es además resistente a la infección por al menos un potyvirus.

De acuerdo con modalidades adicionales, la presente invención proporciona semillas como se definen anteriormente, en donde el potyvirus se selecciona del grupo del virus de la papa Y (PVY) , virus de la papa A (PVA) , virus del grabado del tabaco (TEV) y virus de moteado del pimiento (PepMoV) .

De acuerdo con modalidades adicionales, la presente invención proporciona semillas como se definen anteriormente en donde el potyvirus es PVY.

De acuerdo con otras modalidades, la presente invención proporciona semillas como se definen anteriormente en donde la inoculación de la planta que crece de la semilla con táurica resulta en una aparición menor o ninguna aparición de síntomas de enfermedad de oídio pulverulento en las hojas de la planta.

De acuerdo con otras modalidades la presente invención proporciona semillas como se definen anteriormente en donde los síntomas incluyen manchas cloróticas en la superficie superior de la hoja y esporulación con un tipo de polvo blanco en el área correspondiente de la superficie inferíor de la hoja.

De acuerdo con otras modalidades, la presente invenci on proporciona semillas como se definió anteriormente, en donde la inoculación de el crecimiento de la planta de tal semilla con PVY resulta en menor o ninguna apariencia de manchas verdes tipo mosaico en las hojas de la planta.

De acuerdo con otras modalidades, la presente invención proporciona semillas como se definió anteriormente, que comprenden dentro de su genoma una secuencia de ADN que se empareja con resistencia a un potyvirus, y una secuencia de ADN que se empareja con susceptibilidad a potyvirus, en donde la planta de pimiento es resistente a oídio pulverulento.

De acuerdo con otras modalidades, la presente invención proporciona semillas como se definió anteriormente, en donde la secuencia de ADN que se acopla con resistencia a potyvirus es una plantilla para amplificación de un fragmento de ADN usando un primer cebador que tiene una secuencia | de polinucleótido como se establece en la SEQ ID NO : 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótido como se establece en la SEQ ID NO: 3, tal fragmento de ADN que carece de un sitio de restricción para la enzima !de restricción BseNI .

De acuerdo con otras modalidades, la presente invención proporciona semillas como se definió anteriormente, en donde la secuencia de ADN que se acopla con susceptibilidad potyvirus, es una plantilla para amplificación de |un fragmento de ADN que usa un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótido como se establece en la SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia |de polinucleótido como se establece en la SEQ ID NO: 3, |el fragmento de ADN que contiene un sitio de restricción para|la enzima de restricción BseNI .

De acuerdo con otras modalidades, la presente invención proporciona una planta de pimiento, o una parte del mismo, producida al crecer la semilla antes mencionada como | se definió anteriormente.

De acuerdo con otras modalidades de la presente invención el pimiento cultivado de la semilla antes mencionada es homocigótico para el alelo resistente | al potyvirus y para el alelo resistente al PM.

De acuerdo con otras modalidades de la presente invención el pimiento cultivado de la semilla antes mencionada es homocigótico para el alelo resistente al potyvirus y heterocigótico para el alelo resistente al PM De acuerdo con otras modalidades de la presente invención el pimiento cultivado de la semilla antes mencionada se selecciona del grupo que consiste de una línea pura y un híbrido.

De acuerdo con otras modalidades, la presente invenci|on proporciona el polen de la planta de pimiento cultivada de lia semilla antes mencionada.

De acuerdo con otras modalidades, la presente invencijón proporciona el óvulo de la planta de cultivo a partir de lia semilla antes mencionada.

De acuerdo con otras modalidades, la presente invención proporciona un fruto de una planta de pimiento que comprende dentro de su genoma al menos un alelo resistente a potyvi us y al menos un alelo resistente a oídio pulverulento (PM) , presente en la posición cis en el mismo cromosoma tal que los dos alelos resistentes son co-heredados, en donde el frutóles una fruta dulce comestible.

De acuerdo con otras modalidades, la presente invención proporciona la fruta como se definió anteriormente, en donde el potyvirus se selecciona del grupo que consiste de virus de papa Y (PVY) , virus de papa A (PVA) , virus grabado de tabaco (TEV) y virus moteado de pimiento (PepMoV) De acuerdo con otras modalidades, la presente invención proporciona la fruta como se definió anteriormente, en donde el potyvirus es PVY.

De acuerdo con otras modalidades, la presente invención proporciona un cultivo de tejido de células regenerables | o protoplastos obtenidos de la planta de pimiento como |se definió anteriormente, o una parte del mismo.

De acuerdo con otras modalidades, la presente invención proporciona el cultivo de tejido como se definió anteriormente, en donde las células regenerables protoplasto de tal cultivo de tejido se obtienen de una parte de la planta seleccionada del grupo que consiste de hojas, polen, embriones, raíces, ápices radicales, anteras, flores, frutas y semillas.

De acuerdo con otras modalidades, la presente invención proporciona los cultivos de tejido definidos anteriormente, en donde el cultivo de tejido regenera una planta cue comprenden dentro de su genoma al menos un alelo resistente a potyvirus y al menos un alelo resistente a oídio pulverulento (PM) , presente en la configuración cis en el mismo cromosoma tal que los dos alelos resistentes están en fase de acoplamiento .

De acuerdo con aún modalidades adicionales, la presente invención proporciona plantas de pimiento, en donde '..as plantas o progenie o partes de los mismos se han transformado de modo que su material genético contiene uno o más transgenes operativamente ligados a uno o más elementos reguladores. Las plantas de pimiento y partes de los mismos producidos de las plantas transformadas también se abarcan dentro del alcance de la presente invención. De acuerdo con una modalidad, el gen o genes transformados confieren una característica seleccionada del grupo que consiste de resistencia a herbicidas, resistencia a insectos, resistencia a bacterias, enfermedad por hongo o virus, esterilidad cel sujeto de sexo masculino y crecimiento vigoroso. No obstante, de acuerdo con otras modalidades actualmente preferidas, ? as plantas de pimiento de la presente invención no se modifican genéticamente .

Métodos para generar las plantas de pimiento de la presente invención De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una planta de pimiento que comprende dentro de su genoma al menos un alelo resistente a potyvirus y al menos un alelo resistente a oídio pulverulento (PM) en donde los alelos se presentan | en configuración cis en el mismo cromosoma, que comprende las etapas de : a) proporcionar una primera planta de pimiento resistente a la infección por L. táurica y susceptible a virus de papa Y (PVY) y una segunda planta de pimiento susceptible a la infección por L. táurica y resistente a PVY; b) cruzar la primera y la segunda plantas de pimiento de la etapa ^a) para producir una progenie de planta de pimiento Fl; c) auto-polinizar la planta de pimiento Fl de la etajpa (b) para producir una progenie de planta de pimiento F2 ; d) analizar la progenie de la etapa (c) para plantías resistentes a la infección con L. táurica que comprenden dentro de su genoma un alelo resistente a PVY y un alelo susceptible a PVY; y e) seleccionar al menos una planta que tiene las características de la etapa (d) , que comprende dentro de |su genoma al menos un alelo resistente a potyvirus y al menos |un alelo resistente a oídio pulverulento (PM) en donde los alelos se presentan en configuración cis en el mismo cromosoma De acuerdo con ciertas modalidades, el método además comprende auto-polinizar la planta de la etapa (e) para obtener una progenie homocigótica para el alelo resistente | al potyvirus y el alelo resistente al PM.

De acuerdo a modalidades adicionales, el método como | se definió anteriormente además comprende las etapas de: a) aislar una muestra de ADN genómico de la planta F2 ; b) amplificar un segmento de ADN usando un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótido como | se establece en la SEQ ID NO : 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótido como se establece en la SEQ ID NO: 3; y, c) someter el segmento de ADN amplificado a la restricción con la enzima de restricción BseNI; en donde la ausencia de un sitio de restricción BseNI dentro del segmento de ADN amplificado distingue la planta como resistente a la infección por potyvirus y la presencia del sitio BseNI distingue la planta como susceptible a infección por potyvirus.

La planta de pimiento resistente a la infección por L. táurica y susceptible al virus de papa Y (PVY) y la planta de pimiento susceptible a la infección por L. táurica y resistente a PVY se puede identificar al infectar las plantas candidato con el patógeno y examinar los síntomas de la enfermedad o al usar marcadores moleculares, como se describió en la presente anteriormente.

Las plantas proporcionadas en la etapa (a) pueden ser de tipo silvestre o plantas cultivadas, o plantas modificadas tal como plantas mutagenizadas o transformadas. La progenie analizada en la etapa (d) de la cual las plantas deseadas se seleccionan es preferiblemente una generación F2 ; sin embargo, las plantas recombinantes deseadas pueden ser de cualquier generación, incluyendo generación F2 , F3 , etc.; generación de retrocruzamiento (BC1, BC2 etc.); etc La progenie analizada depende del esquema de cruce/selección deseado y los alelos presentes en las plantas usadas. Los ensayos moleculares y/o ensayos de inoculación se pueden realizar en diferentes generaciones; por lo que estas etapas (a) - (d) se pueden repetir varias veces, con objeto de identificar recombinantes que comprenden los alelos resistentes a potyvirus y resistentes a PM deseados en una configuración cis en el mismo cromosoma.

La selección de una planta recombinante que comprende |un alelo resistente a potyvirus y a PM en la configuración cis y la introgresión de esta unidad Mendeliana sencilla en otras plantas se puede realizar usando una combinación de biología molecular, patología de planta y técnicas de reproducci Ión tradicionales. En un enfoque preferido, la presente invención usa técnicas de biología molecular para discriminar entre diferentes alelos en el PM y lugares pvr para combinar i.os alelos deseados para resistencia de oídio pulverulento y potyvirus, específicamente resistencia a PVY en el genoma de pimiento cultivado. La presente invención facilita la cría de híbridos de pimiento con doble resistencia a PM y potyviruis y proporciona los medios para combinar la resistencia a PM y potyvirus con otros rasgos deseados, incluyendo resistencia a enfermedades adicionales.

La presente invención también abarca plantas producifias por el método de la presente invención, partes del mismo, cultivos de tejido derivados de los mismos y semillas producidas por los mismos.

La presente invención describe por primera vez que ¡la resistencia a potyvirus, específ camente resistencia a PVY, es una ligadura estrecha con la susceptibilidad a la infección por el hongo L. táurica que causa la enfermedad de oídio pulverulento en diversas especies de plantajs, incluyendo plantas de pimiento. Por lo tanto, se describe ahora que sorprendentemente, la resistencia a infección de potyvirus en plantas de pimiento está en fase de repulsion ligada con la resistencia a enfermedad de oídio pulverulento En consecuencia, la presente invención ahora describe que es posible usar los marcadores genéticos hasta ahora conocidos para distinguir entre plantas susceptibles resistentes a potyvirus, con objeto de asignar plantías resistentes a la infección por L. táurica. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto funcional, la presente invención proporciona un método para la caracterización de un planta de pimiento como resistente o susceptible a infección por L. táurica, que comprende las etapas de: a) aislar una muestra de ADN genómico de la planta; b) analizar la muestra de ADN para la presencia de un segmento de ADN que comprende un polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en la SEQ ID NO: 1 o un fragmento del mismo; y c) someter el segmento de ADN amplificado a ¡la restricción con la enzima de restricción BseNI; en donde la presencia de sitio de restricción BseNI dentro del segmento de ADN amplificado distingue la planta como resistente a la infección por L. táurica y la ausencia del BseNI distingue la planta como susceptible a la infección por L. táurica. El anterior es un método sorprendentemente conveniente para separación por exclusión y selección para plantas de pimiento resistentes a oídio pulverulento.

Los siguientes ejemplos se presentan con objeto de ilustrar más completamente ciertas modalidades de la invención. De ninguna manera deben, sin embargo, interpretarse como que limitan el amplio alcance de la invención. Un experto en la técnica puede concebir fácilmente muchas variaqiones y modificaciones de los principios descritos en la presente sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1; Evaluación de resistencia usando ensayos biológicos 1. Evaluación de resistencia a infección por el hongo táurica.

La enfermedad de oídio pulverulento se causa por el hongo Leveillula táurica. Este hongo es un parásito obligado, Israel) que contienen turba y vermiculita. Alrededor de 20-Í70 semillas de cada línea examinada se siembran, de las cuales alrededor de 10-50 plantas se inoculan. Las bandejas se mantienen en medio ambiente semi -controlado en uha temperatura entre 17 °C hasta 42 °C. Justo antes de 1as inoculaciones las plántula se transfieren de las bandejas a recipientes de 1 litro. La inoculación se lleva a ca!bo alrededor de 30-35 días después de la siembra, cuando 1as plántulas tienen 4-5 hojas genuinas .

Evaluación de respuesta de la planta Los síntomas típicos de oídio pulverulento aparecen alrededor de los 12-14 días después de la inoculación. Los síntomas (que aparecen en plantas susceptibles solamente) incluyen manchas cloróticas en la superficie superior de la hoja y una esporulación tipo polvo blanco en el área correspondiente de la superficie de la hoja inferior. La respuesta de la planta se evalúa típicamente alrededor de !.os 19-23 días después de la inoculación, aunque el tiempo específico puede variar de acuerdo con la velocidad de desarrollo de síntoma. En cada experimento, las plantas con genotipos conocidos (esto es, plan:as resistentes/susceptibles) se usan como un control. Las plantas examinadas se evalúan solamente cuando las plantas| de control muestran la respuesta esperada.

Una planta se define como susceptible cuando una esporulación masiva acompañada con distribución masiva !de manchas cloróticas se observa.

Una planta se define como resistente si no se observa esporulación y/o clorosis.

Una planta se define como parcialmente resistente si solamente aparecen grupos pequeños, locales de esporulación en la superficie de la hoja inferior y hay un número bajo de manchas cloróticas muy pequeñas. La FIG. 1 muestra la superficie de la hoja inferior de las hojas obtenidas de las plantas de pimiento resistentes (lado derecho) y plantas susceptibles (lado izquierdo) . Como se muestra, las hojas obtenidas forman la planta de pimiento susceptible exprisa los síntomas típicos de infección de oídio pulverulento como se definió anteriormente, mientras que las hojas resistentes tienen la apariencia de hojas no infectadas. 2. Evaluación de resistencia a infección por virus de papa Y (PVY) .

En la naturaleza, los síntomas de infección con PVY incluyen disminución de los entrenudos del tallo, manchas de hoja en un patrón tipo mosaico, malformación severa de las hojas superiores, defoliación, y muerte temprana de la planta. Para el propósito de evaluación de la resistenc las hojas solamente se examinan por la aparición de malformación y manchas verde oscuro tipo mosaico. La evaluación se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito abajo.

Preparación del inoculo Las plantas de pimiento infectadas con PVY se mantuvieron constantemente en un invernadero, en una temperatura de entre 18 °C hasta 25 °C, con periodo de 1 adicional de 8 horas (desde 16:00 hasta 22:0 0) proporcionado por lámparas de mercurio (todo el año) El inoculo se prepara por desgaste de material de planta infectada en agua de grifo en un material de planta relación del agua de grifo de 1:150 (típicamente, un (il gramo de material de planta infectada se muele en 150 |ml de agua de grifo) . La mezcla obtenida se usa para inoculación.

Inoculación de plantas examinadas Las semillas de las líneas obtenidas durante el programa de reproducción se siembran en bandejas Hishtil® (Hishtil, Israel) . Para cada línea examinada, alrededor de 30-60 plantas se inoculan por difusión de la mezcla de inoculo obtenida como se describió anteriormente en las hojas de la planta. La inoculación se lleva a cabo alrededor de 30-35 días después de la siembra, cuando las plántulas tienen 4-5 de hojas genuinas . Las líneas de planta de pimiento susceptibles (Hazera L4 , 1195) y las plantas de tabaco se usan como un control positivo para el éxito del ensayo de inoculación.

Evaluación de la respuesta de la planta Los síntomas típicos de infección por PVY aparecen alrededor de 3-4 semanas después de la inoculación. Las plantas susceptibles muestran malformación de la hoja ligera y un patrón tipo mosaico de manchas verdes oscuras. Las plantas resistentes no muestran síntomas.

Ejemplo 2; Evaluación de resistencia usando herramientas genéticas Soluciones de Aislamiento de AD : Solución amortiguadora de Extracción: Sorbitol 0.35M EDTA 5mM pH ajustado hasta 7.5 con HCl concentrado.

Solución amortiguadora de lisis nuclear: 10ml de EDTA 0.5M pH 8.0 40ml de NaCl 5.0M 2 gr CTAB La solución se agita durante la noche y el pH se ajusta hasta 7.5 con HCl concentrado. La solución luego se diluye con agua destilada hasta volumen total de 90 mi.

Solución de Sarcosilo: N-lauroilsarcosina al 5% Solución TE Tris-HCl lOmM pH 8.0 EDTA lmM Solución amortiguadora de almacenamiento 80 mi de Etanol al 95% 20 mi de acetato de Na 1M pH se ajusta hasta 7.5 con HCl concentrado.

Solución de octanol/cloroformo (1:24) Un volumen de octanol se mezcla con 24 volúmenes de cloroformo .

Procedimiento de extracción de ADN El ADN total se extrajo de tejido de planta fresco (ho-_ a, fruto verde, planta de semillero) usando el siguiente procedimiento : 1. Se prepara solución de extracción fresca al mezclar | 20 mi de Solución amortiguadora de Extracción, 20 mi de Solución amortiguadora de Lisis Nuclear y 8 mi de solución de Sarcosilo. Se agrega 0.38 mg de bi-sulfato de sodio y mezcla bien con la solución. 2. Alrededor de 3 gr de tejido de planta joven fresco se muelen con una cantidad pequeña de arena (Sigma S9887) y 1 mi de solución de extracción. 1 mi de la mezcla se transfiere a 1.5 mi de tubo microcentrifugo e incuba durante 15 min a 65°,C 3. 600 µ? de solución de octanol : cloroformo (1:24) luego se agrega a la mezcla de la etapa 2, mezclada por vórtice se centrifuga durante 5 min (12000 rpm) . 4. La fase superior obtenida después de |la centrifugación se transfiere a un tubo nuevo, sin interrumpir el peletizado de desechos celulares. 5. 600 µ? de isopropanol se agregan y la solución |se mezcla suavemente al invertir el tubo hasta que l|os precipitados se forman. 6. Las muestras se centrifugan durante 5 min (120|00 rpm) . 7. La fase superior se . descarta, 500 µ? de solución amortiguadora de almacenamiento se agregan y la centrifugación (etapa 6) se repite. 8. La fase superior de descarta de nuevo y el peletizado se seca en una maquina SpeedVac . 9. El peletizado de ADN se eluye con 60 µ? de solución TE e incuba durante 15 min a 65°C 10. El ADN puede almacenarse a 4°C durante un periodo corto o en el congelador durante un periodo largo |de almacenamiento .

Marcadores moleculares La selección de plantas resistentes al oídio pulverulento y/o PVY también fue con base en la configuración alélica de las plantas examinadas. Las plantas que son recesivas homocigotas al alelo pvrl son resistentes a PVY. En la naturaleza, estas plantas son susceptibles al oídao pulverulento. Se ha referencia ahora a la Fig. 3 que presenta la SEQ. ID NO : 1, que es la secuencia de nucleótido de un fragmento de ADN amplificado del gen pvrl. Los cebadores específicos, que están subrayados en la Fig. 3 antes mencionada, se diseñaron para amplificar el segmento de ADN de alrededor de 700 bp desde dentro del gen pvrl, que es indicativo de los alelos presentes en el genoma de la planta examinada: cuando este segmento de ADN incluye un sitio de restricción para la enzima de restricción BseNI que tiene la secuencia ACTGGn (SEQ. ID NO: ) es indicativo de la presencia del alelo de susceptibilidad dominante. Sometiendo el segmento de ADN a esta enzima de restricción, resulta en desdoblamiento de ADN en dos fragmentos, uno de alrededor de 130bp y el otro de alrededor de 580 bp. Cuando el sitio de restricción no se presenta dentro del segmento de ADN, | es indicativo de la presencia del alelo de resistencia recesivo El ensayo molecular por lo tanto comprende aislamiento de ADN de la planta examinada; amplificando un segmento de ADN con cebadores específicos; sometiendo el segmento de ADN amplificado a la restricción con la enzima de restricción BseNI y analizando los productos de restricción.

El ADN se aisló de plantas examinadas por el método descrito arriba en la presente. Un segmento de ADN se amplificó por reacción PCR usando los siguientes cebadores Delantero: 5' TGAGGCAGATGATGAAGTTGA 3' (SEQ ID NO: 2) Inverso: 5' CAACCATAAATATACCCCGAG 3' (SEQ ID NO : 3 ) La PCR se llevó a cabo en un volumen 25 µ? que contiene 50 ng de ADN genómico, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, MgCl2 2 niM, 0.2 mM cada dNTP, 0.4 µ? cada cebador delantero y cebador inverso, y 1 unidad de polimerasa Taq (Fermentas) . La PCR se realizó usando un termociclizador de investigación MJ modelo PTC- 100 (MJ Research, Ramsey, MN, EUA) . Las condiciones del ciclo fueron 95°C 3 min; 35 ciclos de (95°C 1 min, 60°C min, 72°C 1 min) y 72°C 7 min Después de la terminación de la reacción PCR, el ÁDN amplificado se sometió a restricción por la enzima |de restricción BseNI . Las alícuotas del producto PCR 20 µ? |se digirieron con 5 unidades de la endonucleasa de restricción BseNI y 2.5 µ?, 10X solución amortiguadora de reacción proporcionada por el fabricante (volumen total 25 µ?) durante 3 h a 65°C (la temperatura recomendada por el fabricante Los productos de restricción se analizaron por electroforesis de gel . 20 µ? de los productos de reacción se cargaron en gel de agarosa al 2% en solución amortiguadora TAE IX y corrieron durante 3 horas Se hace referencia ahora a la FIG. 2 que muestra la segregación del gen pvr en plantas F2. La presencia | de únicamente un segmento de ADN en una longitud de 711 bp que tiene una secuencia de ácido nucleico como se establece en SEQ ID N0:1 (FIG. 3) es indicativo de una planta homocigota para el alelo de resistencia PVY (R) . En plantas de tipo silvestre, también indicará que la planta es homocigota al alelo de susceptibilidad PM. La presencia de dos segmentos de ADN, una banda de una longitud de alrededor de 130 bp (no se muestra) y la otra banda de una longitud de alrededor de 580 bp es indicativa de una planta homocigota al alelo de susceptibilidad PVY (S) . En plantas de tipo silvestre, también indicará que la planta es homocigota al alelo |de resistencia PM. La presencia de los tres segmentos de ADN (en la longitud de 711bp, 580bp y 130 bp) es indicativa de úna planta heterocigota (H) Ejemplo 3; Producción de plantas de pimiento que tienen alelo de resistencia PM y alelo de resistencia PVY en la configuración cis en el mismo cromosoma El material de fuente incluido: línea pura de pimiento 50-0259A-4 que es resistente a oídio pulverulento (PM)| y susceptible a PVY; y línea pura de pimiento 100/201C que | es susceptible a PM y resistente a PVY. Estas líneas puras | se cruzaron para producir la población F2. La población F2 (122 plantas) más los precursores resistentes y susceptibles y la progenie Fx se plantaron en un invernadero en The Volcani Center (Bet Dagan, Israel) durante el invierno de 2005/06. Las plantas se identificaron como resistentes o susceptibl BS a infección P por L. táurica como se describió en la presente anteriormente. La evaluación de infección y patología se llevo a cabo dos veces en la etapa de fruta madura. El precursor resistente, homocigoto para el alelo de resistencia PM no desarrolla ninguno de los síntomas, |el precursor susceptible tiene alta ocurrencia de hongos mientras que las plantas de la progenie Fx fueron resistentes moderadamente con nivel bajo de ocurrencia de hongos. Oon base en el fenotipo de los precursores y la progenie Fj. se concluyó que la resistencia se hereda como parcialmente dominante .

En la población F2, 19 plantas sin síntomas se clasificaron como altamente resistentes a oídio pulverulento, 55 plantas con ocurrencia baja de hongos en la hoja se clasificaron como moderadamente resistentes y 48 plantas con ocurrencia alta de hongos en la hoja se determinaron para ser susceptibles a PM. Con base en la segregación de un gen sencillo se espera que 25% de la plantas F2 serán susceptibles. En la población F2 descrita arriba un porcentaje superior significativamente (39%) de las plantas se mostraron para ser susceptibles a un nivel similar a aquel observado para el precursor susceptible. Los resultados similares se obtuvieron en una segunda población F2 de los mismos precursores. Estas segundas plantas F2 se inocularon al soplar el hongo de una hoja inoculada a una hoja no inoculada adyacente por un invernadero de Hazera (Mivhor, Israel) en Marzo de 2006. La desviación de relaciones de segregación Mendeliana esperadas es un fenómeno bien conocido que puede ocurrir en regiones específicas del genoma en cruzas específicas.

El ADN extraído de las plantas F2 se analizó por PC para lugares de resistencia pvrl como se describen arriba. Las plantas F2 también se examinaron para su resistencia a PM por la prueba de inoculación descrita arriba. Los resultados de segregación de tanto PM como pvrl muestran que los 2 genes se ubican 2cM aparte una de la otra. Debido a que naturalmente, la resistencia a PM está en trans con resistencia a PVY (el al lo resistente a PM está en el mismo cromosoma con el alelo susceptible a PVY) , un evento recombinante entre los 2 genes resistentes deben ocurrir con objeto de obtener plantas que son resistentes a tanto PM como PVY.

Para este propósito las plantas F3 de 5 plantas recombinantes se plantan. Estas plantas F2 recombinantes son homocigotas resistentes para un gen (PM o PVY) y heterocigota para el segundo gen. Preferiblemente, el patrón de marcador biológico de la planta F2 es como de una planta heterocig ta para la resistencia PVY, esto es comprende un segmento de 711 bp, un segmento de 580 bp y un segmento de 130 bp; sin embargo, la planta es sustancialmente resistente a oídio pulverulenLo, Tabla 1: Resultados de los ensayos fenotípicos y molecul para las plantas recombinantes F3 De esta manera por los métodos de selección y reproducción específicos de la presente invención, como se desea, las plantas de pimiento F3 recombinantes , resistentes a oídio pulverulento y a infección por PVY se producen como se desea. Estas plantas, homocigotas para el alelo de resistencia a pvr y para el alelo resistente al PM, muestran co-segregación estable de ambos rasgos de resistencia .

Las plantas que tienen dos cromosomas de un par |de cromosoma que porta la resistencia a PM y PVY en lia configuración cis también son resistentes a PVY, como |se confirma por el ensayo biológico para la resistencia PVY.

La descripción anterior de las modalidades específicas así completamente revelará la naturaleza general de |la invención que otros pueden, al aplicar conocimiento actuál, modificar fácilmente y/o adaptar para varias aplicacior.es tales modalidades específicas sin experimentación indebida y sin alejarse del concepto genérico, y, por lo tanto, tales adaptaciones y modificaciones deberán y se pretenden para comprenderse dentro del significado e intervalo de equivalentes de las modalidades descritas. Es para entenderse que la fraseología o terminología empleada en la presente es para el propósito de descripción y no de limitación. Los medios, materiales, y etapas para llevar a cabo varias funciones descritas pueden tomar una variedad de formas alternativas sin alejarse de la invención REFERENCIAS DOCUMENTOS DE PATENTE US Patente de E.U.A. No. 6,350,933 Patente de E.U.A. No. 6,677,510 Patente de E.U.A. No. 5,589,612 Patente de E.U.A. No. 5,939,603 Patente de E.U.A. No. 5,986,175 Patente de E.U.A. No. 6,806,400 OTRAS PUBLICACIONES Daubeze et al., 1995. Plant Breed. 114:327-332.

Murphy and Deshpande, 1997. Vegetable Sci . 24:127-131 Lefebvre et al., 2003. Theor. Ap l . Genet . 107:661- 666.

Kang et al. Annu . Rev. Phytopathol . 43:581-621.

Ruffel et al., 2002. The Plant J. 32:1067-1075.

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Yearn et al. 2005. Theor. Appl. Genet. 112:178-186. Akopyanz et al., 1992. Nucleic Acid Research 20:6221-6225.

Konieczny and Ausubel, 1993. La planta J. 4:403-410 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. selecciona del grupo que consiste del virus Y de la papa (PVY) , virus A de la papa (PVA) , virus de grabado del tabaco (TEV) y virus de moteado del pimiento (PepMoV) . 6. La planta de pimiento de conformidad con ¡la reivindicación 3, caracterizada porque la inoculación con IL. táurica resulta en una aparición menor o ninguna aparición !de síntomas de la enfermedad de oídio pulverulento en las hojlas de la planta. 7. La planta de pimiento de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque los síntomas incluyen manchas cloróticas en la superficie superior de la hoja esporulación de tipo de polvo blanco en el á¿ea correspondiente de la superficie inferior de la hoja. 8. La planta de pimiento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la inoculación con PVY resulta en una aparición menor o ninguna aparición de manchas verdes tipo mosaico en las hojas de la planta. 9. La planta de pimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende dentro de su genoma una secuencia de ADN la cual se acopla con resistencia al potyvirus, y una secuencia de ADN que se acopla con susceptibilidad al potyvirus, en donde la planta de pimiento es resistente al oídio pulverulento. La planta de pimiento de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el acoplamiento con| la secuencia de ADN con resistencia al potyvirus es una plantilla para amplificación de un fragmento de ADN que usa un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 3, el fragmento de ADN carece de un sitio de restricción para la enzima de restricción BseNI, en donde además el acoplamiento de la secuencia de ADN con susceptibilidad al potyvirus es una plantilla para amplificación de un fragmento de ADN que usa un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene i.na secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NI : 3 , el fragmento de ADN contiene un sitio de restricción para la enzima de restricción BseNI. 11. La planta de pimiento de conformidad con | la reivindicación 1, caracterizada porque es homocigótica p¿ra el alelo de resistencia al potyvirus y para el alelo | de resistencia al PM. 12. La planta de pimiento de conformidad con | la reivindicación 11, caracterizada porque es una variedad designada MGR10-F6-421, semillas de la cual se depositaron con NCI B Ltd. , bajo el número de acceso 41746 13. La planta de pimiento de conformidad con | la reivindicación 1, caracterizada porque es homocigótica para el alelo de resistencia al potyvirus y heterocigótica para el alelo de resistencia a PM. 14. La planta de pimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque es un híbrido designado MGR10-F1-3019 , semillas de la cual se depositaron con NCIMB Ltd., bajo el número de acceso 41745. 15. La planta de pimiento de conformidad con |la reivindicación 1, caracterizada porque se selecciona d¡el grupo que consiste de una línea pura y un híbrido. 16. El polen y el óvulo caracterizados porque son de la planta de pimiento de conformidad con la reivindicación 1. 17. La planta de conformidad con la reivindicación caracterizada porque comprende además al menos un rasgo adicional seleccionado del grupo que consiste de tasa elevada de germinación, resistencia a herbicidas, resistencia insectos, resistencia al menos a una enfermedad, resistencia a diversos tipos de esfuerzos no bióticos, esterilidad masculina y crecimiento vigoroso. 18. La planta de pimiento de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque adicional se introduce el rasgo por un método seleccionado del grupo que consiste de reproducción, conversión de un rasgo adicional transformación . 19. Una semilla de una planta de pimiento, caracterizáda porque una planta que crece de la semilla comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia a potyvirus y al menos un alelo de resistencia al oídio pulverulento (P ) , en donde los alelos de resistencia están presentes en la configuración cis sobre el mismo cromosoma, tal que los dps alelos de resistencia están en fase de acoplamiento. 20. La semilla de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el al menos un alelo de resistencia al potyvirus y el al menos un alelo de resistencia al PM |se localizan sobre el cromosoma 4. 21. La semilla de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la planta que crece de la semilla es sustancialmente resistente a la enfermedad por PM provocajda por el hongo L. táurica. 22. La semilla de conformidad con la reivindicación 2-1, caracterizada porque la planta que crece de la semilla |es además resistente a la infección por al menos un potyvirus 23. La semilla de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el potyvirus se selecciona del grupo que consiste del virus Y de la papa (PVY) , virus A de la pc.pa (PVA) , virus de grabado del tabaco (TEV) y virus de moteado del pimiento (PepMoV) . 24. La semilla de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la inoculación de la planta que crece de la semilla con L. táurica resulta en una aparición menor o ninguna aparición de síntomas de la enfermedad de oídio pulverulento en las hojas de la planta. 25. La semilla de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque los síntomas incluyen manchas cloróticas en la superficie superior de la hoja y esporulación de tipo de polvo blanco en el área correspondiente de la superficie inferior de la hoja. 26. La semilla de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la inoculación de la planta que crece de la semilla con PVY resulta en una aparición menor o ninguna aparición de manchas verdes tipo mosaico en las hojas de la planta . 27. La semilla de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque comprende dentro de su genoma una secuencia de ADN la cual se acopla con resistencia |al potyvirus, y una secuencia de ADN que se acopla con susceptibilidad al potyvirus, en donde la planta de pimiento es resistente al oídio pulverulento 28. La semilla de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el acoplamiento con la secuencia de ADN con resistencia al potyvirus es una plantilla para amplificación de un fragmento de ADN que usa un priner cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO : 3 , el fragmento de ADN carece de un sitio de restriccion para la enzima de restricción BseNI, en donde además el acoplamiento con la secuencia de ADN con susceptibilidad al potyvirus es una plantilla para amplificación de un fragmento de ADN que usa un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ ID NO : 3 , el fragmento de ADN contiene un sitio de restricción para la enzima de restricción BseNI. 29. Una planta de pimiento, o una parte de la misrra, caracterizada porque es producida por el crecimiento de la semilla de conformidad con la reivindicación 19. 30. La planta de pimiento de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque es homocigótica para el alelo de resistencia al potyvirus y para el alelo de resistencia al PM. 31. La planta de pimiento de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque es una variedad designada MGR10-F6-421, semillas de la cual se depositaron con NCI B Ltd., bajo el número de acceso 41746. 32. La planta de pimiento de conformidad con | la reivindicación 29, caracterizada porque es homocigótica para el alelo de resistencia al potyvirus y heterocigótica para el alelo de resistencia al PM. 33. La planta de pimiento de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque es un híbrido designado MGR10-F1-3019, las semillas de la cual se depositaron con NCIMB Ltd., bajo el número de acceso 41745. 34. La planta de pimiento de conformidad con |la reivindicación 29, caracterizada porque se selecciona d¡el grupo que consiste de una línea pura y un híbrido. 35. El polen y óvulo caracterizados porque son de la planta de pimiento de la reivindicación 29. 36. La planta de conformidad con la reivindicación 2]9 , caracterizada porque comprende además al menos un rasgo adicional seleccionado del grupo que consiste de tasa elevada de germinación, resistencia a herbicidas, resistencia a insectos, resistencia al menos a una enfermedad, resistencia a diversos tipos de esfuerzos no bióticos, esterilidad masculina y crecimiento vigoroso. 37. La planta de pimiento de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque adicional se introduce el rasgo por un método seleccionado del grupo que consiste de reproducción, conversión de un rasgo adicional y transformación . 38. Un fruto de una planta de pimiento caracterizádo porque comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al oídio pulverulento (PM) , presente en la configuración cis sobre el mismo cromosoma, tal que los dos alelos de resistencia están en la fase de acoplamiento, en donde además el fruto es una fruta dulce comestible. 39. El fruto de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el al menos un alelo de resistencia al potyvirus y el al menos un alelo de resistencia al PM |se localizan en el cromosoma 4. 40. El fruto de conformidad con la reivindicación 3|9( caracterizado porque el potyvirus se selecciona del grupo que consiste del virus Y de la papa (PVY) , virus A de la papa (PVA) , virus de grabado del tabaco (TEV) y virus de moteado del pimiento (PepMoV) . 41. Un cultivo de tejidos de células regenerables | o protoplastos caracterizado porque es obtenido de la planta |de pimiento de conformidad con la reivindicación 1 o una parte de la misma. 42. El cultivo de tejidos de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque las células regenerables o protoplasto del cultivo de tejidos se obtienen de una parte de la planta seleccionada del grupo que consiste de hojas, polen, embriones, raíces, ápices radicales, anteras, flores, fruto y semillas 43. El cultivo de tejidos de conformidad con | la reivindicación 41, caracterizado porque regenera una pla ta que comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al oídio pulverulento (PM) , presente en la configuración cis sobre el mismo cromosoma de tal manera que los dos alelos de resistencia están en la fase de acoplamiento. 44. Un método para la producción de una planta |de pimiento que comprende dentro de su genoma al menos un ale'lo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al oídio pulverulento (PM) en donde los alelos están presentes en la configuración cis sobre el mismo cromosoma, caracterizado porque comprende las etapas de: a) proporcionar una primera planta de pimiento resistente a infección por L. táurica y susceptible al virus Y de la papa (PVY) y una segunda planta de pimiento susceptible a infección por L. táurica y resistente a PVY; b) cruzar la primera y segunda plantas de pimiento de la etapa (a) para producir una progenie de planta de pimieiito Fi; c) autopolinizar la planta de pimiento Fi de la etapa (b) para producir una progenie de la planta de pimiento F2; d) analizar la progenie de la etapa (c) para plantas resistentes a la infección con L. táurica que comprenden dentro de su genoma un alelo resistente a PVY y un alelo susceptible a PVY; y e) seleccionar al menos una planta que tenga las características de la etapa (d) , que comprende dentro de su genoma al menos un alelo de resistencia al potyvirus y al menos un alelo de resistencia al oídio pulverulento (PM) en donde los alelos están presentes en la configuración cjis sobre el mismo cromosoma. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque comprende además autopolinizar la planta de la etapa (e) para obtener una progenie homocigótica para el alelo de resistencia al potyvirus y el alelo |de resistencia a PM. 46. El método de conformidad con la reivindicación 4| 4, caracterizado porque comprende además las etapas de: a) aislar una muestra de ADN genómico de la planta de pimiento F2; b) amplificar un segmento de ADN que usa un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótido como |se establece en SEQ ID NO : 2 y un segundo cebador que tiene na secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ |ID NO: 3; y c) someter el segmento amplificado de ADN a restricción con la enzima de restricción BseNI; en donde la ausencia de un sitio de restricción BséNI dentro del segmento amplificado de ADN distingue la planta como resistente a la infección por potyvirus y la presencia del sitio BseNI distingue la planta como susceptible infección por potyvirus. 47. Un método para distinguir una planta de pimiento como resistente o susceptible a infección por L. táurica, caracterizado porque comprende las etapas de: a) aislar una muestra de ADN genómico de la planta b) amplificar un segmento de ADN que usa un primer cebador que tiene una secuencia de polinucleótido como |se establece en SEQ ID NO: 2 y un segundo cebador que tiene una secuencia de polinucleótidos como se establece en SEQ |ID N0:3; y c) someter el segmento amplificado de ADN a restricción con la enzima de restricción BseNI; en donde la presencia del sitio de restricción BseNI dentro del segmento de ADN amplificado distingue la planta como resistente a la infección por L. táurica y la ausencia del sitio BseNI caracteriza a la planta como susceptible infección por L. táurica.