MX2010008292A - Metodos anti-fungicos. - Google Patents

Abstract

Se describe un sistema para reducir la incidencia o severidad de infección fúngica de una planta, que comprende un componente fungicida química, el cual puede ser proporcionado mediante aplicación foliar o en raíz (nutriente para suelo o líquido), junto con una defensina de planta anti-fúngica no expresada por naturaleza en la planta siendo protegida o expresada en cantidades menores o en diferentes tejidos, proporciona mejoras sinergísticas en protección contra infección por un hongo patogénico vegetal, el cual es susceptible a la defensina y al fungicida. El fungicida puede ser una estrobilurina o un triazol, y la defensina se puede seleccionar de una amplia variedad de defensinas conocidas, por ejemplo, NaD1 y otras, o puede ser una defensina quimérica diseñada por ingeniería para tener una baja toxicidad a la planta. La defensina puede ser provista como una formulación de proteína, opcionalmente junto con el fungicida, o puede ser provista a través de expresión recombinante en la planta que será protegida de la infección fúngica.

Description

METODOS ANTI-FUNGICOS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad de la Solicitud Provisional de E.U.A. serie número 61/025,655, presentada el 1o de Febrero del 2008, y de la Solicitud Provisional de E.U.A. serie número 61/085,682, presentada el 1o de Agosto del 2008. Ambas solicitudes se incorporan aquí para referencia.

RECONOCIMIENTO DE HALLAZGO FEDERAL No aplicable.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a estrategias para la protección de plantas de infección o infestación por agente patogénicos, especialmente hongos, así como de condiciones de enfermedad asociadas con los mismos. í ANTECEDENTES DE LA INVENCION Se citan referencias aquí para indicar el estado de la técnica y no deben tomarse como conocimiento de importancia específica a la patentabilidad de la invención. Se proporcionan detalles bibliográficos de las publicaciones denominadas por el autor al final de la especificación. Las pérdidas de cultivos debido a la infección por patógenos fúngicos son un problema principal en la industria agrícola y cada año se gastan millones de dólares en la aplicación de fungicidas para refrenar estas pérdidas (Oerke, 2003). La naturaleza es una fuente rica de péptidos antimicrobianos, muchos de los cuales exhiben actividad anti-fúngica. Se han desarrollado péptidos antimicrobianos para proteger a organismos de patógenos. Se especificidad parece depender enormemente del organismo a partir del cual se origina, probablemente debido a la presión evolucionaría colocada en estos organismos por varios patógenos. Como tales, los péptidos aislados de especies de mamíferos en general exhiben un grado más alto de actividad hacia patógenos bacterianos comparado con patógenos fúngicos, presumiblemente debido al gran riesgo de infección por parte de las bacterias. En contraste, los péptidos antimicrobianos de plantas generalmente exhiben una actividad anti-fúngica más alta debido al gran riesgo de infección fúngica enfrentada por las plantas.

Las defensinas de las plantas representan una clase de péptido antimicrobiano (revisado por Lay y Anderson (2005)). Existe una amplia variedad de defensinas con diferentes patrones espaciales y temporales de expresión y espectros de actividad. Estas incluyen RsAFPI y RsAFP2 de rábano, Ah-AMP4 de Aesculus hippocatanum, y AlfAFP de alfalfa, p 139 y pl230 de chícharo, y DmAM P 1 de dalia así como ZmESR6, PhD2, PhD1, BSD 1 , RsAFP4, WT1, RsFP3, AhAMPI, CtAMPI, HsAFPI, HvAMPI, PsD1, AX2, AX1, SoD2, VaD1, gD1, NaD2, J1-2, SD2 y EGAD1, y de preferencia defensinas florales tales como NaD1 y NaD4 de Nicotiana alata y Tomdef2 y Tomdef3 de Lycopersicum cerasiforme . Los mecanismos que subrayan la especificidad de ¡estos péptidos permanecen desconocidos, aunque se presume que están involucradas interacciones con la superficie celular. Ya q,ue la permeabilizacion de la membrana es una actividad común de muchos péptidos antimicrobianos y la composición de membrana de varios tipos de célula es altamente variable, se postula que la presencia de lípidos específicos en algunos casos es responsable de la susceptibilidad del péptido. En particular, la membrana plasmática de células bacterianas contiene fosfolípidos negativamente cargados en la capa externa, mientras que las células de mamífero no (Matsuzaki, 1999). Estos lípidos negativamente cargados pueden interactuar con péptidos antimicrobianos positivamente cargados. Para apoyar esta hipótesis, estudios in vitro han demostrado que la presencia de lípidos negativamente cargados es importante para la actividad de permeabilizacion de membrana de un número de p¡éptído antimicrobianos (Matsuzaki y otros, 1995; Matsuzaki, 1999; Ladokhin y White, 2001; Epand y otros, 2006). La permeabilizacion de membrana ha sido sugerida como un mecanismo para algunas defensinas vegetales, aunque el mecanismo de permeabilización no ha sido investigado. En el caso de las defensinas vegetales RsAFP2 y DmAMPI, se dice que la permeabilización involucra un receptor específico en la superficie celular. La presencia de esfingolípidos específicos en la membrana plasmática también es requerida para la actividad de estas defensinas, posiblemente como sitios de unión (Thevissen y otros, 2000a, b; Thevissen y otros, 2004; Thevissen y otros, 2005, Ramamoorthy y otros, 2007). Los fungicidas químicos son muy comúnmente utilizados en establecimientos agrícolas y hortícolas. Las estrobilurinas y triazoles son particularmente importantes para usarse en estas industrias. Las estrobilurinas incluyen estrobilurinas A hasta la H, azoxistrobina, cresoxim-metilo, picoxiestrobina, fiuoxaestrobina, orizaestrobina, dimoxiestrobina, piracloestr.obina, metominoestrobina, y trifloxiestrobina . Para una revisión de las estrobilurinas fúngicas ver, Bartlett y otros (2002). Como una clase, las estrobilurinas son parte del grupo de resistencia cruzada Q0 (inhibidores externos de quinona), e inhiben organismos sensibles uniendo el citocromo b e inhibiendo el transporte de electrones y la síntesis de ATP. Los fungicidas de triazol son caracterizados como inhibidores de desmetilasa, e interfieren con la síntesis de esterol en hongos sensibles. Los fungicidas de triazol se describen en la Patente de E.U.A. No. 4,767,777, por ejemplo.

Existe la necesidad en la técnica de economías mejoradas de producción agrícola y mejora de producciones de cultivo. La enfermedad fúngica es una fuente importante de pérdida de producción y estrategias actuales para el control de hongos ambas costosas y que dañan potencialmente el ambiente. Existe la necesidad de nuevos sistemas para proteger a las plantas agronómicas y ornamentales de enfermedades, especialmente la enfermedad fúngica. Aquí se describe un sistema para reducir la pérdida económica que resulta del daño a cultivos y plantas ornamentales causado por agente patogénicos, tales como agentes fúngicos. Además de reducir significativamente el daño a plantas, el costo de producción puede ser reducido a través del uso disminuido de pesticidas químicos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona, entre otras cosas, un sistema para proteger a una planta de una infestación o infección fúngica y/o reducir la incidencia o severidad de una enfermedad asociada con el patógeno. En una modalidad, el patógeno es un agente fúngico y la enfermedad en una enfermedad fúngica. El sistema abarca a un mínimo, dos componentes, una defensina vegetal, la cual por naturaleza no es expresada por la planta, y un agente químico, en particular un fungicida químico. Una propiedad sorprendente del sistema es la propiedad de sinergismo que se observa en la combinación de una defensina anti-fúngica y un fungicida químico como se describe aquí. Como un ejemplo, entre muchos descritos aquí, existe una inhibición sinergística de Fusarium graminearum y Fusarium oxysporum (Fov) a través de una combinación de al menos una defensina vegetal, por ejemplo, NáD1 o una variante anti-fúngica de la misma, y al menos uno de varios fungicidas químicos incluyendo, pero no limitándose a, estrobi (urina y triazol. Un hongo individualmente- susceptible a inhibición por cada uno de los componentes del sistema puede ser más efectivamente controlado al utilizar la combinación que a través de cualquier componente por sí mismo, a pesar de utilizar una concentración más baja del fungicida químico en el aspecto de combinación. Un hongo es "susceptible a inhibición" por cada uno de los componentes individuales del sistema si se puede mostrar que, cada componente individualmente ejerce una actividad inhibidora contra el hongo, lo los componentes en combinación ejercen un efecto inhibidor combinado que es sínergístico. ¡ En ciertos estudios descritos aquí, el efecto de un componente del sistema en la permeabilidad de células fúngicas es medido. Una substancia cuya ubicación puede ser identificada, ya sea dentro o fuera de una célula fúngica, se emplea. La substancia algunas veces es denominada aquí como "compuesto indicador de permeabilidad". Un compuesto indicador de permeabilidad es uno cuya presencia ya sea dentro o fuera de una célula, puede ser detectablemente medida en virtud de poseer una propiedad detectable tal como fluorescencia, radio-etiqueta, característica inmunológica, o similares. También, el compuesto indicador de permeabilidad es uno que, bajo condiciones normales, permanece extracelular, y no puede ser detectado intracelularmente a menos que la permeabilidad de la célula haya sido alterada a partir de la condición fisiológica norma de la célula. En principio, un indicador de permeabilidad puede ser uno normalmente retenido intracelularmente, solo fugándose bajo condiciones anormales, pero el primer tipo de indiciador es el más común. Ejemplos de compuestos indicadores de permeabilidad incluyen colorantes fluorescentes que se unen a ácidos nucleicos tales como SYTOX® Green o yoduro de propidio. Otros ejemplos incluyen dextranas marcadas con FITC o un anticuerpo marcado con oro inmunológico, cuyo sitio puede ser visto a través de un microscopio. La misma defensina marcada fluorescentemente puede ser utilizada como un compuesto indicador de permeabilidad. El término "cantidad detectable" pretende transmitir esas diferencias en cantidad del compuesto indicador de permeabilidad que pueden ser semi-cuantitativamente analizadas, suficientes para propósitos de comparación. Con el propósito de comparar el posible efecto de una defensina vegetal sobre la permeabilidad de la célula fúngica, la defensina vegetal, NaD1, se utiliza como una base para la comparación. Como se describe aquí, el efecto de una defensina dada sobre la permeabilidad de una célula fúngica puede ser cuantificado como un "índice de permeabilidad relativa" a través del uso de un compuesto indicador de permeabilidad.

Las modalidades de la presente invención incluyen aquellas en donde la defensina es cualquier defensina con actividad fungicida y/o fungística contra al menos un hongo patogénico de planta. Ejemplos de de dichas defensinas anti-fúngicas incluyen sin limitación RsAFPI y RsAFP2 de rábano, Ah-AMP4 de Aesculus hippocatanum, y AlfAFP de alfalfa, p 139 y pl 230 de chícharo, y DmAMPI de dalia así como ZmESR6, PhD2, PhD1, BSD1, RsAFP4, WT1, RsFP3, Ah AM P 1 , CtAMPI, HsAFPI, HvAMPI, PsD1, AX2, AX1, SoD2, VaD1, gD1, NaD2, J1-2, SD2 y EGAD1, y de preferencia defensinas florales tales como NaD1 y NaD4 de Nicotiana alata y Tomdef2 y Tomdef3 de Lycopersicum cerasiforme . En el sistema de la presente, para la protección de plantas, también se pueden emplear moléculas de defensinas quiméricas y/o variantes de defensina que retienen la actividad anti-fúngica. Los compuestos útiles en las modalidades de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, compuestos anti-fúngicos total o localmente sistémicos (penetrante local) a partir de las siguientes clases: estrobilurinas, triazoles, anilinopirimidinas, carbamatos de valinamida, bencim idazoles, tiofanatos, acilalaninas, carbamatos, fosfonatos de etilo, dicarboximidas y carboxamidas. Ejemplos de estrobilurinas útiles incluyen sin limitación, azoxiestrobina, cresoxim-metilo, picoxestrobina, fluoxaestrobina, orizaestrobina, dimoxiestrobina, piracloestrobina, metominoestrobina, trifloxiestrobina, enestrobina. Ejemplos de triazoles útiles incluyen sin limitación, azaconazol, bitéranol, bromuconazol, ciproconazol, difenoconazol, dinicohazol, epoxiconazol, fenbuconazol, fluquinconazol, flusilazol, flutriafol, hexaconazol, imibenconazol, ipconazol, metconazol, miclobutanil, penconazol, propiconazol, protioconazol, simeconazol, tebuconazol, tetraconaxol, triadmefon, triadimenol, triticonazol. Ejemplos de anilnopirimidinas útiles incluyen sin limitación, pirimetanil, ciprodinil, mepanipirim. Ejemplos de carbamatos de valinamida incluyen sin limitación, iprovalicarb, bentiavalicarb y valifenal. Ejemplos de bencimidazoles útiles incluyen sin limitación, benomil, carbendazim, fuberidazol, tiabendazol. Ejemplos de tiofanatos útiles incluyen sin limitación, tiofanato, tiofanato-metilo. Ejemplos de acilalaninas útiles incluyen sin limitación, metalaxil-M, benalaxil, metalaxil, furalaxil. Ejemplos de carbamatos útiles incluyen sin limitación, propamocarb, yodocarb, protiocarb. Ejemplos de fosfonatos de etilo útiles incluyen sin limitación, fosetil-AI. Ejemplos de dicarboximidas útiles incluyen sin limitación, clozolinato, iprodiona, procimidona, viclozolin. Ejemplos de carboxamidas útiles incluyen sin limitación, benodanil, mepronil, flutolanil, fenfuram, tifluzamida, boscalid, oxicarboxin, carboxin, pentioopirad y furametpi. Las plantas que pueden ser protegidas de la infección fúngica por el sistema de la presente invención incluye aquellas que con susceptibles a un hongo que sea sensible a un fungicida químico, especialmente una estrobilurina o un triazol, y una defensina vegetal que puede ser expresada como un transgen en esa planta o a la cual se le pueda aplicar una composición comprendiendo la defensina. Preferiblemente, la planta puede ser una planta monocotiledónea, especialmente una planta de la familia Poaceae, asi como granos, tales como maíz, cebada, trigo, arroz, y similares, o una planta dicotiledónea, especialmente de la familia Solanaceae, Brassicaceae, Malvaceae, y Fabaceae. La infección y el daño a partir de muchos patógenos fúngicos, especialmente aquellos que son hongos filamentosos, pueden ser controlados en muchas especies de plantas utilizando el sistema de la presente. Ejemplos de patógenos fúngicos y oomycete incluye, pero no se limitan a, Fusarium, Verticillium, Pythium, Rhizoctonia, Sclerotinia, Leptosphaeria, Phytophthora, Colletotrichum, Diplodia, Cercospora, Aspergillus, Macrophomina, Phialophora, Diaporthe, Thielaviopsis, Alternaría, Phoma, Phymatotrichopsis y hongos de herrumbre y hollín, tales como Puccinia, Phakopsora y Ustílago. Aplicaciones importantes incluyen, pero no se limitan a, las combinaciones sinerg ísticas de un compuesto fungicida químico y una defensina anti-fúngica utilizada, por ejemplo, para proteger a la cánola del pie negro, maíz o trigo (u otros granos) de Fusarium graminearum, y algodón de Fusarium oxysporum . La presente invención además proporciona un uso de un primer componente y un segundo componente en una planta, cada uno de dichos primero y segundo componentes siendo un inhibidor de un hongo susceptible dado, el primer componente siendo una defensina vegetal, la cual no es expresada por naturaleza por dicha primera planta mencionada, el segundo componente siendo un fungicida químico en la inhibición del hongo cuando se combina en contacto con el hongo en dicha planta.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A hasta la E son representaciones gráficas mostrando el efecto de combinaciones de la defensina NaD1 y fungicidas sobre el crecimiento de Fusarium graminearum ¡n vitro. El crecimiento de hongos se midió a través del incremento en densidad óptica a 595 nm (A595) obtenido a las 44, 45, ó 68 horas después de inoculación del medio de crecimiento, (eje vertical) y se gráfico contra la concentración de fungicida (mg/l) en el eje horizontal. La línea sólida conecta los resultados de muestra obtenidos en presencia de 0 µ? NaD1; las líneas rayadas, punteadas y de puntos y rayas representan varias concentraciones de NaD1 como se indica en las gráficas. Las barras de error indican intervalos de 95% de confidencia. Figura 1A. Combinación de NaD1 y propiconazol. Crecimiento a las 44 horas. Figura 1B. Combinación de NaD1 y tebuconazol. Crecimiento a las 44 horas. Figura 1C. Combinación de NaD1 y flusilazol. Crecimiento a las 44 horas. Figura 1D. Combinación de NaD1 y azoxiestrobina. Crecimiento a las 45 horas. Figura 1E. Combinación de NaD1 y picoxiestrobina. Crecimiento a las 45 horas. La Figura 1F proporciona una comparación del efecto ejercido a partir de una respuesta aditiva (Ee) con la respuesta observada (lo) en los bioensayos fúngicos ilustrados en las Figuras 1A-E. Figura 1G. Combinación de NaD1 y propiconazol. Crecimiento a las 45 horas. Figura 1H. Combinación de NaD1 y propiconazol. Crecimiento a las 45 horas. Las Figuras 2A hasta la F y Figuras 2H hasta la I muestran el efecto de combinaciones de la defensina NaD1 y fungicidas sobre el crecimiento de Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum (Fov), in vitro. El crecimiento fúngico se midió a través del incremento en densidad óptica a 595 (A595) obtenido a las 45, 45.5, 47, ó 48 horas después de la inoculación del medio de crecimiento, (eje vertical) y se gráfico contra la concentración fungicida (mg/l) en el eje horizontal. La línea sólida conecta resultados de muestra obtenidos en presencia de 0 µ? NaD1; las líneas rayadas, punteadas y de puntos y rayas representan varias concentraciones de NaD1 como se indica en las gráficas. Las barras de error indican intervalos de 95% de confidencia. Figura 2A. Combinación de NaD1 y azoxiestrobina. Crecimiento después de 47 horas. Concentraciones de azoxiestrobina 0-1 mg/l. Figura 2B. Combinación de NaD1 y azoxiestrobina. Crecimiento después de 47 horas. Concentraciones de azoxiestrobina 0-4 mg/l. Figura 2C. Combinación de NaD1 y picoxiestrobina. Crecimiento después de 48 horas. Concentraciones de picoxiestrobina 0-1 mg/l. Figura 2D. Combinación de NaD1 y fluoxaestrobina. Crecimiento después de 45.5 horas. Concentraciones de fluoxaestrobina 0-1 mg/l. Figura 2E. Combinación de NaD1 y propiconazol. Crecimiento después de 45 horas. Concentraciones de propiconazol 0-4 mg/l. Figura 2F.

Combinación de NaD1 y propiconazol. Crecimiento después de 47 horas. Concentraciones de propiconazol 0-1 mg/l. Figura 2G. Comparación del efecto esperado a partir de una respuesta aditiva (Ee) con la respuesta observada (lo) en los bioensayos fúngicos se ilustra en las Figuras 2A-F. Figura 2H. Combinación de NaD1 y picoxiestrobina. Crecimiento después de 47 horas. Concentraciones de picoxiestrobina 0-0.125 mg/l. Figura 21. Combinación de NaD1 y picoxiestrobina. Crecimiento después de 47 horas. Concentraciones de picoxiestrobina 0-1 mg/l. Las Figuras 3A y B son representaciones tabuladas mostrando el efecto de la combinación de fluoxaestrobina y NaD1 en una planta de algodón transgénica después de infección por Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum (Fov). Figura 3A, bioensayo de invernadero y Figura 3B, bioensayo de gabinete de crecimiento determinando la combinación de fluoxaestrobina y la defensina NaD1 sobre la infección del algodón con Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum (Fov). Semillas de Coker 315 no transgénico y Coker 315 transgénico expresando NaD1 (línea 35.125.1, solicitud de Patente de E.U.A. 12/105,956) con y sin recubrimiento de semilla de fluoxaestrobina. Los resultados representan el porcentaje de mortalidad y clasificación de enfermedad promedio después de 8 semanas para la prueba de invernadero y 5 semanas para la prueba de gabinete de crecimiento. Se utilizaron 48 y 30 semillas para las pruebas de invernadero y de gabinete de crecimiento, respectivamente. Las Figuras 3C-3F ilustran los resultados obtenidos en un bioensayo de experimento de campo para determinar el efecto de la combinación de un transgen expresando la defensina NaD1 en algodón (línea transgénica 35.125.1) y recubrimiento de semilla con varios fungicidas químicos después de la infección por Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum (Fov). Los resultados representan el porcentaje de mortalidad a partir de los días 14 a 57 después de la germinación. Alrededor de 1100-1400 semillas germinadas se obtuvieron y se verificaron para cada tratamiento. Las barras de error representan niveles de 95% de confidencia. Las semillas de Coker 315 no transgénicas y de Coker transgénicas que expresan NaD1 (línea 35.125.1) con y sin recubrimientos de semilla de la Figura 3C Jockey®, Figura 3D Dynasty®, Figura 3E Redigo® y Figura 3F HEC5725, respectivamente. Figura 3G. Comparación de la sobrevivencia mejorada esperada a partir de una respuesta aditiva (Ee) con la sobrevivencia mejorada observada (lo) en los bioensayos de campo ilustrados en las Figuras 3C-F. Las Figuras 4A hasta la C son representaciones gráficas mostrando el efecto de combinaciones de la defensina NaD1 y fungicidas sobre el crecimiento de Verticillium dahliae in vitro. Se midió el crecimiento fúngico a través del incremento en la densidad óptica a 595 nm (A595) obtenido a las 118 horas después de inoculación del medio de crecimiento, (eje vertical) y se gráfico contra la concentración de fungicida (mg/l) sobre el eje horizontal. La línea sólida conecta resultados de muestra obtenidos en presencia de 0 µ? NaD1; las líneas rayadas, punteadas y de rayas y puntos representan varias concentraciones de NaD1 como se indica en las gráficas. Las barras de error indican intervalos de 95% de confidencia. Figura 4A. Combinación de NaD1 y propiconazol. Figura 4B. Combinación de NaD1 y tebuconazol. Figura 4C. Combinación de NaD1 y flusilazol. Figura 4D. Comparación del efecto esperado a partir de una respuesta aditiva (Ee) con la respuesta observada (lo) en los bioensayos fúngicos ilustrados en las Figuras 4A-C. La Figura 5 proporciona representaciones tabuladas mostrando el efecto de la combinación del recubrimiento de semilla Dynasty® (marca registrada) (Syngenta) y NaD1 en una planta de algodón transgénica con infección por Verticillium dahliae en el campo. Figura 5A. Resultados de semillas determinación de ensayo de campo de Coker 315 no transgénico y Coker 315 transgénico expresando NaD1 (línea 35.125.1, solicitud de patente de E.U.A. 12/105,956) con y sin recubrimiento de semilla Dynasty™ (marca registrada) y el recubrimiento de semilla Sicala V2 de industria estándar con Dynasty® (marca registrada). Los resultados representan el porcentaje de germinación después de 4 semanas, porcentaje de sobrevivencia de plantas germinadas después de 18 semanas y porcentaje de plantas no infectadas al final del experimento (30 semanas). Se determinó la clasificación de Verticillium en cosecha. Se utilizaron 500 semillas para cada tratamiento. Figura 5B. La producción de cápsulas de algodón y lino a partir de las plantas descritas en la Figura 5A. Las Figuras 6A y B son representaciones gráficas mostrando el efecto dé combinaciones de la defensina NaD1 y fungicidas sobre el crecimiento de Leptosphaeria maculans in vitro. Se midió el crecimiento fúngico a través del incremento en la densidad óptica a 595 nm (A595) obtenido después de 96 horas de la inoculación del medio de crecimiento (eje vertical) y se gráfico contra la concentración fungicida (mg/l) en el eje horizontal. Se pre-germinaron esporas de L. maculans durante 48 horas en un medio líquido V8 antes de la adición de combinaciones de NaD1 y fungicida. La línea sólida conecta los resultados de muestra obtenidos en presencia de 0 µ? NaD1; las líneas de rayas, punteadas y punteadas-rayadas representan varias concentraciones de NaD1 como se indica en las gráficas. Las barras de error indican intervalos de 95% de confidencia. Figura 6A. Combinación de NaD1 y protioconazol. Figura 6B. Combinación de NaD1 y f luquinconazol. Figura 6A. Comparación del efecto esperado a partir de una respuesta aditiva (Ee) con la respuesta observada (lo) en los bioensayos fúngicos en las Figuras 6A-B. Ciertos valores con negativos (es decir, más crecimiento que el control) ya que "0 uM NaD1, 0.25 mg/l de protioconazol" tiene más crecimiento que "0 uM NaD1, 0 mg/l de protioconazol". La Figura 7A es una representación gráfica del nivel de NaD1 según determinado a través de ELISA en las hojas de la generación T3 de la línea CAT13.26 transformadas con pHEX3. Como el estándar se utilizó NaD1 purificado a partir de Nicotiana alata. Las Figuras 7A y 7B son gráficas de barra mostrando los resultados del bioensayo de invernadero con cañóla transgénica infectada con Leptosphaeria maculans. Durante 10 días, se desarrollaron treinta semillas de RI64 no transgénico y RI64 transgénico expresando NaD1 (CAT13.26). Los cotiledones después se inocularon con esporas de Leptosphaeria maculans y se midió el área de lesión en el Día 10 (Figura 7B) y Día 17 (Figuras 7C). La Figura 8A es un perfil de elución de RP-HPLC de proteínas a partir de flores de tomate. Las proteínas que se unieron a SP-Sepharose se recolectaron y se separaron en una columna de RP-HPLC Zorbax 300SB-C8 analítica utilizando un sistema Agilent Technologies serie 1200 y un gradiente lineal de 40 minutos (0-100% regulador de pH B). Se detectaron proteínas eluidas a través de absorbencia a 215 nm. La Figura 8B es un perfil de elución de RP-HPLC de proteínas a partir de flores N. alata. Las proteínas que se unieron a SP-Sepharose se fraccionaron adicionalmente en una columna de RP-HPCL Vydac C8 de preparación utilizando un sistema Beckman Coulter System Gold y un gradiente lineal de 40 minutos (0-10% regulador de pH B). La Figura 8C es una tabla que lista la fuente de la planta y la masa de la semilla y defensinas florales que se probaron. La Figura 8D es una representación gráfica del consumo verde SYTOX en hifas de F. graminearum inducido por varias concentraciones de NaD1. La Figura 8E es una representación gráfica de liberación de ATP a partir de hifas de F. graminearum inducida por varias concentraciones de NaD1. La Figura 8F es una representación gráfica de la actividad de permeabilización de membrana relativa así como la actividad anti-fúngica relativa de cada una de las defensinas en hifas de F. graminearum. La permeabilización relativa (gráfica de columnas, eje izquierdo) se estimó a partir de la liberación de ATP relativa inducida después de la adición de las varias defensinas. Se midió el crecimiento fúngico (eje de linea, eje derecho) a través del incremento en densidad óptica a 595 nm (Abs 595 nm) obtenido después de 24 horas de la inoculación del medio de crecimiento. Ver Figura 8C para la identificación de las defensinas. Las Figuras 8G-8L son representaciones gráficas mostrando el efecto de varias defensinas en combinación con fungicidas sobre el crecimiento de F. graminearum. Se midió el crecimiento fúngico a través del incremento en densidad óptica a 595 nm (Abs 595 nm) obtenido después de 24 horas de la inoculación del medio de crecimiento, (eje vertical) y se gráfico contra la concentración de fungicida (mg/l) en el eje horizontal. La línea sólida conecta los resultados de muestra obtenidos en ausencia de NaD1; las lineas rayadas, punteadas, de puntos y de rayas representan varias concentraciones de NaD1 como se indica en las gráficas. Las barras de erro indican el error estándar de la media. La Figura 8M es una comparación del efecto esperado a partir de una respuesta aditiva (Ee) con la respuesta observada (lo) en los bioensayos fungióos ilustrados en las Figuras 8G-8L. La Figura 8N es una tabla que muestra el índice de permeabilidad relativo de las defensinas listadas en 8C así como su actividad anti-fúngica relativa en F. graminearum y la sinergia relativa con el fungicida, tebuconazol. El índice de permeabilidad (Pl) se definió como la cantidad relativa de unidades de luminiscencia obtenidas en 10 minutos con 1 µ? de defensinas comparado con la luminiscencia obtenida con 1 µ? NaD1 que dio un Pl de 1. La Figura 9 muestra una clasificación propuesta de defensinas vegetales. El árbol filogenético de unión cercana de dominios maduros de defensina vegetal se construyó utilizando MEGA 4.0. Se indicaron réplicas de instrucciones preliminares mayores que 50%. Las defensinas se separaron en grupos y subgrupos (indicados a la derecha) basándose en la longitud de la ramificación. Escala de ramificación = substituciones por residuo. NaD1 se indica por una flecha. La Figura 10 muestra un árbol filogenético de defensina vegetal indicando funciones conocidas de péptidos individuales. Esta es una vista circular del árbol filogenético construido en la Figura 9. Las ramificaciones que representan diferentes grupos se indican en el círculo externo. Las funciones conocidas de péptidos individuales se indican por formas individuales (ver leyenda).

DESCRIPCION DETALLADA Se utilizan varios términos de acuerdo con sus significados generalmente aceptados. Para claridad, los siguientes términos se explican adicionalmente a continuación. Un "hongo susceptible" es una cepa fúngica que puede ser inhibida en forma separada a través de cada uno de los componentes de la invención o a través de una combinación de ambos componentes. En algunos casos, la inhibición por uno de los componentes solo puede no ser detectable dado el sistema de ensayo empleado, pero se encontrará que contribuye significativamente a toxicidad cuando se combina con el otro componente. Ver, por ejemplo, Figura 1G, cuando la toxicidad de 0.24 µ? NaD1 con Fusarium graminearum es muy baja en ausencia de fungicida, pero la cual es significativamente mejorada cuando se combina con 1 mg/l de propiconazol. El ejemplo anterior también demuestra la sinergia observable cuando una defensina y un fungicida se aplican en combinación. Cualquier cepa fúngica que pueda ser inhibida por NaD1, por ejemplo, puede ser un hongo susceptible si ese hongo también es inhibido por una estrobilurina, un triazol, u otro fungicida. Se ha mostrado que NaD1 inhibe el crecimiento de un arreglo representativo de hongos filamentosos, incluyendo, pero no limitándose a, Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, Fusarium oxysporumf. sp. lycopersici, Fusarium solani, Fusarium pseudograminearum, Cochliobolus heterostrophus, Alternaría brassicola y Gaeumannomyces graminis var. tritici, Thielavippsis basicola, Verticillium dahliae, Aspergillus nidulans, Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinérea y Leptosphaeria maculans. Se ha mostrado que las defensinas relacionadas con activas para inhibir F. graminearum , incluyendo preferiblemente defensinas florales, por ejemplo sin limitación NaD1, Tomdef2 y Tomdef3. Por consiguiente, un gran número de combinaciones sinergísticas de defensinas vegetales y fungicidas químicos está disponible para protección de plantas contra muchas enfermedades fúngicas, especialmente aquellas causadas por hongos filamentosos. i En algunos casos, el efecto inhibidor de un fungicida o defensina dada puede estar por abajo del límite de detección para un ensayo dado, bajo las condiciones de prueba empleadas. Greco y otros 1995 han definido diferentes categorías de sinergia, de acuerdo con si uno, ambos o ninguno de los dos componentes tenga actividad medible cuando se analiza en ausencia del otro componente. La definición adoptada aquí incluye todas !estas situaciones siempre que el efecto combinado de los dos componentes que actúan conjuntamente sea capaz de ser mayor que la suma de los componentes individuales que actúan solos. Se entenderá que una combinación sinergística de dos o más componentes puede producir más que una actividad aditiva solo bajo ciertas condiciones, por ejemplo, cuando uno o más de los componentes está presente a una concentración más baja que la máxima para una eficacia individual. Una combinación de componentes se considera sinergística, como el término lo dice aquí, si existe un grupo de condiciones, incluyendo, pero no limitándose a, concentraciones, en donde el efecto combinado de los componentes que aptúan conjuntamente es mayor que la suma de los componentes individuales que actúan solos. En una modalidad, existe un sistema para proteger plantas de cultivo de enfermedades fúngicas, que comprende un primer componente y un segundo componente, cada uno de dicho primer componente y segundo componente siendo un inhibidor de un hongo susceptible dado, la combinación siendo sinergística. Richer (1987) ha descrito aspectos cuantitativos para demostrar y evaluar la sinergia. Ahí se describe la fórmula de Limpel para comparar un nivel observado de inhibición (lo) en presencia combinada de dos componentes inhibidores, X e Y, con un efecto aditivo esperado /Ee) que resulta de que cada X o Y está actuando en forma separada a las mismas concentraciones respectivas como las usadas para medir su efecto combinado. El porcentaje de inhibición aditiva, Ee, se calcula como X + Y - XY/100, en donde X e Y se expresan como el porcentaje de inhibición. El sinergismo existe cuando lo>Ee. Los valores de Ee e lo han sido calculados a partir de datos descritos aquí basándose en la expresión anterior. En ciertas circunstancias se pueden utilizar aspectos alternativos, como se describe por Richer (1987). La fórmula de Limpel también ha sido utilizada por Harman y otros, patente de E.U.A. 6,512,166, para demostrar sinergia. La inhibición fúngica incluye tanto actividad fungicida como fungistátíca, según medido a través de la reducción del crecimiento fúngico (o pérdida de viabilidad) comparada con un control. El crecimiento fúngico puede ser medido a través de diferentes métodos conocidos en la técnica. Un método comúnmente utilizado para medir el crecimiento de un hongo filamentoso resulta en producir esporas de germinación en un medio de crecimiento adecuado, incubar durante un tiempo suficiente para obtener un crecimiento medible, y medir la densidad óptica incrementada en el cultivo después de un tiempo de incubación especificado. La densidad óptica se incrementa con el crecimiento incrementado. Típicamente, el crecimiento fúngico es necesario para patogénesis. Por lo tanto, la inhibición del crecimiento fúngico proporciona un indicador adecuado para protección de una enfermedad fúngica, es decir, mayor es la inhibición más efectiva es la protección. "Prevenir infección", en el contexto de la presente, significa que las plantas tratadas con el sistema de la presente invención evitan la infección por patógeno o síntomas de enfermedad o ambos, o exhiben infección por patógeno o síntomas de enfermedad, o ambos, reducidos, minimizados o menos frecuentes, que la producción natural de las interacciones de planta-patógeno cuando se compara con plantas ni tratadas con el fungicida químico ni que expresan el transgen defensina o se tratan con la defensina. Es decir, los hongos patogénicos son evitados o reducidos de causar una enfermedad y/o los síntomas asociados con la enfermedad. La infección y/o síntomas se reducen al menos a aproximadamente; 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ó 80% o más según comparado con una planta no así tratada con el sistema aquí enseñado. En un escenario alternativo, el sistema de la presente invención da como resultado esporulación reducida del hongo patogénico a la planta, que es sensible tanto al fungicida químico como a la defensina, reduciendo así la reproducción del hongo y la diseminación de la enfermedad . La protección de la planta (resistencia o reducción de enfermedad) puede ser evaluada a través de métodos conocidos en la técnica. Ver, Potter y otros, (1993); Gorlach y otros, (1996); Alexander y otros, (1993). El experto en la técnica reconocerá que los métodos para determinar infección y enfermedad de planta por un patógeno de planta dependen del patógeno y de la planta que sé está tratando. El término "defensina vegetal" ha sido bien definido en la literatura (ver, por ejemplo, Lay y Anderson (2005)). Las defensinas vegetales son proteínas pequeñas, ricas en cisteína que tienen típicamente 45-54 aminoácidos. Los residuos de cisteína forman un patrón definitivo, característico de enlaces de disulfuro. NaD1 es una defensina vegetal aislada del tejido floral de Nicotiana alata. Las secuencias de aminoácido y de codificación de NaD1 se describen en la patente de E.U.A. 7,041,877, la cual se incorpora aquí para referencia. Otras defensinas anti-fúngicas son bien conocidas en la técnica, incluyendo, pero no limitándose a, RsAFPI y RsAFP2 de rábano, Ah-AMP4 de Aesculus hippocatanum, y AlfAFP de alfalfa, pl 39 y pl230 de chícharo, y DmAMPI de dalia así como ZmÉSR6, PhD2, PhD1, BSD 1 , RsAFP4, WT1, RsFP3, Ah AMP 1 , CtAMPI, HsAFPI, HvA PI, PsD1, AX2, AX1, SoD2, VaD1, gD1, NaD2, J1-2, SD2 y EGAD1, y de preferencia defensinas florales tales como NaD1 y NaD4 de Nicotiana alata y Tomdef2 y Tomdef3 de Lycopersicum cerasiforme. Las funciones de los dominios de defensinas vegetales se discuten en la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 12/105,956, presentada el 18 de Abril del 2008, y se incorpora aquí para referencia. La cola o extremo C-terminal de NaD1 u otra defensina teniendo una cola C-terminal, puede ser incorporada a través de una tecnología de ADN recombinante en la estructura de otras defensinas con el fin de reducir la toxicidad (potencial) a la planta que expresa el transgen. Además, la cola C-terminal de otra defensina o una secuencia de activación vacuolar de otra proteína de planta puede ser substituida por aquella de NaD1. El término "fungicida químico" se utiliza aquí para incluir compuestos químicos inorgánicos y orgánicos utilizados como fungicidas para proteger a las plantas de enfermedad por hongos. Muchos fungicidas útiles se establecieron anteriormente, supra, los párrafos anteriores. Un efecto sinergístico ocurre cuando dos o más componentes producen un resultado combinado que es mayor que la suma de los resultados individuales de cada componente que actúa solo. Como se describe aquí, la inhibición de crecimiento fúngico sinergistica medida en presencia combinada de al menos una defensina vegetal y por lo menos un fungicida químico es mayor que la inhibición sumada y medida en presencia de cada componente, defensina y fungicida, individualmente, bajo condiciones de otra manera idénticas. Se entenderá que no es necesario que se observe un efecto aditivo mayor con cada combinación de concentraciones de los dos componentes con el fin de ser considera sinergístico. El efecto sinergístico de los dos componentes puede ser observado bajo ciertas combinaciones de concentración, pero no en otras. Por ejemplo, si la entrada a la célula limita la actividad fungicida, la presencia de defensina puede dar como resultado sinergia, en especial si la concentración de fungicida aplicado solo es sub-máxima con respecto a la inhibición. Igualmente, la sinergia puede ser enmascarada si uno o ambos componentes está presente a dicho alto nivel que de cómo resultado una inhibición máxima observable. El sistema general para una combinación de fungicida de defensina, por lo tanto, se denomina "sinergística" ya que existe el potencial para sinergia aún si no se observa sinergia bajo todas las condiciones. La sinergia entre una defensina vegetal y un fungicida químico proporciona una mayor inhibición fúngica que la que se obtiene a través de cualquier componente que actúa solo, para al menos algunas dosis. En algunos casos, un fungicida que no es mediblemente efectivo contra un patógeno particular se vuelve efectivo en presencia de defensina. Por lo tanto, esta invención proporciona protección incrementada de plantas de una enfermedad fúngica con dependencia reducida en el fungicida químico^ Las ventajas incluyen costo de entrada reducido para los agricultores, un espectro más amplio de actividad contra patógenos de planta y potencial reducido para daño ambiental. Además, la presión de selección para desarrollo de cepas fúngicas resistentes al fungicida es enormemente reducida, lo cual permite una vida comercial extendida así como una proliferación reducida de cepas fúngicas resistente y la probabilidad reducida de emergencia de múltiples cepas resistentes. Los métodos para utilizar el sistema de la presente invención pueden ser adaptados a combinaciones individuales de planta que será protegida y cepas fúngicas que serán inhibidas, así como se entiende en la técnica. El mecanismo de infección del hongo, la parte o partes de la planta que son susceptibles a ataque fúngico, y la etapa de crecimiento de la planta cuando es probable que ocurra la enfermedad fúngica, son factores importantes que tienen que ser considerados. Por ejemplo, si las hojas de una planta o fruta madura son el sitio principal de crecimiento fúngico, la aplicación de un fungicida como una aspersión foliar (superficie) puede ser el medio preferido para suministrar el fungicida químico. En el caso de enfermedad fúngica en algodón causada por Fov, el daño más importante ocurre en plántulas jóvenes. En ese caso, el componente fungicida de preferencia es incorporado en la tierra u otro medio de crecimiento, colocado como cubierta en las semillas o rociado sobre las plántulas emergentes. A partir del contacto de la planta con un fungicida químico, puede haber un transporte sistémico del fungicida a través de la planta. Los regímenes efectivos de aplicación de la composición fungicida pueden ser influenciados por muchos factores, incluyendo el ambiente y se deben determinar bajo condiciones de uso reales. Preferiblemente, el régimen de aplicación es de aproximadamente 0.11208 kilogramos por hectárea a aproximadamente 11.208 kilogramos por hectárea de fungicida químico. El fungicida de interés puede ser aplicado a las plantas que serán protegidas o tratadas en la forma de una composición con vehículos, agentes tensoactivos, auxiliares u otros químicos promotores de aplicación de costumbre empleados en la técnica de formulación. Los vehículos, agentes tensoactivos y similares puede ser sólidos o líquidos y son las substancias ordinariamente empleadas en la tecnología; de formulación, por ejemplo, substancias minerales naturales o regeneradas, solventes, agentes de dispersión, agentes humectantes, adherentes, espesantes, aglutinantes y/o fertilizantes.

La composición fúngica puede ser aplicada a las partes de las plantas que están por arriba del suelo para protegerlas de ataque fúngico, especialmente las hojas (aplicación foliar). La frecuencia y régimen de aplicación dependen de las condiciones biológicas y climáticas del patógeno. Las composiciones también pueden penetrar las plantas a través de las raíces mediante la tierra o a través del agua (acción sistémica) si el sitio de la planta es impregnado con una formulación líquida o una que se disuelve en agua (cultivo de arroz, por ejemplo) o si la composición se introduce en forma sólida en la tierra, por ejemplo, en la forma de gránulos (aplicación a la tierra). Con el fin de tratar la semilla, las composiciones pueden ser aplicadas a tubérculos o semillas (recubrimiento) ya sea impregnando los tubérculos o semillas con una formulación liquida o recubriendo con una formulación combinada húmeda o seca. Otras estrategias para aplicaciones también son bien conocidas en la técnica. En un aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema para la protección de una planta de una enfermedad fúngica, y esa prevención o tratamiento da lugar a una necesidad reducida de tratamiento con fungida de plantas o partes de planta, reduciendo así los costos de material, trabajo y contaminación ambiental, o prolongando la vida al almacenamiento de los productos (por ejemplo, frutas, semillas, y similares) de dichas plantas. El término "planta" incluye plantas completas y partes de las mismas, pero no se limita a, órganos/estructuras vegetativos del retoño (por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/estructuras florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos), semillas (incluyendo embriones, endospermo, y recubrimiento de semilla) y fruta (el ovario maduro), tejido de la planta (por ejemplo, tejido vascular, tejido terrestre, y similares) y células (por ejemplo, células de guarda, células haploides, y similares), y la progenie de la misma. Las plantas que pueden ser protegidas utilizando el sistema de la invención incluyen plantas superiores e inferiores, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), gimnospermas, pteridof itas, equisetáceas, psilotopsidas, licofitas, briofitas, y algas multicelulares. Las plantas para usarse en el sistema de la presente invención pueden incluir cualquier planta vascular, por ejemplo, monocotiledóneas o dicotiledóneas o gimnospermas, incluyendo, pero no limitándose a, alfalfa, manzana, Arabidopsis, plátano, cebada, cañóla, arbusto de ricino, crisantemo, clavo, cacao, café, algodón, semilla de algodón, maíz, crambe, arándano rojo, pepino, dendrobium (orquídea), dioscorea (nuez negra), eucalipto, festuca, lino, gladiola, liliácea, aceite de linaza o de semilla de lino, ¡mijo, melón, mostaza, avena, palma aceitera, semilla de aceite de colza, papaya, cacahuate, piña, plantas ornamentales, Phaseolus (frijoles, porotos, habichuelas, etc.), papa, colza, arroz, centeno, lolium, cártamo, ajonjolí, sorgo, soya, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, fresa, tabaco, tomate, semilla de césped, trigo y cultivos vegetales tales como lechuga, apio, brócoli, coliflor, cucurbitáceas, cebollas (incluyendo ajo, chalotas, poros, y cebollines); fruta y árboles de frutos secos, tales como manzana, pera, durazno, naranja, toronja, limón, lima, almendras, nuez pacana, nogal, avellana; viñas, tales como uvas, kiwi, lúpulos; arbustos frutales y zarzas, tales como frambuesa, mora, grosella; árboles de bosque, tales como fresno, pino, abetos, arce, quercus, castaño, popular; siendo preferidos alfalfa, cañóla, arbusto de ricino, maíz, algodón, crambe, lino, semilla de lino, mostaza, palma aceitera, aceite de colza, cacahuate, papa, arroz, cártamo, ajonjolí, soya, remolacha azucarera, girasol, tabaco, tomate y trigo. Más particularmente, las plantas para usarse en los métodos de la presente invención incluyen cualquier planta de cultivo, por ejemplo, cultivo de forraje, cultivo de cañóla, cultivo de grano, cultivo de fruta, cultivo vegetal, cultivo de fibra, cultivo de especies, cultivo de nuez, cultivo de semilla de césped, cultivo de azúcar, cultivo de bebida, y cultivo de bosque. La planta de cultivo puede ser soya, trigo, maíz, algodón, alfalfa, remolacha azucarera, arroz, papa, tomate, cebolla, una legumbre, o una planta de chícharo. Una "planta transgénica" se refiere a una planta, o su semilla, que contiene material genético no encontrado (es decir, "exógeno") en una planta de tipo silvestre de la misma especie, variedad o cultivo. El material genético puede incluir un transgen, un evento de mutagénesis de inserción (tal como a través de un transposón o mutagénesis de inserción de T-ADN), una secuencia de marcación de activación, una secuencia mutada, un evento de recombinación homólogo o una secuencia modificada por quimeraplastía. Típicamente, el material genético extraño ha sido introducido a la planta a través de manipulación humana, pero cualquier método puede ser utilizado como un experto en la técnica lo reconoce. Una planta transgénica puede contener un vector o cásete de expresión. El cásete de expresión típicamente comprende una secuencia de codificación de polipéptido operablemente enlazada (es decir, bajo el control regulador de) a secuencias reguladoras inducibles o constitutivas apropiadas que permiten la expresión del pol i péptid o . El cásete de expresión puede ser introducido a una planta a través de la transformación o reproducción después de la transformación de una planta de origen. El término planta transgénica abarca plantas de progenie (y semillas) que contienen el vector o cásete de expresión. La planta o parte de una planta para usarse en el sistema de la presente incluye plantas en cualquier etapa de desarrollo de la planta. Preferiblemente, la aplicación ocurre durante las etapas de germinación, crecimiento de plántula, crecimiento vegetativo y crecimiento reproductivo. Muy preferiblemente, las aplicaciones de la presente invención ocurren durante las etapas de crecimiento vegetativo y reproductivo. Las etapas de crecimiento vegetativo y reproductivo también son denominadas como plantas "adultas" o "maduras". Aunque la presente descripción proporciona un sistema para proteger plantas de infección fúngica utilizando un fungicida químico y una defensina anti-fúngica y la acción sinergística de la misma, se debe entender que se pueden agregar materiales adicionales a la composición aplicada para obtener un mayor beneficio con respecto a la saluda de la planta, por ejemplo, incorporando un compuesto insecticida o nematicida, o utilizando más de una defensina y/o más de un fungicida químico. El componente defensina de preferencia se suministra a través de la planta que se va a proteger, aunque se pueden utilizar en ciertos casos, aspersiones en la superficie o recubrimientos de semilla. En ciertas modalidades, la planta es genéticamente modificada para expresar la defensina deseada utilizando métodos bien conocidos en la técnica. En el ejemplo del algodón que será protegido de enfermedad causada por Fov, una variedad de algodón normalmente susceptible a infección por Fov ha sido genéticamente transformada para expresar la defensina, NaD1. La variedad de algodón transgénico que expresa NaD1 ha mostrado estar significativamente protegida de los efectos patológicos de la infección por Fov en ensayos de campo, comparado con la variedad de origen no transformada (solicitud de E.U.A. 12/105,956, presentada el 18 de Abril del 2008, incorporada aquí para referencia al grado de que no hay inconsistencia con la presente descripción). Los resultados establecen que Fov es susceptible a NaD1 y que la cantidad de una defensina, tal como NaD1, puede ser expresada a través de plantas transgénicas es suficiente para contribuir a un efecto sinergístico cuando se combina con la aplicación de un fungicida químico como se describe aquí. La proteína defensina purificada puede, si se desea, ser directamente combinada con el fungicida químico como una mezcla, siempre que puedan ser formulados en conjunto o secuencialmente a través de medios de aplicación separados. En una modalidad adicional, la defensina puede ser provista por plantas "nodrizas" transgénicas desarrolladas junto a las plantas que van a ser protegidas. Se ha reportado la permeabilización de membrana para algunas defensinas vegetales, aunque el mecanismo de permeabilización no ha sido investigado. En el caso de las defensinas vegetales RsAFP2 y DmAMPI, se cree que la permeabilización involucra un receptor específico en la superficie celular. La presencia de esfingol ípidos específicos en la membrana plasmática también es requerida para la actividad de esas defensinas, posiblemente como sitios de unión (Thevissen y otros, 2000a, b; Thevissen y otros, 2004; Thevissen y otros, 2005). NaD1 se probó in vitro para actividad anti-fúngica contra el hongo filamentoso Fusarium oxysporum (Fov), Verticillium dahliae, Thielaviopsis basteóla, Aspergillus nidulans y Leptosphaeria maculans. A 1 µ?, NaD1 retrasó en crecimiento de Fov y L. maculans por un 50% mientras que V. dahliae, T. basicola, y A. nidulans todos se inhibieron por aproximadamente 65%. A 5 µ? de NaDI, el crecimiento de las cinco especies se inhibió por más de 80%. EEstas cinco especies fúngicas todas son miembros de ascomycete phyium y están distribuidas entre tres clases en subphylum pezimycotiria. Estos hongos son patógenos fúngicos agronómicamente importantes. Todos los hongos filamentosos probados de esta manera son sensibles a la inhibición por NaD1. La actividad anti-fúngica contra F. graminearum se demostró aquí para NaD4, tomdef2 y Tomdef3. Bajo las condiciones probadas, NaD1 no tuvo efecto en el crecimiento de las levaduras Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans y Pichia pastoris, o las cepas bacterianas Gram-negativas y Gram-positivas probadas. El efecto de NaD1 en levadura se repitió bajo las mismas condiciones, en donde las defensinas vegetales RsAFP2 y RsAMPI inhibieron el crecimiento de C. albicans y S. cerevisiae, respectivamente. Bajo estas condiciones, NaD1 no inhibió el crecimiento de ninguna levadura de phylum Ascomycetes, subphylum Saccharomycetes. Además, NaD1 no fue tóxico a células HeLa humanas o a células de insecto Spodoptera frugiperda Sf-21.

CUADRO 1 Efectos inhibidores de crecimiento de NaD1 en varios tipos de célula NaD1 IC50 Tipo de célula (µ?) Fusarium oxysporum f sp. 1.0 vasinfectum Leptosphaeria maculans 0.80 Aspergillus nidulans 0.80 Verticillium dahliae 0.75 Thielaviopsis basicola 0.80 Candida albicans >10 Saccharomyces cerevisiae >10 Pichia pastoris >10 Staphylococcus aureus >10 Bacillus cereus >10 Escherichia coli >10 Pseudomonas aeruginosa >10 Células HeLa >10 Spodoptera frugiperda (Sf21) >10 La importancia de cuatro enlaces de disulfuro en NaD1 se investigó reduciendo y alquilando los residuos de cisteína. El NaD1 reducido y alquilado (NaD1R&A) fue completamente inactivo en los ensayos inhibidores de crecimiento con Fov, aún a una concentración diez veces mayor que la IC50 para NaD1. Las actividades de muchos péptidos antimicrobianos se atenuaron por la presencia de cationes, particularmente cationes divalentes, en el medio; por lo tanto, el efecto de NaD1 (10 µ?) sobre el crecimiento de Fov se midió en presencia de los cationes divalentes Ca2 + y Mg2+ para determinar su efecto en la actividad de NaD1. Ambos cationes redujeron la actividad anti-fúngica de NaD1 en una forma dependiente de concentración. Se observó una completa inactivación de NaD1 a <2 mM de CaCI2, mientras que se requirieron de 50 mM de MgCI2 para obtener el mismo efecto, indicando que C2+ fue mayor que 20 veces más antagonístico. Esto indica que el efecto simplemente no está relacionado con la carga y que estuvo involucrado un bloqueo de interacciones específicas. En contraste, la actividad de la proteína del tabaco, osmotina, se mejoró por la presencia de Ca2+, presumiblemente facilitando una interacción con fosfomananos en la superficie celular fúhgica (Salzman y otros, 2004). La osmotina es un miembro de la familia de tipo taumatina ("TL") de proteínas fúngicas. Las estructuras de varias de estas proteínas de ~22 kDa han sido resueltas. Estas consisten de un pliegue conservado con tres dominios; el Dominio I es un ß- emparedado aplanado de once estructuras que forma el núcleo de la molécula, a partir del cual se extiende un número de bucles de disulfuro (Dominios II y III) (de Vos y otros, 1985). De esta manera, el tamaño y la estructura de las osmotinas son muy diferentes a las de las defensinas. Se sabe que la osmotina permeabiliza las membranas de hongos susceptibles (Abad y otros, 1996). Es improbable que esta permeabilización resulte de la interacción directa de la proteína con la membrana ya que las proteínas TL no exhiben ninguna dé las características estructurales de los péptidos de permeabilización de membrana. El tamaño relativamente grande de la osmotina (~22 kDa) comparado con el de las defensinas (-4.7 kDa) sugiere que el acceso de la osmotina a la membrana fúngica es restringido por los polisacáridos, glucano y quitina, en la pared celular fúngica. De esta manera, la patente de E.U.A. 6,512,166 enseña que las "enzimas quitinolíticas o glucanolíticas de degradación de pared celular fúngica mejoran la actividad anti-fúngica de la osmotina". En contraste, las defensinas ya han entrado a las membranas en hifas fúngicas y de esta manera el tratamiento con enzimas glucanolíticas no mejora la actividad anti-fúngica de las defensinas.

Otra modalidad de la invención es un método para identificar una defensina que mejora la actividad anti-fúngica de un fungicida químico, sin la necesidad de realizar ensayos de actividad anti-fúngica. El método propone medir la habilidad de una defensina para permitir la entrada a una célula fúngica de un compuesto indicador de permeabilidad. Un compuesto indicador de permeabilización adecuado en uno cuya ubicación, ya sea intracelular o extracelular, puede ser detectado. Bajo condiciones normales, el compuesto indicador permanece extracelular y no pasa libremente a través de la pared y membrana celular. En presencia de ciertas defensinas, tales como NaD1, NaD4, Tomdef2 y Tomdef3, el compuesto indicador puede ser detectado dentro de la célula de un hongo dado. Si se encuentra que una defensina que está siendo probada (una defehsina de prueba) incrementa la permeabilidad de un hongo dado aumentando la cantidad intracelular del compuesto indicador, cuando está presente con el hongo, esa defensina de esta forma es identificada como una que mejora la actividad anti-fúngica de un fungicida químico, cuando la defensina y el fungicida son combinados en presencia del hongo, como se muestra en el Ejemplo 8. Un criterio estándar para un compuesto indicador de permeabilidad adecuado para usarse en la invención es provisto a través del uso de verde SYTOX® (Marca Registrada) (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA, EUA) como un indicador para la permeabilidad de célula fúngica incrementada observada en presencia de NaD1, como se describe más adelante. El método para identificar una defensina que mejore la eficacia fungicida química no está limitado al uso de verde SYTOX®, pero puede realizarse con cualquier uso de cualquier compuesto indicador de permeabilidad que produzca datos de permeabilidad similares cuando se prueba con NaD1. En la presente se define un índice de permeabilidad relativa (RPI), en donde se dirige el grado de permeabilizacion de una cepa fúngica inducido por una concentración definida de una defensina dada, con relación a un valor de 1.0 para NaD1 a la misma concentración. Ver Ejemplo 8 y Figura 8N. El método descrito se realiza utilizando los métodos descritos más adelante, o con adaptaciones que pueden ser entendidas por un experto en la técnica como siendo equivalentes. Los pasos del método incluyen: combinar un hongo con un compuesto indicadór de permeabilidad en presencia de, y en forma separada, como un control, en ausencia de, una defensina de prueba; después comparar cualquier cantidad intracelular detectable del compuesto indicador de permeabilidad en el hongo en presencia y en ausencia de la defensina de prueba. Si el efecto de la presencia de la defensina de prueba es tal que se detecta una cantidad incrementada de compuesto indicador intracelular en el hongo, comparado con el control, la defensina de prueba es identificada como una que puede mejorar la eficacia de un fungicida químico cuando la defensina y el fungicida se combinan en presencia del hongo. Se entenderá que una defensina vegetal identificada por el método justamente descrito, será útil como un componente de defensina del sistema para proteger a una planta de una enfermedad fúngica como se describe aquí, ya sea si la defensina es o no conocida por tener actividad anti-fúngica. La permeabilizacion de membranas de hifas de Fov a través de NaD1 se midió utilizando el colorante fluorescente, verde SYTOX®. El colorante fluorescente verde SYTOX® se incrementa más de 1000 veces después de la unión a ácidos nucleicos, pero el colorante solo entra a las células cuando la membrana plasmática está comprometida. Las hifas fueron tratadas con 0.1, 2 ó 10 µ? de NaD1 ó 10 µ? de NaD1 &A (reducida y alquilada) en presencia de verde SYTOX®. Las hifas permeabilizadas con NaD1, y esta permeabilización se correlacionaron con la inhibición de crecimiento excepto a la concentración más baja de NaD1 (0.1 µ?) en donde ocurrió una pequeña cantidad de eliminación de verde SYTOX®, pero no se observó ninguna inhibición de crecimiento. La permeabilización no se observó en hifas tratadas con NaD1R&A, ni con hifas no tratadas, consistente con la falta de inhibición de crecimiento. A una concentración no inhibidora, muy baja de NaD1 (0.1 µ?), el verde SYTOX® entró a algunas hifas, pero no a todas, reflejando una permeabilización mediada por NaD1. Los núcleos de las células de las hifas que tomaron el verde SYTOX® aparecieron intactos, y el citoplasma apareció no alterado. A concentraciones inhibidoras más alta de NaD1, el verde SYTOX® entró a la mayoría de las hifas y se formó un patrón difuso de fluorescencia a través de la célula. Los núcleos ya no fueron intactos, y el citoplasma de todas las hifas permeabilizadas fueron granulares después del tratamiento con NaD1. Para determinar si NaD1 formó una abertura de un tamaño distinto o meramente se desestabilizó la membrana plasmática, las hifas tratadas con NaD1 se incubaron con dextranas marcadas con FITC (Sigma-Aldrich) ya sea de 4 kDa (diámetro globular promedio de 14 A) o de 10 kDa (diámetro globular promedio de 23 A). Las FITC-dextranas de 4 kDa entraron a hifas a la misma concentración de NaD1 que condujo al consumo de verde SYTOX® (M ~650 Da), mientras que 10 kDa de FITC-dextranas se excluyeron aún a concentraciones muy altas de NaD1. Para examinar si la abertura formada por NaD1 fue pasajera o relativamente estable, el ensayo se condujo en dos formas. Las FITC-dextranas fueron agregadas ya sea al mismo tiempo como NaD1 o después de la remoción de NaD1 no unido a través de lavado extensivo. Los 4 kDa de FITC-dextrana fueron capaces de entrar bajo ambas condiciones. El NaD1 permeabilizó la membrana plasmática de hifas susceptibles en una forma dependiente de dosis que se correlacionó con la inhibición de crecimiento; sin embargo, a concentraciones no inhibidoras de NaD1, se siguió detectando algo de permeabilización. A estas bajas condiciones, el citoplasma de hifas permeabilizadas pareció normal bajo la luz del microscopio y el verde SYTOX® se localizó en el núcleo. A concentraciones inhibidoras más altas de NaD1, las hifas permeabilizadas exhibieron una granulación citoplásmica importante y el patrón de fluorescencia de verde SYTOX® fue mucho más difuso a través de la célula indicando que los núcleos ya no estuvieron intactos. Sin desear que esté ligado por teoría, se cree que la permeabilización inducida por NaDÍ de membrana fúngicas es requerida para la inhibición de crecimiento, aunque puede no ser suficiente para inducir la muerte celular. La fluidez de las cadenas de acilo graso de lípidos de membrana se reduce a medida que la temperatura se reduce, conduciendo a un aumento total en la estabilidad de la membrana. Se postuló que esto hace más difícil la inserción de péptidos en bicapas, reduciendo así la cantidad de permeabilización inducida por péptido que ocurre a través de interacción directa de lípido . Esto conduce a una determinación del efecto de temperatura sobre la permeabilización inducida por NaD1. A 10°C, NaD1 indujo; una captación substancial de verde SYTOX®, aunque esto fue meno que aquella observada a 25°C. A 4°C, solo se pudo ver un pequeño grado de permeabilización y este se redujo aún más a 0°C. Sin pretender que esté ligado por ninguna teoría o mecanismo de operación, se postula que NaD1 parece actuar a través de ya sea barril-duela o formación de poro toroide. La consistencia de captación de las dextranas de 4 kDa pero no de las de 10 kDa a través de un número de concentraciones de NaD1 difiere de otros péptidos antimicrobianos de formación de poro tales como melitina, que ocasionan un incremento dependiente de concentración en el tamaño de las dextranas que son liberadas de liposomas artificiales (Ladokhin y otros, 1997), indicando un aumento en el tamaño de poro. El tamaño pronosticado del poro de NaD1 es lo suficientemente grande para permitir que el mismo NaD1 pase a través de y hacia la célula. 1 El régimen de permeabilización de hifas de Fov a varias concentraciones de NaD1 se inspeccionó midiendo la captación de verde SYTOX® con el tiempo. A todas las concentraciones, la permeabilizacion solo se observó después de un tiempo de retraso de aproximadamente 20 minutos, y la fluorescencia comenzó a nivelarse después de 90 minutos. El régimen de permeabilizacion fue parcialmente dependiente de concentración, aumentado progresivamente con concentraciones de NaD1 de has 3 µ?. A concentraciones por arriba de 3 µ? (hasta 50 µ?), se observó muy poca diferencia en la cinética de la permeabilizacion. Esto se reflejó en los datos Vmax (velocidad máxima de incremento de fluorescencia), los cuales muestran un estado estable de captación a bajas concentraciones (por debajo de aquellas requeridas para una inhibición importante de crecimiento), seguido por un incremento lineal en fluorescencia de hasta 6.5 µ? de NaD1. Por arriba de esta concentración, la velocidad de reacción no cambió significativamente, indicando que el proceso es saturable. La pérdida aparente de organelos después de la exposición a NaD1 indicó que las células experimentaron muerte celular. Para examinar esto más, se investigó la producción de especies de oxígeno reactivo (ROS) en hifas tratadas con NaD1. La molécula no fluorescente, dihidrorodamina 123 (DHR123), se pre-cargó en las hifas que después fueron tratadas con NaD1 (0.1, 2 y 10 µ?) ó 10 µ? de NaD1 R&A- En presencia de ROS, DHR123 se oxidó a la molécula fluorescente, rodamina 123. Se observó un incremento dependiente de concentración en la fluorescencia en hifas Fov después de la exposición de NaD1 a concentraciones de NaD1 suficientes para la inhibición del crecimiento. No se observó nada de fluorescencia después del tratamiento con NaD1RSA consistente con su falta de actividad anti-fúngica. El ácido ascórbico y 2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oxilo (TEMPO) (Sigma-Aldrich) ambos son potentes barredores de ROS permeables a célula. Para explorar la relevancia de la producción de ROS inducida por NaD1, se inspeccionó la oxidación de DHR123 mediante NaD1 en presencia de estas dos moléculas. La presencia de ácido ascórbico o TEMPO no alteró el nivel de fluorescencia,; ni la presencia de 10 mM de ácido ascórbico afectó la inhibición de crecimiento de Fov mediante NaD1. En forma concisa, NaD1 rompe membranas, aparentemente a través de la formación de un poro toroide o de barril-duela que permite la entrada de moléculas con un diámetro de entre 14 y 23 A. NaD1 no parece interactuar con bicapas artificiales, incluyendo aquellas formadas con lipidos aislados de las hifas de hongos sensibles, indicando que no puede interactuar directamente con lipidos, aunque la dependencia de temperatura de toxicidad soporta la idea de que no se inserta en la membrana. La cinética de la captación de verde SYTOX® sugiere que un receptor está involucrado en la permeabilización de membrana. Se utilizó microscopía electrónica de inmuno-oro para determinar si NaD1 puede cruzar la membrana celular y entrar al citoplasma de hifas tratadas. Las hifas tratadas con o sin NaD1 (10 µ?) durante 2 horas fueron lavadas, fijadas y seccionadas para microscopía electrónica de inmuno-oro utilizando el anticuerpo anti-NaD1. Muchas, pero no todas las hifas tratadas con NaD1 tuvieron un citoplasma granulado con un número de vacuolas aberrantes. El citoplasma en estas hifas fue fuertemente marcado con el anticuerpo anti-NaD1, aunque la NaD1 no se asoció con organelos intracelulares particulares. El citoplasma granulado en hifas tratadas con NaD1 pareció colapsarse hacia adentro, lejos de la pared celular. También se observó la marcación con oro sobre las paredes celulares. Se identificó un pequeño número de células en donde solo parte del citoplasma estaba granulado. La marcación con oro estuvo presente en estas hifas pero fue más fuerte en la porción granular. Las hifas con citoplasma normal también estuvieron presentes en la muestra. Esta hifas solo exhibieron una pequeña cantidad de marcación con oro citoplásmica, sin embargo, sus paredes celulares se marcaron. No se observó una marcación importante en hifas tanto granulares como no granulares cuando la muestra tratada con NaD1 se marcó con el anticuerpo pre-inmune. Las hifas tratadas con agua en contacto con el anticuerpo anti-NaD1 tampoco mostraron ninguna marcación importante. Para confirmar más la captación de NaD1 y excluir la posibilidad de que la presencia de NaD1 en el citoplasma fue un artefacto del proceso de fijación, NaD1 se marcó con el fluoróforo bimano (Invitrogen-Molecular Probes). Este fluoróforo se eligió por su naturaleza pequeña, no cargada y por la habilidad de unir covalentemente la molécula a residuos de carboxilo en NaD1, dejando las regiones de bucle no modificadas. NaD1 marcado de esta manera retuvo toda la actividad anti-fúngica. En contraste, NaD1 marcado con FITC a través de grupos amina reactiva fue biológicamente activo, probablemente debido al hecho de que la molécula lleva dos cargas negativas a un pH fisiológico. La unión de una molécula FITC individual a una amina reactiva en NaD1 de esta manera puede reducir la carga total de la proteína por tres. Ya que una carga positiva se propone como vital para la actividad antimicrobiana, NaD1 puede no ser capaz de tolerar este tratamiento. Además, dos de las lisinas en NaD1, que pueden reaccionar con FITC, se localizan en las regiones de bucle que han sido descritas como esenciales para la actividad anti-fúngica de otra defensina vegetal, RsAFP2 (De Samblanx y otros, 1997). La cantidad de NaD1 captada en el citoplasma de hifas Fov también se inspeccionó a través de SDS-PAGE e inmunotinción de contenidos citoplásmicos. Estos datos indicaron que la captación de NaDlocurrió después de 20 minutos, lo cual fue consisten con la microscopía. La cantidad de NaD1 en el citoplasma de Fov se incrementó hasta 60 minutos, después de ese tiempo se redujo ligeramente. Esto puede ser un resultado de descomposición de célula y subsecuente liberación de algo de NaD1 internalizado de regreso al sobrenadante. La evidencia ahora se basa en que un número de péptidos antimicrobianos es capaz de entrar a células y su mecanismo de acción involucra objeticos intracelulares. El citoplasma de las hifas tratadas con NaD1 pareció "encogerse" y contraerse de la pared celular. Se observó una morfología similar en hifas Aspergillus nidulans tratadas con la proteína anti-fúngica, AFP, de Aspergillus giganteus. AFP es fungistático a bajas concentraciones, ocasiona permeabilización de membrana y se une a la pared celular; mientras que a altas concentraciones, la proteína es internalizada y ocasiona granulación del citoplasma de las hifas (Theis y otros, 2003; Theis y otros, 2004). También estuvo presente un número de hifas que no captaron grandes cantidades de NaD1, en la muestra tratada con NaD1. El citoplasma de estas hifas no fue granular, sugiriendo que la captación de NaD1 es esencial para el procedimiento de aniquilación de célula. Para apoyar esto, las hifas también pueden ser identificadas con citoplasma parcialmente granulado, y el NaD1 se concentró en estas áreas, pero no en las áreas de la célula que parecían normales. Se cree que esto representa una etapa temprana de muerte celular. La ausencia de NaD1 de varias hifas a una concentración que fue suficiente para ocasionar una inhibición de crecimiento del 90% puede proporcionar algo de información como el modo de captación de NaD1. Los ensayos de inhibición de crecimiento comenzaron con esporas, de manera que NaD1 estuvo presente a través de todas las etapas del ciclo celular. En contraste, se realizó la microscopía en hifas que probablemente estaban en diferentes etapas del ciclo celular. Ya que el análisis de inmunotinción reveló que aD1 permaneció en el sobrenadante después de 3 horas, la falta de internalización de NaD1 por algunas hifas no fue debida al uso de una concentración insuficiente. Es posible que NaD1 no sea capaz de afectar células en ciertas etapas del ciclo celular. Esto es consistente con observaciones para el péptido anti-fúngico de insecto, tenecina 3, el cual es captado en las células durante el crecimiento de fase logarítmica, pero no durante la fase estacionaria (Kim y otros, 2001). Las hifas que no captaron NaD1 en los ensayos de microscopía pueden representar aquellas en una etapa de crecimiento que es resistente a NaD1. Esto puede ser explicado por los cambios de pared celular que ocurren después de la entrada a la fase estacionaria que evita la captación de péptido (Klis y otros, 2002). Se observa que el péptido antimicrobiano, cecropina, el cual es capaz de inhibir el crecimiento de hifas Aspergillus de germinación pero no de no germinación, solo se une a la superficie celular de higas de germinación (Ekengren y Hultmark, 1999). Se agregó NaD1-bimano a hifas vivas, y se inspeccionó la captación mediante microscopía de fluorescencia. Se observó la internalización después de 20-30 minutos, la cual es consistente con la cinética de permeabilización de verde SYTOX®. En este período de tiempo, las hifas que captaron NaD1 se siguieron viendo saludables, sin embargo, con el tiempo, el citoplasma de estas hifas se hizo granular y parecieron morir. NaD1 no pareció interactuar con organelos específicos después de la, captación sino que más bien demostraron una localización citoplásmica. Esto difiere dé la defensina vegetal, Psd1, la cual es transportada al núcleo de células N. crassa, tratadas (Lobo y otros 2007). La interacción de Psd1 con una proteína de ciclo celular localizado nuclear ha sido validada, y se cree que su actividad anti-fúngica es un resultado de detención de ciclo de célula (Lobo y otros, 2007). La proteína anti-fúngica de P. chrysogenum, PAF, por otro lado, presenta la ubicación citoplásmica después de entrar a hifas A. nidulans (Oberparleiter y otros, 2Ó03). Después de entrar, PAF induce un fenotipo apoptótico, probablemente a través de señalización de proteína G (Leiter y otros, 2005). Como se mencionó anteriormente, las defensinas vegetales forman una gran familia de péptidos que tienen un andamio conservado pero una pequeña conservación de secuencia, particularmente en los bucles expuestos a solvente. No todas las defensinas tienen actividad anti-fúngica; también se han identificado defensinas con actividades antibacterianas, inhibidoras de enzima e inhibidoras de síntesis de proteína. El reciente descubrimiento de un gran número de defensinas vegetales y el incremento en el número de éstas que son funcionalmente caracterizadas ha hecho claro que los grupos de clasificación propuestos para defensinas por más de 10 años y no son más apropiados. Se construyó un árbol filogénico de 126 secuencias de defensina vegetal y con base en esto, se propuso un nuevo sistema de agrupación. En total, se definieron nueve grupos principales (grupos 1-9) basándose en puntos de ramificación desde el árbol. Dentro de estos grupos, también se propuso un número un número de subgrupos. En algunos casos, las defensinas de una especie de planta individual se agruparon conjuntamente mientras en otros casos se encontraron en diferentes regiones del árbol. El análisis funcional de estos grupos reveló que las defensinas que se agrupan presentaron actividades similares, mientras que aquellas que se separaron no las presentaron. Esto demuestra que el análisis filogénico (bio-informático) puede probar ser una útil herramienta para la predicción de funciones de defensinas novedosas. Con el fin de realizar análisis filogénicos de unión colindante, se descargaron secuencias de defensinas conocidas de la base de datos de proteína del centro U.S. National Library of Medicine's National Center for Biotechnology Information (NCBI) utilizando la secuencia de búsqueda "defensina vegetal". También se agregaron manualmente otras secuencias identificadas en la literatura pero no disponibles en la base de datos. Una completa lista de péptidos incluyendo su fuente y número de acceso se proporciona en el Cuadro 2. Se realizó una alineación TCOFFEE (Tree based Consistency Objective Function F r AlignmEnt E aluation, Arbol a base de Función de Objetivo de Consistencia para Evaluación de Alineación) (Poirot y otros, 2003) en las secuencias de dominio de defensina madura para 126 proteínas y el archivo de alineación resultante se utilizó para generar un árbol filogénico de unión colindante utilizando MEGA-4 (Tamura y otros, 2007). La integridad del árbol se estimó por 1000 réplicas de instrucciones preliminares con valores de instrucciones preliminares de más de 50% indicados en nodos individuales. Un árbol filogénico de unión colindante de dominios maduros alineados de 126 defensinas vegetales se presenta en la Figura 9. Basándose en este análisis, se propuso un nuevo sistema de clasificación que está compuesto de nueve grupos principales (Grupos 1-9, ver más adelante). El Grupo 1 se separó en cinco subgrupos basándose en la longitud de ramificación (en unidades de substituciones de aminoácido por residuo). Los Grupos 2 y 3 ambos se separaron en dos subgrupos y los Grupos 4, 5 y 6 se separaron en tres subgrupos. Esta clasificación no contradice las agrupaciones previamente propuestas, excepto para separar HsAFPI en un subgrupo separado. Esto sugiere una clasificación basándose tanto en función como en secuencia que puede ser complementaria- En algunos casos (por ejemplo, R. sativus y T. ki arae), las defensinas de un grupo de especies de planta individual se juntan en el árbol, mientras que en otras, se separan a través del árbol (Arabidopsis, N. alata, V. radiata).

C U A D RO 2 , P a rte 1 Péptido Fuente Número de acceso aa¡nh¡21 Sorghum bicolor Q09198 AdAFP Arachis diogoi AA072633 AdDef Arachis diogoi AAP92330 AFP1 Arabidopsis thaliana P30224 AFP2B Sinapis alba Q 10989 AhAMPI Aesculus hippocastanum AAB34970 AhPDFH Arabidopsis halleri AAY27736 AhPDF1.2 Arabidopsis halleri AAY27737 AhPDF1.4 Arabidopsis halleri AAY27739 Artvl Artemisia vulgaris Q84ZX5 At2g26010 Arabidopsis thaliana 080995 At2g26020 Arabidopsis thaliana 080994 AtAFP Arabidopsis thaliana P30224 AtAMPI Arabidopsis thaliana AAM45086 AtAMPI .1 Arabidopsis thaliana AAL36289 AX1 Beta vulgaris P81493 AX2 Beta vulgaris P82010 BnAFP Brassica napus Q39313 BnDef1.2 Brassica napus AAX35338 BoDef Brassica olerácea CAC37558 BoPCP Brassica olerácea CAA06465 BSD1 Brassica campestris L47901 CaDefl Cicer arietinum ABC59238 CaDef2 Capsicum annuum AAL35366 CaDef3 Cicer arietinum ABC02867 CcDef Cajanus cajan AAP49847 CfD1 Cassia fístula n/a C UA D R O 2 , P a rte 2 Péptido Fuente Número de acceso CfD2 Cassia fístula n/a Cpthiol Vigna unguiculata P83399 CtAMP Clitoria tematea AAB34971 DmAMPI Dahlia merckii AAB34972 DRR39 Pisum sativum Q01784 EGAD1 Elaeis guineensis AF322914 Fabatinl Vicia faba A58445 Fabatin2 Vicia faba B58445 FST Nicotiana tabacum P32026 gi-z Zea mays P81008 92-Z Zea mays P81009 GbDef Ginkgo biloba AAU04859 g-H1 Hordeum vulgare P20230 GmPI Glycine max AAC97524 g-Pl Triticum turgidum P20158 g-P2 Tríticum turgidum. P20159 g-thionin Nicotiana paniculata 0241 15 HsAFPI Heuchera sanguínea AAB34974 HvAMPI Hardenbergia violavea n/a JI-1 Capsicum annuum X95363 JI-2 Capsicum annuum X95730 LCR66 Arapidopsis thaliana Q9C947 LCR67 Arapidopsis thaliana NP 5651 19 LCR68 Arapidopsis thaliana Q9ZUL7 LCR69 Arapidopsis thaliana Q39182 LCR70 Arapidopsis thaliana Q41914 LCR72 Arapidopsis thaliana Q9ZUL8 C UA D R O 2. Pa rte 3 Péptido Fuente Número de acceso LCR73 Arapidopsis thaliana P82782 LCR74 Arapidopsis thaliana Q9FFP8 LCR77 Arapidopsis thaliana NP_199255 LCR78 Arapidopsis thaliana P82787 LmDef Lepidium meyenii AAV85992 MsDef1.1 Medicago sativa AAV85437 MsDef3.1 Medicago sativa AAT66095 MsDef3.2 Medicago sativa AAT66096 MtDef Medicago truncatula AAQ91290 MtDef2 Medicago truncatula AY313169 MsDef2.1 Medicago sativa AAV85438 MtDef3.1 Medicago truncatula AAT66097 MtDef3.1a Medicago truncatula AAT69983 MtDefa Medicago truncatula AAQ91287 NaD1 Nicotiana alata Q8GTM0 NaD2 Nicotiana alata ninguno NatD1 Nicotiana attenuata AAS 13436 Nethiol Nicotiana excelsior BAA211 14 Nethio2 Nicotiana excelsior BAA211 13 Npthiol Nicotiana paniculata 0241 15 p322 Solanum tuberosum P20346 PCP-A1 Brassica olerácea CAA06464 PDF1.1 Arabidopsis halleri AAY27736 PDF1.2 Arabidopsis thaliana NP_199256 PDF1.3 Arabidopsis thaliana NPJ80171 PDF1.4 Arabidopsis halleri AAY27739 PDF1.5 Arabidopsis thaliana NP_175899 C UA D RO 2 , Pa rte 4 Péptido Fuente Número de acceso PgDi Picea glauca AY494051 PhD1 Petunia hybrida Q8H6Q1 PhD2 Petunia hybrida Q8H6Q0 PmDef Plantago major CAH58740 PpDLPI Pyrus pyrifolia BAB64930 PpDLP2 Pyrus pyrifolia BAB64929 PPT Petunia inflata L27173 PsD1 Pisum sativum P81929 PsD2 Pisum sativum P81930 RsAFPI Raphanus sativus P69241 RsAFP2 Raphanus sativus P30230 RsAFP3 Raphanus sativus CAA65984 RsAFP4 Raphanus sativus 024331 SaAFPI Sinapis alba P30231 SaAFP2a Sinapis alba P30232 SD2 Helianthus annuus AF178634 Sla1 Sorghum bicolor P21923 Sla2 Sorghum bicolor P21924 Sla3 Sorghum bicolor P21925 SoD2 Spinacia olerácea P81571 SPI1 B Picea abies AAN40688 TaDef Triticum aestivum AB089942 TfAFP Trígonella foenum-graecum AA072632 TkAMPDI Triticum kiharae P84963 TkAMPD1.1 Triticum kiharae P84965 TkAMPDI .2 Triticum kiharae P84964 TkAMPD2 Triticum kiharae P84968 CUADRO 2, Parte 5 Clasificación propuesta de defensinas vegetales Se construyó el árbol filogénico de unión colindante de dominios maduros de defensinas vegetales utilizando MEGA 4.0. Se indican réplicas de instrucciones preliminares mayores que 50%. Las defensinas se separaron en grupos y subgrupos (indicado a la derecha) basándose en la longitud de la ramificación. Escala de ramificación = substituciones por residuo. NaD1 se indica a través de una flecha. Se trazaron fracciones conocidas de defensinas en el árbol filogénico, las funciones individuales indicadas por varios símbolos.

Las defensinas del grupo 1 exhiben la más grande variedad de actividades incluyendo la inhibición de tripsina (Cpthiol, NaD2), inhibición de a-amilasa (Sla2-3, aainh¡21), inhibición de síntesis de proteína (?-purotioninas, ?-hordotioninas) y bloqueo del canal de sodio (?-?1). También se reportaron actividades anti-fúngicas (EGAD1, SD2, JI2, PgD1) y antibacterianas para algunos miembros de este grupo. Todas las defensinas del grupo 2 que han sido funcionalmente caracterizadas exhiben actividad antibacteriana, y algunas poseen también actividad de a-amilasa (VaD1, VrD1) o actividad anti-fúngica (VaD1, VrD1, SoD2). Las defensinas de los grupos 3 a 6 generalmente exhiben actividad anti-fúngica, aunque CfD2, el único representante del grupo 4.0, es un inhibidor de tripsina. Una defensina vegetal, Arabidopsis, del grupo 5.3 (PDF1.3) también está involucrada en la tolerancia del zinc, aunque su efecto sobre el crecimiento fúngico no ha sido investigado. El grupo 7, el cual consiste solo de un miembro (ZmESR6), exhibe actividades anti-fúngica y antibacteriana. El grupo 8 contiene una defensina con actividad inhibidora de a-amilasa (Sla1) y un inhibidor del canal de sodio (?-?2). De manera interesante, estos se separaron en grupos distintos desde su homólogos funcionales en el grupo 1.5 (Sla2-2 y ?-?1), a pesar de originarse de la misma especie de planta. El grupo final está compuesto de dos defensinas de la especie Brassica (BoPCP, PCP-A1) que se ha implicado en el reconocimiento de polen.

En casos en donde las defensinas de un grupo de especies individuales se unen conjuntamente (por ejemplo, RsAFP1-4), también se encuentran que estos péptidos tienen funciones similares. Cuando se separan péptidos de una especie de planta individual en diferentes grupos, tales como NaD1 y NaD2 así como VrD1 y VrD2, estas defensinas exhiben diferentes actividades. En la Figura 10 se muestra una vista circular del árbol filogenético. Las ramificaciones que representan diferentes grupos están indicadas en el círculo externo. Las funciones conocidas de péptidos individuales se indican por símbolos de acuerdo con la actividad biológica, según provisto por la clave. Recientemente se reportó la identificación de más de 300 genes de tipo defensina tanto para Medicago como Arabidopsis (Graham y otros, 2004; Silverstein y otros, 2005). Esto sugiere que las defensinas vegetales son miembros de familias de genes grandes con una variedad de actividades. El análisis filogenético realizado aquí reveló defensinas con actividades similares por lo general agrupadas conjuntamente. Este método de análisis, por lo tanto, puede probar ser útil para determinar las actividades de defensinas aún no caracterizadas; sin embargo, las tendencias reales no solo serán evidentes cuando las funciones de más defensinas han sido establecidas. Otro factor limitante en la predicción de la función de defensina es que muchas defensinas reportadas a la fecha solo han sido probadas para una o más actividades. En algunos casos, la actividad reportada de un péptido puede no reflejar su función primaria. Todas las referencias a través de esta solicitud, por ejemplo, documentos de patente incluyendo patentes o equivalentes expedidas u otorgadas; publicaciones de solicitud de patente; y documentos de literatura que no son patentes u otro material, se incorporan aquí para referencia en sus totalidades, como si se incorporaran aquí individualmente, al grado que cada referenciá por lo menos parcialmente no inconsistente con la descripción es esta solicitud (por ejemplo, una referencia que se parcialmente inconsistente por referencia, excepto para la porción parcialmente inconsistente de la referencia). Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la especificación reflejan el nivel de habilidad de aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. Las referencias citadas aquí indican el estado de la técnica, en algunos casos como sus fechas de presentación, y se pretende que esta información pueda ser empleada aquí, si es necesario, para excluir (por ejemplo, rechazar) modalidades especificas que pueden ser parte de la técnica anterior. Cuando un grupo de substituyentes se describe aquí, se entiende que todos los miembros individuales de esos grupos y todos los subgrupos, incluyendo cualquier isómero y enantiómero de los miembros de grupo con la misma actividad biológica, y clases de compuestos que pueden formarse utilizando los substituyentes se describen por separado. Cuando se reclama un compuesto, se debe entender que los compuestos conocidos en la técnica incluyendo los compuestos descritos en las referencias descritas aquí no pretenden ser incluidos. Cuando aquí se utiliza un grupo Markush u otra agrupación, todos los miembros individuales del grupo y todas las combinaciones y sub-combinaciones posibles del grupo pretenden ser individualmente incluidas en la descripción. Cada combinación de componentes descritos o ilustrados o referenciados puede ser utilizada para practicar la invención, a menos que se indique otra cosa. Los nombre específicos de los compuestos pretenden ser ilustrativos, como es conocido que algún experto en la técnica puede nombrar a los mismos compuestos en forma diferente. Un experto en la técnica apreciará que se pueden emplear métodos, materiales de partida, métodos sintéticos y metodología recombinante diferentes a aquellos específicamente ilustrados, en la práctica de la invención sin recurrir a experimentación indebida. Todos los equivalentes funcionales conocidos en la técnica, de cualquiera de estos métodos, materiales de partida, métodos sintéticos y metodología recombinante pretenden ser incluidos en esta invención. Cada vez que se proporcione una escala en la especificación, por ejemplo, una escala de temperatura, una escala de tiempo, o una escala de composición, todas; las escalas de intermediarios y sub-escalas, así como valores individuales en las escalas dadas, pretenden ser incluidas en la descripción. Como se utiliza aquí "que comprende" es un sinónimo de "que incluye", "que contiene", o "caracterizado por", y es inclusivo o de fin abierto y no excluye elementos adicionales, no dichos o pasos de método. Como se utiliza aquí "que consiste de" excluye cualquier elemento, paso, o ingrediente no especificado en el elemento de reivindicación. Como se utiliza aquí "que consiste esencialmente de" no excluye materiales o pasos que no afecten materialmente las características básicas y novedosas de la reivindicación. Cualquier enunciado aquí del término "que comprende", en particular en una descripción de componentes de una composición, método o sistema, se entiende que abarca aquellas composiciones, métodos y sistemas que consisten esencialmente de y que consisten de los componentes o elementos o pasos ya dichos. La invención ilustrativamente descrita aquí de manera conveniente puede ser practicada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se describen específicamente aquí. Un experto en la técnica fácilmente aprecia que la presente invención está bien adaptada para realizar los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como aquellos inherentes en la presente invención. Los métodos, componentes, materiales y dimensiones descritas aquí, como actualmente representativas de modalidades preferidas, se proporcionan como ejemplos y no se consideran limitaciones del alcance de la invención. A aquellos expertos en la técnica se les ocurrirán cambios y otros usos que están abarcados dentro del espíritu de la invención, y se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones. Aunque la presente descripción contiene cierta información y ejemplos, estos no deben ser construidos como limitantes del alcance de la invención, sino meramente proporcionando ilustraciones de algunas de las modalidades de la invención. De esta manera, modalidades adicionales están entro del alcance de la invención y dentro de las siguientes reivindicaciones. Se debe observar que el científico de cultivo, agrícola o botánico podrían saber cómo y cuándo terminar, interrumpir, o ajustar la administración debido a toxicidad o un efecto dañino en la realización de la planta que será protegida. De manera inversa, el experto también sabes ajustar el tratamiento a niveles más altos si la respuesta no fue adecuada (impidiendo toxicidad). La magnitud de una dosis administrada de fungicida y/o defensina o el nivel de expresión de una defensina recombinantemente expresada puede ser ajustada a través de medios conocidos por un experto en la técnica relevante, o los medios de administración o formulación para el fungicida y/o defensina, si se aplica a la planta o semilla, pueden ser cambiados para mejorar la protección de la planta de patógenos fúngicos. La severidad de la condición, por ejemplo, puede ser evaluada, en parte, a través de métodos de evaluación de pronósticos estándares. Además, la dosis y tal vez la frecuencia de dosis, también variarán de acuerdo con la edad, tamaño, suelo y/o condiciones climáticas y respuesta de la planta individual. El uso de vehículos agronómicamente aceptables para formular los compuestos aquí descritos para la práctica de la invención a dosis adecuadas para administración sistémica y superficial está dentro del alcance de la invención y dentro del nivel ordinari'o de experiencia en la técnica. Con la elección apropiada del vehículo y práctica de fabricación adecuada, las composiciones de la presente invención, en particular aquellas formuladas como soluciones, pueden ser administradas a las superficies de la planta incluyendo las partes que están por arriba de la tierra y/o raíces, o como un recubrimiento aplicado a las superficies de semillas. Las composiciones agronómicamente útiles adecuadas para usarse en el sistema descrito aquí incluyen composiciones en d;onde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para obtener el propósito pretendido. La determinación de las cantidades efectivas está dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica, especialmente en vista de la descripción provista aquí. Además de los ingredientes activos, estas composiciones para usarse en el método anti-fúngico pueden contener vehículos agronómicamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden ser utilizadas en el campo; en invernaderos, o en establecimientos de laboratorio. Las formulaciones anti-fúngicas incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los compuestos activos pueden ser preparadas como suspensiones oleosas apropiadas. Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de ajonjolí, o ésteres de ácido graso sintético, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden"contener substancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa, sorbitol, o dextrana. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Otros componentes pueden incluir agentes de viscosidad, geles, agentes humectantes, protectores ultravioleta, entre otros. Las preparaciones para aplicación de superficie pueden ser obtenidas combinando los compuestos activos con un excipiente sólido, opcionalmente moliendo una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de agregar auxiliares adecuados, si se desea, para obtener polvos para aplicación directa o para disolución antes de rociar sobre las plantas que serán protegidas. Los excipientes adecuados son, en particular, llenadores tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; celulosa o preparaciones de almidón, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hídroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden agregar agentes de desintegración, tales como la polivinilpirrolidona entrelazada, agar, o ácido algínico, o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.

La invención además se describe con detalle a continuación.

Purificación de NaD1 a partir de Pichia pastoris y de Nicoiiana alta El sistema de expresión de Pichia pastoris es bien conocido y está comercialmente disponible de Invitrogen (Carlsbad, CA; ver el Manual de Expresión de Pichia del proveedor que describe la secuencia del vector de expresión pPIC9). Se utilizó una colonia individual de P. pastoris GS115, pPIC9-NaD1 para inocular 10 ml del medio BMG (descrito en el Manual de Expresión de Pichia de Invitrogen) en un matraz de 100 ml y se incubó durante la noche en una incubadora de agitación a 30°C (140 rpm). El cultivo se utilizó para inocular 500 ml de BMG en un matraz derivado de 2 litros, el cual se colocó en una incubadora de agitación a 30°C (140 rpm). Una vez que el OD6oo alcanzó 2.0 (-18 horas), las células se cosecharon a través de centrifugación (2,500 x g, 10 minutos) y se volvieron a suspender en 1 litro del medio BMM (OD6oo = 1.0) en un matraz derivado de 5 litros y se incubaron en una incubadora de agitación a 28°C durante 3 días. El medio de expresión se separó de las células a través de centrifugación (4750 rpm, 20 minutos) y se diluyó con un volumen igual de 20 mM de regulador de pH de fosfato de potasio (pH 6.0). El medio se ajustó a un pH de 6.0 con NaOH antes de que se aplicara a una columna de SP Sepharose (1 cm x 1 cm, Amersham Biosciences) pre-equilibrado con 10 mM de regulador de pH de fosfato de potasio, pH 6.0. La columna después se lavó con 100 mi de 10 mM de regulador dé pH de fosfato de potasio, pH 6.0 y la proteína unida se eluyó en 10 mi de 10 mM de regulador de pH de fosfato de potasio conteniendo 500 mM de NaCI. Las proteínas de elución se sometieron a RP-HPLC utilizando un gradiente lineal de 40 minutos como se describe aquí más adelante. Se recolectaron los picos de proteína y se analizaron a través de SDS-PAGE e inmunotinción con el anticuerpo anti-NaD1. Las fracciones conteniendo NaD1 se liofilizaron y se volvieron a suspender en agua ultrapura milli Q. La concentración de proteína de NaD1 expresada en Pichia se determinó utilizando el ensayó de proteína de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce Chemical Co.) con albúmina de suero bovino (BSA) como el estándar de proteína. Para aislar NaD1 de su fuente natural, flores enteras de N. alata hasta la etapa de coloración de pétalo del desarrollo de la flor se enterraron en un polvo fino y se extrajeron en ácido sulfúrico diluido como se describió previamente (Lay y otros, 2003). En un aspecto conciso, se congelaron flores (760 g de peso húmedo) en nitrógeno líquido, enterradas en un polvo fino en un mortero, y se homogenizaron en 50 mM de ácido sulfúrico (3 mi por g de peso fresco) durante 5 minutos utilizando un homogeneizador Ultra-Turrax (Janke and Kunkel). Después de agitar durante 1 hora a 4°C, se removió el desperdicio celular a través de filtración mediante Miracloth (Calbiochem, San Diego, CA) y centrifugación (25,000 x g, 15 minutos, 4°C). El pH después se ajustó a 7.0 a través de la adición de 10 M de NaOH y el extracto se agitó durante 1 hora a 4°C antes de la centrifugación (25,000 x g, 15 minutos, 4°C) ;para remover proteínas precipitadas. El sobrenadante (1.8 litros) se aplicó a una columna de flujo rápido SP Sepharose™ Fast Flowi (GE Healthcare Bio-Sciences) (2.5 x 2.5 cm) pre-equilibrada con 10 mM de regulador de fosfato de sodio. Las proteínas no unidas se removieron lavando con 20 volúmenes de columna de 10 mM de regulador de pH de fosfato de sodio (pH 6.0) y las proteínas no unidas se eluyeron en fracciones de 3 x 10m I con 10 mM de regulador de pH de fosfato de sodio (pH 6.0) conteniendo 500 nM de NaCI. Las muestras de cada paso de purificación se analizaron a través de electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y se realizó la inmunotinción con los anticuerpos anti-NaD1. Las fracciones de la columna SP Sepharose conteniendo Na'D¡1 se sometieron a cromatografía líquida de alto rendimiento de , fase inversa (RP-HPLC).

Cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa La cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) se realizó en una System Gold HPLC (Beckman) acoplada a un detector (modelo 166, Beckman) utilizando una columna C8 de preparación (22 x 250 mm, Vydac) con una columna de guarda unida. Las muestras de proteína se cargaron en el regulador de pH A (0.1% [v/v] ácido trifluoroacético) y se eluyeron con un gradiente lineal de 1-100% (v/v) de regulador de pH B (60% [v/v] acetonitrilo en 0.089% [v/v] ácido trifluoroacético) a una velocidad de flujo de 10 ml/minuto durante 40 minutos. Las proteínas se detectaron verificando la absorbencia a 215 nm. Los picos de proteína se recolectaron y se analizaron a través de SDS-PAGE. Las muestras de cada etapa de purificación de NaD1 (30 pL) se agregaron a un regulador de pH de carga de muestra LDS NuPAGE® (marca registrada) (10 pL, Invitrogen) y se alentaron a 70°C durante 10 minutos. Las muestras después se cargaron en geles de 4-12% Bis-Tris poliacrilamida pre-colados NuPAGE® (Invitrogen) y las proteínas se separaron utilizando un aparato de electroforesis XCell-Surelock (Invitrogen) operando a 200 V. Las proteínas se visualizaron a través de tinción con azul de Coomassie o se transfirieron en nitroceluiosa para inmunotinción con los anticuerpos anti-NaD1.

Preparación de NaD1 reducido y alquilado Se disolvió NaD1 liofilizado (500 pg) en 400 pL de regulador de pH de abastecimiento (200 mM Tris-HCI pH 8.0, 2 mM EDTA, 6 M guanidina-HCI, 0.02% [v/v] Tween®-20). Se agregó regulador de pH de reducción (regulador de pH de abastecimiento con 15 m ditiotreitol [DTT]) (44 pL) seguido por una incubación de 4.5 horas a 40°C. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente antes de que se agregara ácido yodoacético (0.5 M en 1 M NaOH, 55 pL) y la incubación continuó en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para remover las sales se utilizó una columna de giro Nanosep omega® (marca registrada) (3K corte de peso molecular, PALL Life Sciences), la concentración de DTT y ácido yodoacético y proteína se determinó utilizando el ensayo de proteína BCA (Pierce). El efecto de NaD1 reducido y alquilado (NaD1R&A) en el crecimiento de Fusarium oxysporum (Fov) se midió como se describe aquí.

Análisis de inmunotinción Para el análisis de inmunotinción, las proteínas fueron transferidas a nitrocelulosa y se sondearon con anticuerpos antí-NaD1 purificados con proteína A (dilución 1:3000 de 6.5 mg/ml) seguido por IgG de anti-conejo de cabra conjugada a peroxidasa de rábano (dilución 1:3500; Amersham Pharmacia Biotech). Se utilizaron reactivos de detección de quimioluminiscencia (ECL) mejorados (Amersham Pharmacia Biotech) para visualizar anticuerpos unidos con un sistema de bio-formador de imágenes ChemiGenius™ (Syngene). Para producir antisuero de anti-NaD1, se conjugó NaD1 purificado (1.5 mg) a hemocianina de lapa (0.5 mg, Sigma) con glutaraldehido como se describió por Harlow y Lañe (1988). A un conejo se le inyectaron 1.5 mi de proteína (150 pg NaD1) en un volumen igual de auxiliar completo de Freund (Sigma). Después de cuatro y ocho semanas, se administraron inmunizaciones de refuerzo de proteína conjugada (100 ig NaD1) y auxiliar incompleto de Freund (Sigma-Aldrich). Se recolectó suero pre-inmune antes de la inyección y se recolectó suero inmune 14 días después de las tercera y cuarta inmunizaciones. La fracción de IgG del suero tanto pre-inmune como inmune se purificó utilizando Protein-A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech) y se almacenó a -80°C a concentraciones de 3.4 mg/ml y 7.5 mg/ml, respectivamente.

Análisis de Actividad contra hongos filamentosos, levadura, bacterias y células humanas La actividad anti-fúngica contra Fusarium oxysporumf. sp. vasinfectum (Fov, aislado Australiano VCG01111 aislado de algodón; de Wayne O'Neill, Farming Systems Institute, DPI, Queensland, Australia), Fusarium graminearum (aislado Australiano CS3005 aislado de trigo; de CSIRO, University of Queensland, Queensland, Australia), Thielaviopsis basteóla (regalo de David Nehl, NSW DPI, Narrabri, Australia), Verticillium dahiiae (de Wayne O'Neill, Farming Systems Institute, DPI, Queensland, Australia), Leptosphaeria maculans (de Barbara Howlett, The University of Melbourne, Victoria, Australia) y Aspergillus nidulans (de Michael Hynes, The University of Melbourne) se analizó esencialmente como se describió por Broekaert y otros (1990). Las esporas se aislaron de cultivos de esporulación creciendo ya sea en caldo de dextrosa de papa de resistencia media (PDB) (Fov y T. basteóla), caldo de Czapeck-Dox (V. dahiiae) (Difco Laboratories) o 10% (v/v) medio V8 clarificado (L. maculans y A. nidulans) a través de filtración medíante muselina estéril. Se determinaron las concentraciones de espora utilizando un hemocitómetro a 5 x 104 esporas/ml en el medio de crecimiento apropiado. Se agregaron suspensiones de espora (80 pL) a las cavidades de placas de microtitulación de fondo plano de 96 cavidades junto con 20 µ?_ de NaD1 esterilizado por filtro (0.22 µ?? de filtro de jeringa; Millipore), o agua para dar concentraciones firiales de proteína de 0-10 µ?. Las placas se agitaron brevemente y se colocaron en la oscuridad a 25°C sin agitación hasta que la densidad óptica a 595 nm de control de agua alcanzó aproximadamente 0.2 (24 - 72 horas, dependiendo de la velocidad de crecimiento). Se estimó el crecimiento de las hifas midiendo la densidad óptica a 595 nm utilizando un lector de placa de microtitulación (SpectraMax Pro M2; Molecular Devices). Cada prueba se realizó por cuadruplicado. El efecto de NaD1 en el crecimiento de las cepas de levadura, Candida albicans, Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae (de Department of Microbiolog , La Trobe University) se analizó en placas de microtitulación. Las células se desarrollaron en YPD durante 48 horas, después se contaron utilizando un hemocitómetro y se diluyeron a una concentración de 5 x 104 células/ml en YPD fresco. La suspensión de células (100 µ?) conteniendo 0-10 µ? NaD1 se agregó a las cavidades de una placa de microtitulación de 96 cavidades y se incubaron durante 48 horas a 30°C. El crecimiento se determinó midiendo la densidad óptica a 595 nm utilizando un lector de placa de microtitulación. Cada prueba se realizó por cuadriplicado. El efecto de NaD1 sobre el crecimiento bacteriano, según determinado utilizando cepas de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Bacillus cereus (Department of Microbiology, La Trobe University) se analizó en placas de microtitulación. Las células se desarrollaron durante la noche en caldo Luria-Bertani y se diluyeron a una concentración de 1 x 104 células/ml. Después se agregaron diez µ/L de cultivo diluido durante la noche a 190 µ? de LB conteniendo 0-10 µ? NaD1. Las placas se incubaron a 37°C sin agitación durante 24 horas. El crecimiento se determinó midiendo la densidad óptica a 595 nm utilizando un lector í de placa de microtitulación. Cada muestra se realizó ' por cuadriplicado. Para examinar el efecto de NaD1 en el crecimiento de célula de mamífero, se sembraron células HeLa a 50% en un medio de Eagle modificado con Dulbecco (Gibco™-BRL) conteniendo 10% (v/v) de suero de bovino fetal con o sin NaD1 (10 µ?) a 37°C bajo una atmósfera de C02 al 5% y aire al 95% en una caja de Petri de 60 mm. Las células se incubaron durante 48 horas a 37°C antes de ser teñidas con azul de tripano para verificar la viabilidad y se contaron utilizando un hemocitómetro. El efecto de NaD1 en el crecimiento de células de insecto se determinó como sigue. Se desarrollaron células de insecto, Spodoptera frugiperda (Sf 2 ) a una confluencia de ~90% en un medio libre de suero Sf-900 II (Gibco™, 20 mi) en un matraz de cultivo de tejido de 75 cm2 con una tapa ventilada (Nunc). Las células después se dividieron en dos con medio fresco. La suspensión de célula se agregó a cavidades de placas; de microtitulacion de fondo plano de 96 cavidades (190 L/cavidad) y las células se dejaron sedimentar durante 30 minutos antes de la adición de NaD1 (10 µ?_) para dar una concentración final de 0-10 µ?. El crecimiento se verificó hasta que las células alcanzaron la confluencia (-48 horas).

Efecto de iones metálicos en la actividad de NaD1 La actividad de NaD1 contra Fov se examinó como se describió con concentraciones variables de CaCI2 (0.1, 0.2, 0.5, 1.0 y 2.0 µ?) o MgCI2 (1.0, 2.0, 10, 20 y 50 µ?) presentes en el medio para determinar los efectos de cationes divalentes en la actividad de NaD1.

NaD1 y permeabilización de membrana Se desarrollaron hifas Fov en PDB de resistencia media (10 mi en un tubo de 50ml) a partir de una concentración de partida de 5 x 104 esporas/ml durante 18 horas a 25°C con agitación constante. Las muestras (1 mi) después se removieron y se agregó NaD1 (concentración final 2 µ?), NaD1R&A (concentración final 2 µ?) o un volumen equivalente de agua antes de la incubación durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación moderada. Se agregó verde SYTOX® (Invitrogen-Molecular Probes, Eugene, OR) a una concentración final de 0.5 µ? y las hifas se dejaron reposar durante 10 minutos. Las hifas (20 µ?) después se transfirieron a portaobjetos de microscopio (SuperFrost®Plus, Menzel-Galser) y se montaron cubreobjetos de vidrio sobre los portaobjetos para la visualización de las hifas a través de microscopía de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus BX51. Se detectó fluorescencia de verde SYTOX® utilizando un filtro MWBI (longitud de onda de excitación 460-490 nm). Se capturaron imágenes utilizando una cámara digital SPOT RT 3CCD (Diagñostic Instruments) y se procesaron utilizando Adobe Photoshop. Se cuantifico la captación de verde SYTOX® midiendo la fluorescencia de las hifas en charolas de microtitulacion utilizando un fluorímetro (SpectraMax M2; Molecular Devices) con longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 538 nm, respectivamente. La captación de dextrana marcada con FITC con tratamiento con NaD1 de hifas fúngicas también se estudio. Se desarrollaron hifas Fov como se describió anteriormente y se incubaron con NaD1 (concentración final 0.1, 2, 10 ó 50 µ?) o un volumen equivalente de agua durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación moderada. Las hifas se lavaron dos veces durante 10 minutos con PDB de resistencia media para remover el exceso de NaD1 antes de agregar FITC-dextranas ya sea de 4 kDa (FD-4, Sigma-Aldrich) ó 10 kDa (FD-10, Sigma-Aldrich) a una concentración final de 1 mg/ml. Las hifas se incubaron durante 30 minutos más a temperatura ambiente y después se lavaron dos veces con PDB de resistencia media para remover el exceso de dextranas. Se utilizó microscopía de fluorescencia para visualizar hifas como se describe para verde SYTOX®. Se realizó un segundo ensayo bajo más mismas condiciones, excepto que las dextranas se agregaron al mismo tiempo como NaD1. El efecto de la temperatura en la permeabilización de membrana de hifas Fov a través de NaD1 se verificó como se describió, excepto que las hifas fueron pre-equilibradas durante 60 minutos ya sea a 10°, 4o ó 0°C antes de la adición de NaD1 y todos los pasos subsecuente se realizaron a estas temperaturas. Se analizó la cinética de permeabilización de membrana a través de NaD1. Se desarrollaron hifas Fov en PDB de resistencia media a partir de una concentración de 5 x 104 esporas/ml durante 18 horas a 25°C. Después las hifas (80 µ?_) se transfirieron a placas de microtitulación de 96 cavidades y se incubaron con verde SYTOX® (0.5 µ?) durante 10 minutos antes de la adición de 20 µ?_ de solución de péptido a concentraciones de proteína finales de 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50 ó 100 µ?. después se tomaron lecturas de fluorescencia (Ex; 488 nm, Em; 538) cada 2 minutos durante 3 horas utilizando un fluorímetro (SpectraMax M2).

Aislamiento de NaD1 a partir de hifas tratadas Se desarrollaron hifas Fov como se describió anteriormente antes de la adición de NaD1 (10 µ? concentración final) a 1 mi del cultivo. Se recolectaron muestras (100 µ?.) después de 0.5, 10, 30, 60, 90 y 120 minutos. Se recolectaron hifas a través de centrifugación (10 minutos, 10,000 x g) y el sobrenadante se almacenó a -20°C para análisis. Las hifas se lavaron (2 x 10 minutos) con KCI (0.6 M) para remover cualquier proteína iónicamente unida antes de volver a suspenderse en 50 mM regulador de pH CAPS (pH 10.0) conteniendo 10 mM DTT durante 20 minutos. Las hifas se recolectaron a través de centrifugación y el sobrenadante, conteniendo proteínas de pared celular, se recolectó para análisis. La pella (conteniendo las células) se volvió a suspender en agua y las células se Usaron utilizando perlas de vidrio (Sigma, 60mg) y se arremolinaron (3 x 10 minutos). El desperdicio celular se removió a través de centrifugación (16,000 x g, 10 minutos) y el sobrenadante se recolectó para análisis. Después, todas las muestras se analizaron a través de SDS-PAGE e inmunotinción.

Microscopía Electrónica Se desarrollaron hifas Fov durante 18 horas en PDB de resistencia media (5 mi) con agitación vigorosa a 25°C a partir de una suspensión de espora de partida de 5 x 104/ml. Después las hifas se trataron con 2 µ? NaD1 o un volumen equivalente de agua durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación moderada, se lavaron dos veces en 0.6 M KCI y tres veces en PBS antes de la fijación en paralformaldehído al 4% (p/v) en PBS durante 1 hora a 4°C. Las hifas se lavaron de nuevo tres veces en PBS antes de la deshidratación en una serie de etanol estándar (15 minutos cada una, etanol al 50%, 70% y 90%, 3 x 15 minutos etanol al 100%). Las hifas después se infiltraron con resina Blanca LR (ProSciTech) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por 18 horas a 4°C a temperatura ambiente y 24 horas a 60°C. en cada paso se utilizó resina Blanca LR fresca. Se cortaron secciones ultra-delgadas y se colocaron en rejillas de oro recubiertas con Formvar. Las rejillas se bloquearon con PBS conteniendo BSA al 8% (p/v) y Tritón X-100 al 1% (v/v) durante 1 hora y se marcaron con anticuerpos anti-NaD1 (2 pg/ml en regulador de pH de bloqueo) durante 1 hora. Las rejillas se lavaron en regulador de pH de bloqueo (3 x 10 minutos) y se marcaron con 15 nm de anticuerpos de anti-conéjo de cabra marcados con partículas de oro (ProSciTech) durante 1 hora.

Las rejillas se lavaron de nuevo en una solución de bloqueo (3 x 10 minutos) seguido por agua (15 minutos) antes de secarse con aire.

Se utilizó un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM2010HC x e80 KV para examinar las rejillas marcadas. Se tomaron fotos en una película Kodak EM (ProSciTech) y se revelaron en un cuarto oscuro antes de explorar en un escáner Hewlett Parckard Scanjet 5P.

Verificación de captación de NaD1 marcado fluorescentemente Se conjugó isocianato de fluoresceína (FITC) a NaD1 utilizando el equipo de marcación de proteína FITC EZ-marca™ (Pierce) como se describe por el fabricante. Para producir NaD1 marcada con bimano amina, se disolvió NaD1 liofilizado en 0.1 M regulador de pH MES (pH 0.5) a una concentración final de 2 mM. Se agregó bimano amina de etiqueta fluorescente (Invitrogen-Molecular Probes) a una concentración final de 10 mM junto con 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC, concentración final de 2 mM). La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación moderada antes de la centrifugación (13,000 rpm, 10 minutos) para remover cualquier proteína precipitada. Se utilizó una columna de gira Nanosep omega 3K (PALL Life Sciences) para remover sales, bimano amina no unida y EDC. El NaD1 marcado con bimano se volvió a suspender en agua y la concentración de proteína se determinó utilizando el ensayo de proteína BCA (Pierce). Las hifas desarrolladas durante 18 horas como se describió, se trataron con NaD1-binamo (2 µ?) durante entre 10 minutos y 6 horas. Después, las hifas se visualizaron a través de microscopía de fluorescencia utilizando un filtro MWU (longitud de onda de excitación de 330-385 nm).

Detección de especie de oxígeno reactivo en respuesta a tratamiento con NaD1 Se desarrollaron hifas Fov como se describió aquí y se incubaron con 5 pg/ml de dihidrorodamina 123 (Sigma-Aldrich) durante 2 horas seguido por lavado extensivo con un medio de crecimiento. Después las hifas se trataron con NaD1 (2 µ?) o agua durante 1 hora antes de ser lavadas con 0.6 M KCI. Después se midió la fluorescencia en un fluorímetro con longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 538 nm, respectivamente, o se visualizó a través de microscopía de fluorescencia. El experimento se repitió ya sea en presencia de ácido ascórbico (10 mM) o 2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oxilo (TEMPO, 3 mM).

Producción de células y/o tejidos de plantas transgénicas Las técnicas y los agentes para introducir y seleccionar la presencia de ADN heterólogo en células y/o tejidos de planta son bien conocidas. Los marcadores genéticos que permiten la selección de ADN heterólogo en células vegetales son bien conocidos, por ejemplo, genes que llevan resistencia a un antibiótico tal como canamicina, higromicina, gentamicina o bleomicina. El marcador permite la selección de células vegetales exitosamente transformadas que se desarrollan en el medio conteniendo el antibiótico apropiado ya que llevarán el gen de resistencia correspondiente. En la mayoría de los casos, el ADN heterólogo, el cual se insertó en células vegetales, contiene un gen que codifica un marcador seleccionable tal como un marcador de resistencia a antibiótico, pero esto no es obligatorio. Un marcador de resistencia a fármaco ilustrativo es el gen cuya expresión da como resultado resistencia a canamicina, es decir, el gen quimérico conteniendo una región no traducida 3' de promotor de sintasa de nopalina, Tn5 neomicina fosfotransferasa II y nopalina sintasa, descrito por Rogers y otros (1988). Las técnicas para diseñar genéticamente por ingeniería células y/o tejidos de planta con un cásete de expresión comprendiendo un promotor inducible o promotor quimérico fusionado a una secuencia de codificación heteróloga y una secuencia de terminación de transcripción que van a ser introducidas a la célula o tejido de planta a través de transformación mediada por Agrobacterium, electroporación, micro-inyección, bombardeo de partículas u otras técnicas conocidas en el campo. El cásete de expresión ventajosamente además contiene un marcador que permite la selección del ADN heterólogo en la célula vegetal, por ejemplo, un gen que lleva resistencia a un antibiótico tal como canamicina, higromicina, gentamicina o bleomicina. Una construcción de ADN llevando un gen de expresión de planta u otro ADN de interés puede ser insertado en el genoma de una planta a través de cualquier método adecuado. Duchos métodos pueden involucrar, por ejemplo, el uso de lipospmas, electroporación, difusión, bombardeo de partículas, micro-inyección, pistola de gen, químicos que incrementan la captación de ADN libre, por ejemplo, co-precipitación de fosfato de calcio, vectores virales, y otras técnicas practicadas en el campo. Los vectores de transformación de planta adecuados incluyen aquellos derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, tales como aquellos descritos por Herrera-Estrella (1983), Bevan y otros (1983), Klee y otros (1985) y publicación EPO 120,516 (Schilperoort y otros). Además de los vectores de transformación de planta derivados de los plásmidos Ti o de inducción de raíz (Ri) de Agrobacterium, se pueden utilizar métodos alternativos para insertar las construcciones de ADN de esta invención a células vegetales. La elección del vector en donde el ADN de interés está operativamente enlazado depende en forma directa de, como es bien conocido en la técnica, las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, replicación, expresión de proteína, y la célula huésped que será transformada, estas siendo limitaciones inherentes en la técnica de la construcción de moléculas de ADN recombinante. El vector deseablemente incluye un replicón procariótico, es decir, una secuencia de ADN teniendo la habilidad de replicación autónoma directa y mantenimiento de la molécula de ADN recombinante extra-cromosómicamente cuando se introduce a una célula huésped procariótica, tal como una célula huésped bacteriana. Dichos replicones son bien conocidos en la técnica. Además^ las modalidades preferidas que incluyen un replicón procariótico también incluyen un gen cuya expresión confiere una ventaja selectiva, tal como resistencia a un fármaco, a la célula huésped cuando se introduce a esas células transformadas. Los genes de resistencia a fármaco bacterianos son aquellos que confieren resistencia a ampicilina o tetraciclina, entre otros agentes selectivos. El gen fosfotransferasa de neomicina tiene la ventaja de que se expresa en células eucarióticas así como procarióticas. Aquellos vectores que incluyen un replicón procariótico también típicamente incluyen sitios de restricción convenientes para la inserción de una molécula de ADN recombinante de la presente invención. Típicos de dichos plásmidos de vector son pUC8, pUC9, pBR322, y pBR329 disponibles de BioRad Laboratories (Richmond, CA) y pPL, pK y K223 disponibles de Pharmacia (Piscataway, NJ), y pBLUESCRIPT y pBS disponibles de Stratagene (La Jolla, CÁ). Un vector también puede ser un vector de fago Lambda incluyendo aquellos vectores Lambda descritos en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Sambrook et al, eds., Cold Spring Harbor Press (1989) y los vectores ZAP Lambda disponibles de Stratagene (La Jolla, CA). Otro vector incluye, por ejemplo, pCMU (Nilsson y otros (1989)). otros vectores apropiados también p;ueden ser sintetizados, de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, los vectores pCMU/Kb y pCMUII utilizados en varias aplicaciones de la presente que son modificaciones de pCMUIV (Nilsson y otros, supra). Los vectores de expresión típicos capaces de expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante en células vegetales y capaces de dirigir la integración estable dentro de la célula vegetal huésped incluyen vectores derivados de plásmido de inducción de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens. Una planta transgénica puede ser producida a través de cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitándose a, transferencia de ADN mediada por Agrobacterium tumefaciens, preferiblemente con un vector de T-ADN desarmado, electroporación, transferencia de ADN directa, y bombardeo de partículas (ver, Davey y otros (1989); Walden y Schjell (1990); Joersbo y Burnstedt (1991); Potrykus (1991); Gasser y Fraley (1989); Leemans (1993); Beck y otros (1993); Koziel y otros (1993); y Vasil y otros (1993)). Las técnicas son bien conocidas en la técnica para la introducción de ADN en monocotiledóneas así como en dicotiledóneas, ya que son técnicas para cultivar dichos tejidos vegetales y regenerar esos tejidos. A través de métodos bien conocidos en la técnica se pueden hacer anticuerpos monoclonales y policlonales, preferiblemente monoclonales, que reaccionan de manera específica con un polipéptido o proteína de interés. Ver, por ejemplo, Harlow y Lañe (1988); Goding (1986); y Ausubel y otros (1993). Las técnicas estándares para clonación, aislamiento de ADN, amplificación y purificación, para reacciones enzimáticas que involucran ligasa de ADN, polimerasa de ADN, endonucleasas de restricción, y similares, y varias técnicas de separación son aquellas conocidas y comúnmente empleadas por aquellos expertos en la técnica. Un número de técnicas estándares se describen por Sambrook y otros (1989); y Ausubel y otros (1993). Si se emplean abreviaturas y nomenclatura, éstas se consideran estándares en el campo se comúnmente se utilizan en documentos profesionales tales como aquellos citados aquí.

EJEMPLO 1 Inhibición del crecimiento de Fusarium qraminearum en presencia de NaD1 v fungicidas químicos in vitro Los efectos inhibidores de defensina (NaD1) y fungicidas químicos en el crecimiento de Fusarium graminearum (aislado australiano CS3005 provisto por CSIRO Plant Industry, St. Lucia, Queensland, Australia) se midieron esencialmente como se describió por Broekaert, W.F. y otros (1990). Se aislaron esporas de cultivos de esporulación desarrollándose en un caldo bajo en nutrientes sintético (SNPB). Los cultivos se desarrollaron en caldo de dextrosa de papa de resistencia media (PDB) durante 1-2 semanas a temperatura ambiente, antes de que las esporas se recogieran haciendo pasar el cultivo a través de papel de seda o tisú para remover el material de hifas. Se midieron las concentraciones de espora utilizando un hemocitómetro. Se diluyó NaD1, preparado como se describió en las descripciones detalladas, para proporcionar una serie de 10X de soluciones de abastecimiento de las concentraciones finales mostradas en la Figura 1. Los fungicidas, propiconazol (No. Cat. 45642, 98.96% pureza), tebuconazol (No. Cat. 36565, 99.6% pureza), flusilazol (No. Cat. 45753, 99.8% pureza), azoxiestrobina, (No, Cat. 46160, 99.9% pureza) y picoxiestrobina (No. Cat. 33658, 99.9% pureza) se obtuvieron de Sigma Chemical Co., St. Louis. MO. Se prepararon soluciones de abastecimiento en metanol al 100% á una concentración de final de 100X. Se condujeron ensayos anti-fúngicos en charolas de microtitulación de 96 cavidades esencialmente como se describió en la descripción detallada (análisis de la actividad anti-fúngica). Las cavidades se cargaron con 10 iL de NaD1 esterilizado por ¡filtro (filtro de aguja 0.22 pm, Millipore) (10X abastecimiento para cada concentración final) o agua, 1 uL de fungicida (100X abastecimiento para cada concentración final) y 90 uL de 5 x 104 esporas/ml en PDB de resistencia media. Las placas se incubaron a 25°C durante 44 ó 45 horas. Se analizó el crecimiento fúngico midiendo la densidad óptica a 595 nm (A595) utilizando un lector de placa de microtitulación (SpectraMax Pro M2; Molecular Devices). Cada prueba se realizó por cuadruplicado.

Resultados La defensina mejoró la actividad anti-fúngica de varios fungicidas en una forma sinergística cuando se analizó en ensayos in vitro con F, graminearum (Figura 1). El sinergismo entre NaD1 y propiconazol (Figura 1A) fue más evidente cuando se comparó con las curvas de crecimiento obtenidas con 0 y 0.5 µ? de defensina. 0.5 µ? de defensina (sola) inhibieron el crecimiento fúngico en aproximadamente 13% y 0.06 mg/l de propiconazol (solo) también inhibieron el crecimiento fúngico en aproximadamente 13%. Sin embargo, la combinación de 0.5 µ? de defensina y 0.06 mg/l de propiconazol inhibieron el crecimiento fúngico en aproximadamente 78%. Se observó un sinergismo similar con combinaciones de NaD1 con tebuconazol (Figura 1B), flusilazol (Figura 1C), azoxiestrobina (Figuras 1D), y picoxiestrobina (Figura 1E). Los experimentos mostrados en las Figuras 1G a la 1H se repitieron (resultados mostrados en la Figura 1A) para obtener mediciones de inhibición más exactas en la escala crítica de 0-0.25 mg/l de propiconazol con el fin de determinar con más exactitud la sinergia de acuerdo con la fórmula de Limpel. Los cálculos de sinergia de los datos presentados en las Figuras 1A-1E se establecen en la Figura 1F, en donde Ee es el efecto esperado de la respuesta aditiva de acuerdo con la fórmula de Limpel (Richer, 1987) expresado como porcentaje de inhibición y lo es el porcentaje de inhibición observado. Una concentración de NaD1 (0.5 µ?) y dos concentraciones de cada fungicida se utilizaron para los cálculos de sinergia. La sinergia, es decir, los valores lo mayores que los valores de Ee se obtuvo con las dos estrobilurinas y los tres triazoles que se probaron en combinación con 0.5 µ? de NaD1.

EJEMPLO 2 Inhibición del crecimiento de Fusarium oxysporum en presencia de NaD1 v fungicidas químicos in vitro Los efectos inhibidores de defensina (NaD1) y fungicidas químicos en el crecimiento de Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum (Fov) (aislado australiano VCG01111 aislado de algodón y provisto por Farming Systems Institute, DPI, Queensland, Australia) se midieron esencialmente como se descrió por Broekaert, y otros (1990). Se aislaron esporas de cultivos de esporulación desarrollándose en un caldo de dextrosa de papa de resistencia media (PDB). El cultivo de Fov se desarrolló en ½ PDB durante 1-2 semanas a temperatura ambiente, antes de que las esporas se separaran del material de hifas a través de filtración mediante papel de seda estéril. La concentración de esporas en el filtrado se midió utilizando un hemocitómetro. El NaD1 y los fungicidas se prepararon como se describió en el Ejemplo 1. Las condiciones utilizadas para el ensayo de crecimiento fúngico fueron iguales como aquellas descritas en el Ejemplo 1.

Resultados La defensina mejoró la actividad anti-fúngica de varios fungicidas en una forma sinergística cuando se analizó en ensayos in vitro con Fov (Figura 2). La defensina tuvo un efecto sinergístico en la actividad inhibidora de azoxiestrobina contra Fusarium oxysporum (Figura 2A). El sinergismo entre los dos compuestos fue más obvio cuando se compararon las curvas de crecimiento obtenido con 0 y 0.24 µ? de defensina y 0-1 mg/l de azoxiestrobina (Figuras 2A y 2B). La sinergia no pudo ser determinada a concentraciones más altas de defensina y azoxiestrobina cuando la toxicidad de los componentes individuales fue demasiado alta. La Figura 2C ilustra la sinergia entre picoxiestrobina y defensina. La Figura 2D ilustra la sinergia entre fluoxaestrobina y defensina. El sinergismo entre propiconazol y defensina también fue evidente cuando se compararon curvas de crecimiento en presencia de 0 y 0.47 µ? de defensina y 0.125-4 mg/l de propiconazol (Figuras 2E y 2F). Los experimentos mostrados en las Figuras 2H y 21 se repitieron (resultados mostrados en la Figura 2C) para obtener mediciones de inhibición más exactas en la escala crítica de 0-1 mg/l de picoxiestrobina con el fin de determinar con más exactitud la sinergia de acuerdo con la fórmula de Limpel. Los cálculos de sinergia se establecen en la Figura 2G, en donde Ee es el efecto esperado de la respuesta aditiva de acuerdo con la fórmula de Limpel (Richer, 1987) expresado como porcentaje de inhibición y lo es el porcentaje de inhibición observado. Una concentración de NaD1 (0.5 µ?) y dos concentraciones de cada fungicida se utilizaron para los cálculos de sinergia. La sinergia, es decir, los valores lo mayores que los valores de Ee se obtuvo con todas las estrobilurinas y el triazol que se probaron en combinación con 0.5 µ? de NaD1. La comparación de los resultados descritos en los Ejemplos 1 y 2 ilustran que el grado de sinergia entre la defensina y una molécula anti-fúngica particular varía de un patógeno a otro. Es decir, para Fusarium graminearum la mejora sinergia se obtuvo con la combinación de triazoles y defensina, mientras que una mejor sinergia se obtuvo con estrobilurinas y defensina en los bioensayos de Fusarium oxysporum.

EJEMPLO 3 Inhibición de infección por Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum (Fov) en plántulas de algodón transgénicas expresando NaD1. Efecto de recubrimiento de semilla con fungicidas químicos La línea de algodón transgénico 35.125.1 se describió previamente en la patente de E.U.A. 7,041,877, incorporada aquí para referencia. La línea 35.125.1 se transformó con ácido nucleico de longitud completa que codifica la defensina, NaD1.

Bioensayo de invernadero de semilla de algodón transgénico y no transgénico cubierta con el fungicida en tierra infectada con Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum Se utilizó un bioensayo de invernadero con tierra infectada para determinar el nivel de resistencia a Fov en Coker 315 no transgénico y Coker 315 transgénico expresando NaD1 (línea 35.125.1, Solicitud de Patente de E.U.A. No. 12/105,956). Se prepararon cultivos de Fov (aislado #24500 VCG 01111) en mijo y se incorporaron a una mezcla de tierra. La tierra infectada se utilizó para desarrollar la línea 35.125.1 y Coker 315 no transgénico. El cultivo de Fov se preparó en PDB de resistencia media (12 g/l de dextrosa de papa) y se desarrolló durante aproximadamente una semana a 26°C. El cultivo (5 a 10 mi) se utilizó para infectar mijo desvainado de autoclave, el cual después se desarrolló durante 2 a 3 semanas a temperatura ambiente. El mijo infectado se incorporó a una mezcla de tierra a base de turba pasteurizada a 1% (v/v), mezclando vigorosamente en un tambor giratorio de composta de 200 litros. La tierra infectada se transfirió a contenedores de plástico (10 litros de la mezcla por un contenedor de 13.5 litros). La semilla de algodón tanto no se cubrió como se cubrió con el fungicida HEC5725 (ingrediente activo, Fluoxaestrobina, Bayer Crop Science, número de lote 06529/0022) a una proporción de 1 ml/kg de semilla y se dejó secar antes de sembrar. Se agregó agua para facilitar un recubrimiento parejo de la semilla (62.5 mg/kg de semilla). Las muestras no tratadas se trataron solo con agua. Se plantaron cuarenta y ocho semillas para cada prueba (semillas transgénicas y no transgénicas, recubiertas y no recubiertas). La semilla se sembró directamente en los contenedores, 12 semillas por caja en una disposición de 3 X 4. Tres semillas para cada prueba se sembraron aleatoriamente en cada caja. Las plantas se desarrollaron durante 7 semanas. Se midió en desarrollo de síntoma foliar a través del estudio y se determinó la clasificación de la enfermedad mediante muestreo destructivo el final de la prueba. Se utilizó la siguiente clasificación para determinar la escala de enfermedad: 0 = ningún síntoma, 1 = pardeamiento vascular a la base del tallo, 2 = pardeamiento vascular hacia los cotiledones, 3 = pardeamiento vascular más allá de los cotiledones, 4 = pardeamiento vascular hacia las hojas, 5 = muerte. La escala promedio de enfermedad fue un promedio para todas las semillas que germinaron.

Resultados Los resultados del bioensayo de Fov con semillas cubiertas y no cubiertas y Coker no transgénico y Coker expresando NaD1 se presentan en la Figura 3A. Un quince porciento de plantas Coker no transgénicas que no fueron tratadas con el fungicida murieron de infección por Fov. El tratamiento de la semilla no transgénica con el fungicida no mejoró la supervivencia o mejoró la escala de enfermedad. En contraste, Coker transgénico que expresa NaD1 tuvo aproximadamente la mitad de mortalidad de las plantas no transgénicas, aún cuando las semillas no fueron cubiertas con fungicida. Significativamente, no se obtuvo mortalidad cuando las semillas transgénicas se cubrieron con fungicida. Esto demuestra que el fungicida que no protegió las plantas no transgénicas de infección por Fov mejoraron la protección contra infección por Fov en plantas que expresan defensina. Además, la combinación de fungicida con expresión transgénica de defensina NaD1, dio como resultado una gran reducción en la escala de enfermedad con relación a la semilla transgénica cubierta y una reducción aún mayor en la escala de enfermedad con relación a plantas que no expresan defensina.

Bioensayo de gabinete de crecimiento de semilla de algodón transgénica y no transgénica cubierta con fungicida en tierra infectada con Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum Se utilizó un bioensayo de gabinete de crecimiento con tierra infectada para determinar el nivel de resistencia a Fov en Coker 315 no transgénico y Coker 315 transgénico expr4esando NaD1 (línea 35.125.1). El ensayo se condujo como se describió para el ensayo de invernadero, excepto por las siguientes modificaciones. Se plantaron treinta semillas para cada prueba (semilla transgénica y no transgénica, cubierta y no cubierta). La semilla se sembró directamente en los contenedores, 24 semillas por caja en una disposición de 4 X 6. Seis semillas para cada prueba se sembraron aleatoriamente en cada caja. Las semillas germinaron durante 7 días, las condiciones fueron 16 horas de luz a 30°C y 8 horas de oscuridad a 15°C, con una rampa de 2°C por hora. Para el resto del experimento, las condiciones fueron 16 horas de luz a 25°C y 8 horas de oscuridad a 10°C, con una rampa de 2°C por hora. Las plantas se desarrollaron durante 4 semanas. Se midió el desarrollo de síntoma foliar a través del estudio y se determinó la clasificación de la enfermedad a través de muestreo destructivo al final del ensayo. Se utilizó la siguiente clasificación para determinar la escala de enfermedad: 0 = ningún síntoma, 1 = pardeamiento vascular a la base del tallo, 2 = pardeamiento vascular hacia los cotiledones, 3 = pardeamiento vascular más allá de los cotiledones, 4 = pardeamiento vascular hacia las hojas, 5 = muerte. La escala promedio de enfermedad fue un promedio para todas las semillas que germinaron.

Resultados Los resultados del bioensayo de Fov con semillas cubiertas y no cubierta de Coker no transgénico y Coker expresando NaD1 se presentan en la Figura 3B. El dieciocho por ciento de las plantas Coker no transgénicas que no fueron tratadas con fungicida murieron de infección por Fov. Las plantas Coker no transgénicas que fueron tratadas con fungicida mostraron algo de reducción en mortalidad (13%) y una ligera mejora de la escala de enfermedad (1.7 a 1.6). En contraste, Coker transgénico que expresa NaD1 tuvo menos de la mitad de mortalidad de las plantas no transgénicas (7% en lugar de 18%), aún cuando las semillas no fueron cubiertas con fungicida. Significativamente, no se obtuvo mortalidad cuando las semillas transgénicas se cubrieron con fungicida. Esto demuestra que el fungicida que solo protegió débilmente las plantas no transgénicas de infección por Fov mejoraron la protección contra infección por Fov en plantas que expresan defensina. Además, la combinación de fungicida con expresión transgénica de defensina NaD1, dio como resultado una gran reducción en la escala de enfermedad con relación a la semilla transgénica cubierta y una reducción aún mayor en la escala de enfermedad con relación a plantas que no expresan defensina.

Ensayo de campo de semilla de algodón transgénica y no transgénica cubierta con fungicida en tierra infectada con Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum La línea de algodón transgénico, 35.125.1 (D1) (Patente de E.U.A. 7,041,877) que expresa la defensina NaD1 y Coker 315 no transformado se analizaron en un ensayo de campo de escala pequeña en la temporada de algodón australiano. Las semillas de dos líneas ya sea no se cubrieron con fungicida o se cubrieron con el fungicida HEC5725 (ingrediente activo, fluoxaestrobina, Bayer CropScience, número de Iota 06529/0022) a una proporción de 1 ml/kg de semilla, o con los fungicidas de cubierta de semilla comerciales, Dynasty® (marca registrada) (ingredientes activos 75 g/l de azoxiestrobina, 37.5 g/l de metalaxil-m, 12.5 mg/l de fludioxonil, Syngenta) a una proporción de 2 ml/kg de semilla, Jockey® (marca registrada) (ingrediente activo 167 g/l de fluquinconazol, Bayer CropScience) a una proporción de 20 ml/kg de semilla o Redigo® (marca comercial) (ingrediente activo 100 g/l de protioconazol, Bayer CropScience) a una proporción de 1 ml/kg de semilla. Todas las semillas (cubiertas y no cubiertas con fungicida) se cubrieron con el insecticida Gaucho® (marca registrada) (600 g/l imidacloprid, Bayer CropScience) para controlar trisanópteros y áfidos. La semilla se preparó para asegurar un recubrimiento uniforme de fungicida e insecticida y se dejó secar antes de sembrar. Las plantas se desarrollaron en una granja en la región de Darling Downs de Queensland, Australia. Las semilla se plantó mecánicamente en la tierra que se sabía estaba infectada con Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum . Se plantó un total de aproximadamente 1450 semillas por variedad/tratamiento en ocho parcelas de réplica, cada una conteniendo alrededor de 180 semillas por variedad/tratamiento. Se registraron la emergencia y supervivencia de plantas. Alrededor de 1100-1400 semillas germinaron. Se calculó la importancia estadística de la interacción de la línea de planta y la mortalidad utilizando una prueba de chi-cuadrado de Pearson. La producción de vaina, producción de lino y calidad de lino se determinaron al final del ensayo.

Resultados Las Figuras 3C-F ilustran el nivel de mortalidad hasta 57 días después de la siembra de las semillas que se cubrieron o no se cubrieron con fungicidas químicos. La Figura 3C es una representación gráfica de los resultados obtenidos con Jockey®. Las plántulas de la semilla de Coker no transgénica que se cubrieron con el fungicida exhibieron una mortalidad incrementada con relación a la semilla no cubierta, aunque la diferencia no fue importante (P=0.07). En contraste, las plántulas de semillas de Jockey® cubiertas de la línea transgénica 35.125.1 expresando NaD1 exhibieron una mortalidad significativamente menor (p 0.004) que las plántulas de la misma línea que no se cubrieron. En general, en el día 57, la mortalidad de las plántulas de las semillas 35.125.1 cubiertas con fungicida fue de 31.6% comparado con la mortalidad de 50.2% de las plántulas de Coker no transgénico cubierto. La Figura 3D es una representación gráfica de los resultados obtenidos con Dynasty®. Las plántulas de la semilla de Coker no transgénica que se cubrieron con el fungicida exhibieron una mortalidad incrementada con relación a la semilla no cubierta y esta diferencia fue importante (P=0.000). otra vez, la semilla de la linea transgénica 35.125.1 expresando NaD1 fue más resistente a infección fúngica que las líneas no transgénicas ya sea cubiertas con fungicida o no cubiertas. A los 57 días después de la germinación, las plántulas de las semillas cubiertas con fungicida o 35.125.1 exhibieron una mortalidad significativamente menor (p 0.012) que las semillas de la misma línea que no se cubrieron. En el día 57, la mortalidad de las plántulas de las semillas 35.125.1 cubiertas con fungicida fue de 32.3% comparado con una mortalidad de 54.2% de plántulas de Coker no transgénico cubierto. Las Figuras 3E y F presentan los resultados obtenidos con Redigo® y HEC5725. En ambos casos, las plántulas de semillas de Coker no transgénicas que se cubrieron con los fungicidas fueron más susceptibles a infección que las plántulas de semillas no cubiertas (P=0.044 y P=0.001, respectivamente). Las plántulas de la línea 35.125.1 no cubiertas y cubiertas exhibieron una mortalidad significativamente menor que Coker no transgénico. La supervivencia de semillas 35.125.1 cubiertas con HEC5725 (Figura 3F) pareció ligeramente mayor que las semillas 35.125.1 no cubiertas, pero esta diferencia no fue importante (P=0.493). Similarmente, no hubo una diferencia significativa en la mortalidad entre plántulas producidas de semillas cubiertas con Redigo® o no cubiertas (P=0.755). Lo s caculos de sinergia de los datos presentados en las Figuras 3C-F se establecen en la Figura 3G, en donde Ee es el efecto esperado de la respuesta aditiva de acuerdo con la fórmula Limpel (Richer, 1987) expresada como el porcentaje se supervivencia mejorada y lo es el porcentaje de supervivencia mejorada, observado. Los cálculos se basan en las diferencias de porcentaje con relación al control no tratado de Coker. La sinergia, es decir, los valores de lo mayores que los valores de Ee se obtuvieron cuando las semillas de la línea transgénica 35.125.1 se cubrieron con Jockey®, Dynasty®, Redigo® o HEC5725.

EJEMPLO 4 Inhibición del crecimiento de Verticillium dahiiae en presencia de NaD1 y fungicidas químicos in vitro Los efectos inhibidores de defensina (NaD1) y fungidas químicos se analizaron sobre el crecimiento de Verticillium dahiiae (aislado australiano VCG-4B, Dr. Stephen Alien, Cotton Seed Distributors, Narrabi, NSW, Australia) in vitro. Se aislaron esporas de V. dahiiae de cultivos de esporulación desarrollándose en un caldo de Czapek-Dox (Difco) durante 1-2 semanas a temperatura ambiente. Las esporas se separaron del material de hifas a través de filtración mediante papel de seda estéril y la concentración de esporas en el filtrado se midió utilizando un hemocitómetro. NaD1 y los fungicidas se prepararon como se describió en el Ejemplo 1. Las condiciones utilizadas para el ensayo de crecimiento fúngico fueron iguales a aquellas descritas en el Ejemplo 1, excepto que se utilizó caldo de Czapek-Dox en lugar de PDB.

Resultados El sinergismo entre NaD1 y propiconazol (Figura 4A), NáD1 y tebuconazol (Figura 4B) y NaD1 y flusilazol (Figura 4C) fue obvio cuando las curvas de crecimiento con NaD1 no agregado se compararon con aquellas obtenidas con 0.5M NaD1 particularmente en la escala de 0-0.06 mg/l de propiconazol y flusilazol y 0-0.125M de tebuconazol. Los resultados de sinergia también se establecen en la Figura 4D, en donde Ee es el efecto esperado de la respuesta aditiva de acuerdo con la fórmula de Limpel (Richer, 1987) expresada como el porcentaje de inhibición y lo es el porcentaje de inhibición observado. Se utilizaron una concentración de NaD1 (0.5 µ?) y dos concentraciones de cada fungicida para los cálculos de sinergia. La sinergia, es decir, los valores de lo mayores que los valores de Ee, se obtuvo con los tres triazoles que se probaron en combinación con 0.5 µ? de NaD1.

EJEMPLO 5 Inhibición de infección por Verticillium dahliae en plántulas de algodón transqénicas expresando NaD1. Efecto del recubrimiento de la semilla con fungicidas químicos La línea de algodón transgénica 35.125.1 se describió previamente en la Patente de E.U.A. 7,041,877. La línea 35.125.1 se transformó con ácido nucleico de longitud completa que codifica la defensina NaD1. Sicala V2 se obtuvo de Cotton Seed Distributors, Wee Waa, New South ales, Australia 2388.

Ensayo de campo de semilla de algodón transgénica y no transgénica con fungicida en tierra infectada con Verticillium dahliae La línea de algodón transgénica 35.125.1 (Patente de E.U.A. 7,041,877) expresando la defensina NaD1, Coker 315 no transformado y Sicala V2 de variedad comercial, la cual es menos susceptible a infección por V. dahliae (Australian Industry Estándar), se analizaron en un estudio de campo a pequeña escala en la temperada de algodón australiano. La semillas de tres líneas no se cubrieron con fungicida y se cubrieron con el fungicida de recubrimiento de semilla comercial, Dynasty® (marca registrada) (Syngenta, 2 ml/kg). Dynasty contiene los siguientes fungicidas: 75 g/l de azoxiestrobina, 37.5 de metalaxil-m y 12.5 g/l de fludioxonil. Dynasty® (marca registrada) se registró para el control de enfermedades de humectación excesiva de plántulas de algodón causadas por Pythium ssp y Rhizoctonia solani. Todas las semillas (cubiertas con fungicida y no cubiertas) se cubrieron con el insecticida Gaucho® (Bayer, 600 g/l imidacloprid) para controlar trisanópteros y áfidos de inicio de temporada. Las plantas se desarrollaron en una granja cerca de Merah North, NWS, Australia. La semilla se plantó a mano en la tierra que se infectó con V. dahliae. Se plantó un total de 500 semillas por variedad/tratamiento en cinco parcelas de réplica, cadai una conteniendo 100 semillas por variedad/tratamiento. Se registraron la emergencia, supervivencia de plarita e incidencia de síntomas por Verticillium foliar. Al final del estudio, las plantas se valoraron para enfermedad midiendo la decoloración vascular visible en una sección transversal del corte de tallo principal lo más practicablemente posible al nivel del suelo. Se determinó el número de plantas con la ausencia de decoloración vascular y esta información se utilizó para calcular un Rango de Verticillium como sigue. La proporción de plantas con la ausencia de decoloración vascular (denotada T) se calculó dividiendo el número de plantas sin decoloración vascular entre el número de plantas en la posición de planta inicial. Este cálculo también se realizó para la línea de planta de industria estándar Sicala V2 y se denotó como S. Si el valor de T es menor que el valor de S, se utiliza la siguiente fórmula para determinar el Rango de Verticillium: 100X T/S. Si el valor de T es más del valor de S entonces se utiliza la fórmula Í100 + i [(T-S)/(100-S) X 100]. A la planta estándar Sicala V2 se le da un Rango de Verticillium de 100. La producción de vaina, producción de lino y calidad de lino se determinaron también al final del ensayo. Cada planta se valoró para todas las medidas tomadas.

Resultados La germinación con el tratamiento de semilla cubierta con Dynasty® (marca registrada) fue de 72 a 80%, mientras que la germinación de semillas no cubiertas fue solo de 60 a 62%. Esto confirma que la cubierta Dynasty® (mar registrada) de semilla protegió algo de las plantas emergentes de las enfermedades de plántulas tales como Pythium spp y Rhizoctonia solani. Después de 4 semanas, no se presentó ninguna diferencia importante en la supervivencia de plantas Coker transgénicas y no transgénicas con y sin los tratamientos de semilla (Figura 5A). Al final del estudio, no hubo ninguna diferencia en el nivel de infección por Verticillium en plantas no transgénicas de las semillas cubiertas (0.4% no infectadas) y no cubiertas (1.0% no infectadas). El nivel de infección fue más bajo en la línea transgénica expresando NaD1 que las líneas no transgénicas. Además, se obtuvo el número más alto de plantas no infectadas con la combinación de NaD1 expresado transgénicamente con recubrimiento de semilla con fungicida (5.1% no infectadas para semillas cubiertas contra 3.6% no infectadas para semillas no cubiertas). El rango de enfermedad por Verticillium de la línea transgénica NaD1 (35.125.1) que se tratp con la cubierta de semilla fue equivalente al rango de enfermedad por Ve rtici 11 i u m del estándar de industria Sicala V2, y fue 10 veces mayor que el rango de enfermedad por Verticillium de Coker de línea de origen no transgénica que también tuvo la semilla cubierta. La sinergia entre NaD1 y la semilla cubierta con fungicida fue más evidente cuando se examinó la producción de vainas y lino. Aunque la actividad anti-Verticillium de NaD1 fue evidente del nivel reducido de infección y de ensayos in vitro anteriores, la producción no fue significativamente diferente entre la línea transgénica 35.125.1 y el control Coker no transformado cuando la cubierta de semilla Dynasty® (marca registrada) no se utilizó (Figura 5B) en este experimento. En contraste, la producción de vainas se mejoró significativamente cuando la semilla de la línea transgénica 35.125.1 se cubrió con Dynasty® (marca registrada) (Figura 5B). Este resultado sugiere que hubo un efecto sinergístico entre NaD1 expresado en las plantas transgénicas y por lo menos un componente del fungicida Dynasty® (marca registrada).

EJEMPLO 6 Inhibición del crecimiento de Leptosphaeria maculans en presencia de NaD1 v fungicidas químicos in vitro La defensina (NaD1) y los fungicidas químicos, protioconazol (Sigma-Aldrich Cat. #34232, 99.9% puro) y fluquinconazol (Nova Chem, Cat. #C13805000, 98.5% puro) se valoraron para sus efectos inhibidores individuales y combinados sobre el crecimiento de Leptosphaeria maculans (aislado Australiano IBCN18, Prof. B.

Howlett) in vitro. Se desarrolló Leptosphaeria maculans en 10% (v/v) medio V8 durante aproximadamente 2 semanas. Se recogieron esporas a través de filtración mediante muselina estéril y se ajustaron a una concentración final de 5 X 104 esporas/ml. Las condiciones utilizadas para en ensayo de desarrollo fúngico fueron iguales a aquellas descritas en el Ejemplo 1, excepto que se utilizó 10% (v/v) del medio V8.

Resultados La defensina mejoró la actividad de los fungidas protioconazol y fluquinconazol en una forma sinergística cuando se valoraron en ensayos ¡n vitro con L. maculans (Figura 6A protioconazol, Figura 6B fluquinconazol). Los resultados también se establece en la Figura 6C, en donde Ee es el efecto esperado de la respuesta aditiva de acuerdo con la fórmula de Limpel (Richer 1987)) expresado como porcentaje de inhibición y lo es el porcentaje de inhibición observado.

EJEMPLO 7 Inhibición de Leptosohaeria maculans en plántula de cañóla transgénica expresando NaP1. Efecto de cubierta de semilla con fungicidas químicos Producción de cañóla transgénica Se produjo cañóla transgénica expresando NaD1 a partir de la línea de cañóla R164 (Brassica napus) a través de transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. La construcción de ADN (pHEX3) utilizada para la transformación se describe en la Patente de E.U.A. 7,041,877, incorporada aquí para referencia. El vector binario, pHEX3, se transformó a la cepa de Agrobacterium tumefaciens, AGL 1, a través de electroporación y la presencia del plásmido se confirmó a través de electroforesis de gel. Se utilizaron cultivos de Agrobacterium para infectar secciones hipocotiledóneas de cañóla cv R164. Se seleccionaron retoños transgénicos en el antibiótico, canamicina, a 25 mg/l. se seleccionaron plantas transgénicas expresando NaD1 a través de ELISA utilizando un anticuerpo específico NaD1.

Método utilizado para el ensayo de ELISA para detectar NaD1 Se cubrieron placas de ELISA (Nunc Maxisorp™ (In Vitro, Noble Park VIC 3174) #442404) con 100 pL/cavidad de anticuerpo primario en PBS (50 ng/cavidad de anticuerpo de conejo policlonal purificado de proteína A en respuesta al dominio NaD1 maduro (SEC ID NO:1, residuos 26-72, solicitud de patente de E.U.A 12/105,956) a través de un método estándar) y se incubaron durante la noche a 4°C en una caja húmeda. Al día siguiente, las placas se lavaron con PBS/0.05% (v/v) Tween® durante 2 minutos x 4. Las placas después se bloquéaron con 200 pL/cavidad BSA al 3% (p/v) (Sigma (Castle Hill, NSW Australia 1765) A-7030:98% grado ELISA) en PBS y se incubaron durante 2 horas a 25°C y después se lavaron con PBS/0.05% (v/v) Tween® 20, 2 minutos x 4. Para la preparación de muestras de hoja, se colocaron en la tierra 100 mg de tejido de hojas de cañóla congeladas en nitrógeno líquido utilizando un molino de mezcla durante 2 x 10 segundos a una frecuencia de 30. Se agregó un mililitro de PVP al 2% (p/v) insoluble (Polyclar)/PBS/0.05% (v/v) Tween® 20 a cada muestra y la mezcla se agitó, se centrifugó durante 10 minutos y el sobrenadante se recogió. Se prepararon diluciones de los extractos de proteína de cañóla en OBS/0.05% (v/v) Tween® 20, se aplicaron a cada cavidad (100 pL/cavidad) y se incubaron durante 2 horas a 25°C. Las placas se lavaron con PBS/0.05% (v/v) Tween® 20, 2 minutos x 4. Se aplicó un anticuerpo secundario en PBS (50 ng/cavidad anti-NaD1 marcado con biotina, elevado al dominio de defensina madura) a cada cavidad a 100 pL/cavidad y se incubó durante 1 hora a 25°C. Las placas se lavaron con PBS/0.05% (v/v) Tween® 20, 2 minutos x 4. Se aplicó conjugado de NautriAvidin HRP (Pierce, Rockford, II 61105) #31001; dilución 1:1000; 0.1 pL/cavidad) a cada cavidad a 100 pL/cavidad y se incubó durante 1 hora a 25°C. Las placas se lavaron con PBS/0.05% (v/v) Tween® 20, 2 minutos x 4, después con H20, 2 minutos x 2. Se preparó un substrato fresco disolviendo una tableta ImmunoPure OPD (substrato de peroxidasa) (Pierce, Rockford, II 61105 #34006) en 9 mi de agua, después se agregó 1 mi de regulador de pH de peróxido estable (10x, ' Pierce, Rockford, II 61105 #34062). Se agregó un substrato (100 pL/ cavidad) a cada cavidad y se incubó a 25°C. La reacción se detuvo con 50 µ?_ de 2.5 M ácido sulfúrico y la absorbencia se midió a 490 nm en un lector de placa.

Bioensayo fúngico de invernadero El patógeno Leptosphaeria maculans (aislado australiano ICBN18) se desarrolló en placas de agar V8 al 10% (v/v) durante 1-2 semanas a temperatura ambiente. Se aislaron picnidiosporas cubriendo la placa con agua esterilizada (5 mi) y raspando la superficie del agar para descargas las esporas. Las esporas se separaron del material de hifas a través de filtración mediante papeles de seda estériles (por ejemplo, Kleenex). La concentración se las esporas en el filtrado se midió utilizando un hemocitómetro y la concentración final se ajustó a 106 picnidiosporas/ml con agua. Se desarrollaron plántulas (30 semillas por prueba) en el invernadero en charolas de plantación pequeñas a 22°C. Después de diez días de la siembra, los dos cotiledones de cada siembre se perforaron dos veces con una aguja con un calibre 26 (una vez en cada uno de los 2 lóbulos) y el área herida se inoculó con una gota de esporas (5 pL, 106 esporas/ml). Los controles se inocularon con agua. Las plantas se mantuvieron bajo condiciones de alta humedad durante 3 días para facilitar la germinación de esporas. Se valoraron los síntomas de enfermedad a los 10, 14 y 17 días después de la inoculación. El diámetro de cada lesión se medió y la enfermedad se clasificó basándose en un sistema descrito por Williams y Delwiche (1979). Las heridas sin oscurecimiento se clasificaron como 0, las lesiones con un diámetro de 0.5-1.5 nim se clasificaron como 1, las lesiones con un diámetro de 1.5-3.0 mm se clasificaron como 3, las lesiones con un diámetro de 3.0-6.0 se clasificaron como 5, las lesiones con un diámetro mayor que 6 mm o que tuvieron una completa necrosis de cotiledón se clasificaron como 7. Las clasificaciones de enfermedad fueron estadísticamente analizadas a través de regresión ordinal. El tamaño de la lesión se cuantificó utilizando análisis de software de computadora (ImageJ) de imágenes digitales en mm2. Los datos de tamaño de lesión promedio se analizaron estadísticamente transformando los datos (íog 10) y realizando la prueba t. Para probar la sinergia entre fungicidas químicos y defensina expresada en semillas de plantas de cañóla transgénicas a partir de la línea RI64 no transgénica y el transformante NaD1 CAT13.26 tanto se cubrieron como no se cubrieron con los fungicidas, tales como Jockey® (marca registrada) (ingrediente activo fluquinconazol, Bayer CorpScience) o f luoxaestrobina (Bayer CorpScience). Las semillas se cubrieron con soluciones conteniendo el fungicida y se secaron con aire. Las semillas después se germinaron y se infectaron con L. maculaos como se describió anteriormente. En forma alternativa, 48 horas antes de la inoculación con el patógeno, se aplicaron varias concentraciones de fungicida a la superficie de los cotiledones. Los controles se trataron con agua. Los síntomas de enfermedad se valoraron como se describió anteriormente.

Resultados Se produjeron varias líneas de cañóla transgénica y se valoraron para expresión de NaD1 a través de ELISA. La línea CAT13.26 tuvo niveles detectables de expresión de proteína (Figura 7A) y se utilizó para bioensayos subsecuentes. Se compararon plantas RI64 no transgénicas y CAT13.26 transgénicas expresando NaD1 para su susceptibilidad a enfermedad por L. maculans en el invernadero. Se valoraron los síntomas de enfermedad como se describió anteriormente. Las plántulas CAT13.26 tuvieron escalas de enfermedad significativamente más bajas que la línea RI64 en los días 10, 14 y 17 (valores P 0.010, 0.011 y 0.005, respectivamente). El tamaño de lesión promedio de las plántulas CAT13.26 expresando NaD1 también fue significativamente más pequeño que aquel en las plantas no transgénicas a los 10, 14 y 17 días después de inoculación (valores P <0.001, 0.001 y <0.001, respectivamente). Los resultados para los días 10 y 17 se presentan en las Figuras 7B y 7C.

EJEMPLO 8 Inhibición del crecimiento de Fusarium araminearum en presencia de otras defensinas v fungicidas químicas in vitro Se aislaron defensina de semillas o flores utilizando el procedimiento presentado en las descripciones detallas para la purificación de NaD1 a partir de flores Nicotiana alata. Brevemente, se colocaron semillas (500 g) en un homogeneizador Ultra-Turrax (Janke y Kunkel) y se enterraron en un polvo fina antes de la adición de 50 mM ácido sulfúrico (4 mi por g en peso fresco). Las flores se enterraron en un polvo fino en nitrógeno líquido antes de la adición de 50 mM ácido sulfúrico (3 mi por g en peso fresco). La homogenización se continuó durante 5 minutos antes de que el homogenato se transfiriera a un vaso de precipitados y se agitara durante 1 hora a 4°C. Se removió el desperdicio celular a través de filtración mediante Míracloth (Calbiochem, San Diego, CA) y centrifugación (25,000 x g, 15 minutos, 4°C). El pH después se ajustó a 7.0 a través de la adición de 10 M NaOH y el extracto se agitó durante 1 hora a 4°C antes de la centrifugación (25,000 x g, 15 minutos, 4°C) para remover proteínas precipitadas. El sobrenadante se aplicó a una columna SP-Sepharose™ Fast Flow (GE Healthcare Bio-Sciences) (2.5 x 2.5 cm) pre-equilibrada con 10 mM regulador de pH de fosfato de sodio. Las proteínas no unidas se removieron lavando con 20 volúmenes de 10 mM regulador de pH de fosfato de sodio (pH 6.0) y las proteínas no unidas se eluyeron en fracciones de 3 x 10 mi con 10 mM regulador de pH de fosfato de sodio (pH 6.0) conteniendo 500 mM NaCI. Las fracciones de la columna de SP-Sepharose se sometieron a cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) utilizando una columna de RP-HPLC Zorbax 300SB-C8 y un sistema Agilent Technologies serie 1200 o una columna de preparación de RP-HPLC Vydac C8 en un sistema Beckman Coulter System Gold HPLC. Las muestras de proteína se cargaron en un regulador de pH A (0.1% (v/v) ácido trifiuoroacético) y se eluyeron con un gradiente lineal de 0-100% (v/v) regulador de pH B (60% (v/v) acetonitrilo en 0.089% (v/v). Las proteínas eluidas se detectaron verificando la absorbencia a 215 nm. Se recolectaron los picos de proteína y se identificaron defensinas utilizando SDS-PAGE y espectroscopia masiva. Los efectos inhibidores de las defensinas vegetales y fungicidas químicos sobre el crecimiento de Fusarium graminéarum se midieron como se describió para la defensina NaD1 en el Ejemplo 1.

Medición de índice de permeabilidad relativa de varias defensinas vegetales en hifas F. graminéarum i) Ensayo de captación de verde SYTOX® Se trataron hifas (50 pL) que se desarrollaron durante 16 horas en ½ PDB a partir de una concentración de espora de partida de 5 x 104/ml, con 0.125, 0.25, 0.5, 1.25, 2.5, 5 ó 10 µ de NaD1 en presencia de 0.5 µ? de verde SYTOX® (Molecular Probé) en un volumen final de 100 pL de ½ PDB en charolas de microtitulación negras (Corning). Se inspeccionó la fluorescencia de verde SYTOX® después de 1 hora utilizando un fluorímetro (SpectraMax M5; Molecular Devices) con longitudes de onda de excitación y emisión de 485 nm y 538 nm, respectivamente. ii) Ensayo de liberación de ATP También se midió la permeabilización de las hifas inspeccionando la liberación de ATP de las células. Se trataron hifas (40 µ?_) que se desarrollaron durante 16 horas en ½ PDB a partir de una concentración de espora de partida de 5 x 104/ml, con 0.125, 0.25, 0.5, 1.25, 2.5, 5 ó 10 µ? de NaD1 en presencia de un reactivo de luciferasa (50 µ?_; Roche). La luciferasa (de Photinus pyralis) cataliza la conversión de luciferina a oxiluciferina en presencia de ATP con una liberación subsecuente de luz. La salida de luz es directamente proporcional a la concentración de ATP. Se cuantificó la luminiscencia utilizando un espectrofotómetro SpectraMax M5 (Molecular Devices). Se observó una liberación de ATP dependiente de la concentración después de la adición de NaD1 a las hifas, indicando que la membrana de las hifas se vio comprometida por las defensinas y que ATP se liberó hacia el medio.

Resultados Las proteínas unidas de SP-Sepharose del tomate y extractos de flor de N. alata se fraccionaron más a través de RP-HPLC y sus perfiles de elución se muestran en las Figuras 8A y 8B, respectivamente. Las proteínas que fueron recolectadas y se utilizaron en los bioensayos se marcaron y su masa se proporciona en la Figura 8C. Las defensinas que se aislaron de las semillas o tejidos florales de varias plantas se listan en la Figura 8C junto con su masa. La Figura 8D ilustra la cantidad relativa de verde SYTOX® que entra a las hifas F. graminearum en presencia de varias concentraciones de NaD1. La captación de verde SYTOX se incrementa con concentraciones en incremento de NaD1. El efecto de las defensinas sobre la permeabilidad de membrana también se valoró utilizando un ensayo de liberación de ATP. Este ensayo confirmó que la liberación de ATP se incrementó a medida que la concentración de NaD1 se eleva de 0.125 a 10 µ? de NaD1 (Figura 8E). La Figura 8F ilustra la diferencia en la actividad de permeabilización entre las varias defensinas vegetales sobre hifas F. graminearum que se desarrollan en un cultivo líquido según determinado a través de la liberación de ATP. Las defensinas con la actividad de permeabilización más alta (NaD1, Tomdef2, Tomdef3 y NaD4), todas fueron defensinas florales de plantas solanáceas. La cantidad de luminiscencia observada en presencia de 1 µ de defensina se correlacionó con la cantidad de actividad inhibidora de crecimiento observada a la misma concentración de defensina. El sinergismo entre las varias defensinas vegetales y el triazol, tebuconazol, fue más evidente con defensinas que presentaron la permeabilización y actividad fúngica más altas (Figura 8F). Las Figuras 8G-8L ilustran las curvas de crecimiento obtenidas con varias concentraciones de las defensinas NaD1 (Figura 8G), Tomdef3 (Figura 8H), NaD4 (Figura 81), Tomdef2 (Figura 8J), NaD2 (Figura 8K) y SFSH4 (Figura 8L) con tebuconazol. Los cálculos de sinergia de los datos presentados en las Figuras 8G-8L se establecen en la Figura 8M, en donde Ee es el efecto esperado a partir de la respuesta aditiva de acuerdo on la fórmula de Limpel (Richer, 1987) expresado como el porcentaje de inhibición y lo es el porcentaje de inhibición observado. La sinergia, es decir, los valores de lo mayores que los valores de Ee, se obtuvo con el triazol, tebuconazol, y las defensinas florales NaD1, NáD4 y tomdef3. La relación entre el índice de permeabilidad relativa de cada una de las defensinas en F. graminearum y su actividad anti-fúngica se tabula en la Figura 8N. el índice de permeabilidad (Pl) se definió como la cantidad relativa de unidades de luminiscencia obtenidas en 10 minutos con 1 µ? de defensina, comparado con la luminiscencia obtenida con 1 µ? de NaD1, al cual se le da un Pl de 1.

EJEMPLO 9 Inhibición dei crecimiento de Sclerotinia sclerotiorum en presencia de NaD1 y fungicidas químicos in vitro Los efectos inhibidores de defensina (NaD1) y fungicidas químicos se analizaron sobre el crecimiento de Sclerotinia sclerotiorum (aislado australiano UQ1280 del Prof. B. Howlett, School of Botany University of Melbourne, Victoria, Australia). ¦ Se desarrolló Sclerotinia sclerotiorum durante una semana en PDB hasta que el cultivo produjo un grupo grande de hifas y nada de esporas asexuales. Se cortó una pieza grande de material de hifas (aproximadamente 5 cm2) y se colocó en 30 mi de PDB de resistencia media. Se preparó una suspensión de fragmentos de hifas a través de homogenización con Polytron (Ystral, Alemania) (3 x 30 segundos, velocidad 6). El homogenato se diluyó con PDB de resistencia media hasta tener una absorbencia, a 590 nm, de 0.1. Las condiciones utilizadas para el ensayo de crecimiento fúngico son iguales a aquellas descritas en el Ejemplo 1, excepto que se utilizaron 90 pide suspensión de hifas para inocular las cavidades de la placa de microtitulación en lugar de la suspensión de espora.

EJEMPLO 10 Inhibición de infección por Sclerotinia sclerotiorum en plántulas de cañóla transqénica expresando NaD1. Efecto de cubrimiento de la semilla con fungicidas químicos Se produjo cañóla transgénica expresando NaD1 a través de transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens como se describió en el Ejemplo 7. Se desarrolló el patógeno Sclerotinia sclerotiorum en 10% (v/v) placas de agar V8 durante 3-5 días a 25°C. Se removieron hojas de plantas de cañóla expresando NaD1 y se colocaron en cajas de Petri con papel filtro húmedo. Las hojas se inocularon colocando tapones de agar desde la parte frontal de crecimiento del cultivo de S. sclerotiorum mirando hacia abajo sobre la superficie de la hoja (4 tapones de agrá por hoja). Las hojas inoculadas se incubaron a 25°C y se midieron la altura y el diámetro de las lesiones, 24, 48 horas después de colocar los tapones de agar en las hojas.

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Claims (29)

REIVINDICACIONES

1. Un sistema para proteger a una planta de una enfermedad causada por un hongo susceptible dado, que comprende un primer componente y un segundo componente, cada uno de dichos primer y segundo componentes siendo un inhibidor de un hongo susceptible dado, el primer componente siendo una defensina vegetal, la cual no es expresada por naturaleza por dicha planta, el componente siendo un fungicida químico, la defensina y el fungicida en combinación son sinergístícos con respecto a la inhibición del hongo cuando se combinan en contacto con el hongo.

2. El sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la defensina es una defensina floral.

3. El sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la defensina exhibe un índice de permeabilidad relativa mayor que 0.12 en contacto con el hongo susceptible.

4. El sistema de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la defensina es una defensina de una planta solanácea.

5. El sistema de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la defensina se selecciona del grupo que consiste de NaD1, NaD4, Tomdef2 o Tomdef3.

6. El sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la defensina vegetal es NaD1 o una variante de la misma, la cual retiene la actividad anti-fúngica.

7. El sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fungicida químico es una estrobilurina o un triazol o un fungicida de metalaxilo.

8. El sistema de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la defensina es una defensina floral.

9. El sistema de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la defensina exhibe un índice de permeabilidad relativa mayor que 0.12 en contacto con el hongo susceptible.

10. El sistema de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la defensina es una defensina de una planta solanácea.

11. El sistema de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la defensina se selecciona del grupo que consiste de NaD1, NaD4, Tomdef2 o Tomdef3.

12. El sistema de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el fungicida, estrobilurina es azoxiestrobina, picoxiestrobina o fluoxaestrobina.

13. El sistema de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el fungicida, triazol, es propiconazol, tebuconazol, flusilazol, fluquinconazol o protioconazol.

14. El sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el hongo susceptible es un hongo filamentoso.

15. El sistema de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el hongo filamentoso se selecciona de los grupos que consisten de Fusarium, Sclerotinia, Leptosphaeria o Verticillium.

16. El sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la defensina vegetal es provista a través de una planta transgénica que expresa la defensina vegetal.

17. El sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la planta que va a ser protegida es una planta transgénica que expresa la defensina vegetal.

18. El sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la defensina vegetal se aplica a la planta que va a ser protegida.

19. El sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la planta que va a ser protegida es una plántula.

20. El sistema de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el fungicida se aplica a una semilla, y en donde la defensina vegetal es expresada por la plántula.

21. Un método para identificar una defensina, la cual mejora la actividad anti-fúngica de un fungicida químico, que comprende los pasos de combinar un hongo con un compuesto indiciador de permeabilidad en presencia de, y en forma separada de, en ausencia de, una defensina de prueba; comparar cualquier cantidad intracelular detectable del compuesto indicador de permeabilidad en el hongo en presencia y en ausencia de la defensina de prueba, por lo que una defensina de prueba, la presencia de la cual incrementa la cantidad de compuesto indicador de permeabilidad intracelular comparado con la cantidad intracelular del compuesto indicador detectado en ausencia de la defensina de prueba, se identifica como una defensina, la cual mejora la actividad anti-fúngica dé un fungicida químico.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en dónde una defensina que mejora la actividad anti-fúngica de un fungicida químico se caracteriza por tener un índice de permeabilidad relativa mayor que 0.12 en una escala en donde el índice de permeabilidad de NaD1 se fija como 1.0.

23. Una defensina que tiene un índice de permeabilidad relativa mayor que 0.12, según identificado a través del método de la reivindicación 22.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el compuesto indicador de permeabilidad es Verde SYTOX®.

25. Un sistema para proteger a una planta de una enfermedad causada por un hongo susceptible dado, que comprende un primer componente y un segundo componente, el primer componente siendo un fungicida químico que es un inhibidor de dicho hongo, el segundo componente siendo una defensina vegetal, la cual no es expresada por naturaleza por dicha planta, la defensina vegetal siendo identificada por el método de la reivindicación 21.

26. El sistema de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el grado de inhibición de hongo provisto por los primero y segundo componentes combinados en contacto con el hongo es sinergístico comparado con la inhibición provista por cualquier componente en contacto individual con el hongo a la misma dosis utilizada para el contacto combinado.

27. Una defensina vegetal que tiene las propiedades de NaD4 como se describe aquí.

28. Una defensina vegetal que tiene las propiedades de Tomdef3 como se describe aquí.

29. Un uso de un primer componente y un segundo componente en una planta, cada uno de dichos primero y segundo componentes siendo un inhibidor de un hongo susceptible dado, el primer componente siendo una defensina vegetal, la cual no es expresada por naturaleza por dicha primera planta mencionada, el segundo componente siendo un fungicida químico en la inhibición del hongo, cuando se combina en contacto con el hongo en dicha planta.