MX2010007989A - Alfavirus recombinantes atenuados incapaces de replicarse en mosquitos y usos de estos. - Google Patents
Alfavirus recombinantes atenuados incapaces de replicarse en mosquitos y usos de estos.Info
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Abstract
La presente invención describe un alfavirus recombinante atenuado que es incapaz de replicarse en las células de mosquito y de trasmitirse mediante los vectores de mosquitos. Este alfavirus atenuado podría incluir pero no limita al virus de la Encefalitis Esquina Occidental, virus de Encefalitis Esquina Oriental, virus de Encefalitis Esquina Venezolana o virus de Chikungunya. La presente invención también describe el método de generación de tales alfavirus y su uso como composiciones inmunogénicas.
Description
ALFAVIRUS RECOMBINANTES ATENUADOS INCAPACES DE REPLICARSE EN
MOSQUITOS Y USOS DE ESTOS
Referencia Cruzada a la Solicitud de Referencia
Esta solicitud internacional reivindica el beneficio de la solicitud provisional de
EE.UU. Número de Serie. 61/062,229 presentada en Enero 24, 2008, abandonada ahora, la que es incorporada como referencia en su totalidad.
Inscripción de Financiamiento Federal
Esta invención se produjo en parte, usando los fondos que se obtuvieron a través de un premio 1 U54 AI057156 del Instituto Nacional de Salud/Instituto Nacional de Alergia y Enfermedad Infecciosa. Como consecuencia, el gobierno federal tiene ciertos derechos en esta invención.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Campo de la invención
La presente invención se refiere a los campos de biología molecular, virología e inmunología de los alfavirus. Más específicamente, la presente invención proporciona alfavirus atenuados recombinantes, que tienen la incapacidad de infectar al mosquito y describe el método de generación de tales alfavirus y el uso de estos alfavirus atenuados en las composiciones inmunogénicas.
Descripción de la Técnica Relacionada
El género Alfavirus de la familia Togaviridae contiene un número significativo de patógenos humanos y animales. Estos virus están ampliamente distribuidos en todos los continentes excepto en la región Antártica, y representan una amenaza significativa para la salud pública (18, 39). Bajo condiciones naturales, la mayoría de los alfavirus son transmitidos por mosquitos, causándoles una infección persistente, duradera que tiene poco efecto sobre las funciones biológicas del vector. En los vertebrados infectados por mosquitos durante su alimentación con sangre, los alfavirus causan una infección aguda, caracterizada "por un alto título de viremia que es un pre-requisito para la infección de nuevos mosquitos y su circulación en la naturaleza.
El virus de encefalitis equina venezolana (VEEV) es uno de los miembros más patogénicos del género de alfavirus. Circula constantemente en América del Sur, Central y del
Norte y causa epidemias esporádicas y epizootias que involucran a humanos, caballos y otros animales domésticos. Durante el más reciente y mayor brote en Venezuela y Colombia (1995), que involucró el subtipo IC VEEV, ocurrieron aproximadamente 100 000 casos humanos, con estimado de más de 300 casos fatales de encefalitis (37). Durante las epizootias de VEEV, la mortalidad equina debido a la encefalitis puede alcanzar el 83 %, y mientras la tasa de mortalidad global es menor en humanos (< 1 %), la enfermedad neurológica, que incluye desorientación, ataxia, depresión mental, y convulsiones, puede ser detectada en hasta el 14 % de individuos infectados, especialmente niños (21 ). La enfermedad humana causada por VEEV se caracteriza como una afección febril con escalofríos, dolor de cabeza grave, mialgia, somnolencia y faringitis. Los individuos jóvenes y viejos desarrollan una infección reticuloendotelial con depleción linfoide grave, después por encefalitis. El resultado de la infección SNC es una meningoencefalitis aguda que conduce a la muerte de las células neuronales (9). Los signos neurológicos aparecen dentro de los días 4-10 del inicio de la enfermedad e incluyen ataques, paresis, cambios conductuales y coma.
A pesar de amenaza continua de epidemias por VEEV, no han sido diseñadas vacunas seguras y eficientes para este virus. La cepa atenuada TC-83 VEEV se desarrolló hace más de cuatro décadas por el pase seriado de una cepa de VEEV altamente virulenta de burro Trinidad (TRD) en células de corazón de cobayo (4). Actualmente, todavía la TC-83 es la única vacuna disponible para trabajadores de laboratorio y personal militar. Más de 8000 personas se han vacunado (2, 8, 34), y los datos acumulados demuestran con claridad que cerca del 40 % de todas las vacunas desarrollan una enfermedad con algunos síntomas típicos de VEE natural, que incluyen la fiebre, la enfermedad sistémica y otros efectos adversos (2). Globalmente, esta cepa TC-83 mata a los ratones recién nacidos, pero no a los adultos, después de la inoculación i.c. y s.c. (31), y de ese modo es un buen material de inicio para la atenuación y el estudio adicional de los efectos de las mutaciones en la patogénesis viral.
El genoma VEEV es una molécula de ARN de simple cadena de polaridad positiva de casi 12-kb-de largo, que mimetiza la estructura de los ARNm celulares. El genoma de ARN contiene tanto un casquete 5' metilguanilato como una cola 3' poliadenilato (24), características que permiten la traducción de proteínas virales por la maquinaria celular del huésped inmediatamente después de liberar los genomas de ARN de las nucleocápsidas. Los dos tercios 5' del genoma se traducen por proteínas no estructurales (nsPs) que comprenden los componentes virales del complejo enzimático de replicación que se requieren para la replicación del genoma viral y la transcripción del ARN subgenómico. El ARN subgenómico
corresponde al tercio 3' del genoma. Este se sintetiza a partir del promotor subgenómico y se traduce por las proteínas virales estructurales. El fenotipo atenuado de la cepa TC-83 VEEV es el resultado de dos mutaciones en el genoma de la cepa TRD: una de ellas sustituye un aminoácido en la posición 120 de la glicoproteína E2 y el segundo cambia 3 nt en el 5'UTR (11 , 23, 24, 43). De ese modo, debido a que la tasa de mutación del alfavirus es muy alta, la reversión de TC-83 a un fenotipo patogénico continúa siendo una gran preocupación en caso de que ocurrieran las condiciones selectivas adecuadas, tal como el pase del virus in vivo. Además, la TC-83 VEEV es capaz de replicarse en células de mosquito, e infectar a los mosquitos después de la vacunación (32); por consiguiente, su transmisión a través dé los mosquitos continúa siendo posible.
Perfectamente, las cepas para vacunas vivas de arbovirus no deberían ser trasmitidas por vectores de artrópodos, debido a que la circulación entre los huéspedes de reserva podría conducir a cambios inesperados que podrían incluir el incremento de la virulencia. Esto se cumple para cepas atenuadas, producidas a partir de virus tipo salvaje que cuentan con números pequeños de mutaciones de atenuación que pueden estar sujetas a la reversión, o para cepas genéticamente modificadas que podrían evolucionar a formas imprevistas si experimentan la circulación en el vector de transporte. El riesgo anterior se acentuó por la detección de la cepa vacunal TC-83 VEEV en mosquitos colectados en Louisiana durante 1971 (32), un área fuera de la epizootia/epidemia que se restringió a Texas.
El desarrollo del ADNc infeccioso para los alfavirus abre una oportunidad para explorar su atenuación por modificación extensiva de los genomas virales, una aproximación que podría minimizar o excluir la reversión del tipo salvaje, el fenotipo patogénico. Además, los genomas de tales alfavirus pueden ser diseñados para contener elementos de RNA que serían funcionales sólo en células de vertebrado, pero no en insecto, su origen. De ese modo, tales mutaciones extensivas impedirían la transmisión de los virus genéticamente modificados por los vectores de mosquito.
A pesar de su importancia como un patógeno emergente de humano y animal, su potencial como un armamento biológico y las preocupaciones acerca de la aplicación de los alfavirus atenuados, la técnica anterior es deficiente en los métodos de generación de cepas atenuadas de los alfavirus que son capaces de replicarse sólo en las células de vertebrados. La presente invención cumple esta necesidad y deseo antiguo en la técnica.
SUMARIO DE LA INVENCION
En una modalidad de la presente invención, se proporciona un método de generar un alfavirus atenuado recombinante. Tal método comprende la clonación del sitio interno de entrada al ribosoma del virus de encefalomielocarditis (IRES EMCV) entre el terminal de la secuencia que codifica la proteína 4 no estructural (nsP4) y el inicio AUG de una secuencia que codifica un ARN subgenómico de un alfavirus en lugar del 5' UTR natural del ARN subgenómico. En una modalidad adicional de la presente invención, hay un alfavirus atenuado recombinante generado por el método discutido arriba.
Aún en otra modalidad referida de la presente invención, se proporciona un vector que comprende la secuencia de nucleotidos que codifica el alfavirus atenuado recombinante y una célula huésped que comprende y expresa este vector. Aún en otra modalidad referida de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica. Esta composición comprende el alfavirus atenuado recombinante discutido arriba y un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad referida de la presente invención, se proporciona una composición inmunogénica. Esta composición inmunogénica comprende el alfavirus atenuado recombinante descrito en este documento.
En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método de protección a un sujeto de las infecciones que resultan de la exposición a un alfavirus. Tal método comprende la administración de una cantidad inmunológicamente efectiva de la composición inmunogénica que comprende el alfavirus atenuado recombinante, descrito en este documento, por lo tanto la protección al individuo de las infecciones que resultan de la exposición a los alfavirus.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Las Figuras 1A-1 D muestran la replicación de los virus VEEV derivados de TC- 83 que codifican para IRES EMCV, recombinantes, en células BHK-21. La Figura 1A es una representación esquemática de los genomas virales diseñados, la infectividad de los ARN sintetizados in vitro en la prueba central de infección, los títulos de virus a 24 h post-transfección de 1 mg de los ARN sintetizados in vitro dentro de las células BK-21 , y tamaños de las placas, formadas por el virus indicados en las células BHK-21 a las 48 h post transfección. Las flechas indican los promotores funcionales subgenómicos. Los cuadros rellenos indican IRES de EMCV. La Figura 1B muestra el alineamiento del promotor subgenómico que contiene el fragmento del genoma de TC-83 VEEV y el fragmento correspondiente a IRES/mutSG/VEEV. La posición del promotor se indica por el cuadro
abierto. El inicio del ARN subgenómico en el genoma TC-83 VEEV y el comienzo del IRES de E CV se indican por flechas. Las mutaciones, introducidas dentro del genoma de IRES/mutSG/VEEV se muestran en letras minúsculas. La Figura 1C muestra las placas formadas en las células BHK-21 por los virus, centrifugadas a las 24 h post transfección. La Figura 1D muestra la replicación viral después de la transfección de 1 mg de los ARN sintetizados in vitro dentro de las células BHK-21.
Las Figuras 2A-2C muestran las mutaciones encontradas en las placas de las variantes IRES/mutSG/VEEV purificadas, que demuestran la replicación de mayor eficiencia en las células BHK-21 , y el efecto de las mutaciones de adaptación definidas en la replicación de TC-83 VEEV e IRES/mutSG/VEEV. La Figura 2A muestra la lista de las mutaciones encontradas en los genomas de los aislamientos en placas, comparado a la secuencia publicada de la TC-83 VEEV (24). La Figura 2B es una representación esquemática de los genomas de TC-83 VEEV y IRES/mutSG/VEEV, que tienen ya sea una o dos mutaciones identificadas, y la infectividad de los ARN virales sintetizados in vitro en la prueba central de infección. Los promotores subgenómicos funcionales se indican por flechas, e IRES EMCV por cuadros rellenos. La Figura 2C muestra la replicación en células BHK-21 del virus diseñado después de la transfección de 1 mg de los genomas virales sintetizados in vitro.
Las Figuras 3A-3B muestran las mutaciones identificadas en la proteína P2ns de las variantes IRES/mutSGA EEV que demuestran un fenotipo de placa grande. La Figura 3A muestra una lista de mutaciones identificadas en los genomas de los aislamientos purificados de la placa del virus depositado, centrifugado a las 24 h post transfección del ARN sintetizado in vitro (Original), y en los genomas de los aislamientos del depositado que adicionalmente se pasó tres veces en las células Vero (Pase). La Figura 3B muestra la localización de las mutaciones definidas en la P2ns VEEV. Se indican las posiciones de los dominios funcionales conocidos en la actualidad en la P2ns (38, 39).
Las Figuras 4A-4B muestran el análisis de la síntesis de proteína y ARN en las células BHK-21 transfectadas con los ARN virales recombinantes sintetizados in vitro. Las células se electroporaron con 4 mg de los ARN indicados y se sembraron dentro de placas de 35-mm. En la Figura 4A, a 4.5 h post transfección, el medio de las cavidades se sustituyó por 1 mi de un MEM suplementado con FBS 10%, ActD (1 pg/ml) y [3H]uridina (20 pCi/ml). Después de 4 h de incubación a 37°C, los ARN se aislaron y analizaron por electroforesis en gel de agarosa. Las posiciones de los ARN virales genómicos y subgenómicos se indicaron por G y SG, respectivamente. El ARN subgenómico específico a IRES/VEEV forma una banda
difusa mayor que otras hechas por los virus que producen ARN subgenómico, debido a que en el gel, estas co-migran con el ARN ribosomal - 28S. En la Figura 4B, a 12 h post transfección, las proteínas se marcaron metabólicamente con [35S]metionina y se analizaron en un gel de poliacrilamida al 10% con dodecil sulfato de sodio. Las posiciones de los marcadores de peso molecular (kDa) se indican en el lado izquierdo del gel. Las posiciones de las proteínas estructurales virales: C, E1 y p62 (el precursor de E2) se muestran en el lado derecho del gel. Los asteriscos indican las posiciones de las proteínas celulares (las proteínas de choque térmico) inducidas por la replicación de los virus que codifican IRES.
Las Figuras 5A-5C muestran el pase de las variantes VEEV que contienen IRES EMCV recombinantes, en células C710. La Figura 5A es una representación esquemática de los genomas virales. La flecha indica la posición del promotor funcional subgenómico. El cuadro relleno indica la posición de IRES EMCV. La Figura 5B muestra los títulos de los virus recombinantes después del pase en células C710. Las células en las placas de 35 mm se infectaron con 400 mi de muestras de virus centrifugadas ya sea a las 24 h post transfección de las células BHK-21 con ARN sintetizado in vitro (P1) o a las 48 h post infección de las células C710. La línea de trazos indica el límite de detección. La Figura 5C muestra las delecciones de la secuencia que contiene IRES en las variantes IRES/VEEV purificadas en las placas, que demuestran la replicación eficiente en las células C710. Las secuencias específicas de IRES EMCV residual se indican mediante letras minúsculas.
La Figura 6 muestra la replicación de IRES/mutSG/VEEV/1 y TC-83 VEEV en las células NIH 3T3. Las células se infectaron a una MOI de 10 PFU/célula. Los medios se sustituyeron a los intervalos de tiempo indicados, y los títulos de virus se midieron por el ensayo de placa en las células BHK-21. Las mismas muestras se usaron para medir la liberación de IFN-a/b en el ensayo biológico. Las concentraciones de IFN-a/b liberadas se ' presentan en unidades internacionales (Ul) por mi.
La Figura 7 muestra la sobrevivencia de ratones infectados con los virus TC-83 VEEV e IRES/mutSG/VEEV/1. Los ratones Swiss NIH de seis días de edad se inocularon i.c. con ca. de 106 PFU de los virus indicados. Los animales se monitorearon durante dos meses. No ocurrieron muertes después de 9 días post-infección en ninguno de estos experimentos.
La Figura 8 muestra la sobrevivencia después de la vacunación y el reto de los ratones adultos. Los ratones Swiss NIH hembras de cinco a seis semanas de edad se inmunizaron s.c. con la cepa VEEV TC-83 o el virus recombinante a una dosis de ca. de 106 PFU. Tres semanas después de la inmunización, los ratones se retaron s.c. con ca. de 104 PFU de la cepa VEEV 3908, y la mortalidad se registró.
La Figura 9 muestra un método esquemático de generación del álfavirus recombinante atenuado incapaz de infectar los mosquitos.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invención está diseñada a una nueva estrategia de desarrollo de cepas de álfavirus atenuados. Estos álfavirus atenuados son capaces de replicarse solo en células de vertebrados. Este fenotipo se logró mediante la interpretación de la traducción de las proteínas estructurales virales y finalmente la replicación depende del sitio interno de entrada al ribosoma del virus de encefalomielocarditis (IRES EMCV). Tal virus recombinante es viable y demostró un fenotipo altamente atenuado en ratones recién nacidos, aún indujo inmunidad protectora contra la infección de VEEV. Además, las vacunas inactivadas con formalina son caras e ineficientes. Además de esto, estas vacunas también requieren vacunaciones múltiples, repetidas. Más aún, sólo la vacuna viva atenuada disponible contra la infección de VEEV es muy reactogénica e infecta los mosquitos durante la alimentación con sangre en los caballos vacunados. El álfavirus atenuado discutido en este documento proporciona una ventaja significativa sobre las vacunas que están actualmente disponibles desde que el fenotipo atenuado sea irreversible. Además, los álfavirus genéticamente diseñados no son capaces de replicarse en células de mosquito, de ese modo, la sugerencia de una nueva aproximación para generar nuevos recombinantes de virus vivo, que no sean capaces de replicarse en mosquitos y de ese modo, incapaces de circular en la naturaleza.
El desarrollo de clones de ADNc infecciosos de Sindbis y otros álfavirus (12, 25, 36) abre al público la oportunidad no sólo para los experimentos de genética inversa dirigidos a estudiar aspectos diferentes de la biología y la patogénesis del virus, sino también al desarrollo de nuevas vacunas recombinantes. La atenuación de los virus por el pase ya sea en el cultivo de tejido o en embriones de pollo (29) en general resulta de la acumulación de pequeños números de mutaciones puntuales en los genes estructurales y no estructurales, y en los elementos de actividad cis de los genomas virales. Por ejemplo, la cepa vacunal TC-83 VEEV cuenta con sólo 2 mutaciones puntuales para su atenuación, y el elevado grado de reactogenicidad (34) probablemente refleja la inestabilidad de este mecanismo de atenuación. Esto origina una preocupación sobre la posible reversión del fenotipo tipo salvaje patogénico durante la replicación viral en los individuos vacunados. El número de mutaciones puede ser además aumentado por mutagénesis química (28), pero este procedimiento también no hace irreversibles los cambios introducidos. Las manipulaciones genéticas con clones de ADNc infecciosos de los virus RNA+ abren grandes posibilidades para la modificación más fuerte de
los genomas virales, y proporciona una oportunidad para introducir, supresiones extensivas que le imposibilitarían la reversión a la secuencia del genoma tipo salvaje (5, 6, 10, 19), o el material genético adicional que podría mejorar la inmunogenicidad de las variantes.
También hay una gran preocupación de que los arbovirus genéticamente alterados podrían introducirse en la circulación natural, mediados por los vectores de mosquito, y muestren una evolución adicional durante la replicación a largo plazo, ya sea en mosquitos o durante el desarrollo de la viremia en huéspedes vertebrados. Un ejemplo es el uso de TC-83 VEEV, que es capaz de producir en equinos niveles de viremia suficientes para infectar los mosquitos. El aislamiento de TC-83 de mosquitos naturalmente infectados coleccionados en Louisiana (32) durante la epidemia de Texas en 1971 acentuó el riesgo de transmisión de los alfavirus atenuados. Por consiguiente, en el diseño de una nueva generación de cepas vacunales vivas, es prudente hacer los arbovirus no sólo altamente atenuados, sino también capaces de replicarse sólo en células de origen vertebrado. Esto puede ser logrado por la clonación de elementos ARN específicos de la célula dentro de los genomas virales. En contraste al IRES del virus de parálisis de cricket (20), el elemento específico a EMCV se esperó que funcionara muy ineficientemente en células de artrópodos.
En la presente invención, el IRES EMCV se clonó dentro del genoma de TC-83 VEEV para hacer la traducción de los genes estructurales virales dependientes de IRES. Uno de los genomas contenía un promotor subgenómico funcional, y el IRES en el 5'UTR del ARN subgenómico. Este virus fue viable, pero su habilidad para producir el ARN subgenómico promueve una evolución adicional, que resulta en la supresión y reversión de IRES, más probablemente a un estándar, de traducción de las proteínas estructurales dependientes a cap. Las últimas supresiones hicieron a este capaz de replicarse en las células de mosquito. La segunda variante con múltiples mutaciones en el promotor subgenómico fue estable en términos de su incapacidad para revertir a una traducción dependiente a cap. Debido a que tal reversión requeriría no sólo la supresión de IRES, sino también la restauración del promotor subgenómico, que nosotros inactivamos por 13 mutaciones, la reversión directa de estas mutaciones múltiples probablemente represente un riesgo insignificante. Sin embargo, esta variante desarrolla una vía interesante para involucrar con una mayor eficiencia el fenotipo de replicación por acumulación de mutaciones adaptativas adicionales en el gen de P2ns. Estas mutaciones no cambiaron marcadamente el nivel de replicación del AR viral, la síntesis de las proteínas estructurales vírales, o su compartímentación en las células. Las mutaciones detectadas también, no crearon una señal adicional que podría incrementar la eficiencia del empaquetamiento genómico. De ese modo, el mecanismo de su funcionamiento continúa
siendo determinado. Sin embargo, el atesoramiento de datos publicados sugiere que el empaquetamiento de los genomas de los virus RIMA* está fuertemente determinado por los complejos de replicación y los genomas necesitan ser presentados por las Psns a las proteínas estructurales para la formación de la partícula (22, 30). La hipótesis de trabajo de este documento es que el dominio de la helicasa de la P2ns podría estar involucrado en la presentación de los genomas virales para su empaquetamiento dentro de las nucleocápsidas, y de ese modo, las mutaciones identificadas podrían tener un efecto positivo en la eficiencia de este proceso.
Debe ser notado que un objetivo de la presente invención fue desarrollar variantes VEEV que son incapaces de replicarse en vectores de artrópodos y demostrar un fenotipo estable más atenuado. El crecimiento más lento de la variante IRES/mutSGA/EEV/1 diseñada tanto en células BHK-21 competentes para IFN-alfa/beta como en deficientes para la señal de IFN, su habilidad a inducir niveles superiores de IFN-alfa/beta en el cultivo de tejido, su habilidad grandemente reducida para matar a los ratones recién nacidos aún después de la inoculación Le, y su incapacidad para replicarse en células de mosquito sugiere que esta variante podría reunir esos requisitos. Su inmunogenicidad será además investigada en modelos animales diferentes. Además, se cree que otro alfavirus encefalogénico pueda ser atenuado mediante el uso de una estrategia similar, basada en IRES EMCV, que puede ser aplicada en combinación con otras aproximaciones que se han desarrollado dentro de los años recientes (1 , 13-15, 31 ).
En resumen, el propósito de la presente invención es el desarrollo de un alfavirus atenuado y su aplicación como un nuevo tipo de vacuna contra el alfavirus encefalitogénico que incluye VEEV, EEEV y WEEV y otros alfavirus tales como virus Chikungunya que causa enfermedad en los humanos y el ganado. La replicación de tales alfavirus dependería de IRES EMCV, que los hacen incapaces de replicarse en las células de mosquito o los vectores de mosquito. Con mayor importancia, este fenotipo es irreversible debido a las modificaciones extensivas introducidas en el genoma viral. Por consiguiente, estas nuevas variantes pueden usarse para la vacunación sin preocupación sobre la posibilidad de su trasmisión por los vectores naturales de mosquito.
La presente invención se dirige a la generación de un alfavirus atenuado recombinante que comprende las etapas de: clonación del sitio interno de entrada al ribosoma del virus de encefalomielocarditis (IRES EMCV) entre la secuencia que codifica el terminal de la proteína no estructural (P4ns) y el inicio AUG de una secuencia que codifica el ARN subgenómico de un alfavirus en lugar del 5' UTR natural. Este método además puede
comprender la inactivación del promotor subgenómico del alfavirus por mutaciones puntuales agrupadas y la supresión del 5' UTR natural en el ARN subgenómico. Además, la inactivación del promotor subgenómico no puede modificar el terminal carboxi de la proteína no estructural 4. Adicionalmente, el método puede comprender además la introdMcción de mutaciones adaptativas en la proteína no estructural 2 (P2ns) efectivas para incrementar la replicación viral, la liberación y los títulos del virus. Los ejemplos de las mutaciones adaptativas en la proteína no estructural 2 pueden incluir, pero no son limitativos a Y370?C, K371?Q, P3 9- T, D418?A, ?^-»! o las combinaciones de estos. Además, los ejemplos del alfavirus pueden incluir pero no se limitan al virus de Encefalitis Equina Venezolana (VEEV), Virus de Encefalitis Equina Oriental (EEEV), virus de Encefalitis Equina Occidental (WEEV) o virus Chikungunya.
La presente invención también se dirige a un alfavirus atenuado recombinante generado por el método discutido arriba. Tal alfavirus puede ser capaz de replicarse en mosquitos, incapaz de trasmitirse por vectores de mosquitos, capaz de inducir elevados niveles de IFN alfa/beta, de crecimiento lento en células IFN alfa/beta, de crecimiento lento en células BHK-21 de señal IFN deficiente o una combinación de estos.
La presente invención además, aún se dirige a un vector que comprende una secuencia de nucleótido que codifica el alfavirus atenuado recombinante discutido arriba y una célula huésped que comprende y expresa el vector. Los vectores de construcción y su expresión en células es un procedimiento conocido y estandarizado en la técnica. Por tanto, una persona con conocimiento en la técnica puede construir tales vectores basados en la experiencia de rutina y el conocimiento que está disponible en la técnica.
La presente invención además se dirige a una composición farmacéutica que comprende el alfavirus atenuado recombinante discutido arriba y un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención se dirige también a una composición inmunogénica que comprende el alfavirus recombinante atenuado de este documento.
La presente invención además, aún se dirige a un método de protección a un sujeto de las infecciones que resultan de la exposición a un alfavirus, que comprende la etapa de: administrar la cantidad inmunológicamente efectiva de la composición inmunogénica discutida arriba, por tanto la protección del sujeto de las infecciones que resultan de la exposición a los alfavirus. El sujeto que se beneficia de tal método puede ser el humano o el ganado.
La presente invención aún además se dirige a un método de generación del alfavirus recombinante atenuado incapaz de infectar los mosquitos, que comprende la .etapa de clonar los genes del sitio interno de entrada al ribosoma del virus de encefalomielocarditis y
de la cápsida en la dirección 3' de los genes de la glicoproteína de envoltura con dicho gen de la cápsida en el terminal 3' de la región subgenómica apenas en la dirección 5' del 3' UTR, donde la cápsida se expresa en una forma independiente a cap y los genes de la proteina de envoltura se traducen en una forma dependiente a cap pero la proteína de la cápsida se traduce en una forma dependiente a IRES.
Como se usa en este documento, el término, "un" o "una" puede significar uno o más. Como se usa en este documento en la reivindicación(es), cuando se usa en conjunto con la palabra "que comprende", las palabras "un" o "una" pueden significar uno o más de uno. Como se usa en este documento, "otro" u "otros" puede significar al menos un segundo o más elemento de reivindicación idéntica o diferente o componentes de esta.
La composición que se describe en este documento puede administrarse independientemente, ya sea sistémica o localmente, por cualquier método estándar en la técnica, por ejemplo, subcutáneo, intravenoso, parenteral, intraperitoneal, intradérmico, intramuscular, tópico o nasal. Las formulaciones de dosis de la composición que se describen en este documento pueden comprender portadores no-tóxicos convencionales, fisiológicamente o farmacéuticamente aceptables o vehículos adecuados para el método de administración y que se conocen por un individuo que tiene conocimiento ordinario en esta técnica.
La composición que se describe en este documento puede administrarse independientemente una o más veces para lograr, mantener o mejorar un efecto terapéutico. Es adecuado dentro del conocimiento ordinario de un técnico determinar la dosis o si una dosis apropiada de la composición comprende una dosis simple de administración o dosis múltiples de administración. Una dosis adecuada depende de la salud del sujeto, la inducción de la respuesta inmune y/o prevención de la infección causada por el alfavirus, la vía de administración y la formulación usada
Los siguientes ejemplos se dan con el propósito de ilustrar diversas modalidades de la invención y no significa que limiten la presente invención de ninguna manera. Una persona con conocimiento ordinario en la técnica apreciará con facilidad que la presente invención se adapta bien para realizar los objetivos y obtener los fines y ventajas mencionadas, así como aquellos objetivos, fines y ventajas inherentes a este documento. Cambios en este sentido y otros usos los cuales son abarcados dentro del espíritu de la invención según se definen por el alcance de las reivindicaciones ocurrirán por aquellas personas con conocimiento ordinario en la técnica.
EJEMPLO 1
Cultivo de células
Las células BHK-21 se proporcionaron por Paul Olivo (Universidad de Washington, San Louis, Mo), y las células Vero por Charles Rice (Universidad Rockefeller, NY, NY). Las células NIH 3T3 se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivo de Tejido (Manassas, VA). Estas líneas celulares se mantuvieron a 37°C medio mínimo esencial alfa (aMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y vitaminas. Las células de mosquito C710 se obtuvieron de Henry Huang (Universidad de Washington Univ., San. Louis, MO) y se propagaron en DMEM suplementado con 10% de FBS inactivado por calor y 10% de caldo triptosa fosfato (TPB).
EJEMPLO 2
Constructos de plásmido
Los procedimientos estándares de ADN recombinante se usaron para todas las construcciones de plásmidos. Los mapas y secuencias están disponibles por los autores cuando se solicite. El plásmido original con el genoma de TC-83 VEEV bajo el control del promotor de la ARN polimerasa SP6, TC-83 VEEVp, se describió en otra parte (33). El IRES/VEEVp contenía el IRES EMCV con los primeros 4 codones de la poliproteína de EMCV. Esta secuencia se clonó en la secuencia que codifica el ARN subgenómico de VEEV entre el terminal de 5'UTR y el inicio AUG. El IRES /mutSG/ VEEVp se codificó del genoma de TC-83 VEEV, en el que el promotor subgenómico se inactivo por modificaciones puntuales agrupadas que no modificaron la secuencia de aminoácidos del carboxi terminal de la P4ns (Figuras 1A y 1 B). Este genoma viral tuvo suprimido el 5'UTR del ARN subgenómico. De ese modo, las proteínas no estructurales y estructurales de TC-83 VEEV sé esperaron fueran sintetizadas del mismo ARN genómico. Las mutaciones adaptativas se introdujeron dentro de P2ns codificada por IRES/mutSG/VEEVp por amplificación en PCR de los fragmentos de interés de las variantes seleccionadas, después de la sustitución en el genoma original del fragmento que corresponde. El mismo procedimiento basado en PCR se usó para la clonación por síntesis de diferentes fragmentos en el sitio Sphl del 3'UTR del genoma IRES /mutSG/ VEEV. Todos los fragmentos clonados se secuenciaron después de experimentos adicionales con los virus rescatados.
EJEMPLO 3
Transcripciones del ARN
Los plásmidos se purificaron por centrifugación en gradientes de CsCI y se alinearon por digestión con Mlul. Los ARN se sintetizaron por la ARN polimerasa SP6 (Ambion) en la presencia del análogo de cap (New Engly Biolabs). Los rendimientos e integridad de los transcriptos se analizaron por electroforesis en gel bajo condiciones no desnaturalizantes. La concentración de ARN se midió en un sistema de imágenes FluorChem (Alpha Innotech), y las reacciones de transcripción se usaron durante la electroporación sin purificación adicional.
EJEMPLO 4
Transfecciones del ARN
La electroporación de las células BHK-21 se realizó bajo las condiciones previamente descritas (27). Para rescatar los virus, 1 mg del ARN genómico viral sintetizado in vitro se electroporó en las células (27), y después, estas se sembraron en placas de 100 mm y se incubaron hasta observarse los efectos citopáticos. Los títulos de los virus se determinaron usando una prueba de placa estándar en las células BHK-21 (26).
Para evaluar la infectividad del ARN, diluciones de 10 veces las células BHK-21 electroporadas se sembraron en placas Costar de 6 cavidades que contenían células nativas subconfluentes. Después de 1 h de incubación a 37°C en una incubadora con 5% de C02, las células se cubrieron con 2 mi de 0.5% de agarosa Ultra-pura que contiene MEM suplementado con 3% de FBS. Las placas se tiñeron con violeta cristal después de 2 días de incubación a 37°C, y la infectividad se determinó en unidades formadoras de placas (UFP) por mg de ARN transfectado.
EJEMPLO 5
Secuenciación de los genomas virales
Las placas grandes se seleccionaron al azar durante la titulación de los virus depositados (sin teñir con rojo neutral). Los virus se extrajeron de tapones de agarosa en MEM, y alícuotas de los medios recientes se usaron para infectar las células BHK-21 en placas de 35 mm. Después del desarrollo de ECP profundo, los virus depositados se centrifugaron para la caracterización adicional, y los ARN se aislaron de las células infectadas por el reactivo Trizol de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Los fragmentos
superpuestos de longitud ~1000 nt, se sintetizaron usando los procedimientos de PCR-RT estándares, se purificaron por electroforesis en gel de agarosa y se secuenciaron. La secuenciación del 5'UTR se realizó mediante el uso de un kit FirstChoice RLM-RACE (Ambion) como se describió en otra parte (16).
EJEMPLO 6
Análisis de la replicación viral
Una quinta parte de las células electroporadas se sembraron en platos de 35 mm. En los tiempos indicados en las figuras, los medios se sustituyeron y los títulos de virus se determinaron por la prueba de placa en las células BHK-21 (26). Alternativamente, las células BHK-21 , NIH3T3 o C710 se sembraron en placas de 35 mm y se infectaron a las MOI indicadas en las figuras. Los medios se sustituyeron por medios frescos, y los títulos de virus se determinaron en las muestras centrifugadas por la prueba de placa en las células BHK-21.
EJEMPLO 7
Análisis de la síntesis de proteína
Las células BHK-21 se electroporaron con 4 mg de los ARN indicados, y una quinta parte de las células electroporadas se sembraron en las placas Costar de 6 cavidades. A las 12 h post transfección, las proteínas se marcaron metabólicamente por la incubación durante 30 min en 0.8 mi de medio DMEM carente de metionina, suplementado con 0.1 % de FBS y 20 pCi/ml de [35S]metionina. Después de la incubación, estas se removieron en los medios, se sedimentaron por centrifugación y se disolvieron en 100 µ? de tampón estándar para carga de proteína. Cantidades idénticas de proteínas se cargaron en geles de poliacrilamida al 10% con dodecil sulfato de sodio. Después de la electroforesis, los geles se secaron y autoradiografiaron.
EJEMPLO 8
Análisis de ARN
Para analizar la síntesis de RNA específicos de virus, las células fueron electroporadas con 4 mg de los ARN virales sintetizados in vitro, y una quinta parte de las células se sembraron en placas de 35 mm. A las 4.5 h post transfección, el medio se sustituyó en las cavidades por 1 mi de MEMa suplementado con 10% de FBS, ActD (1 pg/ml) y [3H]uridina (20 pCi/ml). Después de 4 h de incubación a 37°C, los ARN celulares totales se aislaron por Trizol (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante, después se
desnaturalizaron con glioxal en dimetil sulfóxido y se analizaron por electroforesis en gel de agarosa usando las condiciones descritas anteriormente (7). Los geles se impregnaron con 2,5-difeniloxazol (PPO), se secaron y autoradiografiaron.
EJEMPLO 9
Prueba de IFN-alfa/beta
Las concentraciones de IFN-alfa/beta en los medios se midieron mediante una prueba biológica descrita anteriormente (41). Brevemente, las células L929 se sembraron en 100 µ? de medios completos a una concentración de 5x104 células/cavidad en placas de 96 cavidades y se incubaron a 37°C durante 6 h. Las muestras de los medios centrifugados a partir de células NIH 3T3 infectadas se trataron con luz UV durante 1 h, y se diluyeron en serie de etapas duplicadas, directo en las cavidades con células L929. Después de la incubación durante 24 h a 37°C, unos 100 µ? adicionales de medios con 2x105 UFP del virus de estomatitis vesicular (VSV) se adicionó a las cavidades y continuaron incubados durante 36-40 h. Después las células se tiñeron con cristal violeta y el punto final se determinó como la concentración de IFNa/ß requerida para proteger el 50% de las células del ECP inducido por VSV. El estándar de IFNa/ß para la normalización de los resultados se adquirió de la ATCC, y los títulos de los virus liberados se determinaron por la prueba de placa en las células BHK-21.
EJEMPLO 10
Evaluación de la replicación viral en mosquitos
Para evaluar ¡n vivo, la competencia de la replicación en los mosquitos, se usaron inoculaciones intratorácicas en mosquitos Aedes aegypti (una colonia que es original de Galveston, Texas) usando una ca. de 105 UFP en un 1 µ? de volumen. La inoculación intratoráxica se seleccionó por encima de la exposición oral debido a que al menos algún mosquito culícido es altamente susceptible a la infección intratoráxica por algún alfavirus, mientras que la susceptibilidad oral es altamente variable y mucho menos sensible (42). Después de la inoculación usando pipeta de vidrio, los mosquitos se incubaron 10 días a 27°C y después se titularon individualmente en 1 mi de MEM suplementado con 20% de FBS y Fungizona. 100 µ? de volumen de cada mosquito titulado se adicionó a una monocapa de célula Vero en una placa de 24 cavidades y se observó durante 5 días para detectar la infección por aparición de los efectos citopáticos. Las pruebas controles incluyeron tanto el virus parental TC-83 como el mutante IRES.
EJEMPLO 11
Inmunización y reto con el VEEV virulento
Los ratones Swiss NIH de seis días de edad se inocularon intracerebralmente (i.c.) con la cepa TC-83 VEEV o los mutantes diseñados a una dosis de ca. de 106 UFP en un volumen total de 20 µ? de PBS. Después de la infección, cada cohorte de 8-10 animales se mantuvo durante 2 meses sin cualquier manipulación. Durante 21 días, los ratones se observaron diariamente para los signos de enfermedad (pelaje erizado, depresión, anorexia y/o parálisis) y/o muerte.
Los ratones hembras Swiss NIH de ocho semanas de edad se vacunaron s.c. a una dosis de ca. 106 UFP/ratón usando TC-83 VEEV o el virus recombinante, después se retaron por vía subcutánea 4 semanas más tarde con la ca. de 104 UFP de la cepa altamente virulenta 3908 VEEV. Durante 21 días, los ratones se observaron dos veces al día para los signos de enfermedad (pelaje erizado, depresión, anorexia y/o parálisis) y/o muerte.
EJEMPLO 12
Virus basados en el TC-83 VEEV recombinante
Una razón fundamental de este estudio fue desarrollar el alfavirus capaz de replicarse con eficiencia en las células de vertebrados, pero no originarias de mosquito. Por consiguiente, la replicación de tales virus tenía que depender de las secuencias de proteínas o ARN que funciona sólo en vertebrados, pero no en células de insecto. Para lograr esto, la presente invención diseñó un método para hacer dependiente del IRES EMCV, la expresión de las proteínas estructurales de alfavirus. Los IRES diseñados no contenían la secuencia de poli(C) pero retenían a los primeros 4 codones de la poliproteína de EMCV para lograr la traducción con mayor eficiencia de los genes estructurales de TC-83 VEEV. En experimentos posteriores, fue confirmado que estos aminoácidos adicionales no tuvieron efecto negativo en la replicación viral, pero si un efecto positivo detectable en la traducción de las proteínas estructurales virales (datos no mostrados).
En uno de los constructos, IRES/VEEV, la secuencia de IRES se clonó dentro del ARN subgenómico en la dirección 3' del 5'UTR intacto (Figura 1A). Por consiguiente, se esperó que este genoma sería capaz de sintetizar el ARN subgenómico. En otro recombinante, IRES/mutSG/VEEV, el promotor subgenómico se inactivo por 13 mutaciones sinónimas puntuales (Figuras 1A y 1 B), que se esperaron previnieran la reversión para un promotor de ARN SG. Para promover la síntesis de las proteínas estructurales de VEEV, la secuencia IRES se clonó para sustituir la 5'UTR de 26S.
Los ARN genómicos de IRES/VEEV, IRES/mutSG/VEEV y no modificados, TC-83 VEEV tipo salvaje se sintetizaron in vitro y se transfectaron dentro de las células BHK-21. En la prueba central de infección, el ARN de IRES/VEEV demostró infectividad idéntica que la del ARN de TC-83, y desarrolló placas de un tamaño uniforme similar a aquellas de la TC-83 (Figuras 1A y 1C). Esto fue una indicación fuerte de que mutaciones adaptativas adicionales no se requerían para la replicación productiva del virus diseñado. El IRESA/EEV se replicó para títulos que excedeYi 109 UFP/ml, pero estos títulos finales y la tasa de replicación viral fueron significativamente menores (Figura 1 D) que aquellos de TC-83 VEEV. Las células BHK-21 transfectadas con otro genoma viral recombinante, el IRES/mutSG/VEEV, que carece del promotor subgenómico, produjeron muy ineficientemente el virus infeccioso (Figura 1 D). En la prueba central de infección, este constructo desarrolló principalmente placas de precisión, y se dificultó la estimación de su número. Sorprendentemente, este virus demostró una evolución adicional en el pase seriado y rápidamente desarrolló las variantes que produjeron las placas grandes (Figura 1C y datos no mostrados). La curva.de crecimiento presentada en la Figura 1 D representa la liberación de ambos virus formadores de placas pequeños y grandes.
De ese modo, los resultados de estos experimentos indicaron que, al menos en el contexto del genoma IRES/VEEV, el IRES del EMCV podría producir las proteínas estructurales a niveles suficientes para la replicación de VEEV. El constructo con el promotor subgenómico mutado, IRES/mutSG/VEEV, produce una replicación defectuosa del virus que podría evolucionar a una replicación con mayor eficiencia.
EJEMPLO 13
Análisis de las mutaciones adaptativas en IRES/mutSG/VEEV
La evolución de IRES/mutSG/VEEV para un fenotipo de placa grande sugirió una acumulación de mutaciones adicionales en el genoma viral. La reversión para la secuencia genómica de tipo salvaje fue un evento imposible debido al gran número de mutaciones puntuales introducidas, así se dificultó predecir la localización de las mutaciones adaptativas. Para identificar las mutaciones, 5 placas de muestras de IRES/mutSG/VEEV se centrifugaron a las 24 h post electroporación donde se seleccionaron aleatoriamente, y los genomas íntegros (que incluyen los 3' y 5'UTR) de variantes purificadas de dos placas se secuenciaron. La lista de las mutaciones identificadas se presenta en la Figura 2A. La mayor parte de estas fueron sinónimos y no presentaron conocidos en los elementos ARN que activan cis. De ese modo, su efecto sobre la replicación viral fue muy indeseado. Sin embargo,
los genomas de ambos aislados de placa contenían la misma mutación en la proteína P2ns, Y37o?C, y uno de los genomas tuvo cambiado el aa siguiente también (K371?Q).
Para probar el efecto de las mutaciones sobre la replicación viral, Y370?C y ambos Y37o- C y K37i- Q se clonaron dentro del constructo IRES/mutSG/VEEV original (Figura 2B) y se comparó la infectividad del ARN, la tasa de replicación viral y los tamaños de placa con aquellos del IRES/mutSG/VEEV original y otros constructós. Las mutaciones idénticas se clonaron también dentro del genoma de TC-83 VEEV para probar su efecto sobre la replicación de este virus paternal. Los ARN genómicos que codifican para IRES ya sea con una o las dos mutaciones en el genoma IRES/mutSG/VEEV/1 y IRES/mutSG/VEEV/2, demostraron infectividad idéntica en la prueba central de infección como para el ARN de TC-83 VEEV y los virus rescatados formaron placa uniforme de tamaños similares a aquellos de los TC-83 VEEV (datos no mostrados). Ellos también demostraron un fuerte incremento en las tasas de crecimiento (Figuras 2C y 1 D), pero el efecto de la segunda mutación fue apenas detectada. De ese modo, en su conjunto, los datos indican que la mutación Y370?C en la P2ns tuvo un fuerte efecto positivo en la replicación viral y la segunda mutación no la mejoró notablemente. Cuando se introdujo dentro del genoma TC-83 VEEV, las mutaciones idénticas no tuvieron ningún efecto detectable en las tasas de la replicación viral o sobre los títulos finales (Figura 2C), lo que sugiere que el realce de la replicación fue específico a la variante IRES/mutSG/VEEV.
Los cambios identificados en los aa (Y370?C y K37?Q) podrían representar sólo una fracción de las posibles mutaciones que conducen a la replicación eficiente del virus que contiene el IRES deficiente de promotor subgenómico. Por consiguiente, en experimentos paralelos, los nt 2161-2959 aislados de las muestras en otros tres clones de placa se secuenciaron, centrifugaron a las 24 h post transfección del ARN de los ARN sintetizados in vitro, y las variantes purificadas de 5 placas se aislaron del virus depositado después de 3 pases adicionales en las células Vero. Se anticipó que tal pase podría conducir a la selección de virus que se replica con máxima eficiencia. La lista de las mutaciones identificadas se representa en la Figura 3A. La secuenciación se realizó directamente de los fragmentos de ADN derivados del PCR-RT, por consiguiente, las mutaciones presentadas representan las secuencias consensos de la población viral que se derivó en la placa y nó del PCR (Figura 3B).
El total de los aislados contenían mutaciones en el fragmento secuenciado, que corresponden al fragmento carboxi terminal del dominio ARN helicasa de la P2ns, y el total de
los aminoácidos alterados se localizaron entre los aminoácidos 348-424. Además, la mutación más común, tanto en el virus original del depósito, generado después de la electroporación, como en la mezcla de pases, fue la Y370?C. Éste fue un indicio de que probablemente se tenga uno de los efectos más prominentes en la replicacion; por consiguiente, la variante anteriormente descrita con esta mutación particular, IRES/mutSGA/EEV/1 , fue usada en los experimentos esbozados en las secciones siguientes.
EJEMPLO 14
Efecto de la mutación Yg7n-»C de P2ns en la replicacion viral
La identificación de la mutación adaptativa en el fragmento carboxi terminal de la ARN helicasa asociada a la P2ns fue sorprendente y no sugirió ninguna explicación obvia para el incremento en la replicacion de IRES/mutSG/VEEV. Esta mutación podría tener posiblemente un efecto estimulante ya sea en la replicacion del ARN, o la traducción de las proteínas estructurales, o en la formación de la partícula viral, o en la compartimentación de los complejos de replicacion, entre otros. Sin embargo, el efecto máximo esperado fue el incremento en la síntesis viral. Por consiguiente, las células BHK-21 se transfectaron con genomas de diferentes variantes de VEEV sintetizados in vitro, los nuevos ARN virales sintetizados se marcaron metabólicamente con [3H]uridina en presencia de ActD durante 4 h comenzando 4.5 h post electroporación, y el ARN se analizó por electroforesis en geles de agarosa (Figura 4A).
Como era esperado, el IRES/VEEV fue capaz de sintetizar el ARN subgenómico, lo que indicó que el IRES introducido en el extremo 3' del ARN subgenómico 5'UTR no interfirió con la actividad promotora subgenómica. El. IRES/mutSG/VEEV y sus variantes con mutaciones adaptativas en la P2ns no produjeron ARN SG detectables. De ese modo, las 13 mutaciones introducidas dentro de la secuencia promotora de estos genomas suprimieron completamente la transcripción del ARN subgenómico. Sorprendentemente, las mutaciones adaptativas en la P2ns no tuvieron un efecto notable en la replicacion del genoma de ARN, y los ARN genómicos IRES/mutSG/VEEV/1 y IRES/mutSG/VEEV/2 se replicaron tan eficientemente como lo hizo el genoma IRES/mutSG/VEEV originalmente diseñado. Además, el ARN genómico para la replicacion de todas las variantes fue muy similar al del TC-83 VEEV. Tampoco se detectó ningún efecto de estas mutaciones en el contexto del ARN original de TC-83 VEEV (véase los carriles que se corresponden a VEEV/1 y VEEV/2). Este hallazgo sugirió fuertemente que la adaptación no resultó en un incremento de la replicacion de ARN.
La síntesis de las proteínas estructurales se evaluó a las 12h post-electroporación (Figura 4B). Para entonces, la cápsida específica de IRES/VEEV y IRES/mutSG/VEEV y probablemente otras proteínas estructurales se sintetizaron ~2-veces menos eficiente que en las células transfectadas con el ARN de TC-83 VEEV. Esta diferencia razonablemente pequeña no explica los títulos infecciosos con más de 4 y 7 órdenes de magnitud inferiores de los virus IRES/VEEV y IRES/mutSGA/EEV, respectivamente (comparado a los títulos de TC-83 VEEV), detectados en muestras centrifugadas a las 12 h post transfección. Además, no se detectó ninguna diferencia entre la síntesis de las proteínas virales en las células BHK-21 que contienen los genomas origínales IRES/mutSG/VEEV contra IRES/mutSG/VEEV/1 y IRES/mutSG/VEEV/2 con las mutaciones adaptativas en la P2ns en este y otros experimentos. La característica distintiva de los patrones de las proteínas marcadas en las células infectadas con los virus que contienen IRES fue en la presencia de dos bandas adicionales, que se identificaron por espectrometría de masas como proteínas de choque térmico Hsp90 y Hsp72. El significado biológico de su inducción no está claro todavía, pero podría resultar.de algunas anormalidades en el plegamiento de la proteína(s) estructural viral que conduce al desarrollo de estrés en las células con las proteínas estructurales expresadas a partir del IRES.
En experimentos adicionales se evaluaron, la distribución intracelular de las glicoproteínas virales en las células infectadas con TC-83 VEEV, IRES/mutSG/VEEV y IRES/mutSG/VEEV/1 y la presencia de estas proteínas sobre la superficie celular se analizó por tinción con los anticuerpos específicos a VEEV. Ninguna diferencia notable se identificó en la distribución de las glicoproteínas. Se examinó la posibilidad de qué las mutaciones adaptativas causaran la formación de una señal adicional de empaquetamiento en el genoma viral, el fragmento que contenía la mutación (que se corresponde con los nt 2533-2950 del genoma VEEV) se clonó dentro del 3'UTR del genoma IRES/mutSG/VEEV, y el recombinante en el ARN sintetizado in vitro se probó en la prueba de centro infeccioso. No se detectó ningún incremento en el tamaño de placa o títulos virales, comparado con aquellos del IRES/mutSGA/EEV original.
En otra variante, un promotor subgenómico y una secuencia que codifica la cápsida de VEEV se clonó dentro de 3'UTR del genoma IRES/mutSGA/EEV para probar si la expresión adicional de la cápsida del ARN subgenómico podría incrementar la eficiencia de la replicación viral. Esta modificación tampoco tuvo algún efecto positivo sobre los títulos virales. Por último, se analizó si IRES/mutSGA/EEV produjo partículas subvirales libres de genoma en lugar de virus infeccioso. Se observó que este no fue el caso: las células transfectadas con el
ARN IRES/mutSG/VEEV y metabólicamente marcadas con [ Sjmetionina no produjeron partículas subvirales que podrían detectarse por gradientes de ultracentrifugación en sacarosa (datos no mostrados). De ese modo, en su conjunto, el análisis complejo descrito anteriormente no apuntó hacia explicaciones mecanicistas obvias para la muy ineficiente replicación del IRES/mutSG/VEEV original o para el efecto positivo de las mutaciones detectadas en P2ns sobre la replicación del virus que contiene IRES. Sin embargo, el principal objetivo de la presente invención fue el desarrollo de las variantes VEEV, cuya replicación depende de la función de IRES EMCV y ambos, IRES/VEEV y IRES/mutSG/VEEV/1 parecían cumplir este objetivo.
EJEMPLO 15
Replicación de las variantes VEEV dependientes a IRES en las células de mosquito y mosquitos
Los datos acumulados sobre la replicación de alfavirus demuestran con claridad su inestabilidad genética y la alta tasa de evolución, que resulta en la supresión de algunos genes hetórologos (17, 40), en particular si ellos tienen un efecto negativo en la replicación viral. Por consiguiente, una de las cuestiones críticas de la presente invención era si las inserciones diseñadas de IRES EMCV serían estables y harían los virus incapaces de replicarse en las células de mosquito. Para probar esto, las células de mosquito C710 se infectaron con los virus IRES/VEEV y IRES/mutSG/VEEV centrifugados a las 24 h post-electroporación de los ARN sintetizados in vitro dentro de las células BHK-21. El IRES/mutSG/VEEV se usó en lugar del IRES/mutSG/VEEV/1 descrito anteriormente, con una mutación adaptativa Y37o?C en la P2ns, para probar la biblioteca completa de variantes liberadas después de la transfección del ARN, por la habilidad para establecer la replicación en las células de mosquito.
En el primer pase, a las 48 h post infección de las células C710 el título de
IRES/VEEV se aproximó a 1.5x1010 UFP/ml, y un título igual se detectó en el depósito, centrifugado después del segundo pase (Figuras 5A y 5B). Los títulos de IRES/mutSG/VEEV, en contraste, fueron de 150 UFP/ml después del primer pase (probablemente esto reflejó el virus residual usado para la infección en vez del virus naciente producido en las células de mosquito), y por debajo del límite de detección después del pase siguiente al segundo (Figuras 5A y 5B). En los experimentos adicionales, las variantes de IRES/mutSG/VEEV purificadas en placas que contenían mutaciones adaptativas en la P2ns se pasaron en las células C710. Ningún virus infeccioso se recobró nunca después de dos pases a ciegas.
En otro experimento, los mosquitos Ae. aegypti fueron intratoráxicamente inoculados con ca. 105 UFP de TC-83 VEEV y la variante IRES/mutSG/VEEV/1. Ninguno de los 17 mosquitos inoculados con el mutante IRES replicó a niveles detectable en Ae. aegypti, mientras que 17/17 mosquitos inoculados con la cepa parental TC-83 replicaron a niveles detectables en la prueba de ECP, con un título promedio de más de 106 UFP/mosquito. De ese modo, la variante VEEV que contiene a IRES, IRES/mutSG/VEEV/1 , fue incapaz de replicarse en células de mosquito tanto invitro como in vivo.
Para explicar los altos títulos de IRES/VEEV (capaz de producir la variante subgenomica de ARN) después del pase en células de mosquito, dos placas individuales se seleccionaron aleatoriamente y se secuenciaron los fragmentos de genoma que contenían IRES. En ambos aislamientos, la secuencia de IRES no fue mayor que la presente en los genomas virales, y solamente se encontraron 13 y 15 nucleótidos residuales del IRES original (Figura 5C). De ese modo, el pase de la variante IRES/VEEV en células de mosquito condujo a una acumulación de variantes negativas a IRES, y IRES/mutSG/VEEV (que carece del promotor subgenómico) no desarrolló los mutantes capaces de replicarse eficientemente en células de mosquito.
EJEMPLO 16
Variante IRES/mutSG/VEEV/1 demuestra un fenotipo atenuado
La presente invención se dirigió al desarrollo de las variantes VEEV incapaces de replicarse en células de origen mosquito (y, respectivamente, en los vectores de mosquito) pero que demuestran en vertebrados, un fenotipo más atenuado que el parental TC-83 VEEV. Las tasas de replicación más lentas de la variante IRES/mutSG/VEEV/1 promovieron una preocupación de que este virus podría ser incapaz de replicarse en células de vertebrados con la producción y señalización de IFN-a/b intacta. Sin embargo, este no fue el caso. Los resultados de los experimentos, presentados en la Figura 6, demuestran que el IRES/mutSG/VEEV/1 replicó en las células NIH 3T3, que no presentan defectos en la secreción y señalización de IFN-alfa/beta, con títulos por encima de 109 UFP/ml. Esta replicación causó una inducción más eficiente de IFN-a/b (Figura 6), pero en apariencia la liberación de IFN no anula la replicación viral ya establecida. Como se muestra en las células BHK-21 (Figura 2C), la replicación de IRES/mutSG/VEEV/1 fue menos eficiente que la de TC-83 VEEV, lo que sugiere que el mutante dependiente de IRES podría atenuarse in vivo. En efecto, después de la inoculación i.c. de ratones de 6 días de edad con ca. 106 UFP. 86%
sobrevivieron a la infección y no desarrollaron signos de encefalitis; en contraste, el 92%de los ratones se murieron con la misma dosis de la cepa de VEEV, TC-83. En su conjunto, estos datos indican que el VEEV dependiente de IRES genéticamente modificado fue más atenuado que el parental TC-83 VEEV.
No obstante, la variante IRES/mutSG/VEEV/1 permanece inmunogénica tanto en ambos ratones recién nacidos como adultos. De los doce ratones con 6 días de edad que sobrevivieron a la inoculación i.c. con IRES/mutSG/VEEV/1 , 10 sobrevivieron al reto s.c. con 104 UFP de la cepa 3908 tipo salvaje de VEEV, administrada 5 semanas después, en contraste, los 12 ratones infectados con (PBS) falso retados de. la misma manera, ninguno sobrevivió (Figura 7). El IRES/mutSG/VEEV/1 fue también inmunogénico en ratones adultos; una inmunización s.c. con ca. 106 UFP protegió el 80% de los ratones contra el reto s.c. de la cepa 3908 VEEV, 3 semanas después con 104 UFP (~104 DL50) (Figura 8). Los títulos de anticuerpos neutralizantes (PRNT80) fueron indetectables <1 :20 en todos estos ratones inmediatamente antes del reto, lo que sugiere que la protección incompleta después de 1 vacunación probablemente fue un resultado del bajo nivel de replicación in vivo del virus que contiene IRES. De ese modo, su alto nivel de atenuación le confiere un alto grado de seguridad, pero probablemente vacunaciones repetidas serán requeridas.
EJEMPLO 17
Estrategia de expresión para disminuir la atenuación pero mantener la carencia de infectividad en el mosquito
En una modalidad independiente de la presente invención, una estrategia de expresión novedosa se diseñó para disminuir la atenuación pero manteniendo la carencia de infectividad en el mosquito. Esta estrategia involucra la ubicación de IRES en la dirección 3' de los genes de la glicoproteína de envoltura, con el gen de la cápsida en el terminal 3' de la región subgenomica justo dirección 5' del 3' UTR (Figura 9). De ese modo, se generó un mensaje subgenómico con los genes de la proteína de envoltura traducidos de una manera dependiente a cap pero con la proteína de la cápsida traducida de una manera dependiente a IRES. La replicación de este nuevo mutante IRES en las células BHK y Vero fue nuevamente eficiente, pero no podría detectarse en las células de mosquito C7/10. La inoculación intratoráxica de 20 mosquitos hembras adultos Aedes aegypti no rindió evidencia de la replicación. Cuando esta versión 2 de IRES se usó para vacunar los ratones, el total de 10 seroconvertidos con títulos promedios de aproximadamente 2 veces menor que el inducido por la TC-83 normal, y el total de 10 ratones se protegieron del reto subcutáneo letal con la versión 2 de IRES. Por
consiguiente, la nueva estrategia de expresión de IRES parece resultar en una menor atenuación mientras que retiene el fenotipo del mosquito incompetente.
Tabla I
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Algunas patentes o publicaciones mencionadas en esta especificación son indicativas de los niveles de aquellas personas con conocimiento en la técnica a la que la invención pertenece. Además, estas patentes y publicaciones se incorporaron como referencia a este documento en la misma extensión como si cada publicación individual fuera especifica e individualmente indicada para ser incorporada como referencia.
Claims (18)
1. Un método de generación de un alfavirus recombinante, atenuado, caracterizado porque comprende las etapas de: clonar el sitio interno de entrada al ribosoma del virus de encefalomiocarditis (IRES EMCV) entre el terminal de la secuencia que codifica la proteína 4 no estructural (nsP4) y el inicio AUG de una secuencia que codifica un ARN subgenómico de un alfavirus, en lugar del 5' UTR natural del ARN subgenómico.
2. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende: inactivar el promotor subgenómico del alfavirus mediante por mutaciones puntuales agrupadas y la supresión del 5' UTR natural en el ARN subgenómico.
3. El método de la reivindicación 2, caracterizado porque la inactivación del promotor subgenómico no modifica el terminal carboxilo de la proteína 4 no estructural.
4. El método de la reivindicación 2, caracterizado porque comprende: introducir mutaciones adaptativas en la proteína 2 no estructural (P2ns) efectivas para el incremento de la replicación viral, liberación y títulos de virus.
5. El método de la reivindicación 4, caracterizado porque las mutaciones adaptativas son Y370->C, K371?Q, P349?T, D418?A, K423?T o combinaciones de éstas.
6. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque el alfavirus es el virus de Chikungunya.
7. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque el alfavirus es el virus de la Encefalitis Equina Oriental:
8. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque el alfavirus es el virus de la Encefalitis Equina Venezolana.
9. El método de la reivindicación 1 , caracterizado porque el alfavirus es el virus de la Encefalitis Equina Occidental.
10. Un alfavirus recombinante atenuado generado por el método de la reivindicación 1.
11. El alfavirus recombinante atenuado de la reivindicación 10, caracterizado porque dicho alfavirus es incapaz de replicarse en mosquitos, incapaz de trasmitirse mediante vectores de mosquitos, capaz de inducir niveles altos de IFN alfa/beta, de crecimiento lento en células de IFN alfa/beta, de crecimiento lento en células BHK-21 deficientes en la señal de IFN o una combinación de éstas.
. 12. Un vector caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido que codifica el alfavirus atenuado recombinante de la reivindicación 10.
13. Una célula huésped caracterizada porque comprende y expresa el vector de la reivindicación 12.
14. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende: el alfavirus atenuado recombinante de la reivindicación 10 y un portador farmacéuticamente aceptable.
15. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende: el alfavirus atenuado recombinante de la reivindicación 10.
16. Un método de protección a un sujeto de las infecciones que resultan de la exposición a un alfavirus, caracterizado porque comprende la etapa de: administrar una cantidad inmunológicamente efectiva de la composición inmunogénica de la reivindicación 15, protegiendo de esta forma al sujeto de la exposición a las infecciones que resultan de la exposición al alfavirus.
17. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque el sujeto es un humano o un ganado.
18. Un método de generación de un alfavirus atenuado recombinante incapaz de infectar mosquitos, caracterizado porque comprende de la etapa de: clonar los genes del sitio interno de entrada al hbosoma del virus de encefalomieiocarditis y de la cápsida en la dirección 3' de los genes de la glicoproteína de envoltura con dicho gen de la cápsida en el extremo 3' de la región subgenómica justo en la dirección 5' del 3' UTR, donde la cápsida se expresa en una forma independiente a cap y los genes de la proteína de envoltura se traducen en una forma dependiente a cap pero la proteína de la cápsida se traduce en una forma dependiente a IRES.
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