MX2009013222A - Composicion adyuvante a base de la porina de omps2 de salmonella enterica serovar typhi. - Google Patents

Abstract

La presente invención es relativa al uso de la porina OmpS2 de Salmonella enterica serovar Typhi para preparar una composición adyuvante, así como para preparar una composición de vacuna que comprende a la porina OmpS2 más uno más antígenos de origen microbiano y/o cancerígeno.

Description

COMPOSICIÓN ADYUVANTE A BASE DE LA PORINA OMPS2 DE Salmonella entérica serovar Typhi CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona a la utilización de la porina OmpS2 de Salmonella entérica serovar Typhi para preparar una composición adyuvante útil para la producción de vacunas, así como una composición adyuvante que contienen a dicha porina, y una composición de vacuna que comprende a la porina OmpS2 más un antígeno de origen bacteriano o tumoral.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las vacunas son formulaciones capaces de inducir a que el hospedero monte una respuesta inmunológica con fines terapéuticos o profilácticos, el mecanismo mediante el cual son capaces de generar este tipo de respuestas es a través la activación del sistema inmunológico del hospedero mediante la administración de los antígenos de los agentes que causan la enfermedad. La mayoría de las vacunas exitosas utilizadas están constituidas por componentes antigénicos de un patógeno que son reconocidos por las células de la respuesta inmune adaptativa, además de moléculas denominadas Patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP por sus siglas en inglés) capaces de ser censados por los receptores de reconocimiento de patrón (PRR, por sus siglas en inglés) en las células de la respuesta inmune innata generando la activación de las mismas. Tales vacunas están basadas principalmente en formas atenuadas o muertas de los microbios, y pueden ser agentes terapéuticos profilácticos extremadamente potentes.

No obstante, la presencia de otros componentes presentes en la estructura del microorganismo no involucrados con el establecimiento de la respuesta inmune en vacunas atenuadas o muertas puede ocasionar efectos secundarios indeseable, disminuyendo la seguridad de la preparación vacunal lo que ha limitado el uso de vacunas a base de de microorganismos completos y ha estimulado esfuerzos considerables para refinar los componentes de la vacuna fomentando el desarrollo de las vacunas de subunidad, vacunas conjugadas y vacunas de ADN.

Las vacunas de subunidad están basadas en los antlgenos aislados de diferentes microorganismos o antígenos sintéticos creados utilizando técnicas químicas y/o recombinantes. Las vacunas conjugadas implican el acoplamiento de antígenos relativamente no inmunogénicos a proteínas acarreadoras más fuertemente inmunogénicas. Las vacunas de DNA liberan el antígeno en la forma de ácido nucleico codificante y así permiten, después de la administración, la expresión endógena del ADN codificante. Tales vacunas requieren normalmente un vector apropiado para liberar el ácido nucleico codificante a un compartimiento apropiado del hospedero.

Aunque las vacunas de subunidad, conjugadas o de ADN son por lo general bien toleradas con pocos efectos secundarios indeseables, generalmente carecen de los PAMPs que son requeridos para la activación de la respuesta innata. De esta forma, exhiben típicamente una menor potencia cuando se comparan con la mezcla antigénica presente en muchas de las vacunas que están compuestas de microorganismos completos. Otro punto importante es que la naturaleza de los antígenos sintéticos de bajo peso molecular, no permite el establecimiento de una buena respuesta inmunológica y por si mismos no son altamente inmunogénicos, lo cual aún cuando carecen de contaminantes potencialmente peligrosos no los hace una buena opción para la generación de nuevas vacunas.

Por lo tanto, un reto del diseño moderno de vacunas es desarrollar estrategias para inducir de forma eficiente la respuesta innata y la adaptativa para imitar una infección natural y para alcanzar respuestas potentes en contra délos antígenos definidos, con una toxicidad limitada. El gran esfuerzo se centra actualmente en los adyuvantes de la respuesta inmunológica, los cuales son esenciales para hacer nuevos tipos de vacunas viables, más eficaces, y seguras y con procesos de fabricación más baratos.

Un adyuvante es cualquier compuesto o composición que aumenta la fuerza y/o duración de una respuesta inmunológica en contra de antígeno. Las características funcionales clave de un adyuvante incluyen su habilidad para aumentar una respuesta inmunológica apropiada contra el antígeno blanco, seguridad a largo plazo en aplicación extensiva, y flexibilidad en uso con diferentes antígenos/enfermedades. A pesar de su amplio uso dentro de las preparaciones vacunales, los mecanismos de acción de la mayoría de los adyuvantes solo son parcialmente conocidos.

El único adyuvante actualmente con licencia para uso humano con cualquier antígeno es la alumina (sales de aluminio). Esta puede precipitar antígenos solubles en el área cercana al sitio de la inyección, en donde los macrófagos y las células dendríticas lo pueden procesar. De esta forma, actúa como vehículo liberador de antígeno, mediando una presentación más efectiva del antígeno al sistema innato.

No obstante, un estudio reciente ha presentado que la alumina también tiene un efecto potenciador vía el control mediado por citocinas de la respuesta Th1/Th2 (Brewer et al. 1999. The Journal of Immunology, 163: 6448-6454). El estímulo inmunológico exhibido por la alumina es polarizado fuertemente hacia una respuesta tipo Th2. Esto es una limitación importante, puesto que ahora se reconoce que la respuesta inmunológica del tipo Th1 es esencial para generar inmunidad protectora contra muchos agentes infecciosos (virales, bacterianas, y protozoarios intracelulares).

Otro potente adyuvante inmunológico es la endotoxina lipopolisacárido bacteriano (LPS), y específicamente su porción activa, el lípido A. El lípido A nativo es reactogénico y pirogénico; sin embargo, modificaciones químicas en su estructura han dado lugar a preparaciones no tóxicas que conservan su actividad adyuvante. Se han efectuado ensayos clínicos con el lípido A purificado de Salmonella minnesota R595 y detoxificado al remover el grupo fosfato del extremo reductor del esqueleto del disacárido por hidrólisis ácida, para producir monofosforil lipido A (MPL). Este MPL puede ser además detoxificado por 3-O-acetilación con una hidrólisis ligera alcalina y se puede encapsular en liposomas compuestos de fosfolípidos y colesterol.

Por otro lado, la solicitud de patente norteamericana US 2003091599 describe oligonucleótidos adyuvantes que tienen al menos un dinucleótido CpG no metilado y describe que el ADN CpG induce un patrón Th1 de producción de citocinas dominadas por la IL-12 y el IFN-gamma, con una pequeña secreción de citocinas del tipo Th2, de este modo, el CpG activa directamente monocitos, macrófagos, y células dendríticas para que secreten una variedad de citocinas, incluyendo altos niveles de IL-12. Esas citocinas estimulan a las células NK para que secreten IFN-gamma y también aumentar su actividad lítica.

Otro adyuvante conocido, es aquél descrito en la patente norteamericana US 5976539; dicha patente describe el uso potencial de la IL-12 como un adyuvante y subraya su potencial como un activador de respuestas tipo Th1. Su potencial se acentúa en vacunas contra infecciones que requieren una respuesta inmunológica aumentada mediada por células para la protección eficaz contra patógenos. Sin embargo, su uso se ha limitado debido al alto costo de su producción y formulación y a que su uso en seres humanos presenta alta reactogenicidad y efectos pleiotrópicos (que puedan dar lugar a problemas de dosificación y efectos secundarios inesperados).

Por otro lado, la solicitud internacional de patente W08809336 describe varias fracciones de saponinas inmunológicamente activas que tienen actividad adyuvante. Las fracciones se han utilizado con éxito en la práctica veterinaria y se derivan de la corteza del árbol sudamericano Quillajasaponana. Las saponinas substancialmente puras tienen actividad adyuvante a una concentración mucho menor que las preparaciones heterogéneas de saponinas, y no exhiben sus efectos tóxicos. Por ejemplo la QS-21 , también conocida como QA21 , es una fracción purificada por HPLC divulgada (como QA21) en la patente US 5057540. Los adyuvantes de saponina QS-21 estimulan la respuesta inmunológica tipo 1 y 2 y se han utilizado con gran éxito en ensayos clínicos a gran escala de vacunas profilácticas y terapéuticas.

Adicionalmente, la solicitud internacional de patente W09014837 describe varias emulsiones submicrón aceite/agua así como su uso como adyuvantes. En particular, este documento describe las composiciones adyuvantes que comprenden un aceite metabolizable y un agente emulsificante, en donde el aceite y el agente emulsificante están presentes en forma de una emulsión de aceite/agua que tiene gotitas del aceite substancialmente menores de 1 micrómetro de diámetro. Una de las emulsiones descritas, un sistema de emulsión microfluidizado que consiste de polisorbato 80 y sorbitan trioleato MF59, ha sido recientemente aprobada en Italia para su uso en una vacuna de la gripe. Sin embargo, MF59, al igual que la alúmina, estimula una respuesta tipo 2 fuertemente polarizada.

De esta forma, existe una necesidad de adyuvantes y sistemas de adyuvantes de baja toxicidad, que estimulen ambas ramas del sistema inmunológico, que mejoren la seguridad y la eficacia de vacunas existentes y sean convenientes para el uso con las vacunas sintéticas y de subunidad.

En este sentido la presente invención es relativa a un nuevo adyuvante, la porina OmpS2 de S. typhi. Esta porina no se expresa en condiciones de laboratorio, tales como los cambios en la osmolaridad o en condiciones de estrés, como lo son los cambios de pH y temperatura o en anaerobiosis o en presencia de sales biliares y péptidos catiónicos (Oropeza y col. 1999, Mol. Microbio!. 32:243-252).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención proporciona una composición adyuvante a base de la porina OmpS2 de Salmonella entérica serovar Typhi.

En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de la porina OmpS2 de Salmonella entérica serovar Typhi para preparar composiciones adyuvantes útiles para la elaboración de vacunas.

Aún en otro aspecto de la invención, se proporciona una vacuna que comprende una composición adyuvante de porina OmpS2 de Salmonella entérica serovar Typhi y uno o más antígenos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se utiliza aquí, el término vacuna terapéutica intenta definir una subclase de vacunas las cuales tienen propiedades terapéuticas (y no sólo profilácticas). Dichas vacunas pueden tener una actividad profiláctica además de su potencial terapéutico. Ellas encuentran aplicación en el tratamiento de enfermedades, infecciones o condiciones existentes. Ellas vienen a ser de gran importancia como agentes para el tratamiento de cáncer, SIDA y malaria.

Cualquier antígeno o combinación de antígenos se puede utilizar en las vacunas de la invención, incluyendo por ejemplo ácidos nucleicos los cuales codifican uno o más proteínas antigénicas o péptidos; glicoproteínas, polisacáridos y otros carbohidratos; proteínas de fusión; lípidos; glicolípidos, glicopéptidos; carbohidratos y proteínas en mezcla; conjugados carbohidrato-proteína; células o extractos de las mismas; células muertas o atenidas o extractos de las mismas, células tumorales o extractos de las mismas; partículas virales (por ejemplo, partículas virales atenuadas o componentes virales) y alérgenos. El antígeno puede comprender un antígeno bacteriano, viral, fúngico, protozoario o priónico. Otros antígenos disponibles incluyen neoantígenos, antígenos asociados a tumor, y autoantígenos.

Las vacunas de la invención pueden usarse en el tratamiento o profilaxis de una amplia gama de enfermedades y desórdenes. Los blancos virales incluyen enfermedades y desórdenes en los cuales cualquiera de los siguientes virus (o clases de virus) están implicados: Retroviridae, Picomaviridae, Calciviridae, Togaviridae, Flaviridae, Coronoviridae, Rhabdoviradae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bungaviridae, Arenaviridae, Birnaviridae, Hepadnaviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Iridoviridae y virus no clasificados (por ejemplo, los agentes etiológicos de encefalopatías espongiformes), virus HCV (causante de la hepatitis no A ni B), virus Norwalk y relacionados. De los arriba mencionados, particularmente se prefieren los virus HIV, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, rabia, poliovirus, influenza, meningitis, viruela, rubéola, encefalitis, papiloma, fiebre amarilla, sincitial respiratorio, parvovirus, dengue, fiebre hemorrágica y Herpes. En tales incorporaciones el antígeno seleccionado para uso en vacunas deriva de aquellos antígenos presentes en virus ocurridos naturalmente.

Los blancos bacterianos incluyen a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Ejemplos de bacterias las cuales pueden ser blanco por las vacunas de la invención incluyen, pero no se limitan a: Helicobacter pylori, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacterium spp (por ejemplo M. tuberculosis, M. leprae, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii y M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Estreptococos del Grupo A), Streptococcus agalactie (Estreptococos del Grupo B), Streptococcus virídans, Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, cualquiera de la especies anaerobias del género Streptococcus, Streptococcus pneumoniae, Campylobacter spp., Enterococcus spp., Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, Corynebacteríum spp. (incluyendo C. diphtheriae), Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella spp (incluyendo K. pneumoniae), Pasteurella multocida, Bacteroides spp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus monilijormis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira spp., Rickettsia spp. y Actinomyces spp. (incluyendo A. israelil). En tales incorporaciones el antígeno seleccionado para uso en vacunas deriva de aquellos antígenos presentes naturalmente en bacterias (o expresadas/inducidas durante la infección, toxoides y toxinas).

Los blancos fúngicos incluyen Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis y Candida albicans. En tales incorporaciones el antígeno seleccionado para uso en vacunas deriva de aquellos antígenos presentes en fungís ocurridas naturalmente (o expresadas/inducidas durante la infección).

Los blancos prozoarios incluyen Plasmodium spp. (incluyendo Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale y Plasmodium vivax), Toxoplasma spp. (incluyendo T. gondii y T. cruf), Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, y Leishmania spp.

Los cáncer y desórdenes proliferativos incluyen cáncer de tejido sólido y aquellos de los sistemas linfático y sanguíneo (incluyendo la enfermedad de Hodgkin, leucemias, linfomas, mieloma múltiple, y enfermedad de Waldenstrom), melanomas (incluyendo melanoma del ojo), adenomas, sarcomas, carcinomas de tejidos sólidos, melanoma, cáncer de pulmón, tiroides, glándulas salivares, pierna, lengua, labios, conductos biliares, pelvis, mediastino, uretra, Sarcoma de Kaposi (por ejemplo cuando están asociados al SIDA; cáncer de piel (incluyendo melanoma maligno), cáncer del tracto digestivo (incluyendo cáncer de cabeza, cuello, esófago, estómago, páncreas, hígado, colon, recto, y ano), cáncer del sistema genital y urinario (incluyendo cáncer de riñón, vejiga, testículo, y próstata), cáncer en mujeres (incluyendo cáncer de seno, cervicouterino, ovario, y coriocarcinoma), así como también cáncer de cerebro, hueso, nasofaríngeo, retroperitoneal, y cáncer de sitio primario desconocido. En tales incorporaciones el antígeno seleccionado para uso en vacunas son los neoantígenos a antígenos asociados a tumor presentes en las células malignas y/o tejidos.

Los desórdenes alérgicos incluyen alergia atópica, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, dermatitis atópica, hipereosinofilía, síndrome del intestino irritable, migraña inducida por alérgeno, alergia bacteriana, alergia bronquial (asma), alergia de contacto (dermatitis), alergia al polen, alergia a medicamentos, alergia a piquetes, alergia a alimentos, alergia físicas (incluyendo urticaria al frío o angioedema), alergia al calor (urticaria colinérgica) y fotosensibilidad. En tales incorporaciones el antígeno seleccionado para uso en vacunas son derivados de aquellos antígenos presentes en el alérgeno, incluyendo polen, veneno de insectos, esporas de fungís, y medicamentos y proteínas específicas a los siguientes géneros: Canis, Dermatophagoides, Felis, Ambrosia, Lolium, Cryptomeria, Alder, Agnus, Betula, Quercus, Festuca y Bromus.

Las composiciones y vacunas de la invención contienen a la OmpS2 de Salmonella entérica serovar Typhi, opcionalmente junto con uno o más adyuvantes auxiliares y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Cuando la porina OmpS2 de Salmonella entérica serovar Typhi es formulada junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, cualquier excipiente puede ser utilizado, incluyendo por ejemplo diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes de unión, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y preservativos.

Las composiciones adyuvantes o de vacuna pueden tomar cualquier forma disponible, e incluyen por ejemplo tabletas, cápsulas, soluciones, suspensiones, polvos, gránulos y aerosoles.

Las tabletas para uso oral pueden contener la porina OmpS2 de Salmonella entérica serovar Typhi mezcladas con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes de unión, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y preservativos. Los diluyentes inertes disponibles incluyen carbonato de sodio y calcio, fosfato de sodio y calcio, y lactosa, mientras que el almidón de maíz y el ácido algínico están disponibles como agentes disgregantes. Los agentes de unión pueden incluir almidón y gelatina, mientras que los agentes lubricantes, si están presentes, serán generalmente estearato de magnesio, ácido esteárico, o talco.

Las cápsulas para uso oral incluyen cápsulas duras de gelatina, en las cuales la porina OmpS2 de Salmonella entérica serovar se mezcla con un diluyente sólido, y las cápsulas de gelatina suave, en donde el ingrediente activo es mezclado con agua o un aceite tal como el aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva.

Las formulaciones para administración rectal pueden presentarse como un supositorio con una base disponible que comprende por ejemplo mantequilla de cocoa o un salicilato.

Las formulaciones para administración vaginal pueden presentarse como presentaciones de tampones, cremas, geles, pastas, espumas o espray conteniendo además del agente activo, ingredientes tales como acarreadores apropiados bien conocidos en el estado del arte.

Para uso intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo e intravenoso, la porina OmpS2 de Salmonella entérica serovar Typhi generalmente se proporcionara en soluciones o suspensiones acuosas estériles, amortiguadas a un pH e isotonicidad apropiados.

Cuando se utilizan adjuntamente, la porina OmpS2 de Salmonella entérica serovar Typhi se puede formularse con uno o más medicamentos. En particular, se pueden utilizar en combinación con agentes antitumorales, antimicrobianos, antiinflamatorios, antiproliferativos, y/o inmunoestimulatorios. Por ejemplo, las porinas se pueden usar con agentes antiproliferativos tales como atocinas, incluyendo IL-2 e IL-12, interferones e inductores de los mismos, TNF, TGF, así como con agentes mielosupresivos y/o quimioterapéuticos (tales como doxorubicin, 5-fluorouracil, ciclofosfamida y metotrexato), isoniazida (por ejemplo en la prevención o tratamiento de neuropatía periférica) y con analgésico (por ejemplo NSAIDs) para la prevención y tratamiento de úlceras gastroduodenales.

La cantidad de la porina administrada puede variar extensivamente de acuerdo a la unidad de dosis empleada, el período de tratamiento, la edad, peso, clase de tratamiento adjunto, y sexo del paciente a tratar, la naturaleza y extensión del desorden a tratar, la naturaleza del antígeno administrado.

Las vacunas de la invención pueden ser administradas por rutas oral o parenteral, incluyendo intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, transdermal, mucosal, aérea, rectal, vaginal y tópica (incluyendo bucal y sublingual).

La invención será ahora descrita con referencia a ejemplos específico.

Ellos son únicamente para propósitos ilustrativos y no intentan de forma alguna limitar en cualquier sentido el propósito de la invención descrita. Dichos ejemplos constituyen hasta ahora el mejor método actualmente contemplado para la práctica de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Purificación de la porina OmpS2.

La obtención de la porina OmpS2 de S. typhi se realiza a través del método de Nikaido modificado. Se cultiva S. typhi pTrc99A-S2, en 9 litros de medio mínimo A (70g K2HP04, 30g KH2P0 , 10g (NH4) 2S04, 5g citrato de sodio, 10g extracto de levadura, 50g de glucosa, 0.1 % MgS04 ) hasta obtener una densidad óptica de 1.0 a 540 nm que corresponde a la fase logarítmica tardía del crecimiento de la bacteria. Se cosecha por centrifugación a 7,000 rpm durante 15 minutos a 4°C. La biomasa bacteriana se pesa y se resuspende en solución de Tris-CI 0.05M (pH 7.7) hasta obtener 50 mL de suspensión bacteriana. Se rompe por sonicación (Sonicator Ultra Sonio) durante una hora treinta minutos y la suspensión de bacteria rota se centrifuga a 7,000 rpm 30 minutos a 4°C.

El sobrenadante se retira y se trata con 25µ? de DNAsa 10 000 U/mL y 25µ? de RNAsa 10 000 U/mL y 2.77 mL de solución de gCI2 1 M por cada 10g de biomasa húmeda obtenida de la cosecha, por 30 minutos a 37°C 120 rpm para eliminar el ADN y ARN. La biomasa libre de ARN y ADN se ultracentrífuga a 45 000 rpm durante 45 minutos a 4°C. El botón se resuspende en 100 mL de solución de Tris HCI-SDS 2%, se incuba 30 minutos a 32°C, con agitación orbital a 120 rpm y se ultracentrífuga a 40 000 rpm, 30 minutos a 20°C. El botón resultante se resuspende en 25 mL de solución de Tris HCI-SDS 2%, se incuba nuevamente por 30 minutos a 32°C, con agitación orbital a 120 rpm y se ultracentrífuga a 40,000 rpm 30 minutos 20°C. El botón se resuspende en 20 mL de amortiguador de Nikaido SDS 1% (Tris 0.05M, NaCI 0.4M, EDTA 0.005M) pH 7.7. Se incuba 2 horas a 37°C, con agitación orbital a 120 rpm y se ultracentrífuga a 40 000 rpm 45 minutos a 20°C. Se recupera el sobrenadante.

El sobrenadante se purifica en una columna de Sephacryl S-200 (XK100 Pharmacia) a un flujo de 5 mL/min con amortiguador de Nikaido SDS 0.5% pH 7.7. Se colecta el pico obtenido en el cromatograma y se dializa con solución de PBS durante 4 días para eliminar el SDS.

La porina OmpS2 se obtiene en las fracciones 75 a la 100 del cromatograma. Posteriormente se lleva a cabo un corrimiento electroforético en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), para tinción con azul de coomasie y otro para tinción con plata para poder corroborar la presencia de la porina, así como la integridad de la misma. La porina OmpS2 se observa como una banda de 40 kDa, la cual corresponde al peso reportado en la literatura para esta proteína.

Ejemplo 2. Efecto de la porina OmpS2 sobre monocitos de ratón.

Ratones de la cepa BALB/c se sacrifican mediante dislocación y se extraen ambos fémures, en condiciones de esterilidad. Se cortan los extremos del fémur dejando un canal para eluir la médula ósea empleando 2.5 mL de medio DMEM suplementado para cada extremo. El eluido se colecta y se resuspende en 6 mL con medio de médula ósea. Se coloca 1 mL de la suspensión celular en cajas para cultivo celular de baja adherencia y se completa a un volumen final de 15 mL con medio de médula ósea. Las cajas se incuban a 37°C con 5% de C02 durante 6 días.

Al sexto día se desecha el medio de las cajas. Se despegan las células y se colocan en una placa de 6 pozos la cantidad necesaria de suspensión de células para que en cada uno de ellos hayan 1 x 106 células y se completa el volumen en cada pozo a 2mL con DMEM suplementado. Se incuba toda la noche antes del experimento a 37° C en atmósfera de 5% de CO2.

Se colocan placas de 6 pozos con 1 x106 macrófagos derivados de medula ósea en 1 mL de medio DMEM, se estimulan con 1pg/ml de la porina OmpS2 de S. typhi, 2 ng/mL de LPS de E. coli, como control positivo 100 ng/mL de LPS de E.coli y como control negativo medio DMEM, se incuban a 37° C en atmósfera de 5% de C02, a las 6, 12 y 24 horas posteriores a la estimulación se recolecta todo el sobrenadante y se desechan las células. El sobrenadante se almacena a -70°C hasta su análisis de las diferentes citocinas.

La porina OmpS2 es capaz de inducir IL-6, TNF y MCP-1 en MDMO. El control positivo (100 ng de LPS) indujo todas las citocinas evaluadas, los 2 ng de LPS únicamente indujeron una cantidad muy pequeña de MCP1. Por lo que se puede decir que el efecto es debido a la porina y no a la posible contaminación de LPS. MCP-1 se indujo a las 24 horas, y TNF-a se indujo a las 12 horas. También se observó la presencia de IL-6 únicamente a las 12 horas.

Ejemplo 3. Efecto adyuvante de la porina OmpS2 sobre la inmunización con ovoalbúmina (OVA) Grupos de ratones BALB/c fueron inmunizados vía intraperitoneal con 100 g de OVA en ausencia o presencia de adyuvante (10 µg OmpS2, 10 µg porinas). Los ratones control recibieron solución salina isotónica. Muestras de sangre se colectaron de la vena facial a diferentes tiempos. Las muestras individuales de suero se congelaron a -20"C hasta su análisis.

Las placas para ELISA de 96 pozos se fijaron adicionando 100pL de solución de unión por pozo (15pg de OVA/1 OOpL y 5pg de HELJIOOpL). Las placas fueron incubadas 1 hora a 37°C y durante toda la noche a 4°C. Después se lavaron cuatro veces con solución de lavado (PBS-Tween20 0.1 %). Posteriormente se bloquearon las placas adicionando a cada pozo 100µ? de solución de bloqueo (PBS-Leche 0.5%). Se incubaron una hora a 37°C y posteriormente se lavaron cuatro veces con solución de lavado.

Los sueros a ser analizados se diluyeron 1 :40 en solución de bloqueo con un volumen final de 100pL. Se adicionaron 100pL de los sueros diluidos a los primeros pozos de las placas de diluciones, se hicieron diluciones seriadas 1 :2 con solución de bloqueo. Los sueros se transfirieron cuantitativamente y en el orden correspondiente a la placa de ELISA previamente sensibilizada. Se incubaron 1 hora a 37°C y al término de ese tiempo se lavaron cuatro veces con solución de lavado. Posteriormente, se agregaron 100pL del anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón correspondiente marcado con peroxidasa de rábano diluido 1 :1000 en solución de bloqueo. La incubación de las placas se realizó a 37°C durante 1 hora, posteriormente se lavaron cuatro veces con solución de lavado. El revelado de las placas se realizó adicionando 100pL de solución de revelado a cada pozo. Se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente 15 minutos y la reacción se detuvo con 10pL de H2S04 2.5N por pozo. La densidad óptica fue determinada a una longitud de onda de 490nm en un lector de ELISA.

Se encontró que al coadministrar la porina OmpS2 con OVA es capaz de actuar como adyuvante al encontrar altos títulos de anticuerpos contra OVA, de todas las subclases de IgG, desde los primeros días, fenómeno que no se observa cuando se inmuniza únicamente OVA sin adyuvante. Se comparó la respuesta adyuvante con la generada con las porinas mayoritarias (OmpC y OmpF) de S. typhi que también presenta efecto adyuvante y el efecto adyuvante de la porina OmpS2 es menor al generado con las porinas mayoritarias de S. typhi.

Además se evaluó el efecto adyuvante utilizando otro antígeno, en este caso HEL (Lisozima de huevo de gallina) y se observó que la coadministración de OmpS2 con HEL, es capaz de inducir altos títulos de anticuerpos anti-HEL de subclase lgG1 e lgG2b desde los primero días, respuesta que no es capaz de inducir la inmunización de HEL sin adyuvante. Al comparar el efecto adyuvante de la porina OmpS2 con las porinas mayoritarias de S. typhi, la porina OmpS2 mostró ser un mejor adyuvante al inducir mayores niveles de anticuerpos anti HEL.

Ejemplo 4. Reconocimiento de la porina OmpS2 por TLRs Se utilizaron células HEK-293, las cuales presentan una transfección permanente con un plásmido que tiene el gen de TLR-2, TLR-2/CD14, TLR-2/TLR-6, TLR-4, o TLR-5 humano bajo el control del promotor de la L-selectina, que se activa por NF-??. El antibiótico de selección para el plásmido fué blasticidina S (Blasticidin InVivoGen). Estas células se usaron para determinar el reconocimiento de la porina OmpS2 a través del TLR codificado en plásmido transfectado. Las células HEK fueron colocadas en placas para cultivo de células de 12 pozos (Corning incorporated Cat. 3526). Se colocaron 300,000 células por pozo y fueron estimuladas con 1 pg de las porinas OmpS2. Las células se incubaron durante 24 horas a 37C. Como control se utilizó LPS de E. coli (10 pg/mL o 2ng/ml), Zimosan (10 pg/mL), flagelina (1 pg/mL) y las porina OmpC y OmpS2 degradadas con proteinasa K (0.5 pg/mL de proteinasa por cada 10 pg de porina). Posterior a la incubación, se tomaron los sobrenadantes y se les determinó la concentración de IL-8 como medida del reconocimiento de las porinas a través del TLR transfectado en las células.

La porina OmpS2 es reconocida tanto por TLR-2, TLR-2 / CD14, TLR-2 / TLR-6 y TLR-4 y este reconocimiento es de la porina en forma nativa, debido a que después del tratamiento con proteinasa K ya no observa reconocimiento por ninguno de los TLRs evaluados. De acuerdo a la predicción de los sitios probables de corte de la Proteinasa K sobre la OmpS2, utilizando el programa ExPASy PeptideCutter tool, pronostico 160 sitios de corte, lo que generaría péptidos menores a 13 aminoácidos.

La porina OmpS2 no fue reconocida por TLR-5 lo que nos permite descartar contaminación por flagelina. La porina OmpS2 al ser una proteína de membrana externa puede contener trazas de LPS, sin embargo, al evaluar la cantidad de LPS que pudiera contener, mediante el ensayo de Iisado de amebocitos de ümulus, el resultado de la prueba fue negativo, el límite de detección de este sistema es de 0.2 ng de LPS, por lo que si existiera contaminación de LPS este seria menor a 0.2 ng por pg de porina, por lo tanto, se estimularon las células HEK transfectadas con diez veces más la posible cantidad de LPS contaminante (2 ng de LPS) y sólo se observó reconocimiento con TLR-4, que es el receptor de LPS, sin embargo, el efecto observado con los 2 ng de LPS no es similar al observado con la porina OmpS2.

Se puede especular que la mezcla de trazas de LPS con una proteína pudieran ser capaces de señalizar a través de TLR-2, TLR2/CD14 y TLR2/TLR-6, y por esta razón la porina OmpS2 es reconocida por esos TLRs, sin embargo, la mezcla de una proteína como OVA con 2 ng de LPS no son capaces de señalizar por estos receptores.

Ejemplo 5. Efecto antigénico de la porina OmpS2 Grupos de ratones fueron inmunizados por vía intraperitoneal, sin adyuvante, en un volumen total de 500µ?, utilizando como vehículo solución salina isotónica con diferentes dosis de la porina OmpS2 (1 , 10, y 50 pg). Las muestras de sangre se obtuvieron por sangría de la vena facial en los días 0 a 360.

El título de anticuerpos específicos se evaluó mediante la técnica de ELISA. Para ello se sensibilizaron placas de 96 pozos para inmunoensayo (Corning®) con 100 pL por pozo de amortiguador de carbonatos (pH 8.6) conteniendo 1 pg de porinas de S. typhi, se incubaron a 37°C durante una hora (incubadora Shel-lab, 2100) y toda la noche a 4°C.

Para la determinación del título de inmunoglobulinas, se lavaron las placas cuatro veces con solución de lavado (solución de PBS al 0.1 % de Tween 20) y se bloquearon con 150 µ?_ de leche descremada al 5.0% (Svelty, Nestle) disuelta en PBS incubando las placas a 37°C por una hora. Posteriormente, se lavaron cuatro veces con la solución de lavado, las placas se refrigeraron hasta su empleo.

Los sueros fueron diluidos 1 :40 (5µ?_ en 195 µ?_) en PBS-leche al 5%, a partir de esta concentración se realizaron diluciones seriadas en factor de dos transfiriendo 100 µ?_ de la dilución a otro pozo que contenía 100 µ? de PBS-leche hasta completar los 12 pozos de la placa de micro dilución de fondo cónico (Corning).Se transfirieron las diluciones a la placa para inmunoensayo sensibilizada con porinas, se incubaron a 37°C por una hora, se lavaron 4 veces con solución de lavado y se adicionaron 100 µ?_ por pozo de anticuerpo anti-lg respectivo (anticuerpo de cabra anti IgM, IgG totales, lgG1 , lgG2a, lgG2b, lgG3 de ratón conjugado a peroxidasa de rábano, Z ymed ) diluido 1 :1000 en PBS-leche, se incubaron por una hora a 37°C, se lavaron cuatro veces con solución de lavado y se revelaron con la solución reveladora (0.5mg/mL de o-fenilendiamina en solución amortiguadora de citratos pH 5.6 y H2O2) incubando en ausencia de luz por diez minutos, se detuvo la reacción adicionando 10 µ?_ de acido sulfúrico 2.5 N. Las placas fueron leídas en un lector de microplacas (Dynex Technologies, MRX II) a 410 nm. Los títulos de anticuerpos específicos se determinaron como aquella dilución en donde la absorbancia fuera equivalente a 3 veces el fondo (generalmente fue igual a 0.3) y se graficaron en forma logarítmica los títulos contra el día a que corresponda el suero. Se utilizaron como controles positivos sueros de ratón previamente titulados para el antígeno respectivo.

Se observó que una única dosis de 10 g de OmpS2 es capaz de inducir una respuesta de anticuerpos de larga duración tanto Ig como IgG.

Ejemplo 6. Inducción de protección contra la bacteria S. typhi utilizando la porina OmpS2.

Como se ha observado, la porina OmpS2 de S. typhi es un antígeno inmunogénico capaz de inducir una respuesta de anticuerpos de larga duración, los cuales podrían mediar la protección frente a la infección. Para poder corroborar esto, se decidió inmunizar grupos de 6 ratones con 10 pg de la porina OmpS2 o 10 pg de OmpC como grupo control vía i. p. y se reinmunizaron al día 15 con la misma dosis correspondiente. Se retaron el día veinticinco con 20 y 100 DL50 de S. typhi en mucha al 5% (Mucina de estómago porcino tipo II, Sigma) disuelta en solución de Tris-Base EDTA (TE). Se mantuvieron en observación durante 10 días, analizándose el porcentaje de supervivencia.

Se observó que la porina OmpS2 es capaz de conferir un 80 % de protección contra 20 DL50 de S. typhi. No se observó protección contra 100 DI_5o, se sabe que las porinas mayoritarias son capaces de conferir de 90-100% de protección contra 100 DL50 por lo que se utilizó como control de nuestro sistema. Estos datos demuestran que la porina OmpS2 de S. typhi es un antígeno inmunogénico capaz de inducir protección frente a la infección con la bacteria.

Claims (1)

REIVINDICACIONES

1. El uso de la porina OmpS2 de Salmonella entérica serovar Typhi para preparar una composición adyuvante útil para la elaboración de vacunas. Una composición adyuvante útil para la elaboración de vacunas caracterizada porque contiene la porina OmpS2 de Salmonella entérica serovar Typhi. Una composición de vacuna que comprende: a) una composición adyuvante que contiene a la porina OmpS2 de Salmonella entérica serovar Typhi, y b) un antígeno o combinación de antígenos. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 3, en donde el antígeno se selecciona entre el grupo de: ácidos nucleicos codificantes de péptidos, glicoproteínas, polisacáridos, proteínas de fusión, lípidos, glicolípidos, péptidos semejantes a polisacáridos, conjugados carbohidrato-proteína, células o extractos de las mismas, células muertas o atenidas o extractos de las mismas, células tumorales o extractos de las mismas, partículas virales atenuadas o componentes virales, y alergénos. La composición de vacuna de conformidad con las reivindicaciones 3-4, en donde el antígeno se selecciona del grupo: antígenos bacterianos, virales, fúngícos, protozoarios, priónicos, neoantígenos, antígenos asociados a tumor, y autoantígenos. La composición de vacuna de conformidad con las reivindicaciones 3-5, caracterizada porque contiene adicíonalmente un adyuvante auxiliar y excipientes farmacéuticamente aceptables. La composición de vacuna de conformidad con las reivindicaciones 3-6, caracterizadas porque están adaptadas farmacéuticamente en forma de tabletas, cápsulas, soluciones, suspensiones, polvos, gránulos o aerosoles.