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MX2009002011A - Metodo para la produccion de conjugados del factor de crecimiento similar a la insulina-1 y polietilenglicol. - Google Patents

Metodo para la produccion de conjugados del factor de crecimiento similar a la insulina-1 y polietilenglicol.

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Publication number
MX2009002011A
MX2009002011A MX2009002011A MX2009002011A MX2009002011A MX 2009002011 A MX2009002011 A MX 2009002011A MX 2009002011 A MX2009002011 A MX 2009002011A MX 2009002011 A MX2009002011 A MX 2009002011A MX 2009002011 A MX2009002011 A MX 2009002011A
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MX
Mexico
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pro
igf
variant
lysine
pegylated
Prior art date
Application number
MX2009002011A
Other languages
English (en)
Inventor
Kurt Lang
Friederike Hesse
Stephan Fischer
Christian Schantz
Friedrich Metzger
Andreas Schaubmar
Hendrik Knoetgen
Joerg Thomas Regula
Hans Joachim Schoenfeld
Original Assignee
Hoffmann La Roche
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Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37667695&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MX2009002011(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of MX2009002011A publication Critical patent/MX2009002011A/es

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Abstract

Se describe un método para la producción de IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina, y la variante comprende uno o dos aminoácido(s) seleccionados del grupo que consiste en lisina 27, 65 y/o 68 sustituidos independientemente por otro aminoácido polar, que se caracteriza por cultivar una célula huésped procariota que comprende un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende el IGF-I o variante de IGF-I unido en el extremo N-terminal al extremo C-terminal de un propéptido, en el que el propétido finaliza en el C-terminal con los aminoácidos -Y-Pro, en el que Y se selecciona del grupo que consiste en Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro, recuperando y PEGilando la proteína de fusión, escindiendo la proteína de fusión PEGilada con la proteasa IgA, y recuperando el IGF-I o variante de IGF-I PEGilado. El IGF-I o variante de IGF-I PEGilado es útil para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer.

Description

METODO PARA LA PRODUCCION DE CONJUGADOS DEL FACTOR DE CRECIMIENTO SIMILAR A LA INSULINA-1 Y POLIETILENGLICOL Campo de la Invención Esta invención está relacionada con los métodos para la producción de conjugados de factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-I) con polietilenglicol (PEG) , composiciones farmacéuticas que contienen tales conjugados, y métodos para utilizar tales conjugados. Antecedentes de la Invención La enfermedad de Alzheimer (EA) es una forma de neurodegeneración cuya prevalencia está aumentando y que da lugar aproximadamente a un 50%-60% de todos los casos de demencia entre las personas mayores de 65 años. Actualmente se estima que afecta a 15 millones de personas en todo el mundo y debido al aumento relativo de personas mayores en la población, su prevalencia probablemente aumentará en las próximas 2 o 3 décadas. La EA es un trastorno progresivo con una duración media de alrededor de 8.5 años entre la aparición de los síntomas clínicos y la muerte. La muerte de las neuronas piramidales y la pérdida de sinapsis neuronales en las regiones del cerebro asociadas con las funciones mentales superiores resulta en los síntomas típicos, caracterizados por un deterioro general y progresivo de las funciones cognitivas (Francis, P.T., et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 66 (1999) 137-147). La EA es la forma más común en el mundo de Ref.: 199906 ambos tipos de demencia, la senil y la presenil y está reconocida clínicamente como una demencia progresiva e inexorable que aparece con una pérdida creciente de memoria, de la función intelectual y alteraciones en el habla (Merritt, A Textbook of Neurology, 6a ed., Lea& Febiger, Philadelphia (1979), págs. 484-489). En relación a la neuropatología, los principales rasgos distintivos de la EA son la presencia de dos lesiones características: la placa amiloide senil y los ovillos neurofibrilares (ONF) . Mientras que la placa se deposita extraneuronalmente, los ovillos se observan intraneuronalmente en el cerebro post-mortem. Uno de los principales componentes del núcleo de la placa amiloide es el pequeño péptido beta-amiloide (?ß) depositado de forma patológica, que se escinde mediante secretasas de la proteína amiloide precursora (APP) (Selkoe, D.J., Physiol. Rev. 81 (2001) 741-766; Hardy, J. y Selkoe, D.J., Science 297 (2002) 353-356; Bush, A.I. y Tanzi, R.E., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99 (2002) 7317-7319) . El ?ß, un péptido auto-agregante de 39 a 43 residuos (PM ~4 kDa) , se sintetiza como parte de la APP, más larga (110-120 kDa). La APP es una glicoproteína integral de membrana de tipo I con un gran dominio extracelular N-terminal, un dominio único transmembrana y una pequeña cola citoplasmática . La región ?ß abarca porciones de los dominios extracelular y transmembrana de la APP. La hipótesis más común sobre la participación de la APP en la muerte de las células neuronales en la EA es la hipótesis amiloide. Esta hipótesis postula que las deposiciones de placa amiloide o ?ß soluble parcialmente agregada produce una cascada neurotóxica, provocando de esta manera una neurodegeneración similar a la patología de la EA (Selkoe, D.J., Physiol. Rev. 81 (2001) 741-766; Hardy, J. y Selkoe, D.J., Science 297 (2002) 353-356). El factor de crecimiento similar a la insulina-1 humano (IGF-I) es una hormona circulante, que está relacionada en su estructura con la insulina. El IGF-I ha sido considerado tradicionalmente el principal mediador de las acciones de la hormona de crecimiento sobre los tejidos periféricos. El IGF-I consiste en 70 aminoácidos y también se denomina somatomedina C y se define con el N° de SwissProt P01343. Su uso, actividad y producción se mencionan en, por ejemplo, le Bouc, Y., et al., FEBS Lett. 196 (1986) 108-112; de Pagter-Holthuizen, P., et al., FEBS Lett. 195 (1986) 179-184; Sandberg Nordqvist, A. C., et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277; Steenbergh, P. H., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 (1991) 507-514; Tanner, J. M . , et al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 84 (1977) 681-696; Uthne, K. , et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974) 548-554; EP 0 123 228; EP 0 128 733; US 5,861,373; US 5,714,460; EP 0 597 033; WO 02/32449; WO 93/02695. La regulación de la función de IGF-I es bastante compleja. En la circulación, sólo el 0.2% del IGF-I existe en forma libre mientras que la mayoría está unido a proteínas de unión a IGF (IGFBP) , que presentan una muy alta afinidad hacia los IGF y modulan la función de IGF-I. El factor puede liberarse de forma local mediante mecanismos de liberación de IGF-I como la proteólisis de las IGFBP mediante proteasas. El IGF-I juega un papel paracrino en el desarrollo y maduración del cerebro (Werther, G.A., et al., Mol. Endocrinol. 4 (1990) 773-778). Los estudios in vitro indican que el IGF-I es un potente agente trófico no selectivo para diferentes tipos de neuronas en el SNC (Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10(1990) 558-570; Svrzic, D., y Schubert, D. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 172 (1990) 54-60), incluyendo las neuronas dopaminérgicas (Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10(1990) 558-570) y oligodendrocitos (McMorris, F. A., y Dubois-Dalcq, M., J. Neurosci. Res. 21 (1988) 199-209; McMorris, F. A., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83 (1986) 822-826; Mozell, R.L., y McMorris, F. A., J. Neurosci. Res. 30 (1991) 382-390)). La US 5,093,317 menciona que la supervivencia de las células neuronales colinérgicas se ve potenciada mediante la administración de IGF-I. También se sabe que el IGF-I estimula la regeneración de los nervios periféricos (Kanje, M. , et al., Brain Res. 486 (1989) 396-398) y aumenta la actividad de la ornitina descarboxilasa (US 5,093,317). Las patentes US 5,861,373 y WO 93/02695 mencionan un método para tratar lesiones o enfermedades del sistema nervioso central que predominantemente afectan a las neuronas de la glia y/o neuronas no-colinérgicas aumentando la concentración activa de IGF-I y/o análogos del mismo en el sistema nervioso central del paciente. La O 02/32449 se centra en los métodos para reducir o prevenir el daño isquémico en el sistema nervioso central de un mamífero mediante la administración en la cavidad nasal del mamífero en cuestión, de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de IGF-I o de una variante biológicamente activa del mismo. El IGF-I o variante del mismo es absorbido a través de la cavidad nasal y transportado dentro del sistema nervioso central del mamífero en una cantidad efectiva para reducir o prevenir el daño isquémico asociado con un evento isquémico. La EP 0 874 641 reivindica el uso de un IGF-I o un IGF-II para la elaboración de un medicamento para tratar o prevenir el daño neuronal en el sistema nervioso central, debido a la demencia relacionada con el SIDA, EA, Enfermedad de Parkinson, Enfermedad de Pick, Enfermedad de Huntington, encefalopatía hepática, síndromes ganglionares cortico-basales , demencia progresiva, demencia familiar con paraparesia espástica, parálisis progresiva supranuclear , esclerosis múltiple, esclerosis cerebral de Schilder o encefalomielitis hemorrágica aguda necrotizante, en la que el medicamento está en una forma de administración parenteral de una cantidad efectiva de el IGF fuera de la barrera hematoencefálica o hematomedular . La reducción de los niveles de IGF-I libre en el cerebro y en el suero, se ha relacionado con la patogénesis de formas esporádicas y familiares de EA. Además, el IGF-I protege las neuronas de la neurotoxicidad inducida por el ?ß (Niikura, T . , et al., J. Neurosci. 21 (2001) 1902-1910; Dore, S., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94 (1997) 4772-4777; Dore, S., et al., Ann. NY Acad. Sci. 890 (1999) 356-364). Recientemente, se ha visto que el IGF-I administrado periféricamente es capaz de reducir los niveles de ?ß en el cerebro de ratas y ratones (Carro, E . , et al., Nat. Med. 8 (2002) 1390-1397). Además, el estudio ha demostrado en un modelo de ratón transgénico con EA, que el tratamiento prolongado de IGF-I reduce de forma significativa la carga de placas amiloides en el cerebro. Estos datos apoyan fuertemente la idea de que el IGF-I es capaz de reducir los niveles de ?ß en el cerebro y la demencia cerebral asociada a las placas mediante el aclaramiento de ?ß del cerebro. Se ha demostrado que la modificación covalente de las proteínas con polietilenglicol (PEG) es un método útil para aumentar la vida media de circulación de las proteínas en el organismo (Hershfield, M. S., et al., N. Engl. J. Med. 316 (1987) 589-596; Meyers, F. J. , et al., Clin. Pharmacol. Ther. 49 (1991) 307-313; Delgado, C, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9 (1992) 249-304; Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10 (1993) 91-114; EP-A 0 400 472; Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69; Satake-Ishikawa, R . , et al., Cell Struct. Funct . 17 (1992) 157-160; Katre, N. V. , et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987) 1487-1491; Tsutsumi, Y . , et al., Jpn. J. Cáncer Res. 85 (1994) 9-12; Inoue, H . , et al., J. Lab. Clin. Med. 124 (1994) 529-536; Chamow, S.M., et al., Bioconjugate Chem. 5 (1994) 133-140). Otras ventajas de la PEGilación son un incremento de la solubilidad y un descenso en la inmunogenicidad de la proteina (Katre, N.V., J. Immunol . 144 (1990) 209-213). Un método común para la PEGilación de proteínas es la utilización de polietilenglicol activado con reactivos amino-reactivos como la N-hidroxisuccinimida (NHS) . Con tales reactivos, el polietilenglicol se une a las proteínas en los grupos amino primarios libres como el grupo N-terminal a-amino y los grupos e-amino de los residuos de lisina. No obstante, la principal limitación de esta aproximación es que las proteínas normalmente contienen una cantidad considerable de residuos de lisina y por lo tanto, los grupos polietilenglicol están unidos a la proteína de forma no específica a todos los grupos e-amino, resultando en una mezcla heteróloga de producto de proteínas PEGiladas aleatoriamente. Por lo tanto, muchas proteínas NHS-PEGiladas no son adecuadas para su uso comercial debido a su baja actividad especifica. La inactivación resulta de la modificación covalente de uno o más residuos de lisina o del residuo amino N-terminal necesario para la actividad biológica o de la unión covalente de los residuos de polietilenglicol cercanos o en el centro activo de la proteina. Por ejemplo, se ha encontrado que la modificación de la hormona de crecimiento humana utilizando los reactivos de NHS-PEGilación reduce la actividad biológica de la proteina en más de 10 veces (Clark, R., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 21969-21977). La hormona de crecimiento humana contiene 9 Usinas además del aminoácido N-terminal. Algunas de estas Usinas están localizadas en las regiones de la proteina que se saben que son criticas para la unión del receptor (Cunningham, B.C., et al., Science 254 (1991) 821-825). Además, la modificación de la eritropoyetina mediante el uso de reactivos de polietilenglicol amino-reactivos, resulta también en una pérdida casi completa de la actividad biológica (Wojchowski, D.M., et al., Biochim. Biophys . Acta 910 (1987) 224-232). La modificación covalente del Interferón-a2 con reactivos de PEGilación amino-reactivos, resulta en una pérdida del 40-75% de la bioactividad (Patente Estadounidense N° 5,382,657). Una modificación similar del G-CSF resulta en una pérdida de actividad superior al 60% (Tanaka, H., et al., Cáncer Res. 51 (1991) 3710-3714) y de la Interleuquina-2 en más del 90% de su bioactividad (Goodson, R. J. , y Katre, N.
V., BioTechnology 8 (1990) 343-346). Las patentes O 94/12219 y WO 95/32003 reivindican conjugados de polietilenglicol que comprenden PEG y IGF o un IGF mutado en la cisteina, en la que el PEG está unido a la muteina en una cisteina libre en la región N-terminal de la muteina. La WO 2004/60300 describe el IGF-I PEGilado en el extremo N-terminal. El sitio de reconocimiento de la Proteasa IgA está descrito como Yaa-Pro . ! . Xaa-Pro . Yaa significa Pro (o raramente Pro en combinación con Ala, Gly o Thr: Pro-Ala, Pro-Gly, o Pro-Thr. Xaa significa Thr, Ser o Ala (Pohlner, J. , et al., Bio/Technology 10 (1992) 799-804; Pohlner, J. , et al., Nature 325 (1987) 458-462; y US 5,427,927). Los sitios de escisión naturales han sido identificados por Wood, S.G. y Burton J. , Infect. Immun. 59 (1991) 1818-1822. Los sustratos peptidicos sintéticos para la proteasa de la inmunoglobulina Al de Neisseria gonorrhoea (tipo 2) son los sitios autoproteoliticos Lys-Pro-Ala-Pro .!. Ser-Pro, Val-Ala-Pro-Pro .!. Ser-Pro, Pro-Arg-Pro-Pro. ! .Ala-Pro, Pro-Arg-Pro-Pro .!. Ser-Pro, Pro-Arg-Pro-Pro .!. Thr-Pro y los sitios de escisión IgAl: Pro-Pro-Thr-Pro .!. Ser-Pro y Ser-Thr-Pro-Pro. ! .Thr-Pro. La patente WO 2006/066891 describe conjugados que consisten en una variante del factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-I) y uno o dos grupos polietilenglicol, que se caracterizan por que la variante de IGF-I posee una alteración en la secuencia de aminoácidos del IGF-I de tipo salvaje en hasta tres de las posiciones aminoacidicas 27, 37, 65, 68, de forma que uno o dos de los aminoácidos son lisina y el aminoácido 27 es un aminoácido polar diferente de lisina, y está conjugado mediante el grupo amino primario de la(s) lisina (s) y el/lo (s) grupo (s) polietilenglicol poseen un peso molecular total de 20 a 100 kDa. Tales conjugados son útiles para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer. La patente O 2006/074390 se refiere a los polipéptidos de fusión de IGF-I. Sumario de la Invención La invención comprende un método para la producción de un IGF-I PEGilado en la lisina o una variante de IGF-I PEGilado en la lisina, la variante comprende uno o dos aminoácido ( s ) seleccionados de entre el grupo que consiste en la lisina 27, 65 y/o 68 sustituidas independientemente por otro aminoácido polar, que se caracteriza por a) cultivar una célula huésped procariota que comprende un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica una proteina de fusión, que comprende el IGF-I o variante de IGF-I unida por el extremo N-terminal al C- terminal de un propéptido, b) en el que el propéptido finaliza en el extremo C-terminal con los aminoácidos -Y-Pro, en el que Y se selecciona del grupo que consiste en Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro, c) recuperar y PEGilar la proteína de fusión, d) escindir la proteína de fusión PEGilada con la proteasa IgA, y e) recuperar el IGF-I PEGilado o variante de IGF-I. En otra modalidad, el método se caracteriza porque la variante de IGF-I PEGilada en la lisina es RRK y la variante está monoPEGilada en el residuo de lisina 68, o la variante de IGF-I PEGilada en la lisina es RKR y la variante está monoPEGilada en el residuo de lisina 65. En otra modalidad, el método se caracteriza porque la variante de IGF-I PEGilada en la lisina es RKK y la variante está mono- o diPEGilada en los residuos de lisina 65 y 68. En otra modalidad el método se caracteriza porque la variante de IGF-I PEGilada en la lisina es una mezcla de RRK, RKR o RKK y la variante está mono- o diPEGilada en el (los) residuo (s) de lisina 65 y 68. Otra modalidad de la invención es una proteína de fusión que comprende el IGF-I o variante de IGF-I unido en el extremo N-terminal al extremo C-terminal de un propéptido, que se caracteriza porque el propéptido finaliza en el extremo C-terminal con los aminoácidos -Y-Pro, en el que Y se selecciona del grupo que consiste en Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro. Gracias a la secuencia -Y-Pro, el propéptido puede separarse mediante el tratamiento con la la proteasa IgA de el IGF-I o variante de IGF-I . Preferiblemente la proteina de fusión de acuerdo con la invención se caracteriza por la fórmula Met-Xi-Hisn-X2-Y-Pro-[IGF-I o variante de IGF-I], en la que • IGF-I indica el IGF-I humano y la variante de IGF-I indica un IGF-I en el que uno o dos aminoácido ( s ) seleccionados del grupo que consiste en lisina 27, 65 y/o 68 están sustituidos independientemente por otro aminoácido polar, • Met indica metionina, • Xi es un enlace, serina o asparagina, • His es histidina, • n es un número de 0 a 10, preferiblemente de 0 a 6, • X2 es un péptido enlazante, seleccionado de entre el grupo de péptidos SEQ ID No . ° : 6-10, • Pro es prolina, y • Y se selecciona del grupo que consiste en Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro o Pro-Arg-Pro . Preferiblemente la proteina de fusión de acuerdo con la invención se selecciona del grupo que consiste en las proteínas de fusión SEQ ID No. 2-5 y SEQ ID No.22-25.
Preferiblemente el propéptido se muestra mediante la fórmula Met-Xi-Hisn-X2-Y-Pro-, en la que • Met indica metionina • Xi es un enlace, serina o asparagina • His es histidina, • n es un número de 0 a 10, preferiblemente de 0 a 6, • X2 es un péptido enlazante, seleccionado del grupo que consiste en los péptidos SEQ ID No.6-10, • Pro es prolina, y • Y se selecciona del grupo que consiste en Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro o Pro-Arg-Pro . El propéptido está unido en su extremo C-terminal al extremo N-terminal (glicina) del IGF-I o variante de IGF-I. Preferiblemente el propéptido no incluye un residuo de lisina. El propéptido posee preferiblemente una longitud de hasta 30 aminoácidos. Preferiblemente Xi es un enlace. Preferiblemente n es 0 o 6. Preferiblemente X2 es el péptido SEQ ID No .7. Preferiblemente Y es Pro-Arg-Pro. Otra modalidad de la invención es un IGF-I PEGilado en la lisina, que se caracteriza porque no comprende una metionina N-terminal . Otra modalidad de la invención es una variante de IGF-I PEGilado en la lisina, en el que uno o dos aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en lisina 27, 65 y/o 68 están sustituidos independientemente por otro aminoácido polar, que se caracteriza porque la variante no comprende una metionina N-terminal. Preferiblemente el/lo (s) aminoácido ( s ) polar (es) es/son independientemente arginina, glutamina o asparagina, especialmente arginina. La variante de IGF-I y las variantes preferidas de la proteina de fusión son: RKK, RKR, RRK. Las variantes de IGF-I se designan como sigue: K65 indica que el aminoácido 65 es lisina, R27 indica que el aminoácido 27 es arginina, etc. Una variante de IGF-I portadora de los aminoácidos R27, K65, K68 se designa como RKK, y los restantes aminoácidos de la variante RRK son los mismos que en el IGF-I de tipo salvaje de SEQ ID No.l. Asi, RKK es una variante de IGF-I de tipo salvaje, que se mutó en la posición 27 mediante el cambio de K a R. RRK es una variante del IGF-I de tipo salvaje, que se mutó en las posiciones 27 y 68 mediante el cambio de K a R. RRK es una variante de IGF-I de tipo salvaje, que se mutó en las posiciones 27 y 65 mediante el cambio de K a R. El IGF-I de tipo salvaje, en el que no se ha cambiado ningún aminoácido, se denomina KKK. El IGF-I PEGilado en la lisina está preferiblemente PEGilada de forma aleatoria en los residuos de lisina 27, 65 y 68, preferiblemente mono- o diPEGilado (uno o dos PEG por molécula de IGF-I) . La variante de IGF-I PEGilado en la lisina está preferiblemente mono- o diPEGilado en el (los) residuo (s) de lisina 65 y 68, preferiblemente monoPEGilado en K65 o K68. El (los) grupo (s) polietilenglicol está (n) conjugado (s) a el IGF-I o variante de IGF-I mediante el (los) grupo (s) amino primario de la lisina (s). El método de acuerdo con la invención comprende la preparación de un IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina, teniendo el/lo (s) grupo (s) polietilenglicol, preferiblemente un peso molecular total de al menos 20 kDa por IGF-I o variante de IGF-I, más preferiblemente entre alrededor de 20 y 100 kDa, y especialmente preferible de 20 a 80 kDa, haciendo reaccionar la proteina de fusión IGF-I de acuerdo con la invención con polietilenglicol activado bajo condiciones en las que el polietilenglicol se una químicamente a el intermediario de IGF-I mediante el (los) grupo (s) amino primario de la (s) lisina (s) del IGF-I o variante de IGF-I. Preferiblemente el IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina está monoPEGilada . La variante está preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en RKK, RKR, RRK respecto a las posiciones de aminoácido 27, 65 y 68, respectivamente. El PEG preferiblemente posee un peso molecular medio total de 30 a 45 kDa, especialmente de 30 kDa o 40 kDa.
Breve Descripción de las Figuras Fig 1: Análisis peptidico de la proteina de fusión monoPEGilada . Análisis SDS-PAGE de proteina de fusión plegada antes y después de la PEGilación. Carril 1, mezcla de proteínas estándar (aprotinina de pulmón bovino, 6.0 kDa; lisozima de huevo blanco de gallina, 14.4 kDa; inhibidor de la tripsina de soja, 21.5 kDa; anhidrasa carbónica de eritrocito bovino, 31.0 kDa; lactato deshidrogenasa de músculo porcino, 36.5 kDa; glutámico deshidrogenasa de hígado bovino, 55.4 kDa; albúmina de suero bovino, 66.3 kDa; fosforilasa b de músculo de conejo, 97.4 kDa; ß- galactosidasa de E.coli, 97,4 kDa; miosina de músculo de conejo, 200 kDa) ; carril 2, pro-IGF-I antes de la pegilación; carril 3, pro-IGF-I después de la pegilación . Fig. 2: Análisis peptidico de la variante de IGF-I monoPEGilada . Análisis SDS-PAGE de proteína de fusión PEGilada antes y después de la de la escisión con IgA. Carril 1, mezcla de proteínas estándar (igual que en la Figura 1) ; carril 2, mezcla de reacción antes de la escisión con la Proteasa IgA; carril 3, mezcla de reacción después de la escisión con la Proteasa IgA.
Fig. 3: SDS PA6E. Análisis SDS-PAGE de proteína de fusión plegada antes y después de la PEGilación. Carril 1 , mezcla de proteínas estándar (igual que en la Figura 1 ) ; carril 2 , mezcla de reacción antes de la CI I ; carril 3 , flujo a través de CII; carriles 4 - 19 , fracciones únicas eluídas de la CII . Figs. 4A-4C: Disminución In vivo del Abeta mediante PEG-RRK en ratones B6.152H. Se trataron ratones B6 . 152H doble transgénicos de 9 - 10 meses de edad con vehículo (NaCl) o con PEG-RRK ( 5 ig/ kg s.c, dos veces a la semana) durante 14 días. Se prepararon extractos solubles de cerebro y se evaluaron los niveles de APP, Abeta y Actina como se describe. Las proporciones de APP/Actina, Abeta/Actina y Abeta/APP se calcularon y se expresaron como % del control. Figura 4A, APP/Actina; Figura 4B, Abeta/Actina, Figura 4C, Abeta/APP. Las gráficas superiores muestran puntos de datos de animales individuales, las gráficas inferiores muestran representación en barras (medias ± EEM) incluyendo las diferencias estadísticas (*, p<0 . 05 ; **, p<0 . 01 vs. control sin tratar, n=10) . Descripción Detallada de la invención La invención además comprende composiciones farmacéuticas que contienen un IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina de acuerdo con la invención, preferiblemente junto con un transportador farmacéuticamente aceptable.
La invención además comprende métodos para la producción de composiciones farmacéuticas que contienen un IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina de acuerdo con la invención . La invención además comprende la utilización de un IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la EA. La invención además comprende métodos para el tratamiento de la EA, que se caracterizan por que una cantidad farmacéuticamente efectiva del IGF-I PEGilado amino-reactivo o variante de IGF-I se administre a un paciente que necesite el tratamiento, preferiblemente entre una y dos aplicaciones por semana . Se ha hallado con sorpresa que la proteasa IgA, preferiblemente la proteasa IgA de Neisseria gonorrhoea , es capaz de escindir la secuencia de aminoácidos Y-Pro . ! . Gly-Pro . Y se selecciona del grupo que consiste en Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro. Es preferiblemente útil el sitio de escisión Pro-Pro .!. Gly-Pro (SEQ ID No.15) o Pro-Arg-Pro-Pro .!. Gly-Pro (SEQ ID No.°:ll) (.!. : posición de escisión). El sitio de escisión de la proteasa IgA para el proceso de acuerdo con la presente invención presenta la siguiente secuencia de aminoácidos consenso Y-Pro. !. Gly-Pro, en la que Gly-Pro son los dos primeros aminoácidos de IGF-I. Y preferiblemente representa una secuencia de aminoácidos que finaliza con los aminoácidos Pro, Pro-Ala, Arg-Pro o Pro-Arg-Pro. Tales secuencias de aminoácidos Y, especialmente Pro-Arg-Pro pueden prolongarse con otro grupo Ala o Pro-Ala, como por ejemplo en, Ala-Pro-Arg-Pro (SEQ ID No. 12) o Pro-Ala-Pro-Arg-Pro (SEQ ID No. 13) . Particularmente preferidas son las secuencias de escisión de aminoácidos Pro-Ala-Pro .!. Gly-Pro (SEQ ID No. 14), Pro-Pro-!.Gly-Pro (SEQ ID No.°:15), Pro-Arg-Pro-Pro . ! . Gly-Pro (SEQ ID No. 16), Ala-Pro-Arg-Pro-Pro. ! .Gly-Pro (SEQ ID No. 17) o Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro. ! .Gly-Pro (SEQ ID No. 18). De acuerdo con la presente invención el término "proteasa IgA" incluye las proteasas que escinden de forma especifica IgA y que están descritas por ejemplo por Kornfeld, S. J. y Plaut, A. G. en Rev. Infekt. Dis. 3 (1981) 521-534, como por ejemplo, la proteasa IgAl de Neisseria gonorrhoea (tipo 2) . Las proteasas IgA recombinantes , como las descritas en DE-A 36 22 221; Koomey, J. ., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79 (1982) 7881- 7885; Bricker, J., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80 (1983) 2681- 2685; Pohlner, J. , et al., Nature 325 (1987) 458- 462; y Halter, R., et al., EMBO J. 3 (1984) 1595-1601, también son adecuadas. Preferiblemente la proteasa IgA es una proteasa IgA de Neisseria gonorrhoea, preferiblemente de tipo 2. Preferiblemente, la proteasa IgA 1 de Neisseria gonorrhoea (TIPO 2) TIENE LA seq. Id. No. 26.. El gen que codifica la proteina de fusión se sitúa preferiblemente bajo el control de señales de expresión adecuadas (preferiblemente inducibles) por lo que las proteínas de fusión pueden producirse de acuerdo con los requisitos. La células adecuadas para utilizar como células huésped pueden ser células procariotas o eucariotas (tanto vegetales como animales) para la producción de proteínas de fusión; aunque también son posibles los sistemas libres de células. Una modalidad preferida del proceso de acuerdo con la presente invención se caracteriza porque una célula huésped se transforma con un ADN recombinante o un vector recombinante , en que el ADN o el vector contiene al menos una copia de un gen que codifica para la proteína de fusión de acuerdo con la invención y la célula transformada se cultiva en un medio adecuado, el gen que codifica para la proteína de fusión se construye para que se exprese en la célula transformada, la proteína de fusión está PEGilada y por lo tanto se escinde con la proteasa IgA y se puede aislar el IGF-I PEGilado o variante de IGF-I. La expresión de la proteína de fusión de acuerdo con la invención puede, por ejemplo, mejorarse a nivel de ADN mediante la fusión con fragmentos del gen beta-galactosidasa libre de lisinas, es decir, Y contiene una parte de una proteína beta-galactosidasa libre de lisinas. Otras alternativas para aumentar la expresión de la proteína de fusión son conocidas por el experto. La purificación y separación del producto de expresión puede facilitarse mediante la fusión con otros polipéptidos , en particular, con polipéptidos o proteínas que están altamente cargadas (por ejemplo, poli(Lys, Arg) ) o que pueden unirse a sustancias particulares con alta afinidad (por ejemplo, estreptavidina) (véase por ejemplo, EP-A 0 089 626, EP-A 0 306 610) . Los péptidos enlazantes especialmente preferidos son los péptidos SEQ ID No. : 6-10, preferiblemente los que su extremo N-terminal está precedido por SHHHHHH (SEQ ID No.: 19), NHHHHHH (SEQ ID No.:20) O HHHHHH (SEQ ID No.:21). La presente invención también proporciona un ácido nucleico (recombinante) que codifica para una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención y en que un sitio de escisión de una proteasa IgA se incorpora en la región de unión entre el propéptido y el IGF-I o variante de IGF-I. Se puede obtener un ADN recombinante de acuerdo con la presente invención de una forma conocida por un experto en la materia de la biología molecular. Para este propósito, se escinde normalmente un vector que contiene una secuencia de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos del IGF-I o variante de IGF-I con endonucleasa ( s ) de restricción en la región del extremo 5' de este gen y se religa con oligonucleótidos que contienen la secuencia deseada. Además, la invención también proporciona un vector recombinante que contiene al menos una copia de un ADN recombinante de acuerdo con la presente invención. Los vectores que son adecuados como base para la expresión de proteínas en organismos procariotas son conocidos por los expertos. Este vector es preferiblemente uno que permita una alta expresión del ADN recombinante de acuerdo con la presente invención. El ADN recombinante en el vector está preferiblemente bajo el control de una señal de expresión inducible (por ejemplo, el promotor lambda, tac, lac o trp) . El vector de acuerdo con la presente invención puede estar presente de forma extracromosómica (por ejemplo, en forma de plásmido) así como integrado en el genoma del organismo huésped (por ejemplo, bacteriófago lambda) . El vector de acuerdo con la presente invención es preferiblemente un plásmido. Los vectores que son adecuados en cada caso para la expresión del gen en un organismo huésped particular son conocidos por los expertos en la materia de la biología molecular. Puede ser un vector eucariota, pero preferiblemente es un vector procariota. Ejemplos de vectores adecuados para la expresión del ADN de acuerdo con la presente invención en procariotas son, por ejemplo, los vectores pUC y pUR disponibles comercialmente . La invención también proporciona una célula, preferiblemente una célula procariota, particularmente preferida una célula de E. coli, que está transformada con el ADN recombinante de acuerdo con la presente invención y/o con un vector recombinante de acuerdo con la presente invención. Cuando la proteina de fusión se expresa en procariotas, se forman agregados ligeramente solubles (cuerpos refringentes , cuerpos de inclusión) y que son inactivos. Por lo tanto, la proteina de fusión debe transformarse en su forma activa. Utilizando procedimientos familiares a los expertos en la materia (véase por ejemplo, EP-A 0 219 874, EP A 0 114 506, WO 84/03711) se lleva a cabo en primer lugar una solubilización mediante la adición de agentes desnaturalizantes seguida de una renaturalización y, si se desea, otro paso de purificación. El tratamiento de la proteina de fusión con la proteasa IgA tiene lugar después de la PEGilación de la proteina de fusión. Las condiciones necesarias para el tratamiento del IGF-I PEGilado o variante de IGF-I para escindir con proteasas de IgA no son criticas. En este proceso es preferible, no obstante, que la proporción en peso de IGF-I PEGilado o variante de IGF-I respecto a la proteasa IgA sea de 1:1 a 500:1, preferiblemente, 100:1. La reacción tiene lugar preferiblemente en una solución acuosa tamponada con un pH de 6.5 a 8.5. La concentración de tampón está preferiblemente en el intervalo de 50 y 500 mmol/ 1 si se desea, con la adición de 0-100 mmol/ 1 de cloruro sódico. La escisión se lleva a cabo preferiblemente a temperatura ambiente durante entre al menos 60 min. y hasta 5 dias, preferiblemente entre 24 y 72 h.
Tras la solubilización, renaturalización, PEGilación y escisión con proteasa IgA, el producto de escisión PEGilado obtenido de esta manera se purifica preferiblemente por medio de una cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y/o fraccionamiento por tamaño. El IGF-I PEGilado o variante de IGF-I producido de esta manera está libre de metionina en la posición -1 y preferiblemente libre de otras proteínas, como el IGF-I o variante de IGF-I no PEGilado, y preferiblemente libre de propéptido PEGilado en el extremo N-terminal, en un 5% (p/p) o menos. "IGF-I o variante de IGF-I PEGilado" o "PEGilación amino-reactiva" tal como se utiliza aquí, significa que un IGF-I o variante de IGF-I está covalentemente unida a los grupos polietilenglicol mediante acoplamiento amino-reactivo . Los grupo (s) PEG está(n) unidos a los sitios de la molécula IGF-I o variante de IGF-I que son los grupos e-amino primarios de las cadenas laterales de lisina. También es posible que la PEGilación suceda además en el grupo a-amino N-terminal del propéptido. Debido al método de síntesis y la proteína de fusión utilizada, el IGF-I o variante de IGF-I PEGilado puede consistir en una mezcla, en la que los sitios de PEGilación pueden ser diferentes en diferentes moléculas o pueden ser sustancialmente homogéneos respecto a la cantidad de cadenas laterales de polietilenglicol por molécula y/o el sitio de PEGilación en la molécula. Preferiblemente el IGF-I o variante de IGF-I están mono- y/o diPEGilados. La PEGilación amino-reactiva tal como se utiliza aquí designa un método de unión aleatoria de cadenas de polietilenglicol a los grupo (s) amino primario (s) de la lisina del IGF-I o variante de IGF-I, mediante el uso de reactivos (activados) de polietilenglicol, preferiblemente mediante el uso de ésteres de N-hidroxisuccinimilo, preferiblemente de metoxipolietilenglicol . La reacción de acoplamiento une el polietilenglicol a los grupos e-amino primarios reactivos de los residuos de lisina y opcionalmente al grupo a-amino del aminoácido N-terminal de la proteina de fusión. Tal conjugación de grupo amino de PEG a las proteínas se conoce bien en la materia. Por ejemplo, la revisión de tales métodos se describe en Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417. De acuerdo con Veronese, la conjugación de PEG a los grupos amino primarios de las proteínas puede realizarse utilizando PEG activado que produce una alquilación de los grupos amino primarios. Para esta reacción, pueden utilizarse PEG activados alquilantes, por ejemplo PEG aldehido, PEG-cloruro de tresilo o PEG epóxido. También son reactivos útiles los PEG acilantes como los ésteres de hidroxisuccinimidilo de los PEG carboxilados o PEG en el que el grupo hidroxi terminal está activado por cloroformatos o carbonilimidazol . Otros reactivos de PEG útiles son los PEG con porciones de aminoácido. Tales reactivos pueden contener las llamadas ramas de PEG, en las que al menos dos moléculas de PEG idénticas o diferentes están enlazadas mediante un espaciador peptidico (preferiblemente lisina) y, por ejemplo, unido a IGF-I o variante de IGF-I como un carboxilato activado del espaciador de lisina. "PEG o polietilenglicol" tal como se utiliza aqui indica un polímero soluble en agua que está disponible comercialmente o que puede prepararse mediante polimerización por apertura del anillo de etilenglicol de acuerdo con los métodos conocidos en la materia (Kodera, Y., et al., Progress in Polymer Science 23 (1998) 1233-1271; Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18). El término "PEG" se utiliza ampliamente para abarcar cualquier molécula de polietilenglicol, en la que el número de unidades de etilenglicol es de al menos 460, preferiblemente entre 460 y 2300, y especialmente preferible entre 460 y 1840 (230 unidades de PEG se refiere a un peso molecular de alrededor de 10 kDa) . El número máximo de unidades de PEG está sólo limitado por la solubilidad del IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina. Normalmente no se utilizan los PEG que son mayores que los PEG que contienen 2300 unidades.
Preferiblemente, un PEG utilizado en la invención termina en su extremo con hidroxi o metoxi (metoxi PEG, mPEG) y está en el otro extremo covalentemente unido a una porción enlazante mediante un puente de éter oxigeno. El polímero de PEG puede ser lineal o ramificado. Preferiblemente el polímero de PEG es ramificado. Los PEG ramificados se describen, por ejemplo, en Veronese, F.M., et al., Journal of Bioactive and Compatible Polymers 12 (1997) 196-207. Los reactivos de PEG útiles están, por ejemplo, disponibles de Nektar Therapeutics (www.nektar.com). Los PEG ramificados pueden prepararse, por ejemplo, mediante la adición de óxido de polietileno a varios polioles, incluyendo glicerol, pentaeritriol y sorbitol. Por ejemplo, un PEG ramificado de cuatro brazos puede prepararse a partir de pentaeritriol y óxido de etileno. Los PEG ramificados normalmente presentan entre 2 y 8 brazos y están descritos en, por ejemplo, las patentes EP-A 0 473 084 y US N° 5,932,462. Especialmente preferidos son los PEG con dos cadenas laterales de PEG unidas mediante el grupo amino primario de una lisina (abreviado como PEG2) (Monfardini , C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). Puede utilizarse PEG de cualquier masa molecular según sea más práctico, por ejemplo, entre alrededor de 20 kDaltons (Da) y 100 kDa (n es de 460 a 2300) . El número de unidades repetitivas "n" en el PEG es aproximado para la masa molecular descrita en Daltons . Por ejemplo, si dos moléculas de PEG están unidas a un enlazante, en la que cada molécula de PEG posee la misma masa molecular de 10 kDa (cada n es de alrededor de 230) , entonces la masa molecular total de PEG en el enlazante es de alrededor de 20 kDa. Las masas moleculares del PEG unido al enlazante también son diferentes, por ejemplo, de dos moléculas en un enlazante, una molécula de PEG puede ser de 5 kDa y una molécula de PEG puede ser de 15 kDa. La masa molecular siempre indica la media de la masa molecular . En los ejemplos posteriores, se describen algunos reactivos preferidos para la producción de IGF-I o variante de IGF-I amino-reactivo . Se entiende que las modificaciones, por ejemplo, basadas en los métodos descritos por Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417, pueden realizarse en los procedimientos en tanto que el proceso produzca un IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina de acuerdo con la invención . La invención proporciona los métodos para la producción de las formas PEGiladas de IGF-I o variante de IGF-I con sus propiedades mejoradas. Tales IGF-I o variantes de IGF-I PEGilados en la lisina contienen PEG lineal o ramificado de forma aleatoria unido a ésta, en la que el peso molecular total de todos los grupos PEG en el IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina es preferiblemente entre alrededor de 20 y 80 kDa. Será obvio para un experto en la materia que son posibles pequeñas desviaciones en este intervalo de peso molecular mientras que el IGF-I o variante de IGF-I PEGilado muestre actividad en la disminución de los niveles de péptido Abeta en el cerebro. También el PEG con pesos moleculares de más de 80 kDa resulta en una mayor bioadisponibilidad. No obstante, se espera que tal actividad disminuya a medida que el peso molecular aumente debido a una reducción de la activación del receptor de IGF-I y del transporte en la barrera hemato-encefálica . Por lo tanto, el intervalo de 20 a 100 kDa para el peso molecular de PEG debe entenderse como el intervalo optimizado para un IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina útil para un tratamiento eficaz de un paciente que padece la EA. Se produce preferiblemente una variante de IGF-I monoPEGilada , seleccionada del grupo que consiste en RKK, RKR y RRK en la que el grupo PEG ramificado posee un peso molecular de 30-45, preferiblemente de 40-45 kDa (alrededor de 920 unidades de PEG) . Por ejemplo, en base al peso molecular medio de 44 kDa para el PEG y un peso molecular de 7.6 kDa para el IGF-I, el peso molecular medio calculado para el monoPEG-IGF-I es de alrededor de 51.6 kDa. Especialmente preferido es el uso de un éster de PEG ramificado activado de N-hidroxisuccinimidilo (mPEG2-NHS) de un peso molecular de 40 kDa (Monfardini , C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69; Veronese, F. M. , et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12 (1997) 197-207; Patente US 5,932,462). También se produce preferiblemente un IGF-I monoPEGilado en el que el PEG posee un peso molecular medio de 30 o 40 kDa. Tal como se utiliza aquí, "peso molecular" significa el peso molecular medio del PEG. Las siguientes formas PEGiladas de IGF-1 o variante de IGF-I son productos preferido y disponibles mediante los métodos de acuerdo con la invención: La variante monoPEGilada de IGF-I K68, preferiblemente la variante RRK o RKK, más preferiblemente la variante RRK, en la que el grupo PEG posee un peso molecular de 20 a 80 kDa (460 a 1840 unidades de PEG); La variante monoPEGilada de IGF-I K65, preferiblemente la variante RKR o RKK, más preferiblemente la variante RKR, en la que el grupo PEG posee un peso molecular de 20 a 80 kDa (460 a 1840 unidades de PEG) ; La variante diPEGilada de IGF-I, preferiblemente la variante RKK, en la que los grupos PEG poseen un peso molecular de alrededor de 10 a 50 kDa (230 a 1150 unidades de PEG) cada uno; y mezclas de los mismos; La variante monoPEGilada de IGF-I K68, preferiblemente la variante RRK o RKK, más preferiblemente la variante RRK, que comprende un grupo PEG2 de un peso molecular de 40 kDa; La variante monoPEGilada de IGF-I K65, preferiblemente la variante RKR o RKK, más preferiblemente la variante RKR, que comprende un grupo PEG2 de un peso molecular de 40 kDa; El IGF-I monoPEGilado, en el que el grupo PEG posee un peso molecular de 20 a 80 kDa (460 a 1840 unidades de PEG) ; El IGF-I diPEGilado, en el que los grupos PEG poseen un peso molecular de alrededor de 10 a 50 kDa (230 a 1150 unidades de PEG) cada uno; El IGF-I monoPEGilado, que comprende un grupo PEG2 de un peso molecular de 40 kDa. El IGF-I PEGilado o variante de IGF-I es sustancialmente homogéneo. La preparación puede contener pequeñas cantidades de proteina sin reaccionar (es decir, a las que le falta el grupo PEG) . Tal como se determinó mediante el mapeo peptidico, la pureza de la variante es de al menos del 90% (p/p) . Se puede realizar, además, una posterior purificación de tales preparaciones, incluyendo la separación de los IGF-I o variante de IGF-I mono- y/o diPEGilados, mediante los métodos de purificación normales, preferiblemente mediante cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de interacción hidrofóbica y/o mediante cromatografía de intercambio iónico, especialmente mediante cromatografía de intercambio catiónico. "MonoPEGilado" tal como se utiliza aquí significa que el IGF-I o variante de IGF-I está PEGilado en sólo una lisina por molécula de IGF-I o variante de IGF-I. Los "PEG activados o reactivos PEG activados" son bien conocidos en el estado de la materia. Preferiblemente se utilizan PEG activados electrofilicamente como los ésteres de succinimidilo de polietilenglicol del ácido alcoxibutírico ("alcoxi inferior-PEG-SBA" ) o los ésteres de succinimidilo de polietilenglicol del ácido alcoxipropiónico ("alcoxi inferior-PEG-SPA") o PEG activados de N-hidroxisuccinimida . Se puede utilizar cualquier método convencional para hacer reaccionar un éster activado con una amina para formar una amida. En la reacción del PEG activado con IGF-I, el éster de succinimidilo del ejemplo es un grupo saliente que provoca la formación de la amida. La utilización de ésteres de succinimidilo para producir conjugados con proteínas se describe en la Patente US No. 5,672,662. Las condiciones de reacción utilizadas poseen una influencia sobre la cantidad relativa de IGF-I o variantes de IGF-I PEGilados de forma diferente. Si se manipulan las condiciones de reacción (por ejemplo, la proporción de reactivos, pH, temperatura, concentración de proteína, tiempo de reacción, etc.), pueden variar las cantidades relativas de las diferentes especies PEGiladas. Preferiblemente la reacción se realiza en una solución acuosa tamponada a pH 8-10, opcionalmente puede contener hasta un 30% (v/v) de etanol. La relación molar de proteína: PEG está preferiblemente entre 1:1 y 1:6, preferiblemente entre 1:2 y 1:5. La temperatura de reacción y el tiempo de reacción puede variar de acuerdo con el conocimiento del experto, en los que un aumento de la temperatura y de los tiempos de reacción resultan en un aumento de la PEGilación. Si se producen proteínas monoPEGiladas, se prefiere por lo tanto trabajar entre 4°C y 22°C y durante hasta 30 minutos o hasta 60 minutos. Cuando el reactivo de PEGilación se combina con IGF-I o variante de IGF-I en un tampón de reacción, que preferiblemente consiste en borato sódico 50 m y etanol al 25%, a un pH de alrededor de 9.0 - 9.5, con una proporción de proteína: PEG de alrededor de 1:3 a 1:4, y una temperatura de reacción de 4°C, se produce una mezcla de mono-, di- y cantidades traza de las especies tri-PEGiladas dependiendo de la presencia de residuos Lys en la proteína. El IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina de acuerdo con la invención, puede prepararse mediante la reacción covalente de un grupo amino primario de lisina de un IGF-I o variante de IGF-I con un reactivo bifuncional para formar un intermediario con un enlace amida, y la reacción covalente del intermediario que contiene el enlace amida con un derivado de polietilenglicol activado para formar un IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina. En el anterior proceso, el reactivo bifuncional es preferiblemente N-succinimidil-S-acetiltiopropionato o N-succinimidil-S-acetiltioacetato, y el derivado de polietilenglicol activado se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en yodo-acetil-metoxi-PEG, metoxi-PEG-vinilsulfona, y metoxi-PEG-maleimida . Los derivados de PEG activados, son conocidos en la materia y están descritos en, por ejemplo, Morpurgo, M. , et al., J. Bioconjugate Chem. 7 (1996) 363-368 para PEG-vinilsulfona . Las especies de PEG de cadena lineal o ramificada son adecuadas para la preparación de los compuestos de fórmula I. Ejemplos de PEG reactivos son yodo-acetil-metoxi-PEG y metoxi-PEG-vinilsulfona . La utilización de estas sustancias yodo-activadas es conocido en la materia y están descritas en, por ejemplo, Hermanson, G.T., en Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996), págs. 147-148. Un "aminoácido polar" tal como se utiliza aqui, se refiere a un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en cisteina (C) , ácido aspártico (D), ácido glutámico (E) , histidina (H) , asparagina (N) , glutamina (Q) , arginina (R) , serina (S) y treonina (T) . La lisina también es un aminoácido polar, pero se excluye, ya que la lisina se sustituye de acuerdo con la invención. La arginina se utiliza preferiblemente como un aminoácido polar. Formulaciones Farmacéuticas El IGF-I o variante de IGF-I PEGilado producido de acuerdo con la invención proporciona una estabilidad mejorada en la circulación, permitiendo un acceso sostenido a los receptores de IGF-I a lo largo del organismo con intervalos de aplicación bajos. Los compuestos de la presente invención pueden formularse de acuerdo con los métodos para la preparación de composiciones farmacéuticas, y los métodos son conocidos por los expertos en la materia. Para la producción de tales composiciones, un IGF-I o variante de IGF-I PEGilado de acuerdo con la invención, se combina en una mezcla con un transportador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente mediante diálisis o diafiltración frente una solución acuosa que contiene los ingredientes deseados de las composiciones farmacéuticas. Tales transportadores aceptables se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, 1990, Mack Publishing Company, editado por Oslo et al. (por ejemplo, págs. 1435-1712). Las composiciones típicas contienen una cantidad efectiva de la sustancia de acuerdo con la invención, por ejemplo entre alrededor de 0.1 y 100 mg/ mi, junto con una cantidad adecuada de un transportador. Las composiciones pueden administrarse por vía parenteral. El IGF-l o variante de IGF-I PEGilado de acuerdo con la invención se administra preferiblemente por vía intraperitoneal , subcutánea, intravenosa o intranasal . Las formulaciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden prepararse de acuerdo con los métodos conocidos en la materia. Normalmente, las soluciones de IGF-I o variante de IGF-I PEGilado se dializan o diafiltran frente al tampón que se va a utilizar en la composición farmacéutica y la concentración final de proteína se ajusta mediante concentración o dilución. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan para ayudar a entender la presente invención, pero el verdadero alcance de la misma se describe en las reivindicaciones anexadas. Se entiende que pueden realizarse modificaciones en los procedimientos descritos, sin alejarse del espíritu de la invención. Los nombres de los aminoácidos están abreviados utilizando tanto el código de una letra (por ejemplo R) o el código de tres letras (por ejemplo Arg) . Listado de secuencias SEQ ID NO. : 1 secuencia de aminoácidos de IGF-I humano (aminoácidos 49-118 de SwissProt P01343).
SEQ ID NO.: 2 secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión px3036_IAG_R K27R K65R K68 SEQ ID NO.: 3 secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión px3036_IAEE_Fl K27R K65R K68 SEQ ID NO. : 4 secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión px3036_IAFX_Fl 27R K65R K68 SEQ ID NO. : 5 secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión px3036_IAFX_F2 K27R K65R K68 SEQ ID NO. : 6 -10 enlazante SEQ ID NO. : 11· -18 secuencias de escisión SEQ ID NO. : : 19· -21 otras SEQ ID NO. : : 22 secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión px3036_IAG_R K27R K65 K68R SEQ ID NO. : : 23 secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión px3036_IAEE_Fl K27R K65 K68R SEQ ID NO. : : 24 secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión px3036_IAFX_Fl K27R K65 68R SEQ ID NO. : : 25 secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión px3036_IAFX_F2 K27R K65 K68R E emplos Ejemplo 1 Se produjeron los siguientes mutantes (lo que comprende la variante IGF-I - RRK) con los propéptidos de (fórmula I)): Ilutante Xi X2 n Y Px3036_ IAG K27R K65R K68 ninguno KAKRFKKH 6 PRPP Px3036_IAG_R K27R K65R K68 ninguno RARRFRRH 6 PRPP Px3036_IAEE_Fl K27R K65R K68 S NTEHNREH 6 PRPP Px3036_IAFX_Fl K27R K65R 68 N IEGRH 6 PRPP Px3036_IAFX_F2 K27R 65R 68 N TEFENIEH 6 PRPP Preparación de variante IGF-I-mono-PEGilada K68 (variante RRK) El vector de expresión y la cepa E. coli utilizados, se describen en la EP 0 972 838. A partir de un clon de E. coli, que expresa la proteina de fusión px3036_IAG_R K27R K65R K68, px3036_IAEE_Fl K27R K65R K68, px3036_IAFX_Fl K27R K65R K68 o px3036_IAFX_F2 K27R K65R K68, cultivado en una placa de agar selectiva, se transfirió una punta de inoculo a (100 mi) de medio selectivo y se cultivó durante 13 h a 37°C hasta una densidad óptica (578 nm) de 2 - 4. Este cultivo se guardó en hielo durante las siguientes 6 horas antes de la inoculación automatizada del cultivo principal que se realizó a 37°C. La expresión del mutante IGF-I se inició a una densidad óptica (578 nm) de 50 con la adición de IPTG 1.0 m . La fermentación total duró hasta 16 horas. La cantidad de proteina se determinó mediante densitometria comparando la intensidad volumétrica de la banda de proteina del producto con la banda de un IGF estándar en un gel de SDS-PAGE. El medio de cultivo se separó mediante centrifugación. Para obtener material de cuerpos de inclusión (CI) purificado, la biomasa recogida de la fermentación estándar se trató con el siguiente procedimiento: la biomasa se resuspendió con tampón TrisMgS04 pH7 y se suplemento con 0.3 g de lisozima /100 g de biomasa en peso seco y 5 U de Benzonasa /l g de biomasa en peso seco. Se incubaron durante 20 min. y se homogenizaron . Se añadieron 30 U de Benzonasa /l g de biomasa en peso seco y se incubó durante 60 min. a 37 °C. Se añadió 0.5 L de tampón Brij/ litro y se incubó durante 30 min. a TA. Tras la centrifugación el botón se resuspendió en 300 mi de tampón Tris-EDTA /100 g de biomasa en peso húmedo (CI purificados en peso húmedo), se incubó durante 30 min. a TA y se centrifugó. Se solubilizaron 1 g de CI/ litro a temperatura ambiente durante la noche en guanidina-HCl 6.8 M, TrisHCl 0.1 M, DTT 0.1 M, pH 8.5. La solución turbia se dializó a 4°C frente a guanidina-HCl 6.8 M, TrisHCl 0.1 M, pH 8.0. Tras la diálisis, los componentes insolubles se eliminaron por centrifugación. Se realizó el plegamiento mediante la dilución de 50 veces de la solución de pro-IGF-I en arginina 0.8 M, TrisHCl 0.1 M, guanidina-HCl 0.1 M, GSH 1 mM, GSSG 1 mM, pH 8.5 a temperatura ambiente. Tras dos horas, la solución se suplemento con cloruro sódico 2 M, se filtró y se aplicó a una tasa de flujo de 10 ml/min a una columna de CIH (Butil Sefarosa 4 Flujo rápido; GE, Amersham Biosciences) , que se equilibró a temperatura ambiente con tampón, que contiene NaCl 2 M, arginina 0.8 M, TrisHCl 0.1 M, guanidina-HCl 0.1 M, pH 8.5. La columna se lavó con tampón de equilibrado hasta alcanzar la linea basal y después se eluyó con diez volúmenes de columna de un gradiente lineal, empezando con tampón de equilibrado y finalizando con tampón que contiene TrisHCl 0.1 M, etilenglicol al 5%, pH 8.5. Las fracciones eluidas se analizaron mediante cromatografía en fase reversa de alta resolución (rpHPLC) . Las fracciones que contenían proteína con los puentes SS correctamente formados, se agruparon. El conjunto de fracciones se dializó a 4°C frente a borato sódico 50 mM, pH 9.0. Se solubilizó PEG ramificado de 40 kDa activado con NHS (éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) de mPEG PM 20,000 (mPEG2NHS, US 5,932,462, Nektar Shearwater Polymers, Huntsville, AL) ) en HC1 2 mM frío y se añadió inmediatamente a la solución de proteína dializada (proporción molar reactivo-PEG/proteína 2:1) . Tras 1 h y 2 h de incubación en hielo, se añadió la misma cantidad de solución acídica de mPEG2-NHS a la mezcla de reacción proteína/PEG. Tras una tercera adición de la misma cantidad de solución mPEG2-NHS acídica (exceso molar total de 6 veces el reactivo PEG), se incubó la reacción en hielo durante otra hora más. La reacción se paró mediante la adición de cloruro de amonio sólido, se incubó durante otros 45 minutos y después se ajustó a pH 8.0 (véase la Figura 1) . La mezcla de reacción de proteína/PEG se suplemento con proteasa IgAl de Neisseria gonorrhoea (tipo 2) (proporción p/p 1:50) y se incubó durante la noche a temperatura ambiente (véase Figura 2) . La mezcla de reacción se diluyó 1:2 con ácido acético 50 mM pH 4.5 y después se aplicó a una columna de intercambio de cationes (MacroCap SP support; GE, Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) , que había sido equilibrada con ácido acético 50 mM. La columna se lavó hasta alcanzar la línea basal y después se eluyó con 20 volúmenes de columna de un gradiente lineal, comenzando con ácido acético 50 mM y finalizando con ácido acético 50 mM suplementado con cloruro sódico 1 M. Las fracciones eluídas se analizaron mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contenían una sola banda con un tamaño molecular relativo estimado de alrededor de 60 kDa, se agruparon como IGF-I monoPEGilado K68 (véase Figura 3) . La identidad de IGF-I monoPEGilado K68 se verificó mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño (CET) con detección de la dispersión de la luz estática, análisis por EM de las digestiones con tripsina, análisis por EM de las digestiones Asp-N y análisis de la CII de cationes. No se pudieron encontrar isovariantes de PEGilación al margen de IGF-I monoPEGilado K68. Ejemplo 2 Se produjeron los siguientes mutantes (lo que comprende la variante IGF-I RKR) con los propéptidos de (fórmula I) ) : Preparación de la variante IGF-I-mono-PEGilada (variante RKR) El vector de expresión y la cepa E. coli utilizados, describen en la EP O 972 838. A partir de un clon de E. coli, que expresaba la proteina de fusión px3036_IAG_R K27R K65 K68R, px3036_IAEE_Fl K27R K65 K68R, px3036_IAFX_Fl K27R K65 K68R o px3036_IAFX_F2 K27R K65 K68R, cultivado en una placa de agar selectiva, se transfirió una punta de inoculo a (100 mi) de medio selectivo y se cultivó durante 13 h a 37 °C hasta una densidad óptica (578 nm) de 2 - 4. Este cultivo se guardó en hielo durante las siguientes 6 horas antes de la inoculación automatizada del cultivo principal que se realizó a 37°C. La expresión del mutante IGF-I se inició a una densidad óptica (578 nm) de 50 con la adición de IPTG 1.0 mM. La fermentación total duró hasta 16 horas. La cantidad de proteina se determinó mediante densitometria, comparando la intensidad volumétrica de la banda de proteina del producto con la banda de un IGF estándar en un gel de SDS-PAGE. El medio de cultivo se separó mediante centrifugación. Para obtener material de cuerpos de inclusión (CI) purificado, la biomasa recogida de la fermentación estándar se trató con el siguiente procedimiento: la biomasa se resuspendió con tampón TrisMgS04 pH7 y se suplemento con 0.3 g de lisozima /100 g de biomasa en peso seco y 5 U de Benzonasa /l g de biomasa en peso seco, se incubaron durante 20 min. y se homogeneizaron . Se añadieron 30 U de Benzonasa /l g de biomasa en peso seco y se incubó durante 60 min. a 37 °C. Se añadió 0.5 L de tampón Brij/ litro y se incubó durante 30 min. a TA. Tras la centrifugación el botón se resuspendió en 300 mi de tampón Tris-EDTA /100 g de biomasa en peso húmedo (CI purificados en peso húmedo) , se incubó durante 30 min. a TA y se centrifugó. Se solubilizaron 1 g de CI/ litro a temperatura ambiente durante la noche en guanidina-HCl 6.8 M, TrisHCl 0.1 , DTT 0.1 M, pH 8.5. La solución turbia se dializó a 4°C frente a guanidina-HCl 6.8 M, TrisHCl 0.1 M, pH 8.0. Tras la diálisis, los componentes insolubles se eliminaron por centrifugación. Se realizó el plegamiento mediante la dilución de 50 veces de la solución de pro-IGF-I en arginina 0.8 M, TrisHCl 0.1 M, guanidina-HCl 0.1 M, GSH 1 mM, GSSG 1 mM, pH 8.5 a temperatura ambiente. Tras 2 a 48 horas, preferiblemente tras 2 horas, la solución se suplemento con cloruro sódico 2 M, se filtró y se aplicó a una tasa de flujo de 10 mi/ min a una columna de CIH (Butil Sefarosa 4 Flujo rápido; GE, Amersham Biosciences) que se equilibró a temperatura ambiente con tampón, que contiene NaCl 2 M, arginina 0.8 M, TrisHCl 0.1 M, guanidina-HCl 0.1 M, pH 8.5. La columna se lavó con tampón de equilibrado hasta alcanzar la linea basal y después se eluyó con diez volúmenes de columna de un gradiente lineal, empezando con tampón de equilibrado y finalizando con tampón que contiene TrisHCl 0.1 M, etilenglicol al 5%, pH 8.5. Las fracciones eluidas se analizaron mediante cromatografía en fase reversa de alta resolución (rpHPLC) . Las fracciones que contenían proteína con los puentes SS correctamente formados, se guardaron juntas. El conjunto de fracciones se dializó a 4°C frente a borato sódico 50 mM, pH 9.0. Se solubilizó PEG ramificado de 40 kDa activado con NHS (éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) de mPEG PM 20.000 (mPEG2NHS , US 5,932, 462, Nektar Shearwater Polymers, Huntsville, AL) ) en HC1 2 mM frío y se añadió inmediatamente a la solución de proteina dializada (proporción molar reactivo-PEG/proteina 2:1). Tras 1 h y 2 h de incubación en hielo, se añadió la misma cantidad de solución acidica de mPEG2-NHS a la mezcla de reacción proteina/PEG. Tras una tercera adición de la misma cantidad de solución mPEG2-NHS acidica (exceso molar total de 6 veces el reactivo PEG) , se incubó la reacción en hielo durante otra hora más. La reacción se paró mediante la adición de cloruro de amonio sólido y se incubó durante otros 45 minutos y después se ajustó a pH 8.0 (véase la Figura 1) . La mezcla de reacción de proteina/PEG se suplemento con proteasa IgAl de Neisseria gonorrhoea (tipo 2) (proporción p/p 1:50) y se incubó durante la noche a temperatura ambiente (véase Figura 2) . La mezcla de reacción se diluyó 1:2 con ácido acético 50 mM pH 4.5 y después se aplicó a una columna de intercambio de cationes (MacroCap SP support; GE, Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) , que había sido equilibrada con ácido acético 50 mM. La columna se lavó hasta alcanzar la línea basal y después se eluyó con 20 volúmenes de columna de un gradiente lineal, comenzando con ácido acético 50 mM y finalizando con ácido acético 50 mM suplementado con cloruro sódico 1 M. Las fracciones eluidas se analizaron mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contenían una sola banda con un tamaño molecular relativo estimado de alrededor de 60 kDa, se juntaron como IGF-I monoPEGilado K65. La identidad de IGF-I monoPEGilado K65 se verificó mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño (CET) con detección de la dispersión de la luz estática, análisis por EM de las digestiones con tripsina, análisis por EM de las digestiones Asp-N y análisis de la CII de cationes. Ejemplo 3 Reducción de Abe a soluble en cerebro mediante la variante IGF-I-monoPEGilada K68 RRK in vivo Para la evaluación de la potencia de la variante IGF-I-monoPEGilada K68 RRK (40kD, PEG2) (PEG-RRK) para disminuir los niveles de Abeta soluble, se trataron de forma repetitiva ratones B6.152H de 9-10 meses de edad (ratones dobles transgénicos que expresan los mutantes humanos APP y PS2) con una carga pesada de placas amiloides, con una inyección s.c, dos veces por semana, de 5 µg/ kg de PEG-RRK. Se detectaron los niveles de APP cortical, Abeta y Actina tras 14 días. La proporción de APP/actina no cambió significativamente con PEG-RRK (Fig. 4A) sugiriendo que el PEG-RRK no tiene efecto en la expresión del transgén tras 14 días. Por el contrario, las proporciones Abeta/Actina (Fig. 4B) y Abeta/APP (Fig. 4C) disminuyeron de forma significativa gracias a PEG-RRK. Esto indica un efecto positivo de PEG-RRK sobre el aclaramiento de Abeta, independiente de su producción por el transgén. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Método para la producción de un IGF-I o una variante de IGF-I PEGilado en la lisina, y la variante comprende uno o dos aminoácido ( s ) seleccionados del grupo que consiste en lisina 27, 65 y/o 68, que están sustituidos independientemente por otro aminoácido polar, caracterizado porque: a) cultivar una célula huésped procariota que comprende un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica una proteina de fusión que comprende el IGF-I o variante de IGF-I unida por el extremo N-terminal al C- terminal de un propéptido, b) en el que el propéptido finaliza en el extremo C-terminal con los aminoácidos -Y-Pro, en el que Y se selecciona del grupo que consiste en Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro, c) recuperar y PEGilar la proteina de fusión, d) escindir la proteina de fusión PEGilada con la proteasa IgA, y e) recuperar el IGF-I PEGilado o variante de IGF-I. 2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el propéptido se muestra mediante la fórmula
  2. Met-Xi-Hisn-X2-Y-Pro-, en la que • Met indica metionina • Xi es un enlace, serina o asparagina • His es histidina, • N es un número de 0 a 10, • X2 es un péptido enlazante, seleccionado de entre el grupo que consiste en los péptidos SEQ ID No . ° : 6-10, • Pro es prolina, y • Y se selecciona del grupo que consiste en Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro o Pro- Arg-Pro .
  3. 3. Método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el propéptido no comprende un residuo de lisina.
  4. 4. Método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el/lo (s) aminoácido ( s ) polar (es) es/son independientemente arginina, glutamina o asparagina.
  5. 5. Método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la variante de IGF-I PEGilada en la lisina está mono- o diPEGilada en el (los) residuo (s) de lisina 65 y 68.
  6. 6. Método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la variante de IGF-I PEGilada en la lisina es RRK y la variante está monoPEGilada en el residuo de lisina 68 o la variante de IGF-I PEGilado en la lisina es RKR y la variante está monoPEGilada en el residuo de lisina 65.
  7. 7. Método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la variante de IGF-I PEGilada en la lisina es RKK y la variante está mono- o diPEGilada en los residuos de lisina 65 y 68.
  8. 8. Método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la variante de IGF-I PEGilada en la lisina es una mezcla de RRK, RKR o RKK y la variante está mono- o diPEGilada en el (los) residuo (s) de lisina 65 y 68.
  9. 9. Método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el IGF-I PEGilado en la lisina está aleatoriamente mono- o diPEGilado.
  10. 10. Método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el PEG presenta un peso molecular total de alrededor de 20 a 100 kDa.
  11. 11. Método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el (los) grupo (s) polietilenglicol es (son) grupo(s) polietilenglicol ramificado (s) .
  12. 12. Prote na de fusión que comprende un IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina, y la variante comprende uno o dos aminoácido (s) seleccionados de entre el grupo que consiste en lisina 27, 65 y/o 68, y están sustituidos independientemente por otro aminoácido polar, unido del extremo N-terminal al C-terminal de un propéptido, caracterizada porque el propéptido finaliza en C-terminal con los aminoácidos -Y-Pro, en el que Y se selecciona del grupo que consiste en Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro.
  13. 13. Proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el propéptido posee una longitud de hasta 30 aminoácidos.
  14. 14. Proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 12 o 13, caracterizada porque tiene la fórmula Met-Xi-Hisn-X2-Y-Pro- [IGF-I o variante de IGF-I], en la que IGF-I indica IGF-I humano y variante de IGF-I indica IGF-I, en el que uno o dos aminoácidos seleccionados de entre el grupo que consiste en lisina 27, 65 y/o 68 están sustituidos independientemente por otro aminoácido polar, • Met indica metionina, • Xi es un enlace, serina o asparagina , • His es histidina, · n es un número de 0 a 10, • X2 es un péptido enlazante, seleccionado de entre el grupo, que consiste en los péptidos SEQ ID No.2: 6-10, • Pro es prolina, y • Y se selecciona del grupo que consiste en Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro .
  15. 15. El IGF-I PEGilado en la lisina, caracterizado porque no comprende una metionina N-terminal.
  16. 16. La variante de IGF-I PEGilado en la lisina, en el que uno o dos aminoácidos seleccionados de entre el grupo que consiste en lisina 27, 65 y/o 68 están sustituidos independientemente por otro aminoácido polar, caracterizada porque la variante no comprende una metionina N-terminal.
  17. 17. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende un IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina de conformidad con las reivindicaciones 15 o 16.
  18. 18. Uso de un IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina de conformidad con las reivindicación 15 o 16 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA) .
  19. 19. Método para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA) , caracterizado porque se administra una cantidad farmacéuticamente efectiva de IGF-I o variante de IGF-I PEGilado en la lisina de conformidad con la reivindicación 15 o 16 a un paciente que necesite el tratamiento .
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