MX2009001477A

MX2009001477A - Metodo de produccion de un aviar transgenico utilizando celulas progenitoras embrionicas.

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Publication number: MX2009001477A
Application number: MX2009001477A
Authority: MX
Inventors: Majid Mehtali; Isabelle Valarche; Luc Batard
Original assignee: Vivalis
Priority date: 2006-08-09
Filing date: 2007-08-09
Publication date: 2009-02-18
Also published as: RU2473688C2; KR101567095B1; BRPI0714257A8; US20150225695A1; EP2500417A1; US20100235937A1; AU2007283564A1; CN101506354A; CN101506354B; NZ574678A; US8962311B2; BRPI0714257A2; CA2660035A1; AU2007283564B2; JP2010500015A; RU2009107854A; EP2054507A1; KR20090038464A; WO2008017704A1; JP5405302B2

Abstract

La presente invención se relaciona con un método para cultivar células progenitoras embriónicas (ES) de un aviar, que comprende los pasos de: a) suspender las células ES que se originan del disco del blastodermo de huevos aviares fertilizados no incubados en un medio de cultivo basal suplementado con: factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) y factor neurotrófico ciliar (CNTF); y suero animal; y opcionalmente, al menos uno de los factores de crecimiento seleccionados del grupo que comprende interleucina 6 (IL-6), receptor de la interleucina 6 (IL-6R), factor de las células progenitoras (SCF), factor de crecimiento del fibroblasto (FGF), factor inhibidor de la leucemia (LIF), interleucina 11 (IL-11), oncostatina y cardiotrofina; b) sembrar la suspensión de las células ES obtenida en el paso a) en una capa de células alimentadoras y cultivar además las células ES durante al menos entre 2 a 10 pasajes; c) retirar opcionalmente al menos uno de los factores de crecimiento seleccionados SCF, FGF, IL-6, IL-6R, LIF, oncostatina y cardiotrofina e IL-11 del medio de cultivo; d) cultivar además, las células ES en el medio del paso c) en una capa de células alimentadoras.

Description

METODO DE PRODUCCION DE UN AVIAR TRANSGENICO UTILIZANDO CELULAS PROGEN1TORAS EMBRIONICAS La presente invención se relaciona con la biotecnología aviar, y en particular, con un método para producir aves transgénicas. La invención es particularmente útil para generar aves transgénicas que expresan una alta cantidad de una proteína recombinante de interés en el huevo. Con más 400 biomoléculas en desarrollo clínico y un mercado de más de 30 mil miiiones de dólares, el campo terapéutico ha sido testigo de un crecimiento acelerado en los últimos quince años. La mayoría de las proteínas recombinantes requieren modificaciones postraduccionales específicas para las actividades biológicas completas y, por lo tanto, deben producirse en células de mamífero que crecen en biorreactores a gran escala. El costo asociado con tal sistema de producción, combinado con las necesidades cuantitativas importantes, es responsable de retrasos que se incrementan en todo el procedimiento del desarrollo del producto. En este contexto, los animales transgénicos representarían una alternativa económicamente atractiva, especialmente si la modificación pudiera transmitirse a la progenie a través de la línea germinal. Aunque los conejos, cabras y vacas han provocado mucho interés, la gallina se ha considerado durante mucho tiempo como el sistema de producción biológico más atractivo para la producción rápida y efectiva en costo de proteínas terapéuticas recombinantes en huevos de pollo. Las capacidades para poner huevos de ios polios son en realidad notables, puesto que una gallina comercial pone aproximadamente 250 huevos al año, cada huevo contiene casi 4 gramos de proteínas de la clara del huevo. Si únicamente 100 mg de las proteínas recombinantes se produjeran en un huevo, una pequeña bandada de 1000 gallinas sería, por lo tanto, capaz de producir 25 kg de material de proteínas recombinantes sin tratar cada año. Además, la industria comercial de los huevos ya está altamente automatizada, y las agencias reguladoras no tienen problemas con los productos derivados de huevo, puesto que muchas vacunas humanas se producen en los huevos de polio desde hace décadas. De igual manera, la industria de los aves de corral también puede tener interés en el uso de la transgénesis para la selección acelerada de los rasgos genéticos de interés comercial (es decir, "tecnología de metaclonación"). La idea sería evitar el esquema de selección clásico: [Pedigrí ? GGP ? GP ? PS], para obtener en un tiempo más corto el polluelo deseado. El uso más probable de la tecnología transgénica en la producción de aves de corral sería impartir resistencia a las enfermedades, que es una práctica común en las plantas transgénicas, o mejorar la asimilación del alimento. Además, ¡a íecnoiogía transgénica podría ser una estrategia para conservar los recursos genéticos aviares. Hasta ahora, la división en diferentes lugares de animales con pedigrí, los animales más valiosos en la industria de las aves de corral, es la única manera para evitar la pérdida de años de programas de selección en caso de problemas (por ejemplo, infecciones virales), en una instalación de reproducción. Tal enfoque es caro y no garantiza contra las decisiones sanitarias nacionales que obligan a la eliminación preventiva de todas las aves de corral locales para verificar la infección viral, como en los Países Bajos en 2003. El diseño de un animal modificado implica primer la introducción estable del transgen en el genoma del animal. Las diferentes tecnologías para introducir el ADN, investigadas desde hace 25 años son: (i) la microinyección de ADN, (¡i) la transducción viral, (iii) la transferencia del gen mediada por el esperma, (iv) la transferencia nuclear, la transferencia basada en las células utilizando (v) células germinales primordiales, o (vi) células progenitoras embriónicas. En el polluelo, únicamente el procedimiento de microinyección de ADN (Love et al, 1994 Biotechnology 12:60-63) y la transducción viral (Bosselman et al, 1990 J. Reprod. Fértil. Supl. 41 : 183-195), se han validado para la transmisión de la línea germinal del transgen. Sin embargo, estas dos tecnologías sufren de varias limitaciones; son problemáticas y laboriosas y tienen una baja eficiencia, parcialmente debido a la integración aleatoria y al silenciamiento del transgen. La tecnología de la transducción viral tiene la limitación adicional del tamaño del transgen a ser incorporado en ei vector viral. Estas dos tecnologías no permiten hasta ¡a fecha, alcanzar un nivel de expresión de la proteína compatible con los desarrollos comerciales. La inyección en el embrión del polluelo en desarrollo de las células germinales primordiales (PGC) o las células Progenitoras Embriónicas (ES), previamente diseñadas genéticamente in vitro, están entre las tecnologías promisorias de la transgénesis aviar, especialmente debido a que estas tecnologías permiten dirigir la integración del transgen a los sitios específicos dentro del genoma, lo cual debería permitir altos niveles de expresión del transgen. Sin embargo, con el fin de utilizar este procedimiento para producir polluelos transgénicos, un prerrequisito importante debe cumplirse: las células deben sobrevivir a las manipulaciones in vitro, mientras que mantienen todavía su capacidad para incorporarse dentro de un embrión receptor, para colonizar la línea germinal y a continuación transmitir las modificaciones a la progenie. En el pasado, se hicieron muchos intentos para superar los diferentes obstáculos técnicos en cada uno de los pasos del procedimiento y en la actualidad, las quimeras somáticas y de la línea germinal se han obtenido mediante la inyección de células del blastodermo aisladas recientemente, aisladas de embriones no incubados en la cavidad subgerminal de embriones puestos recientemente. La contribución de las células del donador y el receptor se valoró en (i) la población del melanocito a través del examen de la pigmentación negra y blanca (los pollos Barred Rock o Leghorn Marrones tienen un aleio recesivo en ei sitio i, mientras que los Leghorn Blancos tienen un alelo dominante en el sitio I); (ii) la población de eritrocitos a través del análisis de la huella del ADN; (iii) las gónadas a través del análisis de la progenie con un fenotipo derivado del donador (Petitte et al, 1990 Development 108:185-189; Carsience et al, 1993 Development 117:669-675; Thoraval et al, 1994 Poultry Science 73:1897-1905; Pain et al, 1996 Development 122:2339-2348). Una quimera con contribuciones para los tejidos somáticos y la línea germinal se observó cuando las células del blastodermo se inyectaron después de 48 horas (Etches et al, 1996 Mol. Reprod. Dev. 45:291-288) hasta 7 días de cultivo (Pain et al, 1996). Etches et al, 1996, han demostrado que se observaron significativamente más quimeras somáticas después de la inyección de las células cocultivadas con fibroblastos de ratón. Pain et al (1996), sembraron células de blastodermo aviar en una línea celular del fibroblasto de ratón STO. El estado ES de las células mantenidas en cultivo, se basó en la expresión de los epitopos ECMA-7 y SSEA-1 y la actividad de la telomerasa (Pain et al, 1996). La proliferación en la ausencia de diferenciación de las células del blastodermo se estimuló por la presencia del Factor Inhibidor de la Leucemia (LIF) y otros factores, IL-11 , SCF, bFGF, IGF-1 y la diferenciación se inhibió por la exposición de un anticuerpo monoclonal antiácido retinoico (Pain et al, 1996). Se ha mostrado que la colonización del embrión por las células derivadas del donador se facilitó cuando el embrión receptor se comprometió mediante la exposición a radiación antes de la inyección de las células del donador (Carsience et al, 993). Sin embargo, las células del blastodermo mantenidas en cultivo proporcionaron menos quimeras que exhiben contribuciones reducidas a los tejidos somáticos, en comparación con la frecuencia y grado de quimerismo somático observado después de la inyección de células preparadas recientemente. Además, incluso si se demuestra que cada una de las partes componentes de la estrategia de la transgénesis aviar basada en las células pudo lograrse; ningún animal transgénico se ha descrito, que se obtuviera con la tecnología de las células ES. Persiste una necesidad de métodos eficientes para generar pollos transgénicos. Este es el objeto de la presente invención. Para alcanzar este objeto y de acuerdo con el propósito de la invención, como se incorpora y describe ampliamente en la presente, la presente invención proporciona un método para cultivar células progenitoras embriónicas (ES) de aviar, que comprende los pasos de: a) suspender las células ES que se originan del disco del blastodermo de huevos aviares fertilizados, de manera preferida no incubados, en un medio de cultivo basal suplementado con: factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF- ) y/o factor neurotrófico ciliar (CNTF); y opcionalmente, al menos uno de los factores de crecimiento seleccionados del grupo que comprende interleucina 6 (IL-6), receptor de la interleucina 6 (1L-6R), factor de las células progenitoras (SCF), factor de crecimiento del fibroblasto (FGF), factor inhibidor de ia leucemia (LIF), interleucina 11 (IL-11), oncostatina y cardiotrofina; y suero animal; b) sembrar la suspensión de las células ES obtenida en el paso a) en una capa de células alimentadoras y cultivar además las células ES durante al menos entre 2 a 10 pasajes, de manera preferida entre 2 a 20 pasajes; c) retirar opcionalmente al menos uno de los factores de crecimiento seleccionados SCF, FGF, IL-6, IL-6R, LIF, oncostatina, cardiotrofina e IL-11 del medio de cultivo; d) cultivar además las células ES en el medio del paso c) en una capa de células alimentadoras. En una modalidad preferida, el método para cultivar las células progenitoras embriónicas (ES) de un aviar de la invención, comprende los pasos de: a) suspender las células ES que se originan del disco del blastodermo de huevos aviares fertilizados, de manera preferida no incubados en un medio de cultivo basal suplementado con el factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF- ), factor neurotrófico ciliar (CNTF), interleucina 6 (IL-6), receptor de la interleucina 6 (IL-6R), factor de las células progenitoras (SCF) y el factor de crecimiento del fibroblasto (FGF) y suero animal; b) sembrar la suspensión de las células ES obtenida en el paso a) en una capa de células alimentadoras y cultivar además las células ES durante a! menos entre 2 a 10 pasajes, de manera preferida entre 2 a 20 pasajes; c) opcionalmente, retirar al menos un factor de crecimiento seleccionado del grupo que comprende SCF, FGF, IL-6 e IL-6R del medio de cultivo, y de manera preferida, retirar los factores de crecimiento SCF, FGF, IL-6 e IL-6R del medio de cultivo; d) cultivar además las células ES en el medio del paso c) en una capa de células alimentadoras. En otra modalidad preferida, el método para cultivar las células progenitoras embriónicas (ES) de un aviar de la invención, comprende los pasos de: a) suspender las células ES que se originan del disco del blastodermo de huevos aviares fertilizados, de manera preferida no incubados en un medio de cultivo basal suplementado con el factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1 ), factor neurotrófico ciliar (CNTF), interleucina 6 (IL-6), receptor de la interleucina 6 (IL-6R), factor de las células progenitoras (SCF), factor de crecimiento del fibroblasto (FGF) y suero animal; b) sembrar la suspensión de las células ES obtenida en el paso a) en una capa de células alimentadoras y cultivar además las células ES durante al menos entre 2 a 10 pasajes; c) opcionalmente, retirar al menos un factor de crecimiento seleccionado del grupo que comprende SCF y FGF del medio de cultivo; y de manera preferida retirar ambos factores de crecimiento SCF y FGF dei medio de cultivo; d) cultivar además las células ES en el medio del paso c) en una capa de células alimentadoras.

El paso opcional c) del método de la invención se realiza cuando se observan signos de mortalidad y/o diferenciación de las células ES en el cultivo. Los ejemplos de un signo de diferenciación son, por ejemplo, cambios morfológicos de las células a un tipo morfológico característico, tal como, por ejemplo, un tipo de célula epitelial o tipo de célula de fibroblasto. Otro ejemplo de diferenciación puede ser la ausencia o la disminución de la expresión de los marcadores de las células ES, tales como la telomerasa, fosfatasa alcalina, antígeno SSEA-1 , que son marcadores de las células ES. En una modalidad más preferida, el método para cultivar las células progenitoras embriónicas (ES) de aviar de la invención comprende los pasos de: a) suspender las células ES que se originan del disco del blastodermo de huevos aviares fertilizados, de manera preferida no incubados, en un medio de cultivo basal suplementado con al menos un factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), factor neurotrófico ciliar (CNTF), interleucina 6 (IL-6), receptor de la interleucina 6 (IL-6R), factor de las células progenitoras (SCF), factor de crecimiento del fibroblasto (FGF) y suero animal; b) sembrar la suspensión de las células ES obtenida en el paso a) en una capa de células aiimentadoras y cuiíivar además ias células ES en el medio del paso a). En otra modalidad más preferida, el método para cultivar las células progenitoras embriónicas (ES) de aviar, de la invención comprende los pasos de: a) suspender las células ES que se originan del disco del blastodermo de huevos aviares fertilizados no incubados en un medio de cultivo basal suplementado con al menos un factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1 ), factor neurotrófico ciliar (CNTF), interleucina 6 (IL-6), receptor de la interleucina 6 (IL-6R) y suero animal; b) sembrar la suspensión de las células ES obtenida en el paso a) en una capa de células alimentadoras y cultivar además las células ES en el medio del paso a). En otra modalidad más preferida, el método para cultivar las células progenitoras embriónicas (ES) de aviar, de la invención comprende los pasos de: a) suspender las células ES que se originan del disco del blastodermo de huevos aviares fertilizados no incubados en un medio de cultivo basal suplementado con al menos un factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF- ), factor neurotrófico ciliar (CNTF) y suero animal; b) sembrar la suspensión de las células ES obtenida en el paso a) en una capa de células alimentadoras y cultivar además las células ES en el medio del paso a). El término "aviar" como se uíiüza en ia presente, pretende referirse a cualquier especie, subespecie o raza de organismos de la clase taxonómica "ava" tal como, de manera no exclusiva, pollos, pavos, patos, gansos, codornices, faisanes, pericos, pinzones, halcones, cuervos, avestruces, emúes y casuarios. El término "aviar" "ave", "aves" o "ava" como se utilizan en la presente, pretenden tener el mismo significado, y se utilizará de manera indistinta. En una modalidad preferida, "aves", se refiere a cualquier animal del orden taxonómico: "Anseriformes" (es decir, pato, ganso, cisne y aliados). El orden Anseriformes contiene aproximadamente 150 especies de pájaros en tres familias: la Anhimidae (las palamedeas), Anseranatidae (el ganso urraca), y la Anatidae, que incluye más de 140 especies de aves acuáticas, entre ellos los patos, gansos y cisnes. Todas las especies en el orden están altamente adaptadas para la existencia acuática en la superficie del agua. Todas tienen patas palmeadas para un nadado eficiente (aunque algunas se han vuelto posteriormente principalmente terrestres). El término incluye las varias razas de patos, por ejemplo, el pato pequinés y el pato muscovita. "Galliformes" (es decir pollos, codornices, pavo, faisanes y aliados). Los Galliformes es un orden de aves que contienen los pollos, pavos, codornices y faisanes. Aproximadamente 256 especies se encuentran en todo el mundo. El término incluye las varias razas de Gallus gallus o pollos, por ejemplo S86N, Valo, Leghorn Blanco, Leghorn Marrón, Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Ausstralorp, Minorca, Amrox, California Gray, East Lansing, coloreado como la perdiz italiana, Marans, Barred Rock, Cou Nu Rouge (CNR), GF30, ISA así como razas de pavos, faisanes, codornices y otras aves de corral criadas comúnmente. "Columbiformes" (es decir, Pichones y aliados). El orden de aves Columbiformes, incluye las muy extendidas palomas y pichones.

En una modalidad preferida, la célula aviar de la presente invención es una célula de pollo. El pollo se selecciona de manera preferida del grupo de razas de pollo que comprenden S86N, Valo, Leghorn Blanco, Leghorn Marrón, Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Ausstralorp, Minorca, Amrox, California Gray, East Lansing, coloreado como la perdiz italiana, Marans, Barred Rock, Cou Nu Rouge (CNR), GF30, ISA. En una modalidad más preferida, la célula ES de pollo de la presente invención es una de raza Barred-Rock. En otra modalidad preferida, la célula aviar de la presente invención es una célula de pato. En una modalidad más preferida, la célula ES de pato de la presente invención es de la raza pequinesa o muscovita. Las células del paso a) son células progenitoras embriónicas. Las células progenitoras embriónicas (células ES) son células progenitoras que tienen el rasgo característico de ser obtenidas de partes cultivadas o todo de un embrión muy inicial (por ejemplo, etapa de blástula). Estas células ES exhiben in vitro todas las características de una célula progenitora, e in vivo la capacidad única de contribuir a la morfogénesis de un embrión y de participar en la colonización de la línea germinal cuando se reimplantan de cualquier manera en un embrión receptor. Las Céiuias Germinales Primordiales (PGC) que son las progenitoras de las células del esperma o del ovocito que se desarrollan después de la madurez sexual son células ES pluripotentes y constituyen un subtipo de las células ES. De manera preferida, las células progenitoras embriónicas aviares de la invención se aislan del disco del blastodermo de huevos aviares fertilizados en la etapa de desarrollo que comprende entre las etapas VI y XII de la clasificación de Eyal-Giladi & Kochav, y de manera más preferida, alrededor de la etapa X de la clasificación de Eyal-Giladi & Kochav (véase la clasificación de EYAL-GILADI: EYAL-GILADI y KOCHAV, 1976, "From cleavage to primitive streack formation: a complementary normal table and a new look at the first stages of the development ¡n the chick". "General Morphology" Dev. Biol. 49: 321-337). En una modalidad preferida, las células del paso a) se aislan de huevos fertilizados puestos recientemente, es decir, una etapa de desarrollo denominada oviposición. De acuerdo con Sellier et al. (2006, J. Appl. Poult. Res., 15:219-228), la oviposición corresponde a las siguientes etapas de desarrollo de acuerdo con la clasificación de Eyal-Giladi: Pato muscovita: etapa VII Gallina de Guinea: etapa Vil -VIII - Pavo: etapa VI l-VI II Pato pequinés: etapa VIII Pollo: etapa X Codorniz japonesa: etapa XI Ganso: etapa Xi. De manera preferida, las células progenitoras embriónicas (ES) del pato pequinés del paso a), se obtienen disociando al embrión aproximadamente en la etapa VIII (oviposición) de la clasificación de Eyal-Giladi.

De manera preferida, las células progenitoras embriónicas (ES) del pato muscovita del paso a) se obtienen disociando el embrión aproximadamente en la etapa Vii (oviposición) de ia clasificación de Eyal-Giladi. De manera preferida, las células progenitoras embriónicas (ES) de pollo del paso a), se obtienen disociando el embrión aproximadamente en la etapa X (oviposición) de la clasificación de Eyal-Giladi. De manera más preferida, los huevos nunca se han incubado (es decir "no incubados"). Las células aisladas del disco del blastodermo comprenden células embriónicas aviares, más particularmente, células progenitoras embriónicas (ES) aviares; estas células embriónicas aviares son células totipotentes o pluripotentes. Las células del blastodermo son células estrechamente conectadas que crecen como colonias; muestran una morfología de forma redonda, con un núcleo grande y un citoplasma pequeño (véanse las Figuras 2A-2C). La morfología de las células del blastodermo evoluciona durante el cultivo (pasos b y c de las Figuras 2A-2C del método de la invención) de las células estrechamente conectadas a células más dispersas con conexiones más sueltas. Las células ES aviares obtenidas en el paso c) muestran de manera preferida conexiones más sueltas. De acuerdo con otra modalidad, las células del paso a) son una población de células progenitoras embriónicas enriquecidas en células germinales primordiales (PGC). De manera más preferida, las células ES aviares del paso a) son PGC purificadas. En las especies aviares, las células Germinales Primordiales surgen de la región central del blastodermo (Ginsburg y Eyal-Giladi, 1987 Development 101 (2):209-19; Karagenc et al, 1996 Dev Genet 19(4):290-301; Petitte et al, 1997 Poult Sci. 76(8): 1084-92). A continuación se mueven a un sitio extraembriónico anterior, la media luna germinal hasta que se recolectan por la vasculatura entre 2.5 y 5 días del desarrollo embriónico, para alcanzar la protuberancia germinal. Colonizan la protuberancia germinal, en donde se diferencian finalmente en oocitos o espermatocitos (Nieuwkoop y Sutasurya, 1979. The Migration of the primordial germ cells. En: Primordial germ cell in Chordates. Londres: Cambridge University Press p. 113-127). Los métodos para el aislamiento de las PGC de un embrión aviar donador se han reportado en la literatura, y pueden realizarse fácilmente por alguien con experiencia en la técnica (Véase, por ejemplo, la JP924997, publicada en Septiembre 7, de 1993, Publicación N° 05-227947; Chang et al. 1992. Cell Biol. Int. 19(2): 143-149; Naito et al. 1994, Mol. Reprod. Dev. 39: 153-161 ; Yasuda et al. 1992. J. Reprod. Fert. 96: 521-528; Chang et al. 1992, Cell Biol. Int. Repórter 16(9): 853-857). De acuerdo con una modalidad, las PGC se recolectan de la sangre embriónica recolectada de la aorta dorsal de un embrión de pollo en la etapa 12-14 de la clasificación de Hamburger & Hamiiíon (Hamburger & Hamilton 1951 A series of normal stages in the development of chick embryo. J. Morphol. 88: 49-92). En otra modalidad preferida, las PGC se recolectan de la protuberancia germinal mediante la disección mecánica del embrión de pollo o las gónadas.

Sin embargo, como se discutió anteriormente, otros métodos para aislar las PGC son conocidos y pueden utilizarse de manera alterna. Por "medio de cultivo completo", se quiere decir un medio basal, de manera preferida, un medio sintético basal, suplementado con al menos un factor de crecimiento y suero animal. Un ejemplo de un medio de cultivo completo se describe en la WO03/076601 , WO05/007840, EP787180, US6.114,168, US5,340,740, US6,656,479, US5, 830,510 y en Pain et al. (1996, Development 122:2339-2348). De acuerdo con la invención, "medio basal" significa un medio con una formulación de medio clásico que permite, por si mismo, al menos la supervivencia de las células, y aún mejor, el crecimiento de las células. Los ejemplos de un medio basal son BME (Medio basal de Eagle), MEM (medio mínimo de Eagle), medio 199, DMEM (Medio de Eagle modificado por Dulbecco), GMEM (medio de Eagle modificado por Glasgow), DMEM-HamF12, Ham-F12 y Ham-F10, medio de Dulbecco Modificado con Iscove, medio 5A de MacCoy, RPMI 1640. El medio basal comprende sales inorgánicas (por ejemplo: CaCI2, KCI, NaCI, NaHC03, NaH2P04, MgS04l...), aminoácidos, vitaminas (tiamina, riboflavina, ácido fólico, pantotenato de D-Ca,...) y otros componentes tales como glucosa, beta-mercapto-etanol, piruvaío de sodio. De manera preferida, ei medio basal es un medio sintético. El medio basal más preferido de la Invención es DMEM-HamF12 que está complementado con L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales al 1%, beta-mercapto-etanol 0.16 mM.

De manera alterna, el medio de cultivo completo es un medio acondicionado, de manera preferida medio acondicionado BRL. A manera de ejemplo, el medio acondicionado BRL se prepara de acuerdo con las técnicas reconocidas en el campo, tales como se describe por Smith y Hooper (1987, Dev. Biol. 121 : 1-9). Las células de BRL están disponibles del número de acceso de la ATCC CRL-1442. El medio acondicionado puede suplementarse con factores de crecimiento exógenos como se describe a continuación. El término "factor de crecimiento" como se utiliza en la presente, significa un factor de crecimiento exógeno agregado al medio de cultivo, necesario para la supervivencia y el crecimiento de las células aviares en cultivo. Es posible distinguir de manera esquemática dos familias de los factores de crecimiento: las citocinas y los factores tróficos. Las citocinas son principalmente citocinas cuya acción es a través de un receptor que está asociado con la proteína gp130. Así, el factor inhibidor de la leucemia (LIF), la interleucina 11 , la interleucina 6, el receptor de la interleucina 6, el factor Neurotrófico Ciliar (CNTF), la oncostatina y la cardiotrofina tienen un modo de acción similar al reclutamiento al nivel del receptor de una cadena específica y la combinación de la última con la proteína gp130 en forma monomérica o algunas veces heterodimérica. Los factores tróficos son principalmente el Factor de las células Progenitoras (SCF), el factor 1 de Crecimiento de la Insulina (IGF-1) y el Factor de Crecimiento del Fibroblasto (FGF), de manera preferida, FGF básico (bFGF) o FGF humano (hFGF).

El medio de cultivo completo utilizado en el paso a) del procedimiento de la invención, comprende un medio basal, de manera preferida un medio sintético basal, y al menos una citocina, cuya acción es a través de un receptor que está asociado con la proteína gp130 y/o al menos uno de los factores tróficos. De manera preferida, el medio de cultivo completo de acuerdo con la invención, comprende el medio basal y al menos un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste del factor Inhibidor de la Leucemia (LIF), oncostatina, cardiotrofina, factor 1 de Crecimiento de la insulina (IGF-1), factor Neurotrófico Ciliar (CNTF), Interleucina 6 (IL-6), receptor de la interleucina 6 (IL-6R), Factor de las células Progenitoras (SCF), Factor de Crecimiento del Fibroblasto (FGF), interleucina 11 (IL-11). De acuerdo con una primera modalidad preferida, el medio de cultivo completo es un medio basal suplementado con suero animal y con al menos IGF-1 y CNTF. De acuerdo con una segunda modalidad preferida, el medio de cultivo completo es medio basal suplementado con suero animal y al menos IGF-1 , CNTF, IL-6 e IL-6R. De acuerdo con una tercera modalidad preferida, ei medio de cultivo completo es medio basal suplementado con suero animal y al menos IGF-1 , CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF. De acuerdo con otra modalidad, el medio de cultivo completo es un medio de cultivo acondicionado que comprende factores de crecimiento (es decir, expresados por las células BRL, por ejemplo), y suplementado opcionalmente con al menos uno de los factores de crecimiento exógenos seleccionados del grupo que comprende: factor Inhibidor de la Leucemia (LIF), factor 1 de Crecimiento de la Insulina (IGF- ), factor Neurotrófico Ciliar (CNTF), interleucina 6 (IL-6), receptor de la interleucina 6 (IL-6R), Factor de las células Progenitoras (SCF), Factor de Crecimiento del Fibroblasto (FGF), interleucina 11 (IL-11). La concentración de los factores de crecimiento IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF, IL-11 en el medio basal o en el medio de cultivo acondicionado, está comprendido entre aproximadamente 0.01 a 10 ng/ml, de manera preferida, 0.1 a 5 ng/ml, y de manera más preferida aproximadamente 1 ng/ml. Las células progenitoras embriónicas aviares de la invención se cultivan en una capa de células alimentadoras. Las células alimentadoras pueden ser células o líneas celulares cultivadas con el propósito de obtener células ES. De manera alterna, las células alimentadoras podrían sustituirse con una matriz extracelular más factores de crecimiento unidos. La matriz alimentadora por lo tanto, se referirá a las células alimentadoras o a la matriz extracelular. Una matriz alimentadora, como se utiliza en la presente, se construye de acuerdo con ios procedimientos conocidos en la técnica. Como se indicó anteriormente, se prefiere que la matriz alimentadora esté preacondicionada. Por el término "preacondicionada", se quiere decir que la matriz alimentadora se cultiva en la presencia de un medio durante un periodo de tiempo antes de depositar las células que se originan del disco del blastodermo de huevos aviares fertilizados, en contacto con la matriz alimentadora, por ejemplo, un tiempo suficiente para iniciar y establecer la producción de, por ejemplo, factores de crecimiento u otros factores por la matriz alimentadora; usualmente una matriz alimentadora se preacondiciona cultivando la matriz alimentadora por sí misma durante uno a dos días antes de depositar las células que se originan del disco del blastodermo de los huevos aviares fertilizados en contacto con la matriz alimentadora. Las células alimentadoras comprenden, de manera preferida, células de fibroblasto de ratón. Se prefieren los fibroblastos STO, pero los fibroblastos primarios también son adecuados. También, aunque la presente invención se ha descrito con respecto al uso de matrices alimentadoras de células de ratón, se contemplan las matrices alimentadoras que comprenden células de otras especies murinas (por ejemplo, rata); otras especies de mamífero (por ejemplo, especies de ungulados, bovinos, porcinos); o especies aviares (por ejemplo, Gallinácea, pollos, pavo, pato, ganso, codorniz, faisanes), también pueden utilizarse. En otra modalidad, las células alimentadoras de la invención, pueden transfectarse con vectores de expresión, permitiendo por ejemplo, la expresión constitutiva de los factores de crecimiento tales como el SCF aviar en células STO. Así, este "alimentador" produce ei factor en una forma que es soluble y/o está unida en la membrana del plasma de las células. Así, el procedimiento de cultivo de la presente invención puede comprender opcionalmente, establecer una monocapa de células alimentadoras. Las células alimentadoras son desactivadas mitóticamente utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, las células alimentadoras pueden exponerse a radiación X o gamma (por ejemplo, 4000 Rads de radiación gamma), o pueden tratarse con Mitomicina C (por ejemplo, 10 pg/ml durante 2-3 horas). Los procedimientos para inactivar mitóticamente las células también se detallan en la información enviada típicamente con las células de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 (por ejemplo, las células alimentadoras STO están disponibles bajo el número de acceso de la ATCC 1503). Las monocapas pueden, opcionalmente cultivarse a aproximadamente 80% de confluencia, de manera preferida a aproximadamente 90% de confluencia, y de manera más preferida aproximadamente 100% de confluencia. Aunque la configuración de las células alimentadoras como una monocapa es la configuración preferida para el cultivo, cualquier configuración adecuada está contemplada para estar dentro del alcance de la presente invención. Así, por ejemplo, las capas, monocapas, conglomerados, agregados u otras asociaciones o agrupamientos de células alimentadoras están contemplados para caer dentro del alcance de la presente invención, y están contemplados particularmente para caer dentro del significado del término "matriz". El medio de cultivo de la invención está suplementario con suero animal. El suero animal utilizado de manera preferida es suero animal fetal. Se prefiere el suero bovino fetal. También, aunque la presente invención se ha descrito con respecto al uso del suero bovino fetal, se contempla que también pueda utilizarse suero animal que comprenda suero de otras especies animales (por ejemplo, pollo, caballo, porcino, ungulado, etc...)- La concentración final del suero animal en el medio de cultivo comprende entre aproximadamente 1 a 25%, de manera preferida entre 5% a 20%, de manera más preferida entre 8% y 12%. En la modalidad preferida, la concentración final del suero animal en el medio de cultivo es de aproximadamente 10%. De acuerdo con una modalidad preferida, el medio de cultivo comprende aproximadamente 10% de suero de becerro fetal. El medio de cultivo de la invención puede comprender además, antibióticos, tales como por ejemplo, penicilina y estreptomicina, para evitar la contaminación bacteriana. De acuerdo con otra modalidad, la invención proporciona un método para modificar genéticamente las células progenitoras embriónicas aviares, que comprende los pasos de: a) transfectar las células ES obtenidas y cultivadas de acuerdo con el método anterior, con un vector; b) seleccionar las células ES transfectadas, de manera preferida mediante la adición de un agente de selección en el medio, tal como por ejemplo, antibióticos, aminoácidos, hormonas. c) seleccionar y amplificar las clonas ES resistentes modificadas genéticamente, d) cultivar las células ES modificadas genéticamente del paso c) en una capa de células alimentadoras en un medio de cultivo como se describió previamente. De acuerdo con una primera modalidad, el medio de cultivo del paso d) comprende suero animal y al menos un factor de crecimiento seleccionado del grupo que comprende IGF1 , CNTF, IL-6, IL-6R, IL-11 , LIF, FGF, SCF, oncostatina, cardiotrofina. De acuerdo con una modalidad preferida, el medio de cultivo del paso d) comprende suero animal e IGF1 y CNTF. De acuerdo con otra modalidad, el medio de cultivo del paso d) comprende suero animal e IGF1 y CNTF y opcionalmente, al menos un factor de crecimiento seleccionado del grupo que comprende IL-6, IL-6R, IL-1 1 , LIF, FGF, SCF, oncostatina y cardiotrofina. De acuerdo con una tercera modalidad preferida, el medio de cultivo del paso d) comprende suero animal e IGF1 , CNTF, IL-6 e IL-6R. De acuerdo con una cuarta modalidad preferida, el medio de cultivo del paso d) comprende suero animal e IGF1 , CNTF, IL-6, IL-6R, SCF y FGF. Las células ES del paso c) están modificadas genéticamente. La modificación genética se realiza mediante transfección transitoria o estable con el vector en las células ES. De acuerdo con una modalidad preferida, las ES son transfectadas de manera estable con el vector de acuerdo con técnicas bien conocidas por el experto en la técnica. De acuerdo con una primera modalidad, el vector se inserta de manera aleatoria en el genoma de las células ES. De acuerdo con una modalidad preferida, el vector se inserta mediante ia recombinación homóioga en el genoma de las céiuias ES. La WO03/043414, describe los protocolos y vectores de expresión para modificar genéticamente las células ES mediante la recombinación homologa. Las células ES del paso a) pueden mantenerse y cultivarse durante un largo periodo de tiempo in vitro, antes de su introducción en un embrión receptor. Este periodo de tiempo largo permite modificar genéticamente las células. De acuerdo con una modalidad preferida, las células se han cultivado in vitro durante al menos 5 días, al menos 10 días, al menos 14 días, al menos 25 días, al menos 50 días, al menos 75 días, al menos 00 días. El término "vector" como se utiliza en la presente, se refiere a un plásmido natural o sintético de una sola o doble hebra o a una molécula de ácido nucleico viral que puede transfectarse en las células y replicarse de manera independiente de, o dentro del genoma de la célula hospedera. Un plásmido de doble hebra circular puede linealizarse mediante el tratamiento con una enzima de restricción apropiada basándose en la secuencia nucleotídica del vector del plásmido. Un ácido nucleico puede insertarse en un vector cortando el vector con enzimas de restricción y ligando las piezas juntas. La molécula de ácido nucleico puede ser ARN o ADN. El término "plásmido" como se utiliza en la presente, se refiere a un vector de ADN circular pequeño capaz de la replicación independiente dentro de una célula hospedera bacteriana o de levadura. El vector del ácido nucleico incluye además al menos una secuencia reguladora enlazada de manera operable a una secuencia nucleotídica que codifica un "poiipéptido de interés". Las secuencias reguladoras están bien reconocidas en la técnica y pueden seleccionarse para asegurar una buena expresión de la secuencia nucleotídica enlazada sin experimentación indebida por aquellos con experiencia en la técnica. Como se utiliza en la presente, el término "secuencias reguladoras" incluye promotores, mejoradores y otros elementos que pueden controlar la expresión. Los libros de texto de biología molecular estándar tales como Sambrook et al. eds "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2a ed. Cold Spring Harbor Press (1989) y Lodish et al. eds., "Molecular Cell Biology", Freeman (2000), pueden consultarse para diseñar los vectores de expresión, los promotores y otros elementos de control de expresión adecuados. Deberá reconocerse, sin embargo, que la elección de un vector de expresión adecuado depende de múltiples factores, incluyendo la elección de la célula hospedera a ser transformada y/o el tipo de proteína a ser expresada. También útiles para varias aplicaciones, son los promotores selectivos del tejido (es decir, específicos de tejido), es decir, promotores de los cuales la expresión ocurre de manera preferida en células de una clase de tejido particular, en comparación con uno o más de otros tipos de tejido. Un promotor específico del tejido ejemplar es un promotor específico del oviducto de pollo, que está asociado naturalmente con las proteínas de las claras del huevo aviar, incluyendo ovoalbúmina, lisozima, ovomucoide, conalbúmina y ovomucina y lo similar. Los promotores útiles también incluyen promotores inducibles de manera exógena. Estos son promotores que pueden "activarse" en respuesta a un agente o estímuio suministrado de manera exógena, que generalmente no es un metabolito o citocina endógeno. Los ejemplos incluyen un promotor inducible por antibiótico, tal como un promotor inducible por tetraciclina, un promotor inducible por calor, un promotor inducible por la luz, o un promotor inducible por láser (por ejemplo,, Halloran et al., 2000, Development 127(9): 1953-1960; Gemer et al., 2000, Int. J. Hyperthermia 16(2): 171-81 ; Rang y Will, 2000, Nucleic Acids Res. 28(5): 11205; Hagihara et al., 1999, Cell Transplant. 8(4): 4314; Huang et al., 1999, Mol. Med. 5(2): 129-37; Forster, et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27(2): 708-10; y Liu et al., 1998, Biotechniques 24(4): 624-8, 630-2 (1998)). Como se utiliza en la presente, el término "polipéptido de interés" o "proteína de interés", se refiere a un polímero de aminoácidos de tres o más aminoácidos en un arreglo en serie, enlazados a través de enlaces peptídicos. El término "polipéptido" incluye proteínas, fragmentos de proteína, análogos de proteína, oligopéptidos, péptidos y lo similar. El término "polipéptido" contempla polipéptidos como se definió anteriormente, que están codificados por ácidos nucleicos, producidos a través de tecnología recombinante, aislados de una fuente apropiada o son sintetizados. Los ejemplos no limitantes de polipéptidos son hormonas del crecimiento, citocina, interleucina, interferón, enzimas, inmunoglobulinas o fragmentos de los mismos. Los términos "transfección" o "transfectado" como se utilizan en la presente, se refiere al procedimiento de insertar un ácido nucleico en una célula hospedera (es decir, la ES aviar). Muchas técnicas son bien conocidas por aquellos con experiencia en ia técnica, para facilitar la transfección de un ácido nucíeico en un organismo procariótico o eucariótico. Estos métodos involucran una variedad de técnicas incluyendo, de manera no exclusiva, tratar las células con altas concentraciones de sal, tal como, pero no únicamente, una sal de calcio o magnesio, un campo eléctrico (es decir, electroporación), un detergente o transfección mediada por un liposoma (es decir, lipofección, etc.), para volver a la célula hospedera competente para la captación de las moléculas de ácido nucleico. La invención también proporciona un método para obtener un poliuelo quimérico que comprende los pasos de: a) introducir células ES aviares obtenidas y cultivadas mediante el método de la invención en la cavidad subgerminal de un embrión aviar receptor; y b) incubar el embrión obtenido en el paso a) hasta salir del cascarón como un poliuelo; c) seleccionar el poliuelo quimérico que comprende las células heterólogas que han colonizado al poliuelo. El término "poliuelo" como se utiliza en la presente, significa un ave joven, e incluye un pollo joven. El término "cavidad subgerminal" significa el espacio entre el blastodermo y la yema. Este espacio es creado cuando las células del blastodermo absorben el fluido de la albúmina y lo secretan entre ellas mismas y la yema. También es un objeto de la invención proporcionar un método para obtener un poiiueio quimérico modificado genéticamente, que comprende los pasos de: a) introducir las ES modificadas genéticamente obtenidas y cultivadas mediante el método de la invención en la cavidad subgerminal de un embrión aviar receptor; y b) incubar el embrión obtenido en el paso a) hasta salir del cascarón como un polluelo; c) seleccionar el polluelo quimérico que comprende las células heterólogas modificadas genéticamente que han colonizado al polluelo. La selección del polluelo quimérico puede realizarse ya sea mediante un análisis fenotípico o genotípico. De acuerdo con una modalidad preferida, el polluelo quimérico se selecciona mediante el análisis fenotípico del plumaje. De acuerdo con otra modalidad, el método para obtener un polluelo quimérico de la invención puede comprender el paso adicional de determinar el sexo del embrión receptor antes de la introducción de las células ES. De acuerdo con otra modalidad, el embrión receptor se deriva de un huevo no incubado puesto recientemente, y comprende entre aproximadamente 5,000 a aproximadamente 70,000 células. De manera preferida, el embrión receptor está en una etapa comprendida entre las etapas VI y XII de la clasificación de Eyal-Giladi & Kochav, de manera preferida: alrededor de ¡a etapa X de ia clasificación de Eyai-Giiadi & Kochav, cuando el embrión es un pollo; alrededor de la etapa VII de la clasificación de Eyal-Giladi & Kochav, cuando el embrión es un pato muscovita; alrededor de la etapa VIII de la clasificación de Eyal-Giladi & Kochav, cuando el embrión es un pato pequinés; alrededor de la etapa XI de la clasificación de Eyal-Giladi & Kochav, cuando el embrión es una codorniz japonesa o un ganso; - alrededor de la etapa Vll-Vlli de la clasificación de Eyal- Giladi & Kochav, cuando el embrión es una gallina de Guinea o un pavo; De manera preferida, al menos 1000 células ES, al menos 10,000 células ES, al menos 15,000 células ES, al menos 30,000 ES, al menos 45,000 células ES, al menos 65,000 células ES, al menos 85,000 células ES o al menos 100,000 células ES se introducen en la cavidad subgerminal del embrión aviar receptor. De acuerdo con una modalidad preferida, al menos 30,000 células ES se introducen en la cavidad subgerminal del embrión aviar receptor. Las células ES introducidas en la cavidad subgerminal del embrión aviar receptor puede ser una población mezclada de células ES femeninas y masculinas. De acuerdo con otra modalidad, el embrión receptor y las células ES del donador se clasifican según el sexo previamente antes de la introducción. De acuerdo con una modalidad preferida, las células ES femeninas se introducen en la cavidad subgerminal de un embrión aviar receptor hembra. De acuerdo con otra modalidad preferida, las células ES masculinas se introducen en la cavidad subgerminal de un embrión aviar receptor macho.

El método para obtener el polluelo quimérico de la invención, comprende el paso opcional de irradiar ligeramente el embrión receptor con radiación X o gamma antes de la introducción de las células ES en la cavidad subgerminal del embrión receptor. De acuerdo con una modalidad preferida, el embrión receptor del pollo se irradia con entre 3 a 6 gray de rayos X, de manera preferida aproximadamente 4 gray de rayos X. De acuerdo con una modalidad preferida, alrededor de 15,000 células ES de pollo se introducen en la cavidad subgerminal del embrión de pollo receptor, irradiado previamente con rayos X con aproximadamente 4 gray. De acuerdo con otra modalidad preferida, al menos 30,000 células ES de pollo se introducen en la cavidad subgerminal del embrión de pollo receptor no irradiado. De acuerdo con una primera modalidad, el embrión de pollo receptor es de raza Leghorn Blanco, y las células ES de pollo del donador se derivan de una raza seleccionada del grupo compuesto de la raza barred rock, la raza Marans, la raza S86N. De acuerdo con una segunda modalidad, el embrión de pollo receptor es de una raza de pollo seleccionada del grupo que comprende la raza barred rock, la raza Marans y la raza S86N y las células ES del pollo donador se derivan de la raza Leghorn Blanco. La selección dei pollueio quimérico de ia invención que comprende las células heterólogas comprende los pasos de: a) obtener una muestra del material genético del polluelo quimérico; b) probar la presencia de un polimorfismo en una secuencia del virus de la leucosis aviar integrada en el genoma aviar, y en donde el polimorfismo es identificable mediante una amplificación por un conjunto de cebadores seleccionados del grupo que consiste del cebador hacia delante 5'-GGTGTAAATATCAAAATTATC-3' (SEQ ID N°1) y un cebador inverso 5'-CGGTTAAAATACGAATAGAGA-3' (SEQ ID N°2), y un conjunto de un cebador hacia delante 5'-CTATGAGCAGTTACGAGGGTC-3' (SEQ ID N°3) y un cebador inverso 5 -CGGACCAACAGGCTAGTCTC-3' (SEQ ID N°4). De acuerdo con una modalidad preferida, las células ES de pollo se derivan de la especie barred rock y el embrión receptor es de la especie Leghorn Blanco. La amplificación se realiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la PCR con transcriptasa inversa, y en donde el análisis comprende la digestión de ADN amplificado mediante PCR con la enzima de restricción Hincll. El método para identificar la presencia o ausencia de un polimorfismo se selecciona de un grupo que consiste de: análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción (RFLP), análisis heterodúplex, polimorfismo conformacional de una sola hebra (SSCP), eiectroforesis sobre gei con un gradiente desnaturalizante (DGGE), eiectroforesis sobre gel con gradiente de temperatura (TGGE), oligonucleótido específico del alelo (ASO), y huella de didesoxi (ddF). El paso de probar la presencia del polimorfismo comprende los pasos de: a) digerir el material genético con la enzima de restricción Hincll; b) separar los fragmentos obtenidos de la digestión; c) detectar el patrón de restricción generado por los fragmentos; y d) opcionalmente, comparar el patrón con al menos un patrón de restricción obtenido mediante la digestión del material genético de Leghorn Blanco, Marans, Barred Rock, S86N, utilizando la enzima de restricción Hincll, en donde la diferencia en los patrones de restricción detectados en las pasos c) y d) es indicativa de un polluelo quimérico que comprende las células heterólogas. La invención también incluye el método de obtener una progenie del polluelo quimérico, en donde el método comprende los siguientes pasos: a) permitir que el polluelo quimérico seleccionado obtenido mediante el método de la invención madure hasta un ave adulta; b) reproducir el ave adulta que tiene las células heterólogas en el mismo, produciendo por lo tanto una progenie del ave; y c) seleccionar las aves en la progenie que comprende las células heterólogas. La selección de las aves puede realizarse mediante ei análisis fenotípico del plumaje o, cuando es posible, mediante el análisis genotípico probando la presencia de un polimorfismo Hincll en una secuencia del virus de la leucosis aviar integrado en el genoma del ave.

El método puede comprender el paso adicional de expresar el polipéptido heterólogo codificado por el vector comprendido en las células heterólogas modificadas genéticamente. De manera preferida, el polipéptido heterólogo se suministra a los fluidos biológicos del ave, tal como la sangre, esperma, orina, o la clara de un huevo aviar en desarrollo producido por una hembra del ave modificada genéticamente. La presente invención también se relaciona con un medio de cultivo para las células progenitoras embriónicas (ES) aviares modificadas genética y no genéticamente, de manera preferida, células ES de pollo y pato, suplementadas con suero animal y que comprenden al menos un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste del factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), factor neurotrófico ciliar (CNTF), Interleucina 6 (IL-6), Interleucina 6 receptor (IL-6R), interleucina 1 1 , factor de las células Progenitoras (SCF), factor de crecimiento del fibroblasto (FGF), factor inhibidor de la leucemia (LIF), oncostatina y cardiotrofina, en donde el medio es suficiente para el mantenimiento de las células progenitoras embriónicas de pollo, en cultivo durante 10 días al menos, durante 30 días al menos, de manera preferida durante 100 días al menos y de manera más preferida durante un periodo infinito. De acuerdo con una modalidad preferida, la presente invención también se relaciona con un medio de cultivo basal para las células progenitoras embriónicas (ES) aviares modificadas genética o no genéticamente, de manera preferida células ES de pollo y de pato, suplementadas con suero animal y suplementadas con el factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) y el factor neurotrófico ciliar (CNTF). De acuerdo con una segunda modalidad preferida, ia presente invención se relaciona con un medio de cultivo basal para las células progenitoras embriónicas (ES) aviares modificadas genética o no genéticamente, de manera preferida células ES de pollo y de pato, suplementadas con suero animal y suplementadas con el factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), el factor neurotrófico ciliar (CNTF), Interleucina 6 (IL-6) y el receptor de la Interleucina 6 (IL-6R). De acuerdo con una tercera modalidad preferida, la presente invención se relaciona con un medio de cultivo basal para las células progenitoras embriónicas (ES) aviares modificadas genética o no genéticamente, de manera preferida células ES de pollo y de pato, suplementadas con suero animal y suplementadas con el factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), factor neurotrófico ciliar (CNTF), Interleucina 6 (IL-6), receptor de la Interleucina 6 (IL-6R), factor de las células Progenitoras (SCF), factor de crecimiento del Fibroblasto (FGF). El medio es suficiente para el mantenimiento de las células progenitoras embriónicas (ES) aviares, de manera preferida células ES de pollo y de pato en cultivo, durante al menos 7 días, durante al menos 14 días, durante al menos 30 días, durante al menos 50 días, y de manera preferida durante al menos 100 días.

El medio de cultivo de la invención puede comprender además opcionalmente, al menos un compuesto seleccionado del grupo que comprende lnterleucina- 1 , cardiotrofina, oncostatina y/o LIF. El medio de cultivo de la invención puede comprender además una capa (es decir, tamiz) de células alimentadoras. La invención también proporciona un método para el análisis del polimorfismo genético para distinguir entre la raza de pollo Leghorn Blanco de otra raza de pollos, en donde el método comprende los pasos de: a) obtener una muestra de material genético de la raza de pollos Leghorn Blancos, y una muestra del material genético de la otra raza de pollos; b) probar la presencia de un polimorfismo en una secuencia del virus de la leucosis aviar integrada en el genoma del pollo, y en donde el polimorfismo es identificable mediante la amplificación mediante un conjunto de cebadores seleccionados del grupo que consiste del conjunto de un cebador hacia delante 5'-GGTGTAAATATCAAAATTATC-3' (SEQ ID ??) y un cebador inverso 5'-CGGTTAAAATACGAATAGAGA-3' (SEQ ID N°2), y el conjunto de un cebador hacia delante 5'-CTATGAGCAGTTACGAGGGTC-3' (SEQ iD N°3) y un cebador inverso 5'-CGGACCAACAGGCTAGTCTC-3' (SEQ ID N°4). En el método del análisis del polimorfismo genético de acuerdo con la invención, la amplificación se realiza de manera preferida mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la PCR con transcriptasa inversa. El paso de probar la presencia del polimorfismo comprende los pasos de: a) digerir el ADN amplificado mediante PCR con la enzima de restricción Hincll; b) separar los fragmentos obtenidos de la digestión; c) detectar el patrón de la restricción generada por los fragmentos; y d) comparar el patrón obtenido mediante la digestión del material genético de Leghorn Blanco utilizando la enzima de restricción Hincll, y el patrón obtenido mediante la digestión del material genético de otra raza de pollos, en donde la presencia del sitio de restricción Hincll, es indicativo de la raza Leghorn Blanco, y la ausencia del sitio de restricción Hincll, es indicativa de que no es una raza Leghorn Blanco. El método para identificar la presencia o ausencia de un polimorfismo, se selecciona de un grupo que consiste de: análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción (RFLP), análisis heterodúplex, polimorfismo conformacional de una sola hebra (SSCP), eiectroforesis sobre gel con un gradiente desnaturalizante (DGGE), eiectroforesis sobre gel con gradiente de temperatura (TGGE), oiigonucieótido específico del alelo (ASO), y huella de didesoxi (ddF). Los ejemplos siguientes explican la invención con más detalle. Las siguientes preparaciones y ejemplos se proporcionan para permitir a aquellos con experiencia en la técnica, entender más claramente y practicar la presente invención. La presente invención, sin embargo, no está limitada en alcance por las modalidades ejemplificadas, que pretenden ser ilustraciones de los únicos aspectos de la invención solamente, y los métodos que son equivalentes funcionalmente, están dentro del alcance de la invención. En realidad, varias modificaciones de la invención, además de aquellas descritas en la presente, se volverán evidentes para aquellos con experiencia en la técnica, a partir de la descripción anterior y los dibujos acompañantes. Tales modificaciones pretenden caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Durante el resto de la descripción, se hará referencia a las leyendas de las figuras siguientes.

FIGURAS Figura 1 : cinética del cultivo celular de las células ES aviares Las células ES de pollo se cultivaron en una capa alimentadora de ratón en medio de cultivo suplementado con suero de becerro fetal al 0% y con IGF1 , CNTF, IL6, IL6R, SCF, FGF. El número de células se determinó en cada disociación. El número de células obtenidas en cada disociación se sumó para determinar el coeficiente acumulativo de proliferación. Figuras 2A-2C: Morfología de las células ES de pollo Morfologías de las células del blastodermo: (A) BR22p2 y (B) BR22p3: células con forma redonda con núcleos grandes y citoplasma pequeño. (C) BR29p12: células del blastodermo dispersas con conexiones más sueltas. Figuras 3A-3B: Expresión del marcador específico de la célula SSEA-1 La expresión de los marcadores específicos de las células ES, SSEA-1 , se probó en las células del blastodermo mantenidas in vitro durante un periodo de cuitivo diferente. Figura 3A: contraste de la fase. Figura 3B: tinción del anticuerpo. Figuras 4A-4C: Actividad de la fosfatasa alcalina de las células ES Actividad de la fosfatasa alcalina endógena de las células del blastodermo. Las células se tiñeron para la actividad de la fosfatasa alcalina durante un periodo de cultivo diferente. Figura 5: Evolución de la expresión de los marcadores de diferenciación VASA, THY1 , BRACHYURY mientras las células se mantienen en cultivo. Marcadores y cultivo. 1 : Médula ósea, 2: Embrión (cabeza); 3: Gónadas masculinas, 4: embrión (etapa X); 5: alimentadora (STO); 6: alimentadora (SN); 7: BR 4-5; 8: BR 4-6; 9: BR 5-2; 10: BR 8-7; 11 : BR 8-8; 12: BR 8-9; 13: BR 8-12; 14: V 9-19; 15: BR 15-0; 16: BR 15-1 ; 17: BR 15-2; 18: BR 15-3; 19: BR 15-5; 20: BR 15-6; 21 : BR 15-7; 22: BR 15-8; 23: BR 15-8; 24: BR 15-9; 25: BR 5- 0; 26: BR 15-11 ; 27: BR 18-2; 28: BR 18-3; 29: BR 18-4; 30: BR 18-5; 31 : BR 19-1 ; 32: BR 19-2; 33: BR 19-3; 34: BR 19-4; 35: BR 20-2; 36: BR 20-3; 37: S1 p20; 38: ADNg de Barred Rock; 39: agua; 40: agua. Expresión de los marcadores Vasa, Thy-1 y Brachuyry (T) durante un periodo de cultivo diferente. Marcador de control GAPDH. Las células se mantuvieron en cultivo durante varias semanas. Los gránulos de las células se congelaron en cada disociación. La extracción del ARN y la RT-PCR se realizaron de manera concomitante para cada una de los gránulos celulares. Figura 6: Análisis del perfil PCR RFLP de las razas de pollos donadora y receptora y de una quimera Perfil PCR RFLP de las razas de pollos donadora y receptora y de una quimera. 7 huevos embrionados puestos recientemente de las razas de pollos donadora y receptora se incubaron durante 5 días. El ADN se extrajo de los embriones totales. Quimera somática: los embriones inyectados con las células del donador se incubaron durante 18 días. El ADN se extrajo de la sangre, corazón, hígado, bazo y gónadas. Figura 7: Aves quiméricas Las células de pollo del donador se inyectaron en los embriones de pollo receptores. Los embriones receptores se incubaron hasta que salieron del cascarón. Las aves quiméricas se criaron hasta la adultez. Figuras 8A-8B: Progenie F1 y F2 8A: Ave F1 con una pigmentación del plumaje típica de Barred-Rock 8B: Aves F2 de gallina 5664-5665. Las gallinas se inseminaron con semen de gallos Barred Rock. Los huevos se incubaron hasta que el polluelo salió del cascarón. Figura 9: Morfología de las células ES de pato Las células ES de pato se cultivaron en una capa aiimentadora de ratón en medio de cultivo DMEM suplementado con suero de becerro fetal al 10% y con IGF1 , CNTF, IL6, IL6R, SCF, FGF.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Materiales y métodos Células del blastodermo Los embriones se recolectaron de huevos no incubados puestos recientemente. Un anillo de papel filtro estéril se colocó sobre el embrión con e! blastodisco en el centro de un área cortada. La membrana de la yema se cortó alrededor, afuera del disco. El disco se volteó y se transfirió a una caja de petri con PBS a temperatura ambiente. El exceso de yema se lavó cuidadosamente. Todo el blastodermo se retiró mediante aspiración suave con una pipeta Pasteur y se transfirió a PBS. Un promedio de 200 embriones se recolectaron juntos. Las células se centrifugaron dos veces a 300 g. El gránulo celular se disoció mecánicamente en el medio de cultivo. Las células en el medio de cultivo completo se sembraron en una capa alimentadora STO desactivada. Las células del blastodermo se mantuvieron a 39°C en CO2 al 7.5%. Las células se disociaron mediante incubación a 39°C en una solución de pronasa (5 a 2% en peso/volumen). Las células disociadas se sembraron en las células de una nueva capa alimentadora en el medio completo. Las células entre los pasajes 3 y 5 se sembraron en el medio mínimo, en una capa alimentadora STO.

Medio de cultivo El medio de cultivo completo estuvo compuesto de una base de DMEM-F12 suplementada con suero de becerro fetal al 10% (JRH), beta-mercaptoetanol 0.16 mM (SIGMA), aminoácidos no esenciales al 1 % (Biowhittaker), piruvato de sodio 1 mM (Biowhittaker), L-Glutamina 2 mM (Biowhittaker), 1 ng/ml de IGF1 (Tebu), 1 ng/ml de CNTF (Eurobio), 1 ng/ml de IL-6 (Eurobio), 1 ng/ml de IL-6R (Tebu), 1 ng/ml de SCF (Tebu), 1 ng/ml de bFGF (Peprotech), penistreptomicina al 1% (Biowhittaker). De manera alterna, el medio de cultivo completo estuvo compuesto de una base de DMEM-F 2 suplementada con suero de becerro fetal al 10% (JRH), b-mercaptoetanol 0.16 mM (SIGMA), aminoácidos no esenciales al 1% (Biowhittaker), piruvato de sodio 1 mM (Biowhittaker), L-Glutamina 2 mM (Biowhittaker), 1 ng/ml de IGF1 (Tebu), 1 ng/ml de CNTF (Eurobio), 1 ng/ml de IL-6 (Eurobio), 1 ng/ml de IL-6R (Tebu), penistreptomicina al 1% (Biowhittaker). De manera alterna, el medio de cultivo completo también puede estar compuesto de una base de DMEM-F12 suplementada con suero de becerro fetal al 10% (JRH), b-mercaptoetanol 0.16 mM (SIGMA), aminoácidos no esenciales al 1 % (Biowhittaker), piruvato de sodio 1 mM (Biowhittaker), L-Glutamina 2 mM (Biowhittaker), 1 ng/ml de IGF1 (Tebu), 1 ng/ml de CNTF (Eurobio), penistreptomicina al 1 % (Biowhittaker).

Preparación de las células alimentadoras La línea celular STO de fibroblasto de ratón (ATCC) se mantuvo a 37.5°C, C02 al 7.5% en DMEM (Cambrex) suplementado con suero de becerro fetal al 4% (JRH) y glutamina al 1 % (Biowhittaker). A la subconfluencia, las células STO se disociaron con pronasa (Roche) 1X, se lavaron con PBS y se irradiaron con una fuente gamma a 45 gray. Las células alimentadoras se sembraron de 1.5x106 a 2x106 células en medio fresco en recipientes de 00 mm.

Línea celular STO: pGPARa y pMEHCS fueron proporcionados por el Dr. Bertrand Pain. pCINeo se compró de Promega. El ADN del plásmido se preparó utilizando lisis alcalina y purificación con PEG. Para la transfección, las células se sembraron en la mañana a 0.5 x 106 células por recipiente de 100 mm. Se transfectaron en la tarde con 3.0 pg de pCINeo circular, 15 pg de pGPARa o pMEHCS utilizando el lipofectante FuGENE 6 (Roche). El día después, las células se lavaron y el medio se cambió. La selección con neomicina, 0.3 mg/ml, empezó en D1 y se aplicó durante 8 días. Las células resistentes se amplificaron y congelaron en nitrógeno líquido.

Reacción con la fosfatasa alcalina Las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron en formaldehído al 1 .5%, glutaraldehído al 0.5%, Igepal al 0.1 % durante 10 a 20 minutos a 4°C. Después del lavado, las células se incubaron a 37°C en la solución de tinción de fosfatasa alcalina compuesta de NaCI 100 mM, Tris 100 mM pH 9.5, MgCI2 50 mM, 1 mg/ml de NBT, 0.1 mg/ml de BCIP. La reacción se detuvo mediante la adición de PBS 1 x o H20.

Análisis con inmunofluorescencia Los anticuerpos SSEA-1 se compraron del Banco de Hibridomas para Estudios del Desarrollo (Developmental Studies Hybridoma Bank) de la Universidad de IOWA. Las células se fijaron 20 minutos a 4°C en formaldehído al 1.5%, glutaraldehído al 0.5% o en glutaraldehído al 0.2%, IGEPAL al 0.01 %, o 10 minutos a temperatura ambiente en paraformaldehído al 4% o metanol. Las células se incubaron en PBS-BSA al 0.1 % durante 2 horas a 4 horas. El primer anticuerpo diluido se agregó durante la noche. Después del lavado, el segundo anticuerpo anti-lgG marcado con FITC se agregó durante 1 hora a 4°C. La reacción se detuvo retirando el anticuerpo y lavando las células con PBS. Las células se observaron con un microscopio fluorescente.

PCR RFLP Los ADN de los tejidos de los embriones incubados durante 18 días se purificaron de acuerdo con las instrucciones del miniequipo para ADN de QlAamp. Un fragmento del virus de la leucosis aviar integrado en el genoma se amplificó mediante PCR utilizando los siguientes pares de cebadores: Oligos (157-158) Hacia adelante: 5 -GGTGTAAATATCAAAATTATC (SEQ ID N°1 ) Inverso: 5' -CGGTTAAAATACGAATAGAGA (SEQ ID N°2) Oligos (78-81 ) Hacia adelante: 5'-CTATGAGCAGTTACGAGGGTC (SEQ ID ) Inverso: 5'-CGGACCAACAGGCTAGTCTC (SEQ ID N°4) Los amplicones son respectivamente de 3106 y 1004 pb. La especificidad del cebador 157 es mayor para el ADN de los pollos Barred Rock que para el ADN de los Leghorn Blancos. Los amplicones resultantes se cortaron con la enzima Hincll.

Análisis con RT PCR Los ARN se purificaron de acuerdo con las instrucciones del equipo para aislamiento del ARN total SV de Promega. El ARN de la cabeza se extrajo de los embriones después de 5 días de incubación, la médula ósea del fémur de los embriones incubados durante 15 días, los testículos de los pollos adultos. El ARN de las células BR 5 se extrajo de acuerdo con las instrucciones del equipo RNeasy de Qiagen. Los ARN se transcribieron de manera inversa de acuerdo con las instrucciones de los equipos de los cebadores Aleatorios de Promega y la transcriptasa inversa de AMV. La amplificación con PCR se realizó utilizando los siguientes cebadores.

Oliqos vasa Vasa hacia adelante: TTTG GTACTAG ATG AAG C AG AC C (SEQ ID N°5) Vasa inverso: GTTCCCTATCTCCATGAATGC (SEQ ID N°6) Oliqos Brachvurv Brachyury hacia adelante: CACAAAGACATGATGGAGGAAG (SEQ ID N°7) Hacia adelante 2: TGAAGTCCTCTCCAAAACCATT (SEQ ID N°8) Brachyury inverso: CATAAGTTCGGGTACTGACTGG (SEQ ID N°9) Inverso 2: CACAAAATCATTCTGCGGTAAA (SEQ ID N°10) Oligos GAPDH GAPDH hacia adelante: AGGTGCTGAGTATGTTGTGGAGTC (SEQ ID N°1 1) GAPDH inverso: AGAACTGAGCGGTGGTGAAGA (SEQ ID N°12) Oligos Thv- Hacia adelante: AGGACAACAGGAAGCACATCAT (SEQ ID N°13) Inverso: GTTCTGGATCAAGAGGCTGAAG (SEQ ID ? 4) Inyecciones de células en los embriones receptores Cuando se irradiaron, los embriones receptores se prepararon exponiendo los huevos no incubados, puestos recientemente a 4 Gray de radiación X de una fuente de un acelerador. Se tuvo acceso a los embriones a través de una ventana cortada en el eje largo del huevo. El cascarón se retiró mediante trituración. La membrana del cascarón se mantuvo húmeda mediante la adición de una gota de PBS. La membrana del cascarón se cortó para exponer al embrión justo antes de la inyección de las células. 3 µ? de las células en el medio de cultivo se inyectaron en la cavidad subgermina! del embrión receptor utilizando una micropipeta. La ventana se cerró alineando dos piezas de la membrana del cascarón, sumergidas previamente en albúmina. Cuando las membranas del cascarón se secaron, las ventanas se sellaron de manera hermética con cinta quirúrgica. Los huevos se incubaron en incubadoras convencionales mantenidas a 37.5°C y 50% de humedad relativa y se voltearon 90° cada hora durante 18 días. Los huevos se transfirieron a una incubadora convencional al 37°C y 85% de humedad relativa hasta que los polluelos salieron del cascaron. El quimerismo fenotípico y somático se evaluó en los embriones después de 18 días de incubación. La contribución de la línea germinal de las células del donador se valoró comparando las aves inyectadas con pollos Barred Rock.

EJEMPLO 2 Aislamiento y amplificación de las células ES de poilo Las células progenitoras embriónicas de pollo se aislaron de huevos puestos recientemente. Un promedio de 200 embriones se recolectaron juntos y se sembraron en una capa alimentadora de fibroblastos de ratón irradiados. En realidad, Etches et al. (1996 Mol. Reprod. Dev. 45:291-288), habían demostrado que se observaban significativamente más quimeras somáticas después de la inyección de las células del blastodermo de pollo, cocultivadas con fibroblastos de ratón. Del sembrado inicial a los pasajes 3 a 5, las células del blastodermo se cultivaron en el medio de cultivo completo compuesto de una base de DMEM-F 2 suplementada con suero de becerro fetal al 10% (JRH), beta-mercaptoetanol 0.16 mM (SIGMA), aminoácidos no esenciales al 1% (Biowhittaker), piruvato de sodio 1 mM (Biowhittaker), L-Glutamina 2 mM (Biowhittaker), 1 ng/ml de IGF-1 (TEBU), 1 ng/ml de CNTF (Eurobio), 1 ng/ml de IL-6 (Eurobio), 1 ng/ml de IL-6R (TEBU), 1 ng/ml de SCF (TEBU), 1 ng/ml de FGF bovino (Peprotech), penistreptomicina al 1 % (Biowhittaker). A continuación, después de varios pasajes, algunos factores de crecimiento se retiraron y las células se cultivaron en medio de cultivo mínimo para evitar la diferenciación. Los factores de crecimiento que se retiraron fueron (SCF y FGF) o (SCF, FGF, IL-6, IL-6R). El medio de cultivo para cultivar las células ES de pollo para evitar la diferenciación, comprende medio basal (es decir, DMEM-F12) suplementado con suero de becerro fetal al 10% (JRH), beta-mercaptoetanol 0.16 mM (SIGMA), aminoácidos no esenciales al 1 % (Biowhittaker), piruvato de sodio 1 mM (Biowhittaker), L-Glutamina 2 mM (Biowhittaker) y suplementado con 1 ng/ml de IGF-1 , 1 ng/ml de CNTF, 1 ng/ml de IL-6, 1 ng/ml de IL-6R, penistreptomicina al 1%. De manera alterna, el medio de cultivo para cultivar las células ES de pollo para evitar la diferenciación, comprende medio basal (es decir, DMEM-F12) suplementado con suero de becerro fetal al 10% (JRH), beta-mercaptoetanol 0.16 mM (SIGMA), aminoácidos no esenciales al 1 % (Biowhittaker), piruvato de sodio 1 mM (Biowhittaker), L-Glutamina 2 mM (Biowhittaker) y suplementado con 1 ng/ml de IGF-1 , 1 ng/ml de CNTF, penistreptomicina al 1 % (Biowhittaker). Las células ES de pollo pudieron aislarse y expandirse de diferentes razas de pollos (Cuadro 1 ).

CUADRO 1 Aislamiento de las células ES de varias razas de pollos La caracterización del estado ES de las células aisladas y amplificadas in vitro se basó en una serie de criterios biológicos que han demostrado ser específicos para las células ES de ratón y humanas: la propiedad de autorrenovación, la morfología celular, la expresión de los marcadores específicos de las células progenitoras y la totipotencia de las células, es decir, su capacidad para diferenciarse in vitro e in vivo en diferentes linajes para contribuir a la constitución de un embrión. Las características de crecimiento de la mayoría de los aislados fueron idénticas a las observadas con las células del blastodermo de pollo mantenidas durante más de un año en cultivo (Figura 1 ), indicando su potencialidad para la autorrenovación indefinida. Las células del blastodermo crecieron como colonias. Eran células con forma redonda, con un núcleo grande y un citoplasma pequeño (Figuras 2A-2C, BR22p2 & BR22p3). De manera interesante, se observó que la morfología de las células del blastodermo evolucionó durante el periodo de cultivo de células conectadas de manera estrecha (Figuras 2A-2C BR22p2 & BR22p3) a células más dispersas con conexiones más sueltas (Figuras 2A-2C, BR29p12). Las células con las conexiones más sueltas podrían estabilizarse con el cultivo a largo plazo en el medio mínimo. Las células de diferentes morfologías se han caracterizado además para la expresión de los marcadores específicos de las células progenitoras y por su capacidad para contribuir a la constitución del embrión. Las células ES se definen de manera clásica por la expresión de diferentes marcadores, ECMA-7 (Kemler et al. 1981 J. Embryol. Exp. Morphol. 64:45-60), SSEA-1 (Solter y Knowles, 1978 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75(11 ):5565-5569), EMA-1 (Hahnei y Eddy, 1986 J. Reprod. ¡mmunoi. 0(2)89-1 10); la presencia de actividades enzimáticas específicas, actividad de la telomerasa y de la fosfatasa alcalina y por la ausencia de marcadores de células diferenciadas como TROMA-1. La expresión de los marcadores EMA-1 y SSEA-1 y la actividad de la fosfatasa alcalina se valoraron en las células del blastodermo amplificadas in vitro. La morfología de las células del blastodermo cambia durante el periodo de cultivo, se agregaron los marcadores específicos para los linajes germinal (Tsunekawa et al, 2000 Development 127:2741-2750), del mesodermo (Wiikinson et al, 1990, Nature 343:657-659) y hematopoyético (Uchida et al, 1994 Blood 83:3758-3779), para terminar el análisis. Puesto que los anticuerpos contra Brachyury, Thy-1 y vasa no estaban disponibles, la transcripción de los genes correspondientes se valoró mediante RT PCR. Este análisis se realizó a través de un periodo de cultivo extendido y con respecto a las morfologías diferentes. SSEA-1 y EMA-1 permanecieron expresados a través de un largo periodo de cultivo (Figuras 3A-3B). La actividad de la fosfatasa alcalina permaneció también estable a través del mismo periodo de cultivo (Figuras 4A-4C). La Figura 5 ilustra la evolución de la expresión de los marcadores de diferenciación, mientras que las células se mantienen en cultivo. El ARNm de vasa estuvo muy presente en las gónadas masculinas, como se esperaba (Figura 5 carril 3). No se detectó en los embriones en la etapa X (carril 4), aunque las células germinales estaban presentes en los embriones de la etapa X. El gen vasa estaba expresado de manera débil pero reproducibíe en las células mantenidas en cultivo (carril 18 a 36). La ausencia de los transcriptos de Vasa en los embriones de la etapa X puede explicarse por una sensibilidad deficiente de la RT PCR. La expresión del gen vasa en las células amplificadas in vitro puede significar que estas células tienen una competencia de la línea germinal o que las células germinales, que están presentes en los embriones de la etapa X, se han amplificado in vitro. El ARNm de Brachyury, un marcador del linaje del mesodermo, se detectó ya en los embriones de la etapa X (embriones de los huevos puestos recientemente) (Figura 5, carril 4). La expresión se incrementó mientras las células se mantienen en cultivo (Figura 5, BR8 carril 12 & 13; BR 15 carril 19 a 26; BR18 carril 27 a 30 y BR19 carril 32 a 34). El linaje hematopoyético se originó del mesodermo. El ARNm de Thy-1 , un marcador del linaje hematopoyético, también se detectó en las células mantenidas en cultivo (carriles 7, 8; 1 1 , 12, 13; 16 a 24; 27 a 34). HNK1 , un marcador de las células de la cresta neural en el polluelo, se expresó por las células del blastodermo. La expresión de HNK1 permaneció estable mientras las células se mantenían en cultivo (datos no mostrados). Los marcadores de las células no diferenciadas se expresaron a través de todo el periodo de cultivo (datos no mostrados). Las células del blastodermo cultivadas expresaron los marcadores de las células no diferenciadas, así como las células de la cresta neural y los marcadores del mesodermo. De manea sorprendente, el gen Vasa que se pensaba que era específico de las células germinales, es transcrito en las células ES. La totipotencia de las células de pollo amplificadas in vitro se verificó evaluando su capacidad para contribuir in vivo a la reconstitución del embrión. Los experimentos se montaron con diferentes números de células ES de pollo inyectadas en los embriones de pollo receptores para determinar los efectos del nivel de quimerismo. El impacto de la radiación del embrión receptor en la eficiencia de la colonización también se ha estudiado. Se seleccionaron cuatro parámetros para verificar el efecto de las inyecciones y de la radiación: (i) la viabilidad de los embriones; (ii) el porcentaje de quimeras fenotípicas (porcentaje de embriones con plumas coloreadas); (iii) el grado de quimerismo fenotípico (porcentaje de plumas coloreadas); (iv) el porcentaje de quimerismo somático (quimerismo en otros tejidos diferentes a las plumas). 300, 5,000, 15,000 ó 30,000 células ES del donador se inyectaron en la cavidad subterminal de los embriones receptores puestos recientemente, ya sea comprometidos previamente mediante radiación gamma o no irradiados. Los huevos inyectados se incubaron de acuerdo con las condiciones estándar. Las células del blastodermo cultivadas se inyectaron cada semana entre los 14 y 43 días de cultivo, para determinar la evolución de las potencialidades de la colonización con el tiempo de cultivo. Todos los embriones se analizaron a los 18 días de incubación. Las células del blastodermo cultivadas (células del donador) fueron de las razas Barred Rock o S86N coloreadas, que son recesivas homocigóticas (ii) en el sitio blanco dominante /. Las células del donador se inyectaron en los embriones receptores de la raza Leghorn Blanco (raza receptora) que es dominante homocigótica en el sitio /. La quimérica somática podría identificarse al momento de salir del cascarón por la presencia de plumón negro. Sin embargo, se desarrolló un procedimiento con PCR RFLP para discriminar las huellas genéticas de las células de los embriones donador y receptor (Figura 6). El patrón PCR RFLP de la raza receptora es un perfil de 1 ó 2 bandas, dependiendo del individuo. El patrón PCR RFLP de la raza donadora es un perfil de 3 bandas. Los tejidos quiméricos se identificaron por un perfil de 3 bandas, típico del donador. Fue posible entonces determinar si las células inyectadas poseían la capacidad para colonizar otros tejidos diferentes a las plumas. Como se hizo para la expresión de los marcadores específicos, se estudió la capacidad de la colonización in vitro, mientras que las células se mantenían en un cultivo a lago plazo y también de acuerdo con las morfologías celulares. Varias quimeras de pollos fenotípicas (es decir, animales con plumas colonizadas por las células de la raza donadora) y somáticas (es decir, animales con tejidos diferentes de las plumas colonizados por las células de la raza donadora) se han identificado. Las células del donador mostraron estar presentes en lo derivado de las tres capas germinales, incluyendo las gónadas. Estos resultados demostraron que las células ES de pollo expandidas in vitro, obtenidas de acuerdo con el método de la invención, podrían injertarse y reconstituir varios tejidos del embrión receptor, incluyendo las gónadas. De manera sorprendente, los inventores demostraron que la inyección de cantidades mayores de células, comparadas con ia cantidad recomendada en la técnica anterior (es decir, aproximadamente 300 a 500 células irradiadas), no tiene impacto en la viabilidad de los embriones. Además, el porcentaje de quimerismo fénotípico se incrementa de manera significativa cuando se inyectan cantidades grandes de células (es decir, más de 15000 y eventualmente aproximadamente 30000), sin importar la presencia o ausencia del paso de radiación. 30000 células inyectadas no es una limitación superior, y uno considera inyectar más células, la única limitación es que el embrión receptor se capaz de sobrevivir y de desarrollarse después de haber recibido estas células. El inventor demostró que la inyección de 15000 células en los embriones receptores irradiados y la inyección de 30000 células en embriones no irradiados proporcionan los mejores resultados y de manera específica, proporciona un porcentaje más alto de embriones quiméricos en las gónadas. Los inventores demostraron que el intervalo utilizado de radiación no tiene un impacto en la viabilidad de los embriones de pollo. Además, la potencialidad de colonización no parece ser dependiente del lapso de tiempo del cultivo de las células de blastodermo de pollo (datos no mostrados). En general, los datos sustentan la noción de que las células ES aisladas y amplificadas in vitro son células progenitoras embriónicas verdaderas.

EJEMPLO 3 Transmisión de la línea germinal por las células ES de pollo Con las mejores metodologías de inyección desarrolladas, 9% de las aves inyectadas fueron quiméricas en las gónadas (datos no mostrados).

Para tratar el punto de la transmisión de la línea germinal, una bandada de 584 animales se generó mediante la inyección de las células cultivadas en los embriones receptores, de acuerdo con las mejores metodologías, que mostró permitir una colonización óptima de las gónadas. El quimerismo fenotípico de las aves se extendió de unas cuantas plumas al momento de salir del cascarón, que se perdieron posteriormente, a más del 95% en la adultez (Figura 7 y Cuadro 2).

CUADRO 2 Grado de quimerismo fenotípico de las gallinas y gallos inyectados Las gallinas inyectadas con las células de Barred Rock se compararon con los gallos Barred Rock para valorar la contribución del linaje del donador con la línea germinal. La transmisión de la línea germinal se valoró a través del examen de la distribución de las crías negras y amarillas.

La progenie de 221 gallinas se ha examinado. De las 16006 aves F1 , 5 polluelos exhibieron un porcentaje variable de plumas blancas (uno murió antes de salir del cascarón), y 1 polluelo presentó una pigmentación del plumaje típica de aquélla de un Barred Rock (Figura 8A). La descripción de las gallinas que producen la progenie con la pigmentación de plumaje similar a Barred Rock y la descripción de las combinaciones de la inyección se presentan en el Cuadro 3. Incluso después de 59 días de cuitivo, las células permanecieron capaces de colonizar la línea germinal. La transmisión de la línea germinal no se correlaciona con un alto porcentaje de quimerismo fenotípico en la gallina. En realidad, la madre del polluelo similar a Barred Rock era blanca. El número potencial del PGC inyectadas se estimó suponiendo que 50 PGC (Eyal-Giladi et al, 1976), están presentes en los embriones de la etapa X. El número final de PGC se calculó con el factor de dilución que resulta de los pasajes sucesivos de las células y la concentración y el volumen de la suspensión celular inyectada al embrión receptor.

CUADRO 3 Influencia del cultivo de las células ES en la colonización ín vivo G% de la quimera fenotípica: número de embriones con plumas coloreadas/número de embriones de 18 días vivos; % de la quimera qenotípica: número de embriones quiméricos en otros tejidos diferentes a las plumas/número de embriones de 18 días vivos].

Cuatro (4) de 5 polluelos de la progenie F1 (16006 aves) sobrevivieron hasta la adultez. Estas 4 gallinas se inseminaron con semen de gallos Barred Rock. La progenie de la gallina 5664-5665 fue similar a Barred Rock (Figura 8B y Cuadro 4). Entre la progenie de las otras 3 gallinas hubo polluelos similares a Barred Rock y similares a Leghorn Blanco (Cuadro 4).

CUADRO 4 Progenie de aves F1. Las gallinas que resultan de la comparación de la quimera inyectada con las aves Barred Rock se inseminaron con semen de Barred Rock. Los huevos se incubaron hasta salir del cascarón. El fenotipo de la progenie se registró.

Los inventores proporcionan un método de cultivo de las células ES de pollo. La amplificación de las células del blastodermo se ha documentado únicamente para las razas de pollos Leghorn Blanco y Barred Rock (Pain et al, 1996 Dev. 122(8) 2339-2348), Petitte et al, 1990 108(1): 185-189, Zhu et al, 2005 Nat. Biotechnol. 23(9): 59-1 69). El procedimiento de cultivo desarrollado en este estudio, en particular la combinación de factores de crecimiento, específicos y su evolución durante el tiempo, permitió aislar y amplificar de manera reproducible las células de diferentes razas de pollos. La eficacia de la amplificación fue dependiente de la raza, un resultado consistente con la diferencia de la raza en el establecimiento de las líneas de las células ES descritas para el ratón (Kawase et al, 1994 Int.J. Dev. Biol. 38(2):385-390). De manera interesante y a diferencia del ratón, la totipotencia de las células ES de pollo mantenidas en cultivo a largo plazo es sustentada por la privación de varios factores de crecimiento. Es decir, que las células ES de pollo conservan la totipotencia durante el cultivo a largo plazo en medio de cultivo completo, y también en medio completo privado de factores de crecimiento tales como IL-6, IL-6R, SCF y FGF. Debe notarse, que las células ES humanas no pueden mantenerse en las condiciones de cultivo establecidas para las células ES de ratón. Pain et al (1996) describieron, en los cultivos a largo plazo del blastodermo de pollo (más de 160 días), grandes colonias de células pequeñas empacadas de manera estrecha en nidos con características morfológicas "similares a ES", parecidas a aquéllas de las células ES de ratón. En contraste, la morfología de las células del blastodermo de pollo que el inventor mantuvo en cultivo a largo plazo, no permanecen tan estables y cambiaron de células con una forma redonda que estaban conectadas estrechamente a las células con conexiones más sueltas. Esta evolución morfológica fue consistente e independiente de la raza del pollo. Este cambio en la morfología no afecta la propiedad de autorrenovación específica de las células ES. E! compromiso potencial de las células en diferentes linajes se trató mediante (i) la caracterización bioquímica de las células mediante inmunofluorescencia o análisis con RT PCR; (i¡) una metodología de transgénesis para tener acceso a la propiedad biológica de las células cultivadas. Las células se han caracterizado con respecto a los marcadores específicos de las tres capas germinales, el ectodermo, mesodermo y endodermo. Los marcadores indicativos de una diferenciación muy temprana se seleccionaron. Ninguna de las morfologías presentó una combinación específica de marcadores. Los marcadores de las células no diferenciadas, los marcadores de las tres capas germinales, pudieron detectarse, así como un marcador de la línea germinal similar a vasa. No hubo evolución de la expresión de los marcadores específicos de un cambio de la morfología. Incluso las células con la morfología más diferenciada expresaron los marcadores específicos de las células ES y no expresaron los marcadores de diferenciación. Las suspensiones de las células amplificadas in vitro se inyectaron en los embriones receptores. La pigmentación de las plumas resulta de una transferencia de los pigmentos de los melanocitos al cañón de las plumas. Los melanocitos se derivaron de las células de la cresta neural del tronco del embrión. La diferenciación de las células de la cresta neural ocurre muy inicialmente en el desarrollo de un embrión. La pigmentación del plumaje de los embriones receptores blancos inyectados con las células de una raza de pollos negros, puede no reflejar la totipotencia de ¡as células inyectadas, pero puede indicar que las células comprometidas con el linaje del melanocito eran capaces de unirse al linaje melanoblástico del receptor. Así, el estudio de la contribución de las células inyectadas al embrión receptor, no estuvo restringido a la observación del plumaje, sino que incluyó los tejidos derivados de las tres capas germinales. Las quimeras fenotípicas y somáticas se obtuvieron con cada una de las morfologías principales de las células observadas en cultivo (cordones, aglomeraciones y cometas), sustentando el estado no diferenciado de las células sin importar la morfología. De manera interesante, las gónadas también se colonizaron por las células inyectadas. La prueba final del estado ES de una célula es la transmisión de la línea germinal. Una gallina 1 FO (inyectada) (0.3%) sustentó la transmisión de la línea germinal. De los 16 polluelos de la progenie de esta gallina, un polluelo 1 F1 fue similar a Barred Rock (6.25%). Todos los polluelos F2 de la gallina F1 presentaron el fenotipo Barred Rock que indica que la adquisición de los rasgos del donador es estable a través de varias generaciones. La mitad de la progenie de las gallinas F1 que presentaron un porcentaje variable de plumas blancas, fueron similares a Barred Rock y la otra mitad tuvo un fenotipo de Leghorn Blanco como se esperaba de las reglas de la herencia de Mendel. Así, los inventores demostraron la competencia de la línea germinal de las células del blastodermo de pollo. Las células del blastodermo de pollo, por lo tanto, son útiles para desarrollar la transgénesis aviar.

EJEMPLO 4 Aislamiento y amplificación de las células ES de pato 4.1 Materia prima Huevos de pato Los huevos de pato de la raza pequinesa GL30 se obtuvieron de GRIMAUD FRERES SELECTION (La Corbiere, Roussay Francia). Los patos progenitores se vacunaron contra Escherichia Coli (vacuna Autógena Coli 01 & 02), Pasteurella multocida (Landavax), hepatitis viral del Pato (Hepatovax), Erysipelothrix rhusiopathiae (Ruvax), metapneumovirus Aviar (Nemovac), Salmonella typhimurium & Enteridis (vacuna Autógena), Riemerella antipestifer (Autovacuna Riemerella), metapneumovirus Aviar (Nobilis RTV inactivo) y Erysipelothrix rhusiopathiae (Ruvax). Después de la recepción, los huevos del pato pequinés fertilizados se sometieron a una desinfección en un baño de hipocloruro, seguido por una descontaminación con Fermacidal (Thermo) para evitar cualquier riesgo de contaminación relacionado con el polvo unido al cascarón.

Células aiimeníadoras Las células de origen murino (células STO), se utilizaron como la capa alimentadora para mantener la pluripotencia de las células progenitoras de pato. Esas células alimentadoras se desactivaron mitóticamente mediante radiación gamma (45 a 55 Gray) antes de la siembra en plástico. Esta dosis de radiación es una dosis subletal que induce el paro definitivo del ciclo celular, pero permite todavía la producción de los factores de crecimiento y la matriz extracelular, necesarios para el fomento del crecimiento celular de las células no diferenciadas. La línea celular STO se derivó por A. Bernstein, Instituto del Cáncer de Ontario, Toronto, Canadá, de una línea continua de fibroblastos embriónicos de ratón SIM (Ratones Endogámicos de Sandos (Sandos Inbred Mice)) y se suministró por la Colección Americana de Cultivo Tipo (ATCC) (Número de Producto STO: CRL-1503, número de Lote 1 198713). Las capas alimentadoras frescas se prepararon dos veces a la semana. Las células exponenciales se disociaron y contaron. Una parte de las células se sembró para el mantenimiento de los cultivos viables y otra parte se irradió. Para la radiación, preparamos una suspensión celular a 10x106 células/mL en tubos. Las células se expusieron a una dosis de 45 a 55 gray y se sembraron en plástico. Después de la siembra, los recipientes o placas recubiertos con las células alimentadoras desactivadas se utilizaron durante un máximo de 5 días.

Medio Medio GTM-3 (Sigma, N° de Catálogo G9916) DMEM-HamF12 (Cambrex, N° de Catálogo BE04-687) Aditivos Glutamina (Cambrex, N° de Catálogo BE17-605E) Antibióticos: Penicilina/estreptomicina (Cambrex, N° de Catálogo BE17-602E)) Aminoácidos no esenciales (Cambrex, N° de Catálogo BE13- 114E) Piruvato de sodio (Cambrex, N° de Catálogo BE13-115) Vitaminas (Cambrex, N° de Catálogo 13-607C) Beta ercapto Etanol (Sigma, N° de Catálogo M7522) Extracto acuoso de levadura (SAFC, N° de Catálogo 58902C) Factores Se utilizaron seis diferentes factores recombinantes: ? Factor Neurotrófico Ciliar Humano Recombinante (CNTF) (Peprotech Inc, N° de Catálogo 450-13) ? Factor 1 Similar a la Insulina Humano Recombinante (IGF1) (Peprotech Inc, N° de Catálogo 100-11) ? Interleucina 6 Humana Recombinante (IL6) (Peprotech Inc, N° de Catálogo 200-06) ? Receptor de la Interleucina 6 Soluble Humano Recombinante (s¡L6r) (Peprotech Inc, N° de Catálogo 200-06 R) ? Factor de las Células Progenitores Humanas Recombinantes (SCF) (Peprotech Inc, N° de Catálogo 300-07) ? Factor de Crecimiento del Fibroblasto Básico Humano Recombinante (bFGF) (Peprotech Inc, N° de Catálogo 100- 8B) Todos esos factores, excepto el IL6r, se produjeron en la bacteria E. Coli. El IL6r soluble se expresa en células HEK293 transfectadas.

Suero bovino fetal Suero bovino fetal no irradiado (FBS) (JRH, N° de Catálogo 12003) El suero no irradiado utilizado en el programa se recolectó y produjo en Australia. Los animales utilizados para la recolección fueron inspeccionados por la USDA y aceptables para sacrificarlos. Se agregó en el medio durante el cultivo de las células progenitoras aviares. Este lote no se sometió a radiación para evitar la destrucción de las proteínas o componentes críticos que pueden ser esenciales para el mantenimiento de las células progenitoras en cultivo.

Suero irradiado (JRH, N° de Catálogo 12107) El lote irradiado utilizado en este programa se recolectó en los Estados Unidos. Este lote irradiado se agregó como el suplemento en el medio DMEM utilizado para el cultivo de las células STO (células alimeníadoras). Esas células no requieren como las células progenitoras, una calidad específica de suero para el crecimiento y mantenimiento en cultivo. Para reducir al mínimo la alta concentración del suero en el medio, hemos adaptado las células STO para crecer en presencia de 4% de FBS únicamente. 4.2 Procedimiento de aislamiento y cultivo de las células ES de pato Aproximadamente 360 huevos de pato fertilizados se abrieron, la yema se separó de la albúmina durante la abertura. Los embriones se retiraron de la yema con la ayuda de un pequeño papel filtro absorbente (papel Whatmann 3M), cortado de antemano en la forma de un anillo perforado con ayuda de una perforadora. El diámetro de la perforación es de aproximadamente 5 mm. Estos pequeños anillos se esterilizaron utilizando calor seco durante aproximadamente 30 minutos en un horno. En la práctica, durante el paso de recolección del embrión, un pequeño anillo de papel se deposita en la superficie de la yema y se centra el en embrión, que está rodeado así por el anillo de papel. El último se corta entonces con ayuda de unas tijeras pequeñas y todo lo retirado se coloca en una caja de Petri, llena con PBS. Los embriones portados así por el anillo se limpiaron del exceso de yema en el medio y el disco embriónico, libre así del exceso de vitelina, se recolectaron con una pipeta Pasteur. Los embriones de pato se colocaron en tubos de 50 mL que contienen PBS 1X. Los embriones de pato se disociaron entonces de manera mecánica, se lavaron con PBS, y se sembraron en una capa desactivada de células STO alimentadoras en medio de cultivo completo a 39°C, 7.5% de C02. Las células alimentadoras se sembraron en placas o recipientes de 6 pozos a aproximadamente 2.7 x104 células/cm2. El medio de cultivo completo está compuesto de un medio libre de suero DMEM-Ham F12 suplementado con suero bovino fetal al 10%, con IGF1 , CNTF, y opcionalmente IL-6, IL-6R, SCF y FGF bovino, a una concentración final de 1 ng/ml, y con aminoácidos no esenciales al 1%, con 1% de una mezcla de vitaminas de origen comercial, con piruvato de sodio a una concentración final de 0.1 mM, con beta-mercapto-etanol a una concentración final de 0.5 mM, glutamina a una concentración final de 2.1 mM, penicilina a una concentración final de 100 U/ml, estreptomicina a una concentración final de 100 yg/ml y extracto acuoso de levadura 1X. Rápidamente, en el pasaje 4, la mezcla de antibióticos ya no se agregó al medio. Las células ES de pato se cultivaron en el medio de cultivo completo DMEM-Ham F12 hasta el pasaje 4. Después del pasaje 4, el medio de base se modifica y el medio completo DMEM-Ham F12 se reemplaza por: el medio GTM-3 suplementado con suero bovino fetal al 10% y con IGF1 y CNTF a una concentración final de 1 ng/ml, con aminoácidos no esenciales al 1 %, con 1 % de una mezcla de vitaminas de origen comercial, con piruvato de sodio a una concentración final de 0.1 mM, con beta-mercapto-etanol a una concentración final de 0.5 mM, glutamina a una concentración final de 2.1 mM y extracto acuoso de levadura o 1X; o el medio GTM-3 suplementado con suero bovino fetal al 10% y con IGF1 , CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF a una concentración final de 1 ng/ml, con aminoácidos no esenciales al 1 %, con 1 % de una mezcla de vitaminas de origen comercial, con piruvato de sodio a una concentración final de 0.1 mM, con beta-mercapto-etanol a una concentración final de 0.5 mM, glutamina a una concentración final de 2.1 mM y extracto acuoso de levadura 1X. Las células ES de pato se cultivaron además durante al menos 14 pasajes en este nuevo medio de cultivo sin diferenciación.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método para cultivar células progenitoras embriónicas (ES) de un aviar, que comprende los pasos de: a) suspender las células ES que se originan del disco del blastodermo de huevos aviares fertilizados no incubados en un medio de cultivo basal suplementado con: factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) y factor neurotrofico ciliar (CNTF); y suero animal; y opcionalmente, al menos uno de los factores de crecimiento seleccionados del grupo que comprende interleucina 6 (IL-6), receptor de la interleucina 6 (IL-6R), factor de las células progenitoras (SCF), factor de crecimiento del fibroblasto (FGF), factor inhibidor de la leucemia (LIF), interleucina 11 (IL-11), oncostatina y cardiotrofina; b) sembrar la suspensión de las células ES obtenida en el paso a) en una capa de células alimentadoras y cultivar además las células ES durante al menos entre 2 a 10 pasajes; c) retirar opcionalmente al menos uno de los factores de crecimiento seleccionados SCF, FGF, IL-6, IL-6R, LIF, oncostatina y cardiotrofina e IL-11 deí medio de cultivo; d) cultivar además ias céiuias ES en el medio dei paso c) en una capa de células alimentadoras. 2 - El método para cultivar las células progenitoras embriónicas (ES) de un aviar de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende los pasos de: a) suspender las células ES que se originan del disco del blastodermo de huevos aviares fertilizados no incubados en un medio de cultivo basal suplementado con factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1 ), factor neurotrófico ciliar (CNTF), interleucina 6 (IL-6), receptor de la interleucina 6 (IL-6R), factor de las células progenitoras (SCF) y factor de crecimiento del fibroblasto (FGF) y suero animal; b) sembrar la suspensión de las células ES obtenida en el paso a) en una capa de células alimentadoras y cultivar además las células ES durante al menos entre 2 a 10 pasajes; c) opcionalmente, retirar al menos un factor de crecimiento seleccionado del grupo que comprende SCF, FGF, IL-6 e IL-6R del medio de cultivo; d) cultivar además las células ES en el medio del paso c) en una capa de células alimentadoras. 3.- El método para cultivar las células progenitoras embriónicas (ES) de un aviar de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende los pasos de: a) suspender las células ES que se originan del disco del blastodermo de huevos aviares fertilizados no incubados en un medio de cultivo basal suplementado con factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1 ), factor neurotrófico ciliar (CNTF), interleucina 6 (IL-6), receptor de la interleucina 6 (IL-6R), factor de las células progenitoras (SCF), factor de crecimiento del fibroblasto (FGF) y suero animal; b) sembrar la suspensión de las células ES obtenida en el paso a) en una capa de células alimentadoras y cultivar además las células ES durante al menos entre 2 a 10 pasajes; c) opcionalmente, retirar al menos un factor de crecimiento seleccionado del grupo que comprende SCF y FGF del medio de cultivo; d) cultivar además las células ES en el medio del paso c) en una capa de células alimentadoras. 4 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el aviar es un pollo. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el aviar es un pato. 6. - Un método para modificar genéticamente las células progenitoras embriónicas aviares, que comprende los pasos de: a) transfectar las células ES cultivadas de acuerdo con el método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5 con un vector; b) seleccionar las células ES transfectadas; c) seleccionar y amplificar las clonas ES seleccionadas que están modificadas genéticamente, d) cultivar las células ES modificadas genéticamente del paso c) en una capa de células alimentadoras en un medio de cultivo que comprende suero animal y al menos un factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), factor neurotrófico ciliar (CNTF) y opcionalmente al menos uno de los factores de crecimiento seleccionados del grupo que comprende interleucina 6 (IL-6), receptor de la interleucina 6 (IL-6R), factor de las células progenitoras (SCF), factor de crecimiento del fibroblasto (FGF). 7. - Un método para obtener un polluelo quimérico, que comprende los pasos de: a) introducir las células ES cultivadas de acuerdo con el método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5 en la cavidad subgerminal de un embrión aviar receptor; y b) incubar el embrión obtenido en el paso a) hasta que salga del cascarón como un polluelo; c) seleccionar el polluelo quimérico que comprende las células heterólogas que han colonizado al polluelo. 8.- Un método para obtener un polluelo quimérico modificado genéticamente, que comprende los pasos de: a) introducir las células ES modificadas genéticamente obtenidas en el paso d) de conformidad con la reivindicación 6 en la cavidad subgerminal de un embrión aviar receptor; y b) incubar el embrión obtenido en el paso a) para que salga del cascarón como un polluelo; c) seleccionar el polluelo quimérico que comprende las células heterólogas modificadas que han colonizada al polluelo. 9.- El método de conformidad con las reivindicaciones 7 y 8, caracterizado además porque la selección del polluelo quimérico se realiza mediante el análisis fenotípico del plumaje. 10.- El método de conformidad con las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado además porque comprende el paso adicional de determinar el sexo del embrión receptor antes de la introducción de las células ES. 1 1 - El método de conformidad con las reivindicaciones 7 y 10, caracterizado además porque las células ES cultivadas del paso a) se han cultivado in vitro durante al menos 5 días. 12.- El método de conformidad con las reivindicaciones 7 a 11 , caracterizado además porque el embrión receptor se deriva de un huevo no incubado puesto recientemente y comprende entre aproximadamente 5,000 a aproximadamente 70,000 células. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el embrión receptor está en una etapa comprendida entre las etapas VI y XII de la clasificación de Eyal-Giladi & Kochav, de manera preferida aproximadamente la etapa X de la clasificación de Eyal-Giladi & Kochav. 14. - El método de conformidad con las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado además porque al menos 1000 células ES, de manera preferida al menos 15,000 células ES se introducen en la cavidad subgerminal del embrión aviar receptor. 15.- El método de conformidad con las reivindicaciones 7 a 14, caracterizado además porque al menos 30,000 células ES se introducen en la cavidad subgerminal del embrión aviar receptor. 16. - El método de conformidad con las reivindicaciones 7 a 15, caracterizado además porque las células ES introducidas en la cavidad subgerminal del embrión aviar receptor son una población mezclada de células ES femeninas y masculinas. 17. - El método de conformidad con las reivindicaciones 7 a 15, caracterizado además porque las células ES femeninas se introducen en la cavidad subgerminal de un embrión aviar receptor hembra. 18.- El método de conformidad con las reivindicaciones 7 a 15, caracterizado además porque las células ES masculinas, se introducen en la cavidad subgerminal de un embrión aviar receptor macho. 19.- El método de conformidad con las reivindicaciones 7 a 18, caracterizado además porque comprende el paso adicional de irradiar el embrión receptor con radiación X o gamma antes de la introducción de las células ES en la cavidad subgerminal del embrión receptor. 20 - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el embrión de pollo receptor se irradia con entre 3 a 6 gray de rayos X, de manera preferida, aproximadamente 4 gray de rayos X. 21. - El método de conformidad con las reivindicaciones 7 a 20, caracterizado además porque aproximadamente 15,000 células ES de pollo se introducen en la cavidad subgerminal del embrión de pollo receptor, irradiado previamente con aproximadamente 4 gray. 22. - El método de conformidad con las reivindicaciones 7 a 20, caracterizado además porque al menos 30,000 células ES de pollo se introducen en la cavidad subgerminal de un embrión de pollo receptor no irradiado. 23. - El método de conformidad con las reivindicaciones 7 a 22, caracterizado además porque el embrión de pollo receptor es de raza Leghorn Blanco y en donde ías céiuias ES de polio se derivan de una raza seleccionada del grupo compuesto por la raza barred rock, la raza Marans, la raza S86N. 24. - El método de conformidad con las reivindicaciones 7 a 22, caracterizado además porque el embrión de pollo receptor es de una raza de pollos seleccionada del grupo compuesto por la raza barred rock, la raza Marans y la raza S86N y en donde las células ES de pollo se derivan de la raza Leghorn Blanco. 25. - El método de conformidad con las reivindicaciones 23 a 24, caracterizado además porque la selección del polluelo quimérico que comprende las células heterologas comprende los pasos de: a) obtener una muestra de material genético del polluelo quimérico; b) probar la presencia de un polimorfismo en una secuencia del virus de la leucosis aviar integrada en el genoma aviar, y en donde el polimorfismo es identificable por una amplificación de un conjunto de cebadores seleccionados del grupo que consiste del conjunto de un cebador hacia adelante 5'-GGTGTAAATATCAAAATTATC-3' (SEQ ID N°1) y un cebador inverso 5'-CG GTTAAAATAC GAATAGAGA-3 ' (SEQ ID N°2) y un conjunto de un cebador hacia adelante 5'-CTATGAGCAGTTACGAGGGTC-3' (SEQ ID N°3) y un cebador inverso 5'-CGGACCAACAGGCTAGTCTC-3' (SEQ ID N°4). 26. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el método para identificar la presencia o ausencia de un polimorfismo se selecciona de un grupo que consiste de análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción (RFLP), análisis heterodúplex, polimorfismo conformacional de una sola hebra (SSCP), electroforesis sobre gel con un gradiente desnaturalizante (DGGE), electroforesis sobre gel con gradiente de temperatura (TGGE), oligonucleótido específico del alelo (ASO) y huella de didesoxi (ddF). 27. - El método de conformidad con las reivindicaciones 25 y 26, caracterizado además porque el paso de probar la presencia del polimorfismo comprende los pasos de: a) digerir el material genético con la enzima de restricción Hincll; b) separar los fragmentos obtenidos de la digestión; c) detectar el patrón de restricción generado por los fragmentos; y d) opcionalmente, comparar el patrón con al menos un patrón de restricción obtenido mediante la digestión del material genético de Leghorn Blanco, Marans, Barred Rock, S86N, utilizando la enzima de restricción Hincll, en donde la diferencia en los patrones de restricción detectados en las pasos c) y d) es indicativa de un polluelo quimérico que comprende las células heterólogas. 28. - El método de conformidad con las reivindicaciones 25 a 27, caracterizado además porque la amplificación se realiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la PCR con transcriptasa inversa y en donde el análisis comprende la digestión de ADN amplificado con PCR con la enzima de restricción Hincll. 29. - Un método para obtener una progenie del polluelo quimérico, en donde el método comprende los siguientes pasos: a) permitir que el polluelo quimérico seleccionado obtenido en el paso c) de conformidad con las reivindicaciones 7 u 8 madure hasta un ave adulta; b) reproducir el ave adulta que tiene las células heterólogas en el mismo, produciendo por lo tanto una progenie del ave; y c) seleccionar las aves de interés en la progenie. 30. - El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la selección de las aves se realiza mediante el análisis fenotípico del plumaje. 31. - El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la selección de las aves se realiza mediante el análisis genotípico, probando la presencia de un polimorfismo Hincll en una secuencia del virus de la leucosis aviar integrada en el genoma del ave. 32. - El método de conformidad con las reivindicaciones 29 a 31 , caracterizado además porque comprende el paso de expresar el polipéptido heterólogo codificado por el vector comprendido en las células heterólogas modificadas genéticamente. 33. - El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el polipéptido heterólogo es suministrado a la clara de un huevo aviar en desarrollo producido por un ave modificada genéticamente. 34. - Un medio de cultivo para células progenitoras embriónicas aviares, que comprende al menos un factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), factor neurotrófico ciliar (GNTF) y opcionalmente al menos un compuesto seleccionado del grupo que comprende interleucina 6 (IL-6), receptor de la interleucina 6 (IL-6R), factor de las células progenitoras (SCF), factor de crecimiento del fibroblasto (FGF), en donde el medio es suficiente para el mantenimiento de las células progenitoras embriónicas aviares en cultivo durante al menos 7 días, de manera preferida durante al menos 100 días. 35.- El medio de cultivo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque comprende una capa de células alimentadoras. 36.- Un método para el análisis de un polimorfismo genético para distinguir la raza de pollos Leghorn Blanco de otra raza de pollos, en donde el método comprende los pasos de: a) obtener una muestra de material genético de la raza de pollos Leghorn Blanco, y una muestra del material genético de la otra raza de pollos; b) probar la presencia de un polimorfismo en una secuencia del virus de la leucosis aviar integrada en el genoma del pollo, y en donde el polimorfismo es identificable por una amplificación por un conjunto de cebadores seleccionados del grupo que consiste del conjunto de un cebador hacia adelante 5'-GGTGTAAATATCAAAATTATC-3' (SEQ ID N°1) y un cebador inverso 5'-CGGTTAAAATACGAATAGAGA-3' (SEQ ID N°2) y el conjunto de un cebador hacia adelante 5 -CTATGAGCAGTTACGAGGGTC-3' (SEQ ID N°3) y un cebador inverso 5 -CGGACCAACAGGCTAGTCTC-31 (SEQ ID N°4). 37. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque ¡a amplificación se realiza mediante ia reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la PCR con transcriptasa inversa. 38. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el paso de probar la presencia del polimorfismo comprende los pasos de: a) digerir el ADN amplificado con PCR con la enzima de restricción Hincll; b) separar los fragmentos obtenidos de la digestión; c) detectar el patrón de la restricción generado por los fragmentos; y d) comparar el patrón obtenido mediante la digestión del material genético de Leghorn Blanco utilizando la enzima de restricción y el patrón obtenido mediante la digestión del material genético de la otra raza de pollos, en donde la presencia del sitio de restricción Hincll es indicativo de la raza Leghorn Blanco, y la ausencia del sitio de restricción Hincll es indicativa de que no es una raza Leghorn Blanco. 39.- El método de conformidad con las reivindicaciones 36 a 38, caracterizado además porque el método para identificar la presencia o ausencia de un polimorfismo se selecciona del grupo que consiste de: análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción (RFLP), análisis heterodúplex, polimorfismo conformacional de una sola hebra (SSCP), electroforesis sobre gel con un gradiente desnaturalizante (DGGE), electroforesis sobre gel con gradiente de temperatura (TGGE), oligonucleótido específico del alelo (ASO) y huella de didesoxi (ddF)..