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MX2009000808A - Moduladores de la actividad del receptor de quimiocina, formas cristalinas y procesos. - Google Patents

Moduladores de la actividad del receptor de quimiocina, formas cristalinas y procesos.

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MX2009000808A
MX2009000808A MX2009000808A MX2009000808A MX2009000808A MX 2009000808 A MX2009000808 A MX 2009000808A MX 2009000808 A MX2009000808 A MX 2009000808A MX 2009000808 A MX2009000808 A MX 2009000808A MX 2009000808 A MX2009000808 A MX 2009000808A
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MX
Mexico
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compound
formula
oxo
mcp
tert
Prior art date
Application number
MX2009000808A
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English (en)
Inventor
John V Duncia
Michael E Randazzo
Rulin Zhao
Percy H Carter
Michael G Yang
Boguslaw M Mudryk
Zili Xiao
Original Assignee
Squibb Bristol Myers Co
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Filing date
Publication date
Application filed by Squibb Bristol Myers Co filed Critical Squibb Bristol Myers Co
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Abstract

La presente invención proporciona un antagonistas novedoso o agonista parcial/antagonista del receptor de la actividad de MCP-1; N-((1R,2S,5R)-5-(tert-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(triflu orometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)ciclohexil)acetamid a, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable, de los mismos que tiene una combinación inesperada de características farmacológicas deseables. Las formas cristalinas de la presente invención también se proporcionan. Las composiciones farmacéuticas contienen los mismos y los métodos de uso de los mismos como agente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades alérgicas, autoinmunes, metabólicos, cáncer y/o cardiovascular también es un objetivo de esta invención. La presente descripción también proporciona un proceso para preparar los compuestos de la fórmula (I), incluyendo N-((1R,S2,5R)-5-(tert-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluoromet il)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)ciclohexil)acetamida: (ver fórmula (I)) en donde R1, R8, R9, R10 y HET son como se describen en la presente. Los compuestos que son intermediarios útiles de los procesos también se proporcionan en la presente.

Description

MODULADORES DE LA ACTIVIDAD DEL RECEPTOR DE QUIMIOCINA, FORMAS CRISTALINAS Y PROCESOS Campo de la Invención presente invención proporciona N- ( ( IR, 2S, 5R) -5- (tert butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6- (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable de los mismos, que tiene una combinación inesperada de características farmacológicas deseables. Las formas cristalinas de la presente invención también se proporcionan. Las composiciones farmacéuticas que contienen los mismos y los métodos de uso de los mismos como agentes para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades alérgicas, autoinmunes, metabólicas, cáncer y/o cardiovasculares también es un objetivo de esta invención. La presente descripción también proporciona un proceso para preparar los compuestos de la fórmula (I), incluyendo N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6- (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida: en donde son como se describen en la Ref . : 199535 presente. Los compuestos que son intermediarios útiles de los procesos también se proporcionan en la presente. Antecedentes de la Invención Las quimiocinas son citocina quimiotácticas , de peso molecular de 6-15 kDa, que se liberan por una amplia variedad de células para atraer y activar, entre otros tipos de células, macrófagos, linfocitos T y B, eosinófilos, basófilos y neutrófilos (revisión en: Charo and Rasonhoff, New Eng. J. Med. 2006, 354, 610-621; Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445 y Rollins, Blood, 1997, 90, 909-928). Existen dos principales clases de quimiocinas, CXC y CC, dependiendo de si las primeras dos cisteinas en la secuencia de aminoácido se separan por un aminoácido sencillo (CXC) o están adyacentes (CC) . Las quimiocinas CXC, tales como interleucina 8 (IL-8), proteina 2 activada por neutrófilo (NAP-2) y proteina activada estimuladora del crecimiento de melanoma (MGSA) son quimiotácticas principalmente para los neutrófilos y linfocitos T, mientras que las quimiocinas CC, tales como RANTES, ???-?a, ???-?ß, las proteínas quimiotácticas de monocitos (MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, y MCP-5) y las eotaxinas (-1 y -2) son quimiotácticas para, entre otros tipos de células, macrófagos, linfocitos T, eosinófilos, células dendríticas y basófilos. También existen las quimiocinas linfotactina-1 , linfotactina-2 , (ambas quimiocinas C) , y fractalquina (una quimocina CX3C) que no caen en ambas de las subfamilias de quimocina principales. Las quimiocinas se enlazan a receptores de superficie celular específicos que pertenecen a la familia de proteínas de siete dominios de transmembrana acopladas a la proteína G (revisión en Horuk, Trends Pharm. Sci., 1994, 15, 159-165) que se llaman "receptores de quimiocina". En el enlace de sus ligandos similares, los receptores de quimiocina transducen una señal intracelular a través de las proteínas G triméricas asociadas, lo que resulta en, entre otras respuestas, un rápido incremento en la concentración de calcio intracelular, cambios en la forma celular, incremento en la expresión de moléculas de adhesión celular, desgranulación y promoción de la migración celular. Hay al menos diez receptores de quimiocina humana que se enlazan o responden a las quimiocinas CC con los siguientes patrones característicos (revisado en Zlotnik and Oshie Immunity 2000, 12, 121) : CCR-1 (o "CKR-1" o "CC-CKR-1") [MIP-la, MCP-3, MCP-4, RANTES] ( Ben-Barruch , et al., Cell 1993, 72, 415-425, and Luster, New Eng . J. Med. , 1998, 338, 436-445); CCR-2A y CCR-2B (o "CKR-2A"/"CKR-2B" o "CC-CKR-2A"/"CC-CKR-2B") [MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5] (Charo, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1994, 91, 2752-2756, and Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445); CCR-3 (o "CKR-3" o "CC-CKR-3") [eotaxina-1, eotaxina-2, RANTES, MCP-3, MCP-4] (Combadiere, et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 16491-16494, and Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445); CCR-4 (o "CKR-4" o "CC-CKR-4") [TARC, MDC] (Power et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 19495-19500, and Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445); CCR-5 (o "CKR-5" o "CC-CKR-5") [MIP-la, RANTES, IP-?ß] (Sansón, et al., Biochemistry 1996, 35, 3362-3367); CCR-6 (o "CKR-6" o "CC-CKR-6") [LARC] (Baba et al., J. Biol. Chem. 1997, 272, 14893-14898); CCR-7 (o "CKR-7" o "CC-CKR-7") [ELC] (Yoshie et al., J. Leukoc. Biol. 1997, 62, 634-644); CCR-8 (o "CKR-8" o "CC-CKR-8") [1-309] (Napolitano et al., J. Immunol. 1996, 157, 2759-2763); CCR-10 (o "CKR-10" o "CC-CKR-10") [ CP-l, MCP-3] (Bonini et al., DNA and Cell Biol. 1997, 16, 1249-1256); y CCR-11 [MCP-l, MCP-2, y MCP-4] (Schweickert, et al., Biol. Chem 2000, 275, 90550). Además de los receptores de quimiocina de mamíferos, los citomegalovirus de mamífero, virus del herpes y virus de viruela, han demostrado que expresan, en células infectadas, proteínas con las propiedades de enlace de los receptores de quimiocina (revisión en: Wells and Schwartz, Curr. Opin, Biotech. 1997, 8, 741-748). Las quimiocinas CC humanas, tales como RANTES y MCP-3, pueden causar una rápida movilización del calcio por medio de estos receptores viralmente codificados. La expresión · del receptor puede tolerar la infección al permitir la subversión de la vigilancia y respuesta del sistema inmune normal a una infección. Adicionalmente, los receptores de quimiocina humanos, tales como CXCR4 , CCR2, CCR3, CCR5 y CCR8, pueden actuar como co-receptores para la infección de células de mamífero por microbios como con, por ejemplo, los virus de inmunodeficiencia humana (VIH) . Los receptores de quimiocina y sus similares se han implicado como mediadores importantes de trastornos y enfermedades inflamatorias, infecciosas e inmunoreguladoras , que incluyen el asma y enfermedades alérgicas, así como patologías autoinmunes tales como artritis reumatoide y esclerosis múltiple; y enfermedades metabólicas, tales como ateroesclerosis y diabetes (revisado en: Charo and Rasonhoff, New Eng. J. Med. 2006, 354, 610-621; Z. Gao and W. A. Metz, Chem. Rev. 2003, 3733; P. H. Cárter, Current Opinión in Chemical Biology 2002, 6, 510; Trivedi, et al, Ann. Reports Med. Chem. 2000, 35, 191; Saunders and Tarby, Drug Disc. Today 1999, 4, 80; Premack and Schall, Nature Medicine 1996, 2, 1174). Por ejemplo, el quimioatrayente de monocito de quimiocina 1 (MCP-1) y su receptor del Receptor 2 de Quimiocina 2 CC (CCR-2) juegan un papel esencial en atraer leucocitos a los sitios de inflamación y posteriormente en activar estas células. Cuando la quimiocina MCP-1 se enlaza a CCR-2, se induce un incremento rápido en la concentración de calcio intracelular, se incrementa la expresión de las moléculas de adhesión celular, y la promoción de la migración de leucocitos. La demostración de la importancia de la interacción MCP-l/CCR-2 se ha proporcionado por experimentos con ratones genéticamente modificados. Los ratones MCP-l_/~ no fueron capaces de reclutar monocitos en los sitios de inflamación después de varios tipos diferentes de pruebas inmunogénicas (Bao Lu, et al., J. Exp. Med. 1998, 287, 601). Similarmente, los ratones CCR-2 -/- no fueron capaces de reclutar monocitos o producir el interferón ? cuando se aplica la prueba inmunogénica con varios agentes exógenos; por otro lado, ' los leucocitos de los ratones sin CCR-2 no migraron en respuesta al MCP-1 (Landin Boring, et al., J. Clin. Invest. 1997, 100, 2552), por lo que se demuestra la especificidad de la interacción MCP-l/CCR-2. Otros dos grupos han reportado independientemente resultados equivalentes con diferentes cepas de ratones CCR-2 -/- (William A. Kuziel, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 1997, 94, 12053, y Takao Kurihara, et al., J. Exp. Med. 1997, 186, 1757). La viabilidad y generalmente la salud normal de los animales MCP-1 -/- y CCR-2 -/- es notable, en que la disrupción de la interacción MCP-l/CCR-2 no induce una crisis fisiológica. Tomados en conjunto, estos datos llevan a la conclusión de que las moléculas que bloquean las acciones de MCP-1/CCR2 serian útiles en el tratamiento de un número de trastornos inflamatorios y autoinmunes (revisado en: M. Feria and F. Diaz-González , Exp. Opin. Ther. Patents 2006, 16, 49; and J. Da son, W. Miltz, and C. Wiessner, C. Exp. Opin. Ther. Targets 2003, 7, 35) . Esta hipótesis no se ha validado en un número de diferentes modelos de enfermedad animal, como se describe a continuación.
Se conoce que MCP-1 se sobreregula en pacientes con artritis reumatoide (Alisa Koch, et al., J. Clin. Invest. 1992, 90, 772-779) . Por otro lado, varios estudios preclinicos han demostrado el valor terapéutico potencial del antagonismo de la interacción MCP-1/CCR2 en el tratamiento de la artritis reumatoide. Una vacuna de ADN que codifica MCP-1 se ha mostrado recientemente para aliviar la artritis inducida por poliadyuvantes crónicos en ratas (Sawsan Youssef, et al., J. Clin. Invest. 2000, 106, 361). Similarmente, los síntomas de la enfermedad podrían controlarse por medio de la administración directa de anticuerpos para MCP-1 a las ratas con artritis inducida por colágeno (Hiroomi Ogata, et al., J. Pathol. 1997, 282, 106), o artritis inducida por la pared celular de estreptococos (Ralph C. Schimmer, et al., J. Immunol. 1998, 160, 1466). Quizá más significativamente, un antagonista péptido de MCP-1, MCP-1 (9-76), se muestra que previene tanto el inicio de la enfermedad como la reducción de los síntomas de la enfermedad (dependiendo del tiempo de administración) en el modelo de ratón MRL-lpr de artritis (Jiang-Hong Gong, et al., J. Exp. Med. 1997, 186, 131). Adicionalmente, se ha demostrado que la administración de antagonistas CCR2 de molécula pequeña reduce el registro clínico en modelos de roedores con artritis (C. M. Brodmerkel, et al, J. Immunol. 2005, 175, 5370; and M. Xia, et al. Solicitud de Patente de EUA 0069123, 2006) . La administración de un anticuerpo anti-CCR2 tuvo efectos variados en CIA de murino, dependiendo del tiempo de administración (H. Bruhl, et al. J. Immunol. 2004, 172, 890). Los estudios recientes con ratones CCR2-/- han sugerido que la eliminación de CCR2 pueden exacerbar modelos de artritis en roedores en circunstancias experimentales especificas (M. P. Quiñones, et al. J. Clin. Invest. 2004, 113, 856: M. P. Quiñones, et al. J. Mol. Med. 2006, 84, 503) . Se conoce que el MCP-1 se sobreregula en lesiones ateroescleróticas, y se ha mostrado que los niveles circulantes de MCP-1 se reducen a través del tratamiento con agentes terapéuticos (Abdolreza Rezaie-Majd, et al, Arterioscler . Thromb. Vasc. Biol. 2002, 22, 1194 - 1199). Varios estudios clave han demostrado el valor potencial terapéutico del antagonismo de la interacción MCP-1/CCR2 en el tratamiento de la ateroesclerosis . Por ejemplo, cuando los ratones MCP-1 -/- se aparean con ratones deficientes en el receptor LDL, se observa una reducción del 83% en la deposición de lipido aórtico (Long Gu, et al., Mol. Cell 1998, 2, 275) . Similarmente, cuando el MCP-1 se extirpa genéticamente de los ratones que ya sobreexpresan la apolipoproteina B humana, los ratones resultantes se protegieron de la formación de lesión ateroesclerótica con relación a los ratones de control MCP-1 +/+ apoB (Jennifa Gosling, et al., J. Clin. Invest. 1999, 103, 773).
Similarmente, cuando los ratones CCR-2 -/- se cruzan con ratones con apolipoproteina E -/-, se observa una reducción importante en la incidencia de lesiones ateroescleróticas (Landin Boring, et al. Nature 1998, 394, 894; T. C. Dawson, et al. Atherosclerosis 199, 143, 205). Finalmente, cuando los ratones E -/- con apolipoproteina se les administra un gen que codifica un antagonista péptido de CCR2, entonces el tamaño de lesión se reduce y la estabilidad de placa se incrementa (W. Ni et al. Circulation 2001, 103, 2096 - 2101). El transplante de médula ósea de ratones CCR2-/- en ratones ApoE3-Leiden inhibió la aterogénesis temprana (J. Guo, et al. Arterioscler . Thromb. Vasc. Biol.. 2003, 23, 447), pero tuvo efectos mínimos en lesiones avanzadas (J. Gou, et al. Arterioscler. Thomb. Vasc. Biol.. 2005, 25, 1014). Los pacientes con diabetes mellitus tipo 2 típicamente muestran resistencia a la insulina como una de las características de marca de contraste de la enfermedad. La resistencia a la insulina también se asocia con el agrupamiento de anormalidades conocidas como el "síndrome metabólico" o "síndrome X", el cual incluye obesidad, ateroesclerosis , hipertensión, y dislipidemia (revisado en: Eckel, et al. Lancet 2005, 365, 1415). Es bien reconocido que la inflamación juega un papel en exacerbar el proceso de la enfermedad en la diabetes tipo 2 y las patologías del "síndrome X" (revisado en: Chen, Pharmacological Research 2006, 53, 469; Neels and Olefsky, J. Clin. Invest. 2006, 116, 33; Danadona and Aijada, Am J Cardiol. 2002 90, 27G-33G; Pickup and Crook, Diabetologia 1998, 41, 1241) . El CP-1 se reconoce que juega un papel en la resistencia de la insulina inducida por obesidad. En cultivo, los preadipocitos humanos constitutivamente expresan MCP-1 (Gerhardt, Mol. Cell. Endocrinology 2001, 175, 81) . El CCR2 se expresa en adipocitos; la adición de MCP-1 para adipocitos in vitro disminuye la absorción de glucosa estimulada por insulina y la expresión de varios genes adipogénicos (LpL, adipsina, GLU-4), aP2, receptor adrenérgico ß3, y PPARy) (P. Sartipy and D. Loskutoff, Proc. Nati. Acad. Sci USA 1999, 96, 6902). Los pacientes con diabetes tipo 2 tuvieron niveles mayores de MCP-1 circulante que los controles no diabéticos (S. Nomura, et al. Clin. Exp . Immunol. 200, 121, 437), y la liberación de MCP-1 de tejido adiposo puede reducirse por el tratamiento con terapias anti-diabéticas tales como metformina o tiazolidindionas (J. M. Bruñí, et al. J. Clin. Endocrinol . Metab. 2005, 90, 2282) . Similarmente, el MCP-1 también se sobreexpresa en modelos de obesidad experimentales de murino, y se produjo principalmente por tejido adiposo (Sartipy and Loskutoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2003, 100, 7265). En ratones obesos, la expresión de MCP-1 tanto precedió como sucedió concurrentemente con el comienzo de la resistencia de insulina (H. Xu, et. J. Clin. Invest. 2003, 112, 1821). Otro estudio muestra que la expresión de MCP-1 se correlaciona positivamente con masa corporal en el tejido adiposo perigonadal de ratones (Weisberg, et al. J. Clin. Invest. 2003, 112, 1796). Consistente con estos datos, el desarrollo de la resistencia de insulina en ratones db/db se alivió ya sea por medio de la eliminación genética de MCP-1 o por expresión inducida por el gen de un péptido negativo dominante (H. Kanda, et al. J. Clin. Invest. 2006, 116, 1494). La conversión lógica también se puede demostrar: sobreexpresion de MCP-1 en tejido adiposo promovido por la resistencia a la insulina (N. Kamei, et al. J. Biol . Chem. 2006, 281, 26602). Un resultado conflictivo que muestra que la eliminación genética de MCP-1 no afecta la resistencia a la insulina en los ratones db/db también ha aparecido (F. Y. Cho . et al., Diabetologica 2007, 50, 471). Consistente con los datos en MCP-1, los estudios directos con CCR2 (el receptor MCP-1) ha demostrado que juega un papel en la formación de obesidad y resistencia a la insulina inducida por obesidad. El mantenimiento de una dieta alta en grasa incrementa los números de monocitos inflamatorios CCR2+ circulantes en ratones tanto tipo silvestre (C. L. Tsou, et al. J. Clin. Invest. 2007, 117, 902) como ApoE~ _ (F. Tacke, et al. J. Clin. Invest. 2007, 117, 185). La eliminación genética de CCR2 redujo los números de macrófagos activados en tejido adiposo de murino (C. N. Lumeng, et al. Diabetes 2007, 56, 16), pero no afectó a una población de macrófagos adiposos M2 no obstante para mantener el estado "magro" (C. N. Lumeng, et al. J. Clin. Invest. 2007, 117, 175). La eliminación genética de obesidad inducida por dieta reducida por CCDR2 y sensibilidad de insulina mejorada en modelo de obesidad inducida por dieta (S. P. Weisberg, et al. J. Clin. Invest. 2006, 116, 115; P Cornelius, RP Gladue, RS Sebastián, Patente de WO 2006/013427 A2) 2006), dependiendo de las condiciones experimentales (A. Chen, et al. Obes. Res. 2005, 13, 1311). La administración de una molécula pequeña CCR2 antagonista también mejora la sensibilidad de insulina en este mismo modelo (S. P. Weisberg, et al. J. Clin. Invest. 2006, 116, 115) . Dos estudios describieron el papel importante de CCR2 en inflamación vascular inducida por hipertensión, remodelación, e hipertrofia (E Bush et al., Hipertensión 200, 36, 360; M Ishibashi, et al. Circ. Res. 2004, 94, 1203). Se conoce que las CP-l se sobreregulan en esclerosis múltiple humana, y se ha mostrado que la terapia efectiva con interferón ß-lb reduce la expresión de MCP-1 en células mononucleares de sangre periférica, lo que sugiere que la CP-1 juega un papel en el progreso de la enfermedad (Carla Iarlori, et al., J. Neuroimmunol . 2002, 123, 170-179). Otros estudios han demostrado el valor terapéutico potencial del antagonismo de la interacción MCP-l/CCR-2 en el tratamiento de la esclerosis múltiple; todos estos estudios se han demostrado en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) , el modelo animal convencional para esclerosis múltiple. La administración de anticuerpos para MCP-1 a animales con EAE, disminuye de manera importante la recurrencia de la enfermedad (K. J. Kennedy, et al., J. Neuroimmunol . 1998, 92, 98). Adicionalmente, dos reportes recientes han mostrado ahora que los ratones CCR-2 -/- son resistentes a EAE (B. T. Fife, et al., J. Exp. Med. 2000, 192, 899; Leonid Izikson, et al., J. Exp. Med. 2000, 192, 1075) . Un reporte posterior extiende estas observaciones iniciales al examinar los efectos de la eliminación de CCR2 en ratones de diferentes cepas (S. Gaupp, et al. Am. J. Pathol. 2003, 162, 139). Notablemente, la administración de un antagonista CCR2 de molécula pequeña también bloqueó la progresión de la enfermedad en ratones C57BL/6 (C. M. Brodmerkel, et al. J. Immunol . 2005, 175, 5370) . Se conoce que la MCP-1 se sobreregula en pacientes que desarrollan el síndrome de obliteración de bronquiolitis después del transplante de pulmón (Martine Reynaud-Gaubert , et al., J. of Heart and Lung Transplant., 2002, 21, 721-730; John Belperio, et al., J. Clin. Invest. 2001, 108, 547-556). En el modelo murino del síndrome de obliteración de bronquiolitis, la administración de un anticuerpo a MCP-1 lleva al alivio de la obstrucción de las vías respiratorias; similarmente, los ratones CCR2 -/- son resistentes a la obstrucción de las vías respiratorias en el mismo modelo (John Belperio, et al., J. Clin. Invest. 2001, 108, 547-556). Estos datos sugieren que el antagonismo de CP-1/CCR2 puede ser benéfico en el tratamiento del rechazo de órganos después del transplante. Además, los estudios han mostrado que la disrupción del eje MCP-1/CCR2 es capaz de prolongar la supervivencia del transplante de isleta (I Lee et al. J Immunol 2003, 171, 6929; R Abdi et al., J Immunol 2004, 172, 767). En modelos de injerto de ratas, CCR2 y MCP-1 se mostró para sobreregular en injertos que desarrollan vasculopatia de injerto (K Horiguchi et al., J Heart Lung Transplant. 2002, 21, 1090). En otro estudio, la terapia de gen anti-MCP-1 atenúa con la vasculopatia de injerto (A Saiura et al., Artherioscler Thromb Vasc Biol 2004, 24, 1886). Un estudio descrbió la inhibición de la formación neointima de injerto de la vena experimental de MCP-1 (H Tatewaki et al., J Vasc Surg. 2007, 45, 1236). Otros estudios han demostrado el valor terapéutico potencial del antagonismo de la interacción MCP-1/CCR2 en el tratamiento del asma. La detención de MCP-1 con un anticuerpo neutralizante en ratones con prueba inmunogénica con ovalbúmina resulta en una reducción marcada en las hiperrespuestas bronquiales y la inflamación (Jose-Angel Gonzalo, et al., J. Exp. Med. 1998, 188, 157). Se prueba que es posible reducir la inflamación alérgica de las vías respiratorias en ratones con prueba inmunogénica con huevos de Schistosoma mansoni a través de la administración de anticuerpos para MCP-1 (Nicholas W. Lukacs, et al., J. Immunol. 1997, 158, 4398). Consistente con esto, los ratones MCP-1 -/- exhiben una respuesta reducida a la prueba inmunogénica con huevos de Schistosoma mansoni (Bao Lu, et al., J. Exp. Med. 1998, 187, 601). Otros estudios han demostrado el valor terapéutico potencial del antagonismo de la interacción MCP-1/CCR2 en el tratamiento de enfermedades del riñon. La administración de anticuerpos para MCP-1 en un modelo murino de nefritis glomerular, resulta en una reducción marcada en la formación creciente glomerular y la deposición del colágeno de tipo I (Clare M. Lloyd, et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 1371). Además, los ratones MCP-1 -/- con nefritis de suero nefrotóxico inducido muestran importantemente menos daño tubular que sus contrapartes MCP-1 +/+ (Gregory H. Tesch, et al., J. Clin. Invest. 1999, 103, 73). Varios estudios han demostrado el valor terapéutico potencial del antagonismo de la interacción MCP-1/CCR2 en el tratamiento del lupus eritematoso sistémico. Los ratones CCR2" _ muestran supervivencia prolongada y reducen la enfermedad renal con relación a su contraparte T en un modelo murino de lupus eritematoso sistémico (G. Pérez de Lema, et al. J. Am. Soc. Neph. 2005, 16, 3592). Estos datos son consistentes con la actividad que modifica la enfermedad encontrada en estudios recientes en la eliminación genética de MCP-1 (S. Shimizu, et al. Rheumatology (Oxford) 2004, 43, 1121; Gregory H. Tesen, et al., J. Exp. Med. 1999, 190, 1813) o la administración de un antagonista péptido de CCR2 (H. Hasegawa, et al. Artritis & Rheumatism 2003, 48, 2555) en modelos de roedores de lupus. Un incremento marcado de 30 veces en linfocitos de la lamina propria CCR2+ se observó en los intestinos delgados de pacientes con enfermedad de Crohn con relación al íleo sin enfermedad (S. J. Connor, et al. Gut 2004, 53, 1287). También se nota, que hay una expansión en el subconjunto de monocitos CCR2+/CD14+/CD56+ circulantes en pacientes con enfermedad de Crohn activa con relación a los controles. Diversos estudios en roedores han demostrado el valor terapéutico potencial de antagonismo de la interacción MCP-1/CCR2 en el tratamiento de enfermedad de Crohn/colitis. Los ratones CCR2_ ~ se protegieron de los efectos de la colitis inducida por sulfato de sodio de dextrano (Pietro G. Andrés, et al., J. Immunol. 200, 164, 6303). La administración de un antagonista de molécula pequeña de CCR2, CCR5 y CXCR3 (afinidades de enlace de murino = 24, 236 y 369 nM, respectivamente) también se protege contra la colitis inducida por sulfato de sodio de dextrano (H. Tokuyama, et al. Int. Immunol. 2005, 17, 1023). Finalmente, los ratones MCP-1-/- mostraron daño colónico reducido substancialmente (tanto macroscópico como histológico) en un modelo inducido por hapteno de colitis (W. I. Khan, et al., Am. J. Physiol. Gastrointest . Liver Physiol. 2006, 291, G803).
Dos reportes describen la sobreexpresion de MCP-1 en las células epiteliales intestinales y mucosa del intestino de pacientes con enfermedad del intestino inflamatorio (H. C. Reinecker, et al., Gastroenterology 1995, 108, 40 and Michael C. Grimm, et al., J. Leukoc. Biol. 1996, 59, 804). Un estudio describió la asociación del polimorfismo del promotor en el gen MCP-1 con esceroderma (esclerosis sistémica) (S Karrer et al., J Invest Dermatol. 2005, 124, 92). En modelos relacionados de fibrosis de tejidos, la inhibición del eje CCR2/MCP-1 reduce la fibrosis en la piel (T Yamamoto and K Nishioka, J Invest Dermatol 2003, 121, 510; AM Ferreira et al., J Invest Deramtol. 2006, 126, 1900), pulmón (T Okuma et al., J Pathol . 2004, 204, 594; M Gharaee-Kermani et al., Cytokine 2003, 24, 266), riñon (K Kitagaea et al., Am J Pathol. 2004, 165, 237; T Wada et al., J Am Soc Naphrol 2004, 15, 940), corazón (S Hayashidani et al., Circulation 2003, 108, 2134) e hígado (S Tsuruta et al., Int J Mol Med. 2004, 14, 837). Un estudio ha demostrado el valor terapéutico potencial del antagonismo de la interacción MCP-1/CCR2 en el tratamiento de alveolitis.- Cuando ratas con lesión pulmonar del complejo inmune IgA se tratan intravenosamente con anticuerpos sacados de rata MCP-1 (JE) , los síntomas de la alveolitis se alivian parcialmente (Michael L. Jones, et al., J. Immunol. 1992, 149, 2147) . Varios estudios han demostrado el valor terapéutico potencial del antagonismo de la interacción MCP-1/CCR2 en el tratamiento de cáncer (revisado en: M. J. Craig and R. D. Loberg, Cáncer Metástasis Rev. 2006, 25, 611; I. Conti and B. Rollins, Seminars in Cáncer Biology 2004, 14, 149; R. Giles and R. D. Loberg, Curr. Cáncer Drug Targets 2006, 6, 659) . Cuando ratones inmunodeficientes que portan células de carcinoma de mama humano se trataron con un anticuerpo anti-MCP-1, se observó la inhibición de micrometástasis de pulmón y el incremento en la supervivencia (Rosalba Salcedo, et al., Blood 2000, 96, 34-40). Usando especies con tumor clínico humano, la expresión CCR2 se asoció con la progresión de cáncer de próstata (Y. Lu, et 1., J. Cell. Biochem. 2007, 101, 676) . Se ha mostrado in vitro, la expresión MCP-1 para mediar el crecimiento y la invasión de la célula de cáncer de próstata (Y. Lu et al., Prostate 2006, 66, 1311); adicionalmente, MCP-1 expresado por las células de cáncer de próstata inducido por los progenitores de la médula ósea humana para la reabsorción del hueso (Y. Lu, et al., Cáncer Res. 2007, 67, 3646) . Estudios múltiples han descrito el valor terapéutico potencial del antagonismo de la interacción de MCP-1/CCR2 en el tratamiento de las restenosis. En humanos, los niveles de MCP-1 se correlacionan directamente con el riesgo para las restenosis (F. Cipollone, et al. Arterioscler . Thromb. Vasc. Biol.. 2001, 21, 327). Los ratones deficientes en CCR2 o en MCP-1 muestran reducciones en el área intima y en la relación intima/media (con relación a las carnadas de tipo silvestre) después de la lesión de la arteria (Merce Roque, et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002, 22, 554; A. Schober, et al. Circ. Res. 2004, 95, 1125; W. J. Kim, et al. Biochem Biophys Res Común. 2003, 310, 936) . En ratones, la transfección de un inhibidor negativo dominante de MCP-1 en el músculo esqueletal (K. Egashira, et al. Circ. Res. 2002, 90, 1167) también reduce la hiperplasia intima después de la lesión arterial. El bloqueo de CCR2 usando un anticuerpo neutralizando reduce la hiperplasia neointima después de que se coloca en endoprotesis vascular en primates (C. Horvath, et al. Circ. Res. 2002, 90, 488). Dos reportes describen la sobreexpresión de ratas MCP-1 con trauma de cerebro inducido (J. S. King, et al., J. Neuroimmunol . 1994, 56, 127, and Joan W. Berman, et al., J. Immunol . 1996, 156, 3017). Además, los estudios han mostrado que tanto ratones CCR2" _ (O. B. Dimitri evic, et al., Stroke 2007, 38, 1345) como MCP-1"7" (P., M. Hughes, et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 2002, 22, 308) se protegen parcialmente de la lesión por isquemia/reperfusión. Se conoce que los monocitos/macrófagos juegan un papel importante en el desarrollo del dolor neuropático (Liu T, van Rooijen N, Tracey DJ, Pain 2000, 86, 25) . Consistente con esta noción, un papel potencial para CCR2 en el tratamiento de tanto el dolor inflamatorio como neuropático se han descrito recientemente. Los ratones CCR2~ _ muestran respuestas alteradas para dolor inflamatorio con relación a sus contrapartes WT, incluyendo comportamiento de dolor reducido después de la inyección de formalina entre las plantas y reduce ligeramente la alodinia mecánica después de la inyección CFA entre plantas (C. Abbadie, et al. Proc. Nati. Acad. Sci., USA 2003, 100, 7947). Además, los ratones CCR2_/" no desplegan alodinia mecánica importante después de lesión de nervio ciático. De forma similar, un antagonista CCR2 de molécula pequeña reduce la alodinia mecánica a -80% de niveles pre-lesión después de la administración oral (C. Abbadie, J. A. Lindia, and H. Wang, WO PCT 110376, 2004). Un estudio describió el papel critico de MCP-1 en cardiomiopatia isquémica (N. G. Frangogiannis , et al., Circulation 2007, 115, 584). Otro estudio describe la atenuación de insuficiencia cardiaca experimental seguido por la inhibición de MCP-1 (S Hayashidani et al., Circulation 2003, 108, 2134) . Otros estudios han proporcionado evidencia de que la MCP-1 se sobreexpresa en varios estados de enfermedad no mencionados arriba. Estos reportes proporcionan una evidencia correlativa de que los antagonistas de MCP-1 podrían ser terapéuticos útiles para tales enfermedades. Otro estudio ha demostrado la sobreexpresion de MCP-l en aloinjertos cardiacos de roedores, lo que sugiere un papel para la MCP-l en la patogénesis de la arterieesclerosis de transplante (Mary E. Russell, et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6086). La sobreexpresion de MCP-l se ha notado en las células endoteliales de pulmón de pacientes con fibrosis pulmonar idiopática (Harry N. Antoniades, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1992, 89, 5371). Similarmente, la sobreexpresion de MCP-l se ha notado en la piel de pacientes con psoriasis (M. Deleuran, et al., J. Dermatol. Sci. 1996, 13, 228, and R. Gillitzer, et al., J. Invest. Dermatol. 1993, 102, 127); los hallazgos correlativos con predominancia de células CCR2+ también se han reportado (C. Vestergaard, et al. Acta Derm. Venerol . 2004, 84, 353). Finalmente, un reporte reciente ha mostrado que MCP-l se sobreexpresa en los cerebros y fluido cerebroespinal de pacientes con demencia asociada con el VIH-1 (Alfredo Garzino-Demo, O 99/46991) . Además, se ha demostrado que el polimorfismo CCR2 se asocia con la sarcoidosis al menos en un subconjunto de los pacientes (P. Spagnolo, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2003, 168, 1162) . También deberá notarse que CCR-2 se ha implicado como un co-receptor para algunas cepas de VIH (B. J. Doranz, et al., Cell 1996, 85, 1149) . También se ha determinado que el uso de CCR-2 como un co-receptor del VIH está correlacionado con el progreso de la enfermedad (Ruth I. Connor, et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 621) . Este hallazgo es consistente con el reciente hallazgo de que la presencia de un mutante CCR-2, CCR2-64I, está correlacionado positivamente con el retardo en el inicio del VIH en la población humana (Michael W. Smith, et al., Science 1997, 277, 959). No obstante que la MCP-1 no se ha implicado en estos procesos, puede ser que los antagonistas de MCP-1 que actúan por medio del enlace al CCR-2 puedan tener efectos terapéuticos benéficos en el retardo del progreso de la enfermedad para el SIDA en pacientes infectados con el VIH.
Se notará que CCR-2 también es el receptor para las quimiocinas MCP-2, MCP-3 y MCP-4 (Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445) . Ya que los nuevos compuestos de la fórmula (I) descritos en la presente, antagonizan la MCP-1 por el enlace al receptor CCR-2, puede ser que estos compuestos de la fórmula (I) también sean antagonistas efectivos de las acciones de MCP-2, MCP-3 y MCP-4 que están mediadas por CCR-2. En consecuencia, cuando se hace referencia a "antagonismo del MCP-1", se supone que esto es un equivalente de "antagonismo de la estimulación de quimiocina de CCR-2". En consecuencia, los compuestos que modulan la actividad de quimiocina pueden demostrar un intervalo amplio de utilidades al tratar enfermedades inflamatorias, alérgicas, autoinmunes, metabólicas, cáncer y/o cardiovasculares. La Publicación de Solicitud de Patente de EUA. WO2005021500 Al (incorporado en la presente para referencia y se asigna a la solicitud presente) describe compuestos que modulan la actividad MCP-1, MCP-2, MCP-3 y MCP-4 por medio de CCR2. La referencia también describe varios procesos para preparar estos compuestos incluyendo síntesis de etapa múltiple que incluye la introducción y la eliminación posterior de grupos protectores . Es deseable encontrar nuevos compuestos con características farmacológicas mejoradas comparadas con moduladores de la quimiocina conocida. Por ejemplo, es deseable encontrar nuevos compuestos con actividad inhibidora CCR-2 mejorada y selectividad para CCR-2 contra otros receptores acoplados a la proteína G (esto es, receptor 5HT2A) . También es deseable encontrar compuestos con características ventajosas y mejoradas en una o más de las siguientes categorías: (a) propiedades farmacológicas (esto es, solubilidad, permeabilidad, receptibilidad para formulaciones de liberación sostenida) ; (b) requerimientos de dosis (por ejemplo, dosis inferiores y/o dosis una vez diaria) ; (c) factores los cuales disminuyen las características a través de un pico de concentración de sangre (esto es, liberación y/o volumen de la distribución); (d) factores que incrementan la concentración de fármaco activo al receptor (esto es, proteina enlazada, volumen de distribución) ; (e) factores que disminuyen la responsabilidad de interacciones clínicas fármaco-fármaco (inhibición o inducción de la enzima P450 de citocromo, tales como inhibición de CYP 2D6, ver G.K. Dresser, J.D. Spence, D.G. Bailey, Clin. Pharmacolkinet . 2000, 38, 41-57, la cual se incorpora en la presente para referencia) ; (f) factores que disminuyen el potencial para efectos secundarios adversos (por ejemplo, receptores acoplados a la proteína G superiores a la selectividad farmacológica, reactividad metabólica o química potencial, penetración CNS limitada, selectividad del canal de ion) . Es específicamente deseado encontrar compuestos que tienen una combinación deseada de las características farmacológicas antes mencionadas. También se desea en la técnica proporcionar procesos nuevos y/o mejorados para preparar tales compuestos. Estos procesos pueden caracterizarse, sin limitación, por a) adaptación fácil para producción a grande escala, tales como planta piloto o escalas de manufactura; b) etapas de procesos y/o técnicas que faciliten mejoras en la pureza (incluyendo pureza química), estabilidad y/o facilidad de manejo de los intermediarios y/o compuestos finales; y/o c) menores etapas de proceso. Sumario de la Invención La presente invención proporciona antagonistas o agonistas/antagonistas parciales novedosos de la actividad del receptor CP-1: N- ( (IR, 2S, 5R) -5- ( tert-butilamino) -2- ( (S) -2- oxo-3- ( 6- (trifluorometil ) quinazolin-4 -ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, o un sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptables de los mismos, que tiene una combinación inesperada de características farmacológicas deseables. Las formas cristalinas de la presente invención también se proporcionan. Las composiciones farmacéuticas que contienen los mismos y los métodos de uso de los mismos como agentes para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades alérgicas, autoinmunes, metabólicos, cáncer y/o cardiovasculares también es un objetivo de esta invención. La presente descripción también proporciona un proceso para preparar los compuestos de la fórmula (I), incluyendo N-( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-( trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino )pirrolidin-l-il ) ciclohexil ) acetamida : en donde son como se describen en la presente. Los compuestos que son intermediarios útiles de los procesos también se proporcionan en la presente.
La presente descripción también proporciona el uso de N-( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il) ciclohexil) acetamida, o un sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptables, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades alérgicas, autoinmunes, metabólicos, cáncer y/o cardiovasculares. Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Patrones en polvo experimentales y simulados de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, hemi-hidrato, Forma HO.5-4. Figura 2. Patrones en polvo experimentales y simulados de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-(trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, base libre, Forma N-2. Figura 3. Patrones en polvo experimentales y simulados de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-( trifluorometil ) quinazolin-4 -ilamino) pirrolidin-1-il) ciclohexil) acetamida, 1.75 moles H20, Forma Hl.75-5. Figura 4. Patrones en polvo experimentales y simulados de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, solvato de mono-etanol, Forma E-l.
Figura 5. Patrones en polvo experimentales y simulados de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-( trifluorometil ) quinazolin-4 -ilamino) pirrolidin-l-il ) ciclohexil ) acetamida , solvato de ácido mono-acético, Forma HAC-1. Figura 6. Patrones en polvo experimentales y simulados de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- ( 6-(trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il ) ciclohexil ) acetamida , solvato de mono-R-propilen glicol, Forma RPG-3. Figura 7. DSC de N-((lR,2S,5R)-5- (tert-butilamino) -2-( (S) -2-OXO-3- (6- (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, hemi-hidrato, Forma HO.5-4. Figura 8. TGA de N-( (lR,2S,5R)-5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-OXO-3- (6- (trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, hemi-hidrato, Forma HO.5-4. Figura 9. DSC de N-( (lR,2S,5R)-5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-OXO-3- ( 6- (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, base libre, Forma N-2. Figura 10. TGA de N-( (lR,2S,5R)-5- (tert-butilamino) - 2- ( (S) -2-OXO-3- (6- (trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, base libre, Forma N-2. Figura 11. Isotermía de Sorción de Vapor de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( ( S ) -2-oxo-3- ( 6-( trifluorornetil ) quinazolin-4 -ilamino )pirrolidin-l-il ) ciclohexil ) acetamida, base libre, Forma N-2 a 25°C. Figura 12. DSC de N-( (lR,2S,5R)-5- (tert-butilamino) - 2- ( (S) -2-OXO-3- ( 6- ( trifluorornetil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, 1.75 moles H20, Forma Hl.75-5. Figura 13. TGA de N- ( (1R,2S, 5R) -5- (tert-butilamino) - 2- ( (S) -2-???-3- (6- (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, 1.75 moles H20, Forma Hl.75-5. Figura 14. DSC de N-((lR,2S,5R)-5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-OXO-3- ( 6- (trifluorometil ) quinazolin- -ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, solvato de ácido mono-acético, Forma HAC-1. Figura 15. TGA de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) - 2- ( (S) -2- OXO-3- (6- (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, solvato de ácido mono-acético, Forma HAC-1. Figura 16. DSC de N- (( IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) - 2- ( (S) -2-OXO-3- ( 6- (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, solvato de mono-etanol, Forma E-l.
Figura 17. TGA de N-((lR,2S,5R)-5- (tert-butilamino) - 2- ( ( S ) -2-OXO-3- ( 6- (trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, solvato de mono-etanol, Forma E-l. Figura 18. DSC de N-((lR,2S,5R)-5- (tert-butilamino) - 2- ( (S) -2-OXO-3- (6- (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il ) ciclohexil ) acetamida, solvato de mono-R-propilen glicol, Forma RPG-3. Figura 19. TGA de N-((lR,2S,5R)-5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-OXO-3- (6- ( trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il ) ciclohexil ) acetamida, solvato de mono-R-propilen glicol, Forma RPG-3. Figura 20. Modelo de desafio intradermal en monos cinomólogos: El Ejemplo 1 inhibe el reclutamiento celular mononuclear a la piel. Figura 21. Peritonitis TG de 48 horas en ratón hCCR2 KI : Ejemplo 1 inhibición de la infiltración de monocito/macrófago en la cavidad peritoneal. Figura 22. EAE en ratón hCCR2 KI (encefalomielositis autoinmune experimental) : Ejemplo 1 tratamiento de calificación clínica reducida. Figura 23. Espectro de RMN de protones del Ejemplo 1, 2da Preparación Alternativa, Etapa 3- Compuesto 7. Figura 24. Espectro de RMN de protones del Ejemplo 1, 2da Preparación Alternativa, Etapa 4 - Compuesto 8.
Figura 25. Espectro de RMN de protones del Ejemplo 1, 2da Preparación Alternativa, Etapa 4 - Compuesto 9. Figura 26. Espectro de RMN de protones del Ejemplo 1, 2da Preparación Alternativa, Etapa 4 - Compuesto 10. Figura 27. Espectro de RMN de protones del Ejemplo 1, 2da Preparación Alternativa, Etapa 5- Compuesto 11. Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona un antagonista o agón i s t a s / an t agoni s t a s parciales novedosos de la actividad del receptor MCP-1: - ( ( 1 R , 2 S , 5 R ) - 5 - ( t e r t -but i lamino )-2-( (S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida , o un sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptables de los mismos, que tiene una combinación inesperada de características farmacológicas deseables. Las formas cristalinas de la presente invención también se proporcionan. Las composiciones farmacéuticas que contienen los mismos y los métodos de uso de los mismos como agentes para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades alérgicas, autoinmunes, metabólicas, cáncer y/o cardiovasculares también es un objetivo de esta invención. La presente descripción también proporciona un proceso para preparar los compuestos de la fórmula (I) , incluyendo N-( (lR,2S,5R)-5- ( tert-but i lamino ) -2-( (S)-2-oxo-3-(6-( trifluorometil) quinazolin- -ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida : I en donde R1, R8, R9, R10 y son como se describen en la presente. Los compuestos que son intermediarios útiles de los procesos también se proporcionan en la presente. La N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-(trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il) ciclohexil) acetamida, demuestra inesperadamente una combinación deseable de características farmacológicas incluyendo un grado alto sorpresivamente de biodisponibilidad oral en combinación con indicaciones que es altamente eficaz y tiene criterios de seguridad excelentes. Los moduladores conocidos de los receptores CCR2, tales como aquellos descritos en la publicación de Patente WO2005021500 Al publicado el 10 de marzo de 2005 (Patente de EUA No. 7,163,937, presentada el 16 de Enero de 2007, asignado para la Solicitud actual) que demuestra un grado adecuado de permeabilidad de membrana (un factor critico de biodisponibilidad oral), no son suficientemente eficaces, como se mide por su capacidad de enlazar a CCR2 (una medición de eficacia), y/o carecen de criterios apropiados para seguridad como se indica por la selectividad del canal de iones como se mide por hERG y estudios del canal de iones Na+. En contraste, como se ilustra por los datos presentados en la presente en la sección titulada "Características farmacológicas comparativas", infra, la relatividad de molécula polar, N-( (lR,2S,5R)-5- (tert-butilamino) -2- ( ( S ) -2-oxo-3- ( 6- ( trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida demuestra un grado sorpresivamente alto de permeabilidad de membrana, y todavía mantiene la capacidad de enlazar a CCR2 potente junto con selectividad del canal de iones excelente. En consecuencia, la presente invención proporciona un modulador de quimiocina nuevo que tiene características farmacológicas mejoradas que se esperan para ser útiles en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, alérgicas, autoinmunes, metabólicas, de cáncer y/o cardiovasculares. MODALIDADES En una modalidad, la descripción se dirige a N- ( (IR, 2S, 5R) -5- ( tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6- ( trifluorometil ) quinazolin-4 -ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Otra modalidad es una forma cristalina de N- ( ( IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-( trifluorometil ) quinazolin-4 -ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, base libre. Otra modalidad es una forma cristalina de N- ( ( IR, 2S , 5R) -5- (tert-butilamino ) -2- ( ( S ) -2-oxo-3- ( 6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il) ciclohexil) acetamida, base libre, la forma cristalina comprende de la forma N-2. Otra modalidad es una forma N-2 caracterizada porque (o tiene) parámetros de célula unitaria substancialmente igual a lo siguiente: Dimensiones de célula: a = 18.7240 (4) b = 8.0171 (2) c = 19.6568 (5) a = 90 ß = 114.935 (2) ) ? = 90 V(Á3) = 2675.7 (1) Grupo de espacio ?2?2?2? Moléculas/célula unitaria 2 en donde el cristal es a una temperatura de alrededor de +22°C (TA) .
Otra modalidad es una forma N-2 caracterizada por (o tiene) un patrón de difracción de polvo de rayos X que comprende tres o más valores 2T (CuKa ? = 1.5418Á) seleccionados de 5.5, 9.1, 12.1, 14.0 y 19.2, a una temperatura de alrededor de 22 °C. Otra modalidad es una forma N-2 caracterizada por (o tiene) un patrón de difracción de polvo de rayos X que comprende además cuatro o más valores 2T (CuKa ? = 1.5418Á) seleccionados del grupo que de 5.5, 9.1, 12.1, 14.0 y 19.2 a una temperatura de alrededor de 22°C. Otra modalidad es una forma N-2 caracterizada por (o tiene) coordenadas atómicas fracciónales substancialmente como se enlistan en la Tabla 3. Otra modalidad es una forma N-2 caracterizada por (o tiene) un patrón de difracción de polvo de rayos X substancialmente de acuerdo a la figura 2. Otra modalidad es una forma cristalina de N- ( ( IR, 2S , 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( ( S ) -2-oxo-3- ( 6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, sal del ácido di-bencensulfónico, que comprende la forma Hl.75-5 (1.75 moles de agua), caracterizada por los parámetros de célula unitaria encontrados en la Tabla 1; 3 ó 4 o más valores 2T (CuKa ? = 1.5418Á) seleccionados de la Tabla 9; coordenadas atómicas fracciónales substancialmente como se enlistan en la Tabla 4; y/o un patrón de difracción de polvo de rayos X substancialmente de acuerdo a la figura 3. Otra modalidad es una forma cristalina de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, base libre, que comprende la forma HO.5-4 (hemi-hidrato) , caracterizada por los parámetros de célula unitaria encontrados en la Tabla 1; 3 ó 4 o más valores 2T (CuKa ? = 1.5418Á) seleccionados de la Tabla 9; coordenadas atómicas fracciónales substancialmente como se enlistan en la Tabla 2; y/o un patrón de difracción de polvo de rayos X substancialmente de acuerdo a la figura 1. Otra modalidad es una forma cristalina de N- ( ( IR, 2S , 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- ( 6-(trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il) ciclohexil) acetamida, base libre, que comprende la forma E-1 (solvato de mono-acetona) , caracterizada por los parámetros de célula unitaria encontrados en la Tabla 1; 3 ó 4 o más valores 2T (CuKa ? = 1.5418Á) seleccionados de la Tabla 9; coordenadas atómicas fracciónales substancialmente como se enlistan en la Tabla 5; y/o un patrón de difracción de polvo de rayos X substancialmente de acuerdo a la figura 4. Otra modalidad es la forma cristalina de N- ( ( IR, 2S, 5R) -5-( tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- ( 6-(trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida , base libre, que comprende la forma (solvato de ácido mono-acético) , caracterizada por los parámetros de célula unitaria encontrados en la Tabla 1; 3 ó 4 o más valores 2T (CuKa ? = 1.5418Á) seleccionados de la Tabla 6; coordenadas atómicas fracciónales substancialmente como se enlistan en la Tabla 6; y/o un patrón de difracción de polvo de rayos X substancialmente de acuerdo a la figura 5. Otra modalidad es una forma cristalina de N- ( ( IR, 2S , 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- ( 6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, base libre que comprende la forma IPA-1 (solvato de mono-isopropanol) , caracterizada por los parámetros de célula unitaria encontrados en la Tabla 1; 3 ó 4 o más valores 2T (CuKa ? = 1.5418Á) seleccionados de la Tabla 9; coordenadas atómicas fracciónales substancialmente como se enlistan en la Tabla 7. Otra modalidad es una forma cristalina de N- ( ( IR, 2S , 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- ( 6-(trifluorometil ) quinazolin-4 -ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida , base libre que comprende la forma RPG-3 (solvato de mono-R-propilen glicol) , caracterizada por los parámetros de célula unitaria encontrados en la Tabla 1; 3 ó 4 o más valores 2T (CuKa ? = 1.5418Á) seleccionados de la Tabla 9; coordenadas atómicas fracciónales substancialmente como se enlistan en la Tabla 8 y/o un patrón de difracción de polvos de rayos X substancialmente de conformidad a la figura Otra modalidad, es una composición farmacéutica, que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un compuesto de los ejemplos. Otra modalidad es un método para la modulación de la quimiocina o la actividad del receptor de la quimiocina, que comprende administrar a un paciente que necesite del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ej emplos . Otra modalidad es un método para la modulación de la actividad del receptor CCR-2 que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos. Otra modalidad es un método para la modulación de MCP-1, MCP-2, CP-3, y MCP-4 y la actividad MCP-5 que está mediada por el receptor CCR2 que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos. Otra modalidad es un método para la modulación de la actividad MCP-1 que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos. Otra modalidad es un método para inhibir la actividad CCR2 y CCR5 que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos. Otra modalidad es un método para tratar trastornos, que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos, los trastornos se seleccionan de otra modalidad es un método para tratar trastornos, que comprende administrar al paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos, los trastornos se seleccionan de diabetes, obesidad, síndrome metabólico, apoplejía, · dolor neuropático, cardiomiopatía isquémica, psoriasis, hipertensión, esqueroderma, osteoartritis , aneurisma, fiebre, enfermedad cardiovascular, enfermedad de Crohn, insuficiencia cardiaca congestiva, enfermedades autoinmunes, infección por VIH, demencia asociada con VIH, psoriasis, fibrosis pulmonar idiopática, arterieesclerosis por transplante, trauma cerebral físicamente o químicamente inducido, enfermedad inflamatoria del intestino, alveolitis, colitis, lupus eritematoso sistémico, nefritis de suero nefrotóxico, nefritis glomerular, asma, esclerosis múltiple, arterioesclerosis , vasculitis, placas vulnerables, artritis reumatoide, restenosis, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de injerto de diálisis, hiperplasia íntima de derivación arteriovenosa, transplante de órganos, nefropatía de aloinjerto crónico y cáncer. Otra modalidad es un método para tratar trastornos, que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos, en donde los trastornos se seleccionan de diabetes, obesidad, enfermedad de Crohn, psoriasis, fibrosis pulmonar idiopática, arterioesclerosis por transplante, trauma cerebral físicamente o químicamente inducido, enfermedad inflamatoria del intestino, alveolitis, colitis, lupus eritematoso sistémico, nefritis de suero nefrotóxico, nefritis glomerular, asma, esclerosis múltiple, arterioesclerosis y artritis reumatoide, restenosis, transplante de órganos, y cáncer. Otra modalidad es un método para tratar trastornos, que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos, en donde los trastornos se seleccionan de diabetes, obesidad, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, nefritis glomerular, esclerosis múltiple, arterioesclerosis, restenosis y transplante de órganos. Otra modalidad es un método para tratar trastornos, que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos, en donde los trastornos se seleccionan de esclerosis múltiple, arterioesclerosis, enfermedad de Crohn y diabetes. Otra modalidad es un método para tratar trastornos, que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos, en donde los trastornos se seleccionan de restenosis, transplante de órganos, y cáncer. Otra modalidad es un método para tratar diabetes, que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ej emplos . Otra modalidad es un método para tratar la enfermedad de Crohn, que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos. Otra modalidad es un método para tratar la esclerosis múltiple, que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos. Otra modalidad es un método para tratar la ateroesclerosis, que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos. Otra modalidad es un método para tratar la restenosis, que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ej emplos . Otra modalidad es un método para tratar el transplante de órganos, que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos. Otra modalidad es un método para tratar el cáncer, que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ej emplos . Otra modalidad es un método para tratar el cáncer, en donde el cáncer se selecciona de cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de próstata y melanoma. Otra modalidad es un método para tratar enfermedades inflamatorias, enfermedades alérgicas, autoinmunes, metabólicas, cáncer y/o cardiovasculares que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos. Otra modalidad es un métodos para tratar enfermedades inflamatorias, alérgicas, autoinmunes, metabólicas, cáncer y/o cardiovasculares las cuales son al menos parcialmente mediadas por CCR-2, que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos. Otra modalidad es un método para la modulación de la actividad CCR2 que comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ejemplos. Otra modalidad es un método para la modulación de la actividad MIP-?ß y RANTES que es mediada por el receptor CCR5 que comprende administrar a un paciente que necesite del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de los ej emplos . Otra modalidad es un compuesto de los ejemplos en la preparación de un medicamento para el tratamiento de diabetes, obesidad, síndrome metabólico, apoplejía, dolor neuropático, cardiomiopatía isquémica, psoriasis, hipertensión, esqueroderma, osteoartritis , aneurisma, fiebre, enfermedad cardiovascular, enfermedad de Crohn, insuficiencia cardiaca congestiva, enfermedades autoinmunes, infección por VIH, demencia asociada con VIH, psoriasis, fibrosis pulmonar idiopática, arterioesclerosis por transplante, trauma cerebral físicamente o químicamente inducido, enfermedad inflamatoria del intestino, alveolitis, colitis, lupus eritematoso sistémico, nefritis de suero nefrotóxico, nefritis glomerular, asma, esclerosis múltiple, arterioesclerosis, vasculitis, placas vulnerables, artritis reumatoide, restenosis, hiperplasis neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de injerto de diálisis, hiperplasia íntima de derivación arteriovenosa , transplante de órganos, nefropatía de aloinjerto crónica y cáncer . Otra modalidad es un compuesto de los ejemplos para uso en la terapia. La invención puede abarcarse en otras formas específicas sin salirse del espíritu o atributos esenciales de la misma.
Esta invención también abarca todas las combinaciones de los aspectos alternativos y modalidades de la invención notada en la presente. Se entenderá que cualesquiera y todas las modalidades pueden tomarse en conjunto con cualesquiera de otra modalidad para describir modalidades adicionales de la presente invención. Adicionalmente, cualesquiera de los elementos de una modalidad (incluyendo aspecto preferidos) pueden combinarse con cualesquiera y todos los otros elementos de cualesquiera de las modalidades para describir modalidades adicionales. MODALIDADES DE PROCESO La presente descripción proporciona un proceso novedoso para hacer los compuestos de la fórmla I: I Incluyendo N-((lR,2S,5R)-5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6- (trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida o una sal farmacéuticamente del mismo.
En una Ia modalidad, la descripción proporciona un proceso para preparar un compuesto de la fórmula IV, el proceso comprende: acoplar un derivado de aminoácido de la estructura III, o una sal del mismo, con una ciclohexanona de la fórmula II, o una sal del mismo (ver preparación en WO2005021500) , para proporcionar un compuesto de la estructura IV, o una sal del mismo que tiene una cadena lateral de amida substituida en donde: Ra y Rb son independientemente alcoxi Ci_6; o Ra y Rb junto con el carbono al cual ambos se enlazan se combinan para formar un carbonilo, un tiocarbonilo, un acetal cíclico o tioacetal cíclico, en donde el acetal cíclico o tioacetal cíclico se selecciona de -0-Z-O- y -S-Z-S-, Z es - (CTiT2)2, -(CTiT2)3, o y Ti, T2 y T3 cada que se presenta se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo C1-4 , alquenilo C2-4, halógeno, hidroxi, ciano, nitro, CF3, Oalquilo C1- 4 , OCF3, y C(=0) alquilo C1-4 (preferiblemente Ti, T2 y T3 son cada uno hidrógeno) ; i/ R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo protector amina; R4 es alquilo Ci_6 inferior o bencilo substituido opcionalmente ; Y es halógeno, SMe, S(Me)+Ri2, o OSO2R13; Y es OH, halógeno o OSO2R13; R12 es hidrógeno, alquilo Ci_6, -(CH2)C(0)0 alquilo Ci-6, o -(CH2)C(0)0 alquilo Ci_6; y R13 cada que se presenta es alquilo Ci_6. Los grupos protectores amina preferidos son grupos que se pueden remover por hidrólisis o hidrogenólisis bajo condiciones estándar. Tales grupos incluyen sin limitación, un grupo carbobenciloxi (Cbz), un tert-butiloxicarbonilo (BOC) , un grupo fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), un grupo bencilo (Bn) o un grupo p-metoxibencilo (PMB) . Más preferidos son grupos Cbz, BOC, o Bn (especialmente Cbz y Bn) . En una 2a modalidad, la presente descripción proporciona un proceso novedoso en donde: Ra y b junto con los átomos de carbono al cual ambos se enlazan combinados para formar un carbonilo o un grupo 1,3-dioxolano (especialmente un grupo 1, 3-dioxolano) ; Ri es hidrógeno; R2 es Cbz; R3 es hidrógeno; R4 es alquilo C1-6; Y es S (Me) ; y V es OH. En una 3a modalidad, donde Y es -SMe, la descripción proporciona un proceso que además comprende alquilación del compuesto de la fórmula IV con un grupo R12X, donde X es un halógeno, para formar una sal de sulfonio del mismo. El agente de alquilación es preferiblemente yoduro de metilo. En una 4 a modalidad, la descripción proporciona un proceso en donde ciclohexanona de la fórmula IV es una sal de toluensulfonato . En una 5a modalidad, la descripción proporciona un proceso en donde el compuesto de la fórmula IV es una sal de sulfonio . En una 6a modalidad, la descripción proporciona un proceso en donde el acoplamiento se conduce bajo una atmósfera inerte, tal como nitrógeno o argón (preferiblemente nitrógeno) en un solvente aprótico tal como proprionitrilo, acetato de isopropilo, acetato de n-butilo, acetato de tert-butilo o acetonitrilo (especialmente acetonitrilo y/o acetato de etilo) . En una 7a modalidad, la descripción proporciona un proceso en donde el acoplamiento se puede obtener por el contacto con un compuesto de la fórmula II con un reactivo de acoplamiento diimida en la presencia de un activador, y una base de amina terciaria. El reactivo de acoplamiento diimida incluye reactivos, por ejemplo tal como EDAC. Los Ejemplos de activadores incluyen HOBt ( (el término incluye hidratos del mismo) y N' , NT -4-dimetilamino-piridina . Una base de amina terciaria, incluye por ejemplo, trietilamina, N-N-disopropil-N-etil amina y tri-n-propilamina . En una 8a modalidad, la descripción proporciona un proceso en donde el reactivo de acoplamiento diimida es EDAC, el activador, es HOBt, (el término incluye hidratos del mismo) y la base de amina terciaria es trietilamina. En una 9a modalidad, la descripción proporciona un proceso en donde las relaciones en mol de un compuesto de la fórmula II para el reactivo de acoplamiento diimida para el activador para la amina terciaria es alrededor de uno hasta alrededor de 0.090 - 1.50 hasta alrededor de 0.95-1.50 hasta alrededor de 2.00 hasta 3.00, respectivamente. Las relaciones en mol son preferiblemente una hasta alrededor de 0.095 - 1.05 hasta alrededor de 0.95-1.10 y hasta alrededor de 2.10 hasta 2.20, respectivamente. En una 10a modalidad, la descripción proporciona un proceso novedoso para preparar un compuesto de la fórmula V que tiene una porción éster: proceso comprende ciclizar la cadena lateral del derivado de aminoácido de un compuesto de la fórmula IV, o una sal del mismo, para proporcionar un compuesto de la fórmula V que tiene una porción éster. En una 11a modalidad donde Ra y Rb son independientemente alcoxi Ci-6, o Ra y Rb junto con el carbono al cual ambos se enlazan combinados para formar un tiocarbonilo, un acetal cíclico o tioacetal cíclico, la descripción proporciona un proceso que además comprende opcionalmente la etapa de hidrolizar los grupos Ra y Rb de modo que la combinación de Ra y Rb junto con el carbono al cual ambos se enlazan para formar un carbonilo. La hidrolización se puede conducir en un solvente tal como acetona, butanona, acetonitrilo e isopropanol, o soluciones acuosas del mismo, y se conduce preferiblemente en acetona acuosa. Preferiblemente, la etapa de hidrólisis sigue la etapa de ciclización. En una 12a modalidad, la descripción proporciona un proceso en donde la ciclización se conduce al combinar un compuesto de la fórmula IV, o una sal del mismo, con una base en la presencia de un solvente. Tales bases pueden ser, por ejemplo sin limitación, carbonato de cesio, bicarbonato de cesio, carbonato de potasio, tert-butilato de sodio, hexametildisilazida de sodio, y preferiblemente carbonato de cesio . En una 13a modalidad, la descripción proporciona un proceso en donde la ciclización se conduce bajo una atmósfera inerte, tal como nitrógeno o argón (preferiblemente nitrógeno) en un solvente que incluye, por ejemplo sin limitante, DMSO, DMF, DMA, N-metilpirrolidona, sulfolano (especialmente DMSO y/o DMF) . En una 14a modalidad, la descripción proporciona un proceso para preparar un compuesto de la fórmula VI: VI el proceso comprende: hidrolizar la porción éster del compuesto de la fórmula V con un agente de hidrolización para formar el ácido del compuesto VI a temperaturas desde alrededor de -5 hasta alrededor de 5°C. Los agentes de hidrolización de éster son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen hidróxidos de metal alcalino, MOH, donde M es Li, Na o K, preferiblemente el agente de hidrolización es NaOH acuoso. Preferiblemente la etapa de hidrolización se realiza bajo condiciones bifásicas con un solvente orgánico que es parcialmente mezclable en agua. Los solventes orgánicos preferidos son éteres aciclicos o cíclicos que incluyen THF, 2-metilo THF, 1 , 2-dimetoxietaen, 1,4-dioxano, especialmente THF . Alternativamente , en una 15 a modalidad, donde Ra y ¾ j unto con el átomo al cual ambos se enlazan combinados para formar un carbonilo , la descripción proporciona un proceso para preparar un compuesto de la fórmula VI I : VI VII el proceso comprende : reaccionar un compuesto de la fórmula Vía, HO-Z-OH, con un compuesto de la fórmula IV (opcionalmente in situ) en la presencia de un catalizador ácido para dar un compuesto de la fórmula VII, en donde Z es - (CTiT2) 2-, - Ti? T2 y T3 cada que se presentan se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo Ci_4, alquenilo C2-4, halógeno, hidroxi, ciano, nitro, CF3, Oalquilo Ci-4, OCF3, y C (=0) alquilo Ci_4 (preferiblemente Tx, T2 y T3 son cada uno hidrógeno) . Preferiblemente el compuesto de la fórmula Vía es etilen glicol y el catali zador ácido es ácido p-toluensulf ónico, o un hidrato del mismo . En una 16a modalidad, la descripción proporciona un proceso para preparar un compuesto de la fórmula VIII: VIII el proceso comprende: transformar el cetal de la fórmula VII a un isocianato intermediario de la fórmula VIII. La transformación se conduce preferiblemente por medio de una configuración Curtius. En una 17a modalidad, la descripción proporciona un proceso en donde la etapa de transformación se conduce por medio de una configuración Curtius que comprende las etapas de: a) mezclar una solución substancialmente anhidra de la fórmula VII con una base (la base es por ejemplo, sin limitación, una alquilamina, especialmente una amina terciaria, preferiblemente trietilamina) ; b) agregar un haloformiato (por ejemplo, un cloroformiato, preferiblemente Í-BUO2CCI) a la solución a una temperatura desde alrededor de -10°C hasta alrededor de 0°C para formar un anhídrido mezclado del ácido de la fórmula VII; c) tratar el anhídrido mezclado con un reactivo de azida (preferiblemente NaN3) en la presencia de un catalizador de transferencia de fase (preferiblemente una sal de tetralquilamonio tal poner en contacto el isocianato de la fórmula VIII (opcionalmente in situ) con un compuesto de la fórmula Ri0COW (por ejemplo, ácido acético) en la presencia de un anhídrido ácido correspondiente (esto es, (Ri0CO)2O) para formar la amida de la fórmula IX en donde: Rio es alquilo Ci-6 (Rio es preferiblemente metilo) : y W es OH o Oalquilo Ci_6. En una 19a modalidad la descripción proporciona un proceso para preparar un compuesto de la fórmula X: el proceso comprende: hidrolizar la porción cetal de la amida de la fórmula IX para formar un compuesto de la fórmula X. Las condiciones y reactivos de hidrolización de cetal son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. La hidrólisis preferiblemente se conduce al calentar una solución del compuesto IX que tiene una porción cetal en un solvente orgánico (por ejemplo acetona) y ácido clorhídrico (alrededor de 1 N) a alrededor de 45°C hasta alrededor de 55°C durante alrededor de 2-4 horas . En una 20a modalidad, la descripción proporciona un proceso para preparar un compuesto de la fórmula XI: HNReRg XI el proceso comprende: aminar reductivamente el compuesto de la fórmula X con una amina de la fórmula ??]¾]¾ en la presencia de un ácido Lewis seguido por un agente reductor para formar un compuesto de la fórmula XI que tiene una porción pirrolidonilo amina. En una 21a modalidad, la descripción proporciona un proceso en donde aminar reductivamente comprende las etapas de: a) agregar un ácido Lewis (preferiblemente un reactivo de titanio que incluye, sin limite, TiCl2 (O-iso-propil) 2) a una solución del compuesto X y la amina que tiene la fórmula HNR8R9 en un solvente aprótico para formar una imina-enamina de la fórmula XA: b) tratar la imina-enamina de la fórmula Xa con un agente reductor (preferiblemente borano dimetil sulfuro) para proporcionar el compuesto de la fórmula XI que tiene una porción pirolindonil amina. En las etapas anteriores, el solvente aprótico puede ser por ejemplo, sin limitación, diclorometano, acetonitrilo, DMSO, D F, y N-metil-pirrolidinona (preferiblemente diclorometano) . En un 22a modalidad, la descripción proporciona un proceso en donde la amina de la fórmula HN(R8) (R9) es preferiblemente tert-butil amina. En una 23a modalidad, la descripción proporciona un proceso para preparar un compuesto de la fórmula XII: XII el proceso comprende: desproteger la amina de pirollidonilo de la fórmula XI para formar un compuesto de la fórmula XII. En una 24a modalidad, la descripción proporciona un proceso en donde la etapa de desprotección se lleva a cabo por hidrogenación por una solución del compuesto de la fórmula XII en la presencia de un catalizador tal como paladio.
Preferiblemente la hidrogenación se lleva a cabo a alrededor de 20 hasta alrededor de 40 psig (2.812 kg/cm2) en un solvente, incluyendo, sin limitación, metanol, sobre catalizador 5% Pd/C a alrededor de 25°C durante alrededor de dos hasta alrededor de seis horas. En una 25a modalidad, la descripción proporciona un proceso para preparar un compuesto de la fórmula I que comprende acoplamiento del compuesto de la fórmula XII con un compuesto de la fórmula para proporcionar un compuesto de la fórmula I en donde: El HET es un anillo heteroarilo de 3-14 miembros que tiene uno hasta cuatro heteroátomos seleccionados de N, O o S (preferiblemente uno hasta tres heteroátomos, especialmente uno hasta dos átomos de nitrógeno) en al menos uno de los anillos (HET es preferiblemente un quinazolin-4-il 6-substituido, más preferiblemente 6-trifluorometil-quinazolin-4-il); y LG es un grupo saliente seleccionado de halógeno o OS02Ri6, en donde R16 es fenilo, un heteroarilo de 5 hasta 7 miembros que tiene uno o más átomos seleccionados de N, S, o O, alquilo Ci_6, o un cicloalquilo de 3 hasta 7 miembros, todos los cuales son substituidos opcionalmente por uno hasta tres grupos seleccionados de halógeno, CF3 y alquilo Ci-6 (preferiblemente LG es un halógeno, especialmente cloro) . Un grupo saliente como se usa en la presente incluye, sin limitación, grupos tal como halógenos, mesilato, nonaflatos, sulfonatos, tosilatos y triflatos. Un grupo saliente preferido es halógeno o OS02Ri6í en donde R16 es fenilo, un heteroarilo de 5 hasta 7 miembros que tiene uno o más átomos seleccionados de N, S u 0, alquilo Ci-6, o un cicloalquilo de 3 hasta 7 miembros, todos los cuales son substituidos opcionalmente por uno hasta tres grupos seleccionados de halógeno, CF3, y alquilo Ci_6. En la modalidad más preferida LG es un halógeno, especialmente cloro. En una 26a modalidad, la descripción proporciona un proceso para preparar un compuesto de la fórmula X: Comprende las etapas de: hidrolizar la porción éster del compuesto de la fórmula V con un agente de hidrolización para formar el ácido del compuesto VI a temperaturas desde alrededor de -5 hasta alrededor de 5 °C: V VI reaccionar un compuesto de la fórmula Vía, HO-Z-OH, con un compuesto de la fórmula IV ( opcionalmente in situ) en la presencia de un catalizador ácido para dar un compuesto de la fórmula VII que tiene una porción de ácido carboxilico : VII reaccionar un compuesto de la fórmula Vía, HO-Z-OH (preferiblemente alquilen glicol, especialmente etilen glicol) , con un compuesto de la fórmula IV (opcionalmente in situ) en la presencia de un catalizador ácido (preferiblemente ácido p-toluensulfónico, o un hidrato del mismo) para dar un compuesto de la fórmula VII que tiene una porción de ácido carboxí lico : VI VII transformar la porción de ácido carboxilico del cetal de la fórmula VII a un isocianato intermediario correspondiente de la fórmula VIII: poner en contacto el isocianato de la fórmula VIII (opcionalmente in situ) , con un compuesto de la fórmula Ri0COW (por ejemplo, ácido acético) en la presencia de un anhídrido ácido correspondiente (esto es ( Ri0CO ) 2O ) para formar la amida de la fórmula IX que tiene una porción cetal: IX; y hidrolizar la porción cetal de la amida de la fórmula IX para formar el compuesto de la fórmula X: en donde: Ri, y R2 son independientemente hidrógeno o un grupo protector amina; R4 y Rio son independientemente alquilo Ci_6 o bencilo substituido opcionalmente; R8 y R9 son independientemente hidrógeno o alquilo Ci_6; W es OH o Oalquilo Ci- ; Z es -(CTiT2)2-, -(CTiT2)3-, o Ti, T2 y T3 cada que se presentan son independientemente seleccionados de hidrógeno, alquilo C1-4, alquenilo C2-4, halógeno, hidroxi, ciano, nitro, CF3, Oalquilo C1-4, OCF3, y C (=0) alquilo Ci_ . En una 27a modalidad, la descripción proporciona un proceso para preparar un compuesto de la fórmula XI en donde: el compuesto de la fórmula VII es ácido (7R, 8S) -8- ( ( 3 S ) -3 - ( ( (benciloxi) carbonil) amino) -2-oxo-l-pirrolidinil) -1, 4-dioxaespiro [4.5] decano-7-carboxilico, o una sal del mismo; el compuesto de la fórmula Vlla es ( (3S)-1- ( (7R,8S)-7-(azidocarbonil)-l,4-dioxaespiro[4.5]dec-8-il ) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mismo; el compuesto de la fórmula VIII es ( (3S)-1- ( (7R,8S)-7-isocianato-l, 4-dioxaespiro [4.5] dec-8-il) - 2-???-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mi smo ; el compuesto de la fórmula IX es ( ( 3 S ) - 1 - ( ( 7 R , 8 S ) -7-acetamido-l, 4-dioxaespiro [4.5] dec-8-il) -2-oxo-3-p i r r o 1 i din i 1 ) ca rbamat o de bencilo, o una sal del mismo; el compuesto de la fórmula X es ( ( 3 S ) - 1 - ( ( 1 S , 2 R ) -2-acetamido-4-oxociclohexil) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mismo; y el compuesto de la fórmula XI es ( (3S)-1- ( ( 1S, 2R, 4R) -2-acetamido-4- (tert-butilamino) ciclohexil) -2-oxo-3-pirrolidinil) carbamato de bencilo, o una sal del mismo. En una 28a modalidad, la descripción proporciona un proceso para preparar un compuesto de la fórmula I : el proceso comprende: hidrolizar la porción éster del compuesto de la fórmula V con un agente de hidrolización (preferiblemente un hidróxido alcalino, especialmente hidróxido de sodio) para formar un compuesto de la fórmula VI; reaccionar un compuesto de la fórmula Va, HO-Z-OH, con el compuesto de la fórmula VI, opcionalmente in situ, en la presencia de catalizador ácido (preferiblemente ácido p-toluensulfónico, o un hidrato del mismo) para proporcionar un compuesto de la fórmula VII que tiene una porción de ácido carboxilico; transformar la porción de ácido carboxilico del cetal de la fórmula VII para formar un isocianato intermediario correspondiente de la fórmula VIII; poner en contacto el isocianato de la fórmula VIII, opcionalmente in situ, con un compuesto de la fórmula Ri0COW (preferiblemente ácido acético) en la presencia de un anhídrido ácido correspondiente, (Ri0CO)2O (preferiblemente anhídrido acético) , para formar la amida de la fórmula IX que tiene una porción cetal; hidrolizar la porción cetal de la amida de la fórmula IX para formar el compuesto de la fórmula X; y aminar reductivamente el compuesto de la fórmula X con una amina de la fórmula HNR8R9 (preferiblemente amina tert-butilo) en la presencia de un ácido Lewis (preferiblemente un reactivo de titanio tal como TiCl2 (0-iso-propil ) 2) para formar un compuesto de la fórmula XI que tiene una porción pirollidonil amina; desproteger la pirollidinil amina de la fórmula XI para formar un compuesto de la fórmula XII; y acoplar el compuesto de la fórmula XII con un compuesto de la fórmula para proporcionar un compuesto de la fórmula I; en donde: Ri, y R2 son independientemente hidrógeno o un grupo protector amina; R4 y Rio son independientemente alquilo Ci_ 6 o bencilo substituido opcionalmente ; Rg y Rg son independientemente hidrógeno o alquilo Ci- 6 ," es OH o Oalquilo Ci- 6 ; Z es -(CTiT2)2-, -(CTiT2)3-, o Ti, T2 y T3 cada que se presentan se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo Ci_4, alquenilo C2-4, halógeno, hidroxi, ciano, nitro, CF3, Oalquilo Ci_4, OCF3, y C(=0) alquilo Ci_4 (preferiblemente Z es -(CH2)2-); HET es un anillo heteroarilo de 3-14 miembros que tiene uno hasta cuatro heteroátomos seleccionados de N, O o S (preferiblemente uno hasta tres heteroátomos, especialmente uno hasta dos átomos de nitrógeno) en al menos uno de los anillos (HET es preferiblemente un quinazolin-4-il 6 substituido, más preferiblemente 6-trifluorometil-quinazolin-4-il) ; y LG es un grupo saliente seleccionado de halógeno o OS02Ri6, en donde Ri6 es fenilo, un heteroarilo de 5 hasta 7 miembros que tiene uno o más átomos seleccionados de N, S, o 0, alquilo Ci-6, o un cicloalquilo de 3 hasta 7 miembros, todos los cuales son substituidos opcionalmente por uno hasta tres grupos seleccionados de halógeno, CF3 y alquilo Ci-6 (preferiblemente LG es un halógeno, especialmente cloro) . En una 29a modalidad, la descripción proporciona un compuesto de la fórmula VI, o una sal del mismo: VI en donde : Ri y R2 son independientemente seleccionados de hidrógeno y un grupo protector amina seleccionado de BOC, Cbz, y bencilo (preferiblemente Ri es hidrógeno y R2 es Cbz) ; Z es - (CTiT2)2-, - (C 1T2)3-r o Ti, T2 y T3 cada que se presenta son independientemente seleccionado de hidrógeno, alquilo Ci-4, alquenilo C2_4, halógeno, hidroxi, ciano, nitro, CF3, Oalquilo Ci-4, 0CF3, y C(=0) alquilo C1-4 (preferiblemente Z es -(CH2)2-). Un compuesto preferido de la fórmula VI es ácido (1R,2S)-2- ( (S) -3- (benciloxicarbonilamino) -2-oxopirrolidin-l-il ) -5-oxociclohexancarboxílico o una sal del mismo. En una 30a modalidad, la descripción proporciona un compuesto de la fórmula VI que es ácido ( IR, 2S ) -2- ( ( S ) -3-(benciloxicarbonilamino) -2-oxopirrolidin-l-il) -5-oxociclohexancarboxílico o una sal del mismo. En una 31a modalidad, la descripción proporciona un compuesto novedoso de la fórmula VII, o una sal del mismo: VII en donde: Ri y R2 son independientemente seleccionados de hidrógeno y un grupo protector amina seleccionado de BOC, Cbz, y bencilo (preferiblemente Ri es hidrógeno y R2 es Cbz) ; Z es -(CTiT2)2-, -(CTiT2)3-, o y Ti, T2 y T3 cada que se presentan son independientemente seleccionados de hidrógeno, alquilo C1-4 , alquenilo C2_4, halógeno, hidroxi, ciano, nitro, CF3, Oalquilo C1-4 , OCF3, y C(=0) alquilo Ci-4 (preferiblemente Z es -(CH2)2-). Un compuesto preferido de la fórmula VII es ácido (7R, 8S) -8- ( (3S) -3- ( ( (benciloxi) carbonil) amino) -2-oxo-l-pirrolidinil ) -1, 4-dioxaespiro [4.5] decan-7-carboxílico . En una 32a modalidad, la descripción proporciona un compuesto de la fórmula VII que es ácido ( 7R, 8S ) -8- ( ( 3S ) -3-( ( (benciloxi) carbonil) amino) -2-oxo-l-pirrolidinil ) -1, 4-dioxaespiro [4.5] decan-7-carboxilico, o una sal del mismo. En una 33a modalidad, la descripción proporciona compuestos novedosos de la fórmula Vlla, o una sal del mismo: Vlla en donde: Ri y R2 son independientemente seleccionados de hidrógeno y un grupo protector amina seleccionado de BOC, Cbz, y bencilo (preferiblemente Ri es hidrógeno y R2 es Cbz) ; Z es -(CTiT2)2-, ~(CTiT2)3-, o; y Ti, T2 y T3 cada que se presentan son independientemente seleccionados de hidrógeno, alquilo C1-4, alquenilo C2_4, halógeno, hidroxi, ciano, nitro, CF3, Oalquilo C1-4, OCF3, y C(=0)alquilo Ci_4 (preferiblemente Z es -(CH2)2-) . Un compuesto preferido de la fórmula Vlla es ( (3S)-l-( (7R,8S)-7-(azidocarbonil)-l,4-dioxaespiro [4.5] dec-8-il) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo. En una 34a modalidad, la descripción proporciona un compuesto de la fórmula Vlla que es ( (3S)-1-( (7R, 8S) -7- (azidocarbonil) -1, 4-dioxaespiro [4.5] dec-8 -il ) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mi smo . En una 35a modalidad, la descripción proporciona un compuesto de la fórmula VIII, o una sal del mismo: en donde: Ri y R2 son independientemente seleccionados de hidrógeno y un grupo protector amina seleccionado de BOC, Cbz, o bencilo (preferiblemente Rx es hidrógeno y R2 es Cb z ) ; Z es -(CTiT2)2-, -(CTiT2)3-, o Ti, T2 y T3 cada que se presentan son independientemente seleccionados de hidrógeno, alquilo Ci_4, alquenilo C2_4, halógeno, hidroxi, ciano, nitro, CF3, Oalquilo C1-.4 , OCF3, y C(=0) alquilo Ci_4 (preferiblemente Z es -(CH2)2-). Un compuesto preferido de la fórmula VIII es bencilo ( (3S) -1- ( (7R, 8S) -7 -isocianato-1, 4-dioxaespiro [4.5] dec-8-il) -2-???-3-pirrolidinil) carbamato. En una 36a modalidad, la descripción proporciona un compuesto de la fórmula VIII que es ( (3S) -1- ( (7R, 8S) -7-isocianato-1 , 4-dioxaespiro [4.5] dec-8-il) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mismo. En una 37a modalidad, la descripción proporciona un compuesto de la fórmula IX, o una sal del mismo: IX en donde: Ri y R2 son independientemente seleccionados de hidrógeno y un grupo protector amina seleccionado de BOC, Cbz, o bencilo (preferiblemente Ri es hidrógeno y R2 es Cbz) ; Z es -(CTiT2)2-, -(CTiT2)3-, o Ti, T2 y T3 cada que se presentan son independientemente seleccionados de hidrógeno, alquilo Ci_4, alquenilo C2. , halógeno, hidroxi, ciano, nitro, CF3, Oalquilo Ci-4, OCF3, y C(=0) alquilo Ci-4 (preferiblemente Z es -(CH2)2-); y Rio es alquilo Ci_6 (preferiblemente metilo) . Un compuesto preferido de la fórmula IX es ((3S)-1-( (7R, 8S) -7-acetamido-l, 4-dioxaespiro [4.5] dec-8-il) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo. En una 38a modalidad, la descripción proporciona un compuesto de la fórmula IX que es ( ( 3S ) -1- ( ( 7R, 8S ) -7-acetamido-1, 4-dioxaespiro [4.5] dec-8-il) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mismo. En una 39a modalidad, la descripción proporciona un compuesto de la fórmula X, o una sal del mismo: en donde : Ri y R2 son independientemente hidrógeno o un grupo protector amina seleccionado de BOC, Cbz, y bencilo; y Rio es alquilo Ci_6. Preferiblemente Ri es hidrógeno, R2 es Cbz y R10 es metilo. Un compuesto preferido de la fórmula X es ((3S)-1-( (1S, 2R) -2-acetamido-4-oxociclohexil) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo. En una 40a modalidad, la descripción proporciona un compuesto de la fórmula X que es ( ( 3S ) -1- ( ( 1S , 2R) -2-acetamido-4-oxociclohexil) -2-oxo-3-pirrolidinil) carbamato de bencilo, o una sal del mismo. En una 40a modalidad, la descripción proporciona un compuesto de la fórmula XI, o una sal del mismo: XI en donde : Ri y R2 son independientemente hidrógeno o un grupo protector amina seleccionado de BOC, Cbz, y bencilo; Ra y Rg son independientemente hidrógeno o alquilo Ci-6; y Rio es alquilo Ci_6. Preferiblemente Ri es hidrógeno, R2 es Cbz, ' R8 es hidrógeno, Rg es tert-butilo, y Rio es metilo. Un compuesto preferido de la fórmula XI es ( (3S) -1- ( ( 1S, 2R, 4R) -2-acetamido-4- ( tert-butilamino) ciclohexil) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo. En una 41a modalidad, la descripción proporciona un compuesto de la fórmula XI que es ( ( 3S ) -1- ( ( 1S , 2R, 4R) -2-acetamido-4- (tert-butilamino) ciclohexil) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mismo. En una 42a modalidad, la descripción proporciona un compuesto de la fórmula XII, o una sal del mismo: XII en donde: Ri es hidrógeno o un grupo protector amina seleccionado de BOC, Cbz, y bencilo; Re y Rg son independientemente hidrógeno o alquilo Ci_6; y Rio es alquilo Ci-6. Preferiblemente Ri es hidrógeno, Rg es hidrógeno, R9 es tert-butilo, y Rio es metilo. Un compuesto preferido de la fórmula XII es N- ( (1R,2S, 5R) -2- ( (3S) -3-amino-2-oxo-l-pirrolidinil) -5- (tert-butilamino) ciclohexil ) acetamida . En una 43a modalidad, la descripción proporciona un compuesto de la fórmula XII que es N- ( ( IR, 2S, 5R) -2- ( ( 3S ) -3- amino-2-oxo-l-pirrolidinil ) -5- (tert-butilamino) ciclohexil) acetamida, o una sal del mismo. En una 44a modalidad, la descripción proporciona un compuesto seleccionado de: Ácido (7R, 8S) -8- ( (3S) -3- (( (benciloxi) carbonil) amino) -2-oxo-l-pirrolidinil ) -1, 4-dioxaespiro [4.5] decano-7-carboxílico, o una sal del mismo; ( (3S) -1- ( (7R, 8S) -7- (azidocarbonil) -1,4-dioxaespiro [4.5] dec-8-il) -2-oxo-3-pirrolidinil) carbamato de bencilo, o una sal del mismo; ((3S)-1-((7R,8S) -7-isocianato-l, 4-dioxaespiro [ 4.5 ] dec-8-il ) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mismo ; ((3S)-1-((7R,8S) -7-acetamido-l, 4-dioxaespiro [4.5] dec-8-il ) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mismo; ( (3S) -1- ( (1S, 2R) -2-acetamido-4-oxociclohexil) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mismo; y ( (3S) -1- ( (1S, 2R, 4R) -2-acetamido-4- (tert-butilamino) ciclohexil) -2-oxo-3-pirrolidinil) carbamato de bencilo, o una sal del mismo. En una 45a modalidad, la descripción proporciona un proceso en donde: un compuesto de la fórmula VII es ácido (7R, 8S) -8- ( (3S) -3- ( ( (benciloxi) carbonil) amino) -2-oxo-l-pirrolidinil ) -1, 4- dioxaespiro [4.5] decano-7-carboxilico, o una sal del mismo; un compuesto de la fórmula Vlla es ( (3S) -1- ( (7R, 8S) -7- (azidocarbonil ) -1, -dioxaespiro [4.5] dec-8 -il) -2-oxo-3-pirrolidinil) carbamato de bencilo, o una sal del mismo; un compuesto de la fórmula VIII es ( (3S) -1- ( (7R, 8S) -7-isocianato-1 , 4-dioxaespiro [4.5] dec-8-il) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mismo; un compuesto de la fórmula IX es ( ( 3S ) -1- ( ( 7R, 8S ) -7-acetamido-1 , -dioxaespiro [ 4.5 ] dec-8-il ) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mismo; el compuesto de la fórmula X es ( (3S) -1- ( ( 1S, 2R) -2-acetamido-4-oxociclohexil ) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mismo; y un compuesto de la fórmula XI es ( ( 3S ) -1- ( ( 1S, 2R, R) -2-acetamido-4- ( tert-butilamino) ciclohexil) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mismo. En una 46a modalidad, la descripción proporciona un proceso en donde un compuesto de la fórmula I es N-( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-( trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il) ciclohexil) acetamida o una sal del mismo. La presente invención puede abarcarse en otras formas especificas sin salirse del espíritu o atributos esenciales de la misma. Así, las modalidades de arriba no deberán considerarse como limitantes. Cualesquiera y todas las modalidades de la presente invención pueden tomarse en conjunto con cualquier otra modalidad o modalidades para describir las modalidades adicionales. Cada elemento individual (incluyendo aspectos preferidos) de las modalidades es su modalidad independiente. Además, cualquier elemento de una modalidad es un medio para combinarse con cualquiera y todos los otros elementos de cualquier modalidad para describir una modalidad adicional. Además, la presente invención abarca combinaciones de diferentes modalidades, partes de las modalidades, definiciones, descripciones y ejemplos de la invención escritos en la presente. DEFINICIONES Las siguientes son definiciones de los términos usados en esta especificación y reivindicaciones anexadas. La definición inicial se proporciona para un grupo o término en la presente que aplica al grupo o término a través de la especificación y reivindicaciones, individualmente o como parte de otro grupo, a menos de que se indique de otra manera. El término "alquilo" se refiere a grupos de hidrocarburos de cadena recta o ramificada que tienen 1 hasta 12 átomos de carbono, preferiblemente 1 hasta 6 átomos de carbono. Cuando los números aparecen en un subíndice después del símbolo "C", el subíndice se define más específicamente el número de átomos de carbono que un grupo particular puede contener. Por ejemplo, "Ci-6alquilo" se refiere a grupos de alquilo de cadena recta y ramificada con uno hasta seis átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo, y asi sucesivamente. El subíndice "0" se refiere a un enlace. Así, el término hidroxi alquilo (C0-2) o hidroxialquilo (C0-2) incluyen hidroxi, hidroximetilo y hidroxietilo . Los grupos alquilo pueden substituirse con uno hasta tres grupos seleccionados de alquilo (C1-6) , alquenilo (C2-6) / hidroxi, halógeno, ciano, nitro, CF3, 0 (alquilo C1-6) , OCF3, C(=0)H, C(=0) (alquilo Ci_6) , C02H, C02 (alquilo Ci_6) , NHCO2 (alquilo Ci-6) , -S (alquilo Ci_6) , NH2, NH (alquilo Ci_6) , N (alquilo Ci-6)2, N(CH3)3+, S02 (alquilo Ci_6) , C (=0) (alquileno Ci_ 4)NH2, C (=0) (alquileno Ci_4) NH (alquilo) , C (=0) (alquileno Ci_ 4) N (alquilo Ci-4)2, cicloalquilo C3-7, fenilo, bencilo, feniletilo, feniloxi, benciloxi, naftilo, un heterociclo de cuatro hasta siete miembros, y/o un heteroarilo de cinco o seis miembros. Cuando un alquilo substituido es substituido con un grupo arilo, heterociclo, cicloalquilo, o heteroarilo, los sistemas de anillo son como se definen a continuación y así pueden tener cero, uno, dos o tres substituyentes, también como se definen a continuación. Cuando el término "alquilo" se usa junto con otro grupo, tal como un "arilalquilo" , esta conjunción se define con más especificidad en al menos uno de los substituyentes que el alquilo substituido deberá contener. Por ejemplo, "arilalquilo" se refiere a un grupo alquilo substituido como se define arriba en donde al menos uno de los substituyentes es un arilo, tal como bencilo. Asi, el término arilalquilo (C0-4) incluye un alquilo inferior substituido que tiene al menos un substituyente arilo y también incluye un arilo directamente enlazado a otro grupo, esto es, arilalquilo (C0) .
El término "alquenilo" se refiere a · grupos de hidrocarburos de cadena recta o ramificada que tienen 2 hasta 12 átomos de carbono y al menos un enlace doble. Los grupos alquenilo de 2 hasta 6 átomos de carbono y que tienen un enlace doble son más preferidos. Los grupos alquenilo pueden ser substituidos como se describe arriba por los grupos alquilo . El término "alquinilo" se refiere a grupos de hidrocarburos de cadena recta o ramificada que tienen 2 hasta 12 átomos de carbono y al menos un enlace triple. Los grupos alquinilo de 2 hasta 6 átomos de carbono y que tienen un enlace triple son más preferidos. Los grupos alquinilo pueden ser substituidos como se describe arriba por los grupos alquilo . El término "alquileno" se refiere a grupos de hidrocarburos de cadena recta o ramificada divalente que tienen 1 hasta 12 átomos de carbono, preferiblemente 1 hasta 8 átomos de carbono, por ejemplo, {-CH2-} n, en donde n es 1 hasta 12, preferiblemente 1-8. Los grupos alquileno inferiores, que son, grupos alquileno de 1 hasta 2 átomos de carbono, son más preferidos. Los términos "alquenileno" y "alquinileno" se refieren a radicales divalentes de los grupos alquenilo y alquinilo, respectivamente como se define arriba. Los grupos alquenileno pueden ser substituidos como se describe arriba por los grupos alquilo. El término "alcoxi" se refiere a un átomo de oxigeno substituido por alquilo, como se define en la presente. Por ejemplo, el término "alcoxi" o incluye el grupo -O-alquilo Ci-6 · Cuando un subíndice se usa con referencia a un alcoxi, tioalquilo o aminoalquilo, el subíndice se refiere al número de átomos de carbono que el grupo puede contener en adición a los heteroátomos . Se deberá entender que las selecciones para todos los grupos, incluyen por ejemplo, alcoxi, tioalquilo, y aminoalquilo, deberán hacerse por alguien de habilidad en el campo para proporcionar compuestos estables. El término "carbonilo" se refiere a un grupo de carbonilo divalente -C(=0)-. El término "acilo" se refiere a un grupo carbonilo ligado a un radical orgánico, más particularmente, el grupo C(=0)Re, así como el grupo divalente -C(=0)Re-, el cual se liga a los radicales orgánicos. El grupo Re puede seleccionarse de alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclo, arilo, o heteroarilo como se define en la presente, o cuando sea apropiado, el grupo divalente correspondiente, por ejemplo, alquileno. El término "cicloalquilo" se refiere a anillos de hidrocarburo parcialmente no saturados y completamente saturados (y por lo tanto incluyen "anillos de cicloalquenilo" ) de 3 hasta 9, preferiblemente 3 hasta 7 átomos de carbono. El término "cicloalquilo" incluye tales anillos que tienen cero, uno, dos o tres substituyentes seleccionados de alquilo ( C1-4) , alquenilo (C2-4) , halógeno, hidroxi, ciano, nitro, CF3, O (alquilo C1-4) , OCF3, C(=0)H, C (=0) (alquilo C1-4) , C02H, C02 (alquilo C1-4) , NHC02 (alquilo C1-4) , S(alquilo C1-4) , NH2, NH(alquilo C1-4) , N(alquilo Ci-4)2, N (alquilo 01-4) 3 S02 (alquilo C1-4) , C ( =0 ) (alquileno Ci_4)NH2, C ( =0 ) (alquileno C1-4) NH (alquilo) , y/o C ( =0 ) (alquileno Ci_ 4) N (alquilo 01- ) 2 - El término "cicloalquilo" también incluye tales anillos que tienen un segundo anillo fusionado de los mismos (por ejemplo, incluyendo anillos de benzo, heterociclo, o heteroarilo) o que tienen un puente carbono-carbono de 3 hasta 4 átomos de carbono. El término "halo" o "halógeno" se refiere a cloro, bromo, fluoro y yodo. El término "haloalquilo" significa un alquilo substituido que tiene uno o más substituyentes halo. Por ejemplo, "haloalquilo" incluye mono, bi, y trifluorometilo . El término "haloalcoxi" significa un grupo alcoxi que tiene uno o más substituyentes halo. Por ejemplo, "haloalcoxi" incluye OCF3. El término "heteroátomos" deberá incluir oxigeno, azufre y nitrógeno. El término "arilo" se refiere a fenilo, bifenilo, fluorenilo, 1-naftilo y 2-naftilo. El término "arilo" incluye tales anillos que tienen cero, uno, dos o tres substituyentes seleccionados de alquilo (Ci-4), alquenilo (C2- ) , halógeno, hidroxi, ciano, nitro, CF3, O(alquilo Ci_4) , OCF3, C(=0)H, C (=0) (alquilo C^) , C02H, C02 (alquilo Ci-4) , NHC02 ( alquilo C1-4 ) , S (alquilo C1-4 ) , NH2, NH (alquilo Ci_ ) , N (alquilo Cx- )2, N(alquilo C1_4)3+, S02(alquilo Ci- ) , C (=0) (alquileno Ci_4)NH2, C (=0) (alquileno C^) NH (alquilo) , y/o C (=0) (alquileno Ci-4)N(alquilo Ci-4)2. Los términos "heterociclo" o "heterociclico" se refieren a anillos de 3 hasta 15 miembros substituidos y no substituidos no aromáticos (los cuales pueden ser parcialmente o completamente saturados) que tienen uno hasta cuatro heteroátomos. Tales anillos pueden ser grupos monociclicos de 3 hasta 7 miembros, grupos biciclicos de 7 hasta 11 miembros, y grupos triciclicos de 10 hastal5 miembros. Cada anillo del grupo heterociclo contiene un heteroátomo que puede contener uno o dos átomos de oxigeno o azufre y/o de uno hasta cuatro átomos de nitrógeno proporcionando que el número total de heteroátomos en cada anillo es cuatro o menos, y además proporciona que el anillo contiene al menos un átomo de carbono. Los anillos fusionados que completan los grupos biciclicos o triciclicos pueden contener solamente átomos de carbono y pueden ser saturados, parcialmente saturados o no saturados. Los átomos de nitrógeno y azufre pueden ser opcionalmente oxidados y los átomos de nitrógeno pueden ser opcionalmente cuaternizados . El grupo heterociclo puede enlazarse a cualquier nitrógeno o átomo de carbono disponible. El anillo heterociclo puede contener cero, uno, dos o tres substituyentes seleccionados de alquilo (C1-4) , alquenilo (C2-4) , halógeno, hidroxi, ciano, nitro, CF3, O (alquilo C1-4) , OCF3, C(=0)H, C (=0) (alquilo C1-4) , C02H, C02 (alquilo Ci_4) , NHC02 (alquilo C1-4) , S (alquilo C1-4) , NH2, NH (alquilo Ci_4) , N (alquilo Ci-4)2, N (alquilo Ci_4)3+, S02 (alquilo C1-4) , C (=0) (alquileno Ci_4)NH2, C (=0) (alquileno C1-4) NH (alquilo) , y/o C(=0) (alquileno Ci_4) N (alquilo Ci_4)2. Los grupos heterociclicos ejemplares incluyen azetidinilo, pirrolidinilo, oxetanilo, imidazolinilo, oxazolidinilo, isoxazolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, tetrahidrofuranilo, piperidilo, piperazinilo, 2-oxopiperazinilo, 2-oxopiperidilo, 2-oxopirrolodinilo, 2-oxoazepinilo, azepinilo, 4-piperidonilo, tetrahidropiranilo, morfolinilo, tiamorfolinilo, sulfóxido de tiamorfolinilo, sulfona de tiamorfolinilo, 1 , 3-dioxolano, quinuclidinilo y tetrahidro-1 , 1-dioxotienilo y similares. El término "heteroarilo" se refiere a anillos de 3 hasta 14 miembros substituidos y no substituidos aromáticos que tienen uno hasta cuatro heteroátomos seleccionados de 0, S, o N en al menos uno de los anillos. Los anillos pueden ser grupos monociclicos de 5 ó 6 miembros, grupos biciclicos de 9 ó 10 miembros, y grupos triciclicos de 11 hasta 14 miembros. Cada anillo del grupo heteroarilo contiene un heteroátomo que puede contener uno o dos átomos de oxigeno o azufre y/o desde uno hasta cuatro átomos de nitrógeno proporcionando que el número total de heteroátomos en cada anillo es cuatro o menos y cada anillo tiene al menos un átomo de carbono. Los anillos fusionados completan los grupos biciclicos y triciclicos que pueden contener solamente átomos de carbono y pueden ser saturados, parcialmente saturados o no saturados. Los átomos de nitrógeno y azufre pueden ser opcionalmente oxidados y los átomos de nitrógeno pueden ser opcionalmente cuaternizados . Los grupos heteroarilo los cuales son biciclicos o triciclicos incluyen al menos un anillo completamente aromático pero el otro anillo o anillos fusionados pueden ser aromáticos o no aromáticos. El grupo heteroarilo puede enlazarse a cualquier nitrógeno o átomo de carbono disponible de cada anillo. El sistema de anillo heteroarilo puede contener cero, uno, dos o tres substituyentes seleccionados de alquilo (C1-4) , alquenilo (C2-4) , halógeno, hidroxi, ciano, nitro, CF3, O (alquilo C1-4) , OCF3, C(=0)H, C(=0) (alquilo Ci_4) , C02H, C02 (alquilo Ci_4) , NHCO2 (alquilo C1- 4 ) , S (alquilo Ci_4) , NH2, NH (alquilo C1-4 ) , N(alquilo Ci_4)2, N(alquilo Ci_4 ) 3 + , S02(alquilo Ci-4) , C (=0) (alquileno Ci-4)NH2, C (=0) (alquileno Ci-4) NH (alquilo) , y/o C (=0) (alquileno Ci-4) N (alquilo Ci_4)2. Los grupos heteroarilo ejemplares incluyen pirrolilo, pirazolilo, pirazolinilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, isotiazolilo, furanilo, tienilo, oxadiazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, triazinilo, indolilo, benzotiazolilo, benzodioxolilo, benzoxazolilo, benzotienilo, quinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, isoquinolinilo, benzimidazolilo, benzopiranilo, indolizinilo, benzofuranilo, cromonilo, coumarinilo, benzopiranilo, cinnolinilo, quinoxalinilo, indazolilo, pirrolopiridilo, furopiridilo, dihidroisoindolilo, tetrahidroquinolinilo y similares. Los grupos heteroarilo particulares incluyen, por ejemplo, quinazolin-4-ilo 6 substituido y 6-trifluorometil-quinazolin-4-ilo . En donde un grupo es opcionalmente substituido, este deberá incluir grupos substituidos y no substituidos. Los compuestos descritos en la presente pueden tener centros asimétricos. Los compuestos de la presente invención contienen un átomo asimétricamente substituido puede ser aislado en formas óptimamente activas o racémicas. Se conoce en el arte que para preparar formas ópticamente activas, tales como por la resolución de formas racémicas o por síntesis de materiales de partida ópticamente activos. Muchos isómeros geométricos de olefinas, enlace doble C=N, y similares pueden también presentarse en los compuestos descritos en la presente y similares pueden también presentarse en los compuestos descritos en la presente y todos los isómeros estables se contemplan en la presente invención. Los isómeros geométricos cis y trans de los compuestos de la presente invención se describe y pueden aislarse como una mezcla de isómeros o como formas de isómeros separados. Todas las formas quirales, diaestereoméricas, racémicas y todas las formas isoméricas de una estructura se entiende, al menos la estereoquímica específica o forma isomérica es especialmente indicada. Un enantiómero de los compuestos descritos en la presenten pueden exhibir actividad superior comparada con el otro. Así, todas las estereoquímicas se consideran como parte de la presente invención. Cuando se requiere, la separación del material racémico se lleva a cabo por HPLC usando una columna quiral o por una resolución usando un agente de resolución tal como cloruro canfónico como en Steven D. Young et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1995, 2602-2605. La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosis que son, dentro del alcance del juicio médico sólido, apropiados para usarse en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin una toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación excesiva, en proporción con una relación beneficio/riesgo razonable . Como se usa en la presente, "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a derivados de los compuestos descritos en donde el compuesto precursor se modifica al hacer sales ácidas o base de los mismos. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de ácido mineral u orgánico de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxilicos ; y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales no tóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario del compuesto precursor formado, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Por ejemplo, tales sales no tóxicas convencionales incluyen aquellas derivadas de los ácidos inorgánicos tales como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico y similares; y las sales preparadas a partir de ácidos orgánicos tales como acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamoico, maléico, hidroximaléico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, sulfanílico 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluensulfónico, metansulfónico, etandisulfónico, oxálico, isetiónico y similares.
Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden sintetizarse a partir del compuesto precursor que contiene una porción básica o ácida por métodos de química convencional. Generalmente, tales sales pueden prepararse al hacer reaccionar las formas de ácido o base libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un solvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, un medio no acuoso tal como éter, acetato etílico, etanol, isopropanol, o acetonitrilo se prefieren. Las listas de sales apropiadas se encuentran en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 17a ed., ack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418, la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia. Ya que los profármacos se conocen por aumentar las numerosas cualidades deseables de los farmacéuticos (por ejemplo, solubilidad, biodisponibilidad, manufactura, etc.), los compuestos de la presente invención pueden suministrarse en forma de profármacos. De esta manera, la presente invención se pretende que cubra profármacos de los compuestos actualmente reivindicados, métodos de suministro de los mismos y composiciones que contienen los mismos. "Profármacos" se pretende que incluyan cualesquiera de los portadores covalentemente enlazados que liberan un fármaco precursor activo de la presente invención in vivo cuando tal profármaco se administra a un sujeto mamífero. Los profármacos de la presente invención se preparan al modificar grupos funcionales presentes en los compuestos de tal manera que las modificaciones se desdoblan ya sea por manipulación de rutina o in vivo, al compuesto precursor. Los profármacos incluyen compuestos de la presente invención en donde un grupo hidroxi, amino, o sulfhidrilo se enlaza a cualquier grupo que, cuando el profármaco de la presente invención se administra un sujeto mamífero, se desdobla para formar un grupo hidroxilo libre, amino libre, o sulfhidrilo libre, respectivamente. Los ejemplos de profármacos incluyen, pero no se limitan a, derivados de acetato, formiato y benzoato de grupos funcionales alcohol y amina en los compuestos de la presente invención . "Compuesto estable" y "estructura estable" significan para indicar un compuesto que es suficientemente robusto para sobrevivir aislado hasta un grado útil de pureza a partir de una mezcla de reacción, y la formulación en un agente terapéuticamente eficaz. La presente invención se pretende para abarcar compuestos estables. "Cantidad terapéuticamente efectiva" se pretende que incluya una cantidad de un compuesto de la presente invención solo o una cantidad de la combinación de los compuestos reivindicados o una cantidad de un compuesto de la presente invención en combinación con otros ingredientes activos efectivos para inhibir MCP-1 o efectivos para tratar o prevenir trastornos. Como se usa en la presente, "tratamiento o "tratado" cubre el tratamiento de un estado de enfermedad en un mamífero, particularmente en un humano, e incluye: (a) evitar que el estado de enfermedad se presente en un mamífero, en particular, cuando tal mamífero está predispuesto a tal estado de enfermedad pero no se le ha diagnosticado aún que lo tiene; (b) inhibir el estado de enfermedad, esto es, detener su desarrollo; y/o (c) aliviar el estado de enfermedad, esto es, causar la regresión del estado de enfermedad. Los nombres usados en la presente para designar una forma específica, por ejemplo, "N-2", no deberán considerarse limitantes con respecto a cualquier otra substancia que posee características físicas y químicas idénticas o similares, preferiblemente deberá entenderse que estas designaciones son meramente idénticas a aquellas que deberán interpretarse de conformidad a la caracterización de información también presente en la presente. La presente invención proporciona, al menos en parte, formas cristalinas de la base libre de N- ( ( IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- ( 6- (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, como un material novedoso, en particular, en una forma farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades preferidas, las formas cristalinas de la base libre son en forma substancialmente pura. Las modalidades preferidas de la base libre se describen en el ejemplo 2 como las formas E-l, HAC-1, IPA-1, N-2, RPG-3, HO.5-4 y Hl.75-5. Como se usa en la presente "polimorfo" se refiere a las formas cristalinas que tienen la misma composición química pero diferentes arreglos especiales de las moléculas, átomos, y/o iones formando el cristal. Como se usa en la presente "solvato" se refiere a una forma cristalina de una molécula, átomo, y/o iones que contienen además moléculas de un solvente o solventes incorporados en la estructura cristalina. Las moléculas de solvente en el solvato pueden presentarse en un arreglo regular y/o un arreglo no ordenado. El solvato puede comprender ya sea una cantidad estoiquiometrica o no estoiquiometrica de las moléculas de solvente. Por ejemplo, un solvato con una cantidad no estoiquiometrica de moléculas de solvente pueden resultar de menos parcial del solvente del solvato . Como se usa en la presente "amorfo" se refiere a una forma sólida de una molécula, átomo, y/o iones que no son cristalinos. Un sólido amorfo no exhibe un patrón de difracción de rayos X definitivo. Como se usa en la presente, "substancialmente puro," cuando se usa en referencia a una forma cristalina, significa un compuesto que tiene una pureza mayor que 90 % en peso, incluyendo más que 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 y 99 % en peso, y también incluyen igual hasta alrededor de 100 % en peso del compuesto I, basado en el peso del compuesto. El material restante comprende otras formas del compuesto, y/o impurezas de reacción y/o procesos de impurezas de su preparación. Por ejemplo, una forma cristalina de N-( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-( trifluorornetil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, base libre o sal, puede considerarse substancialmente puro que tiene una pureza mayor que 90 % en peso, como se mide significa que son en este tiempo conocidos y generalmente aceptados en el arte, donde el menos restante es de 10 % en peso del material que comprende otras formas de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- ( tert-butilamino ) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-( trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino ) pirrolidin-1-il) ciclohexil) acetamida, base libre o sal, y/o impurezas de reacción y/o impurezas del proceso. Las muestras de las formas cristalinas pueden proporcionarse con homogeneidad de fases substancialmente pura, indicando la presencia de una cantidad dominante de una forma cristalina sencilla de y opcionalmente cantidades menores de una o más otras de las formas cristalinas. La presencia de más de una forma cristalina de una muestra puede determinarse por técnicas tales como difracción de polvo de rayos X (PXRD) o espectroscopia de resonancia magnética nuclear de estado sólido (SSNMR) . Por ejemplo, la presencia de picos extra en la comparación de un patrón PXRD medido experimentalmente con un patrón PXRD simulado puede indicar más de una forma cristalina en la muestra. El PXRD simulado puede calcularse de datos de rayos X de cristal sencillos. Ver Smith, D.K., "A FORTRAN Program for Calculating X-Ray Powder Diffraction Patterns," Lawrence Radiation Laboratory, Livermore, California, UCRL-7196 (April 1963) . Preferiblemente, la forma cristalina tiene la homogeneidad de fases substancialmente pura como se indica por menos de 10%, preferiblemente menos de 5%, y más preferiblemente menos de 2% del área del pico total en el patrón PXRD medido experimentalmente elevado de los picos extra que están ausentes del patrón de PXRD simulado. Más preferida es una forma cristalina que tiene la homogeneidad de fases substancialmente pura con menos de 1% del área del pico total en el patrón PXRD medido experimentalmente elevado de los picos extra que están ausentes del patrón de PXRD simulado . Los procedimientos para la preparación de las formas cristalinas se conocen en el arte. Las formas cristalinas pueden prepararse por una variedad de métodos, incluyendo por ejemplo, cristalización o recristalización de un solvente adecuado, sublimación, crecimiento de una fusión, transformación de estado sólido a otra fase, cristalización de un fluido supercrítico, y rocío de chorro. Las técnicas para la cristalización o recristalización de las formas cristalinas de una mezcla de solvente incluyen, por ejemplo, evaporación del solvente, disminución de la temperatura de la mezcla del solvente, cristal de semilla una mezcla del solvente supersaturado de la molécula y/o sal, secado por congelado de la mezcla de solvente, la adición de antisolventes (contrasolventes) a la mezcla de solvente. Las formas pueden caracterizarse y distinguirse usando difracción de rayos X de cristal sencillo, los cuales se basan en mediciones de células unitarias de un cristal sencillo de una forma a una temperatura analítica fija. Una descripción detallada de células unitarias se proporciona en Stout & Jensen, X-Ray Structure Determination : A Practical Guide, Macmillan Co . , New York (1968), cápitulo 3, el cual se incorpora para referencia. Alternativamente, el arreglo único de los átomos en la relación espacial dentro del reticulado cristalino puede caracterizarse de conformidad a las coordenadas atómicas de las fracciones observadas. Otro medio de caracterización de la estructura cristalina es por análisis de difracción de polvo de rayos X en el cual el perfil de difracción experimental u observado se compara a un perfil simulado que representa el material de polvo puro, ambos se corren en la misma temperatura analítica, y se miden para someter la forma caracterizada a una serie de valores 2T.
El término "pérdida de peso insignificante," como se emplea en la presente, se caracteriza por el TGA que indica la presencia de una forma de cristal pura (no solvatada) . El término "reabsorción de % de agua insignificante," como se emplea en la presente, se caracteriza por la isotermía de absorción de humedad que indica que la forma de prueba no es higroscópica. En una modalidad de la invención, una forma cristalina de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- ( tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6- (trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il) ciclohexil) acetamida, base libre o sal, se proporciona en la forma substancialmente pura. Esta forma cristalina puede emplearse en composiciones farmacéuticas las cuales opcionalmente incluyen uno o más de otros componentes seleccionados, por ejemplo, del grupo que consiste de excipientes, portadores, y uno de los otros ingredientes farmacéuticos activos o entidades químicas activas de diferentes estructuras moleculares. Preferiblemente, la forma cristalina tiene homogeneidad de fases substancialmente pura como se indica por menos de 10%, preferiblemente menos de 5%, y más preferiblemente menos de 2% del área del pico total en el patrón PXRD medido experimentalmente elevado de los picos extra que están ausentes del patrón de PXRD simulado. Más preferida es una forma cristalina que tiene homogeneidad de fases substancialmente pura con menos de 1% del área del pico total en el patrón PXRD medido experimentalmente elevado de los picos extra que están ausentes del patrón de PXRD simulado. En otra modalidad, una composición se proporciona que consiste esencialmente de las formas cristalinas de N-( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-( trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, base libre o sal. La composición de esta modalidad puede comprender al menos 90 % en peso de la forma, basada en su peso en la composición. La presencia de impurezas de reacción y/o impurezas del proceso puede determinarse por técnicas analíticas conocidas en el arte, tales como, por ejemplo, cromatografía, espectroscopia de resonancia magnética nuclear, espectrometría de masa o espectroscopia infrarroja. Las formas cristalinas pueden prepararse por una variedad de métodos, incluyendo por ejemplo, cristalización o recristalización de un solvente adecuado, sublimación, crecimiento de una fusión, transformación de estado sólido a otra fase, cristalización de un fluido supercrítico, y rocío de chorro. Las técnicas para la cristalización o recristalización de las formas cristalinas de una mezcla de solvente incluyen, por ejemplo, evaporación del solvente, disminución de la temperatura de la mezcla del solvente, cristal de semilla, una mezcla de solvente supersaturado de la molécula y/o sal, secado por congelado de la mezcla de solvente, la adición de antisolventes (contra-solventes) a la mezcla de solvente. Las técnicas de cristalización de alto rendimiento pueden emplearse para preparar las formas cristalinas incluyendo polimorfos. Los cristales de fármacos, incluyendo polimorfos, métodos de preparación, y caracterización de cristales de fármaco se describen en Solid-State Chemistry of Drugs, S.R. Byrn, R.R. Pfeiffer, and J.G. Stowell, 2nd Edition, SSCI, West Lafayette, Indiana (1999). Para las técnicas de cristalización que emplean el solvente, la elección del solvente o solventes depende típicamente de uno o más factores, tales como la solubilidad del compuesto, técnica de cristalización, y presión de vapor del solvente. Las combinaciones de los solventes pueden emplearse; por ejemplo, el compuesto puede solubilizarse en un primer solvente para proporcionar una solución, seguida por la adición de un antisolvente para disminuir la solubilidad del compuesto en la solución y para proporcionar la formación de los cristales. Un "antisolvente" es un solvente en el cual el compuesto tiene menos solubilidad. Los solventes adecuados para preparar cristales incluyen solventes polares y no polares . En un método para preparar cristales, N- ( ( IR, 2S, 5R) -5-(tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6- (trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, base libre o sal, se suspende y/o agita en un solvente adecuado para proporcionar una mezcla espesa, la cual puede calentarse para promover la disolución. El término "mezcla espesa," como se usa en la presente, significa una solución saturada, la cual puede también contener una cantidad adicional del sólido para proporcionar una mezcla heterogénea a una temperatura dada. Los solventes adecuados en este aspecto incluyen, por ejemplo, solventes apróticos polares y solventes próticos polares, y mezclas de dos o más de estos como se discute en la presente. Los cristales de semilla pueden agregarse a cualquier mezcla de cristalización para promover la cristalización. Como deberá ser claro para aquellos de habilidad en el arte, el sembrado se usa un medio para controlar el crecimiento de una forma cristalina particular o como un medio para controlar la distribución del tamaño de partícula del producto cristalino. En consecuencia, el cálculo de la cantidad de las semillas necesarias depende del tamaño de la semilla disponible y el tamaño deseado de una partícula de producto promedio como se describe, por ejemplo, en "Programmed cooling of batch crystallizers, " J.W. Mullin and J. Nyvlt, Chemical Engineering Science (1971) 26:369-377. En general, las semillas de tamaño pequeño son necesarias para controlar efectivamente el crecimiento de los cristales en el lote. Las semillas de tamaño pequeño pueden generarse por el tamizado, molido o micronizado de los cristales más grandes, o por micro-cristalización de las soluciones. Se deberá tener cuidado en el molido o micronizado de los cristales que no resulte en ningún cambio en cristalinidad de la forma de cristal deseada (esto es, cambio a amorfo o a otro polimorfo) . Una mezcla fría puede filtrarse bajo vacio, y los sólidos aislados pueden lavarse con un solvente adecuado, tal como solvente de recristalización frió, y se seca bajo una purga de nitrógeno para proporcionar la forma cristalina deseada. Los sólidos aislados pueden analizarse por una técnica de espectroscopia adecuada o analítica, tal como SSNMR, DSC, PXRD, o similares, para asegurar la formación de la forma cristalina preferida del producto. La forma cristalina resultante es típicamente producida en una cantidad de más de alrededor de 70 % en peso de rendimiento aislado, pero preferiblemente mayor a 90 % en peso basado en el peso de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( ( S ) -2-oxo-3- ( 6- ( trifluorometil ) quinazolin- -ilamino ) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, base libre o sal, originalmente empleado en el procedimiento de cristalización. El producto puede ser co-molido o pasado a través de tamiz de malla para desaglomerar el producto, si es necesario. Las formas cristalinas pueden prepararse directamente del medio de reacción de la etapa de proceso final para preparar N- ( (IR, 2S, 5R) -5- ( tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6- (trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, base libre o sal. Esto puede llevarse a cabo, por ejemplo, por emplearse en la etapa del proceso final un solvente o mezcla de los solventes a partir de los cuales el compuesto puede cristalizarse. Alternativamente, las formas cristalinas pueden obtenerse por destilación o técnicas de adición del solvente. Los solventes adecuados para este propósito incluyen cualquiera de aquellos solventes descritos en la presente, incluyendo solventes próticos polares, tales como alcoholes, y solventes apróticos polares, tales como cetonas . A manera de guia general, la mezcla de reacción puede filtrarse para remover cualquier impureza innecesaria, sales inorgánicas, y similares, seguido por lavado con solvente de reacción o cristalización. La solución resultante puede concentrarse para remover los constituyentes del exceso de solvente o gas. Si la destilación se emplea, la cantidad última del destilado colectado puede variar, dependiendo de los factores del proceso incluyendo, por ejemplo, tamaño de recipiente, capacidad de agitación, y similares. A manera de guia general, la solución de reacción puede destilarse hasta alrededor de 1/10 del volumen original antes de que el reemplazo del solvente se lleve a cabo. La reacción puede mostrarse y ensayarse para determinar el grado de la reacción y el % en peso del producto de conformidad con las técnicas de proceso estándar. Si se desea, el solvente de reacción adicional puede agregarse o removerse para optimizar la concentración de reacción. Preferiblemente, la concentración final se ajusta hasta alrededor de 50 % en peso en cuyo punto una mezcla espesa resulta típicamente. Puede ser preferible agregar solventes directamente al recipiente de reacción sin destilar la mezcla de reacción. Los solventes preferidos para este propósitos son aquellos los cuales pueden participar últimamente en el reticulado cristalino, como se discute arriba en la conexión con el intercambio de solvente. Aunque la concentración final puede variar dependiendo de la pureza deseada, recuperación y similares, la concentración final de la base libre en la solución es preferiblemente alrededor de 4% hasta alrededor de 7%. La mezcla de reacción puede agitarse siguiendo la adición del solvente y calentamiento simultáneamente. A manera de ilustración, la mezcla de reacción puede agitarse durante alrededor de 1 hora mientras se calienta hasta alrededor de 70°C. La reacción se filtra preferiblemente caliente y se lava con ya sea el solvente de reacción, el solvente agregado o una combinación de los mismos. Los cristales de semilla pueden agregarse a cualquier solución de cristalización para iniciar la cristalización. Las diversas formas descritas en la presente pueden distinguirse una de otra a través del uso de diversas técnicas analíticas conocidas por alguien de habilidad ordinaria en el arte. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a, difracción de polvo de rayos X (PXRD), calorimetría de barrido diferencial (DSC) y/o análisis termogravimétrico (TGA) . Alternativamente, las formas pueden caracterizarse y distinguirse usando difracción de rayos X de cristal sencillo, las cuales se basan en células unitarias medidas de un cristal sencillo de una forma dada a una temperatura analítica fija. Una descripción detallada de células unitarias se proporciona en Stout & Jensen, X-Ray Structure Determination : A Practical Guide, Macmillan Co., New York (1968), Chapter 3, el cual se incorpora para referencia. Específicamente, el arreglo único de átomos en la relación espacial dentro del reticulado cristalino puede caracterizarse de conformidad a las coordenadas atómicas fraccionadas observadas. Otros medios de caracterización de la estructura cristalina por análisis de difracción de polvo de rayos X en los cuales el perfil de difracción observado se compara a un perfil simulado generado de los datos de estructura de cristal sencilla. Las medidas de la difracción de polvo de rayos X para la forma sometida se caracterizan como una serie de valores 2T (usualmente cuatro o más) . Otro medio de caracterización de la forma puede usarse, tal como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear en estado sólido (SSNMR) , calorimetría de barrido diferencial (DSC) , termografía y examen aproximado de la morfología cristalina o amorfa. Estos parámetros pueden también usarse en combinación para caracterizar la forma objetivo. Alguien de habilidad ordinaria en el arte apreciará que un patrón de difracción de rayos X puede obtenerse con un error de medición que depende de las condiciones de medición empleadas. En particular, se conoce generalmente que las intensidades en el patrón de difracción de rayos X pueden fluctuar dependiendo de las condiciones de medición empleadas y la forma o morfología del cristal. Deberá entenderse además que las intensidades relativas pueden también variarse dependiendo de las condiciones experimentales y en consecuencia, el orden exacto de la intensidad no deberá tomarse en cuenta. Adicionalmente, un error de medición del ángulo de difracción para un patrón de difracción de rayos X convencionales es típicamente alrededor de valores 0.2° 2T o menos, preferiblemente alrededor de valores 0.1° 2T (como se discute en la presente de aquí en adelante) , y tal grado del error de medición deberá tomarse en cuenta como referente a los ángulos de difracción anteriormente mencionados. Consecutivamente, se deberá entender que las formas de cristal de la presente invención no se limitan a formas de cristal que proporcionan patrones de difracción de rayos X completamente idénticos a los patrones de difracción de rayos X detallados en las figuras acompañadas descritas en la presente. Cualquier forma de cristal que proporcione patrones de difracción de rayos X substancialmente idénticos a aquellos descritos en las figuras anexas están dentro del alcance de la presente invención. La habilidad para determinar identidades substanciales de los patrones de difracción de rayos X está dentro del alcance de alguien de habilidad ordinaria en el arte . Esquema de Reacción 1 Hidrólisis del cetoéster V al cetoácido VI SINTESIS El cetoéster V se hidrolizó a su cetoácido VI correspondiente al suspender V en un solvente orgánico parcialmente miscible con agua, tal como éteres acrilicos o cíclicos incluyendo THF, 2-metil THF, 1 , 2-dimetoxietano, 1,4-dioxano, THF siendo preferido, y agregar base acuosa tal como soluciones acuosas de MOH de hidróxidos de metal alcalino, donde M es Li, Na o K, 1N NaOH siendo la base preferida, a - °C hasta +5°C. La mezcla bifásica se agita entonces a < 5°C durante al menos una hora. La temperatura baja para la adición y reacción de la base es importante para minimizar la epimerización en el carbono adyacente al grupo éster. El solvente no miscible en agua, preferiblemente éter de metil tert-butilo se agrega entonces y las capas se separan. El producto se transfiere entonces del acuoso de nuevo al solvente orgánico, preferiblemente diclorometano, al ajusfar el pH con ácido, preferiblemente HC1 3N, y VI se usa en la solución para la siguiente etapa. Esquema de Reacción 2 Cetalización del cetoácido VI al ácido cetal VII La solución de VI, preferiblemente en diclorometano, se intercambia por medio de destilación en un solvente de alta ebullición, no higroscópico, tal como tolueno, trifluorotolueno, xilenos, ásteres de ebullición superiores tal como acetato de n-butilo o isobutilo, preferiblemente tolueno. Un glicol de la fórmula HO-Z-OH, (en donde Z es como se define supra) se agrega entonces, preferiblemente etilen glicol (1.2 eq) , seguido por una cantidad catalítica (0.5-2 M %) de un ácido, preferiblemente ácido p-toulensulfónico, y la mezcla se destila a presión atmosférica hasta que la formación del compuesto VII se completa. El producto VII cristaliza durante la adición de acetato de etilo después de enfriar a aproximadamente 70°C. Después de enfriar además hasta temperatura ambiente, VII se aisla por filtración y secado posterior en alrededor de 70% de rendimiento (para HO(CH2)2OH , Ri=H, R2=CBz) . Esquema de Reacción 3 Transformación del ácido cetal VII al isocianato de cetal no aislado VIII y luego a la amida cetal IX por medio de activación/azidación ácida, reconfiguración y acilación Curtius VIH IX El cetoácido VII se activa primero al transformarlo a su anhídrido mezclado usando aminas terciarias, preferiblemente trietilamina, y haloformiatos , preferiblemente cloroformiato de isobutilo en solventes secos, tales como tolueno, trifluorotolueno, 1 , 2-dicloroetano, 1-clorobutano, xilenos, preferiblemente tolueno seco, por la adición de un haloformiato a una solución previamente enfriada de VII y trialquilamina . La temperatura preferida para al formación de anhídrido mezclado es de -10°C hasta 0°C. Después de aproximadamente 30 min, una solución acuosa de azida de metal alcalino, preferiblemente ~30 % en peso de sodio azida y un catalizador de transferencia de fase, tales como sales de tetralquilamonio, preferiblemente bromuro de tetrabutilamonio (5 mol %) se agrega y la mezcla bifásica se agita vigorosamente durante alrededor de lh a -10°C hasta 0°C. La fase orgánica se separa entonces y la solución de acil azida resultante se seca, tamices moleculares 4 Á molecular siendo el agente secante preferido. La reconfiguración Curtius y el atrapado concomitante del isocianato VIII in situ con un ácido carboxílico para formar una amida cetal IX se realiza al agregar primero un ácido carboxílico, preferiblemente ácido acético, y su correspondiente anhídrido, preferiblemente anhídrido acético, a una solución seca del acil azida, y luego calentar la mezcla 80-90°C por 1-4 horas. El uso de un anhídrido en conjunto con ácido carboxílico es crítico para minimizar la formación de impureza. Después de la remoción parcial del solvente y ácido carboxílico por destilación, el producto cristaliza durante el enfriamiento a temperatura ambiente. El IX se aisla por filtración y secado en 65-78 % de rendimiento (para Z = -(CH2)2-, Ri=H, R2=CBz, Ri0=Me) . Esquema de Reacción 4 Hidrólisis de la amida cetal IX a la cetoamida X IX La cetal hidrólisis del compuesto IX a la cetoamida X se realiza al calentar un solución de IX en un solvente miscible en agua, orgánico, preferiblemente acetona y una solución acuosa de ácido fuerte, preferiblemente HC1 1N, por 2-4 hrs. La temperatura preferida para la hidrólisis es 45-55°C. Después de remover la acetona, el producto se extrajo para dicloromet ano , que se intercambia por acetato de etilo por destilación. El producto X se cristaliza a partir del acetato de etilo durante el enfriamiento a temperatura ambiente, y se aisla por filtración y secado en 85-90% de rendimiento (para HO(CH2)2OH, Ri=H, R2=CBz, Ri0=Me) .
Esquema de Reacción 5 Aminación reduct de cetoamida X para la aminoamida XI A una solución seca de X, preferiblemente en diclorometano, se agrega una amina primaria o secundaria, preferiblemente tert-butilamina (5 eq) , seguido por un ácido Lewis, preferiblemente TiCl2 (OPr-i ) 2 (1.2 eq) , a -20°C hasta 0°C. La mezcla de imina resultante se calienta hasta 10-20°C y el borano (1.1-1.2 eq) se agrega como un complejo con sulfuro de dimetilo o THF, preferiblemente sulfuro de dimetilo. La mezcla de reacción se agita durante 4-6 h y el acetato de etilo saturado con agua se agrega entonces. Las sales de titanio se remueven por filtración y el producto XI se extrae del filtrado orgánico al agua como su sal con un ácido acuoso, preferiblemente HCl 1N. El diclorometano se agrega entonces y la base acuosa, preferiblemente hidróxido de amonio concentrado se agrega a la mezcla bifásica agitada hasta que el pH se ajusta hasta 8.0-8.5. La fase de diclorometano rica en producto se separa entonces y se lava dos veces con solución de cloruro de amonio acuosa para remover los trans isómeros indeseados de XI, y finalmente con agua. El diclorometano se intercambia en acetato de etilo por destilación y XI cristaliza del acetato de etilo durante el enfriamiento y la adición de heptano. El XI se aisla por filtración y se seca en 65-70 % de rendimiento (para Ri=H, R2=CBz, R8=H, R9=tert-Bu, Ri0=Me) . Esquema de Reacción 6 Desprotección de pirrolidonil amina XI La remoción del grupo protector amina R2, donde R2 es C02CH2Ph o CH2Ph, se realiza al hidrogenar un solución de XI en un alcohol, preferiblemente metanol, en presencia de catalizador Pd, preferiblemente Pd/C al 5% en peso, durante varias horas. El catalizador se remueve entonces por filtración, y el metanol se intercambia en acetato de etilo por destilación. El producto XII, que se cristaliza del acetato de etilo durante el enfriamiento y adición de heptano, se aisla por filtración y se seca en 90-95 % de rendimiento (para Ri=H, R2=CBz, R8=H, R9=tert-Bu, Ri0=Me) .
Esquema de Reacción 7 Acoplamiento de amina XII con heterocicloque porta un grupo saliente HET-LG I XII La síntesis del compuesto I se realiza al acoplar la pirrolidonilamina XII y un heterociclo que porta un grupo saliente en presencia de una amina terciaria, preferiblemente trietilamina, en un solvente compatible, tal como diclorometano, isopropanol o acetonitrilo, el diclorometano siendo preferido. Todos los componentes se combinan por lo tanto y la solución se hace reaccionar durante 24-48 hrs a temperatura ambiente. Un solución del componente heterocíclico crudo previamente preparado también puede emplearse. Después de completar la reacción, el diclorometano se lava con ácido diluido, preferiblemente ácido acético al 5 % en peso, la fase acuosa se separa y el diclorometano se intercambia entonces en acetato de etilo por destilación. El producto I, que se cristaliza del acetato de etilo durante el enfriamiento y la adición de heptano, se aisla por filtración y se seca 75-80 % de rendimiento (para Ri=H, Rs=H, R9=tert-Bu, Ri0=Me, HET=6-(trifluorometil ) quinazolin-4-il ) . Para los procesos de esta invención, los materiales de partida son comercialmente disponibles o pueden prepararse fácilmente por alguien de habilidad ordinaria en el arte. Los solventes, temperaturas, presiones, materiales de partida que tienen los grupos deseados, y otras condiciones de reacción, pueden fácilmente seleccionarse como sea apropiado por alguien de habilidad ordinaria en el arte. Los procesos pueden hacerse en escala con objeto de preparar grandes cantidades del compuesto de la fórmula I, tal como en una facilidad de producción comercial. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran las modalidades de los compuestos inventivos y materiales de partida, y no se pretenden como limitantes del alcance de las reivindicaciones.
Como sea apropiado, las reacciones se conducen bajo una atmósfera de nitrógeno seco (o argón) . Para reacciones anhidras, los solventes Dri-Solv del EM se emplearon. Para otras reacciones, solventes de grado reactivo o solventes de grado HPLC se utilizaron. A menos de que se indique de otra manera, todos los reactivos comercialmente obtenidos se usaron como se reciben. Las mediciones CL/EM se obtuvieron utilizando un sistema híbrido de espectrómetro de masas de cuatro polos sencillo Waters ZQ/HPLC Shimadzu. Los datos para el pico de interés se reportaron a partir de la ionización de electrorocio de modo positivo. El espectro RMN (resonancia magnética nuclear) se obtuvo típicamente en los instrumentos Bruker o JEOL 400 Hz y 500 MHz en los solventes indicados. Todos los giros químicos se reportaron en ppm de tetrametilsilano con la resonancia del solvente como el estándar interno. Los datos espectrales 1H-RMN se reportaron típicamente como sigue: giro químico, multiplicidad (s = singlete, br s = singlete amplio, d = doblete, dd = doblete de dobletes, t = triplete, q = cuarteto, sep = septeto, m = multiplete, app = aparente) , constantes de acoplamiento (Hz), e integración. Alguien de habilidad en el arte deberá reconocer las abreviaturas estándar utilizadas en la presente. Para facilitar la referencia, las abreviaturas incluyen, pero no necesariamente limitan a: sat. = saturado, HPLC = cromatografía líquida de alta resolución, PA = porcentaje de área, KF = Karl-Fischer , T.A. = temperatura ambiente, mmol = milimoles, EMAR = espectroscopia de masa de alta resolución, TBTU = tetrafluoroborato de O-benzotriazol-2-il-N, , N ' , N ' -tetrametiluronio, MTBE = TBME = tert-butil metil éter, EDAC = clorohidrato de N- (3-dimetilaminopropil) -N 1 -etilcarbodiimida, EDC = N- (3-dimetilaminopropil) - ' -etilocarbodimida, TEA trietilamina, DPPA = difenil fosforil azida, IPA = alcohol de isopropilo, TFA = ácido trifluoroacético, DCM = diclorometano, THF = tetrahidrofurano, DMF = N, -dimetilformamida , BOP = hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi ) tris (dimetilamino) fosfonio, EtOAc = Acetato de etilo, DMSO = dimetilsulfóxido, °C = grados celsius, eq = equivalente o equivalentes, g = gramo o gramos, mg = miligramo o miligramos, mL (o mi) = mililitro o mililitros, h = hora o horas, M = molar, N = normal, min = minuto o minutos, MHz = megahertz, tic = cromatografía de capa delgada, v/v = volumen a relación de volumen. "a", "ß", "R" y "S" son desginaciones estereoquímicas familiares a aquellas de habilidad en el arte. N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( ( S ) -2-oxo-3- ( 6-( trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il) ciclohexil) acetamida EJEMPLO 1 Ejemplo 1, Etapa 1: El 2-benciloxicarbonilamino-7-oxo-6-aza-biciclo [ 3.2.1 ] octano-6-carboxilato de (IR, 2S, 5R) -tert-Butilo (89.6 g, 0.24 mol, ver: P. H. Cárter, et al. PCT solicitud WO 2005/021500) se disolvió en acetato de etilo (1.5 L) y la solución resultante se lavó con NaHC03 sat. (2 x 0.45 L) y NaCl sat. (1 x 0.45 L) . La solución se secó (Na2S0 ) y luego se filtró directamente en un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 3L. La solución se purgó con inyección de nitrógeno directa antes de cargarse con 10% Pd/C (13.65 g) bajo una atmósfera de nitrógeno. El matraz se evacuó y se volvió a llenar con hidrógeno; esto se repitió dos veces más. El hidrógeno se burbujeó a través de la solución durante 30 minutos y luego la reacción se agitó bajo 1 atm H2 durante 18 horas. El matraz se evacuó, se volvió a llenar con nitrógeno, y se cargó con catalizador fresco (6 g de 10% Pd/C). El hidrógeno se burbujeó a través de la solución durante 30 minutos y luego la reacción se agitó bajo 1 atm H2 durante 18 horas. El matraz se evacuó y se volvió a llenar con nitrógeno. La mezcla se filtró a través de celite; la almohadilla filtro luego se lavó con acetato de etilo. El filtrado (~1.6 L EtOAc volumen) se diluyó con acetonitrilo (0.3 L) y se cargó secuencialmente con L-N-Cbz-metionina (68 g, 0.24 mol), TBTU (77 g, 0.24 mol), y N, N-diisopropiletilamina (42 mL, 0.24 mol) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h, durante el tiempo esto se cargó de una suspensión a una solución clara. La reacción se apagó con la adición de NH4C1 saturado (0.75 L) y agua (0.15 L) ; la mezcla se diluyó además con EtOAc (0.75 L) . Las fases se mezclaron y se separaron y la fase orgánica se lavó con Na2C03 sat. (2 x 0.9 L) y NaCl sat. (1 x 0.75 L) . La solución se secó (Na2S04) , se filtró y se concentró in vacuo para dar 2- ( (S) -2- (benciloxicarbonilamino) - 4- (metilotio) butanamido ) -7-oxo-6-aza-biciclo [3.2.1] octano-6-carboxilato de ( 1R, 2S, 5R) -tert-butilo como un aceite, el cual se tomó en la siguiente etapa sin purificación adicional. CL/EM para el pico primario: [M-Boc+H]+ = 406.3; [M+Na]+ = 528.3. """H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : d 7.36 (m, 5H) , 5.11 (s, 2H) , 4.32 (m, 1H) , 4.2 (m, 1H) , 4.0 (m, 1H) , 2.5 - 2.7 (m, 3H) , 2.25 (m, 1H) , 2.11 (s, 3H) , 2.05 (m, 4H) , 1.9 (m, 1H) , 1.7 (m, 2H) , 1.54 (s, 9H) . También se presentan EtOAc [1.26 (t), 2.03 (s), 4.12 (q)] y N, N, N, N-tetrametilurea [2.83 (s)]. Ejemplo 1, Etapa 2: Una muestra de 2-((S)-2- (benciloxicarbonilamino) -4- (metiltio) butanamido) -7-oxo-6-aza-biciclo [ 3.2.1 ] octano-6-carboxilato de ( IR, 2S, 5R) -tert-butilo (0.24 mol asumido; ver procedimiento previo) se disolvió en yodometano (1.250 g) y se agitó durante 48 h a temperatura ambiente. La reacción se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en diclorometano y se concentró in vacuo. Esto se repitió dos veces más. El lodo resultante se disolvió en diclorometano (0.4 L) y se vació en una solución agitada rápidamente de MTBE (4.0 L) . Los sólidos amarillos resultantes se colectaron por medio de filtración de succión y se secaron bajo alto vacio para proporcionar la sal de sulfonio (179 g) . Este material se tomó en la siguiente etapa sin purificación adicional. CL/EM para el pico primario: [M-Me2S+H] + = 458.4; [M]+ = 520.4. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : d 7.35 (m, 5H) , 5.09 (s, 2H), 4.33 (m, 1H) , 4.28 (m, 1H) , 3.98 (m, 1H) , 3.3 - 3.45 (m, 2H) , 2.97 (s, 3H) , 2.94 (s, 3H) , 2.78 (m, 1H) , 2.0 - 2.3 (m, 4H) , 1.7 (m, 2H) , 1.52 (s, 9H) . También se presentan MTBE [1.18 (s) , 3.2 (s) ] y los trazos de N, N, N, N-tetrametilourea [2.81 (s)]. Ejemplo 1, Etapa 3: Todas las sales de sulfonio de la etapa previa (0.24 mol asumir) se disolvieron en DMSO (2.0 L) . La solución resultante se agitó bajo nitrógeno a temperatura ambiente y se cargó con carbonato de cesio (216 g) en porciones. La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 3 h y luego se filtró para remover los sólidos. La solución se dividió en ~0.22 L porciones y se preparó como sigue: la mezcla de reacción (-0.22 L) se diluyó con acetato de etilo (1.5 L) y se lavó sucesivamente con agua (3 x 0.5 L) y salmuera (1 x 0.3 L) . La fase orgánica se secó (Na2S04) , se filtró y se concentró in vacuo. El 2-((S)-3-(benciloxicarbonilamino) -2-oxopirrolidin-l-il) -7-oxo-6-azabiciclo [3.2.1] octano-6-carboxilato de ( IR, 2S , 5R) -tert-butilo deseado (90.8 g, 83%) se obtuvo como una espuma microcristalina, libre de impureza de tetrametilo urea. CL/EM para el pico primario: [M-Boc+H]+ = 358.4; [M+Na]+ = 480.4. 1H-RMN (400 MHz , d4-MeOH) : d 7.35 (m, 5H) , 5.12 (s, 2H) , 4.35 (m, 2H) , 4.2 (m, 1H), 3.6 (m, 1H) , 3.3 (m, 1H) , 2.64 (m, 1H) , 2.28 - 2.42 (m, 2H) , 2.15 (m, 1H) , 1.7 - 2.0 (m, 5H) , 1.55 (s, 9H) . Si se desea, este material puede aislarse como un sólido por disolverse en MTBE (1 volumen), agregarse a heptano (3.3 volumen), y colectarse el precipitado resultante. Ejemplo 1, Etapa 4: Una solución agitada de 2-((S)-3-(benciloxicarbonilamino) -2-oxopirrolidin-l-il) -7-oxo-6-azabiciclo [ 3.2.1 ] octano-6-carboxilato de ( IR, 2S, 5R) -tert-butilo (108 g, 0.236 mol) en THF (1 L) se cargó con monohidrato de hidróxido de litio (21.74 g, 0.519 mol). Agua (0.3 L) se agregó lentamente, tal que la temperatura no excedió 2°C. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y los volátiles se removieron in vacuo. El pH se ajustó hasta ~4 a través de la adición de 1N HC1 (450 mL) y NaH2P04. Los precipitados blancos resultantes se colectaron por filtración y se lavaron con agua (2 x 1 L) .' El sólido se disolvió en diclorometano (1.5 L) y agua (~ 1 L) . La capa orgánica se secó (Na2S04) , se filtró y se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en EtOAc (0.7 L) y la solución resultante se calentó a reflujo durante 1 h. Los sólidos se separaron después de enfriarse a T.A., y se colectaron por medio de filtración. Estos sólidos se purificaron por recristalización en isopropanol para proporcionar el ácido (IR, 2S, 5R) -2- ( (S) -3- (benciloxicarbonilamino) -2-oxopirrolidin-l-il) -5- ( tert-butoxicarbonilamino) ciclohexanocarboxilico como un sólido blanco (104.5 g, 93% de rendimiento). CL/EM para el pico primario: [M-tBu+H]+ = 420.2; [M-Boc+H]+ = 376.2; [M+H]+ = 476.2. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : d 7.35 (m, 5H) , 5.11 (s, 2H) , 4.35 (m, 2H) , 3.71 (m, 1H) , 3.45 - 3.6 (m, 2H) , 2.99 (m, 1H), 2.41 (m, 1H) , 2.15 (m, 1H) , 2.0 (m, 2H) , 1.6 - 1.9 (m, 4H) , 1.46 (s, 9H) . Ejemplo 1, Etapa 5: Un matraz de fondo redondo de 3 L se cargó con ácido ( IR, 2S, 5R) -2- ( (S) -3- (benciloxicarbonilamino) -2-oxopirrolidin-l-il ) -5- (tert-butoxicarbonilamino) ciclohexanocarboxílico (75.5 g, 0.158 mol), EDOHC1 (33.5 g, 0.175 mol), 1-hidroxibenzotriazol (23.6 g, 0.175 mol), y diclorometano (1 L) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, durante el tiempo esto se cargó de una suspensión blanca a una solución clara. El amoniaco (gas) se burbujeó en la solución hasta que el pH se hizo fuertemente básico (papel) y la reacción se agitó durante 10 minutos; esta adición de amoniaco se repitió y la reacción se agitó durante 10 minutos adicionales. El agua se agregó. La fase orgánica se lavó con NaHC03 saturado, NaH2P04, y salmuera antes de concentrarse in vacuo. El residuo se hizo mezcla espesa con acetonitrilo (0.5 L) y luego se concentró para dar (1R,2S, 5R) -2- ( (S) -3- (benciloxicarbonilamino) -2-oxopirrolidin-l-il) -5- ( tert-butoxicarbonilamino) ciclohexanecarboxamida como un sólido blanco (75.9 g, -100%), el cual se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. CL/EM para el pico primario: [M-Boc+H]+ = 375.3; [M+H]+ = 475.4; [M-tBu+H]+ = 419.3. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : d 7.35 (m, 5H) , 5.11 (s, 2H), 4.25 (m, 2H) , 3.70 (m, 1H) , 3.6 (m, 1H) , 3.45 (m, 1H) , 2.91 (m, 1H) , 2.38 (m, 1H) , 2.12 (m, 1H) , 1.9 - 2.05 (m, 2H) , 1.65 - 1.9 (m, 4H) , 1.46 (s, 9H) . Ejemplo 1, Etapa 6: La reacción se corrió en tres porciones iguales y combinó para el trabajo acuoso. Un matraz de fondo redondo de 3 cuellos, 5 L se cargó con ( IR, 2S, 5R) -2-( (S) -3- (benciloxicarbonilamino) -2-oxopirrolidin-l-il ) -5- (tert-butoxicarbonilamino) ciclohexancarboxamida (25.3 g, 53 mmol), acetonitrilo (1.9 L) , y 2.6 L de agua/hielo. La mezcla se agitó y enfrió a 0°C. El diacetato de yodobenceno (25.77 g, 80 mmol) se agregó y la reacción se agitó durante 2 h; otros 0.5 eq de diacetato de yodobenceno se agregó. La reacción se agitó durante 9 h (temperatura de reacción < 10°C) . La mezcla se cargó con 8 eq de N, -diisopropiletilamina y 2 eq de anhídrido acético. Durante los siguientes treinta minutos, 4 eq de N,N-diisopropiletilamina y 2 eq de anhídrido acético se agregaron cada diez minutos, hasta que la reacción había procedido a la terminación (HPLC) . El acetonitrilo se removió in vacuo; un poco de sólido se separó del residuo, y esto se colectó por filtración. El residuo restante se extrajo con diclorometano (3 L, luego 1 L) . La fase orgánica se lavó secuencialmente con agua, NaHC03 saturado, y salmuera. Los sólidos colectados se agregaron a la fase orgánica, junto con carbono activado (15 g) . La mezcla se agitó durante 30 minutos a 40°C antes de filtrarse y concentrarse in vacuo. El residuo se disolvió en EtOAc (1 L), y la solución resultante se agitó a 75°C durante 1 h antes de permitirse a enfriar a temperatura ambiente. Un sólido se separa y se colecta por filtración. Este sólido se purificó además por recristalización: esto se disolvió primero en CH2CI2 0.5 L, luego se concentró in vacuo, luego se re-cristalizó de EtOAc 1 L; esto se repitió tres veces. Los sólidos obtenidos de los licores madre de lo anterior se re-cristalizaron tres veces usando el mismo método. Los sólidos combinados se re-cristalizaron dos veces más de acetonitrilo (0.7 L) para proporcionar 66 g (84%) de ( IR, 3R, 4S ) -3-acetamido-4- ( (S) -3- (benciloxicarbonilamino) -2-oxopirrolidin-l-il ) ciclohexilcarbamato de tert-butilo (pureza >99.5% por HPLC) . CL/EM para el pico primario: [M+H]+ = 489.4; [M-tBu+H]+ = 433.3. XH-RMN (400 MHz, d4-MeOH) : d 7.3 - 7.4 (m, 5H) , 5.11 (s, 2H), 4.35 (m, 1H) , 4.15 (m, 1H) , 4.04 (m, 1H) , 3.8 (m, 1H), 3.6 (m, 2H), 2.44 (m, 1H) , 2.12 (m, 1H) , 1.87 - 2.05 (m, 4H), 1.87 (s, 3H) , 1.55 - 1.7 (m, 2H) , 1.46 (s, 9H) . La fidelidad estereoquímica del cambio de Hofmann se confirmó a través de Análisis de estructura de cristal de rayos X de este compuesto, como se muestra en la Figura 1. Ejemplo 1, Etapa 7: A una solución de ( IR, 3R, S) -3-acetamido-4- ( (S) -3- (benciloxicarbonilamino) -2-oxopirrolidin-l-il ) ciclohexilcarbamato de tert-butilo (100 g, 0.205 mol) en diclorometano (400 mi) se agregó TFA (400 mi) a -20°C. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El solvente y más de TFA se removieron bajo presión reducida, y el residuo se diluyó con diclorometano (2 L) y solución de K2C03 acuoso (2 L) . El pH se ajustó hasta 10 con 1N HC1. La capa acuosa se extrajo con diclorometano (3 x 1L) . La capa orgánica combinada se secó sobre Na2S04, y se concentró para dar (S) -1- ( (1S, 2R, 4R) -2-acetamido-4-aminociclohexil) -2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de bencilo como un aceite (81 g, 100% de rendimiento) . Esta amina se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Ejemplo 1, Etapa 8: A una solución de (S) -1- ( ( 1S , 2R, 4R) -2-acetamido-4 -aminociclohexil ) -2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de bencilo (13.3 g, 34 mmol) y 3 , 5-di-tert-butilciclohexa-3 , 5-dieno-1 , 2-diona (7.54 g, 34 mmol) en metanol (160 mi) se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La solución se concentró y se diluyó con acetona (132 mi) y agua (33 mi), seguido por adición de Dowex-50 X8-200 (33 g) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El Dowex-50WX8-200 se removió por filtración y se lavó con diclorometano (300 mi) . El filtrado se concentró bajo vacio para remover más de la acetona. El residuo se diluyó con diclorometano (200 mi) y se lavó con una solución de NaHC03 acuoso (200 mi) y salmuera (200 mi) . Las capas acuosas combinadas se extrajeron con diclorometano (2 x 100 mi) . Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2S04 y se concentraron. El producto de (S)-1- ( (1S, 2R) -2-acetamido-4-oxociclohexil ) -2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de bencilo se obtuvo como un sólido (12 g, 90% de rendimiento) por cristalización en EtOAc (100 mi) y Hexano (200 mi). 1H-RMN (500 MHz, D SO-d6) d ppm 7.99 (d, J=9.35 Hz, 1 H) , 7.44 (d, J=8.80 Hz, 1 H) , 7.28 -7.39 (m, 5 H) , 5.03 (s, 2 H), 4.50 (s, 1 H), 4.31 (d, J=12.10 Hz, 1 H) , 4.18 (q, J=8.98 Hz, 1 H) , 3.27 (m, 2 H) , 2.82 (dd, J=15.12, 5.22 Hz, 1 H), 2.52 - 2.65 (m, 1 H) , 2.40 (dd, J=12.92, 4.67 Hz, 1 H) , 2.15 - 2.31 (m, 2 H) , 2.09 (d, J=15.40 Hz, 1 H) , 1.90 (m, 1 H) , 1.81 (s, 3 H), 1.68 (m, 1 H) . m/z: 388.46 [M+H] . Ejemplo 1, Etapa 9: A una solución de TiCl4 (1M en diclorometano, 36 mi, 36 mmol) en diclorometano (30 mi) a 0°C se agregó Ti(OiPr)4 (10.8 mi, 36 mmol). La mezcla luego se agitó a temperatura ambiente durante 10 min. A una solución de (S) -1- ( (1S, 2R) -2-acetamido-4-oxociclohexil ) -2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de bencilo (23.25 g, 60 mmol) en diclorometano (600 mi) se agregó tert-butilamina (30 mi, 300 mmol) a temperatura ambiente, seguido por la adición de la solución de TiCl4/Ti (OiPr ) 4 a -50°C. La reacción se permitió calentar lentamente a temperatura ambiente. La reacción se finalizó después de 2 h (La reacción se monitoreó en HPLC por apagar una muestra HPLC con NaBH4 en metanol) . La solución se enfrió a 10°C y BH3»SMe2 ( 1M en diclorometano, 66 mi, 66 mmol) se agregó. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 h luego se apagó con una solución de Na2C03 acuoso (300 mi) . El precipitado se filtró completamente. Las dos capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con diclorometano (600 mi) . Las capas de diclorometano combinadas se extrajeron con 1N HC1 dos veces (150 mi y 15 mi). (El producto y el trans isómero indeseado fueron ambos en la fase acuosa ácida) . Las capas acuosas acidicas combinadas se neutralizaron con 12 M solución acuosa de NH4OH (12 mi) hasta pH~8 y se extrajeron con diclorometano dos veces (600 mi, 450 mi). (El producto se hizo fase orgánica, mientras el trans isómeros todavía estaba en la capa acuosa.) Las capas orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa de NHC1 3 veces (3 x 200 mi) hasta que el trans isómero no se dejo en la capa orgánica. La capa orgánica se secó sobre Na2S04 y se concentró. El residuo se purificó por cristalización en EtOAc/Hexano (200 mi / 800 mi) para dar el (S ) -1- ( ( 1S, 2R, 4R) -2-acetamido-4- ( tert-butiloamino) ciclohexil) -2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de bencilo (20.80 g, 78% de rendimiento) como un sólido blanco con 99.5% de pureza. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) d ppm 8.76 (s, 1H), 7.27 - 7.46 (m, 6 H) , 5.03 (m, 2 H) , 4.14 (m, 1 H) , 4.07 (q, J=8.80 Hz, 1 H) , 3.83 (m, 1H) , 3.36 (m, 2H) , 2.91 (s, 1H) , 2.18 (m, 1H), 2.04 (m, 1H) , 1.78 (s, 3H) , 1.41 - 1.74 (m, 7H) , 1.04 (s, 9H) . m/z: 445.54 [M+H] . Ejemplo 1, Etapa 10: A una solución de ( S ) -1- ( ( 1S , 2R, 4R) - 2-acetamido-4- ( tert-butiloamino ) ciclohexil) -2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de bencilo (43.3 g, 98 mmol) en metanol (400 mi), 10% en peso Pd/C (4.34 g) se agregó. La mezcla se evacuó y se volvió a llenar con hidrógeno con un globo de hidrógeno. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 h. La mezcla se filtró y se lavó con metanol (500 mi) y se concentró bajo vacio hasta secarse. El producto crudo obtenido se destiló con IPA (2 x 100 mi) bajo presión reducida para dar el producto N-( (IR, 2S, 5R) -2- ( (S) -3-amino-2-oxopirrolidin-l-il) -5- (tert-butiloamino) ciclohexil ) acetamida como un aceite (30 g, 98% de rendimiento) . Esta amina se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Ejemplo 1, Etapa 11: A una solución de N- ( ( IR, 2S , 5R) -2-( (S) -3-amino-2-oxopirrolidin-l-il ) -5- (tert-butiloamino) ciclohexil ) acetamida (30 g, 97 mmol) en IPA (400 mi) se agregó TEA (27 mi, 195 mmol) y 4-cloro-6-( trifluorometil ) quinazolina (25 g, 107 mmol; ver P. H. Cárter, et al. Solicitud PCT WO 2005/021500). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche y luego se agitó a 70°C durante lh. La solución resultante se concentró bajo presión reducida hasta secarse. El residuo se disolvió en diclorometano (1 L) y se extrajo con una solución de ácido acético I (preparada por combinar 700 mL de agua y 22.6 mL de ácido acético glacial) dos veces (500 mi, 200 mi) . La capa acuosa acidica (pH 4-5) se extrajo con diclorometano (2 x 300 mi) . La capa de diclorometano se extrajo con una solución de ácido acético II (300 mi; preparada por combinar 300 mL agua con 4 mL de ácido acético glacial) . Las capas de ácido acético combinadas se hicieron básicas con 1 M NaOH hasta pH > 12 y se extrajeron con diclorometano (3 x 700 mi) . Las capas orgánicas combinadas se secaron y se concentron para dar el producto crudo como un sólido (45.6 g, 93% de rendimiento) . El producto crudo se purificó por recristalización de EtOAc (400 ml)/Hexano (900 mi) para dar 42.86 g (88%) N- ( ( IR, 2S, 5R) -5- ( tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6- ( trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il) ciclohexil) acetamida con 99.7% de pureza. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) d ppm 9.71 (1 H, br. s.), 9.02 (1 H, s), 8.71 (1 H, d, J=7.97 Hz), 8.59 (1 H, s), 8.04 (1 H, dd, J=8.66, 1.79 Hz) , 7.88 (1 H, d, J=8.52 Hz), 4.91 - 5.13 (1 H, m) , 4.30 - 4.57 (1 H, m) , 3.86 (1 H, dt, J=11.89, 3.71, 3.64 Hz), 3.43 - 3.57 (1 H, m) , 3.35 - 3.45 (1 H, m) , 3.04 (1 H, t, J=3.85 Hz), 2.23 -2.40 (1 H, m) , 2.05 - 2.22 (1 H, m) , 1.90 - 1.98 (1 H, m) , I.86 - 1.93 (3 H, m) , 1.50 - 1.78 (5 H, m) , 0.98 - 1.15 (9 H, m) . 13C-RMN (126 MHz, DMSO-d6) d ppm 171.23, 169.35, 159.54, 156.87, 151.17, 128.97, 128.20, 125.76 (1 C, q, J=30.52 Hz), 121.55 (1 C, br. s.), 124.04 (1 C, q, J=272.11 Hz), 114.31, 53.26, 52.39, 50.81, 47.56, 45.70, 42.77, 34.52, 32.17, 29.14 (3 C, s), 26.49, 23.29, 20.30. 19F-RMN (471 MHz, DMSO-d6) d ppm -60.34 (s). m/z: 507.0 [M+H] . Análisis calculado para C25H33 6O2 F3 : C, 59.27; H, 6.56; N, 16.59; F, 11.25 Encontrado: C, 59.44; H, 6.64; N, 16.74; F, 10.99. PREPARACION ALTERNATIVA DEL EJEMPLO 1 Ejemplo 1, Preparación alternativa, Etapa 1: Un matraz de fondo redondo de 3 cuellos secado al horno se equipó con una barra de agitación seca, un condensaro de flujo seco, y dos septos. Después de enfriarse bajo N2, el matraz se cargó secuencialmente con ácido (IR, 2S, 5R) -2- ( (S) -3- (benciloxicarbonilamino) -2-oxopirrolidin-l-il ) -5- (tert-butoxicarbonilamino) ciclohexanocarboxílico (60 g, 126 mmol; ver Ejemplo 1, Etapa 4), acetonitrilo (800 mL) , N-metilmorfolina (27.7 mL, 252 mmol), y difenilfosforil azida (29.9 mL, 139 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h 40 min, tiempo en el cual 2-trimetilsililetanol (90 mL, 631 mmol) se agregó. La reacción se agrupo para calentarse, y alcanzo reflujo 30 minutos más tarde. Esto se permitió poner a reflujo durante 1 h, tiempo en el cual esto se permitió enfriar a 50°C gradualmente y luego se enfrió a 15°C con enfriamiento externo. La reacción se apagó con la adición de ácido acético (1.734 mL, 30.3 mmol). La reacción se concentró in vacuo y luego se disolvió en EtOAc (1.2 L) . Esto se lavó secuencialmente con agua (1 x 0.3 L) , NaHC03 sat. (2 x 0.3 L) , 1N HC1 (1 x 0.3 L) , y salmuera (2 x 0.3 L) . La fase orgánica se secó (Na2S04) , se filtró, y se concentró in vacuo. Un sólido apareció muy tempranamente en el proceso de concentración. Después de que los volátiles se removieron, 800 mL 10% EtOAc/Hexanos se agregó, y la mezcla se agitó durante la noche. El sólido se colectó y se secó para proporcionar (IR, 3R, 4S) -4- ( (S) -3-benciloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il) -3- ( (2- trimetilsilil ) etoxicarbonilaraino) ciclohexilcarbamato de tert-butilo (60.5 g, 102 mmol, 81 % de rendimiento). HPLC mostró que el material fue 72% puro, con dos impurezas del 12%. Este material se tomó en la siguiente etapa sin purificación. El filtrado se concentró más tarde para proporcionar otros 4.38 g del producto. Rendimiento total = 64.9 g (87%). Ejemplo 1, Preparación alternativa, Etapa 2: Un matraz de fondo redondo de 500 mi seco se equipó con una barra de agitación y se cargó secuencialmente con ( IR, 3R, 4S) -4- ( (S) -3-benciloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il ) -3- ( (2-trimetilsilil) etoxicarbonilamino) ciclohexilcarbamato de tert-butilo (60.5 g) , CH2C12 (180 mL) , y una solución de monohidrato de ácido para-toluensulfónico (19.48 g, 102 mmol) en CH2C12 (120 mL) y metanol (30 mL) . La mezcla se colocó en un evaporador rotatorio y el volumen de CH2C12 se removió (temperatura de baño ca . 20°C) . Cuando la mezcla se hizo espuma, el vacio se re-liberó, y la temperatura del baño se incrementó a 46°C (la temperatura varió de entre 44 y 51°C; esto se controló con la adición de hielo externo) . La mezcla se giro a esta temperatura durante exactamente una hora la evolución del gas fue visible a través de esto) y luego se diluyó con EtOAc (1 L) . La fase orgánica se lavó con 0.5 N NH4OH (2 x 250 mL) . Los lavados acuosos se combinaron y se agruparon a un lado. La fase orgánica se lavó con NH4C1 sat. (1 x 250 mL) y NaCl sat. (1 x 250 mL) ; estos lavados acuosos se descartaron. Los lavados de NH4OH combinados iniciales se volvieron a extraer con EtOAc (1 x 250 mL) , y que el extracto orgánico se lavó con NHC1 sat. (1 x 60 mL) y NaCl sat. (1 x 60 mL) . Todos los extractos orgánicos se combinaron, se secaron (Na2S04) , se filtraron, y se concentraron. El residuo se purificó por elusión a través de un tapón S1O2 (13 cm ancho x 7.5 cm alto) . El primer eluyente fue EtOAc puro (ca. 4 L) . El segundo eluyente fue 1:9 (10% NH4OH en MeOH) /CH2C12 (ca. 5 L) . Las fracciones que contienen el producto deseado se vaciaron juntas y se evaporaron para proporcionar el (IR, 2S, 5R) -5-amino-2- ( (S) -3-benciloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il ) ciclohexilcarbamato de 2- (trimetilsilil) etilo deseado (31.6 g, 64.4 mmol, 63 % de rendimiento) . Ejemplo 1, Preparación alternativa, Etapa 3: Una solución agitada de ( IR, 2S , 5R) -5-amino-2- ( ( S ) -3-benciloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il ) ciclohexilcarbamato de 2- (trimetilsilil) etilo (400 mg, 0.82 mmol) en acetonitrilo (3 mL) se cargó secuencialmente con diisopropiletilamina (315.8 mg, 3 eq) y bromoacetonitrilo (109.5 mg, 1.1 eq) . La mezcla se agitó a 40°C durante 30 h. El solvente se removió bajo presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía de columna de gel de sílice, usando 1.5% de metanol en diclorometano como eluyente. El ( IR, 2S , 5R) -2- ( ( S ) -3-benciloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il ) -5- ( cianometilamino ) ciclohexilcarbamato de 2- (trimetilsilil) etilo deseado se obtuvo como un sólido blanco (400 mg, 93%). CL/EM encontrado [M + H]+ = 530. Ejemplo 1, Preparación alternativa, Etapa 4: Una solución agitada de (IR, 2S, 5R) -2- ( (S) -3-benciloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il) -5- (cianometilamino) ciclohexilcarbamato de 2- (trimetilsilil ) etilo (400 mg, 0.76 mmol) en diclorometano (5 mL) , se enfrió a 0°C y se cargó con m-CPBA (372.6 mg, 2.2 eq) en porciones. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 h. La solución de Na2S203 saturado (3 mL) y la solución de NaHC03 saturado (3 mL) se agregaron y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 0.5h. La mezcla se diluyó con diclorometano (80 mL) , se lavó con NaHC03 saturado (20 mL) y salmuera (20 mL) . La solución se secó sobre Na2SC anhidro, se filtró, y se concentró in vacuo. El residuo obtenido se disolvió en metanol (5 mL) y la solución se cargó con NH2OH-HC1 (262.7 mg, 5 eq) . La mezcla se agitó a 60°C durante 2.5 h. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con diclorometano (80 mL) y se filtró a través de una almohadilla de celite. El filtrado se lavó con NaHC03 saturado (2 x 20 mL) . Los lavados acuosos se extrajeron con diclorometano (30 mL) . Las capas de diclorometanos se combinaron y se lavaron con salmuera (30 mL) . La solución se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró, y se concentró in vacuo para dar ( IR, 2S , 5R) -2- ( ( S ) -3-benciloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il ) -5- (hidroxiamino) ciclohexilcarbamato de 2- (trimetilsilil) etilo (350 mg, 91%). CL/EM encontrado [M + H]+ = 507. Ejemplo 1, Preparación alternativa, Etapa 5: A una solución de ( IR, 2S, 5R) -2- ( (S) -3-benciloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il ) -5- (hidroxiamino) ciclohexilcarbamato de 2- ( trimetilsilil ) etilo (350 mg, 0.69 mmol) en acetona (5 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. La mezcla se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en THF anhidro (7 mL) y se enfrió a 0°C. A una solución de MeMgBr (1.1 mL, 3M en dietil éter, 5 eq) se agregó gota a gota. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1.5h. La reacción se apagó con agua (5 mL) a 0°C. La mezcla se diluyó con acetato de etilo (100 mL) y se filtró a través de una almohadilla de celite. El filtrado se lavó con salmuera (30 mL) . La solución se secó sobre MgS04 anhidro, se filtró, y se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en 2 mi de acetonitrilo y 1 mi de CS2 se agregó. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 horas. El solvente se removió y el producto crudo se purificó por cromatografía de columna de gel de sílice, usando 1.5% de metanol en diclorometano como eluyente, para proporcionar el (IR, 2S, 5R) -2- ( (S) -3-benciloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il ) -5- ( tert-butilamino) ciclohexilcarbamato de 2- ( trimetilsilil ) etilo deseado (160 mg, 42%). CL/EM encontrado [M + H]+ = 547. Ejemplo 1, Preparación alternativa, Etapa 6: Una solución agitada de ( IR, 2S, 5R) -2- ( (S) -3-benciloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-l-il) -5- (tert-butilamino) ciclohexilcarhamato de 2- (trimetilsilil) etilo (100 mg, 0.183 mmol) en diclorometano (3 mL) se cargó con ácido trifluoroacético (2 mL) . La reacción se agitó durante 2 h a temperatura ambiente y se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en diclorometano (50 mL) y se lavó con NaHC03 saturado (20 mL) . La capa acuosa se extrajo con diclorometano (3 x 30 mL) . Las capas de diclorometano se combinaron y se secaron sobre Na2S04 anhidro, se filtraron, y se concentraron in vacuo para dar (S) -1- ( ( 1S, 2R, 4R) -2-amino-4-(tert-butilamino) ciclohexil) -2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de bencilo (66 mg, 90%). CL/EM encontrado [M + H]+ = 403. Ejemplo 1, Preparación alternativa, Etapa 7: A una solución de (S) -1- ( ( 1S, 2R, 4R) -2-amino-4- ( tert-butilamino ) ciclohexil ) -2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de bencilo (22 mg, 0.055 mmol) en diclorometano (2 mL) se cargó secuencialmente con trietilamina (11.1 mg, 2 eq) y anhídrido acético (6.1 mg, 1.1 eq) . La reacción se agitó durante 1.5 h a temperatura ambiente, se diluyó con diclorometano (50 mL) y se lavó con NaHC03 saturado (20 mL) . La fase orgánica se secó sobre Na2S0 anhidro, se filtró, y se concentró in vacuo para dar ( S )- 1 -( ( 1 S , 2R, 4 R ) -2 -acetamido- 4 -( tert-butilamino) ciclohexil) -2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de bencilo (22 mg , 90%) . CL/EM encontrado [M + H]+ = 445.
Ejemplo 1, Preparación alternativa, Etapa 8: A una solución de (S) -1- ( ( 1S, 2R, R) -2-acetamido-4- (tert-butilamino) ciclohexil) -2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de bencilo (22 mg, 0.05 mmol) en metanol (2 mL) se agregó Pd(OH)2 (20 mg de 50% en peso catalizado) . El matraz se evacuó y se volvió a llenar con hidrógeno de un globo de hidrógeno. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 h y el catalizador se removió por filtración. El filtrado se concentró in vacuo para proporcionar N- ( ( IR, 2S , 5R) -2- ( ( S ) -3-amino-2-oxopirrolidin-l-il) -5- ( tert-but i lamino ) ciclohexi 1 ) ace t amida (13 mg, 85%) . CL/EM encontrado [M + H]+ = 311. Ejemplo 1, Preparación alternativa, Etapa 9: A una solución ' de N - ( ( 1 R , 2 S , 5 R ) - 2 - ( ( S ) - 3 -ami no - 2 -oxopirrolidin-l-il) -5- (tert-butilamino) ciclohexil ) acetamida (70 mg, 0. 225 mmol) en isopropanol (3 mL) se agregó 4-cloro-6-( t r i f luo rorne t i 1 ) qu ina z o 1 i na (63 mg, 1.2 eq) y trietilamina (56.9 mg, 2.5 eq) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 h. El solvente se removió bajo presión reducida. El residuo se purificó con HPLC preparativa para proporcionar el compuesto del titulo como su sal bis-TFA (110 mg, 67%) . CL/EM encontrado [M + H]+ = 507.
PREPARACIÓN ALTERNATIVA DEL EJEMPLO 1 Ejemplo 1, 2a Preparación alternativa, Estapa la: A un hidrogenador se le cargaron sal de 4-toluensulfonato de (7R,8S)-8-((S) -1-fenil-etilamino) -1, 4-dioxa-espiro [4.5] decano-7-carboxilato de etilo 1A (1417 g, 2.8 moles, c.f.: O2004098516, preparado análogamente a Pat. E.U.A 6,835,841), etanol (200 proof, 11.4 L) , y 10% Pd/C catalizador (50% de húmedad, 284 g) . La mezcla se hizo inerte con nitrógeno, luego se presurizó con gas de hidrógeno (45 psig (3.163 kg/cm2) ) y agitó vigorosamente a aproximadamente 40°C hasta que el material de partida se consumió (HPLC) . La suspensión se enfrió, purgó con gas de nitrógeno y el catalizador se removió por filtración mientras fue inerte. El catalizador gastado se lavó con etanol (4.3 L) . El filtrado y los lavados se combinaron y concentraron bajo vacío a un volúmen de 2-3 L mientras mantuvieron el lote entre 40°-60°C. El acetato de isopropilo (5 L) se cargó y la mezcla se concentró a un volúmen de ~2 L hasta que más etanol se removió (<0.5%) y contenido de húmedad residual fue <1,000 ppm. El volumen del lote se ajustó a -7.5 L por la adición de acetato de isopropilo. La mezcla se calentó a 80°C hasta que está transparente, luego se enfrió 65°-70°C. Los cristales de semilla de 1 (5 g) se agregaron y el lote se enfrió a 50°C durante 2 horas, luego se enfrió además a 20 °C durante 4 horas y conservando durante ~10 horas. La mezcla espesa resultante se filtró y la torta se lavó con acetato de isopropilo (2 L) . El producto se secó bajo vacio a -35°C hasta que los volátiles se redujeron abajo -1% (LOD) . La sal 4-toluensulfonato de (7R, 8S) -8-amino-l, 4-dioxa-espiro [4.5] decano-7-carboxilato de etilo 1 se obtuvo como un sólido blanco, cristalino (936 g, 83% de rendimiento; HPLC pureza: 99.8%). ^"H-RM : (300MHz, CDC13) 8.14-7.89 (brs, 3H) , 7.75 (d, J 9.0Hz, 2H) , 7.15 (d, J 8.0Hz, 2H) , 4.22-4.04 (m, 2H), 4.01-3.77 (m, 4H) , 3.55-3.43 (m, 1H, ) , 3.20-3.13 (m, 1H) , 2.40-2.27 (m, 4H) , 2.21-1.94 (m, 2H) , 1.81-1.51 (m, 3H) , 1.23 (t, J 7.0Hz, 3H); HPLC: aters Xterra EM C18 4.6 mm x 150 mm i.d., 3.5mm tamaño de partícula, 0.05% NH4OH (5% ACN, 95% H20, solvente A), a 0.05% NH4OH (95% ACN, 5% H20, solvente B) , 5% B a 20% B en 10 minutos, cambiado a 95% B en 25 minutos, y luego cambiado a 5% B en 1 minuto; 11.1 minutos (aminoéster 1).
Ejemplo 1, 2a Preparación alternativa, Etapa Ib: La sal de 4-toluensulfonato de (7R, 8S) -8-amino-l, 4-dioxa-espiro [ 4.5 ] decano-7-carboxilato 1 (450. lg; el producto de la desprotección reductiva de un compuesto conocido - ver R. J. Cherney, O 2004/098516 y G. V. Delucca & S. S. Ko, WO 2004/110993), se combinó con clorohidrato de l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil ) carbo-diimida (236.3g), hidrato de 1-hidroxi benzotriazol (171.9g), N-carbobenciloxi-L-metionina (333. g) y acetonitrilo (3.1 L) . A la mezcla agitada se agregó trietilamina (249.5 g) de bajo de 30°C. Mientras se completó la reacción (HPLC) , la mezcla se diluyó con acetato de etilo (8.2 L) y se lavó con una solución de bicarbonato de potasio acuoso 25% (2x4.5 L) seguido por agua (4.5 L) . La fase orgánica se separó y se concentró bajo presión reducida para obtener una solución de ( 7R, 8S ) -8- ( ( S ) -2-benciloxicarbonilamino-4-metilsulfanil-butirilamino) -1, 4-dioxa-espiro [4.5] decano-7-carboxilato de etilo 2 (1.4 L) . el yoduro de metilo (2.39 kg) se agregó, el recipiente se protegió de la luz y la mezcla se mantuvo bajo agitación lenta durante aproximadamente 24 h. Al precipitado amarillo espeso se agregó éter de metil tert-butilo (2.7 L) y la mezcla se mantuvo durante aproximadamente 1 h. El producto se aisló por filtración y la torta se lavó con éter de metil tert-butilo (2x1.4 L) , luego se secó bajo vacio, proporcionando yoduro de [ (S) -3-benciloxi-carbonilamino-3- ( (7R, 8S) -7-etoxicarbonil-l , 4-dioxa-espiro [4.5] dec-8-ilcarbamoil ) -propil] -dimetilsulfonio 3 (671.4 g, -94% de rendimiento) como un sólido blanco opaco (HPLC pureza 99.9%) .
Ejemplo 1, 2a Preparación alternativa, Etapa 2: La sal de sulfonio 3 (619.4 g) , y carbonato de cesio (416.8 g) y sulfóxido de dimetilo anhidro (6.2 L) se combinaron en un reactor equipado con un limpiador para neutralizar los sulfuros volátiles. La agitación vigorosa se mantuvo hasta que la conversión completa se obtuvo (HPLC) . Acetato de etilo (12.4 L) se agregó, seguido por 20 % salmuera (3 L) . La fase orgánica se separó, se lavó dos veces con salmuera (2x3 L) y se evaporó para obtener a una solución de (7R, 8S) -8- ( (S) -3-benciloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidin-l-il ) -1, 4-dioxa-espiro [4.5] decano-7-carboxilato de etilo 4 en acetato de etilo (-0.8 L) . Acetona (2.55 L) se agregó, seguido por una solución de ácido clorhídrico acuoso 0.5 M (2.3 L) . Con buen mezclado, la solución se calentó hasta 50 hasta 60°C hasta que la conversión de 4 a (IR, 2S) -2- ( (S) -3-benciloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidin-l-il ) -5-oxo-ciclohexanocarboxilato de etilo 5 se completó (HPLC) . La mezcla se concentró bajo presión reducida de bajo de 40°C, se enfrió a -30 °C, y agua (4.1 L) se agregó. La mezcla espesa resultante se enfrió de 5 hasta 10°C y se agitó durante ~1 hora. El producto se filtró y la torta se lavó con agua (2x2.5 L) . Durante la deslicorización, la torta se secó hasta un peso constante de bajo de 40°C en un horno al vacio. La ciclohexanona 5 (272g, 70% de rendimiento) se obtuvo (HPLC pureza 98.7%).
Ejemplo 1, 2a Preparación alternativa, Etapa ciclohexanona 5 (lOOg) se suspendió en THF (500 mL) y se enfrió a 0°C. 1N NaOH (271g) se agregó a 0-5°C y la mezcla bifásica se agitó a < 5 °C durante al menos una hora. El TBE (500 mL) se agregó y las capas se separaron. La capa acuosa del fondo se lavó nuevamente con MTBE (500 mL) y las capas se separaron. Diclorometano (500 mL) se cargó al producto-capa acuosa rica, y la mezcla se enfrió a 0°C. 3N HC1 (156 g) se cargó mantenido < 5 °C. Después de agitarse durante al menos 10 min, la mezcla se calentó a 20-25°C, y las capas se separaron. La capa acuosa se extrajo con diclorometano (100 mL) . Las capas orgánicas se combinaron y el solvente se cambió en tolueno por medio de la destilación. El volumen de la solución de tolueno se ajustó hasta aproximadamente 1L, y monohidrato de ácido p-toluensulfónico (0.24 g) se agregó. Etilen glicol (16.22 g) se agregó, y la mezcla se destiló a presión atmosférica hasta que la formación del compuesto 7 se completó y el volumen superior fue aproximadamente de 500-700 mL. La solución se enfrió a aproximadamente 70°C, y acetato de etilo (500 mL) se agregó mantenido aproximadamente 70°C. La mezcla se enfrió y se filtró para dar 73 g (70 % de rendimiento) del compuesto 7, ácido (7R, 8S) -8- ( (3S) -3- ( ( (benciloxi) carbonil) amino) -2-oxo-l-pirrolidinil) -1, 4-dioxaespiro [4.5] decano-7-carboxilico .
Ejemplo 1, 2a Preparación alternativa, Etapa 4: A una mezcla espesa del compuesto 7 (147 g) en tolueno seco (370 mL) se cargó trietilamina (32.7 g) a 15-25°C. Después de que la mezcla espesa se volvió una solución después de 10-15 minutos de agitación a 25°C, el matraz se enfrió a -10°C y cloroformiato de isobutilo (44. lg) se cargó a -10o- 0°C. La mezcla se agitó a -10o- 0°C durante alrededor de 30 min. A una solución de azida de sodio (42 g) y bromuro de tetrabutilamonio (5.2 g) en agua (130 mL) se agregó a -10o-0°C. La mezcla espesa bifásica se agitó vigorosamente durante al menos una hora y tolueno (1750 mL) seguido por agua (300 mL) se agregaron. Las dos fases se agitaron durante al menos 10 minutos y la capa orgánica superior se separó y se secó con tamiz molecular 4Á. El anhídrido acético (76 mL) y ácido acético (28 mL) se agregaron y la solución se calentó hasta 80-90°C durante 1-4 horas, hasta que <2 AP del intermediario 9 se detectó por HPLC. El solvente se destiló completamente parcialmente hasta aproximadamente dos tercios del volumen inicial bajo una presión atmosférica, la solución se enfrió a temperatura ambiente y la mezcla espesa resultante se agitó durante 16 horas. Heptano (350 mL) se agregó lentamente y la mezcla espesa se agitó durante lh. Los sólidos se filtraron, se lavaron con tolueno/heptano 4:1 (300 mL) , y se secaron para dar 109 g (78% de rendimiento) del compuesto 10, ((3S)-1- ( (7R, 8S) -7-acetamido-l, 4-dioxaespiro [4.5] dec-8-il) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo. 11 Ejemplo 1, 2a Preparación alternativa, Etapa 5: A una solución del compuesto 10 (109 g) en acetona (760 mL) se cargó 1N HC1 (760 mL) . La mezcla se calentó hasta 50°C durante 2.5 horas. La acetona se destiló completamente bajo presión reducida y el producto se extrajo con diclorometano dos veces l x l L y l x 0.5 L. Las capas de diclorometano se combinaron y diclorometano se cambió en acetato de etilo por destilación hasta que los p.b. en el recipiente alcanzo 78°C y el volumen final fue de aproximadamente 10 mL/g compuesto 10 consumo. La mezcla espesa de acetato de etilo se enfrió a temperatura ambiente, se agitó durante 16 hrs y los sólidos se filtraron y se lavaron con acetato de etilo (400 mL) . El sólido se secó para dar 84 g (87% de rendimiento) del compuesto 11, ((3S)-1-( ( 1S, 2R) -2-acetamido-4-oxociclohexil) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo.
Ejemplo 1, 2a Preparación alternativa, Etapa 6: el reactivo TiCl2(OPri)2 se pre-formó por agregar Ti(OiPr)4 (11.5 mL) a una solución de 1M TiCl4 en diclorometano (39 mL) a 5-10°C y subsecuentemente se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. El compuesto 11 (25 g) se disolvió en diclorometano (500 mL) y t-butilamina (34 mL) se agregó a temperatura ambiente. Después de 10 minutos la solución se enfrió a -25 hasta -20°C y la solución del reactivo de titanio preformada se agregó a una temperatura de bajo de -20°C. La mezcla se permitió calentar a temperatura ambiente y esto se agitó durante lh. Una muestra se tomó para confirmar que la formación de imina se completó por minoapagarse con borohidruro de sodio en metanol (la ausencia de alcoholes indicando la consumación completa de la cetona de partida 11) . El sulfuro de dimetil borano (7.0 mL) luego se agregó a 0-5°C y la mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante al menos 5 horas. Diclorometano se evaporó parcialemnte (alrededor de la mitad) bajo presión reducida y acetato de etilo húmedo (300 mL, se preformó por agitación de acetato de etilo con agua) se agregó dentro de 30-60 min. La mezcla espesa resultante se agitó durante al menos 4 h, los sólidos se filtraron y se lavaron varias veces con diclorometano hasta que no más de 5 M % del producto se retiene en la torta. El filtrado y lavados se combinaron, 1N HC1 (200. mL) se agregó y la mezcla bifásica se agitó durante al menos 30 min (la evolución de gas ceso después de -20 min) . El producto de capa acuosa rica (fase superior) se separó y diclorometano (500 mL) se agregó. Hidróxido de amonio concentrado se agregó a la mezcla bifásica agitada hasta que el pH se ajustó hasta 8-8.5 (~15 mL) . La fase orgánica se separó y se lavó 2 x 100 mL con 14 % en peso cloruro de amonio, para remover el trans isómero no deseado del compuesto 12, y finalmente con agua (25 mL) . Diclorometano se cambió en acetato de etilo por destilación bajo presión normal hasta que los p.b. en el recipiente alcanzo 78°C y el volumen final fue de aproximadamente 5 mL/g compuesto 11 consumo (~140 mL) . La solución se enfrió a temperatura ambiente. Heptano (250 mL) se agregó lentamente a 40-50°C y compuesto 12 inicio la cristalización. La mezcla espesa se agitó a temperatura ambiente durante 3 hrs y los sólidos se filtraron, se lavaron con heptano (100 mL) y se secaron para dar 20.1 g (70 % de rendimiento) del compuesto 12, ( ( 3S ) -1- ( ( 1S, 2R, 4R) -2-acetamido-4- ( tert-butilamino) ciclohexil) -2-oxo-3-pirrolidinil) carbamato de bencilo, como cristales esponjosos blancos .
NHAc vNHAc Pd/C MeOH ÑH ÑH 12 13 Ejemplo 1, 2a Preparación alternativa, Etapa 7: El compuesto 12 (20 g) se disolvió en metanol (400 mL) y 5 % Catalizador Pd/C (1.8 g, 9 % en peso) se agregó. La mezcla se hidrogeno a 25°C y 25 psig (1.7575 kg/cm2) durante 3h. El catalizador se removió por filtración, y el metanol se cambió en acetato de etilo por destilación continua. El producto se cristalizo a partir de acetato de etilo (160 mL) durante el enfriamiento. Heptano (160 mL) se agregó a 25°C, la mezcla espesa se agitó durante lh y el producto se filtró, se lavó con heptano y se secó para dar 12.8 g (94 % de •rendimiento) del compuesto 13, N- ( ( 1 R , 2 S , 5R ) -2 - ( ( 3 S ) -3-amino-2-oxo-l-pirrolidinil) -5- (tert-butilamino) ciclohexil) acetamida.
Ejemplo 1, 2a Preparación alternativa, Etapa 8: 6- (trifluorometil) -4-quinazolinol, 14 (5 g; ver P. H. Cárter, et al. PCT application WO 2005/021500) se suspendió en diclorometano (100 mL) . N, N-diisopropiletilamina (4.2 mL, 1.05 eq) y DMF (0.4 mL, 0.2 eq) se agregaron. Cloruro de oxalilo (3.0 mL, 1.5 eq) luego se agregó a la mezcla espesa agitada a 20-25°C bajo enfriamiento (adición exotérmica) . La mezcla espesa anaranjada se agitó a 30-35°C durante 2h. La evolución de gas estudiada se observó durante -1.5 hrs en cuyo punto la mezcla espesa se volvió una solución anaranjada. Después de enfriarse a 20°C, la solución de reacción se agregó gota a gota hasta 20% en peso K2HP04 acuoso (50 mL) bajo agitación vigorosa y evolución de gas. La fase orgánica inferior se separó y se lavó un tiempo más con 20 % en peso K2HP04 acuoso (50 mL) . La solución orgánica se usó como es durante la siguiente etapa dentro de 16h.
Ejemplo 1, 2a Preparación alternativa, Etapa 8: A una solución de 15 en diclorometano (22 mL, 5.5 mmol), sólido 13 (1.55 g, 5 mmol) se agregó y la mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta que los sólidos se disolvieron. Trietilamina (1.4 mL, 11 mmol) se agregó y la mezcla se agitó durante 24 hrs a temperatura ambiente. Agua (10 mL) se agregó, las dos fases se agitaron durante 10 minutos y la fase orgánica se separó. El diclorometano se cambió en acetato de etilo por destilación continua hasta que los p.b. en el recipiente alcanzo 78°C y el volumen final fue de aproximadamente 10 mL/g compuesto 13 consumo (~15 mL) . La mezcla espesa se enfrió a temperatura ambiente, heptano (15 mL) se agregó lentamente y la mezcla espesa se agitó durante 16 h. Los sólidos se filtraron, se lavaron con heptano/acetato de etilo 1:1 (5 mL) y se secaron para dar 1.83 g (72 % de rendimiento) de cristales beige (forma N-2 por XRD) de N- ( ( IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6- (trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il ) ciclohexil) acetamida, Ejemplo 1. EJEMPLO 2 Formas de Cristal de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- ( tert-butilamino) -2- ( ( S ) -2-OXO-3- ( 6- (trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida Diversas formas de cristal de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-0X0-3- (6- (trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il ) ciclohexil ) acetamida, incluyendo la base libre se prepararon y caracterizaron como se describe abaj o . PROCEDIMIENTOS PARA CARACTERIZAR LAS FORMAS Datos de Cristal Sencillo Los datos se colectaron en un difractómetro de serie Bruker-Nonius (BRUKER AXS, Inc., 5465 East Cheryl Parkway Madison, WI 53711 USA) CAD4. Los parámetros celulares unitarios se obtuvieron a través de análisis de mínimos cuadrados de los ajustes de difractómetro experimental de 25 reflecciones de ángulo alto. Las intensidades se midieron usando radiación Cu Ka (? = 1.5418 Á) a una temperatura constante con la técnica de barrido variable T-2T y se colectaron solamente por factores de polarización Lorentz. Las cuentas de respaldo se colectaron en los extremos de lo barrido por la mitad del tiempo de lo barrido.
Alternativamente, los datos de cristal sencillo se colectaron en un sistema Bruker-Nonius Kappa CCD 2000 usando radiación Cu Ka (? = 1.5418 Á) . El índice y procesamiento de los datos de intensidad medidos se llevaron a cabo con el paquete de software HKL2000 (Otwinowski, Z. & Minor, W. (1997) en Macromolecular Crystallography, eds . Cárter, W.C. Jr & Sweet, R.M. (Academic, NY) , Vol . 276, pp. 307-326) en el conjunto de programa de colección. (Collect Data collection and processing user interface: Collect: Data collection software, R. Hooft, Nonius B.V., 1998.). Alternativamente, los datos de cristal sencillo se colectaron en un sistema Bruker-AXS APEX2 CCD usando radiación Cu ?a (? = 1.5418 Á) . El índice y procesamiento de los datos de intensidad medidos se llevaron a cabo con el conjunto paquete/programa de software APEX2 (APEX2 Data collection and processing user interface: APEX2 User Manual, vi.27; BRUKER AXS, Inc., 5465 East Cheryl Parkway Madison, WI 53711 USA) . Cuando se indica, los cristales se enfriaron en la corriente fría de un sistema Oxford cryo (Oxford Cryosystems Cryostream cooler: J. Cosier and A.M. Glazer, J. Appl. Cryst., 1986, 19, 105) durante la colección de datos. Las estructuras se solucionan por métodos directos y se refinan con base en las reflexiones observadas usando ya sea el paquete de software SDP (SDP, siglas en inglés de Paquete de Determinación de Estructura, Enraf . onius , Bohemia NY 11716. Factores de dispersión, incluyendo f y f' ' , en el softaware SDP se toman de las "International Tables for Crystallography", Kynoch Press, Bromingham, Inglaterra, 1974; Vol IV, Tablas 2.2A y 2.3.1) con modificaciones locales menores o el paquete cristalográfico, MAXUS (conjunto de software de solución y refinamiento maXus : S. Mackay, C.J. Gilmore, C. Edwards, M. Tremayne, N. Stewart, K. Shankland. MaXus : un programa de computadora para la solución y refinamiento de estructuras de cristal de datos de difracción o SHELXTL4. Los parámetros atómicos derivados (coordenadas y factores de temperatura) se refinan a través de la matriz completa por mínimos cuadrados. La función minimizada en los refinamientos fue ?w ( | F0 | - | Fc | ) 2. R se define como ? 0| mientras que R„ = [?„ ( F0 | - | Fc | ) 2 Fo | 2] 1/ donde w es una función de peso apropiada basada en errores en las intensidades observadas. Se examinan los mapas de diferencias en todas las etapas de refinamiento. Se introducen los hidrógenos en posiciones idealizadas con factores de temperatura isotrópicos, pero los parámetros de hidrógeno no varían. Datos de Difracción de polvo de rayos X (PXRD) Los datos PXRD se obtuvieron usando un Bruker C2 GADDS . La radiación fue Cu Ka (40 KV, 50mA) . La distancia del detector muestra fue 15 cm. Las muestras de polvo se colocaron en capilares de vidrio sellado de lmm o menos en diámetro; la capilaridad se giró durante la colección de datos. Los datos se colectaron por 3=2T=35° con un tiempo de la exposición de la muestra de al menos 2000 segundos. Los arcos de difracción de dos dimensiones resultantes se integraron para crear un patrón PXRD de 1 dimensión tradicional con un tamaño de etapa de 0.02 grados 2T en el intervalo de 3 hasta 35 grados 2T. Calorimetría de barrido diferencial (DSC) Los experimentos DSC se realizaron en un TA Instruments™ modelo Q1000 o 2920. La muestra (alrededor de 2-6 mg) se pesó en una plancha de aluminio y se registra exactamente hasta una centésima de un miligramo, y se transfiere al DSC. El instrumento se purgó con gas de nitrógeno a 50 mL/min. Los datos se colectaron entre temperatura ambiente y 300°C a relación de calentamiento 10°C/min. El diagrama se hizó con los picos endotérmicos que apuntan hacia abajo. Análisis Termo Gravimétrico (TGA) Los experimentos TGA se realizaron en un TA Instruments™ modelo Q500 o 2950. La muestra (alrededor de 10-30 mg) se colocó en una plancha de platino previamente tarada. El peso de la muestra se midió exactamente y se registró a una milésima de un miligramo por el instrumento. El horno se purgó con gas de nitrógeno a 100 mL/min. Los datos se colectaron entre temperatura ambiente y 300 °C a relación de calentamiento 10°C/min.
PREPARACIÓN Y ANALISIS DE LAS FORMAS Los datos celulares unitarios y otras propiedades para estos ejemplos se presentan en la Tabla 1. Los parámetros celulares unitarios se obtuvieron de análisis cristalográfico de rayos X de cristal sencillo. Una cuenta detallada de células unitarias se puede encontrar en el Capitulo 3 de Stout & Jensen, X-Ray Structure Determination : a Practical Guide, (MacMillian, 1968) . Las coordenadas atómicas fraccionarias para los Ejemplos 2a, b, c, d, e, f, g, y h, y las condiciones las cuales se miden se presentan en las Tablas 2-9. Adicionalmente, las posiciones de pico de difracción de rayos X en polvo característico (grados 2T±0.1)@ TA para los Ejemplos 2a, b, c, d, e y f, se presentan en la Tabla 10, todos los cuales se basan en los patrones de alta calidad colectados con un difractómetro (CUKOÍ) con una capilaridad de barrido con 2T calibrado con un NIST u otro estándar adecuado . Finalmente, las Figuras 1-6 presentan patrones XRPD para los Ejemplos 2a, b, c, d, e y f, figuras 8, 10, 13, 15, 17 y 19 se describe en TGA de los ejemplos 2a, b, c, d, e y f, respectivamente. Las figuras 7, 9, 12, 14, 16 y 18 describe el DSC de los ejemplos 2a, b, c, d, e y f, respectivamente. La figura 11 describe la isotermía de sorpción de vapor del Ejemplo 2b.
Forma de Preparación, Caracterización DSC y TGA Ejemplo 2a, Forma HO.5-4: 150 mg de N- ( ( IR, 2S, 5R) -5-(tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- ( 6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, base libre se disolvió en acetato de n-butilo saturado caliente con agua. Heptano se agregó hasta que se observa una turbiedad persistente. La mezcla espesa se permitió enfriar a temperatura ambiente. La Forma HO.5-4 se caracterizó por 0.5 mol agua por mol N- ( ( IR, 2S, 5R) -5- ( tert-butilamino ) -2- ( ( S ) -2-oxo-3- ( 6- (trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, base libre. La Forma HO.5-4 se caracterizó por un termograma DSC que tiene un inicio endotérmico amplio típicamente en el intervalo de entre temperatura ambiente ca . y 67 °C ca . en el convenio en la curva TGA; a temperaturas más altas en otros eventos pueden ocurrir. La Forma HO.5-4 se caracterizó por una curva termal TGA que tiene típicamente menos peso desde 0.6% hasta alrededor de 1.4% hasta 100°C ca . La perdida de peso teoretical para la forma HO.5-4 es 1.7%, sin embargo, esto no es usual para hidratos inestables para llevar a ser parcialmente deshidratado durante el secado. Ejemplo 2b, Forma N-2: 1 g de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6- ( trifluorometil ) quinazolin-4 -ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, base libre se disolvió en 10 mL de agua-libre EtOAc a 77°C. La solución se enfrió a 70°C. 10 mg de las semillas de N-2 se agregaron. A la mezcla espesa, 18 mL de n-heptano se agregó durante 1 hora con una bomba de jeringa. La mezcla espesa se enfrió de 70°C hasta 20°C durante 1 hora, y se agitó a 20°C durante la noche. El sólido se aisló por filtración, se lavó con 3 mL de n-heptano, se secó a 50°C en un horno al vacio durante la noche. La Forma N-2 es N- ( (lR,2S,5R)-5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- ( 6- ( trifluorometil ) quinazolin- -ilamino) irrolidin-1-il) ciclohexil) acetamida, base libre, una forma pura (dentro de las moléculas de agua o solvente) . La Forma N-2 se caracterizó por un termograma DSC que tiene un inicio endotérmico típicamente entre ca. 230°C y ca . 232°C como un punto sencillo sin otras transformacions . La Forma N-2 se caracterizó por una curva TGA que tiene perdida de peso insignificante hasta 200°C ca . y de acuerdo con la estructura de cristal sencilla. Ejemplo 2c, Forma Hl.75-5: Una mezcla espesa de 50 mg de N- ( (IR, 2S, 5R) -5- ( tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6- (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il) ciclohexil) acetamida, base libre se agitó vigorosamente en 1 mL agua durante más de 16 horas. La Forma Hl.75-5 se caracterizó por 1.75 moles de agua por un mol de N- ( (1R,2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6- ( trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il) ciclohexil) acetamida, base libre. La Forma Hl.75-5 se caracterizó por un termograma DSC que tiene un inicio edotermico típicamente entre temperatura ambiente ca. y 70°C ca . de acuerdo con la curva TGA; a temperaturas más altas en otros eventos pueden ocurrir. La Forma Hl.75-5 se caracterizó por una curva TGA que tiene una pérdida de peso de 4.3% ca. hasta 5.3% ca. a temperaturas de hasta 100°C ca.. La perdida de peso teórica es 5.9% ca., sin embargo, esto no es usual para hidratos inestables para llevar a ser parcialmente deshidratado durante el secado. Ejemplo 2d, HAC-1: 100 mg de N- ( ( IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- ( 6- (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, base libre se disolvió en 0.1 mL de HOAc a 80°C. A esto, 0.2 mL de t-BuOAc se agregó y la solución se enfrió a 20°C. La solución se evaporó hasta secarse. El sólido resultante se agitó en heptano a 50°C durante 15 horas, seguido por enfriamiento a 20°C. HAC-1 se filtró y se secó a 25°C bajo vacío durante la noche. La Forma HAC-1 se caracterizó por 1 mol de ácido acético por un mol de N- ( ( IR, 2S, 5R) -5- ( tert-butilamino) -2-( ( S ) -2-OXO-3- ( 6- (trifluorometil ) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, base libre. La Forma HAC-1 se caracterizó por un termograma DSC que tiene un inicio endotérmico típicamente a 100°C ca. en el convenio en la curva TGA; a temperaturas más altas en otros eventos pueden ocurrir. La Forma HAC-1 también se caracterizó por una curva TGA que tiene ca . 15.3% perdida de peso de hasta 200°C ca . La pérdida de peso teorética es 10.5% ca. , sin embargo esto no es usual durante cantidades menores de solvente de punto de ebullición altos para asociar los restos con el sólido. En casos similares a estos, PXRD se diagnóstica de la forma, pero no es sensible a pequeñas cantidades de solvente adventicio. Ejemplo 2e, Forma E-l: 50 mg de N- ( ( IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6- (trif luorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-i 1 ) c i el ohex i 1 ) a ce t amida , base libre se disolvió en <lmL de etanol hervido. La solución se enfrió a temperatura ambiente y se permitió evaporar lentamente. La Forma E-l se caracterizó por 1 mole de etanol por un mole de N- ( ( 1 R , 2 S , 5 R ) - 5 - ( t er t -butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- ( 6 -(trif luorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, base libre. La Forma E-l se caracterizó por un termograma DSC que tiene un inicio endotérmico típicamente a 100 °C ca . en el convenio en la curva TGAs; a temperaturas más altas en otros eventos pueden ocurrir. La Forma E-l se caracterizó por una curva termal TGA que tiene una pérdida de peso de 7.1% ca . hasta 7.6% ca . hasta 150°C ca . La pérdida de peso teorética es 8.3% ca . , sin embargo, esto no es inusual para solvatos inestables para llegar a ser parcialmente desolvatados durante el secado.
Ejemplo 2f, RPG-3: 30 hasta 40 mg de N- ( ( IR, 2S , 5R) -5-( tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, base libre se disolvió en 2 mL de propilen glicol racémico. El agua se agregó hasta una nube se observó. El solvente se permitió evaporar lentamente hasta secarse. La Forma RPG-3 se caracterizó por 1 molécula de R-propilen glicol por una molécule de N- (( IR, 2S , 5R) -5- ( tert-butilamino) -2- ( (S) -2-???-3- (6- (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, base libre. La Forma RPG-3 se caracterizó por un termograma DSC que tiene un inicio endotérmico a 70 °C ca . en el convenio en la curva TGA, a temperatura altas otros eventos pueden resultar. La Forma RPG-3 se caracterizó por una curva TGA que tiene una pérdida de peso de 16.4% ca . hasta 110°C ca . La pérdida de peso teorética es ca. 13.1%, sin embargo esto no es usual durante cantidades menores de solventes de punto de ebullición alto para asociar los restos con el sólido. En casos similares a estos, PXRD es un diagnóstico de la forma pero no es sensitiva a cantidades pequeñas del solvente adventicio. Ejemplo 2g, Forma IPA-1: 40 mg de N- (( IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-OXO-3- (6 - (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, base libre se hicieron mezcla espesa en <lmL de alcohol de isopropilo. La mezcla espesa se calentó suavemente para disolver el sólido restante. La solución se enfrió a temperatura ambiente y se permitió evaporar lentamente hasta que los cristales se observaron. La Forma IPA-1 se caracterizó por 1 mole de alcohol de isopropilo por un mole de N- ( ( IR, 2S, 5R) -5- ( tert-butilamino) -2-( (S) -2-OXO-3- (6- (trifluorometil) quinazolin-4-ilamino) pirrolidin-l-il) ciclohexil) acetamida, base libre. TABLA 1 Parámetros de célula unitaria TABLA 1 (continuación) Parámetros de celda unitaria Las variables usadas en la tabla 1 se definieron a continuación: T = temperatura en centígrados para los datos cristaligráficos (T.A. es temperatura ambiente la cual es alrededor de +22°C) V = volumen de la celda unitaria Z' = número de moléculas de fármaco por unidad asimétrica Vm = V(celda unitaria )/ (Moléculas de fármaco Z por célula) sg = grupo de espacio dcalc = densidad de cristal calculada TABLA 2 Coordenadas atómicas para el ejemplo 2a, Forma HO.5-4 Átomo X Y Z Atomo X Y Z Fl 0.1718 0.5612 0.2388 F138 0.9730 0.9700 0.6210 F2 0.1576 0.4167 0.1518 F139 1.0220 0.7300 0.6430 F3 0.1277 0.6827 0.1463 F140 0.9470 0.7710 0.5532 N7 0.3729 0.0177 -0.0187 0137 0.5289 1.1320 0.2702 N9 0.3967 0.3613 0.0716 H10 0.3464 0.3422 0.0601 Nll 0.5034 0.5324 0.1275 H16 0.1889 -0.1347 -0.0192 N12 0.1513 -0.3723 -0.0803 H85 0.2780 0.4332 0.1193 N15 0.2070 -0.0340 -0.0258 H88 0.4895 0.3182 0.0357 NI8 0.4944 0.7660 0.2016 H90 0.2688 -0.4938 -0.1162 023 0.3677 0.2704 -0.0786 H91 0.2791 -0.3427 -0.1635 025 0.2371 0.2420 0.0154 H93 0.2277 0.1128 -0.0967 C82 0.2630 0.6176 0.1822 H95 0.3290 -0.0521 -0.1140 C83 0.4281 0.4888 0.1165 H99 0.3760 -0.3135 -0.0574 C84 0.3027 0.5269 0.1466 H100 0.3100 -0.3067 -0.0228 C86 0.3810 0.5754 0.1513 H102 0.5234 0.0450 0.0773 C8 0.4447 0.2515 0.0409 H103 0.4804 0.1033 0.1290 C89 0.2647 -0.3681 -0.1237 H105 0.1184 -0.0766 -0.1500 C92 0.2304 -0.0122 -0.0852 H106 0.1831 -0.0821 -0.1859 C94 0.3163 -0.0776 -0.0729 H110 0.3980 0.9063 0.2542 C96 0.4172 0.7161 0.1933 H112 0.4292 -0.1628 0.0516 C97 0.1821 0.5681 0.1800 H113 0.3692 -0.0449 0.0742 C98 0.3221 -0.2755 -0.0632 H115 0.2715 0.8230 0.2452 C101 0.4735 0.0847 0.0816 H117 0.0540 -0.3914 -0.0071 C104 0.1724 -0.1130 -0.1448 H118 0.1047 -0.5613 -0.0042 C107 0.3915 0.1858 -0.0261 H119 0.0122 -0.5664 -0.0392 C108 0.2116 0.0919 0.0195 H121 0.0157 -0.2070 -0.1065 C109 0.3748 0.8103 0.2276 H122 -0.0438 -0.3568 -0.1418 Clll 0.4081 -0.0451 0.0507 H123 0.0156 -0.2818 -0.1762 C114 0.2994 0.7605 0.2220 H126 0.1446 -0.3645 -0.1779 C116 0.0592 -0.4960 -0.0309 H128 0.5835 0.7006 0.1755 C120 0.0087 -0.3106 -0.1338 H130 0.2266 0.0448 0.1189 C124 0.0696 -0.4465 -0.0977 H131 0.1603 -0.0732 0.0701 C125 0.1783 -0.3101 -0.1359 H132 0.1430 0.1249 0.0800 C127 0.5309 0.6696 0.1690 H134 0.0091 -0.6633 -0.1497 C129 0.1827 0.0426 0.0774 H135 0.1005 -0.6984 -0.1175 C133 0.0611 -0.6143 -0.1412 H136 0.0686 -0.5851 -0.1833 F4 0.9541 0.9380 0.5714 H141 0.1830 -0.4440 -0.0580 F5 0.9826 0.6800 0.5759 H14 0.6945 1.0312 0.5339 F6 1.0259 0.8300 0.6655 H21 0.7741 1.5073 0.4379 N8 0.6040 1.3694 0.4758 H28 0.7049 1.4602 0.3064 N13 0.6631 1.0203 0.5573 H29 0.6130 1.4814 0.2902 NI 7 0.7581 1.7462 0.3780 H32 0.5464 1.0615 0.5430 NI 9 0.6266 0.8793 0.6383 H34 0.6724 1.6789 0.4661 N20 0.7501 1.4082 0.4350 H35 0.5807 1.7062 0.4509 N22 0.7080 0.6517 0.7080 H38 0.8152 0.9372 0.5749 024 0.7581 1.1336 0.4774 H41 0.5545 1.4575 0.3823 026 0.5442 1.1244 0.4164 H44 0.5540 1.3350 0.5873 C27 0.6643 1.5023 0.3242 H45 0.6406 1.2709 0.6290 C30 0.6817 0.9034 0.6081 H48 0.6272 1.8887 0.3818 C31 0.5921 1.1293 0.5402 H49 0.5627 1.7587 0.3377 C33 0.6205 1.6624 0.4324 H52 0.6566 1.2721 0.3752 C36 0.5758 1.2019 0.4701 H55 0.6234 1.5433 0.5534 C37 0.8201 0.8496 0.6069 H56 0.6965 1.4170 0.5619 C39 0.7568 0.8126 0.6288 H58 0.8887 1.9136 0.4290 C40 0.6067 1.4694 0.4172 H59 0.9292 1.8759 0.3743 C42 0.8902 0.7591 0.6317 H60 0.9085 1.7203 0.4146 C43 0.6042 1.2934 0.5840 H62 0.6632 1.7578 0.2922 C46 0.7651 0.6822 0.6794 H64 0.8824 1.3038 0.5620 C 7 0.6162 1.7663 0.3697 H65 0.8870 1.4370 0.5064 C50 0.8099 1.8166 0.3410 H66 0.9097 1.2396 0.5019 C51 0.6689 1.3952 0.3877 H69 0.7263 1.9822 0.2803 C53 0.7895 1.2775 0.4740 H70 0.8132 2.0339 0.2846 C54 0.6389 1.4243 0.5469 H71 0.7823 2.0761 0.3450 C57 0.8917 1.8331 0.3947 H73 0.8374 1.5813 0.3078 C61 0.6751 1.6998 0.3362 H74 0.8486 1.7393 0.2638 C63 0.8750 1.3182 0.5148 H75 0.7629 1.6701 0.2558 C67 0.9615 0.8066 0.6143 H77 0.8443 0.5011 0.7349 C68 0.7802 1.9934 0.3099 H79 0.9456 0.5638 0.6960 C72 0.8152 1.6904 0.2872 H81 0.6060 0.7320 0.7067 C76 0.8381 0.5893 0.7029 H142 0.7500 1.8390 0.4090 C78 0.8982 0.6264 0.6799 H143 0.5333 1.1298 0.3123 C80 0.6445 0.7516 0.6862 H144 0.5194 1.0278 0.2538 TABLA 3 Coordenadas atómicas Dará el eiemolo 2b. Base Forma N-2 Átomo X Y Z Átomo X Y Z NI 0.7824 1.3195 0.3238 C71 0.9289 1.4591 0.5167 N2 0.1685 0.3056 -0.0178 H72 0.9378 1.4237 0.5668 H3 0.1633 0.1989 -0.0196 H73 0.9764 1.4359 0.5102 N4 0.6223 0.8215 0.1887 C74 0.8719 1.7574 0.6080 N5 0.2627 0.4840 -0.0849 C75 0.6719 1.2862 0.4846 N6 0.6868 0.9765 0.2943 H76 0.6246 1.2933 0.4390 H7 0.7030 0.9877 0.3420 H77 0.6814 1.3914 0.5103 N8 0.4185 0.9718 0.0742 H78 0.6660 1.2009 0.5162 N9 0.0989 0.0258 -0.1003 C79 0.9173 1.6199 0.6639 N10 0.7913 1.3680 0.4754 H80 0.8851 1.5217 0.6541 Hll 0.7826 1.4618 0.4918 H81 0.9305 1.6578 0.7142 N12 0.5331 0.6005 0.1813 H82 0.9647 1.5943 0.6584 N13 0.3353 0.7474 0.0475 C83 0.9176 1.9198 0.6225 H14 0.3028 0.6896 0.0583 H84 0.9680 1.8999 0.6220 N15 0.8501 1.6946 0.5311 H85 0.9252 1.9631 0.6707 NI6 0.4567 1.1267 0.1887 H86 0.8887 1.9992 0.5842 017 0.7470 1.1042 0.4435 C87 0.7960 1.7901 0.6131 018 0.2114 0.7470 -0.1165 H88 0.7660 1.8705 0.5758 019 0.2229 0.5239 0.0583 H89 0.8064 1.8325 0.6620 020 0.8588 1.0890 0.3360 H90 0.7667 1.6881 0.6048 F21 0.5881 0.9034 0.4961 C91 0.2069 0.3753 0.0494 F22 0.4828 0.7754 0.4659 C92 0.1886 0.3981 -0.1294 F23 0.5874 0.6500 0.5199 H93 0.1617 0.4641 -0.1751 C24 0.1049 -0.1653 -0.0049 C94 0.1345 0.3960 -0.0889 H25 0.1473 -0.2167 -0.0125 H95 0.1249 0.5115 -0.0787 H26 0.0773 -0.2487 0.0097 C96 0.3636 0.8982 0.1612 H27 0.1257 -0.0826 0.0338 C97 0.0560 0.3169 -0.1396 C28 0.0052 -0.2107 -0.1371 H98 0.0300 0.3865 -0.1836 H29 -0.0334 -0.1565 -0.1806 H99 0.0226 0.3123 -0.1131 H30 -0.0204 -0.2889 -0.1178 C100 0.0655 0.1409 -0.1647 H31 0.0423 -0.2685 -0.1506 H101 0.0138 0.0994 -0.1999 C32 -0.0102 0.0236 -0.0618 C102 0.2651 0.6526 -0.0801 H33 0.0176 0.1111 -0.0276 C103 0.3727 0.8727 0.0930 H34 -0.0371 -0.0447 -0.0399 C104 0.3129 0.8065 0.1831 H35 -0.0478 0.0713 -0.1077 H105 0.2826 0.7213 0.1525 C36 0.6347 0.8573 0.2590 C106 0.4090 1.0275 0.2081 C37 0.7956 1.1614 0.3094 C107 0.1998 0.2249 -0.1544 C38 0.5429 0.6399 0.2526 H108 0.2268 0.1548 -0.1108 C39 0.5969 0.8058 0.3661 H109 0.2321 0.2314 -0.1820 H40 0.6303 0.8901 0.3943 C110 0.0479 -0.0823 -0.0781 C41 0.5928 0.7673 0.2949 Clll 0.3943 0.5437 -0.0102 C42 0.7174 1.0886 0.2543 H112 0.4319 0.5306 0.0416 H43 0.7243 1.0288 0.2140 H113 0.4226 0.5469 -0.0417 C44 0.8437 1.4188 0.3806 C114 0.1202 0.1477 -0.2041 H45 0.8919 1.4020 0.3733 H115 0.0955 0.2128 -0.2496 C46 0.8266 1.6034 0.3730 H116 0.1283 0.0355 -0.2179 H47 0.7791 1.6255 0.3797 C117 0.3076 0.8411 0.2485 H48 0.8177 1.6396 0.3230 C118 0.2292 0.2619 0.1158 C49 0.5524 0.7201 0.3942 H119 0.2846 0.2720 0.1469 C50 0.6668 1.2414 0.2237 H120 0.2172 0.1487 0.0989 H51 0.6690 1.2785 0.1776 H121 0.2001 0.2924 0.1441 H52 0.6125 1.2182 0.2137 C122 0.3349 0.4024 -0.0337 C53 0.8609 1.3569 0.4595 H123 0.3502 0.3144 -0.0588 H54 0.8773 1.2398 0.4636 H124 0.3290 0.3556 0.0092 C55 0.4991 0.5496 0.2836 C125 0.3458 0.7009 -0.0200 H56 0.4668 0.4624 0.2569 H126 0.3682 0.7937 -0.0371 C57 0.7010 1.3718 0.2841 C127 0.4561 1.0941 0.1233 H58 0.6975 1.4822 0.2628 H128 0.4859 1.1659 0.1085 H59 0.6744 1.3722 0.3171 C129 0.4030 1.0567 0.2762 C60 0.9137 1.6472 0.5099 H130 0.4339 1.1390 0.3084 H61 0.9621 1.7039 0.5438 C131 0.2548 0.7395 0.2713 C62 0.7404 1.2441 0.4666 C132 0.3536 0.9679 0.2955 C63 0.5039 0.5898 0.3526 H133 0.3500 0.9907 0.3403 H64 0.4747 0.5300 0.3726 F134 0.1847 0.7359 0.2156 C65 0.5722 0.6959 0.1556 F135 0.2364 0.8060 0.3220 H66 0.5642 0.6734 0.1065 F136 0.2859 0.5920 0.2960 C67 0.8949 1.7014 0.4308 F137 0.1977 0.8329 0.2710 H68 0.9412 1.6866 0.4211 F138 0.2168 0.6170 0.2301 H69 0.8818 1.8193 0.4256 F139 0.2934 0.6790 0.3395 C70 0.5532 0.7632 0.4678 H140 0.8280 1.7679 0.5060 H141 0.1330 -0.0400 -0.1062 TABLA 4 Coordenadas atómicas para el ejemplo 2c, Base Forma Hl.75-5 Atomo X Y Z Átomo X Y Z Cl 0.3942 0.1176 0.2183 C51 0.6094 0.0443 -0.0547 C2 0.2287 0.1174 0.0897 C52 0.6750 0.0382 0.0420 N3 0.1192 0.1293 0.0594 C53 0.9963 0.1572 0.4974 N4 0.1798 0.0501 0.1322 C54 0.7176 -0.0005 0.0684 N5 0.3753 0.0509 0.2822 C55 1.1985 0.0503 0.7049 N6 -0.0927 0.1070 -0.1055 C56 1.1539 0.1133 0.4965 N7 -0.3691 0.1154 -0.3165 C57 1.0229 0.1608 0.6162 N8 -0.2260 0.1440 -0.1970 C58 1.0367 0.1185 0.4572 09 0.1323 0.1298 -0.1137 C59 0.7341 0.1669 0.3280 010 0.0301 0.0456 0.0130 C60 1.1829 0.1168 0.6162 CU 0.0785 0.1332 -0.0419 C61 1.1435 0.1563 0.6496 C12 0.2431 0.0735 0.0697 C62 0.5636 0.1744 0.0306 C13 -0.2272 0.0747 -0.2281 C63 0.6973 0.1581 0.4320 C1 0.0812 0.0382 0.0995 C64 0.7972 0.1517 0.5115 C15 0.4135 0.0738 0.2008 C65 1.3015 0.0605 0.7775 C16 0.2774 0.1283 0.2010 C66 1.2257 0.0279 0.6122 C17 0.3592 0.0623 0.0929 C67 1.1287 0.0258 0.7652 C18 -0.3242 0.0799 -0.2978 C68 0.9017 0.0664 0.4282 C19 -0.1859 -0.0329 -0.2601 C69 0.8592 0.0308 0.4749 C20 -0.3192 0.1441 -0.2671 F70 0.7706 -0.0040 0.1659 C21 -0.1804 0.1091 -0.1748 F71 0.7890 -0.0119 0.0101 C22 -0.1842 0.0372 -0.2149 F72 0.6477 -0.0283 0.0583 C23 0.0394 0.1336 0.1281 N73 0.7366 0.2979 0.1640 C24 -0.3330 0.0112 -0.3340 N74 0.9286 0.2769 0.3415 C25 -0.2347 0.0067 -0.2683 N75 0.9490 0.3548 0.4399 C26 0.0308 0.0146 0.1792 N76 0.6679 0.2686 0.0076 C27 -0.3753 0.0465 -0.3473 N77 0.5468 0.3015 -0.1239 C28 -0.0381 0.1410 -0.0545 N78 1.1302 0.3587 0.6021 C29 0.4391 0.0161 0.3216 079 0.7689 0.2552 0.3756 C30 0.4331 -0.0152 0.2365 080 0.8000 0.3561 0.3182 C31 -0.0565 0.1490 0.0571 C81 0.6779 0.3005 0.0685 C32 0.5574 0.0267 0.3640 C82 0.8021 0.2636 0.1953 C33 0.3907 0.0006 0.4127 C83 0.6253 0.3363 0.0330 F34 -0.1107 -0.0374 -0.1835 C84 0.8293 0.2641 0.3145 F35 -0.1514 -0.0419 -0.3469 C85 0.9704 0.2829 0.4523 F36 -0.2560 -0.0605 -0.2519 C86 0.9612 0.3232 0.6101 N37 0.9782 0.0854 0.4895 C87 1.0815 0.3238 0.6395 N38 0.8832 0.1624 0.4564 C88 0.6395 0.3717 0.0871 N39 0.6198 0.1729 0.1273 C89 0.9221 0.3194 0.4932 N40 0.7167 0.1350 0.2533 C90 0.5107 0.3694 -0.1081 N41 0.5429 0.1472 -0.0401 C91 0.5605 0.3350 -0.0649 N42 1.1331 0.0855 0.6708 C92 0.6021 0.2715 -0.0843 043 0.9140 0.1821 0.2960 C93 0.5266 0.4037 -0.0538 044 0.8654 0.0771 0.3382 C94 0.9119 0.2659 0.1620 C45 0.8542 0.1720 0.3563 C95 0.5911 0.4051 0.0443 C46 0.5876 0.1117 -0.0112 C96 1.1535 0.3924 0.6738 C47 0.6629 0.1387 0.1561 C97 0.6068 0.4429 0.0984 C48 0. 6954 0.0688 0.1114 C98 0.8832 0.3710 0.3595 C49 0. 6512 0. 1060 0.0865 C99 1.0912 0.2839 0.4757 C50 0.5679 0.0801 -0.0813 C100 1 .1264 0.2872 0. 5933 C101 0. 9810 0.2861 0.2520 0151 0.4292 0.1756 0.7593 C102 0. 9190 0.4094 0.3235 0152 0.3473 0.1636 0.8339 C103 1.0516 0.4113 0. 6921 H153 0.4310 0.1254 0.2979 C104 1.2130 0.3807 0.7821 H154 0.4349 0.1341 0.1645 C105 1 .2167 0.4208 0. 6206 H155 0.2779 0. 1337 0.0447 F106 0. 6836 0.4427 0. 1806 H156 0.2164 0.0417 0.2100 F107 0.5186 0.4543 0. 1375 H157 0.3714 0.0703 0.3474 F108 0. 6281 0. 4715 0.0364 H158 -0.0576 0.0785 -0.0868 N109 0.3031 0.2523 0.0895 H159 0.2173 0.0675 -0.0123 NllO 0.3202 0.3294 0. 1970 H160 0.4992 0.0681 0.2061 Nlll 0.5022 0.3356 0.3522 H161 0.2372 0. 1127 0.2569 N112 0.0946 0.2741 -0.0674 H162 0.2676 0. 1594 0.2134 N113 -0.0336 0.2377 -0. 1697 H163 0.3639 0.0302 0.0854 N114 -0.2016 0.2650 -0.2433 H164 0.4006 0.0751 0.0350 0115 0.1682 0.3314 0.0829 H165 -0.3534 0. 1727 -0.2828 0116 0.1499 0.2237 0. 1243 H166 -0. 1099 0.0321 -0.1626 C117 0.2052 0.2373 0.0644 H167 0.0215 0. 1059 0. 1611 C118 0.2992 0.2930 0.2475 H168 0.0659 0. 1539 0. 1907 C119 -0.0515 0.3401 -0.0764 H169 -0.3750 -0.0142 -0.3730 C120 0.3416 0.2960 0.3644 H170 -0.0484 0.0061 0.1467 C121 -0. 1222 0.3701 -0.0923 H171 0.0783 -0.0115 0.2000 C122 0.4698 0.2615 0.2174 H172 0.0297 0.0317 0.2489 C123 -0.1737 0.2997 -0.1931 H173 -0.4526 0.0496 -0.3983 C124 -0.0044 0.2713 -0.1206 H174 -0.0573 0.1673 -0.1021 C125 -0.2438 0.3311 -0.2090 H175 0.4770 -0.0409 0.2650 C126 -0.0754 0.3040 -0.1278 H176 0.3484 -0.0242 0.2146 C127 0.1701 0.2420 -0.0535 H177 0.4596 -0.0045 0.1679 C128 0.3488 0.2578 0.2007 H178 -0.1282 0.1348 0.0707 C129 0.5097 0.2640 0.3350 H179 -0.0650 0.1804 0.0686 C130 0.4624 0.2986 0.3883 H180 0.5963 -0.0009 0.3924 C131 -0.0968 0.4077 -0.0362 H181 0.5930 0.0381 0.3032 C132 0.3460 0.2683 0.0015 H182 0.5596 0.0461 0.4284 C133 -0.1317 0.2372 -0.2271 H183 0.4332 -0.0251 0.4433 C134 0.5253 0.3677 0.4289 H184 0.3902 0.0220 0.4712 C135 -0.2190 0.3662 -0.1602 H185 0.3084 -0.0081 0.3820 C136 0.2745 0.2511 -0.0941 H186 0.9987 0.0754 0.5691 C137 0.5618 0.4023 0.3689 H187 0.7487 0.1066 0.2786 C138 0.6152 0.3567 0.5186 H188 1.1096 0.0983 0.7400 C139 0.4264 0.3788 0.4754 H189 0.7448 0.0641 0.1858 C140 0.2540 0.3461 0.1186 H190 0.5192 0.0845 -0.1565 C141 0.2900 0.3831 0.0758 H191 0.5930 0.0200 -0.1086 F142 0.0020 0.4176 -0.0257 H192 1.0402 0.1792 0.4633 F143 -0.1497 0.4372 -0.0806 H193 1.1791 0.0849 0.4744 F144 -0.1239 0.4079 0.0550 H194 1.1975 0.1355 0.4619 0145 0.4346 0.1106 0.5123 H195 0.9975 0.1890 0.6409 0146 0.1371 0.2037 0.3256 H196 0.9825 0.1382 0.6530 0147 0.6629 0.2454 0.5702 H197 1.0259 0.1190 0.3726 0148 0.4523 0.2291 0.5970 H198 0.6972 0.1932 0.2915 0149 0.3986 0.3042 0.6776 H199 1.2687 0.1146 0.6366 O150 0.3459 0.1840 0.4326 H200 1.1831 0.1795 0.6123 H201 1.1631 0.1593 0.7328 H251 1.1684 0.4299 0.5453 H202 0.5306 0.2029 0.0082 H252 0.3950 0.3437 0.2241 H203 0.6519 0.1824 0.4545 H253 0.5749 0.3293 0.3230 H204 0.6483 0.1323 0.4245 H254 0.1193 0.3022 -0.0335 H205 0.8029 0.1216 0.5375 H255 0.2147 0.2880 0.2355 H206 0.7957 0.1702 0.5801 H256 0.0233 0.3437 -0.0249 H207 1.3466 0.0340 0.8006 H257 0.3083 0.3215 0.3958 H208 1.3500 0.0795 0.7383 H258 0.3160 0.2703 0.4028 H209 1.2843 0.0747 0.8476 H259 0.5050 0.2366 0.1841 H210 1.2710 0.0024 0.6388 H260 0.4927 0.2878 0.1790 H211 1.1517 0.0185 0.5635 H261 -0.3192 0.3277 -0.2606 H212 1.2687 0.0462 0.5671 H262 0.1323 0.2153 -0.0854 H213 1.1703 -0.0007 0.7926 H263 0.3327 0.2320 0.2439 H214 1.1105 0.0421 0.8313 H264 0.4885 0.2372 0.3700 H215 1.0556 0.0182 0.7149 H265 0.5951 0.2670 0.3470 H216 0.7976 0.0176 0.4203 H266 0.4874 0.2957 0.4712 H217 0.9226 0.0100 0.4973 H267 0.3419 0.2998 0.0019 H218 0.8269 0.0390 0.5453 H268 0.4278 0.2594 0.0040 H219 0.7349 0.3217 0.2190 H269 -0.1537 0.2100 -0.2663 H220 1.0259 0.3684 0.4660 H270 -0.2738 0.3905 -0.1734 H221 1.2052 0.3497 0.5802 H271 0.3087 0.2249 -0.1215 H222 0.7595 0.2370 0.1705 H272 0.2609 0.2719 -0.1576 H223 0.9510 0.2576 0.4964 H273 0.5805 0.4266 0.4203 H224 0.9305 0.2994 0.6498 H274 0.6328 0.3938 0.3368 H225 0.9306 0.3505 0.6365 H275 0.5006 0.4101 0.3051 H226 1.1023 0.3226 0.7234 H276 0.6311 0.3804 0.5741 H227 0.6892 0.3732 0.1634 H277 0.5931 0.3310 0.5600 H228 0.8361 0.3164 0.4802 H278 0.6878 0.3500 0.4880 H229 0.4622 0.3687 -0.1842 H279 0.4455 0.4020 0.5307 H230 0.5955 0.2449 -0.1310 H280 0.3644 0.3877 0.4139 H231 0.4887 0.4301 -0.0865 H281 0.4001 0.3535 0.5147 H232 0.9411 0.2373 0.1483 H282 0.2315 0.3935 0.0139 H233 0.9065 0.2830 0.0906 H283 0.3050 0.4046 0.1373 H234 1.1232 0.2576 0.4474 H284 0.3642 0.3778 0.0457 H235 1.1194 0.3088 0.4371 H297 0.5031 0.1166 0.5720 H236 1.2129 0.2887 0.6081 H298 0.4013 0.1383 0.4827 H237 1.1010 0.2618 0.6307 H291 0.1415 0.2116 0.2456 H238 0.9841 0.3173 0.2399 H292 0.0561 0.1944 0.3301 H239 1.0614 0.2747 0.2630 H285 0.7189 0.2533 0.6386 H240 0.8608 0.4208 0.2603 H286 0.7007 0.2488 0.5014 H241 0.9250 0.4304 0.3884 H287 0.4531 0.2087 0.6605 H242 0.9943 0.4069 0.2987 H288 0.5334 0.2354 0.5869 H243 1.0681 0.4363 0.7411 H289 0.4187 0.2763 0.6478 H244 1.0091 0.4217 0.6147 H290 0.4459 0.3091 0.7532 H245 1.0017 0.3911 0.7227 H293 0.3695 0.2054 0.4921 H246 1.2276 0.4062 0.8315 H294 0.2663 0.1913 0.3921 H247 1.1658 0.3601 0.8194 H295 0.4701 0.1653 0.8329 H248 1.2882 0.3671 0.7752 H296 0.4645 0.1639 0.6962 H249 1.2341 0.4465 0.6673 H299 0.2731 0.1523 0.8513 H250 1.2881 0.4078 0.6030 H300 0.4117 0.1542 0.8909 TABLA 5 Coordenadas atómicas Dará el e emolo 2e. Base Forma E-l Átomo X Y Z Átomo X Y Z F18 0.2662 0.4002 0.0274 F23 0.0301 0.3722 0.0039 F19 0.0473 0.4191 0.0033 C18 0.1648 0.3165 . 0.0297 F20 0.1401 0.2386 0.0059 H31 0.2375 0.5477 0.2387 02 0.3035 0.7582 0.1985 H41 0.5018 0.4801 0.2585 028 0.4277 0.5819 0.1087 H42 0.4761 0.3850 0.2161 NI 0.5559 0.6627 0.1978 H51 0.6480 0.5043 0.1733 N6 0.2412 0.4989 0.1766 H52 0.7376 0.5463 0.2204 N8 0.0422 0.3993 0.2139 H61 0.2881 0.5282 0.1472 N10 -0.1606 0.2714 0.1828 H91 -0.1519 0.3157 0.2435 N27 0.6744 0.6813 0.1115 HUI -0.2586 0.1707 0.1140 N29 0.9824 0.8036 0.1064 H121 -0.1207 0.1964 0.0469 C2 0.3877 0.6687 0.2028 H141 0.2343 0.4431 0.0976 C3 0.3235 0.5438 0.2136 H211 0.5921 0.8399 0.1984 C4 0.4822 0.4775 0.2252 H221 0.4827 0.7942 0.1303 C5 0.6231 0.5426 0.2028 H231 0.6846 0.8993 0.0877 C7 0.1130 0.4242 0.1780 H232 0.6444 0.9699 0.1348 C9 -0.0900 0.3261 0.2139 H241 0.9421 0.9813 0.1221 CU -0.1488 0.2295 0.1107 H251 1.0517 0.8711 0.1826 C12 -0.0761 0.2450 0.0735 H252 0.8644 0.9484 0.1930 C13 0.0600 0.3235 0.0687 H261 0.8551 0.7433 0.2231 C14 0.1243 0.3844 0.1017 H262 0.8872 0.6821 0.1741 C15 -0.0857 0.2914 0.1453 H271 0.8051 0.6804 0.1028 C16 0.0498 0.3680 0.1409 H291 1.0794 0.7695 0.1261 C17 0.1207 0.3503 0.0270 H294 0.7893 0.5312 0.0656 C21 0.6470 0.7650 0.1817 H292 0.6583 0.4189 0.0854 C22 0.6168 0.7817 0.1361 H293 0.5951 0.5011 0.0421 C23 0.7030 0.8953 0.1212 H311 0.9885 0.9169 0.0098 C2 0.8922 0.8952 0.1304 H312 0.8322 0.8277 0.0324 C25 0.9185 0.8727 0.1765 H313 0.8750 0.9701 0.0523 C26 0.8353 0.7590 0.1910 H321 1.2632 0.9515 0.0466 C28 0.5782 0.5936 0.0987 H322 1.1556 1.0063 0.0897 C29 0.6596 0.5024 0.0711 H323 1.2983 0.8878 0.0951 C30 1.0633 0.8393 0.0676 H331 1.1943 0.7459 0.0197 C31 0.9326 0.8931 0.0389 H332 1.2251 0.6857 0.0690 C32 1.2044 0.9276 0.0745 H333 1.0345 0.6616 0.0430 C33 1.1314 0.7245 0.0492 H971 -0.8355 0.1305 0.1615 099 -0.4402 0.1232 0.1894 H972 -0.7164 0.0043 0.1747 C97 -0.7313 0.0985 0.1797 H973 -0.7551 0.1157 0.2115 C98 -0.5812 0.1608 0.1676 H981 -0.5951 0.2544 0.1716 F21 0.3052 0.3620 0.0283 H982 -0.5565 0.1430 0.1349 F22 0.1907 0.2403 0.0143 H991 -0.3383 0.1855 0.1847 TABLA 6 Coordenadas atómicas para el ejemplo 2d, Base Forma HAC- [Átomo X Y Z Átomo X Y Z 0.0418 0.3612 0.1413 H32 -0.1504 0.2133 0.0512 G N2 -0.1614 0.2566 0.1827 H21 0.2024 0.4361 0.1001 N3 0.5574 0.6476 0.1969 H19 -0.2633 0.1786 0.1141 04 0.4002 0.5938 0.1104 H15 -0.1260 0.2877 0.2400 N5 0.0480 0.3793 0.2136 H6 0.2703 0.5248 0.1514 N6 0.2349 0.4911 0.1766 H14 0.2507 0.5355 0.2354 N7 0.6581 0.6819 0.1120 H25A 0.5017 0.4595 0.2502 09 0.3141 0.7518 0.2032 H25B 0.4643 0.3765 0.2131 CIO 0.6548 0.7519 0.1823 H22A 0.6302 0.4915 0.1724 Cll 0.1091 0.4116 0.1779 H22B 0.7255 0.5203 0.2124 C12 0.6143 0.7805 0.1389 H10 0.6208 0.8184 0.1990 C13 -0.0977 0.2822 0.1453 H12 0.4961 0.7944 0.1361 C14 0.3251 0.5321 0.2128 H31A 0.7369 0.5221 0.0663 C15 -0.0849 0.3037 0.2135 H31B 0.5607 0.5108 0.0459 C16 0.5496 0.5972 0.0993 H31C 0.6086 0.4250 0.0815 C17 0.8422 0.7397 0.1888 H17A 0.8651 0.7215 0.2164 N18 0.9734 0.7976 0.1050 H17B 0.8826 0.6751 0.1722 C19 -0.1674 0.2302 0.1113 H23A 0.6885 0.9061 0.0978 C20 0.0380 0.3268 0.0698 H23B 0.6640 0.9626 0.1405 C21 0.1085 0.3827 0.1029 H28A 0.8869 0.9177 0.1920 C22 0.6188 0.5229 0.1991 H28B 1.0495 0.8473 0.1796 C23 0.7063 0.8942 0.1260 H27 0.9448 0.9635 0.1263 C24 0.3943 0.6572 0.2042 H18 1.0626 0.7570 0.1189 C25 0.4808 0.4583 0.2218 H39A 1.2479 0.9507 0.0498 C27 0.8951 0.8864 0.1321 H39B 1.2853 0.8792 0.0894 C28 0.9305 0.8535 0.1757 H39C 1.1647 0.9911 0.0903 F29 0.2449 0.4047 0.0277 H38A 0.9706 0.9352 0.0175 C30 1.0501 0.8412 0.0669 H38B 0.8802 0.9740 0.0573 C31 0.6205 0.5052 0.0708 H38C 0.8310 0.8527 0.0360 C32 -0.1018 0.2511 0.0743 H40A 1.1575 0.7492 0.0195 C33 0.1058 0.3467 0.0300 H40B 1.0092 0.6805 0.0403 F36 0.1168 0.2494 0.0085 H40C 1.1861 0.6845 0.0608 F37 0.0041 0.4132 0.0068 H7 0.7708 0.6743 0.1022 C38 0.9217 0.9066 0.0421 H35A -0.8134 0.1022 0.1656 C39 1.2014 0.9229 0.0747 H35B -0.7586 0.1045 0.2107 C40 1.1073 0.7290 0.0448 H35C -0.7035 -0.0029 0.1830 08 -0.4446 0.1296 0.1963 H8 -0.3548 0.1817 0.1876 C26 -0.5724 0.1491 0.1735 034 -0.5673 0.2213 0.1458 C35 -0.7251 0.0824 0.1840 TABLA 7 Coordenadas atómicas para el ejemplo 2g, Base Forma Atomo X Y Z Átomo X Y Z Fl 0.1519 0.3786 0.0243 H4B 0.8724 0.7912 0.1232 F3 -0.0140 0.2540 -0.0043 H3 0.6171 0.6809 0.1026 F2 0.0260 0.4241 0.0085 Hl 0.1162 0.5505 0.1460 N4 0.8062 0.8075 0.1016 H10 0.3362 0.7935 0.1099 N3 0.5159 0.6834 0.1054 H9 0.3991 0.8799 0.1736 N2 0.3481 0.7197 0.1890 H6A 0.4782 0.9618 0.1051 NI 0.0675 0.5440 0.1700 H6B 0.5369 0.8805 0.0686 N5 -0.1311 0.4643 0.2095 H22 0.0665 0.4473 0.0929 N6 -0.2941 0.3121 0.1828 H5 0.7491 0.9735 0.1042 01 0.1140 0.8031 0.1697 H21 -0.3360 0.1865 0.1167 02 0.2925 0.5779 0.1031 H12A 0.5507 0.4357 0.0989 CIO 0.4463 0.7911 0.1197 H12B 0.6252 0.5211 0.0660 C9 0.4471 0.8051 0.1677 H12C 0.4678 0.4565 0.0549 C4 0.9030 0.8194 0.0629 H8A 0.6698 0.7392 0.1786 C24 -0.0632 0.3232 0.0669 H8B 0.6137 0.8216 0.2153 C19 -0.0909 0.3946 0.1378 H16 0.0302 0.6334 0.2243 C6 0.5348 0.8912 0.0992 H13A 0.4882 0.6277 0.2283 C20 -0.2139 0.3158 0.1454 H13B 0.4421 0.5607 0.1863 CU 0.4342 0.5879 0.0964 H3B 0.9771 0.9859 0.0712 C22 -0.0159 0.3962 0.0980 H3C 1.0944 0.9144 0.0431 C5 0.7048 0.9021 0.1156 H3D 1.0915 0.8973 0.0926 C17 -0.0508 0.4684 0.1726 H23 -0.2112 0.1922 0.0537 C21 -0.2559 0.2399 0.1123 H18 -0.3052 0.3848 0.2368 C14 0.1869 0.7250 0.1863 H2A 0.7158 0.7853 0.0234 C12 0.5279 0.4917 0.0774 H2B 0.8604 0.8380 -0.0010 C8 0.6155 0.8107 0.1847 H2C 0.7518 0.9169 0.0270 C16 0.1187 0.6161 0.2052 H7A 0.6551 0.9825 0.1718 C13 0.4041 0.6134 0.2080 H7B 0.8129 0.9118 0.1736 C3 1.0281 0.9129 0.0679 H1A 1.0319 0.6803 0.0846 C23 -0.1824 0.2437 0.0749 H1B 1.0662 0.7077 0.0366 C18 -0.2485 0.3861 0.2114 H1C 0.9087 0.6458 0.0495 C2 0.7981 0.8420 0.0246 H15A 0.2542 0.5916 0.2593 C7 0.7045 0.9108 0.1635 H15B 0.2564 0.4841 0.2288 Cl 0.9852 0.7023 0.0579 H3A -0.4990 0.1985 0.1863 C15 0.2577 0.5672 0.2298 H27 -0.6926 0.2734 0.1759 C25 0.0153 0.3263 0.0246 H26A -0.7745 0.0861 0.1320 F4 0.1640 0.2980 0.0315 H26B -0.6492 0.1771 0.1173 F5 -0.0739 0.3770 -0.0036 H26C -0.8259 0.2136 0.1243 F6 0.0440 0.2214 0.0112 H28A -0.8028 0.1216 0.2237 03 -0.5666 0.1486 0.1890 H28B -0.9203 0.1527 0.1868 C27 -0.7093 0.1903 0.1763 H28C -0.8515 0.2497 0.2160 C26 -0.7420 0.1648 0.1343 C28 -0.8290 0.1780 0.2024 C29 -0.8460 0.1070 0.1744 C30 -0.6990 0.2550 0.1410 TABLA 8 Coordenadas atómicas para el ejemplo 2f, Base Forma RPG-3 Atomo X Y Z Átomo X Y Z Fl 1.4700 0.5720 0.6614 N2 0.6350 0.3813 0.3765 F7 1.4119 0.5575 0.7000 N6 0.2687 0.8628 0.3992 F2 1.4315 0.5398 0.7741 N4 0.3398 0.7349 0.3149 F8 1.5600 0.5336 0.8131 NI 0.8898 0.3354 0.4598 F3 1.6320 0.5630 0.7860 N5 0.0527 0.9107 0.3489 F9 1.6111 0.5864 0.6960 C12 0.4202 0.2078 0.3911 N9 0.7997 -0.0295 0.8348 01 0.6129 0.7507 0.2839 N8 0.7989 0.1232 0.9974 CIO 0.7273 0.4981 0.3447 Nll 1.1628 -0.0946 0.6829 C6 0.8597 0.4735 0.3332 N10 1.0937 0.0679 0.7424 C9 0.7661 0.6239 0.4071 N7 0.5331 0.0253 1.0441 C20 0.1173 0.7695 0.2548 N12 1.3802 -0.0414 0.6342 C19 0.0264 0.8385 0.2716 03 0.8190 0.0931 0.7142 C5 0.9561 0.4627 0.4193 04 1.0177 0.2159 0.9737 C17 0.2435 0.7914 0.3234 C34 0.7187 0.1296 0.9094 C8 0.8573 0.6109 0.4957 C45 1.3119 0.1383 0.6926 02 0.4273 0.3887 0.2980 C37 0.6769 0.0002 0.8509 C24 -0.0460 0.6680 0.1174 C30 0.4799 0.0412 0.9508 C16 0.4606 0.7449 0.3864 C42 1.1869 0.0349 0.7058 C22 0.0802 0.6875 0.1776 C31 0.5850 0.1596 0.9161 C14 0.5786 0.7190 0.3544 C4 1.4737 0.3643 0.7029 C7 0.9892 0.5850 0.4828 C33 0.5750 -0.1179 0.8869 C23 -0.1359 0.7367 0.1342 C47 1.3487 0.2751 0.7153 C18 0.1707 0.9200 0.4061 C40 0.8584 0.0198 0.7679 C25 -0.0848 0.5788 0.0372 C32 0.4447 -0.0846 0.8933 C13 0.5736 0.6259 0.4906 C41 0.9773 -0.0327 0.7663 C21 -0.1010 0.8179 0.2096 C39 1.0115 -0.0750 0.8618 C4 0.9438 0.1985 0.3554 C35 0.9405 0.1730 1.0250 C3 0.9469 0.2256 0.4509 C38 0.8681 -0.1166 0.8863 C15 0.4317 0.6466 0.4565 C28 0.4760 0.0765 1.1130 C2 1.0956 0.2572 0.5066 C43 1.2625 -0.1234 0.6483 Cll 0.4953 0.3347 0.3508 C44 1.4064 0.0935 0.6556 Cl 0.8466 0.1026 0.4843 C46 1.5338 0.1870 0.6430 F4 -0.1040 0.4554 0.0598 C48 1.5649 0.3202 0.6666 F5 0.0211 0.6100 -0.0030 C36 1.0000 0.1703 1.1211 F6 -0.1869 0.5900 -0.0238 C29 0.5552 0.0482 1.2020 FIO -0.2221 0.5070 0.0190 C27 0.3192 0.0052 1.1006 Fll -0.0370 0.4791 0.0400 C26 0.5156 0.2276 1.1108 F12 -0.0360 0.6334 -0.0302 C50 1.5103 0.5068 0.7292 07 0.3015 0.5242 0.1820 N3 0.6420 0.6560 0.4169 08 0.5067 0.7155 0.1016 C55 0.4573 0.5719 0.0792 H12C 0.3410 0.1518 0.3473 C56 0.3131 0.5089 0.0936 H10A 0.6770 0.5138 0.2867 C54 0.4592 0.5517 -0.0152 H6A 0.8326 0.3912 0.2958 05 1.1135 0.3136 0.8309 H6B 0.9113 0.5467 0.3027 06 0.9224 0.3638 0.6775 H9 0.8236 0.6994 0.3801 C52 0.9658 0.4383 0.7607 H95 1.0446 0.4603 0.4067 C53 1.0998 0.4403 0.8150 H8B 0.8035 0.5371 0.5249 C51 0.9706 0.5801 0.7445 H8C 0.8845 0.6928 0.5336 H8 0.7521 0.0843 1.0354 H16 0.4967 0.8363 0.4153 H10 1.1043 0.1515 0.7516 H22 0.1413 0.6448 0.1660 H34 0.7767 0.2034 0.8813 H7A 1.0479 0.6636 0.4601 H37 0.6246 0.0147 0.7931 H77B 1.0425 0.5720 0.5399 H30 0.3926 0.0620 0.9462 H23 -0.2199 0.7261 0.0931 H31A 0.5395 0.1776 0.8580 H18 0.1897 0.9731 0.4584 H31B 0.6110 0.2396 0.9557 H13A 0.6288 0.6865 0.5425 H33A 0.5480 -0.1985 0.8476 H13B 0.5604 0.5340 0.5057 H33B 0.6213 -0.1349 0.9450 H21 -0.1626 0.8605 0.2204 H47 1.2884 0.3066 0.7391 H4A 0.8479 0.1679 0.3217 H32A 0.3953 -0.0742 0.8343 H4B 0.9856 0.1305 0.3502 H32B 0.3818 -0.1587 0.9172 H4C 0.9960 0.2797 0.3330 H41 0.9434 -0.1120 0.7240 H15A 0.3587 0.5626 0.4312 H39A 1.0471 -0.1496 0.8633 H15B 0.4034 0.6838 0.5038 H39B 1.0801 -0.0006 0.9013 H2A 1.1552 0.3410 0.4913 H38A 0.8152 -0.2110 0.8689 H2B 1.1310 0.1867 0.4955 H38B 0.8786 -0.0998 0.9495 H2C 1.0948 0.2640 0.5683 H43 1.2434 -0.2140 0.6327 HlA 0.8496 0.1213 0.5456 H46 1.5955 0.1582 0.6190 H1B 0.8758 0.0261 0.4785 H48 1.6483 0.3822 0.6582 H1C 0.7522 0.0839 0.4497 H36A 1.0650 0.1213 1.1285 H99 0.9009 0.3500 0.5070 H36B 0.9249 0.1270 1.1498 H7 0.3628 0.5029 0.2157 H36C 1.0484 0.2607 1.1471 H8A 0.5335 0.7307 0.1555 H29A 0.5101 -0.0427 1.2144 H55 0.5214 0.5322 0.1164 H29B 0.5546 0.1090 1.2479 H56A 0.2502 0.5475 0.0555 H29C 0.6509 0.0606 1.1995 H56B 0.2814 0.4136 0.0755 H27A 0.2727 0.0063 1.0399 H54A 0.4034 0.5980 -0.0510 H27B 0.2829 0.0501 1.1386 H54B 0.4208 0.4574 -0.0335 H27C 0.3022 -0.0863 1.1155 H54C 0.5546 0.5867 -0.0221 H26A 0.6150 0.2666 1.1142 H5 1.0835 0.2863 0.8748 H26B 0.4925 0.2636 1.1602 H6 0.9213 0.2865 0.6847 H26C 0.4641 0.2486 1.0564 H52 0.8933 0.3997 0.7941 HIOO 0.5160 -0.0550 1.0510 H53A 1.1740 0.4907 0.7866 H2 0.6741 0.3386 0.4153 H53B 1.1148 0.4884 0.8717 H4 0.3295 0.6914 0.2656 H51A 1.0458 0.6226 0.7158 H12A 0.3879 0.2319 0.4404 H51B 0.9866 0.6294 0.8002 H12B 0.4843 0.1597 0.4113 H51C 0.8826 0.5788 0.7073 TABLA 9 Las características de las posiciones del pico de difracción de de polvos de rayos X (grados 2?±0.1)@ temperatura ambiente para los ejemplos 2a, b, d, c, d, e, f, y g basados en un patrón de alta calidad colectado con un difractometro (CuKa) con un hilado capilar con 2T calibrado con un NIST u otro estándar adecuado CARACTERISTICAS FARMACOLOGICAS COMPARATIVAS Los ensayos y datos que comparan las características farmacológicas del Ejemplo 1 y los compuestos encontrados en WO2005021500 (correspondiente a la Patente E.U.A. No. 7,163,937 asignada al Solicitante actual) se presentan abajo.
Enlace celular mononuclear de sangre periférica humana ("enlace CCR2") Ver también: Yoshimura et al., J. Immunol . 1990, 145, 292. El ensayo de enlace CCR2 humano se establció con células mononucleares de sangre periférica humanas (hPBMCs) usando MCP-1 I-humano como el ligando marcador. Las hPBMCs se aislaron del leucopaquete humano (Biological Specialty Inc.) usando un protocolo estándar con Ficoll-Hypaque (Mediatech Cellgro) . Las hPBMCs aisladas se lavaron y diluyeron hasta lxl07/ml en solución amortiguadora de enlace (RPMI-1640, 0.1%BSA, 20 mM Hepes, pH 7.4). La 125I-MCP-1 (NEN/Perk Elmer) se diluyó hasta 0.45 nM en solución amortiguadora. El compuesto se diluyó en solución amortiguadora de enlace a 3 veces las concentraciones finales usadas en el ensayo de enlace. El ensayo de enlace se ralizó usando una placa filtro de 96 pozos (Millipore) . El enlace 125I- CP-1 total se evaluó como sigue: a cada reacción de un volumen total de 150 µ? se le agregaron 5xl05 células, 0.15 nM 125I-MCP-1, y el compuesto de tal manera que la concentración final está en el intervalo desde 0 hasta 100 nM. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos seguido por tres lavados con RPMI-1640, 0.1% BSA, 0.4 M NaCl, 20 mM Hepes, pH 7.4 usando una filtración de múltiple al vacio (Millipore) . Después del lavado, la placa se secó al aire durante 60 minutos a temperatura ambiente. Esto se siguió por agregar 25 µ? de Microscint 20 en cada pozo. La placa se sellóT y contó en el Trilux durante 1 minuto. Se determinó el enlace no especifico en presencia de 300 nM MCP-1 frío (PeproTech Inc.). El 125I-MCP-1 se calcula como la diferencia entre el enlace total y no especifico. Todas las condiciones se probaron por duplicado.
El IC50 se define como la concentración de compuesto de competencia requerido para reducir el enlace especifico por el 50%. Flujo hERG Se hacen crecer canales hERG que expresan establemente células HEK293 (37°C, 5% C02) en Medio Eagle Modificado de Dulbecco complementado con suero de bovino fetal al 10% Sigma, aminoácidos no esenciales, 2mM L-glutamina y 500 µ?/p?? de G418, en un incubador. La solución amortiguadora de disociación se usó para extraer las células de los matraces, que luego se colocaron en placas negras/transparentes recubiertas con poli-D-lisina Corning de 384 pozos a una densidad de 2 x 104 células por pozo (20 µ?) en medio de suero al 10%, y se incuba durante 15-24 horas a 37°C en un incubador de CO2 al 5% hasta que se obtuvo una monocapa confluente de células . Una solución de reserva 2 mM de pigmento BTC-AM (Molecular Probes, Eugene, OR) se preparó en DMSO al 100% y luego se agregó 1:1 al ácido plurónico al 10% (p/v) en DMSO el día del ensayo. El pigmento se diluyó entonces en solución amortiguadora EP externa hERG (140 mM NaCl, 4.0 mM KC1, 1.8 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3 y 10 mM glucosa; todos los componentes de la solución amortiguadora obtenidos de Sigma Chemical) . Esta mezcla de pigmento BTC (30 µ?) se agregó a las células y produce una concentración de carga final de 2.5 µ?. Las células se incubaron a 21°C durante 45 minutos . Los compuestos de prueba se diluyeron hasta 10 mM DMSO en 60 µ? . Estos compuestos se diluyeron entonces en serie a una relación 1:2 en DMSO en columnas 1-10 y 11-20 de una placa de 384 pozos. Las placas lista para ensayo se generaron al estampar 2.5 µ? de la placa de DMSO diluida en serie, que se preparó en el Velocity 11 BioCel. Las placas acuosas se crearon al agregar 48 µ? de la solución amortiguadora EP y luego se diluyeron 30 - 45 minutos antes de que el ensayo se leyera en el FLIPR. Después de cargar el pigmento, los compuestos acuosos diluidos se agregaron a las células de las tres placas de replicado (10 µ?) proporcionando un intervalo de concentración de diez puntos de 80 µ? hasta 0.156 nM. La concentración de DMSO final en el ensayo es del 1%. Las placas acuosas listas para el ensayo se prepararon y diluyeron en un manej ador liquido Cybio. Las células cargadas con el pigmento se leyeron en el FLIPR384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) , que excitan el pigmento usando la linea 488 nm de un láser de argón. La emisión se filtró usando un filtro de paso de banda 540 ± 30 nm. Los canales hERG se estimularon al abrir por la adición de 20 µ?/???? de solución amortiguadora EP que contiene 66 mM K2S04 y 1.3 mM T12S04 (Sigma/Aldrich) . Para cada placa, los datos se colectaron cada segundo durante un periodo de 12 segundos, en cuyo tiempo la solución amortiguadora de estimulo que contiene Tl+ se agregó. La colección de datos procede cada segundo durante 48 segundos, y luego continua cada tres segundos durante 2 minutos adicionales. El intervalo dinámico del ensayo se determinó de pozos en blanco y totales. Los pozos totales (columnas 21 y 22) definen la activación hERG máxima para la placa (sin compuesto de prueba presente), y los pozos en blanco (columnas 23 y 24) definen el 100% de inhibición hERG. Los pozos en blanco contiene 400 nM de cualquiera de los inhibidores de dofetiluro hERG estándar (Ficker et al., 1998) o E-4031. Los puntos de datos crudos en cada pozos de muestra se corrigieron primero para variación de célula/señal, respaldo de control negativo (blancos) , y normalizado de controles positivos (totales) usando el software FLIPR en linea. Las curvas de respuesta de concentración del compuesto de prueba para los datos de flujo hERG Tl+ se ajustaron primero usando el Ajuste Excel (ID Business Solutions Limited, Surrey, RU) con una ecuación lógica de sitio sencillo, Y= A + ( (B-A)/l + ( (C/X) ? D) ) ) donde A= inhibición máxima. Los datos se analizaron al ajustar las amplitudes máximas de cambio en al fluorescencia para el flujo Tl+ para una condición dada del compuesto de prueba. Las potencias (valores IC50) de los compuestos se calcularon del promedio de pozos triplicados.
Ensayo de enlace de sitio 2 , canal de sodio Ver también: W. A. Catterall, et al. J. Biol. Chem. 1981, 256, 8922. La solución amortiguadora de enlace estándar contiene 50 m HEPES, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 130 mM cloruro de colina, 5.4 mM KC1, 0.8 mM MgCl2, 5.5 mM glucosa, 40 g/mL LqT. Las reacciones de enlace se iniciaron al agregar sinaptosomas (preparadas de cerebro de rata istar) a la mezcla de reacción que contiene 5 nM [3H] -Batracotoxina en una solución amortiguadora de enlace estándar y el compuesto a probarse a la concentración deseable. Las muestras se mezclaron entonces e incubaron a 37 °C durante 60 minutos. Las reacciones se detuvieron al agregar solución amortiguadora de lavado enfriada en hielo que contiene 50 mM HEPES, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1.8 mM CaCl2, 0.8mM MgCl2 y 1 mg/mL de albúmina de suero de bovino. Las sinaptosomas se colectaron inmediatamente en filtros de fibra de vidrio y se lavan 3 veces con soluciones amortiguadoras de lavado. La radioactividad de la [3H] -Batracotoxina que se mantiene en los filtros se contó usando espectrómetros de escintilación liquida. Ensayo de Permeabilidad de Membrana Artificial Paralelo (PAMPA) El ensayo de permeabilidad de membrana artificial paralelo (PAMPA) consiste de una combinación de lipidos basada en lecitina especialmente formulada referida como el lipido del tracto gastrointestinal (GIT) . El lipido GIT se usa para formar una membrana en un ensamble de placa intercalado similar al que se usa en los ensayos Caco-2. El lipido GIT es muy semejane a la composición y desempeño de la membrana in vivo como se mide por compuestos estándar que se conocen que se absorben pasivamente en humanos. El PAMPA se usa ampliamente como un modelo in vitro para separación por exclusión de permeabilidad de compuestos descubiertos. La relación de paso de los compuestos a través de la membrana PAMPA se usa para determinar el coeficiente de permeabilidad (Pe), que puede relacionarse a la permeabilidad pasiva in vivo del compuesto. El coeficiente de permeabilidad (Pe) de un compuesto particular se examina en un ajuste dependiente del pH con un pH de la punta y basolateral de 7.4. Todos los experimentos se conducen en determinaciones por triplicado. Los compuestos (soluciones de reserva 10 mM en 100% DMSO) se diluyeron 1:100 en solución amortiguadora de pozo donador pH 7.4 (pION CAT # 110151), proporcionando una solución de ensayo 100 µ? en DMSO al 1%. El compuesto diluido en la solución amortiguadora de pozo donador se transfirió a una placa Whatman Unifilter y se filtra antes de dispensar 200 µ? en el pozo donador de la placa de ensayo (pION CAT #110163) . La membrana PAMPA se formó al pipetear 4 µ? de solución de lipido (pION CAT #110169) en la placa filtro (VWR CAT #13503) .
La membrana se cubrió entonces con 200 µ? de solución amortiguadora de pozo aceptor a pH 7.4 (pION CAT #110139). La placa de ensayo PAMPA (lado donador y lado aceptor) se combinó y permitió incubar a temperatura ambiente durante 4 horas. La placa se desmonta y las placas de espectrofotómetro (VWR CAT #655801) se llenan (150 µ?/????) . Las placas donadora, aceptora, referencia, y blanco se leyeron en el lector de placa SpectraMax UV. Los datos se capturaron por el software pION, que analiza los espectros y genera valores Pe. Quimiotaxis CCR2 El ensayo de quimiotaxis CCR2 humano se condujo con la linea celular monocitica humana, THP-1. Las células THP-1 se etiquetaron primero con el pigmento fluorescente Calcein-AM en RPMI-1640 libre de BSA, libre de fenol rojo (pH 7.4) a 37°C durante 30 minutos con mezclado suave cada 15 minutos. Las células etiquetadas se lavan entonces y se vuelven a suspender a lxloVml en solución amortiguadora de quimiotaxis (RPMI-1640 libre de fenol rojo, 0.1% BSA, pH 7.4). El compuesto de prueba se diluyó en solución amortiguadora de quimiotaxis de tal manera que la concentración de ensayo final está en el intervalo desde 0.01 nM hasta 1 µ?. El ligando MCP-1 (PeproTech Inc.) se diluyó a 20 nM en solución amortiguadora de quimiotaxis. Para realizar el ensayo, un volumen igual de las diluciones de compuesto de prueba se mezclaron con un volumen igual de células THP-1 etiquetadas (Mezcla 1), y un volumen igual de diluciones de compuesto de prueba se mezcló con un volumen igual de ligando MCP-1 diluido (Mezcla 2) . Ambas mezclas se incubaron independientemente a 37°C durante 10 minutos seguido por agitación suave. La quimiotaxis inducida por MCP-1 se midió entonces en una placa de quimiotaxis (Becton Dickinson) al colocar 50 µ? de la Mezcla 1 en la cámara superior y 225 µ? de la Mezcla 2 en la cámara del fondo. La placa se cubrió con una tapa y se incuba a 37°C durante 30 minutos. 30 minutos más tarde, la placa se leyó en un Cytofluor. Todas las condiciones se probaron por duplicado. Para la señal de determinación de ruido, se colocaron 50 µ? de células THP-1 etiquetadas solas (5xl04/pozo) en la cámara superior y 225 µ? de ligando MCP-1 solo se colocó en la cámara del fondo (concentración final de 10 nM) . La inhibición alcanzada por concentraciones en grado del compuesto de prueba se calculó como un porcentaje del control MCP-1 libre de compuesto. El IC50 se define como la concentración del compuesto de prueba requerida para alcanzar el 50% de inhibición de quimiotaxis celular. Pinzamiento Zonal de Membrana (Patch Clamp) hERG El pinzamiento zonal de membrana de célula completa se usó para medir directamente las corrientes hERG en células HEK-293 que expresan establemente la subunidad a del canal de potasio hERG clonada. El compuesto se probó en una solución amortiguadora acuosa con pH 7.4 a temperatura ambiente. Los pulsos de prueba repetitivos (0.05 Hz) se aplicaron desde un potencial de espera de -80 mV hasta +20 mV durante 2 segundos y las corrientes de la cola se sacan siguiendo los pulsos de prueba por colocado en etapas del voltaje hasta -65 mV. Los efectos del compuesto se calcularon al medir la inhibición de la corriente de cola pico. Pinzamiento Zonal del canal de sodio Se usó el pinzamiento zonal de célula completa para medir directamente las corrientes de sodio que ingresan en células HEK-293 que expresan el canal de sodio cardiaco humano, SCN5A. El compuesto se probó en una solución amortiguadora acuosa libre de proteina. Para determinar la inhibición en estado de estudio, se sacan las corrientes de sodio cada 5 segundos usando el siguiente protocolo de voltaje: las células se mantienen a un potencial de -90 mV y se colocan en etapas a -20 mV por 60 ms . Los efectos se calcularon al medir la inhibición de la corriente pico durante el pulso de prueba hasta -20 mV . Se evaluó la dependencia a la relación de la inhibición por la estimulación a frecuencia de 1 Hz y 4 Hz. Farmacocinética de Dosis Sencilla en Ratas Se usaron ratas Sprague-Dawley (250-300 g) para los estudios farmacocinéticos . Las ratas se ayunaron durante la noche antes de la dosificación PO y se alimentan 4 horas después de la dosis. Se colectaron las muestras de sangre (~0.3 mL) de la vena yugular en tubos que contienen K2EDTA y luego se centrifugan a 4°C ( 1500-2000xg) para obtener el plasma. En un estudio de biodisponibilidad oral, 2 grupos de animales (N=2-3 por grupo) reciben el compuesto de prueba ya sea como una infusión intravenosa (IV) (durante 10 min) por medio de la vena yugular o por alimentación oral. Se obtienen muestras sanguíneas en serie a 0.17 (sólo para IV) , 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 4, 6, 8, y 24 h después de la dosis. Las muestras de plasma, obtenidas por centrifugación a 4°C (1500-2000xg) , se almacenaron a -20°C hasta el análisis por CL/EM/E . Farmacocinética de Dosis Sencilla en Monos La farmacocinética de varios compuestos de prueba se evaluaron en monos cinomólogos macho en un diseño de cruza. Los monos se hicieron ayunar durante la noche antes de la dosificación PO y se alimentan 4 horas después de la dosificación. Un grupo de 1-3 animales (3 a 5 kg) reciben el compuesto por infusión IV (durante 10 minutos) por medio de la vena femoral y por alimentación oral, con lavados de 1 semana entre los tratamientos. Las muestras sanguíneas en serie (-0.3 mL) se colectaron de la arteria femoral a 0.17 (sólo IV) , 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 4, 6, 8, y 24 h después de la dosis, y se centrifugan a 4°C ( 1500 - 2000 xg ) para obtener plasma. Las muestras se almacenaron a -20°C hasta el análisis por CL/EM/EM. Análisis de Datos para ensayos farmacocinéticos Los parámetros farmacocinéticos se obtienen por análisis sin compartimientos de la concentración de plasma contra datos de tiempo (software KINETICA™, Versión 4.2, InnaPhase Corporation, Filadelfia, ??) . La concentración pico (Cmax) y el tiempo para Cmax se registraron directamente de observaciones experimentales. El área bajo la curva del tiempo cero para el último tiempo en muestra (AUC(O-T) ) se calculó usando una combinación de sumas lineales y trapezoidales log. La liberación de plasma total (CLTp), volumen de distribución en estado de estudio (Vss) , vida media de eliminación aparente (Tl/2) y tiempo de residencia media (MRT) se estimaron después de la administración IV. Las estimaciones de Tl/2 se hicieron usando un mínimo de 3 puntos con concentraciones cuant i f icables . La biodisponibilidad oral absoluta (F) se estimó como la relación de valores AUC normalizados por dosis después de las dosis oral e IV. Abajo se encuentran datos para cada compuesto como se mide en los ensayos descritos arriba.
Tabla 10. Datos Comparativos In Vitro Tabla lia. Datos Comparativos Adicionales In Vitro pinzamiento zonal IC50 de pinzamiento zonal de membrana del Compuesto quimiotaxis CCR2 de membrana hERG canal Na+ (nM) (% Inhib.) (% Inhib.) Ejemplo 2k 52%, 10,000 nM 0.24 ± 0.16 (12) 83%, 10,000 nM WO2005021500 90%, 30,000 nM Ejemplo 8a 22%, 10,000 nM 2.63 ± 1.24 (4) 4%, 10,000 nM O2005021500 49%, 30,000 nM Ejemplo 9c, 19%, 10,000 nM 0.21 4%, 10,000 nM WO2005021500 39%, 30,000 nM Ejemplo 1, 12%, 10,000 nM Presente 0.75 ± 0.42 (16) 29%, 30,000 nM 19%, 30,000 nM Invención Tabla 11b. Datos Farmacocinéticos In Vivo Comparativos n la Rata Tabla 11c. Datos Farmacocinéticos In Vivo Comparativos en 1 Mono Compuesto Dosis IV/PO Cl (mL/min/kg) F% AUC Oral (mg/kg) (nM*h) Ejemplo 2k 1 / 1.4 25 46 862 WO2005021500 Ejemplo 8a 1 / 11 14 9.4 1896 WO2005021500 Ejemplo 9c, 1 / 10 12 26 6763 WO2005021500 Ejemplo 1, 1 / 1 12 95 2352 Presente Invención UTILIDAD Los compuestos representativos de los ejemplos se muestra que son moduladores de la actividad del receptor de quimiocina usando ensayos conocidos por aquellos expertos en el arte. En esta sección, se describen estos ensayos y se dan sus referencias en la literatura. Más ensayos se describen en la presente en la sección titulada "Características Farmacológicas Comparativas", supra. Al exhibir la actividad en estos ensayos del antagonismo de MCP-1, los compuestos de los ejemplos se espera que sean útiles en el tratamiento de enfermedades humanas asociadas con las quimiocinas y sus receptores similares. La definición de actividad en estos ensayos es un compuesto que demuestra un IC50 de 30 µ? o inferior en la concentración, cuando se mide en un ensayo particular . Antagonismo del enlace MCP-1 al PBMC humano. (Yoshimura et al., J. Immunol . 1990, 145, 292) Al menos unos compuestos descritos en los ejemplos tienen actividad en el antagonismo del enlace MCP-1 al PBMC humano (células mononucleares de sangre periférica humana) aquí descritas . Se tratan placas con filtros Millipore (#MABVN1250) con 100 µ? de solución amortiguadora de enlace (albúmina de suero de bovino al 0.5%, solución amortiguadora 20 mM HEPES y cloruro de magnesio 5mM en medio RPMI 1640) durante treinta minutos a temperatura ambiente. Para medir el enlace, 50µ1 de solución amortiguadora de enlace con o sin un compuesto de concentración conocida se combinan con 50µ1 de MCP-1 humano etiquetado con 125-I (para dar una concentración final de radioligando 150pM) y 50µ1 de solución amortiguadora de enlace que contiene 5xl05 células. Las células usadas para tales ensayos de enlace pueden incluir células mononucleares de sangre periférica humana aisladas por centrifugación con gradiente Ficoll-Hypaque, monocitos humanos (Weiner et al., J. Immunol. Methods . 1980, 36, 89), o la linea celular THP-1 que expresa el receptor endógeno. La mezcla de compuesto, células y radioligando se incuban a temperatura ambiente por treinta minutos. Se colocan las placas en un múltiple a vacio, se aplica vacío, y las placas se lavan tres veces con solución amortiguadora de enlace que contiene 0.5M NaCl . La cubierta plástica se retira de la placa, se deja secar la placa al aire, se perforan los pozos y se cuentan. El porcentaje de inhibición de enlace se calcula usando las cuentas totales obtenidas en ausencia de cualquier compuesto en competencia y el enlace de respaldo determinado por la adición de 100 nM MCP-1 en lugar del compuesto de prueba.
Antagonismo de la entrada de flujo de Calcio Inducida por MCP-1 (Sullivan et al. Methods Mol. Biol., 114, 125-133 (1999) Al menos uno de los compuestos descritos en los ejemplos tiene actividad en el antagonismo del ensayo de la entrada de flujo de calcio inducido por MCP-1 aqui descrito. Se mide la movilización de calcio usando un colorante indicador de Ca2+ fluorescente, Fluo-3. Se incuban las células a 8 X 105 células/ml en solución salina amortiguadora de fosfato que contiene albúmina de suero de bovino al 0.1%, solución amortiguadora 20 mM HEPES, glucosa 5mM, suero de bovino fetal al 1%, 4 µ? Fluo-3AM y probenecid a 2.5 mM por 60 minutos a 37°C. Las células usadas para tales ensayos de calcio pueden incluir monocitos humanos aislados como se describe por Weiner et al., J. Immunol. Methods, 36, 89-97 (1980) o lineas celulares que expresan el receptor endógeno CCR2 tal como THP-1 y MonoMac-6. Luego se lavan las células tres veces en solución salina amortiguada de fosfato que contiene albúmina de suero de bovino 0.1%, 20mM HEPES, glucosa 5 mM y 2.5 mM de probenecid. Se vuelven a suspender las células en solución salina amortiguadora de fosfato que contiene albúmina de suero de bovino 0.5%, 20 mM HEPES y probenecid 2.5 mM a una concentración final de 2-4 X 106 células/ml. Se colocan en placas las células en microplacas de pared negra de 96 pozos ( ???µ?/pozos ) y se centrifugan las placas a 200 x g por 5 minutos. Se agregan concentraciones diversas de compuesto a los pozos (50 µ?/pozos) y después de 5 minutos se agregan 50µ1/???? de MCP-1 para dar una concentración final de ????. Se detecta la movilización de calcio al usar un lector de placas de imagen fluorescente. La monocapa de células se excita con un láser de argón (488 nM) y se mide la fluorescencia asociada con la célula durante 3 ^minutos, (cada segundo durante los primeros 90 segundos y cada 10 segundos durante los siguientes 90 segundos). Se generan los datos como unidades de fluorescencia arbitraria y el cambio en la fluorescencia para cada pozo se determina como un diferencial máximo-mínimo. La inhibición dependiente del compuesto se calcula con relación a la respuesta de MCP-1 solamente . Antagonismo de la Quimiotaxis PBMC humana inducida por MCP-1 (Bacon et al., Brit. J. Pharmacol. 1998, 95, 966) Al menos unos compuestos descritos en los ejemplos tienen actividad en el antagonismo del ensayo de quimiotaxis PBMC humana inducido por MCP-1 aquí descrito. La cámara de quimiotaxis de 96 pozos MBA96 Neuroprobe, la placa de 96 pozos Polyfiltronics MPC, y los filtros de 8 mieras de PFD5 de policarbonato libre con polivinilpirrolidona Neuroprobe se entibian en un incubador de 37°C. Las células Mononucleares de Sangre Periférica Humanas (PBMCs, por sus siglas en inglés) (Boyum et al., Scand. J. Clin Lab Invest. Suppl. 1968, 97, 31), aisladas recientemente por medio del método de separación de densidad ficoll, se suspenden en D EM a 1 X 107 c/ml y se calentaron a 37 °C. Una solución 60n de MCP-1 humano también se calienta a 37 °C. Se hacen diluciones del compuesto de prueba a 2x la concentración necesaria en DMEM. La suspensión PBMC y la solución 60nM MCP-1 se mezclan 1:1 en tubos de polipropileno con DMEM precalentado con o sin una dilución de los compuestos de prueba. Estas mezclas se calientan en un calentador de tubos de 37 °C. Para comenzar con el ensayo, se agrega a la mezcla MCP-l/compuesto en los pozos de la placa de pozo Polyfiltronics MPC 96 que se ha colocado en la parte inferior de la cámara de quimiotaxis Neuroprobe. El volumen aproximado es de 400µ1 para cada pozo y debe haber un menisco positivo después de dosificar. El filtro de 8 micrones se coloca suavemente en la parte superior de la placa de 96 pozos, se coloca una empaquetadura de hule al fondo de la cámara superior y se ensambla la cámara. Un volumen de 200µ1 de la mezcla de compuesto/suspensión de células se agrega a los pozos adecuados de la cámara superior. Se cubre la cámara superior con un sellador de placas y se coloca la unidad ensamblada en un incubador de 37°C por 45 minutos. Después de la incubación se retira el sellador de placas y toda la suspensión celular restante se aspira completamente. Se desensambla la cámara y el filtro se retira suavemente.
Mientras se mantiene el filtro en un ángulo de 90 grados, se lavan completamente las células sin migrar usando una corriente suave de solución salina amortiguada de fosfato y la parte superior del filtro se limpia con la punta de un escobillón de hule. Se repite ese lavado dos veces más. Se seca al aire el filtro y luego se sumerge completamente en una tinción Wright Geimsa por 45 segundos. Luego se lava el filtro al sumergir en agua destilada por 7 minutos y luego un lavado adicional de 15 segundos en agua fresca destilada. El filtro se seca al aire nuevamente. Las células migradas al filtro se cuantifican por microscopía visual. Los receptores de quimiocina de mamífero proporcionan un objetivo para interferir con o promover la función de células inmunes en un mamífero, tal como un humano. Los compuestos que inhiben o promueven la función del receptor de quimiocina son particularmente útiles para la modulación de la función de células inmunes para propósitos terapéuticos. De esta manera, la presente invención se dirige a compuestos que son útiles en la prevención y/o tratamiento de una amplia variedad de trastornos y enfermedades inflamatorias, infecciosas, e inmunoreguladoras , incluyendo enfermedades alérgicas y asma, infección por microbios patogénicos (los cuales, por definición, incluyen virus) así como patologías autoinmunes tales como la artritis reumatoide y la ateroesclerosis . Por ejemplo, un compuesto actual que inhibe una o más funciones de un receptor de quimiocina mamífero (por ejemplo, un receptor humano de quimiocina) se puede administrar para inhibir (esto es, reducir o evitar) la inflamación o enfermedad infecciosa. Como resultado, uno o más procesos inflamatorios, tales como la migración de leucocitos, adhesión, quimiotaxis, exocitosis, (por ejemplo, de enzimas, histaminas) o liberación del mediador inflamatorio, se inhibe.
Similarmente, un compuesto actual que promueve una o más funciones del receptor mamífero de quimiocinas (por ejemplo, una quimiocina humana) cuando se administra para estimular (inducir o mejorar) una respuesta inmune o inflamatoria, tal como la migración de leucocitos, adhesión, quimiotaxis, exocitosis, (por ejemplo, de enzimas, histaminas) o liberación del mediador inflamatorio, resultan en la estimulación benéfica de los procesos inflamatorios. Por ejemplo, los eosinófilos se pueden reclutar para combatir infecciones de parásitos. Además, el tratamiento de las enfermedades alérgicas y autoinmunes inflamatorias antes mencionadas, también se puede contemplar para un compuesto actual que promueve una o más funciones del receptor mamífero de quimiocinas si se contempla a la administración de compuesto suficiente para provocar la pérdida de la expresión del receptor en células a través de la inducción de la internalización del receptor de quimiocinas, o el suministro de un compuesto en una forma que resulte en la dirección equivocada de la migración de células. Además de los primates, tales como los humanos, se puede tratar una diversidad de otros mamíferos de conformidad con el método de la presente invención. Por ejemplo, mamíferos que incluyen pero no se limitan a, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejillos de indias, ratas u otros bovinos, especies ovinas, equinas, caninas, felinas, roedores o murinas, se pueden tratar. Sin embargo, el método también se puede practicar en otras especies tales como especies de aves. El sujeto tratado en los métodos anteriores es un mamífero, macho o hembra, en quien la modulación de la actividad del receptor de quimiocinas se desea. La "modulación" como se usa en la presente, pretende antagonismo, agonismo, antagonismo parcial y/o agonismo parcial. Enlace de CCR5 y ensayos funcionales Derivación celular y cultivo celular: Un grupo de células HT1080 que expresan establemente el receptor 5 de quimiocina CC endógena (CCR5) se desarrolló usando los métodos resumidos por Harrington, Sherf and Rundlett (ver Patentes de Estados Unidos US 6,361,972 y US 6,410,266). Los clones que se expresaron más altos se aislaron usando citometría de flujo repetitivo, seguido por sub-clonación . Estas células luego se cultivaron en placas de 6 pozos a células 3 x 105/pozo y se transfirieron con un vector de ADN que contiene el Gqi5 de proteína HA-etiquetada G quimérica (Molecular Devices; 5 microgramos del ADN de vector linealizado en 15 microl de Ex-Gen de Fermentes usados para la transíección) . Dos días después de la transfección, los pozos se combinaron y se colocaron en P100 placas. Siete días después de colocarse en placas, las colonias se pincharon, se expandieron y se analizaron por Gqi5 contenido por Western blot. Un clon (designado como 3559.1.6) que tiene alta expresión de Gqi5 (de transfección) y de CCR5 (endógeno) se selecciona y se uso para los experimentos descritos a continuación. Las células HT1080 (clon 3559.1.6) se cultivaron con alfa-MEM suplementado con 10% de suero de bovino fetal . dializado, 2% de penicilina/estreptomicina/glutamina y 500 migrogramo/ml de higromicina B (concentración final) a 37 °C con 5% de C02 en una atmósfera humidificada . Preparación de membranas: Un granulado celular que contiene 1 x 108 células HT1080 (clon 3559.1.6) se resuspendió en 5 mi de solución amortiguadora preparativa de membrana enfriada en hielo (50 mM HEPES, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2) y se homogenizó a alta velocidad en un homogenizador Politron durante 20 segundos en hielo. El homogeneizado se diluyó con otros 25 mi de solución amortiguadora preparativa de membrana y se centrifugó durante 12 minutos (48,000 x g a 4°C). El granulado celular se resuspendió en 5 mi de solución amortiguadora preparativa de membrana antes de rehomogenizarse como se describe previamente. El homogeneizado se diluyó con 5 mi de solución amortiguadora preparativa de membrana y se ensayó por la concentración de la proteina CCR5. Ensayo de enlace: El homogeneizado recientemente preparado de la preparación de la membrana descrita arriba se diluyó en la solución amortiguadora de enlace (50 mM HEPES, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.1% de BSA; una tableta de inhibidor de proteasa completa se agregó antes del ensayo) para llevar a cabo una concentración de la proteina final de 10 microgramos/pozo (placas de 96 pozos de sólido blanco de Corning, Inc.). Esta preparación de la membrana se mezcló con perlas WGA-SPA (Amershsam; se pre-remojó en solución amortiguadora de enlace) para dar una concentración de 200 microgramos/pozo. La mezcla membrana/perla SPA (100 microlitros/pozo) luego se agregó a una placa que se pre-punteo con 2 microlitros de D SO que contienen diversas concentraciones de artículos de prueba (DMSO puro para el control negativo; diversas concentraciones de los ejemplos de esta invención para los artículos de prueba; 500 nM MIP-1 beta como un control positivo) . El ensayo de enlace se inició a través de la adición de 50 microlitros de [125I]-MIP-1 beta (Perkin Elmer; material se diluyó en solución amortiguadora de enlace tal que la adición de 50 microlitros/pozo dio una concentración final de 0.1 nM [125I]-MIP-1 beta). La placa se selló y se permitió mantener a temperatura ambiente durante 4-6 horas antes de contarse en un Packard TopCount. El porcentaje de enlace para el artículo reprueba se calculó, usando controles negativos y positivos para definir la ventana para cada experimento. Ensayo Funcional basado en el Lector de placa formadora de imágenes fluorométrica (FLIPR) : Las células HT1080 (clón 3559.1.6) se colocaron en 10,000 células/pozo (30 microlitros) en placas de 384 pozos (fondo negro/claro Biocoat PDL, Beckton Dickinson) y se cargaron con 30 microlitros/pozo del teñido fluorescente Fluro-4 AM (preparado por disolver 1 mg de Fluro-4 AM en 440 microlitros de DMSO y se diluyó con 100 microlitros de solución plurónica antes de diluirse además con 10 mi de solución amortiguadora Hanks) . Las células se incubaron a 37 °C con 5% de C02 durante 30 minutos antes de lavarse tres veces y suspenderse en solución amortiguadora de ensayo (20 mM HEPES, 1.2 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 2.5 mM Probenecid, 0.5% de BSA, lx Hanks). El artículo de prueba se diluyó en serie en DMSO y luego se diluyó 1:10 con solución amortiguadora de ensayo antes de agregarse a las células (10 microlitros/opzo) . Usando FLIPR, las placas se leyeron (10-17 segundos) para la inducción de flujo (esto es, actividad agonista) . Las células además se cargaron con solución agonista (30 microlitros/pozo, se prepararon por diluir 30 micrones de 100 microMolar MIP-1 beta en 100 mi de solución amortiguadora de ensayo; este protocolo liberó una concentración final de 5 nM MIP-1 beta en el ensayo) y las placas se leyeron usando FLIPR durante un minuto. La actividad antagonista del articulo de prueba se determinó relativo hasta 0.4% de DMSO/control negativo de solución amortiguadora. Al menos un compuestos de la descripción es un inhibidor de ambos CCR2 y CCR5 y puede usarse para tratar enfermedades asociadas con ya sea quimiocina. Los compuestos de la presente invención se consideran a antagonistas duales. Las enfermedades o condiciones de humanos u otras especies que se pueden tratar con promotores de la función del receptor de quimiocinas incluyen, pero no se limitan a: enfermedades y condiciones inflamatorias o alérgicas, incluyendo enfermedades alérgicas respiratorias tales como asma, rinitis alérgica, enfermedades de hipersensibilidad de pulmón, neumonitis de hipersensibilidad, celulitis eosinofilica (por ejemplo, síndrome de Well) , neumonías eosinofílicas (por ejemplo, síndrome Loeffler, neumonía eosinofilica crónica) , fascitis eosinofilica (por ejemplo, síndrome de Shulman) , hipersensibilidad de tipo retrasado, enfermedades del pulmón intersticial (ILD) (por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática o ILD asociado con artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, polimiositis o dermatomiositis ) ; anafilaxis sistémica o respuestas de hipersensibilidad, alergias a fármacos (por ejemplo, a penicilina, cefalosporinas ) , síndrome de mialgia- eosinofilia debido a la ingestión de triptofano contaminado, alergias a picaduras de insectos; enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide, artritis psoriática, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, miastenia gravis, diabetes de comienzo juvenil; glomerulonefritis, tiroiditis autoinmune, enfermedad de Behcet, rechazo de injerto (por ejemplo, en transplantes) , incluyen rechazo de aloinjertos o enfermedad de injerto contra hospedero, enfermedades inflamatorias del intestino, tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerante, espondiloantropatias ; escleroderma; psoriasis (incluyendo psoriasis mediada por células T) y dermatosis inflamatoria tal como en dermatitis, eczema, dermatitis atópica, dermatitis de contacto alérgica, urticaria; vasculitis (por ejemplo, vasculitis necrotizante, cutánea, e hipersensibilidad) ; miositis eosinofilica , fasciitis eosinofilica, cánceres con infiltración de leucocitos de la piel u órganos. Otras enfermedades o condiciones en las cuales las respuestas inflamatorias indeseables se van a inhibir y pueden tratarse, incluyen, pero no se limitan a, vasculitis, placas vulnerables, lesión por reperfusión de hiperplasia neointima venosa, hiperplasia neointima de injerto en diálisis, hiperplasia intima de desviación artio-venosa, ateroesclerosis , ciertas malignidades hematológicas , toxicidad inducida por citocinas (por ejemplo, choque séptico, coche endotóxico) , polimiositis , dermatomiositis . Las enfermedades o condiciones infecciosas del humano o de otras especies que se pueden tratar con inhibidores de la función del receptor de quimiocina, incluyen, pero no se limitan a, VIH. Las enfermedades o condiciones de humanos u otras especies que se pueden tratar con promotores de la función del receptor de quimiocinas incluyen, pero no se limitan a: inmunodepresión, tal como aquella en individuos con síndrome de inmunodeficiencia tal como el SIDA u otras infecciones virales, individuos que se someten a terapia de radiación, quimioterapia, terapia para enfermedad autoinmune o terapia de fármacos (por ejemplo, terapia de corticosteroides ) , que provoca la inmunosupresión, inmunosupresión debido a la deficiencia congénita en la función del receptor u otras causas; y enfermedades infecciosas tales como enfermedades de parásitos que incluyen, pero no se limitan a infecciones por helmintos, tal como nemátodos (gusanos redondos) (Trichuriasis , Enterobiasis, Ascariasis, Gusano de gancho, Strongiloidiasis, Triquinosis, filariasis) ; tremátodos, (gusanos planos), ( Schistosomiasis , Clonorchiasis ) , céstodos (gusanos truncos) , (Echinococcosis, Taeniasis sagiata, Cysticercosis ) ; gusanos viscerales, migrañas por larvas viscerales (por ejemplo, Toxocara), gastroenteritis eosinofílica (por ejemplo, especies Anisaki, Phocanema), migrañas de larva cutánea (Anilostona braziliense, Ancilostoma caninum) . Los compuestos de la presente invención son, de esta manera, útiles en la prevención y tratamiento de una amplia variedad de trastornos y enfermedades inflamatorias infecciosas e inumunoreguladoras . Además, el tratamiento de las enfermedades inflamatorias, alérgicas y autoinmunes antes mencionadas, también se puede contemplar para los promotores de la función del receptor de quimiocinas, si se contempla la administración de un compuesto suficiente para provocar la pérdida de la expresión del receptor en las células a través de la inducción de la internalización del receptor de quimiocina o la administración de un compuesto en una forma que resulte en una mala dirección de la migración de células. En otro aspecto, la invención actual se puede usar para evaluar los agonistas o antagonistas específicos supuestos de un receptor acoplado a la proteína G. La presente invención se dirige al uso de estos compuestos en la preparación y ejecución de ensayos de separación por exclusión para compuestos que modulan la actividad de los receptores de quimiocinas. Adicionalmente, los compuestos de esta invención son útiles en establecer o determinar el sitio de enlace de otros compuestos a los receptores de quimiocina, por ejemplo, por la inhibición competitiva o como una referencia del ensayo para compartir su actividad conocida a un compuesto con una actividad desconocida. Cuando se desarrollan nuevos ensayos o protocolos, los compuestos de conformidad con la presente invención se pueden usar para probar su efectividad. Específicamente, tales compuestos se pueden suministrar en un kit comercial, por ejemplo, para su uso en investigación farmacéutica que involucre las enfermedades antes mencionadas. Los compuestos de la invención actual también son útiles para la evaluación de moduladores específicos supuestos de los receptores de quimiocinas. Además, se pueden utilizar compuestos de esta invención para examinar la especificidad de los receptores acoplados a la proteína G, que no se piensa que sean receptores de quimiocinas, ya sea que sirvan como ejemplos de compuestos que no se enlazan o como variantes estructurales de tales de compuestos activos en estos receptores que puedan ayudar a definir los sitios específicos de interacción. Los compuestos descritos en la presente son útiles para tratar o prevenir trastornos seleccionados de artritis reumatoide, osteoartritis , choque séptico, ateroesclerosis , aneurisma, fiebre, efectos cardiovasculares, choque hemodinámico, síndrome de sepsis, lesión por reperfusión postisquémica, malaria, enfermedad de Crohn, enfermedades inflamatorias del intestino, infección micobacteriana, meningitis, psoriasis, insuficiencia cardiaca congestiva, enfermedades fibróticas, caquexia, rechazo de injerto, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias de la piel, esclerosis múltiple, daño por radiación, lesión alveolar hiperóxica, VIH, demencia por VIH, diabetes mellitus no dependiente de insulina, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, fibrosis pulmonar idiopática, penfigoide buloso, infecciones de parásitos helmínticos, colitis alérgica, eczema, conjuntivitis, transplante, eosinofilia familiar, celulitis eosinofilica, neumonías eosinofilicas , fasciitis eosinofílica, gastroenteritis eosinofílica , eosinofilia inducida por fármacos, fibrosis cística, síndrome de Churg-Strauss, linfoma, enfermedad de Hodgkin, carcinoma colónico, síndrome de Felty, sarcoidosis, uveitis, Alzheimer glomerulonefritis, y lupus eritematoso sistémico, carcinoma de células escamosa esofagal, dolor neuropático y obesidad. En otro aspecto, los compuestos son útiles para tratar o prevenir trastornos inflamatorios seleccionados de artritis reumatoide, osteoartirtis , ateroesclerosis , aneurisma, fiebre, efectos cardiovasculares, enfermedad de Crohn, enfermedades inflamatorias del intestino, psoriasis, insuficiencia cardiaca congestiva, esclerosis múltiple, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias de la piel. En otro aspecto, los compuestos se usan para tratar o prevenir trastornos inflamatorios seleccionados de artritis reumatoide, osteoartritis, ateroesclerosis, enfermedad de Crohn, enfermedades inflamatorias del intestino, y esclerosis múltiple.
En otro aspecto, los ejemplos descritos en la presente pueden ser útiles para el tratamiento de una variedad de cánceres, incluyendo, pero no limitando a los siguientes: Carcinoma incluyendo a aquel de la vejiga (incluyendo cáncer de vejiga metastática y acelerada), mama, colón (incluyendo cáncer colorectal) , riñon, hígado, pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de célula pequeña y no pequeña y adenocarcinoma de pulmón) , ovario, próstata, testículos, tracto genitourinario, sistema linfático, recto, laringe, páncreas (incluyendo carcinoma pancreático exocrino), esófago, estómago, vesícula biliar, matriz, tiroides y piel (incluyendo carcinoma de célula escamosa) ; Tumores hematopoyéticos de línea linfoide incluyendo ¦leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma Hodgkin, linfoma de no Hodgkin, linfoma de célula vellosa, linfoma histiocítico y linfoma de Burketts; Tumores hematopoyéticos de línea mieloide incluyendo leucemias mielógenas agudas y crónicas, síndrome mielodisplástico, leucemia mieloide y leucemia promielocítica ; Tumores del sistema nervioso central y periférico que incluyen astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; Tumores de origen mesenquimal que incluyen fibrosarcoma, rabdomioscarcoma y osteosarcoma; y Otros tumores que incluyen melanoma, xenoderma pigmentoso, ceratoactantoma , seminoma, cáncer folicular de tiroides y teratocarcinoma . En otra modalidad, se describe en la presente los métodos para tratar cáncer, en donde el cáncer se selecciona de cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de próstata y melanoma. Adicionalmente , los compuestos descritos en la presente pueden ser útiles en el tratamiento de cáncer de ovario y mieloma múltiple . La presente invención proporciona métodos para el tratamiento de una variedad de enfermedades proliferativas no cancerosas . La terapia combinada para prevenir y tratar trastornos y enfermedades inflamatorias, infecciosas e inmunoreguladoras incluyen enfermedades alérgicas y asma, así como patologías autoinmunes tales como artritis reumatoide y ateroesclerosis , y aquellas patologías antes señaladas, se ilustran por la combinación de los compuestos de esta invención y otros compuestos que se conocen para tales utilidades. Por ejemplo, en el tratamiento o prevención de inflamación, los compuestos actuales se pueden usar en conjunto con un agente analgésico o anti-inflamatorio tal como un agonista opiáceo, un inhibidor de lipoxigenasa , un inhibidor de ciclooxigenasa 2, un inhibidor de interlucina, tal como un inhibidor de interleucina 1, un inhibidor del factor de necrosis de tumor, un antagonista NMDA, un inhibidor del óxido nítrico o un inhibidor de la síntesis de óxido nítrico, un agente inflamatorio no esteroidal, un inhibidor de fosfodiesterasa, o un agente anti-inflamatorio supresor de la citoquina, por ejemplo, con un compuesto tal como acetominofen, aspirina, codeina, fentainil, ibuprofeno, indometacina, cetorolaco, morfina, naproxeno, fenacetina, piroxicam, un analgésico esteroidal, sufentanil, sunlindac, interferón alfa y similares. Similarmente, los compuestos actuales se pueden administrar con un aliviador del dolor; un potenciador tal como la cafeína, un antagonista H2, simeticona, hidróxido de aluminio o magnesio, un descongestionante tal como fenilefrina, fenilpropanolamina, seudofedrina, oximetazolina, efinefrina, nafazolina, xilometazolina, propilhexedrina , o levodesoxi-efedrina, un antitusivo tal como codeina hidrocodona, caramifen, carbetapentano, o dextrametorfano; un diurético; y un antihistamínico sedante o no sedante. Similarmente, los compuestos descritos en la presente se pueden usar en combinación con otros fármacos que se usan en el tratamiento/prevención/supresión o mejora de las enfermedades o condiciones para las cuales son útiles el compuesto de la presente invención. Se pueden administrar tales otros fármacos por una ruta y en una cantidad comúnmente usadas por lo tanto, contemporáneamente o secuencialmente con un compuesto de la presente invención. Cuando un compuesto de la presente invención se usa contemporáneamente con uno o más de otros fármacos, una composición farmacéutica que contiene tales otros fármacos además del compuesto de la presente invención se puede usar. En consecuencia, las composiciones farmacéuticas incluyen aquellas que también contienen uno o más de otros ingredientes activos, además de un compuesto de la presente descripción. Los ejemplos de otros ingrediente activos que se pueden combinar con un compuesto de la presente invención, administrado separadamente o en las mismas composiciones farmacéuticas, incluyen, pero no se limitan a: (a) antagonistas de integrina tales como aquellos para selectina, ICAMs y VLA-4, (b) esteroides tal como beclometasona, metilprednisolona, betametasona , prednisona, dexametasona e hidrocortisona, (c) inmunodepresores tales como ciclosporina, tacrolimus, rapamicina y otros inmunodepresores del tipo FK-506: (d) antihistaminicos (antagonistas de la histamina Hl) tales como bromofeniramina, clorfeniramina, dexclorfeniramina, triprolidina, clemastina, difenhidramina , difenilpiralina, tripelenamina, hidroxizina, metdilazina, prometazina, trimeprazina , azatadina, ciproheptadina, antazolina, feniramina, pirilamina, astemizol, terfenadina, loratadina, cetirizina, fexofenadina, descarboetoxiloratadina, y similares; (e) antiasmáticos no esferoidales tales como agonistas b2 (terbutalina, metaproterenol , fenoterol, isoetarina, albuteral, bitolterol, y pirbuteril) , teofilina, cromolina sodio, atropina, bromuro de ipratropio, antagonistas de leucotrieno ( zafirlucast , montelucast, pranlucast, iralucast, pobilucast, SKB-102, 203) , inhibidores de la biosintesis leucotrieno (zileuton, BAY-1005) ; (f) agentes anti-inflamatorios no esteroidales (NSAIDs) tal como derivados del ácido propiónico, (alminoprofeno, benxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indoprofeno, cetoprofeno, miroprofeno, naproxeno, oxaprozino, pirprofeno, pranoprofeno, suprofeno, ácido tiaprofénico y tioxaprofeno) derivados del ácido acético ( indometacina , acemetacina, alclofenac, clidanac, diclofenaco, fenclofenaco, ácido fenclózico, fentiazaco, furofenaco, ibufenaco, isoxepaco, oxipinaco, sulindaco, tiopinaco, tolmetino, idometacina, y zomepiraco) , derivados de ácido fenámico (ácido flufenámico, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, ácido niflúmico, y ácido tolfenámico) , derivados de ácido bifenilcarboxilico (diflunisal y flufenisal) oxicamos (isoxicam, piroxicam sudoxicam y tenoxican) , salicilatos (ácido acetil salicilico, sulfasalazina) y las pirazolonas (apazona, bezpiperilon, feprazona, mafebutazona, oxifenbutazona, fenilbutazona) ; (g) inhibidores de cicloxigenasa-2 (COX-2); (h) inhibidores de la fosfodiesterasa de tipo IV (PDE-IV) ; (I) otros antagonistas de los receptores de quimiocinas ; (j) agentes reductores del colesterol tales como inhibidores de la HMG-COA reductasa (lovastatina, simvastatina y pravastatina, fluvastataina, atorvastatina, y otras estatinas) , secuestrantes (cloestiramina y colestipol), ácido nicotinico, derivados del ácido fenofibrico (gemfibrozil, clofibrat, fenofibrato y benzafibrato) , y probucol; (k) agentes antidiabéticos tales como insulina, sulfonilureas , biguanidas (metformina) , inhibidores de a-glucosidasa (acarbosa) y glitazonas ( troglitazona y pioglitazona) ; (1) preparaciones de interferones (interferón alfa-2a, interferón 2B, interferón alfa-N3, interferón beta-la, interferón beta-lb, interferón gamma-Ib) ; (m) compuestos antivirales tales como efavirenz, nevirapina, indinavir, ganciclovir, lamivudina, famciclovir, y zalcitabina; (o) otros compuestos tales como el ácido 5-aminosalicílico y profármacos del mismo, antimetabolitos tales como azatioprina y 6-mercaptopurina, y agentes quimioterapéuticos para el cáncer citotóxico. La relación en peso del compuesto de la presente invención al segundo ingrediente activo se puede variar, y dependerá de las dosis efectivas de cada ingrediente. Generalmente, se usará una dosis efectiva de cada uno.
Asi, por ejemplo, cuando un compuesto se combina con un NSAID la relación en peso del compuesto de la presente invención al NSAID estará generalmente en un intervalo desde alrededor de 1000:1 hasta alrededor de 1:1000, o alternativamente desde alrededor de 200:1 hasta alrededor de 1:200. Las combinaciones de un compuesto de la presente invención y otros ingredientes activos estarán generalmente dentro del intervalo arriba mencionado, pero en cada caso, se debe usar una dosis efectiva de cada ingrediente activo. En el tratamiento de cáncer, una combinación de agentes quimioterapéuticos y/o otros tratamientos (por ejemplo, terapia de radiación) es ventajoso a menudo. El segundo agente (o tercero) puede tener el mismo o diferente mecanismo de reacción que el primer agente terapéutico. Esto puede ser especialmente útil para emplear combinaciones de fármaco citotóxicas en donde dos o más fármacos administrados actúan en diferentes maneras o en diferentes fases del ciclo celular y/o en donde los dos o más fármacos tiene sobre expresión de efectos laterales o tóxicos y/o en donde los fármacos se combinan cada uno demostrando eficacia en el tratamiento de los estados de las enfermedades particulares manifestadas por el paciente. En consecuencia, los compuestos descritos en la presente (o otras fórmulas descritas en la presente) pueden administrarse en combinación con otros agentes anti-cáncer y citotóxicos y tratamientos útiles en el tratamiento de cáncer u otras enfermedades proliferativas . La invención en la presente además comprende el uso de los compuestos de la presente (u otras fórmulas descritas en la presente) , en la preparación de medicamentos para el tratamiento de cáncer, y/o estos comprenden el empaquetamiento de los compuestos de la presente junto con las instrucciones que los compuestos utilicen en combinación con otro agentes anti-cáncer o citotóxico y para el tratamiento de cáncer. La presente invención además comprende las combinaciones de los compuestos de y uno o más agentes adicionales en forma de kit, por ejemplo, en donde estos se empacan juntos o se colocan en paquetes separados para venderse juntos como un kit, o en donde estos se empacan para formularse juntos. El segundo agente anti-cáncer (o más) pueden seleccionarse de cualquiera uno o más de los siguientes: agentes alquilantes (incluyendo mostaza de nitrógeno, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas , derivados de etilenimina, y triazenos) ; anti-angiogénicos (incluyendo inhibidores de metaloproteinasa de matriz); antimetabolitos (incluyendo inhibidores de deaminasa de adenosina, antagonistas de ácido fólico, análogos de purina y análogos de pirimidina) ; antibióticos o anticuerpos (incluyendo anticuerpos monoclonales ; anticuerpos CTLA-4, antraciclinas ) ; inhibidores de aromatasa; modificadores de la respuesta de ciclo celular; enzimas; inhibidores de transferasa de proteina de farnesilo; agentes hormonales y antihormonales y esteroides (incluyendo análogos sintéticos, glucocorticoides , estrógenos/anti-estrógenos [por ejemplo, SERMs] , andrógenos/anti-andrógenos, progestinas, agonistas del receptor de progesterona, y agonistas y antagonistas [LHRH] de liberación de la hormona luteinizada) ; factor de crecimiento de tipo insulina ( IGF) /moduladores del sistema (IGFR) del receptor del factor de crecimiento de tipo insulina (incluyendo inhibidores IGFR1) ; inhibidores de señal de integrina; inhibidores de cinasa (incluyendo inhibidores de multi-cinasa y/o inhibidores de Src cinasa o Src/abl, inhibidores de [CDK] cinasa dependiente de ciclina, panHer, anticuerpo Her-1 y Her-2, inhibidores VEGF, incluyendo anticuerpos anti-VEGF, inhibidores EGFR, inhibidores [MAP] de la proteina activada con mitogeno, inhibidores MEK, inhibidores de aurora cinasa, inhibidores PDGF, y otros inhibidores de tirosina cinasa o inhibidores de serina/treonina cinasa; agentes disruptores de microtúbulo, tales como ecteinascidinas o sus análogos y derivados; agentes estabilizadores del microtúbulo tales como taxanos y las epotilonas que se presentan naturalmente y sus análogos sintéticos y semi-sintéticos ; agentes de enlace de microtúbulo, desestabilizadores (incluyendo alcaloides vinca) ; e inhibidores de topoisomersa, inhibidores de transferasa de proteina de prenilo; complejos de coordinación de platino; inhibidores de transducción de señal, y otros agentes se usaron como agentes anti-cáncer y citotóxicos tales como modificadores de respuesta biológica, factores de crecimiento y moduladores inmunes. Adicionalmente, los compuestos de la presente invención pueden formarse o co-administrarse con otros agentes terapéuticos que se seleccionan por su utilidad particular para atender los efectos colaterales asociados con las condiciones anteriormentes mencionadas. Por ejemplo, los compuestos de la presente invención pueden formularse con agentes para prevenir náusea, hipersensibilidad e irritación gástrica, tales como antieméticos y antihistaminicos Hi y H2. Los otros agentes terapéuticos de arriba, cuando se emplean en combinación con los compuestos de la presente invención, pueden usarse, por ejemplo, en aquellas cantidades indicadas en el Physicians' Desk Reference (PDR) o como se determina de otra manera por alguien de habilidad ordinaria en el arte. Se administran los compuestos a un mamífero en una cantidad terapéuticamente efectiva. Por "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de un compuesto de la presente invención que, cuando se administra solo o en combinación con un agente terapéutico adicional mamífero, es efectivo para evitar o mejorar la condición de enfermedad tromboembólica o el avance de la enfermedad.
DOSIS Y FORMULACION Los compuestos de esta descripción se pueden administrar en forma de dosis orales tales como tabletas, cápsulas (cada una de las cuales incluye formulaciones de liberación programada o liberación sostenida) , pildoras, polvos, gránulos, elixires, pinturas, suspensiones jarabes y emulsiones. También se pueden administrar en forma intravenosa (bolo o infusión) , intraperitoneal , subcutánea, o intramuscular, todas formas de dosis unitarias bien conocidas para aquellos expertos ordinarios en las técnicas farmacéuticas. Se pueden administrar solas pero generalmente se administrarán con un portador farmacéutico seleccionado sobre la base de la ruta elegida de administración y la práctica farmacéutica estándar. El régimen de dosis para los compuestos de la presente invención, variará, por supuesto, dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente en particular y su modo y ruta de administración; la especie, edad, sexo, salud, condición médica y peso del receptor; la naturaleza y grado de los síntomas; el tipo de tratamiento concurrente; la frecuencia de tratamiento; la vía de administración, la función renal y hepática del paciente, y el efecto deseado. Un médico o veterinario puede determinar y prescribir la cantidad efectiva del fármaco requerido para evitar, contrarrestar, o detener el avance del trastorno.
A manera de guía general, la dosis diaria oral de cada ingrediente activo, cuando se usa para los efectos indicados, estará en un intervalo de entre alrededor de 0.001 hasta 1000 mg/kg de peso corporal, o entre alrededor de 0.01 hasta 100 mg/kg de peso corporal por día, o alternativamente, entre alrededor de 1.0 hasta 20 mg/kg/día. De forma intravenosa, la dosis estará desde alrededor de 1 alrededor de 10 mg/kg/minuto durante una infusión a velocidad constante. Los compuestos de esta invención se pueden administrar en una dosis diaria sencilla, o la dosis diaria total se puede administrar en dosis divididas de dos, tres, o cuatro veces al día. En una modalidad, la dosis oral diaria del ingrediente activo es entre 3 y 600 mg ya sea administrada una vez al día o en dosis dividas administradas dos veces al día. Alternativamente, el ingrediente activo puede administrarse en dosis de 10-20 mg administrado dos veces diarias o 40 hasta 100 mg administrado una vez diaria. Alternativamente, el ingrediente activo puede administrarse en una dosis de 12.5 mg dos veces al día o 75 mg una vez al día. Alternativamente, el ingrediente activo puede administrarse en dosis de 3, 10, 30, 100, 300 y 600 mg administrados ya sea una vez o dos veces al día. Los compuestos de esta invención se pueden administrar en forma intranasal mediante el uso tópico de los vehículos intranasales adecuados o por medio de vías transdermales usando parches transdermales para la piel. Cuando se administran en forma de un sistema de administración trasndermal, la administración de dosis, por supuesto, será continua más que intermitente a través del régimen de dosis. Los compuestos se administran típicamente en mezcla con diluyentes, excipientes o portadores farmacéuticos adecuados (referidos colectivamente en la presente como portadores farmacéuticos) seleccionados adecuadamente con respecto a la forma pretendida de administración, esto es, tabletas orales, cápsulas, elíxires, jarabes y similares, y consistente con las prácticas farmacéuticas convencionales. Por ejemplo, para administración oral en la forma de una tableta o cápsula, el componente de fármaco activo puede combinarse con un portador inerte oral, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, tal como lactosa, almidón, sacarosa, glucosa, metil celulosa, estearato de magnesio, fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, manitol, sorbitol y similares; para administración oral en forma líquida, los componentes de fármaco oral se pueden combinar con cualquier portador inerte, oral, no tóxico, farmacéuticamente aceptable tal como etanol, glicerol, agua, y similares. Además, cuando sea deseado o necesario, se pueden también incorporar en la mezcla aglutinantes adecuados, lubricantes, agentes de desintegración, y agentes colorantes. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa o beta-lacotosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilen glicol, ceras y similares. Los lubricantes usados en estas formas de dosis incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, y similares. Los desintegradores incluyen, sin limitación, almidón, metil celulosa, agar, bentonita, goma de xantano y similares. Los compuestos de la presente invención también pueden administrarse en forma de sistemas de administración de liposomas, tales como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas unilamerales grandes, y vesículas multilamerales . Los liposomas se pueden formar a partir de una variedad de fosfolípidos, tal como colesterol, estearilamina, o fosfatidilcolinas . Los compuestos de la presente invención también se pueden acoplar con polímeros solubles como portadores de fármacos objetivos. Tales polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropilmetacrilamida-fenol, polihidroxietilaspartamidafenol , o polietilenoxido-polilisina sustituidos con residuos de palmitoilo. Adicionalmente, los compuestos de la presente invención se pueden acoplar a una clase de polímeros biodegradables útiles en alcanzar la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros del ácido poliláctico y poliglicólico, poliepsilon, caprolactona, ácido polihidroxi butírico, poliortoésteres , poliacetales, polidihidropiranos, policianoacilatos, y copolímeros de bloque reticulados o antipáticos de hidrogeles. Las formas de dosis (composiciones farmacéuticas) adecuadas para administración pueden contener desde alrededor de 1 miligramo a alrededor de 100 miligramos de ingrediente activo por unidad de dosis. En estas composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo estará ordinariamente presente en una cantidad de alrededor de 0.5-95% de peso con base en el peso total de la composición. Las cápsulas de gelatina pueden contener el ingrediente activo y portadores pulverizados, tales como lactosa, almidón, derivados de celulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico y similares. Se pueden usar diluyentes similares para hacer tabletas comprimidas. Ambas tabletas y cápsulas se pueden fabricar como productos de liberación sostenida para suministrar la liberación continua del medicamento por periodos de horas. Las tabletas comprimidas pueden ser recubiertas con azúcar o recubiertas con película para ocultar cualquier sabor desagradable y proteger la tableta de la atmósfera, o recubiertas de forma entérica para la desintegración selectiva en el tracto gastrointestinal. Las formas de dosis líquidas para administración oral pueden contener coloración y saborización para incrementar la aceptación del paciente. En general, el agua, un aceite adecuado, solución salina, dextrosa acuosa (glucosa) , y soluciones relacionadas de azúcar y glicoles tales como propilen glicol o polietilen glicoles, son portadores adecuados para soluciones parenterales . Las soluciones para administración parenteral pueden contener una sal soluble en agua del ingrediente activo, agentes de estabilización adecuados, y si es necesario, sustancias amortiguadoras. Los agentes antioxidantes tal como el bisulfito de sodio, sulfito de sodio o ácido ascórbico, ya sean solos o combinados, son agentes estabilizadores adecuados. También se usan el ácido cítrico y sus sales EDTA de sodio. Además, las soluciones parenterales pueden contener conservadores, tales como cloruro benzalconio, metil o propil paraben, y clorobutanol . Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, un texto estándar de referencia en este campo. Las formas de dosis farmacéutica representativas útiles para la administración de los compuestos de esta invención, se pueden ilustrar como sigue: Cápsulas Un gran número de cápsulas unitarias se pueden preparar al llenar cápsulas de gelatina dura de dos piezas estándar cada una con 100 miligramos de ingrediente activo pulverizado, 150 miligramos de lactosa, 50 miligramos de celulosa, y 6 miligramos de estearato de magnesio. Cápsulas de gelatina suave. Se puede preparar una mezcla de ingrediente activo en un aceite digerible tal como aceite de soya, aceite de semilla de algodón, o aceite de olivo, e inyectarse por medio de una bomba de desplazamiento positivo dentro de la gelatina para formas cápsulas de gelatina suave que contienen 100 miligramos de ingrediente activo. Las cápsulas se deben lavar y secar. Tabletas Las tabletas se pueden preparar por procedimientos convencionales de manera que la dosis unitaria es de 100 miligramos del ingrediente activo, 0.2 miligramos de dióxido de silicio coloidal, 5 miligramos de estearato de magnesio, 275 miligramos de celulosa microcristalina, 11 miligramos de almidón y 98.8 miligramos de lactosa. Los recubrimientos adecuados se pueden aplicar para incrementar el sabor o retrazar la absorción. Inyectables Una composición parenteral adecuada para administración por inyección se puede preparar al agitar 1.5% en peso de ingrediente activo en 10% de volumen de propilen glicol y agua. La solución debe hacerse isotónica con cloruro de sodio y esterilizarse.
Suspensión Se puede preparar una suspensión acuosa para administración oral de manera que cada 5mL contienen 100 mg de ingrediente activo finamente dividido, 200 mg de carboximetil celulosa de sodio, 5 mg de benzoato de sodio, 1.0 mg de solución de sorbitol, U.S.P., y 0.025 mL de vanillina. Donde se combinan los compuestos de esta invención con otros agentes anticoagulantes, por ejemplo, una dosis diaria puede ser alrededor de 0.1 hasta 100 miligramos del compuesto de Fórmula I y alrededor de 1 hasta 7.5 miligramos del segundo anticoagulante por kilogramo del peso corporal del paciente. Para una forma de dosis de tableta, los compuestos de esta invención pueden estar generalmente presentes en una cantidad de alrededor de 5 hasta 10 miligramos por dosis unitaria, y el segundo anticoagulante en una cantidad del alrededor de 1 hasta 5 miligramos por dosis unitaria. Donde se administran dos o más del segundo agente terapéutico anterior con el compuesto de los ejemplos, generalmente la cantidad de cada componente en una dosis diaria típica y forma de dosis típica se puede reducir con relación a la dosis usual del agente cuando se administra solo, en vista del efecto aditivo o sinérgico de los agentes terapéuticos cuando se administran por combinación. Particularmente cuando se suministra como una dosis unitaria sencilla, existe un potencial para una interacción química entre los ingredientes activos combinados. Por esta razón, cuando el compuesto de los ejemplos y un segundo agente terapéutico se combinan en una dosis unitaria sencilla, se formulan de manera tal que aunque se combinen los ingredientes activos en una dosis unitaria sencilla, se minimiza el contacto físico entre los ingredientes activos (esto es, se reduce). Por ejemplo, un ingrediente activo puede estar recubierto de forma entérica. Al recubrir de forma entérica uno de los ingredientes activos, es posible no solamente minimizar el contacto entre los ingredientes activos combinados, sino también, es posible controlar la liberación de uno de estos componentes en el tracto gastrointestinal, de manera tal que uno de estos componentes no se liberen el estómago, sino más bien se liberen en los intestinos. Uno de los ingredientes activos también se puede recubrir con un material que efectúa una liberación sostenida a través del tracto gastrointestinal, y también sirve para minimizar el contacto físico entre los ingredientes activos combinados. Además, el componente de liberación sostenida se puede adicionalmente recubrir de forma entérica, de manera tal que la liberación de este componente sucede solamente en el intestino. Todavía otro enfoque involucraría la formulación de un producto de combinación en el cual un componente se recubre con un polímero de liberación entérica y/o sostenida, y el otro componente también se recubre con un polímero tal como un grado de baja viscosidad de hidroxipropil metilcelulosa (HPMC) u otros materiales adecuados como se conocen en el arte, con objeto de separar además los componentes activos. El recubrimiento de polímero sirve para formar una barrera adicional a la interacción con el otro componente. Estas, así como otras formas de minimizar el contacto entre los componentes de los productos de combinación de la presente invención, ya sea administrado en una forma de dosis sencilla o administrado en forma separada pero al mismo tiempo por la misma manera, serán fácilmente evidentes para aquellos expertos en la técnica una vez equipado con la presente descripción . Adicionalmente, ciertos compuestos descritos en la presente pueden ser útiles como metabolitos de otros compuestos. Por lo tanto, los compuestos pueden ser útiles ya sea como un compuesto substancialmente puro, el cual también luego puede incorporarse en una composición farmacéutica, o puede ser útil como metabolito la cual se genera después de la administración del profármaco de tal compuesto. En una modalidad, un compuesto puede ser útil como un metabolito por ser útil para tratar trastornos como se describen en la presente . "Substancialmente puro" como se usa en la presente se pretende para incluir un compuesto que tiene una pureza mayor que alrededor de 90 porciento en peso, incluyendo alrededor de 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y 100 por ciento. Como un ejemplo, un compuesto descrito en la presente puede ser substancialmente puro que tiene una pureza mayor que alrededor de 90 porciento (en peso) , donde el resto es menor que alrededor de 10 porciento de material que comprende otro metabolito del compuesto, un profármaco del compuesto, y/o reacción y/o purezas procesadas que resulta de su preparación . Obviamente, son posibles diversas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores. Por lo tanto se entenderá que dentro del alcance de la reivindicaciones anexas la invención se puede practicar de otra forma a la que se describe específicamente en la presente. ENSAYOS Y EFICACIA IN VIVO La N- ( (IR, 2S, 5R) -5- ( tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6- ( trifluorometil ) quinazolin- -ilamino) pirrolidin-1-il) ciclohexil) acetamida (también referida como "Ejemplo 1") se evaluó en los siguientes ensayos in vivo como se describe abajo . Sección 1. Ejemplo 1 que bloquea el reclutamiento celular mononuclear a la piel después de la provocación con MCP-1 intradérmico (ID) en mono cinomólgo. La inyección intradermal de MCP-1 resulta en la infiltración de células mononucleares al sitio de inyección. Este modelo se desarrolla inicialmente para evaluar el efecto inhibidor de antagonistas CCR2 en la infiltración de células mononucleares al tejido de la piel inyectadas con MCP-1 humano. El infiltrado celular puede medirse semicuantitativamente por clasificación histológica. Métodos Cada mono se dosificó con el Ejemplo 1 o su control de vehículo (HC1 0.5 N) una vez al día durante tres días. El Ejemplo 1 se administró oralmente a dosis de 0, 5, 10, ó 20 mg/kg a grupos de 4 monos conomólogos (2 por sexo por grupo) . Inmediatamente después de dosificar el Día 3, todos los animales reciben al menos 2 inyecciones t r an s de rma le s de 10 µg (50 µ?/???ß?????) de MCP-1 humano (R & D Systems) y 2 inyecciones t ransdermales de su control DPBS (50 µ? / inyección ) en sitios separados en el tórax dorsal. Las biópsias dermales de todos los sitios se obtuvieron a aproximadamente 18 horas después de la provocación con MCP-1 (o DPBS) . Las biopsias se procesaron para evaluación histológica s emi - cuant i t a t i va . Las secciones representativas de muestras de piel se examinaron por microscopio de luz, las lesiones de microscopio e infiltración celular se notan, y sus incidencias se tabulan.
Además del análisis de biópsia, la sangre se colectó y evaluó para cuentas de sangre completa y diferenciales celulares. También se evaluaron las muestras de plasma para concentraciones del compuesto, y muestras de suero para niveles mediadores inflamatorios sistémicos. Resultados El reclutamiento de células mononucleares a la piel de los animales de control tratados con el vehículo en respuesta a la provocación por MCP-1 fue significativo (calificación histológica media de 2.0 con un intervalo del-3, Tabla 10) . El Ejemplo 1 a 5, 10, y 20 mg/kg inhibe esta infiltración celular mononuclear dermal por 75%, 95% y 95%, respectivamente (Tabla 10 y Figura 20) . El compuesto también bloquea la infiltración de otros tipos de células tales como eosinófilos y neutrófilos (Tabla 12) . _ Las concentraciones de plasma del Ejemplo 1 a 18 horas y su relación a los niveles de inhibición y valores IC90 de quimiotaxis Cyno se resumen en la Tabla 12. Con base en el valor IC50 de 7.1 ± 2.7 nM para el Ejemplo 1 en ensato de quimiotaxis cyno, la dosis de 5, 10 y 20 mg/kg resulta en concentraciones de plasma libres de 0.8, 2.1, y 4.3 veces el IC90 de quimiotaxis a 18 horas después de la dosificación (Tabla 12) .
TABLA 12 Resumen de efectos del Ejemplo 1 en la infiltración células mononucleares y otros tipos de células en respuesta la provocación con MCP-1 en monos cinomolgus a,b a Un sistema de escalamiento arbitrario desde 0 hasta 4 se utilizó con cada número representando una designación particular de infiltrado inflamatorio como sigue: 0, número no notable de células inflamatorias; 0.5, rastro; 1, mínimo; 2, medio; 3, moderado; 4, infiltración marcada. b Valores medios son un promedio de 8 biopsias de sitio MCP-1, que representa 2 biopsias separadas de 4 monos por grupo. Los intervalos representan la extensión del promedio de registros histológicos promedio para 2 biopsias por animal. a ??? se establece para célula polimorgonuclear (neutrófilo) . b Eos es una abreviatura para eosinófilos. c El registro total es una suma matemática de los valores medios para cada tipo de célula APRA demostrar la respuesta a la dosis. La evaluación de cambios en los mediadores inflamatorios de suero muestra un incremento (aproximadamente 3-4 veces) en el nivel MCP-1 en grupos tratados con el Ejemplo 1 con relación al control de vehículo. Además, el análisis de conteo sanguíneo completo (CBC) muestra un incremento (~2 veces) en neutrófilos en grupos tratados con el Ejemplo 1, con relación al control de vehículo, a 18 horas el día 4 después de tres días de dosificación. Para refinar la respuesta a la dosis (concentración) del Ejemplo 1 en un sistema cuantificable más fácilmente, se usaron ratones hCCR2 KI para evaluar el efecto de la infiltración de monocito/macrófago del Ejemplo 1 en el modelo de peritonitis inducida por tioglicolato (TG) con la metodología basada en citometría de flujo. Sección 2. Infiltración del monocito/macrófago inhibida por el Ejemplo 1 en modelo de peritonitis TG de 48 horas en ratón hCCR2 KI El modelo de peritonitis inducido por TG se ha usado como un modelo de reclutamiento de monocitos macrofagos al sitio de inflamación. Tanto en estudios caseros como publicados, se ha demostrado que el reclutamiento de monocito/macrófago en este modelo depende de CCR2. Ver Boring L. et al., Impaired monocyte migration and reduced type 1 (Thl) cytokine responses in C-C chemokine receptor 2 knockout mice. J Clin Invest., 100(10) :2552-61. (1997); y Kuziel, W.A. et al., Severe reduction in leukocyte adhesión and monocyte extravasation in mice deficient in CC chemokine receptor 2. Proc Nati Acad Sci U S A. 94 (22) : 12053-8 (1997). Métodos Para el estudio de peritonitis TG de 48 horas, el Ejemplo 1 se dosificó dos veces al dia con una primera dosis dada una hora antes de la inyección TG. Se obtienen cuentas celulares perifonéales totales en células aisladas por un contador celular. La sangre también se colecta en heparina del seno retro-orbital la final de cada estudio para citometria de flujo y en EDTA para determinación de concentración de fármaco . Para análisis citométrico de flujo, se lavaron las células exudadas perifonéales (lxlO6) una vez con solución amortiguadora FACS (PBS/0.5% BSA) y se vuelve a suspender en solución amortiguadora FACS. Las células se incubaron con un anticuerpo de bloqueo Fe (BD Pharmingen) en hielo durante 15 min seguido por la adición de los siguientes anticuerpo (BD Pharmingen) : conjugado PE anti-F4/80, conjugado FITC anti- Ly6C, y conjugado Alexa 647 anti-hCCR2. Después de 45 min en hielo, las células se fijaron por BD Cytofix durante 15 min en hielo, se lavan dos veces con solución amortiguadora FACS, y se vuelven a suspender en 200 µ? de solución amortiguadora FACS. Los eventos celulares (40,000) se adquirieron de cada muestra y los datos se analizaron usando el software FloJo (TreeStar) . Se coloca una puerta FSC/SSC para incluir todos los monocitos (SSC inferior, FSC más alto) mientras se excluye los granulocitos de los análisis. Esta población en puerta se analiza entonces para expresión Ly6C (FITC) , F4/80 (PE) . Los números de monocitos/macrófago peritoneal se determinan al multiplicar las cuentas celulares perifonéales totales obtenidas por el contador celular y el porcentaje de monocitos/macrófagos identificados por células F4/80+ de citometria de flujo. La importancia estadística de diferencias entre medios se analiza usando la prueba t de dos colas emparejada con significancia establecida a valores p debajo de 0.05. Resultados El Ejemplo 1 se evaluó en el modelo de peritonitis TG de ratón hCCR2 KI para determinar su EC50 para inhibir la infiltración de monocito/macrófago . Los ratones se les administró tioglicolato, y se dosificaron oralmente con el Ejemplo 1 a 1, 25, ó 100 mg/kg BID. Cuarenta y ocho horas después del tratamiento TG, se obtiene un lavado peritoneal para análisis de infiltrado celular por citometria de flujo. Para distinguir entre los monocitos/macrófagos reclutados contra los macrófagos y granulocitos residentes, se usó el teñido de marcadores de superficie de monocito/macróf ago tanto F4/80 como Ly6C para definir los monocitos/macrófagos reclutados. Una inhibición dependiente de la dosis se observó (Figura 21) . Las dosis de 1, 25, y 100 mg/kg dan una inhibición del 24%, 74% y 78%, respectivamente. En tres estudios separados con dosis múltiples, el EC50 promedio para inhibición de infiltración monocito/macróf ago por este análisis se estimó que es 3.9 Nm. Para evaluar el nivel in vivo de ocupación del receptor por el Ejemplo 1 en el modelo de peritonitis de tioglicolato de 48 horas usando el ratón hCCR2 KI, los niveles de plasma de tanto el Ejemplo 1 como el MCP-1 del ratón se midieron. La advertencia para esta estimación es que sólo el CCR2 y su ligando MCP-1 principal, se tomaron en consideración. La ocupación del receptor del ligando en presencia de un inhibidor competitivo se define por la ecuación Gaddum: ÍRL1 - i [R] l + (Kd / [L]) (l + [I]/K0 Ya que el Ejemplo 1 es un inhibidor competitivo de MCP-1 enlazado a CCR2, las cantidades de tanto el complejo del MCP-1/receptor CCR2 de ratón como el complejo Ejemplo 1/receptor CCR2 pueden determinarse usando los niveles de suero de tanto el MCP-1 de ratón como el Ejemplo 1 no enlazado a la proteina en el plasma. El Kd para el MCP-1 de ratón enlazado al hCCR2 es 0.91 +/- 0.08 nM (n=8) , que se determina en experimentos de enlace de ligando de competencia fria usando MCP-1 125I-humano. El Ki promedio para el Ejemplo 1 enlazado al hCCR2 es 1.3 nM. La fracción de complejos MC P- 1 / r ecep t o r CCR2 de ratón se determina usando la forma de la ecuación descrita arriba. Para determinar la fracción de complejos Ejemplo 1/CCR2 la ecuación se vuelve a definir como : [Rfl - 1 Finalmente, la cantidad de CCR2 libre se determina de : [CCR2] totai= [CCR2] iibre+ [MCP-1 de ratón/CCR2] + (Ejemplo 1/CCR2] Como se muestra en la Tabla 13, el porcentaje de inhibición de la infiltración monocito/macrófago en el peritoneo a 48 h refleja el porcentaje del complejo Ejemplo 1/receptor CCR2.
TABLA 13 Determinación de ocupación del receptor in vivo del Ejemplo 1 en sangre de ratones hCCR2 KI el modelo de peritonitis TG de 48 horas Sección 3. Estudios de eficacia crónica Ence alomielitis autoinmune experimental (???) Métodos Para evaluar el efecto del Ejemplo 1 en modelos de enfermedad crónica, se usaron el modelo EAE de esclerosis múltiple en ratones hCCR2 KI . Para estudiar el efecto del Ejemplo 1 en el modelo EAE, se usaron 10 ratones por grupo. El día 0, los ratones hCCR2 KI se inmunizaron subcutáneamente con un total de 200 µ? de 300 µg de glicoproteína oligodendrítica de mielina (MOG) 35-55 (Genemed Synthesis) mezclada 1:1 con 300 µ? de tuberculosis micobacteriana (H37Ra) (Becton-Dickinson) en adyuvante Freund incompleto (IFA) (Sigma-Aldrich) . El dia 0 (dos horas después de la inmunización) y el dia 2, los ratones se inyectaron intraperitonealmente con 100 µ? de toxina pertusis 400 ng. El registro clínico inicial el día 10, continua tres veces por semana durante el estudio, y se basó en una escla de 0-5: 0, sin señales de enfermedad; 0.5, debilidad de la cola parcial; 1, cola blanda o paso contoneado con tonicidad de cola; 1.5 paso contoneado con debilidad de cola parcial; 2, paso contoneado con cola blanda (ataxia); 2.5 (ataxia con parálisis de miembro parcial; 3, parálisis completa de un miembro; 3.5, parálisis completa de un miembro con parálisis aprcial de un segundo miembro; 4, parálisis completa de dos miembros; 4.5, moribundo; 5, muerte. La dosis oral del Ejemplo 1 a 25 mg/kg y 55 mg/kg (BID) se inició el día 1. Resultados El Ejemplo 1 a ambas dosis reduce el área bajo la curva (AUC) del registro clínico por 49% (p < 0.05) (Figura 22). El IC50 es 3.7 n para el Ejemplo 1 en 125I-ratón MCP-1 enlazado a células que expresan hCCR2, hPBMCs (imitadores hCCR2 KI establecidos) . Con base en este valor IC50, la dosis de 25 y 55 mg/kg resulta en una concentración de canal de plasma libre de 1 y 3 veces el enlace IC90. La evaluación histológica de la médula espinal el día 22 no demuestra una diferencia importante en el infiltrado celular inflamatorio total entre los ratones tratados con el Ejemplo 1 contra vehículo. Se observó un infiltrado neutrófilo marcado en ratones tratados con el compuesto. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por el solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

  1. Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Compuesto, caracterizado porque es N- ( ( IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-( trifluorometil) quinazolin- -ilamino) pirrolidin-1-il) ciclohexil) acetamida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  2. 2. Compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es una forma cristalina de N- ( ( IR, 2S, 5R) -5- (tert-butilamino) -2- ( (S) -2-oxo-3- (6-( trifluorometil ) quinazolin- -ilamino) pirrolidin-1-il ) ciclohexil ) acetamida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  3. 3. Forma cristalina de conformidad con las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque comprende la forma N-2.
  4. 4. Forma cristalina de conformidad con las reivindicaciones 1-3, caracterizada por los parámetros celulares unitarios substancialmente iguales a los siguientes: dimensiones celulares: a = 18.7240 (3) b= 8.01701 (2) c = 19.6568 (5) a = 90 ß = 114.935 (2) ) ? = 90 V(Á3) = 2675.7 (1) Grupo de espacio ?2?2?2? Moléculas/célula unitaria 2 en donde el cristal está a una temperatura de alrededor de +22°C (T.A. ) . 5. Forma cristalina de conformidad con las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque el patrón de difracción de rayos X en polvo comprende tres o más de los valores 2T (CuKa ?=1.5418?) seleccionados de
  5. 5.5, 9.1, 12.1, 14.0 y 19.2 a una temperatura de alrededor de 22°C.
  6. 6. Forma cristalina de conformidad con las reivindicaciones 1-5, caracterizada además porque el patrón de difracción' de rayos X en polvo comprende cuatro o más de los valores 2T (CuKa ?=1.5418?) seleccionados del grupo que consiste de 5.5, 9.1, 12.1, 14.0 y 19.2, a una temperatura de alrededor de 22°C .
  7. 7. Forma cristalina de conformidad con las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque las coordenadas atómicas fracciónales son substancialmente como se enlistan en la Tabla 3.
  8. 8. Forma cristalina de conformidad con las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque tiene un patrón de difracción de rayos X en polvo substancialmente de conformidad con la Figura 2.
  9. 9. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el compuesto de conformidad con las reivindicaciones 1-8, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
  10. 10. Uso del compuesto de conformidad con la reivindicaciones 1-9 para la manufactura de un medicamento para tratar una enfermedad en donde la enfermedad se selecciona de diabetes, obesidad, síndrome metabólico, apoplejía, dolor neuropático, cardiomiopat i a isquémica, psoriasis, hipertensión, esqueroderma , o s t eoa r t r i t i s , aneurisma, fiebre, enfermedad cardiovascular, enfermedad de Crohn, insuficiencia cardiaca congestiva, enfermedades autoinmunes, infección por VIH, demencia asociada con VIH, psoriasis, fibrosis pulmonar idiopática, arterioesclerosis por transplante, trauma cerebral físicamente o químicamente inducido, enfermedad inflamatoria del intestino, alveolitis, colitis, lupus eritematoso sistémico, nefritis de suero nefrotóxico, nefritis glomerular, asma, esclerosis múltiple, arterioesclerosis, vasculitis, placas vulnerables, artritis reumatoide, restenosis, hiperplasia neointima venosa, hiperplasia neointima de injerto de diálisis, hiperplasia intima de derivación arteriovenosa , transplante de órganos, nefropatia de aloinjerto crónico y cáncer.
  11. 11. Uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde la enfermedad se selecciona de diabetes, obesidad, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, g 1 orne rul one f r i t i s , esclerosis múltiple, ateroesclerosis , restenosis, y transplante de órganos.
  12. 12. Uso de conformidad con las reivindicaciones 10-11, en donde la enfermedad se seleciona de esclerosis múltiple, ateroesclerosis, enfermedad de Crohn, y diabetes.
  13. 13. Proceso para la preparación de un compuesto teniendo la fórmula (X) caracterizado porque comprende los pasos de: hidrolizar la porción éster del compuesto de la fórmula V un agente de hidrolización para formar el ácido del compuesto VI a temperaturas desde alrededor de -5 hasta alrededor de 5°C. V reaccionando un compuesto de la fórmula Vía, HO-Z-OH, con un compuesto de la fórmula IV (opcionalmente in situ) en la presencia de un catalizador ácido para dar un compuesto de la fórmula VII VII transformando la porción del ácido carboxilico de el cetal de la fórmula VII a un isocianato intermediario de la fórmula VIII VII contactando el isocianato de la fórmula VIII con un compuesto de la fórmula Ri0COW (por ejemplo, ácido acético) en la presencia de un anhídrido ácido correspondiente, (Ri0CO)2O) para formar la amida de la fórmula IX teniendo una porción cetal : Hidrolizar la porción cetal de la amida de la formula IX para formar el compuesto de la formula X caracterizado porque Ri, y R2 son independientemente hidrógeno o un grupo protector amina; R4 y Rio son independientemente alquilo Ci_6 o bencilo substituido opcionalmente; R& y Rg son independientemente hidrógeno, alquilo Ci-6, W es OH o Oalquilo Ci_6. -(CTiT2)2-, -(CTiT2)3-, o Ti, T2 y T3 cada que se presentan se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo Ci-4, alquenilo C2_4, halógeno, hidroxi, ciano, nitro, CF3, Oalquilo Ci_4, OCF3, y C(=0) alquilo Ci_
  14. 14. Proceso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque aminar reductivamente comprende las etapas de : a) agregar un ácido Lewis a una solución del compuesto X y la amina que tiene la fórmula HNR8R9 en un solvente aprótico para formar una imina-enamina de la fórmula Xa: Xa ; y b) tratar la imina-enamina de la fórmula Xa con un agente reductor para proporcionar el compuesto de la fórmula X que tiene una porción pirolindonil amina.
  15. 15. Compuesto caracterizado porque es seleccionado de Ácido (7R, 8S) -8- ( (3S) -3- ( ( (benciloxi) carbonil ) amino) -2-???-1-pirrolidinil ) -1 , 4-dioxaespiro [4.5] decano-7-carboxílico, o una sal del mismo; ( (3S) -1- ( (7R, 8S) -7- (azidocarbonil) -1, 4-dioxaespiro [4.5] dec-8-il) -2-oxo-3-pirrolidinil) carbamato de bencilo, o una sal del mismo; ( (3S) -1- ( (7R, 8S) -7-isocianato-l, 4-dioxaespiro [4.5] dec-8-il ) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mismo; ( (3S) -1- ( (7R, 8S) -7-acetamido-l, 4-dioxaespiro [4.5] dec-8-il ) -2-oxo-3-pirrolidinil) carbamato de bencilo, o una sal del mismo ; ( (3S) -1- ( (1S, 2R) -2-acetamido-4-oxociclohexil) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mismo; y ( (3S) -1- ( (1S, 2R, R) -2-acetamido-4 - (tert-butilamino) ciclohexil) -2-oxo-3-pirrolidinil ) carbamato de bencilo, o una sal del mismo.
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