MX2008016031A - Uso de ppd para la adyuvacion de una vacuna de acido nucleico. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un nuevo adyuvante para vacunas de ácido nucleico, y en particular la presente invención proporciona vacunas de ácido nucleico que comprenden, o son administradas en asociación con PPD. La presente invención también proporciona métodos para mejorar la eficacia terapéutica de las vacunas de ácido nucleico.

Description

USO DE PPD PARA LA ADYUVACION DE UNA VACUNA DE ACIDO NUCLEICO.

Campo de la Invención La presente invención proporciona un nuevo adyuvante para vacunas de ácido nucleico, y en particular la presente invención proporciona vacunas de ácido nucleico que comprenden, o son administradas en asociación con PPD. La presente invención también proporciona métodos para mejorar la eficacia terapéutica de las vacunas de ácido nucleico. Más particularmente, la presente invención proporciona el uso de PPD en la fabricación de una composición de una vacuna de ácido nucleico con el fin de mejorar la inmunorespuesta contra el antígeno específico que es codificado por la vacuna de ácido nucleico. Se proporcionan composiciones vaccíneas, kits que comprenden la composición separada de ácido nucleico y composiciones que comprenden PPD para administración separada, métodos de fabricación de las vacunas y de los kits, y métodos de tratamiento de individuos con las composiciones vaccíneas de la presente invención. Antecedentes de la Invención Por años, las técnicas de vacunación esencialmente han consistido en la introducción en un animal de un antígeno (por ejemplo, una proteína, un virus muerto o atenuado) para elevar una inmunorespuesta dirigida contra un organismo infeccioso.

Desde el final de los años 80 nuevas técnicas de vacunación han aparecido que consisten en la introducción en un animal de un vector que comprende una codificación de la secuencia del ácido nucleico para el antígeno. Por ejemplo, un virus de vaccinia vivo que codifica una glicoproteína de la rabia se ha utilizado con éxito para la eliminación de la rabia terrestre en países de Europa Occidental (Cliquet y colaboradores, Dev. Biol (Basel), 2004.119.185-204). La ventaja principal de la inmunización del ácido nucleico es que tanto las inmunorespuestas celulares (incluyendo las células T CD4+ y CD8 + ) y humorales pueden ser inducidas debido a que el antígeno codificado se procesa a través de vías endógenas y exógenas, y los epítopes péptidos son presentados por los principales complejos de histocompatibilidad (MHC) clase I así como los complejos clase II (Haupt y colaboradores, Biol Med (Maywood), 2002, 227.227-37). La generación eficiente de una respuesta de CTL ha preparado el camino para el tratamiento profiláctico o terapéutico del cáncer por la vacunación de ácido nucleico. Muchas células tumorales expresan el antígeno(s) específico llamado TAA (por antígeno asociado a un tumor), pero estos antígenos son pobremente reconocidos por el sistema inmunológico que es sobreregulado por factores en la periferia del tumor. La vacunación de pacientes con un ácido nucleico que codifica un TAA conduce a la expresión del TAA en un ambiente donde el sistema inmunológico es completamente eficaz y genera una inmunorespuesta dirigida específicamente contra las células tumorales. Como para cada tratamiento, siempre hay una necesidad de mejorar la eficacia de la vacunación de ácido nucleico. Por consiguiente, pueden ser útiles las maneras de elevar cuantitativamente la inmunorespuesta o de cambiar el tipo de respuesta a la que sería más eficaz para la indicación de la enfermedad. Sin embargo la identificación de los adyuvantes convenientes para la vacunación de ácido nucleico no es directa puesto que los mecanismos implicados en la inmunorespuesta contra una vacuna tradicional o una vacuna de ácido nucleico no son iguales. Por ejemplo, el aspirante ha encontrado que los adyuvantes fuertes de la vacuna tradicional tales como BCG, montanida, levimazol o cloroquina no pueden elevar una inmunorespuesta contra un antígeno codificado en un ácido nucleico. PPD (derivado de proteína purificada) es una mezcla de compuestos extraídos del Mycobacterium tuberculosis. PPD se utiliza como una prueba para la detección de reactividad a la tuberculina. Después de la inyección intradérmica de PPD, la producción de una reacción retrasada de hipersensibilidad caracterizada por el crecimiento de un forúnculo es una muestra de infección de tuberculosis. El uso de PPD como un portador para el antígeno clásico se ha descrito ya en la técnica anterior. Por ejemplo, Perraut y colaboradores (Clin. Exp. Immunol., 1993, 93, 382-6) describe una vacuna que comprende péptidos sintéticos de malaria conjugados con PPD. Ohno y colaboradores (US20060008478) describe complejos que comprenden PPD y un antígeno en donde estos dos componentes son coprecipitados. La técnica anterior completa describe la inyección simultánea del PPD y del antígeno. El solicitante ha encontrado que PPD es un adyuvante muy potente para la vacuna de ácido nucleico y más particularmente para la vacuna de ácido nucleico usando un virus recombinante como un vector. Este descubrimiento fue particularmente sorprendente puesto que los varios antígenos virales presentes en la superficie del virus o expresados durante la infección viral fueron supuestos para ser suficientes para adyuvar la inmunorespuesta incrementada contra el antígeno (J Immunoí., 2005, 175, 599-606). Breve Descripción de la Invención De acuerdo con una modalidad de la presente invención se proporciona una composición de una vacuna que comprende (i) PPD (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno. En un aspecto adicional, la invención proporciona un kit de partes que comprende (i) PPD, y (¡i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para incrementar una inmunorespuesta a un antígeno, este método que comprende la administración, ya sea secuencial o simultáneamente, de un ácido nucleico que codifica un antígeno y un PPD. En otra modalidad se proporciona el uso de PPD en la fabricación de un medicamento para el mejoramiento de una inmunorespuesta a un antígeno codificado por una secuencia de ácido nucleico, esta secuencia de ácido nucleico es administrada secuencial o simultáneamente con el derivado. En otra modalidad la presente invención además proporciona una composición farmacéutica que comprende el derivado de PPD para mejorar una inmunorespuesta a un antígeno codificado por una secuencia de ácido nucleico. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para elevar una inmunorespuesta en un mamífero contra un estado de enfermedad, que comprende administrar al mamífero una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido antigénico asociado al estado de enfermedad; además administrar PPD al mamífero para elevar la inmunorespuesta. Se proporciona además un método para aumentar la inmunorespuesta de un mamífero a un inmunógeno, que comprende la etapa de administrar al mamífero, una secuencia de ácido nucleico que codifique al inmunógeno, administrando además PPD al mamífero en una cantidad eficaz para aumentar la ¡nmunorespuesta. Descripción Detallada de la Invención. Como son utilizados a través de toda la solicitud, los términos "un" y "uno" son utilizados en el sentido que significan "por lo menos uno", "por lo menos un primer", "uno o más" o "una pluralidad" de los componentes o etapas referidas, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, que incluyen mezclas de las mismas. - El término "y/o" donde sea utilizado en la presente incluye el significado de "y", "o" y "todos o cualquier otra combinación de los elementos conectados por el término". El término "aproximadamente" como es utilizado en la presente significa dentro de 20%, preferiblemente dentro de 10%, y más preferiblemente dentro de 5% de un valor o de un intervalo dado. Como es utilizado en la presente, el término "que comprende" está pensado para significar que los productos, composiciones y métodos incluyen los componentes o las etapas referidas, pero no excluye otros, "que consiste esencialmente de" cuando es utilizado para definir productos, composiciones y métodos, deberá significar que excluye otros componentes o etapas de cualquier significación esencial. Por lo tanto, una composición que consiste esencialmente de los componentes citados no excluiría rastros de contaminantes y portadores farmacéuticamente aceptables. "Que consiste de" deberá significar que excluye más que los rastros de elementos de otros componentes o etapas. Como es utilizado en la presente el término "composición de una vacuna" se refiere a una combinación de una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno, y PPD. La combinación está, por ejemplo, en la forma de una mezcla de los dos componentes en una sola formulación farmacéuticamente aceptable o en la forma de componentes separados, individuales, por ejemplo, en la forma de un kit que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno, y PPD, en donde los dos componentes son para administrarse de manera separada, secuencial o simultánea. Preferiblemente, la administración de los dos componentes es sustancialmente simultánea. Como es utilizado en la presente, el término "PPD", "derivado de proteína purificada" o "tuberculina" (que puede utilizarse alternativamente) se refiere a las proteínas obtenidas por el proceso de Seibert (Seibert y colaboradores Am. Rev. Tuberc, 1934, 30, 713-720 y Seibert y colaboradores Am. Rev. Tuberc, 1941, 44, 9-23). PPD también se refiere a las composiciones que comprenden la proteína obtenida por el proceso de Seibert. Tales composiciones están, por ejemplo, comercialmente disponibles bajo las marcas Applisol® (Parkedale, Pharmaceuticals, Rochester, USA), PPD Tine Test® (Lederlele Pharmaceutical, Pearl River, USA), Tubertest (Sanofi Pasteur Msd), Tubersol® (Aventis Pasteur), Aplitest®, Sclavo Test-PPD® (Sclavo Laboratories, Italy), o Mono-Vacc Test (O.T.). De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, PPD es una composición elegida del grupo que comprende tubertest y tubersol. Es posible para los métodos y las composiciones de vacunación de acuerdo con la presente solicitud que se adapte para protección o tratamiento de mamíferos contra una variedad de estados de enfermedad tales como, por ejemplo, infecciones virales, bacterianas o parásitas, cáncer, alergias y trastornos autoinmunes. El término "antígeno" se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de unirse por un aglutinante selectivo, tal como un anticuerpo, y además capaz de utilizarse en un animal para producir anticuerpos capaces de unir a un epítope de ese antígeno. Un antígeno puede tener unos o más epítopes. En una modalidad, el antígeno es un antígeno asociado a un tumor (TAA). TAA se refiere a una molécula que es detectada en una frecuencia o densidad más alta en células tumorales que en células no tumorales del mismo tipo de tejido. Los ejemplos de TAA incluyen pero no se limitan a CEA, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GP-100, MUC-1, MUC-2, oncógeno ras puntualmente mutado, p53 normal o mutado puntual, p53 sobreexpresado, CA-125, PSA, C-erb/B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, tirosinasa, TRP-1, TRP-2, NY- ESO-1, TAG72, KSA, HER-2/neu, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, survivina y LRP. De acuerdo con una modalidad preferida el TAA es MUC1. En otra modalidad de la invención, el antígeno es un antígeno microbiano. Un antígeno microbiano como es utilizado en la presente es un antígeno de un microorganismo que incluye pero no está limitado a virus, bacterias, parásitos, y hongos. El virus comprende pero no se limita a Retroviridae, Picornaviridae (por ejemplo, virus de la poliomielitis, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus Coxsackie humano, rinovirus, ecovirus); Calciviridae (por ejemplo, cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus del sarampión); Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronoviridae (por ejemplo, coronavirus); Rhabdoviradae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de paraínfluenza, virus de paperas, virus de sarampión, virus respiratorio sincitial); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de influenza); Bungaviridae (por ejemplo, virus de Hantaan, virus bunga, flebovirus y virus de Nairo); Arena viridae (virus de la fiebre hemorrág ica) ; Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la hepatitis B); Parvovirida (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus simple del herpes (HSV) 1 y 2, virus varicela zoster, cytomegalovirus (CMV), virus del herpes; Poxyiridae (virus varióla, virus vaccinia, virus pox); e Iridoviridae (por ejemplo, virus de la peste porcina africana). De cuerdo con una modalidad preferida de la invención el antígeno es un antígeno del Virus del Papilloma Humano (HPV), de acuerdo con una modalidad preferida, el antígeno de HPV es derivado de HPV-16 y/o HPV-18. De acuerdo con una modalidad aún más preferida, el antígeno de HPV es seleccionado en el grupo que consiste en la región temprana de codificación de E6 del HPV, de la codificación temprana de E7 del HPV y parte o combinación de las mismas. La presente invención comprende el uso de cualquier polipéptido HPV E6 el cual unido a p53 se altera o por lo menos se reduce perceptiblemente y/o el uso de cualquier polipéptido HPV E7 el cual unido a Rb se altera o por lo menos se reduce perceptiblemente (Munger y colaboradores, 1989, EMBO J. 8, 4099-4105; Crook y colaboradores, 1991, Cell 67, 547-556; Heck y colaboradores, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 4442-4446; Phelps y colaboradores, 1992, J. Virol. 66, 2148-2427). Una variante no oncogénica de HPV-16 E6 que es conveniente para el propósito de la presente invención se suprime de uno o más residuos de aminoácido localizados aproximadamente de la posición 118 a aproximadamente la posición 122 (+1 que representan el primer residuo de metionina del polipéptido nativo de HPV-16 E6), con una preferencia especial por la supresión completa de los residuos 118 a 122 (CPEEK). Una variante no oncogénica de HPV-16 E7 que es conveniente para el propósito de la presente invención se suprime de uno o más residuos de aminoácido localizados aproximadamente de la posición 21 a aproximadamente la posición 26 ( + 1 que representan el primer aminoácido del polipéptido nativo HPV-16 E7, con una preferencia especial por la supresión completa de los residuos 21 a 26 (DLYCYE). De acuerdo con una modalidad preferida, el uno o más polipéptido(s) temprano(s) HPV-16 en uso en la invención se modifica(n) adicionalmente para mejorar la presentación de MHC clase I y/o MHC clase II, y/o estimular la inmunidad anti-HPV. Los polipéptidos HPV E6 y E7 son proteínas nucleares y se ha demostrado previamente que la presentación de la membrana permite mejorar su eficacia terapéutica (ver por ejemplo, WO99/03885). Así, puede ser recomendable modificar por lo menos uno de (los) polipéptido(s) temprano(s) de HPV para ser anclado(s) a la membrana de la célula. El anclaje de la membrana fácilmente puede ser alcanzado incorporando en el polipéptido temprano de HPV una secuencia de anclaje a la membrana y si el polipéptido nativo la carece una secuencia secretora (es decir un péptido señal). Las secuencias de anclaje a la membrana y secretoras son conocidas en la técnica. Brevemente, las secuencias secretoras están presentes en el término N de los polipéptidos de la membrana presentes o secretados e inician su paso en el retículo endoplásmico (ER). Comprenden generalmente 15 a 35 aminoácidos esencialmente hidrofóbicos que después son retirados por una endopeptidasa localizada en ER específica para dar el polipéptido maduro. Las secuencias de anclaje a la membrana son en general altamente hidrofóbicas en naturaleza y sirven para anclar los polipéptidos en la membrana de la célula (ver por ejemplo, Branden and Tooze, 1991, en Introduction to Protein Structure p. 202-214, NY Garland). La elección de las secuencias de anclaje a la membrana y secretoras que pueden utilizarse en el contexto de la presente invención es extensa. Pueden ser obtenidas de cualquier polipéptido de anclaje a la membrana y/o secretado que las comprendas (por ejemplo, polipéptidos celulares o virales) tal como la glicoproteína de la rabia, de la glicoproteína de la envoltura del virus del VIH o de la proteína F del virus del sarampión o pueden ser sintéticas. Las secuencias de anclaje a la membrana y/o secretoras insertadas en cada uno de los polipéptidos tempranos HPV-16 usados de acuerdo con la invención pueden tener un origen común o diferente. El sitio preferido de la inserción de la secuencia secretora es el Término N corriente abajo del codón para la iniciación de la traducción y el de la secuencia de anclaje a la membrana es el Término C, por ejemplo, inmediatamente contracorriente desde el codón de parada. El polipéptido HPV E6 en uso en la presente invención es modificado preferiblemente por la inserción de las señales secretoras y de anclaje a la membrana de la proteína del sarampión F. Opcionalmente o en combinación, el polipéptido HPV E7 en uso en la presente invención es modificado preferiblemente por la inserción de las señales secretoras y de anclaje a la membrana de la glicoproteína de la rabia. Las bacterias comprenden bacterias Gram positivas y Gram negativas. Tales bacterias Gram positivas incluyen, pero no se limitan a, especie de Pasteurella, especie de estafilococos, y especie de estreptococo. Las bacterias Gram negativas incluyen, pero no se limitan a, Escherichia coli, especie de pseudomonas, y especie de Salmonella. Los ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen pero no se limitan a, Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus Grupo A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus Grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (SPS anaerobio), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp. patogénico, Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerógenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, y Actinomyces israelli. Los hongos notablemente comprenden cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. De acuerdo con otra modalidad de la invención, el antígeno es un antígeno de organismos infecciosos que comprenden Plasmodium tal como Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, y Plasmodium vivax y Toxoplasma gondii. Los parásitos contenidos en la sangre y/o en los tejidos incluyen Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania trópica, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense y Trypanosoma rhodesiense (enfermedad africana del sueño), Trypanosoma cruzi (enfermedad de Chagas), y Toxoplasma gondii. De acuerdo con otra modalidad, el antígeno es un alergénico. Un alergénico se refiere a una sustancia que puede inducir una respuesta alérgica o asmática en un sujeto susceptible. La lista de alergénicos es enorme y puede incluir pólenes, venenos de insecto, polvo de caspa de animales, esporas fungicidas y fármacos (por ejemplo, penicilina). Los ejemplos de alergénicos naturales, de animal y de plantas incluyen pero no se limitan a proteínas específicas a los siguientes géneros: Canine (Canis famiiiaris); Dermatophagoides (por ejemplo, Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemüsfolia; Lolium (por ejemplo, Lolium perenne o Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japónica); Alternaría (Alternaría alternata); Alder; Alnus (Alnus gultínoasa); Betula (betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (por ejemplo, Plantago lanceolata); Parietaria (por ejemplo, Parietaria officinalis o Parietaria judaica); Blatteila (por ejemplo, Blatteila germánica); Apis (por ejemplo, Apis multiflorum); Cupressus (por ejemplo, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica y Cupressus macrocarpa); Juniperus (por ejemplo, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis y Juniperus ashei); Thuya (por ejemplo, Thuya orientalis); Chamaecyparis (por ejemplo, Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (por ejemplo, Periplaneta americana); Agropyron (por ejemplo, Agropyron repens); Sécale (por ejemplo, Sécale cereale); Triticum (por ejemplo, Triticum aestivum); Dactylis (por ejemplo, Dactylis glomerata); Festuca (por ejemplo, Festuca elatior); Poa (por ejemplo, Poa pratensis o Poa compressa); Avena (por ejemplo, Avena sativa); Holcus (por ejemplo, Holcus lanatus); Anthoxanthum (por ejemplo, Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (por ejemplo, Arrhenatherum elatius); Agrostis (por ejemplo, Agrostis alba); Phleum (por ejemplo, Phleum pratense); Phalaris (por ejemplo, Phalaris arundinacea); Paspalum (por ejemplo, Paspalum notatum); Sorghum (por ejemplo, Sorghum halepensis); y Bromus (por ejemplo, Bromus inermis) . Como es utilizado en la presente, el término "inmunorespuesta" comprende respuestas de células B mediadas, células T mediadas, o una combinación de ambas células B y T mediadas. El término "secuencia de ácido nucleico" se refiere a una secuencia linear de nucleótidos. Los nucleótidos son una secuencia linear de poliribonucleótidos o de polideoxiribonucleótidos, o una mezcla de ambos. Los ejemplos de polinucleótidos en el contexto de la presente invención incluyen ADN de cadena sencilla y doble, ARN de cadena sencilla y doble, y moléculas híbridas que tienen ambas mezclas de ADN y de ARN de cadena sencilla y doble. Además, los polinucleótidos de la presente invención pueden tener uno o más nucleótidos modificados. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno está comprendida en un vector. El vector puede ser de origen plásmido o viral y puede, cuando sea apropiado, combinarse con una o más sustancias que mejoren la eficacia de transfección y/o estabilidad del vector. Estas sustancias están ampliamente documentadas en la literatura que está disponible para la persona experta (ver, por ejemplo, Feigner y colaboradores, 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson y Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy y colaboradores, 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 647-654). A modo de ilustración no limitante, las sustancias pueden ser polímeros, lípidos, en particular lípidos cationicos, liposomas, proteínas nucleares o lípidos neutrales. Estas sustancias pueden utilizarse solas o en combinación. Una combinación que puede ser considerada es la de un vector de plásmido recombinante que es combinado con lípidos cationicos (DOGS, DC-CHOL, espermina-colesterol, espermidina-colesterol, etc.), los lisofosfolípidos (por ejemplo, Hexadecilfosfocolina) y lípidos neutrales (DOPE). De acuerdo con una modalidad preferida, los lípidos cationicos que pueden utilizarse en la presente invención son los lípidos cationicos descritos en el documento EP901463B1 y más preferiblemente pcTG90. La opción de los plásmidos que pueden utilizarse dentro del contexto de la presente invención es inmensa. Pueden ser vectores clonados y/o vectores de expresión. De una manera general, son conocidos para la persona experta y, mientras que un número de ellos están disponibles comercialmente, es también posible construirlos o modificarlos usando las técnicas de manipulación genética. Los ejemplos que pueden mencionarse son los plásmidos que se derivan de pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) o p Poly (Lathe y colaboradores, 1987, gene 57, 193-201). Preferiblemente, un plásmido que se utiliza en el contexto de la presente invención contiene un origen de replicación que asegura que la replicación es iniciada en una célula productora y/o una célula hospedadora (por ejemplo, el origen ColE1 será elegido para un plásmido que se piense para ser producido en E. coli y el sistema oriP/EBNA1 será elegido si se desea que el plásmido deberá ser auto-replicante en una célula hospedadora de mamífero, Lupton y Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542; Yates y colaboradores, Nature 313, 812-815). El plásmido puede comprender además un gen de selección que permite a las células transfectadas ser seleccionadas o identificadas (complementación de una mutación auxotrófica, gen que codifica resistencia a un antibiótico, etc.). Naturalmente, el plásmido puede contener elementos adicionales que mejoran su mantenimiento y/o su estabilidad en una célula dada (secuencia cer, que promueve el mantenimiento de un plásmido en forma monomérica (Summers y Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103, secuencias para la integración en el genoma de la célula). Con respecto a un vector viral, es posible considerar un vector que se derive de un poxvirus (virus vaccinia, en particular MVA, canarypoxvirus, etc.), de un adenovirus, de un retrovirus, de un herpesvirus, de un alfavirus, de un virus espumoso o de un virus asociado con adenovirus. Es posible utilizar vectores virales de replicación competente o replicación deficiente. La preferencia se dará a usar un vector que no se integre. A este respecto, los vectores adenovirales y los vectores que derivan de poxvirus y preferiblemente del virus vaccinia y MVA son muy convenientes particularmente para implementar la presente in ención. Según una modalidad preferida, el vector viral de acuerdo con la invención deriva de un Virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA). Los vectores MVA y métodos para producir tales vectores se describen completamente en las Patentes Europeas EP83286 y EP206920, así como en Mayr y colaboradores (1975, Infection 3, 6-14) y Sutter et Moss (1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851). De acuerdo con una modalidad más preferida, la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede insertarse en la supresión I, II, III, IV, V y VI del vector MVA y aun más preferiblemente en la supresión III (Meyer y colaboradores, 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutter y colaboradores, 1994, Vaccine 12, 1032-1040). Los retrovirus tienen la característica de infectar, y en la mayoría de los casos de integrarse en, células divisoras y en este aspecto son particularmente apropiadas para uso en relación al cáncer. Un retrovirus recombinante de acuerdo con la invención contiene generalmente las secuencias LTR, una región de encapsidación y la secuencia del nucleótido de acuerdo con la invención, que se coloca bajo control del retroviral LTR o de un promotor interno tal como los descritos abajo. El retrovirus recombinante puede derivarse de un retrovirus de cualquier origen (murina, primate, felino, humano, etc.) y en particular del retrovirus murina MOMuLV (virus de la leucemia murina de Moloney), MVS (virus del sarcoma Murino) o Friend (Fb29). Este se propaga en una línea celular de encapsidación que puede proveer en trans los polipéptidos virales gag, pol y/o env que se requieren para constituir una partícula viral. Tales líneas celulares están descritas en la literatura (PA317, Psi CRIP GP + Am-12 etc.). El vector retroviral de acuerdo con la invención puede contener modificaciones, en particular en la región LTRs (reemplazo de la región del promotor con un promotor eucariota) o de encapsidación (reemplazo con una región de encapsidación heteróloga, por ejemplo, el tipo VL30) (ver Solicitudes Francesas 9408300 y 9705203) La preferencia también se dará a usar un vector adenoviral que carezca toda o una parte de por lo menos una región que sea esencial para la replicación y la cual se selecciona de las regiones E1, E2, E4 y L1-L5 para evitar que el vector sea propagado dentro del organismo hospedador o del ambiente. Se prefiere una supresión de la región E1. Sin embargo, puede combinarse con otra(s) modificación(es)-/supresión(es) que afecten, en particular, toda o una parte de las regiones E2, E4 y/o L1-L5, hasta el punto en que las funciones esenciales defectuosas se complementan en trans por medio de una línea celular de complementación y/o de un virus ayudante. En este aspecto, es posible utilizar vectores de segunda generación de 5 vanguardia (ver, por ejemplo, solicitudes internacionales WO-A- 94/28152 y WO-A-97/04119). A modo de ilustración, la supresión de la parte principal de la región E1 y de la unidad de transcripción E4 es particularmente ventajosa. Con el propósito de aumentar las capacidades de clonación, el vector adenoviral 10 puede carecer además de toda o una parte de la región no esencial E3. De acuerdo con otra alternativa, es posible hacer uso de un vector adenoviral mínimo que retenga las secuencias que son esenciales para la encapsidación , a saber la 5' y 3' ITRs (Repetición Terminal Invertida), y la región de encapsidación. 15 Los varios vectores adenovirales, y las técnicas para prepararlos, son conocidos (ver, por ejemplo, Graham y Prevect, 1991, en Methods in Molecular Biolog, Vol 7, p 109-128; Ed: E.J. Murey, i j The Human Press me). I Además, el origen del vector adenoviral de acuerdo con la 20 invención puede variar desde el punto de vista de la especie y desde el punto de vista del serotipo. El vector puede derivarse del genoma de un adenovirus de origen humano o animal (canino, aviar, bovino, murina, ovino, porcino, simio, etc.) o de un híbrido que comprende fragmentos de genoma adenoviral de por lo menos ! 25 dos diferentes orígenes. Una mención más particular puede i I hacerse de los adenovirus CAV-I o CAV-2 de origen canino, del adenovirus DAV de origen aviar o del adenovirus Bad del tipo 3 de origen bovino (Zakharchuk y colaboradores, Arch. Virol., 1993, 128: 171-176; Spibey y Cavanagh, J. Gen. Virol. 1989, 70: 165-172; Jouvenne y colaboradores, Gene, 1987, 60: 21-28; Mittal y colaboradores, J. Gen Virol., 1995, 76: 93-102). Sin embargo, la preferencia será dada a un vector adenoviral de origen humano que se deriva preferiblemente de un adenovirus de serotipo C, en particular un adenovirus de serotipo C del tipo 2 ó 5. El término "replicacion competente" según es utilizado en la presente se refiere a un vector viral capaz de replicar en una célula hospedadora en la ausencia de cualquier complementación trans. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el vector competente de replicacion es un vector adenoviral competente de replicacion. Estos vectores adenovirales competentes de replicacion son bien conocidos por el experto en la técnica. Entre éstos, los vectores adenovirales suprimidos en la región E1b que codifican el inhibidor 55kD P53, como en el virus ONYX-015 (Bischoff y colaboradores, 1996; Heise y colaboradores, 2000; WO 94/18992), son particularmente preferidos. Por consiguiente, este virus puede utilizarse para infectar y matar selectivamente a las células neoplásticas p53 deficientes. Un experto en la técnica puede también mutar e interrumpir el gen inhibidor p53 en el adenovirus 5 u otros virus de acuerdo con las técnicas establecidas. Los vectores adenovirales suprimidos en la región de unión E1A Rb pueden también utilizarse en la presente invención. Por ejemplo, virus Delta24 que es un adenovirus mutante que tiene 24 pares de supresión base en la región E1A (Fueyo y colaboradores, 2000). Delta24 tiene una supresión en la región de unión Rb y no se une al Rb. Por lo tanto, la replicación del virus mutante es inhibida por Rb en una célula normal. Sin embargo, si se inactiva el Rb y la célula se vuelve neoplástica, Delta24 ya no está inhibido. En cambio, el virus mutante replica eficientemente y lisa la célula Rb deficiente. Un vector adenoviral de acuerdo con la presente invención puede generarse in vitro en Escherichia coli (E. coli) por la ligadura o recombinación homologa (ver, por ejemplo, la solicitud internacional WO-A-96/17070) o bien por la recombinación en una línea celular de complementación. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el vector comprende además los elementos necesarios para la expresión del antígeno. Los elementos necesarios para la expresión consisten de todos los elementos que permiten a la secuencia de ácido nucleico ser transcrita en ARN y el mARN ser traducido en polipéptido. Estos elementos comprenden, en particular, a un promotor que pueda ser regulable o constitutivo. Naturalmente, al promotor es conveniente para el vector elegido y para la célula hospedadora. Los ejemplos que pueden ser mencionados son los promotores eucariotas de PGK (fosfoglicerato cinasa), MT (metalotioneina; Mclvor y colaboradores, 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), a-1 antitripsina, CFTR, tensoactivos, inmunoglobulina, actinia (Tabin y colaboradores, 1982, Mol. Cell Biol. 2, 426-436) y los genes SRa (Takebe y colaboradores, 1988, Mol. Cell Biol. 8, 466-472), el promotor temprano del virus SV40 (virus del Simio), el LTR de RSV (virus del sarcoma de Rous), el promotor HSV-I TK, el promotor temprano del virus CMV (citomegalovirus), los promotores p7.5K ph5R, pK1L, p28 y p 11 del virus vaccinia, y los promotores adenovirales de E1A y MLP. El promotor puede también ser un promotor que estimula la expresión en una célula tumoral o de cáncer. Mención particular puede hacerse de los promotores del gen MUC-I, que está sobreexpresado en cánceres de mama y próstata (Chen y colaboradores, 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782), del gen CEA (derivado del antígeno embrionario del carcinoma), que está sobreexpresado en cánceres de colón (Schrewe y colaboradores, 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748) del gen de tirosinasa, que está sobreexpresado en melanomas (Vile y colaboradores, 1993, Cáncer Res. 53, 3860-3864), del gen ERBB-2, que está sobreexpresado en cánceres de mama y pancreático (Harris y colaboradores, 1994, Gene Therapy 1, 170-175) y del gen a-fetoproteína, que está sobreexpresado en cánceres de hígado (Kanai y colaboradores, 1997, Cáncer Res. 57, 461-465). El promotor temprano de citomegalovirus (CMV) es particularmente preferido. Sin embargo, cuando se utiliza un vector que deriva de un virus Vaccinia (como por ejemplo, un vector MVA), el promotor del gen de la timidina cinasa 7.5K es particularmente preferido. Los elementos necesarios pueden además incluir elementos adicionales que mejoran la expresión de la secuencia del nucleotido de acuerdo con la invención o su mantenimiento en la célula hospedadora. Las secuencias Intron, secuencias de señal de secreción, secuencias de localización nucleares, sitios internos para el reinicio de la traducción de tipo IRES, transcripción de las secuencias de terminación poli A, líderes tripartitos y orígenes de la replicación puede en particular ser mencionados. Estos elementos son conocidos para la persona experta. El vector recombinante de acuerdo con la invención puede también comprender uno o más genes adicionales de interés, siendo posible con esto que estos genes sean colocados bajo el control de los mismos elementos reguladores (módulo policistrónico) o de elementos independientes. Los genes que pueden en particular mencionarse son los genes que codifican los interleucina IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, quimiocinas como CCL19, CCL20, CCL21, CXCL-14, interferones, factor de necrosis de tumor (TNF), factores estimulantes de colonia (CSF), en particular GM-CSF, y factores que actúan en la inmunidad y angiogénesis naturales (por ejemplo, PAI-1, derivado del inhibidor del activador plasminógeno). En una modalidad particular, el vector recombinante de acuerdo con la invención comprende el gen de interés que codifica IL-2. La presente invención además proporciona una composición farmacéutica que comprende una composición de una vacuna, un kit de partes de acuerdo con la presente invención, y un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención además proporciona un proceso para la fabricación de una composición de una vacuna que comprende mezclar PPD con un ácido nucleico que codifica un antígeno. En una modalidad adicional, el proceso además proporciona incorporar la composición de una vacuna dentro de un portador farmacéuticamente aceptable. El portador farmacéuticamente aceptable es preferiblemente isotónico, hipotónico o débilmente hipertónico y tiene una fuerza iónica relativamente baja, tal como por ejemplo, una solución de sucrosa. Por otra parte, tal portador puede contener cualquier solvente, o líquido acuoso o parcialmente acuoso tal como agua estéril apirogénica. El pH de la composición farmacéutica, además, se ajusta y se amortigua para reunir los requisitos de uso in vivo. La composición farmacéutica puede también incluir un diluyente, un adyuvante o un excipiente farmacéuticamente aceptable, así como agentes solubilizantes, estabilizantes y preservativos. Para la administración inyectable, se prefiere una formulación en solución acuosa, no acuosa o isotónica. Puede ser proporcionada en una sola dosis o en una multidosis en forma líquida o seca (polvo, liofilizado y similares) que puede reconstituirse al momento de uso con un diluyente apropiado. Cuando la secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno es de origen plásmido, el portador farmacéuticamente aceptable es de preferencia una partícula usable para la administración por pistola genética. Por ejemplo, el portador puede ser un gránulo de oro. La presente invención además proporciona un método para tratar a un paciente que sufre de o es susceptible de un tumor, por la administración de una composición de una vacuna, un kit de partes o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención. El tumor que se tratará puede ser carcinoma de seno; carcinoma de pulmón, que incluye carcinoma de pulmón de célula no pequeña; o próstata, gástrica, y otros carcinomas gastrointestinales. La presente invención además proporciona un método para tratar a un paciente que sufre o es susceptible de una enfermedad infecciosa, por la administración de una composición de una vacuna, un kit de partes o composición farmacéutica de acuerdo con lo descrito en la presente. El término "enfermedad infecciosa" según es utilizado en la presente, incluye, pero no se limita a cualquier enfermedad que sea causada por un organismo infeccioso. Los organismos infecciosos pueden comprender virus, (por ejemplo, virus de ARN de cadena sencilla, virus de ADN de cadena sencilla, virus de inmuno-deficiencia humana (VIH), virus de hepatitis A, B, y C, virus del herpes simple (HSV), citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), virus del papiloma humano (HPV)), parásitos (por ejemplo, patógenos protozoanos y metazoanos tales como especie de Plasmodia, especie de Leishmania, especie de Schistosoma, especie de Tripanosoma), bacterias (por ejemplo, micobacteria, en particular, tuberculosis M., Salmonelas, Estreptococos, E. coli, Estafilococos), hongos (por ejemplo, especie de Candida, especie de Aspergillus), Pneumocystis carinii, y priones La presente invención además proporciona un método para tratar a un paciente que sufre o es susceptible de alergia, por la administración de una composición de una vacuna, un kit de partes o composición farmacéutica de acuerdo con lo descrito en la presente. La presente invención además proporciona un método para aumentar una inmunorespuesta en un mamífero a un antígeno, el método que comprende la administración al mamífero de los siguientes componentes: (i) PPD, (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno. En una modalidad, el método comprende la administración simultánea de cualquiera de dos componentes (i) y (ii). Alternativamente, el método comprende la administración secuencial de los componentes (i) y (ii). Según es utilizado en la presente, el término "secuencial" significa que los componentes son administrados al sujeto uno después de otro dentro de un tiempo determinado. Por lo tanto, la administración secuencial puede permitir que un componente sea administrado dentro de 5 minutos, 10 minutos o en cuestión de horas después del otro. La presente invención además proporciona un método para elevar una inmunorespuesta en un mamífero contra un estado de enfermedad, que comprende administrar al mamífero una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno con el estado de enfermedad y además administrar al mamífero PPD para elevar la inmunorespuesta. La presente invención además proporciona un método para aumentar la inmunorespuesta de un mamífero a un antígeno, que comprende la etapa de administrar al mamífero dentro de una secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno y además administrar PPD al mamífero. La presente invención además proporciona el uso de PPD en la fabricación de un medicamento para mejorar las inmunorespuestas iniciadas por un antígeno que es expresado como resultado de la administración a un mamífero de una secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno. La presente invención además proporciona el uso de PPD para la fabricación de los medícamentbs para la administración concomitante o secuencial a un mamífero para el mejoramiento de una inmunorespuesta a un antígeno codificado por una secuencia de ácido nucleico, en la cual la secuencia de ácido nucleico está formulada en un medicamento separado. Administrar la composición de una vacuna, el kit de partes o la composición farmacéutica de la presente invención puede lograrse por cualquier medio conocido al experto. Las rutas de 5 administración preferidas incluyen pero no se limitan a intradérmica, subcutánea, oral, parenteral, intramuscular, intranasal, sublingual, intratraqueal, inhalación, ocular, vaginal, y rectal. De acuerdo con una modalidad preferida, la composición de una vacuna, el kit de partes o la composición farmacéutica de 10 la presente invención son suministradas de manera subcutánea o intradérmica. De acuerdo con una modalidad aún más preferida de la invención, el PPD y el ácido nucleico que codifica un antígeno se administran en el mismo sitio. La administración puede ocurrir en una sola dosis o una 15 dosis repetida una o varias veces después de cierto intervalo de tiempo. Deseablemente, la composición de una vacuna, el kit de partes o la composición farmacéutica son administradas 1 a 10 veces en intervalos semanales. La dosis de administración de PPD variará, pero puede ser 20 desde 0.1 Ul a 50 Ul, ventajosamente desde 1 Ul a 10 Ul y más ventajosamente aproximadamente 5 Ul. La dosis de administración de la secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno también variará, y puede adaptarse en función de varios parámetros, en particular el modo i 25 de administración; la composición empleada; la edad, salud, y el i peso del organismo hospedador; la naturaleza y el grado los de síntomas; clase de tratamiento concurrente; la frecuencia del tratamiento; y/o la necesidad de prevención o terapia. El refinamiento adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosificación apropiada para el tratamiento es hecho rutinariamente por un médico, en vista de las circunstancias relevantes. Para guía general, la dosificación conveniente para una composición que contiene MVA varía desde aproximadamente 104 a 1010 pfu (unidades formadoras de placa), deseablemente desde aproximadamente 105 y 108 pfu mientras que la composición que contiene adenovirus varía de aproximadamente 105 a 1013 iu (unidades infecciosas), deseablemente de aproximadamente 107 y 1012 iu. Una composición basada en vectores plásmidos puede administrarse en dosis de entre 10 g y 20 mg, ventajosamente entre 100 g y 2 mg. Preferiblemente la composición se administra en dosis que comprenden desde 5 105 a 5 107 pfu del vector vaccinia de MVA. Cuando el uso o el método de acuerdo con la invención es para tratamiento de cáncer, el método o uso de la invención puede realizarse conjuntamente con una o más modalidades terapéuticas convencionales (por ejemplo, radiación, quimioterapia y/o cirugía). El uso de múltiples métodos terapéuticos proporciona al paciente con una intervención de base más amplia. En una modalidad, el método de la invención puede ser precedido o seguido por una intervención quirúrgica.

En otra modalidad, puede ser precedido o seguido por radioterapia (por ejemplo, radiación gamma). Los expertos en la técnica pueden formular fácilmente protocolos y parámetros de radioterapia apropiados que pueden utilizarse (ver por ejemplo, Pérez y Brady, 1992, Principies and Practice of Radiation Oncology, 2nd Ed. JB Lippincott Co; usando adaptaciones y modificaciones apropiadas como será fácilmente evidente a los expertos en la técnica). La presente invención además se refiere a un método para mejorar el tratamiento de un paciente de cáncer que está experimentando tratamiento quimioterapéutico con un agente quimioterapéutico, que comprende el co-tratamiento del paciente junto con un método como se describe anteriormente. La presente invención además se refiere a un método para mejorar la eficacia citotóxica de fármacos citotóxicos o de la radioterapia que comprende el co-tratamiento de un paciente en necesidad de tal tratamiento junto con un método como el descrito anteriormente. Cuando el uso o método de acuerdo con la invención, es para tratamiento de una enfermedad infecciosa, el método o uso de la invención puede realizarse con el uso de otros compuestos terapéuticos tales como antibióticos, compuestos fungicidas y/o compuestos antivirus. La presente invención además se refiere a un método para mejorar la eficacia terapéutica de un antibiótico, de un fármaco antivirus o fungicida que comprende el co-tratamiento de un paciente en necesidad de tal tratamiento junto con un método como el descrito anteriormente. En otra modalidad, el método o uso de la invención se realiza de acuerdo con una modalidad terapéutica de primer refuerzo que comprende la administración secuencial de una o más composición(es) iniciadora(s) y una o más composición(es) reforzantes. Normalmente, las composiciones iniciadoras y reforzadoras utilizan diferentes vehículos que comprenden o codifican por lo menos un dominio antigénico en común. La composición iniciadora es inicialmente administrada al organismo hospedador y la composición reforzadora es posteriormente administrada al mismo organismo hospedador después de un período que varía desde un día a doce meses. El método de la invención puede comprender una a diez administraciones secuenciales de la composición iniciadora seguida por una a diez administraciones secuenciales de la composición reforzadora. Deseablemente, los intervalos de inyección son una cuestión de una semana a seis meses. Por otra parte, las composiciones iniciadoras y reforzadoras pueden administrarse en el mismo sitio o en sitios alternativos por la misma ruta o por rutas diferentes de administración. Los ejemplos que siguen están pensados para ilustrar los varios temas de la presente invención y son por lo tanto no limitantes en carácter.

Todas las descripciones de patentes, de publicaciones y de entradas de base de datos arriba citadas, están incorporadas específicamente en la presente por referencia en su totalidad al mismo grado como si cada patente, publicación o entrada individual fueran indicadas específicamente e individualmente para ser incorporadas por referencia. La figura 1 representa el porcentaje de ratones libres de tumor después de la inyección de las células tumorales TC1 que expresan las proteínas E6 y E7 de HPV16. Después de la inyección de las células TC1, los ratones fueron vacunados tres veces (en intervalos semanales) con un vector de MVA que expresa el antígeno E6/E7 conjuntamente con PPD, BCG vivo o levimasole. Un MVA vacío y un MVA que codifica el antígeno E6/E7 inyectado solo fueron utilizados como controles. La figura 2 representa el número de células T específico para los epitopes E6/E7 después de la inmunización de los ratones con un vector MVA que codifica el antígeno E6/E7 conjuntamente con la inyección subcutánea de levimasole, BCG vivo o PPD. La figura 3 representa el porcentaje de las células T CD8 + , específicas para un péptido E7 (R9F), después de la inmunización de ratones con un vector MVA que codifica el antígeno E6/E7 conjuntamente con la inyección subcutánea de levimasole, BCG vivo o PPD. Ejemplos 1. Prueba del Artículo a. Denominación y Breve descripción construcción del vector b. Condiciones de almacenaje: Los virus fueron recibidos del Molecular Inmunology Department y después mantenidos a -80°C hasta el día de la inyección. La suspensión viral fue rápidamente descongelada inmediatamente antes de la dilusión y administración. 2. Modelo animal a. Especie/Cepa/Proveedor: Ratones C57BI/6 hembras sanos SPF fueron obtenidos de Charles River (Les Oncins, France). Especificación: Los animales tenían 6 semanas de edad cuando llegaron. Al principio de la experimentación, tenían 7 semanas de edad. Ambiente: Los animales fueron contenidos en un cuarto sencillo, exclusivo, condicionado con aire para proporcionar un mínimo de 11 cambios de aire por hora. Los índices de temperatura y humedad relativa estaban dentro de 20°C y 24°C y 40 a 70% respectivamente. La iluminación fue controlada automáticamente para dar un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. El estado libre de patógeno específico fue comprobado por el control regular de animales centinela. Dieta: A lo largo del estudio los animales tenían acceso ad libitum a la dieta tipo RM 1 esterilizada (Dietex France, Saint Gratien). El agua estéril era proporcionada ad libitum a través de botellas. 3. Descripción de las células a. características de las células / condiciones de uso: Células tumorales TC1: Estas células obtenidas del pulmón de ratones C57BI6, han sido transducidas con 2 retrovirus: LXSN16E6E7 que expresa E6 y E7 de HPV16 y pVEJB que expresa el gene ras. Son un amable obsequio del Dr TC Wu (The Johns Hopkins University, Baltimore, USA). Las células fueron cultivadas en DMEM que contenía 0.5 mg/ml de G418 y 0.2 mg/ml de Higromicina. Las células adherentes fueron retiradas por tratamiento con tripsina y después de 3 lavados, la provocación del tumor fue realizada de manera subcutánea con 2.105 células TC1 viables. 4. Protocolo a. Programa de inmunizaciones: Para los experimentos inmunoterapéuticos, 15 ratones hembras C57BI6 fueron provocados de manera subcutánea en el flanco derecho con 2.105 células TC1 en D1. Los ratones fueron tratados tres veces, de manera subcutánea en tres sitios distantes, con 5.106 pfu de poxvirus (cepa de MVA que expresa la proteína E6/E7 de HPV16) en D8, 15 y 22. 0.5 Ul de tubertest, 5 106 cfu de BCG ó 0.5% de levamisole fue inyectada de manera subcutánea momentos antes de cada inmunización en los sitios de inyección a la piel afeitada de los ratones (aproximadamente 10 cm2). El crecimiento del tumor fue supervisado, dos veces por semana durante 80 días, con un caliper. A los ratones se les practicó la eutanasia por razones éticas cuando el tamaño de su tumor era superior a 25 mm de diámetro o cuando mostraron dolor incluso si el tumor era más pequeño. Para el estudio de inmunogeneticidad, 3 ratones hembras C57BI6 fueron vacunados de manera subcutánea en tres sitios distantes con 5.107 pfu de poxvirus (cepa de MVA) en D1, 8 y 15. Esta dosis fue utilizada para optimizar la detección de la inmunidad celular contra los antígenos de HPV específicos. 0.5 Ul de tubertest, 5 106 cfu de BCG o 0.5% de levamisole fue inyectada de manera subcutánea momentos antes de cada inmunización sobre los sitios de la inyección a la piel afeitada de los ratones (aproximadamente 10 cm2). El bazo y el suero fueron quitados en D22 para el análisis inmunológico. 1. Medida del número/frecuencia de las células secretoras IFNy por Elispot Células frescas del bazo fueron preparadas usando el amortiguador de purificación Lymfolite. Todos los péptidos fueron sintetizados por Neosystem en el nivel de grado inmunológico (10 mg). Cada péptido fue disuelto en DMSO a 10 mg/ml y almacenado a 4°C. Una placa de nitrocelulosa de 96 pozos fue recubierta con 3pg/ml de anticuerpo IFNy anti-ratón monoclonal de rata (clon R4-6A2; Pharmingen, cat. nr551216, Lot M072862; 100µ?/????) en amortiguador de carbonato de sodio. Las placas fueron incubadas durante la noche a 4°C ó 1h a 37°C. Las placas fueron lavadas tres veces con DMEM 10% FCS y saturadas 2 horas a 37°C con 100 µ I DMEM 10% FCS/pozo. Espenocitos fueron plateados a una concentración de 106 cels/???µ?. Interleukine 2 fue agregado a todos los pozos en una concentración " de 61_?/50µ?/???? (R&D Systems) 10 ng/ml). ConcanavalinA fue utilizado como control positivo (5pg/ml). Los péptidos específicos de HPV fueron utilizados en una concentración de 5pg/ml. Las placas fueron incubadas 48 horas a 37°C, 5% C02. La placa fue lavada una vez con PBS IX y 5 veces con PBS-Tween 0.05%. IFNy anti-ratón biotinilado (clon XMG1.2, Pharmingen) fue agregado a la concentración de 0.3pg/1 ??µ?/???? e incubado 2 horas a temperatura ambiente bajo agitación lenta. La placa fue lavada 5 veces con PBS-Tween 0.05%. Extravidin AKP (Sigma, St. Louis, MO) diluido en 1/5000 en PBS-Tween0.05%-FCS1 % fue también agregado a los pozos (1 ??µ?/????). La placa fue incubada 45 minutos a temperatura ambiente y después lavada 5 veces con PBS-Tween 0.05%. La secreción de IFNy fue revelada con el kit de Biorad. 00µ? de sustrato (NBT + BClP) fueron agregadas por pozo y la placa fue dejada a temperatura ambiente por ½ hora. La placa fue lavada con agua y puesta a secar durante la noche a temperatura ambiente. Los puntos fueron contados usando un microscopio de disección. 2. Lista de péptidos analizados: SCVYCKKEL (E6; Db): Péptido S9L RCIICQRPL (E6; Db): Péptido R9L SEYRHYQYS (E6; Kb): Péptido S9S ECVYCKQQL (E6; Db): Péptido E9L TDLHCYEQL (E7; Kb): Péptido T9L RAHYNIVTF (E7; Db): Péptido R9F Péptido irrelevante (específico de influenza) 3. Medida de la frecuencia de las células T CD8 + específicas R9F Tetramer Células frescas del bazo fueron cosechadas y preparadas usando un tamiz específico BD (filtro celular). Espenocitos fueron estimulados durante 5 días con el péptido R9F (5 pg/ml) en placas de 24 pozos o utilizados directamente para el etiquetado específico. 1.106 células fueron filtradas con 1µ? de un anticuerpo específico CD8 de ratón acoplado con APC (BD Pharmingen 553035; clon 53-6.7; lote n° 32567) y 10µ? de Tetramer R9F específico de H-2Db (Beckman Coulter T20071; H-2Db/PE; péptido RAHYNIVTF; lote C507117; C602110) durante 30 minutos a 4°C. Las células fueron lavadas y después diluidas en PBS/0.5% PFA. 4. Resultados: Un experimento" terapéutico se ha hecho en el modelo subcutáneo TC1 de acuerdo con lo descrito en la sección del protocolo. Hemos observado que un pre-tratamiento por una administración subcutánea de 0.5UI de PPD 5% incrementa perceptiblemente la eficacia terapéutica de MVATG8042 por 45% a 65% de los ratones libres de tumor al final del experimento (ver la figura 1). La diferencia estadística en el experimento de supervivencia in vivo entre los diferentes grupos fue determinada usando una aplicación Log Rank (Statistica software 5.1, Statsoft, Inc.) de las curvas de supervivencia Kaplan-Meier. Un P<0.05 se considera estadísticamente significativo. Los adyuvantes previamente descritos (es decir levamisole, BCG vivo), conocidos para mejorar eficientemente vacunas tradicionales no pueden aumentar la eficacia terapéutica de la vacuna de ácido nucleico MVATG8042. Un estudio de inmunogeneticidad también fue realizado en paralelo para buscar la inducción de respuestas celulares contra los antígenos de E6 y E7 de HPV. Los ratones fueron vacunados de acuerdo con lo descrito en la sección del protocolo. En un primer conjunto de experimentos (ver la figura 2), el número de células secretoras IFNy de E6 o E7 específico fueron enumeradas usando un análisis de ELISPOT. Los péptidos restringidos H-2Db E6 y E7 fueron utilizados para monitorear la respuesta de la célula T CD8 después de la inmunización. Hemos observado que el pre-tratamiento con una administración subcutánea de PPD mejora perceptiblemente el número de células CD8 T restringidas de MHC clase I obtenidas, así como el número de péptidos restringidos H-2Db reconocidos. De la misma manera, el número de células T CD8+/R9F Tetramer+ también ha sido medido por análisis de citometría de flujo (figura 3) antes o después de la estimulación in vitro con el epitope inmunodominante R9F E7 específico. Indicando así que el reconocimiento del epitope inmunodominante R9F es mediado claramente por las células T de CD8 específicas. Esta población es relativamente baja en el bazo y un análisis de citometría de flujo requirió una estimulación in vitro con el péptido. El pre-tratamiento con PPD mejora el número de células T CD8 específicas contra este epitope particular en donde el pre-tratamiento con levamisole y BCG vivos no pueden hacerlo (las diferencias observadas no son estadísticamente significativas).

Claims (29)

REIVINDICACIONES

1. Composición de vacuna que comprende (i) PPD y (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno.

2. Kit de partes que comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno, y (ii) PPD.

3. Composición de vacuna o kit de partes de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde el PPD es una composición elegida del grupo que comprende tubertest y tubersol.

4. Composición de vacuna o kit de partes de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el antígeno es un antígeno asociado a tumor (TAA).

5. Composición de vacuna o kit de partes de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el antígeno es un antígeno microbiano.

6. Composición de vacuna o kit de partes de conformidad con la reivindicación 5, en donde el microbiano es un antígeno de un virus, una bacteria, un parásito o un hongo.

7. Composición de vacuna o kit de partes de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el antígeno es un antígeno de un organismo infeccioso.

8. Composición de vacuna o kit de partes de conformidad con la reivindicación 6, en donde el antígeno se selecciona en el grupo que consiste de la región de codificación temprana E6 de HPV, región de codificación temprana E7 de HPV y una parte o una combinación de las mismas.

9. Composición de vacuna o kit de partes de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el antígeno es un alergénico.

10. Composición de vacuna o kit de partes de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la secuencia de ácido nucleico está comprendida en un vector.

11. Composición de vacuna o kit de partes de conformidad con la reivindicación 10, en donde el vector es de origen plásmido o viral.

12. Composición de vacuna o kit de partes de conformidad con la reivindicación 11, en donde el vector es derivado de un poxvirus, de un adenovirus, de un retrovirus, de un herpesvirus, de un alfavirus, de un virus espumoso o de un virus asociado con adenovirus.

13. Composición de vacuna o kit de partes de conformidad con la reivindicación 12, en donde el vector es derivado de un M VA.

14. Composición de vacuna o kit de partes de conformidad con una de las reivindicaciones 10 a 13, en donde el vector además comprende los elementos necesarios para la expresión del antígeno.

15. Kit de partes de conformidad con una de las reivindicaciones 2 a 14, en donde los componentes son para administración sustancialmente simultánea.

16. Kit de partes de conformidad con una de las reivindicaciones 2 a 14, en donde los componentes están dentro de una sola formulación farmacéuticamente aceptable.

17. Composición farmacéutica que comprende una composición de vacuna o un kit de partes de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 16, y un portador farmacéuticamente aceptable.

18. Proceso para la fabricación de una composición de una vacuna que comprende mezclar PPD con una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno.

19. Proceso de conformidad con la reivindicación 18, que comprende además la etapa de incorporar la composición de una vacuna dentro de un portador farmacéuticamente aceptable.

20. Método para tratar a un paciente que sufre o es susceptible de un tumor, por la administración de una composición de vacuna o un kit de partes de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 17.

21. Método para tratar a un paciente que sufre o es susceptible de una enfermedad infecciosa, por la administración de una composición de vacuna o un kit de partes de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 17.

22. Método para tratar a un paciente que sufre o es susceptible de alergia, por la administración de una composición de vacuna, un kit de partes o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9.

23. Método para incrementar una inmunorespuesta de un mamífero a un antígeno, el método que comprende la administración al mamífero de (i) PPD, (¡i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno.

24. Método de conformidad con la reivindicación 23, en donde el PPD y el ácido nucleico son administrados simultáneamente.

25. Método para elevar una inmunorespuesta en un mamífero contra un estado de enfermedad, que comprende administrar al mamífero una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno y además administrar al mamífero PPD para elevar la inmunorespuesta.

26. Método para aumentar la inmunorespuesta de un mamífero a un antígeno, que comprende la etapa de administrar al mamífero una secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno y además administrar PPD al mamífero.

27. Método para mejorar el tratamiento de un paciente con cáncer que esté experimentando tratamiento quimioterapéutico con un agente quimioterapéutico, que comprende el co-tratamiento del paciente junto con un método de conformidad con la reivindicación 20.

28. Método para mejorar la eficacia citotóxica de fármacos citotóxicos o radioterapia que comprende el co-tratamiento de un paciente en necesidad de tal tratamiento junto con un método de conformidad con la reivindicación 20.

29. Uso de PPD en la fabricación de un medicamento para mejorar las inmunorespuestas iniciadas por un antígeno que es expresado como resultado de la administración al mamífero de una secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno.