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MX2008015649A - Sustratos e inhibidores de enzima de escision de antiplasma y metodos de uso. - Google Patents

Sustratos e inhibidores de enzima de escision de antiplasma y metodos de uso.

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MX2008015649A
MX2008015649A MX2008015649A MX2008015649A MX2008015649A MX 2008015649 A MX2008015649 A MX 2008015649A MX 2008015649 A MX2008015649 A MX 2008015649A MX 2008015649 A MX2008015649 A MX 2008015649A MX 2008015649 A MX2008015649 A MX 2008015649A
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MX
Mexico
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antiplasmin
plasma
asn
met
level
Prior art date
Application number
MX2008015649A
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Inventor
Patrick A Mckee
Kyung N Lee
Kenneth W Jackson
Victoria J Christiansen
Original Assignee
Patrick A Mckee
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Patrick A Mckee filed Critical Patrick A Mckee
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Abstract

La presente invención se refiere a inhibidores de la enzima de escisión de antiplasmina para el uso en varias terapias relacionadas a fibrina y ?2-antiplasmina, y a sustratos de APCE, que se peden usar, por ejemplo, en métodos de detección para identificar estos inhibidores. La presente invención se refiere además a métodos para tratar o inhibir la ateroesclerosis y trastornos trombóticos al alterar las relaciones de los tipos de ?2-antiplasmina en plasma.

Description

SUSTRATOS E INHIBIDORES DE ENZIMA DE ESCISION DE ANTIPLASMINA Y METODOS DE USO Campo de la Invención La presente invención se refiere a, pero no se limita a, sustratos e inhibidores de la enzima de escisión de a2-antiplasmina y a métodos de selección para identificar estos inhibidores, y a métodos para tratar condiciones que comprenden fibrina y a2-antiplasmina, incluyendo formación de placas y coágulos y aterosclerosis . Antecedentes de la Invención La a.2-antiplasmina (a2AP) es una proteina de plasma sanguíneo que inhibe rápida y específicamente la enzima, plasmina, que digiere coágulos sanguíneos, si se presentan de forma temprana como depósitos intravasculares de plaqueta-fibrina o como trombos parcial o completamente oclusivos. De manera similar, las actividades de plasmina y a2AP son importantes en el desarrollo y supervivencia de la fibrina como se presenta en inflamación, curación de heridas y virtualmente todas las formas de cáncer y sus metástasis. La a2-antiplasmina (a2AP) humana, también conocida como inhibidor de a2-plasmina, es el inhibidor principal de la plasmina. La plasmina juega un papel crítico en la proteólisis de la fibrina y remodelado de tejido. La pertinencia fisiológica de la inhibición de plasmina por a2AP Ref. : 198910 a la coagulación sanguínea y la hemostasis fibrinolítica se soporta por las siguientes observaciones: (1) la velocidad de inactivación de plasmina libre por a2AP en circulación es mucho más rápida que la digestión con fibrin (ógeno) por plasmina, eliminando de este modo la posibilidad de un estado lítico sistémico y sangrado consecuente; (2) la a2AP se retícula para formar fibrina por el factor XIII de coagulación sanguínea (FXIIIa) activado e inhibe la lisis mediada por plasmina en proporción directa a la cantidad incorporada; y (3) pacientes con deficiencia de a2AP homocigota manifiestan serias tendencias hemorrágicas , en tanto que los heterocigotos tienden a sangrar sólo después de trauma mayor o cirugía. La a2AP humana se sintetiza principalmente en el hígado, y durante la circulación en plasma, la forma precursora segregada, et-a2-antiplasmina (Met-a2AP) , una proteína de 464 residuos que tienen metionina como el N-término, se somete a escisión proteolítica entre Prol2 y Asnl3 (la unión escindible Pi_Pi') para producir Asn-a2-antiplasmina (Asn-a2AP) , una versión de 452 residuos con asparagina como el N-término. La Met-a2AP da cuenta de aproximadamente 30 % de la a2AP en circulación, y la Asn-a2AP da cuenta de aproximadamente 70 %. Cuando la forma Met de la a2AP se encontró en plasma y se secuenció su gen, inicialmente pareció ser una discrepancia en uno de los nucleótidos que codifican para el sexto aminoácido. Los dos grupos encontraron una citidina (C) que da por resultado Arg como el sexto aminoácido, y un grupo encontró timidina (T) , que da por resultado Trp en esa posición. Se sugirió que la diferencia fue debida a un grupo que ha usado células de carcinoma hepático como una fuente de ADN, en tanto que los otros dos grupos usaron células normales. Ahora, se ha determinado que tanto las formas de Arg6 como de Trp6 de et-a2AP existen en muestras normales de plasma humano. Una investigación de a2AP mutante en una familia con tendencias de sangrado identificó la mutación responsable de la a2AP inefectiva junto con tres polimorfismos en el gen de a2AP incluyendo este polimorfismo de nucleótido individual C/T (SNP) ; este estudio examinó 30 donadores normales de sangre y reportó una frecuencia alélica de 0.81/0.19 para el SNP C/T. No se han realizado por más tiempo estudios de una población normal para examinar la frecuencia de homocigotos y heterocigotos, o si el genotipo puede afectar las relaciones de Met- a Asn-a2AP en plasma. El SNP de Arg6Trp se asumió aparentemente como que es un polimorfismo inactivo, pero el examen bioquímico de las dos formas polimórficas de et-a2AP en la producción de la forma derivativa, Asn-a2AP, su incorporación en fibrina y el impacto en la fibrinólisis nunca se han valorado antes del presente trabajo.
Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a inhibidores de la enzima de escisión de antiplasmina para el uso en varias terapias relacionadas a fibrina y a2-antiplasmina, y al sustrato de APCE, que se pueden usar, por ejemplo, en métodos de selección para identificar estos inhibidores. La presente invención se refiere adicionalmente a, pero no se limita a, métodos para tratar o inhibir aterosclerosis y trastornos trombóticos al alterar las relaciones de los tipos de a2-antiplasmina en plasma e inhibir APCE. Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Met-a2AP como por ciento de a2AP total y por genotipo. Se purificó a2AP a partir de cada plasma de personas con los genotipos RR (n = 15), RW (n = 15) y WW (n = 5) ' y las secuencias amino-terminales determinadas por degradación de Edman. Se calculó el por ciento de Met-a2AP a partir de recuperaciones en picomol de Met y Asn en el primer ciclo . Figuras 2a-2b. Los niveles en plasma de APCE en una población normal, y divididos por genotipo. Se determinaron los niveles de APCE en muestras de plasma por ELISA. Figura 2a. Histograma de concentraciones de APCE en una población normal (n = 109) . Figura 2b. Niveles de APCE por genotipo de Met-a2AP.
Figura 3. Escisión de APCE de formas polimórficas de Met-a2AP. Se digirieron cantidades iguales (40 µg) de Met-a2AP(Arg6) y Met-a2AP (Trp6 ) purificados por APCE. Después de detener en tiempos seleccionados, la reacción, se valoraron las muestras por espectrometría de masa por electro-rociado para la cantidad del péptido de 12 aminoácidos amino-terminal producido de cada forma de Met-a2AP. Figura 4. Efecto del genotipo de Met-a2AP en la generación de Asn-a2AP en plasma con el tiempo. Una muestra de plasma de una persona del genotipo RR, RW o WW se incubó a 29°C; en tiempos seleccionados, se purificó a2AP de cada muestra y se sometió a análisis de secuencia amino-terminal. Se calculó la relación de Asn-a2AP/Met-a2AP a partir de recuperaciones en picomol de Met y Asn en el primer ciclo. Figuras 5a-5b. Tiempo de lisis en coágulo de plasma (PCLT) por el genotipo de Met-a2AP. Se determinaron los PCLT de muestras de plasma de personas de RR, RW y WW. Figura 5a. Se dividieron los valores de PCLT por genotipo y se graficaron como media ± S.E.M., para la población total, hombres únicamente y mujeres únicamente. Figura 5b. Por ciento de plasmas que no lisaron (n = 14) en comparación al porcentaje de población total (n = 200) dentro de cada genotipo. Figura 6. Efecto de remoción de APCE en la conversión de Met-a2-AP a Asn-a2-AP con el tiempo. Se extrajo plasma de una persona del genotipo Met-a2AP RR y se dividió en tres alícuotas. Se mezcló una alícuota con mAb de APCE F19 (F19) unido a cuentas de cromatografía y se incubó a 4°C para remover APCE. La segunda alícuota se incubó a 4°C con Ab a-cabra de conejo no específico (RAG) unido a cuentas. La tercera alícuota (RR) no recibió tratamiento. Después de la remoción de las cuentas, cada muestra se incubó a 29°C y se determinaron las relaciones de Asn-a2AP/Met-a2AP en tiempos seleccionados. Además, las cuentas unidas a F19 y las cuentas unidas a RAG se hirvieron con SDS para remover la proteína unida a anticuerpo. Las muestras se sometieron a electroforesis en geles de SDS-PAGE de Bis-Tris al 10 % y se transfirieron a nitrocelulosa . Se identificó APCE (97 kDa) por transferencia Western usando un Ab de cabra a su región amino-terminal, y se visualizó con un sustrato quimioluminiscente . La Figura 7 muestra el efecto inhibidor de Val-boroPro en la conversión de Met-a2AP a Asn-a2AP por APCE. La Figura 8 muestra una secuencia de ejemplo no limitante del péptido FRET (SEQ ID NO: 5) . La Figura 9 muestra varias sustituciones que se pueden hacer en la posición Pi ' del grupo P2-Pi- i', y varias sustituciones que se pueden hacer a residuos en la dirección 5' (dirección N-terminal) del residuo P2, y a los residuos en la dirección 3' (dirección C-terminal) del residuo ??' (SEQ ID NO: 6) . Figura 10. Análisis de LC/MS de péptidos antiplasmina (SEQ ID NO: 7) para determinación de diferentes sustrato en la posición P7 (sexto aminoácido en la dirección 5' del Pi pro) . Aquellos con His(H), Lys (K) y Arg(R) positivamente cargados mejoraron la velocidad de escisión de la unión Proi2-Ni3. Figura 11. Importancia de la posición de Arg con relación a la unión escindible Pro-Asn. Se digirieron cuatro péptidos similares en base a la secuencia amino-terminal antiplasmina (4-17") por APCE y luego se realizó el análisis de LC/MS. Cada solución de reacción contuvo un péptido experimental y el péptido de control, con Arg en la posición P , 7, ?ß ?5 ó P4 (no mostrada) y glicinas en las otras tres posiciones variables para cualquier péptido determinado. La sustitución en P4 dio un resultado que fue aproximadamente el mismo como Ps . Figura 12. Análisis de LC/MS de péptidos antiplasmina para determinación de preferencia de sustrato en las posiciones P4, P3, P2, Pi. Las bibliotecas de péptidos que representan la posición seis hasta 17 de la secuencia antiplasmina humana se trataron con APCE (también conocido como FAP soluble) . La fenilalanina en rojo se adicionó para mejorar la unión a la columna de HPLC de fase invertida. Los aminoácidos comunes a las proteínas, menos cisteína se sustituyeron uno a la vez en cada una de las posiciones Pi hasta P4 (SEQ ID NO: 8). Las velocidades relativas de escisión de la unión Pro-Asn se determinaron por análisis de LC/MS. La Figura 13 muestra una modalidad alternativa de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) que comprende una porción de un péptido de FRET o inhibidor de la presente invención. La secuencia se puede extender en la dirección C-terminal, por ejemplo, ¦ por las secuencias mostradas en la Figura 9 que se extienden desde Ni3, en la dirección N-terminal o que se extienden desde Ni3 en la dirección C-terminal . La Figura 14 muestra el efecto inhibidor de APCE de varios peptidomiméticos inhibitorios (SEQ ID NO: 11-13) a concentraciones de inhibidor de 20 µ?, donde se ha sustituido la prolina con ácido pipecólico. Descripción Detallada de la Invención La Met-a2AP humana es un sustrato fisiológicamente importante de APCE, puesto que la escisión proteolitica entre Prol2-Asnl3 produce el derivado más activo, Asn-a2AP, que se llega a reticular significativamente más rápido a fibrina por FXIIIa que Met-a2AP, y como consecuencia, mejora la resistencia de fibrina a digestión por plasmina. Puesto que la APCE humana aumenta la inhibición de fibrinólisis al incrementar la disponibilidad de la forma de reticulación más rápida (es decir, Asn-a2AP) , los inhibidores potentes y selectivos de APCE que se han descubierto como se describe en la presente permiten la titulación de la producción de Asn-a2AP a menores niveles in vivo, y de este modo mejoran la fibrinólisis tanto endógena como exógena (remoción de fibrina) . Las complicaciones de sangrado usando los tratamientos descritos en la presente son improbables, en base a la observación que las personas heterocigotas para deficiencia de a2AP tienen riesgo hemorrágico mínimo. Por lo tanto, existe una ventaja de seguridad para disminuir la función de a2AP en personas saludables. Particularmente en situaciones clínicas donde es probable la formación de fibrina, los inhibidores de APCE darán por resultado una cantidad disminuida de Asn- 2AP disponible para reticulación a fibrina conforme progrese el desarrollo de trombos o inflamación. Entonces, los niveles endógenos de plasmina generada, o plasmina producida al administrar pequeñas cantidades de un activador de plasminógeno, pueden ser suficientes para efectuar la remoción de fibrina de modo que se mantenga la abertura de los vasos y la función de los órganos y se reduzca al mínimo el riesgo de sangrado. Como se señala anteriormente, APCE escinde Met-a2AP al derivado Asn-a2AP, que se incorpora más eficientemente en fibrina y en consecuencia la hace sorprendentemente resistente a digestión de plasmina. De esta manera, la APCE representa un nuevo objetivo para modulación farmacológica e inhibición del sistema fibrinolitico, puesto que menos generación y por lo tanto menos incorporación de Asn-a2AP da por resultado una remoción más rápida de fibrina por plasmina durante aterogénesis , trombosis, y estados inflamatorios. La presente invención se refiere a inhibidores de la enzima de escisión de antiplasmina para el uso en varias terapias relacionadas a fibrina y a2-antiplasmina, y a sustratos de APCE (enzima de escisión de antiplasmina, por sus siglas en inglés), que se pueden usar, por ejemplo en métodos de detección para identificar estos inhibidores. La presente invención se refiere además a, pero no se limita a, métodos para tratar o inhibir aterosclerosis y trastornos de trombos al alterar las relaciones de tipos de a2-antiplasmina en plasma. En una modalidad preferida, la inhibición de APCE se define en la presente como al menos 50 % de inhibición de actividad de APCE, por ejemplo, a una concentración de inhibidor de 20 µ?. La Asn-a2AP se retícula a fibrina a una velocidad de aproximadamente 13 veces más rápida que Met-a2AP. Una velocidad más rápida de reticulación da por resultado un mayor número de moléculas de antiplasmina unidas a la fibrina recién formada y una resistencia resultante mejorada a fibrinólisis . De esta manera, la inhibición de APCE en plasma puede disminuir el número de moléculas de antiplasmina reticuladas, dando por resultado de este modo coágulos que se remueven más fácilmente durante la fibrinólisis . Por lo tanto, se puede usar un inhibidor especifico para APCE para regular la fibrinólisis . Como se señala anteriormente, la Met-a2AP humana existe en dos formas polimórficas en la posición seis en la secuencia madura, con arginina predominante y triptofano que da cuenta de un porcentaje menor. Se ha descubierto en la presente que la inhibición de APCE puede alterar la relación de a2AP desde aproximadamente 30 % de et-a2AP : 70 % de Asn-a2AP a aproximadamente 60 %-70 % de Met-a2AP:40 %-30 % de Asn-a2AP en el plasma. Modulación de Relación de a2-Antiplasmina En el presente trabajo, se determinó la prevalencia del polimorfismo en una población normal mucho mayor y luego se valoró si se relaciona a la función inhibidora de a2AP. Se proporcionan en la presente resultados con respecto a (1) frecuencias de genotipo del SNP de Arg6Trp en Met-a2AP; (2) cómo cada forma afecta la susceptibilidad a la escisión por APCE; (3) el por ciento de Met-a2AP en plasma para cada uno de los dos polimorfismos; (4) tiempos de lisis de coágulo en plasma con relación al genotipo; y (5) evidencia que la remoción de APCE en circulación impide la conversión de Met- a Asn-a2AP. Materiales y Métodos Materiales Se compró plasma humano congelado, fresco para la purificación de proteínas a partir de Sylvan Goldman Blood Institute (Oklahoma City, OK) . Se compraron células de hibridoma que segregan el anticuerpo F19 de la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) y se cultivaron en medio libre de suero; el anticuerpo F19 se purificó del medio de cultivo usando cromatografía de MEP-Hypercel (Pall, East Hills, NY) . Se obtuvo la aprobación de la junta de revisión institucional (IRB) de la Universidad de Oklahoma, Centro de Ciencias de la Salud para estos estudios (IRB # 10142 y 12189) . Aislamiento de a2AP Se aislaron mezclas de Met-a2AP y Asn-a2AP por una modificación de un procedimiento publicado de purificación usando los dominios peptídicos 1-3 de plasminógeno unidos a Sefarosa 4B como una matriz de afinidad. Se separaron Met-a2AP y Asn-a2AP por cromatografía de inmunoafinidad como se describe anteriormente. La relación de Met-a2AP a Asn-a2AP en muestras de plasma se determinó por comparación de la recuperación en picomol de Met versus Asn en el ciclo uno durante la secuenciación automatizada de proteina por degradación de Edman (Applied Biosystems Procise model 492, Foster City, CA) . Aislamiento de APCE Se purificó APCE de plasma humano como se describe anteriormente (U.S. número de serie 10/774,242). De forma breve, se usaron para la purificación una combinación de precipitación con sulfato de amonio, interacción hidrófoba, y cromatografía de inmunoafinidad . Antes del almacenamiento a -80°C, se adicionó glicerol a la APCE pura para dar una concentración final de 20 %. Determinación de genotipo de a2AP Doscientos voluntarios normales que respondieron de manera aleatoria, que se auto-reportaron como saludables y libres de enfermedad aguda, se reclutaron para donar sangre para la determinación de la frecuencia de genotipo y tiempo de lisis de coágulo en plasma (PCLT; ver siguiente sección) en una población normal. Se aisló el ADN de la sangre entera de cada donador usando un kit sanguíneo de ADN genómico AquaPure (Bio-Rad, Hercules, CA) . La porción de ADN que abarca el SNP de Arg6Trp se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa usando los cebadores de oligonucleótido (5'-GACCTCCTATCCTCATCCCTTT (SEQ ID NO: 1) y 5'- CTGGTTCGGCCCGCTAGTTAG (SEQ ID NO: 2)), dNTP (Takara Mirus Bio, adison, WI), y Taq-ADN-polimerasa de Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Después de la purificación, se purificó el producto de PCR, usando el kit de purificación de PCR MinElute (Qiagen Operon, Alameda, CA) y se secuenció, usando un secuenciador automatizado de ADN ABI3730. Medición de Tiempo de Lisis de Coágulo de Plasma Para medir el tiempo de lisis de coágulo de plasma (PCLT) , se adicionó una mezcla de 1 unidad/mL de trombina, CaCl2 16 mM y 45 IU/mL de urocinasa (µ??) (Abbott, Chicago, IL) a cada plasma de los voluntarios para catalizar la formación esencialmente instantánea de coágulo de fibrina y para iniciar la fibrinólisis ; se determinó la velocidad de la lisis de coágulo de plasma por un método turbidimétrico de placa de microtitulo. Determinación de Velocidades de Escisión Las mezclas de reacción que contienen cantidades iguales (40 µg) de Met-a2AP ( rg6 ) pura y et-a2AP (Trp6) pura se digirieron por APCE. En tiempos seleccionados, se detuvo la digestión al disminuir el pH desde 7.5 a 4.0 con ácido trifluoroacético . Se removieron las proteínas de la mezcla por ultrafiltración centrífuga de Microcon (Millipore, Bedford, MA) usando una membrana de corte de 30 kDa. Los péptidos se aislaron de la mezcla de digestión ultrafiltrada por la unión a el medio de fase invertida POROS-50 (Applied Biosystems, Foster City, CA) envasado en un capilar de purificación de vidrio (Proxeon, Odense, Dinamarca) . Los péptidos entonces se eluyeron desde el POROS-50 directamente en un capilar de nano-rociado de vidrio revestido con metal con 2.0 µ? de ácido acético al 0.5 % en metanol/agua 1:1. El capilar de nano-rociado se montó en la fuente de ionización de nano-rociado de un espectrómetro de masa QSTAR ESI-Quad-TOF operado bajo la versión 1.0 del sofware Analyst QS (Applied Biosystems, Foster City, CA) con un voltaje de rociado iónico de 1400 voltios. Se recolectaron datos sobre un intervalo de masa de 300 a 1500 Da. Las cantidades relativas de los dos péptidos de 12 aminoácidos amino-terminales de a2AP, producidos, (MEPLGRQLTSGP (SEQ ID NO: 3), Mr = 1284.65 para Met-a2AP (Arg6) y MEPLGWQLTSGP (SEQ ID NO: 4), Mr = 1314.63 para Met-a2AP (Trp6 ) , se determinaron al sumar las áreas de los cuatro picos de isótopo más abundante para las formas de carga observadas para cada péptido. Los datos para cada punto de tiempo se normalizaron por una cuantificación similar de un péptido normal interno inerte adicionado que no contuvo prolina . Determinación de Nivel de Antigeno de APCE Se desarrolló un ensayo inmunosorbente enlazado a enzimas (ELISA) para determinar niveles de antigeno en plasma humano. Se preparó un anticuerpo de cabra a la secuencia de 15 aminoácidos amino-terminal de APCE, usando como el inmunógeno, un péptido antigénico múltiple (MAP) construido en nuestro laboratorio para contener ocho copias del péptido amino-terminal enlazado mediante su carboxil-término a un péptido de núcleo de siete Usinas. Este anticuerpo de MAP de cabra (péptido de APCE de 15 residuos amino-terminal) se unió a placas blancas de ensayo .de poliestireno de alta unión (Corning, Corning, NY) y se usó como el anticuerpo de captura. Después de la incubación con diluciones de plasma, se aplicó un anticuerpo monoclonal purificado de hibridomas F19 comercialmente disponible (ATCC, Manassas, VA) , y se siguió por anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa (Sigma, St . Louis, MO) . Se adicionó un sustrato quimioluminiscente, SuperSignal ELISA Pico (Pierce, Rockford, IL) , y se monitorizó la luminiscencia usando un lector de placa BIO-TEK FL600 (Winooski, VT) . Se cuantificó el nivel de antigeno usando APCE humana purificada como la norma. Remoción de APCE de Plasma El mAb F19 se enlazó a cuentas de cromatografía de perfusión de poli (estirenodivinilbenceno) POROS EP 20 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y se enlazó un anticuerpo no específico, anti-cabra de conejo al mismo tipo de medio. El plasma de un donador individual del genotipo RR se dividió en 3 alícuotas, se diluyó 1:1 con PBS y se incubó de manera separada con cada uno de los dos anticuerpos enlazados a cuentas, Ab no especifico o el mAb F19, durante la noche a 4°C. La tercera alícuota no recibió tratamiento. Las cuentas se removieron del plasma por filtración y el plasma entonces se incubó a 29°C. Se removieron las alícuotas en el tiempo cero, 24 horas y 48 horas. Se purificó a2AP de cada alícuota y se determinó la relación Asn-a2AP/Met-a2AP como se describe anteriormente. Después de la remoción del plasma, las cuentas de mAb F19 se lavaron con NaP04 25 mM/NaCl 0.5 M y luego se ebulleron con amortiguador de carga de SDS. El extracto de amortiguador de SDS entonces se separó por electroforesis en un gel de Bis-Tris al 10 % (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transfirió a nitrocelulosa . Se identificó APCE por transferencia Western usando el anticuerpo MAP amino-terminal de cabra como se describe anteriormente en esta sección de Métodos y se visualizó usando el Sustrato Quimioluminiscente de Sensibilidad Máxima SuperSignal West Femto (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) . Resultados Determinación de Genotipo de a2AP Un grupo de 201 voluntarios normales, quienes se reclutaron en dos conjuntos de aproximadamente 100 personas cada uno, separados por aproximadamente dos años, proporcionó muestras sanguíneas para determinar la frecuencia de SNP C/T de a2??. La población total consistió de 61 hombres y 139 mujeres de 21 a 69 años de edad con una etnia que correspondió cercanamente a lo demográfico para una población de Oklahoma como se lista para el año 2000 en el sitio Web del censo norteamericano (factfinder.census.gov). Se determinó el genotipo para 200 de los sujetos. Sólo una muestra de ADN no se amplificó por la reacción en cadena de la polimerasa, posiblemente debido a una mutación que impidió la unión de uno de los cebadores, aunque esto no se ha explorado adicionalmente . Las frecuencias de los genotipos para las dos poblaciones normales fueron esencialmente las mismas con menos de 1 % de diferencia para cualquiera de los genotipos. Después de combinar los dos conjuntos, las frecuencias para la población completa fueron RR 62.5 %; RW 34.0 % ; WW 3.5 %. El alelo R tiene una frecuencia de 79.5 % y el alelo W tiene una frecuencia de 20.5 %. No hubo diferencia en la frecuencia de genotipo entre hombres y mujeres. Debido a que la población fue 72 % caucásica, con los otros 28 % divididos entre 6 categorías étnicas, no fue posible determinar si el genotipo varió entre grupos étnicos. Niveles de Met-a2AP y Asn-a2AP en Plasma Se purificó a2AP de los plasmas de 15 personas del genotipo RR; 15 personas con RW; y 5 con el genotipo WW. La a2AP se secuenció por degradación de Edman y se determinaron las recuperaciones en picomol de Met y Asn para el primer ciclo para calcular el por ciento de Met-a2AP y Asn-a2AP. La Figura 1 muestra resultados significativamente diferentes (p< 0.001) que se dividieron por el genotipo con WW que tiene el más alto porcentaje de Met-ot2AP (56.4 %); RR, lo menor (23.6 %) , y RW que cae entre, en (40.6 %). Para entender el mecanismo para los porcentajes variables de Met-a2AP en plasma humano, se examinó si una variación en el nivel de la enzima que convierte Met-a2AP a Asn-a2AP, es decir, APCE, para explicar las diferencias entre los genotipos. Para investigar esta posibilidad, se desarrolló un método de ELISA para cuantificar el nivel de antigeno de APCE en plasma y luego se determinaron las concentraciones de APCE en plasma de 109 sujetos en nuestra población normal. Como se ve en la Figura 2a, hay una distribución de niveles de APCE en plasma humano normal, que varia desde 38 a 159 ng/ml que no correlaciona con la edad o el género, y a pesar de la sugerencia de una posible asociación de los niveles de APCE con el genotipo (RR: 70.4 ± 26; RW: 66.6 ± 24.5; WW: 64.7 ± 10.1), las diferencias no fueron estadísticamente significativas (Figura 2b). Por lo tanto, parece que los niveles de APCE no dan cuenta de la variación de los niveles de Met-a2AP entre los genotipos. Otra explicación para los diferentes porcentajes de Met-a2AP en los tres genotipos que se exploró fue que Met-a2AP(Arg6) es un mejor sustrato para APCE que Met-a2AP (Trp6) . Para probar esta hipótesis, se purificó a2AP a partir de plasma de RR y y se determinó la velocidad de escisión de cada forma polimórfica, Met-a2AP (Arg6) y Met-a2AP (Trp6 ) , usando espectrometría de masa para monitorizar la generación del péptido amino-terminal de 12 residuos con el tiempo. Como se ve en la Figura 3, las comparaciones de las velocidades de reacción se basaron en el análisis de regresión lineal de puntos de tiempo tempranos y mostraron que APCE escinde Met-a2AP(Arg6) aproximadamente 8 veces más rápido que Met-a2AP (Trp6) . Para examinar si la velocidad de escisión de Met-a2AP en plasma entero da resultados similares en base a la presencia de R o en la posición 6, se obtuvieron muestras frescas de plasma de individuos cuyo genotipo se determinó que es RR, RW y WW, se incubaron a 29°C, con cada una que se analiza a 0, 24 y 48 horas para las relaciones de Asn-a2AP/Met-a2AP . Se purificó a2AP de cada muestra y se determinó la relación de las dos formas polimórficas por recuperación de picomol del residuo amino-terminal en el primer ciclo de la degradación de Edman. Como se ve en la Figura 4, Asn-a2AP se incrementó a una velocidad mucho mayor en plasma de un voluntario normal del genotipo RR que en ya sea los pacientes con genotipo R o WW. Estos resultados concurren obviamente con aquéllos de mezclas de reacción de a2AP pura y APCE que mostraron que APCE escinde Met-a2AP (Arg6 ) aproximadamente 8 veces más rápido que Met-a2AP (Trp6 ) . Lisis de Coágulo de Plasma Se determinaron los tiempos de lisis de coágulo de plasma (PCLT) en muestras sanguíneas de 200 mujeres y hombres que comprenden la población normal. No se intentó controlar las variaciones de la lisis de coágulos que se conoce que se presentan debido a la liberación del activador, interacciones activador-inhibidor, nivel de fibrinogeno o efectos de lípidos y mecanismos de enzima-sustrato; por lo tanto, el género, edad, estatus adrenérgico, fumar, obesidad, consumo de alcohol, mediciones de fibrinogeno y lípidos en suero, medicamento, actividades diurnas, etc., se descartaron como calificadores para participación de voluntarios en el estudio. En cambio, los "participantes" se introdujeron en tanto que reportaron por sí mismos estar en buena salud, creyendo que los tiempos de lisis de los participantes del estudio deben reflejar más o menos el "promedio" de todos los efectos fisiológicos/farmacológicos dentro de cada genotipo en cualquier punto del tiempo y que si en realidad el polimorfismo afectó de manera detectable la lisis de coágulo de plasma bajo las presentes condiciones, entonces se acentuará su importancia potencial. Importante para enfatizar es que los PCLT promedio para hombres se prolongaron significativamente en comparación a valores para mujeres (p = 0.0002). Como se representa en la Figura 5, los PCLT promedios para los grupos de genotipos RR, RW y WW exhibieron una disminución lineal impresionante, pero las diferencias entre los PCLT promedio entre los tres genotipos no fueron estadísticamente significativos. Como se muestra en el panel A de la Figura 5, después de separar los genotipos por género, las diferencias para el PCLT promedio entre los genotipos mostró una tendencia obvia hacia tiempos más cortos de lisis para el genotipo de WW tanto en hombres como en mujeres. Puesto que fue sesgada la distribución de los PCLT, se usaron métodos estadísticos no paramétricos para analizar los datos. Las medias para RR y RW fueron similares y las distribuciones se traslaparon, sugiriendo que el alelo R es dominante. Cuando se fusionaron los grupos RR y RW y se compararon a WW, después de contar la variación debida al género, las diferencias se aproximaron al significado (p = 0.061). Como se señala en la Figura 5, panel B, 12 personas (10 %) del genotipo RR y 2 (3 %) del genotipo RW tienen coágulos de plasma que permanecieron totalmente intactos durante el periodo completo de ensayo de una hora; ninguna persona del genotipo WW tiene un tiempo de lisis >2100 segundos.
Remoción de APCE de Plasma En un esfuerzo para establecer de manera definitiva que APCE es la enzima responsable de la conversión de Met-a2AP a Asn-a2AP, se removió APCE del plasma al incubar el plasma con el anticuerpo monoclonal especifico de FAP, el F19, unido covalentemente a cuentas de cromatografía de POROS. Después de la remoción de las cuentas, se continuó la incubación del plasma durante tiempos seleccionados a 29°C para permitir la conversión de Met-a2AP a Asn-a2AP. La gráfica de la Figura 6 muestra que la relación Asn-a2AP/Met-a2AP en el plasma de control, no incubado con el anticuerpo unido a POROS, se incrementó de 2.62 a 6.12 después de 48 horas de incubación. En un segundo control, específicamente, el plasma incubado con un anticuerpo no específico unido a cuentas de cromatografía POROS, se presentó después de 48 horas un incremento significativo en la relación Asn-a2AP/ et-a2AP desde 2.54 a 5.2. Sin embargo, el plasma incubado con el anticuerpo F19, no mostró incremento en la relación Asn-a2AP/ et-a2AP, 2.4 a 2.17, durante el mismo periodo de incubación, indicando de este modo la remoción de APCE por el anticuerpo F19. Estos resultados demuestran claramente que la remoción de APCE de plasma anula la conversión de Met-a2AP a la forma más corta, de reticulación más rápida de fibrina, Asn-a2AP. Como soporte adicional para esta conclusión, también se demostró por análisis de transferencia Western que en realidad APCE que se unió y removió por mAb F19 unido a cuentas. El análisis de transferencia Western mostrado en la Figura 6 muestra una banda de 97 kDa monomérica de APCE en la muestra eluida de las cuentas enlazadas a F19; esta banda no estuvo presente en las cuentas enlazadas a Ab anti-cabra (RAG) de conejo. Otras bandas visibles fueron el resultado de la unión especifica del Ab secundario a inmunoglobulina en las muestras, que lixivia las cuentas durante la extracción por ebullición en SDS. En el presente trabajo, las dos poblaciones de voluntarios normales que se analizaron en cuadros separados de tiempo fueron esencialmente idénticas, con la frecuencia del genotipo mezclado que es RR, 62.5 %; RW, 34.0 %; y WW, 3.5 %. Los valores de la frecuencia alélica de 0.795/0.0205 están de acuerdo con el otro estudio único de los cuales estamos conscientes, específicamente aquél de Lind y Thorsen, quienes reportaron valores de 0.81/0.19 para la transición de nucleótido individual en 30 donadores sanguíneos normales. Debido a que este polimorfismo se presenta en el péptido amino-terminal de 12 residuos que se remueve de la forma precursora más larga de a2AP, y dado que una arginina (R) hidrófila positivamente cargada se sustituye con un aminoácido hidrófobo, triptofano (W) , se cuestionó si esta diferencia puede afectar la velocidad de escisión del péptido por APCE y la incorporación subsiguiente en la formación de fibrina. Se encontró que APCE pura escindió et-a2AP pura del genotipo aproximadamente 8X más lento en comparación a Met-a2AP pura de plasma de individuos con RR. La Figura 4 muestra claramente que las relaciones de Met-a2AP precursor nativo/Asn-a2AP derivado en muestras de plasma que contienen cada una de las dos formas polimórficas de Met-a2AP cambió espontáneamente con el tiempo cuando se permitió que el plasma recién extraído se incube a 29°C. Esta escisión puede ser debida a los niveles de plasma que se presentan de manera natural de la APCE, puesto que como se muestra en la Figura 6, la remoción de APCE con un anticuerpo monoclonal específico abortó totalmente la generación de Asn-a2AP derivado durante el mismo tiempo de incubación. Puesto que esta escisión se presenta espontáneamente dentro de la sangre en circulación, las relaciones de et-a2AP precursor/Asn-a2AP derivado deben variar dentro del plasma en circulación de los tres genotipos, que en realidad se demostró por el análisis amino-terminal cuantitativo de las formas de a2AP precursora/derivada para cada una de las 35 personas analizadas. Como se predice, las personas del genotipo RR tienen la menor cantidad de Met-a2AP en circulación (23.6 %) ; con RW intermedio, (40.6 %); y WW lo más alto, (56.4 %). Los presentes resultados no se pueden explicar por la variación en los niveles de APCE, puesto que como se representa en la Figura 2b, los niveles de antígeno no fueron significativamente diferentes entre los tres genotipos. La relación entre los genotipos RR, RW y WW y las relaciones et-a2AP/Asn-a2AP correspondientes aumentaron la posibilidad que estas últimas impactarian las actividades fibrinoliticas de los individuos de modo que durante el transcurso de la vida de alguien, la vulnerabilidad de la fibrina intravascularmente generada a la fibrinólisis endógena, y en consecuencia su sobrevivencia, se afectan de manera diferente por el genotipo de Met-a2AP. Como consecuencia, las personas del genotipo WW tendrían Met-a2AP que es menos susceptible a la conversión a Asn-a2AP debido a la escisión por APCE y por lo tanto incorporada de manera menos efectiva en la formación de fibrina, haciendo de este modo cualquier fibrina generada más susceptible a la digestión por plasmina. Se llevaron a cabo experimentos para demostrar esto usando plasma entero para aproximarse a las condiciones nativas tanto como sea posible. Como se indica en la sección anterior, se hizo sólo esfuerzo mínimo para estandarizar las condiciones bajo las cuales se extrajeron todas las muestras de voluntarios saludables, en base a que si en realidad el grupo del genotipo WW tiene tiempos acortados de fibrinólisis, entonces la probabilidad de favorecer esto que es el caso para la mayoría del tiempo. La mayoría de las perturbaciones conocidas que afectan los tiempos de fibrinólisis, ya sea de manera exacta o crónica, están en juego durante el tiempo de vida de cualquiera, y a pesar de estas influencias, se postula que en promedio, el estado fibrinolitico se segregaría de acuerdo al genotipo de Met-a2AP. Notable es que en todos los presentes análisis, las personas del genotipo RR tienen el PCLT promedio más prolongado, con el grupo de RW que está intermedio, y aquellos en el genotipo WW el más corto, sugiriendo que las personas con WW tienen de forma crónica un sistema fibrinolitico más activo que el grupo RW, y ciertamente mayor actividad que aquellos con el genotipo RR. El genotipo RR contuvo un porcentaje mayor que el esperado de personas cuya fibrina nunca se liso, y si éstos fueron valores de PCLT asignados, un segundo por arriba del valor máximo medido para cualquier persona del presente estudio, entonces, para hombres, la asociación de tiempos promedios de lisis con RR y RW logró significado a nivel de p < 0.05. Los presentes resultados indican que durante el tiempo de vida de alguien, el alelo W puede servir como un "factor de protección" (en contraste al término bien entendido, "factor de riesgo") al incrementar la susceptibilidad de desarrollar trombos intravasculares para remoción por plasmina, disminuyendo de este modo el riesgo de aterosclerosis . Adicionalmente, estos resultados demuestran la utilización en el incremento de las relaciones de Met- a2AP/Asn-a2AP para aproximarse a aquéllas que aceleran la fibrinólisis . Al disminuir la función de a2AP, esencialmente el único inhibidor in vivo de plasmina, a niveles que llevan poco riesgo de sangrado principal, como se ejemplifica en las deficiencias heterocigotas de la función de a2AP, y un nivel crónico de actividad litica endógena sostenida, entonces se puede reducir la sobrevivencia y participación de trombos de fibrina-plaqueta intravasculares en el proceso aterosclerótico . En otro trabajo, se tomaron muestras de plasma de pacientes con cáncer de colon metastático quienes se trataron experimentalmente con Val-boroPro oral (talabostat) que ha demostrado que es un inhibidor no especifico de APCE. La Figura 7 muestra que el inhibidor de APCE, Val-boroPro aumenta el porcentaje de Met-a2AP en plasma indicando menos conversión de et-a2AP hacia Asn-a2AP por APCE. La fibrina es clave a la estabilización de plaquetas conforme se adhieren y agregan en un sitio de lesión de una pared arterial durante la etapa temprana del desarrollo de placa. La fibrina continúa siendo dejada como lipido oxidado y los macrófagos se infiltran en el sitio de lesión, y la placa crece para meterse gradualmente en el diámetro del lumen con riesgo de ruptura y formación oclusiva aguda de trombos. Durante todas estas etapas, si la fibrina contiene a2plasmina alta o máxima, entonces se disminuye la vulnerabilidad de la fibrina a la remoción por el sistema fibrinolitico endógeno, que si la fibrina contiene menos cantidades de inhibidor de a2AP . Con mayores niveles sanguíneos en circulación de a2AP precursora, (Met-a2AP) menos a2AP total se llega a reticular a fibrina, provocando que la fibrina se digiera más fácilmente y depure del sitio de placa por la encima fibrinolítica, plasmina. Sin embargo, si su derivado, Asn-a2AP, domina, entonces la fibrina es más resistente a remoción por fibrinólisis . Al inhibir APCE, entonces se incrementa et-a2AP en la concentración en sangre y cualquier fibrina que se forme se remueve más fácilmente por el sistema fibrinolitico propio de cualquiera. Sustratos de Péptido de Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia La presente invención en una modalidad contempla un péptido de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET-péptido) que tiene una unión escindible de P-N (prolina-asparagina) (??-??') y que tiene una G (glicina) en la posición P2 en la dirección 5' de la prolina Pi. El FRET-péptido comprende un grupo de escisión, por ejemplo, DABCYL, en un lado de la unión ????' y un grupo fluoróforo, por ejemplo, EDANS, en el otro lado de la unión escindible. De manera preferente, el FRET-péptido tiene hasta 13 residuos de aminoácido en la dirección 5' de la prolina ?? y hasta 13 residuos en la dirección 3' del residuo de asparagina Pi ' (es decir, el péptido completo que incluye hasta 28 aminoácidos) . El aminoácido que tiene el grupo de escisión (por ejemplo, lisina) puede ser uno de hasta 13 aminoácidos en la dirección 5 ' o en la dirección 3' del grupo ??-??' y el aminoácido que tiene el grupo fluoróforo (por ejemplo, ácido glutámico) puede ser uno de hasta 13 aminoácidos en la dirección 5' o dirección 3' del grupo ??-??' . De manera preferente, los grupos de escisión y fluoróforo están en los extremos distantes del FRET-péptido, y de manera preferente al menos un extremo del péptido se termina con un residuo de arginina (u otro aminoácido positivamente cargado) , o de manera alternativa, un extremo puede tener un aminoácido positivamente cargado y el otro extremo puede tener un aminoácido negativamente cargado. Los términos "heterociclo" o "heterociclico" se refieren a estructuras de anillo, preferentemente estructuras de anillo de 4, 5, 6, ó 7 miembros, y de manera más preferente anillos de 5 a 6 miembros, cuyas estructuras de anillo incluyen de uno a cuatro heteroátomos tal como nitrógeno, azufre u oxigeno. Los grupos heterociclicos incluyen, pero no se limitan a, tiofeno, furano, pirano, pirrol, imidazol, pirazol, isotiazol, isoxazol, piridina, pirazina, pirimidina y piridazina . El anillo heterociclico puede estar sustituido en una o más posiciones con sustituyentes tal como, por ejemplo, halógeno, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, cetona, aldehido, éster, heterociclico, una porción aromática o heteroaromática, CF3, CN, o similares. El término "carbociclo" o "carbocíclico" , como se usa en la presente, se refiere a un anillo aromático o no aromático en el cual cada átomo del anillo es carbono, preferentemente a anillos de 4, 5, 6 ó 7 carbonos, y de manera más preferente a anillos de 5 y 6 carbonos. Los análogos de prolina, y derivados, de los compuestos peptidomiméticos de la presente invención pueden existir en formas geométricas o estereoisoméricas particulares. La presente invención contempla todos estos compuestos, incluyendo isómeros cis y trans, enantiómeros R y S, diastereómeros, (D) -isómeros, (L) -isómeros, las mezclas racémicas de los mismos, y otras mezclas de los mismos, como caigan dentro del alcance de la invención. Pueden estar presentes átomos de carbono, asimétricos, adicionales, en un sustituyente tal como un grupo alquilo. Todos estos isómeros, asi como la mezcla de los mismos, se propone que se incluyan en esta invención. La Figura 8 muestra un ejemplo de un FRET-péptido (SEQ ID NO: 5) que tiene la secuencia nativa de aminoácidos que circunda la unión ??-??' de la forma Arg6 de Met-a2-AP. En este caso, se muestra la secuencia máxima, preferida, completa de un FRET-péptido que se va a usar para imitar las características del sustrato del péptido N-terminal de Met-a2-AP. El fundamento para incluir hasta 13 residuos en cualquier lado de la unión de escisión es incluir igual número de residuos de aminoácido en cualquier lado de la unión ??-??', puesto que este nivel de simetría reduce al mínimo problemas estéricos potenciales conforme la enzima y el sustrato se unen para escindir la unión Pi2_ i3 (es decir, ??-??')· En esta modalidad, los grupos arginina opcionales en cada término mejoran la solubilidad de los derivados de péptido cuando se escinde la unión -P-N-. Gn y P12 (es decir, P2-Pi) son aminoácidos preferidos que no se pueden sustituir por otros aminoácidos que se presentan de manera natural si el péptido se propone que sea un sustrato escindible. La prolina puede estar sustituida con otros derivados o análogos de prolina o aminoácidos tipo prolina en péptidos propuestos para el uso como inhibidores. Pi2-Ni3- es la unión escindible. Pi2, como se señala, se puede sustituir para formar un inhibidor. Los grupos fluorescentes y de escisión del FRET-péptido, se acoplan cada uno a aminoácidos, tal como E y K cerca de los términos en esta modalidad. Mi es el residuo de metionina N- terminal de la secuencia nativa del precursor a2AP. La Figura 9 muestra una secuencia alternativa de FRET-péptido (SEQ ID NO: 6) que tiene permutaciones potenciales de aminoácidos sustitutos aceptables en posiciones especificas de un péptido que comprende los aminoácidos 8-18 del péptido de la Figura 8. En una modalidad preferida del FRET-péptido, el grupo de escisión y el grupo fluoroforo se acopla cada uno a un residuo de aminoácido que están en cualquier lado de la unión escindible y que están preferentemente dentro de 1.0 a 5.0 nm de la unión escindible. En otra modalidad preferida, cada grupo de escisión y fluoroforo se une a cualquiera de los residuos en la dirección 5' del residuo de glicina de P2, o en la dirección 3' del residuo de ??' (asparagina o un aminoácido apropiadamente sustituido) , en donde el grupo de escisión está en un lado del residuo P2 o ?? ' , y el grupo fluoroforo está en el lado del residuo de P2 o Pi 1 , opuesto al grupo de escisión. Se realizaron experimentos usando sustratos de péptido para investigar cómo las variaciones estructurales (sustituciones de aminoácidos) en y cerca del sitio de escisión de antiplasmina afecta la escisión de antiplasmina por APCE. La secuencia de aminoácidos de Met-a2AP que circunda la unión P1-P1' escindida por la enzima de escisión de antiplasmina (es decir, Pro-Asn) se usó como una guia para producir péptidos sintéticos idénticos de longitud variable para determinar residuos importantes para mejorar la escisión del péptido, asumiendo que las velocidades de escisión son proporcionales a la unión. La prolina (o un análogo o sustituto de prolina carbociclico o heterociclico) en la posición Pi es un residuo necesario para la unión a APCE, como es glicina en la posición P2 en la dirección 5' y adyacente a la prolina o sustituto de prolina o residuo análogo. Trabajando a través de un conjunto de sustituciones en varios residuos en la dirección 5' desde la prolina Pi, se encontró que un aminoácido positivamente cargado (por ejemplo, arginina, lisina o histidina) en P7 (es decir, el sexto residuo en la dirección 5' de la prolina) o en las posiciones P5 ó P6 fueron particularmente favorables para aumentar al máximo la unión a APCE y de esta manera la velocidad de escisión (Figuras 10 y 11). La marcación mostrada en la misma en referencia a P5, P6, P7 se refiere a los residuos como se numeran de forma creciente desde el residuo Pro en la unión escindible en la dirección N-terminal. Pro por ejemplo es Pi, con el número subíndice que se incrementa en la dirección 5'. La Figura 10 muestra que una arginina en la dirección 5', o cualquier aminoácido positivamente cargado, es crítico para aumentar al máximo la velocidad de escisión de la unión ??-??' por APCE en un péptido que tiene SEQ ID NO: 7.
La Figura 11 indica que al sustituir arg en P4, P5, P6 y Pe r se determinó que P5 y ?ß son al menos tan efectivos como la arg en la posición P7 nativa, con P6 que es mejor. P4 y P8 son significativamente inferiores y no mostraron mejora a la escisión de la unión escindible. Además de la presencia de una carga positiva en P5, P6, ó P7 que tiene un efecto acelerador en la escisión de la unión escindible, también hay un requerimiento de espaciado para que el efecto de la carga positiva sea máximo. En la posición P7, Arg fue el aminoácido más óptimo con una velocidad de escisión relativa de aproximadamente 5-10 veces más rápida que otros aminoácidos excepto lys, que fue aproximadamente 70 % de la velocidad de arg (Figura 10). El efecto mejorador de arginina en la posición P7 (el sexto residuo en la dirección 5' de la prolina de Pi) también se observó (Figura 11) cuando arginina estuvo en la posición P6 ó P5 (es decir, 4 ó 5 residuos en la dirección 5' de la unión Pi_Pi') / pero las velocidades de escisión disminuyeron cuando arg estuvo en las posiciones P8, Pi , P3 ó P2 de la unión P1-P1' (Figuras 11 y 12). La Figura 12, por ejemplo, muestra el efecto de sustituir cada uno de los 19 aminoácidos en cada una de las posiciones P3.-P4 de secuencia de aminoácidos en un péptido (SEQ ID NO: 8) y el efecto en la velocidad de reacción de escisión de la unión P1-P1' del péptido por APCE. Los residuos positivamente cargados, lys e his, se pueden sustituir por arg en las posiciones P7, P6 y P5 (ver Figura 10 para P7) , indicando que el efecto en la velocidad de escisión de P1-P1' es sustancialmente dependiente de la carga positiva (aunque pro, phe, tyr, trp, y algunos otros aminoácidos tengan niveles parciales de actividad (Figura 10)). En una modalidad alternativa, el FRET-péptido de la presente invención comprende una secuencia peptidica como se muestra en la Figura 13 (SEQ ID NO: 9) en donde las posiciones X1-X5 y ¾ pueden comprender un aminoácido seleccionado del grupo de aminoácidos indicados más adelante, cada uno de X1-X5 y Xa, con la condición que al menos uno de X1-X3 se seleccione de R, H y K (es decir, es un aminoácido positivamente cargado) . Adicionalmente, puede estar ausente al menos uno de Xi, X2 y X3. Como se señala anteriormente, el FRET-péptido que comprende SEQ ID NO: 9 (o cualquier péptido o peptidomimético) comprende preferentemente hasta e incluyendo 28 aminoácidos. El FRET-péptido que comprende SEQ ID NO: 9 comprende de manera preferente un grupo de escisión y un fluoróforo en lados opuestos de la unión gly-pro. SEQ ID NO: 9 puede comprender además un péptido 1-1Orner en la dirección 5' del aminoácido N-terminal en la dirección N-terminal y que puede comprender cualquiera de los 20 aminoácidos naturales, y puede comprender además un péptido l-10mer en la dirección 3' del aminoácido C-terminal en la dirección C-terminal y que puede comprender cualquiera de los 20 aminoácidos naturales. Como se señala anteriormente, el sustrato del péptido de transferencia de energía de resonancia fluorescente puede comprender el grupo de escisión en la dirección 5' de la unión Pi-Pi' y el fluoróforo en la dirección 3' de la unión ??-Pi ' , o el péptido de transferencia de energía de resonancia fluorescente puede comprender el grupo de escisión en la dirección 3' y el fluoróforo en la dirección 5' de la unión ??-??' . La Pi es preferentemente prolina o un análogo o sustituto efectivo de prolina, como se describe en la presente, Pi 1 es preferentemente asparagina, y un grupo P2 en la dirección 5' de ?? es preferentemente glicina. Detección para Inhibidores de APCE En una modalidad particular, la invención comprende un método para seleccionar inhibidores de la enzima de escisión de antiplasmina, que comprende: proporcionar un péptido de transferencia de energía de resonancia fluorescente como se contempla en la presente, que comprende una unión Px-Pi ' y que comprende un fluoróforo (por ejemplo, EDANS) y un grupo de escisión (por ejemplo, DABCYL) separado por la unión ??-??' tal que el péptido se puede escindir por la enzima de escisión de a2-antiplasmina, proporcionar una cantidad de enzima de escisión de a2-antiplasmina, exponer la enzima de escisión de a2-antiplasmina a un candidato de inhibidor de enzima de escisión de a2-antiplasmina para formar una mezcla de prueba, combinar la mezcla de prueba con el péptido de transferencia de energía de resonancia fluorescente, y medir la emisión de fluorescencia de la mezcla de prueba para identificar cuándo se inhibe la actividad de la enzima de escisión de a2-antiplasmina por el candidato de inhibidor de enzima de escisión de a2-antiplasmina . Inhibidores de APCE Como se describe en la presente, se han usado en la presente para el desarrollo del inhibidor, varias variaciones de secuencia del FRET-péptido y la secuencia peptídica que circunda la unión escindible de a2AP . En particular, las sustituciones de la prolina de la unión escindible con análogos de prolina han conducido a desarrollo de inhibidores específicos de APCE como se describe en la presente. De esta manera, la presente invención contempla peptidomiméticos inhibidores de APCE que tienen hasta 28 aminoácidos o más, y que comprende derivados y análogos de prolina para el uso como un sustituto de prolina Pi, que incluye, pero no se limita a, los análogos y derivados de prolina mostrados en la Tabla I. Los peptidomiméticos comprenden de manera preferente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ó 28 aminoácidos, no incluyendo compuestos separadores para separar ciertos aminoácidos del compuesto, o compuestos que se pueden unir o formar complejos a estos para extender la vida en suero del péptido, tal como PEG u otros portadores o materiales poliméricos. De manera preferente, un inhibidor de APCE que posee un residuo positivamente cargado a una distancia que corresponde a la longitud de cuatro a siete residuos en la dirección 5' de la unión escindible P1-P1' (3.5-24 Á, es decir, .35 nm - 2.4 nm) de esta manera se puede usar como un inhibidor rápido, efectivo de unión estrecha de la APCE. Además, estos inhibidores pueden ser útiles para la inhibición de la enzima cercanamente relacionada, proteina de activación de fibroblasto (FAP) y de esta manera para el tratamiento de trastornos que se relacionan a FAP, por ejemplo como se describe en la patente de los Estados Unidos número 6,949,514. El espaciado de la carga positiva en cualquiera de las posiciones P5, P6 ó P7 de la unión escindible Pi-Pi' es una determinante pertinente y por lo tanto cualquier aminoácido u otro separador construido de sustancias inertes o neutrales que rellene este espacio para lograr la longitud aproximada (es decir, .35 nm - 2.4 nm) será efectivo en la construcción de un inhibidor de APCE/FAP. En una modalidad particularmente favorable del FRET-péptido o inhibidor de APCE, la arginina (u otro aminoácido positivamente cargado) está dentro de 6 - 21 Á, ( .6 nm - 2.1 nm) de la prolina (o sustituto de residuo de Pi) en la unión escindible.
El inhibidor en una versión preferida comprende una secuencia que tiene 2-6 aminoácidos en la dirección N-terminal de la unión ??-??', incluyendo un aminoácido positivamente cargado (por ejemplo, arginina, lisina, o histidina) , y de manera preferente pero no necesariamente, incluye un enlace de pro-asn en ??-??' y de manera preferente una glicina en P2 y de manera preferente un aminoácido negativamente cargado o aromático (por ejemplo, asp, glu, trp, tyr, y phe) en una posición en la dirección 3' (dirección C-terminal) desde la unión ??-?? ' . En una modalidad preferida de un inhibidor o FRET-péptido de la presente invención, el compuesto puede comprender un grupo separador (ligador o de relleno) entre la unión escindible y el aminoácido positivamente cargado en el lado N-terminal, en donde el aminoácido positivamente cargado, por ejemplo, arg, his, o lys, está en una posición equivalente a P7, P6 ó P5 (por ejemplo, ver Figura 14) . El separador (es decir, ligador o agente de relleno) entre el grupo de unión escindible y el aminoácido positivamente cargado en la posición P5, P6 ó P7 puede comprender por ejemplo una pluralidad de aminoácidos neutrales, no cargados (por ejemplo, glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, metionina, triptofano, tirosina, treonina, serina, y más preferentemente serina, glicina, alanina, ß-alanina, ácido ?-aminobutirico, ácido épsilon-amino-caproico; o derivados de amino-PEG tal como ácido 8-, 11-, ó 14-amino-3, 6, 9, 12-tetraoxatetradecanoico y oligómeros de PEG (por ejemplo, n = 2-6) ) . Estos separadores pueden ser homogéneos (por ejemplo, todos, glicina, alanina, etc., u otro aminoácido individual) o heterogéneos (por ejemplo, más de un tipo de aminoácido o una molécula híbrida de aminoácido/PEG) , y es preferentemente de 3.5-21 Á (.35 nm - 2.1 nm) (ó 1 a 7 aminoácidos) de longitud. El separador puede estar comprendido de monómeros neutrales tal como etilenglicol , por ejemplo, u otras unidades monoméricas similares (por ejemplo, propilenglicol ) , que tiene una longitud de 3.5 - 21 Á (.35 nm - 2.1 nm) tal que el separador coloca la arginina (u otro aminoácido positivamente cargado) dentro de aproximadamente 5 - 25 Á (.5 nm - 2.5 nm) de la prolina o sustituto o análogo de prolina de la unión escindible. Por lo tanto, la presencia de un aminoácido positivamente cargado dentro de la distancia como se define en la presente es un aspecto de la invención que contribuye de manera específica a la especificidad de unión a la secuencia de APCE. Además, cuando los aminoácidos dentro de este-espacio están sustituidos con polietilenglicol de longitudes de 3.5 - 21 Á (.35 nm - 2.1 nm) , la velocidad de escisión de la unión P12-N13 permanece máxima para el siguiente péptido, X-R6- (PEG3) -Gii-Pi2-N13-Qi -Ei5 (SEQ ID NO: 10), en donde (PEG3) representa polietilenglicol que contiene tres unidades de etilenglicol y X es cualquier aminoácido. Dada la especificidad del efecto de carga positiva que debe estar dentro de una cierta distancia desde P12 (Pi), este péptido pegilado es la base para el desarrollo del inhibidor a través de modificaciones o sustituciones selectivas de prolina, P12, para inhibir la actividad de proteinasa de APCE. La Figura 14 muestra el efecto inhibidor de APCE de varios péptidos (SEQ ID NO: 11-13) con las secuencias indicadas en 20 µ de cada péptido cuando Prol2 está sustituido con ácido pipecólico, un análogo de prolina. En una modalidad preferida, la invención comprende un compuesto que tiene la fórmula: Xaai - Spi - Gly - Cyc - Xaa2 - Sp2 - Xaa3 (Fórmula I) · En esta modalidad, Xaai es un aminoácido positivamente cargado, incluyendo pero no limitado a, arginina, histidina, o lisina. Spi es una molécula separadora que comprende de 1 a 6 aminoácidos, preferentemente aminoácidos neutrales que incluyen serina, glicina, alanina, o ß-alanina, o ácido gamma-amino-butirico, ácido épsilon-amino-caproico, ácido 8-amino-3 , 6, 9, 12-tetraoxatetradecanoico, ácido ll-amino-3, 6, 9, 12-tetraoxatetradecanoico, ácido 14-amino-3, 6, 9, 12-tetraoxatetradecanoico, o PEGn o PPGn, en donde n = 1-6 unidades de etilenglicol o propilenglicol , y en donde Spi tiene una longitud de 3 Á a 21 Á (.3 nm - 2.1 nm) . Gly es glicina. Cyc es un anillo carbociclico o heterociclico . El anillo carbociclico puede comprender 4, 5, 6, ó 7 átomos de carbono, y el anillo heterociclico puede comprender 4, 5, 6, ó 7 átomos, por ejemplo en donde al menos un átomo es un heteroátomo tal como nitrógeno. Xaa2 es preferentemente glutamina, asparagina, serina, histidina, tirosina, alanina, o fenilalanina, o cualquier aminoácido natural que pueda servir como el átomo Pi ' en la unión escindible ??-??' del compuesto de la presente invención. Sp2 es una molécula separadora y puede estar ausente, o puede comprender de 1 a 6 aminoácidos, preferentemente aminoácidos neutrales que incluyen serina, glicina, alanina, ß-alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, o ácido gamma-amino-butírico, ácido épsilon-amino-caproico, ácido 8-amino-3, 6, 9, 12-tetraoxatetradecanoico, ácido 11-amino-3, 6, 9, 12-tetraoxatetradecanoico, ácido 14-amino-3, 6, 9, 12-tetraoxatetradecanoico, o PEGn o PPGn, en donde n = 1-6 unidades de etilenglicol o propilenglicol , y en donde Spi tiene una longitud de 3 Á a 2.1 Á ( .3 nm - 2.1 nm) . Xaa3 es ácido glutámico, ácido aspártico, triptofano, tirosina, o fenilalanina, o cualquier aminoácido negativamente cargado, o aminoácido aromático. El compuesto puede comprender adicionalmente un oligopéptido N-terminal que tiene de 1 a 10 aminoácidos que se extienden en una dirección N-terminal desde Xaai, y un oligopéptido C-terminal que tiene 1-10 aminoácidos que se extienden en la dirección C-terminal desde Xaa3, en donde el oligopéptido N-terminal y el oligopéptido C-terminal puede comprender uno o más de los 20 aminoácidos que se presentan de manera natural. El compuesto se coloca de manera preferente en un portador farmacéuticamente aceptable como se describe en otra parte de la presente. En una modalidad, la invención es un método para alterar una relación en plasma de a2-antiplasmina en un sujeto que tiene un nivel de pretratamiento de et-a2-antiplasmina en plasma y un nivel de pretratamiento de Asn-a2-antiplasmina en plasma. En particular, el método comprende tratar el sujeto con un inhibidor de la enzima de escisión de antiplasmina en donde el inhibidor inhibe de manera especifica la escisión del sitio de escisión de Pro-Asn Met-a2-antiplasmina por la enzima de escisión de antiplasmina, en donde después del tratamiento el sujeto tiene un nivel de post-tratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma que es al menos 5 % mayor que el nivel de pretratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma, y tiene un nivel de post-tratamiento de Asn-a2-antiplasmina en plasma que es al menos 5 % menor que el nivel de pretratamiento de Asn-a2-antiplasmina, alterando de este modo la relación de a2-antiplasmina en plasma en el sujeto. En el método, la alteración de la relación de a2-antiplasmina en el sujeto mejora preferentemente la fibrinólisis en el sujeto. En particular, el método es un tratamiento para inhibir o tratar aterosclerosis , trombosis arterial, trombosis venosa, apoplejía, o embolia pulmonar. En una modalidad del método, el nivel de posttratamiento de et-a2-antiplasmina en plasma es al menos 10 % mayor que el nivel de pretratamiento de Met-a.2-antiplasmina en plasma, y el nivel de post-tratamiento de Asn-a2-antiplasmina en plasma es al menos 10 % menor que el nivel de pretratamiento de Asn-a2-antiplasmina en plasma. En otra modalidad, el nivel de post-tratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma es al menos 15 % mayor que el nivel de pretratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma y el nivel de post-tratamiento de Asn-a2-antiplasmina en plasma es al menos 15 % menor que el nivel de pretratamiento de Asn-ct2-antiplasmina en plasma. En otra modalidad, el nivel de posttratamiento de Met-a,2-antiplasmina en plasma es al menos 20 % mayor que el nivel de pretratamiento de Met-a,2-antiplasmina en plasma y el nivel de post-tratamiento de Asn-a2-antiplasmina en plasma es al menos 20 % menor que el nivel de pretratamiento de Asn-a,2-antiplasmina en plasma. En otra modalidad del método, el nivel de post-tratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma es al menos 25 % mayor (y puede ser, por ejemplo, cualquier porcentaje mayor) que el nivel de pretratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma y el nivel de post-tratamiento de Asn-a2-antiplasmina en plasma es al menos 25 % menor (y puede ser, por ejemplo, cualquier porcentaje menor) que el nivel de pretratamiento de Asn-ot2-antiplasmina en plasma. La invención es preferentemente, en una modalidad, un método para tratar o inhibir aterosclerosis, trombosis arterial, trombosis venosa, apoplejía, o embolia pulmonar en un sujeto que tiene un nivel de pretratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma y un nivel de pretratamiento de Asn-a2-antiplasmina al alterar el nivel de a2-antiplasmina en el sujeto. El método comprende tratar el sujeto con un inhibidor de la enzima de escisión de antiplasmina en donde el inhibidor inhibe de manera específica la escisión del sitio de escisión de Pro-Asn de Met-a2-antiplasmina por la enzima de escisión de antiplasmina, en donde después del tratamiento el sujeto tiene un nivel de post-tratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma que es al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, ó 25 % mayor (o cualquier porcentaje mayor) que el nivel de pretratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma, y tiene un nivel de posttratamiento de Asn-a2-antiplasmina en plasma que es al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, ó 25 % menor (o cualquier porcentaje menor) respectivamente, que el nivel de pretratamiento de Asn- a2-antiplasmina, alterando de este modo la relación de a2-antiplasmina en plasma en el sujeto. La alteración de la relación de a2-antiplasmina en el sujeto se presenta de manera preferente por mejora de la fibrinólisis en el sujeto. La presente invención contempla adicionalmente compuestos terapéuticos para tratar cánceres y trastornos que comprenden FAP tal como aquéllos descritos en la patente de los Estados Unidos número 6,949,514, que se incorpora expresamente en la presente como referencia. Los compuestos terapéuticos comprenden los inhibidores de APCE de la presente invención como se describe en la presente que se conjugan a compuestos portadores que son capaces de pasar a través de la membrana celular, incluyendo, pero no limitado, a dominios de transducción de proteina (PTD) . Los PTD son péptidos positivamente cargados o moléculas tipo péptido que permean las bi-capas lipidicas de la membrana celular. Típicamente, los PTD contienen varios residuos de arginina y se pueden usar para distribuir otros agentes, tal como péptidos, proteínas, oligonucleótidos o moléculas pequeñas a través de una membrana celular y en el citosol. Un PTD es un transportador molecular altamente eficiente formado al sintetizar un oligómero de argininas que se alteran con eACA. Los ejemplos de PTD que se pueden usar en la presente invención se muestran en las patentes de los Estados Unidos números 7,166,692; 7,217,539; 7,053,200; 6,835,810; 6,645,501; y en las solicitudes publicadas de patente de los Estados Unidos números 2002/0009491; 2003/0032593; 2003/0162719; 2006/0159719; 2006/0293234; y 2007/0105775, cada una de las cuales se incorpora expresamente en la presente en su totalidad como referencia . Utilidad Las utilidades de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: (1) prevención o reducción de desarrollo y progreso de placa aterosclerótica, especialmente en pacientes en alto riesgo; (2) prevención o reducción del desarrollo de formación de coágulos sanguíneos arteriales o venosos (trastornos aterotrombóticos y de trombos venosos) , especialmente en condiciones reconocidas como alto riesgo para estos coágulos, es decir, apoplejía cardiaco o apoplejía; (3) mantenimiento mejorado de abertura de vaso por administra continua del inhibidor de APCE, posiblemente en asociación con la administración simultánea de bajas dosis de fármacos de activador de plasminógeno; (4) prevención o reducción de formación de fibrina donde puede provocar síntomas crónicos o agudos persistentes en asociación con condiciones inflamatorias tal como todas las formas de artritis, fibrosis de órganos, cicatrización indeseable, y cáncer y sus metástasis; (5) se induce reducción del riesgo de sangrado como un estado hiperfibrinolitico, dado que a2APpr0 inhibe plasmina en estado de solución asi como a2APact, cuando no se retícula en fibrina; (6) ayuda en la prevención y terapia de depósitos de fibrina que interfieren con la función de los órganos como se puede ver en enfermedad aterotrombótica, tal como trombosis de arterias coronarias, apoplejía, embolia pulmonar, todas las otras formas de trombosis arterial y venosa, condiciones inflamatorias, y cáncer y sus metástasis; (7) determinación si un sujeto tiene un polimorfismo Trp6 ó Arg6 en a2-antiplasmina ; y (8) detección de inhibidores de la enzima de escisión de antiplasmina . Por lo tanto, varias modalidades de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: (1) un método terapéutico para promover la digestión de fibrina in vivo, que comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de un inhibidor de la enzima de escisión de antiplasmina; (2) péptidos de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) para actuar como sustrato de APCE; (3) un inhibidor de la enzima de escisión de antiplasmina, en donde el inhibidor puede comprender, o está enlazado a un separador, ligador o portador polimérico; (4) un inhibidor de la enzima de escisión de antiplasmina, que es efectivo en la unión a o el bloqueo del sitio de unión de a2-antiplasmina, o sitio de escisión de pro-asn de a2-antiplasmina de la enzima de escisión de antiplasmina ; (5) un método para mejorar la digestión de fibrina in vivo, que comprende proporcionar a un sujeto en necesidad de digestión de coágulos o prevención de coágulos, simultáneamente o en secuencia, una cantidad de activador de plasminógeno y un inhibidor de la enzima de escisión de antiplasmina, en donde la cantidad de activador de plasminógeno es menor que la cantidad proporcionada en el protocolo terapéutico normal ausente del inhibidor de la enzima de escisión de antiplasmina; y (6) un ADN que codifica para el FRET-péptido o péptido inhibidor contemplado en la presente, y un vector de plásmido u hospedador que contiene el ADN. Otras modalidades de la presente invención proporcionan composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más de los compuestos descritos en la presente, formulados conjuntamente con uno o más portadores (aditivos) y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Como se describe en detalle más adelante, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular de manera especial para administración en forma sólida o liquida, incluyendo aquéllas adaptadas para lo siguiente: (1) administración oral, por ejemplo, soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas, tabletas, por ejemplo, aquéllas dirigidas para absorción bucal, sublingual y sistémica, bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicación a la lengua; (2) administración parenteral, por ejemplo, por inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o epidural tal como por ejemplo una solución o suspensión estéril, o formulación de liberación sostenida; (3) aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, ungüento, o parche de liberación controlada o aspersión aplicada a la piel; (4) de manera intravaginal o intra-rectal , por ejemplo, como una crema o espuma; (5) de forma sublingual; (6) ocularmente; (7) transdérmicamente ; u (8) de forma nasal. La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa en la presente significa aquella cantidad de un compuesto, material, o composición que comprende un compuesto de la presente invención que es efectiva para producir el mismo efecto terapéutico deseado en al menos una sub-población de células en un animal a una relación razonable de beneficio/riesgo aplicable a cualquier tratamiento médico.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosis que son, dentro del alcance del juicio médico razonable, adecuadas para el uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, en proporción con una relación razonable de beneficio/riesgo . La frase "portador farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente significa una composición, material o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un agente de relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente, o material encapsulador de solvente, comprendido en llevar o transportar el presente compuesto desde un órgano, o una porción del cuerpo, a otro órgano, o una porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no dañino al paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tal como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tal como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa, y sus derivados, tal como carboximetil-celulosa sódica, etil-celulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tal como manteca de cacao y ceras de supositorio; (9) aceites, tal como aceite de coco, aceite de algodón, aceite de cártamo, aceite de ajonjolí, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soya; (10) glicoles, tal como propilenglicol ; (11) polioles, tal como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol ; (12) ésteres, tal como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes amortiguadores, tal como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones amortiguadas en pH; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos ; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas. Como se expone anteriormente, ciertas modalidades de los presentes compuestos contienen un grupo funcional básico, tal como amino o alquilamino, y de esta manera son capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con ácidos farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" a este respecto, se refiere a sales de adición de ácidos inorgánicos y orgánicos, relativamente no tóxicas, de los compuestos de la presente invención. Estas sales se pueden preparar in situ en el vehículo de administración o el proceso de elaboración de la forma de dosis, o al hacer reaccionar de manera separada un compuesto purificado de la invención en su forma de base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado, y al aislar la sal formada de esta manera durante la purificación subsiguiente. Las sales representativas incluyen las sales de bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato, y laurilsulfonato, y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables de los presentes compuestos incluyen las sales convencionales no tóxicas o sales de amonio cuaternario de los compuestos, por ejemplo, de ácidos orgánicos o inorgánicos no tóxicos. Por ejemplo, estas sales no tóxicas convencionales incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos tal como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico, y similares; y las sales preparadas de ácidos orgánicos tal como acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, palmítico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicíclico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, etano-disulfónico, oxálico, isotiónico, y similares. En otros casos, los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más grupos funcionales ácidos y de esta manera son capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" en estos casos se refiere a las sales de adición de base inorgánicas y orgánicas, relativamente no tóxicas de los compuestos de la presente invención. Estas sales igualmente se pueden preparar in situ en el vehículo de administración o en el proceso de elaboración de formas de dosis, o al hacer reaccionar de manera separada el compuesto purificado en su forma de ácido libre con una base adecuada, tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable, con amoniaco, o con una amina primaria, secundaria o terciaria orgánica farmacéuticamente aceptable. Las sales alcalinas o alcalinotérreas representativas incluyen las sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio y similares. Las aminas orgánicas representativas útiles para la formación de las sales de adición de base incluyen etilamina, dietilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, y similares. Los agentes humectantes, emulsionadores y lubricantes, tal como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de revestimiento, agentes edulcorantes, saborizantes y aromatizantes, conservadores y antioxidantes también pueden estar presentes en las composiciones. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tal como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteina, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio, y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tal como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, propil-galato, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes metálicos, tal como ácido cítrico, ácido etilendiamina-tetra-acético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares. Como se señala anteriormente, las formulaciones de la presente invención incluyen aquéllas adecuadas para administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones se pueden presentar de manera conveniente en la forma de dosis unitaria y se pueden preparar por cualquier método bien conocido en la técnica de farmacia. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosis variará dependiendo de los hospedadores que se traten, el modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosis individual será en general aquella cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico. En general, del cien por ciento, esta cantidad variará desde aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, de manera preferente de aproximadamente 5 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, de manera más preferente de aproximadamente 10 por ciento a aproximadamente 30 por ciento. En ciertas modalidades, una formulación de la presente invención comprende un excipiente seleccionado del grupo que consiste de ciclodextrinas , liposomas, agentes formadores en micelas, por ejemplo, ácidos biliares, y portadores poliméricos, por ejemplo, poliésteres y polianhidridos . Los métodos para preparar estas formulaciones o composiciones pueden incluir el paso de poner en asociación un compuesto de la presente invención con el portador y, opcionalmente, uno o más ingredientes auxiliares. En general, las formulaciones se preparan al poner de manera uniforme e intima en asociación un compuesto de la presente invención con portadores líquidos, o portadores sólidos finalmente divididos, o ambos, y entonces, si es necesario, formar el producto . Las formulaciones de la invención adecuadas para administración oral pueden estar en la forma de cápsulas, cápsulas amiláceas, pildoras, tabletas, pastillas (usando una base saborizada, usualmente sacarosa y goma de acacia o tragacanto), polvos, gránulos, o como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia) y/o como lavados bucales ' y similares, cada uno que contiene una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invención como un ingrediente activo. Un compuesto de la presente invención también se puede administrar como un bolo, o una pasta. En las formas de dosis sólidas de la invención para administración oral (cápsulas, tabletas, pildoras, polvos, gránulos, y similares) , el ingrediente activo se mezcla con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio, y/o cualquiera de lo siguiente: (1) agentes de relleno o extendedores, tal como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y/o ácido silícico; (2) aglutinantes, tal como por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinil-pirrolidona, sacarosa y/o acacia; (3) humectantes, tal como glicerol; (4) agentes desintegrantes, tal como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, y carbonato de sodio; (5) agentes que retardan la solución, tal como parafina; (6) aceleradores de absorción, tal como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tal como por ejemplo, alcohol cetílico, monoestearato de glicerilo, y agentes tensioactivos no iónicos; (8) absorbentes, tal como caolín y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tal como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio, y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de cápsulas, tabletas y pildoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes amortiguadores. Las composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como agentes de relleno en cápsulas de gelatina de gelatina blanda usando excipientes tal como lactosa o azúcares lácteos, asi como polietilenglicoles de alto peso molecular, y similares. Se puede elaborar una tableta por compresión o moldeado, opcionalmente con uno o más ingredientes auxiliares. Se pueden preparar tabletas comprimidas usando aglutinante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetil-celulosa ) , lubricante, diluyente inerte, conservador, desintegrante (por ejemplo, almidón glicolato de sodio o carboximetilcelulosa sódica reticulada) , agente dispersante o activo en la superficie. Se pueden elaborar tabletas moldeadas al moldear en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humectado con un diluyente liquido inerte. Las tabletas, y otras formas sólidas de dosis de las composiciones farmacéuticas de la presente invención, tal como grageas, cápsulas, pildoras y gránulos, se pueden marcar opcionalmente o preparar con revestimientos y cubiertas, tal como revestimientos sintéticos y otros revestimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. También se pueden formular para proporcionar liberación lenta o controlada del ingrediente activo en los mismos usando, por ejemplo, hidroxipropilmetil-celulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil deseado de liberación, otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas . Se pueden formular para liberación rápida, por ejemplo, secado por congelación. Se pueden esterilizar por ejemplo por filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o al incorporar agentes esterilizantes en la forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en agua estéril, o algún otro medio inyectable estéril inmediatamente antes del uso. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificadores y pueden ser de una composición que liberen los ingredientes activos únicamente, o preferencialmente , en una cierta porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de una manera retrasada. Los ejemplos de composiciones de incrustación que se pueden usar incluyen sustancias poliméricas ligeras. El ingrediente activo también puede estar en forma microencapsulada, si es apropiado-, con uno o más de los excipientes descritos anteriormente . Las formas liquidas de dosis para administración oral de los compuestos de la invención incluyen emulsiones farmacéuticamente aceptables, microemulsiones , soluciones, suspensiones, jarabes y elixires. Además del ingrediente activo, las formas liquidas de dosis pueden contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tal como por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizadores y emulsionadores , tal como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol , 1,3-butilenoglicol, aceites (en particular, aceites de algodón, de cacahuate, de maíz, de germen, de oliva, de ricino y de ajonjolí) , glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitano, y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tal como agentes humectantes, agentes emulsionadores y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes , colorantes, aromatizantes y conservadores . Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión tal como por ejemplo, alcoholes isoestearílieos etoxilados, polioxietilen-sorbitol y ésteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos. Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas de la invención para administración rectal o vaginal se pueden presentar como un supositorio, que se puede preparar al mezclar uno o más compuestos de la invención con uno o más excipientes o portadores no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, una cera de supositorio o un salicilato, y que son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a temperatura corporal, y por lo tanto, se fundirán en el recto o cavidad vaginal y liberarán el compuesto activo. Las formulaciones de la presente invención que son adecuadas para administración vaginal también incluyen tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de aspersión que contienen portadores tal como se conocen en la técnica que son apropiados. Las formas de dosis para administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen polvos, aspersiones, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo se puede mezclar bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable, y con cualquier conservador, amortiguadores, o propulsores que se puedan requerir. Los ungüentos, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un compuesto activo de esta invención, excipientes, tal como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles , silicones, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc, o mezclas de los mismos. Los polvos y aspersiones pueden contener, además de un compuesto de esta invención, excipientes tal como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Las aspersiones pueden contener adicionalmente propulsores habituales, tal como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos insustituidos volátiles, tal como butano y propano. Los parches transdérmicos tienen la ventaja adicional de proporcionar distribución controlada de un compuesto de la presente invención al cuerpo. Estas formas de dosis se pueden elaborar al disolver o dispersar el compuesto en el medio apropiado. También se pueden usar mej oradores de absorción para incrementar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad de este flujo se puede controlar ya sea al proporcionar una membrana de control de velocidad o al dispersar el compuesto en un gel o matriz polimérica. También se contemplan, que están dentro del alcance de esta invención, las formulaciones oftálmicas, ungüentos para ojos, polvos, soluciones, y similares. Las composiciones farmacéuticas de esta invención adecuadas para administración parenteral comprenden uno o más compuestos de la invención en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas, isotónicas, estériles, farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles, que se pueden reconstituir en soluciones o dispersiones inyectables, estériles justo antes del uso, que pueden contener azúcares, alcoholes, antioxidantes, amortiguadores, bacteriostatos, solutos que vuelven isotónica la formulación con la sangre del receptor propuesto o agentes de suspensión o espesantes. Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol , polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, por el uso de materiales de revestimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño requerido de partícula en el caso de dispersiones, y por el uso de agentes tensioactivos . Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tal como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionadores y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos en los presentes compuestos se puede asegurar por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifungoideos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol , ácido fenol-sórbico, y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tal como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, se puede provocar absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable por la inclusión de agentes que retrasen la absorción tal como monoestearato de aluminio y gelatina. En algunos casos, a fin de prolongar el efecto de un fármaco, es deseable retrasar la absorción del fármaco de inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr por el uso de una suspensión liquida de material cristalino o amorfo que tiene pobre solubilidad en agua. La velocidad de absorción del fármaco entonces depende de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y forma cristalina. De manera alternativa, la absorción retrasada de una forma de fármaco parenteralmente administrada se logra al disolver o suspender el fármaco en un vehículo de aceite. Las formas inyectables de depósito se elaboran al formar matrices de microencapsulamiento de . los presentes compuestos en polímeros biodegradables tal como poliláctido-poliglicólido . Dependiendo de la relación del fármaco al polímero, y de la naturaleza del polímero particular empleado, la velocidad de liberación de fármaco se puede controlar. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli (ortoésteres ) y poli (anhídridos) . Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan al atrapar el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal. Cuando los compuestos de la presente invención se administran como productos farmacéuticos, a humanos y animales, se pueden dar per se o como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, de 0.1 a 99.5 % (de manera más preferente de 0.5 a 90 %) del ingrediente activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Las preparaciones de la presente invención se pueden dar de manera oral, de manera parenteral, tópicamente o de forma rectal. Por supuesto, se dan en formas adecuadas para cada ruta de administración. Por ejemplo, se administran en tabletas o forma de cápsula, por inyección, inhalación, loción de ojo, ungüento, supositorio, etc., administración por inyección, infusión o inhalación; tópica por loción o ungüento; y rectal por supositorios. Se prefieren administraciones orales. Las frases "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" como se usa en la presente significa modos de administración diferentes de administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluye, sin limitación, inyección intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular , intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal , transtratecal, subcutánea, subeuticular , intra-articular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal , e infusión. Las frases "administración sistémica", "administrada de manera sistémica", "administración periférica" y "administrado de forma periférica" como se usan en la presente significan la administración de un compuesto, fármaco u otro material diferente de directamente en el sistema nervioso central, tal que entra al sistema del paciente y de esta manera se somete a metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, administración subcutánea. Estos compuestos se pueden administrar a humanos y otros animales para terapia por cualquier ruta adecuada de administración, incluyendo de manera oral, nasal, como por, por ejemplo, una aspersión, de manera rectal, de manera intravaginal , parenteralmente, intracisternalmente y de forma tópica, como por polvos, ungüentos o gotas, incluyendo de forma bucal y sublingual. A pesar de la ruta de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que se pueden usar en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosis farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los niveles reales de dosis de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que es efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición, y modo de administración, sin que sea tóxico al paciente. El nivel seleccionado de dosis dependerá de una variedad de factores que incluye la actividad del compuesto particular de la presente invención, empleado, o el éster, sal o amida del mismo, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción o metabolismo del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con el compuesto particular empleado, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica anterior del paciente que se trate, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Un médico o veterinario que tenga habilidad ordinaria en la técnica puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario puede empezar dosis de los compuestos de la invención empleadas en la composición farmacéutica a niveles menores que los requeridos a fin de lograr el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de la invención será aquella cantidad del compuesto que es la menor dosis efectiva para producir un efecto terapéutico. Esta dosis efectiva dependerá en general de los factores descritos anteriormente. En general, las dosis intravenosas, intracerebroventricular y subcutáneas de los compuestos de esta invención para un paciente, cuando se usen para los efectos analgésicos indicados, variarán desde aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal por dia. Si se desea, la dosis diaria efectiva del compuesto activo se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis administradas de manera separada en intervalos apropiados a todo lo largo del dia, opcionalmente, en formas de dosis unitarias. En tanto que es posible que un compuesto de la presente invención se administre solo, se prefiere administrar el compuesto como una formulación farmacéutica (composición) . En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más de los presentes compuestos, como se describe anteriormente, formulados con untamente con uno o más portadores (aditivos) y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Como se describe en detalle más adelante, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular de manera especial para administración en forma sólida o liquida, incluyendo aquellas adaptadas para lo siguiente: (1) administración oral, por ejemplo, soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas, tabletas, bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicación a la lengua; (2) administración parenteral, por ejemplo, por inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa como por ejemplo una solución o suspensión estéril; (3) aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, ungüento o aspersión aplicada a la piel, pulmones, o cavidad oral; o (4) de manera intravaginal o intravectalmente, por ejemplo, como un pesario, crema o espuma; (5) sublingualmente ; (6) de forma ocular; (7) transdérmicamente; u (8) de forma nasal. Los compuestos de acuerdo a la invención se pueden formular para administración de cualquier manera conveniente para el uso en medicina humana o veterinaria, por analogía con otros productos farmacéuticos. El término "tratamiento" se propone que abarque también profilaxis, terapia y curación. El paciente que recibe este tratamiento es cualquier animal en necesidad, incluyendo primates, en particular humanos y otros mamíferos tal como equinos, ganado vacuno, cerdos y ovejas; y aves de corral y mascotas en general. El compuesto de la invención se puede administrar como tal o en mezclas con portadores farmacéuticamente aceptables y también se pueden administrar en unión con agentes antimicrobianos tal como penicilinas, cefalosporinas , aminoglicósidos y glicopéptidos . La terapia conjuntiva, incluye de esta manera administración secuencial, simultánea y separada del compuesto activo de una manera que los efectos terapéuticos de la primera administrada no se desaparezcan completamente . cuando se administre la subsiguiente. Como se usa en la presente, el término "sujeto" o "paciente" se refiere de manera preferente a un animal de sangre caliente tal como un mamífero que está afligido con un estado de enfermedad inflamatoria particular. Se entiende que los cobayos, perros, gatos, ratas, ratones, caballos, ganado, ovejas y humanos son ejemplos de animales dentro del alcance del significado del término. Una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto usada en el tratamiento descrito en la presente se puede determinar fácilmente por el médico que atiende, como un experto en la técnica, por el uso de técnicas convencionales y al observar los resultados obtenidos bajo circunstancias análogas. Al determinar la dosis terapéuticamente efectiva, se consideran varios factores por el médico que atiende, incluyendo, pero no limitado a: la especie del mamífero; su tamaño, edad, y salud general; la enfermedad o condición específica comprendida; el grado de implicación o la severidad de la enfermedad o condición; la respuesta del sujeto individual; el compuesto particular administrado; el modo de administración; la biodisponibilidad característica de la preparación administrada; el régimen de dosis seleccionado; el uso de medicamento concomitante; y otras circunstancias pertinentes . Una cantidad terapéuticamente efectiva de las composiciones de la presente invención contendrá en general suficiente ingrediente activo (es decir, la APCE o inhibidor de la misma) para distribuir desde aproximadamente 0.1 g/kg a aproximadamente 100 mg/kg (peso de ingrediente activo/peso corporal del paciente) . De manera preferente, la composición distribuirá al menos 0.5 µg/kg a 50 mg/kg, y de manera más preferente al menos 1 µg/kg a 10 mg/kg. La práctica del método de la presente invención comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del ingrediente activo, en cualquier formulación local o sistémica adecuada, en una cantidad efectiva para distribuir las dosis listadas anteriormente. La dosis se puede administrar en una base de una vez, o (por ejemplo) de una a cinco veces por día o una vez o dos veces por semana, o de manera continua, mediante goteo venoso, u otro medio, dependiendo del efecto terapéutico deseado. Como se señala, las cantidades preferidas y los modos preferidos de administración son capaces de ser determinados por un experto en la técnica. Un experto en la técnica para preparar formulaciones puede seleccionar fácilmente la forma apropiada y el modo de administración dependiendo de las características particulares del compuesto seleccionado, el estado de enfermedad que se trate, el estado de la enfermedad, y otras circunstancias pertinentes usando tecnología de formulación conocida en la técnica, descrita, o por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, última edición, Mack Publishing Co . Las composiciones farmacéuticas se pueden elaborar utilizando técnicas conocidas. Típicamente, la cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto se mezclará con un portador farmacéuticamente aceptable. La vida media de las moléculas descritas en la presente se puede extender al ser conjugadas a otras moléculas tal como polímeros usando métodos conocidos en la técnica para formar conjugados de fármaco-polímero. Por ejemplo, las moléculas se pueden unir a moléculas de polímeros inertes conocidos en la técnica, tal como una molécula de polietilenglicol (PEG) en un método conocido como "pegilación" . Por lo tanto, la pegilación puede extender la vida in vivo y de esta manera la efectividad terapéutica de la molécula. Se pueden modificar moléculas de PEG por grupos funcionales, por ejemplo como se muestra en Harris et al., "Pegylation, A Novel Process for Modifying Phararmacokinetics", Clin Pharmacokinet , 2001:40(7); 539-551, y el extremo amino-terminal de la molécula, o residuo de cisteína si está presente, u otro aminoácido de enlace en el mismo se puede enlazar a esto, en donde la molécula de PEG puede tener uno o una pluralidad de una o más tipos de moléculas . Por "polietilenglicol" o "PEG" se quiere decir un compuesto de polialquilenglicol o un derivado del mismo, con o sin agentes acopladores o derivatización con porciones acopladoras o activadoras (por ejemplo, con tiol, triflato, tresilato, azirdina, oxirano, o preferentemente con una porción de maleimida) . Los compuestos tal como maleimido-monometoxi-PEG son compuestos de PEG de ejemplo o activados de la invención. Otros compuestos de polialquilenglicol, tal como polipropilenglicol , se pueden usar en la presente invención. Otros conjugados apropiados de polímero incluyen, pero no se limitan a, polímeros no de polipéptido, polímeros cargados o neutrales de los siguientes tipos: dextrano, ácidos colomínicos u otros polímeros basados en carbohidrato, derivados de biotina y dendrímeros, a manera de ejemplo. El término PEG también se propone que incluya otros polímeros de la clase de óxidos de polialquileno. El PEG se puede enlazar a cualquier aminoácido N-terminal de la molécula descrita en la presente y/o se puede enlazar a un residuo de aminoácido en la dirección 3' del aminoácido N-terminal, tal como lisina, histidina, triptofano, ácido aspártico, ácido glutámico, y cisteína, a manera de ejemplo, u otros aminoácidos conocidos por aquellos expertos en la técnica. La molécula portadora de PEG unida al péptido puede variar en el peso molecular desde aproximadamente 200 a 20,000 PM. De manera preferente, la porción de PEG será de aproximadamente 1,000 a 8,000 PM, de manera más preferente de aproximadamente 3,250 a 5,000 PM, de manera más preferente de aproximadamente 5,' 000 PM. El número real de moléculas de PEG unidas covalentemente por . molécula de la invención puede variar ampliamente dependiendo de la estabilidad deseada (es decir, vida media en suero) . Las moléculas contempladas en la presente se pueden enlazar a moléculas de PEG usando técnicas conocidas, por ejemplo (pero no limitad a) , en las patentes de los Estados Unidos números 4,179,337; 5,382,657; 5,972,885; 6,177,087; 6,165,509; 5,766,897; y 6,217,869; las especificaciones y figuras de las cuales se incorporan expresamente de este modo en la presente como referencia. De manera alternativa, es posible atrapar las moléculas en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de co-acumulación o por polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacilato ) , respectivamente), en sistemas de distribución de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanoparticulas, y nanocápsulas) , o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en la- última edición de Remington ' s Pharmaceutical Sciences. La patente de los Estados Unidos número 4,789,734 describe métodos para encapsular productos bioquímicos en liposomas y de este modo se incorpora expresamente como referencia en la presente. Esencialmente, el material se disuelve en una solución acuosa, los fosfolípidos apropiados y lípidos adicionados, junto con agentes tensioactivos , si se requiere, y el material dializado o tratado con ultrasonido, como sea necesario. Una revisión de los métodos conocidos se da por G. Gregoriadis, Capítulo 14, "Liposomes", Drug Carriers in Biology and Medicine, PP. 287-341 (Academic Press, 1979) . Las microesferas formadas de polímeros o proteínas son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, y se pueden adaptar para el paso a través del tracto gastrointestinal directamente en la corriente sanguínea. De manera alternativa, los agentes se pueden incorporar y las microesferas, o productos compuestos de microesferas, implantadas para liberación lenta durante un periodo de tiempo, que varían desde días a meses. Ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos números 4,906,474; 4,925,673; y 3,625,214 que se incorporan en la presente como referencia. Cuando la composición se va a usar como un material inyectable, se puede formular en un portador inyectable convencional. Los portadores adecuados incluyen soluciones salinas amortiguadas con fosfato, biocompatibles y farmacéuticamente aceptables, que preferentemente son isotónicos . Para reconstitución de un producto liofilizado de acuerdo con esta invención, se puede emplear un diluyente estéril, que puede contener materiales reconocidos en general para aproximar las condiciones fisiológicas y/o como se requiera por la regulación gubernamental. A este respecto, el diluyente estéril puede contener un agente amortiguador para obtener un pH fisiológicamente aceptable, tal como cloruro de sodio, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, y/u otras sustancias que son fisiológicamente aceptables y/o seguras para el uso. En general, el material para inyección intravenosa en humanos debe ajustarse a las regulaciones establecidas por la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos, que están disponibles para aquellos en el campo. La composición farmacéutica también puede estar en la forma de una solución acuosa que contiene muchas de las mismas sustancias como se describe anteriormente para la reconstitución de un producto liofilizado. Los compuestos también se pueden administrar como una sal de adición de base o ácido farmacéuticamente aceptable, formada por reacción con ácidos inorgánicos tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, · ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociánico, ácido sulfúrico, y ácido fosfórico, y ácidos orgánicos tal como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, y ácido fumárico, o por reacción con una base inorgánica tal como hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, y bases orgánicas tal como mono-, di-, tri-alquil y aril-aminas y etanolaminas sustituidas. Como se menciona anteriormente, los compuestos de la invención se pueden incorporar en preparaciones farmacéuticas que se pueden usar para propósitos terapéuticos. Sin embargo, el término "preparación farmacéutica" se propone en un sentido más amplio en la presente para incluir preparaciones que contienen una composición de glicosulfopéptido de acuerdo con esta invención, usado no sólo para propósitos terapéuticos sino también para propósitos de reactivo o de diagnóstico como se conoce en la técnica, o para cultivo de tejido. La preparación farmacéutica propuesta para uso terapéutico debe contener una "cantidad farmacéuticamente aceptable" o "terapéuticamente efectiva" de un molécula como se define en la presente. Todos los métodos de ensayo listados en la presente están bien dentro de la capacidad de un experto en la técnica, dados las enseñanzas proporcionadas en la presente. Todas las referencias, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan de este modo en la presente en sus totalidades como referencia. En particular, las solicitudes de patente de los Estados Unidos números de serie 10/774,242, 60/445,774, 60/811,568, y 60/836,365 se incorporan expresamente de este modo en la presente como referencia en sus totalidades. Aunque la presente invención y sus ventajas se han descrito en detalle, se debe entender que se pueden hacer varios cambios, sustituciones y alteraciones en la presente sin apartarse del espíritu y alcance de la invención como se define por las reivindicaciones anexas. Sin embargo, el alcance de la presente solicitud no se propone que se limite a las modalidades particulares del. proceso, elaboración, composiciones de materia, medios, métodos y pasos descritos en la especificación. Como fácilmente lo apreciará un experto en la técnica a partir de la descripción de la presente invención, los procesos, elaboración, composiciones de materia, medios, o pasos, que actualmente existen o se desarrollan más adelante que forman sustancialmente la misma función o logran sustancialmente los mismos resultados como las modalidades correspondientes descritas en la presente se pueden utilizar de acuerdo a la presente invención. Por consiguiente, se propone que las reivindicaciones anexas incluyan dentro de su alcance, estos procesos, elaboración, composiciones de materia, medios, métodos o pasos.
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Aminas Cíclicas y Análogos de Prolina Ácido 4-hidroxipirrolidina-2-carboxílico (cis y trans) Ácido 3-fenilpirrolidina-2-carboxílico (cis y trans ) Ácido 3-hidroxipirrolidina-2- carboxílico (cis y trans) Ácido 4-hidroxipirrolidina-2-carboxílico (cis y trans) Ácido 2-etiltiazolidina-4-carboxílico (cis y trans) Ácido 2-metiltiazolidina-4-carboxílico (cis y trans ) Ácido 2-feniltiazolidina-4-carboxílico (cis y trans) Ácido 5, 5-dimetiltiazolidina-4 -carboxílico Ácido tiazolidina-2-carboxílico (cis y trans) Ácido tiazolidina-4-carboxílico (cis y trans) Ácido azetidina-2-carboxílico (cis y trans) Ácido tiazolidina-2-carboxílico (cis y trans) Ácido tiazolidina-4-carboxílico (cis y trans) Ester metílico de amino-L-prolina Ester metílico de ciano-L-prolina 4-ciano-L-prolina 3, 4-dehidro-L-prolina 4-fluoro-L-prolina Lisil-piperidida N- ( 4-clorobencil ) 4-0x0-4- ( 1-piperidinil ) -1, 3- (s) -butano diamina Ácido bromociclopentil-carboxílico Ácido clorociclopentil-carboxilico Ácido fluorociclopentil-carboxilico cis-3-metilprolina cis-3-etilprolina cis-3-isopropilprolina cis-3-isopentanilprolina homoprolina bencil-prolina ( 2-fluoro-bencil ) -prolina ( 3-fluoro-bencil ) -prolina ( -fluoro-bencil ) -prolina ( 2-cloro-bencil ) -prolina ( 3-cloro-bencil ) -prolina ( 4-cloro-bencil ) -prolina ( 2-bromo-bencil ) -prolina ( 3-bromo-bencil ) -prolina (4-bromo-bencil) -prolina fenetil-prolina (2-metil-bencil) -prolina ( 3-metil-bencil ) -prolina (4-metil-bencil) -prolina ( 2-nitro-bencil ) -prolina ( 3-nitro-bencil ) -prolina -nitro-bencil) -prolina ( 1-Naftalenilmetil) -prolina (2-Naftalenilmetil) -prolina (2, 4-dicloro-bencil ) -prolina -dicloro-bencil ) -prolina (3, 4-difluoro-bencil ) -prolina -trifluorometil-bencil) -proli (3-trifluorometil-bencil) -prolina -trifluorometil-bencil ) -prolina -ciano-bencil ) -prolina -ciano-bencil ) -prolina -ciano-bencil) -prolina ( -yodo-bencil ) -prolina (3-Fenil-alil) -prolina -Fenil-allil ) -proli -Fenil-propil ) -prolina (4-ter-Butil-bencil) -prolina Benzhidril-prolina ( 4-Bifenilmetil ) -prolina (4-Tiazolilmetil) -prolina (3-Benzo [b] tiofenilmetil ) -prolina ( 2-Tiofenilmetil ) -prolina ( 5-Bromo-2-Tiofenilmetil) -prolina ( 3-Tiofenilmetil ) -prolina (2-Furanilmetil) -prolina (2-Piridinilmetil) -prolina ( 3-Piridinilmetil ) -prolina ( 4-Piridinilmetil ) -prolina Alil-prolina Propinil-prolina Ácido 4-fenil-pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- (2-fluoro-fenil) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- ( 3-fluoro-fenil ) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido trans-4- ( 4-fluoro-fenil ) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido trans-4- (2-cloro-fenil ) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido trans-4- ( 3-cloro-fenil ) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- ( 4-cloro-fenil) -pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- (2-bromo-fenil ) -pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- (3-bromo-fenil) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido trans-4- (4-bromo-fenil) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- (2-metil-fenil) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- ( 3-metil-fenil ) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- ( 4 -metil-fenil ) -pirrolídina-3-carboxí lico Ácido 4- (2-nitro-fenil) -pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- ( 3-nitro-fenil ) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- ( 4-nitro-fenil ) -pirrolidina-3-carboxí lico Ácido 4- (1-naftil) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- (2-naftil) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- (2, 5-dicloro-fenil ) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- (2, 3-dicloro-fenil ) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- (2-trifluorometil-fenil ) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- ( 3-trifluorometil-fenil ) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- (4-trifluorometil-fenil ) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- (2-ciano-fenil) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- (3-ciano-fenil) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- (4-ciano-fenil) -pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- ( 2-metoxi-fenil ) -pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- ( 3-metoxi-fenil ) -pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- (4-metoxi-fenil) -pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- ( 2-hidroxi-fenil ) -pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- ( 3-hidroxi-fenil ) -pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- ( 4-hidroxi-fenil ) -pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- (2, 3-dimetoxi-fenil ) -pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- (3, 4-dimetoxi-fenil ) -pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- (3, 5-dimetoxi-fenil) -pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- ( 2-piridinil ) -pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- ( 3-piridinil ) -pirrolidina-3-carboxílico Ácido 4- ( 6-metoxi-3-piridinil ) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- (4-piridinil) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- (2-tienil) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- (3-tienil) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4- (2-furanil) -pirrolidina-3-carboxilico Ácido 4-isopropil-pirrolidina-3-carboxilico Piperidina Pirrolidina Azetidina Ácido pipecólico Piperidida 3-carboxi-l, 2,3, 4-tetrahidro-isoquinolina 2-carboxi-2, 3-dehidroindol acetil-gli-valboropro ciclopentilos Derivados de ciclopentilo N-sustituidos Ciclohexilos Derivados de ciclohexilo N-sustituidos val-boropro glu-boropro oxazolidina y análogos y derivados de prolina como se define en las Patentes de los Estados Unidos No. 4,428,939; 6,890,904; 4,762,821 y Solicitudes Publicadas No. 2003/0158114; 20050272703; y 2006/0287245.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Método para alterar una relación en plasma de a2-antiplasmina en un sujeto que tiene un nivel de pretratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma y un nivel de pretratamiento de Asn-a2-antiplasmina en plasma, caracterizado porque comprende : tratar al sujeto con un inhibidor de enzima de escisión de antiplasmina en donde el inhibidor inhibe específicamente la escisión del sitio de escisión de Pro-Asn de Met-a2-antiplasmina por la enzima de escisión de antiplasmina, en donde después del tratamiento el sujeto tiene un nivel de post-tratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma que es al menos 5 % mayor que el nivel de pretratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma, y tiene un nivel de posttratamiento de Asn-a2-antiplasmina en plasma que es al menos 5 % menor que el nivel de pretratamiento de Asn-a2-antiplasmina , alterando de este modo la relación en plasma de 2-antiplasmina en el sujeto. 2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la alteración de la relación de a2- antiplasmina en el sujeto mejora la fibrinólisis en el sujeto. 3. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento del sujeto con el inhibidor de la enzima de escisión de antiplasmina es un 5 tratamiento para inhibir o tratar aterosclerosis, trombosis arterial, trombosis venosa, apoplejía, o embolia pulmonar . 4. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de post-tratamiento de Met-a2-0 antiplasmina en plasma es al menos 10 % mayor que el nivel de pretratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma y el nivel de post-tratamiento de Asn-a2-antiplasmina en plasma es al menos 10 % menor que el nivel de pretratamiento de Asn-a2- antiplasmina en plasma. 5 5. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de post-tratamiento de Met-a2- antiplasmina en plasma es al menos 15 % mayor que el nivel de pretratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma y el nivel de Q post-tratamiento de Asn-a2-antiplasmina en plasma es al menos 15 % menor que el nivel de pretratamiento de Asn-a2- antiplasmina en plasma. 6. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de post-tratamiento de Met-a2-5 antiplasmina en plasma es al menos 20 % mayor que el nivel de pretratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma y el nivel de post-tratamiento de Asn-012-antiplasmina en plasma es al menos 20 % menor que el nivel de pretratamiento de Asn-a2-antiplasmina en plasma. 7. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de post-tratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma es al menos 25 % mayor que el nivel de pretratamiento de Met-a2-antiplasmina en plasma y el nivel de post-tratamiento de Asn-a2-antiplasmina en plasma es al menos 25 % menor que el nivel de pretratamiento de Asn-a2-antiplasmina en plasma. 8. Compuesto que tiene la fórmula: Xaai - Spi - Gly - Cyc - Xaa2 - Sp2 - Xaa3 caracterizado porque: Xaai es arginina, histidina o Usina; ' Spi es un separador que comprende al menos uno de ácido 8-, 11-, o 14-amino-3, 6, 9, 12-tetraoxatetradecanoico, PEGn o PPGn, en donde n = 1-6, ácido gamma-amino-butirico, ácido epsilon-amino-caproico, serina, glicina, alanina, o ß-alanina, o una combinación de los mismos, en donde Spi tiene una longitud de 0.3 nm - 2.1 nm; Gly es glicina; Cyc es un compuesto carbociclico o heterociclico; Xaa2 es glutamina, asparagina, serina, histidina, tirosina, alanina, o fenilalanina; Sp2 es un separador que comprende al menos uno de PEGn o PPGn, en donde n = 1-5, ácido 8-, 11-, o 14-amino-3, 6, 9, 12-tetraoxatetradecanoico, ácido gamma-amino-butirico, ácido epsilon-amino-caproico, serina, glicina, alanina, ß-alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, o una combinación de los mismos, o está ausente; y Xaa3 es ácido glutámico, ácido aspártico, triptofano, tirosina, o fenilalanina . 9. Compuesto de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque Cyc es un carbociclo de 4 , 5, 6 ó 7 miembros de carbono. 10. Compuesto de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque Cyc es un heterociclo de 4 , 5, 6 ó 7 miembros de carbono. 11. Compuesto de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el heterociclo de carbono comprende un heteroátomo de nitrógeno. 12. Compuesto de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque Spi es PEGn y en donde n = 2-5. 13. Compuesto de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque Spi tiene una longitud de .6 nm a 17.5 nm. 14. Compuesto de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende un oligopéptido l-8mer que se extiende desde Xaai en la dirección N-terminal. 15. Compuesto de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende un oligopéptido 2-10mer que se extiende desde Xaa3 en la dirección C-terminal. 16. Compuesto de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque se coloca dentro de un portador farmacéuticamente aceptable. 17. Compuesto de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque se enlaza mediante un residuo de aminoácido a la molécula portadora de polietilenglicol . 18. Método para seleccionar inhibidores de la enzima de escisión de antiplasmina, caracterizado porque comprende: proporcionar un péptido de transferencia de energía de resonancia fluorescente que es escindible por la enzima de escisión de a.2-antiplasmina, y que comprende una unión ??-??', y comprende un fluoróforo y un grupo de extinción separado por la unión ??-??', en donde el ?? comprende una prolina, el Pi' comprende un asn, phe, gln, ser, tyr, his o ala, y que tiene un residuo P2 que comprende gly; proporcionar una cantidad de enzima de escisión de a2-antiplasmina ; exponer la enzima de escisión de a2-antiplasmina a un candidato de inhibidor de enzima de escisión de a2-antiplasmina para formar una mezcla de prueba; combinar la mezcla de prueba con el péptido de transferencia de energía de resonancia fluorescente; y medir la emisión fluorescente desde la mezcla de prueba para identificar cuándo el candidato de inhibidor de enzima de escisión de a.2-antiplasmina inhibe la actividad de la enzima de escisión de o2-antiplasmina . 19. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el péptido de transferencia de energía de resonancia fluorescente comprende el grupo de extinción en la dirección 5' de la unión de prolina-asparagina y el fluoróforo en la dirección 3' de la unión ??-??'. 20. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el péptido de transferencia de energía de resonancia fluorescente comprende el grupo de extinción en la dirección 3' y el fluoróforo en la dirección 5' de la unión ??-??' · 21. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el péptido de transferencia de energía de resonancia fluorescente comprende SEQ ID NO: 9. 22. Inhibidor de enzima de escisión de a2-antiplasmina, caracterizado porque se identifica por el método de- detección de la reivindicación 18. 23. Sustrato de oligopéptido de la enzima de escisión de a2-antiplasmina, caracterizado porque comprende: Xi - X2 - X3 - X4 - 5 - Gly - Pro - X8 (SEQ ID NO: 9) en donde: Xi se selecciona de arg, his, lys, thr, ser, trp, gly, ala, gln, asn, ile, leu, met, phe, val, pro, y tyr; X2 se selecciona de arg, his, lys, thr, ser, trp, gly, ala, gln, asn, ile, leu, met, phe, val, pro, y tyr; X3 se selecciona de arg, his, lys, thr, ser, trp, gly, ala, gln, asn, ile, leu, met, phe, val, pro, y tyr; X4 se selecciona de thr, ser, trp, gly, ala, gln, ile, leu, met, phe, val, pro, tyr, asn, e his; X5 se selecciona de thr, ser, trp, gly, ala, gln, ile, leu, met, phe, val, pro, tyr, asn, e his; XQ se selecciona de asn, ser, his, tyr, ala, phe, gln; y en donde al menos uno de Xi, X2, y X3 se selecciona de arg, his, y lys; y en donde uno o dos de Xi, X2, y X3 puede estar ausente y en donde el oligopéptido consiste de hasta 28 aminoácidos. 24. Oligopéptido de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque además comprende un oligopéptido l-8mer que se extiende desde ?? en la dirección N-terminal. 25. Oligopéptido de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque además comprende un oligopéptido 2-10mer que se extiende desde X8 en la dirección C-terminal . 26. Oligopéptido de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque además comprende un grupo de extinción y un fluoróforo en lados opuestos de la unión Gly-Pro.
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