MX2008014281A - Metodo para extraer componentes de un cultivo de celulas de levadura. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un método para extraer componentes de célula de levadura con una fosfolipasa purificada.

Description

METODO PARA EXTRAER COMPONENTES DE UN CULTIVO DE CELULAS LEVADURA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con un método para extraer componentes de un cultivo de célula de levadura con una fosfolipasa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los cultivos de levadura se utilizan como una fuente para extracción de varios componentes. El término "extracto de levadura" habitualmente se utiliza para un material concentrado soluble derivado de células de levadura que se han sometido a hidrólisis de material celular, particularmente proteínas, carbohidratos solubles y ácidos nucleicos. Las células de levadura también se pueden utilizar como una fuente para componentes únicos específicos los cuales se extraen y purifican de células- de levadura. Estos componentes se pueden producir de manera natural por la levadura en cuestión o se pueden producir por las células de levadura después de manipulación genética. Cuando se produce extracto de levadura y cuando se purifican componentes específicos de los cultivos de célula de levadura, existe el deseo de incrementar el rendimiento de los productos de interés para mejorar la economía de la producción. La producción de extractos de REF. : 197203 levadura se describe en las páginas 240-251 de Nagodawithana (1995) Savory Flavours, Esteekay Associates, Inc., Winsconsin. Estados Unidos de Norteamérica.

SUMARIO DE LA INVENCION Los inventores han encontrado que el tratamiento de un cultivo de células de levadura con una fosfolipasa facilita la extracción de componentes del cultivo. En consecuencia, la presente invención se relaciona con un método para extraer uno o más componentes de levadura, el método comprende: i) tratar células de levadura con una fosfolipasa; y ii) separar uno o más de los componentes deseados de las células de levadura tratadas. En otros aspectos, la invención se relaciona con un método para producir un extracto de levadura y para uso de una fosfolipasa purificada para extraer uno o más componentes de un cultivo de células de levadura.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Levadura Un cultivo de células de levadura para ser utilizado en el método de la invención puede ser un cultivo de cualquier levadura, por ejemplo una cepa de Saccharomyces, por ejemplo S. cerevisiae, S. uvarum; una cepa de Kluyveromyces, por ejemplo K. fragilis y K. marxianus; o una cepa de Candida, por ejemplo C. utilis. El cultivo de células de levadura se puede seleccionar para su producción de uno o más componentes deseados y/o puede haber sido modificado genéticamente para producir uno o más de los componentes específicos y/o para incrementar el rendimiento de uno o más de los componentes específicos. Los métodos para modificación genética de células de levadura, por ejemplo por inserción de ADN que codifica para un componente proteínico deseado, es bien conocido en la técnica. El cultivo de células de levadura se puede propagar bajo condiciones favorables para el crecimiento del cultivo de células y/o favorable para la producción de uno o más componentes deseados con un rendimiento elevado, antes de que se someta al método de la invención.

Componente que se va a extraer Un componente que se va a extraer de la levadura por el método de la invención puede ser cualquier componente producido de manera natural por una levadura o cualquier componente producido por una levadura que ha sido modificada genéticamente para producir el componente deseado. Los componentes que son producibles en levadura incluyen, por ejemplo, enzimas; vitaminas, por ejemplo Bl, B6 y B12, antibióticos; astaxantina; polihidroxialcanoatos ; licopeno; ß-caroteno; albúmina sérica humana; ?-deltalactona y cis-3-hexanol . En una modalidad de la invención, un componente que se va a extraer de levadura es una proteína, particularmente una enzima, por ejemplo una lactasa. En otra modalidad de la invención, un componente que se va a extraer de la levadura es un componente no proteinico, por ejemplo un carbohidrato. En una modalidad de la invención, uno o más componentes que se van a extraer es un extracto de levadura, como se describe en lo siguiente.

Separación De acuerdo con la invención, uno o más componentes deseados se separan del cultivo de células de levadura después .de tratamiento con una fosfolipasa. La separación se puede obtener por cualquier método conocido en la técnica, en base en uno o más componentes específicos que se van a separar. La separación se puede llevar a cabo, por ejemplo, por centrifugación; filtración, por ejemplo microfiltración o ultrafiltración; técnicas cromatográficas , por ejemplo cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica y/o precipitación, por ejemplo por adición de una sal tal como, por ejemplo, sulfato de amonio. La separación se puede llevar a cabo por una combinación de varias técnicas de separación, por ejemplo se puede utilizar centrifugación para separar fragmentos de pared celular y una o más técnicas cromatográficas se pueden utilizar subsecuentemente para separar uno o más componentes específicos . Para facilitar la separación, las células de levadura se deben someter a métodos para romper las células de levadura antes de la separación, por ejemplo por homogeneización y/o adición de uno o más componentes que faciliten la ruptura celular, por ejemplo cloruro de sodio, acetato de etilo o isopropanol. El método de la invención puede facilitar la separación de uno o más componentes deseados de un cultivo de levadura, por ejemplo al reducir la cantidad de material particulado que se va a separar. El método también puede incrementar el rendimiento de uno o más componentes deseados en comparación con métodos de extracción similares que no incluyen tratamiento con una fosfolipasa.

Hidrólisis En una modalidad de la invención, el cultivo de células de levadura se somete a hidrólisis de proteína antes, después o durante el tratamiento con fosfolipasa. La hidrólisis de proteína se puede obtener por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo por enzimas proteolíticas . Las enzimas proteolíticas pueden ser, por ejemplo, enzimas proteolíticas presentes en las células de levadura y liberadas, por ejemplo, por ruptura mecánica de las células, por plasmólisis o autólisis. También se pueden agregar al cultivo de células de levadura una o más enzimas proteoliticas purificadas. La hidrólisis se puede obtener como se describ en lo siguiente bajo extractos de levadura.

Extracto de levadura En una modalidad de la invención, uno o más componentes que se van a extraer es un extracto de levadura. Por lo tanto, en una modalidad, la invención se relaciona con un método para producir un extracto de levadura, el método comprende: i) tratar células de levadura con una fosfolipasa purificada; y ii) someter las células de levadura tratadas a hidrólisis proteinica; y iii) separar componentes de células de. levadura; en donde la etapa ii) se lleva a cabo antes, después o durante la etapa i) . El extracto de levadura es un concentrado de material soluble derivado de cultivos de células de levadura después de hidrólisis del material celular, especialmente proteínas, carbohidratos solubles y ácidos nucleicos. Los extractos de levadura son útiles en aplicaciones alimenticias como agentes saborizantes/mej oradores , así como en promoción del crecimiento microbiano en fermentaciones industriales. El valor de los extractos de levadura depende en altó grado de la cantidad de proteína en el extracto, por lo tanto existe el deseo de obtener el más alto rendimiento de proteína posible. La materia prima para producir extractos de levadura puede ser cualquier cultivo de células de levadura de cualquier fuente. Habitualmente, la . materia prima es un cultivo de células de levadura que crecen especialmente para la producción de extracto de células de levadura o levaduras de fermentación agotadas que se desechan por las cervecerías después del uso en la elaboración de cerveza. La producción de extracto de levadura es bien conocido en la técnica. Los cultivos de levadura utilizados para la producción de extractos de levadura incluyen, por ejemplo, como cepas de Saccharomyces, por ejemplo S. cerevisiaer S. uvarum; una cepa de Kluyveromyces, por ejemplo K. fragilis y K. marxianus; y cepas de Candida, por ejemplo C. utilis. Si se utilizan levaduras de cervecería agotadas, con frecuencia se someten a eliminación de amargura para quitar los sabores amargos, por ejemplo por lavado a pH 8-9 antes de la producción de extracto. La hidrólisis habitualmente se lleva a cabo como autólisis en donde las enzimas hidrolíticas propias de las células de levadura se utilizan para ruptura de células e hidrólisis de componentes celulares. Para autólisis, el pH y la temperatura habitualmente se controlan para obtener la muerte de las células de levadura sin inactivar las enzimas internas. La autólisis se puede llevar a cabo, por ejemplo a un pH de 7 a 55-60 °C durante 20 horas. Una persona experta en la técnica puede seleccionar las condiciones de pH y temperatura adecuadas para un cultivo de levadura específico y las características de sabor deseadas. Las condiciones de pH y temperatura también pueden afectar el rendimiento del extracto que se obtiene. El grado de autólisis se puede medir, por ejemplo por la proporción- de nitrógeno amino (AN) en relación a la cantiad de nitrógeno total (TN) en el autolizado. Para un medio altamente autolizado es común una proporción AN/TN de 0.4-0.5. Se pueden agregar una o más enzimas hidrolíticas para facilitar la hidrólisis. La más común es la adición de proteasa para incrementar a velocidad de hidrólisis de proteína. Cualquier proteasa que sea activa bajo las condiciones específicas se puede utilizar, dependiendo de las características deseadas del producto. Una proteasa que se va ¦ a utilizar puede ser, por ejemplo, de origen animal, vegetal o microbiano, por ejemplo derivadas de una bacteria u hongo. Las proteasas que se pueden agregar incluyen papaína, subtilisina, por ejemplo subtilisina Carlsberg o proteasas micóticas, por ejemplo derivadas de una cepa de Aspergillus, por ejemplo A. orizae. Los ejemplos de proteasas comerciales útiles en los procesos de la invención incluyen Alcalase1^ y Flavourzyme^, ambas disponibles de Novozymes A/S, Bagsvasrd, Dinamarca. En una modalidad de la invención, una o más de las proteasas purificadas se agregan para facilitar hidrólisis de proteína. La hidrólisis también se puede obtener por plasmólisis en donde se agrega un compuesto, por ejemplo cloruro de sodio, acetato de etilo o isopropanol, que induce la muerte celular de la ruptura de las células, lo que genera liberación de enzimas hidroliticas internas. La autólisis y plasmólisis se pueden combinar, por ejemplo, al agregar cloruro de sodio al medio después de que el proceso de autólisis se ha permitido que se lleve a cabo durante un periodo de tiempo definido. La hidrólisis ácida también se puede utilizar para obtener hidrólisis de componentes de células de levadura. La hidrólisis ácida puede realizarse, por ejemplo, al agregar ácido clorhídrico a un cultivo de levadura, habitualmente el cultivo de levadura estará en forma de una suspensión con una concentración de sólidos de 65-80%. La hidrólisis con frecuencia se lleva a cabo a temperaturas elevadas, por ejemplo de hasta aproximadamente 100 °C y se puede realizar, por ejemplo, en un evaporador de película descendente. Después de que se ha alcanzado un nivel requerido de nitrógeno amino, se puede ajustar el hidrolizado al pH deseado, por ejemplo pH 5-7, habitualmente con hidróxido de sodio. Después de la hidrólisis de los componentes no deseados, típicamente los fragmentos de células no hidrolizados se retiran por separación para producir el extracto de levadura. La separación se puede llevar a cabo por cualquier método adecuado conocido en la técnica, típicamente por centrifugación y/o filtración. El extracto se puede enviar para pasteurización para destruir cualquier célula vegetativa, inactivar enzimas y evitar el crecimiento de contaminantes microbiológicos . El extracto habitualmente se concentrará, por ejemplo por evaporación en un evaporador de pelicula descendente. El concentrado también se puede secar/ por ejemplo mediante secado por aspersión o secado en tambor para proporcionar el polvo de extracto de levadura. El producto final habitualmente se vende como un liquido, pasta o polvo.

Fosfolipasa Una fosfolipasa utilizada en el proceso de la presente invención incluye fosfolipasa Ai, fosfolipasa A2, fosfolipasa B, fosfolipasa C y fosfolipasa D y cualquier combinación de las mismas. En el procedimiento de la invención, un cultivo de células de levadura se trata con una fosfolipasa, por ejemplo una fosfolipasa única; dos o más fosfolipasas, por ejemplo dos fosfolipasas que incluyen, sin limitación el tratamiento con el tipo A y B; el tipo i y A2; el tipo Ai y B; el tipo A2 y B; el tipo Ai y C; el tipo A2 y C; o el tratamiento con dos o más fosfolipasas diferentes del mismo tipo. También se incluye el tratamiento con un tipo de fosfolipasa tal como Ai, A2, B, C o D. La actividad de fosfolipasa se puede proporcionar por enzimas que tengan también otras actividades tales como, por ejemplo, una lipasa con actividad de fosfolipasa. La actividad de fosfolipasa puede ser, por ejemplo, de una lipasa con actividad secundaria de fosfolipasa. En otras modalidades de la invención, la actividad de enzima fosfolipasa se proporciona por una enzima que tenga esencialmente solo actividad de fosfolipasa y en donde la actividad de la enzima fosfolipasa no es una actividad secundaria. La fosfolipasa Ai se define de acuerdo con la clasificación EC de enzimas estándar como EC 3.1.1.32. Nombre oficial: fosfolipasa ?? Reacción catalizada: fosfatidilcolina + agua <=> 2-acilglicerofosfo-colina + un anión de ácido graso Comentario: tiene una especificidad mucho más amplia que EC 3.1.1.4. La fosfolipasa A2 se define de acuerdo con la clasificación EC de enzima stándar como EC 3.1.1.4 Nombre oficial: fosfolipasa i¾2. Nombres alternativos: fosfatidilcolina 2-acilhidrolasa . lecitinasa a; fosfatidasa; o fosfatidolipasa . Reacción catalizada: fosfatidilcolina + agua <=> 1-acilglicerofosfo-colina + un anión de ácido graso Comentario: también actúa sobre fosfatidiletanolamina, plasmalógeno de colina y fosfátidos, eliminando el ácido graso unido a la posición 2. La fosfolipasa B se define de acuerdo · con la clasificación EC de enzima estándar como EC 3.1.1.5. Nombre oficial: lisofosfolipasa . Nombres alternativos: lecitina b; lisolecitinasa fosfolipasa B; o PLB. Reacción catalizada; 2-lisofosfatidilcolina + agua <=> glicerofosfocolina + un anión de ácido graso La fosfolipasa C se define de acuerdo con la clasificación EC de enzima estándar como EC 3.1.4.3. La fosfolipasa C hidroliza el enlace fosfato de fosfatidilcolina y otros glicerofosfolipidos, por ejemplo fosfatidiletanolamina, lo que proporciona diacilglicerol; esta enzima también hidrolizará los enlaces fosfato de esfingomielina, cardiolipina, plasmalógeno de colina y fosfolipidos de ceramida. Reacción con fosfatidilcolina : fosfatidilcolina + agua <=> 1, 2-diacilglicerol + fosfato de colina. La fosfolipasa D se define de acuerdo con la clasificación EC de enzima estándar como EC 3.1.4.4. La fosfolipasa D hidroliza los enlaces fosfato de fosfolipidos y' esfingomielina para proporcionar el ácido fosfatidico correspondiente.

Reacción con fosfatidilcolina : Fosfatidilcolina A + agua <=> colina + un fosfotidato.

Fosfolipasa A La actividad de fosfolipasa A, que incluye fosfolipasa Ai, fosfolipasa A2 y combinaciones de los mismos, se pueden proporcionar por enzimas que tienen otras actividades también tales como, por ejemplo, una lipasa con actividad de fosfolipasa A. La actividad de fosfolipasa A puede ser, por ejemplo, de una lipasa con actividad secundaria de fosfolipasa. En otras modalidades de la invención, la actividad de la fosfolipasa A se proporciona por una enzima que tiene esencialmente solo actividad de fosfolipasa A y en donde la actividad de la enzima fosfolipasa A no es una actividad secundaria. La fosfolipasa A puede ser de cualquier origen, por ejemplo de origen animal (tal como, por ejemplo, de mamífero) , por ejemplo de páncreas (por ejemplo páncreas bovino o porcino), o de veneno de víbora o veneno de abeja. De manera alternativa, la fosfolipasa A puede ser de origen microbiano, por ejemplo de hongos filamentosos, levaduras o bacterias, tales como el género o la especie Aspergillus, por ejemplo A. niger; Dictyostelium, por ejemplo D. discoideum; Mucor, por ejemplo M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, por ejemplo N. crassa; Rhizomucor, por ejemplo R. pusillus; Rhizopus, por ejemplo R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinía, por ejemplo S. libertiana; Trichophyton, por ejemplo T. rubrum; Whetzelinia, por ejemplo W. sclerotiorum; Bacillus, por ejemplo B. megaterium, N. subtilis; Citrobacter, por ejemplo C. freundii; Enterobacter, por ejemplo E. aerogenes, E. cloacas; Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, por ejemplo E. herbicola; Escherichia, por ejemplo E. coli; Klebisella, por ejemplo K. Pneumoniae; Proteus, por ejemplo P. vulgaris; Providencia, por ejemplo P. stuartii; Salmonella, por ejemplo S. typhimurium; Serratia , por ejemplo S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, por ejemplo S. flexneri; Streptomyces, por ejemplo S. violaceoruber; Yersinia, por ejemplo Y. enterocolitica . Por lo tanto, la fosfolipasa A puede ser micótica, por ejemplo de la clase Pyrenomycetes, t.al como el género Fusarium tal como una cepa de F. culmorum, F. ¦ heterosporum, F. solani o una cepa de F. oxysporum. La fosfolipasa A también puede ser de una cepa de hongo filamentoso dentro del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger o Aspergillus orizae. Una fosfolipasa A preferida se deriva de una cepa de Fusarium, particularmente F. venenatum o F. oxysporum, por ejemplo de la cepa DSM 2672 como se describe en WO 98/26057, especialmente descrita en la reivindicación 36 y la SEC ID NO: 2 de WO 98/26057. Otra fosfolipasa A preferida es PLA 2 de Streptomyces tal como, por ejemplo, PLA 2 de S. violaceoruber. En modalidades adicionales, la fosfolipasa es una fosfolipasa como se describe en WO 00/32758 (Novozymes A/S, Dinamarca) . La actividad de la fosfolipasa tipo A puede expresarse, por ejemplo, en unidades Lecitase (LEU) . La actividad de fosfolipasa en unidades Lecitase se mide en relación a un estándar de fosfolipasa utilizando lecitina como un sustrato. La fosfolipasa A cataliza la hidrólisis de lectina a lisolectina y un ácido graso libre. El ácido graso liberado se titula con hidróxido de sodio 0.1 N bajo condiciones estándar (pH 8.00; 40.00°C + 0.5). La actividad de fosfolipasa A se determina como la velocidad de consumo de hidróxido de sodio durante la neutralización del ácido graso y se expresa en unidades de Lecitase (LEU) en relación al estándar de Lecitase (fosfolipasa) (disponible de Novozymes A/S, Bagsvasrd, Dinamarca) . 1 LEU se define como la cantidad de enzimas que, bajo las condiciones estándar (pH 8.00; 40.00°C + 0.5) resulta en la misma velocidad de consumo de hidróxido de sodio (µ????/min) que el estándar de Lecitase diluido a una actividad nominal de 1 LEU/g.

Fosfolipasa B El término "fosfolipasa B" utilizado en la presente en relación con una enzima de la invención se pretende que abarque una enzima con actividad de fosfolipasa B.

La actividad de fosfolipasa B se puede proporcionar por enzimas que tengan otras actividades también, tales como por ejemplo una lipasa con actividad de fosfolipasa B. La actividad de fosfolipasa B puede estar, por ejemplo, de una lipasa con actividad secundaria de fosfolipasa B. En otras modalidades de la invención, la actividad de la enzima fosfolipasa B se proporciona por una enzima que tiene esencialmente solo actividad de fosfolipasa B y en donde la actividad de la enzima fosfolipasa B no es una actividad secundaria. En una modalidad de la invención, la fosfolipasa B no son lipasas que tengan actividad secundaria de fosfolipasa B como se define en WO 98/26057. La fosfolipasa B puede ser de cualquier origen, por ejemplo de origen animal (tal, por ejemplo de mamífero), por ejemplo de hígado (por ejemplo hígado de rata) . De manera alternativa, la fosfolipasa B puede ser de origen microbiano, por ejemplo de hongos filamentosos, levaduras o bacterias tales como el género o especies Aspergillus, por ejemplo A. foetidus, A. fumigatus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae; Botrytis, por ejemplo B. cinérea; Candida, por ejemplo C. albicans; Cryptococcus, por ejemplo C. neoformans, Escherichia, por ejemplo E. coli , Fusarium, por ejemplo F. sporotrichiodesr F. venenatum, F. verticillioides; Hyphozyma; Kluyveromyces, por ejemplo K. lactis; Magnaporte, por ejemplo M. grísea; Metarhizium, por ejemplo M. anisopliae; Mycosphaerella, por ejemplo M. graminicola; Neurospora, por ejemplo N. crassa; Penicillium, por ejemplo P. notatum; Saccharomyces, por ejemplo S. cerevisiae; Schizosaccharomyces, por ejemplo S. pombe; Torulaspora, por ejemplo T. delbrueckii; Vibrio; por ejemplo V. choierae. Una fosfolipasa B preferida se deriva de una cepa de Aspergillus, particularmente fosfolipasa LLPL-1 o LLPL-2 de A. niger, por ejemplo como está contenida en los clones de Escherichia coli DSM 13003 o DSM 13004 o fosfolipasa LLP-1 o LLP-2 de A. oryzae, por ejemplo como está contenida en los clones de E. coli DSM 13082 o DSM 13083 como se describe en WO 01/27251, especialmente descritos en la reivindicación 1 y las SEC ID NOS: 2, 4, 6 u 8 del documento WO 01/27251.

Fosfolipasa C La actividad de fosfolipasa C se puede proporcionar por enzimas que tienen también otras actividades tales como, por ejemplo, una lipasa con actividad de fosfolipasa C o una fosfatasa con actividad de fosfolipasa C. La actividad de fosfolipasa C puede ser, por ejemplo, de una lipasa con actividad secundaria de fosfolipasa C. En otras modalidades de la invención, la actividad de la enzima fosfolipasa C se proporciona por una enzima que tiene esencialmente solo actividad de fosfolipasa C y en donde la actividad de la enzima fosfolipasa C no es una actividad secundaria.

La fosfolipasa C es de cualquier origen, por ejemplo de origen animal, tal como origen de mamífero, de origen vegetal o de origen microbiano, tal como origen micótico u origen bacteriano, por ejemplo de una cepa de Mycobacterium, por ejemplo M. tuberculosis o M. bovis; una cepa de Bacillus, por ejemplo B. cereus; una cepa de Clostridium, por ejemplo C. bifermentans, C. haemolyticum, C. novyi, C. sordelli o C. perfingens; una cepa de Listeria, por ejemplo L. monocytogenes; una cepa de . Pseudomonas, por ejemplo P. aeruginosa o una cepa de Staphylococcus, por ejemplo S. aureus; o una cepa de Burkholderia, por ejemplo B. pseudomallei .

Fosfolipasa D La actividad de fosfolipasa D se puede proporcionar por enzimas que también tienen otras actividades tales como, por ejemplo, una lipasa con actividad de fosfolipasa D, una fosfatasa con actividad de fosfolipasa D o una colina esterasa con actividad de fosfolipasa D. La actividad de fosfolipasa D puede ser, por ejemplo, de una lipasa con actividad secundaria de fosfolipasa D. En otras modalidades de la invención, la actividad de la enzima fosfolipasa D se proporciona por una enzima que tiene esencialmente solo actividad de fosfolipasa D y en donde la actividad de la enzima fosfolipasa D no es una actividad secundaria.

La fosfolipasa D puede ser de cualquier origen, por ejemplo de origen animal tal como origen de mamífero, por ejemplo de ratón, rata o hámster chino; de origen vegetal, por ejemplo de repollo, maíz, arroz, algarrobo, tabaco, caupi o Arabidopsis thaliana; o de origen microbiano tal como de origen bacteriano, por ejemplo de una cepa de Corynebacterium, por ejemplo C. pseudotuberculosis, C. ulcerans o C. haemolyticum; o de origen micótico tal como, por ejemplo, de una cepa de Streptomyces, por ejemplo S. antibioticus o S. chrornofuscus; una cepa de Trichoderma, por ejemplo T. reesei; una cepa de Saccharomyces, por ejemplo S. cerevisiae; o una cepa de Aspergillus, por ejemplo A. oryzae, A. niger, A. nidulans o A. fumigatus.

Fuentes de enzima y formulación La fosfolipasa utilizada en el procedimiento de la invención se puede derivar o se puede obtener de cualquiera de las fuentes mencionadas en la presente. El término "derivados" en este contexto significa que la enzima puede haber sido aislada de un organismo en donde actualmente se encuentra de manera nativa, es decir, la identidad de la secuencia de aminoácidos de la enzima son idénticos a la enzima nativa. El término "derivado" también significa que las enzimas pueden haber sido producidas de manera recombinante en un organismo hospedador, la enzima producida de manera recombinante tiene una identidad idéntica a la enzima nativa o tiene una secuencia de aminoácidos modificada, por ejemplo que tiene uno o más aminoácidos los cuales se han suprimido, insertado y/o sustituido, es decir, una enzima producida de manera recombinante la cual es un mutante y/o un fragmento de una secuencia nativa de aminoácidos. Dentro del significado de la enzima nativa se incluyen las variantes naturales. Además, el término "derivado" incluye enzimas producidas de manera sintética, por ejemplo por síntesis peptídica. El término "derivado" también abarca enzimas las cuales se han modificado por ejemplo por glucosilación, fosforilación, etc., ya sea in vivo o in vitro. El término "obtenible" en este contexto significa que la enzima tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a una enzima nativa. El término abarca una enzima que se ha aislado de un organismo en donde actualmente está presente de manera nativa o una en la cual se ha expresado de manera recombinante en el mismo tipo de organismo u otro, o enzimas producidas de manera sintética, por ejemplo, por síntesis peptídica. Con respecto a la enzima producida de manera recombinante, los términos "obtenibles" y "derivados" se refieren a la identidad de la enzima y no a la identidad del organismo hospedador en el cual se produce de manera recombinante . En consecuencia, la fosfolipasa se puede obtener de un microorganismo mediante el uso de cualquier técnica adecuada. Por ejemplo se puede obtener una preparación de enzima de fosfolipasa por fermentación de un microorganismo adecuado y aislamiento subsecuente de una preparación de fosfolipasa del caldo fermentado resultante o del microorganismo por métodos conocidos en la técnica. La fosfolipasa también se puede obtener mediante el uso de técnicas de ADN recombinante . El método normalmente comprende cultivo de una célula hospedadora transformada con un vector de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica para la fosfolipasa en cuestión y la secuencia de ADN está unida operacionalmente con una señal de expresión apropiada de manera que es capaz de expresar la fosfolipasa en un medio de cultivo bajo condiciones que permiten la expresión de la enzima y recuperación de la enzima del cultivo. La secuencia de ADN también se puede incorporar en el genoma de la célula hospedadora. La secuencia de ADN puede ser de origen genómico, de ADNc o sintético o cualquier combinación de estos y se puede aislar o sintetizar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Las fosfolipasas adecuadas están disponibles comercialmente . Los ejemplos de enzimas comerciales son, por ejemplo, LecitaseMR (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), YieldMAX*0 (Novozymes A/S, Bagsvasrd, Dinamarca y Chr. Hansen A/S, H0rsholm, Dinamarca) , LysomaxMR (Genencor International, Inc., Palo Alto, California) o Purifine1^ (Diversa Corp., San Diego, California) . Una fosfolipasa B adecuada es, por ejemplo, la fosfolipasa LLPL-2 de Aspergillus niger, que se puede producir de manera recombinante en A. niger, como se describe en el documento WO 01/27251. En el procedimiento de la invención, la fosfolipasa es una fosfolipasa purificada. El término "purificado" como se utiliza en la presente, cubre las preparaciones de enzima de fosfolipasa en donde los componentes del organismo del cual se derivan se han separado. El término "purificado" también abarca la proteína de enzima fosfolipasa libre de los componentes del organismo nativo del cual se obtiene, este también de denomina fosfolipasa "esencialmente pura" y puede ser particularmente relevante para fosfolipasas las cuales se encuentran de manera natural las cuales no han sido modificadas genéticamente, por ejemplo por supresión, sustitución o inserción de uno o más residuos aminoácidos. En consecuencia, la fosfolipasa se purifica, por ejemplo, únicamente con cantidades menores de otras proteínas que están presentes. La expresión "otras proteínas" se relaciona en particular a otras enzimas. El término "purificado" como se utiliza en la presente, también se refiere a la separación de otros componentes, particularmente otras proteínas y de manera más particular otras enzimas presentes en la célula de origen de la fosfolipasa. La fosfolipasa puede ser "sustancialmente pura" es decir, puede estar libre de otros componentes del organismo en el cual se produce, por ejemplo un organismo hospedador para fosfolipasa producida de manera recombinante . Preferiblemente, las enzimas son por lo menos 75% (p/p) puras, de manera más preferible por lo menos 80%, 85%, 90% o incluso por lo menos 95% puras. En una modalidad más preferida, la fosfolipasa es una preparación de proteina de enzima por lo menos 98% pura. Los términos "fosfolipasas" incluyen cualquiera de los compuestos auxiliares que pueden ser necesarios para la actividad catalítica de la enzima tales como, por ejemplo, un aceptor o cofactor apropiados, los cuales pueden estar o no presentes de manera natural en el sistema de reacción. La fosfolipasa puede estar en cualquier forma adecuada para uso en cuestión, tal como, por ejemplo, en forma de un polvo seco o granulado, un granulado que no forme polvo, un líquido, un líquido estabilizado o una enzima protegida. Los granulados se pueden producir, por ejemplo, como se describe en el documento de E.U.A. 4,106,991 y el documento E.U.A. 4,661,452 y opcionalmente pueden estar recubiertos por métodos conocidos en la técnica. Las preparaciones de enzima líquida pueden ser estabilizadas, por ejemplo, al agregar estabilizantes tales como un azúcar, un alcohol de azúcar u otro poliol, ácido láctico u otro ácido orgánico de acuerdo con métodos establecidos. Las enzimas protegidas se pueden preparar de acuerdo con el método descrito en el documento EP 238216.

Tratamiento con fosfolipasa De acuerdo con la invención, las células de levadura se tratan con una fosfolipasa purificada. El tratamiento se puede llevar a cabo por cualquier método apropiado, por ejemplo al agregar la fosfolipasa al cultivo de células de levadura. El cultivo de células de levadura puede, por ejemplo, suspenderse en agua cuando se trata con una fosfolipasa. El tratamiento con una fosfolipasa se puede llevar a cabo antes, después o simultáneamente con el proceso de sometimiento de cultivo de célula de levadura a hidrólisis proteinica . Las condiciones adecuadas bajo las cuales realizar el tratamiento de fosfolipasa se pueden encontrar por las personas expertas en la técnica por métodos habituales conocidos en la técnica para optimización de reacciones enzimáticas . Una persona experta en la técnica sabrá cómo ajusfar parámetros tales como pH, temperatura y cantidad de fosfolipasa para obtener los resultados deseados. En una modalidad de la invención, el tratamiento con fosfolipasa se lleva a cabo a un pH entre pH 2 y pH 10, por ejemplo entre pH 3 y pH 9, entre pH 2 y pH 6 o entre pH 4 y pH 6. La cantidad de fosfolipasa que se va a utilizar en el método de la invención puede depender de la actividad de la fosfolipasa especifica. Cuando se utiliza la fosfolipasa A, la cantidad de fosfolipasa puede estar, por ejemplo, entre 0.001 y 1 mg de proteina de enzima/g de materia seca, por ejemplo, entre 0.005 y 0.1 mg de proteina de enzima/g de materia seca. En una modalidad de la invención, se agrega una fosfolipasa en una cantidad suficiente para obtener un rendimiento aumentado de uno o más de los componentes que se van a extraer, en comparación con un procedimiento de extracción similar en donde no se lleva a cabo un tratamiento con una fosfolipasa. El rendimiento puede, por ejemplo, incrementarse en por lo menos 1%, por ejemplo por lo menos 2%, por lo menos 5% o por lo menos 10% o por lo menos 20%. En , una modalidad, la invención se relaciona con el uso de una fosfolipasa purificada, por ejemplo, una fosfolipasa Ai para extracción de uno o más componentes de un cultivo de células de levadura.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Un cultivo de células de levadura en bloque de Saccharomyces cerevisiae se mezcla con agua desionizada para alcanzar un contenido de materia seca de 14% y se agita con un agitador magnético durante 60 min a temperatura ambiente. La cantidad de nitrógeno en esta mezcla de levadura se determina por un método de combustión en un equipo Leco FP-528. Los sólidos secos se miden en la mezcla de levadura por peso (después de secado a 105°C) . La mezcla de levadura se calienta a 55 °C y se ajusta el pH a 6.5 con NaOH 4N. Las muestras se tratan con 0.25% (peso/peso de materia seca de levadura) de una fosfolipasa (LecitaseMR Ultra, 10 kLU/g Novozymes A/S, Dinamarca) y/o 0.5% (peso/peso de materia seca de levadura) de una enzima proteolitica (AlcalaseMR 2.4L, Novozymes A/S, Dinamarca) . Las enzimas se agregan a la mezcla de levadura después de 10 minutos de precalentamiento a 55°. Una muestra control (blanco) no se trata con la enzima. La autólisis se lleva a cabo durante 22 horas a 55°C bajo agitación magnética. Se extraen muestras de 20 mi y la cantidad exacta se pesa. Las muestras se inactivan a 85°C durante 10 min. Después de una activación, las muestras se centrifugan durante 10 min a 3500 rpm utilizando un equipo Multifuge 3S-R de Heraeus . La cantidad de extracto se pesa después de la decantación. Los sólidos secos se miden en el extracto por pesado (después de secado a 105°C) . La cantidad de nitrógeno en el extracto se determina por el método de combustión en un equipo Leco FP-528. Se calcula la cantidad de proteina como 6.25 veces la cantidad de nitrógeno. Se determina el nitrógeno amino utilizando el método OPA (o-ftaldialdehido) . En base en las mediciones anteriores se calcula lo siguiente: Rendimiento extracto en % = (g de extracto después de la centrifugación) / (g de mezcla de levadura antes de la centrifugación) *100 % de rendimiento de proteína = (g de extracto después de centrifugación*contenido de proteína en extracto) / (g de mezcla de levadura antes de la centrifugación*contenido de proteína de mezcla de levadura) *100 Grado de hidrólisis = (Número de enlaces peptídicos separados/número total de enlaces peptídicos) *100 = (h/htot) *100 En donde h se expresa como función de miliequivalentes de serina NH2: h = (serina NH2 -0.4) /l y htot = 7.8. La serina NH2 se mide en relación a un estándar de serina que contiene 100 mg/1 al medir la absorción a 340 nm. Los resultados se basan en determinaciones dobles, y se muestran en la tabla 1.

Tabla 1 Enzima % de % de Grado de rendimiento rendimiento hidrólisis de proteína de extracto Blanco 21.2 62.1 33.9 0.5% de Alcalase 2.4L 59.2 60.9 66.9 0.25% de Lecitase Ultra 21.8 61.8 35.7 0.5% de Alcalase 2.4L 67.4 66.8 61.1 0.25% de Lecitase Ultra Ejemplo 2 Se prepara extracto de levadura por el mismo método que en el ejemplo 1, excepto que se utiliza una fosfolipasa diferente (YieldMaxMR, Chr. Hansen A/S y Novozymes A/S, Dinamarca) y se realiza el tratamiento enzimático a 40°C y pH 6.0. Los resultados se proporcionan en la tabla 2 (determinaciones solas) .

Tabla 2 Ejemplo 3 Un cultivo de células de levadura en bloque de Saccharomyces cerevisiae se mezcla con agua desionizada para alcanzar un contenido de materia seca de 14% y se agita con un agitador magnético durante 60 min a temperatura ambiente. La cantidad de nitrógeno en esta mezcla de levadura se determina por un método de combustión en un equipo Leco FP-528. Los sólidos secos se miden en la mezcla de levadura por peso (después de secado a 105°C) . La mezcla de levadura se calienta a 55°C y se ajusta a pH natural (aproximadamente 5-5.3) o se ajusta a 5.8 con NaOH 4N. Las muestras se tratan con 0.25% (peso/peso de materia seca de levadura) de una fosfolipasa (Lecitasem Ultra, 10 kLü/g Novozymes A/S, Dinamarca) y/o 0.3% (peso/peso de materia seca de levadura) de una enzima proteolítica (Papain, Pang Bo Biological Co. Ltd) ) . Las enzimas se agregan a la mezcla de levadura después de 10 minutos de precalentamiento a 55°C. Una muestra control (blanco) no se trata con la enzima. La autólisis se lleva a cabo durante 22 horas a 55°C bajo agitación magnética. Se extraen muestras de 30 mi y la cantidad exacta se pesa. Las muestras se inactivan a 85°C durante 10 min. Después de inactivación, las muestras se centrifugan durante 10 min a 3500 rpm utilizando un equipo Multifuge 3S-R de Heraeus. El análisis de los extractos es como se describe en el Ejemplo 1. Se determina la turbidez utilizando un equipo Turbidimeter 2100A de HACH. Los resultados se basan en determinaciones dobles y se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3 Enzima pH en % de % de Grado de Turbidez hidrolizado rendimiento rendimiento hidrólisis (NTU) de proteína de extracto Control 5 47.2 66.7 48.6 3820 0.25% de lecitase Ultra 5 52.5 65.9 45.9 1421 control de pH ajustado 5.8 24.8 64.5 44.3 1579 0.25% de Lecitase Ultra 5.8 26.1 64.6 47.93 1449 0.3% de Papaína 5.8 63.5 68.8 71.8 2179 0.3% de Papaína y 5.8 66.5 67.3 67.8 157 0.25% de lecitase Ultra Se hace constar que con relación a esta fecha, mejor método conocido por la solicitante para llevar a práctica la citada invención, es el que resulta claro de presente descripción de la invención.

Claims (11)

1. . REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para extraer uno o más componentes de levadura, caracterizado porque comprende: i) tratar células de levadura con una fosfolipasa; y ii) separar uno o más componentes deseados de la célula de levadura tratadas.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de levadura se someten a hidrólisis de proteina antes, después o durante la etapa i) .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la proteina se hidroliza por enzimas proteoliticas .
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la proteina se hidroliza por autólisis .
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque se utilizan una o más enzimas proteoliticas purificadas.
6. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se utiliza en la etapa i) una fosfolipasa Ai.
7. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se utiliza en la etapa i) una fosfolipasa A2.
8. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque uno o más componentes que se van a extraer comprenden una proteina.
9. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque uno o más componentes que se van a extraer comprenden una enzima.
10. 10. ün método para producir un extracto de levadura, caracterizado porque comprende: i) tratar células de levadura con una fosfolipasa purificada; y ii) someter las células de levadura tratadas a hidrólisis proteinica; y iii) separar los componentes de célula de levadura; en donde la etapa ii) se lleva a cabo antes, después o durante la etapa i) .
11. 11. El uso de una fosfolipasa purificada para extraer uno o más componentes de un cultivo de células de levadura .