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MX2008013882A - Produccion de alcoholes de cuatro carbonos por fermentacion. - Google Patents

Produccion de alcoholes de cuatro carbonos por fermentacion.

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MX2008013882A
MX2008013882A MX2008013882A MX2008013882A MX2008013882A MX 2008013882 A MX2008013882 A MX 2008013882A MX 2008013882 A MX2008013882 A MX 2008013882A MX 2008013882 A MX2008013882 A MX 2008013882A MX 2008013882 A MX2008013882 A MX 2008013882A
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MX
Mexico
Prior art keywords
seq
amino acid
butanol
dehydratase
acid sequence
Prior art date
Application number
MX2008013882A
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English (en)
Inventor
Vasantha Nagarajan
Charles E Nakamura
Gail K Donaldson
Andrew C Eliot
Jean-Francois Tomb
Original Assignee
Du Pont
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Filing date
Publication date
Application filed by Du Pont filed Critical Du Pont
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Abstract

La presente invención proporciona métodos para la producción por fermentación de alcoholes de cuatro carbonos. Específicamente el butanol, preferentemente el 2-butanol es producido por el crecimiento por fermentación de una bacteria recombinante que expresa una ruta biosintética de 2-butanol. Los microorganismos y métodos recombinantes de la invención también pueden estar adaptados para producir 2-butanona, un compuesto intermedio en las rutas biosintéticas de 2-butanol descritas aquí.

Description

PRODUCCION DE ALCOHOLES DE CUATRO CARBONOS POR FERMENTACION CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al campo de la microbiología industrial y a la producción de alcoholes. Más específicamente, el 2-butanol es producido por medio de fermentación industrial de un microorganismo recombinante . Los microorganismos recombinantes y los métodos de la invención también pueden ser adaptados para producir 2-butanona, un compuesto intermedio en las rutas biosintét icas del 2-butanol descritas en la presente. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El butanol es una substancia química industrial importante, útil como un aditivo de combustible, como una substancia química de alimentación en la industria de los plásticos, y como un agente de extracción de grado alimenticio en la industria de los alimentos y de los sabores. Cada año, 4,540 a 5,448 millones de kilogramos (10,000 a 12,000 millones de libras) de butanol son producidas por medios petroquímicos y la necesidad de que esta substancia química básica probablemente se incrementará. La 2-butanona, también referida como la metil etil cetona (MEK, por sus siglas en inglés), es un solvente utilizado ampliamente y es la cetona producida comercialmente más importante, después de la acetona. La misma es utilizada como un solvente para pinturas, resinas y adhesivos, así como un agente de extracción selectivo y un Ref . : 196272 activador de las reacciones de oxidación. Los métodos para la síntesis química de la 2-butanona ya son conocidos, tales como por la deshidrogenación del 2-butanol o en un proceso en donde el butano líquido es oxidado de manera catalítica proporcionando la 2-butanona y ácido acético {Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, sexta edición, 2003, Wiley-VHCVerlag GmbH and Co . Weinheim, Alemania, Vol . 5, pp. 727-732) . La 2-butanona también puede ser convertida químicamente al 2-butanol por hidrogenación (Breen et al., J. , o Catalysis 236: 270-281 (2005)) . Los métodos para la síntesis química de 2-butanol ya son conocidos, tales como la hidratación del n-buteno (Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, sexta edición, 2003, Wiley-VHCVerlag GmbH and Co. Weinheim, Alemania, Vol. 5, pp . 716-719) . Estos procesos utilizan las materias primas derivadas de substancias petroquímicas y generalmente son costosos, y no son favorables para el medio ambiente. La producción de 2-butanona y 2-butanol a partir de las materias primas derivadas de las plantas podrían minimizar las emisiones del gas de invernadero y podría representar un avance en el arte. Los métodos para producir 2-butanol por la biotransformación de otras substancias químicas orgánicas también son conocidos. Por ejemplo, Stampfer et al (WO. 03/078615) describe la producción de alcoholes secundarios, tales como 2-butanol, por la reducción de las cetonas que es catalizada por una enzima de la alcohol deshidrogenasa obtenida de Rhodococcus ruber . De manera semejante, Kojima et al. (EP 0645453) describe un método para la preparación de alcoholes secundarios, tales como 2-butanol, por la reducción de las cetonas que es catalizada por una enzima de alcohol deshidrogenasa secundaria obtenida de Candida parapsilosis . Adicionalmente , Kuehnle et al. (EP 1149918) describe un proceso que produce tanto el 1-butanol y el 2-butanol por la oxidación de los hidrocarburos por varias cepas de Rhodococcus ruber. El proceso favoreció la producción de 1-butanol con una selectividad de 93.8 %. La producción de 2-butanol por ciertas cepas de Lactobacilli también es conocida (Speranza et . al, J. Agrie. Food. Chem. (1997) 45:3476-3480) . El 2-butanol es producido por la transformación de meso-2 , 3-butandiol . La producción de 2-butanol a partir de acetolactato y acetoina por estas cepas de Lactobacilli también fue demostrada. Sin embargo, no han existido reportes de un microorganismo recombinante diseñado para producir el 2-butanol. Por lo tanto, existe una necesidad de procesos efectivos en cuanto al costo, responsables con el medio ambiente, para la producción de 2-butanol y 2-butanona. La presente invención resuelve esta necesidad por medio del descubrimiento de elementos hospederos para la producción de microbios recombinantes que expresan rutas biosintéticas para el 2-butanol y la 2-butanona. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un microorganismo recombinante que tiene una ruta biosintética diseñada para el 2-butanol. También se proporciona un microorganismo recombinante que tiene una ruta biosintética diseñada para la 2-butanona, que es la misma que la ruta biosintética para el 2-butanol con la omisión de la última etapa. Los microorganismos diseñados pueden ser utilizados para la producción comercial de 2-butanol o 2-butanona. En consecuencia, la invención proporciona una célula hospedera microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza un substrato para producir una conversión, seleccionado del grupo que consiste de: i) piruvato al alfa-acetolactato ; ii) alfa-acetolactato a la acetoina; iii) acetoina al 2 , 3-butandiol ; iv) 2 , 3-butandiol a la 2-butanona; y v) 2-butanona al 2-butanol; en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana y en donde la célula hospedera microbiana produce 2-butanol. En otra modalidad de la invención se proporciona una célula hospedera microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza un substrato para producir la conversión, seleccionado del grupo que consiste de: i) piruvato al alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato a acetoina; iii) acetoina al 2 , 3-butandiol ; y iv) 2 , 3-butandiol a la 2-butanona; en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana y en donde la célula hospedera microbiana produce 2-butanona. En otra modalidad, la invención proporciona un método para la producción de 2-butanol, que comprende: 1) proporcionar una célula hospedera microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza un substrato para producir la conversión seleccionado del grupo que consiste de: i) piruvato al alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato a la acetoina; iii) acetoina al 2 , 3-butandiol ; iv) 2 , 3-butandiol a la 2-butanona; y v) 2-butanona al 2-butanol;" en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana; y 2) poner en contacto la célula hospedera de (1) con un substrato de carbón fermentable en un medio de fermentación bajo condiciones por las cuales es producido el 2-butanol. De manera semejante, la invención proporciona el método A para la producción de 2-butanona que comprende: 1) proporcionar una célula hospedera microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza un substrato para producir la conversión, seleccionado del grupo que consiste de: i) piruvato al alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato a la acetoina; iii) acetoina al 2 , 3-butandiol ; iv) 2 , 3-butandiol a la 2-butanona; en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana; y 2) poner en contacto la célula hospedera de (1) con un substrato de carbón fermentable en un medio de fermentación bajo condiciones por las cuales se produzca la 2-butanona. En otra modalidad la invención proporciona un 2-butanol o la 2-butanona que contiene el medio del producto de fermentación producido por el método de la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La invención puede ser entendida de manera más completa a partir de la siguiente descripción detallada, las figuras, y las descripciones de las secuencias que se anexan, que forman una parte de esta solicitud. La figura 1 muestra cuatro diferentes rutas para la biosintesis de 2-butanona y 2-butanol. La figura 2? muestra un árbol filogenético de las subunidades grandes de longitud total de las dioles/gliceroles deshidratasas , con >95 % de secuencias idénticas removidas (excepto que todas las secuencias de la función verificadas experimentalmente fueron retenidas), y la figura 2B muestra un listado de claves que muestra la identidad de cada secuencia en el árbol. Las secuencias con la función determinada experimentalmente como las dioles/gliceroles deshidratasas están realzadas con gris oscuro o gris claro, respectivamente. La figura 3A muestra un árbol filogenético de las subunidades intermedias de longitud total de las dioles/gliceroles deshidratasas, con >95 % de secuencias idénticas removidas, y figura 3B muestra un listado de claves que muestra la identidad de cada secuencia en el árbol. Las secuencias con la función determinada experimentalmente como las dioles/gliceroles deshidratasas están realzadas con gris oscuro o gris claro, respectivamente. La figura 4A muestra un árbol filogenético de las subunidades pequeñas de longitud total de las dioles/gliceroles deshidratasas, con >95 % de secuencias idénticas removidas, y figura 4B muestra un listado de claves que muestra la identidad de cada secuencia en el árbol. Las secuencias con la función determinada experimentalmente como las dioles/gliceroles deshidratasas están realzadas con gris oscuro o gris claro, respectivamente. BREVE DESCRIPCION DE LAS TABLAS Y LAS SECUENCIAS La Tabla 12 es una tabla del Perfil de HMM de subunidades alfa grandes para la enzima de diol/glicerol deshidratasa . La Tabla 12 es presentada con el presente electrónicamente y es incorporada aquí para referencia. La Tabla 13 es una tabla del Perfil de HMM de subunidades beta intermedias para la enzima de diol/glicerol deshidratasa. La Tabla 13 es presentada con el presente electrónicamente y es incorporada aquí para referencia. La Tabla 14 es una tabla del Perfil de HMM de subunidades gamma pequeñas para la enzima de diol/glicerol deshidratasa. La Tabla 14 es presentada con el presente electrónicamente y es incorporada aquí para referencia. Las siguientes secuencias están de acuerdo con 37 C.F.R. 1.821-1.825 ("Requerimientos para las Solicitudes de Patente que Contienen Secuencias de Nucleótidos y/o Descripciones de Secuencias de Aminoácidos - las Reglas de la Secuencia") y son consistentes con el estándar ST.25 de la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (OMPI) (1998) y los requerimientos del listado de las secuencias de la EPO y del PCT (Reglas 5.2 y 49.5 (a-bis) , y la Sección 208 y el Anexo C de las Instrucciones Administrativas) . Los símbolos y el formato utilizado para la secuencia de nucleótidos y aminoácidos cumplen con las reglas descritas en 37 C.F.R. § 1.822. Tabla 1 Breve descripción de los números de SEC ID de los ácidos nucleicos y proteínas Descripción SEC ID del ácido SEC ID de la nucleico proteína budA, acetolactato descarboxilasa de Klebsiella 1 2 pneumoniae ATCC 25955 alsD, acetolactato descarboxilasa de Bacillus subtilis 80 81 BudA, acetolactato descarboxilasa de Klebsiella terrigena 82 83 budB, acetolactato sintasa de Klebsiella pneumoniae 3 4 ATCC 25955 alsS, acetolactato sintasa de Bacillus subtilis 76 77 budB, acetolactato sintasa de Klebsiella terrigena 78 79 BudC, butandiol deshidrogenasa de Klebsiella 5 6 pneumoniae IAM1063 butandiol deshidrogenasa de Bacillus cereus 84 85 butandiol deshidrogenasa de bacillus cereus 86 87 butB, butandiol deshidrogenasa de Lactococcus lactis 88 89 pddA, butandiol deshidratasa, subunidad alfa de 7 8 Klebsiella oxytoca ATCC 8724 pddB, unidad beta de la butandiol deshidratasa de 9 10 Klebsiella oxytoca ATCC 8724 pddC, subunidad gamma de la butandiol deshidratasa de 1 1 12 Klebsiella oxytoca ATCC 8724 Descripción SEC ID del ácido SEC ID de la nucleico proteína pduC, subunidad grande de la diol deshidratasa 92 93 dependiente de B 12 de Salmonella typhimurium pduD, subunidad intermedia de la diol deshidratasa 94 95 dependiente de B 12 de Salmonella typhimurium pduE, subunidad pequeña de la diol deshidratasa 96 97 dependiente de B 12 de la Salmonella typhimurium pduC, subunidad grande de la diol deshidratasa 98 99 dependiente de B 12 de Lactobaccillus collinoides pduD, subunidad intermedia de la diol deshidratasa 100 101 dependiente de B 12 del Lactobaccillus collinoides pduE, subunidad pequeña de la diol deshidratasa 102 103 dependiente de B 12 de Lactobaccillus collinoides pddC, subunidad alfa de la diol deshidratasa dependiente 104 105 de adenosilcobalamina de Kliebsiella pneumoniae pddD, subunidad beta de la diol deshidratasa dependiente 106 107 de adenosilcobalamina de Klebsiella pneumoniae pddD, subunidad gamma de la diol deshidratasa 108 109 dependiente de adenosilcobalamina de Kliebsiella pneumoniae ddrA, subunidad grande del factor de reactivación de la 1 10 1 1 1 diol deshidratasa de Kliebsiella oxytoca ddrB, subunidad pequeña del factor de reactivación de la 1 12 1 13 diol deshidratasa de Kliebsiella oxytoca pduG, subunidad grande del factor de reactivación de la 1 14 1 15 diol deshidratasa de Salmonella typhimurium pduH, subunidad pequeña del factor de reactivación de la 1 16 1 17 diol deshidratasa de Salmonella typhimurium Descripción SEC ID del ácido SEC ID de la nucleico proteína pduG, subunidad grande del factor de reactivación de la 1 18 1 19 diol deshidratasa de Lactobaccillus collinoides pduH, subunidad pequeña del factor de reactivación de la 120 121 diol deshidratasa de Lactobaccillus collinoides sadH, butanol deshidrogenasa de Rhodococcus ruber 219 13 14 adhA, butanol deshidrogenasa de Pyrococcus furiosus 90 91 chnA, ciclohexanol deshidrogenasa de Acinteobacter sp. 71 72 yqhD, butanol deshidrogenasa de Escherichia coli 74 75 amina: piruvato transaminasa de Vibrio fluvialis (una 144 codón opc. 122 acetoína aminasa) aminobutanol cinasa de Erwinia carotovora subesp. 123 124 atroseptica Amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia carotovora 125 126 subesp. atroseptica budC, acetoína reductasa (butandiol deshidrogenasa) de 133 134 Klebsiella terrigena (ahora Raoullella terrigena) Subunidad alfa de la glicerol deshidratasa de Klebsiella 145 146 pneumoniae Subunidad beta de la glicerol deshidratasa de Klebsiella 147 148 pneumoniae Subunidad gamma de la glicerol deshidratasa de 149 150 Klebsiella pneumoniae Subunidad grande de la glicerol deshidratasa reactivasa 151 152 de Klebsiella pneumoniae Subunidad pequeña de la glicerol deshidratasa reactivasa 153 154 de Klebsiella pneumoniae SEC ID NOs: 15-65 son las secuencias de nucleótidos de los cebadores de clonación, selección, y secuenciación, de la PCR del oligonucleótido, utilizados en los ejemplos. SEC ID NO: 66 es la secuencia de nucleótidos de la región delecionada del gel yqhD en la cepa MG1655 AyqhCD de E. coli, descrito en el ejemplo 11. La SEC ID NO: 67 es la secuencia de nucleótidos de una variante del promotor de glucosa isomerasa 1.6GI . SEC ID NO: 68 es la secuencia de nucleótidos del promotor 1.5GI. La SEC ID NO: 69 es la secuencia de nucleótidos del operón de la diol deshidratasa de Klebsiella oxytoca . La SEC ID NO: 70 es la secuencia de nucleótidos del operón del factor de reactivación de la diol deshidratasa de Klebsiella oxytoca. La SEC ID NO: 73 es la secuencia de nucleótidos de pDCQ2, que es descrita en el ejemplo 9. Las SEC ID NOs: 127-132 son las secuencias de nucleótidos de los cebadores de clonación y de PCR de oligonucleótidos , adicionales, utilizados en los ejemplos. La SEC ID NO: 155 es una región de codificación optimizada para la amino alcohol cinasa de Erwinia carotovora subesp. atroseptica. La SEC ID NO: 156 es una región de codificación optimizada por el codón para la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia carotovora subesp. atroseptica. Las SEC ID NOs: 157-163 son las secuencias de nucleótidos de los cebadores de clonación y de PCR de oligonucleótidos , adicionales, utilizados en los ejemplos. La SEC ID NO: 275 es la secuencia de nucleótidos de un operón de Erwinia carotovora subesp. atroseptica. Tabla 2 Subunidades grande, intermedia y pequeña de la glicerol y diol deshidratasa, adicionales "Descripción bsubunidad SEC ID de la proteína Subunidades correspondientes del mismo organismo0 Subunidad alfa de la glicerol deshidratasa de Clostridium L 135 pasteurianum Subunidad beta de la glicerol deshidratasa de Clostridium M 136 pasteurianum Subunidad de gamma de la glicerol deshidratasa de S 137 Clostridium pasteurianum Subunidad alfa de glicerol deshidratasa de Escherichia L 138 blattae Subunidad beta de glicerol deshidratasa de Escherichia M 139 blattae Subunidad gamma de glicerol deshidratasa de S 140 Escherichia blattae Subunidad alfa de glicerol deshidratasa de Citrobacter L 141 freundii Subunidad beta de glicerol deshidratasa de Citrobacter M 142 freundii Subunidad gamma de glicerol deshidratasa de S 143 Citrobacter freundii aDescripción bSubunidad SEC ID de la proteína Subunidad alfa de la diol deshidratasa de Lactobacillus L 164 brevis Subunidad beta de la diol deshidratasa de Lactobacillus M 165 brevis Subunidad gamma de la diol deshidratasa de S 166 Lactobacillus brevis Subunidad alfa de la diol deshidratasa de Salmonella L 167 entérica subespecie entérica serovarCholeraesuis cepa SC-B67 Subunidad beta de la diol deshidratasa de Salmonella M 168 entérica subespecie entérica serovarCholeraesuis cepa. SC-B67 Subunidad gamma de la diol deshidratasa de Salmonella S 169 entérica subespecie entérica serovarCholeraesuis cepa SC-B67 subunidad grande, de la Propandiol deshidratasa de L 170 Escherichia coli E24377A Subunidad intermedia de la diol/glicerol deshidratasa de M 171 Escherichia coli A24377A subunidad pequeña de la Propandiol deshidratasa de S 172 Escherichia co /¡ E24377A Subunidad grande de la diol deshidratasa de Shigella L 173 sonnei Ss046 Subunidad intermedia de la diol deshidratasa de Shigella M 174 sonnei Ss046 Subunidad pequeña de la diol deshidratasa de Shigella S 175 sonnei Ss046 Subunidad grande de la propandiol deshidratasa de L 176 Yersinia bercovieri ATCC 43970 Proteína hipotética YberA O 1000484 de Yersinia M 177 bercovieri ATCC 43970 Subunidad pequeña de la propandiol deshidratasa de S 178 Yersinia bercovieri ATCC 43970 "Descripción bSubunidad SEC ID de la proteína Subunidad grande de la propandiol deshidratasa de L 179 Yersinia Mollaretii ATCC 43969 Proteína hipotética YmolA_01001292 de Yersinia M 180 mollaretii ATCC43969 Subunidad pequeña de propandiol deshidratasa de S 181 Yersinia mollaretii ATCC 43969 Subunidad grande de la diol deshidratasa de Yersinia L 182 enterocolitica subespecie enterocolitica 8081 Subunidad intermedia de diol deshidratasa de Yersinia M 183 enterocolitica subespecie enterocolitica 8081 Subunidad pequeña de la diol deshidratasa de Yersinia S 184 enterocolitica subespecie enterocolitica 8081 Subunidad grande de la propandiol deshidratasa de L 185 Yersinia intermedia ATCC 29909 Subunidad intermedia de la diol/glicerol deshidratasa de M 1 86 Yersinia intermedia ATCC 29909 Subunidad pequeña de la propandiol deshidratasa de S 187 Yersinia intermedia ATCC 29909 Subunidad grande de la glicerol deshidratasa de Listeria L 188 welshimeri serovar 6b cepa SLCC5334 Utilización de propandiol, subunidad intermedia de la M 1 89 deshidratasa que de Listeria welshimeri serovar 6b cepa SLCC5334 Utilización de propandiol, subunidad pequeña de S 190 deshidratasa de Listeria welshimeri serovar 6b cepa SLCC5334 Pro teína hipotética lin 1 1 17 de Listeria innocua L 191 Clip 1 1262 Proteína hipotética linl 1 18 de Listeria innocua M 192 Clip 1 1262 Proteína hipotética linl 1 19 de Listeria innocua S 193 Clip 1 1262 Proteína hipotética Imol 153 de Listeria monocytogenes L 194 EGD-e "Descripción bSubunidad SEC ID de la proteína Proteína hipotética Imo 1 154 de Listeria monocytogenes M 195 EGD-e Proteína hipotética Imol 155 de Listeria monocytogenes S 196 EGD-e Subunidad grande de la glicerol deshidratasa de L 197 Salmonella entérica subespecie entérica serovar Typhi cepa CT 18 Subunidad intermedia de diol deshidratasa de Salmonella M 198 entérica subespecie entérica serovar Typhi cepa. CT 18 Subunidad pequeña de diol deshidratasa de Salmonella S 199 entérica subespecie entérica serovar Typhi cepa CT18 Subunidad grande de la glicerol deshidratasa supuesta L 200 [de Escherichia coli] Subunidad intermedia de la diol deshidratasa supuesta de M 201 Escherichia coli Subunidad pequeña de la diol deshidratasa supuesta de S 202 Escherichia coli Subunidad grande de la glicerol deshidratasa de Listeria L 203 monocytogenes cepa 4b F2365 Utilización de propandiol, deshidratasa, subunidad M 204 intermedia de Listeria monocytogenes cepa 4b F2365 Utilización de propandiol, deshidratasa, subunidad S 205 pequeña de Listeria monocytogenes cepa 4b F2365 Subunidad grande pduC de la glicerol deshidratasa, L 206 supuesta, de Streptococcus sanguinis SK36 Utilización de propandiol, subunidad intermedia de M 207 deshidratasa, supuesta de Streptococcus sanguinis SK36 Subunidad pequeña de la diol deshidratasa, dependiente S 208 de B 12, supuesta, de Streptococcus sanguinis SK36 DhaB de Escherichia blattae L 209 DhaC de Escherichia blattae M 210 DhaE de Escherichia blattae S 21 1 aDescripción "Subunidad SEC ID de la proteína Subunidad grande de la glicerol deshidrogenasa L 212 dependiente de la coenzima B 12 de Clostridium perfringens cepa 13 Subunidad intermedia de la glicerol deshidrogenasa M 213 dependiente de la coenzima B 12 de Clostridium perfringens cepa 13 Subunidad pequeña de la glicerol deshidrogenasa S 214 dependiente de la coenzima B 12 de Clostridium perfringens cepa 13 Subunidad grande de propandiol deshidratasa de L 215 Yersinia frederiksenii ATCC 33641 Proteína hipotética YfreA O 1000478 de Yersinia M 216 frederiksenii ATCC 33641] Propandiol deshidratasa, subunidad pequeña de Yersinia S 217 frederiksenii ATCC 33641 Glicerol deshidratasa de Thermoanaerobacter L 218 ethanolicus X514 Subunidad intermedia de deshidratasa de M 219 Thermoanaerobacter ethanolicus X514 Subunidad pequeña de deshidratasa de S 220 Thermoanaerobacter ethanolicus X514 Subunidad GldC grande de la glicerol deshidratasa de L 221 Lactobacillus hilgardii Subunidad GldD intermedia de la glicerol deshidratasa M 222 de Lactobacillus hilgardii Subunidad GldE pequeña de la glicerol deshidratasa de S 223 Lactobacillus hilgardii Glicerol deshidratasa de Lactobacillus reuteri JMC 1 1 12 L 224 Semejante a la subunidad gamma de la diol deshidratasa M 225 de Lactobacillus reuteri JMC 1 1 12 Utilización de propandiol: subunidad pequeña de S 226 deshidratasa de Lactobacillus reuteri JMC 1 1 12 Subunidad grande GldC de la glicerol deshidratasa de L 227 Lactobacillus diolivorans aDescripción "Subunidad SEC ID de la proteína Subunidad intermedia GldD de la glicerol deshidratasa M 228 de Lactobacillus diolivorans Subunidad pequeña GldE de la glicerol deshidratasa de S 229 Lactobacillus diolivorans Subunidad grande de la propandiol deshidratasa de L 230 Lactobacillus reuteri Subunidad intermedia de la propandiol deshidratasa de M 231 Lactobacillus reuteri Subunidad pequeña de la propandiol deshidratasa de S 232 Lactobacillus reuteri Subunidad grande de la glicerol deshidratasa de L+M 233 Mesorhizobium loti MAFF303099 Subunidad pequeña de la glicerol deshidratasa de S 234 Mesorhizobium loti MAFF303099 Glicerol deshidratasa de Mycobacterium vanbaalenii L+M 235 PYR-1 Utilización de propandiol: subunidad pequeña de S 236 deshidratasa a partir de Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 Glicerol deshidratasa de Mycobacterium esp. MCS L+M 237 Subunidad pequeña de deshidratasa de Mycobacterium S 238 esp. MCS Subunidad grande de deshidratasa: subunidad intermedia L+M 239 de deshidratasa de Mycobacterium flavescens PYR-GCK Utilización de propandiol: deshidratasa, subunidad S 240 pequeña de Mycobacterium flavescens PYR-GCK Glicerol deshidratasa de Mycobacterium sp. JLS L+M 241 Subunidad pequeña de deshidratasa de Mycobacterium S 242 esp. JLS Subunidad grande de la glicerol deshidratasa de L 243 Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 Subunidad intermedia de deshidratasa de Mycobacterium M 244 smegmatis cepa MC2 155 aDescripción bSubunidad SEC ID de la proteína Subunidad gamma de la diol deshidratasa de S 245 Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 Subunidades adicionales Subunidad grande de la glicerol deshidratasa de L+M 246 Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 Subunidad grande de la glicerol deshidratasa de L+M 247 Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 Subunidad pequeña de la glicerol deshidrogenasa S 248 dependiente de la coenzima B 12 de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 Subunidad pequeña de la glicerol deshidrogenasa S 249 dependiente de la coenzima B 12 de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 Subunidad intermedia de la diol deshidratasa de M 250 Salmonella entérica subespecie entérica serovar Parathypi A cepa ATCC 9150 Subunidad pequeña de la diol deshidratasa de S 251 Salmonella entérica subespecie entérica serovar Parathypi A cepa ATCC 9150 Glicerol deshidratasa, subunidad beta de Clostridium M 252 perfringens SM 101 Glicerol deshidratasa, subunidad gamma de Clostridium S 253 perfringens SM101 PduC de Salmonella entérica subespecie entérica L 254 serovarTtyph im urium Subunidad grande de la glicerol deshidratasa de Listeria L 255 monocytogenes cepa 4b H7858 DhaB de Escherichia blattae L 256 DhaB de bacteria no cultivada L 257 DhaB de bacteria no cultivada L 258 Subunidad grande GldC de glicerol deshidratasa de L 259 Lactobacillus collinoides aDescripción bSubunidad SEC ID de la proteína PduD de bacteria no cultivada M 260 PduD de bacteria no cultivada M 261 DhaC de bacteria no cultivada M 262 DhaC de bacteria no cultivada M 263 DhaC de bacteria no cultivada M 264 Glicerol deshidratasa dependiente de la coenzima B 12, M 265 subunidad intermedia, de Clostridium perfringens ATCC 13124 Desconocida M 266 Subunidad beta de glicerol deshidratasa de Escherichia M 267 blattae PduE de bacteria no cultivada S 268 PduE de bacteria no cultivada S 269 Deshidratasa, subunidad pequeña de Listeria S 270 monocytogenes cepa l/2a F6854 DhaE de bacteria no cultivada s 271 DhaE de bacteria no cultivada s 272 DhaE de bacteria no cultivada s 273 Subunidad pequeña de la deshidratasa de Listeria s 274 monocytogenes FSL N 1 -017 aDescripción : de la anotación del Genbank de la secuencia y no puede ser corregida incluyendo la designación del glicerol o del diol, o no puede incluir la información de la subunidad. bSubunidad: identificada por la homología de la secuencia con respecto a la subunidad grande, media o pequeña de la enzima Kliebsiella oxytoca . cLas subunidades son listadas conjuntamente que son del mismo organismo y tienen anotaciones como la misma enzima, o tienen los números de Genbank cercanos estrechamente indicando la proximidad en el genoma . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los métodos para la producción de 2-butanol utilizando microorganismos recombinantes . La presente invención satisface un número de necesidades comerciales e industriales. El butanol es una substancia química básica industrial importante, con una variedad de aplicaciones, en donde su potencial como un combustible o como un aditivo para combustible es particularmente significativo. Aunque es solamente un alcohol de cuatro carbonos, el butanol tiene un contenido de energía semejante a aquel de la gasolina y puede ser mezclado con cualquier combustible fósil. El butanol es favorecido como un combustible o aditivo para combustible que solamente produce CO2 y poco o nada de SOx o NOx cuando es quemado en un motor de combustión interna estándar. Adicionalmente , el butanol es menos corrosivo que el etanol, el aditivo para combustible más preferido hasta la fecha. Además de su utilidad como un biocombustible o un aditivo para combustible, el butanol tiene el potencial de tener un impacto sobre los problemas de distribución de hidrógeno en la industria de las celdas de combustible que está en crecimiento. Las celdas de combustible todavía están afectadas por asuntos de seguridad asociados con el transporte y distribución de hidrógeno. El butanol puede ser reformado fácilmente por su contenido de hidrógeno y puede ser distribuido a través de las estaciones de gas existentes con la pureza requerida para ya sea las celdas de combustible o los motores de combustión en los vehículos. Finalmente, la presente invención produce 2-butanol a partir de fuentes de carbono derivadas de las plantas, evitando el impacto negativo sobre el medio ambiente asociado con los procesos petroquímicos estándares para la producción de butanol. La presente invención también proporciona microorganismos recombinantes y métodos para la producción de 2-butanona, un compuesto intermedio en las rutas biosintéticas de 2-butanol descritas aquí. La 2-butanona, también conocida como metil etil cetona (MEK) , es útil como un solvente en las pinturas y otros recubrimientos. La misma también es utilizada en la industria del caucho sintético y en la producción de cera de parafina. Las siguientes definiciones y abreviaturas son para que sean utilizadas para la interpretación de las reivindicaciones y especificación. El término "invención" o "presente invención" como se utilizan aquí, es un término no limitante y no está propuesto para referirse a ninguna modalidad única de la invención particular sino que abarca todas las modalidades posibles como se describen en la especificación y las reivindicaciones. El término "ruta biosintética para el 2-butanol" se refiere a las rutas de la enzima para producir el 2-butanol a partir del piruvato. El término "ruta biosintética para la 2-butanona" se refiere a las rutas de la enzima para producir la 2-butanona a partir del piruvato. El término "acetolactato sintasa", también conocido como "acetohidroxi ácido sintasa", se refiere a un polipéptido (o polipéptidos ) que tiene una actividad de la enzima que cataliza la conversión de dos moléculas de ácido pirúvico hasta una molécula de alfa-acetolactato . La acetatolactato sintasa, conocida como EC 2.2.1.6 [anteriormente 4.1.3.18] (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego) puede ser dependiente del cofactor de pirofosfato de tiamina para su actividad. Las enzimas de acetolactato sintasa adecuadas están disponibles de un número de fuentes, por ejemplo, Bacillus subtilis [GenBank Nos: AAA22222 NCBI (National Center for Biotechnology Information) secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 77), la secuencia de nucleótidos de L04470 NCBI (SEC ID NO: 76)], Klebsiella terrigena [GenBank Nos: AAA25055 (SEC ID NO:79), L04507 (SEC ID NO: 78)], y Klebsiella pneumoniae GenBank Nos: AAA25079 (SEC ID NO: 4), 73842 (SEC ID NO: 3)]. El término "acetolactato descarboxilasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos ) que tienen actividad de la enzima, que catalizan la conversión de alfa-acetolactato a la acetoina. Las acetolactatos descarboxilasas son conocidas como EC 4.1.1.5 y están disponibles, por ejemplo de Bacillus subtilis [GenBank Nos: AAA22223 (SEC ID NO: 81), L04470 (SEC ID NO: 80)], Kliebsiella terrigena (GenBank Nos: AAA25054 (SEC ID NO: 83), L04507 (SEC ID NO: 82)] y Klebsiella pneumoniae [GenBank Nos: AAU43774 (SEC ID NO: 2), AY722056 (SEC ID NO: 1) ] · El término "acetoina aminasa" o "acetoina transaminasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tienen una actividad de la enzima que cataliza la conversión de acetoina a 3-amino-2-butanol . La acetoina aminasa puede utilizar el cofactor de 5' -fosfato de piridoxal o NADH (dinucleót ido de nicotinamida adenina reducida) o NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducida) . El producto resultante puede tener la estereoquímica (R) o (S) en la posición 3. La enzima dependiente del fosfato de piridoxal puede utilizar un aminoácido tal como la alanina o glutamato como el donante de amino. Las enzimas dependientes de NADH y de NADPH pueden utilizar el amoniaco como un segundo substrato. Un ejemplo adecuado de una acetoina aminasa dependiente de NADH, también conocida como la amino alcohol deshidrogenasa , se describe por Ito et al. (patente U.S. No. 6,432,688) . Un ejemplo de una acetoina aminasa dependiente del piridoxal es la amina : piruvato aminotransferasa (también llamada amina : piruvato transaminasa ) descrita por Shin y Kim (J. Org. Chem. 67:2848-2853 (2002)) . El término "butanol deshidrogenasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos ) que tiene una actividad de la enzima que cataliza la interconversión de 2-butanona y 2-butanol. Las butanol deshidrogenasas son un subconjunto de una familia amplia de alcohol deshidrogenasas. La butanol deshidrogenasa puede ser dependiente de NAD o NADP. Las enzimas dependientes de NAD son conocidas como EC 1.1.1.1 y están disponibles por ejemplo, de Rhodococcus ruber [GenBank Nos: CAD36475 (SEC ID NO: 14), AJA91307 (SEC ID NO: 13) ] . Las enzimas dependientes de NADP son conocidas como EC 1.1.1.2 y están disponibles, por ejemplo, de Pyrococcus furiosus [GenBank Nos: AAC25556 (SEC ID NO: 91), AF013169 (SEC ID NO: 90)] . Adicionalmente , una butanol deshidrogenasa está disponible de Escherichia coli [GenBank Nos: NP_417484 (SEC ID NO: 75), NC_000913 (SEC ID NO:74)] y una ciclohexanol deshidrogenasa está disponible de Acinetobacter sp. [GenBank Nos: AAG10026 (SEC ID NO: 72), AF282240 (SEC ID NO: 71) ] . El término "acetoina cinasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tienen una actividad de la enzima que cataliza la conversión de acetoina a fosfoacetoina . La acetoina cinasa puede utilizar la ATP (trifosfato de adenosina) o el fosfoenolpiruvato como el donante de fosfato en la reacción. Aunque no existen reportes de enzimas que catalicen esta reacción sobre la acetoina, existen enzimas que catalizan la reacción análoga sobre el substrato de dihidroxiacetona semejante, por ejemplo, las enzimas conocidas como EC 2.7.1.29 (Garcia-Alles et al. (2004) Biochemistry 43: 13037-13046) . El término "acetoina fosfato aminasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos ) que tienen una actividad de enzima que cataliza la conversión de fosfoacetoina hasta el 0-fosfato de 3-amino-2-butanol . La acetoina fosfato aminasa puede utilizar el cofactor de 5' -fosfato de piridoxal, NADH o NADPH. El producto resultante puede tener la estereoquímica (R) o (S) en la posición 3. La enzima dependiente del fosfato de piridoxal puede utilizar un aminoácido tal como la alanina o glutamato. Las enzimas dependientes de NADH y de NADPH pueden utilizar el amoníaco como un segundo substrato. Aunque no existen reportes de enzimas que catalizan esta reacción sobre la fosfoacetoina, existe una enzima dependiente del fosfato de piridoxal que está propuesta para llevar a cabo una reacción análoga sobre el substrato de fosfato de serinol semejante (Yasuta et al. (2001) Appl . Environ. Microbiol . 67: 4999-5009) . El término "aminobutanol fosfato fosfo-liasa" también llamada "amino alcohol O-fosfato liasa", se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tienen una actividad de la enzima que cataliza la conversión del O-fosfato de 3-amino-2-butanol a 2-butanona. La aminobutanol fosfato fosfo-liasa puede utilizar el cofactor de 5' -fosfato de piridoxal. No existen reportes previos de enzimas que catalicen esta reacción sobre el fosfato de aminobutanol, aunque existen reportes de enzimas que catalizan la reacción de manera análoga sobre el substrato de fosfato de l-amino-2-propanol semejante (Jones et al. (1973) Biochem J. 134:167-182) . La presente invención describe una aminobutanol fosfato fosfo-liasa identificada recientemente (SEC ID NO: 126) del organismo de Erwinia carotovora , con la actividad demostrada en el ejemplo 15 de la presente. El término "aminobutanol cinasa" se refiere a un polipéptido (o polipépt idos ) que tiene una actividad de la enzima que cataliza la conversión del 3-amino-2-butanol al 0-fosfato de 3-amino-2-butanol . La aminobutanol cinasa puede utilizar el ATP como el donante de fosfato. Aunque no existen reportes de enzimas que catalicen esta reacción sobre el 3-amino-2-butanol , existen reportes de enzimas que catalizan la reacción análoga sobre los substratos semejantes de etanolamina y l-amino-2-propanol (Jones et al., supra) . La presente invención describe, en el ejemplo 14, un amino alcohol cinasa de Erwinia carotovora subespecie atroseptica (SEC ID NO: 124) . El término "butandiol deshidrogenasa" también conocida como "acetoina reductasa" se refiere a un polipéptido (o polipépt idos ) que tienen una actividad de enzima que cataliza la conversión de acetoina a 2 , 3-butandiol . Las butandiol deshidrogenasas son un subconjunto de la amplia familia de las alcohol deshidrogenasas. Las enzimas de butandiol deshidrogenasa pueden tener una especificidad para la producción de la estereoquímica (R) o (S) en el producto de alcohol. Las butandiol deshidrogenasas específicas para (S) son conocidas como EC 1.1.1.76 y están disponibles, por ejemplo, de Klebsiella pneumoniae (GenBank Nos: BBA13085 (SEC ID NO: 6, D86412 (SEC ID NO: 5)) . Las butandiol deshidrogenasas específicas para (R) son conocidas como EC 1.1.1.4 y están disponibles, por ejemplo, de Bacillus cereus [GenBank Nos: NP_830481 (SEC ID NO: 85), NC_004722 (SEC ID NO: 84); AAP07682 (SEC ID NO: 87), AE017000 (SEC ID NO: 86)], y Lactococcus lactis [GenBank Nos. AAK04995 (SEC ID NO: 89), AE006323 (SEC ID NO: 88)] . El término "butandiol deshidrogenasa", también conocido como "diol deshidrogenasa" o "propandiol deshidratasa" se refiere a un polipéptido (o polipépt idos ) que tienen una actividad de enzima que cataliza la conversión de 2 , 3-butandiol a la 2-butanona. La butandiol deshidratasa puede utilizar el cofactor de adenosil cobalamina (vitamina B12) . Las enzimas dependientes de la adenosil cobalamina son conocidas como EC 4.2.1.28 y están disponibles, por ejemplo, de Klebsiella oxytoca [GenBank Nos: BAA08099 (subunidad alfa) (SEC ID NO: 8), D45071 (SEC ID NO: 7), BAA08100 (Subunidad beta) (SEC ID NO: 10), D45071 (SEC ID NO: 9); y BBA08101 (subunidad gamma) (SEC ID NO: 12), D45071 (SEC ID NO: 11) (nótese que la totalidad de las tres subunidades son requeridas para la actividad) ] , y Klebsiella pneumoniae [GenBank Nos: AAC98384 (subunidad alfa) (SEC ID NO: 105), AF102064 (SEC ID NO: 104); GenBank Nos: AAC98385 (subunidad beta (SEC ID NO: 107), AF102064 (SEC ID NO: 106), GenBank Nos: AAC98386 (subunidad gamma) (SEC ID NO: 109), AF102064 (SEC ID NO: 108)] . Otras diol deshidratasas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, las diol deshidratasas dependientes de B12 disponibles de Salmonella typhimurium [GenBank Nos: AAB84102 (subunidad grande) (SEC ID NO: 93), AF026270 (SEC ID NO: 92) ; GenBank Nos: AAB84103 (subunidad intermedia) (SEC ID NO: 95), AF026270 (SEC ID NO: 94) ; GenBank Nos: AAB84104 (subunidad pequeña) (SEC ID NO: 97), AF026270 (SEC ID NO: 96)]; y Lactobacillus collinoides [GenBank Nos: CAC82541 (subunidad grande) (SEC ID NO: 99), AJ297723 (SEC ID NO: 98) ; GenBank Nos: CAC82542 (subunidad intermedia) (SEC ID NO: 101) ; AJ297723 (SEC ID NO: 100) ; GenBank Nos: CAD01091 (subunidad pequeña) (SEC ID NO: 103), AJ297723 (SEC ID NO: 102) ]; y las enzimas de Lactobacillis brevis (particularmente las cepas CNRZ 734 y CNRZ 735, Speranza et al., supra), y las secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas correspondientes. Los métodos de aislamiento del gen de la diol deshidratasa son bien conocidos en el arte (por ejemplo, patente U.S. No. 5,686,276) . Las diol deshidratasas adicionales son listadas en la Tabla 2. El término "glicerol deshidratasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos ) que tienen una actividad de la enzima que cataliza la conversión de glicerol al 3-hidroxipropionaldehido . Las glicerol deshidratasas dependientes de la adenosil cobalamina son conocidas como EC 4.2.1.30. Las glicerol deshidratasas de EC 4.2.1.30 son semejantes a las diol desihidratasas en la secuencia y en que tienen tres subunidades. Las glicerol deshidratasas también pueden ser utilizadas para convertir la 2 , 3-butandiol a la 2-butanona. Algunos ejemplos de glicerol deshidratasas de EC 4.2.1.30 incluyen aquellos de Klebsiella pneumoniae (subunidad alfa, SEC ID NO: 145, región de codificación y SEC ID NO: 146, proteína; subunidad beta, SEC ID NO: 147, región de codificación y SEC ID NO: 148, proteína, y la subunidad gamma SEC ID NO: 149, región de codificación y SEC ID NO: 150, proteína) ; de Clostridium pasteurianum [GenBank Nos: 3360389 (subunidad alfa, SEC ID NO: 135), 3360390 (subunidad beta, SEC ID NO: 136), y 3360391 (subunidad gamma, SEC ID NO: 137)]; de Escherichia blattae [GenBank Nos: 60099613 (subunidad alfa, SEC ID NO: 138), 57340191 (subunidad beta, SEC ID NO: 139), y 57340192 (subunidad gamma, SEC ID NO: 140)]; y de Citrobacter freundii [GenBank Nos: 1169287 (subunidad alfa, SEC ID NO: 141), 1229154 (subunidad beta, SEC ID NO: 142), y 1229155 (subunidad gamma, SEC ID NO: 143) ] . Nótese que la totalidad de las tres subunidades son requeridas para la actividad. Las glicerol deshidratasas adicionales son listadas en la tabla 2. Las diol y glicerol deshidratasas pueden padecer la inactivación suicida durante la catálisis. Una proteina del factor de reactivación, también referida aquí como "reactivasa", puede ser utilizada para reactivar las enzimas inactivas (Mori et al., J. Biol. Chem . 272:32034 (1997) ) . Preferentemente, el factor de reactivación es obtenido de la misma fuente que la diol o glicerol deshidratasa utilizada. Por ejemplo, los factores de la reactivación de la diol deshidratasa adecuados están disponibles de Klebsiella oxytoca [GenBank Nos: AAC15871 (subunidad grande) (SEC ID NO: 111), AF017781 (SEC ID NO: 110) ; GenBank Nos: AAC15872 (subunidad pequeña) (SEC ID NO: 113), AF017781 (SEC ID NO: "112) ]; Salmonella typhimurium [GenBank Nos: AAB84105 (subunidad grande) (SEC ID NO: 115), AF026270 (SEC ID NO: 114) , GenBank Nos: AAD39008 (subunidad pequeña) (SEC ID NO: 117) ; AF026270 (SEC ID NO: 116)]; y Lactobacillus collinoides [GenBank Nos: CAD01092 (subunidad grande) (SEC ID NO: 119), AJ297723 (SEC ID NO: 118); GenBank Nos: CAD01093 (subunidad pequeña) (SEC ID NO: 121), AJ297723 (SEC ID NO: 120)] . Las subunidades tanto pequeñas como grandes son requeridas para la actividad. Por ejemplo, los factores de reactivación de la glicerol deshidratasa adecuados están disponibles de Klebsiella pneumoniae (subunidad grande, SEC ID NO: 151, región de codificación y SEC ID NO: 152, proteína; y la subunidad pequeña, SEC ID NO: 153, región de codificación y SEC ID NO: 154 , proteína) . El término "un anaerobio facultativo" se refiere a un microorganismo que puede crecer en los medio ambientes tanto aeróbico como anaeróbico. El término "substrato de carbón" o "substrato de carbón fermentable" se refiere a una fuente de carbón capaz de ser metabolizada por los organismos hospederos de la presente invención y particularmente las fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste de monosacáridos , oligosacáridos , polisacáridos , y substratos de un carbón o mezclas de los mismos. El término "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que es capaz de ser expresado como una proteína específica, incluyendo opcionalmente las secuencias reguladoras precedentes (las secuencias no codificantes 5') y siguientes (secuencias no codificantes 3') de la secuencia de codificación. El "gen natural" se refiere a un gen como es encontrado en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. El "gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen natural, que comprende las secuencias reguladoras y de codificación que no son encontradas conjuntamente en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender las secuencias reguladoras y las secuencias de codificación que son derivadas de diferentes fuentes, o las secuencias reguladoras y las secuencias de codificación derivadas de la misma fuente, pero arregladas de manera diferente que la encontrada en la naturaleza. "Gen endógeno" se refiere a un gen natural en su localización natural en el genoma de un organismo. Un gen "extraño" o "heterólogo" se refiere a un gen no encontrado normalmente en el organismo hospedero, pero que es introducido en el organismo hospedero por transferencia genética. Los genes extraños pueden comprender genes naturales insertados en un organismo- no natural, o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que ha sido introducido en el genoma por un procedimiento de transformación. Cuando se utilice aquí, un "fragmento de ácido nucleico aislado" o "molécula de ácido nucleico aislado" o "construcción genética" serán utilizados intercambiablemente, y significarán un polímero de ARN o de ADN que es de una sola hebra o de doble hebra, que contiene opcionalmente bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento del ácido nucleico aislado en la forma de un polímero de ADN puede estar comprendido de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético. Un fragmento de ácido nucleico es "hibridi zable" a otro fragmento de ácido nucleico, tal como una molécula de ADNc, ADN genómico o de ARN, cuando una forma de una sola hebra del fragmento de ácido nucleico puede ser recocida a otro fragmento de ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y concentración iónica de la solución. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y e emplificadas en Sambrook, J. , Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente el capitulo 11 de la tabla 11.1 en el mismo (incorporado completamente aquí para referencia) . Las condiciones de temperatura y de concentración iónica determinan las "características estrictas" de la hibridación. Las condiciones estrictas pueden ser ajustadas para seleccionar los fragmentos moderadamente semejantes (tales como las secuencias homologas de los organismos relacionados distantemente), hasta los fragmentos altamente semejantes (tales como los genes que duplican las enzimas funcionales de los organismos estrechamente relacionados) . Los lavados poshibridación determinan las condiciones estrictas. Un conjunto de condiciones preferidas utilizan una serie de lavados empezando con 6X SSC, 0.5 % de SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego se repite con 2X SSC, 0.5 % de SDS a 45 °C durante 30 minutos, y luego se repite dos veces con 0.2 X SSC, 0.5 % de SDS a 50 °C durante 30 minutos. Un conjunto más preferido de condiciones estrictas utiliza las temperaturas más elevadas en las cuales los lavados son idénticos a aquellos mencionados anteriormente excepto que la temperatura de los dos lavados de 30 minutos finales en 0.2X SSC, 0.5 % de SDS se incrementó a 60 °C. Otro conjunto preferido de condiciones altamente estrictas utiliza dos lavados finales en 0.1 X SCS, 0.1 % de SDS a 65 °C. Un conjunto adicional de condiciones estrictas incluyen la hibridación a 0. IX SSC, 0.1 % de SDS, 65 °C y lavados con 2X SSC, 0.1 % SDS seguido por 0.1 X SSC, 0.1 % de SDS, por ejemplo. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de las características estrictas de la hibridación, son posibles desigualdades entre las bases. Las características estrictas apropiadas para la hibridación de los ácidos nucleicos dependen de la longitud de los ácidos nucleicos y el grado de complemento, variables que son bien conocidas en el arte. Mientras mayor es el grado de semejanza u homología entre dos secuencias de nucleótidos, más grande será el valor de ?p? para los híbridos de los ácidos nucleicos que tienen estas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a una T/n más elevada) de las hibridaciones del ácido nucleico se reduce en el siguiente orden: AR : ARN, AD : ARN , AD : ADN . Para los híbridos mayores que 100 nucleótidos de longitud, se han derivado ecuaciones para calcular Tm (véase Sambrook et al., supra, 9.50-9.51) . Para las hibridaciones con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos , la posición de las desigualdades llega a ser más importante, y la longitud de los oligonucleótidos determina la especificidad (véase Sambrook et al., supra, 11.7-11.8) . En una modalidad, la longitud por un ácido nucleico hibridizable es de al menos aproximadamente 10 nucleótidos. Preferentemente una longitud mínima para un ácido nucleico hibridizable es de al menos aproximadamente 15 nucleótidos; más preferentemente de al menos aproximadamente 20 nucleótidos; y todavía más preferentemente la longitud es de al menos aproximadamente 30 nucleótidos. Además, la persona experta reconocerá que la temperatura y la concentración de la sal de la solución de lavado pueden ser ajustadas cuando sea necesario de acuerdo con factores tales como la longitud de la sonda. Una "porción substancial" de una secuencia de aminoácidos o nucleótidos es aquella porción que comprende una cantidad suficiente en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia de nucleótidos de un gen para identificar supuestamente tal polipéptido o gen, ya sea por evaluación manual de la secuencia por un experto en el arte, o por una comparación de una secuencia automatizada por computadora y la identificación utilizando algoritmos tales como BLAST (Altschul, S. F. , et al., J. Mol. Biol . , 215:403-410 (1993) ) . En general, una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o treinta o más nucleótidos, es necesario para identificar supuestamente un polipéptido o secuencia de ácidos nucleicos como homólogos con respecto a una proteina o gen conocido. Además, con respecto a las secuencias de nucleótidos, las sondas de nucleótidos especificas para el gen que comprenden 20-30 nucleótidos contiguos pueden ser utilizadas en los métodos dependientes de la secuencia de la identificación del gen (por ejemplo, la hibridación de Southern) y el aislamiento (por ejemplo, la hibridación in situ de las colonias bacterianas o placas de bacteriófagos) . Además, los polinucleótidos cortos de 12-15 bases pueden ser utilizados como cebadores de la amplificación de la PCR para obtener un fragmento de aminoácidos particulares que comprende los cebadores. En consecuencia, una "porción substancial" de una secuencia de nucleótidos comprende una cantidad suficiente de la secuencia para identificar y/o aislar específicamente un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. La presente especificación enseña la secuencia de aminoácidos y nucleótidos completa que codifica las proteínas fungosas particulares. La persona experta, que tiene el beneficio de las secuencias como se reportaron aquí, puede utilizar ahora la totalidad o una porción substancial de las secuencias descritas para los propósitos conocidos para aquellos expertos en el arte. En consecuencia, la presente invención comprende las secuencias completas como se reportaron en el listado de secuencias que se anexa, asi como las porciones substanciales de estas secuencias como se definieron anteriormente. El término "complementario" se utiliza para describir la relación entre las bases de nucleótidos que son capaces de hibridizarse con respecto a las otras. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria con respecto a la timina y la citosina es complementaria con respecto a la guanina . Los términos "homología" y "homólogo" son utilizados intercambiablemente aquí. Los mismos se refieren a los fragmentos de ácido nucleico en donde los cambios en una o más bases de nucleótidos no afectan la capacidad del fragmento de ácido nucleico para que tenga un papel de mediación en la expresión del gen o para producir un cierto fenotipo. Estos términos también se refieren a las modificaciones de los fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención tales como la deleción o inserción de uno o más nucleótidos que no alteran substancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante con relación al fragmento no modificado, inicial. Por lo tanto, se entiende como lo apreciarán aquellos expertos en el arte, que la invención abarca más de las secuencias ejemplares específicas. Además, la persona experta reconoce que las secuencias de ácidos nucleicos homologas abarcadas por esta invención también están definidas por su capacidad para hibridizar, bajo condiciones moderadamente estrictas (por ejemplo, 0.5 X SSC, 0.1 % de SDS, 60 °C) con las secuencias ejemplificadas aquí, o con respecto a cualquier porción de las secuencias de nucleótidos descritas aquí y que son equivalentes funcionalmente con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente. La "degeneración del codón" se refiere a la naturaleza en el código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. La persona experta está bien conciente de la "desviación del codón" exhibida por una célula hospedera especifica en el uso de los codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por lo tanto, cuando se sintetiza un gen para la expresión mejorada en una célula hospedera, es deseable diseñar el gen de tal modo que su frecuencia de uso del codón se aproxime a la frecuencia del uso del codón preferida de la célula hospedera. El término "identidad porcentual" como se conoce en el arte, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos , como se determina por la comparación de las secuencias. En el arte, "identidad" también significa el grado de capacidad de relación de las secuencias entre las secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, dependiendo del caso de que trate, como se determina por la correspondencia entre las cadenas de tales secuencias. La "identidad" y "semejanza" pueden ser calculadas fácilmente por los métodos conocidos, incluyendo pero sin estar limitado a aquellos descritos en: 1.) Computacional Molecular Biology (Lesk, A. M. Ed.) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomputing : Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Part 1 (Griffin, A. M., y Griffin, H. G., Eds . ) Humania: NJ (1994) ; 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); y 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J. , Eds.) Stockton: NY (1991) . Los métodos preferidos para determinar la identidad son diseñados para dar la mejor correspondencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y semejanza son codificados en los programas de computadora disponibles públicamente. Las alineaciones de las secuencias y los cálculos de la identidad porcentual pueden ser efectuados utilizando el programa MegAlign™ del sitio de cálculos bioinformáticos LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, I) . La alineación múltiple de las secuencias es efectuada utilizando el "Método de alineación de Clustal" que abarca varias variedades del algoritmo incluyendo el "Método de Alineación Clustal V" que corresponde al método de alineación etiquetado como Clustal V (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D. G. et al., Comput Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) ; y encontrados en el programa MegAlign™ del sitio de cálculos bioinformáticos LASERGENE (DNASTAR Inc.) . Para alineaciones múltiples, los valores de falla corresponden a PENALIDAD POR HUECO = 10 y PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 10. Los parámetros de falla para las alineaciones por pareja y el cálculo de la identidad porcentual de las secuencias de proteínas que utilizan el método Clustal son KTUPLE = 1, PENALIDAD POR HUECO = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5. Para los ácidos nucleicos estos parámetros son KTUPLE = 2, PENALIDAD POR HUECO = 5, VENTANA = 4 y DIAGONALES GUARDADAS = 4. Después de la alineación de las secuencias utilizando el programa Clustal V, es posible obtener una "identidad porcentual" por la observación de la tabla de "distancias de las secuencias" del mismo programa. Adicionalmente , el "método de alineación Clustal W" está disponible y corresponde al método de alineación etiquetado Clustal W (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989) ; Higgins, D. G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191 (1992)) y encontrados en el programa MegAlign™ v6.1 del sitio de cálculos bioinformáticos LASERGENE (DNASTAR Inc.) . Los parámetros de falla para la alineación múltiple (PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.2, Secuencias Divergentes de Retardo (%) = 30, Peso de la Transición de ADN = 0.5, Matriz de Peso de la Proteina = Serie Gonnet, Matriz de Peso de ADN = IUB) . Después de la alineación de las secuencias utilizando el programa Clustal es posible obtener una "identidad porcentual" observando la tabla de "distancias de la secuencia" del mismo programa. Se entiende bien por un experto en el arte que muchos niveles de identidad de la secuencia son útiles en la identificación de los polipéptidos , a partir de otras especies, en donde tales polipéptidos tienen la misma función o actividad o una semejante. Los ejemplos útiles de las identidades porcentuales incluyen, pero no están limitadas a: 24 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, ó 95 %, o cualquier porcentaje de número entero desde 24 % hasta 100 % puede ser útil en la descripción de la presente invención, tal como 25 o o / 26 o ° > 27 0. o 28 %, 29 o o 30 g. 31 o 32 o o , 33 o 34 o, o / 35 o 36 o 37 ° f 38 o 39 %, 40 o 41 o 42 o o o , 43 0, 44 o , 45 o ° ? 46 o o / 47 o ° r 48 ° / 49 %, 50 o o o ° / 51 52 o ° í 53 54 o ° / 55 o. 56 g. 57 o o o , 58 59 0 ° í 60 %, 61 o 62 o o o o o / 63 64 ° / 65 o 66 o ° f 67 o / 68 o ° í 69 g, o , 70 %, 71 o 72 Q. 73 o o 76 77 o o o ° ? 74 75 o o ° í 78 o 79 80 o o , 81 %, 82 o 83 o o o / 84 g. 85 0, 86 87 88 o ° f 89 O 90 o ° / 91 %, 92 o 93 o 94 o ° í 95 o ° r 96 o 0 , 97 9- , 98 % ó 99 o . Los fragmentos de ácidos nucleicos adecuados no solamente tienen las homologías anteriores sino que típicamente codifican un polipéptido que tiene al menos 50 aminoácidos, preferentemente al menos 100 aminoácidos, más preferentemente al menos 150 aminoácidos, todavía más preferentemente al menos 200 aminoácidos, y aún más preferentemente al menos 250 aminoácidos . El término "software de análisis de la secuencia" se refiere a cualquier algoritmo de computadora o programa de software que es útil para el análisis de las secuencias de nucleótidos o aminoácidos. El "software de análisis de la frecuencia" puede estar disponible comercialmente o puede ser desarrollado independientemente. El software de análisis de la secuencia típico incluirá, pero no está limitado a: 1.) el sitio de GCG de programas (Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG), adison, WI); 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1190) ); 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc. Madison WI) ; 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) ; y 5.) el programa FASTA que incorpora el algoritmo de Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput . Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Fecha de Reunión 1992, 111-20. Editor (es) : Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY) . Dentro del contexto de esta solicitud se entenderá que el software del análisis de la secuencia es utilizado para el análisis, porque los resultados del análisis estarán basados en los "valores de falla" del programa referido, a menos que se especifique de otra manera. Cuando se utilice aquí "valores de falla" significará cualquier conjunto de valores o parámetros que originalmente serán cargados con el software cuando es iniciado primero. Cuando se utilice aquí el término "secuencia de codificación" o "CDS" se refiere a una secuencia de ADN que codifica alguna secuencia de aminoácidos especifica. "Secuencias reguladoras adecuadas" se refiere a las secuencias de nucleótidos localizadas corriente arriba (secuencias no codificantes 5'), dentro, o corriente abajo (secuencias no codificantes 3' ) de una secuencia de codificación, y que influyen en la transcripción, procesamiento de "ARN o estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir los promotores, secuencias delanteras de la traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de la poliadenilación, sitio de procesamiento del ARN, sitio de aglutinación del efector y una estructura de espiga-anillo. El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o un ARN funcional. En general, una secuencia de codificación está localizada 3' con respecto a una secuencia promotora. Los promotores pueden ser derivados en su totalidad de un gen natural, o está compuesto de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o que comprenden aún segmentos del ADN sintético. Se entiende por aquellos expertos en el arte que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones fisiológicas o del medio ambiente. Los promotores que provocan que un gen sea expresado en la mayoría de los tipos de las células la mayoría de las veces, son referidos comúnmente como "promotores constitutivos". Se reconoce además que puesto que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no han sido definidos completamente, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener una actividad idéntica del promotor. El término "enlazado operativamente" se refiere a la asociación de las secuencias de ácidos nucleicos sobre un fragmento de ácido nucleico único de modo que la función de uno es afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está enlazado operativamente con una secuencia de codificación cuando la misma es capaz de afectar la expresión de modo que la secuencia de codificación (es decir, que la secuencia de codificación está bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias de codificación pueden estar enlazadas operativamente con las secuencias reguladoras en una orientación de sentido o antisentido. El término "expresión" como se utiliza aquí, se refiere a la trascripción y la acumulación estable del ARN de sentido (ARNm) o del ARN antisentido derivado del fragmento de ácido nucleico de la invención. La expresión también se puede referir a la traducción del ARNm en un polipéptido. Cuando se utilice aquí, el término "transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en un organismo hospedero, conduciendo a una herencia estable genéticamente. Los organismos hospederos que contienen los elementos de ácidos nucleicos transformados son referidos como organismos " transgénicos" o "recombinantes" o "transformados" . Los términos "plásmido" y "vector" se refieren a un elemento extracromosómico que lleva frecuentemente los genes que no son parte del metabolismo central de la célula, y usualmente en la forma de los fragmentos de ADN de doble hebra, circulares. Tales elementos pueden ser secuencias de replicación autónoma, secuencias de integración del genoma, secuencias del fago o del nucleótido, lineales o circulares, de un ADN o de ARN de una sola hebra o de doble hebra, derivada de cualquier fuente, en el cual un número de secuencias de nucleótidos han sido unidas o recombinadas en una construcción única que es capaz de introducirse en un fragmento del promotor y la secuencia de ADN para un producto genético seleccionado en compañía de la secuencia no traducida 3' apropiada en una célula. "Vector de transformación" se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos además del gen extraño que facilitan la transformación de una célula hospedera particular.
Cuando se utilice aquí, el término "degeneración del codón" se refiere a la naturaleza en el código genético que permite la variación de una secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. La persona experta está bien advertida de la "desviación del codón" exhibida por una célula hospedera especifica en el uso de los codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por lo tanto, cuando se sintetice un gen para la expresión mejorada en una célula hospedera, es deseable diseñar el gen de tal modo que su frecuencia de uso del codón se aproxime a la frecuencia del uso del codón preferida de la célula hospedera. El término "codón optimizado" cuando el mismo se refiere a los genes o las regiones de codificación de las moléculas de ácido nucleico para la transformación de varios elementos hospederos, se refiere a la alteración de los codones en el gen o las regiones de codificación de las moléculas de ácido nucleico para reflejar el uso del codón típico del organismo hospedero sin alterar al polipéptido codificado por el ADN. El término "medio del producto de fermentación" se refiere a un medio en el cual la fermentación ha ocurrido de tal modo que el producto está presente en el medio. El ADN recombinante estándar y las técnicas de clonación molecular utilizadas aquí son bien conocidas en el arte y se describen por Sambrook, J. Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (aquí posteriormente) ("Maniatis") ; y por Silhavy, T. J. , Bennan, M. L. y Enquist, L. W. Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); y por Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicada por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987) . Las rutas biosintéticas de 2-butanol y 2-butanona Los microorganismos que utilizan carbohidratos emplean la ruta de Embden-Meyerhof-Pamas (EMP, por sus siglas en inglés), la ruta de Entner-Doudoroff y el ciclo del fosfato de pentosa como la ruta metabólicas centrales para proporcionar la energía y los precursores celulares para el crecimiento y mantenimiento. Estas rutas tienen en común el 3-fosfato de gliceraldehído intermedio y, por último, el piruvato es formado directamente o en combinación con la ruta de EMP. Las reacciones combinadas de la conversión de azúcar a piruvato produce energía (por ejemplo el 5' -trifosfato de adenosina ATP) y los equivalentes de reducción (por ejemplo el dinucleótido de nicotinamida adenina reducido, NADH, y el fosfato del dinucleótido de adenina nicotinamida reducido, NADPH) . NADH y NADPH deben ser reciclados a sus formas oxidadas (NAD+ y NADP+, respectivamente) . En la presencia de los aceptores de electrones inorgánicos (por ejemplo 02, N03~ y S042") , los equivalentes de la reducción pueden ser utilizados para aumentar el conjunto de la energía; alternativamente, un producto por carbón reducido puede ser formado. La invención hace posible la producción de 2-butanona o 2-butanol a partir de las fuentes de carbohidratos con microorganismos recombinantes por la provisión de una ruta biosintética completa desde el piruvato hasta la 2-butanona o 2-butanol. Tres rutas adicionales ya han sido descritas. Aunque el 2-butanol no se sabe que sea el producto principal de cualquier fermentación bacteriana, existen un número de posibles rutas para la producción del 2-butanol por medio de los tipos de reacción bioquímica conocidos. Estas rutas son mostradas en la figura 1. Las letras y los números romanos citados anteriormente corresponden a las letras y números romanos en la figura 1, que son utilizados para mostrar las etapas y productos de conversión, respectivamente. Como se describe posteriormente, la 2-butanona es un compuesto intermedio en la totalidad de estas rutas biosintéticas del 2-butanol. La totalidad de las rutas empiezan con la reacción inicial de dos moléculas de piruvato para dar el alfa-acetolactato (I), mostradas como la conversión del substrato con respecto al producto (a) en la figura 1. A partir del alfa-acetolactato, existen 4 rutas posibles para la 2-butanona (V) , referidas aquí como las rutas biosintét icas de la 2-butanona : Ruta 1) I ? II ? III -> IV ? V (conversiones del substrato al producto b, c, d, e) ; 2) I ? II - VII ? IV ? V (conversiones del substrato al producto b, g, h, e) 3) I ? I I ? VIII ? V (conversiones del substrato al producto b, i, j) : Esta es la ruta de la presente invención. 4) I ? IX ? X ? V (conversiones del substrato al producto k, 1, m) . Las rutas biosintéticas del 2-butanol concluyen con la conversión de la 2-butanona (V) al 2-butanol (VI) . Una descripción detallada de las conversiones del substrato con respecto al producto en cada ruta se proporciona en seguida. Ruta 1: ( a ) piruvato a la alfa-acetolactato : La etapa inicial de la ruta 1 es la conversión de las dos moléculas de piruvato a una molécula de alfa-acetolactato (compuesto 1 en la figura 1) y una molécula de dióxido de carbono catalizada por una enzima dependiente del pirofosfato de tiamina. Las enzimas que catalizan esta conversión del substrato con respecto al producto (llamada generalmente ya sea la acetolactato sintasa o el acetohidroxi ácido sintasa; EC 2.2.1.6 [cambiado a partir de 4.1.3.18 en el 2002]) son bien conocidas, y las mismas participan en la ruta biosintética para los aminoácidos proteinogénicos de leucina y valina, asi como en la ruta para la producción por fermentación del 2 , 3-butandiol y acetoina de un número de organismos . La persona experta apreciará que los polipéptidos que tienen la actividad de acetolactato sintasa aislados de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de la secuencia. Algún ejemplo de las enzimas de acetolactato sintasa adecuadas están disponibles de un número de fuentes, por ejemplo, Bacillus subtilis [GenBank Nos: ???22222 NCBI (National Center for Biotechnology Information) secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 77) , L04470 NCBI secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 76) ] , Klebsiella terrigena [GenBank Nos: AAA25055 (SEC ID NO: 79) , L04507 (SEC ID NO: 78) ] , y Klebsiella pneumoniae [GenBank Nos: AAA25079 (SEC ID NO: 4) , M73842 (SEC ID NO: 3) ] . Las enzimas de acetolactato sintasa preferidas son aquellas que tienen al menos 80 % - 85 % de identidad para la SEC ID NOs 4, 77, y 79, en donde al menos 85 % - 90 % de identidad es más preferida y en donde al menos 95 % de identidad basado en el método de alineación de Clustal utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz de peso de la proteína, es más preferido. (b) alfa-acetolactato a acetoína El alfa-acetato (I) es convertido a la acetoína (II) por la acción de una enzima tal como la acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5) . De manera semejante a la acetatolactato sintasa, la enzima es dependiente del pirofosfato de tiamina y también está involucrada en la producción de 2 , 3-butandiol y acetoína por un número de organismos. Las enzimas de diferentes fuentes pueden variar muy ampliamente en tamaño (25-50 kilodaltons ) , la oligomerización (dímero-hexámero) , la localización ( intracelular o extracelular) , y la regulación alostérica (por ejemplo, la activación por los aminoácidos de cadena ramificada) . Para el propósito de la presente invención, una localización intracelular es más preferible que una extracelular, pero otras variaciones son aceptables generalmente . La persona experta apreciará que los polipéptidos que tienen la actividad de acetatolactato descarboxilasa aislada de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de la secuencia. Algún ejemplo de las enzimas de acetatolactato descarboxilasa adecuadas están disponibles de un número de fuentes, por ejemplo, Bacillus subtilis [GenBank Nos: AAA22223 (SEC ID NO: 81), L04470 (SEC ID NO: 80)], Klebsiella terrigena [GenBank Nos: AAA25054 (SEC ID NO: 83), L04507 (SEC ID NO: 82)] y Klebsiella pneumoniae [GenBank Nos: AAU43774 (SEC ID NO: 2), AY722056 (SEC ID NO: 1) ] . Las enzimas de acetatolactato descarboxilasa preferidas son aquellas que tienen al menos 80 % - 85 % de identidad hacia las SEC ID NOs 2, 81 y 83, en donde al menos 85 % - 90 % de identidad es más preferida y en donde al menos 95 % de identidad basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz por peso de la proteína, es más preferida. ( c ) acetoína a 3-amino-2-butanol : Existen dos tipos conocidos de reacciones bioquímicas que podrían efectuar la conversión del substrato al producto de acetoína (II) al 3-amino-2-butanol (III), específicamente, la t ransaminación dependiente del fosfato de piridoxal utilizando un donante de amino accesorio y la aminación reductora directa con amoníaco. En este último caso, los equivalentes de reducción son suministrados en la forma de un cofactor de nicotinamida reducida (ya sea NADH o NADPH) . Un ejemplo de una enzima dependiente de NADPH que cataliza esta reacción con acetoína como un substrato es reportada por Ito et al. (patente U.S. No. 6,432,688) . Cualquier esteroespecificidad de esta enzima no ha sido ensayada. Un ejemplo de una transaminasa dependiente del foafato de piridoxal que cataliza la conversión de acetoína a 3-amino-2-butanol ha sido reportado por Shin y Kim (supra) . Esta enzima fue mostrada en el ejemplo 13 de aquí que se convierte tanto al isómero (R) de la acetoina al isómero (2R,3S) del 3-amino-2-butanol como el isómero (S) de la acetoina al isómero (2S,3S) del 3-amino-2-butanol . Cualquier tipo de enzima (es decir, transaminasa o aminasa reductora) se considera que va a ser una acetoina aminasa y puede ser utilizada en la producción de 2-butanol. Otras enzimas en este grupo pueden tener diferentes estereoespecifidades . La persona experta apreciará que los polipéptidos que tiene una actividad de acetoina aminasa, aislados de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de la secuencia. Un ejemplo de esta actividad es descrita aquí y es identificada como la SEC ID NO: 122. En consecuencia, las enzimas de acetoina aminasa preferidas son aquellas que tienen al menos 80 % - 85 % de identidad con respecto a la secuencia SEC ID NO: 122, en donde al menos 85 % - 90 % de identidad es más preferida y en donde al menos 95 % de la identidad basada en el método de alineación de Clustal utilizando los parámetros de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteína, es más preferida. (d) 3-amino-2-butanol a O-fosfato de 3-amino-2-butanol : No existen enzimas conocidas en el arte que catalicen la conversión del substrato al producto del 3-amino-2-butanol (III) al fosfato de 3-amino-2-butanol (IV) . Sin embargo, algunas especies de Pseudomonas y Erwinia se ha mostrado que expresan una etanolamina cinasa dependiente de ATP (EC 2.7.1.82) que permite que ellos utilicen la etanolamina o el l-amino-2-propanol como una fuente de nitrógeno (Jones et al. (1973) Biochem. J. 134: 167-182) . Es probable que esta enzima también tenga actividad hacia el 3-amino-2-butanol o podría ser diseñado para hacerlo así, por lo cual se proporciona una aminobutanol cinasa. La presente invención describe en el ejemplo 14, un gen de Erwinia carotovora subespecie atroseptica (SEC ID NO: 123) que codifica una proteína (SEC ID NO: 24) . Esta proteína ha sido identificada como una amino alcohol cinasa. Esta enzima puede ser utilizada para convertir el 3-amino-2-butanol al O-fosfato de 3-amino-2-butanol . La persona experta apreciará que los polipéptidos que tienen una actividad de aminobutanol cinasa aislados de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de la secuencia. Un ejemplo de esta actividad ha sido descrita aquí y es identificada como la SEC ID NO: 124. En consecuencia, las enzimas de aminobutanol cinasa preferidas son aquellas que tienen al menos 80 % - 85 % de identidad con respecto a SEC ID NO: 124, en donde al menos 85 % - 90 % de identidad es más preferido y en donde al menos 95 % de identidad basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina, es más preferida. (e) fosfato de 3-amino-2-butanol a 2-butanona: Aunque no existan enzimas reportadas que catalicen la conversión del substrato al producto del fosfato de 3-amino-2-butanol (IV) a la 2-butanona (V), el substrato es muy semejante a aquellos utilizados por la enzima de fosfotanolamina fosfo-liasa dependiente del fosfato de piridoxal, que ha sido encontrada en un número pequeño de especies de pseudomonas y Erwinia . Estas enzimas tienen actividad hacia la fosfoetanolamina y ambos enantiómeros del 2-fosfo-l-aminopropano (Jones et al. (1973) Biochem J. 134:167-182), y también pueden tener actividad hacia el 0-fosfato de 3-amino-2-butanol . Aquí está identificado un gen de Erwinia carotovora subespecie atroseptica (SEC ID NO: 125) que codifica una proteina (SEC ID NO: 126) con homología con respecto a la aminotransferasa de la clase III. El ejemplo 15 demuestra que esta enzima es activa sobre tanto el fosfato de aminopropanol como los substratos del fosfato de aminobutanol . La enzima caracterizada e identificada recientemente fue capaz de catalizar la conversión de una mezcla de (R) -3-amino- ( S ) -2-butanol y 0-fosfato de ( S ) -3-amino- ( R) -2-butanol , y una mezcla de (R) -3-amino- (R) -2-butanol y O-fosfato de (S) -3-amino- (S) -2-butanol a la 2-butanona. La enzima identificada y caracterizada recientemente también fue capaz de catalizar la conversión del fosfato tanto (R) como ( S ) -2-amino-l-propanol a la propanona, con una preferencia hacia el fosfato de (S)-2-amino-l-propanol . La actividad más elevada fue observada con el substrato natural propuesto de fosfato de DL-l-amino-2-propanol, el cual fue convertido al propionaldehido . La persona experta apreciará que los polipéptidos que tienen una actividad de aminobutanol fosfato fosfo-liasa aislada de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de la secuencia. Un ejemplo de la enzima de aminobutanol fosfato fosfo-liasa adecuada es descrita aquí en la SEC ID NO: 126. En consecuencia, las enzimas de aminobutanol fosfato fosfo-liasa preferidas son aquellas que tienen al menos 80 - 85 % de identidad con respecto a la SEC ID NO: 126, en donde al menos 85 % - 90% de identidad es más preferida y en donde al menos 95 % de identidad basado en el método de la invención de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteína, es más preferida . (f ) 2-butanona a 2-butanol: La etapa final en todas las rutas para producir 2-butanol a partir de ácido pirúvico es la reducción de la 2-butanona (V) a 2-butanol (VI) . Este substrato para la conversión del producto es catalizado por algunos miembros de la clase amplia de alcohol deshidrogenasas (los tipos que utilizan ya sea NADH o NADPH como una fuente de hidruro, dependiendo de la enzima) que pueden ser llamadas butanol deshidrogenasas. Las enzimas de cada tipo que catalizan la reducción de 2-butanona son bien conocidas, como se describió anteriormente en la definición para la butanol deshidrogenasa . La persona experta apreciará que los polipéptidos que tienen la actividad de la butanol deshidrogenasa aislada de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de la secuencia. Algunos ejemplos de las enzimas de butanol deshidrogenasas adecuadas están disponibles de un número de fuentes, por ejemplo, Rodhococcus ruber [GenBank Nos: CAD36475 (SEC ID NO: 14), AJ491307 (SEC ID NO: 13)] . Las enzimas dependientes de NADP son conocidas como EC 1.1.1.2 y están disponibles, por ejemplo, de Pyrococcus furiosus [GenBank Nos: AAC25556 (SEC ID NO: 91), AF013169 (SEC ID NO: 90)] . Adicionalmente , una butanol deshidrogenasa está disponible de Escherichia coli [GenBank Nos: NP_417484 (SEC ID NO: 75), NC_000913 (SEC ID NO: 74)] y una ciclohexanol deshidrogenasa está disponible de Acinetobacter sp. [GenBank Nos: AAG10026 (SEC ID NO: 72), AF282240 (SEC ID NO: 71)] . Las enzimas de butanol deshidrogenasa preferidas son aquellas que tienen al menos 80-85 % de identidad con respecto a las SEC ID NOs 14, 91, 75, y 72, en donde al menos 85 %-90 % de la identidad es más preferida y en donde al menos 95 % de la identidad basada en el método de Clustal W de alineación utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina, es más preferida. Ruta 2: (a) piruvato a alfa-acetolactato : Este substrato para producir la conversión es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1. (b ) alfa-acetolactato a acetoina: Este substrato para producir la conversión es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1. ( g ) acetoina a fosfoacetoina : Aunque las enzimas que catalizan la conversión del substrato al producto de la acetoina (II) a la fosfoacetoina (VII) no han sido descritas, la estructura del substrato de acetoina es muy semejante a aquel de la dihidroxiacetona , y por lo tanto la acetona puede ser un substrato aceptable para la dihidroxiacetona cinasa (EC 2.7.1.29), una enzima que cataliza la fosforilación de dihidroxiacetona. Las técnicas de diseño de proteínas para la alteración de la especificidad del substrato de las enzimas son bien conocidas (Antikainen y Martin (2005) Bioorg. Med. Chem. 13:2701-2716) y pueden ser utilizadas para generar una enzima con la especificidad requerida. En esta conversión, la porción del fosfato puede ser suministrada por cualquier donante del fosfato biológico de alta energía, con el substrato común que es el fosfoenolpiruvato (como en la dihidroxiacetona cinasa de E.coli) y la ATP (como en la dihidroxiacetona cinasa de Citrobacter freundii) (Garcia-Alles et al. (2004) Biochemistry 43 : 13037-13045) . (h) fosfoacetoína a O-fosfato de 3-amino-2-butanol : Aunque las enzimas que catalizan el substrato para producir la conversión de f os f oacetoína (VIII) al O-fosfato de 3 - ami no - 2 -bu t ano 1 (IV) no han sido descritas, la estructura del substrato es muy semejante a aquella del fosfato de h i d r ox i a ce t on a que es un substrato para la serinol fosfato aminotransferasa propuesta codificada por la porción 5' del gen rtxA en algunas especies de Bradyrhi zobium (Yasuta et al. , supra) . Por consiguiente, una serinol fosfato aminotransferasa puede ser funcional en esta etapa . (e) O-fosfato de 3-amino-2-butanol a 2-butanona: Este substrato para producir la conversión es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1. ( f ) 2-butanona a 2-butanol: Este substrato para producir la conversión es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1.
Ruta 3: ( a ) piruvato a alfa-acetolactato : Este substrato para la conversión del producto es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1. (b) alfa-acetolactato a acetoina: Este substrato para producir la conversión es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1. ( i ) acetoina a 2 , 3-butandiol : El substrato para producir la conversión de acetoina (II) a 2 , 3-butandiol (VIII) puede ser catalizado por una butandiol deshidrogenasa que puede utilizar ya sea NADH o NADPH como la fuente de reducción de los equivalentes cuando se llevan a cabo las reducciones. Las enzimas con actividad hacia la acetoina participan en la ruta para la producción de 2 , 3-butandiol en organismos que producen este compuesto. Las enzimas reportadas (por ejemplo, BudC de Klebsiella pneumoniae (Ui et al. (2004) Letters in Applied Microbiology 39:533-537) generalmente utilizan NADH. Cualquier cofactor es aceptable para su uso en la producción de 2-butanol por esta ruta. La persona experta apreciará que los polipéptidos que tienen la actividad de la butanol deshidrogenasa aislada de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de la secuencia. Algunos ejemplos de las enzimas de butanol deshidrogenasas adecuadas están disponibles de un número de fuentes, por ejemplo, Klebsiella pneumoniae [GenBank Nos: BBA13085 (SEC ID NO: 6), D86412 (SEC ID NO: 5)] . Las butandiol deshidrogenasas (R) -específicas son conocidas como EC 1.1.1.4 y están disponibles, por ejemplo, de Bacillus cereus [GenBank Nos: NP_830481 (SEC ID NO: 85), NC_004722 (SEC ID NO: 84); AAP07682 (SEC ID NO: 87), AE017000 (SEC ID NO: 86)], y Lactococcus lactis [GenBank Nos: AAK04995 (SEC ID NO: 89), AE006323 (SEC ID NO: 88)] . Las enzimas de butandiol deshidrogenasa preferidas son aquellas que tienen al menos 80-85 % de identidad con respecto a las SEC ID NOs 6, 85, 87, y 89, en donde al menos 85 %-90 % de la identidad es más preferida y en donde al menos 95 % de la identidad basada en el método de Clustal W de alineación utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteína, es más preferida . ( j ) 2 , 3-butandiol a 2-butanona: Este substrato para producir la conversión de 2,3-butandiol (VIII) a la 2-butanona (V) puede ser catalizado por las enzimas de diol deshidratasa (EC 4.2.1.28) y las enzimas de glicerol deshidratasa (EC 4.2.1.30) . La diol deshidratasa mejor caracterizada es la coenzima de Klebsiella oxytoca dependiente de la coenzima de B12, pero enzimas semejantes son encontradas en un número de bacterias entéricas. La enzima de K. oxytoca se ha mostrado que acepta al meso-2 , 3-butandiol como un substrato (Bachovchin et al. (1977) Biochemistry 16:1082-1092), produciendo el producto de 2-butanona deseado. El ejemplo 17 demuestra que la glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae fue capaz de convertir el meso-2,3-butandiol a 2-butanona. Las tres subunidades de la glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae (alfa: SEC ID NO: 145 (región de codificación) y 146 (proteína); beta: SEC ID NO: 147 (región de codificación) y 148 (proteína); y gamma: SEC ID NO: 149 (región de codificación) y 150 (proteína)) fueron expresadas en conjunción con las dos subunidades de la glicerol deshidratasa reactivasa de Klebsiella pneumoniae (subunidad grande, SEC ID NO: 151 (región de codificación) y 152 (proteína); y la subunidad pequeña, SEC ID NO: 153 (región de codificación y 154 (proteína) ) para proporcionar la actividad. También existen reportes en la literatura de una diol deshidratasa independiente de B12 de Clostridium glycolicum (Hartmanis et al. (1986) Arch. Biochem. Biophys. 245:144-152) . Esta enzima tiene la actividad hacia el 2 , 3-butandiol aunque esta actividad es menor que 1 % de la actividad hacia el etandiol, pero la enzima puede ser diseñada para mejorar esta actividad. Una deshidratasa independiente de B12 mejor caracterizada es la glicerol deshidratasa de Clostridium butyricum (O'Brien et al. (2004) Biochemistry 43:4635-4645), que tiene una actividad elevada hacia el 1 , 2-propandiol así como el glicerol . Esta enzima utiliza la S-adenosilmetionina como una fuente del radical de adenosilo. No existen reportes de la actividad hacia el 2 , 3-butandiol , pero tal actividad, si no está ya presente, posiblemente puede ser diseñada. La persona experta apreciará que los polipéptidos que tienen la actividad de la butandiol deshidrogenasa aislados de una variedad de fuentes serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de la secuencia. Como se señaló anteriormente, una variedad de dioles y gliceroles deshidratasas han sido descritas en la literatura y serán adecuadas para su uso en la invención. En consecuencia, en un aspecto de la invención las enzimas de diol y glicerol deshidratasa preferidas son aquellas que tienen al menos 80%-85% de identidad con las enzimas que tienen las subunidades grande, intermedia y pequeña, respectivamente, de las secuencias listadas en seguida: a) SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, y SEC ID NO: 12; b) SEC ID NO: 93, SEC ID NO: 95, y SEC ID NO: 97; c) SEC ID NO: 99, SEC ID NO: 101, y SEC ID NO: 103; d) SEC ID NO: 105, SEC ID NO: 107, y SEC ID NO: 109; e) SEC ID NO: 135, SEC ID NO: 136, y SEC ID NO: 137; f) SEC ID NO: 138, SEC ID NO: 139, y SEC ID NO: 140; g) SEC ID NO: 146, SEC ID NO: 148, y SEC ID NO: 150; h) SEC ID NO: 141, SEC ID NO: 142, y SEC ID NO: 143; e i) SEC ID NO: 164, SEC ID NO: 165, y SEC ID NO: 166. en donde al menos 85-90 % de la identidad es más preferida y en donde al menos 95 % de la identidad basada en el método Clustal W de alineación utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina, es más preferida. De manera semejante, las enzimas de diol y glicerol deshidratasa son aquellas que tienen al menos 80%-85% de identidad con las enzimas que tienen las subunidades grande, intermedia y pequeña, respectivamente, de las secuencias listadas en seguida: subunidad grande: SEC ID NOs : 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146, y 164; subunidad intermedia: SEC ID NOs: 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148, y 165; subunidad pequeña: SEC ID NOs: 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150, y 166; en donde al menos 85%-90% de la identidad es más preferida y en donde al menos 95 % de la identidad basada en el método Clustal W de alineación utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina, es más preferida . Las enzimas de diol y glicerol deshidratasa adicionales que pueden ser utilizadas en la ruta biosintética 3 de la presente invención fueron identificadas a través de un análisis de la estructura/función bioinformática que es descrita posteriormente y en el ejemplo 18. ( f ) 2-butanona a 2-butanol: Esta conversión del substrato al producto es la misma que aquella descrita anteriormente para la ruta 1. Dioles y gliceroles deshidratasas para la ruta biosintética 3 Cualquier enzima que sea un diol o glicerol deshidratasa puede ser utilizada en la presente invención para la conversión del 2 , 3-butandiol a la 2-butanona. Una relación de la estructura/función para las dioles y gliceroles deshidratasas en las clases de enzimas EC 4.2.1.28 y EC 4.2.1.30, respectivamente, fue establecida aquí en el ejemplo 18. La función es provista por los datos experimentales y la estructura es provista por los análisis bioinformáticos . Ocho enzimas de diol y glicerol deshidratasa con actividades que han sido demostradas experimentalmente, fueron analizadas. En este grupo (listado en la tabla 10), las enzimas de la diol deshidratasa de Klebsiella oxytoca y de glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae se muestra que ambas convierten el 2 , 3-butandiol a la 2-butanona (Bachovchin et al. (1977) Biochemistry 16:1082-1092 y el ejemplo 17 de aquí, respectivamente) , mientras que las actividades de las seis enzimas adicionales fueron demostradas utilizando sus substratos naturales (las referencias provistas en la tabla 10) . Este conjunto de ocho dioles y gliceroles deshidratasas fue analizado utilizando el algoritmo hmmsearch del paquete de software de HMMER (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA). El parámetro Z del algoritmo hmmsearch se fijó en 1 mil millones. El rendimiento del análisis de HMMER utilizando un conjunto de secuencias de la proteina es un Modelo de Perfil Oculto de Markov (perfil HMM, por sus siglas en inglés) . La teoría detrás del perfil de HMM es descrita en Durbin et al., Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, 1998; Krogh et al; 1994; J. Mol. Biol . 235:1501-1531, incorporada aquí para referencia) que caracteriza el conjunto de proteínas basado en la probabilidad de cada aminoácido de que está presente en cada posición en la alineación de las proteínas del conjunto. Puesto que las ocho dioles y gliceroles deshidratasas (dioles/gliceroles deshidratasas) con una función verificada experimentalmente que fueron utilizadas para el análisis cada una tiene tres subunidades (grandes o alfa, intermedias o beta, y pequeñas o gamma) , un perfil de HMM separado fue preparado para cada subunidad. El perfil HMM de la subunidad grande (tabla 12) fue construido utilizando las proteínas con las SEC ID NOs : 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146 y 164 que son descritas en las tablas 1 y 2. El perfil de HMM de la subunidad intermedia (tabla 13) fue construida utilizando las proteínas con la SEC ID NOs: 10, 101, 107, 136, 139, 142 148, y 165 que son descritas en las tablas 1 y 2. El perfil de HMM de la subunidad pequeña (tabla 14) fue construida utilizando proteínas con las SEC ID NOs : 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150, y 166 que son descritas en las tablas 1 y 2. Las referencias que proporcionan los datos del ensayo funcional son provistas en la tabla 10. El perfil de HMM preparado para la subunidad grande proporciona una caracterización estructural para la subunidad grande funcional de las dioles/gliceroles deshidratasas . De manera semejante, el perfil de HMM para las subunidades media y pequeña proporciona caracterizaciones estructurales para las subunidades media y pequeña funcionales, respectivamente, de las dioles/gliceroles deshidratasas. Por lo tanto, cualquier proteína que tiene una igualdad significativa con el perfil de HMM de la subunidad ya sea grande, media o pequeña, está relacionada directamente con la función de la subunidad para la cual el perfil fue preparado. Para que sea significativa, la igualación tiene un valor E de 0.01 o menor, y el uso adicional de "igualación" se entiende que va a estar dentro de este criterio del valor E. Así, las subunidades de diol/glicerol deshidratasa que pueden ser utilizadas en la presente invención son proteínas que igualan el perfil de HMM, que son preparadas utilizando las proteínas con las SEC ID NOs listadas anteriormente, con un valor E de 0.01 o menor. Las proteínas que son de longitud total y que tienen una relación funcional con la subunidad grande de las dioles/gliceroles deshidratasas, por medio de la igualación del perfil de HMM de la subunidad grande, incluyen pero no están limitadas a, proteínas con las SEC ID NOs : 93, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254, 255, 256, 257, 258, y 259. Las proteínas que son de longitud total y que tienen una relación funcional con la subunidad intermedia de las dioles/gliceroles deshidratasas por medio de la igualación del perfil de HMM de la subunidad intermedia, incluyen pero no están limitadas a las proteínas con las SEC ID NOs: 95, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 244, 250, 252, 260, 261, 262, 263, 364, 265, 266, y 167. Las proteínas que son de longitud total y tienen una relación funcional con la subunidad pequeña de las dioles/gliceroles deshidratasas, por medio de la igualación del perfil de HMM de la subunidad pequeña, incluyen pero no están limitadas a las proteínas con las SEC ID NOs: 97, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 245, 248, 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273, y 274. Además, las proteínas que son subunidades grandes e intermedias, de longitud completa, fusionadas, que tienen una relación funcional con las subunidades grandes e intermedias de las dioles/gliceroles deshidratadas, por medio de la igualación de los perfiles de HMM de las subunidades grandes e intermedias, incluyen pero no están limitadas a, proteínas con las SEC ID NOs : 233, 235, 237, 239, 241, 246, y 247. Puesto que el perfil de HMM descrito anteriormente proporciona una relación de la estructura/función para las dioles/gliceroles deshidratasas , las proteínas identificadas recientemente que igualan estos perfiles también pueden ser utilizados en la presente invención. Además, las secuencias de proteínas de la subunidad de diol/glicerol deshidratasa que pueden ser utilizadas en la presente invención incluyen proteínas con cambios de aminoácidos que tienen efectos mínimos sobre la función de la subunidad, que son substancialmente semejantes a las secuencias de las SEC ID NOs listadas anteriormente. Se sabe bien en el arte que la substitución de un aminoácido equivalente químicamente en un sitio dado que no afecte las propiedades funcionales de la proteína codificada es común. Para los propósitos de la presente invención las substituciones que proporcionan proteínas substancialmente semejantes son definidas como intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos: 1. Residuos alifáticos, no polares o ligeramente polares, pequeños; Ala, Ser, Thr (Pro, Gly) ; 2. Residuos cargados negativamente, polares, y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln; 3. Residuos cargados positivamente polares: His, Arg, Lys; 4. Residuos no polares, alifáticos, grandes: Met, Leu, lie, Val (Cys) ; y 5. Residuos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp. Por consiguiente, las substituciones de un aminoácido por otro en estos grupos se puede esperar que produzca una proteina funcionalmente equivalente. En muchos casos, los cambios que conduzcan a una alteración de las porciones N-terminal y C-terminal de la proteina tampoco se podría esperar que alteren la actividad de la proteína. Las proteínas substancialmente semejantes a aquellas de las SEC IDs que se igualan con el perfil de HMM puede ser de 90 % o 95 % idénticas en la secuencia de aminoácidos a una de las proteínas de igualación, y estas pueden ser utilizadas en la presente invención. Un experto en el arte puede identificar fácilmente un conjunto de 3 subunidades que pueden ser utilizadas conjuntamente para proporcionar una diol/glicerol deshidratasa funcional. Es particularmente adecuada una combinación de una subunidad grande, media y pequeña de la misma cepa de organismos, cuyas regiones de codificación están localizadas cercanas entre sí en el genoma . Estas subunidades podrían formar más probablemente una diol o glicerol deshidratasa natural. Muchas subunidades grandes, medias, y pequeñas están agrupadas de esta manera en la tabla 2. Una combinación de las subunidades de las cepas o especies relacionadas estrechamente es adecuada para la composición de una diol deshidratasa o una glicerol deshidratasa. Cualquier combinación de subunidades que catalizan la conversión de 2 , 3-butandiol a 2-butanona puede ser utilizada. Las combinaciones de subunidades efectivas pueden ser determinadas fácilmente por un experto en el arte por medio de las comparaciones de las secuencias de aminoácidos y/o los ensayos funcionales. De acuerdo con esto, la invención proporciona enzimas de diol y glicerol deshidratasas que tienen secuencias de aminoácidos que comprenden las subunidades grande, intermedia y pequeña de longitud total, que proporcionan cada una un parámetro de un valor E de 0.01 o menor cuando son investigadas utilizando un modelo de perfil oculto de Markov preparado utilizando las subunidades grandes de la SEC ID NOs: 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146, y 164; las subunidades intermedias de las SEC ID NOs: 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148, y 165; y las subunidades pequeñas de las SEC ID NOs: 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150, y 166; cada investigación es llevada a cabo utilizando el algoritmo de hmmsearch en donde el parámetro Z es fijado en 1 mil millones. Alternativamente, la presente invención proporciona enzimas de diol y glicerol deshidratasa que tienen las secuencias de aminoácidos identificadas por un proceso que comprende: a) generar un modelo de Markov de perfil oculto a partir de la alineación de las secuencias de aminoácidos que corresponden a las subunidades grande, intermedia y pequeña de las enzimas de diol y glicerol deshidratasa en donde; i) la subunidad grande comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146, y 164; ii) la subunidad intermedia comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148 y 165; y iii) la subunidad pequeña comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150, y 166; b) investigar al menos una base de datos pública de las secuencias de proteínas que contienen las secuencias de las dioles y gliceroles deshidratasas con el modelo de Markov de perfil oculto de (a) utilizar el algoritmo hmmsearch en donde el parámetro Z del es fijado en 1 mil millones y el parámetro del valor E es fijado en 0.01, para identificar un primer conjunto de datos de las secuencias de aminoácidos de la diol y glicerol deshidratasa; y c) remover cualesquiera secuencias parciales del primer conjunto de datos (b) para generar un segundo conjunto de datos de las secuencias de aminoácidos de diol y glicerol deshidratasa, en donde las enzimas de diol deshidratasa y de glicerol deshidratasa son identificadas. Con respecto a las subunidades grandes de las dioles y gliceroles deshidratasas de la invención, las enzimas pueden comprender una subunidad grande que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs : 8, 93, 99, 105, 135, 138, 141, 146, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254, 255, 256, 257, 258, y 259, basado en el método Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina. Con respecto a las subunidades intermedias de las dioles y gliceroles deshidratasas de la invención, las enzimas pueden comprender una subunidad intermedia que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 10, 95, 101, 107, 136, 139, 142, 148, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 244, 250, 252, 260, 261, 262, 263, 364, 265, 266, y 167 basado en el método Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina. Con respecto a las subunidades pequeñas de las dioles y gliceroles deshidratasas de la invención, las enzimas pueden comprender una subunidad intermedia que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs : 12, 97, 103, 109, 137, 140, 143, 150, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 245, 248, 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273, y 274, basado en el método Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina. Alternativamente, la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa pueden comprender subunidades grandes, intermedias, y pequeñas, fusionadas, que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 233, 235, 237, 239, 241, 246, y 247, basado en el método Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina. Alternativamente, las enzimas de diol deshidratasa o glicerol deshidratasa pueden comprender subunidades grande, intermedia y pequeña, fusionadas, y tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos que comprende la totalidad de las tres secuencias de aminoácidos que codifican las subunidades grande, intermedia y pequeña, seleccionadas del grupo que consiste de: a) SEC ID NO : 8, SEC ID NO: 10, y SEC ID NO: 12; b) SEC ID NO : 93, SEC ID NO: 95, y SEC ID NO: 97; c) SEC ID NO : 99, SEC ID NO: 101, y SEC ID NO: 103; d) SEC ID NO : 105, SEC ID NO : 107, y SEC ID NO: 109; e) SEC ID NO : 135, SEC ID NO : 136, y SEC ID NO: 137; f) SEC ID NO : 138, SEC ID NO : 139, y SEC ID NO: 140; g) SEC ID NO : 146, SEC ID NO : 148, y SEC ID NO: 150; h) SEC ID 141, SEC ID NO: 142, y SEC ID NO: 143; e i) SEC ID NO : 164, SEC ID NO : 165, y SEC ID NO: 166; basado en el método Clustal W de alineación utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina. Ruta 4 : (a) piruvato a alfa-acetolactato : Este substrato para producir la conversión es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1. ( k) alfa-acetolactato al ácido 2 , 3-dihidroxi-2-metilbutanoico : El substrato para producir la conversión de acetolactato (I) al ácido 2 , 3-dihidroxi-2-metilbutanoico (IX) no es conocido en el arte. Sin embargo, el producto de esta conversión ha sido reportado como un componente de los caldos de fermentación (Ziadi et al. (1973) Comptes Rendus des Seances de 1'Academie des Sciences, Serie D: Sciences Naturelles 276:965-8), pero el mecanismo de formación es desconocido. El mecanismo probable de formación es la reducción del acetolactato con NADH o NADPH como el donante de electrones. Para utilizar esta ruta para la producción de 2-butanol, una enzima que cataliza esta reacción necesita ser identificada o diseñada. Sin embargo, el precedente para la reducción enzimática de las cetonas y los alcoholes está bien establecido . ( 1 ) ácido 2 , 3-dihidroxi-2-metilbutanoico al ácido 2-hidroxi-2-meti1-3-fosfobutanoico No existen enzimas conocidas que catalicen la conversión del substrato al producto del ácido 2 , 3-dihidroxi-2-metilbutanoico (IX) al ácido 2-hidroxi-2-metil-3-fosfobutanoico (X) . Sin embargo, existe un gran número de cinasas en la naturaleza que poseen una especificidad variable. Por lo tanto es probable que una enzima podría ser aislada o diseñada con esta actividad. (m) ácido 2-hidroxi-2-metil-3-fosfobutanoico a la 2-butanona : No existen enzimas conocidas que catalicen la conversión del substrato al producto del ácido 2-hidroxi-3-metilfosfobutanoico (X) a la 2-butanona (V) . La combinación de esta reacción con uno previa es muy semejante a la reacción de etapas múltiples catalizada por la mevalonato-5-pirofosfato (M5PP) descarboxilasa , que consiste de la fosforilación inicial de M5PP a la 3-fosfomevalonato-5-??, seguido por la eliminación dependiente de la descarboxilación del fosfato (Alvear et al. (1982) Biochemistry 21: 4646-4650) . ( f ) 2-butanona a 2-butanol: Este substrato para producir la conversión es el mismo que se describió anteriormente para la ruta 1. Por consiguiente, para proporcionar rutas recombinantes múltiples del piruvato al 2-butanol, existe un número de elecciones para satisfacer las etapas de conversión individuales, y la persona con experiencia en el arte será capaz de utilizar las secuencias disponibles públicamente y las secuencias descritas aquí para construir las rutas relevantes. Un listado del número representativo de genes conocidos en el arte y útiles en la construcción de las rutas biosintét icas de 2-butanol está dado anteriormente en las tablas 1 y 2. Elementos hospederos microbianos para la producción de 2-butanol y 2-butanona Los elementos hospederos microbianos para la producción de 2-butanol o 2-butanona pueden ser seleccionados de las bacterias, cianobacterias , hongos filamentosos y levaduras. El animal hospedero microbiano utilizado para la producción de 2-butanol o 2-butanona debe ser tolerante con respecto al producto producido, de modo que el rendimiento no este limitado por la toxicidad del producto con respecto al animal hospedero. La selección de un animal hospedero microbiano para la producción de 2-butanol se describe con detalle posteriormente. Aplica el mismo criterio para la selección de un animal hospedero para la producción de 2-butanona . Los microbios que son metabólicamente activos a niveles de concentración elevada de 2-butanol no son bien conocidos en el arte. Aunque los mutantes tolerantes al butanol han sido aislados de Clostridia solventogénica , está disponible poca información que se refiera a la tolerancia al butanol de otras cepas de bacterias potencialmente útiles. La mayoría de los estudios sobre la comparación de la tolerancia al alcohol en las bacterias sugirieron que el butanol es más tóxico que el etanol (de Cavalho et al., Microsc. Res. Tech. 64:215-22 (2004) y Kabelitz et al., FEMS Microbiol. Lett. 220:223-227 (2003) ) . Thomas et al. (J. Bacteriol. 186:2006-2018 (2004)) reportó que el rendimiento de 1-butanol durante la fermentación en Clostridium acetobutylicum puede ser limitado por la toxicidad del butanol. El efecto primario del 1-butanol sobre Clostridium acetobutylicum es la alteración de las funciones de la membrana (Hermann et al., Appl . Environ. Microbiol. 50:1238-1243 (1985) ) . Los animales hospederos microbianos seleccionados para la producción de 2-butanol deben ser tolerantes hacia el 2-butanol y deben ser capaces de convertir los carbohidratos al 2-butanol utilizando la ruta biosintética introducida. Los criterios para la selección de los animales hospederos microbianos adecuados incluyen los siguientes: tolerancia intrínseca al 2-butanol, velocidad elevada de utilización de carbohidratos, disponibilidad de herramientas genéticas para la manipulación genética, y la capacidad para generar alteraciones cromosómicas estables. Las cepas de los animales hospederos adecuados con una tolerancia hacia el 2-butanol pueden ser identificadas por la selección con base en la tolerancia intrínseca de la cepa. La tolerancia intrínseca de los microbios al 2-butanol puede ser medida por la determinación de la concentración del 2-butanol que es responsable de la inhibición del 50 % de la velocidad de crecimiento (IC50) cuando se hacen crecer en un medio mínimo. Los valores de IC50 pueden ser determinados utilizando los métodos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, los microbios de interés se pueden hacer crecer en la presencia de varias cantidades de 2-butanol y la velocidad de crecimiento verificada por la medición de la densidad óptica a 600 nanómetros. El tiempo de duplicación puede ser calculado a partir de la parte logarítmica de la curva de crecimiento y utilizado como una medida de la velocidad de crecimiento. La concentración del 2-butanol que produce 50 % de inhibición del crecimiento puede ser determinada de una gráfica de la inhibición porcentual del crecimiento contra la concentración del 2-butanol. Preferentemente, la cepa hospedera debe tener una IC50 hacia el 2-butanol mayor que aproximadamente 0.5 %. Es más adecuada una cepa del animal hospedero con una IC50 hacia el 2-butanol que sea mayor que aproximadamente 1.5 %. Es particularmente adecuada una cepa del animal hospedero con una IC50 hacia el 2-butanol que es mayor que aproximadamente 2.5 %. El animal hospedero microbiano para la producción del 2-butanol también debe utilizar la glucosa y/u otros carbohidratos a una velocidad elevada. La mayoría de los microbios son capaces de utilizar carbohidratos. Sin embargo, ciertos microbios del medio ambiente no pueden utilizar eficientemente los carbohidratos, y por lo tanto podrían no ser animales hospederos adecuados. La capacidad para modificar genéticamente el animal hospedero es esencial para la producción de cualquier microorganismo recombinante . Los modos de la tecnología de transferencia genética que pueden ser utilizados incluyen electroporación, conjugación, transducción o transformación natural. Una amplia gamma de plásmidos conjugados hospederos y marcadores de resistencia del fármaco están disponibles. Los vectores de clonación utilizados con un organismo son adaptados con respecto al organismo hospedero basado en la naturaleza de los marcadores de resistencia antibiótica que pueden funcionar en este animal hospedero. El animal hospedero microbiano también puede ser manipulado para inactivar las rutas competentes para el flujo del carbón por la inactivación de varios genes. Esto requiere la disponibilidad de ya sea los transposones o los vectores de integración cromosómica para dirigir la inactivación. Adicionalmente , la producción de animales hospederos que sean capaces de una mutagénesis química pueden padecer mejoras y la tolerancia al 2-butanol intrínseca por medio de la mutagénesis química y la selección de los mutantes. Basado en los criterios descritos anteriormente, los animales hospederos microbianos adecuados para la producción de 2-butanol y 2-butanona incluyen, pero no están limitados a, elementos de los géneros Clostrídíu , Zymomonas, Escherichia, Salmonella , Rhodococcus , Pseudomonas , Bacillus, Lactobacillus , Enterococcus , Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella , Paenibacillus , Arthrobacter, Corynebacterium , Brevibacterium , Pichia , Candida, Hansenula y Saccharomyces . Los animales hospederos preferidos incluyen: Escherichia coli, Alcaligenes euthrophus , Bacillus licheniformis, Paenibacillus macerans , Rhodococcus erythropolis , Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum , Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium, Enterococcus faecalis , Pediococcus pentosaceus , Pediococcus acidilactici , Bacillis subtilis y Saccharomyves cerevisiae. Construcción de los animales hospederos para la producción Los organismos recombinantes que contienen los genes necesarios que codifican la ruta enzimática para la conversión de un substrato de carbono fermentable al 2-butanol o 2-butanona pueden ser construidos utilizando las técnicas bien conocidas en el arte. En la presente invención, los genes que codifican las enzimas de la ruta 3 biosintética del 2-butanol: acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa , butandiol deshidrogenasa , y butanol deshidrogenasa ; o la ruta 3 biosintética de la 2-butanona omitiendo la butanol deshidrogenasa, pueden ser aislados de varias fuentes, como se describió anteriormente. Los métodos de obtención de los genes deseados a partir de un genoma bacteriano son comunes y son bien conocidos en el arte de la biología molecular. Por ejemplo, si la secuencia del gen es conocida, los cebadores pueden ser diseñados y la secuencia deseada amplificada utilizando los métodos de amplificación dirigidos al cebador, estándares, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (patente U.S. No. 4,683,202) para obtener las cantidades del ADN adecuadas para la clonación en los vectores de expresión. Si un gen que es heterólogo para una secuencia conocida va a ser aislado, las bibliotecas genómicas adecuadas pueden ser creadas por la digestión de la endonucleasa de restricción y pueden ser seleccionados con sondas que tienen una secuencia complementaria para la secuencia del gen deseado. Una vez que la secuencia es aislada, el ADN puede ser amplificado utilizando los métodos de amplificación dirigidos al cebador, estándares, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (U.S. No. 4,683,202) pata obtener las cantidades del ADN adecuadas para la clonación en los vectores de expresión, que son transformados entonces en las células hospederas apropiadas . Además, dada la secuencia de aminoácidos de una proteina con la actividad enzimática deseada, la secuencia de codificación puede ser averiguada por la traducción inversa de la secuencia de la proteina. Un fragmento del ADN que contiene la secuencia de codificación puede ser preparado sintéticamente y clonado en un vector de expresión, luego transformado en la célula hospedera deseada. En la preparación de un fragmento de ADN sintético que contiene una secuencia de codificación, esta secuencia puede ser optimizada para la expresión en la célula hospedera objetivo. Las herramientas para la optimización del codón para la expresión en un elemento hospedero heterólogo están disponibles fácilmente. Algunas herramientas para la optimización del codón están disponibles basado en el contenido de GC del organismo hospedero. Los contenidos de GC de algunos animales hospederos microbianos ejemplares están dados en la tabla 3 . Tabla 3 Contenidos de GC de los animales hospederos microbianos Una vez que los genes de la ruta relevante son identificados y aislados, los mismos pueden ser transformados en elementos hospederos de expresión adecuada por los medios bien conocidos en el arte. Los vectores útiles para la transformación de una variedad de células hospederas son comunes y están disponibles comercialmente de compañías tales como EPICENTRE® (Madison, I), Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) , Stratagene (La Jolla, CA) , y New England Biolabs, Inc.
(Beverly, MA) . Típicamente, el vector contiene un marcador seleccionado y secuencias que permiten la replicación autónoma o la integración cromosómica en el elemento hospedero deseado. Adicionalmente , los vectores adecuados comprenden una región promotora que colecta los controles de iniciación transcripcional y una región de control de terminación transcripcional , entre las cuales puede ser insertado un fragmento del ADN de la región de codificación, para proporcionar la expresión de la región de codificación insertada. Ambas regiones de control pueden ser derivadas de los genes análogos hacia la célula hospedera transformada, aunque se va a entender que tales regiones de control también pueden ser derivadas de los genes que no son naturales con respecto a las especies genéticas elegidas como un elemento hospedero para la producción. Las regiones de control de iniciación o promotores, que son útiles para estimular la expresión de las regiones de codificación de la ruta relevante en la célula hospedera deseada son numerosas y son familiares para aquellos expertos en el arte. Virtualmente cualquier promotor capaz de estimular estos elementos genéticos es adecuado para la presente invención incluyendo, pero sin estar limitado a los promotores derivados de los siguientes genes: CYC1 , HIS3, GAL1, GALIO, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1 , TRP1 , URA3 , LEU2 , ENO, TPI, CUP1, FBA, GPD, y GPM (útiles para la expresión en Saccharomyces) ; A0X1 (útil para la expresión en Pichia) , asi como los promotores lac, ara, tet , trp, IPhr IPR, T7, tac, y trc (útiles para la expresión en Escherichia coli, Alcaligenes , y Pseudomonas) ; los promotores amy, apr, y npr, y varios promotores del fago útiles para la expresión en Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis y Paenibacillus macerans ; nisA (útil para la expresión de las bacterias gram-positivas, Eichenbaum et al. Appl . Environ. Microbiol. 64 (8) :2763-2769 (1998) ) ; y el promotor Pll sintético (útil para la expresión en Lactobacillus plantarum, Rud et al., Mícrobiology 152: 1011-1019 (2006) ) . Las regiones de control de la terminación también pueden ser derivadas de varios genes negativos naturales para los elementos hospederos preferidos. Opcionalmente , un sitio de terminación también puede ser innecesario, sin embargo, es más preferido si es incluido. Ciertos vectores son capaces de replicación en un intervalo amplio de bacterias hospederas y pueden ser transferidos por conjugación. La secuencia completa y anotada de pRK404 y tres vectores relacionados: pRK437, pRK442, y pRK442 (H) están disponibles. Estos derivados han probado que van a ser herramientas valiosas para la manipulación genética en las bacterias gram-negativas (Scott et al., Plasmid 50(l) :74-79 (2003) ) . Varios derivados de plásmido del intervalo de huéspedes amplios de Inc P4 plásmido RSF1010 también están disponibles con los promotores que pueden funcionar en un intervalo de bacterias gram negativas. Los plásmidos pAYC36 y pAYC37, tienen promotores activos en compañía de sitios de clonación múltiples para permitir la expresión del gen heterologo en las bacterias gram negativas. Las herramientas de reemplazo de los genes cromosómicos también están ampliamente disponibles. Por ejemplo, una variante termosensible del replicón p VIOl del intervalo de huéspedes amplios ha sido modificada para construir un plásmido pVE6002 que puede ser utilizado para efectuar el reemplazo del gen en una gama de bacterias gram-positivas (Maguin et al., J. Bacteriol 17 (17 ) : 5633-5638 (1992)) . Adicionalmente, los transposomas in vitro están disponibles de las fuentes comerciales tales como EPICENTRE® para crear mutaciones aleatorias en una variedad de genomas. La expresión de una ruta biosintética de 2-butanol en varios elementos microbianos hospederos preferidos es descrita con mayor detalle posteriormente. Para la expresión de una ruta biosintética de la 2-butanona, aplica la misma descripción, pero el substrato final para producir la conversión de 2-butanona a 2-butanol es omitida. Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en E. coli Los vectores útiles para la transformación de E. coli son comunes y están disponibles comercialmente de las compañías listadas anteriormente. Por ejemplo, los genes de una ruta biosintética de 2-butanol pueden ser aislados de varias fuentes, como se describió anteriormente, clonados sobre un vector de pUC19 modificados y transformados en E. coli NM522, como se describe en los ejemplos 6 y 7. Alternativamente, los genes que codifican una ruta biosintética de 2-butanol pueden ser separados en operones múltiples, clonados sobre los vectores de expresión, y transformados en varias cepas de E. coli como se describe en los ejemplos 9, 10 y 11. La ruta biosintética de la 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa . Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en Rhodococcus erythropolis En una serie de vectores de transferencia de E. coli- Rhodococcus están disponibles para la expresión en R. erythropolis incluyendo, pero sin estar limitado a pRhBR17 y pDA71 (Kostichka et al., Appl . Microbiol. Biotechnol. 62:61-68 (2003)). Adicionalmente, una serie de promotores están disponibles para la expresión del gen heterólogo en R. erythropolis (véase por ejemplo Nakashima et al., Appl. Environ. Microbiol. 70:5557-5568 (2004), y Tao et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, DOI 10.1007 /s00253-005-0064 ) . Las alteraciones de los genes objetivo en los genes cromosómicos de R. erythropolis pueden ser creadas utilizando los métodos descritos por Tao et al., supra; y Brans et al. {Appl. Environ. Microbiol. 66: 2029-2063 (2000) ) . Los genes heterólogos requeridos para la producción de 2-butanol, como se describieron anteriormente, pueden ser clonados inicialmente en pDA71 o pRhBR71 y transformados en E. coli. Los vectores pueden ser transformados entonces en R. erythropolis por electroporación, como se describe por Kostichka et al., supra. Los materiales recombinantes se pueden hacer crecer en un medio sintético que contiene glucosa y la producción de 2-butanol puede ser seguida utilizando los métodos de fermentación conocidos en el arte. La ruta de la biosintesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa . Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en B. subtilis Los métodos para la expresión del gen y la creación de mutaciones en B. subtilis también son bien conocidas en el arte. Por ejemplo, los genes de una ruta biosintética de 2-butanol pueden ser aislados de varias fuentes, como se describió anteriormente, clonados en un vector transferencia de E. coli-Bacillus modificado y transformados en Bacillus subtilis BE1010, como se describe en el ejemplo 8. Los genes deseados pueden ser clonados en el vector de expresión de Bacillus y transformados en una cepa para fabricar un elemento hospedero de producción. Alternativamente, los genes pueden ser integrados en el cromosoma de Bacillus utilizando replicones condicionales o vectores suicidas que son conocidos por un experto en el arte. Por ejemplo, el Bacillus Genetic Stock Center lleva numerosos vectores de integración. La ruta de la biosintesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa . Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en B. licheniformis La mayoría de los plásmidos y vectores de transferencia que se replican en B. subtilis pueden ser utilizados para transformar B. licheniformis por ya sea la transformación o electroporacion del protoplasto. Los genes requeridos para la producción de 2-butanol pueden ser clonados en los plásmidos pBE20 o los derivados de pBE60 (Nagarajan et al. , Gene 114:121-126 (1992) ) . Los métodos para transformar B . licheniformis ya son conocidos en el arte (por ejemplo véase Fleming et al. Appl . Environ. Microbiol. , 61 ( 11 ) : 3775 - 3780 (1995) ) . Los plásmidos construidos para la expresión en B. subtilis pueden ser transformados en B . licheniformis para producir un elemento hospedero recombinante microbiano que produce 2-butanol. La ruta de la biosintesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en Paenibacillus macerans Los plásmidos pueden ser construidos como se describió anteriormente para la expresión en B. subtilis y utilizados para transformar Paenibacillus macerans por la transformación de protoplasto para producir un elemento hospedero microbiano recombinante que produce 2-butanol. La ruta de la biosintesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa . Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en Alcaligenes (Ralstonia ) eutrophus Los métodos para la expresión del gen y la creación de mutaciones en Alcaligenes euthrophus ya son conocidos en el arte (véase por ejemplo Taghavi et al., Appl . Environ. Microbiol., 60 ( 10 ) : 3585-3591 (1994)) . Los genes para la ruta biosintética de 2-butanol pueden ser clonados en cualquiera de la gama amplia de elementos hospederos descritos anteriormente y electroporados en Alcaligenes euthrophus para generar recombinantes que producen 2-butanol. La ruta de poli (hidroxibutirato) en Alcaligenes ha sido descrita con detalle, una variedad de técnicas genéticas para modificar el genoma de Alcaligenes euthrophus ya son conocidas, y estas herramientas pueden ser aplicadas para diseñar una ruta biosintética de 2-butanol. La ruta de la biosintesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa . Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en Pseudomonas putida Los métodos para la expresión del gen en Pseudomonas putida ya son conocidos en el arte (véase por ejemplo Ben-Bassat et al., patente U.S. No. 6,586,629, la cual es incorporada aquí para referencia) . Los genes de una ruta biosintética de 2-butanol pueden ser insertados en pPCU18, y este ADN ligado puede ser electroporado en las células DOT-Tl C5aARl de Pseudomonas putida electrocompetentes para generar recombinantes que producen 2-butanol. La ruta de la biosintesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa. Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en Lactobacillus plantarum El género de Lactobacillus que pertenece a la familia de Lactobacillales y muchos plásmidos y vectores utilizados en la transformación de Lactobacillus subtilis y Streptococcus pueden ser utilizados para Lactobacillus . Los ejemplos no limitativos de los vectores adecuados incluyen ???ß? y los derivados de los mismos (Renault et al., Gene 183:175-182 (1996) ; y O'Sullivan et al., Gene 137:227-231 (1193) ; pMBBl y pHW800, un derivado de pMBBl (Wyckoff et al. Appl. Envíron. Microbiol. 62:1481-1486 (1996) ) ; pMGl, un plásmido conjugado (Tanimoto et al., J. Bacteriol. 184:5800-5804 (2002) ) ; pNZ9520 (Kleerebezem et al., Appl . Environ. Microbiol. 63: 4581-4584 (1997) ) ; pA 401 (Fujimoto et al., et al., Appl. Environ. Microbiol. 67:1262-1267 (2001) ) ; y pAT392 (Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38:1899-1903 (1994) ) . Varios plásmidos de Lactobacillus plantarum también han sido reportados (van Kranenburg et al., Appl. Environ. Microbiol. 71 ( 3 ) : 1223-1230 (2005) ) . Los diversos genes para una ruta biosintética del 2-butanol pueden ser ensamblados en cualquier vector adecuado, tales como aquellos descritos anteriormente. Los codones pueden ser optimizados para la expresión basada en el índice del codón deducido de las secuencias del genoma de Lactobacillus plantarum o Lactobacillus arizonensis . Los plásmidos pueden ser introducidos en la célula hospedera utilizando los métodos conocidos en el arte, tales como la elect roporación (Cruz-Rodz et al., Molecular Genetics and Genomics 224:1252-154 (1990) , Bringel, et al., Appl. Microbiol. Bíotechnol. 33:664-670 (1990), Alegre et al., FEMS Microbiology Letters 241:73-77 (2004) ) , y conjugación (Shrago et al., Appl. Environ. Microbiol. 52:574-576 (1986) ) . Los genes de la ruta biosintética de 2-butanol también pueden ser integrados en el cromosoma de Lactobacillus utilizando vectores de integración (Hols et al., Appl. Environ. Microbiol. 60:1401-1403 (1990) , Jang et al., Micro. Lett . 24:191-195 (2003) ) . La ruta de la biosíntesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa . Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium , y Enterococcus faecalis El género Enterococcus pertenece a la familia Lactobacillales y muchos plásmidos y vectores utilizados en la transformación de Lactobacillus , Bacíllus subtilis , y Streptococcus, descritos anteriormente, pueden ser utilizados para Enterococcus . Los vectores de expresión para E. faecalis utilizando el gen de nisA de Lactococcus también pueden ser utilizados (Eichenbaum et al., Appl . Environ. Microbiol. 64:2763-2769 (1998) . Adicionalmente , los vectores para el reemplazo del gen en el cromosoma de E. faecium pueden ser utilizados (Nallaapareddy et al., Appl. Environ. Microbiol. 72 : 334-345 (2006) ) . Los diversos genes para una ruta biosintética de 2-butanol pueden ser ensamblados en cualquier vector adecuado, tales como aquellos descritos anteriormente. Los codones pueden ser optimizados para la expresión basado en el índice del codón deducido de las secuencias del genoma de Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium. Los plásmidos pueden ser introducidos en la célula hospedera utilizando los métodos conocidos en el arte, tales como la electroporación, como se describen por Cruz-Rodz et al. (Molecular Genetics and Genomics 224:1252-154 (1990) ) o conjugación, como se describe por Tanimoto et al. (J. Bacteriol. 184:5800-5804 (2002)); y Grohamann et al. {Microbiol . Mol. Biol. Rev. 67:277-3014 (2003) ) . La ruta de la biosintesis de 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa. Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol o 2-butanona en Pediococcus pentosaceus o Pediococcus acidilactici El género Pediococcus pertenece a la familia Lactobacillales y muchos plásmidos y vectores utilizados en la transformación de Bacillus subtilis y Streptococcus descritos anteriormente, pueden ser utilizados para Pediococcus . Un ejemplo no limitativo de un vector adecuado es pHPS9 (Bukhtiyarova et al., Appl . Environ. Microbiol. 60:3405-3408 (1994)) . Varios plásmidos de Pediococcus también han sido reportados (Alegre et al., FEMS Microbiology Lett. 250-151-156 (2005) ; Shareck et al., Crit. Rev. Bíotechnol. 24:155-208 (2004) ) . Los genes para una ruta biosintética de 2-butanol pueden ser ensamblados en cualquier vector adecuado, tales como aquellos descritos anteriormente. Los codones pueden ser utilizados para la expresión basada en el índice del codón deducido de la secuencia del genoma de Pediococcus pentosaceus . Los plásmidos pueden ser introducidos en la célula hospedera utilizando los métodos conocidos en el arte, tales como electroporación (véase, por ejemplo, Osmanagaoglu et al., J. Basic Microbiol. 40:233-241 (2000); Alegre et al., FEMS Microbiol. Lett. 250:151-156 (2005)) y conjugación (González y Kunka, Appl . Environ. Microbiol. 46:81-89 (1983)) . Los genes de la ruta biosintética del 2-butanol también pueden ser integrados en el cromosoma de Pediococcus utilizando vectores de integración (Davidson et al., Antonie van Leeuwenhoek 70:161-183 (1996)) . La ruta de la biosintesis de la 2-butanona puede ser expresada de manera semejante, omitiendo la butanol deshidrogenasa . Medio de fermentación El medio de fermentación en la presente invención debe contener substratos de carbono adecuados. Los substratos adecuados pueden incluir pero no están limitados a monosacáridos , tales como glucosa o fructosa, oligosacáridos tales como lactosa o sucrosa, polisacáridos tales como almidón o celulosa o mezclas de los mismos y mezclas no purificadas de materiales en almacenamiento no renovables tales como un material permeado del suero del queso, el licor de una infusión de maíz, las molasas de la remolacha, y la malta de la cebada. Adicionalmente , el substrato del carbón también puede ser de substratos de un carbón tales como dióxido de carbono, o de metanol para el cual la conversión metabólica en los compuestos intermedios bioquímicos clave ha sido demostrada. Además, para los substratos de uno y dos carbonos, los organismos met ilotróficos también se sabe que utilizan un número de otros compuestos que contienen carbón tales como metilamina, glucosamina y una variedad de aminoácidos para la actividad metabólica. Por ejemplo, las levaduras metilotróficas se sabe que utilizan el carbón de la metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion et al., Microb. Growth Cl Compd. , [Int. Symp.], 7th (1993), 415-32, Editor (es) : urrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher; Intercept, Andover, UK) . De manera semejante, varias especies de Candida metabolizarán la alanina o el ácido oleico (Sulter et al., Arch. Microbiol. 153:485-489 (1990) ) . Por consiguiente, está contemplado que la fuente de carbón utilizada en la presente invención puede abarcar una amplia variedad de substratos que comprenden carbono y solamente estará limitado por la elección del organismo. Aunque está contemplado que la totalidad de los substratos de carbono mencionados anteriormente y las mezclas de los mismos sean adecuadas en la presente invención, los substratos de carbón preferidos son glucosa, fructosa, y sucrosa, asi como las mezclas de cualquiera de estos azúcares. La sucrosa puede ser obtenida de los materiales en almacenamiento tales como la caña de azúcar, remolacha, mandioca y sorgo dulce. La glucosa y la dextrosa pueden ser obtenidas por medio de la sacarificación de los materiales en almacenamiento a base de almidón incluyendo granos como el maíz, trigo, centeno, cebada, y avenas. Además, los azúcares fermentables pueden ser obtenidos de los materiales celulósicos y la biomasa lignocelulósica por medio de los procesos de pret ratamiento y sacarificación, como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente US del mismo solicitante y copendiente US 20070031918A1 , que es incorporada aquí para referencia. Biomasa se refiere a cualquier material celulósico o lignocelulósico e incluye los materiales que comprenden celulosa, y que comprenden además opcionalmente hemicelulosa , lignina, almidón, oligosacáridos y/o monosacáridos. La biomasa también puede comprender componentes adicionales, tales como proteina y/o lipidos. La biomasa puede ser derivada de una sola fuente, o la biomasa puede comprender una mezcla derivada de más de una fuente; por ejemplo, la biomasa puede comprender una mezcla de mazorcas de maíz y forraje de maíz, o una mezcla de césped y hojas. La biomasa incluye, pero no está limitada a, cultivos bioenergéticos , residuos agrícolas, desechos sólidos municipales, desechos sólidos industriales, las suspensiones de la manufactura del papel, desechos de astilleros, desechos de madera y forestales. Los ejemplos de la biomasa incluyen, pero no están limitados a, gramos de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cultivos tales como las cáscaras del maíz, forraje de maíz, céspedes, trigo, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, paja de arroz, switchgrass (panicum virgatum) , papel desechable, bagazo de la caña de azúcar, sorgo, soya, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raices, hojas, virutas de madera, aserrín, arbustos y matorrales, vegetales, frutas, flores y estiércol de animales. Además de una fuente apropiada de carbón, el medio de fermentación debe contener minerales adecuados, sales, cofactores, amortiguadores y otros componentes, conocidos por aquellos expertos en el arte, adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de una ruta enzimática necesaria para la producción de 2-butanol o 2-butanona . Condiciones del cultivo Típicamente, las células se hacen crecer en una temperatura en el intervalo de aproximadamente 25 °C hasta aproximadamente 40 °C en un medio apropiado. El medio de crecimiento adecuado en la presente invención es el medio preparado comercialmente , común, tal como el caldo de Luria Bertani (LB) , el caldo de dextrosa de Sabourad (SD) o el caldo del medio de levadura (YM) . Otro medio de crecimiento sintético o definido también puede ser utilizado, y el medio apropiado para el crecimiento del microorganismo particular será conocido por un experto en el arte de la ciencia de la microbiología o de la fermentación. El uso de agentes que se sabe que modulan la represión del catabolito de manera directa o indirecta; por ejemplo, el 2 ' : 3 ' -monofosfato de adenosina cíclica, también puede ser incorporado en el medio de fermentación . Los intervalos de pH adecuados para la fermentación están entre pH 5.0 hasta pH 9.0, en donde se prefieren pH 6.0 hasta pH 8.0 como la condición inicial. Las fermentaciones pueden ser efectuadas bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas, en donde las condiciones anaeróbicas o microanaeróbicas son preferidas. Fermentaciones continuas y por lotes, industriales El presente proceso emplea un método por lotes de fermentación. Una fermentación clásica por lotes es un sistema cerrado en donde la composición del medio es colocada al inicio de la fermentación y no sometida a las alteraciones artificiales durante la fermentación. Así, al inicio de la fermentación, el medio es inoculado con el organismo u organismos deseados, y se deja que ocurra la fermentación sin agregar nada al sistema. Sin embargo, típicamente una fermentación "por lotes" es un lote con respecto a la adición de la fuente de carbono y frecuentemente se hacen intentos para controlar factores tales como el pH y la concentración del oxígeno. En los sistemas por lotes las composiciones del metabolito y la biomasa del sistema cambian constantemente hasta el tiempo en el que se detiene la fermentación. Dentro de los cultivos por lotes las células son moderadas por medio de una fase de retardo estática hasta una fase logarítmica de crecimiento elevado y finalmente hasta una fase estacionaria en donde la velocidad de crecimiento es reducida o detenida. Si las células no son tratadas en la fase estacionaria, eventualmente morirán. Las células en la fase logarítmica generalmente son responsables de la expansión de la producción del producto final o del producto intermedio. Una variación del sistema por lotes estándares es el sistema de lotes de alimentación. Los procesos de fermentación por lotes de alimentación también son adecuados en la presente invención y comprenden un sistema por lotes típico con la excepción que el substrato es agregado en incrementos cuando la fermentación progresa. Los sistemas de alimentación por lotes son útiles cuando la represión del catabolito es apta para inhibir el metabolismo de las células y en donde sea deseable para tener cantidades limitadas del substrato en el medio. La medición de la concentración real del substrato en los sistemas de alimentación por lotes es difícil y por lo tanto se estima con base en los cambios de los factores medibles tales como el pH, el oxígeno disuelto y la presión parcial de los gases de desecho tales como CO2. Las fermentaciones por lotes y por lotes de alimentación son comunes y son bien conocidas en el arte y se pueden encontrar ejemplos en Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA. , o Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol. , 36:227, (1992), incorporada aquí para referencia.
Aunque la presente invención es efectuada en un modo por lotes, está contemplado que el método podría ser adaptable a métodos continuos de fermentación. La fermentación continua es un sistema abierto en donde un medio de fermentación definido es agregado continuamente a un biorreactor y una cantidad igual del medio acondicionado es removida simultáneamente para el procesamiento. La fermentación continua generalmente mantiene a los cultivos a una densidad elevada constante. La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan el crecimiento de las células o la concentración del producto final. Por ejemplo, un método mantendrá a un nutriente limitante tal como la fuente del carbón o el nivel del nitrógeno a una tasa fija y permitirá que todos los otros parámetros sean moderados. En otros sistemas, un número de factores que afectan el crecimiento pueden ser alterados continuamente mientras que la concentración de las células, medida por la turbidez del medio de cultivo, es mantenida constante. Los sistemas continuos se esfuerzan en mantener las condiciones de un crecimiento en estado permanente y así la pérdida de las células debido a que el medio es extraído, debe ser balanceado contra la velocidad de crecimiento de las células en la fermentación. Los métodos de modulación de los nutrientes y los factores del crecimiento para los procesos de fermentación continua así como las técnicas para maximizar la velocidad de formación del producto son bien conocidos en el arte de la microbiología industrial y una variedad de métodos son detallados por Brock, supra. Está contemplado que la presente invención puede ser practicada utilizando procesos ya sea por lotes, por lotes de alimentación o continuos y que cualquier modo conocido de fermentación podría ser adecuado. Adicionalmente, está contemplado que las células pueden ser inmovilizadas sobre un substrato porque los catalizadores de las células totales y sometidos a las condiciones de fermentación para la producción de 2-butanol o 2-butanona. Métodos para el aislamiento de 2-butanol y 2-butanona a partir del medio de fermentación El 2-butanol bioproducido puede ser aislado del medio de fermentación utilizando los métodos conocidos en el arte para las fermentaciones de ABE (véase por ejemplo, Durre Appl. Microbiol. Biotechnol. 46:639-648 (1998), Groot et al., Process Biochem. 27:61-75 (1992), y las referencias de allí) . Por ejemplo, los sólidos pueden ser removidos del medio de fermentación por centrifugación, filtración, decantación, o semejantes. Luego, el 2-butanol puede ser aislado del medio de fermentación utilizando los métodos tales como la destilación, destilación azeotrópica, extracción líquido-líquido, adsorción, destilación del gas, evaporación a través de una membrana, o pervaporación . Estos mismos métodos pueden ser adaptados para aislar la 2-butanona bioproducida del medio de fermentación.
E emplos La presente invención está definida además en los siguientes ejemplos. Se debe entender que estos ejemplos, aunque indican una modalidad preferida de la invención, están dados solamente a manera de ilustración. De la descripción anterior y de estos ejemplos, un experto en el arte puede averiguar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu y alcance de la misma, pueden hacer varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a varios usos y condiciones. Métodos generales Las técnicas de clonación molecular y del ADN, recombinantes, estándares, descritas en los ejemplos son bien conocidas en el arte y son descritas por Sambrook, J. , Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY, (1989) (Maniatis); y por T. J. Silhavy, M. L. Bennan, y L. W. Enquist, Experi ents with Gene Fusíons, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); y por Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. por Greene Publishing Assoc. y iley-Interscience (1987) . Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y el crecimiento de los cultivos bacterianos ya son bien conocidos en el arte. Las técnicas adecuadas para su uso en los siguientes ejemplos pueden ser encontradas como se describe en Manual of Methods for General Bacteriology (Philipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Phillipps, eds . ) , American Society for Microbiology, Washington, DC ( 1994 ) ) o por Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda edición, Sinauer Associates, Inc . , Sunderland, MA ( 1989) . Todos los reactivos, enzimas de restricción y materiales descritos para el crecimiento y mantenimiento de las células bacterianas fueron obtenidos de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI ) , BD Diagnostic Systems (Sparks, MD) , Life Technologies (Rockville, MD) , o Sigma Chemical Company (St . Louis, MO) a menos que se especifique de otra manera . Las cepas bacterianas son obtenidas de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) a menos que se señale de otra manera . Los cebadores de ol igonucleót idos descritos en los s iguientes ej emplos están dados en la tabla 4 . Todos los cebadores de ol igonucleót idos fueron s inteti zados por Sigma-Genosys ( Woodlands , TX ) . Tabla 4 Cebadores para la clonación y selección Gen Neniare SBC ID Descripción fpkirl r NO: budB B1 CACCATGGACAAACAGTA 15 fcu3B TCCGGTACGCC delantero budB B2 CGAAGGGCGATAGCTTTA 16 budB CCAATCC inverso budA B3 CACCATGAATCATTCTGC 17 budA TGAATGCACCTGCG budA B4 GATACTGTTTGTCCATGT 18 budA GACC inverso budC B5 CACCATGAAAAAAGTCGC 19 budC ACTTGTTACC delantero budC B6 TTAGTTAAATACCAT 20 budC inverso pddA B7 CACCATGAGATCGA 21 pddABC AAAGATTTG delantero pddC B8 CTTAGAGAAGTTAATCGT 22 pddABC CGCC sadh B9 CACCATGAAAGCCCTCCA 23 sadh GTACACC delantero sadh B10 CGTCGTGTCATGCCCGG 24 sadh G inverso budA B11 GATCGAATTCGTTTAAACT 25 budABC TAG I I I I CTACCGCACG delantero budC B12 GATCGCATGCAAGCTTTC 26 txriABC ATATAGTCGGAATTCC inverso pddA B13 GATCGAATTCGTTTAAACA 27 ddABC AAGGAGGTCTGATTCATG delantero AGATCG pddC B14 GATCGGATTCTTAATCGT 28 pddABC CGCC inverso sadh B1S GATCGGATCCAAAGGAGG 29 sadh TCGGGCGCATGAAAGCC delantero C sadh B16 GATCTCTAGAAAGCTTTC 30 sadh AGCCCGGGACGACC inverso — BenF ACTTTCTTTCGCCTGTTTC 31 AC BenBPR CATGAAGCTTGTTTAAACT 32 CGGTGACCTTGAAAATAA TGAAAACTTATATTG 1 1 1 1 GAAAATAATGAAAACTTAT ATTG budAB BABC F GAGCTCGAATTCAAAGGA 33 budAB GGAAGTGTATATGAATCA delantero TTC budAB BAB R GGATCCTCTAGAATTAGT 34 kxdAB TAAATACCATCCCGCCG inverso budC BC Spe F ACTAGTAAAGGAGGAAAG 40 budC AGTATGAAGAAGGTCGCA delantero CT budC BC Xba R TCTAGAAAGCAGGGGCAA 41 GCCATGTC inverso pddAB DDo For AAGCTTAAAGGAGGCTGA 44 pddABC-ddrAB C- TTCATGAGATCGAAAAGA delantero ddrAB TT pddAB DDo Rev TCTAGATTATTCATCCTGC 45 pddABC-ddrAB C- TGTTCTCC inverso ddrAB chnA ChnA F CATCAATTGACTACGTAG 54 chnA TCGTACGTGTAAGGAGGT delantero TTGAAATGGAAAAAATTAT G chnA ChnA CATGCTAGCCCCGGGTAT 55 chnA CTTCTACTCAI 1 1 1 1 I ATTT inverso CG — Top ter F1 CTAGAAGTCAAAAGCCTC 58 delantero CGACCGGAGGC I 1 1 I GA Top ter F2 CTGCTCGAGTTGCTAGC 59 delantero AAGTTTAAACAAAAAAAA GCCCGCTCATTAGGCGG GCTGAGCT Bot ter R1 CAGCCCGCCTAATGAGC 60 inverso GGGC I 1 I I 1 1 1 I GTTTAA AC Bot ter R2 TTGCTAGCAACTCGAGCA 61 inverso GTCAAAAGCCTCCGGTC GGAGGC I 1 1 I GACTT KA-AT OT872 CTCCGGAATTCATGTCTG 127 AnüjToalcohol ACGGACGACTCACCGCA cinasa/liasa operen delantero KA-AT OTB73 TTCCAATGCATTGGCTGC 128 Aminoalcc ol AGTTATCTCTGTG CACG A cinasa/liasa GTGCCGATGA operen inverso KA OT879 AACAGCCAAGCTTGGCT 129 Amncaloc ol GCAGTCATCGCGCATTCT cinasa CCGGG inversa AT OT880 TCTCCGGAATTCATGACG 130 ¾minoalccol TCTGAAATGACAGCGACA liasa GAAG delantera pBAD. OT909 GCTAACAGGAGGAAGAA 131 agregar a siti<|> HísB TTCATGGGGGGTTCTC EcoRI para reemD.sitio ccfc pBAD. OT910 GAGAACCCCCCATGAATT 132 agregar a sitio HIsB CTTCCTCCTGTTAGC EcoRI para rearo,sitio NJDI BudAB N84seqR3 GGACCTGCTTCGCTTTAT 59 CG APT APTfor GCGCGCCCGGGAAGAAG 162 ??G G AG CTCTTC ACC ATG AAC delantero AAACCACAGTCTTGG APT APTrev GCGCGCCCGGGTTCATG 163 ??G CCACCTCTGCG inverso Tabla 5 Cebadores de Secuenciación Gen SE ID cfribre Secuencia especifico ND: M13 delantero GTAAAACGACGGCCAGT — 35 M13 inverso AACAGCTATGACCATG — 36 N83 SeqF2 GCTGGATTACCAGCTCGACC - 37 N83 SeqF3 CGGACGCATTACCGGCAAAG - 38 N8 Seq R2 GCATCGAGATTATCGGGATG — 65 84 SeqR4 CGAAGCGAGAGAAGTTATCC ~ 39 Trc F TTGACAATTAATCATCCGGC todos 42 Trc R CTTCTCTCATCCGCCAAAAC todos 43 pddABC- DOko seq F2 GCATGGCGCGGATTTGACGAAC 46 ddrAB pddABC- DDko seq F5 CATTAAAGAGACCAAGTACGTG 47 ddrAB pddABC- DDko seq F7 ATATCCTGGTGGTGTCGTCGGCGT 48 ddrAB pddABC- DDko seq F9 TCTTTGTCACCAACGCCCTGCG 49 ddrAB pddABC- DDko seq R1 GCCCACCGCGCTCGCCGCCGCG 50 ddrAB pddABC- DDko seq 3 CCCCCAGGATGGCGGCTTCGGC 51 ddrAB pddABC- DDko seq R7 GGGCCGACGGCQATAATCACTT 52 ddrAB pddABC- DDko seq R10 TTCTTCGATCCACTCCTTAACG 53 ddrAB chnSeq F1 CTCAACAGGGTGTAAGTGTAGT chrvA 56 chnSeq R1 CGTTTTGATATAGCCAGGATGT c nA 57 pCL1925 vec F CGGTATCATCAACAGGCTTACC todos 62 pCL1925 vec R1 Aüüü 1 1 1 1 CCCA 1 CACGACGT todos 63 PCL1925 vec R2 CGCAATAGTTGGCGAAGTAATC todos 64 APTseqRev GCTAGAGATGATAGC APT 160 APTseqFor GGAAGAGACTATCCAGCG APT 161 Métodos para la determinación de la concentración de 2-butanol y 2-butanona en el medio de cultivo La concentración de 2-butanol y 2-butanona en el medio de cultivo puede ser determinada por un número de métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, un método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utiliza una columna Shodex SH-1011 con una columna protectora Shodex SH-G, ambas compradas de Waters Corporation (Milford, MA) , con una detección del índice de refracción (IR). La separación cromatográfica se logró utilizando H2S04 0.01 M como la fase móvil con una velocidad de flujo de 0.5 ml/min y una temperatura de la columna de 50 °C. Bajo las condiciones utilizadas, la 2-butanona y el 2-butanol tuvieron tiempos de retención de 39.5 y 44.3 min, respectivamente. Alternativamente, los métodos de cromatografía en fase gaseosa (GC) están disponibles. Por ejemplo, un método de GC específico utiliza una columna HP-INNOWax (30 m x 0.53 rom id, espesor de la película de 1 µp?, Agilent Technologies, ilmington, DE) , con un detector de ionización de la flama (FID) . El gas portador fue helio a una velocidad de flujo de 4.5 ml/min, medido a 150 °C con una presión hidrostática constante; la separación del inyector fue de 1:25 a 200 °C; la temperatura del horno fue de 45 °C durante 1 minuto, 45 hasta 220 °C a 10 °C/minuto, y 220 °C durante 5 minutos; y la detección de FID se empleó a 240 °C con 26 ml/min de gas de composición de helio. Los tiempos de retención de la 2-butanona y 2-butanol fueron de 3.61 y 5.03 minutos, respectivamente . La 2-butanona también puede ser detectada por derivación con 3-metil-2-benzotriazolinona hidrazona (MBTH) . Una solución acuosa que contiene 2-butanona es mezclada con un volumen igual de una solución acuosa de 6 mg/ml de MBTH en 375 mM de glicina-HCl (pH 2.7) y se incuba a 100 °C durante 3 minutos. Las muestras derivadas de MBTH resultantes son analizadas sobre una columna Supelosil LC-18-D5 de 5 µp\, de 25 cm x 4.6 mm (id) (Supelco) utilizando una fase móvil de 55 % de acetonitrilo en agua a una velocidad de flujo de 1 ml/min. El derivado de 2-butanona aparece como dos picos (isómeros cis y trans) con tiempos de retención de aproximadamente 12.3 y 13.3 min y una absorbancia máxima de 230 y 307 nm. El significado de las abreviaturas es como sigue: "s" significa segundo (s), "min" significa minuto (s), "h" significa hora(s), "psi" significa libras por pulgada cuadrada, "nm" significa nanómetros, "d" significa dia(s), "µ? ' significa microlitro ( s ) , "mi" significa mililitro ( s ) , "1" significa litro (s), "mm" significa milímetro ( s ) , "nm" significa nanómetros, "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol (es) , "µ????" significa micromol ( es ) , "g" significa gramo (s), " g" significa microgramo ( s ) y "ng" significa nanogramo ( s ) , "PCR" significa reacción en cadena de la polimerasa", "OD" significa densidad óptica, "OD60o" significa la densidad óptica medida a una longitud de onda de 600 nm, "kDa" significa kilodaltons , "g" significa la constante gravitacional, "bp" significa par (es) base, "kbp" significa par (es) de kilobase (es) , "% p/v" significa por ciento en peso/volumen, "% v/v" significa por ciento en volumen/volumen", "% peso" significa por ciento en peso, "HPLC" significa cromatografía líquida de alta resolución, y "GC" significa cromatografía en fase gaseosa. El término "selectividad molar" es el número de moles del producto producidos por mol del substrato de azúcar consumido y es reportado como un porcentaje. Ejemplo 1 Clonación y expresión de la acetolactato sintasa El propósito de este ejemplo fue la clonación y expresión en E. coli del gen budB que codifica la enzima de acetolactato sintasa. El gen de budB fue amplificado por el ADN genómico de la cepa ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae utilizando PCR. La secuencia de budB que codifica la acetolactato sintasa fue amplificada a partir del ADN genómico de Klebsiella pneumoniae (ATCC 25955) por PCR utilizando el par de cebadores Bl (SEC ID NO: 15) y B2 (SEC ID NO: 16) . Otros reactivos de amplificación por PCR (por ejemplo la ADN polimerasa de Kod HiFi (Novagen Inc., Madison, WI; catálogo no. 71805-3)) fue suministrado en los kits de los fabricantes y utilizados de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN genómico de Klebsiella pneumoniae se prepara utilizando el kit de Gentra Puregene Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; número de catalogo D-5000A) . La amplificación fue llevada a cabo en una máquina termocicladora de ADN GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) . La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) y la secuencia predicha de los aminoácidos de la enzima están dados como la SEC ID NO: 3 y la SEC ID NO: 4, respectivamente. Para los estudios de la expresión se utilizó la tecnología de clonación de Gateway (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA) . El vector de entrada pENTR/SD/D-TOPO permite la clonación direccional y proporciona una secuencia de Shine-Dalgarno para el gen de interés. El vector de destino pDEST de 14 utilizó un promotor de T7 para la expresión del gen sin etiqueta. El cebador delantero incorporó cuatro bases (CACC) adyacentes inmediatamente al codón de partida traduccional para permitir la clonación direccional del producto de PCR de la región de codificación de la acetolactasa budB en pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen) , generando el plásmido pENTRSDD-TOPObudB . La construcción de pENTR fue transformada en las células ToplO de E. coli (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los transformantes se hicieron crecer toda la noche y el ADN del plásmido se prepara utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Valencia, CA; catálogo no. 27106) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para crear un clon de expresión, la región de codificación, de budB de pENTRSDD-TOPObudB se transfiere al vector pDEST 14 por la recombinación in vitro utilizando la mezcla de LR Clonase (Invitrogen, Corp. Carlsbad, CA) . El vector resultante, pDEST14budB, se transforma en las células BL-21-AI (Invitrogen Corp.) . Las células BL-21-A1 llevan una copia cromosómica de la T7 ARN polimerasa bajo el control del promotor araBAD inducido por arabinosa. Los transformantes son inoculados en el medio LB suplementado con 50 µq/ml de ampicilina y se hicieron crecer toda la noche. Una alícuota del cultivo toda la noche es utilizado para inocular 50 mi del medio de LB suplementado con 50 de ampicilina. El cultivo es incubado a 37 °C con agitación hasta que la OD6oo alcance 0.6-0.8. El cultivo es dividido en dos porciones de 25 mi y se agrega arabinosa a uno de los frascos a una concentración de 0.2 % p/v. El frasco de control negativo no es inducido con arabinosa. Los frascos son incubados durante 4 h a 37 °c con agitación. Las células fueron colectadas por centrifugación y las pelotillas de las células son resuspendidas en MOPS 50 mM, en un amortiguador de pH 7.0. Las células son alteradas ya sea por sonicación o por el paso a través de un aparato French Pressure Cell. Cada lisado celular es centrifugado produciendo el sobrenadante y la pelotilla o la fracción insoluble. Una alícuota de cada fracción (el lisado celular completo, de las células inducidas y de control), es resuspendido en SDS que es el amortiguador de la carga (MES) ( Invitrogen) , se calienta a 85 °C durante 10 minutos y se somete a análisis de SDS-PAGE (NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Gel, catalogo no. NP0322Box, Invitrogen) . Una proteína del peso molecular esperado, como es deducido de la secuencia de los ácidos nucleicos está presente en el cultivo inducido pero no en el control no inducido. La actividad de la acetolactato sintasa en los extractos libres de la célula es medida utilizando el método descrito por Bauerle et al. (Bauerle et al. (1964) Biochem. Biophys . Acta 92:142-149) . La concentración de la proteína es medida ya sea por el método de Bradford o por el kit de Bicinchoninic (Sigma, catálogo no. BCA-1; St. Louis, MO) utilizando la albúmina de suero de bovino (BSA) (Bio-Rad, Hercules, CA) , como el estándar. Ejemplo 2 Clonación y expresión de la acetolactato descarboxilasa El propósito de este ejemplo fue la clonación y expresión en E. coli del gen budB que codifica la enzima de acetolactato descarboxilasa. El gen de budB fue amplificado a partir del ADN genómico de la cepa ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae utilizando PCR. La secuencia budA que codifica la acetolactato descarboxilasa fue clonada de la misma manera que se describió para budB en el ejemplo 1, excepto que los cebadores utilizados para la amplificación de PCR fue de B3 (SEC ID NO: 17) y B4 (SEC ID NO: 18) . La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) y la secuencia predicha de los aminoácidos de la enzima están dados como SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2, respectivamente. El plásmido resultante fue nombrado pENTRSDD-TOPObudA. La actividad de la acetolactato descarboxilasa en los extractos libres de la célula es medida utilizando el método descrito por Bauerle et al., supra. Ejemplo 3 (Profético) Clonación y expresión de la butandiol deshidrogenasa El propósito de este ejemplo profético es describir como se clona y se expresa en E. coli del gen budC que codifica la enzima de butandiol deshidrogenasa. El gen de budC es amplificado a partir del ADN genómico de la cepa IAM1063 de Klebsiella pneumoniae utilizando PCR. La secuencia de budC que codifica la butandiol deshidrogenasa es clonada y expresada de la misma manera que la descrita para budA en el ejemplo 1, excepto que los cebadores utilizados para la amplificación por PCR son B5 (SEC ID NO: 19) y B6 (SEC ID NO: 20) y el ADN del molde genómico es de IAM1063 de Klebsiella pneumoniae (el cual es obtenido del Institute of Applied Microbiology Culture Collection, Tokio, Japón) . El ADN genómico de IAM1063 de Klebsiella pneumoniae es preparado utilizando el kit de Gentra Puregene Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; número de catalogo D-5000A) . La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierta (ORF) y la secuencia de aminoácidos predicha de la enzima están dados como la SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 6, respectivamente . La actividad de la butandiol deshidrogenasa en los extractos de las células libres es medida espectrofotométricamente por el siguiente consumo de NADH a una absorbancia de 340 nm. Ejemplo 4 (Profético) Clonación y expresión de la butandiol deshidrogenasa El propósito de este ejemplo profético es describir como clonar y expresar en E. colí los genes de pddA, pddB y pddC que codifican la butandiol deshidratase . Los genes de pddA, pddB y pddC son amplificados a partir del ADN genómico del ATCC 8724 de Klebsiella oxytoca utilizando PCR. Las secuencias de pddA, pddB y pddC que codifican la butandiol deshidratasa son clonados y expresados de la misma manera que se describió para budA en el ejemplo 1, excepto que el ADN del molde genómico es de ATCC 8724 de Klebsiella oxytoca, y los cebadores PCR son B7 (SEC ID NO: 21) y B8 (SEC ID NO: 22) . El ADN genómico de Klebsiella oxytoca es preparado utilizando el kit de Gentra Puregene Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; número de catalogo D-5000A) . Un producto de PCR único incluyendo la totalidad de los tres marcos de lectura abierta (ORF) es clonado, de modo que la totalidad de las tres regiones de codificación sean expresadas como un operón desde un promotor único sobre el plásmido de expresión. Las secuencias de nucleótidos de los marcos de lectura abierta para las tres subunidades son provistas como las SEC ID NOs: 7, 9, y 11, respectivamente y las secuencias de aminoácidos predichas de las tres subunidades de la enzima están provistas como las SEC ID NOs: 8, 10 y 12, respectivamente. La actividad de la butandiol deshidratasa en los extractos libres de células es medida derivando el producto de cetona con 2 , -dinitrofenilhidrazina (DNPH) . Brevemente, 100 µ? de a mezcla de reacción, el extracto celular que contienen aproximadamente 0.0005 unidades de enzima, el amortiguador de fosfato de potasio 40 mM (pH 8.0), 2 µq de adenosilcobalamina , 5 µg de 2 , 3-butandiol , y 1 µ? de albúmina del suero de bovino, es apagada por la adición de un volumen igual de 0.05 % en peso de DNPH en HC1 1.0 N. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, el color es desarrollado por la adición de 100 µ? de NaOH 4 N. La cantidad del producto es determinada a partir de la absorbancia de la solución final a 550 nm comparado con la curva estándar preparada con 2-butanona. Todas las reacciones son llevadas a cabo a 37 °C bajo una luz roja difusa. Ejemplo 5 (Profético) Clonación y expresión de la butanol deshidrogenasa El propósito de este ejemplo profético es describir como clonar y expresar en E. coli el gene de sadh que codifica la butanol deshidrogenasa. El gen sadh es amplificado a partir del ADN genómico de la cepa 219 de Rhodococcus ruber utilizando PCR. La secuencia sadh que codifica la butanol deshidrogenasa es clonada y expresada de la misma manera que la descrita para budA en el ejemplo 1, excepto que el ADN del molde genómico es de la cepa 219 de Rhodococcus ruber (Meens, Institut fuer Mikrobiologie, Universitaet Hannover, Hannover, Alemania) y los cebadores son B9 (SEC ID NO: 23) y B10 (SEC ID NO: 24) . El ADN genómico de Rhodococcus ruber es preparado utilizando el kit de aislamiento del ADN microbiano Ultra Clean™ (MO BIO Laboratories Inc., Carlsbad, CA) , de acuerdo con el protocolo del fabricante. La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierta (ORF) y la secuencia de aminoácidos predicha de la enzima están dados como la SEC ID NO: 13 y la SEC ID NO: 14, respectivamente. La actividad de la butanol deshidrogenasa en los extractos de la célula libre es medida siguiendo el incremento en la absorbancia a 340 nm que resulta de la conversión de NAD a NADH cuando la enzima es incubada con NAD y 2-butanol. Ejemplo 6 (profético) Construcción de un vector de transformación para los genes en una ruta biosintética de 2-butanol El propósito de este ejemplo es describir la preparación de un vector de transformación para los genes en una ruta biosintética de 2-butanol (es decir, la ruta 3, como se describió anteriormente). De manera semejante a la mayoría de los organismos, E. coli convierte la glucosa inicialmente al ácido pirúvico. Las enzimas requeridas para convertir el ácido pirúvico al 2-butanol siguiendo la ruta 3, es decir, la acetolactato sintasa, la acetolactato descarboxilasa , la butandiol deshidrogenasa, la butandiol deshidratasa , y la butanol deshidrogenasa, son codificadas por los genes de budA, budB, budC, pddA, ppdB, pddC y sadh. Para simplificar la construcción de la ruta biosintética de 2-butanol en un organismo recombinante , los genes que codifican las 5 etapas en la ruta son separados en dos operones. La ruta superior comprende las primeras tres etapas catalizadas por la acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, y butandiol deshidrogenasa . La ruta inferior comprende al menos dos etapas catalizadas por la butandiol deshidratasa y la butanol deshidrogenasa. Las secuencias de codificación son amplificadas por PCR con los cebadores que incorporan los sitios de restricción para la clonación posterior, y los cebadores delanteros contienen un ciclo de aglutinación del ribozoma de E. coli optimizado (AAAGGAGG) . Los productos de PCR son clonados en TOPO en el vector de pCR4Blunt-TOPO y transformados en las células ToplO ( Invitrogen) . El ADN del plásmido es preparado a partir de los clones de TOPO, y la secuencia del fragmento de PCR clonado es verificada. Las enzimas de restricción y la 1 igasa de ADN de T4 (New England, Biolabs, Beverly, MA) son utilizados de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para los experimentos de clonación, los fragmentos de la extracción son purificados en un gel utilizando el kit de extracción en un gel de QIAquick (Qiagen) . Después de la confirmación de la secuencia, las regiones de codificación son subclonadas en un vector de pUC19 modificado como una plataforma de clonación. El vector pUC19 es modificado por una digestión de Hindl I I /SapI , seguido por el tratamiento con la ADN polimerasa para el llenado de los extremos. El fragmento del vector de 2.4 kB es purificado con un gel y religado creando pUC19dHS. Alternativamente, el vector pUC19 es modificado por una digestión de Sphl/SapI, seguido por el tratamiento con la ADN polimerasa de Klenow para separar los extremos. El fragmento del vector de 2.4 kB es purificado en un gel y religado creando UC19dSS. Las digestiones remueven el promotor lac adyacente al MCS (sitios de clonación múltiples), previniendo la transcripción de los operones desde el vector. Ruta superior: Las regiones de codificación de budABC son amplificadas a partir del ADN genómico de Klebsiella pneumoniae por PCR utilizando el par de cebadores Bll y B12 (tabla 4), provistos como las SEC ID NOs: 25 y 26, respectivamente. El cebador delantero incorpora un sitio de restricción de EcoRI y un sitio de aglutinación del ribosoma (RBS) . El cebador inverso incorpora un sitio de restricción de Sphl. El producto de PCR es clonado en pCR4 Blunt-TOPO creando pCR4 Blunt-TOPO-budABC. Para construir el operón de la ruta superior el pCR4 Blunt-TOPO-budABC es digerido con EcoRI y Sphl liberando un fragmento de budABC de 3.2 kbp . El vector de pucl9dSS también es digerido con EcoRI y Sphl, liberando un fragmento del vector de 2.0 kbp. El fragmento de budABC y el fragmento del vector son ligados conjuntamente utilizando la T4 ADN ligasa (New England Biolabs) para formar pUCl 9dSS-budABC .
Ruta inferior: Las regiones de codificación de pddABC son identificadas a partir del ADN genómico del ATCC 8724 de Klebsiella oxytoca por PCR utilizando los cebadores B13 y B14 (tabla 4), provistos como las SEC ID NOs : 27 y 28, respectivamente, creando un producto de 2.9 kbp. El cebador delantero incorpora los sitios de restricción de EcoRI y Pmel y un RBS. El producto de PCR es clonado en pCRBlunt II-TOPO creando pCRBluntll-pdd. El gen de sadh es amplificado a partir del ADN genómico de la cepa 219 de Rhodococcus ruber por PCR utilizando los cebadores B15 y B16 (tabla 4), provistos como las SEC ID NOs: 29 y 30, respectivamente, creando un producto de 1.0 kbp. El cebador delantero incorpora un sitio de restricción de BamHI y un RBS. El cebador inverso incorpora un sitio de restricción de Xbal. El producto de PCR es clonado en pCRBlunt II-TOPO creando pCRBluntll-sadh . Para construir el operón de la ruta inferior, un fragmento de EcoRI de 2.9 kbp y el fragmento de BamHI de pCRBluntll-pdd, un fragmento de BamHI y de Xbal de 1.0 kbp de pCRBlunt I I-sadh, y el fragmento grande de una digestión de EcoRI y de Xbal de pUC19dHS son ligados conjuntamente. La ligación de tres vías crea pUCl 9dHS-pdd-sadh . El vector de pUCl 9dSS-budABC es digerido con Pmel y HindIII liberando un fragmento de 3.2 kbp que es clonado en pBenBP, un vector de transferencia de E. coli-B. subtilis . El plásmido pBenBP es creado por la modificación del vector pBE93, el cual es descrito por Nagarajan (WO 93/2463, ejemplo 4). Para generar pBenBP, la secuencia de la señal del promotor de la proteasa neutral de Bacillus amyloliquefaciens (NPR) y el gen de phOA son removidos de pBE93 o una digestión de NcoI/HindIII . El promotor de NPR es amplificado por PCR a partir de pBE93 por los cebadores BenF y BenBPR, proporcionando las SEC ID NOs: 31 y 32, respectivamente. El cebador BenBPR incorpora los sitios de BstEII, Pmel y HindIII corriente abajo del promotor. El producto de PCR es digerido con Ncol y HindIII, y el fragmento es clonado en los sitios correspondientes en el vector pBE93 para crear pBenBP. El fragmento del operón superior es subclonado en los sitios de Pmel y HindIII en pBenBP creando pBen-budABC. El vector de pUCl 9dHS-pdd-sadh es digerido con Pmel y HindIII liberando un fragmento de 3.9 kbp que es clonado en los sitios Pmel y HindIII de pBenBP, creando pBen-pdd-sadh . Ejemplo 7 (Profético) Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol en una ruta biosintética en E. coli El propósito de este ejemplo profético es describir cómo expresar una ruta biosintética de 2-butanol en E. coli. Los plásmidos de pBen-budABC y pBen-pdd-sadh, preparados como se describe en el ejemplo 6, son transformados separadamente en NM522 de E. coli (ATCC No. 47000), y la expresión de los genes en cada operón es verificado por el análisis de SDS-PAGE y el ensayo de la enzima. Después de la confirmación de la expresión de todos los genes, pBen-budABC es digerido con EcoRI y HindIII para liberar el fragmento del promotor de NPR-budABC. El fragmento es dividido en los extremos utilizando el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa (New England Biolabs, Catalogo No. M0210S) . El plásmido pBen-pdd-sadh es digerido con EcoRI y dividido de manera semejante para crear un fragmento del vector dividido en los extremos, linearizado. Los fragmentos del vector y de NPR-budABC son ligados, creando p2BOH. Este plásmido es transformado en NM522 de E. coli para dar NM522/p2BOH de E. coli, y la expresión de los genes es verificada como se describió previamente. El NM522/p2BOH de E. coli es inoculado en un recipiente de agitación de 250 mi que contiene 50 mi del medio y se agitan a 250 rpm y 35 °C. El medio está compuesto de: dextrosa, 5 g/1; MOPS, 0.05 M, sulfato de amonio, 0.01 M; fosfato de potasio, monobásico, 0.005 M; una mezcla de metales de S10, 1 % (v/v) ; extracto de levadura, 0.1 % (p/v) ; casaminoácidos , 0.1 % (p/v) , tiamina, 0.1 mg/1; prolina 0.05 mg/1; y biotina 0.002 mg/1, y es titulada a pH 7.0 con KOH . La mezcla de metales de S10 contiene MgCl2 200 mM, CaCl2, 70 mM; MnCl2, 5 raM; FeCl3, 0.1 mM; ZnCl2, 0.1 mM; clorhidrato de tiamina, 0.2 mM, CuS04, 172 µ?, CoCl2, 253 µ?; y Na2 o04; 242 µ?. Después de 18 horas, el 2-butanol es detectado por análisis de HPLC o de GC utilizando los métodos que son bien conocidos en el arte, por ejemplo, como se describe en la sección de métodos generales anterior. Ejemplo 8 (Profético) Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol en Bacillus subtilis El propósito de este ejemplo profético es describir como expresar una ruta biosintética de 2-butanol en Bacillus subtilis . Los plásmidos de pBen-budABC y pBen-pdd-sadh preparados como se describe en el ejemplo 6, son transformados separadamente en BE1010 de bacillus subtilis (J. Bacteriol. 173:2278-2282 (1991) ) y la expresión de los genes en cada operón es verificada como se describe en el ejemplo 7. El plásmido pBen-budABC es digerido con EcoRI y HindIII para liberar el fragmento de budABC-promotor NPR. El fragmento es dividido en los extremos utilizando el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa (New England Biolabs, Catálogo No. M0210S) . El plásmido pBen-pdd-sadh es digerido con EcoRI y dividido de manera semejante para crear un fragmento del vector dividido en los extremos, linearizado. El vector y los fragmentos de NPR-budABC son ligados, creando p2BOH. Este plásmido es transformado en BE1010 de Bacillus subtilis para dar BE1010/p2BOH de Bacillus subtilis , y la expresión de los genes es verificada como se describió previamente. BE1010/p2BOH de Bacillus subtilis es inoculado en un recipiente de agitación de 250 mi que contiene 50 mi del medio y se agita a 250 rpm y 35 °C durante 18 h. El medio está compuesto de: dextrosa, 5 g/1; MOPS, 0.05 M, sulfato de amonio, 0.01 M; fosfato de potasio, amortiguador monobásico, 0.005 M; una mezcla de metales de S10, 1 % (v/v) (como se describe en el ejemplo 7); extracto de levadura, 0.1 % (p/v) ; casaminoácidos , 0.1 % (p/v) ; triptófano, 50 mg/1; metionina 50 mg/1; y lisina 50 mg/1, y es titulada a pH 7.0 con KOH . Después de 18 horas, el 2-butanol es detectado por análisis de HPLC o de GC utilizando los métodos que son bien conocidos en el arte, por ejemplo, como se describe en la sección de métodos generales anterior. Ejemplo 9 Construcción de un vector de transformación para los genes en una ruta biosintética de 2-butanol El propósito de este ejemplo fue preparar un elemento hospedero de E. coli recombinante que lleva los genes en una ruta biosintética de 2-butanol (es decir, la ruta 3 como se describió anteriormente) . De manera semejante a la mayoría de los organismos, E. coli convierte la glucosa inicialmente al ácido pirúvico. Las enzimas requeridas para convertir el ácido pirúvico a 2-butanona en la ruta 3, es decir, la acetatolactato sintasa, acetatolactato descarboxilasa, butandiol deshidrogenasa, y butandiol deshidratasa son codificados por los genes budA, budB, budC, pddA, ppdB y pddC . En la última etapa de la ruta, una butanol deshidrogrenasa convierte la 2-butanona al 2-butanol. Las deshidrogenasas que llevan a cabo esta última etapa son promiscuas y pueden ser encontradas en muchos organismos. Para construir de manera amplificada la ruta biosintética de 2-butanol en un organismo recombinante, los genes que codifican las 5 etapas en la ruta fueron separados en operones múltiples. El operón de la ruta superior comprendió las primeras tres etapas catalizadas por la acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, y butandiol deshidrogenasa y fueron clonados sobre un vector de expresión. La ruta inferior comprendió las últimas dos etapas catalizadas por la butandiol deshidratasa incluyendo el factor de reactivación (Mori et al., J. Biol . Chem . 272:32034 (1997)) y una butanol deshidrogenasa. La diol deshidratasa puede padecer la inactivación suicida durante la catálisis. La proteina del factor de reactivación codificada por ddrA y ddrB (GenBank AF017781, SEC ID NO: 70) reactiva la enzima inactiva. Los genes de ddrA y ddrB flanquean el operón de la diol deshidratasa. Los operones para la deshidratasa/factor de reactivación y la butanol deshidrogenasa fueron ya sea clonados sobre otro vector de expresión o la deshidratasa/operón del factor de reactivación fue clonado de manera única sobre el otro vector de expresión y la última etapa fue provista por una actividad endógena en el elemento hospedero de demostración. Construcción del vector pTcr99a-budABC Las regiones de codificación de budAB fueron amplificadas a partir del ADN genómico de ATCC 24955 de K. pneumoniae por PCR utilizando el par de cebadores BABC F y BAB R, dadas como las SEC ID NOs : 33 y 34, respectivamente (véase la tabla 4) creando un producto de 2.5 kbp . El cebador delantero incorporó los sitios de restricción de SacI y EcoRI y un sitio de aglutinación del ribosoma (RBS) . El cebador inverso incorporó un sitio de restricción de Spel. El producto de PCR fue clonado en pCR4 Blunt-TOPO creando pCR4 Blunt-TOPO-budAB. El ADN del plásmido fue preparado a partir de los clones de TOPO y la secuencia de los genes fue verificada con los cebadores M13 delantero (SEC ID NO: 35), M13 inverso (SEC ID NO: 36), N83 SeqF (SEC ID NO: 37) , N83 SeqF3 (SEC ID NO: 38), y N84 SeqR4 (SEC ID NO: 39) (véase la tabla 5) . La región de codificación de budC fue amplificada a partir del ADN genómico del ATCC 25955 de K. pneumoniae por PCR utilizando el par de cebadores BC Spe F y BC Xba R provistos como SEC ID NOs: 40 y 41, respectivamente, creando un producto de 0.8 kbp. El cebador delantero incorporó un sitio de restricción de Spel, un RBS y modificó el CDS cambiando el segundo y tercer codones desde AAA hasta AAG . El cebador inverso incorporó un sitio de restricción de XabI . El producto de PCR fue clonado en pCR4 Blunt-TOPO creando pCR4 Blunt-TOPO-budC . El ADN del plásmido fue preparado a partir de los clones de TOPO y las secuencias de los genes fue verificada con los cebadores M13 delantero (SEC ID NO: 35) y M13 inverso (SEC ID NO: 36) . Para construir el operón de budABC, pCR4 Blunt-TOPO-budC se digiere con SnaBI y XabI liberando un fragmento de budC de 1.0 kbp. El vector pTrc99a (Amann et al., Gene 69 (2) : 301-315 (1992) ) fue digerido con Smal y Xbal creando un fragmento del vector linearizado de 4.2 kbp. El vector y el fragmento de budC fueron ligados para crear pTrc99a-budC y se transformó en las células ToplO de E. coli (Invitrogen) . Los transformantes fueron analizados por amplificación por PCR con los cebadores Trc F (SEC ID NO: 42) y Trc R (SEC ID NO: 43) para un producto de 1.2 kbp para confirmar la presencia del inserto de budC. Los genes de budAB fueron subclonados a partir de pCR4 Blunt-TOPO-budAB como un fragmento de EcoRI/Spel de 2.5 kbp. El vector pTrc99a-budC se digiere con EcoRI y Spel y el fragmento del vector de 5.0 kbp fue purificado con un gel. El vector purificado y el inserto de budAB fueron ligados y transformados en las células ToplO de E. coli. Los transformantes fueron seleccionados por amplificación por PCR con los cebadores Seq R2 (SEC ID NO: 42) y N84 Seq R2 (SEC ID NO: 65) para confirmar la creación de pTrc99a-budABC . En este plásmido, las regiones de codificación de bud A, B, y C están adyacentes entre si, en este orden, y entre el promotor de Trc y la secuencia de terminación de rrnB . Resultados : Tres aislados independientes de ToplO/pTrc99a-budABC de E. coli fueron examinados para la producción de butandiol, utilizando ToplO/pCL 1925-Kodd-ddr de E. coli (descrito posteriormente) como un control negativo. Las cepas se hicieron crecer en el medio LB que contiene 100 µg/ml de carbenicilina . Las células resultantes fueron utilizadas para inocular los recipientes de agitación (aproximadamente 175 mi del volumen total) que contiene 125 mi del medio de TM3a/glucosa con 100 µg/ml de carbenicilina. Además, los recipientes inoculados con las cepas que llevan pTrc99a-budABC contuvo 0.4 mM de isopropil ß-D-l-tiogalactopiranósido (IPTG) . El medio de TM3a/glucosa contiene (por litro) : 10 g de glucosa, 13.6 g de KH2P04, 2.0 g del monohidrato de ácido cítrico, 3.0 g de (NH4)2S04, 2.0 g de MgS04-7H20, 0.2 g de CaCl2-2H20, 0.33 g del citrato de amonio férrico, 1.0 mg de tiamina-HCl, 0.50 de extracto de levadura, y 10 mi de la solución de los elementos de traza, ajustado a pH 6.8 con NH4OH. La solución de los elementos de traza contuvo: ácido cítrico-H20 (4.0 g/1), MnS04-H20 (3.0 g/1), NaCl (1.0 g/1), FeS04-7H20 (0.10 g/1), CoCl2-6H20 (0.10 g/1) , ZnS04-7H20 (0.10 g/1), CuS04-5H20 (0.010 g/1), H3B03 (0.010 g/1) , y Na2Mo04-2H20 (0.010 g/1) . Los recipientes, tapados con tapas ventiladas, fueron inoculados a una OÜ6oo de partida de aproximadamente 0.03 unidades y se incubaron a 34 °C con agitación a 300 rpm. Aproximadamente 23 horas después de la inducción, una alícuota del caldo fue analizada por HPLC (columna Shodex Sugar SHlOll) y GC (HP-INNO ax) , utilizando los mismos métodos descritos en la sección de los Métodos Generales para 2-butanol y 2-butanona. Los resultados del análisis son provistos en la tabla 6. Los tres clones de E. coli convirtieron la glucosa a acetoína y meso-2, 3-butandiol, el compuesto intermedio deseado de la ruta, con una selectividad molar del 14 %. Esta selectividad fue de aproximadamente 35 veces más elevada que aquella observada con la cepa de control de E. coli que carece de budABC. Tabla 6 Producción de acetoína y meso-2 , 3-butandiol por ToplO/pTrc99a- budABC de E. Coli Cepa OD600 Acetoína, mM Meso-2, 3- Selectividad butandiol, mM molar3, % Control negativo 1.4 0.07 0.03 0.4 Aislado # 1 1 .5 0.64 1 .3 14 Aislado # 2 1.4 0.70 1 .2 14 Aislado # 3 1.4 0.74 1.3 15 aLa selectividad molar es (acetoina + meso-2,3-butandiol) / (glucosa consumida) . Construcción del vector de pCL1925-KoDD-drr : Los operones de la diol deshidratasa (GenBank D45071, SEC ID NO: 69) y el factor de reactivación (GenBank AF017781, SEC ID NO: 70) fueron amplificados por PCR a partir de ATCC 8724 de Klebsiella oxytoca como una sola unidad con los cebadores DDo For (SEC ID NO: 44) y DDo Rev (SEC ID NO: 45) . El cebador delantero incorporó un RBS de E. coli optimizado y un sitio de restricción de HindIII. El cebador inverso incluye un sitio de restricción de Xbal. El producto de PCR de 5318 pb se clonó en pCR4Blunt-TOPO y los clones de pCR4Blunt-TOPO-Kodd-ddr resultante fueron secuenciados con los cebadores M13 delantero (SEC ID NO: 35), M13 inverso (SEC ID NO: 36), DDko seq F2 (SEC ID NO: 46), DDko seq F5 (SEC ID NO: 47), DDko seq F7 (SEC ID NO: 48) , DDko seq F9 (SEC ID NO: 49) , DDko seq Rl (SEC ID NO: 50), DDko seq R3 (SEC ID NO: 51) , DDko seq R7 (SEC ID NO: 52), y DDKo seq RIO (SEC ID NO: 53) . Un clon que tiene el inserto con la secuencia esperada fue identificado. Para la expresión, los genes del factor de react ivación/diol deshidratasa fueron subclonados en pCL 1925 (patente U.S. No. 7,074,608), un plásmido de copiado bajo que lleva el promotor de la glucosa isomerasa de Streptomyces . pCR4Blunt-TOPO-Kodd-ddr fue digerido con HindIII y Xbal y el fragmento de Kood-ddr de 5.3 kbp resultante fue purificado con un gel. El vector pCL 1925 fue digerido con HindIII y Xbal y el fragmento del vector de 4539 pb resultante fue purificado con un gel. El vector y el fragmento de Kodd-ddr fueron ligados y transformados en ToplO de E. coli. Los transformantes fueron seleccionados por PCR como los cebadores DDko seq F7 (SEC ID NO: 48) y DDko seq R7 (SEC ID NO: 52) . La amplificación del plásmido (pCL 1925-Kodd-ddr) que lleva al inserto condujo a un producto de aproximadamente 797 pb . La actividad de la diol deshidratasa hacia el meso-2 , 3-butandiol fue medido por la incubación del extracto celular (proteina total ~ 0.8 mg/ml) con 10 mM de butandiol y la coenzima Bi2 12 mM en HEPES 80 mM (pH 8.2) durante 17 h a temperatura ambiente. La formulación del producto esperado, la 2-butanona fue determinada por HPLC como se describe por los Métodos Generales. Construcción del vector pCL 1925-KoDD-ddr : T5chnA ter: Para proporcionar una actividad de la alcohol deshidrogenasa heteróloga, el gen chnA que codifica la ciclohexanol deshidrogenasa de Acetinobacter sp . (Cheng et al., J. Bacteriol. 182: 4744-4751 (2000) ) fue clonado en el vector pCL 1925 con el operón de la diol deshidratasa, pCL 1925-Kodd-ddr. El gen chnA, dado como la SEC ID NO: 71 (GenBank No: AF282240, SEC ID NO: 73) fue amplificado a partir de pDCQ2, un cósmido que lleva el grupo de genes de ciclohexanol de Acinetobacter, con los cebadores ChnA F (SEC ID NO: 54) y ChnA R (SEC ID NO: 55) . El producto de PCR de 828 pb resultante fue clonado en pCR4Blunt-TOPO para crear pCR4Blunt-T0P0-chnA y los transformantes fueron seleccionados por la PCR de la colonia con los cebadores M13 delantero (SEC ID NO: 35) y M13 inverso (SEC ID NO: 36) . Los clones correctos produjeron un producto de PCR de aproximadamente 1 kbp y fueron secuenciados con los cebadores MI 3 delantero (SEC ID NO: 5) y 13 inverso (SEC ID NO: 36) . Después de la secuenciación de pCR4Blunt-T0P0-chnA para confirmar la secuencia correcta, el gen chnA fue subclonado desde el plásmido como un fragmento de Mfel/Smal de 813 pb. El vector de expresión pQE30 (Qiagen) fue digerido con Mgel y Smal y el fragmento del vector de 3350 pb resultante fue purificado con un gel. El fragmento de chnA y el vector purificado fueron ligados y transformados en las células ToplO de E. coli. Los transformantes fueron seleccionados por PCR de las colonias con los cebadores chnSeq Fl (SEC ID NO: 56) y chnSeq Rl (SEC ID NO: 57) para un producto de PCR de 494 pb . Esta clonación colocó al gen de chnA bajo el control del promotor T5 en el plásmido, pQE30-chnA. Para preparar el vector de pCL 1925 para llevar dos operones, se agregaron terminadores al vector. Un fragmento del terminador de tonB-mcs-terminador de trpA fue preparado por el recocido del oligonucleótido con los cebadores Top ter Fl (SEC ID NO: 58), Top ter F2 (SEC ID NO: 59), Bot ter Rl (SEC ID NO: 60), y Bop ter R2 (SEC ID NO: 61) . El ADN recocido fue purificado con un gel sobre un gel de PAGE al 6 % (Embi-tec, San Diego, CA) . El vector pCl 1925 fue digerido con SacI y Xbal y purificado con un gel. El ADN recocido y el fragmento del vector fueron ligados para crear pCl 1925-ter. Los transformantes fueron seleccionados por la amplificación de PCR de las colonias con los cebadores pCL 1925 vec F (SEC ID NO: 62) y pCL 1925 vec Rl (SEC ID NO: 63) para verificar la presencia de un producto de PCR de aproximadamente 400 pb. Los clones positivos de la selección de PCR fueron secuenciados con los mismos cebadores. El vector pCL 1925-ter fue digerido con Xhol y Pmel y el fragmento de 4622 pb resultante fue purificado con un gel. pQE30-chnA fueron digeridos con Ncol y el ADN fue tratado con la ADN polimerasa de Klenow para dividir los extremos. pQE30-chnA fue digerido entonces con Xhol y el fragmento del promotor T5-chnA de 1.2 kbp resultante fue purificado con un gel. El vector de pCL 1925-ter y el fragmento del operón de chnA fueron ligados conjuntamente para dar pCL 1925-ter-T5cnhA y se transformó en ToplO de E. coli. Los transformantes fueron seleccionados por la amplificación de las PCR de las colonias con los cebadores pCL 1925 vec F (SEC ID NO: 64) y chnseq Rl (SEC ID NO: 59) para un producto de aproximadamente 1 kbp. Para terminar la construcción del vector de la ruta, el plásmido de pCL 1925-KoDD-ddr fue digerido con Xbal y SacI y el fragmento del vector de 9504 pb resultante fue purificado con un gel. El operón de chnA flanqueado por los terminadores, con el terminador de trpA (Koichi et al. (1997) volumen 272, número 51, pp. 32034-32041) 3' con respecto a la secuencia de codificación de chnA, a partir de pCL 1925-ter-T5chnA se purificó con un gel como un fragmento de Xbal/SacI de 1271 pb. Después de la ligadura de los fragmentos y la transformación en ToplO de E. coli, los transformantes fueron seleccionados por la PCR de la colonia. Los cebadores chnSeq Fl (SEC ID NO: 58) y pCL 1925 vec R2 (SEC ID NO: 64) amplificaron el producto de PCR de 1107 pb esperado en el plásmido resultante, pCL 1925-KoDD-ddr: :ter-T5chnA. Ejemplo 10 Expresión de la ruta biosintética de 2-butanol en E. coli con la alcohol deshidrogenasa endógena sobreexpresada El propósito de este ejemplo fue expresar una ruta biosintética de 2-butanol en varias cepas de E. coli. Construcción de las cepas de E. coli que expresan constitutivamente yghD: E. coli contiene un gen natural (yqhD) que fue identificado como una 1, 3-propandiol deshidrogenasa (patente U.S. No. 6,514,733). El gen de yqhD, provisto como la SEC ID NO: 74, tiene 40 % de identidad con respecto al gen adhD en Clostridium, una butanol deshidrogenasa dependiente de NADH probable. El gen yqhD fue colocado bajo la expresión constitutiva de una variante del promotor de la glucosa isomerasa de 1.6GI (SEC ID NO: 67) en la cepa MG1655 1.6yqhD: : Cm de E. coli (WO 2004/033646) utilizando la tecnología de ? Red (Datsenko y Wanner, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A 97:6640 (2000)). De manera semejante, el promotor natural fue reemplazado por el promotor 1.5GI (WO 2003/089621) (SEC ID NO: 68), creando la cepa G1655 1.5yqhD::Cm, reemplazando por consiguiente el promotor de 1.6GI de MG1655 1.6yqhD::Cm con el promotor de 1.5GI. Los promotores de 1.5GI y 1.6GI difieren en 1 pb en la región -35, por lo cual se altera la fuerza de los promotores (WO 2004/033646) . Aunque el reemplazo del promotor de yqhD natural con el promotor ya sea de 1.5GI o de 1.6GI, el gen de yqhC que codifica el regulador transcripcional supuesto para el operón de yqh fue delecionado. La actividad de la butanol deshidrogenasa fue confirmada por el ensayo de la enzima utilizando los métodos que son bien conocidos en el arte. Transformación de las cepas de E. coli: Los plásmidos pCL 1925-Kodd-ddr y pTrc99a-budABC de la ruta, descritos en el ejemplo 9, fueron co-transformados en las cepas MG1655, MG1655 1.6yqhD, y MG1655 1.5yqhD de E. coli. Estas últimas dos cepas sobreexpresan la 1, 3-propandiol deshidrogrenasa, YqhD, que también tiene actividad de la butanol deshidrogenasa. Las cepas fueron examinadas para verificar la producción de 2-butanona y 2-butanol esencialmente como se describió anteriormente. Las células fueron inoculadas en recipientes de agitación (aproximadamente 175 mi del volumen total) que contiene ya sea 50 ó 150 mi del medio de TM3a/glucosa (con 0.1 mg/1 de vitamina B12, antibióticos apropiados e IPTG) para representar el medio y las condiciones bajas de oxígeno, respectivamente. La espectinomicina (50 µg/ml) y carbenicilina (100 |jg/ml) fueron utilizados como los plásmidos pCL 1925-Kodd-ddr y pRC99a-budABC, respectivamente. Los recipientes fueron inoculados a una OD6oo de partida de < 0.04 unidades e incubados a 34 °C con agitación a 300 rpm. Los recipientes que contienen 50 mi del medio fueron tapados con tapas ventiladas; los frascos que contienen 150 mi, fueron tapados con tapas no ventiladas para minimizar el intercambio de aire. La IPTG estuvo presente en el tiempo cero a una concentración de cero hasta 0.04 mM. Los resultados analíticos para la producción de 2-butanona y 2-butanol son presentados en la tabla 7. Todas las cepas de E. coli que comprenden una ruta biosintética de 2-butanol produjeron la 2-butanona bajo condiciones de oxígeno bajas y medias y produjeron el 2-butanol bajo condiciones bajas de oxígeno. Tabla 7 Producción de 2-butanona y 2-butanol por los plásmidos pCL1925-Kodd-ddr y Terc99a-budABC de la ruta que colecta las cepas MG1655 de E. Coli Cepa3 " IPTG, mM Volumen del 2-butanona, mM 2-butanol mM medio, mi MG 1655 # 1 0 50 0.08 No detectado MG 1655 # 2 0 50 0.1 1 No detectado MG 1655 # 1 0.04 50 0.12 No detectado MG1655 # 2 0.04 50 0.1 1 No detectado MG 1655 # 1 0 150 0.15 0.047 MG 1655 # 2 0 150 0.19 0.041 a #1 y #2 representan aislados independientes. b MG1655 es MG1655/pCL1925-Kodd-ddr/pTrc99a-budABC MG1655 1. 6yqh D es MG1655 1.6yqhD/pCL1925-Kodd-ddr/pTrc99a-budABC MG1655 1. 6 yqhD es MG1655 1.5yqhD/pCL1925-Kodd-ddr/pTrc99a-budABC. Ejemplo 11 Expresión de una ruta biosintética de 2-butanol en E. coli con la alcohol deshidrogenasa heteróloga Los plásmidos pCL 1925-KoDD-ddr : : ter-T5chnA y pTrc99a-budABC, descritos en el ejemplo 9, fueron transformados en las cepas MG1655 y MG1655 AyqhCD de E. coli para una demostración de la producción de 2-butanol. MG1655 AyqhCD lleva una inactivación de yqhCD que se hizo utilizando el método de Datsenko y Wanner (Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 97 ( 12 ): 6640-6645 (2000)). Después del reemplazo de la región con el cásete de FRT-CmR-FRT de pKD3, el marcador de la resistencia al cloranfenicol fue removido utilizando la FLP recombinasa. La secuencia de la región delecionada es provista como la SEC ID NO: 66. Las cepas de MG1655/pTrc99a-budABC/pCL 1925KoDD-ddr::Ter-T5 chnA y MG1655 AyqhCD/pTrc99a-budABC/pCL 1925KoDD-ddr::Ter-T5 chnA fueron examinados para la producción de 2-butanona y 2-butanol esencialmente como se describió anteriormente. La cepa MG1655 AyqhCD/pCL 1925 fue utilizada como un control negativo. Las células fueron inoculadas con recipientes de agitación (de aproximadamente 175 mi de volumen total) que contiene 50 o 150 mi del medio TM3a/glucosa (con 0.1 mg/1 de vitamina ??2 y antibióticos apropiados) para representar las condiciones de oxigeno intermedias y bajas, respectivamente. La espect inomicina (50 µg/ml) y la ampicilina (100 µg/ml) fueron utilizadas para la selección de los plásmidos basados en pCL 1925 y pTrc99a-budABC, respectivamente. La actividad de la enzima derivada de pTrc99a-budABC fue detectada por el ensayo de la enzima en la ausencia del inductor de IPTG, por consiguiente, IPTG no fue agregado al medio. Los frascos fueron inoculados a una OD600 de partida de <_ 0.01 unidades e incubados a 34 °C con agitación a 300 rpm durante 24 h. Los frascos que contienen 50 mi del medio fueron tapados con tapas ventiladas; Los frascos que contienen 150 mi, fueron tapados sin tapas ventiladas para minimizar el intercambio de aire. Los resultados analíticos para la producción de 2-butanona y 2-butanol son presentados en la tabla 8. Ambas cepas de E. coli que comprenden una ruta biosintética de 2-butanol produjeron 2-butanona bajo condiciones medias y bajas de oxígeno y produjeron 2-butanol bajo condiciones bajas de oxígeno, mientras que la cepa de control negativo no produjo niveles detectables ya sean de 2-butanona o de 2-butanol.
Tabla 8 Producción de 2-butanona y 2-butanol por las cepas de E. coli a #1 y #2 representan aislados independientes.
Ejemplo 12 Clonación de amino : piruvato transaminasa (APT) Una amino : piruvato transaminasa (APT) de Vibrio Fluvialis JS17 fue identificado por Shin et al. (Appl. Biol. Biotechnol. (2003) 61:463-471) . La secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 122) se encontró que tiene una homología significativa con las ?-aminoácido : piruvato transaminasas (Shin y Kim (J. Org. Chem. 67:2848-2853 (2002) ) . Se ha mostrado que Vibrio Fluvialis APT tiene la actividad de transaminasa hacia la acetoína. Para la expresión de la enzima de APT en E. coli, una región de codificación de APT optimizada en el codón (SEC ID NO: 144) fue diseñada utilizando los codones de E. coli preferidos con consideraciones adicionales tales como el balance del codón y la estabilidad del ARNm, y sintetizados (por DNA2.0; Redwood City, CA) . El fragmento del ADN de la región de codificación fue subclonada en el vector pBAD.HisB (Invitrogen) entre los sitios de Ncol y HindIII y el plásmido resultante, referido después de esto, pBAD.APTl, fue transformado en las células TOP10. E emplo 13 Caracterización de la actividad de la APT alanina : acetoína aminotransferasa de Vibrio fluvialis Un volumen de 5 mi del caldo de LB + 100 µg/ml de ampicilina fue inoculado con una colonia fresca de las células TOPlO/pBAD: APT1. El cultivo se incuba a 37 °C durante aproximadamente 16 h con agitación (225 rpm) . Una alícuota de 300 µ? de este cultivo fue utilizada para inocular 300 mi del mismo medio, que fue incubado a 37 °C con agitación (225 rpm) . Cuando el cultivo alcanzó una OD6oo de 0.8, se agrega la L-arabinosa a una concentración final de 0.2 % (p/v) . el cultivo se inocula durante unas 16 h adicionales, luego se colecta. Las células fueron colectadas una vez con el amortiguador de fosfato de potasio 100 mM (pH 7.8) y luego congeladas y almacenadas a -80 °C. Para aislar la enzima, las pelotillas de las células fueron descongeladas y se resuspendieron en 8 mi del amortiguador de fosfato de potasio 100 mM (pH 7) que contiene 0.2 mM de tetraacetato de etilendiamina , ditiotreitol 1 mM y una tableta del cóctel del inhibidor de proteasa (Roche, Indianapolis , IN) . Las células fueron lisadas por dos pasadas a través de una celda de una prensa French a 63.33 kg/cm2 (900 psi), y el lisado resultante fue aclarado por centrifugación durante 30 minutos a 17000 x g. Se agrega sulfato de amoníaco a una saturación del 35 %, y la solución fue agitada durante 30 minutos a temperatura ambiente, punto en el cual los sólidos precipitados fueron removidos por centrifugación (30 minutos, 17000 x g) . Se agrega sulfato de amonio adicional al sobrenadante para dar 55 % de saturación, y la solución se agita nuevamente durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Los sólidos precipitados fueron removidos por centrifugación (30 minutos, 17000 x g) y luego' se resuspenden en 5 mi del amortiguador de fosfato de potasio 100 mM (pH 7) que contiene 5' -fosfato de piridoxal 10 µ? y ditiotreitol 1 mM. La solución fue desalada por el paso a través de una columna de PD10 equilibrada con el amortiguador A (amortiguador de bis-tris propano 50 mM (pH 6), que contiene 5' -fosfato de piridoxal 10 µ? y ditiotreitol 1 mM) . El extracto desalado fue localizado entonces sobre una columna Q-Fast Flow de 20 mi pre-equilibrada con el amortiguador A. La APT fue eluida con un gradiente lineal de NaCl 0-0.1 M en el amortiguador A. La enzima fue detectada en fracciones eluidas por la presencia de una banda de proteina de tamaño de ~ 50 kD cuando es analizada por electrofóresis con un gel de SDS-poliacrilamida y por la absorbancia característica a 418 mm. Las fracciones contienen la enzima eluida a ~ 0.3 M NaCl. Estas fracciones fueron agrupadas para dar un total de 6 mi de 5.45 mg/ml de la solución de enzima, la cual fue > 90 % pura, como se juzga por la electroforesis con un gel de SDS-poliacrilamida. La actividad de la alanina : acetoína aminotransferasa de la APT fue ensayada utilizando un ensayo relacionado con la deshidrogenasa láctica. Las mezclas de reacción contuvieron bis-tris propano 100 mM (pH 9.0), 5' -fosfato de piridoxal 10 µ?, acetoína 0-50 mM, L-alanina 0-5 mM, enzima purificada en una cantidad de 0.14 o 0.28 mg/ml, NADH 200 µ? y 20 U/ml de la deshidrogenasa láctica (Sigma; St. Louis, MO) . La reacción fue seguida por la medición del cambio en la absorbancia a 340 mm, indicativa de la oxidación de NADH . Bajo estas condiciones, la kcat/Km para la acetoina fue de 10 M"1 s_1 y aquella para la alanina fue de 400 M"1 s"1. La identidad del producto de 3-amino-2-butanol fue confirmada por la comparación con un estándar sintético. Una mezcla de (R,R)- y (S, S) -3-amino-2-butanol fue sintetizada por el método de Dikckey et al [J. Amer Chem Soc 74:944 (1952)] : 5 g del trans-2 , 3-epoxibutano fueron agitados lentamente en 150 mi de NH4OH frío (4 °C) . La reacción fue calentada lentamente a temperatura ambiente, sellada y agitada a temperatura ambiente durante unos 10 días adicionales. En este tiempo, el amoniaco en exceso y el agua y el epoxibutano residual fueron removidos por evaporación rotatoria bajo vacio a 40 °C. El aceite claro resultante (2.9 g) se resuspende en agua hasta una concentración del 10 % (p/v) . La producción del producto deseado fue confirmada por análisis de RMN y la comparación del espectro con aquel reportado por Levi et al. [Org. Magnetic Resonante 14:214 (1980)] . Una mezcla de los isómeros (2R, 3S) y (2S, 3R) correspondientes fue producida utilizando el método idéntico con excepción de que el material de partida fue el isómero cis de 2 , 3-epoxibutano . Un método analítico para la detección del 3-amino-2-butanol fue desarrollado con base en el método de derivación de o-ftaldialdehido para la determinación de los aminoácidos reportado por Roth [Anal. Chem. 43:880 (1971)] . Una alícuota de 200 µ? del 3-amino-2-butanol 1 mM (mezcla de isómeros) fue mezclada con 200 µ? de una solución 50 mM del borato (pH 9.5) , a la cual se agregan 10 µ? del 2-mercaptoetanol 5 µ?/ml en etanol y 10 µ? del o-ftalaldehído 10 mg/ml en etanol. La solución se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos, tiempo en el cual el derivado fue extraído en 200 µ? de hexano. El hexano fue separado de la solución acuosa por decantación, y 10 µ? fueron inyectados sobre una columna de HPLC Chiralcel OD (Daicel Chemical Industries; Fort Lee, NJ) . La columna fue corrida isocrát icamente con una fase móvil de hexano : isopropanol 90:10 a una velocidad de 1 ml/min. Los isómeros derivados del 3-amino-2-butanol fueron detectados por absorbancia a 340 nm con los tiempos de retención de aproximadamente 15.7 y de 16.8 minutos [ (2S,3S) y (2R,3R) ], y 18.4 y 21.9 minutos [(2R,3S) y (2S,3R) ] . Para diferenciar los enantiómeros en la primera mezcla, el isómero (2R,3R) puro (Bridge Organics; Vicksburg, MI) también fue corrido bajo las condiciones idénticas y se encontró que va a estar en el pico de 16.8 minutos. Para diferenciar los enantiómeros en la segunda mezcla, la mezcla fue primero resuelta cinéticamente utilizando la alanina : acetoína aminotransferasa . 0.28 mg de la enzima purificada fueron incubados con el piruvato 10 mM y el 3-amino-2-butanol 10 mM [mezcla 1:1 de los isómeros (2R,3S) y (2S,3R)] en 1 mi del bis-tris propano 100 mM (pH 9.0) . Después de 24 horas a temperatura ambiente, una alícuota fue removida y analizada como se describió anteriormente. El análisis reveló que el pico de 18.4 minutos fue agotado en el 95 %, mientras que el pico de 21.9 minutos fue retenido en > 90 %. Una alícuota de 100 µ? de la mezcla de reacción restante fue mezclada con 50 µ? de NADH 20 mM y 10 µ? del extracto de la cepa Topl0/pTrc99a-budC descrita en el ejemplo 9. La enzima de BudC ya se sabe que reduce la (R)-acetoína al meso-2,3-butandiol y (S)-acetoína a ( S , S ) -2 , 3-butandiol [Ui et al (2004) Letters in Applied Microbiology 39:533-537] . Después de 3 h, las muestras fueron tomadas de la reacción y analizadas como se describió anteriormente para verificar la acetoína y el butandiol. El análisis indicó que el producto primario de la reducción fue el meso-2 , 3-butandiol , indicando que el producto de la reacción de aminot ransferasa fue la (R)-acetoína, y por lo tanto el isómero de 3-amino-2-butanol consumido fue el isómero {2R,3S) . Por consiguiente, el tiempo de retención de 18.4 minutos puede ser asignado a este isómero y 21.9 al isómero {2S,3R) . Para confirmar que el producto de la reacción de alanina : acetoína aminotransferasa catalizada por APT fue el 3-amino-2-butanol , se incubaron 0.28 mg de la enzima purificada con acetoína 10 mM, L-alanina 10 mM, 50 U de deshidrogenasa láctica y 200 µ? de NADH en 1 mi del bis-tris propano 100 mM (pH 9.0) . La mezcla de reacción fue incubada a temperatura ambiente durante 1 h, después de lo cual una alícuota de 200 µ? fue removida y derivada como se describió anteriormente. Los tiempos de retención de los productos derivados fueron de 15.8 min (producto principal) y 18.5 min (producto mayor) , que corresponde con aquel de los estándares del (2S, 3S)- y (2R, 3S) -3-amino-2-butanol . Ejemplo 14 Identificación y clonación de la amino alcohol cinasa y la amino alcohol 0-fosfato liasa de Erwinia carotovora subespecie atroseptica El propósito de este ejemplo es describir la identificación y clonación de las secuencias que codifican una amino alcohol cinasa y la amino alcohol O-fosfato liasa de la bacteria Erwinia carotovora. Estas dos enzimas son parte de la ruta 1 para la conversión del 3-amino-2-butanol a la 2-butanona por medio del compuesto intermedio de fosfato de 3-amino-2-butanol como se muestra en la figura 1. Predicción de la amino alcohol cinasa y la amino alcohol 0-fosfato liasa de Erwinia Las actividades de la amino alcohol cinasa y la amino alcohol O-fosfato liasa dependiente de ATP han sido detectadas en varias especies de Pseudomonas y Erwinia, incluyendo Pseudomonas sp. P6 (NCIB 10431) , Pseudomonas putida NCIB 10558 (Jones et al., (1973) Biochem J. 134:167-182) , Erwinia carotovora , Erwinia amanas, Erwinia milletiae, y Erwinía atroseptica (Jones et al. (1973) Biochem J. 134:959-968) . En estos estudios, los extractos de las especies anteriores se mostró que tienen actividad hacia la conversión enzimática del aminopropanol por medio del 0-fosfato aminopropanol hasta el propionaldehido, y la conversión de etanolamina a través del 0-fosfato de etanolamina hasta acetaldehido . La secuencia genómica de la cepa de Erwinia atroseptica en la cual estas actividades se reportó que existen (ahora designadas como la cepa SCRI1043 de Erwinia carotovora subespecie atroseptica (ATCC BAA-672) ) ha sido determinada en el Sanger Institute (Bell et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101(30) : 11105-11110) . El análisis de las cinasas supuestas en el genoma de Erwinia carotovora subespecie atroseptica reveló una secuencia del operón (SEC ID NO: 275) que codifica una proteina supuesta (ECA2059; SEC ID NO: 124) que es 39 % idéntica a una homoserina cinasa de Rhizobium loti y una aminotransferasa dependiente del fosfato de piridoxal (PLP) de la clase III supuesta (ECA2060; SEC ID NO: 126) que es 58 % idéntica a una ami no t r a n s f e r a s a supuesta de Rhizobium meliloti. Basado en lo anterior, se espera que ECA2059 tenga una amino alcohol cinasa y ECA2060 fue una amino alcohol O-fosfato liasa que utiliza PLP como el cofactor.
Clonación de la amino alcohol cinasa supuesta y la amino alcohol O-fosfato liasa supuesta de Erwinia carotovora subespecie atroseptica El ADN genómico de Erwinia carotovora subespecie atroseptica (ATCC #: BAA-672D) fue obtenido del American Type Culture Collection (ATCC) . El operón que codifica la amino alcohol cinasa supuesta (KA) y la amino alcohol O-fosfato liasa (AT) fue nombrada KA-AT (SEC ID NO: 275) . Este operón fue amplificado a partir del ADN genómico de Erwinia por la ADN polimerasa de Phusion (Finnzymes, por medio del New England Biolabs; Ipswich, A) utilizando los cebadores OT872 (SEC ID NO: 127) y OT873 (SEC ID NO: 128) . Un fragmento del ADN de 2.4 kb fue obtenido por la reacción de PCR, la cual corresponde al tamaño del operón de KA-AT. El producto de PCR fue digerido con las enzimas de restricción de EcoRI y PstI, y clonados en el vector pKK223-3 (Amersham Biosciences ; Piscataway NJ) el cual fue digerido con las mismas enzimas de restricción. Este plásmido producido pKK223. KA-AT , que contuvo el operón de amino alcohol cinasa-liasa de Erwinia supuesto, bajo el control del promotor tac. De manera semejante, los plásmidos pKK223.KA y pKK223.AT fueron hechos, y en los cuales se colocaron las regiones de codificación de la cinasa de Erwinia supuesta y de liasa de Erwinia supuesta en vectores separados, cada uno bajo el control del promotor tac. Para la clonación de PCR de la región de codificación de KA (SEC ID NO: 123), se utilizaron los cebadores OT872 (SEC ID NO: 127) y OT879 (SEC ID NO: 129); y para la clonación de PCR de la región de codificación de AT (SEC ID NO: 125) , se utilizaron los cebadores OT873 (SEC ID NO: 128) y OT880 (SEC ID NO: 130) en las amplificaciones de PCR, las cuales generaron los productos de PCR de 1.1 kb y de 1.3 kb respectivamente. Los productos de PCR fueron digeridos cada uno con EcoRI y PstI, y ligados en el vector pKK223-3 para generar pKK-223.KA y pKK223. AT . Actividad in vivo de la amino alcohol cinasa supuesta y la amino alcohol O-fosfato liasa supuesta de Erwinia carotovora subespecie atroseptica Los plásmidos pKK223. KA-AT, pKK223.KA, pKK223.AT y pKK223-3 fueron transformados en la cepa MG1655 de E. coli. Los transformantes fueron aplicados otra vez como lineas sobre una placa con un medio mínimo de MOPS que contiene 1 % de glucosa, 0.5 % de aminopropanol como la única fuente de nitrógeno, IPTG 1 mM y 100 µg/ml de ampicilina. La expresión de los genes KA-AT, KA y AT fue inducida por el IPTG. Una placa de control no tiene el IPTG incluido. Las placas fueron incubadas a 37 °C durante 7 días. En la placa con IPTG, solamente creció la cepa MG1655/pKK223. KA-AT, mientras que la totalidad de las otras tres cepas no crecieron. Sobre la placa sin IPTG agregado, creció la cepa MG1655/KK223. KA-AT , pero las colonias fueron significativamente más pequeñas que aquellas sobre la placa que contiene IPTG, que corresponde a los niveles de expresión inferior de KA y AT en las células no inducidas. Ninguna de las otras tres cepas creció en esta placa. Esto indica que la co-expresión de los genes de KA y AT de Erwinia, supuestos, proporcionaron suficientes actividades de la enzima que permitieron que la cepa MG1655/pKK223. KA-AT de E. coli utilice el aminopropanol como la única fuente de nitrógeno. La expresión de cada enzima individual sobre ya sea KA o AT no fue suficiente para proporcionar tal actividad de la enzima in vivo. Ejemplo 15 Actividad in vitro de la amino alcohol cinasa y la amino alcohol O-fosfato liasa supuestas de Erwinia Subclonación del operón KA-AT de Erwinia en el vector pBAD.HisB y la inducción de la expresión de la proteína Los niveles de expresión de la proteína de las enzimas de KA y AT supuestas de Erwinia, expresadas en las células de MG1655 del vector de pKK223. KA-AT fueron analizados por el análisis de SDS-PAGE. El nivel de expresión de la enzima AT de Erwinia fue relativamente bajo, con una nueva banda de proteína detectada en el peso molecular correcto de 46 kD en la fracción soluble de un extracto celular, mientras que ninguna nueva banda de proteína fue detectada en el tamaño predicho para la enzima KA. En un esfuerzo por mejorar la expresión de los genes de AA y AT supuestas de Erwinia, el operón de KA-AT fue subclonado en los sitios de EcoRI y HindIII del vector pBAD. HisB-EcoRI . El pBAD . HisB-EcoRI fue derivado del vector pBAD-HisB ( Invitrogen) , por el reemplazo del sitio Ncol en pBAD.HisB con un sitio EcoRI a través de la mutagénesis dirigida al sitio de QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA) utilizando los cebadores OT909 (SEC ID # 131) y OT910 (SEC ID. # 132) . En el plásmido construido pBAD. KA-AT, el operón de KA-AT fue colocado directamente bajo el control del promotor araB (sin His-tag) . El plásmido pBAD. KA-AT fue transformado en la cepa TOP10 de E. coli. Un cultivo de 50 mi de la cepa TOPlO/pBAD. KA-AT se hizo crecer hasta la fase logarítmica intermedia (OD60o = 0.6) en LB, 100 µg/ml del medio de ampicilina a 37 °C con agitación a 250 rpm. El cultivo fue inducido por la adición de L-arabinosa a una concent ación final de 0.1 % (p/v) , y fue incubado adicionalmente a 37 °C durante 5 h antes de la colección por centrifugación. Las pelotillas celulares fueron resuspendidas en Tris-HCl 50 mM enfriado con hielo, pH 8.0, y alteradas por sonicación sobre hielo con un aparato Fischer Sonic Model 300 Dismembrator (Fischer, Pittsburgh, PA) a 50 % de potencia, repitiendo cuatro ciclos de 30 segundos de sonicación con 60 segundos de descanso entre cada ciclo. Cada muestra sonicada fue centrifugada (15,000 x g, 4 min, 4 °C) . Los extractos de las células libres, aclarados, fueron analizados para verificar el nivel de expresión de la proteína y la actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa. Síntesis química de O-fosfato de aminobutanol y el O-fosfato de aminopropanol El substrato de O-fosfato de (R, R) -3-amino-2-propanol fue sintetizado por un método basado en el aquel reportado por Ferrari y Ferrari (patente US 2730542 [1956]) para la fosfoetanolamina : 10 mmol de H3P04 en una solución acuosa al 50 % (p/v) fueron mezclados con una solución al 50 % (p/v) de ( R , R ) - 3 - ami no - 2 -bu t ano 1 (Bridge Organics; Vicksburg, MI) mientras que se agita sobre hielo. Después del mezclado, la solución se calienta lentamente a temperatura ambiente y luego se agita bajo vacío y se calienta a 70 °C. Después de 1 h a 70 °C, la temperatura se incrementó lentamente hasta 185 °C y se mantuvo allí durante unas 2 h adicionales. En este instante, la reacción se enfría a temperatura ambiente y se libera el vacío. El material restante se disuelve en agua, y el análisis por RMN indicó que el 80 % de la materia prima se convirtió al producto con 20 % restante que no reaccionó. No se observo ningún producto adicional. Los substratos adicionales de O-fosfato de (2R,3S)-3-amino-2-butanol y O-fosfato de ( 2S , 3R) -3-amino-2-butanol fueron sintetizados por el mismo procedimiento utilizando una mezcla 1:1 del ( 2R, 3S ) -3-amino-2-butanol y ( 2S , 3R) -3-amino-2-butanol (sintetizado como se describe en el ejemplo 13) como la materia prima. El O-fosfato de DL-1-amino-propanol , el O-fosfato de ( S ) - 2 - ami no- 1 -propanol, y el O-fosfato de ( R ) - 2 - ami no - 1 -p r opa no 1 fueron sintetizados por el mismo procedimiento utilizando el DL-amino-2 -propanol , ( R ) - 2 - ami no - 1 -propanol, o ( S ) - 2 - ami no - 1 - r opano 1 como los materiales de part ida . Análisis de la actividad de la aminopropanol O-fosfato liasa codificada por el operón de KA-AT de Erwinia, supuesto El ensayo de aminopropanol O-fosfato liasa fue efectuado como se describe por Jones et al. (1973, Biochem. J. 134:167-182) y G. Gori et al. (1995, Chromatographia 40:336) . La formación de propionaldehido a partir del O-fosfato de aminopropanol fue ensayado colorimétr icamente con MBTH, que permite la detección de la formación del aldehido. La reacción fue efectuada como sigue. En 1 mi de la reacción, se agregaron 100 µg del extracto libre de células de TOPl 0 /pBAD . KA-AT de E. coli al 0-fosfato de DL- 1 - ami no - 2 -p r opa no 1 10 mM en Tris-HCl 100 mM, pH 7.8, con PLP 0.1 mM . La reacción fue incubada a 37 °C durante 10 minutos y 30 minutos, con una alícuota de 100 µ? de la mezcla de reacción removida en cada instante del tiempo y mezclada con 100 µ? de 6 mg/ml de MBTH en glicina-HCl 375 mM, pH 2.7. Esta mezcla se incuba a 100 °C durante 3 minutos, se enfría sobre hielo durante 15-30 s, y se agrega 1 mi de 3.3 mg/ml de FeCl3.6H20 (en HC1 10 mM) , seguido por incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente. La absorbancia de la mezcla de reacción que contiene el aducto del a 1 de h i do -MBTH , fue medida a 670 nm . Los resultados del ensayo son listados en la tabla 9. En la presencia del substrato de fosfato de aminopropanol , PLP y el extracto libre de células, se detectó la formación del aldehido, como está indicado por Abs6 0 que fue más elevado que el fondo de control de hasta 0.3. En la ausencia ya sea del substrato o del extracto libre de células, no se detectó ninguna formación del aldehido. En la ausencia de PLP agregado, se detectó una cantidad algo menor del aldehido, presumiblemente debido a la presencia de PLP en el extracto libre de células. El extracto libre de células del cultivo de TOP10 /pBAD . KA-AT no inducido, no produjo ningún aldehido detectable en la reacción. Estos resultados indicaron que la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia supuesta cataliza la conversión del O-fosfato de aminopropanol al propionaldehí do .
Tabla 9 Ensayo de aminopropanol O-fosfato liasa. La muestra 1 fue el extracto libre de células de un control no inducido de TOPlO/pBAD. KA-AT de E. coli. Las muestras 2-5 contuvieron el extracto libre de células del cultivo inducido por TOPlO/pBAD. KA-AT de E. Coli Análisis de la actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia hacia el substrato de O-fosfato de aminobutanol La actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa hacia los substratos de O-fosfato de aminobutanol fue estudiada bajo las mismas condiciones que se describieron anteriormente. La reacción se llevó a cabo a 37 °C durante toda la noche en 1 mi de la reacción que contuvo 100 µq del extracto libre de TOPlO/pBAD . KA-AT de E. coli, O-fosfato de aminobutanol 10 mM (ya sea la mezcla de (R,R) + (S,S) o la mezcla de los isómeros (R,S) + (S,R) descrita en el ejemplo 15) en Tris-HCl 100 mM, pH 7.8, con PLP 0.1 mM. Una alícuota de 100 µ? de la mezcla de reacción fue removida y el producto de 2-butanona fue detectado utilizando el método de derivación de MBTH descrito en los Métodos Generales. Los dos picos que representan los dos isómeros de 2-butanona derivados fueron observados. Por lo tanto, la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia es una aminobutanol fosfato fosfo-liasa además de un aminopropanol fosfato fosfo-liasa. Análisis de la actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia hacia los estereoisómeros del O-fosfato de aminopropanol y el O-fosfato de aminobutanol La actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia hacia varios estereoisómeros del O-fosfato de aminopropanol y el O-fosfato de aminobutanol fue estudiada bajo las mismas condiciones que se describieron anteriormente. En la presencia de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia, tanto el O-fosfato de (R) como de ( S ) -2-amino-l-propanol fueron convertidos a la propanona por la enzima, pero el rendimiento del producto fue mucho más elevado con el isómero (S) . La enzima también produjo la butanona a partir de ambas mezclas de los isómeros de O-fosfato de 3-amino-2-butanol, con el rendimiento del producto más elevado encontrado en la reacción que contiene los isómeros (R,S) y (S,R) del substrato. Ambos productos de propanona y butanona fueron derivados por MBTH, y se detectaron por HPLC como se describió en los Métodos Generales. Optimización del nivel de expresión del gen para la amina alcohol cinasa y la amino alcohol 0-fosfato liasa de Erwinia Para mejorar los niveles de expresión para la amino alcohol cinasa y la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia en E. coli, las regiones de codificación optimizadas por el codón para ambas enzimas (llamadas EKA: SEC ID NO: 155 y EAT : SEC ID NO: 156 respectivamente) fueron sintetizadas por DNA:2.0 (Redwood City, CA) . Cada región de codificación fue sintetizada con las extremidades 5' y 3' incluyendo los sitios de restricción para la clonación: EKA tiene los sitios de 5' Bbsl y 3' EcoRI, HindIII; EAT tiene los sitios de 5' EcoRI y 3' HindIII. Las regiones de codificación de EKA y EAT fueron provistas a partir de DNA2.0 como los plásmidos pEKA y pEAT, que estuvieron en el vector pJ51 de DNA2.0. La región de codificación optimizada por EKA fue subclonada por la ligadura de un fragmento digerido por Bbsl y HindIII de pEKA en el vector pBAD.HisB entre los sitios de Ncol y HindIII para generar el plásmido pBAD.EKA. En el plásmido resultante, la región de codificación está colocada 5' con respecto a su etiqueta His, de modo que una región de codificación para una etiqueta de His6 de la terminación N fusionada a la amino alcohol cinasa de Erwinia fue construida efectuando una reacción de mutagénesis dirigida al sitio de QuickChange utilizando los cebadores SEC ID NO: 157 y SEC ID NO: 158 para generar el vector pBAD . His-EKA . pBAD . His-EKA fue transformado en la cepa BL21-A1 ( F~ ompThsdSB (rB~ mB~) gal dcm araB: : T7RNAP-tetA de E. coli; Invitrogen) para producir la cepa BL21-Al/pBAD. His-EKA. Un cultivo de 50 mi de BL21-AI /pBAD . HisA-EKA se hizo crecer hasta una etapa logarítmica intermedia (OD60o = 0.6), inducida con 0.1 % de arabinosa, y se incubó adicionalmente a 30 °C toda la noche. Los extractos de las células libres fueron preparados por sonicación. La proteína de fusión etiquetada con His6 de la amino alcohol cinasa de Erwinia fue purificada utilizando el sistema de purificación de ProBond™ (Invitrogen) bajo condiciones de purificación no desnaturalizantes siguiendo las instrucciones del fabricante. Resultados proféticos La actividad de la cinasa de la amino alcohol cinasa de Erwinia etiquetada con His6 es analizada por el ensayo de ADP Quest (DiscoverRX, Fremont, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este es un ensayo bioquímico que mide la acumulación de ADP, un producto de la reacción de amino alcohol cinasa utilizando ya sea el aminopropanol o el aminobutanol como el substrato. El substrato 10 mM es mezclado con la amino alcohol cinasa de Erwinia etiquetada con His6, en Tris-HCl 100 mM, pH 7.8, MgCl2 10 mM, KC1 2 mM, ATP 0.1 mM, y se incuba a 37 °C durante 1 h en 0.2 mi de la reacción. El reactivo A de ADP (100 µ?) y el reactivo B de ADP (200 µ? ) son agregados y la mezcla es incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos. La señal fluorescente que indica la actividad es medida con una longitud de onda de excitación de 530 mm y una longitud de onda de la emisión de 590 nm. Ejemplo 16 Expresión de la Ruta 3 Completa Construcción del vector pCLBudAB-ter-T5chnA El vector pTrc99a : : BudABC (descrito en el ejemplo 9) es digerido con EcoRI) y el ADN es tratado con la ADN polimerasa de Klenow para separar los extremos. El vector dividido es digerido subsiguientemente con Spel para dar un fragmento de 2.5 kb que contiene los genes BudA y BudB. El vector pCL 1925-ter-T5chnA (descrito en el ejemplo 9) es digerido con HindIII, y el ADN fue tratado con la ADN polimerasa de Klenow para dividir los extremos. El vector dividido es digerido subsiguientemente con Xbal para dar un fragmento de 4.6 kb que es ligado entonces al fragmento BudAB de pTrc99a : : BudABC . El plásmido resultante, designado pCLBudAB-ter-T5chnA, es utilizado para transformar las células ToplO de E. coli, y las colonias únicas fueron seleccionadas para la estructura del plásmido apropiada por PCR utilizando los cebadores pCL1925vecF (SEC ID NO: 62) y N84seqR3 (SEC ID NO: 159) . El plásmido es preparado a partir de una sola colonia que produce un producto de PCR del tamaño esperado de 1.4 kb.
Construcción del vector pKK223. KA-AT-APT El gen APT es amplificado a partir del vector pBAD.APT (descrito en el ejemplo 12) por PCR utilizando los cebadores APTfor (SEC ID NO: 162; 5' incluye el sitio RBS y Smal) y APTrev (SEC ID NO: 163; 3' se agrega el sitio Smal) . El producto del tamaño esperado de 1.7 kbp es purificado con un gel y digerido con Smal para dar los extremos separados. El vector pKK223.KA-AT (descrito en el ejemplo 14) es digerido con PstI, y el ADN es tratado con la ADN polimerasa de Klenow para separar los extremos. El fragmento de ADN resultante es ligado con el producto de PCR digerido con Smal, y el producto de la ligadura es utilizado para transformar las células ToplO de E. coli. Las colonias resistentes a la ampicilina, individuales, son seleccionadas por PCR utilizando los cebadores OT872 (SEC ID NO: 127) y APTrev (SEC ID NO: 163) . La presencia de un producto de PCR del tamaño esperado de 4.1 kbp indica que el gen que codifica APT está presente y está orientado en la misma dirección que los genes que codifican KA y AT . La secuencia del inserto es verificado utilizando los cebadores APTseqRev (SEC ID NO: 160) y APTseqFor (SEC ID NO: 161) . Este plásmido es nombrado pKK223. KA-AT-APT . La expresión apropiada de la totalidad de los tres genes es verificada haciendo crecer un cultivo de 5 mi de ToplO/pKK223. KA-AT-APT en LB + 100 µ$/p?1 de ampicilina a 37 °C con agitación. Cuando la OD6oo alcanza - 0.8, la expresión de los genes del plásmido es inducida por la adición de IPTG a 0.4 mM. La expresión es evaluada por SDS PAGE y los ensayos de la actividad como se describieron anteriormente. Construcción de la cepa de producción de 2-butanol y producción de 2-butanona y 2-butanol La cepa MG1655 de E. coli es transformada tanto con pKK223.KA-AT-APT como pCLBudAB-ter-T5chnA, y los transformantes seleccionados para la resistencia a la ampicilina y espectinomicina, indicativo de la presencia de los plásmidos. Las células son inoculadas en los recipientes de agitación (de aproximadamente 175 mi de volumen total) que contienen 50 ó 150 mi del medio de TM3a/glucosa (con los antibióticos apropiados) para representar las condiciones de oxigeno bajas e intermedias, respectivamente. IPTG es agregado a 0.4 mM para inducir la expresión de los genes de pKK223.KA-AT-APT. Como un control negativo, las células de MG1655 se hacen crecer en el mismo medio que carece de antibióticos. Los recipientes son inoculados a una OD60o de partida de < 0.01 y se incuban a 34 °C con agitación a 300 rpm durante 24 h. Los frascos que contienen 50 mi del medio son tapados con tapas ventiladas; los frascos que contienen 150 mi son tapados con tapas no ventiladas para minimizar el intercambio de aire. La cepa MG1655/pKK223.KA-AT-APT/pCLBudAB-ter-T5chnA que comprende una ruta biosintética de 2-butanol produce tanto la 2-butanona como el 2-butanol bajo condiciones de oxigeno intermedias y bajas mientras que la cepa de control negativo no produce niveles detectables ya sea de 2-butanona o de 2-butanol.
Ej emplo 17 Caracterización de la actividad de la glicerol deshidratasa butandiol deshidratasa La glicerol deshidratasa (E.C. 4.2.1.30) y la diol deshidratasa (E.C. 4.2.1.28), aunque están relacionadas estructuralmente, frecuentemente son distinguidas en el arte basada en varias diferencias que incluyen la especificidad del substrato. Este e emplo demuestra que la glicerol deshidratasa convierte el meso-2, 3-butandiol a 2-butanona. La cepa KLP23/pSYC012 de E. coli recombinante, que comprende los genes de Klebsiella pneumoniae que codifican las subunidades múltiples de glicerol deshidratasa (alfa: SEC ID NO: 145 (región de codificación) y 146 (proteina) , beta: SEC ID NO: 147 (región de codificación) y 148 (proteina) ; y gamma: SEC ID NO: 149 (región de codificación) y 150 (proteina) ) y los genes de Klebsiella pneumoniae que codifica las subunidades múltiples de la glicerol deshidratasa reactivasa (subunidad grande, SEC ID NO: 151 (región de codificación) y 152 (proteina) ; y la subunidad pequeña, SEC ID NO: 153 (región de codificación) y 154 (proteina)), es descrita en Emptage et al., US 6,514,733 y en O 2003089621, que son incorporados aquí para referencia. Un extracto libre de células, sin refinar, de KLP23/pSYC012 fue preparado por los métodos conocidos en el arte. El ensayo de enzima fue efectuado en la ausencia de la luz en el amortiguador HEPES 80 mM, pH 8.2 a 37 °C con la coenzima Bi2 12 µ? y el meso-2 , 3-butandiol 10 mM. La formación de la 2-butanona fue verificada por HPLC (columna Shodex SH-1011 y una columna protectora SH-G con una detección del índice de refracción; H2S04 0.01 M como la fase móvil a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min y una temperatura de la columna de 50 °C; tiempo de retención de la 2-butanona = 40.2 min) . La velocidad de formación de la 2-butanona por la preparación de glicerol deshidratasa se determinó que va a ser de 0.4 nmol/min/mg de proteina sin refinar. Ejemplo 18 Análisis estructural de las dioles/gliceroles deshidratasas por medio de la generación y validación de un perfil HMM para las dioles/gliceroles deshidratasas probadas experimentalmente Las enzimas de diol deshidratasa y glicerol deshidratasa pertenecen a las clases 4.2.1.28 y 4.2.1.30 de las enzimas, respectivamente. Las enzimas en ambas clases son cada uno un complejo de tres subunidades: grande (también llamada alfa), intermedia (también llamada beta) y pequeña (también llamada gamma) . En algunas glicerol deshidratasas las subunidades grande e intermedia se encontró que van a estar fusionadas. Identificación de los miembros de la familia por secuencia La enzima de butandiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca fue utilizada como una enzima prototipo para la identificación de una familia de enzimas de diol y glicerol deshidratasa. Las secuencias de aminoácidos de las subunidades alfa (GenBank No: BAA08099; SEC ID NO: 8), beta (GenBank No: BAA08100; SEC ID NO: 10) y gamma (GenBank No: BAA08101; (SEC ID NO: 12) fueron corridas cada una como una secuencia de investigación en una búsqueda BLASTp contra la base de datos de proteínas no redundantes de GenBank utilizando parámetros de falla. Las secuencias con igualdades o correspondencias relevantes fueron extraídas. La relevancia se juzgó por la evaluación del valor E, la definición de la proteína, los detalles incluidos en el reporte de GenBank para las proteínas igualadas, y la revisión de la literatura sobre este tópico. Para la subunidad grande, la salida de BLAST mostró una reducción abrupta en el valor E desde e-20 hasta un valor E de 1.5. Todas las igualdades de la secuencia con un valor E de 1.5 o más grande, tuvieron definiciones inconsistentes con aquellas que son deshidratasas. Muchas de estas secuencias fueron etiquetadas como subunidades beta de la ARN polimerasa dirigida al ADN . Existen igualaciones con valores E alrededor de e-20, que fueron secuencias parciales. Las secuencias sin anotación fueron incluidas y el valor E fue menor que 1.5. Utilizando la subunidad alfa de la butandiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca como una investigación, se identificaron 50 homólogos como miembros de esta familia de proteínas. Este grupo incluyó algunas secuencias que no fueron proteínas de longitud completa. Las secuencias de longitud completa identificadas por la familia de la subunidad alfa de las dioles/gliceroles deshidratasas son el prototipo de la SEC ID NO: 8 y las SEC ID NOs: 93, 99, 105, 135, 138, 141, 146, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254, 255, 256, 257, 258, y 259. Las SEC ID NOs: 233, 235, 237, 239, 241, 246, 247 incluyen las subunidades tanto alfa como beta, que están fusionadas en estos casos. Utilizando la subunidad beta de la butandiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca como una investigación, se identificaron 51 homólogos como elementos de esta familia de proteínas. Este grupo incluyó algunas secuencias que no fueron proteínas de longitud total. Las secuencias de longitud total identificadas para la familia de la subunidad beta de las dioles/gliceroles deshidratasas son el prototipo SEC ID NO: 10 y SEC ID NOs : 95, 101, 107, 136, 139, 142, 148, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 244, 250, 252, 260, 261, 262, 263, 364, 265, 266, y 167. Utilizando la subunidad gamma de la butandiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca como una investigación, se identificaron 48 homólogos como miembros de esta familia de proteínas. Este grupo incluyó algunas secuencias que no fueron proteínas de longitud completa. Las secuencias de longitud completa identificadas por la familia de la subunidad gamma de las dioles/gliceroles deshidratasas son el prototipo de la SEC ID NO: 12 y la SEC ID NOs: 97 , 103, 109, 137, 140, 143, 150, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 245, 248, 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273, y 274.
Identificación de los miembros de la familia con una función ensayada experimentalmente Para cada secuencia identificada por medio del análisis descrito anteriormente, una búsqueda fue llevada a cabo para la evidencia experimental de su función bioquímica en las bases de datos de BRENDA, UniProt y NCBI Entrez. BRENDA es una base de datos conservada-humana que contiene la información detallada acerca de las propiedades cinéticas, físicas y bioquímicas de la enzima, extraídas de la literatura experimental y que se relacionan con las bases de datos relevantes (Cologne University Biolnformatics Center) . La UniProt Knowledgebase está compuesta de una parte humana-conservada, la base de datos Swiss-Prot y de un suplemento anotado en la máquina, la base de datos TrEMBL. La base de datos Swiss-Prot conservada (Swiss Institute of Bioinformatics) proporciona un nivel elevado de anotación de las proteínas que incluye la arquitectura del dominio, las modificaciones pos-traduccionales y las variantes de la secuencia. NCBI Entrez es el sistema de búsqueda y recuperación a base del texto, integrado, utilizado en NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD) para las bases de datos mayores, incluyendo PubMed y Nucleotide and Protein Sequences, Protein Structures, Complete Genomes y Taxonomy. Por medio del análisis de la información y las referencias identificadas de estas bases de datos, ocho dioles/gliceroles deshidratasas con una función verificada experimentalmente como una diol o glicerol deshidratasa fueron identificadas . Estas están dadas en la tabla 10. Tabla 10 Dioles /gliceroles deshidratasas con una función verif icada expe rimen taimen te Organismo Subunidad GenBank# SEC ID No. Tipo Referencia Klebsiella grande gi|6980836 8 diol Shibata et al., ox toca Structure 1999; K. oxytoca intermedia gi|6980837 10 diol 7:997- 1008 K. oxytoca pequeña gi|6980838 12 diol Klebsiella grande gi|4063702 105 diol Tobimatsu et al., pneumoniae 1998; Biosci.
K. pneumoniae intermedia gi|94470233 107 diol Biotechnol. Biochem.
K. pneumoniae pequeña gi|4063704 109 diol 62: 1774-1777 Clostridium grande gi|3360389 135 glicerol Macis et al., FEMS pasteurianum Microbiol Lett. 1998; C. pasteurianum intermedia gi|3360390 136 glicerol 164( 1 ): 21 -8 C. pasteurianum pequeña gi|3360391 137 glicerol Escherichia grande gi|60099613 138 glicerol Sdnke et al. blattae J. of Mol. Micro, and E. blattae intermedia gi|57340191 139 glicerol Biotech. 2004; 8: 150- E. blattae pequeña gi|57340192 140 glicerol 168 Klebsiella grande gi|24158719 146 glicerol Willard, Thesis pneumoniae (1 94), U of K. pneumoniae intermedia gi|24158720 148 glicerol Wisconsin-Madison K. pneumoniae pequeña gi|24158721 150 glicerol Citrobacter grande gi| 1 169287 141 glicerol Seyfried, Gottschalk; freundii J. Bacterio!. 178: C. freundii intermedia gi| 1229154 142 glicerol 5793-5796 (1996) C. freundii pequeña gi| 1229155 143 glicerol Lactobacillus grande gi| l 16334196 164 diol Schuetz and Radler brevis 1984; Arch.
L. brevis intermedia gi| l 16334195 165 diol Microbiol. 139, 366- L. brevis pequeña gi| 1 16334194 166 diol 370 Lactobacillus grande gi| 1 8857678 99 diol Sauvageot et al., collinoides 2002; Eur J.
L. collinoides intermedia gi| 1 8857679 101 diol Biochem. 269(22): L. collinoides pequeña gi| 1 8857680 103 diol 5731 -7 El conjunto de 8 secuencias de aminoácidos de cada subunidad de las dioles/gliceroles deshidratasas con una función determinada experimentalmente , listada en la tablas 10, fueron comparadas fabricando una alineación de secuencias múltiples utilizando Clustal W con los parámetros de falla. El % de la identidad para las secuencias de la subunidad grande varió desde 97.6 % hasta 58.4 %. El % de la identidad para las secuencias de la subunidad intermedia varió desde 89.5 % hasta 41.7 %. El % de identidad para las secuencias de la subunidad pequeña varió desde 83.3 % hasta 36.4 %. Por consiguiente, la cantidad de identidad de la secuencia entre algunas secuencias de la subunidad fue más baja (tal como 36.4 %, 41.7 %) aún cuando estas subunidades se sabe que van a ser componentes de enzimas conocidas a través de los datos experimentales para efectuar la misma función. El nivel bajo del % de identidad de la secuencia hizo impráctico utilizar este criterio para las correlaciones de la estructura/función. Relación de las secuencias de las dioles/gliceroles deshidratasas verificadas experimentalmente con respecto a otras dioles/gliceroles deshidratasas Para efectuar este análisis, las secuencias altamente redundantes que son > 95 % idénticas fueron removidas del conjunto de las secuencias para las subunidades grande, intermedia o pequeña, excepto que la totalidad de las secuencias de la función verificadas experimentalmente fueron retenidas. Las secuencias de las proteínas truncadas o parciales también fueron removidas. Una alineación de secuencias múltiples fue efectuada sobre las secuencias restantes utilizando Clustal W con los parámetros de falla. El % de identidad para las subunidades grandes varió desde 97.6 % (el % más alto es de las secuencias verificadas experimentalmente, múltiples) hasta 42.8 %. El % de la identidad para las subunidades intermedias varió desde 91.9 % hasta 26.4 %. El % de la identidad para las subunidades pequeñas varió desde 85.2 % hasta 20.5 %. Estos % de las identidades son intervalos semejantes a los % de las identidades para las secuencias verificadas experimentalmente. Basado en las alineaciones de las secuencias múltiples, se construyeron árboles filogenéticos utilizando el algoritmo de unión al entorno (como se implemento en el paquete MEGA software versión 3.1; Kumar et al., 2004 Briefings in Bioinformat ics 5: 150-163) . Los árboles filogenéticos son mostrados en las figuras 2A-2B (subunidad grande), 3 (subunidad intermedia), y 4 (subunidad pequeña), con las identidades de las secuencias mapeadas listadas en una clave para cada figura. Como se observa de las posiciones marcadas para las secuencias de la función ve ificada experimentalmente (en círculos grises oscuros y claros para la diol deshidratasa y la glicerol deshidratasa , respectivamente) , estas secuencias son dispersadas sobre la mayoría de los árboles. Sin embargo, cada árbol incluye una ramificación sin elementos verificados experimentalmente, pero los cuales parece que pertenecen a la familia de la diol/glicerol deshidratasa. Construcción de un Modelo de Markov de Perfil Oculto (HMM) de la familia de la diol/glicerol deshidratasa sobre los conjuntos de ocho secuencias de la subunidad Una caracterización de la estructura/función alternativa de los conjuntos de subunidades de la familia de enzimas de la diol/glicerol deshidratasa fue efectuada utilizando el paquete de software HMMER (la teoría detrás del perfil HMM es descrito en R. Durbin, S. Eddy, A. Krogh, y G. Mitchison, Biological sequence analysis: probabilist ic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, 1998: Krogh et al., 1994; J. Mol. Biol. 235:1501-1531) , siguiendo la guía del usuario que está disponible de HMMER (Janelia Farm Research Campus, Ashbum, VA) . Cada conjunto de 8 secuencias de aminoácidos para las subunidades grande, intermedia, y pequeña de las dioles/gliceroles deshidratasas caracterizadas funcionalmente (en la tabla 10) fueron analizadas separadamente utilizando el programa de software HMMER. El rendimiento del programa de software HMMER es un Modelo de Markov de Perfil Oculto (HMM) que caracteriza las secuencias de entrada. Como se estableció en la guía del usuario, los perfiles de HMM son modelos estadísticos de las alineaciones de secuencias múltiples. Los mismos capturan la información específica para la posición acerca de cómo se conservó cada columna de la alineación, y cuales residuos de aminoácidos es más probable que estén presentes en cada posición. Por consiguiente, los HMM tienen una base probabilí stica formal. Los perfiles de HMM para un gran número de familias de proteínas están disponibles públicamente en la base de datos de PFAM (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA) . Cada perfil fue construido como sigue. Etapa 1. Construcción de una alineación de la secuencia Las ocho secuencias para la subunidad grande de las dioles/gliceroles deshidratasas verificadas funcionalmente (SEC ID NOs: 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146, y 164) fueron alineadas utilizando Clustal W con parámetros de falla. Lo mismo se hizo para el conjunto de secuencias de subunidades intermedias (SEC ID NOs: 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148 y 165) y el conjunto de las secuencias de subunidades pequeñas (SEC ID NOs: 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150 y 166) . Etapa 2. Construcción de un perfil de HMM El programa hmmbuild fue corrido sobre cada conjunto de las secuencias alineadas utilizando los parámetros de falla, hmmbuild lee el archivo de alineación de secuencias múltiples, construye un nuevo perfil de HMM, y guarda el perfil HMM en un archivo. Utilizando este programa se generó un perfil no calibrado de alineaciones múltiples para cada conjunto de secuencias de subunidades descritas anteriormente. La siguiente información basada en la guia del usuario del software de HMMER proporciona alguna descripción de la ruta por la cual el programa hmmbuild prepara un perfil de HMM. Un perfil de HMM es capaz de modelar las alineaciones con huecos, por ejemplo, incluyendo las inserciones y deleciones, que dejan que el software describa un dominio conservado completo (en lugar de solo una porción sin huecos pequeña) . Las inserciones y deleciones son modeladas utilizando los estados de inserción (I) y los estados de deleción (D) . Todas las columnas que contienen más de una cierta fracción x de caracteres del hueco, serán asignados como una columna de inserto. Por un valor de falla, x es fijado en 0.5. Cada estado de correspondencia tiene un estado I y un estado D asociados con el mismo. HMMER requiere un grupo de tres estados (M/D/I) en la misma posición de consenso en la alineación de un "nodo". Estos estados están interconectados con hileras llamadas probabilidades de transición de estado. Los estados M e I son emisores, mientras que los estados D no son emisores. Las transiciones son arregladas de modo que en cada nodo, ya sea el estado M es utilizado (y un residuo es alineado y evaluado) o el estado D es utilizado (y ningún residuo es alineado, conduciendo a un carácter de deleción-hueco, "-") . Las inserciones ocurren entre los nodos, y los estados I tienen una auto-transición, permitiendo que uno o más residuos insertados estén presentes entre las columnas de consenso. Las evaluaciones de los residuos en el estado de igualdad (es decir las evaluaciones de la emisión en el estado de igualdad) , o en un estado de inserto (es decir las evaluaciones de emisión del estado de inserto) son proporcionales a Lod_2 (p_x) / (null_x) . en donde p_x es la probabilidad de un residuo de aminoácidos, en una posición particular en la alineación, de acuerdo con el perfil HMM y null_x es la probabilidad de acuerdo con el modelo Nuil. El modelo Nuil es un modelo probabilistico de un estado, simple, con un conjunto precalculado de probabilidades de emisión para cada uno de los 20 aminoácidos derivados de la distribución de los aminoácidos en SWISSPROT reléase 24. Las evaluaciones de transición de estado también son calculadas como parámetros impares logarítmicos y son proporcionales a Log_2 (t_x) . En donde t_x es la probabilidad de transición a un estado emisor o no emisor. Etapa 3. Calibrar el perfil de HMM Cada perfil de HMM fue leído utilizando hmmcalibrate que evalúa un número grande de secuencias aleatorias sintetizadas con el Perfil (el número de falla de las secuencias sintéticas utilizadas es 5,000), ajusta una distribución del valor de extremo (EVD) al histograma de estas evaluaciones, y vuelve a guardar el archivo de HMM incluyendo ahora los parámetros de EVD. Estos parámetros de EVD (µ y ?) son utilizados para calcular los valores E de las evaluaciones de los bits cuando el perfil es investigado contra una base de datos de la secuencia de proteina. hmmcalibrate escribe dos parámetros en el archivo HMM sobre una linea etiquetada "EVD": estos parámetros son los parámetros µ (localización) y ? (escala) de una distribución del valor de extremo (EVD) que se ajusta mejor a un histograma de valores calculados sobre las secuencias generadas aleatoriamente de aproximadamente la misma longitud y composición de residuos que SWISS-PROT . Esta calibración de hizo una vez para cada perfil de HMM. Los perfiles de HMM calibrados para los conjuntos de subunidades grandes, de subunidades intermedias y de subunidades pequeñas de las secuencias, son provistas en el apéndice como el perfil de HMM alfa, el perfil de HMM beta, y el perfil de HMM gamma de las gráficas de Excel. Cada perfil de HMM es provisto en una gráfica que proporciona la probabilidad de que cada aminoácido este presente en cada posición en la secuencia de aminoácidos. La probabilidad más elevada es realzada en cada posición. La tabla 11 muestra algunas lineas del perfil de HMM para las subunidades grandes de las dioles/gliceroles deshidratasas con una función verificada experimentalmente .
Tabla 11 Una porción del perfil de HMM de la subunidad grande.
Los aminoácidos están representados por el código de una letra. La primera linea para cada posición reporta la igualdad de las evaluaciones de la emisión: probabilidad para que cada aminoácido esté en este estado (el valor más elevado está realzado) . La segunda linea reporta las evaluaciones de emisión del inserto, y la tercera linea reporta sobre las evaluaciones de transición del estado: M—»M, M—>1, M?D; I?M, I?I; D?M, D?D; B?M; M?E . La tabla 11 muestra que para las subunidades grandes, la metionina tiene 4141 probabilidades de estar en la primera posición, la probabilidad más elevada está realzada. En la segunda posición la lisina tiene la probabilidad más elevada, que es de 1954. En la tercera posición la arginina tiene la probabilidad más elevada, que es de 3077.
Etapa 4. Prueba de la especificidad y sensibilidad del perfil de HMM construido Cada perfil de HMM fue evaluado utilizando hmmsearch, que lee un perfil de HMM de hmmfile e investiga un archivo de la secuencia para buscar igualaciones de la secuencia significativamente semejantes. El archivo de la secuencia investigado se realizó en la base de datos de proteínas no redundantes de GenBank. El tamaño de la base de datos (parámetro Z) fue fijado en 1 mil millones. Este ajuste del tamaño asegura que los valores de E significativos contra la base de datos actual permanecerán como significativos en el futuro previsible. El corte del valor E fue fijado en 10. Los perfiles de HMM para las subunidades grandes, intermedias y pequeñas de las dioles/gliceroles de s h idr a t a s a s con una función verificada experimentalmente fueron específicos porque solamente las subunidades de las dioles /gl icerol deshidratadas fueron recuperadas, como está indicado por la anotación de las secuencias igualadas, y sensibles porque aún las secuencias parciales de las subunidades de las dioles/gliceroles deshidratasas fueron recuperadas. Cada una de las secuencias recuperadas tuvieron un valor E de 0.01 o menor.
La totalidad de las secuencias sobre los árboles f i logenét icos y las figuras 2A-2B, 3A-3B y 4A-4B fueron recuperadas durante la igualación del perfil de HMM . Todas las secuencias en las ramificaciones de los árboles que no contienen una secuencia con una función verificada experimentalmente fueron igualadas. Por consiguiente, la totalidad de las dioles y gliceroles de s h i dr a t a s a s fueron relacionadas con las 8 dioles y gliceroles de s h i dr a t a s a s con la función verificada experimentalmente por medio de la igualación con los perfiles de HMM para las subunidades grandes, medias, o pequeñas de las enzimas. Las subunidades de las dioles y gliceroles de s h i dr a t a s a s de longitud total que igualan los perfiles de HMM tuv ieron las siguientes SEC ID NOs Subunidades grandes (alfa) : ii, 93, 99, 105, 135, 138 , 141, 146, 164 , 167 , 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188 , 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209 , 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254 , 255, 256, 257 , 258 , y 259 Subunidades grandes + intermedias fusionadas (la porción de la subunidad grande y de la subunidad intermedia se iguala con el perfil para las subunidades grandes y el perfil para las subunidades intermedias, respectivamente) : 233, 235, 237, 239, 241, 246, y 247.
Subunidades intermedias (beta) : 10, 95, 101 , 107 , 136, 139, 142 , 148 , 165, 168, 171, 174, 177 , 180, 183 , 186, 189, 192 , 195, 198 , 201, 204 , 207 , 210 , 213, 216, 219, 222 , 225, 228 , 231 , 244 , 250 , 252 , 260 , 261, 262, 263, 364 , 265, 266, y 167 Subunidades pequeñas ; ( gamma ) : 12, 97, 103, 109, 137 , 140, 143, 150 , 166, 169, 175, 175, 178 , 181, 184 , 187 , 190, 193, 196, 199, 202 , 205 , 208 , 211, 214 , 217 , 220 , 223 , 226, 229, 232 , 234 , 236, 238 , 240 , 242 , 245 , 248 , 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273, y 274. Este análisis muestra que el perfil de HMM para cada subunidad, que fue preparado utilizando las secuencias con una función verificada experimentalmente , proporciona una estructura que está relacionada con la función de las enzimas de diol /gl icerol deshidratasa. La igualación de la totalidad de las secuencias anteriores con respecto a los perfiles de HMM proporciona su vez una relación de la e s t r uc t u r a / f une i ón para estas secuencias.
TABLA 12 HMMER2.0 [2.3.2] Nombre del programa y versión AME alpha_exp_seqs Nombre del archivo de alineación de la secuencia de entrada LENG 557 Longitud de la alineación; incluyendo los indels ALPH Andno Tipo de residuos MAP yes El mapa de igualdad establece las columnas de la alineación OCM hrmbuild alpha. rati alpha_exp_seqs.ain Comandos utilizados para generar el archivo: esto significa que hmrbuild (parámetros de falla) fue aplicado al archivo de alineación CC nmoalibrate alpa.hrmi Comandos utilizados para generar el archivo: esto significa que hmmcalibrate (parámetros de falla) fue aplicado al perfil de hmm NSBQ 8 Número de secuencias en el archivo de alineación Fecha vier. 30 mar 2007 19:02:15 Cuando fue generado el archivo XT-8455-4-1000-1000-8455-4-8455-4 NULT-4-8455 La distribución de la probabilidad de transición para el modelo nulo (Estado G sencillo) NULO 595 -155885338 -294453 -1158197249902 -1085 -142 -21 -31345531201384 -1998 -644 La distribución de la probabilidad de la emisión del símbolo para el modelo nulo (estado G) (por ejemplo 4 ó 20) números enteros. La probabilidad nula utilizada para convertir estos de regreso a las probabilidades del modelo es 1/K. 3( ) -781 -1268 •994 -512 •1638 -1313 •151 •1479 778 •1459 •913 -539 •1557 136 -831 -760 •1263 -1437 -1152 3 - -149 •500 233 43 -381 399 106 -626 210 -466 -720 275 394 45 96 359 117 •369 -294 -249 - -41 -5736 -6778 -894 -1115 -535 -1690 * • -149 -1077 25 226 •1650 -945 •85 •1408 309 -1505. -735 33 •1280 ? -34 1644 -225 -1020 -1731 -1155 4 - -149 -500 233 43 -381 399 106 -626 210 -466 -720 275 394 45 96 359 117 -369 •294 -249 - -33 -6045 -7087 -894 -1115 -701 -1378 • 5 K) •1028 -1686 -800 •442 -2171 •1521 -263 -1873 -1859 -1251 -547 -1750 74 · 599 -1004 -972 -1620 -1812 -1528 5 - -149 -500 233 43 -381 399 108 -626 210 -466 -720 275 394' 45 96 359 117 -369 -294 -249 - -33 -6045 -7087 -894 -1115 -701 -1378. - - 6(R) -1181 -1614 -1431 •003 -2066 -1632 -446 •1944 569 -1887 -1326 •899 -1873 -156 -1225 - 148 -1717 -1746 - 529 6 - •149 -500 233 43 -381 399 108 -628 210 -466 -720 275 394 45 96 359 117 -369 -294 -249 -33 •6045 -7087 -894 -1115 -701 -1378 • • 7(F) -1602 -1340 -2512 -2455 •2315 -379 -478 -2225 -175 -180 -1874 -2503 -1781 -2079 -1892 -1647 -683 210 1257 7 - -149 •500 233 43 -381 399 108 -626 210 •486 -720 275 394 45 96 359 117 -294 -249 -33 ¦6045 -7087 •894 -1115 -701 •1378 * • 8(E) 37 -1709 562 w •2000 -1013 65 -1701 388 -1724 -924 314 -1290 1204 -72 •263 -376 -1331 -1960 -1293 B - -149 -500 233 43 -381 399 106 •620 210 -466 -720 275 394 45 98 359 117 -369 -294 -249 - -33 -6045 -7087 •894 •1115 -701 • 378 9{V) 428 •898 -212 744 •1083 -1160 90 -556 881 -841 -94 22 -1284 414 20 -168 -65 -1268 -753 9 - -149 •500 233 43 -381 399 106 •628 210 -466 -720 275 394 45 98 359 117 -369. -294 -249 - -33 -6045 -7087 -894 -1115 -701 -1378 * • 10(L) -1369 -1189 -2542 -2285 -129 -2453 •1603 488 -1867 ??ß?¾ 742 -2168 -2539 -1724 -1835 -1B92 -1384 130 -1284 -897 10 - -149 -500 233. 43 •381 399 106 -628 210 -468 -720 275 394 45 96 359 117 -366 -294 -249 - -33 -6045 -7087 -894 -1115 -701 -1378 • • 11(E) 995 •1189 274 nssa -1710 -927 -3 -1362 257 -1488 •682 191 -1227 366 -212 521 -177 •986 •1785 -1178 11 - -149 •500 233 43 -381 399 106 -626 210 -466 -720 275 394 45 96 359 117 -368 -294 -249 - -33 -6045 -7087 -894 -1115 -701 -1378 * * o - 1 -33 | -604d| -7087| -894 |-1115 -701 |-1378| * | * | 28(0) -758 -1103 -1313 -1487 •2460 3331 -1562 -2502 -1720 -2644 -2081 •1324 -1775 -1590 -1780 -958 -1093 -1921 -2198 -2279 28 - -148 -500 233 43 -381 399 106 -626 210 -466 -720 275 394 45 96 359 117 -369 [ -294 -249 - -33 •6045 -7087 •894 -1115 -701 -1376 • • 29(F) -1300 -1032 -2939 -2479 rzoesj -2797 •1060 610 -2170 2072 1034 -2173 •2620 -1672 •2063 -1972 •1227 200 -496 232 29 - •149 -500 233 43 •381 389 106 -626 210 -466 -720 275 394 45 96 3S9 117 •369 -294 -249 - -33 -6045 -7087 •894 -1115 -701 •1378 * » (1) -932 -616 -3069 -2823 -730 -2845 -2140 •2385 279 372 -2420 -2786 •2188 -2440 -2065 -921 2194 -1936 -1554 30 - -149 -500 233 43 -381 399 106 -626 210 -466 -720 275 394 45 96 359 117 -369 -294 -249 - •33 •6045 -7087 -894 -1115 -701 -1378 « • 31(A) 2806 -444 -1270 -1265 -1732 -74 -1182 -1034 -1212 -1545 -1010 -869 -1380 -1102 -1325 -158 •259 •840 -2039 -1721 31 - -149 -soo 233 43 -381 399 106 •626 210 -466 -720 275 394 45 86 359 117 -369 -294 -249 - -33 -6045 -7087 -894 -1115 -701 -1378 * * 32(M) -1097 -94$ -2613 -2096 66 -2604 •1439 782 -1681 1467 "3576 -2007 -2489 -1444 •1696 -1772 -1045 428 -1173 -886 32 - -149 -500 233 43 -381 399 108 -826 210 -466 -720 275 394 45 96 359 117 -369 -294 -249 - -33 -6045 -7087 -894 , -1115 -701 -1378 • * 33(E) •103 -1383 474 1130 •1629 -475 238 -1330 588 -1372 919 886 -1165 659 86 417 -61 -967 -1624 -981 33 - •149 -500 233 43 -381 399 106 -626 210 ¦466 -720 275 394 45 96 359 117 •369 -294 •249 - -33 -6045 -7087 -894 -1115 -701 •1378 • * 34(S) 317 -370 -658 -61B -1967 1419 -807 -1713 -760 •1924 -1109 -411 -1164 -588 -1027 2116 -11 -1006 -2151 -1737 34 - -149 -500 233 43 •381 399 106 •626 210 -488 -720 275 394 45 98 359 117 -3BS -294 -249 - -33 -6045 -7087 -894 -1115 -701 -1378 • • 35(P) -405 •1216 -191 T -1782 -1120 -188 -1451 1187 -1681 -850 -164 ,2497 138 133 •424 -456 -1124 -1757 -1301 35 - -149 -500 233 43 -361 399 106 -626 210 -466 -720 275 394 45 96 359 117 -369 •294 •249 - -33 •6045 -7087 -894 -1115 -701 -1378 • • 440) •935 •625 •3052 -2609 -708 •2832 •2125 -2364 307 391 -2408 -2777 -2168 -2419 -2052 -926 2060 -1920 -1540 44 - -149 •500 233 43 -381 399 108 -628 210 -466 -720 275 394 45 96 359 117 -369 -294 -249 • -33 -6045 -7087 -894 - 115 -701 -1378 • * 45(E) -190 -1482 610 m -1728 • 033 193 -1411 949 -1462 •616 305 -1203 607 49 -87 -141 -15 -1713 -1064 45 - -149 -500 233 43 -381 399 106 -828 210 -466 -720 275 3S4 45 96 359 117 -389 -294 -249 - -33 -6045 -7087 •894 -1115 -701 -1378 * • 46(N) -508 -1893 708 1172 -2155 -1000 25 •1908 309 -1897 -1104 ¾BS -1320 976 -163 -338 -492 -1519 -2098 -1394 48 - -149 •500 233 43 -381 399 106 -628 210 •468 -720. 275 384 45 BB 359 117 -369 -294 -249 - -33 -6045 -7087 •894 -1116 -701 -137B • * 47(G) -758 -1 03 -1313 -1487 •2480 m -1582 -2502 -1720 -2644 -2081 -1324 -1775 -1590 -1790 -958 •1093 -1921 -2198 -2279 47 - -149 -500 233 43 •381 399 108 -626 210 -466 -720 275 384 45 96 359 117 -369 -264 -249 - -33 -6045 -7087 -894 -1115 -701 -1378 • • 4ß{?) 398 -959 -358 223 -1120 -1205 148 -688 -524 -121 8 -1289 492 847 -178 -70 241 -1280 •760 48 - •149 -500 233 43 -381 399 106 -626 210 •466 -720 275 394 45 66 359 117 ¦366 -294 -249 - -33 -6045 -7087 •894 -1115 -701 -1378 • * 48(V) -905 -603 -3012 -2567 -752 -2794 -2098 2117 -2327 233 342 -2367 -2755 -2145 -2394 -2012 -898 -1933 -1537 49 - -149 •500 233 43 -381 399 106 •626 210 ¦466 -720 275 394 45 96 359 117 gm •294 •249 - -33 -6045 -7087 -694 -1115 -701 -1378 * • 50(V) -367 -384 •1856 -1345 •565 -1819 •984 1488 -1115 20 389 -1247 -1954 -968 -1285 -941 1596 -1282 -891 50 - -149 •500 233 43 -381 399 106 •626 210 -468 -720 275 394 45 96 359 117 •366 -294 •249 - -33 •6045 -7087 •894 -1115 -701 -1378 • * 51(E) •988 -1921 379 -2309 -1198 •495 -2108 -350 -2194 -1612 -103 -1621 -210 -770 •662 -1042 -1799 -2207 -1742 51 - -149 -500 233 43 -381 399 108 -628 210 -466 -720 275 394 46 98 359 117 -369 -294 •249 - -33 -6045 -7087 •894 -1116 -701 - 378 * • 52(M) -1262 -1030 •2945 •2401 126 -2872 -1670 808 -2031 2152 -2305 -2645 -1652 •1984 •2035 -1186 370 -1224 -1041 52 - -149 -500 233 43 -381 399 106 -626 210 •466 ?7? 275 394 45 96 359 117 -368 -294 -249 - -33 -6045 -70B7 -694 -1115 -701 -1378 * • 53(D) -1130 •2063 £tf ll 243 -2502 -1157 -662 -2514 -843 -2578 -2029 -88 -1658 -421 -1434 •970 -1239 •2138 •2388 -1915 53 - 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-149 -500 233 43 -381 399 106 -626 210 -466 -720 275 364 45 96 359 117 -369 -294 -249 - -12 -7442 •6484 -894 -1115 -701 -1378 * « 144(E) •2080 -3966 2020 ¾228? -4159 -1924 -1325 -4125 -1833 -3985 -3364 -528 -2480 -1008 -2526 -1723 -2163 -3592 -4133 -3124 144 - -149 -500 233 43 -381 399 106 -626 210 -468 -720 275 394 45 96 359 117 •369 -294 -249 - -12 -7442 -84B4 •894 -1115 -701 -1378 • • U5(U -3371 -2888 -4716 -4628 - 407 -4203 -3653 -947 -4306m -381 -4472 -4191 -3767 -3993 -4264 -3364 -1600 -2791 -2682 145 - -149 -500 233 43 -381 399 106 -626 210 -466 -720 275 364 45 96 359 117 -369 -294 -249 - -12 -7442 -8484 -694 -1115 -701 -1378 * • 169( ) -963 -2461 926 23 -2770 -1679 1437 -2530 2489 -2458 -1580 1750 •1887 -51 -577 -804 -916 -2086 -2613 -1914 169 - -149 •500 233 43 -381 399 106 -626 210 -466 -720 275 394 45 98 359 117 -369 -294 -249 - -12 -7442 4484 -894 -1115 -701 -1378 * * 170( ) -3217 -3413 -3082 -2664 -4291 -3257 -2104 -?231 3883 -3955 -3433 -2635 -3520 -1813 -964 -3215 -3130 -3953 -3447 •3538 170 - -149 -500 233 43 -381 399 108 •626 210· -466 -720 275 394 45 96 359 117 -369 -294 -249 - -12 -7442 •8484 -894 -1115 -701 -1378 • 171ft.) -2582 -2146 -4846 -4375 -908 -4427 -3477 110 -4068 2853 256 -4182 ¦4041 -3350 -3803 -3735 -2504 1163 -2519 -2467 171 - -149 -600 233 43 -381 399 108 -626 210 -466 -720 275 394 45 96 358 , 117 -369 -264 -246 - -12 -7442 •8484 -894 -1115 -701 -1378 * * 172(?) -2474 -3104 -3210 -1788 -4002 -2957 •830 -3301 ¾94? -2931 -2275 -1649 •2892 -412 2812 -2351 -2137 -3082 -2748 -2679 172 - -149 -500 233 43 •381 399 106 -626 210 -466 -720 275 394 45 98 359 117 •369 -294 -249 •12 -7442 -8484 •894 -1115 -701 -1378 * * 173(G) -1037 -1749 •1285 -849 -2174 2283 ¦841 794 1846 -1893 -1188 -977 -2185 -518 -441 -1114 -1045 -1375 -2263 -1816 173 -149 -500 233 43 -381 399 106 -626 210 -466 -720 275 394 45 96 359 117 -369 -294 -249 - -12 -7442 -8484 -894 -1115 -701 -1378 * • 174(D) -1S39 -3820 3052 1863 •4026 1028 -1223 -3952 -1477 -3823 -3155 •460 -2399 -893 -2340 -1601 -2010 -3421 -4014 -3000 174 - -149 -500 233 43 -381 399 106 ¦626 210 -466 -720 275 394 45 9S 359 117 -369 -264 -249 - -12 -7442 -8484 -894 -1115 -701 -1378 • • 175(H) 355 -2563 2286 -73 -3075 •1686 -794 -2864 -«38 -2825 -1980 2330 ? -2039 -399 -1233 944 -1176 -2366 -3020 -2262 175 - - • • • • * • • 0 Se hace constar que con relación , a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (43)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una célula hospedera microbiana recombinante, caracterizada porque comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto, seleccionado del grupo que consiste de: i) piruvato al alfa-acetolactato ; ii) alfa-acetolactato a la acetoina; iii) acetoina al 2 , 3-butandiol ; iv) 2 , 3-butandiol a la 2-butanona; y v) 2-butanona al 2-butanol; en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana y en donde la célula hospedera microbiana produce 2-butanol.
  2. 2. Una célula hospedera microbiana recombinante, caracterizada porque comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto, seleccionado del grupo que consiste de: i) piruvato al alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato a la acetoina; iii) acetoina al 2 , 3-butandiol ; y iv) 2 , 3-butandiol a la 2-butanona; en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana y en donde la célula hospedera microbiana produce 2-butanona.
  3. 3. Una célula hospedera de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de piruvato a alfa-acetolactato es la acetolactato sintasa.
  4. 4. Una célula hospedera de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de alfa-acetolactato a la acetoina es la acetolactato descarboxilasa .
  5. 5. Una célula hospedera de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de acetoina al 2 , 3-butandiol es la butandiol deshidrogenasa .
  6. 6. Una célula hospedera de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de 2,3-butandiol a la 2-butanona es la diol deshidratasa o glicerol deshidratasa .
  7. 7. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de 2-butanona a 2-butanol es la butanol deshidrogenasa.
  8. 8. Una célula hospedera de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque es seleccionada del grupo que consiste de: una bacteria, una cianobacteria , un hongo filamentoso y una levadura.
  9. 9. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque es un miembro de un género seleccionado del grupo que consiste de: Clostridium, Zymomonas , Escherichia , Salmonella , Rhodococcus , Pseudomonas , Bacillus , Lactobacillus , Enterococcus , Pediococcus , Alcaligenes , Klebsiella , Paenibacillus , Arthrobacter, Corynebacterium , Brevibacterium , Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces .
  10. 10. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la acetolactato sintasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 77, y SEC ID NO: 79 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina.
  11. 11. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la acetolactato descarboxilasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 81 y SEC ID NO: 83 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina .
  12. 12. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la butandiol deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:6, SEC ID NO:85, SEC ID NO:87, y SEC ID NO:89, basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina .
  13. 13. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprenden las subunidades grandes, intermedias y pequeñas, de longitud completa, que proporcionan cada una un parámetro de valor E de 0.01 o menor cuando es investigada utilizando un Modelo de Markov de Perfil Oculto preparado utilizando las subunidades grandes de las SEC ID NOs: 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146, y 164; las subunidades intermedias de las SEC ID NOs: 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148, y 165; y las subunidades pequeñas de las SEC ID NOs: 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150, y 166; cada investigación es llevada a cabo utilizando el algoritmo hmmsearch en donde el parámetro Z es fijado en 1 mil millones.
  14. 14. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa son identificadas por un proceso que comprende las etapas de: a) generar un Modelo de Markov de Perfil Oculto a partir de la alineación de las secuencias de aminoácidos que corresponden a las subunidades grandes, intermedias y pequeñas de las enzimas de diol y glicerol deshidratasa en donde; i) la subunidad grande comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146, y 164; ii) la subunidad intermedia comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148 y 165; y iii) la subunidad pequeña comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150, y 166; b) investigar al menos una base de datos pública de las secuencias de proteínas que contienen las secuencias de las dioles y gliceroles deshidratasas con el Modelo dé Markov de Perfil Oculto de (a) utilizando el algoritmo hmmsearch en donde el parámetro Z del es fijado en 1 mil millones y el parámetro del valor E es fijado en 0.01, para identificar un primer conjunto de datos de las secuencias de aminoácidos de la diol y glicerol deshidratasa ; y c) remover cualesquiera secuencias parciales del primer conjunto de datos (b) para generar un segundo conjunto de datos de las secuencias de aminoácidos de diol y glicerol deshidratasa, en donde las enzimas de diol deshidratasa y de glicerol deshidratasa son identificadas.
  15. 15. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprenden una subunidad grande que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 8, 93, 99, 105, 135, 138, 141, 146, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254, 255, 256, 257, 258, y 259, basado en el método Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina.
  16. 16. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprenden una subunidad intermedia que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs : 10,- 95, 101, 107, 136, 139, 142, 148, 165, 168, 171, 174 , 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 244, 250, 252, 260, 261, 262, 263, 364, 265, 266, y 167 basado en el método Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina.
  17. 17. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprenden una subunidad pequeña que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 12, 97, 103, 109, 137, 140, 143, 150, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 245, 248, 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273, y 274, basado en el método Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina .
  18. 18. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprenden subunidades grandes, intermedias, y pequeñas, fusionadas, que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs : 233, 235, 237, 239, 241, 246, y 247, basado en el método Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina.
  19. 19. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprenden subunidades grandes, intermedias y pequeñas, fusionadas, y tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos que comprende la totalidad de las tres secuencias de aminoácidos que codifican las subunidades grandes, intermedias y pequeñas, seleccionadas del grupo que consiste de: a) SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, y SEC ID NO: 12; b) SEC ID NO: 93, SEC ID NO: 95, y SEC ID NO: 97; c) SEC ID NO: 99, SEC ID NO: 101, y SEC ID NO: 103; d) SEC ID NO: 105, SEC ID NO: 107, y SEC ID NO: 109 e) SEC ID NO: 135, SEC ID NO: 136, y SEC ID NO: 137 f) SEC ID NO: 138, SEC ID NO: 139, y SEC ID NO: 140 g) SEC ID NO: 146, SEC ID NO: 148, y SEC ID NO: 150 h) SEC ID NO: 141, SEC ID NO: 142, y SEC ID NO: 143; e i) SEC ID NO: 164, SEC ID NO: 165, y SEC ID NO: 166; basado en el método Clustal W de alineación utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina.
  20. 20. Una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la butandiol deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:14, SEC ID NO:72, SEC ID NO:75, y SEC ID NO:91, basado en el método Clustal W de alineación utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina.
  21. 21. Un método para la producción de 2-butanol, caracterizado porque comprende: 1) proporcionar una célula hospedera microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza la conversión de un substrato al producto, seleccionado del grupo que consiste de: i) piruvato al alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato a la acetoina; iii) acetoina al 2 , 3-butandiol ; iv) 2 , 3-butandiol a la 2-butanona; y v) 2-butanona al 2-butanol; en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana; y 2) poner en contacto la célula hospedera de (1) con un substrato de carbón fermentable en un medio de fermentación bajo condiciones por las cuales es producido el 2-butanol.
  22. 22. Un método para la producción de 2-butanona, caracterizado porque comprende: 1) proporcionar una célula hospedera microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza la conversión de un substrato al producto, seleccionado del grupo que consiste de: 1) piruvato al alfa-acetolactato ; ii) alfa-acetolactato a la acetoina; iü) acetoina al 2 , 3-butandiol ; y iv) 2 , 3-butandiol a la 2-butanona; en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a la célula hospedera microbiana; y 2) poner en contacto la célula hospedera de (1) con un substrato de carbón fermentable en un medio de fermentación bajo condiciones por las cuales se produce la 2-butanona.
  23. 23. Un método de conformidad con las reivindicaciones 21 ó 22, caracterizado porque el substrato de carbón fermentable es seleccionado del grupo que consiste de monosacáridos , oligosacáridos , y polisacáridos .
  24. 24. Un método de conformidad con las reivindicaciones 21 ó 22, caracterizado porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de piruvato al alfa acetolactato es la acetolactato sintasa.
  25. 25. Un método de conformidad con las reivindicaciones 21 ó 22, caracterizado porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto del alfa-acetolactato a la acetoina es la acetolactato descarboxilasa .
  26. 26. Un método de conformidad con las reivindicaciones 21 ó 22, caracterizado porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de acetoina a 2,3-butandiol es la butandiol deshidrogenasa .
  27. 27. Un método de conformidad con las reivindicaciones 21 ó 22, caracterizado porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de 2 , 3-butandiol a 2-butanona es la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa .
  28. 28. Un método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el polipéptido que cataliza una conversión del substrato al producto de la 2-butanona al 2-butanol es la butanol deshidrogenasa.
  29. 29. Un método de conformidad con las reivindicaciones 21 ó 22, caracterizado porque la célula es seleccionada del grupo que consiste de: una bacteria, una cianobacteria , un hongo filamentoso, y una levadura.
  30. 30. Un método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la célula es un elemento seleccionado del grupo que consiste de: Clostridium, Zymomonas, Escherichia , Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas , Bacillus, Lactobacillus , Enterococcus , Pediococcus , Alcaligenes , Klebsiella , Paenibacillus , Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium , Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces .
  31. 31. Un método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la acetolactato sintasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 77 y SEC ID NO: 79 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina.
  32. 32. Un método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la acetolactato descarboxilasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 81 y SEC ID NO: 83 basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina.
  33. 33. Un método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la butandiol deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 85, SEC ID NO: 87, y SEC ID NO: 89, basado en el método de alineación de Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y la serie Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina.
  34. 34. Un método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprenden las subunidades grandes, intermedias y pequeñas, de longitud completa, que proporcionan cada una un parámetro de valor E de 0.01 o menor cuando es investigada utilizando un Modelo de Markov de Perfil Oculto preparado utilizando las subunidades grandes de las SEC ID NOs: 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146, y 164; las subunidades intermedias de las SEC ID NOs: 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148, y 165; y las subunidades pequeñas de las SEC ID NOs: 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150, y 166; cada investigación es llevada a cabo utilizando el algoritmo hmmsearch en donde el parámetro Z es fijado en 1 mil millones.
  35. 35. Un método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa son identificadas por un proceso que comprende las etapas de: a) generar un Modelo de Markov de Perfil Oculto a partir de la alineación de las secuencias de aminoácidos que corresponden a las subunidades grandes, intermedias y pequeñas de las enzimas de diol y glicerol deshidratasa en donde; i) la subunidad grande comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146, y 164; ii) la subunidad intermedia comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148 y 165; y iii) la subunidad pequeña comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150, y 166; b) investigar al menos una base de datos pública de las secuencias de proteínas que contienen las secuencias de las dioles y gliceroles deshidratasas con el Modelo de Markov de Perfil Oculto de (a) utilizando el algoritmo hmmsearch en donde el parámetro Z del es fijado en 1 mil millones y el parámetro del valor E es fijado en 0.01, para identificar un primer conjunto de datos de las secuencias de aminoácidos de la diol y glicerol deshidratasa; y c) remover cualesquiera secuencias parciales del primer conjunto de datos (b) para generar un segundo conjunto de datos de las secuencias de aminoácidos de diol y glicerol deshidratasa, en donde las enzimas de diol deshidratasa y de glicerol deshidratase son identificadas.
  36. 36. Un método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprenden una subunidad grande que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs : 8, 93, 99, 105, 135, 138, 141, 146, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254, 255, 256, 257, 258, y 259, basado en el método Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina.
  37. 37. Un método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprenden una subunidad intermedia que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 10, 95, 101, 107, 136, 139, 142, 148, 165, 168, 171, 174 , 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 244, 250, 252, 260, 261, 262, 263, 364, 265, 266, y 167 basado en el método Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina.
  38. 38. Un método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprenden una subunidad pequeña que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs : 12, 97, 103, 109, 137, 140, 143, 150, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 245, 248, 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273, y 274, basado en el método Clustal W utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina .
  39. 39. Un método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprenden subunidades grandes, intermedias, y pequeñas, fusionadas, que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 233, 235, 237, 239, 241, 246, y 247, basado en el método Clustal utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina.
  40. 40. Un método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprenden subunidades grandes, intermedias y pequeñas, fusionadas, y tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos que comprende la totalidad de las tres secuencias de aminoácidos que codifican las subunidades grandes, intermedias y pequeñas, seleccionadas del grupo que consiste de: a) SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, y SEC ID NO: 12; b) SEC ID NO: 93, SEC ID NO: 95, y SEC ID NO: 97; c) SEC ID NO: 99, SEC ID NO: 101, y SEC ID NO: 103; d) SEC ID NO: 105, SEC ID NO: 107, y SEC ID NO: 109; e) SEC ID NO: 135, SEC ID NO: 136, y SEC ID NO: 137; f) SEC ID NO: 138, SEC ID NO: 139, y SEC ID NO: 140; g) SEC ID NO: 146, SEC ID NO: 148, y SEC ID NO: 150; h) SEC ID NO: 141, SEC ID NO : 142, y SEC ID NO: 143; e i) SEC ID NO: 164, SEC ID NO: 165, y SEC ID NO: 166; basado en el método Clustal W de alineación utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina.
  41. 41. Un método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la butanol deshidrogenasa tiene una secuencia dé aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 72, SEC ID NO: 75, y SEC ID NO: 91, basado en el método Clustal W de alineación utilizando los parámetros de falla de PENALIDAD POR HUECO = 10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL HUECO = 0.1, y las series Gonnet 250 de la matriz en peso de la proteina.
  42. 42. Un medio de producto de fermentación que contiene 2-butanol, caracterizado porque es producido por el método de conformidad con la reivindicación 21.
  43. 43. Un medio de producto de fermentación que contiene 2-butanona, caracterizado porque es producido por el método de conformidad con la reivindicación 22.
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Families Citing this family (194)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070029252A1 (en) 2005-04-12 2007-02-08 Dunson James B Jr System and process for biomass treatment
CA2604964C (en) 2005-04-12 2014-12-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Treatment of biomass to obtain a target chemical
US9303225B2 (en) 2005-10-26 2016-04-05 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for the production of isobutanol by recombinant yeast
US8273558B2 (en) 2005-10-26 2012-09-25 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
US8945899B2 (en) 2007-12-20 2015-02-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Ketol-acid reductoisomerase using NADH
US8206970B2 (en) * 2006-05-02 2012-06-26 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Production of 2-butanol and 2-butanone employing aminobutanol phosphate phospholyase
US8828704B2 (en) 2006-05-02 2014-09-09 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
US7541173B2 (en) 2006-06-15 2009-06-02 E.I. Du Pont De Nemours And Company Solvent tolerant microorganisms and methods of isolation
KR20090090319A (ko) 2006-10-31 2009-08-25 메타볼릭 익스플로러 높은 수율로 글리세롤로부터 1,3-프로판디올을 생물학적으로 생산하는 방법
US8017364B2 (en) * 2006-12-12 2011-09-13 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Solvent tolerant microorganisms
KR100971790B1 (ko) * 2006-12-15 2010-07-23 바이오퓨얼켐 주식회사 Butyryl-CoA를 중간체로 하여 부탄올을 생합성하는 능력을가지는 박테리아를 이용하여 부탄올을 제조하는 방법
WO2008074794A1 (en) * 2006-12-19 2008-06-26 Dsm Ip Assets B.V. Butanol production in a prokaryotic cell
US8673601B2 (en) 2007-01-22 2014-03-18 Genomatica, Inc. Methods and organisms for growth-coupled production of 3-hydroxypropionic acid
CA2677309A1 (en) * 2007-02-08 2008-07-14 Biofuelchem Co., Ltd. Method for preparing butanol through butyryl-coa as an intermediate using yeast
CN105936887A (zh) 2007-03-16 2016-09-14 基因组股份公司 用于1,4-丁二醇和其前体生物合成的组合物和方法
ES2426070T3 (es) 2007-04-18 2013-10-21 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Producción fermentativa de isobutanol utilizando enzimas cetol-ácido reductoisomerasas muy activas
US8426174B2 (en) * 2007-05-02 2013-04-23 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Method for the production of 2-butanol
US20080274522A1 (en) * 2007-05-02 2008-11-06 Bramucci Michael G Method for the production of 2-butanone
CN104726350A (zh) * 2007-06-08 2015-06-24 丹尼斯科美国公司 异源和同源纤维素酶表达体系
US7947483B2 (en) 2007-08-10 2011-05-24 Genomatica, Inc. Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol
WO2009045637A2 (en) * 2007-08-10 2009-04-09 Genomatica, Inc. Methods for the synthesis of acrylic acid and derivatives from fumaric acid
US7819976B2 (en) 2007-08-22 2010-10-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Biomass treatment method
US20090215137A1 (en) 2007-10-31 2009-08-27 Gevo, Inc. Methods for the economical production of biofuel precursor that is also a biofuel from biomass
US8193402B2 (en) 2007-12-03 2012-06-05 Gevo, Inc. Renewable compositions
CN101952398B (zh) 2007-12-03 2014-05-21 格沃股份有限公司 可再生组合物
US8114641B2 (en) * 2007-12-10 2012-02-14 Synthetic Genomics, Inc. Methylbutanol as an advanced biofuel
WO2009079183A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-25 Abengoa Bioenergy R & D Improved quality and value of co-products of the ethanol production industry
RU2010129915A (ru) 2007-12-17 2012-01-27 Университейт Ван Амстердам (Nl) Стимулируемое светом восстановление co2 до органических соединений, служащих топливами или промышленными полуфабрикатами, в автотрофах, содержащих кассету с генами ферментов
US8372612B2 (en) * 2007-12-21 2013-02-12 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Production of four carbon alcohols using improved strain
US8518678B2 (en) * 2007-12-21 2013-08-27 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Strain comprising increased expression of a CFA coding region for butanol production
US20090162911A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-25 E.I. Du Pont De Nemours And Company Strain for butanol production
EP2072621A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-24 DSM IP Assets B.V. Solvent tolerant microorganisms
CN107090424A (zh) 2008-01-22 2017-08-25 基因组股份公司 利用合成气或其它气态碳源和甲醇的方法和有机体
JP2011512144A (ja) * 2008-02-21 2011-04-21 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア γ−アミノ酪酸の生産方法
ES2703775T3 (es) 2008-03-05 2019-03-12 Genomatica Inc Organismos productores de alcoholes primarios
EP3666899A3 (en) * 2008-03-11 2020-09-02 Genomatica, Inc. Preparation of 6-aminocaproic acid from 5-formylvaleric acid
CN113430119A (zh) 2008-03-27 2021-09-24 基因组股份公司 用于产生己二酸和其他化合物的微生物
KR101100866B1 (ko) 2008-04-14 2012-01-02 한국과학기술원 게놈 수준에서의 부탄올 생산 미생물의 대사 네트워크 모델 및 이를 이용한 부탄올 생성 미생물의 대사특성분석 및 결실 표적 스크리닝 방법
US8188250B2 (en) * 2008-04-28 2012-05-29 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Butanol dehydrogenase enzyme from the bacterium Achromobacter xylosoxidans
WO2009135074A2 (en) * 2008-05-01 2009-11-05 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of methacrylic acid
US8389252B2 (en) 2008-05-12 2013-03-05 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Yeast strain for production of four carbon alcohols
US8906666B2 (en) 2008-05-22 2014-12-09 Butamax Advanced Biofuels Llc Engineering resistance to aliphatic alcohols
CA2723874A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Butamaxtm Advanced Biofuels Llc Deletion mutants for the production of isobutanol
US8828695B2 (en) * 2008-06-04 2014-09-09 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for producing butanol using two-phase extractive fermentation
CA2723877C (en) 2008-06-04 2017-10-24 Butamaxtm Advanced Biofuels Llc A method for producing butanol using two-phase extractive fermentation
US20100112649A1 (en) * 2008-06-04 2010-05-06 Willson Bryan Dennis Compositions, methods and uses for growth of microorganisms and production of their products
BRPI0909989A2 (pt) 2008-06-05 2021-06-22 Butamax Advanced Biofuels Llc célula de levedura recombinante e método para a produção de um produto
PT2307556T (pt) 2008-06-09 2020-10-23 Lanzatech New Zealand Ltd Produção de butanodiol mediante fermentação microbiana anaeróbia
WO2009155382A1 (en) * 2008-06-17 2009-12-23 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of fumarate, malate, and acrylate
WO2010030711A2 (en) 2008-09-10 2010-03-18 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol
WO2010031772A2 (en) * 2008-09-16 2010-03-25 Dsm Ip Assets B.V. Alternative butanol production process in a microbial cell
ES2521675T3 (es) 2008-09-29 2014-11-13 Butamax Advanced Biofuels Llc Identificación y uso de [2Fe-2S]-dihidroxi-ácido deshidratasas bacterianas
WO2010037114A1 (en) * 2008-09-29 2010-04-01 Butamax™ Advanced Biofuels LLC Enhanced pyruvate to 2,3-butanediol conversion in lactic acid bacteria
BRPI0913552B1 (pt) * 2008-09-29 2020-09-29 Butamax Advanced Biofuels Llc Método para produção de isobutanol e método para conversão de 2,3-dihidroxi isovalerato
CN102238990B (zh) 2008-10-03 2014-07-23 代谢探索者公司 使用降膜、刮膜、薄膜或短程蒸发器从发酵液纯化醇的方法
WO2010057022A1 (en) * 2008-11-14 2010-05-20 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of methyl ethyl ketone and 2-butanol
US8652823B2 (en) 2008-12-03 2014-02-18 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Strain for butanol production with increased membrane unsaturated trans fatty acids
US20100140166A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process for fermentive preparation of alcohols and recovery of product
US20100143992A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 E. I Du Pont De Nemours And Company Process for Fermentive Preparation of Alcohols and Recovery of Product
US20100143994A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 E. I. Du Pont De Memours And Company Process for fermentive preparation of alcohols and recovery of product
US20100143995A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for Fermentive Preparation of Alcohols and Recovery of Product
US20100143999A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process for fermentive preparation of alcohols and recovery of product
US20100143993A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process for fermentive preparationfor alcolhols and recovery of product
US20100144000A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for fermentive preparation fo alcohols and recovery of product
US20100139154A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process for fermentive preparation of alcohols and recovery of product
JP2012511928A (ja) 2008-12-16 2012-05-31 ゲノマチカ， インク． 合成ガス及び他の炭素源の有用な製品への変換のための微生物及び方法
WO2010080489A1 (en) * 2008-12-19 2010-07-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company Ozone treatment of biomass to enhance enzymatic saccharification
US8455225B2 (en) * 2008-12-29 2013-06-04 Butamax Advanced Biofuels Llc Yeast with increased butanol tolerance involving high osmolarity/glycerol response pathway
RU2405826C2 (ru) 2008-12-29 2010-12-10 Дэвон Инвестмент Лимитед Способ получения органических растворителей, установка для его осуществления, продукт, полученный описанным способом
US8795992B2 (en) * 2008-12-29 2014-08-05 Butamax Advanced Biofuels Llc Yeast with increased butanol tolerance involving cell wall integrity pathway
US8557562B2 (en) * 2008-12-29 2013-10-15 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Yeast with increased butanol tolerance involving filamentous growth response
WO2010081053A2 (en) 2009-01-08 2010-07-15 Codexis, Inc. Transaminase polypeptides
RU2405828C2 (ru) 2009-01-29 2010-12-10 Дэвон Инвестмент Лимитед Способ получения органических растворителей
US8614085B2 (en) 2009-02-27 2013-12-24 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Yeast with increased butanol tolerance involving a multidrug efflux pump gene
US8178329B2 (en) 2009-04-01 2012-05-15 Richard Allen Kohn Process to produce organic compounds from synthesis gases
JP2012523245A (ja) 2009-04-13 2012-10-04 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー 抽出発酵を用いてブタノールを生成するための方法
KR101950944B1 (ko) 2009-04-30 2019-02-21 게노마티카 인코포레이티드 1,3-부탄다이올 생산 유기체
US8993285B2 (en) 2009-04-30 2015-03-31 Genomatica, Inc. Organisms for the production of isopropanol, n-butanol, and isobutanol
KR101930540B1 (ko) 2009-05-07 2019-03-15 게노마티카 인코포레이티드 아디페이트, 헥사메틸렌디아민 및 6-아미노카프로산의 생합성을 위한 미생물 및 방법
EP2429587A4 (en) 2009-05-15 2014-10-08 Genomatica Inc ORGANISMS FOR THE PREPARATION OF CYCLOHEXANONE
LT3199511T (lt) 2009-06-04 2020-03-25 Genomatica, Inc. Komponentų atskyrimo nuo fermentacijos sultinio būdas
SG176656A1 (en) 2009-06-04 2012-01-30 Genomatica Inc Microorganisms for the production of 1,4-butanediol and related methods
JP2012529889A (ja) * 2009-06-10 2012-11-29 ゲノマチカ， インク． Ｍｅｋ及び２−ブタノールの炭素効率のよい生合成のための微生物及び方法
EP3190174A1 (en) 2009-08-05 2017-07-12 Genomatica, Inc. Semi-synthetic terephthalic acid via microorganisms that produce muconic acid
SG179048A1 (en) 2009-09-09 2012-04-27 Genomatica Inc Microorganisms and methods for the co-production of isopropanol with primary alcohols, diols and acids
WO2011037414A2 (ko) * 2009-09-22 2011-03-31 한국과학기술원 알코올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 알코올의 제조방법
CA2775893A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Improved yeast production host cells
US20110195505A1 (en) * 2009-10-08 2011-08-11 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Bacterial strains for butanol production
EP2488652A4 (en) 2009-10-13 2014-04-09 Genomatica Inc MICRO-ORGANISMS FOR THE PREPARATION OF 1,4-BANDANDIOL, 4-HYDROXYBUTANAL, 4-HYDROXYBUTYRYL-COA, PUTRESCIN AND CORRESPONDING COMPOUNDS, AND CORRESPONDING METHODS
WO2011050326A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of aniline
JP2013511283A (ja) * 2009-11-23 2013-04-04 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー 電解質の添加を伴う抽出発酵を用いたブタノールの生成方法
EP2504447A2 (en) 2009-11-23 2012-10-03 ButamaxTM Advanced Biofuels LLC Method for producing butanol using extractive fermentation with osmolyte addition
US8530210B2 (en) 2009-11-25 2013-09-10 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the coproduction 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone
SG181607A1 (en) 2009-12-10 2012-07-30 Genomatica Inc Methods and organisms for converting synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol to 1,3-butanediol
WO2011073250A2 (en) 2009-12-15 2011-06-23 Stratley Ag Method for recovery of organic components from dilute aqueous solutions
CN102741401A (zh) 2009-12-29 2012-10-17 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 己糖激酶在重组宿主细胞中的表达
US8765433B2 (en) 2009-12-29 2014-07-01 Butamax Advanced Biofuels Llc Alcohol dehydrogenases (ADH) useful for fermentive production of lower alkyl alcohols
US8450543B2 (en) 2010-01-08 2013-05-28 Gevo, Inc. Integrated methods of preparing renewable chemicals
WO2011094131A1 (en) * 2010-01-29 2011-08-04 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of p-toluate and terephthalate
US8574406B2 (en) 2010-02-09 2013-11-05 Butamax Advanced Biofuels Llc Process to remove product alcohol from a fermentation by vaporization under vacuum
US9012189B2 (en) 2010-02-12 2015-04-21 Gevo, Inc. Modified alcohol dehydrogenases for the production of fuels and chemicals
MX348605B (es) 2010-02-17 2017-06-21 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Mejoramiento de la actividad de proteinas que requieren centros fe-s.
US8445244B2 (en) 2010-02-23 2013-05-21 Genomatica, Inc. Methods for increasing product yields
US8048661B2 (en) 2010-02-23 2011-11-01 Genomatica, Inc. Microbial organisms comprising exogenous nucleic acids encoding reductive TCA pathway enzymes
US9023636B2 (en) 2010-04-30 2015-05-05 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of propylene
CN103080324B (zh) 2010-05-05 2019-03-08 基因组股份公司 用于丁二烯生物合成的微生物和方法
WO2011140560A1 (en) 2010-05-07 2011-11-10 Gevo, Inc. Renewable jet fuel blendstock from isobutanol
US8852900B2 (en) 2010-06-17 2014-10-07 Codexis, Inc. Biocatalysts and methods for the synthesis of (S)-3-(1-aminoethyl)-phenol
US20120149080A1 (en) 2010-06-17 2012-06-14 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Yeast production culture for the production of butanol
US9012190B2 (en) 2011-06-15 2015-04-21 Butamax Advanced Biofuels Llc Use of thiamine and nicotine adenine dinucleotide for butanol production
US9040263B2 (en) 2010-07-28 2015-05-26 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of alcohol esters and in situ product removal during alcohol fermentation
BR112012032357A2 (pt) 2010-06-18 2015-11-24 Butamax Tm Advanced Biofuels “método, sistema para produção de produto fermentativo e composição”
US8871488B2 (en) 2010-06-18 2014-10-28 Butamax Advanced Biofuels Llc Recombinant host cells comprising phosphoketolases
KR20130087013A (ko) * 2010-06-18 2013-08-05 부타맥스 어드밴스드 바이오퓨얼스 엘엘씨 추출 발효에서의 알코올 제거를 위한 오일로부터 유래되는 추출 용매
JP2013535203A (ja) 2010-07-26 2013-09-12 ジェノマティカ・インコーポレイテッド 芳香族、２，４−ペンタジエノエートおよび１，３−ブタジエンを生合成するための微生物および方法
WO2012027642A1 (en) * 2010-08-27 2012-03-01 Gevo, Inc. Balanced four-step pathways to renewable butanols
JP2013544072A (ja) 2010-09-02 2013-12-12 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー 真空下での蒸発により発酵から生成物アルコールを取り出す方法
US9267157B2 (en) 2010-09-07 2016-02-23 Butamax Advanced Biofuels Llc Butanol strain improvement with integration of a polynucleotide encoding a polypeptide that catalyzes pyruvate to acetolactate conversion
DE102011003387A1 (de) * 2011-01-31 2012-08-02 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2,3-Butandiol
DE102011003394A1 (de) * 2011-01-31 2012-08-02 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2,3-Butandiol
DE102011003383A1 (de) * 2011-01-31 2012-08-02 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2,3-Butandiol
US20130040340A1 (en) 2011-02-07 2013-02-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of alcohol esters in situ using alcohols and fatty acids produced by microorganisms
US8759044B2 (en) 2011-03-23 2014-06-24 Butamax Advanced Biofuels Llc In situ expression of lipase for enzymatic production of alcohol esters during fermentation
US8765425B2 (en) 2011-03-23 2014-07-01 Butamax Advanced Biofuels Llc In situ expression of lipase for enzymatic production of alcohol esters during fermentation
AU2012230737B2 (en) 2011-03-24 2017-02-23 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Host cells and methods for production of isobutanol
TW201247596A (en) 2011-04-19 2012-12-01 Gevo Inc Variations on prins-like chemistry to produce 2,5-dimethylhexadiene from isobutanol
KR101298988B1 (ko) * 2011-05-18 2013-08-26 서강대학교산학협력단 2,3-부탄다이올 생산을 위한 크렙시엘라 뉴모니아 균주 및 제조방법
BR112013032319A2 (pt) 2011-06-17 2016-12-20 Butamax Advanced Biofuels Llc métodos da geração de coprodutos de destilação, coprodutos de destilação, método para atenuar o impacto de contaminantes de fermentação, método para a redução da contaminação por micotoxinas, método para a redução da variabilidade do teor de lipídeos, método para aumento do teor de triglicerídeos, método de produção de um coproduto de destilação para o combustível e método de produção de um coproduto destilação para o biodiesel
CN103814135A (zh) 2011-06-17 2014-05-21 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 木质纤维素水解产物作为原料用于异丁醇发酵
US20130180164A1 (en) 2011-07-28 2013-07-18 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Low sulfur fuel compositions having improved lubricity
EP2737073B1 (en) 2011-07-28 2021-10-20 Butamax Advanced Biofuels LLC Keto-isovalerate decarboxylase enzymes and methods of use thereof
WO2013063513A1 (en) 2011-10-27 2013-05-02 The Regents Of The University Of California Bacterial production of methyl ketones
US9962623B2 (en) 2011-12-09 2018-05-08 Butamax Advanced Biofuels Llc Process to remove product alcohols from fermentation broth
JP2015503350A (ja) 2011-12-30 2015-02-02 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー アルコールの発酵生産
CA2862450A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Butamax Advanced Biofuels Llc Genetic switches for butanol production
EP2828391A1 (en) 2012-03-23 2015-01-28 Butamax Advanced Biofuels LLC Acetate supplemention of medium for butanologens
JP2015517303A (ja) 2012-05-04 2015-06-22 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー アルコールの製造および回収のための方法およびシステム
MX370134B (es) 2012-05-11 2019-12-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Enzimas de cetol-acido reductoisomerasa y metodo de uso.
GB201209425D0 (en) 2012-05-28 2012-07-11 Lucite Int Uk Ltd Process for production of methyl methacrylate
TW201410865A (zh) 2012-06-04 2014-03-16 Genomatica Inc 製造４－羥基丁酸酯、１，４－丁二醇及相關化合物之微生物及方法
CN104919037A (zh) * 2012-06-08 2015-09-16 朗泽科技新西兰有限公司 重组微生物和其用途
US9783832B2 (en) 2012-07-17 2017-10-10 Biopolis, S.L. Method for producing 2,3-butanediol using improved strains of Raoultella planticola
US20140024064A1 (en) 2012-07-23 2014-01-23 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of fermentative alcohols
AU2013295626B2 (en) 2012-07-26 2018-02-01 Butamax Advanced Biofuels Llc Butanol purification
BR112015003701A2 (pt) 2012-08-22 2017-12-12 Butamax Advanced Biofuels Llc células hospedeiras recombinantes, método para aprimoramento, processo para a produção de um álcool, polinucleotídeo isolado, cassete de expressão e composição
CN105051179B (zh) * 2012-08-28 2018-06-15 朗泽科技新西兰有限公司 重组微生物和其用途
AU2013315520B2 (en) 2012-09-12 2017-03-30 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of fermentation products
WO2014047412A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc A method for producing butanol using two-phase extractive fermentation and recyclable extractant compositions
US9840724B2 (en) 2012-09-21 2017-12-12 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of renewable hydrocarbon compositions
JP6407869B2 (ja) 2012-09-26 2018-10-17 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチド
US20140093931A1 (en) 2012-09-28 2014-04-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of fermentation products
JP2015530116A (ja) * 2012-09-28 2015-10-15 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニアＴｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 光合成微生物を使用してアセトインおよび２，３−ブタンジオールを生産する方法
US9273330B2 (en) 2012-10-03 2016-03-01 Butamax Advanced Biofuels Llc Butanol tolerance in microorganisms
WO2014059273A1 (en) 2012-10-11 2014-04-17 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of fermentation products
US10290479B2 (en) * 2012-11-07 2019-05-14 Ohio University Online monitoring of fuel cell reactions by desorption electrospray mass spectrometry
WO2014074701A1 (en) 2012-11-07 2014-05-15 Ohio University Ionization of chemicals in mixture at low ph by ambient ionization / mass spectrometry
US10288610B2 (en) * 2012-11-13 2019-05-14 The General Hospital Corporation Vitro assays for detecting Salmonella enterica serotype typhi
US20140142352A1 (en) 2012-11-20 2014-05-22 Butamax Advanced Biofuels Llc Butanol purification
WO2014092562A1 (en) * 2012-12-11 2014-06-19 Photanol B.V. Synthesis of acetoin, 2,3-butanediol and 2-butanol by cyanobacteria by heterologous expression of a catabolic pathway
US20140178954A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 E I Du Pont De Nemours And Company Expression of xylose isomerase activity in yeast
WO2014106107A2 (en) 2012-12-28 2014-07-03 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Dhad variants for butanol production
WO2014105840A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentative production of alcohols
US20160002131A1 (en) 2013-02-21 2016-01-07 Butamax Advanced Biofuels Llc Vapor recompression
US8669076B1 (en) 2013-03-11 2014-03-11 E I Du Pont De Nemours And Company Cow rumen xylose isomerases active in yeast cells
US9187743B2 (en) 2013-03-11 2015-11-17 E I Du Pont De Nemours And Company Bacterial xylose isomerases active in yeast cells
US9523104B2 (en) 2013-03-12 2016-12-20 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of alcohols
US20140273105A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 E I Du Pont De Nemours And Company Gradient pretreatment of lignocellulosic biomass
ES2735024T3 (es) 2013-03-14 2019-12-13 Du Pont Glicerol-3-fosfato deshidrogenasa para la producción de butanol
WO2014144210A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Butamax Advanced Biofuels Llc Competitive growth and/or production advantage for butanologen microorganism
WO2014151190A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Butamax Advanced Biofuels Llc Dhad variants and methods of screening
WO2014151645A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Butamax Advanced Biofuels Llc Process for maximizing biomass growth and butanol yield by feedback control
BR112015020685A2 (pt) 2013-03-15 2017-07-18 Butamax Advanced Biofuels Llc método para a recuperação do butanol, composição, métodos para a extração de álcool e de secagem
WO2014144643A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for producing butanol using extractive fermentation
US9663759B2 (en) 2013-07-03 2017-05-30 Butamax Advanced Biofuels Llc Partial adaptation for butanol production
CN105722969A (zh) 2013-10-28 2016-06-29 丹尼斯科美国公司 大规模基因工程化活性干酵母
US20150147786A1 (en) 2013-11-24 2015-05-28 E I Du Pont De Nemours And Company High force and high stress destructuring for starch biomass processing
WO2015085015A1 (en) * 2013-12-03 2015-06-11 Lanzatech New Zealand Limited Microorganisms and methods for the production of ketones
CN103627698A (zh) * 2013-12-05 2014-03-12 江南大学 乙偶姻高耐受性菌株的选育和用该菌株发酵生产乙偶姻
CN105219666B (zh) * 2014-06-18 2021-03-26 清华大学 用于在微氧条件下生产丁醇的共生菌体系和方法
WO2016025425A1 (en) 2014-08-11 2016-02-18 Butamax Advanced Biofuels Llc Yeast preparations and methods of making the same
AU2015360786B2 (en) * 2014-12-08 2021-10-21 Lanzatech Nz, Inc. Recombinant microorganisms exhibiting increased flux through a fermentation pathway
BR112017014195B1 (pt) 2014-12-31 2023-04-11 Poet Research, Inc Processos para produzir uma corrente (slip stream) de açúcar e sistemas para produzir uma corrente (slip stream) de açúcar
CA2972464C (en) * 2014-12-31 2025-07-22 Poet Research, Inc. HIGH-PURITY STARCH FLOW PROCESSES AND SYSTEMS
ES2855992T3 (es) * 2015-12-11 2021-09-27 Wacker Chemie Ag Cepa de microorganismos y procedimiento para la producción fermentativa exenta de antibióticos de sustancias y proteínas de bajo peso molecular
WO2017176875A1 (en) 2016-04-08 2017-10-12 E I Du Pont De Nemours And Company Arabinose isomerases for yeast
KR102028161B1 (ko) * 2017-01-10 2019-10-02 경희대학교 산학협력단 형질전환 미생물을 이용한 2,3-부탄디올 생산방법
US10858661B2 (en) 2017-01-10 2020-12-08 University-Industry Cooperation Group Of Kyung Hee University Use of Methylomonas sp. DH-1 strain and its transformants
KR102525517B1 (ko) 2017-01-30 2023-04-25 프레시전 인코포레이티드 C1 탄소로부터 2,3-부탄디올 및 그의 유도체의 제조를 위한 방법 및 미생물
EP3615676A4 (en) 2017-04-28 2021-07-07 Intrexon Corporation PROCESSES AND MICRO-ORGANISMS FOR THE FERMENTATION OF METHANE INTO MULTI-CARBON COMPOUNDS
WO2019055498A1 (en) * 2017-09-12 2019-03-21 Igc Bio, Inc. PROSS OPTIMIZED ENZYMES
CN115427557A (zh) 2020-04-10 2022-12-02 科德克希思公司 工程化转氨酶多肽
FR3115988A1 (fr) 2020-11-06 2022-05-13 Global Bioenergies Composition de maquillage à base d’isododécane biosourcé et son procédé de préparation
FR3157389A1 (fr) 2023-12-22 2025-06-27 Axens Procédé de production de bioalkylat ou d’essence biosourcée
WO2025226576A1 (en) 2024-04-25 2025-10-30 ExxonMobil Technology and Engineering Company Processes for producing isobutylene and isobutylene-based polymers

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2198104A (en) * 1938-12-15 1940-04-23 Commercial Solvents Corp Butyl alcohol fermentation process
US2730542A (en) 1951-06-25 1956-01-10 Ferrari Vittorio Emiliano Process for preparing ethanol-2-aminophosphoric acid
US4424275A (en) 1979-09-17 1984-01-03 Sidney Levy Continuous process for producing N-butanol employing anaerobic fermentation
US4568643A (en) 1981-08-03 1986-02-04 Sidney Levy Continuous process for producing n-butanol employing anaerobic fermentation
US4520104A (en) 1982-11-18 1985-05-28 Cpc International Inc. Production of butanol by a continuous fermentation process
JPS61209594A (ja) 1985-03-14 1986-09-17 Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> アルコ−ルの製造方法
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
JPS6317695A (ja) 1986-07-09 1988-01-25 Idemitsu Kosan Co Ltd アルコ−ル類の製造法
JPS63102687A (ja) 1986-10-20 1988-05-07 Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> ブタノ−ルの製造方法
AT388174B (de) 1987-03-10 1989-05-10 Vogelbusch Gmbh Verfahren zur vergaerung von kohlenhydrathaeltigen medien mit hilfe von bakterien
JPS63254986A (ja) 1987-04-10 1988-10-21 Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> アルコ−ルの製造法
JPH084515B2 (ja) 1987-11-09 1996-01-24 出光興産株式会社 有機化合物の製造方法
US5000000A (en) 1988-08-31 1991-03-19 University Of Florida Ethanol production by Escherichia coli strains co-expressing Zymomonas PDC and ADH genes
US5424202A (en) * 1988-08-31 1995-06-13 The University Of Florida Ethanol production by recombinant hosts
US5063156A (en) * 1990-04-30 1991-11-05 Glassner David A Process for the fermentative production of acetone, butanol and ethanol
US5192673A (en) 1990-04-30 1993-03-09 Michigan Biotechnology Institute Mutant strain of C. acetobutylicum and process for making butanol
WO1993002463A1 (de) 1991-07-24 1993-02-04 Elin Energieversorgung Gesellschaft M.B.H. Schalterpol eines leistungsschalters
US5210032A (en) 1992-01-21 1993-05-11 Trustees Of The Boston University Degeneration-resistant solventogenic clostridia
WO1993018138A1 (de) * 1992-03-13 1993-09-16 Forschungszentrum Jülich GmbH Neue ketoester-reduktase, deren herstellung und verwendung für enzymatische redoxreaktionen
JP3574682B2 (ja) * 1993-09-24 2004-10-06 ダイセル化学工業株式会社 新規な酵素、該酵素を製造する方法、該酵素をコードするｄｎａ、該ｄｎａを含む形質転換体、該酵素による光学活性アルコール等の製造方法
US5686276A (en) * 1995-05-12 1997-11-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Bioconversion of a fermentable carbon source to 1,3-propanediol by a single microorganism
WO1998051813A1 (en) 1997-05-14 1998-11-19 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois A METHOD OF PRODUCING BUTANOL USING A MUTANT STRAIN OF $i(CLOSTRIDIUM BEIJERINCKII)
US7074608B1 (en) 1998-05-12 2006-07-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant organisms comprising genes for coenzyme B12 synthesis
EP1020515A3 (en) * 1999-01-18 2002-08-07 DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, Ltd. Amino alcohol dehydrogenase, its production and use
CA2380616C (en) * 1999-08-18 2011-05-24 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process for the biological production of 1,3-propanediol with high titer
EP1149918A1 (de) 2000-04-27 2001-10-31 Creavis Gesellschaft für Technologie und Innovation mbH Verfahren zur Oxidation von Kohlenwasserstoffen unter Verwendung von Mikroorganismen
US6586229B1 (en) 2000-06-01 2003-07-01 North Carolina State University Method for the production of ρ-Hydroxybenzoate in species of pseudomonas and agrobacterium
US6960465B1 (en) * 2001-06-27 2005-11-01 Northwestern University Increased cell resistance to toxic organic substances
EP1485471B1 (en) * 2002-03-18 2007-08-29 BioCatalytics Inc. Alcohol dehydrogenases with high solvent and temperature stability
US8192959B2 (en) 2002-04-22 2012-06-05 Genencor International Inc Promoter and plasmid system for genetic engineering
WO2004033646A2 (en) 2002-10-04 2004-04-22 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process for the biological production of 1,3-propanediol with high yield
EP2534961A1 (en) * 2003-03-10 2012-12-19 POET Research, Inc. Method for producing ethanol using raw starch
JP4294382B2 (ja) * 2003-06-06 2009-07-08 ダイセル化学工業株式会社 （２ｓ，３ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素
AT413541B (de) 2004-05-10 2006-03-15 Iep Gmbh Verfahren zur herstellung von 2-butanol
CA2604964C (en) 2005-04-12 2014-12-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Treatment of biomass to obtain a target chemical
US8828704B2 (en) * 2006-05-02 2014-09-09 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
US8206970B2 (en) * 2006-05-02 2012-06-26 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Production of 2-butanol and 2-butanone employing aminobutanol phosphate phospholyase
US7659104B2 (en) * 2006-05-05 2010-02-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company Solvent tolerant microorganisms and methods of isolation
US7541173B2 (en) * 2006-06-15 2009-06-02 E.I. Du Pont De Nemours And Company Solvent tolerant microorganisms and methods of isolation
EP2041266A4 (en) 2006-07-06 2009-12-23 Integrated Genomics Inc COMPOSITIONS AND METHOD FOR BUTANEAN MANUFACTURE
US8426174B2 (en) * 2007-05-02 2013-04-23 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Method for the production of 2-butanol
US8188250B2 (en) 2008-04-28 2012-05-29 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Butanol dehydrogenase enzyme from the bacterium Achromobacter xylosoxidans

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