MX2008013703A - Plantas de tomate que tienen mas altos niveles de resistencia a botrytis. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para detectar un locus de rasgo cuantitativo (QTL) asociado con resistencia a Botrytis cinerea en el tomate, que comprende los pasos de cruzar una planta de tomate donante resistente a Botrytis, con una planta de tomate recipiente, no resistente o susceptible a Botrytis, poniendo en contacto una o más plantas de la progenie con una cantidad infecciosa de Botrytis, determinando cuantitativamente la incidencia de la enfermedad y/o la velocidad de crecimiento de la lesión en una o más plantas de progenie, estableciendo un mapa de la conexión genética que vinculan la incidencia de la enfermedad observada y/o la velocidad de crecimiento de la lesión, a la presencia de los marcadores cromosómicos de la planta de tomate donante en una o más plantas de progenie, y asignando a un QTL los marcadores contiguos sobre el mapa que están vinculados a una incidencia reducida de la enfermedad y/o velocidad reducida de crecimiento de la lesión.

Description

PLANTAS DE TOMATE QUE TIENEN MAS ALTOS NIVELES DE RESISTENCIA A BOTRYTIS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al cultivo de plantas y a la biología molecular. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para detectar un locus del rasgo cuantitativo (QTL, por sus siglas en inglés) asociado con resistencia a Botrytis cinérea en tomate, a un método para producir una planta de tomate resistente a Botrytis con el mismo, y a las plantas de tomate resistentes a Botrytis obtenida de este modo, y partes de las mismas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Botrytis cinérea es un hongo patógeno necrotrófico con una gama excepcionalmente amplia de huéspedes o de hospederos, que comprenden al menos 235 posibles hospederos. Debido a su amplia gama de hospederos y debido a que éste afecta a partes económicamente importantes de las plantas, B. cinérea es un problema mayor en muchas cosechas comercialmente desarrolladas. Entre los productores, el hongo es comúnmente denominado como Botrytis . El tomate cultivado (Solanum lycopersicum; antiguamente Lycopersicon esculentum) es también susceptible a la infección por Botrytis y el hongo afecta en general el tallo, las hojas y REF . : 197617 el fruto de la planta de tomate. En invernaderos calientes la aparición de infecciones por Botrytis sobre los tallos, es particularmente común. Botrytis mata activamente las células infectadas, provocando pudrimiento suave, marchitamientos, manchas en las hojas, pudrimiento por el pie, y cánceres en el tallo. Las hojas afectadas se llegan a cubrir con conidiofóros y conidia, y subsecuentemente se colapsan y se emblanquecen. El hongo se desarrollará a partir de las hojas enfermas hacia el tallo y produce lesiones café claro, secas, de unos pocos milímetros a varios centímetros de longitud. Las lesiones pueden también formarse en las cicatrices de poda sobre el tallo. Las lesiones del tallo pueden ser también cubiertas con un moho gris. En casos severos, la infección circunda al tallo y mata a la planta. El tejido senecto más viejo de una planta de tomate es usualmente más susceptible al ataque por Botrytis que el tejido más joven. Con el fin de prevenir el desarrollo de Botrytis en tomates desarrollados en invernadero, la temperatura y la humedad relativa deben ser estrechamente regulados. Es además importante proporcionar agua sin humedecer las hojas. Para plantas desarrolladas en campo, debe ser empleado un buen drenado y control de malas hierbas. Además, los niveles de nutrientes de las plantas deben ser mantenidos altos. No obstante, estas medidas preventivas no pueden prevenir completamente la aparición de pérdida de rendimiento considerado en el caso de infección. Están disponibles los fungicidas para controlar Botrytis en tomates desarrollados en invernadero y en campo. Los Ejemplos de algunos fungicidas incluyen Dowicide A® y clorotalonil , el cual puede ser también aplicado a los frutos de tomate después de la cosecha. No obstante, se sabe que Botrytis tiene una resistencia desarrollada contra varios fungicidas comúnmente utilizados. Además, no es deseado el uso de fungicidas desde una perspectiva económica y desde una perspectiva ambiental. Actualmente, existe una necesidad para variedades comerciales de tomate que muestran resistencia de Botrytis . La resistencia parcial a Botrytis ha sido desarrollada en varias especies silvestres de tomate (Egashira et al. 2000; Nicot et al. 2002; Urbasch 1986) . No obstante, estas plantas no producen tomates de cosecha comercial . El documento WO 02/085105 describe una región genética sobre el cromosoma 10 del genoma de S. habrochaites que se cree está involucrada en la resistencia parcial a Botrytis . La introgresión de este material genético dentro de variedades cultivadas de tomate se mostró que proporcionan plantas de tomate cultivadas que son parcialmente resistentes a Botrytis . Hasta ahora, no obstante, los programas de producción dirigidos a proporcionar resistencia a Botrytis en tomates, han tenido éxito limitado. La razón para estos pobres resultados a la fecha no es clara. Por una parte, esto puede ser debido a insuficiente conocimiento en base genética y en la herencia de la resistencia de Botrytis . Por otra parte, esto puede ser debido a la falta de bioensayos adecuados para evaluar los niveles de resistencia a Botrytis en plantas de tomate obtenidas en programas de producción o crianza. La falta de conocimiento y los métodos también complica la selección de las plantas entre los accesos silvestres y las plantas de progenie que comprenden los genes involucrados en la resistencia a Botrytis . En un estudio previo, los presentes inventores encontraron que la resistencia Botrytis en tomate es heredada poligénicamente , y que esto puede explicar parcialmente los pobres resultados en la producción de plantas resistentes. Un objetivo de la presente invención es mejorar el éxito de los programas de producción dirigidos a proporcionar variedades de tomate comerciales que son resistentes a Botrytis . Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar resistencia adicional y/o mejorada a Botrytis en variedades comerciales de tomate. Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar material genético adicional en el genoma de los accesos de tomate silvestres que está involucrado en la resistencia a Botrytis en tales plantas. Tal material genético adicional puede ser utilizado para ampliar la base para la producción de variedades resistentes a Botrytis de tomates cultivados.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Los presentes inventores han encontrado ahora que el genoma del material genético de S. habrochaites está presente un número de cromosomas que no fueron previamente identificados como involucrados en la resistencia a Botrytis . De hecho, los presentes inventores han identificado exitosamente los locus (loci del rasgo cuantitativo) (QTLs) en el genoma de una linea de un pariente silvestre del tomate, por ejemplo, en Solanum habrochaites LYC 4/78. Estos QTLs adicionales fueron descubiertos mediante el uso de lineas de introgresión . Los inventores fueron subsecuentemente capaces de producir plantas de tomate resistentes a Botrytis mediante el cruce de las plantas provenientes de estas lineas de tomate silvestre resistentes a Botrytis (donantes) con plantas de tomate recipiente no resistentes. Estas plantas mostraron un más alto nivel de resistencia que cualquier planta de tomate cultivada producida hasta ahora. El mejoramiento sobre la técnica anterior radica en la disponibilidad de los criterios de selección adicionales por los cuales el proceso de producción puede ser monitorizado y dirigido. Las plantas de progenie producidas a partir de una cruza entre un Solanum habrochaites silvestre resistente y un tomate cultivado susceptible, pueden ser seleccionadas para tener uno o más, o incluso todas las regiones genómicas involucradas en la resistencia a Botrytis en el acceso silvestre. Como resultado, es proporcionado un método para la producción de una planta de tomate con el cual puede ser mejor controlada la constitución genética requerida Una ventaja del presente método es que, en un sentido genético, la progenie puede ser hecha para asemejarse al acceso silvestre más estrechamente para el rasgo deseado. En consecuencia, el rasgo de resistencia en la planta de tomate cultivada puede ser más establemente introducido en ésta, por ejemplo, son ahora proporcionadas las posibilidades para averiguar cuáles de las regiones genómicas pueden ser fácilmente introducidas, y cuáles son difíciles de transferir a las plantas de progenie, cuáles de las regiones genómicas son esenciales, cuáles son cooperativas, y cuáles pueden ser utilizadas para mejorar adicionalmente los niveles de resistencia en líneas parcialmente resistentes de tomate cultivado . Al evaluar el nivel de resistencia a Botrytis en diversas líneas de introgresión, cada una teniendo una introgresión genómica específica de S. habrochaites LYC 4/78, en relación a la presencia de marcadores moleculares de la planta donante, los presentes inventores fueron capaces de identificar QTLs adicionales vinculadas a resistencia a Botrytis en las lineas de tomate silvestres resistentes, y con esto establecer la posición de las secuencias de ADN que confieren resistencia múltiple, en el genoma . En la descripción siguiente, un locus de rasgo cuantitativo (QTL) asociado con resistencia a Botrytis en tomate, será dirigido en breve como un QTL para resistencia a Botrytis o un QTL asociado con resistencia a Botrytis . Un total de 5 nuevos QTLs para la resistencia a Botrytis fueron encontrados en una linea de tomate silvestre de S. habrochaites . Un QTL estuvo localizado sobre el cromosoma 4, el cual fue previamente identificado como poseedor de un QTL asociado con resistencia a Botrytis . Se encontró además que un área de este cromosoma, previamente asociado con la resistencia contenia de hecho dos QTLs separados. Los otros QTLs fueron identificados sobre cromosomas 6, 9, 11 y 12. Los nuevos QTLs podrían estar todos vinculados a un parámetro cuantitativo que refleja la capacidad de la planta para reducir el establecimiento inicial de una infección, de aquí en adelante denominado como el parámetro para incidencia de la enfermedad (DI) , así como un parámetro cuantitativo que refleja la capacidad de la planta a retardar la progresión de la enfermedad, de aquí en adelante denominado como el parámetro para la velocidad de crecimiento de la lesión (LG) . Nuevamente, la presencia de un QTL sobre el cromosoma 10, como es reportado en la técnica anterior, no puede ser confirmada por los métodos utilizados. Todos los QTLs probados hasta ahora pudieron ser confirmados mediante la evaluación de la resistencia a la enfermedad en BC5S1 o BC5S2 (retrocruza 5, autopolinizado una vez o dos veces) , que son progenies segregantes para los QTLs bajo investigación . La presente invención se refiere a un primer aspecto en un método para producir una planta de tomate resistente a Botrytis, el método comprende los pasos de: a) proporcionar una planta de tomate donante resistente a Botrytis , preferentemente una planta resistente a Botrytis de la especie S. habrochaites, más preferentemente una planta resistente a Botrytis de la linea S. habrochaites LYC 4/78; b) transferir el ácido nucleico desde la planta donante hacia una o más plantas de tomate recipientes, susceptibles a Botrytis , preferentemente una planta de la especie S. lycopersicum, en donde la transferencia da como resultado la introducción de material genómico proveniente de la planta donante en la región correspondiente del genoma de una o más plantas recipientes susceptibles; c) seleccionar de entre las plantas de tomate recipientes (o de la planta adicionalmente autopolinizada de la planta retrocruzada, obtenida con la planta de tomate recipiente; por ejemplo, de las plantas recombinantes obtenidas después de la transferencia) una planta que comprende dentro de su genoma al menos un QTL para la resistencia a Botrytis derivada de la planta de tomates donante resistente a Botrytis , en donde la selección comprende la detección sobre el cromosoma 4, 6, 9, 11 y/o 12 de la planta de tomate recipiente, de al menos un marcador genético vinculado a al menos a un QTL para la resistencia a Botrytis. en donde la posición del QTL sobre el cromosoma 4 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos CT50, C2Atlg74970, P14M49-283e, P14M48-74e, P14M50-67e, CT1739 y P14M50-85h sobre el cromosoma 4 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 4 de S. lycopersicum, más preferentemente sobre el cromosoma 4 de S. habrochaites LYC 4/78 o sobre el cromosoma 4 de S. lycopersicum variedad Moneymaker. En modalidades preferidas, la posición del QTL sobre el cromosoma 6 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P22M50-188h, P14M48-521e, P15M48-386h, P18M51-199h, P18M51-103h, P22M50-103e, P18M51-388e, P15M48-395e, P22M50-124e, P14M48-160e y P22M50-513h sobre el cromosoma 6 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 6 de S. lycopersicum, más preferentemente sobre el cromosoma 6 de S. habrochaites LYC 4/78 o sobre el cromosoma 6 de S. lycopersicum variedad Moneymaker. En otras modalidades preferidas, la posición del QTL sobre el cromosoma 9 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P18M50-141, P14M49-240, TG254, TG223, TG10, P18M50-134h, P14M49-243h, P18M50-599, P14M60-222h, P22M51-417h, P14M50-174h, P14M60-157h, P14M60-107h, P15M48-138h, P14M48-113h, Tm2a, P18M51-146h, P14M48-282h y P14M50-276h sobre el cromosoma 9 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 9 de S. lycopersicum, más preferentemente sobre el cromosoma 9 de S. habrochaites LYC 4/78 o sobre el cromosoma 9 de S. lycopersicum variedad Moneymaker. En otras modalidades preferidas adicionales, la posición del QTL sobre el cromosoma 11 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P14M60-215e, P14M61-173h, P14M50-307h, TG47, P14M50-29xCD, P18M51-358h, Pl8M50-27xCD, P18M51-136h, P22M50-488h, TG393, P14M61-396h, P22M51-235h y P22M51-174e sobre el cromosoma 11 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 11 de S. lycopersicum, más preferentemente sobre el cromosoma 11 de S. habrochaites LYC 4/78 o sobre el cromosoma 11 de S. lycopersicum variedad Moneymaker. En otras modalidades preferidas adicionales, la posición del QTL sobre el cromosoma 12 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos CT19, TG68, P14M48-411e, P18M50-244h, P18M50-273h, P14M61-420h, P14M61-406h,. P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48-153h, P22 50-97h, TG296, P22M50-131h y P22M51- 135h, preferentemente por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-2X9e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, y P22M50-131h sobre el cromosoma 12 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 12 de S. lycopersícum, más preferentemente sobre el cromosoma 12 de S. habrochaites LYC 4/78 o sobre el cromosoma 12 de S. lycopersícum variedad Moneymaker. La transferencia del ácido nucleico que comprende al menos un QTL para la resistencia a Botrytis, o una parte del mismo que confiere co-resistencia a Botrytis , puede ser muy adecuadamente realizada mediante la cruza de la planta de tomate donante resistente a Botrytis con una planta de tomate recipiente susceptible a Botrytis, para producir plantas de progenie. Un método de selección preferido comprende por lo tanto la selección asistida por marcadores (MAS) (ver por ejemplo, Tanksley et al. 1998) del ADN sometido a introgresión, en donde uno o más marcadores asociados con el QTL son detectados en las plantas de progenie. MAS puede por ejemplo ser realizada mediante el aislamiento del material genético de las plantas de progenie y determinando la presencia en éste, mediante técnicas moleculares, de uno o más marcadores de la planta donante. Alternativamente, los métodos de detección de marcadores moleculares pueden ser utilizados sin aislamiento previo del material genético. Opcionalmente , además de la detección del marcador, puede ser realizada una prueba fenotipica sobre la resistencia a Botrytis, con el fin de seleccionar las plantas adecuadas. Una prueba muy adecuada por lo tanto es el bioensayo cuantitativo como se describe en la presente, mediante el cual son determinados parámetros tales como la incidencia de la enfermedad y/o la velocidad del crecimiento de la lesión. La confirmación de la presencia de al menos un marcador proveniente de un QTL de acuerdo a la resistencia a Botrytis, en combinación con el establecimiento de la presencia de un fenotipo resistente proporciona evidencia para la transferencia exitosa del ácido nucleico, que comprende al menos un QTL, o una parte del mismo que confiere resistencia a Botrytis, proveniente de la planta donante hacia la planta recipiente . En una modalidad alternativa de un método de producción de una planta de tomate resistente a Botrytis, la transferencia indicada del ácido nucleico puede ser muy adecuadamente realizada mediante métodos transgénicos (por ejemplo, mediante transformación), por ejemplo, por fusión de protoplastos , por una técnica de haploide duplicado o mediante rescate de embrión. En una modalidad preferida de un método de producción de una planta de tomate resistente a Botrytis , las plantas donantes son Solanum habrochaites LYC 4/78 y el ácido nucleico transferido de estas plantas donantes hacia plantas recipientes comprende preferentemente al menos un QTL para la resistencia a Botrytis, seleccionado del grupo que consiste de las QTLs sobre los cromosomas 4, 6, 9, 11 y/o 12 de Solanum habrochaites LYC 4/78 asociados con resistencia a Botrytis , , o una parte del mismo que confiere resistencia a Botrytis . En otra modalidad preferida de un método de producción de una planta de tomate resistente a Botrytis , el método comprende la cruza de la planta de tomate donante resistente a Botrytis, con una planta de tomate recipiente susceptible a Botrytis , para producir las plantas de progenie y de primera generación; la selección de entre las plantas de progenie de primera generación, de una planta que comprende en su genoma del ácido nucleico introducido desde la planta de tomate donante, en donde el ácido nucleico introducido comprende al menos un QTL, preferentemente dos, más preferentemente más de QTLs para la resistencia a Botrytis, de acuerdo a la invención, o una parte del mismo que confiere resistencia a Botrytis; la cruza de la planta de progenie seleccionada con una linea de tomate comercial adecuada para producir plantas de progenie de segunda generación; seleccionando de entre las plantas de progenie de segunda generación una planta que comprende en su genoma el ácido nucleico introducido desde la planta de tomate de progenie de primera generación, en donde el ácido nucleico introducido comprende al menos un QTL, preferentemente dos, más preferentemente más de dos QTLs para la resistencia a Botrytis, de acuerdo a la invención, o una parte del mismo que confiere resistencia a Botrytis, y produciendo opcionalmente generaciones adicionales de plantas de progenie Preferentemente los dos QTLs, más preferentemente más de dos QTLs mencionados para la resistencia a Botrytis que son introducidos en las plantas de progenie pueden ser QTLs para la incidencia a la enfermedad, QTLs para la velocidad de crecimiento de la lesión o una combinación de estos tipos. En una modalidad más preferida, el paso c) comprende la selección de una planta que comprende dentro de su genoma al menos 4 QTLs para la resistencia a Botrytis, seleccionados del grupo que consiste de los QTLs sobre los cromosomas 1, 2, 4, 6, 9, 11 y 12 de Solanum habrochaites, preferentemente la linea LYC 4/78, asociada con la resistencia a Botrytis . En otro aspecto más, la presente invención se refiere a una planta de tomate resistente a Botrytis , o una parte de la misma, obtenible mediante un método de la presente invención. La presente invención se refiere además a un QTL para la resistencia a Botrytis en tomate, en donde el QTL se selecciona del grupo que consiste de los QTLs sobre los cromosomas 4, 6, 9, 11 y 12 de Solanum habrochaites , preferentemente la linea LYC 4/78, asociada con la resistencia a Botrytis . Estos QTLs están localizados sobre las posiciones del genoma no previamente asociados con resistencia a Botrytis . Los detalles de estos QTLs son descritos con más detalle más adelante en la presente. Los alelos presentes sobre las posiciones del genoma indicadas por estos QTLs son un aspecto de la presente invención. Un QTL de la presente invención puede estar en la forma de un ácido nucleico aislado, preferentemente de doble hebra que comprende el QTL o una parte del mismo que confiere resistencia. De manera muy adecuada, el tamaño de la secuencia de ácido nucleico, la cual puede ser por ejemplo aislada de los cromosomas de una planta donante adecuada, puede representar una distancia genética de 1-100 cM, preferentemente 10-50 cM sobre el cromosoma. El ácido nucleico puede comprender al menos 50, más preferentemente al menos 500, aún más preferentemente al menos 1000, todavía más preferentemente al menos 5000 pares de bases. Una o más secuencias de ácidos nucleicos que comprenden un QTL o una parte del mismo que confiere resistencia, de acuerdo a la invención, pueden a su vez estar comprendidas en una construcción de ácido nucleico, la construcción puede comprender además regiones que flanquean una o más secuencias de ácido nucleico y cuyas regiones son capaces de ser integradas dentro de un vector adecuado para la transferencia de una o más secuencias de ácido nucleico dentro de una planta de tomate recipiente, adecuada, susceptible a Botrytis . El vector puede además comprender regiones promotoras adecuadas u otras secuencias reguladoras. Los QTLs pueden también estar en una forma presente dentro del genoma de una planta de tomate. Los QTLs de la presente invención comprenden preferentemente al menos un marcador, preferentemente dos, más preferentemente tres, todavía más preferentemente cuatro, todavía más preferentemente más de cuatro marcadores asociados con la resistencia a Botrytis , seleccionada del grupo que consiste de los marcadores de las Tablas 1-5 vinculados al QTL. La presente invención se refiere, en otro aspecto más, a un método para detectar un QTL para la resistencia a Botrytis, que comprende detectar al menos un marcador vinculado a QTL para la resistencia a Botrytis sobre los cromosomas 4, 6, 9, 11 y/o 12 desde una presunta planta de tomate resistente a Botrytis, en donde la posición del QTL sobre el cromosoma 4 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos CT50, C2Atlg74970, P14M49-283e, P14M48-74e, P14M50-67e, CT1739 y P14M50-85h sobre el cromosoma 4 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 4 de S. lycopersicum, más preferentemente sobre el cromosoma 4 de S. habrochaites LYC 4/78 o sobre el cromosoma 4 de S. lycopersicum variedad Moneymaker. En una modalidad preferida de un método para la detección de un QTL de la presente invención, la posición del QTL sobre el cromosoma 6 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P22M50-188h, P14M48-521e, P15M48-386h, P18M51-199h, P18M51-103h, P22M50-103e, P18M51-388e, P15M48-395e, P22M50-124e, P14M48-160e y P22M50-513h sobre el cromosoma 6 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 6 de S. lycopersicum, más preferentemente sobre el cromosoma 6 de S. habrochaites LYC 4/78 o sobre el cromosoma 6 de S. lycopersicum variedad Moneymaker. En otra modalidad preferida de un método para la detección de un QTL de la presente invención, la posición del QTL sobre el cromosoma 9 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P18M50-141, P14M49-240, TG254, TG223, TG10, P18M50-134h, P14M49-243h, P18M50-599, P14 60-222h, P22M51-417h, P14M50-174h, P14M60-157h, P14M60-107h, P15 48-138h, P14 48-113h, Tm2a, P18M51-146h, P14M48-282h y P14 50-276h sobre el cromosoma 9 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 9 de S. lycopersicum, más preferentemente sobre el cromosoma 9 de S. habrochaites LYC 4/78 o sobre el cromosoma 9 de S. lycopersicum variedad Moneymaker. En otra modalidad preferida adicional de un método para detectar un QTL de la presente invención, la posición del QTL sobre el cromosoma 11 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P14M60-215e, P14M61-173h, P14M50-307h, TG47, P14M50-29xCD, P18M51-358h, P18M50-27xCD, P18M51-136h, P22M50-488h, TG393, P14M61-396h, P22M51-235h y P22M51-174e sobre el cromosoma 11 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 11 de S. lycopersicum, más preferentemente sobre el cromosoma 11 de 5. habrochaites LYC 4/78 o sobre el cromosoma 11 de S. lycopersicum variedad Moneymaker . En otra modalidad preferida adicional de un método para la detección de un QTL de la presente invención, la posición del QTL sobre el cromosoma 12 de la planta es indicada por una región genómica que comprende los marcadores genéticos CT19, TG68, P14M48-411e, P18M50-244h, P18M50-273h, P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48- 153h, P22M50-97h, TG296, P22M50-131h y P22M51-135h, preferentemente por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22 51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, y P22M50-131h sobre el cromosoma 12 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 12 de S. lycopersicum, más preferentemente sobre el cromosoma 12 de S. habrochaites LYC 4/78 o sobre el cromosoma 12 de S. lycopersicum variedad Moneymaker. En otro aspecto más, la presente invención se refiere a una planta resistente a Botrytis de la especie S. lycopersicum, o parte de la misma, que comprende dentro de su genoma, al menos un QTL, o una parte del mismo que confiere resistencia a Botrytis, en donde el QTL se selecciona del grupo que consiste de los QTLs sobre los cromosomas 4, 6, 9, 11 y 12 de Solanum habrochaites , preferentemente linea LYC 4/78, asociada con la resistencia a Botrytis, en donde la posición del QTL sobre el cromosoma 4 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos CT50, C2Atlg74970, P14M49-283e, P14M48-74e, P14M50-67e, CT1739 y P14M50-85h sobre el cromosoma 4 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 4 de S. lycopersicum, más preferentemente sobre el cromosoma 4 de S. habrochaites LYC 4/78 o sobre el cromosoma 4 de S. lycopersicum variedad Moneymaker, en donde el QTL o la parte del mismo que confiere resistencia a Botrytis , no está en su antecedente genético natural, y en donde la planta comprende además opcionalmente uno o más QTLs adicionales, o las partes del mismo que confieren resistencia a Botrytis , asociadas con la resistencia a Botrytis seleccionados de los QTLs sobre los cromosomas 1, 2 y/o 4 de Solanum habrochaites, preferentemente de Solanum habrochaites linea LYC 4/78, en donde la posición del QTL adicional sobre el cromosoma 4 de la planta es indicada por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P18M51-169.5e, P18M51-305. h, P14M60-262.9e, P14M61-292.7h, TG609, P14M48-345e, P14M48-177e y P18M50-147e sobre el cromosoma 4 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 4 de S. lycopersicum, más preferentemente sobre el cromosoma 4 de S. habrochaites LYC 4/78 o sobre el cromosoma 4 de S. lycopersicum variedad Moneymaker. En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un método para producir una planta de tomate endogámica resistente a Botrytis . El método comprende los pasos de producir una planta de tomate resistente a Botrytis de acuerdo a un método de la invención como se describe anteriormente, autopolinizando la planta, desarrollando la semilla obtenida de la planta autopolinizada, en nuevas plantas; identificando las plantas que muestran resistencia a Botrytis , y poseen características comercialmente deseables de entre las nuevas plantas, y repitiendo los pasos de autopolinización y selección hasta que es producido una planta de tomate endogámica que muestra resistencia a Botrytis, y posee características comercialícente deseables. Un método de producción de una planta de tomate endogámica resistente a Botrytis, puede comprender además el paso adicional de seleccionar las plantas de tomate endogámicas homocigotas que muestran resistencia a Botrytis, y poseen características comercialmente deseables. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una planta de tomate endogámica resistente a Botrytis, o partes de la misma, obtenible mediante un método de la invención. En un aspecto de la invención, la presente invención se refiere a una planta de tomate híbrida, o partes de la misma, que muestra resistencia a Botrytis, en donde la planta de tomate híbrida es obtenible mediante la cruza de una planta de tomate endogámica resistente a Botrytis obtenible mediante un método de la invención, con una planta de tomate endogámica que muestra características comercialmente deseables. La invención se refiere además a un cultivo de tejidos de células regenerables de las plantas de tomate de la presente invención. En una modalidad preferida de tal cultivo de tejidos, las células o los protoplastos de las células han sido aislados de un tejido seleccionado del grupo que consiste de hojas, polen, embriones, raices, puntas de raíz, anteras, flores, frutos, y tallos y semillas. La invención se refiere además al uso de un marcador seleccionado del grupo que consiste de los marcadores de las Tablas 1-5 para la detección de los QTLs para la resistencia a Botrytis , de acuerdo a la invención, y/o para la detección de las planta de tomates resistentes a Botrytis . La planta de tomate donante resistente a Botrytis , utilizada en los métodos de la presente invención es preferentemente seleccionada del grupo que consiste de Lycopersicon cerasi forme, Lycopersicon chees anii, Lycopersicon chilense, Lycopersicon chmielewskii , Lycopersicon licopersicum , Lycopersicon habrochaites , Lycopersicon p ruiflorum, Lycopersicon pennellii, Lycopersicon peruvianum , Lycopersicon pimpinellifolium y Solanum lycopersicoides, más preferentemente, se utiliza un acceso de tomate silvestre como la planta donante. Las plantas donantes altamente preferidas son Solanum habrochaites, en particular Solanum habrochaites LYC 4/78. La planta de tomate recipiente susceptible a Botrytis , utilizado en los métodos de la presente invención es preferentemente una planta de la especie Solanum lycopersicum, más preferentemente un cultivo de S. lycopersicum que posee características comercialmente deseables, u otra linea de tomate comercial.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la posición de los locus de rasgos cuantitativos (QTLs) para la resistencia a B. cinérea que se origina de S. habrochaites LYC 4/78 con los mapas de unión o conexión que representan el cromosoma 4 (posición putativa de los QTLs proporcionados como secciones oscuras) . Las posiciones del mapa se dan en cM. Los datos muestran la identificación putativa de dos QTLs separados, uno centrado alrededor del marcador TG62 (ver Ejemplo 1) e identificado en IL 4-1 en el Ejemplo 4, y otro más separado de éste que no incluye el marcador TG62 pero centrado alrededor del marcador P14M49-283e e identificado en IL 4-3 en Ejemplo 4. Los QTLs tratados con el cromosoma 4 disminuyen la velocidad de crecimiento de la lesión y la incidencia de la enfermedad. Los códigos para los marcadores AFLP son más extensamente descritos en la Tabla 1. Todos los marcadores indicados como asociados a los QTLs en las Figuras que ejemplifican la presente invención pueden ambos individualmente, asi como en combinación, ser utilizados como marcadores en aspectos de la presente . La Figura 2 muestra la posición del locus de rasgo cuantitativo (QTL) para resistencia a B. cinérea que se origina de S. habrochaites LYC 4/78 con los mapas de conexión que representan el cromosoma 6 (posición putativa de QTL proporcionada como sección oscura) . El QTL sobre el cromosoma 6 disminuye la velocidad de crecimiento de la lesión y la incidencia de la enfermedad. La Figura 3 muestra la posición del locus de rasgo cuantitativo (QTL) para resistencia a B. cinérea que se origina de S. habrochaites LYC 4/78 con los mapas de conexión que representan el cromosoma 9 (posición putativa de QTL proporcionada como sección oscura) . El QTL sobre el cromosoma 9 disminuye la velocidad de crecimiento de la lesión y la incidencia de la enfermedad. La Figura muestra además la introgresión sobre el cromosoma 9 de las lineas 11-2 y 12-3. La Figura 4 muestra la posición del locus de rasgo cuantitativo (QTL) para resistencia a B. cinérea que se origina de S. habrochaites LYC 4/78 con los mapas de conexión que representan el cromosoma 11 (posición putativa de QTL proporcionada como sección oscura) . El QTL sobre el cromosoma 11 disminuye la velocidad de crecimiento de la lesión y la incidencia de la enfermedad. El mapa de conexión representa la linea de IL 11-2 del Ejemplo 4. La Figura 5 muestra la posición del locus de rasgo cuantitativo (QTL) para resistencia a B. cinérea que se origina de S. habrochaites LYC 4/78 con los mapas de conexión que representan el cromosoma 12 (posición putativa de QTL proporcionada como sección oscura) . El QTL sobre el cromosoma 12 disminuye la velocidad de crecimiento de la lesión y la incidencia de la enfermedad. La figura 6 muestra la retrocruza y la estrategia de selección utilizada para obtener la población de IL de S. habrochaites LYC 4/78 sometida a introgresión en el antecedente genético de S. lycopersicum variedad Moneymaker descrita en el Ejemplo 4. La figura 7 muestra un genotipo gráfico de la linea de introgresión S. lycopersicum variedad Moneymaker x S. habrochaites LYC 4/78 utilizada en el Ejemplo 4. Todos los cromosomas son dibujados a escala en segmentos de 20 cM de acuerdo al mapa de conexión genética F2. Algunas regiones fueron agregadas a los extremos de los cromosomas 3, 4, 5 y 9 (marcadores CAPS) . Las i n t r og r e s i one s homocigotas provenientes de S. habrochaites son presentadas en negro, mientras que las i n t r og r e s i one s he t e r o c i go t a s son marcadas utilizando un patrón diagonal (gris) . La figura 8 muestra la posición de los locus de rasgo cuantitativo (QTLs) para resistencia a B. cinérea que se originan de S. habrochaites LYC 4/78 con los mapas de conexión que representan los cromosomas 1, 2 y 4 e indican los QTLs indicados en esta solicitud como QTL-Ih, QTL-2h y QTL-4hA.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION DEFINICIONES Como se utiliza en la presente, el término "Botrytis" significa Botrytís cinérea, también conocido como moho gris o mancha gris, una enfermedad comúnmente encontrada sobre el tallo como hojas y frutos de los tomates. Se considera en general que el hongo patógeno vegetal Sclerotinia sclerotiorum tiene un mecanismo de infección similar a aquel de B. cinérea (Prins et al., 2000) . Aunque la infección por S. sclerotiorum en tomate es económicamente mucho menos importante que la infección por B. cinérea, ambos hongos secretan un espectro de proteasas, enzimas que degradan la pared celular de las plantas, toxinas, asi como ácido oxálico. Se sabe que algunos de estos factores juegan un papel en la estrategia de infección de ambos hongos. Como resultado, se cree que los mecanismos y genes que confieren resistencia a Botrytis son igualmente efectivos en la provisión de resistencia a la infección por S. sclerotiorum . Por lo tanto, cuando se hace referencia en la presente a "resistencia a Botrytis" , tal resistencia debe entenderse como que incluye también la resistencia a cualquier hongo de la familia Sclerotiniaceae , preferentemente la resistencia a S. sclerotiorum y B. cinérea, más preferentemente la resistencia a B. cinérea. Como se utiliza en la presente, el término "alelo (s)" significa cualesquiera de una o más formas alternativas de un gen, cuyos alelos se refieren todos al menos a un rasgo o característica. En una célula u organismo diploide, los dos alelos de un gen dado ocupan los locus correspondientes sobre un par de cromosomas homólogos. Ya que la presente invención se refiere a los QTLs, por ejemplo, las regiones genómicas que pueden comprender uno o más genes, pero también las secuencias reguladoras, algunas es más preciso referirse a "haplotipo" (por ejemplo, un alelo de un segmento cromosomico) en vez de "alelo", no obstante, en esos casos, el término "alelo" debe entenderse como que comprende el término "haplotipo". Un "gen" es definido en la presente como una unidad hereditaria que consiste de una secuencia de AND que ocupa una posición específica sobre un cromosoma, y que contiene la instrucción genética para una característica o rasgo particular en un organismo. Un "locus" es definido en la presente como la posición que ocupa un gen dado sobre un cromosoma de una especie dada. Como se utiliza en la presente, el término "heterocigoto" significa una condición genética que existe cuando diferentes alelos residen en locus correspondientes sobre los cromosomas homólogos. Como se utiliza en la presente, el término "homocigoto" significa una condición genética existente cuando alelos idénticos residen en locus correspondientes sobre cromosomas homólogos. Como se utiliza en la presente, el término "híbrido" significa cualquier progenie de una cruza entre dos individuos genéticamente no similares, incluyen pero no limitados a la cruza entre dos líneas endogámicas. Como se utiliza en la presente, el término "endogámico" significa un individuo o línea sustancialmente homocigoto. En esta solicitud un "evento de recombinación" se entiende que significa una cruza meiótica. Como se utiliza en la presente, los términos " introgresión" , "introgresado o sometido a introgresión" e "introgresamiento" se refieren a un proceso natural y artificial mediante el cual los genes de una especie variedad o cultivos son movidos dentro del genoma de otra especie, variedad o cultivo, mediante la cruza de esas especies. El proceso puede ser completado opcionalmente mediante retrocruza al progenitor recurrente. "Manipulación por ingeniería genética", "transformación" y "modificación genética" son todos utilizados en la presente como sinónimos para la transferencia de los genes aislados y clonados dentro del ADN, usualmente el ADN cromosómico o el genoma, de otro organismo.

Como se utiliza en la presente, el término "marcador molecular" se refiere a un indicador que es utilizado en métodos para visualizar diferencias en características de las secuencias de ácido nucleico. Los ejemplos de tales indicadores son los marcadores de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) , marcadores de polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP) , polimorfismos de nucléotidos simple (SNPs), marcadores microsatélites (por ejemplo, SSRs), marcadores de la región amplificada caracterizada en secuencia (SCAR) , marcadores de la secuencia polimórfica amplificada escindida (CAPS) o marcadores o combinaciones de isozima de los marcadores descritos en la presente que definen una posición genética y cromosómica específica. Los términos "resistente" y "resistencia" abarcan la resistencia parcial y completa a la infección. Una planta de tomate susceptible a Botrytis puede ser ya sea no resistente o tener bajos niveles de resistencia a la infección por Botrytis . Como se utiliza en la presente, el término "parte de planta o parte vegetal" indica una parte de la planta de tomate, incluyendo células simples y tejidos celulares tales como células vegetales que están intactas en las plantas, grupos de células y cultivos de tejidos de los cuales pueden ser regeneradas las plantas de tomate. Los ejemplos de partes de plantas incluyen, pero no están limitadas a, células simples y tejidos provenientes del polen, óvulos, hojas, embriones, raices, puntas de raíz, anteras, flores, frutos, brotes de tallos y semillas; asi como polen, óvulos, hojas, embriones, raices, puntas de raíz, anteras, flores, frutos, tallos, brotes, retoños, materiales de raíz, semillas, protoplastos , callos y similares. Como se utiliza en la presente, el término "población" significa una colección genéticamente heterogénea de plantas que comparten una derivación genética común. Como se utiliza en la presente, el término "tomate" significa cualquier planta, linea o población antiguamente conocida bajo el nombre de género de Lycopersicon incluyendo pero no limitados a Lycopersicon cerasiforme, Lycopersicon cheesmanii, Lycopersicon chilense, Lycopersicon chmielewskii , Lycopersicon esculentum (now Solanum lycopersicum) , Lycopersicon hirsutum , Lycopersicon parviflorum , Lycopersicon pennellii, Lycopersicon peruvianum, Lycopersicon pimpinellifolium , o Solanum lycopersicoides . El nombre científico recién propuesto para Lycopersicon esculentum es Solanum lycopersicum . Similarmente , los nombres de las especies silvestres pueden ser alterados. L. pennellii se ha vuelto Solanum pennellii, L. hirsutum puede volverse S. habrochaites , L. peruvianum puede ser dividido en S. "N peruvianum" y S. "Callejón de Huayles", S. peruvianum , y S. corneliomuelleri , L. parviflorum puede volverse S.neorickii, L. chmielewskii puede volverse S. chmielewskii , L. chilense puede volverse S. chilense , L. cheesmaniae puede volverse S. cheesmaniae o S. galapagense, y L. pimpinela folium puede volverse S. pimpinela folium (Solanacea Genome Network (2005) Spooner y Knapp; http : //www . sgn . cornell . edu/help/about/ solanum nomenclature . html ) . Se nota especialmente que S. habrochaites puede ser definido como una especie de tomate que posee frutos peludos, mientras que S. lycopersicum es una especie de tomate que posee frutos sin pelo. Como se utiliza en la presente, el término "variedad" o "cultivo" significa un grupo de plantas similares que por características estructurales o genéticas y/o funcionamiento pueden ser distinguidas de otras variedades dentro de la misma especie. El término "QTL" es utilizado en la presente en su significado reconocido en la técnica. El término "QTL asociado con resistencia B. cinérea en tomate" así como el término más corto "QTL para la resistencia a Botrytis" se refiere a una región localizada sobre un cromosoma particular del tomate, que está asociado con al menos un gen que codifica para la resistencia a Botrytis o al menos una región reguladora, por ejemplo, una región de un cromosoma que controla la expresión de uno o más genes involucrados en la resistencia a Botrytis . La expresión fenotipica de ese gen puede por ejemplo ser observada como una velocidad reducida de crecimiento de la lesión y/o como una incidencia reducida de la enfermedad. Un QTL puede comprender por ejemplo, uno o más genes de los cuales los productos confieren resistencia genética. Alternativamente, un QTL puede por ejemplo comprender genes o secuencias reguladoras de los cuales los productos influyen la expresión de los genes sobre otros locus en el genoma de la planta, con lo cual se confiere la resistencia a Botrytis . Los QTLs de la presente invención pueden ser definidos por la indicación de su posición genética en el genoma del acceso de tomate silvestre respectivo utilizando uno o más marcadores genómicos moleculares. Uno o más marcadores, a su vez, indican un locus especifico. Las distancias entre locus son usualmente medidas por frecuencia del cruzamiento entre el locus sobre el mismo cromosoma. Entre más separados estén dos locus, más probable es que ocurrirá una cruza entre ellos. De manera contraria, si dos locus están muy cercanos, es menos probable que ocurra entre ellos una cruza. Como una regla, un centimorgan (cM) es igual a una recombinación del 1% entre el locus (marcadores) . Cuando un QTL puede ser indicado por múltiples marcadores, la distancia genética entre los marcadores de punto final es indicadora del tamaño del QTL.

El término "planta de tomate recipiente susceptible a Botrytis" se utiliza en la presente para indicar una planta de tomate que va a recibir el ADN obtenido de una planta de tomate donante que comprende un QTL para la resistencia a Botrytis . La "planta de tomate recipiente susceptible a Botrytis" puede o no comprender ya uno o más QTLs para la resistencia a Botrytis , en cuyo caso el término indica una planta que va a recibir un QTL adicional. El término "antecedente genético natural" es utilizado en la presente para indicar el antecedente genético original de un QTL. Tal antecedente puede por ejemplo ser el genoma de un acceso silvestre de tomates con resistencia a Botrytis . Por ejemplo, los QTLs de la presente invención fueron encontrados en posiciones especificas sobre los cromosomas 4, 6, 9, 11 y 12 de Solanum habrochaites LYC 4/78. Como un ejemplo, el Solatium habrochaites LYC 4/78 representa el antecedente genético natural de los QTLs sobre los cromosomas 4, 6, 9, 11 y 12 de Solanum habrochaites LYC 4/78. También, el Solanum habrochaites LYC 4/78 representa el antecedente genético natural de los QTLs. De manera contraria, un método que involucra la transferencia del ADN que comprende el QTL, o una parte del mismo que confiere resistencia proveniente del cromosoma 4 de Solanum habrochaites LYC 4/78 a la misma posición sobre el cromosoma 4 de otra especie de tomate, más notablemente S. lycopersicum, dará como resultado ese QTL, o la parte del mismo que confiere resistencia, que no está en su antecedente genético natural . El término "incidencia de la enfermedad" es definido en la presente como el parámetro que refleja la capacidad de la planta para reducir el establecimiento de una infección y puede por ejemplo ser establecida por la determinación del éxito de lograr la infección de la planta después del contacto con el agente infeccioso. El término "velocidad de crecimiento de la lesión" o "velocidad proporción de crecimiento de la lesión" es definido en la presente como el parámetro que refleja la capacidad de la planta para retardar o reducir la progresión de la infección, y puede por ejemplo, ser establecido por la determinación de la velocidad o proporción de crecimiento de las lesiones en expansión. El término "determinación cuantitativa" es definido en la presente como el establecimiento o evaluación de una manera que involucra medición, en particular la medición de aspectos mensurables en términos de las cantidades y número. La determinación en grado de severidad e indicaciones de mayor, más, menos o igual o de magnitud cada vez mayor o cada vez menor, no están comprendidos en el presente término "determinación cuantitativa", cuyo término implica al final la presencia de un mecanismo de conteo objetivo para determinar valores absolutos. Por lo tanto, "la determinación cuantitativa de la incidencia de la enfermedad y/o la velocidad de crecimiento de la lesión" comprende preferentemente la determinación del porcentaje de todos los contactos potencialmente infecciosos entre la planta y el agente infeccioso que dan como resultado lesiones mensurables (con el fin de evaluar la incidencia de la enfermedad) y/o la determinación del incremento en diámetro, circunferencia, área superficial o volumen de una o más de las lesiones sobre el tiempo bajo condiciones favorables para el crecimiento del hongo (con el fin de evaluar la velocidad de crecimiento de la lesión) . El término "condiciones de práctica estándares", "condiciones de invernadero estándares" y "condiciones estándares" se refieren a las condiciones de luz, humedad, temperatura, etc., bajo las cuales las plantas son desarrolladas o incubadas, por ejemplo, para el propósito de caracterización fenotipica de la resistencia a la enfermedad, como estándar. Para invernaderos por ejemplo, esto se refiere a 16 horas de día, 15°C-25°C. Más en general, los términos se refieren a condiciones de crecimiento estándares y de referencia con un periodo de iluminación de 8 a 24 horas (flujo de fotones fotosintét icos (PPF) 50 a 1000 µp??? rrf2 s-1) , preferentemente un régimen de luz de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, una temperatura en el aire de aproximadamente 19°C durante el día y 15°C en la noche, un déficit de presión de vapor de aproximadamente 4.4 g rtf3 correspondiente a una humedad relativa (RH) de aproximadamente 60%-85%, a 600-700 ppm de C02 y concentración atmosférica de O2 y a una presión de aire atmosférica (en general 1008 hPa ( 1.02kg/cm2) ) . El agua y los nutrientes pueden ser administrados gota a gota cerca del tallo o en la forma de un rocío o niebla. Las condiciones estándares de experimentación de bioensayo, tales como el ensayo de longitud de lesión en el tallo, la incidencia de la enfermedad y las mediciones de la velocidad de crecimiento de la lesión, son además especificadas en los siguientes Ejemplos. Con más detalle, el ensayo de longitud de lesión promedio del tallo tiene que ser realizado como se describe en los Ejemplos 3.10 y 3.11.

IDENTIFICACION DE QTLs ASOCIADOS CON RESISTENCIA A BOTRYTIS, EN TOMATE Se sabe que las especies de tomates silvestres proporcionan fuentes adecuadas para rasgos de resistencia a la enfermedad y a las plagas y la presencia de resistencia parcial a B. cinérea en hojas de especies de tomates silvestres, ha sido documentada (Urbasch, 1986) . Dos factores han impedido la producción para la resistencia de B. cinérea en tomate en el pasado. Primeramente, la resistencia parcial a la cruza en líneas de producción comerciales se ha encontrado con éxito limitado. En segundo lugar, faltaban ensayos confiables y reproducibles de la enfermedad que pudieran hacer posible la identificación y localización del material genético responsable de conferir resistencia. Urbasch (Urbasch, 1986) , por ejemplo, infectó hojas con micelio utilizando tapones de agar proporcionando el hongo con exceso de nutrientes, lo cual afectó fuertemente el proceso de infección. Otros investigadores tienen utilizados índices subjetivos de la enfermedad de la planta, que son inadecuados para el análisis cuantitativo requerido para la identificación de los locus de rasgos cuantitativos (QTLs) . La infección con Botrytis cinérea en Solanum lycopersicum bajo condiciones de laboratorio está relativamente bien estudiada (por ejemplo, Benito et al., 1998) . La inoculación por gotas de las hojas y la incubación subsiguiente a temperaturas moderadas (15-20°C) da como resultado una desarrollo rápido (16-24 horas después de la infección (hpi)) de las manchas necróticas en el sitio del inoculo. La infección está temporalmente restringida a este punto por aproximadamente 48 horas. Desde ese momento en adelante comienza a expandirse una proporción de las lesiones (usualmente 5-10%) . El crecimiento o escrescencia de estas denominadas "lesiones en expansión" va acompañada por un incremento en la biomasa del hongo y da como resultado la colonización de la hoja completa en las siguientes 48 horas. Los presentes inventores encontraron al principio que los QTLs específicos asociados con la resistencia a Botrytis en el tomate pueden ser identificados cuando es utilizado un bioensayo para medir la resistencia, en donde la velocidad de la progresión de la infección y/o el éxito de lograr la infección después del contacto con el agente infeccioso son medidos cuantitativamente sobre las partes de la planta de tomate, preferentemente sobre partes desprendidas, más preferentemente sobre los segmentos del tallo. Además, puede ser utilizada una prueba como se describe en el Ejemplo 4, en donde es estudiada la resistencia de las plantas enteras en donde el tallo fue mecánicamente herido, y se aplicó a la herida un inoculo de Botrytis . Después del uso de líneas de introgresión, cada una conteniendo un segmento de introgresión específico del genoma de S. habrochaites LYC 4/78 en un antecedente de S. lycopersicum variedad Moneymaker, los inventores fueron capaces sorprendentemente de descubrir QTLs adicionales asociados con resistencia a Botrytis en S. habrochaites LYC 4/78. De este modo, la presente invención proporciona ahora un método para producir una planta de tomate cultivada que es resistente a Botrytis, que comprende: la producción de una serie de lineas de introgresión del tomate cultivado, en donde cada linea de introgresión contiene una introgresión genómica especifica (una región cromosómica) proveniente de un acceso de tomate silvestre resistente a Botrytis, preferentemente S. habrochaites LYC 4/78, y cuyas series conjuntamente cubren el genoma del acceso de tomate silvestre resistente; la identificación de los QTLs asociados con la resistencia a Botrytis en plantas de cada uno de las lineas de introgresión individuales, mediante la realización de un bioensayo cuantitativo para la medición de la resistencia a Botrytis, en plantas de cada una de las lineas de introgresión individuales, preferentemente mediante la medición de la incidencia de la enfermedad y/o la velocidad de crecimiento de la lesión, y el establecimiento de un mapa de conexión o vinculo genético que vincula la resistencia observada a Botrytis con la presencia de marcadores cromosómicos en las lineas de introgresión, y la asignación de marcadores contiguos sobre el mapa que están ligados a una resistencia mejorada (por ejemplo, una incidencia reducida a la enfermedad y/o una velocidad reducida de crecimiento de la lesión) a un locus de rasgo cuantitativo; y el uso de una linea de introgresión que contiene un QTL asociado con la resistencia de Botrytis para la producción de una planta de tomate cultivada que es resistente a Botrytis, o el uso de la información del marcador para los QTLs identificados de este modo en selección asistida por marcadores, de las plantas sospechosa de tomates resistentes a Botrytis . Se encontró sorprendentemente que múltiples QTLs para la resistencia a Botrytis , estaban presentes en el genoma de las plantas de tomates resistentes a Botrytis, mientras que los métodos de la técnica anterior dieron como resultado la identificación tentativa de los QTLs sobre los cromosomas 1, 2, 4 y 10. Además, se encontró que los QTLs mediante el uso de los presentes métodos, estaban localizados en los cromosomas no previamente asociados con la resistencia a Botrytis, de las plantas de tomate, incluso cuando se utiliza un antecedente genético similar (WO 02/085105) . Por lo tanto, los métodos de la presente invención han proporcionado la introspectiva adicional de que el uso sobre las ILs puede dar como resultado investigación más detallada del origen genético de la resistencia a Botrytis en el tomate, y puede dar como resultado la identificación de material cromosómico involucrado en tal resistencia, no identificada previamente con éste. Un método para detectar un locus de rasgo cuantitativo (QTL) asociado con la resistencia a Botrytis en tomates de acuerdo a la presente invención, de otro modo dirigible como método para identificar o localizar un locus de rasgo cuantitativo (QTL) , requiere la disponibilidad de una planta de tomate (parcialmente) resistente a Botrytis . Tal planta puede ser proporcionada mediante cualquier método conocido en la técnica, o mediante el uso de cualquier método para la determinación de la presencia de la resistencia (parcial) en la planta. La provisión de una planta de tomate (parcialmente) resistente a Botrytis (que posteriormente servirá como una planta donante en un método de la presente invención) hace posible el establecimiento o la provisión de marcadores croraosómicos, preferentemente los marcadores AFLP, CAPS y/o SCAR, lo más preferentemente los marcadores CAPS y/o SCAR, para al menos uno, pero preferentemente para todos los cromosomas de la planta. Mediante el establecimiento de una colección de marcadores cromosómicos sobre la longitud completa de los cromosomas, las diversas posiciones de los cromosomas pueden ser efectivamente marcadas. Tales métodos son bien conocidos en la técnica y los métodos ejemplares serán descritos con más detalle más adelante en la presente. Un método para detectar un locus de rasgo cuantitativo (QTL) asociado con resistencia a Botrytis en tomate de acuerdo con la presente invención puede comprender el paso de medir la resistencia a Botrytis en una planta. Hasta ahora, una planta es puesta en contacto con una cantidad infecciosa de Botrytis . Tal cantidad puede variar entre las plantas y entre las especies fúngicas probadas.

Usualmente, será suficiente una cantidad de aproximadamente 1 a 10 hasta una cantidad de aproximadamente 500-5000 conidias del hongo. La medición de la resistencia a Botrytis puede comprender determinar cuantitativamente la incidencia de la enfermedad y/o la velocidad del crecimiento de la lesión en una planta. El paso de poner en contacto una planta con una cantidad infecciosa de Botrytis y determinar cuantitativamente la resistencia, es preferentemente realizado como parte de un bioensayo de resistencia sobre segmentos de tallo u hojas como se describe en la presente, preferentemente, un bioensayo de resistencia sobre segmentos de tallo, más preferentemente sobre plantas enteras como se describe en el Ejemplo 4. El experto en la materia entenderá que son posibles variaciones de estos ensayos como se describe más adelante en la presente. Un bioensayo de resistencia sobre segmentos de tallo puede ser realizado esencialmente como sigue: Primeramente, las semillas para las plantas de progenies son plantadas y desarrolladas hasta plántulas/plantas adecuadamente de aproximadamente 50 cm de altura. Los 5-10 cm superiores y los 5-10 cm inferiores del tallo de las plantas pueden ser retirados y los 30 cm remanentes pueden ser cortados en segmentos iguales de 5-6 cm. Los segmentos de tallo son preferentemente colocados erguidos en una red con la base del tallo sobre papel filtro húmedo. Antes de la inoculación, los segmentos de tallo son adecuadamente rociados con agua con el fin de asegurar una dispersión igual del inoculo sobre la superficie herida. Cada segmento de tallo puede luego ser inoculado por una suspensión de conidias de B. cinérea. Una cantidad adecuada del inoculo, por ejemplo, una gota de aproximadamente 5 µ?, que comprende aproximadamente 106 conidias x mi-1, puede ser aplicada a éste sobre la parte superior de cada segmento de tallo. Los segmentos de tallo son luego incubados a una temperatura adecuadamente de aproximadamente 16°C, preferentemente en la oscuridad, y preferentemente a una alta humedad (por ejemplo, 100% de RH) . El progreso de la infección puede ser determinado cuantitativamente mediante la medición del avance máximo del síntoma del pudrimiento a diversos intervalos de tiempo después de la inoculación con un calibrador Vernier. En un número de intervalos de tiempo adecuados, por ejemplo, a las 96, 120 y 144 horas después de la infección (hpi), los tallos pueden ser luego inspeccionados para la formación de lesiones (incidencia de la enfermedad) y el crecimiento de las lesiones de una manera cuantitativa. Parámetros muy adecuados comprenden la medición del tamaño de la lesión, por ejemplo, mediante el uso de un calibrador. Con el fin de corregir la variación provocada por la estación o el cultivo de las plantas, las mediciones cuantitativas de los bioensayos pueden estar relacionadas a las mediciones comparables en lineas de control o referencia susceptibles. La incidencia de la enfermedad puede ser determinada adecuada al nivel del número total de lesiones en expansión entre el número total de gotitas de inoculación. La proporción de las lesiones de expansión sobre un genotipo particular puede ser luego dividida por la proporción de la expansión de las lesiones observadas en un genotipo control de referencia, y expresadas como un porcentaje. Alternativamente, o adicionalmente las velocidades de crecimiento de las lesiones pueden ser determinadas mediante el cálculo del incremento en el tamaño de las lesiones (por ejemplo, en milímetro) en un periodo adecuado, por ejemplo, en un periodo de 24 horas. Los datos para las lesiones sin expansión puede suprimido del análisis cuantitativo. La velocidad de crecimiento de la lesión, obtenida, puede entonces ser opcionalmente dividida entre la velocidad de crecimiento de la lesión observada en un genotipo control o de referencia y expresada como un porcentaje, o como una cifra absoluta, por ejemplo, en milímetros . Alternativamente, las plantas pueden ser seleccionadas mediante el uso de un bioensayo de infección en hoja como sigue: Primeramente, las semillas de tomate son plantadas y desarrolladas a plántulas/plantas. Para cada planta individual una o dos hojas compuestas pueden ser cortadas del tallo principal y transferidas a espuma de floristas pre-humedecida . La espuma de floristas es luego colocada en una caja de Petri que contiene agua de la llave y sustancialmente colocada en un recipiente humedecido por aspersión que contiene papel filtro húmedo. Un núcleo adecuado que comprende conidias de B. cinérea puede ser preparado mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe por Benito et al., 1998. Las hojas compuestas son luego inoculadas con la suspensión de conidia de B. cinérea mediante la colocación de un número de gotitas, adecuadamente por ejemplo, de 6 a 10 gotitas de 2 µ? cada una, sobre la superficie superior de las hojas. El recipiente es luego cerrado y las hojas son incubadas a una temperatura adecuadamente entre 15°C-20°C, preferentemente en la oscuridad, y preferentemente a alta humedad. A un número de intervalos de tiempo adecuados, por ejemplo, a las 96, 120 y 144 hpi, las hojas pueden ser luego inspeccionadas para la incidencia de la enfermedad y el crecimiento de las lesiones, de una manera cuantitativa como se describe anteriormente para el bioensayo de tallo. Un método para detectar un locus de rasgo cuantitativo (QTL) asociado con la resistencia a Botrytis en tomate de acuerdo a la presente invención comprende los pasos de establecer un mapa de conexión genética que vincula la resistencia observada con la presencia de marcadores cromosómicos de la planta donante de tomate en las plantas recipiente de las ILs, y asignando marcadores contiguos sobre el mapa, que están vinculados a una resistencia aumentada a un locus de rasgo cuantitativo. Un mapa de conexión genética que vincula la resistencia aumentada, observada, con la presencia de marcadores cromosómicos de la planta de tomate donante en las plantas IL, puede ser establecido mediante cualquier método conocido en la técnica. La persona experta está enterada de los métodos para identificar los marcadores regulares vinculados a los locus de rasgos cuantitativos de resistencia (QTLs) y el mapeo de estos marcadores sobre un mapa de conexión genética (ver por ejemplo Bai et al., 2003; Foolad et al., 2002; van Heusden et al., 1999) . La asociación de entre el fenotipo resistente a Botrytis, y el genotipo marcador pueden ser realizados mediante el uso de paquetes de software tales como JoinMap® y apQTL® (ver Ejemplos) o cualquier paquete estadístico estándar que puede realizar el análisis del análisis de varianza. Los marcadores moleculares pueden ser utilizados para construir mapas de conexión genética y para identificar los locus de rasgos cuantitativos (QTL) para la resistencia a Botrytis . Los tipos adecuados de marcadores moleculares y los métodos para obtener éstos son descritos con más detalle más adelante en la presente.

Marcadores Moleculares y QTLs Los marcadores moleculares son utilizados para la visualización de diferencias en las secuencias de ácido nucleico. Esta visualización es debido a las técnicas de hibridación de ADN-ADN (RFLP) y/o debido a técnicas que utilizan la reacción en cadena de polimerasa (por ejemplo, STS, microsa t é 1 i t e s , AFLP) . Todas las diferencias entre dos genotipos progenitores se segregarán en una población de mapeo (por ejemplo, BCi, F2 ; ver La figura 2) con base en la cruza de estos genotipos progenitores. La segregación de los diferentes marcadores puede ser comparada y pueden ser calculadas las frecuencias de recombinación. Las frecuencias de recombinación de los marcadores moleculares sobre diferentes cromosomas es en general de 50%. Entre marcadores moleculares localizados sobre el mismo cromosoma, la frecuencia de recombinación depende de la distancia entre los marcadores. Una baja frecuencia de recombinación corresponde a una baja distancia de marcadores sobre un cromosoma. Comparando todas las frecuencias de recombinación dará como resultado el orden más lógico de los marcadores moleculares sobre los cromosomas. Este orden más lógico puede ser descrito en un mapa de enlace (Paterson, 1996) . Un grupo de marcadores adyacentes o contiguos sobre el mapa de conexión que está asociado a una incidencia reducida de la enfermedad y/o a una velocidad reducida de crecimiento de la lesión, apunta con precisión a la posición de un QTL. Después de la identificación del QTL, el efecto del QTL (la resistencia) puede ser confirmado por ejemplo mediante la evaluación de la resistencia a Botrytis en progenies d BC2Si que segregan para los QTLs bajo investigación. La evaluación de la resistencia a Botrytis , puede ser realizada adecuadamente mediante el uso de un bioensayo en tallo o en hoja como se describe en la presente. Los QTLs para la resistencia contra Botrytis en tomate, obtenible mediante el uso de un método de la invención son un aspecto de la presente invención. Una característica de tales QTLs es que, cuando están presentes en plantas, éstos son indicadores de la presencia de una incidencia reducida de la enfermedad y/o una velocidad reducida de crecimiento de la lesión después del contacto con la planta con una cantidad infecciosa del material de Botrytis , cuyo material puede ser proporcionado en cualquier forma, tal como la forma de conidias o de micelium.

La presente invención también se refiere a un QTL para la resistencia contra Botrytis en tomate, en donde el QTL se selecciona del grupo que consiste de los QTLs sobre los cromosomas 4, 6, 9, 11 y 12 de Solanium habrochaites LYC 4/78 asociados con la resistencia a Botrytis. Estos QTLs pueden ser más claramente definidos o indicados por los marcadores listados en las Tablas 1-5 En estas tablas, la región genómica donde los QTLs están localizados, es indicada por los marcadores de AFLP listados. Los QTLs de la presente invención comprenden información genética en la forma de ADN responsable de conferir incidencia a la enfermedad de Botrytis (parcial) y/o una velocidad reducida de crecimiento de la lesión por Botrytis en una planta de tomate. La información genética puede por ejemplo comprender un gen o un elemento regulador.

Tabla 1: QTLs encontrados sobre el cromosoma 4 en la progenie de una cruza de S. lycopersicum variedad Moneymaker x S. habrochaites LYC 4/78 e información de resistencia cuantitativa relacionada. Las plantas de S. Lycopersicum variedad Moneymaker susceptibles, mostraron en promedio una velocidad de crecimiento de la lesión de 4.6 mm/dia y una incidencia promedio de la enfermedad de 73 ± 6.4 % (Ver tablas 8 y 9) QTL Marcador1* Cromosoma Velocidad Incidencia de de la crecimiento enfermedad de la 2 (%) lesión2 (mm/dia QTL-4hA P18M51-146h 4 2.5 41 ± 6.4 P14M48-158h TG6093 P22M50-158h P14M61-215h P14M48-349h P14M61-237e P14M48-345e P14M50-124e P14M61120e TG624 T14055 TG5556 CT507 C2Atlg749708 QTL-4hB CT50 4 2.8 51 ±9.6 C2Atlg74970 P14M49-283e P14M48-84e P14M50-67e CT1739 P14M50-85h nomenclatura de los marcadores: Los códigos por los cuales es comúnmente indicada la combinación del cebador de AFLP, por ejemplo P 18M51 - 156h , en donde P y M son las secuencias cebadoras comunes PstI y Msel o los cebadores universales (Vos et al. , 1995 ; Bai et al. , 2003) seguido por 2 ó 3 bases selectivas extra como es indicado por un código de extensión de dos dígitos Los códigos de extensión de dos dígitos son como sigue: 14: AT ; 15: CA; 18: CT; 22: GT; 48: CAC ; 49: CAG; 50: CAT ; 51: CCA; 60: CTC; 61: CTG . 156h es el tamaño aproximado en pares de bases del fragmento polimórfico resultante (tamaño dado ± 2 pares de bases) . El tamaño es normalmente redondeado pero puede también ser dado en decimales. Este fragmento es amplificado ya sea en S. lycopersicum variedad Moneymaker (e) o S. habrochaites LYC 4/78 (h) . La presencia de un marcador indica que al menos está presente un alelo del origen indicado. Las secuencias cebadoras y adaptadoras son descritas con detalle por Bai et al. 2003. 2 Incidencia de la enfermedad y crecimiento de la lesión son determinados utilizando los métodos como son explicados con detalle en los Ejemplos. 3TG609: ver Tabla 10. 4TG62: Ver Tabla 11. 5T14Q5: ver Tabla 20. 6 TG555: ver Tabla 12. 7CT50: ver Tabla 13. 8C2_Atlg74970 : ver Tabla 14. 9CT173: ver Tabla 21.

Tabla 2: QTLs encontrados sobre el cromosoma 6 en la progenie de una cruza de S. lycopersicum variedad Moneymaker x S. habrochaites LYC 4/78 e información de resistencia cuantitativa relacionada. Las plantas de S. Lycopersicum variedad Moneymaker susceptibles, mostraron en promedio una velocidad de crecimiento de la lesión de 4.6 mm/dia y una incidencia promedio de la enfermedad de 73 ± 6.4 % (Ver tabla 1 para notas) QTL Marcador1* Cromosoma Velocidad Incidencia de de la crecimiento enfermedad2 de la (%) lesión2 (mm/dia QTL-6h P22M50-188h 6 3.6 49 ± 6.5 P14M48-521e P15M48-386h P18M51-199h P18M51-I03h P22M50-103h Pl8M51-388e P15M48-395e P22M50-124e P14M48-160e P22M50-513h Tabla 3: QTLs encontrados sobre el cromosoma 9 en la progenie de una cruza de S. lycopersicum variedad Moneymaker x S. habrochaites LYC 4/78 e información de resistencia cuantitativa relacionada. Las plantas de S. Lycopersicum variedad Moneymaker susceptibles, mostraron en promedio una velocidad de crecimiento de la lesión de 4.6 mm/dia y una incidencia promedio de la enfermedad de 73 ± 6.4 % (Ver tabla 1 para notas) QTL Marcador1* Cromosoma Velocidad Incidencia de de la crecimiento enfermedad2 de la (%) lesión2 (mm/dia QTL-9h P18M50-141 9 3.0-3.1 49 ± 6.4 - P14M49-240 59 ± 6.5 TG2543 TG2232 TG103 P18M50-134h P14M49-243h P18M50-599 P14M60-222h P22M51-417h P14M50-174h P14M60-157h P14M60-107h P15M48-138h P14M48-113h Tm2a4 P18M51-146h P14M48-282h P14M50-276h 1 TG254: ver Tabla 22. 2 TG223: ver Tabla 23.3 TG10: ver Tabla 17. Tm2a: ver Tabla 18 o Sorbir, O.T. et al. (2000) .

Tabla 4: QTLs encontrados sobre el cromosoma 11 en la progenie de una cruza de S. lycopersicum variedad Moneymaker x S. habrochaites LYC 4/78 e información de resistencia cuantitativa relacionada. Las plantas de S. Lycopersicum variedad Moneymaker susceptibles, mostraron en promedio una velocidad de crecimiento de la lesión de 4.6 mm/dia y una incidencia promedio de la enfermedad de 73 ± 6.4 % (Ver tabla 1 para notas) QTL Marcador1* Cromosoma Velocidad Incidencia de la de enfermedad2 crecimiento (%) de la lesión2 (mm/dia QTL-llh P14M60-215e 11 3.2 34 + 6.4 P14M61-173h P14M50-307h TG47 P14M50-29xCD P18M51-358h P18M50-27xCD P18 51-136h P22M50-488h TG393 P14M61-396h P22M51-235h P22M51-174e TG47: ver Tabla 24. 2 TG393: ver Tabla 25.

Tabla 5: QTLs encontrados sobre el cromosoma 12 en la progenie de una cruza de S. lycopersicum variedad Moneymaker x S. habrochaites LYC 4/78 e información de resistencia cuantitativa relacionada. Las plantas de S. Lycopersicum variedad Moneymaker susceptibles, mostraron en promedio una velocidad de crecimiento de la lesión de 4.6 mm/dia y una incidencia promedio de la enfermedad de 73 ± 6.4 % (Ver tabla 1 para notas) QTL Marcador1* Cromosoma Velocidad Incidencia de de la crecimiento enfermedad2 de la (%) lesión2 (mm/dia QTL-12h CT19 12 2.3 24 ± 8.6 TG68 P14M48-411e P18M50-244h P18M50-273h P14M61-420h P14M61-406h P14M61-223h P14M60-193h P22M51-314h TG565 P14 48-172h P22M50-321e P14M60-219e P14M48-153h P22 50-97h TG296 P22M50-131h P22M51-135h 1 CT19: ver Tabla 26. 2 TG68 : ver Tabla 27. TG565: ver Tabla 28. TG296: ver Tabla 29.

De manera más confiable, la región genómica donde está localizado el QTL-4hA, está colocada entre los marcadores P18M51-156h y C2_Atlg74970 (Tabla 14) como se muestra en la figura 1. Por lo tanto, cualquier marcador localizado dentro de esta región puede ser utilizado para evaluar la presencia del QTL en el genoma de una planta, asi como cualquier marcador que se sabe está localizado en esa región, con base en la información públicamente disponible, tal como a partir de los mapas de consenso Tomato-EXPEN 1992 (Tanksley et al, 1992), Tomato-EXHIR 1997 (Bernacchi y Tanksley, 1997), Tomato-EXPEN 2000 (Fulton et al, 2002) o Tomato-EXPIMP 2001 (Grandillo y Tanksley, 1996; Tanksley et al. 1996, Doganlar et al. 2002) . Más confiablemente, la región genómica donde está localizado el QTL-4hB está colocada entre los marcadores CT50 (Tabla 13) y P14M50-85h como se muestra en la figura 1. Por lo tanto, cualquier marcador localizado dentro de esta región puede ser utilizado para evaluar la presencia del QTL en el genoma de una planta, asi como cualquier marcador que se sabe está localizado en esa región, con base en la información públicamente disponible. Más confiablemente, la región genómica donde está localizado el QTL-6h está colocada entre los marcadores P22M50 y P22M50-513h como se muestra en la figura 1. Por lo tanto, cualquier marcador localizado dentro de esta región puede ser utilizado para evaluar la presencia del QTL en el genoma de una planta, asi como cualquier marcador que se sabe está localizado en esa región, con base en la información públicamente disponible. Más confiablemente, la región genómica donde está localizado el QTL-9h está colocada entre los marcadores P18M50-141 y P14M50-27h como se muestra en la figura 3. Por lo tanto, cualquier marcador localizado dentro de esta región puede ser utilizado para evaluar la presencia del QTL en el genoma de una planta, asi como cualquier marcador que se sabe está localizado en esa región, con base en la información públicamente disponible. Más confiablemente, la región genómica donde está localizado el QTL-llh está colocada entre los marcadores P14M60-215e y P22M51-174e como se muestra en la figura 4. Por lo tanto, cualquier marcador localizado dentro de esta región puede ser utilizado para evaluar la presencia del QTL en el genoma de una planta, asi como cualquier marcador que se sabe está localizado en esa región, con base en la información públicamente disponible. Más confiablemente, la región genómica donde está localizado el QTL-12h está colocada entre los marcadores P14M61-420h y P22M50-131h como se muestra en la figura 5. Por lo tanto, cualquier marcador localizado dentro de esta región puede ser utilizado para evaluar la presencia del QTL en el genoma de una planta, asi como cualquier marcador que se sabe está localizado en esa región, con base en la información públicamente disponible. Preferentemente, un QTL de la presente invención comprende al menos un marcador de las Tablas 1-5 asociado con el QTL. Debido a que la secuencia de ácido nucleico del QTL que es responsable de conferir la resistencia a Botrytis , puede ser únicamente una fracción del QTL completo identificado en la presente, los marcadores indican meramente la herencia vinculada de las regiones genéticas o la ausencia de recombinación observada dentro de tales regiones genéticas Por lo tanto, se nota que los marcadores listados en las Tablas 1-5 indican la región cromosómica donde está localizado un QTL de la invención, en el genoma de las lineas especificas de Solanum y que esos marcadores no necesariamente definen los limites o la estructura de ese QTL De este modo, la parte del QTL que comprende la o las secuencias de ácido nucleico que confieren resistencia, esenciales, puede ser considerablemente más pequeña que aquella indicada por los marcadores contiguos listados para un QTL particular. Tal parte es denominada en la presente como una "parte que confiere resistencia" de un QTL. Como resultado, una parte que confiere resistencia de un QTL no necesariamente necesita comprender alguno de los marcadores listados. También, pueden ser utilizados otros marcadores para indicar los diversos QTLs, con la condición de que tales marcadores estén genéticamente vinculados a los QTLs, y la persona experta en la materia puede encontrar o utilizar un QTL que sea análogo a aquellos de la presente invención, pero en donde uno o más marcadores listados en las tablas 1-5 e indicados como vinculados al QTL, están ausentes. Una parte que confiere resistencia a Botrytis, de un QTL para la resistencia contra Botrytis en tomate, puede ser identificada mediante el uso de una técnica de marcador molecular, por ejemplo, con uno o más de los marcadores para un QTL mostrados en las Tablas 1-5 que está vinculado al QTL, preferentemente en combinación con un bioensayo de resistencia. Las plantas de tomate que no comprenden una parte que confiere resistencia a Botrytis de un QTL, de la presente invención, son relativamente susceptibles a la infección por Botrytis . Los marcadores proporcionados por la presente invención pueden ser utilizados muy adecuadamente para detectar la presencia de uno o más QTLs de la invención en una planta de tomate resistente a Botrytis , sospechosa, y por lo tanto puede ser utilizada en métodos que involucran la producción y selección asistida por marcadores, de plantas de tomate resistentes a Botrytis . Preferentemente, la detección de la presencia de un QTL de la invención es realizada con al menos uno de los marcadores para un QTL mostrados en las Tablas 1-5 que está vinculado al QTL. La presente invención se refiere por lo tanto a otro aspecto más, a un método para detectar la presencia de un QTL para la resistencia a Botrytis, que comprende la detección de la presencia de una secuencia de ácido nucleico del QTL en una planta sospechosa de tomate resistente a Botrytis, cuya presencia puede ser detectada mediante el uso de los marcadores. La secuencia de ácido nucleico de un QTL de la presente invención puede ser determinada mediante métodos conocidos por la persona experta. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende el QTL o una parte del mismo que confiere resistencia, puede ser aislada de una planta donante resistente a Botrytis, mediante fragmentación del genoma de la planta y seleccionando aquellos fragmentos que albergan uno o más marcadores indicadores del QTL. Subsecuentemente, o alternativamente, las secuencias marcadoras (o partes de las mismas) indicadoras del QTL pueden ser utilizadas como cebadores de amplificación (PCR), con el fin de amplificar una secuencia de ácido nucleico que comprende el QTL proveniente de una muestra de ácido nucleico genómico o un fragmento genómico obtenido de la planta. La secuencia amplificada puede ser luego purificada con el fin de obtener el QTL aislado. La secuencia nucleotidica del QTL, y/o de cualquiera de los marcadores adicionales comprendidos en esta, puede ser obtenida mediante métodos de secuenciamiento estándares. La presente invención se refiere también por lo tanto a una secuencia aislada de ácido nucleico (preferentemente ADN) que comprende un QTL de la presente invención, o una parte del mismo que confiere resistencia a Botrytis . De este modo, los marcadores que apuntan exactamente a diversos QTLs descritos en la presente pueden ser utilizados para la identificación, aislamiento y purificación de uno o más genes provenientes del tomate que codifica para la resistencia a Botrytis . La secuencia nucleotidica de un QTL de la presente invención puede ser por ejemplo también resuelta por la determinación de la secuencia nucleotidica de uno o más marcadores asociados con el QTL, y diseñando los cebadores ? internos para las secuencias marcadoras que pueden ser utilizadas luego para determinar adicionalmente la secuencia del QTL fuera de las secuencias marcadoras. Por ejemplo, la secuencia nucleotidica de los marcadores de AFLP de las Tablas 1-5 puede ser obtenida mediante aislamiento de los marcadores a partir del gel de electroforesis utilizado en la determinación de la presencia de los marcadores en el genoma de una planta objetivo, y determinando la secuencia nucleotidica de los marcadores por ejemplo mediante los métodos de terminación de cadena didesoxi, bien conocidos en la técnica. En modalidades de tales métodos para detectar la presencia de un QTL en una planta de tomate sospechosa resistente a Botrytis, el método puede también comprender los pasos de proporcionar un oligonucleótido o polinucleótido capaz de hibridarse bajo condiciones exigentes de hibridación a una secuencia de ácido nucleico de un marcador vinculado a QTL, preferentemente seleccionado de los marcadores de las Tablas 1-5 que está vinculado al QTL, poniendo en contacto el oligonucleótido o el polinucleótido con un ácido nucleico genómico de una planta de tomate sospechosa resistente a Botrytis , y determinando la presencia de la hibridación especifica del oligonucleótido o el polinucleótido, al ácido nucleico genómico. Preferentemente, el método es realizado sobre una muestra de ácido nucleico obtenida de la planta de tomate sospechosa resistente a Botrytis, aunque pueden ser también empleados métodos de hibridación in situ. Alternativamente, y en una modalidad más preferida, la persona experta en la materia puede, una vez que ha sido determinada la secuencia nucleotidica del QTL, diseñar las sondas de hibridación especificas o los polinucleót idos capaces de hibridarse bajo condiciones de hibridación estrictas a la secuencia de ácido nucleico del QTL, y puede utilizar tales sondas de hibridación en métodos para detectar la presencia de un QTL de la invención en una planta de tomate sospechosa resistente a Botrytis . La frase "condiciones de hibridación estrictas o exigentes" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda o polinucleót ido se hibridará a su subsecuencia objetivo, típicamente en una mezcla compleja de ácidos nucleicos, pero esencialmente no a otras secuencias. Las condiciones estrictas o exigentes son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos es encontrada en Tijssen (Thijssen, 1993) . Generalmente, las condiciones exigentes son seleccionadas para ser aproximadamente 5-10°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica definida. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica definida, pH, y concentración de ácido nucleico) a la cual 50% de las sondas complementarias al objetivo se hibridan a la secuencia objetivo en el equilibrio (ya que las secuencias objetivo están presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas son ocupadas en el equilibrio) . Las condiciones exigentes serán aquellas en las cuales la concentración salina sea menor de aproximadamente 1.0 M de ión sodio, típicamente aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ión sodio (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3, y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos) . Las condiciones exigentes pueden ser también logradas con la adición de agentes estabilizadores tales como formamida. Para la hibridación selectiva o especifica, una señal positiva es al menos dos veces el antecedente, preferentemente 10 veces la hibridación antecedente. Las condiciones de hibridación estrictas, ejemplares, son a menudo: 50% de formamida, 5xSSC, y 1% de SDS, incubando a 42°C, o, 5xSSC, 1% de SDS, incubando a 65°C, con lavado en 0.2xSSC, y 0.1% de SDS a 65°C. Para la PCR, una temperatura de aproximadamente 36°C es típica para la amplificación de baja exigencia, aunque las temperaturas de recocido pueden variar entre aproximadamente 32°C y 48°C dependiendo de la longitud del cebador. Lineamientos adicionales para determinar los parámetros de hibridación son proporcionados en numerosas referencias, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds . Ausubel, et al. 1995) . El "ácido nucleico" u "oligonucleót ido" o "polinucleótido" o equivalentes gramaticales utilizados en la presente significan al menos dos nucleótidos covalentemente enlazados entre si. Los oligonucleót idos son típicamente de aproximadamente 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 40, 50 o hasta aproximadamente 100 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos y los polinucleót idos son polímeros de cualquier longitud, incluyendo longitudes más largas, por ejemplo, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10.000, etc. Un ácido nucleico de la presente invención contendrá en general enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, son incluidos análogos de ácido nucleico que pueden tener columnas vertebrales alternadas, que comprende, por ejemplo, enlaces fosforamidato , fosforotioato , fosforoditioato, o 0-metilfoforoamidita (ver Eckstein, 1991) , y columnas vertebrales y enlaces de ácido nucleico peptídicos. Las mezclas de ácido nucleico de origen natural y análogos pueden ser utilizadas. Los análogos particularmente preferidos para los oligonucléotidos son ácidos nucleicos peptídicos (PNA) .

Producción de plantas de tomate resistentes a Botrytis , mediante métodos transgénicos De acuerdo a otro aspecto más de la presente invención, una secuencia de ácido nucleico (preferentemente ADN) que comprende al menos un QTL de la presente invención o una parte del mismo que confiere resistencia a Botrytis , puede ser utilizado para la producción de una planta de tomate resistente a Botrytis . En este aspecto, la invención proporciona el uso de un QTL de la presente invención o partes del mismo que confieren resistencia a Botrytis , para producir una planta de tomate resistente a Botrytis , que involucra la introducción de una secuencia de ácido nucleico que comprende el QTL en una planta de tomate recipiente, susceptible a Botrytis . Como se establece, la secuencia de ácido nucleico puede ser derivada de una planta de tomate donante resistente a Botrytis, adecuada. Dos plantas de tomate donante resistentes a Botrytis, adecuadas, capaces de proporcionar una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos uno de los QTLs anteriormente descritos, o partes de la misma que confieren resistencia a Botrytis, son S. habrochaites LYC 4/78. Otras plantas de tomate relacionadas que muestran resistencia a Botrytis, y comprenden uno o más genes que codifican para la resistencia a Botrytis , pueden ser también utilizadas como plantas donantes de resistencia a Botrytis ya que la presente invención describe cómo puede ser identificado este material. Otros accesos de especies de tomate pueden ser examinados para la resistencia a Botrytis , incluyendo, pero no limitados a, Lycopersicon cerasi forme , Lycopersicon cheesmanii, Lycopersicon chilense, Lycopersicon chmielewskii , Solanum lycopersicum , Lycopersicon hirsutum, Lycopersicon parviflorum, Lycopersicon pennellii, Lycopersicon peruuianum , Lycopersicon pimpinellifolium y Solanum lycopersicoid.es . Una vez identificada en una planta de tomate donante adecuada, la secuencia de ácido nucleico que comprende un QTL para la resistencia a Botrytis, de acuerdo a la presente invención, o una parte de la misma que confiere resistencia a Botrytis , puede ser transferida a una planta recipiente adecuada mediante cualquier método disponible. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico puede ser transferida mediante cruza de una planta de tomate donante con resistencia a Botrytis, con una planta de tomate recipiente susceptible (por ejemplo, mediante introgresión) , mediante transformación, mediante fusión de protoplastos , mediante una técnica haploide duplicado o mediante rescate de embriones o mediante cualquier otro sistema de transferencia de ácido nucleico, seguido opcionalmente por la selección de plantas de progenie que comprenden el QTL y que muestran resistencia a Botrytis . Para los métodos transgénicos de transferencia de una secuencia de ácido nucleico que comprende un QTL para resistencia a Botrytis, de acuerdo a la presente invención, o una parte de la misma que confiere resistencia a Botrytis, puede ser aislada de la planta donante mediante el uso de métodos conocidos en la materia y de este modo la secuencia aislada de ácido nucleico puede ser transferida a la planta recipiente mediante métodos transgénicos, por ejemplo, por medio de un vector, en un gameto o en cualquier otro elemento de transferencia adecuado, tal como una partícula balística recubierta con la secuencia de ácido nucleico. La transformación de la planta involucra en general la construcción de un vector de expresión que funcionará en células vegetales. En la presente invención, tal vector comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende un QTL para la resistencia a Botrytis de la presente invención, o una parte del mismo que confiere resistencia a Botrytis, cuyo vector puede comprender un gen que confiere resistencia Botrytis, que está bajo el control de u operablemente enlazado a un elemento regulador, tal como un promotor. El vector de expresión puede contener una o más combinaciones de gen/elemento regulador operablemnente enlazados, con la condición de que al menos uno de los genes contenidos en las combinaciones codifique para la resistencia a Botrytis . El o los vectores pueden estar en la forma de un plásmido, y pueden ser utilizados, solos o en combinación con otros plásmidos, para proporcionar plantas transgénicas que son resistentes a Botrytis, utilizando los métodos de transformación conocidos en la técnica, tales como el sistema de transformación en Agrobacterium. Los vectores de expresión pueden incluir al menos un gen marcador, operablemente enlazado a un elemento regulador (tal como un promotor) que permite que las células transformadas que contienen el marcador sean o bien recuperadas mediante selección negativa (por inhibición del crecimiento de las células que no contienen el gen marcador seleccionable ) , o mediante selección positiva (mediante selección para el producto codificado por el gen marcador) . Muchos genes marcadores seleccionables , comúnmente utilizados para la transformación vegetal son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, genes que codifican para enzimas que destoxifican metabólicamente un agente químico selectivo que puede ser un antibiótico o un herbicida, o genes que codifican para un objetivo alterado que es insensible al inhibidor. Son conocidos en la técnica varios métodos de selección positiva, tales como la selección con mañosa. Alternativamente, puede ser utilizada la transformación sin marcador para obtener plantas sin los genes marcadores mencionados, las técnicas para los cuales son conocidas en la técnica . Un método para introducir un vector de expresión en una planta está basado en el sistema de transformación natural de Agrobacterium (ver por ejemplo, Horsch et al., 1985) . A. turnefaciens y A. rhizogenes son bacterias del suelo patógenas de plantas que transforman genéticamente las células vegetales. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefacíens y A. rhizogenes , respectivamente, llevan genes responsables para la transformación genética de la planta (ver por ejemplo, Kado, 1991) . Los métodos de introducción de vectores de expresión dentro del tejido vegetal incluyen la infección directa o el co-cultivo de las células vegetales con Agrobacterium tumefacíens (Horsch et al., 1985) . Las descripciones de los sistemas vectores de Agrobacterium y los métodos para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium son proporcionados por Gruber y Crosby, 1993 y Moloney et al., 1989. Ver también, Patente de los Estados Unidos No. 5,591,616. Las descripciones generales de los vectores de expresión en plantas y los genes reporteros y los protocolos de transformación y las descripciones de los sistemas de vectores de Agrobacterium, y los métodos para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium, pueden ser encontradas en Gruber y Crosby, 1993. Los métodos generales para cultivar tejidos vegetales son proporcionados por ejemplo, por Miki et al., 1993 y por Phillips, et al., 1988. Un manual de referencia adecuado para técnicas de clonación molecular y vectores de expresión adecuados es Sambrook y Russell (2001) . Otro método para introducir un vector de expresión dentro de una planta está basado en la transformación mediada por proyectiles, en donde el ADN es llevado sobre la superficie de los microproyectiles . El vector de expresión es incluido dentro de los tejidos vegetales con un dispositivo biolistico que acelera los microproyectiles a velocidades de 300 a 600 m/segundo lo cual es suficiente para penetrar las paredes celulares y membranas de las células vegetales (Ver, Sanford et al., 1987, 1993; Sanford, 1988, 1990; Klein et al., 1988, 1992) . Otro método más para introducir ADN a las plantas es por medio de la sonicación de células objetivo o diana (ver Zhang et al., 1991) . Alternativamente, la fusión de liposoma o seroplastos ha sido utilizada para introducir vectores de expresión dentro de las plantas (ver por ejemplo, Deshayes et al, 1985 y Christou et al, 1987) . La captación directa del ADN dentro de los protoplastos utilizando precipitación con cloruro de calcio, alcohol polivinilico o poli-L-ornitina ha sido también reportada (ver por ejemplo, Hain et al. 1985 y Draper et al., 1982). La electroporación de los protoplastos en células enteras y tejidos ha sido también descrita (D'Halluin et al., 1992 y Laursen et al, 1994). Después de la transformación de los tejidos objetivo de tomate, la expresión de los genes marcadores mencionados anteriormente descritos para la selección preferencial de las células transformadas, tejidos y/o plantas, utilizando métodos de regeneración y selección son ahora bien conocidos en la técnica. Los marcadores de las Tablas 1-5 pueden ser también preparados" para ese propósito.

Producción de plantas de tomate resistentes a Botrytis mediante métodos no transgénicos En una modalidad alternativa para producir una planta de tomate resistente a Botrytis, puede ser utilizada la fusión de protoplastos para la transferencia de ácidos nucleicos desde una planta donante hacia una planta recipiente. La fusión de protoplastos es una unión inducida o espontánea tal como una hibridación somática, entre dos o más protoplastos (células de las cuales las paredes celulares son removidas mediante tratamiento enzimático) para producir una célula simple bi- o mult inucleada . La célula fusionada, que puede incluso ser obtenida con especies de plantas que no pueden ser cruzadas en la naturaleza es tejido cultivado en una planta híbrida que muestra la combinación de rasgos deseable. Más específicamente, un primer protoplasto puede ser obtenido a partir de una planta de tomate u otra línea vegetal que muestra resistencia a la infección por Botrytis . Por ejemplo, puede ser utilizado un protoplasto proveniente de S. habrochaites LYC 4/78. Un segundo protoplasto puede ser obtenido de una segunda planta de tomate u otra variedad vegetal, preferentemente una línea de tomate que comprende características comercialmente deseables, tales como, pero no limitadas a, resistencia a la enfermedad, resistencia a insectos, características de frutos valiosos, etc. Los protoplastos son luego fusionados utilizando procedimientos tradicionales de fusión de protoplastos, los cuales son conocidos en la técnica. Alternativamente, puede ser empleado el rescate de embriones en la transferencia de un ácido nucleico que comprende uno o más QTLs de la presente invención a partir de una planta donante a un planta recipiente. El rescate de embriones puede ser utilizado como un procedimiento para aislar embriones provenientes de cruzas, en donde las plantas fallan en producir semillas viables. En este proceso, el ovario fertilizado o la semilla madura de una planta es tejido cultivado para crear nuevas plantas (Pierik, 1999) . La presente invención también se refiere a un método para producir una planta de tomate resistente a Botrytis, que comprende los pasos de realizar un método para detectar la presencia de un locus de un rasgo cuantitativo (QTL) asociado con la resistencia a B. cinérea en una planta de tomate donante de acuerdo a la invención como se describió anteriormente, y transfiriendo una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos un QTL detectado de este modo, o una parte de la misma que confiere resistencia a Botrytis , desde la planta donante hacia una planta de tomate recipiente, susceptible a Botrytis . La transferencia de la secuencia de ácido nucleico puede ser realizada mediante cualquiera de los métodos previamente descritos en la presente. Una modalidad preferida de tal método comprende la transferencia mediante introgresión de la secuencia de ácido nucleico desde una planta donante de tomate resistente a Botrytis hacia una planta de tomate recipiente susceptible a Botrytis, mediante la cruza de las plantas. Esta transferencia puede de este modo ser adecuadamente lograda mediante el uso de técnicas de reproducción tradicionales. Los QTLs son preferentemente introgresados dentro de las variedades de tomate comerciales mediante el uso de reproducción asistida por marcadores (MAS) . La reproducción asistida por marcadores o la selección asistida por marcadores involucra el uso de uno o más marcadores moleculares para la identificación y selección de aquellas plantas de progenie que contienen uno o más de los genes que codifican para el rasgo deseado. En el presente caso, tal identificación y selección está basada en la selección de los QTLs de la presente invención o los marcadores asociados con ésta. Puede ser también utilizado MAS para desarrollar lineas casi isogénicas (NIL) que albergan el QTL de interés, permitiendo un estudio más detallado de cada uno de los efectos de QTL y es también un método efectivo para el desarrollo de poblaciones de linea endogámica ret rocruzadas (BIL) (ver por ejemplo, Nesbitt et al., 2001; van Berloo et al., 2001) . Las plantas de tomate desarrolladas de acuerdo a esta modalidad preferida pueden derivar ventajosamente una mayoría de sus rasgos de la planta recipiente, y derivar la resistencia a Botrytis de la planta donante. Ya que la resistencia a B cinérea es heredada poligénicamente , se prefiere que al menos dos, preferentemente tres QTLs o partes de los mismos que confieren resistencia a Botrytis, sean insertados mediante un método de transferencia adecuado dentro de una planta recipiente simple, por ejemplo de modo que múltiples QTLs son apilados en el genoma de la planta recipiente. Se cree que el apilamiento de dos o más QTLs de la invención puede conducir a resistencia incrementada hacia Botrytís . Como una persona experta en la técnica entenderá fácilmente, el apilamiento puede ser logrado mediante cualquier método, por ejemplo, mediante transformación de una planta con una construcción de ácido nucleico que comprende múltiples QTLs de la invención. Alternativamente, al menos un QTL puede estar presente en cada planta progenitora de una cruza, de modo que al menos dos QTLs están comprendidos en el híbrido resultante. Mediante apilamiento de estos rasgos de resistencia, pueden ser obtenidas plantas altamente resistentes. Tales plantas son modalidades altamente preferidas de la presente invención. Como se discutió brevemente anteriormente, las técnicas de reproducción adicionales pueden ser utilizadas para introgresar una secuencia de ácido nucleico que codifica para la resistencia a Botrytis , dentro de una planta de tomate recipiente susceptible a Botrytis . En un método, el cual es denominado como reproducción de pedigrí, una planta de tomate donante que muestra resistencia a Botrytis , y que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la resistencia a Botrytis, es cruzada con una planta de tomate recipiente susceptible a Botrytis que muestra preferentemente características comercialmente deseables, tales como, pero no limitadas a, resistencia a enfermedades, resistencia a insectos, características valiosas de la fruta, etc. La población de plantas resultantes (que representa los híbridos Fi) es luego auto-polinizada y se obtienen semillas (semillas F2) . Las plantas F2 desarrolladas a partir de las semillas F2 son luego seleccionadas para la resistencia a Botrytis . La población puede ser seleccionada en un número de diferentes formas. Primeramente, la población puede ser seleccionada utilizando un tamiz o selección de enfermedad, tradicional. Tales selecciones de enfermedad son conocidas en la técnica. Preferentemente, es utilizado un bioensayo cuantitativo de infección de tallo u hoja, preferentemente el bioensayo de tallo utilizado en los métodos de la presente invención como se describe con más detalle anteriormente en la presente, y en los ejemplos, es utilizado. En segundo lugar, puede ser realizada la selección asistida por marcador utilizando uno o más de los marcadores moleculares anteriormente descritos para identificar aquella progenie que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la resistencia a Botrytis Otros métodos, denominados anteriormente en la presente por métodos para detectar la presencia de un QTL, pueden ser utilizados. También, puede ser utilizada la selección asistida por marcador para confirmar los resultados obtenidos de los bioensayos cuantitativos, y por lo tanto, pueden ser utilizados también varios métodos en combinación.

Plantas de tomate y semillas resistentes a Botrytis Una planta de tomate resistente a Botrytis de la presente invención está caracterizada por tener un alto nivel de resistencia. Esto es definido como un nivel de resistencia que es más alto que aquel observado para plantas control susceptibles. De hecho, las plantas de la invención tienen un nivel de resistencia que es más alto que aquel de cualquier variedad de tomate comercial, por ejemplo, una variedad que tiene características comercialmente deseables, conocida hasta la fecha. Una planta de la invención tiene una susceptibilidad a Botrytis cinérea que es al menos tres veces más baja que una planta control susceptible cuando se mide mediante un bioensayo. Por ejemplo, cuando se mide mediante un bioensayo en donde la longitud promedio de una lesión del tallo resultante de la infección con Botrytis cinérea en plantas adultas, es medida durante un periodo de tres semanas bajo condiciones de práctica estándar como se describe con más detalle en los Ejemplos 3.10 y 3.11. Típicamente, una planta de la invención tiene un nivel de resistencia que da como resultado una longitud promedio de lesión en el tallo de las lesiones por Botrytis cinérea en plantas adultas de menos de 3.2 cm tres semanas después de la inoculación utilizando condiciones de práctica estándares en un bioensayo de resistencia diseñado para determinar la resistencia con base en tales características. Más típicamente, una planta de la invención muestra una longitud promedio de la lesión del tallo de menos de 2.9 cm. Algunas plantas de la invención muestran incluso una longitud promedio de lesión de tallo de 2.0 cm. Tomando en cuenta que los números expresan la longitud de una lesión que incluye la herida de inoculación de 2 cm inicial, se puede inferir que un alto nivel de resistencia, e incluso una resistencia completa en el caso de algunos QTLs, es observada en plantas de la invención. En comparación, las plantas control susceptibles muestran una longitud promedio de la lesión del tallo bajo las mismas condiciones de aproximadamente 3.6 cm hasta aproximadamente 6.0 cm, con un promedio de 4.85 cm (ver Tabla 7) . También como una comparación, S. habrochaites LA 1777, el QTL-10 que contiene la fuente parcialmente resistente a Botrytis del documento WO02/085105, muestra una longitud promedio de lesión del tallo bajo las mismas condiciones de aproximadamente 4.3 cm. En resumen, las plantas de la invención muestran lesiones del tallo netas en el bioensayo de resistencia anteriormente referido, que son en general menores de aproximadamente 30% (0.9/2.85 x 100%) de la longitud neta de las plantas control susceptibles, y en general de menos de aproximadamente 40% (0.9/2.3 x 100%) de la longitud neta de S. habrochaites LA 1777 parcialmente resistente . De este modo, una planta de la presente invención tiene una susceptibilidad a Botrytis cinérea cuando se mide mediante un bioensayo que es 3 veces menor que, o el cual es menor de 1/3 del nivel de una planta control susceptible. Reciprocamente, una planta de la invención es más de 3 veces más resistente que una planta control susceptible, como se define en la presente y determinado con el bioensayo como se describe. Con QTL-lh se observa resistencia completa. Una planta cuando es susceptible es definida como una planta que muestra susceptibilidad normal, o ninguna resistencia a la infección por Botrytis cinérea. Un ejemplo de una planta cuando es susceptible es la planta del híbrido Solanum lycopersicum variedad "Moneyberg" (De Ruiter Seeds R&D BV, Bergschenhoek, Holanda) . Una planta de tomate resistente a Botrytis, o una parte de la misma, obtenible mediante un método de la invención es también un aspecto de la presente invención. Otro aspecto más de la presente invención se refiere a una planta de tomate resistente a Botrytis, o una parte de la misma, que comprende dentro de su genoma al menos un QTL, o una parte que confiere resistencia a Botrytis, seleccionado del grupo que consiste de los QTLs sobre los cromosomas 4, 6, 9, 11 y 12 de Solanum habrochaites LYC 4/78 asociado con resistencia a Botrytis , en donde el QTL o la parte del mismo que confiere resistencia a Botrytis no está en su antecedente genético natural. Las plantas de tomate resistentes a Botrytis de la presente invención pueden ser de cualquier tipo genético tales como endogámicas, híbridas, haploides, dihaploides, partenocarpia o transgénicas . Además, las plantas de la presente invención pueden ser heterocigotos u homocigotos para el rasgo de resistencia, preferentemente homocigotas. Aunque los QTLs de la presente invención, así como aquellos QTLs obtenible mediante un método de la invención, así como las partes de los mismos que confieren resistencia a Botrytis pueden ser transferidos a cualquier planta con el fin de proporcionar una planta resistente a Botrytis, los métodos y plantas de la invención son preferentemente relacionados a plantas de la familia Solanaceae, más preferentemente el tomate. Además de los QTLs sobre los cromosomas 4 (QTL-4hB) , 6, 9, 11 y 12 de Solanum habrochaites LYC 4/78 asociado con resistencia a Botrytis como se identifica en la presente, una planta de la presente invención puede comprender además opcionalmente uno o más QTLs derivados de S. habrochaites identificados en la presente como QTL-lh, QTL-2h y QTL-4hA y descrito con mayor detalle en las solicitudes co-pendientes números PCT/NL2005/000762 y EP 1 652 930 A (la solicitud de Patente Europea 04077931.6), a la cual se hace referencia explícita en este contexto. Se propone que una combinación de QTLs, ya sea los QTLs como se describen en la presente, o los QTLs como se describen en el documento PCT/NL2005/000762, podrían incrementar la resistencia a la enfermedad en plantas que albergan tal combinación. No obstante, cada uno de los QTLs también llevan la información genética de un ancestro antecedente de S. habrochaites, lo cual significa que en la progenie con demasiada información genética de este antecedente, no será posible obtener plantas con las característica agronómicas óptimas deseadas. Las líneas de plantas de tomate resistentes a Botrytis , endogámicas, pueden ser desarrolladas utilizando las técnicas de selección recurrente y retrocruza, autopolinización y/o dihaploides o cualquier otra técnica utilizada para elaborar líneas progenitoras . En un método de selección y retrocruza, la resistencia a Botrytis puede ser introgresada dentro de una planta recipiente objetivo (que es llamada el progenitor recurrente) mediante cruza de progenitor recurrente con una primera planta donante (que es diferente del progenitor recurrente y denominada en la presente como el "progenitor no recurrente") . El progenitor recurrente es una planta que no es resistente o que tiene un bajo nivel de resistencia a Botrytis y posee características comercialmente deseables, tales como, pero no limitadas a resistencia a enfermedades, resistencia a insectos, características de frutas valiosas, etc. El progenitor no recurrente muestra resistencia a Botrytis que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la resistencia a Botrytis . El progenitor no recurrente puede ser cualquier variedad de planta o linea endogámica que sea fértil al cruzamiento con el progenitor recurrente. La progenie resultante de una cruza entre el progenitor recurrente y el progenitor no recurrente es retrocruzada al progenitor recurrente. La población vegetal resultante es luego seleccionada. La población puede ser seleccionada en un número de diferentes formas. Por ejemplo, la población puede ser seleccionada utilizando bioensayos cuantitativos en tallo como se describe previamente en la presente. Las plantas híbridas Fx que muestran un fenotipo resultante a Botrytis comprende la secuencia de ácido nucleico requerida que codifica para la resistencia a Botrytis , y posee características comercialmente deseables, son entonces seleccionadas y autopolinizadas, y seleccionadas para un número de generaciones con el fin de permitir que la planta de tomate se vuelva cada vez más endogámica. Este proceso de autopolinización continua y selección continua puede ser realizado por dos a cinco o más generaciones. El resultado de tal reproducción y selección es la producción de líneas que son genéticamente homogéneas para los genes asociados con la resistencia a Botrytis, así como otros genes asociados con los rasgos de interés comercial. En vez de utilizar selecciones de patología fenotípica de los bioensayos, pueden ser realizadas MAS utilizando uno o más de los marcadores moleculares anteriormente descritos en la presente, sondas de hibridación o polinucleótidos para identificar aquella progenie que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia a Botrytis . Alternativamente, se puede utilizar MAS para confirmar los resultados obtenidos a partir de los bioensayos cuantitativos. Una vez que se realizan selecciones apropiadas, el proceso es repetido. El proceso de retrocruza del progenitor recurrente y selección para la resistencia a Botrytis es repetido por aproximadamente cinco o más generaciones. La progenie resultante de este proceso es heterogénea para uno o más genes que codifican para la resistencia a Botrytis . La última generación retrocruzada es luego autopolini zada con el fin de proporcionar la progenie de reproducción pura homocigota para la resistencia a Botrytis. Las lineas de tomate endogámicas resistentes a Botrytis descritas en la presente pueden ser utilizadas en cruzas adicionales para crear plantas híbridas resistentes a Botrytis . Por ejemplo, una primera planta de tomate endogámica resistente a Botrytis de la presente invención puede ser cruzada con una segunda planta de tomate endogámica que posee rasgos comercialmente deseables tales como, pero no limitados a, resistencia a enfermedades, resistencia a insectos, características deseables de los frutos, etc. Esta segunda linea de tomate endogámica puede o no ser resistente a Botrytis . Otro aspecto más de la presente invención se refiere a un método para producir semillas que pueden ser desarrolladas en plantas de tomate resistentes a Botrytis . En una modalidad, el método comprende el paso de proporcionar una planta de tomate resistente a Botrytis de la invención, cruzando la planta resistente a Botrytis con una planta de Solanum lycopersicum, y recolectando las semillas resultantes de la cruza, que cuando se plantan, producen plantas de tomate resistentes a Botrytis. En otra modalidad más, el método comprende los pasos de proporcionar una planta de tomate resistente a Botrytis de la invención, cruzando la planta resistente a Botrytis con una planta de Solanum lycopersicum, recolectando las semillas resultantes de la cruza, regenerando las semillas en plantas, seleccionando las plantas resistentes a Botrytis mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente, auto-cruzando las plantas seleccionadas por un número suficiente de generaciones para obtener plantas que son fijas para un alelo que confiere resistencia a Botrytis en las plantas, retrocruzando las plantas producidas de este modo con plantas de S. lycopersicum que tienen los rasgos fenotipicos deseables por un número suficiente de generaciones para obtener plantas de S. lycopersicum que son resistentes a Botrytis , y que tienen rasgos fenotipicos deseables, y recolocando las semillas producidas a partir de las plantas resultantes del último retro-cruce, que cuando se plantan, producen plantas de tomate que son resistentes a Botrytis . A manera de ejemplo, y no de limitación, los Ejemplos de la presente invención son ahora dados.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Método para identificar los QTLs asociados con resistencia a Botrytis cinérea 1.1. Introducción Este Ejemplo presenta el desarrollo de un bioensayo cuantitativo para evaluar la resistencia a Botrytis cinérea de una colección de genotipos de tomate silvestres. La resistencia parcial contra Botrytis cinérea ha sido reportada en especies de tomates silvestres, pero estos reportes han sido en gran medida descriptivos y cualitativos. La identificación de los genotipos parcialmente resistentes podría proporcionar perspectivas para introgresar la resistencia en líneas de reproducción comerciales para obtener líneas con niveles de resistencia manejables. La disponibilidad de un ensayo reproducible , objetivo y cuantitativo, así como la identificación de los genotipos con una resistencia (parcial) genéticamente determinada hacia el moho gris, abre la vía para la producción de resistencia en variedades de tomate cultivadas. El presente Ejemplo describe un ensayo de enfermedad cuantitativo. El ensayo es aplicado sobre las hojas (ensayo de inoculación en hoja) y segmentos de tallo (ensayo de inoculación de tallo) . Fueron examinados dos parámetros para la susceptibilidad a la enfermedad. El primer parámetro medido fue la incidencia de la enfermedad (DI), por ejemplo la proporción de inoculación que dio como resultado una lesión en expansión. Si la falla (parcial) de una lesión primaria de B. cinérea para expandirse sobre un genotipo de hospedero particular es un rasgo genético de la planta, tal rasgo es importante ya que éste limita directamente el número de focos de enfermedad en la cosecha. El segundo parámetro probado fue la velocidad de crecimiento de la lesión en un periodo de 24 horas (crecimiento de la lesión, LG) . Las lesiones que se expandieron a partir del punto de inoculación primario parecieron dispersarse a una velocidad uniforme (en mm/día) sobre el tiempo hasta que la lesión alcanzó el borde de la hoja o el extremo inferior del segmento del tallo. Los presentes ensayos hacen posible la cuantificación de la ocurrencia (incidencia de la enfermedad) y desarrollo (crecimiento de la lesión) de la infección por B. cinérea, dando como resultado dos grupos de datos de rasgos cuantitativos. El ensayo fue utilizado para seleccionar una colección de especies de tomate (de aquí en adelante también denominadas como "accesos") para la presencia de resistencia en éstos. 1.2. Plantas Los genotipos vegetales probados son listados Tabla 6.

Tabla 6: Lista de genotipos de Solanum probados.

Código Fuente'1) Especie Especificación/Cultivo Hoja<2> Tallo*2) Referencia!3) 78/1604 DRS S. lycopersicum Kecksemeti Torpe Y Y 82/2577 DRS S. lycopersicum Futuria Y Y 83/2896 DRS S. lycopersicum Biruinca Y 89/3695 DRS S. lycopersicum X S. lycopersicum Y variedad cerasiforme 89/3793 DRS S. lycopersicum Y 89/3862 DRS S. lycopersicum Olomoucke Y 90/4063 DRS S. lycopersicum L 4034 Y 91/4311 DRS S. lycopersicum Seedathip 2 Y Y 96/4326 DRS S. lycopersicum Gb nr 90124 Y Y MM WU PPW S. lycopersicum Moneymaker S S 61.1290 WO LoPB S. habrochaites Y G1.1556 WU LoPB S. chilense Y Y G1.1558 WU LoPb S. chilense Y G1.1560 WU LoPB S. habrochaites Y Y G1. 1601 WU Lope S. neorickii Y Y G1.1615 WU LoPB S. cheesmanii Y IZ.2P) MPIZK S. pimpinellifolium Y (Urbasch, 1986) LA.716 TGRC S. pennellü Y LA.2157 TGRC L. peruvianum Y LA.2172 TGRC L. peruvianum Y Lyc. IPK S habrochaites Y Y (Urbasch, 1986) 4 78(3) T160/79(3) IPK L. glandulosum Y (Urbasch, 1986) T566/8K3) IPK S. habrochaites Y (Urbasch, 1986) DRS: De Ruiter Seeds, Bergschenhoek, Holanda; WU PPW: Plantkundig Proefcentrura Wageningen, Wageningen University, Wageningen, Holanda; LoPB: Laboratory of Plant Breeding, Wageningen University, Wageningen, Holanda; MPIZK: Max Planck Institut für Züchtungsforschung an Kulturpflanze, Kóln, Alemania; TGRC. Tomato Genetics Resource Center, Universidad de California en Davis, Davis CA, EUA; IPK: Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung, Gatersleben, Alemania. 2 Y indica que el genotipo fue probado en el ensayo particular, S indica el genotipo servido como un control de referencia susceptible. (3) Publicado antes de que sea resistente contra B. cinérea. Las plantas fueron desarrolladas en suelo de maceta en macetas de 12 cm en un invernadero con temperatura mínima de 15°C. Luz de lámpara de sodio artificial fue aplicada (16 horas/día) desde octubre hasta marzo. En los días 5-7 después de la germinación, se agregaron 10 mi de solución de FeNaEDTA (3.5 g/1), seguido 3 días después por 10 mi de solución de micronutrientes (0.286 g/litro de H3B03; 0.1558 g/litro de MnS04'H20; 0.008 g/litro de Cu04.H20; 0.022 g/litro de ZnS04; 0.00196 de (NH4 ) 6Mo7024 · 4H20) . Desde las dos semanas después de la germinación en adelante, se agregaron en una base semanal una solución de Hoagland (Ca(N03)2 5 mM; KN03 5 mM; MgS04 2 mM; KH2P04 1 mM) . 1.3. Ensayo en hoja Un inoculo de B. cinérea cepa B05.10 se preparó de acuerdo a Benito (1998). Para cada planta individual una o dos hojas compuestas que fueron completamente estiradas fueron desprendidas del tallo principal con una navaja de rasurar afilada y transferidas a una espuma de florista prehumedecida . La espuma de florista fue colocada en una caja de Petri que contenía agua de la llave y subsecuentemente colocada en un recipiente humedecido por rocío que contenía papel filtro húmedo. Las hojas compuestas fueron luego inoculadas con una suspensión de conidias de B. cinérea al tomar con pipeta cuidadosamente un total de 6 a 10 gotitas de inoculo (2 µ?) sobre la superficie superior de las hojas. Los recipientes fueron cerrados con una tapa humedecida por rocío e incubados a 15°C en la oscuridad a 100% de humedad relativa, esencialmente como se describe por Benito et al. 1998. Adecuadamente, una hoja compuesta fue dividida en cuatro láminas, y en donde cada lámina fue inoculada con 10 gotas de 2 µ? cada una, que contenía 200 conidias. La proporción de lesiones agresivas en expansión (incidencia de la enfermedad) y la velocidad de crecimiento de la lesión fueron monitorizadas en varios días. Para corregir la variación provocada por la estación o el cultivo de las plantas, la incidencia de la enfermedad de un genotipo particular en cada experimento estuvo relacionada a la incidencia de la enfermedad de Moneymaker probada en ese mismo experimento. Los tamaños de la lesión fueron medidos a 96, 120 y 144 hpi utilizando un calibrador. La incidencia de la enfermedad fue determinada al dividir el número total de lesiones en expansión entre el número total de gotitas de inoculación. Las velocidades de crecimiento de las lesiones fueron determinadas mediante el cálculo del incremento en el tamaño de la lesión (en mm) en un periodo de 24 horas. Los datos para las lesiones de no expansión fueron suprimidos del análisis cuantitativo. 1.4. Ensayo de tallo (procedimiento estandarizado) El ensayo de tallo fue realizado como sigue: Los 5 a 10 cm superiores y los 5 a 10 cm inferiores del tallo de plantas de aproximadamente 50 cm de alto fueron retirados y los 30 cm remanentes fueron cortados en segmentos iguales de 5 a 6 cm. Cada segmento de tallo fue colocado erguido en una red con la base del tallo sobre papel filtro húmedo. Antes de la inoculación, los segmentos de tallo fueron rociados con agua de la llave con el fin de asegurar una dispersión igual del inoculo sobre la superficie de herida. El inoculo fue preparado como se describe para el ensayo de hoja. Una gota de un núcleo de 5 µ?, que contenia aproximadamente 106 conidias por mi, se aplicó sobre la parte superior de cada segmento de tallo. Las incubaciones fueron realizadas a 15 ± 2°C en la oscuridad con 100% de humedad relativa. El progreso de la infección fue determinado mediante la medición del avance máximo del síntoma de pudrición en varios intervalos de tiempo después de la inoculación con un calibrador Vernier. Para cada genotipo, fue calculado el porcentaje de piezas de tallo infectadas. La incidencia de la enfermedad fue determinada al dividir el número total de segmentos de tallo con lesiones en expansión entre el número total de segmentos inoculados. Las velocidades de crecimiento de las lesiones fueron determinadas mediante el cálculo del incremento en el tamaño de la lesión en un periodo de 24 horas, con lo cual los datos para las lesiones de no expansión fueron omitidos del análisis. 1.5. Resultados La incidencia de la enfermedad y el crecimiento de la lesión en experimentos de infección de hoja desprendida fueron determinados en varios días para cada genotipo, usualmente de 2 a 4 días después de la infección. La incidencia de la enfermedad en S. lycopersicum variedad Moneymaker, que sirvió como una referencia, fluctuó entre 15 y 78% en estos experimentos. Excepto para los genotipos 82/2577 y 83/2896 (ambos de la especie S. lycopersicum) , los genotipos probados mostraron en todos los experimentos una menor incidencia de la enfermedad que Moneymaker. Los genotipos G1.1556, G1.1560 y G1.1601 mostraron una menor incidencia de la enfermedad en tres experimentos independientes, en el intervalo de 0 a 21%. El análisis estadístico indicó que la incidencia de la enfermedad en los genotipos 78/1604, 91/4311, 96/4326, G1.1556, G1.1558, G1.1560, G1.1601, LA716 y LYC 4/78 fue significativamente menor que en la línea control de S. lycopersicum variedad Moneymaker (p<0.05) . No obstante, existió una gran variación entre las semanas y algunas de las diferencias observadas en los ensayos de hoja desprendida pueden efectivamente no ser muy robustos debido a las fluctuaciones en la incidencia de la enfermedad entre experimentos/semanas (15-78%) . Dentro de estos genotipos resistentes (con una incidencia de enfermedad significativamente menor que aquella en la referencia de Moneymaker) , las lesiones que se expandieron exitosamente a menudo lo hizo a una velocidad similar que el Moneymaker (por ejemplo 96/4326, G1.1560, LA716) . La situación contraria no fue encontrada: ninguno de los genotipos mostraron una incidencia de la enfermedad similar a aquella de Moneymaker sino una velocidad de crecimiento de la lesión más lenta que Moneymaker. La velocidad de crecimiento de la lesión en un periodo de 24 horas (entre 48 y 72 hpi) en la mayoría de los genotipos estuvo en el mismo intervalo que Moneymaker. Cinco accesos (91/4311, 160/79, G1.1556, G1.1601 y LYC 4/78) mostraron una velocidad de crecimiento de la lesión más lenta, la cual fue estadísticamente significativamente diferente de aquella de S. lycopersicum variedad Moneymaker. El ensayo de infección del segmento del tallo pareció ser más robusto que el ensayo en hoja en términos de reproducibilidad entre experimentos realizados en diferentes estaciones. Aún cuando el número de puntos de datos con los segmentos de tallo (5 a 8 segmentos por planta) es mucho más pequeño que con el ensayo de hoja (40 gotas de inoculación por hoja compuesta, una o dos hojas pudieron ser probadas por planta) , la variabilidad entre experimentos fue en general menor en el ensayo de segmento de tallo. La incidencia de la enfermedad en el ensayo de tallo para el genotipo control S. lycopersicum variedad Moneymaker estuvo en el intervalo de 52 a 95%. La incidencia de la enfermedad en 17 genotipos fue comparada a la incidencia de la enfermedad de la linea control S. lycopersicum variedad Moneymaker determinada en el mismo experimento/semana. La mayoría de los genotipos mostraron una incidencia de la enfermedad en un intervalo similar que la línea control Moneymaker. Los genotipos G1.1556 (29% y 41%) y G1.1560 (28% y 7%) mostraron una incidencia reducida de la enfermedad. Únicamente G1.1560 difirió estadísticamente de manera significativa (p<0.05) del control . Las velocidades de crecimiento de las lesiones en el ensayo de tallo para el genotipo control S. lycopersicum variedad Moneymaker, estuvieron en el intervalo de 5.4 a 9.2 mm/día. Las velocidades de crecimiento de las lesiones de muchos genotipos estuvieron en un intervalo similar que el control. No obstante, en los accesos 89/3793, G1.1601, LYC 4/78, T566-81, la velocidad de crecimiento de las lesiones fue estadísticamente significativamente diferente (p<0.01) del control variedad Moneymaker. Con un número de genotipos que fueron calificados como parcialmente resistentes en el ensayo de segmento de tallo, fueron realizados ensayos cualitativos sobre las plantas enteras, desarrolladas en un invernadero en Rockwool®. El objetivo fue evaluar si los genotipos que parecieron resistentes en los segmentos de tallo bajo condiciones de laboratorio verdaderamente eran más resistentes que las lineas control en un sistema de cosecha semi-comercial . Las plantas fueron desarrolladas en un orden aleatorizado en hileras de Rockwool®, el compartimiento del invernadero fue rellenado con fruta cítrica fuertemente infectada por B. cinérea en el punto de esporulación . El compartimiento del invernadero fue mantenido a alta humedad al rociar el piso dos veces al día con agua de la llave y dejando las puertas y las ventanas cerradas. A intervalos regulares, fueron realizadas heridas por corte sobre todas las plantas y se monitorizó la aparición del moho gris sobre el tiempo. Un número de accesos de tomate silvestres fueron identificados los cuales mostraban una reducción severa de ambos parámetros, proporcionando de este modo fuentes potenciales para introgresar dos, mecanismos potencialmente independientes de resistencia parcial dentro de S. lycopersicum .

Ejemplo 3. Mapeo de la resistencia parcial a Botrytis cinérea en una población de tomate interespecifica (S. lycopersicum variedad Moneymaker x S. habrochaites acceso LYC 4/78) En este ejemplo, dos locus de QTL que confieren resistencia parcial a B. cinérea que se origina de S. habrochaites LYC 4/78, son presentados. Se obtuvo una confirmación de los resultados al evaluar el nivel de resistencia a B. cinérea en dos poblaciones de BC2Si que segregan uno de los dos locus de QTL respectivamente. 3.1. Material vegetal Semillas de Solanum habrochaites LYC 4/78 (de aquí en adelante denominadas como LYC 4/78) fueron obtenidas del banco de genes localizado en el Instituto para la Genética Vegetal e Investigación de Plantas de Cosecha (Institute for Plant Genetics and Crop Plant Research, Gatersleben, Alemania ) . Las semillas de Solanum lycopersicum variedad Moneymaker (de aquí en adelante denominadas como Moneymaker) fueron obtenidas del banco de semillas de De Ruiter Seeds R&D BV, Berggschenhoek, Holanda. Una cruza interespecifica entre Moneymaker y LYC 4/78 fue realizada para producir semillas Fi . Las semillas Fi fueron desarrolladas en plantas Fi . Las semillas F2, derivadas de la autopolinización de una planta Fi fueron sembradas para obtener una población F2 de 174 individuos. Una población de BC2 (retrocruza 2) de 59 individuos fue generada mediante dos rondas de retrocruza con oneymaker como el progenitor recurrente y femenino. Utilizando MAS, BC2, BC3 y BC4, fueron seleccionados los genotipos que contenían uno de los QTLs identificados y algunos BC2 fueron autopolini zados para producir semillas BC2Si (ver Figura 2) . Fueron desarrolladas dos poblaciones de BC2Si: uno de 60 individuos de BC2Si que segregó el QTL para la incidencia de la enfermedad y otro más de 47 individuos de BC2Si que segregaron el QTL para el crecimiento de la lesión. 3.2 Ensayo de tallo Un inoculo de B. cinérea cepa B05.10 fue preparado de acuerdo a Benito (1998) . El ensayo de tallo fue realizado como se describe en el Ejemplo 1. 3.3. Aislamiento del ADN y análisis del marcador El ADN genómico fue aislado de dos hojas jóvenes (enrolladas) utilizando un protocolo basado en bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) de acuerdo a Steward y Via (1993), ajustado para el aislamiento de ADN de alto rendimiento utilizando tubos micrónicos de un mi (Micronic BV, Lelystad, Holanda) y trituradas utilizando un agitador Retsch de 300 mm a velocidad máxima (Retsch BV, Ochten, Holanda) . El análisis de AFLP (Vos et al., 1995) de las poblaciones F2, BC2, BC3, BC4 y BC2Si se realizó y los fragmentos de AFLP fueron resueltos en un secuenciador de ADN LI-COR 4200, siguiendo esencialmente el método publicado por Myburg (Myburg et al. 2001) . El cebador Pst selectivo fue etiquetado con un marcador fluorescente IRD 700 o IRD 800. Las imágenes en gel de AFLP fueron calificadas utilizando un paquete de software Pro AFLP-Quantar (Keygene BV, Wageningen, Holanda) . Las siguientes diez combinaciones de cebadores y secuencias adaptadoras fueron utilizadas para la genotipificación : P14M48, P14M49, P14M50, P14M60, P14 61, P15M48, P18M50, P18M51, P22M50 y P22M51, como se describen por Bai et al. (2003) . 3.4. Análisis fenotípico de la población F2 La variación en la incidencia de la enfermedad entre los diferentes ensayos de Botrytís fue observada (ver Ejemplo 1, supra) . Por lo tanto, fueron realizados siete ensayos de enfermedad en tallo consecutivos, independientes en el día 172 de los 174 individuos de la población F2 derivada de la cruza entre Moeymaker x LYC 4/78. Esto dio como resultado al menos cinco evaluaciones independientes del bioensayo de enfermedad para casi cada genotipo de F2. En cada bioensayo de la enfermedad individual seis segmentos de tallo contribuyeron al cálculo del crecimiento de la lesión.

Los valores promedio para la incidencia de la enfermedad y el crecimiento de las lesiones para la población F2 mostró una distribución normal (datos no mostrados) . La incidencia promedio de la enfermedad para Monyemaker es 59% con un crecimiento de lesión de 9.2 mm/dia. La incidencia promedio de la enfermedad en la población F2 estuvo en el intervalo entre 10% y 97% con un promedio de población de 48%. El crecimiento de la lesión estuvo en el intervalo entre 3.3 mm y 11.5 mm/dia con un promedio de 7.8 mm/dia. La incidencia promedio de la enfermedad de cada experimento individual estuvo en el intervalo de 31% a 73%, mientras que el crecimiento promedio de la lesión estuvo en el intervalo de 6.2 a 7.9 mm/dia (datos no mostrados) . El crecimiento de la lesión puede ser calculado únicamente si existe al menos infección en una de las seis piezas de tallo. Consecuentemente, pudo ser observado un incremento en el número de genotipos informativos para el crecimiento de la lesión, con más altas incidencias de la enfermedad. Por ejemplo, con la baja incidencia promedio de la enfermedad (31%) únicamente 52% de los genotipos fueron informativos para el crecimiento de la lesión. 3.5. Marcadores moleculares y mapa de conexión genética Un mapa de conexión o vinculación genética fue calculado para una población F2 (n=174) derivado de la cruza de Moneymaker x LYC 4/78. Se utilizaron diez combinaciones de cebadores para obtener 218 marcadores amplificados de polimorfismo de longitud de fragmento (AFLP) en la población F2 (n=174) . Un total de 69 marcadores (31.7%) pudo ser fácilmente calificado co-dominantemente, permitiendo de este modo el cálculo de un mapa de conexión genética F2 integrado. El análisis de marcador realizado sobre los genotipos BC2, BC3 y BC2Si permitió la adición de 145 marcadores AFLP adicionales. Un total de 102 de estos 145 marcadores de AFLP adicionales fueron previamente no calificados debido a la complejidad de los geles F2. El mapa de conexión genética completo consistió de 315 marcadores de AFLP de 14 grupos de enlace y tiene una longitud total de 958 cM. Ya que los marcadores AFLP co-migrantes dentro de una especie en general específicos de alelo, la co-linearidad con otros mapas de conexión de AFLP se utilizó para asignar grupos de vinculación a los cromosomas. Algunos marcadores de AFLP específicos de Moneymaker fueron en común con los mapas de conexión genética como se publicó (Haanstra et al. 1999; Bai et al. 2003) y por lo tanto algunos grupos de conexión o vínculos pudieron ser asignados a los cromosomas, incluyendo los grupos de conexión que albergan los QTLs identificados. Para mejorar el mapa de conexión en los intervalos de QTL, fueron agregados marcadores CAPS de diagnóstico en estas regiones, con base en el mapa publicado de S. lycopersicum x L . pennelli (Tanksley et al. 1992; Haanstra et al. 1999) 3.6. Análisis de conexión y mapeo de QTL Los datos de los marcadores fueron analizados y el mapa de conexión genética fue calculado como se describe en el párrafo 3.5. La longitud total del mapa de conexión F2 fue de 958 cM, lo cual es menor que otros mapas interespecificos de Lycopersicon publicados, con longitudes genéticas en el intervalo de 1200 a 1400 cM (Foolad et al. 2002; Haanstra et al. 1999; Tanksley et al. 1992). Los marcadores AFLP adicionales fueron calificados utilizando los datos del marcador AFLP obtenidos de la retrocruza y las poblaciones BC2S1. Aunque 46% más marcadores fueron colocados sobre el mapa de conexión, la longitud del mapa de conexión genética no se incrementó. La razón para esto es que los datos utilizados fueron obtenidos de varias sub-familias pequeñas, y de este modo no son informativos para el cálculo de las distancias genéticas, pero la estimación de la posición es posible mediante la inspección visual de los genotipos gráficos (Van Berloo, 1999) . 3.7. Mapeo de QTL en la población F2 Los datos fenotipicos y los marcadores fueron utilizados para la identificación de los QTLs por medio del mapeo por intervalos (IM, ver párrafo 3.5) . El IM fue aplicado a los datos obtenidos de las réplicas individuales y a los valores promedios de las réplicas.

Incidencia de la enfermedad El mapeo por intervalos para la incidencia de la enfermedad en la población F2 fue realizado para aquellas pruebas de enfermedad individuales con una incidencia promedio de la enfermedad menor de 50% y para los datos promedio obtenidos de todas las pruebas de la enfermedad. Los datos promedio de todas las pruebas dieron, en el procedimiento de mapeo por intervalos, un QTL significativo único para la incidencia de la enfermedad (la probabilidad de las calificaciones impares (LOD) debe ser mayor de 3.4 para un nivel de confianza a lo largo del genoma de P<0.05) . Este QTL tuvo una calificación LOD de 4.5 y explicó 13% de la variación fenotipica total. La contribución del alelo a la resistencia se originó del progenitor resistente LYC 4/78. El mapeo de QTL sobre cada experimento individual dio en los cuatro casos la misma región de QTL. En cada experimento independiente ocasionalmente se observaron otros "QTLs menores".

Crecimiento de la lesión El crecimiento de la lesión puede ser medido de una mejor manera en aquellas pruebas de enfermedad con una alta incidencia de la enfermedad. Para el mapeo de QTL el promedio de las 7 pruebas de enfermedad fue utilizado, y un QTL para el crecimiento de la lesión de B. cinérea fue identificado por arriba del umbral (LOD 3.4 para un nivel de confianza a lo largo del genoma de P<0.05) . Este QTL tuvo una calificación LOD de 4.2 y explicó 12% de la variación fenotipica total. El efecto positivo se originó del progenitor resistente LYC 4/78. La necesidad de realizar múltiples pruebas de enfermedad es ilustrada debido a que únicamente en una repetición simple fue encontrado un perfil LOD por arriba del umbral. Un QTL para el crecimiento de la lesión fue encontrado sobre el cromosoma 1 (QTL-lh) , y un QTL para la incidencia de la enfermedad fue encontrado sobre el cromosoma 2 (QTL-2h) . Estos QTLs, asi como el QTL denotado QTL4hA son el objeto de la solicitud copendiente PCT/NL2005/000762. 3.8. Confirmación de los QTLs en un bioensayo La planta Fi de la cruza oneymaker x LYC 4/78 fue dos veces retrocruzada con Moneymaker y las 59 plantas de progenie fueron seleccionadas para la presencia de las dos regiones QTL identificadas (QTL-lh y QTL-2h) utilizando los marcadores AFLP. Las plantas, heterocigotas para uno de los dos QTLs identificados, fueron seleccionadas y autopolinizadas para obtener dos poblaciones BC2Si. Un total de cuatro bioensayos de la enfermedad fueron realizados con cada genotipo BC2Si. Los datos de ambas subpoblaciones de BC2S1, analizados con SPSS, mostraron distribuciones normales para el crecimiento de la lesión, pero no para la incidencia de la enfermedad ya que fueron observadas algunas subclases. Todas las plantas BC2Si fueron genotipificadas por AFLP con las mismas 10 combinaciones de cebadores como se describieron para la población F2 en la sección 3.3 anterior. El crecimiento promedio de la lesión en la población que segrega para el locus de crecimiento de la lesión, fue de 5.3 mm/dia mientras que en la otra población se observó un crecimiento promedio de la lesión de 6.3 mm/dia. Ninguna planta simple tubo un crecimiento de la lesión tan bajo como el progenitor resistente LYC 4/78. Para la incidencia de la enfermedad, no obstante, las plantas con una menor incidencia de la enfermedad que el progenitor resistente LYC 4/78, fueron observadas. La incidencia promedio de la enfermedad para ambas poblaciones BC2Si fue igual (57-59%) . El efecto positivo de cada QTL fue confirmado en las poblaciones BC2Si. El QTL para la incidencia de la enfermedad disminuyó la oportunidad de infección con 17% (46% de la variación del progenitor) y el QTL para el crecimiento de la lesión redujo el crecimiento fúngico con 1.3 mm/dia (33% de la variación del progenitor) . Únicamente una parte de la variación pudo ser explicada por el efecto de ambos QTLs. Algunos locus de QTL adicionales ("menores") fueron identificados. Durante el análisis de los datos de las pruebas de enfermedad obtenidas de los genotipos F2 y BC2Si, un QTL mayor para la incidencia de la enfermedad fue identificado (QTL-2h) . Además de este QTL, otros locus de QTL "putativos" para la incidencia de la enfermedad fueron identificados. Utilizando esta información, fueron seleccionados los cofactores para realizar un procedimiento de "mapeo de QTLs múltiples" restringido (MQM) sobre el grupo de datos de F2. En este análisis, un locus QTL "menor" adicional para la incidencia de la enfermedad fue identificado (QTL-4hA) . Un QTL es denotado como "menor" cuando su calificación está por debajo del umbral de incidencia de LOD 3.4. No obstante, se cree que los efectos son efectos QTL reales. QTL-4hA está localizado sobre el cromosoma 4 y reduce la incidencia de la enfermedad. 3.9. Conclusiones del ensayo de la enfermedad y mapeo de QTL El bioensayo para medir la resistencia a B. cinérea ha probado ser una herramienta valiosa. No obstante, aparece una variación todavía grande y desconocida e incluye el desarrollo del proceso de infección. Esta variación no genética grande puede ser reducida al mínimo mediante el uso de procedimientos estandarizados y mediante la realización de muchas réplicas independientes. La variación puede ser provocada por condiciones de invernadero cambiantes de semana a semana (longitud del día, horas de luz solar y temperatura) que provocan diferencias en las condiciones fisiológicas del tallo. También, variaciones pequeñas en la preparación del inoculo del hongo pueden jugar un papel en la variación del proceso de infección. Otra observación es que el desarrollo de la enfermedad puede también ser afectado por el microclima en las charolas en las cuales fueron colocadas las piezas de tallo. Fueron utilizadas diez charolas experimentales diferentes para los bioensayos de BC2Si. El análisis estadístico fue utilizado para compensar la variación entre y dentro de los experimentos. Los experimentos con la más alta incidencia promedio de la enfermedad fueron los más informativos para medir el crecimiento de la lesión, mientras que los experimentos con una incidencia más moderada de la enfermedad fueron más informativos. La incidencia de la enfermedad y el crecimiento de la lesión son rasgos independientes, ya que no pudo ser observada ninguna correlación lineal entre los dos rasgos. Los locus de rasgos cuantitativos para la resistencia contra B. cinérea en tomate fueron identificados en la población F2. Estos QTLs identificados fueron confirmados en poblaciones BC2S1 y explicaron 46% y 33% de la variación progenitora para la incidencia de la enfermedad y el crecimiento de la lesión, respectivamente. Estos resultados sugieren que no todos los QTLs confieren resistencia a B. cinérea fueron detectados en la población de 5 mapeo F2 original. En ambas poblaciones de BC2Si fueron encontradas plantas con mayores niveles de resistencia que el progenitor resistente LYC 4/78. Esto es indicador de la presencia de locus de resistencia adicionales que segregan en la población BC2S1. Una segregación adicional de resistencia 10 fue sorprendente debido a que puede haber sido esperado que partes ya grandes del genoma de las dos poblaciones BC2S1 eran Moneymaker homocigotas. 3.10 Confirmación del efecto de los QTLs individuales en condiciones de invernadero Las plantas que contienen cualquiera de los QTLs descritos anteriormente fueron colocadas en un antecedente de S. lycopersicum utilizando el método descrito en la Figura 2. Las lineas BC2S2 fueron colocadas en el invernadero en suelo y desarrolladas bajo condiciones de práctica estándares en Holanda. Después de 3 meses fueron inoculadas mediante la colocación de un disco de agar que contenia Botrytis en una herida en el tallo principal. La herida fue subsecuentemente cerrada utilizando Parafilm®. Tres semanas después de la ¦LJ inoculación se midió la longitud de la lesión del tallo (en centímetros) para más detalles ver más adelante) . Los resultados son listados en la Tabla 7. Claramente, las líneas que contienen el QTL para el crecimiento de la lesión muestran una reducción extrema en el tamaño de la lesión.

Tabla 7. Longitud promedio de la lesión del tallo de lesiones con Botrytis cinérea en plantas adultas de S. habrochaites acceso LYC 4/78 y S. habrochaites LA 1777, tres semanas después de la inoculación.

Línea Repetición Longitud promedio Desviación Antecedente Comentarios/QTL de la lesión del estándar tallo (cm) 21 a*** 4.2 1.1 GT Control susceptible 21 b 3.6 0.9 GT Control susceptible 22 a 3.0 0.0 Durintha Control parcialmente resistente 22 b 5.0 2.9 Durintha Control parcialmente resistente 23 a 5.6 3.0 Tradiro Control relativamente susceptible 23 b 6.0 3.3 Tradiro Control relativamente susceptible 26 a 3.2 0.8 BChirs3 QTL-2h 26 b 2.6 0.9 BChirs3 QTL-2h 26 c 2.6 1.3 BChirs3 QTL-2h 26 d 3.2 2.2 BChirs3 QTL-2h 28 a 2.6 0.5 BChirs5 QTL-1h 28 b 2.0 0.0 BChirs5 QTL-1 h 28 c 2.0 0.0 BChirsS QTL-1 h 28 d 2.0 0.0 BChirsS QTL-1 h 373 e 4.3 0.6 LA 1777 QTL-10 que contiene la fuente de WO02/085105 373 f 4.3 0.2 LA 1777 QTL-10 que contiene la fuente de WO02/085105 374 e 4.8 0.6 BC chrs 10 Línea intogr. de S. lycopersicum x LA 1777 374 f 4.5 0.0 BC chrs 10 Línea ¡ntogr. de S. lycopersicum x LA 1777 375 e 4.2 0.3 BC chrs 10 Línea ¡ntogr. de S. lycopersicum x LA 1777 375 f 4.2 0.2 BC chrs 10 Línea intogr. de S. lycopersicum x LA 1777 376 e 4.3 0.3 BC chrs 10 Línea ¡ntogr. de S. lycopersicum x LA 1777 376 f 5.0 0.7 BC chrs 10 Línea ¡ntogr. de S. lycopersicum x LA 1777 377 e 4.2 0,3 BC chrs 10 Línea ¡ntogr. de S. lycopersicum x LA 1777 377 f 4.3 0.2 BC chrs 10 Línea ¡ntogr. de S. lycopersicum x LA 1777 378 e 4.8 0.2 BC chrs 10 Línea intogr. de S. lycopersicum x LA 1777 378 f 4.6 0.4 BC chrs 10 Línea intogr. de S. lycopersicum x LA 1777 68 e 2.0 0.0 par l QTL-3p + QTL p 68 f 2.0 0.0 pan/1 QTL-3p + QTL p 78 e 2.0 0.0 parv2 QTL-9p + QTL-4p 78 f 2.0 0.0 parv2 QTL-9p + QTL-4p ***) a, b, c y d son repeticiones mediante las cuales cada repetición representa 5 plantas; e y f son repeticiones por las cuales cada repetición representa 3 plantas; GT es Moneyberg con resistencia a TMV; Durintha es un híbrido con resistencia parcial de acuerdo a los productores; Tradiro es un híbrido, susceptible a Botrytis de acuerdo a los productores; BChirs indica líneas de retrocruza resultantes de introgresiones de S. habrochaites LYC 4/78; LA 1777 es especie silvestre acceso S. habrochaites LA 1777; BC chrs 10 indica líneas de retrocruza con introgresión en el cromosoma 10 de S. habrochaites LA 1777; parv indica líneas resultantes de introgresiones de S. neorichii. 3.11. El nivel de resistencia a Botrytis conferido por QTLs de S. habrochaites LYC 4/78 es más alto que el nivel de resistencia conferido por los QTLs de S. habrochaites LA 1777 en el cromosoma 10. El nivel de resistencia en plantas que contienen los QTLs de S. habrochaites LYC 4/78 descrito en la presente, fue comparado a aquel de S. habrochaites LA 1777, la fuente de WO02/085105 que contiene un QTL para la resistencia parcial a Biotrytis sobre el cromosoma 10, y a las lineas de introgresión derivadas de ésta con introgresiones en el cromosoma 10. Las lineas fueron colocadas en el invernadero en suelo y desarrolladas bajo condiciones de práctica estándares en Holanda. Después de 3 meses las plantas fueron inoculadas mediante la colocación de un disco de agar de 0.5 cm x 0.5 cm que contenia Botrytis en una herida vertical del tallo de 2 cm de longitud en el tallo principal. La herida fue subsecuentemente cerrada utilizando Parafilm®. Tres semanas después de la inoculación se midió la longitud de la lesión del tallo (longitud del tejido decolorado punteado con crecimiento fúngico) (en cm) desde la parte superior de la lesión hasta el fondo de la lesión. Los resultados se listan en la Tabla 7. Se observó que las lineas que contenían los QTLs provenientes de S. habrochaites LYC 4/78 mostraron un mas alto nivel de resistencia a Botrytis que la fuente de LA 1777 y las líneas IL. Las primeras líneas mostraron mejor crecimiento de la lesión sobre el tallo y por lo tanto muestran un más alto nivel de resistencia a Botrytis que las líneas derivadas de LA 1777 (ver Tabla 7) . Donde una longitud de lesión de 2.0 cm es registrada, únicamente la herida original pudo ser medida y no se observó crecimiento de hongos, lo cual indica un alto nivel de resistencia. De este modo, una longitud de lesión del tallo de 2 cm indica ausencia del crecimiento neto.

Ejemplo 4. Mapeo de la resistencia parcial a Botrytis cinérea en una población de tomate interespecífica (S. lycopersicum variedad Moneymaker x 5. habrochaites acceso LYC 4/78) Introducción Con el fin de hacer un proceso de producción más efectivo, que involucre la selección de plantas progenitoras candidatas que tengan la constitución genética adecuada, es necesario tener a la disposición de uno, uno o más marcadores genéticos que indiquen la presencia de esa constitución genética en al menos una de las plantas progenitoras candidatas. Este proceso, el cual incluye la cruza de las plantas seleccionadas y es denominada selección asistida por marcador (MAS) , transfiere eficientemente los alelos progenitores favorables desde un donante hacia una población recipiente y asegura que la producción ya no sea dependiente de la coincidencia y es económicamente mucho más efectiva en términos de costos de desarrollo. La resistencia a B. cinérea fue identificada en el acceso silvestre Solanum habrochaites LYC 4/78 (Urbasch, 1986; Ejemplo 1) . Para estudiar la genética detrás de esta resistencia, se desarrolló una población de mapeo F2 (n=174) de la cruza entre S. lycopersicum variedad oneymaker y S. habrochaites LYC 4/78 (ver Ejemplo 3) . Inicialmente, los dos QTLs para la resistencia a B. cinérea fueron identificados en el estudio de mapeo de F2 (QTL-lh y QTL-2h como se describieron anteriormente) . Posteriormente en un tercer QTL (QTL-4hA) fue detectado en la progenie BC2Si de segregación, un QTL a partir del cual pudo ser únicamente observado el efecto en ausencia del QTL-2h. Utilizando un análisis de VARIANZA (ANDEVA) de 2 vías fue identificada una interacción epistática significativa entre ambos QTLs en el grupo de datos de F2. Algunas clases genotipicas son representadas a una baja frecuencia y por lo tanto son necesarias poblaciones F2 grandes para detectar las interacciones de QTL (Tanksley 1993) . En nuestra población F2, tres plantas fueron S. lycopersicum homocigotas para QTL-lh y QTL-2h, mientras que 12 plantas fueron S. habrochaites homocigotas para ambas. Utilizando un análisis ANDEVA de 2 vías, fue detectada una interacción significativa entre ambos locus. El análisis de las observaciones medias de cada una de las clases mostraron que cuando QTL2 es homocigotamente S. habrochaites, no existe efecto adicional de QTL-4hA . Una desventaja del mapeo de QTL en poblaciones F2 de segregación interespecificas , es la amplia variación de los fenotipos que imitan fácilmente los QTLs con efectos menores. Otra desventaja más es la incapacidad para realizar pruebas repetidas ya que cada planta F2 es un genotipo único. Alternativamente, una biblioteca genética que consiste de un tipo de lineas de introgresión (IL) puede ser utilizada para fines de mapeo. Cada IL alberga inicialmente un segmento cromosómico definido, simple que se origina de la especie donante en un antecedente genético de otro modo uniforme (Zamir 2001). Tales lineas tienen una habilidad incrementada para identificar los QTLs debido a que: I) la variación fenotipica entre la linea y el cultivo control está asociada con el segmento sometido a introgresión; II) cada linea contiene principalmente más de 95% del genoma progenitor cultivado, recurrente, y efectos cuantitativos menores pueden ser fácilmente identificados por comparación con el progenitor recurrente; III) efectos epistáticos provocados por otras regiones del genoma silvestre no están presentes. Interacciones epistáticas negativas sin conexión pueden de este modo conducir a la identificación de nuevos QTLs (Eshed et al. 1995); IV) cada linea es homocigota e inmortal y de este modo permite las pruebas múltiples (en múltiples ambientes) y V) los problemas de esterilidad están casi ausentes debido al hecho de que la constitución genética de cada linea es idéntica en gran medida a la variedad cultivada. La primera población IL desarrollada se remonta ya a 1965 ( ehrhahn et al.), la mayoría de las poblaciones IL fueron desarrolladas durante la última década. Además del tomate, fueron desarrolladas poblaciones IL para la cebada (von Korff et al. 2004), col (Ramsay et al. 1996), lechuga (Jeuken et al. 2004), melón (Eduardo et al. 2005), arroz (Lin et al. 1998) y trigo (Pestsova et al. 2001) . Todas estas poblaciones IL fueron desarrolladas utilizando selección asistida por marcadores (MAS) pero fueron utilizadas diferentes estrategias indicadas por el número diferente de cruzas y generaciones endogámicas para obtener las poblaciones IL. Una segunda diferencia en la estrategia fue la elección del sistema marcador (por ejemplo, qué tipo de marcadores) se utilizó para desarrollar la población IL. Cuatro de las poblaciones mencionadas anteriormente fueron desarrolladas utilizando marcadores SSR. Dentro de Solanum, los ILs han sido desarrollados para Solanum pennellii LA716 (Eshed et al. 1994), S. habrochaites LA1777 (Monforte et al. 2000a) y Solanum lycopersicoides LA2951 (Canady et al. 2005) . Tales poblaciones han mostrado que son extremadamente auxiliares en la identificación de rasgos cuantitativos (Eshed et al. 1995; Rousseaux et al. 2005), el mapeo fino de los QTLs (Fridman et al. 2004; 2004; Monforte et al. 2001; Monforte et al. 2000b) y la clonación de QTL (Frary et al. 2000; Fridman et al. 2000; Ku et al . 2001) . Actualmente, existe una población IL de S. habrochaites LA1777 en un S. lycopersicum E6203 de crecimiento determinado (Monforte et al. 2000a) . En este Ejemplo, se describe el desarrollo de una segunda población IL de S. habrochaites , ahora basada en introgresiones provenientes de S. habrochaites LYC 4/78 en el antecedente del tomate S. lycopersicum variedad Moneymaker cultivado, de crecimiento indeterminado, y el uso de las lineas en la identificación de los QTLs para la resistencia a B. cinérea.

Materiales y Métodos Material vegetal y desarrollo de los ILs Una cruza interespecifica entre S. lycopersicum variedad Moneymaker (de aquí en adelante denominada como SL) y S. habrochaites LYC 4/78 (de aquí en adelante denominada como SH; lote de semillas de 1978) se realizó para producir semillas Fi . Las semillas de SH fueron obtenidas del banco de genes localizado en el Instituto para la Genética Vegetal 11 e investigación de plantas de Cosecha (Plant Genetics and Crop plant research, Gatersleben, Alemania) . Una planta Fi fue auto polinizada para obtener semillas F2 y retrocruzada a SL para obtener semillas BCi. Las semillas F2 fueron inicialmente utilizadas para la construcción del mapa de vinculación genética. Las semillas BCi fueron utilizadas para desarrollar los ILs (Figura 6) .

Análisis de marcadores El ADN genómico fue aislado de dos hojas jóvenes (enrolladas) utilizando un protocolo basado en CTAB de acuerdo a Steward et al. (1993), ajustado para el aislamiento de ADN de alto rendimiento, utilizando tubos micrónicos de 1 mi (Micronic BV, Lelystad, Holanda) y trituradas utilizando un agitador Retsch 300 mm a velocidad máxima (Retsch VB, Ochten, Holanda) . El análisis AFLPMR (Vos et al. 1995) de cada una de las retrocruzas e IL se realizó y los fragmentos AFLP fueron resueltos sobre un secuenciador de ADN LI-COR 4200, siguiendo esencialmente el método publicado por Myburg (2001) . El cebador Pst selectivo fue marcado con un marcador fluorescente IRD700 o IRD 800. Las imágenes de gel AFLP fueron calificadas utilizando el paquete de software AFLP-QuantarMR Pro (http://www.keygene-products.com) . Las secuencias cebadoras y adaptadoras son descritas por Bai et al. (2003) . Los grupos de cebadores de CAPS fueron obtenidos de "Solanaceae Genomics ebsite" (http://sgn.cornell.edu) o designados sobre las secuencias de los clones genómicos o de cADN disponibles de la misma fuente. Los polimorfismos entre S. habrochaites y S. lycopersicum fueron determinados utilizando el procedimiento de digestión con CAPS descrito por Brugmans et al. (2003) . Las secuencias marcadoras, las condiciones de PCR, y las endonucleasas de restricción especificas utilizadas para el genotipo son presentadas en la Tabla 30. Los productos de PCR fueron generalmente separados utilizando un gel de agarosa al 2.5%. En la Tabla 31 de los diferentes productos de digestión que discriminan entre S. lycopersicum y S. habrochaites son indicados para cada uno de los marcadores de la Tabla 30 encontrados en los QTLs de interés .

Genotipo gráfico Los genotipos gráficos para cada retrocruza y los ILs fueron obtenidos utilizando el programa de software GGT (van Berloo, 1999) . Para el cálculo del tamaño de introgresión y los porcentajes genómicos, los intervalos medios que flanquean un locus marcador fueron considerados como de la misma introgresión que se implemento por el software GGT. Los datos del marcador faltante fueron estimados de los marcadores flanqueantes; se asumió que éstos tenían el mismo genotipo de los dos marcadores flanqueantes, y éstos tenían genotipos idénticos. Si los dos marcadores flanqueantes tenían genotipos contrastantes, entonces los datos fueron registrados como faltantes.

Evaluaciones de la enfermedad Para evaluar la resistencia, se utilizaron 16 bloques aleatorizados incompletos con un total de 11 réplicas para cada IL. Cada bloque contenía al menos dos plantas SE y una planta de S. lycopersicum variedad Durinta. Durinta es un cultivo comercial que produce tomates en racimo con un tiempo de conservación prolongado y muestra un cierto (pero no alto) nivel de resistencia. Seis semanas después de la siembra, las plantas fueron trasplantadas a compartimientos llenos de suelo y desarrollándose en un régimen de 15 grados en la noche/19 grados durante el día y un periodo de iluminación de 16 horas. Después de 11 semanas, dos lesiones de aproximadamente 15 ituti fueron cortadas en el tallo de cada planta utilizando un cuchillo de cocina. Cada herida fue inoculada con un tapón de 1 cm2 de B. cinérea B05.10 que contiene agar (Benito et al. (1998)), y cerrado con una cinta. Una segunda inoculación fue realizada dos semanas después. Durante la prueba, las plantas fueron regadas al comienzo de la tarde para mantener un clima húmedo durante la noche. El progreso de la enfermedad fue medido 9, 12 y 22 días después de la inoculación utilizando un calibrador. El progreso de la enfermedad fue descrito de acuerdo a los siguientes parámetros: tamaño de la lesión corregido (LS) después de 12 días (por ejemplo, la longitud total de la lesión menos 15 rara de la herida) , porcentaje de lesiones en crecimiento (DI), y velocidad de crecimiento de la lesión expresado como la diferencia en el tamaño de la lesión corregido, medido a los días 9 y 12 y expresado en mm/dia (LG) .

Análisis estadístico El análisis estadístico fue realizado utilizando el paquete de software SPSS 12.0 (SPSS Inc. Chicago, EUA) . Utilizando el procedimiento de modelo linearizado general (GLM) , fueron estimadas las medias para cada IL/rasgo. Los valores medios de los rasgos medidos fueron comparados al genotipo control SL utilizando una prueba de Dunnett (Dunnett, 1955) y las probabilidades menores de 0.05 fueron consideradas como significativas. Para analizar LG y LS, se aplicó una transformación de raíz cuadrada para normalizar los datos de ambos rasgos. Las correlaciones entre los rasgos fueron calculadas utilizando un coeficiente de correlación de Pearson.

Resultados Población de IL Una población de línea de introgresión (IL) de S. habrochaites LYC 4/78 (SH) en el antecedente genético de S. lycopersicum variedad Moneymaker (SL) fue desarrollada. Una planta Fi derivada de la cruza entre SL y SH fue retrocruzada a SL (Figura 6) . Subsecuentemente, un grupo aleatorio de 14 plantas BCi fue retrocruzada a SL para obtener una progenie BC2 (n=59) . Todas las plantas BC2 fueron genotipificadas y un grupo seleccionado fue retrocruzado a SL. Este grupo fue elegido de una manera tal que las int rogresiones combinadas cubrieron tanto como fuera posible del genoma de SH mientras que se seleccionan recombinantes de una manera tal que cada cromosoma extraño será representado por tres ILs. Este proceso de selección y de retrocruza fue repetido hasta BC5. 31 plantas BC5 seleccionadas, que contienen principalmente una o dos introgresiones fueron auto polinizadas. Hasta 12 plantas de cada una de las 31 familias de BC5S1 fueron auto polinizadas y seleccionadas con marcadores AFLP para obtener una progenie BC5S2 (n=44) homocigota para la introgresión. Los marcadores de las 44 ILs fueron seleccionadas una vez más y fue elegido un grupo núcleo de 30 ILs. Este grupo núcleo representa la cobertura máxima del genoma de SH en tan pocas ILs como sea posible (Figura 7) . El grupo núcleo consiste de 15 ILs que albergan una introgresión simple, 10 ILs que contienen dos introgresiones, 4 ILs que contienen tres introgresiones , mientras una IL todavía contenia cuatro introgresiones homocigotas . En promedio cada IL contenía 60 cM (= 5.2%) del genoma de SH y la longitud de las introgresiones varió entre 20 (1.7%) y 122 cM (10.6%) . Nuestra población IL cubre 95% de la longitud del mapa de conexión F2 original. Sin embargo, se constata que este mapa de conexión F2 no está cubriendo completamente el genoma. Esto es ilustrado por el análisis de CAPS adicional sobre los cromosomas 3 (parte superior entre el brazo corto) , 4 (parte superior del brazo corto) , 5 (brazo largo) y 9 (parte superior del brazo corto) donde los marcadores de CAPS revelaron introgresiones sin marcadores en el mapa de conexión F2 basado en AFLP. El tamaño de estas introgresiones fue estimado con base en el mapa RFLP de alta densidad (Tanksley et al. 1992; http://www.sgn.cornell.edu) . Ya que no se aplicó ninguna selección previa para la parte superior del Cromosoma 3, la IL para esta región es heterocigota . Las plantas, seleccionadas como SH homocigotas para SH para IL5-1 y 5-2 fallaron en dar semillas, por lo tanto estas líneas fueron mantenidas en su estado heterocigoto . No estuvieron presentes ILs que contuvieran la parte superior del brazo corto del Cromosoma 8 y la parte inferior del brazo largo del Cromosoma 2. Las introgresiones, sobre la parte superior del brazo corto de los Cromosomas 7 y 9 están presentes en múltiples ILs. La selección es para la parte superior del Cromosoma 9 fue únicamente posible después del desarrollo de marcadores de CAPS específicos para esta región.

Evaluaciones de la enfermedad La población de 30 ILs fue desarrollada en once réplicas en un diseño de bloque aleatorizado incompleto, inoculadas y evaluadas para los síntomas de la enfermedad. Un grupo de controles claramente resistentes y susceptibles fue incluido en la prueba. En los días 9, 12 y 22 después de la inoculación, se midió el progreso de la enfermedad y se evaluó mediante la calificación de los siguientes tres parámetros: la probabilidad de infecciones crecientes, la incidencia de la enfermedad (DI), el tamaño corregido de la lesión creciente o tumoral (LS) y la velocidad de crecimiento de la lesión (LG) . El progenitor SH resistente difícilmente mostró síntomas (Tabla 8, Tabla 9) mientras que 73% de las lesiones de SL fueron crecientes.

Tabla 8: observaciones fenotípicas medias para LS, LG y DI de las ILs más resistentes y las líneas control. Las medias de cada IL por rasgo (Tabla 9) fueron comparadas a la media de S. lycopersicum variedad Moneymaker (SL) utilizando una prueba de Dunnett y las diferencias significativas fueron marcadas con * o ** (p<0.05, p<0.1 respectivamente) Tamaño de lesión Crecimiento de Lesiones crecientes corregido3 (mm) LS lesión3 (mm/día) LG (%) DI 1-3/ 29 30 ** ** 1.7 ** 45 ± 9.1 3-3 1-4 44 34 * 2.4 ** 37 ± 6.4 2-2 44 26 * 2.8 37 ± 6.5 ** 4-1 44 ** * 26 2.5 ** 41 ± 6.4 6-1 44 44 3.6 * 49 ± 6.5 9-2 44 33 * 3.1 49 ± 6.4 1 1-2 44 33 * 3.2 34 ± 6.4 ** 12-3 24 21 ** 2.3 24 ± 8.6 ** SL 156 46 4.6 73 ± 4.0 SH 44 .3 ± 6.4 DRS5 39 20 15 ± 6.9 Durinta 68 29 2.3 42 ± 5.5 a la primera observación de una lesión mensurable fue después de 12 días. b No determinado.

Tabla 9: Observaciones fenotipicas medias estimadas para LS, LG y DI. La tabla es clasificada sobre DI. Las medias de cada IL por rasgo fueron comparadas a la media de S. lycopersicum variedad Moneymaker (SL) utilizando una prueba de Dunnett y las diferencias significativas son marcadas con * o ** (p<0.05, p<0.01 respectivamente). Tamaño de lesión Crecimiento de lesión3 Lesiones crecientes corregido3 (mm) LS (mm/día) LG (%) DI ** 2.3 ** 12-3 24 21 24 ± 8.6 * 11-2 44 33 3.2 ** 34 ± 6.4 1-4 44 34 2.4 * 37 ± 6.4 ** * 2.8 ** 2-2 44 26 37 ± 6.5 ** * ** 4-1 44 26 2.5 41 ± 6.4 * 2-1 44 30 3.0 41 ± 6.4 ** ** ** ** 1-3/ 29 30 1.7 45 ± 9.1 3-3 * 4-2 42 33 3-9 45 ± 6.7 * 3-2 44 35 4.2 46 ± 6.5 3-1 43 41 2.8 * 47 ± 6.6 1-2 40 33 3.4 47 ± 6.7 11-1/ 44 36 4.3 * 48 ± 6.5 9-3 9-2 44 33 3.1 49 ± 6.4 * * 6-1 44 44 3.6 49 ± 6.5 7-1 44 35 3.1 50 ± 6.4 4-3 20 29 2.8 51 ± 9.6 12-1 44 35 4.7 51 ± 6.4 12-2 43 37 4.0 52 ± 6.4 6-2/7-2 44x 44 3.7 55 ± 6.3 2-3 44 44 3.5 58 ± 6.5 8-3 44 43 3.9 59 ± 6.5 10-1 43 47 4.3 60 ± 6.6 5-1 44 53 4.8 61 ± 6.6 10-2 44 49 4.4 62 ± 6.5 1-1 41 56 5.9 65 ± 6.7 * 9-1 44 34 3.0 69 ± 6.5 5-2 43 64 5.4 69 ± 6.5 10-3 44 53 4.7 70 ± 6.4 10-4 44 47 4.8 76 ± 6.6 6-3 44 49 4.6 79 ± 6.5 SL 156 46 4.6 73 ± 4.0 SH 44 -3 ± 6.4 * DRS5 39 20 NDb 15 ± 6.9 ** Durinta 68 29 2.3 42 ± 5.5 Dentro de la población IL, 14 ILs fueron identificadas con síntomas reducidos de la enfermedad (Tabla 9) . Un total de 12 ILs mostraron una DI significativamente menor. Siete tuvieron LS significativamente reducidas y cinco una LG significativamente menor. IL4-1 e IL 1-3/3-3 mostraron una reducción significativa de los tres parámetros (DI, LG y LS) . En los ILs significativamente menores para DI el intervalo en el porcentaje de lesiones en crecimiento fue de 24 a 49%. LS y LG variaron para los ILs que se desvian significativamente, entre 21-34 mm y 1.7-3.0 mm/dia, respectivamente. El control S. lycopersicum variedad Durinta, con un cierto nivel de resistencia, fue también significativamente menor para los tres parámetros, y la resistencia en cada uno de los siete ILs identificados es más o menos comparable a este nivel. En experimentos previos, fue seleccionado un genotipo BC2S2 (DRS 5, ver Tablas 8 y 9) . Esta linea contiene tres introgresiones homocigotas que representan en total 18% del genoma SH (Figura 7) . Esta linea fue la linea más resistente en la prueba descrita anteriormente. Ésta tuvo una DI significativamente menor (15%) y el LS fue también significativamente reducido. En comparación a S. lycopersicum variedad Durinta, el DI reducido 2.8 veces de esta linea, es significativamente menor, mostrando el potencial de alelos múltiples en pirámide que confiere resistencia a B. cinérea.

Efecto del apilamiento de introgresiones Cuando se analizan las diversas introgresiones presentes en lineas IL individuales (Figura 7) y comparando éstas con sus efectos individuales sobre la resistencia como se muestra en la Tabla 9, se pueden inferir los efectos del apilamiento. Como se debe observar en las lineas 9-1, 9-2, 11-2 y 12-3 el apilamiento de las introgresiones puede tener efecto . Se concluye por ejemplo que la introgresión en el cromosoma 6 en la linea 9-2 no tiene efecto, ya que una introgresión idéntica en la linea IL6-3 no proporciona resistencia . De igual modo, una introgresión en el cromosoma 7 en la linea 11-2 no tiene efecto (compárese a la linea 7-1 y 8-2) . Los dos patrones de resistencia (DI y LS) como están presentes en 11-2 no son el resultado de la introgresión sobre el cromosoma 11 únicamente. La reducción en el tamaño de la lesión (LS) en esta linea podría ser debido a una introgresión proveniente del cromosoma 9 (compárense las introgresiones similares en 9-1 mientras que una reducción en la incidencia de la enfermedad no es encontrada nunca en asociación con la introgresión de 9-1 únicamente. Por lo tanto, la reducción en la incidencia de la enfermedad debe ser debida a la introgresión desde el cromosoma 11. De este modo, en la línea 11-2 la resistencia total es el resultado de varias introgresiones. Similarmente, el porcentaje de lesiones tumorales o en crecimiento reducidas en la línea 12-3 en comparación a la línea 9-1, pudo ser debida a la introgresión en el cromosoma 12, mientras que el tamaño de la región corregido, reducido, pudo ser debido a la introgresión desde el cromosoma 9. Por lo tanto, aquí también la presencia combinada de múltiples introgresiones da como resultado la resistencia mejorada.

Conexión entre IL y los datos de la enfermedad Utilizando un bioensayo en invernadero se identificó un grupo de ILs que contienen introgresiones responsables de una resistencia incrementada a B. cinérea. Tres regiones, localizadas en los cromosomas 2, 4 y 6 contienen de manera no ambigua uno o varios genes para la resistencia incrementada. Las otras ILs contienen múltiples introgresiones que hacen más difícil señalar con exactitud los genes de resistencia. IL9-2 contiene introgresiones sobre los cromosomas 6 y 9. La introgresión sobre el cromosoma en IL9-2 es similar a la introgresión del cromosoma 6 en IL6-3, una IL tan susceptible como SL. De este modo, se espera que el efecto de IL9-2 sea incrementado por la introgresión sobre el cromosoma 9 y no sobre el cromosoma 6. ILll-2 contiene una introgresión del cromosoma 9 más pequeña que la que está presente en IL9-1. Por lo tanto, la DI reducida se espera que sea provocada por un locus en el cromosoma 11. Las dos ILs 1-4- y 12-3 contienen introgresiones que traslapan la introgresión en el cromosoma 9 de IL9-2. Únicamente IL12-3 es significativamente más resistente que IL9-2 sugiriendo un efecto combinado de las introgresiones sobre el cromosoma 9 y 12. Ya que las ILs 1-4 y 11-2 no son significativamente más resistentes que IL9-2 no se puede excluir que la resistencia dentro de estas dos lineas sea el resultado de la introgresión del cromosoma 9. Resumiendo; se identificaron introgresiones localizadas sobre los cromosomas 1, 2 ,4 (2x) , 6, 8, 11 y 12 que son responsables de una resistencia incrementada a B. cinérea. Los efectos sobre el cromosoma 2 y uno sobre el cromosoma 4 han sido previamente detectados durante el análisis de F2 y poblaciones segregantes de BC2Si de esta cruza (ver Ejemplos 1-3) .

Segregación en el F2 de los locus identificados Para todas las regiones, en las cuales es encontrada una asociación entre la introgresión y una resistencia incrementada a B. cinérea, el grupo de datos F2 original fue verificado para encontrar una posible explicación de porqué QTL inicialmente estaba ausente. Ambas desigualdades de los datos del marcador y los resultados provenientes del análisis QTL, fueron verificadas. Las introgresiones sobre el cromosoma 1 (1:6:6), el cromosoma 2 (1:3:2) y el cromosoma 9 (1:6) se desviaron significativamente de las proporciones 1:2:1 o 1:3 esperadas. Para las tres regiones, se observa una falta de alelos homocigotos de L. lycopersicum. Los datos del análisis de QTL para el mapeo del intervalo y el análisis del marcador simple utilizando un procedimiento de Kruskal-Wallis fueron verificados pero no se encontró evidencia respecto a la existencia de un QTL significativo en el grupo de datos de la población F2 sobre el cromosoma 6, 9, 11 y 12.

Secuencias marcadoras como se utilizan en la presente Las siguientes Tablas proporcionan información detallada sobre los diversos marcadores RFLP y COS-II como son indicados en los diversos mapas de conexión o vinculo y como se indican para la asociación con los QTLs de la presente invención. La información fue directamente copiada de la base de datos SOL Genomic Net ork (SGN) alojada en la Universidad de Cornell, versión del 7 de octubre del 2005.

Tabla 10 TG609 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: TG609 Tamaño del inserto: 190 Vector: pGEM 4Z Sitio del Corte: PST1 Resistencia a Fármaco: Secuencia delantera GAGACAGCTTGCATGCCTGCAGAGGTGATAAATTCACCAAGGTTTCATATTTAGGAAACAA GAAAATTAAAAGATCATTAACACAGATGA AAGGATATGACTAGGAGGCAATGACTGATCTTTGACTATCAAATACTTCTCAGGGAAACAA TGTGAATGGGCTTTTACATGCAGAGATAT TGATTGTGATCATGTTGAAGAACTTAGGAAACATGAAATTAAATGATCATTAACACTGATG CAAGGATATGCCAAGTAGGCAAGCAAATT AAGGTTGAACATAAATGTCTGTGATCTTTGACTATCAAATATCTTCTCAGAAAAAAAAATG TGAATGCTCATTTACATGCAGAGATGGCT ATTGTGATCATGTGGCTCAGCCTTGAGTCTATATTGAGGTGCAGACAACATAGTCCCTAAC CACATGTGTGATCAAGCAACTTTTTTGAT GTCCACAGGGTTATAAGTAGGCAACATTTAAGCAAGAAAAAACACAGGATCACTATTGAGT CAGCTGCTGTTGCCTGT Secuencia inversa GGAGACAAGCTTGCATGCCTGCAGAGGTGATAAATTCACCAAGGTTTCATATTTAGGAAAC AAGAAAATTAAAAGATCATTAACACAGAT GAAAGGATATGACTAGTAGGCAATGACTGATCTTTGACTATCA'AATACTTCTCAGGGAAAC AATGTGAATGGGCTTTTACATGCAGAGAT ATTGATTGTGATCATGTTGAAGAACTTAGGAAACATGAAATTAAATGATCATTAACACTGA TGCAAGGATATGCCAAGTAGGCAAGCAAA TTAAGGTTGAACATAAATGTCTGTGATCTTTGACTATCAAATATCTTCTCAGAAAAAAAAA TGTGAATGCTCATTTACATGCAGAGATGG CTATTGTGATCATGTGGCTCAGCCTTGAGTCTATATTGAGGTGCAGACAACATAGTCCCTA ACCACATGTGTGATCAAGCAACTTTTTTG ATGTCCACAGGTTTATAAGTAGGCAACATTTAAGCAAGAAAAAACACAGGATCACTATTGA GTCAGCTGCTGTTGCCTGTTACTGAG Tabla 11 TG62 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: TG62 Tamaño del inserto: 1800 Vector : pUC Sitio del Corte: PST1 Resistencia a Fármaco : ??? Secuencia delantera CAAAATGCTTCAGCTACTGGCTAAATGAAGTATGTTCTCAACATATTCACAAGCTTCTGTC TTCGAAGCTCAAGAAGTGTCGGTATTATC TGAATTAAATAGTAAAGCAAAGAGATGGTTTTATGTTTCTTAAGCAGCATTTCTTAGCTTA ACGGCCCTCCAGATATATGGTGGACAAAA TAGAATCCATTAGATATAACAAATGGGATTAGTATAATGATCTTTTACTTTGTTAGATGAT CATACTAACAGATTGCAAGTTAATCATAT CCAACATATTCTGTAGATATTTCACATTGGCTAGCATGAGGAAAGGTCATGTAGGAAATTG AATAGAGTTCAATTTTGGGAAAAGTTGCA TTGAAGAAGGT ACTTCAACAAACGTGTGAAAAAATCACATT GAGTTGCCCGCTCACCAT CGTGATTCCAGTACGAACTACTCAAAAAT TTACTTTTGAGCCTTAAACATCATTTTAAGCCTTGAAAAGCTGCTTTTGAAAAGATCTAAG CAAGAT Secuencia inversa GGAGAATATTGTCACTCTATCAGATAGTTCAAAACTATCGGAGAATGAAATGGTCAATTCT TCTCACAAGATATTCATGCCTAGTTGCAG TGTCCGAATTAACATAACATGCTC'AATTTTCATATCTTGCAGCAAAATTTATCATTG'AAAC TCTCTGAGATGGAAACAGAGAACAAAGAC CATATTGGAAAGCTTCAATCAGACATGCAGAAAAAGGAAGATGAGATTCATGTTTTACGCA AGGAAATTGACAATTACACGGAAACAGTG GATTCACTGGAGAAGCATGTTACAGAGATTAACAATAAATTGGAGGAGAAAGATCAGCTTG TTCAGGAACTTCAGGACAAGGAGAAGCAG TTGGAAGCTGACAGAGAAAAGGTTTTTACTACGGATACTTTTAGTTCTACAAATTCTATTA TAACCAATACAATGTGTTCAAGTGACTAG TGTTTTGCACCTTGTTGCAGATTCAGGCATCTTTGCTTGCTGCTGAAAGCAAGCTCACAGA ATCCAAAAAGCAGTATGATCAGATGT Tabla 12 TG555 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: TG555 Tamaño del inserto: 1600 Vector: pGEM4Z Sitio del Corte: PST1 Resistencia a Fármaco: AMP Secuencia delantera AATTCGGAGCTCACTGCTTCTAATCCTCAGTGAGACTTATTTTCTACATATTAAACAATAA GAAATTTACGAAGGAATATTATAGACTGA ATTCCTTGGTGACAAGTATCAAGACATCTTGACCAAGTTTAAAGTTTTGTAGTGGCAGTTC TTTTAAGCTTTACTTGTGTGAGGTAGACA TCAAGGAAGATAAGTAGCAGCTACTCTTCACGGAGCAGCCCATAGGACACTCAAATTCACT ATTGCGAGGGTCAATCTACCAATTTATGG AACGATACCAGTAAAGTCATTTTTATGTAAACATCAGACAGCTTTTGACTAAGCAGAGACA TGAATAAGTTCTATTTGTTAGAAGTCGAA GAGACAAATAAGTTAATTTCACCTATGCTATAAAAGAGGACTCTTATAGTTATAAATACAG TACATTTTATTAAGGGTTCTAATTGTTGA CTATGATAGCAAGCATGCCGTACTAATT Secuencia inversa ACATTTTGAGGAAGACAGGAGTTATGTATCGCCATCTGGTGTGCTCCAAGAACATGACAGA TATAAAAGACCGCGGGGTGCACCAGAGAA ATGTTGCATTGGAGCATATTGAACATCATAGGCTCAATGGAATTGTTTACTTTGCAGATGA TGATAATATCTACTCACTTGAGTTGTTTG AGAGCATTAGATCGATCAAGTAAGTTGAGATTCATCAGTCTTGTTTACATGACTTGTCTTT GTTTTGTCCTGCTGTGAGCATGTTCAGGA TGATGTTATGTGCTTTATGTAGATGTTCAAGTCGATAATAGTGAATAGTCTAGAGCTATTT CACATATATTACA'ACTTCACTAACAAATT CTTTTCCTGGTGTCCTCGGTTCATCACTCTTCATAGTTATAAGAATAACAGTTGTAGATTA GACCACTGGTCGTGTGATTTTTGGACTTA ATTATTATCTCAATTCTTCCTCAAAATAGCAGTCCTTAGATTAGAAGCTGAGG Tabla 13 CT50 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: CT50 Tamaño del inserto: 1600 Vector: pBLUESC Sitio del Corte: EcoRI Resistencia a Fármaco : AMP Secuencia delantera CTTTTTTTTTTTTTTTATATATTGTGGTATAGATTATTATATAATAACAAGGTGAATTAAC ATGAGAAATGAATAATTGTCACATTCTTG TTCTGTCCATTTTCCAGTAGCGGCTAGTTGGAAAATTTGTTGTAACATGTAACACAGGCTG TCCACATTCTACTCCAGAGAGAAAGTTGG TAAGTAGTGGGGGCAAAAGATAGAGACCCCAATAGCTATCAATTCACTTTGTTGACAATCA AGATTTGAGAAAAAAG TCAAAACTTTAC CAACTTAGATAGCTCCATAATCAACTGTAGGTACAATTCTTTAGTGAAATTGCGGCGTTCA TCTTCTGGGGACGAAGAGTAAGTAGACAA TCAATTGTCTTGTAGAACTTGGGCTTTACCATTTTCCCTAGGACATAAGCTCTTGATCGAA GCTTGAAGTTTAATTTTAGTGGCACTGGT AATG Secuencia inversa TTTTTTTTTTTTTTTAGCCAAAATGCATACAAAAACTGATTCAGAAGATACGAGCTTGGCT CCTTCGTCGCCGGACAATAGAGGGCCGAC GGCGTATTACGTTCAGAGTCCGTCACGTGATTCTCACGATGGCGAGAAGACAACGACGTCG TTTCACTCTACTCCTGTTATCAGTCCCAT GGGTTCTCCTCCTCACTCTCACTCATCCGTCGGCCGTCACTCCCGTGATTCCTCTTCCTCC AGATTCTCCGGCTCCCTCAAGCCTGGATC TCAGAAGATTTTACCCGACGCCGCCGGAGGCGTCGGCGGCCGTCACCACCGCAAAGGGCAG AAGCCCTGGAAGGAATGTGATGTTATTTG AGGAAGAAGGACTACTTGAAGATGATAGATCCAGTAAATCTCTTCCACGTCGTTGCTATGT CCTTGCTTTTTGTTGTTGGTTTCTTCGTC CTTTTCTCCTTCTTTGCTCTCATCCTTTGGGGTGCTAGTCGACCTC Tabla 14 C2_Atlg74970 Marcador COS-II Experimentos de mapeo Mapa: Tomate-EXPEN 2000 Cebador delantero (5Sapos ; -3Sapos ; ) : TCATCATCAACTATCGTGATGCTAAG Cebador inverso (5 apos ; -3Sapos ; ) : ACGCTTGCGAGCCTTCTTGAGAC Temperatura: 55 °C Concentración de Mg+2 : 1.5 mM Tamaños de Producto de PCR: LA716: 1000 LA925: 1000 Tamaños de banda Digeridos (utilizando AluI) LA716: 550 LA925: 850 Posiciones Mapeada: Mapa Cromosoma Desplaz . Confianza Tomate-EXPEN 2000 4 109.7 I Tabla 15 CT128 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: CT128 Tamaño del inserto: 700 Vector: pBLUESC Sitio de corte: EcoRI Resistencia a fármaco: AMP Secuencia delantera CTTTTTTTTTTTTTCAACACAAACAAAATTTCATTATATTGTCAGGTAGCACACTACATCT TTACACTGTCATCAAACGACCAGAGACTT GAGAACGTTTTAAGAGATTCATTTTCCGGGGACAAAGTTTGTGGCGAAAGCCCAGGCATTG TTGTTTACGGGGTCTGCAAGGTGGTCAGC AAGGTTCTCCAATGGACCCTTTCCGGTGACAATAGCTTGAACAAAGAATCCAAACATAGAG AACATAGCAAGTCTACCGTTCTTGATCTC CTTTACCTTGAGCTCAGCAAATGCCTCTGGGTCTTCAGCAAGGCCTAATGGGTCGAAGCTG CCACCAGGGTAGAGTGGGTCGACAACCTC ACCAAGAGGTCCACCAGCAATACGGTATCCCTCAACAGCTCCCATCAACACAACTTGGCAA GCCCAGATGGCCAAGATGCTTTGTGCATG GACCAAGCTTGGGTTGCCCAAGTAGTCAA Secuencia inversa CTGGTGATTACGGGTGGGATACCGCTGGACTTTCAGCAGACCCTGAAACTTTTGCCAAGAA CCGTGAACTTGAGGTGATCCACTGCAGAT GGGCTATGCTTGGTGCTCTTGGATGTGTCTTCCCTGAGCTCTTGGCCCGTAATGGTGTCAA GTTCGGTGAGGCTGTGTGGTTCAAGGCCG GATCCCAGATCTTCAGTGAAGGTGGACTTGACTACTTGGGCAACCCAAGCTTGGTCCATGC ACAAAGCATCTTGGCCATCTGGGCTTGCC AAGTTGTGTTGATGGGAGCTGTTGAGGGATACCGTATTGCTGGTGGGACCTCTTGGTGAGG TTGTCGACCCACTCTACCCTGGTGGCAGC TTCGACCCATTAGGCCTTGCTGAAGACCCAGAGGCATTTGCTGAGCTCAAGGTAAAGGAGA TCAAGAACGGTAGACTTGCTATGTTCTCT ATGTTTGGATTCTTTGTTCAAGCTATTGTCACCGGAAAGGGTCCA Tabla 16 TG599 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: TG599 Tamaño del inserto: 700 Vector: pGEM4Z Sitio de corte: PST1 Resistencia a fármaco: AMP Secuencia delantera TGCTTTGAGACAGATGTCTCTCATTAAGTGACTGAAGCTTTCTTCTAGTTGGCTAGCATAT TCATTTTCAGCATATAATCTGTATCATGA ACAAAATTGCGACAGTATTGAATTTTTATTGTTGAATAGTCTTTTTATTATCCCCGAAGTT GAGGGTGGAACTTACATTTTCTGTTGATC CTTGCTTGCTGTTTTTGTAAACAAAAAAGCGTCACCCATTATTTTTCTTTTATTCTTTCTA GGTTGGGACTAAGATTTTTTGAAATGAGA AAGGTATTCGCTACCTTGAGGGCTGTGGTTGAAGTGATGGAGTATCTGAGCAAAGATGCAG CTCCTGATGGTGTGGGAAGGCTTATAAAG GAGGAGGGAGTATTTCCTTTCATTTCTTTGTATTTCCGTGTGTGTATAGTCCGGAACTGGT TCCCTACTTATGAATTCTTTCATGGTTTG GTCAATTGAGAAGGATCAAGAAATCTGATGCTACTTTATCATGGGAACTT Secuencia inversa GCTTGCATGCCTGCAGAGTGGTCATACAATAAAAGGTAAAAATCAACATTCTTACCTCTGG AAAGAAACCAATAGCATTGGTCAATGATG CTGCCTCTAGAGGAACAATATTGTATGGTGCAAGTTCCCCTGATAAAGTAGCATCAGATTT CTTGATCCTTCTCAACTGACCAAACCATG AAAGAATTCATAAGTAGGGAACCAGTTCCGGACTATACACACACGGAAATACAAAGAAATG AAAGGAAATACTACCTCCTCCTTTATAAG CCTTCCCACACCATCAGGAGCTGCATCTTTGCTCAGATACTCCATCACTTCAACCACAGCC CTCAAGGTAGCGAATACCTTTCTCATTTC AAAAAATCTTAGTCCCAACCTAGAAAGAATAAAAGAAAAATAATGGGTGACGCTTTTTTGT TTACAAAAACAGCAAGCAAGGATCAACAG AAAATCTAAGTTCCACCCTCAACTTCGGGGATAATAAAAAGACTATTCAACAATAAAAATT CAATACTGTCGCAA Tabla 17 TG10 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: TG10 Tamaño del inserto: 900 Vector : pUC Sitio de corte: EcoRI /Hindl I I Resistencia a fármaco: AMP Secuencia delantera AACTCTGCTCTGCCAATAGTAGTCAGGCAGATCAAGATGCTCAAAATTTTCTATTTGAATT GGAAGCATCAAGATGGTTCTTAGCATTTA TTTTAGAAAGACTAACCATATTATCAAATAACCAGACTGAGACGCACACAAAAGTTTCCCT CTATTATTTTTATAATGATGTGAAGATGC TACATAATGAGTACACTTTGCCTTACTTTACTGCAGATGGACCTACCAGGCCCAAACGGAC ATGTAGCTATGACAGAAGAGCAACCGCTA TGAATGTCTCAAACTGTTGGCCTAGGCGATCAGCACAGATGATGAATCTGGAAGTACATTC CAAGAAGGAAAGCTGGAGCGTGGGAACTA ACCAGATGCAGGGGATGAATCCACACCTTTCAGTTGATCATCTGAAGGGAAAACTAAGAAT TTTCATGAG?????GACTGGCTATTTTCA ACTTTG Secuencia inversa TTCAATGCATTTAAGCTCAAAAAAACAAAGCTGTAGGAAGGAGCATATTAGTAGCCTAACT CTGCTCTGCCAATAATAGTTAAGCAGATC AAGATGCTCAAAATTTTCTAATTGAATTGTTAGCATCAAGATGCTTCTTAGCATTTATTTT AGAAAGATTAACCATATTATCAAATAACC AGACAGAGACGCACACAAAAGTTTCAATCTATTATTTTTATAATGATGTGAAAATGCTACA TAATGAGTACACTTTCCCTTACTTTACTG CAGATGGACCTACCAGGCCCAAACGGTCATGTAGTTATGACAGAAGAACAACAGTATGAAT TTCTCAAACTGTTGGCCAAGGTGATCAGC AAAGATTATGAATTTGGAAGTACATTCCAAGAGGAAAGCTGGAGCATCGTAACTAACCAGA TGCAGGGGATGAATCCACACCTTTCAGTT GATCATCTGAAGGCAAAACTAAGAATTTTCATGAGAAAATACTGGTTATTTTCAACTTTGT TGGCCAGACGAGGAGTCCAATGGGATAGA AGGACTAACTCAATGACGTATG Tabla 18 TM2a Marcador TM Información de TM Nombre: TM2A ID COS antiguo: T0899 Secuencia CNAGCTCGANNNACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGC GGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGCTCCTCC ATTGAAAAGGG???CAAGTTTGCCAAAGAAA'ACTAAAAAAAC?????TAT GGTCTAGTTTTCTATAGTGACAGTTTTGGATCTTTTTGGGTCAATTGTTT TTGTATCCTTTGCAAGTTTCTTGCAGCCGGAGGCTTAGATTTAGCTCTTT TGATATTATACCCAACATTTCTACAAAATAATGTATGGCAAACTGGGGGC CTATCCCATTTGCCTTAGTGTGGAGGTGTTATTCTCACATGAATCGTTTT CCAATTATGGTTAGTAGCAGACAATTGATGCAAAATGAAGAAATGTTCAT GACC?????????????????? Posiciones Mapeadas Mapa Cromosoma Desplaz . Confianza Tomate-EXPEN 2000 (TM2A) 9 50.5 I Tabla 19 TG551 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: TG551 Tamaño del inserto: 950 Vector: pGEM4Z Sitio de corte: PSTl Resistencia a fármaco: AMP Secuencia delantera AATGAAGTTCAGTTGATAAGCTAAATGGTGGAAATACTAATTTTAATTGACAGTAACTTTG CATTTCAAGGTCCATACCAAAACATTTGC TAACACCAGTTGCTTTGTCAACGAAAACCTTGGCACTCAAAACCCTACCAAAAGGCTGAAA TGCATTTGCAAGCTCTTGATCACCAAATT CTTGAGGAATATGGTAAATAAATAGATTAGCACCAGGTGGACCTGTAAACAGCAAAATCGT TTTTGATAAGTACAGGTTTATTTCTACAT GTTCAACTACCACTGCCAAGTACACTAGTTCAAGTGACATCTCCACCACTTAATTGCATAA AGCTTTACCAACGACAAATATAACAAACT TGTGCAAGTAATTTGAGTTCCTGTCTATACAGTCCAGAATCTCCATATGCTGCTCATCTCA CAATGTTGGTTAAGGAAATTTGTCAAGTA AAGTTCAA Secuencia inversa CATCTTCAAGTGTCAGCTCAAGTACAGGGGGTCAGGTTGAAGGTTGTTGAACATTTATTTT GTGACCTTTTTAGCTCTAGAATTTCTGTA GCTAATCAAGTACAGTCCCATAACCTAGGGGCTGTTAGGGTTTTCTGCTGAATGAGGCTGC TTGTCTTTATTTTGGTTAATTATTTTCTG GAAATTGTTCCTCGTCATAGAGAATAGAAGTAGAAGAAGAAGAAGATAGTATAATCTATTA TATTTGTTTTTTACTTAATTTATAAAGAT TCCATAAATGCATGTGATCTTTGATCAATGATATCTTATACAAGTGTATCACTAGAATCTA TTATATTTGGATTTACTTATTTTATATAG GATTTCATAAACGCATGTGATC Tabla 20 T1405 Marcador COS Información de COS Nombre: T1405 Categoría MIPS: 1.05.01 Información EST T1405 fue desarrollado de la traza de EST TPTAR86TH .

Ortología de Arabidopsis En concordancia: T1405 mejores concordancias contra el Arabidopsis BAC AC009243.3. En posición: 1.1490000 En identidades: 0.677 Aciertos de proteina de Genbank Mejores aciertos de proteina de Genbank: AAF17692.1 Evaluación: 1.5e-67 Identidades : 0.677 Descripción "similar a beta-1 , 4-xilosidasa dbj | BAA2 107 [Arabidopsis thaliana] " Posiciones Mapeadas Map Cromosoma Desplazamiento Tomate-EXPEN 2000 4 77.00 Tabla 21 CT173 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: CT173 Tamaño del inserto: 400 Vector: pBLUESC Sitio de corte: EcoRI Resistencia a fármaco: AMP Secuencia delantera TTTTTTTTTTTAAAAATTCAAACTCCAATTATTTGCAGTATAAAACTACAGATACA AATCCCAGTACATGGTTTGAGGCACGATAATAAG GTGCTGATGAAATCCAAGACATGAGTTCACAATACATTACTGACCAATATATTTAC AAAGATTAGGGTAATGGCAGTAAAATCGCTGATT ACAGACAACATTCTTGGGATATATTTCATCTTAAAGATTAGGATTAGTAGTATGTG TGGCAGTCACAGTAGAGACCATGGCATCAACTCC GCAGATATTGTGACCCCTGCAGATCTTGTAATATCCGTGTTCTCCCCAAGTCTTTC CCCAA Secuencia inversa TTGGGGAAAGACTTGGGGAGAACACGGATATTACAAGATCTGCAGGGGTCACAATA TCTGCGGAGTTGATGCCATGGTCTCTACTGTGAC TGCCACACATACTACTAATCCTAATCTTTAAGATGAAATATATCCCAAGAATGTTG TCTGTAATCAGCGATTTTACTGCCATTACCCTAA TCTTTGTAAATATATTGGTCAGTAATGTATTGTGAACTCATGTCTTGGATTTCATC AGCACCTTATTATCGTGCCTCAAACCATGTACTG GGATTTGTATCTGTAGTTTTATACTGCAAATAATTGGAGTTTGAATTTTTAA'AAAA AAAAA Tomate-EXPEN 2000 (S. lycopersicum LA925 x S. pennellii LA716 tipo F2.2000) Tabla 22 TG254 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: TG25 Tamaño del inserto: 2200 Vector: pGEM4Z Sitio de corte: PST1 Resistencia a fármaco: AMP Secuencia delantera CTAGTTGGATTGAAACAATTGGGAATATAGTGTAGGAAGACTTCGGGGCAATTATC TGCTTTCTTCTATATCAAACTGGGTCTATTGAAG AATTACAAACTGGACCTTAAATCTTTTGCCAGTTTTTGTAAAATTGATAAACTTTT GATATTTTATTATGGAAATTCAAAATATATCTTA ATAGTAGCTTGTTAATTTATTTCAAGAGACCCTTTTCATTGTTCATAGTTCATTAT CATCCCCTTATCAGTAGTGCACCAAGGGTGTGAC CTAGTGGTCAATTAAGTATGAATCATGAGTCTTAGACAGAAACACTAGGTGATTTT CTTCCATGTGTCCTAGCCTCTTAGGCTTGGTGGA TAGAGGAGGTATCCTGTCTTTCCCCTTTCCAGAAATTCATAGCATTATTTTCTGTT CTTTATTGATAAATTATTCATTAGAACAGTTATT AGAAATGTGGAACTGGTTGAGGTAGGCG Secuencia inversa CAGAACAGAGAACATGTAAAGTTGTTCAACTAATGAGCATATTTAGAAAAACTTAG TGGCTATCAATAGTTGGCAATATGAAAACTAAGA TAGTGTGGTCACCTGTTGATCAATTTCTTCTTCAATAGGCATCTTGTCAGCTTCCT CTTGTAACAAGGCTTTCATTTGTGACTTGAGAAT ATATCCAGGAGGAAGTGCATGCCTGTAATGGCATTCTTTACCATTTGGACAGGCCC AGAACCAACCGTACTGCTTTTTCTCCACAGCATC CAAAAAGAATTTACATACCTGCATATAAACCAAATCATAAGCTTGATTTATGAAAC GAGCACTGCATTCATGTTTGGCAATATTTGACTG GAGGAGGAGTTTTAAAGGGGGAAATTAAGACTATAGACACATACACTAAATATGCA TAAAACGCCAAAAGTACCCTGGTTTCCTATCCAG TTAAGGCAACAGTAGCAGAAAATGAGTGTTGTAATGAGTCAAT Tomate-EXHIR 1997 (S. lycopersicum TA209 x S. habrochaites LA1777 tipo BC1, 1997) Tabla 23 TG223 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: TG223 Tamaño del inserto: 7 Vector: pGEM4Z Sitio de corte: PST1 Resistencia a fármaco Secuencia delantera TATTCAAGAAAATATTGTGTAGTGTTCTCCAATATTCAACTATTTAAGTTCAATGG ATCTAGACACACAATATTATTAATTCTCGTCGCC GATGGGATGGTTGAGTGATTGAAGCATAGGAATAACATCCTGGAGATTCTAGGTTT GGACTCCAGTTTGAACATAAGTGTGAGCCCATCT GCTTTATCTTACAAGTTCAATTCAAACTTGTGTGAGTGGGCCATAGTAGATCCATG CAAAATAGTGGTTATGACGCTATGGTGAGTTCAT GAGAAGAATTATTGTTCCTTAGGAACAGTGACAGGAAATTCAATGGTCAAATAACA TCAAGAAGACTTTTTGGATTAGTTACTGAGTGAT GTTCAGAAGAGGGACTAAATATCTAACATGCCCCCTCAAGCTCCAGATGGTAAAGC AACTTGAGTTTGAGTTACTAGAATTTAGTAACAT AAAAAGGTTTTCCAT Secuencia inversa TTTCCACACACACAAAAAAAACATCTTGAACACACTGTAATCCCCCTCTTCATCAA ATTCTCCTGTGTCAACACAACTTCCTTAGCCAGT AACCACACAACTTCCCTCTTCTGAACATTACAAAGTCGCTGATCCAGAAAGTCTTG TTCTTGATGCTATTTGACCATTGAATTTCCTGTC ACTATCCAACATGAATAGTGTTTGTAGGGAATAAATTGAAATCAGATTACAAGGAT CCAAATATCCATCCCCAACAATGTACTGTTTATG CCCGAAGGTGAGGATA'AAAAGATGGAAAACCTTTTTATGTTACTAAATTCTAGTAA CTCAAACTCAAGTTGCTTTACCATCTGGAGCTTG AGGGGGCATGTTAGATATTTAGTCCCTCTTCTG Tomate-EXHIR 1997 (S. lycopersicum TA209 x S. habrochaites LA1777 tipo BC1, 1997) Tabla 24 TG47 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: TG47 Tamaño del inserto: 1900 Vector : pUC Sitio de corte: EcoRI /BamHI Resistencia a fármaco: AMP Secuencia delantera TGCAGTTGAATTCGTCTTCTTAACACTATTCTCTTATGCTGTGCATCAAGACAACC ACCCTCATTGGGCGGTCATTGCTTCTTCAGGCAT GACCCTACAGTTAGTACATTTGGTTTTACCAAATCTTCTTCTAAGGATAAATCTAT TTGACTATGGTTCACTCTCTAAATCATAAGCTGA AACAACATCAACATACCCCGTGTAAATCATAAGCTAAAACAAACTCTAGAATAGCC TTACCTCATCATTCCTAGGACCATAATTATATCT ATACTTAGTCAAAATCATCATAAAATTTACCTACAAGACCATTTAGATCTCACCTG ATTAAGATTTGTTGGTTACTCGTAATCCCTTGAA CTAAGGTGTAACATCTTAACCCCTCCTTTTGAGTATTTATACCATCATATTTTGAA ACTTCTCGTAGGTTCATATGTTTCTTTTGGTACT TGTTAGTATAGCTTGGAGTGGGACCCAAGGGGCTCCAGTGAGTTCTAGACAAGAAA AACGAGATTTGAACATTGCAGATTTTATGTTTTC TGGT Secuencia inversa CTTTGTTTGCTTGCAAGACAGAGATTTATACACGCTAATGCTATCTTTTTGTGTCA TTAACAGCTAGTTTGATTTGCTTGGTTAATACAG TTATGGTAGATAGAGAAGATAGTTTCAAAATAGAAAGAATGATGTAGACAGCATTA ATGAATCTTTCTCCTTACAATTGTACCTTTGACA AGGAATCCACCTTTTATAGGTAGTTTGGTGAGTTTGATGGAAGATTGTGGTTGAAT CTGGTTGAGTCATAGACACTACTTGTACATTCTT TTATGACACTGACTTGATGTTGTAAGAGTGAAATGTATAGACTTATCAACAAATAA CAGAGTAG'AAATAAAAGTAGGTTGAAGATAGCTT CTTGTTTGGTTCTAACTTGCTCCTTTGTTGACTGATATGATAACATTGTGTCAATA TAAGATGATTCAAAATGTTGCCTGAATTTTTATG AAAFTGATATTCATCGTCCAGTTTAGAGAGTTCT Tomate-EXPEN 2000 (S. lycopersicum LA925 x S. pennellii LA716 tipo F2.2000) Tabla 25 TG393 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: TG393 Tamaño del inserto: 1200 Vector: pGEM4Z Sitio de corte: PST1 Resistencia a fármaco: AMP Secuencia delantera ACTGACTAAGCTGCTGGATTTGATTAGCCGAAGGAATTTACTTTTGGTTACATCTT GCTCCATCACCTTTGTCTTTATCTAGGTCAATCT TGTACCATAGATGCAAATAACACTATGAACAGATTAACAATGTCTTGAGGAGGATT AGGCTGTCAACAGCCTGCATAATAACAGGAACAA CATTGGCGTTTGTTTGCATCAGTTACTGTGACTCTGATTAAAGGAGAAAATGTGGC ATCCTCTGCTTATACTGTCAGTGTGTATACTTGT CAGGTTAAGTTGGTTGCTATAATCTTTAATAATTCTTGATTTTGTGGTTGTTTCTG AAGTAAATTGATATGTGGGCCTTTGAGCTGGAGG AGATGGTACTTTAGCTATTCACTAACAATCGTTTACCTTAAAAATGTTATTCTGTA AGTATCTAACCAAATTCTGATCAC Secuencia inversa TGCAGACACCAAAGAAACAATTGGTTATATAAAAAACAATCCACAATCATTCTCTA TAGAAGTCACGCAAAGACACTACATAACCTCCAA GTGCAATGAAGAGGATGCAGAATAAGAAGCTCAGAACTTCCAAAAGAAAAGGTGAC TGAAAATAAGTTTGCTGAAAAGGTACAAGGCAAG TTCTAATTCTCAACTAGCTTTAGGTATACACTAAAGAAAAGGAAAATAAATTCCAA ACAGAAGTTTCCATCCTACCTAGTACATAAAAGA AAAAGGTAAAAAGGAACATATGGAAGTGTTCCCCTGTTACCTAAACTTTTGGTGAT AAACAGTAATCATGATTACCCCCACCTCACACAC CACCACTACAGCACAAAAATTAGAAATGTTGTATGGACCATGATCAACCAGCCAAG AATCCCAGAAGGAGAATAAAGGAGTTCTCTTAAT CACAAGAGGAGAATATCATCTACT Tomate-EXPEN 2000 (S. lycopersicum LA925 x S. Pennellii LA716 tipo F2.2000) Tabla 26 CT19 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: CT19 Tamaño del Inserto: 300 Vector: pCRIOOO Sitio de corte: Hindl I I /EcoRI Resistencia a fármaco: KN Secuencia delantera Secuencia inversa GCCCCAAAACTCCTGCTGGATTTTACTGGATCTCCACTTGCTGCGGACATTGCTTG CCTCCGACAATCATCTTCCCAACTTCTTCCTTTT TGTCTTGAAATTAATCCCTTGTACCCATTGCTGCTTCTAAATGACCTCCTGCATCC CGGCGGATCCACTAGGTCTA'AAGCTGCCGCCCCC Tomate-EXPEN 2000 (S. lycopersicum LA925 x S. pennellii LA716 tipo F2.2000) Tabla 27 TG68 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: TG68 Tamaño del inserto: 1900 Vector: pUC Sitio de corte: EcoRI Resistencia a fármaco: AMP Secuencia delantera GGATTTTGATGAACTTGTATCTGTGCTTCTAGCTCCACCTAGGATGAGTTTGGATT TGTACGATTAACAAATGTTTGAGCTGAAAGAATT AAATTTGATTACACCTGCCTTTACATATTTTTGTTGCGTAAGGATTTTCTATGAAG AATATATATGTATGTATGTGTAAAGGATGCACTA AGCATCTCGCATTTTGATAAAGAAATGAACTTTGGGCTTAACTCAACTCCAAAAGT TAGCTCATGAAGTGAGGATATCGCGTAAGACCGT ATAAGGAGACCTAGAACCCATCCCACAACAATGTGTGACTCCAACACATTCACGCA AGTTCTGGGGAAGGGTTGCACTCGTAAGGGTTGT GATGTAGGCAGCCATAATTGTGTGTACCCATTCGTTAGAAAACTACACTGTGCAAG TGGAGTTAAATTGTATCTTTTTTGGTTTTGTGTG AGTTGTTCAATCCCCTTGACATGAAAAAAAGAAGCAAAATTCAAGTATAATGGTAA AAGGGGATTCAAAAT Secuencia inversa TTGGGTCAGCCATAGTACTTCGTGATATATCTCTGACAGAAGATATCTGCTCAAGA CCATGAACAATACGGAGACATAAGAAGGAAAGAA GTTCAGTGCAGCACAAAATTTTAATAAGTT'AACTTAAAGGGGGATAAGAGGCAAAA CCAATATAAAAGTTTGGACAGACAAATTTTAATT AGTATCAAAGAGTGAATGATGCTAAAAGAAGAGATGCTTAAATATCTGATACTATA AAGTAAGCCATGACTAATTGGTAATTATGAATGG CATATGATACGACTATCAGTTTTGACTGTTGTCTACAATAATGATTTCAGAAACAT ATGATATATTTCAAATAGAATTGAATAACAACAC TTGTTCAAATACCTAGCTCTCGGAGGCAGATCCAGAATTTTAGAAAGTGGGTGCAG TAAATCACAAGAGTACACCTCTGCTAGAATGGGT GTGTACTGTAACAAAACCTGTTTTGATATGCATAT Tomate-EXPEN 2000 (S. lycopersicum LA925 x S. Pennellii LA716 tipo F2.2000) Tabla 28 TG565 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: TG565 Tamaño del inserto : 1700 Vector: pGEM4Z Sitio de corte: PST1 Resistencia a fármaco: AMP Secuencia delantera ACTAGCATCTCTTGGAGGATGCTGAGGTGTCTAGTGGTGTTGACCACTCGTTACCA CTGATTCACAGCTGGTGTCTTTCGAAGCAAGCTT CGTCTGCAAAACAAGAATCACACTTTAATCCTCTGTTACCTAAAAACAATAGTTGT TTGATGTAATGAAAGAAGAATTTTCACTTCAATG ATGGAAAGAAAATCTTACAGTTTGAGTTTGCTTGCGAAAGTAGCCATTTTCATACA CCAGTTGAGAAACTTGCTTCTGCAATCTATCATT CTCTTCCATTAATAGCTTGTTCATTGCTGACAGCTTCCTATTCACACCCTGAAGCC TTGATGACTCTTTCCTCTGTTTTTCCCTACATCT ATACAACTCAAAGAAACAATCAATTATACTTCAAATTAATTGGGGTCGCTAAAAAT GAATCCTTTAGACTAACAACATCCCACAAGTCCT TACCCCTACCTCGCAGAGGTAGAGA Secuencia inversa TCAGCAAAATGTCACACAGAGAGTACAGTAGTAGAGCACAGTAGAGTAGGGAGAAG TTGCCTCAAAAGAGGAAAAGAAAAGGTAACGAAC CACACATTTGACAGCTCAAAACCACTTTACCAATCCAAACAAAAAATCATCACATT ATCCCTCCCTTCTCTCCTTTCTCTATTACTCTCA TTTTCCCCAAGTTTCAGGTACCTTTTTCCTAACATAATCCGCCCATAGTGTTCATC ATTCAAGATCTGTCCTTTTGAGGAGACTTCATTC CTTACTATGGTCTTCTTTTTTTGATGATTTCTTATGTGAGATGTTGAAAACTGGAA AGAAGTGATAAAGATAGGAGGTTTGGTTTCTGGG GTTTGTTTATTTTGCTTTACAAGGGTTAAAGATTGGATCTTTTTTAGTTTTGGTAG ATACCCATGTCTAATCTTGTTTCAGAATTCAAAA GGTTGGTACTTTACTGTTTTGCAAGTGGATGACAGAGGAG Tomate-EXPEN 2000 (S. lycopersicum LA925 xS. pennellii LA716 tipo F2.2000) Tabla 29 TG296 Marcador de RFLP Información de RFLP Nombre: TG296 Tamaño del inserto: 1100 Vector: pGEM4Z Sitio de corte: PST1 Resistencia a fármaco: AMP Secuencia delantera TTAGGTTTTTGTGTGGTTCAACGTTTTTGGTTTTGATTTTTATGTGTTTTCTTAGT TCCTTGCTTCACCATTTTGATGGTATTTTGAGTT TTTGATGTTCTGTCGGCATAAAGTAGTGATTTTTCAGACAGTTTGGTATTATGGAG TATGTTTCTTTGCTCTTCTCTAATTTGGATTGGT TCTGATTTGTATATGCTTGTTTTAGTTTCGATGGTTTTTGAGTTTTTGATGATTCA TTGGCACAAAGTAGTGATTTTTCAGACTGTTGGG TTTTGTGGGGTTCCCGTGCTTGCTCTTCACTAATTTGGATTGGTTCTGATTTGTAT ATGTTTTAGTTTTGATGGTTTTTGAGTTTTTGAT GATTCATCGGCACAAAGTAGTGATCTTTCAGACAGTTGGGTTTTGTGGGGTTCACG TGCTTATTCTTCACTATTCTCGGTTGGTTTGATT TGTAGGTCCGTTTTAGCAT Secuencia inversa AGAATATAACAAAAAAGCAGATAAATCAGTTAATTATGCCTCAATCTCAACAAGTG AATAACAAATCCTATCAGAAGATATAGTAGACGA TAAACAGTGAAGGTAGAAGCCTAACTCTATGACATTATCTTGAGACCCAAAACACT TCATCAAAGACTCAAAAGAAATAATTTGTTCACC AAGTACTATTAACTAATTATCAAAACTAGAATTCTCAAAATAAAAAATAACAAATC TTATCAGTCACATGGACATTCATTAAACATCATG AAGAAGACAACAAGGGAAGGTCAAAACTGGACTCCATGGCACATAAGATAATAACA AAAGGTAGTTTAAGGCCTAAAACACTTCAAAAAT AAAATTTATTCACCAGATATCAATAATATTATCTGTTCTTCCTTCATTCATGAGGG GCATGCACAAGAGACAATATACATCATTTCTCCT TTTACTTTTTCTTTCCTGAGGAAGTAAAAGGAGCAGAAAGCAGATAGAAAGA Tomate-EXPEN 2000 (S. lycopersicum LA925 x S. pennellii LA716 tipo F2.2000) Tabla 30: Secuencias cebadoras, longitudes de los productos de PCR y enzimas que revelan un polimorfismo para los Tabla 31. Tabla de tamaños de alelos encontrados en los polimorfismos de la Tabla 30, cuando son cortados con la(s) misma (s) enzima (s).

* SL = Solanum lycopersicum. SH = Solanum habrochaites . En plantas heterocigotas son encontrados productos digeridos de SL y SH. En la Tabla 30 y en la Tabla 31 la longitud del producto de PCR observado es estimada a partir de las bandas del gel de agarosa Referencias Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JGr, Smith JA, Struhl K. (1995) . "Current Protocols in Molecular Biology", 4th edition, John Wiley and Sons Inc., New York, N. Y. Bai YL, Huang CC, van der Hulst R, Meijer Dekens F, Bonnema G, Lindhout P (2003) QTLs for Tomate powdery mildew resistance (Oidium lycopersici) in Lycopersicon parviflorum G1.1601 co-localize with two qualitative powdery mildew resistance genes. Mol. plant microbe interactions 16:169-176. Benito EP, ten Have A, van ' t Klooster JW, van Kan JAL (1998) Fungal and plant gene expression during synchronized infection of Tomate leaves by Botrytis cinérea. Eur. J. Plant Pathol. 104:207-220. Bernacci D, Tanksley SD (1997) An interspecific backcross of Lycopersicon lycopersicum x L. hirsutum: Linkage analysis and a QTL study of sexual compat ibility factors and floral traits. Genetics 147:861-877. Brugmans B, van der Hulst RGM, Visser RGF, Lindhout P, van Eck HJ (2003) A new and versatile method for the successful conversión of AFLP (TM) Marcadors into simple single locus Marcadors. Nucleic acids research 31: Nil_9-Nil_17 Canady MA, Meglic V, Chetelat RT (2005) A library of Solanum lycopersicoides introgression lines in cultivated Tomate. Genome 48: 685-697 Christou P, Murphy JE, and Swain WF (1987) Stable transformation of soybean by electroporation and root formation from transformed callus. Proc. Natl. Acad. Sci . USA 84:3962-3966. Churchill GA, Doerge RW (1994) Empirical threshold valúes for Quantitative trait mapping. Genetics 138: 963-971. Deshayes A, Herrera-Estrella L, Caboche M (1985) Liposome-mediated transformation of tobáceo mesophyll protoplasts by an Escherichia coli plasmid. EMBO J. 4 : 2731-2737. , D'Halluin K, Bonne E, Bossut M, De Beuckeleer , Leemans J (1992) Plant. Cell 4:1495-1505. Dik AJ, Koning G, Kohl J (1999) Evaluation of microbial antagonists for biological control of Botrytis cinérea stera infection in cucumber and Tomate. Eur. J. Plant Pathol. 105:115-122. Doganlar S, Frary A, Ku HM and Tanksley SD (2002) Mapping Quantitative Trait Loci in Inbred Backcross Lines of Lycopersicon pimpinellifolium (LA1589) . Genome 45:1189-1202. Draper J, Davey MK, Freeman JP, Cocking EC and Cox BJ (1982) Ti plasmid homologous Secuencias present in tissues from Agrobacterium plasmid-transformed Petunia protoplasts. Plant and Cell Physiol. 23:451-458.

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Claims (22)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para producir una planta de tomate resistente a Botrytis, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar una planta de tomate donante resistente a Botrytis, preferentemente una planta resistente a Botrytis de la especie S. habrochaítes, más preferentemente una planta resistente a Botrytis de la linea S. habrochaítes LYC 4/78; b) transferir el ácido nucleico desde la planta donante hacia una o más plantas de tomate recipientes, susceptibles a Botrytis, preferentemente una planta de la especie S. lycopersicum, en donde la transferencia da como resultado la introducción de material genómico proveniente de la planta donante en la región correspondiente del genoma de una o más plantas recipientes susceptibles; c) seleccionar de entre las plantas de tomate recipientes una planta que comprende dentro de su genoma al menos un QTL para la resistencia a Botrytis derivada de la planta de tomates donante resistente a Botrytis, en donde la selección comprende la detección sobre el cromosoma 4, 6, 9, 11 y/o 12 de la planta de tomate recipiente, de al menos un marcador genético vinculado a al menos a un QTL para la resistencia a Botrytis , en donde la posición del QTL sobre el cromosoma 4 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos CT50, C2Atlg74970, P14M49-283e, P14M48-74e, P14M50-67e, CT1739 y P14M50-85h sobre el cromosoma 4 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 4 de S. lycopersicum,
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la posición del QTL sobre el cromosoma 6 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P22M50-188h, P14M48-521e, P15M48-386h, P18M51-199h, P18 51-103h, P22M50-103e, P18M51-388e, P15M48-395e, P22M50-124e, P14M48-160e y P22M50-513h sobre el cromosoma 6 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 6 de S. lycopersicum, - en donde la posición del QTL sobre el cromosoma 9 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P18M50-141, P14M49-240, TG254, TG223, TG10, P18M50-134h, P14M49-243h, P18M50-599, P14M60-222h, P22M51-417h, P14M50-174h, P14M60-157h, P14M60-107h, P15M48-138h, P14M48-113h, Tm2a, P18M51-146h, P14M48-282h y P14M50-276h sobre el cromosoma 9 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 9 de S. lycopersicum, en donde la posición del QTL sobre el cromosoma 11 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P14M60-215e, P14M61-173h, P14M50-307h, TG47, P14M50-29xCD, P18M51-358h, P18M50-27xCD, P18M51-136h, P22M50-488h, TG393, P14M61-396h, P22M51-235h y P22M51-174e sobre el cromosoma 11 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 11 de S. lycopersicum, y en donde la posición del QTL sobre el cromosoma 12 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos CT19, TG68, P14M48-411e, P18M50-244h, P18M50-273h, P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14 60-219e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, P22M50-131h y P22M51- 135h, preferentemente por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-2X9e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, y P22M50-131h sobre el cromosoma 12 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 12 de S. lycopersicum,
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 , caracterizado porque la transferencia del ácido nucleico que comprende al menos un QTL para la resistencia a Botrytis, o una parte del mismo que confiere resistencia a Botrytis, puede ser muy adecuadamente realizada mediante la cruza de la planta de tomate donante resistente a Botrytis con una planta de tomate recipiente susceptible a Botrytis , para producir plantas de progenie que comprende el QTL como una introgresión, y en donde el paso c) es realizado sobre una o más plantas de progenie.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la transferencia del ácido nucleico que comprende al menos un QTL para la resistencia a Botrytis , o una parte del mismo que confiere resistencia a Botrytis , es realizada mediante métodos transgénicos (por ejemplo mediante transformación), mediante fusión de 0 protoplastos , mediante una técnica de haploide duplicado o mediante rescate de embriones.
5. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el paso c) es realizado mediante la detección del marcador genético en el 5 ADN aislado de las plantas de tomate recipientes.
6. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el paso c) comprende además someter las plantas a un bioensayo para medir la resistencia a Botrytis en las plantas. 0
7. 7. El método de conformidad con cualquiera de las ' reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el paso c) comprende además la selección de una planta que comprende dentro de su genoma al menos un QTL para la resistencia a Botrytis, seleccionado de los QTLs localizados sobre el 5 cromosoma 1, 2 y 4 de S. habrochaites LYC 4/78 en donde la posición del QTL sobre el cromosoma 1 de la planta es indicada por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P22M50-412h, P14M50-349h, P14 60-69h, P14M49-192h, P14M49-232h, P14M49-260e, P14M50-503h, Pl 8M50-124h y P14M49-114h sobre el cromosoma 1 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 1 de S. lycopersicum, en donde la posición del QTL sobre el cromosoma 2 de la planta es indicada por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P14M60-537h, P15M48-257e, P14M49-327h, P14M49-325h, P14 61-286e, P14 61-125h, P18 51-134h y CT128 sobre el cromosoma 2 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 2 de S. lycopersicum, y en donde la posición del QTL sobre el cromosoma 4 de la planta es indicada por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P18M51-169.5e, P18M51-305.4h, P14M60-262.9e, y P14M61-292.7h sobre el cromosoma 2 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 2 de S. lycopersicum .
8. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el paso c) comprende la selección de: una planta que comprende dentro de su genoma al menos 4 QTLs para la resistencia a Botrytís, seleccionado del grupo que consiste de los QTLs de conformidad con las reivindicaciones 1, 2 y 7, o - una planta que comprende dentro de su genoma al menos 2 QTLs para la resistencia a Botrytis, seleccionado del grupo que consiste de los QTLs de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2.
9. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque comprende además el paso d) de cruzar la planta seleccionada en el paso c) con una planta de una linea de tomate para producir plantas de progenie .
10. 10. Una planta de tomate resistente a Botrytis, o parte de la misma, caracterizada porque es obtenible mediante un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
11. 11. Un QTL para resistencia a Botrytis en S. lycopersicum, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de los QTLs sobre los cromosomas 4, 6, 9, 11 y 12 de Solanum habrochaites LYC 4/78 asociados con la resistencia a Botrytis como se define de conformidad con la reivindicación 1 ó 2.
12. 12. Una muestra de ADN aislada, caracterizada porque es obtenida a partir de una planta de tomate de la especie S. lycopersicum que comprende un QTL de conformidad con la reivindicación 11.
13. 13. Un método para detectar un QTL para la resistencia a Botrytis , caracterizado porque comprende detectar al menos un marcador genético vinculado a QTL para la resistencia a Botrytis, derivado de S. habrochaites LYC 4/78 sobre los cromosomas 4, 6, 9, 11 y/o 12 de una planta de tomate que se sospecha que es resistente a Botrytis , en donde la posición del QTL sobre el cromosoma 4 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos CT50, C2Atlg74970, P14 49-283e, P14M48-74e, P14 50-67e, CT1739 y P14M50-85h sobre el cromosoma 4 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 4 de S. lycopersicum, - en donde la posición del QTL sobre el cromosoma 6 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P22M50-188h, P14M48-521e, P15M48-386h, P18 51-199h, P18M51-103h, P22M50-103e, P18M51-388e, P15M48- 395e, P22M50-124e, P14M48-160e y P22M50-513h sobre el cromosoma 6 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 6 de S. lycopersicum, en donde la posición del QTL sobre el cromosoma 9 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P18M50-141, P14M49-24Q, TG254, TG223, TG10, P18M50-134h, P14M49-243h, P18M50-599, P14M60-222h, P22M51-417h, P14 50-174h, P14M60-157h, P14 60-107h, P15M48-138h, P14 48- 113h, Tm2a, P18M51-146h, P14M48-282h y P14 50-276h sobre el cromosoma 9 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 9 de S. lycopersicum, - en donde la posición del QTL sobre el cromosoma 11 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P14M60-215e, P14M61-17 3h , P14M50-307h, TG47, P14M50-29xCD, P18M51-358h, P18M50-27xCD, P18M51-136h, P22M50-488h, TG393, P14M61-396h, P22M51-235h and P22M51-174e sobre el cromosoma 11 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 11 de S. lycopersicum, y en donde la posición del QTL sobre el cromosoma 12 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos CT19, TG68, P14M48-4 1 1 e , P18M50-244h, P18M50-273h, P14M61-42Qh, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48- 153h, P22M50-97h, TG296, P22 50-131h y P22M51-135h, preferentemente por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, y P22M50-131h sobre el cromosoma 12 de S. habrochaites o sobre el cromosoma 12 de S. lycopersicum .
14. 14. Una planta resistente a Botrytis de la especie S. lycopersicum, o una parte de la misma, caracterizada porque comprende dentro de su genoma al menos un QTL, o una parte del mismo que confiere resistencia a Botrytis, en donde QTL se selecciona del grupo que consiste de los QTLs sobre los cromosomas 4, 6, 9, 11 y 12 de Solanum habrochaites, asociados con la resistencia a Botrytis, en donde la posición de QTL sobre el cromosoma 4 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos CT50, C2Atlg74970, P14M49-283e, P14M48-74e, P14M50-67e, CT1739 y P14 50-85h sobre el cromosoma 4 de S. habrochaítes o sobre el cromosoma 4 de S. lycopersicum, en donde el QTL o la parte del mismo que confiere resistencia a Botrytis no está en su antecedente genético natural, y en donde la planta comprende además opcionalmente uno o más QTLs adicionales, o partes de los mismos que confieren resistencia a Botrytis, asociados con la resistencia a Botrytis seleccionados de los QTLs sobre los cromosomas 1, 2 y/o 4 de Solanum habrochaítes, preferentemente de Solanum habrochaítes linea LYC 4/78, en donde la posición del QTL adicional sobre el cromosoma 4 de la planta es indicado por una región genómica que comprende los marcadores genéticos P18M51-169.5e, P18M51-305. h, P14M60-262.9e, P14M61-292.7h, TG609, P14M48-345e, P14M48-177e y P18M50-147e sobre el cromosoma 4 de S. habrochaítes o sobre el cromosoma 4 de S. lycopersicum, más preferentemente sobre el cromosoma 4 de S. habrochaítes LYC 4/78 o sobre el cromosoma 4 de S. lycopersicum variedad Moneymaker.
15. 15. La planta de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la posición de los QTLs sobre los cromosomas 1, 2, 6, 9, 11 y/o 12 es como se define de conformidad con las reivindicaciones 1, 2 y/o 7.
16. 16. Un método para producir una planta de tomate endogámica resistente a Botrytis , caracterizado porque comprende : a) producir una planta de tomate resistente a Botrytis de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 9; b) cruzar la planta de tomate resistente a Botrytis consigo misma o con otra planta de tomate para producir semillas de tomate de progenie; c) desarrollar la semilla de tomate de progenie del paso anterior para producir las plantas de tomate adicionales resistentes a Botrytis ; d) repetir los pasos de cruza y desarrollo de 0 a 7 veces para generar una planta de tomate endogámica resistente a Botrytis .
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el paso c) comprende además el paso de identificar las plantas que muestran resistencia a Botrytis y poseen características comercialmente deseables.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque comprende además el paso de seleccionar las plantas de tomate endogámicas homocigotas.
19. 19. Una planta de tomate endogámica resistente a Botrytis, o partes de la misma, caracterizada porque es obtenible mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.
20. 20. Una planta de tomate híbrida, o partes de la misma, que muestra resistencia a Botrytis , caracterizada porque es obtenible mediante la cruza de una planta de tomate endogámica resistente a Botrytis, obtenible mediante un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 con una planta de tomate endogámica que muestra características comercialmente deseables.
21. 21. Un cultivo de tejidos de células regenerables de las plantas de tomate de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10, 14, 15, 19 ó 20, caracterizado porque las células regenerables comprenden preferentemente células o protoplastos aislados de un tejido seleccionado que consiste de hojas, polen, embriones, raíces, puntas de raíz, anteras, flores, frutas y tallos y semillas.
22. 22. El uso de un marcador genético seleccionado del grupo que consiste de marcadores genéticos de las Tablas 1-5 para la detección de los QTLs para la resistencia a Botrytis , y/o para la detección de plantas de tomate resistentes a Botrytis .