MX2008013513A - Metodo de produccion de anticuerpos en animales inmunodeficientes inyectados con celulas madre hepaticas fetales de humano. - Google Patents

Abstract

La actual invención se relaciona con un método para la producción de un anticuerpo monoclonal de humano de un animal no humano inmunodeficiente, el método comprende poner en contacto un animal no humano inmunodeficiente recién nacido con una célula madre hepática fetal humana (célula FL) para generar un animal no humano transplantado inmune (animal reconstituido), posteriormente poner en contacto el animal reconstituido con un antígeno, recolectar del animal reconstituido una célula humana que produce anticuerpo humano contra el antígeno, y aislar el anticuerpo de la célula que produce el anticuerpo.

Description

METODO DE PRODUCCION DE ANTICUERPOS EN ANIMALES INMUNODEFICIENTES INYECTADOS CON CELULAS MADRE HEPATICAS FETALES DE HUMANO Campo de la invención La presente invención se relaciona con métodos para la producción de anticuerpos, composiciones de células que producen anticuerpos, métodos para su producción y usos de las mismas .

Antecedentes de la invención Los anticuerpos monoclonales (MAB) se han considerado largo tiempo como medicamentos que todo lo curan en inmunoterapia del cáncer, infección o enfermedad autoinmunitaria etc. Sin embargo, la primera generación de anticuerpos de murino que se usan en humanos fue menos exitosa debido a las respuestas humanas inmunes anti-ratón. Los anticuerpos humanos se han derivado la mayoría de las veces del alojamiento de ratones transgénicos un conjunto restringido de genes Ig humanos o seleccionados de grandes genotecas artificiales de anticuerpos que usan expresión en fagos, expresión el levadura o tecnologías recombinantes similares. Estas estrategias se han diseñado para eliminar cualquier raección inmunitaria contra el anticuerpo monoclonal en el antecedente humano. Los anticuerpos humanos Ref. 195944 pueden producirse en animales transgénicos (p.ej., ratones) que son capaces, con la inmunización, de producir anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. La transferencia del orden génico geminal de inmunoglobulina de humano en estos ratones transgénicos geminales originan la producción de anticuerpos de humano con el reto del antígeno (véase, p.ej., van Dijk, M.A. and van de inkel, J.G., Curr . Opin. Chem. Biol . 5(200) 368-374; Jakobovits, A., et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M. , et al., Year Immunol . 7 (1993) 33-40). Los anticuerpos humanos también pueden producirse en genotecas de expresión en fagos (Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks , J.D., et al., Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Las técnicas de Colé et al., and Boerner et al., también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., Monoclonal antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); and Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Sin embargo estos ratones transgénicos solo son capaces de proporcionar anticuerpos con un grupo restringido de genes Ig de humano - aquellos que resultan del orden génico de inmunoglobulina transíectada . Las metodologías con base a ratones transgénicos con genes de inmunoglobulina humana han permitido la generación de anticuerpos derivados de la secuencia génica germinal humana, las cuales han reportado una reducción de la inmunogenicidad de los fármacos de anticuerpos resultantes preparados para anticuerpos quiméricos de murino o ratón humano. Sin embargo, los anticuerpos humanos derivados de ratón transgénico se limitan a su diversidad, afinidades y especificidades comparadas con los repertorios inmunes humanos naturales . Similarmente, la principal desventaja de las investigaciones de la genoteca combinatoria a base de expresión en fagos o expresión en levadura es el apareamiento aleatorio de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo. La disociación del apareamiento de la cadena pesada y ligera de anticuerpo, apareamiento no cognado, necesita el tamizado de un gran número de clones a fin de identificar los pares de cadenas pesadas y ligeras de gran afinidad. Además, estos pares no cognados puede mostrar reactividad cruzada indeseable con los autoantígenos humanos. Finalmente, la diversidad genética de los ' anticuerpos blancos-específicos identificados por la selección y tamizado de genotecas combinadas se limita comúnmente debido a los sesgos inherentes en la selección. Traggai, E. et al., Science 304 (2004) 104-107 describe un método para el desarrollo de un sistema inmunitario humano en Rag 2-/-yc-ratón transplantado con células sanguíneas del cordón umbilical humano, que pueden usarse como un modelo pre-cl nico para evaluar las respuestas a las vacunas o patógenos infecciosos hepáticos y con compuestos farmacológicos que tienen como blanco el sistema inmunitario humano. Se mostró que los ratones reconstituidos y posteriormente vacunados con patógenos pueden producir bajos niveles de respuesta al toxoide tetánico especifico.

Breve descripción de la invención La invención comprende un método para la producción de anticuerpo monoclonal humano de un animal no humano inmunodeficiente, el método comprende poner en contacto un animal no humano inmunodeficiente recién nacido con una célula madre hepática fetal humana (célula FL) para generar un animal no humano transplantado inmune (animal reconstituido) , posteriormente poner en contacto el animal reconstituido con un antígeno, recolectar del animal reconstituido una célula humana que produce anticuerpo humano contra el antígeno, aislar el anticuerpo de la célula que produce el anticuerpo. La invención preferentemente comprende un método de acuerdo con la invención, se caracteriza en establecer la célula que produce el anticuerpo una célula que produce un anticuerpo inmortal preferentemente por un método de transformación o método de fusión celular. Preferentemente la célula inmortal es capaz de estar viable durante al menos 50 pasos . Preferentemente el animal no humano es un roedor y más preferentemente un ratón, rata o conejo. Se prefiere más que el ratón sea un Rag 2- /-ye-, Rag 2-1- lampiño, NOD (significa de acuerdo con la invención preferentemente NOD . Cg-RagltmlMom Prfltmlsdz/SzJ) o SCID ratón beige y la rata es una rata lampiña . La invención comprende un método de acuerdo con la invención, se caracteriza en que la célula FL es una célula madre hepática fetal hematopoyética humana (célula HFL) , preferentemente CD133+, CD117+, CD31+ y y/o CD34+. En otra modalidad el método preferentemente se caracteriza en que la célula FL es una combinación de una célula HFL y una célula madre hepática fetal no hematopoyética humana. La invención comprende un método de acuerdo con la invención, se caracteriza en que la célula que produce anticuerpo es una célula B humana. La invención comprende un método de acuerdo con la invención, se caracteriza en que la célula FL es para inyectarse por contacto i.p., s.c, o intrahepática dentro del animal . La invención comprende un método de acuerdo con la invención, se caracteriza en que el antígeno es un polipéptido, un complejo MHC/péptido o ADN. La invención comprende un método de acuerdo con la invención, se caracteriza en que el antígeno está en contacto con el animal reconstituido como antígeno, fragmento de antígeno, ADN que codifica el antígeno y/o célula que porta el antígeno. La invención comprende un método de acuerdo con la invención, se caracteriza en que el animal no humano deficiente en inmunidad se irradia por debajo de los niveles letales antes de ponerse en contacto con la célula FL. La invención comprende un método de acuerdo con la invención, se caracteriza en que el ratón se pone en contacto la primera vez con en antígeno 5 a 18 semanas después de ponerse en contacto el ratón con la célula FL. La invención comprende un método de acuerdo con la invención, se caracteriza en que el ratón se pone en contacto hasta diez veces con el antígeno. La invención comprende un método de acuerdo con la invención, se caracteriza en que la célula recolectada es una célula humana CD19+ ó CD22+. La invención comprende un método de acuerdo con la invención se caracteriza en que la célula se establece por tecnología de hibridoma. La invención comprende un método de acuerdo con la invención, se caracteriza en que la línea celular compañera de fusión es una línea celular MFP-2, HK-128, K6H6/B5 o Karpas 707. La invención comprende un método para la producción de una pluralidad de células B humanas que producen una completa pluralidad de anticuerpos humanos contra un antígeno, el método se caracteriza por poner en contacto un animal no humano deficiente en inmunidad recién nacido con una célula FL para generar un animal inmuno reconstituido, posteriormente poner en contacto al animal reconstituido con un antígeno, recolectar las células B humanas que producen la completa pluralidad de anticuerpos. La invención comprende el uso de un animal no humano para la producción de una célula inmortal que produce antígeno de acuerdo con la invención. Si la célula inmortal es una célula hibridoma, un compañero de fusión para la generación de hibridoma es una célula B humana del animal transplantado y reconstituido, el otro compañero de fusión es una célula mieloma, p.ej., de humano, roedor u otro animal. Alternativamente, las células B inmortales transplantadas y reconstituidas se generan por transformación EBV. La invención comprende una pluralidad de células B humanas que producen, una completa pluralidad de anticuerpos humanos contra una proteína humana. La invención comprende una composición de células inmortales que proporcionan una completa pluralidad de anticuerpos humanos contra una proteína humana. La invención comprende el uso de un animal reconstituido para la producción de una pluralidad de células B inmortales, que producen una completa pluralidad de anticuerpos humanos contra una proteína humana. La invención comprende un método para la generación y producción de un anticuerpo humano monoclonal en un animal no humano, el anticuerpo se dirige contra una proteína humana (incluyendo fragmentos) que es al menos 80%, (BLAST) homologo con la proteína correspondiente del animal no humano. Un ejemplo de este es CXCR5. Humano y murino CXCR5 son 84% homólogos. Por lo tanto la invención proporciona un método para generar anticuerpos humanos contra proteínas altamente conservadas, o regiones de proteínas, aun si la proteína o fragmento de esta es al menos 95% o más homólogo entre el humano y el animal no humano o aun 100% de homología. Por lo tanto otro objetivo de la invención es un anticuerpo humano monoclonal específico para una proteína humana que tiene al menos 95%, preferentemente 98% y aun 100% de homología (BLAST) con la correspondiente proteína de un animal no humano preferentemente ratón, rata y/o conejo. Otro objetivo de la invención es un anticuerpo humano monoclonal específico para una proteína humana que tiene al menos 95%, más preferentemente 98% y aun 100% de homología (BLAST) con la correspondiente proteína de murino (ratón) .

La invención comprende un método para la producción recombinante de un anticuerpo, se caracteriza por poner en contacto un animal no humano inmuno-deficiente recién nacido con una célula FL, posteriormente poner en contacto al animal no humano con un antígeno, recolectar del animal no humano una célula humana que produce anticuerpo humano contra el antígeno y aislar el anticuerpo, secuenciar las regiones variables, construir el/los vector (es) de expresión que codifican las cadenas pesadas y/o ligeras en al menos CDRS, combinada con una cadena constante humana, expresar el /los vector (es) en célula (s) huésped apropiada (s) y aislar el anticuerpo (proteína inmuno-reactiva) de la(s) célula(s) huésped o sobrenadantes de fermentación. La invención comprende un método para la producción recombinante de un anticuerpo, se caracteriza por poner en contacto un animal no humano inmuno-deficiente recién nacido con una célula FL, posteriormente poner en contacto al animal no humano con un antígeno, recolectar del animal no humano una célula humana que produce anticuerpo humano contra el antígeno y aislar el ARNm de la célula humana que produce el anticuerpo humano, generar el ADNc específico del anticuerpo (p.ej., con uso de cebadores específicos de inmunoglobulina) , construir el/los vector (es) de expresión que codifican las cadenas pesadas y/o ligeras en al menos CDRS, combinada con una cadena constante humana, expresar el /los vector (es) en célula (s) huésped apropiada (s) y aislar el anticuerpo (prote na inmuno-reactiva) de la(s) célula (s) huésped o sobrenadante de fermentación. La invención comprende un método para la selección de una célula inmortal que produce un anticuerpo humano que muestra el enlace específico con un antígeno, el método que se caracteriza por proporcionar una pluralidad células B humanas del bazo o de un animal no humano que produce una completa pluralidad de anticuerpos humanos, fusionar las células o un subconjunto con una célula mieloma inmortal o inmortalizar las células B o subconjunto por transformación EBV, y seleccionar una célula hibridoma que produce un anticuerpo humano que muestra el enlace específico con el antígeno. La invención comprende un método para la selección de una célula inmortal que produce un anticuerpo que muestra la afinidad de enlace específica al menos de 1CT6 mol/1 con un antígeno en una cantidad al menos de 1.5 pg/ml, el método se caracteriza en proporcionar una pluralidad de células B humanas del bazo de un animal no humano que produce una completa pluralidad de anticuerpos humanos, fusionar las células o un subconjunto de estas con una células mieloma inmortal o inmortalizar las células B o subconjunto por transformación EBV, y seleccionar una célula hibridoma que produce un anticuerpo humano que muestra la afinidad del enlace específico con el antígeno al menos de 1CT6 mol/1. Preferentemente, la cantidad de anticuerpo aislado es al menos de 1.5 yg/ml . Preferentemente el anticuerpo muestra una afinidad de enlace específica al menos de 1CT9 mol/1 de antígeno.

Breve descripción de las figuras Figs . 1A-1C Análisis flu ocitométrico de la sangre periférica de los ratones reconstituidos en la semana 15 después de injerto. Injerto de células hematopoyéticas de humano. Los histogramas muestran traslape de las células sanguíneas periféricas sincronizadas viables desde tres animales representativos en la semana 15 después de la reconstitución marcada con el CD45- FITC mAb antihumano (área rellena) o marcado anterior del mismo animal con mAb de control irrelevante, acoplado-isotipo (línea oscura) que se usa como histograma denominador para generar los traslapes estadísticos del histograma. Las estadísticas representan el número y porcentaje de eventos en las secciones designadas (Mi, M2 ) comparadas con el número total de eventos dentro de la barrera. Muestran los medios de intensidad fluorescente .

Fig. 1A: Histograma numerador Archivo: Sonda.002 Parámetro X: anti-hu-CD45-FITC Histograma denominador Archivo: Sonda.001 Parámetro X: anti-hu-CD45-FITC Marcador Eventos ¾ sincronizado Todos 18110 108.79 MI 16705 100.35 M2 860 5.17 Fig. IB: Histograma numerador Archivo : Sonda .004 Parámetro X: anti-hu-CD45-FITC Histograma denominador Archivo: Sonda.003 Parámetro X: anti-hu-CD45-FITC Marcador Eventos % sincronizado Todos 14622 231.91 MI 11833 187.68 M2 2136 33.88 Fig. 1C: Histograma numerador Archivo: Sonda.006 Parámetro X: anti-hu-CD45 Histograma denominador Archivo: Sonda.005 Parámetro X: anti-hu-CD45 Marcador Eventos % sincronizado Todos 4181 95.59 Mi 2992 68.40 M2 844 19.30 Figura 2 Examen de la capacidad de producción de los anticuerpos de humano en los ratones reconstituidos .

Figuras 3A-3D El análisis fluj ocitométrico de los anticuerpos específicos del antígeno de humano en sangre periférica de ratones reconstituidos en la semana 17 después de la inmunización. Se muestra la relación (%) de células positivas de antígeno marcadas con diferente dilución de suero (1/20 (Fig. 3C) y 1/150 (Fig. 3D) ) de un ratón inmunizado representativo y reconstituido comparado con el suero normal del ratón de control (NMS) como control negativo (2s histograma (Fig. 3B) ) o con los anticuerpos específicos de antígeno purificados como un control positivo (histograma superior (Fig. 3A) ) . La estadística representa el número y el porcentaje de eventos en las secciones designadas (marcadores M2 y Mi muestran células marcadas positivas o negativas para el antígeno respectivamente) comparado con el número total de evento dentro de la barrera. Muestra las intensidades fluorescentes medias.

Fig. 3A: Control positivo Histograma numerador Eventos totales: 6764 Histograma denominador Eventos totales: 7072 Marcador % sincronizado % Total Todos 95.54 95.05 MI 2.02 2.01 M2 93.55 93.07 Fig. 3B: Control negativo Histograma numerador Eventos totales: 7093 Histograma denominador Eventos totales: 7072 Marcador % sincronizado % Total Todos 95.54 99.87 MI 99.33 98.83 M2 1.08 1.07 Fig. 3C: Suero Ratón 1 (1/20) vs. NMS Histograma numerador Eventos totales: 15544 Histograma denominador Eventos totales: 7093 Marcador ¾ sincronizado % Total Todos 160.13 159.45 MI 125.33 124.80 M2 34.84 34.70 Fig. 3D: Suero Ratón 1 (1/150) vs. NMS Histograma numerador Eventos totales: 7102 Histograma denominador Eventos totales: 7093 Marcador ¾ sincronizado % Total Todos 100.03 99.61 MI 92.18 91.79 M2 7.86 7.82 Figura 4 Examen de la capacidad de producción de anticuerpos CXCR5 de humano en ratones reconstituidos. Figura 5 Examen de la capacidad de producción de anticuerpos específicos CXCRB de humano en ratones reconstituidos después de la tercera inmunización.

Descripción detallada de la invención El término pluralidad completa de anticuerpos humanos o genes de inmunoglobulina humana se refiere a anticuerpos o genes de inmunoglobulina que comprenden o que codifican - cadenas kappa al menos de 20, preferentemente 31 a 33 genes kappa en 2pll en el cromosoma 2 (76 genes, del cual 31 a 35 son funcionales) , - cadenas lambda al menos de 20, preferentemente 29 a 33 genes lambda en la posición 22qll en el cromosoma 22 y un gen J; (existen 4 a 5 genes de cadena lambda, cada uno está precedido por un gen J lambda) , y - cadenas pesadas al menos desde 5, preferentemente 9 genes pesados en 14q32 en el cromosoma 14 (11 genes de cadena pesada, 9 de los cuales son funcionales y corresponden respectivamente con 9 isotipos de cadena pesada µ, d, ??, ?2 , ?3 , ?4 ?, a2 y e ) . Por ejemplo, el antígeno puede ser una sustancia derivada del humano, como una proteína humana, una hormona, un glicolípido asociado a un tumor (p.ej., US 5,091,178) u otra sustancia involucrada en el metabolismo humano que se presenta naturalmente. El antígeno también puede ser una sustancia derivada de un no humano la cual se tolera por un ser humano sano a fin de que este humano no desarrolle anticuerpos en una forma detectable contra el antígeno. El término proteína humana (que incluye polipéptidos ) se refiere a una proteína arbitraria de un ser humano que ya sea se tolera naturalmente o se ataca en enfermedades autoinmunitarias . El término proteína humana incluye de acuerdo con el conocimiento de una persona con experiencia en la técnica fragmentos de la proteína que son capaces de inducir anticuerpos específicos para una proteína humana en el animal no humano de forma adecuada de acuerdo con la invención. Estos fragmentos pueden incluirse por ejemplo en una proteína más grande, p.ej., se sabe bien que los anticuerpos contra proteínas humanas pueden inducirse por inmunización con una proteína homologa de otras especies como el ratón. La proteína humana preferentemente es una proteína humana tolerada. El término proteína humana tolerada se refiere a una proteína de un ser humano que se tolera naturalmente y no se ataca en enfermedades autoinmunitarias como el síndrome de Goodpasture, diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), anemia hemolítica inmunitaria, purpura trombocitopénica inmunitaria, miastenia grave (MG) , esclerosis múltiple (MS) artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso (SLE) , o tirotoxicosis (enfermedad de Graves) . Por ejemplo, la proteína humana puede ser una molécula transmembrana (p.ej., receptor) o ligando tal como un factor de crecimiento. Antígenos de ejemplificación incluyen moléculas tal como renina; una hormona de crecimiento, factor de liberación de la hormona de crecimiento; hormona paratiroides ; hormona que estimula la tiroides, lipoproteínas ; alfa-l-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina, hormona estimulante del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulación tal como el factor VIII, factor IX, factor tisular (TF) , y factor von Willebrands ; factores anticoagulantes como Proteína C; factor nutriuretica atrial; surfactantes pulmonar; un activador plasminogeno , tal como uroquinasa o urina humana o activador plasminogeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RA TES (células T expresadas y secretadas normalmente reguladas con activación) ; proteína inflamatoria macrófaga humana (???-1-alfa) ; una suero albúmina tal como suero albúmina humana; sustancia que inhibe la Muellarian; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorelaxina; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNAsa; IgE; un antígeno asociado con T-linfocito citotóxico (CTLA) , tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ; receptores de hormonas o factores de crecimiento; proteínas A ó D; factores reumatoides; un factor neurotrofico tal como factor neurotrofico derivado de los huesos (BDNF) , neurotropin-3 , -4, -5 ó -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ó NT-6), un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-b; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ; factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF) ; factor de crecimiento de transformación (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, que incluyen el EGF-bl , TGF-b2 , TGF-b3, TGF-b4 y TGF-b5; factor de necrosis tumoral (TNF) tal como TNF-alfa o TNF-beta; factor de crecimiento I y II similar a la insulina; proteínas de enlace del factor de crecimiento similar a la insulina; proteínas CD tal como CD3 , CD4 , CD8 , CD19, CD20, CD22, CD40; eritropoyetina; factores osteoinductivos ; inmunotoxinas ; una proteína morfogenética ósea (BMP) ; un interferon tal como xnterferon-alfa, -beta y -gama; factores estimulantes de la colonia (CSFs), p.ej., M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (ILs), p.ej., IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, y IL-10; superoxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana superficial; factor de aceleración de decaimiento; antígeno viral, tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del SIDA; proteínas de transporte; receptores de sentamiento; diriginas; proteínas reguladoras tal como CDlla, CDllb, CDllc, CD18, un ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado con tumores tal como receptor HER2 , HER3 ó HER4; y fragmentos de cualquiera de las proteínas listadas anteriormente. Otras proteínas de humano son miembros de la familia de receptores ErbB tal como el receptor EGF, receptor HER2 , HER3 ó HER4 ; un miembro de la superfamilia del receptor de necrosis tumoral , incluyendo DR5 ; antígeno de célula madre prostética (PSCA); moléculas de adhesión celular tal como LFA-1, Macl, pl50.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, integrina alfa4/beta7, e integrina alfav/beta3 que incluye ya sea subunidades alfa o beta de estas (p.ej., anticuerpos anti-CDlla, anti-CDl8 o anti-CDllb) ; factor tisular (TF) ; alfa interferon (alfa-IFN) ; una interleucina ; tal como IL-8; IgE; antígenos del grupo sanguíneo; receptores flk2/flt3; receptor de obesidad (OB) o receptor de mpl . El término célula inmortal se refiere a una célula hibridoma o célula inmortalizada por otro medio, como transformación EDV, reemplazo de telomerasa o inmortalización retroviral .

El término animal como se usa en la presente se refiere a un animal no humano, preferentemente un roedor y especialmente un ratón o rata. Preferentemente el animal no humano es un roedor y más preferentemente un ratón, rata o conejo. Se prefiere más que el ratón sea un Rag 2- /-y -, Rag 2-/- lampiño, ratón beige NOD o SCID y la rata es una rata lampiña. El SCID beige es un ratón mutante doble que porta la mutación scid la cual origina una ausencia tanto de linfocitos T como B debido a un defecto en la recombinación V(D)J. También porta la mutación beige que origina la célula T citotóxica y defectos macrófagos así como también el apareamiento selectivo de las funcionales celulares NK. Los ratones beige SCID son potencialmente un modelo mejorado para recibir las células hematopoyéticas humanas. Los ratones NOD preferidos son NOD . Cq-RagltmlMomPr£ltmlMom Prfl tmlsdz/SzJ, NOD. Cg- Prkdcscíd 112rgtmlMj1 / SzJ , NOD .129S7 (B6 ) -RagltmlMom/'J , NOD . Cg- Prkdcscid B2mtmlUnc/J y NOD . CBl 7 - Prkdcscíd/ SzJ . Cada cepa carece de células T y B maduras y no tiene actividad citotóxica NK detectable. Las cepas soportan el injerto mejorado con células hematopoyéticas humanas tienen una durabilidad relativamente mayor y es significativamente más resistente a la irradiación. El Rag2 es esencial para la reorganización genética que genera los receptores del antígeno funcional en las células T y B; los mutantes Rag2~/- homozygous no tienen células T y B maduras, funcionales. El ratón KO () gama común carece de receptores funcionales para muchas de las citocinas incluyendo IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 y IL-15. Como consecuencia el desarrollo de linfocitos está muy comprometido. El ratón carece de células Asesinas Naturales (NK) y produce solo un pequeño número de células T y B. El término anticuerpo, como se usa en la presente, incluyen anticuerpos que tienen regiones variables y constantes (dominios) que pueden asignarse para las secuencias génicas gemínales de inmunoglobulinas de humano debido a su alta similitud de la secuencia o identidad con estas secuencias gemínales. Un anticuerpo humano abarca las diferentes formas de anticuerpos, preferentemente anticuerpos monoclonales incluyendo pero no limitándose a todos los anticuerpos, cada cadena pesada o ligera, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos alterados en su clase, y anticuerpos genéticamente diseñados (anticuerpos variantes o mutantes) tanto como las propiedades características de acuerdo con la invención se retienen. Especialmente se prefieren los anticuerpos humanos recombinantes . El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpos que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos. El término "anticuerpo humano recombinante" , como se usa en la presente, intenta incluir anticuerpos humanos que están preparados, creados o aislados por medios recombinantes , tal como los anticuerpos aislados de una célula huésped tal como células NSO, HEK 293 o CHO que comprenden un vector de expresión recombinante capaz de expresar la(s) cadena (s) pesada (s) y/o ligera (s) del anticuerpo y que se transfectan en una célula huésped. Estos anticuerpos recombinantes de humano tienen regiones variables y constantes en una forma reorganizada. Los anticuerpos recombinantes de humano de acuerdo con la invención se han sujeto a hipermutación somática in vivo. De esta forma, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que pueden asignarse a las secuencias VH y VL germinales de humano, pero pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la linea germinal de anticuerpo de humano in vivo. La "región variable" (región variable de una cadena ligera (VL) , región variable de una cadena pesada (VH) ) como se usa en la presente denota cada par de cadenas ligera y pesada que se involucran directamente en el enlace del anticuerpo con un antigeno. Los dominios de las cadenas ligeras y pesadas de humano variables tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones estructurales (FR) cuyas secuencias se conservan ampliamente, conectadas por tres "regiones hipervariables " (o regiones que determinan el complemento CDRs) . Las regiones estructurales adoptan una configuración de (beta) ß- lámina y los CDRs pueden formar lazos que conectan la estructura de ß- lámina. Los CDRs en cada cadena se sujetan en su estructura tridimensional por las regiones estructurales y forman junto con los CDRs de la otra cadena el sitio de enlace del antígeno. Las regiones de CDRs de cadena pesada y ligera de anticuerpo, preferentemente el CDR3 de cadena pesada, juegan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad del enlace de los anticuerpos de acuerdo con la invención y por lo tanto proporcionan otro objetivo de la invención. Los términos "región hipervariable" o "porción de enlace del antígeno de un anticuerpo" cuando se usa en la presente se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables del enlace del antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de las "regiones determinante de la complementariedad" o "CDRs" regiones "Estructura" o "FR" son aquellas regiones con dominio variable en lugar de los residuos de región hipervariable como se define en la presente. Por lo tanto, las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo comprenden del término N- a C- los dominios FRl , CDRl , FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 , y FR4 , CDR4. Las regiones CDR y FR se determinan de acuerdo con la definición estándar de Kabat et al., Secuencias de Proteínas de Interés Inmunitario, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) .

Los "dominios constantes" no se involucran directamente en el enlace de un anticuerpo con un antigeno, pero exhiben diferentes funciones efectores . Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de las cadenas pesadas, los anticuerpos o inmunoglobulinas se dividen en las clases: IgA, IgD, IgD, IgE, IgG y IgM, y varias de estas pueden dividirse en sus clases (isotipos), p.ej., IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, IgAl e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman µ, d, ?, a y e, respetivamente. Los siguientes ejemplos, referencias, listado de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar al entendimiento de la presente invención, el alcance verdadero de esto se expone en las reivindicaciones anexas. Se entiende que modificaciones pueden hacerse en los procedimientos expuestos sin alejarse del alcance de la invención. Aislando los anticuerpos de las células que producen anticuerpos, y/o sobrenadantes pueden desarrollarse de acuerdo con los métodos conocidos en el estado de la técnica de cromatografía o diálisis. Por ejemplo el anticuerpo puede purificarse usando uno o más de un método seleccionado de purificación por inmunoafinidad, precipitación por sulfato de amonio, purificación por proteína A/G, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel y/o precipitación en sulfato de amonio. Estos métodos se describen en Ñau, D.R., Optimización de la purificación del anticuerpo monoclonal, En: Techniques in Protein Chemistry, Hugli, T. (ed) , Academic Press, New York, 1989, pp. 339-347; Coligan, J.E. et al., (des), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc. (2005). En lugar de la generación de hibridoma pueden usarse métodos alternos para la producción de un anticuerpo de acuerdo con la invención. Estos métodos son p.ej., en base a la identificación de la secuencia de ácido nucleico del anticuerpo. Por lo regular es suficiente identificar la secuencia de las regiones variables, las regiones CDR o aun solo la región CDR3 de cadena pesada. Preferentemente se aisla el ARNm de un conjunto de células que producen anticuerpo y se usa para construir una codificación de ADNc-banco esta(s) región (es) en un vector de expresión apropiado. La genoteca de ADNc se transfecta en las células huésped tal como NSO o CHO y se tamizan buscando la producción del anticuerpo específico y los clones específicos se identifican y aislan y usan para la producción de anticuerpo sin la generación de hibridoma. Las células FL son células madre que son capaces de desarrollarse en diferentes tipos de células sanguíneas p.ej., células B, células T, granulocitos , paquetas, y eritrocitos. Las células madre hepáticas fetales hematopoyéticas comúnmente expresan el/los antígeno(s) de superficie CD31, CD34, CD117 (equipo-c) y CD133. De acuerdo con la invención se usa preferentemente una célula FL que expresa CD133. Como la célula FL también puede usarse como precursor celular (es decir, célula madre embrionaria) que se desarrolla después del tratamiento con citoquinas en una célula FL. Las células FL que expresan el CD133 pueden aislarse del hígado fetal humano y se separan más por el línea CD133, preferentemente, preferentemente por un procedimiento de separación inmunitario p.ej., Miltenyi "MACS® separation systems". Otro método preferido de aislamiento de células FL incluyen los pasos adicionales de etiquetado de monocitos con un anticuerpo CD133 conjugado con biotina y recuperación de la población de células madres positivas CD133. Los ratones que portan la mutación nula de la cadena gama común del receptor de citoquina (ye) sobre el cromosoma X se ha descrito por Disanto, J.P. et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 92 (1995) 377-381. Las ye'1' hembras pueden cruzarse con los machos homocigotos para la interrupción de la mutación del gen RAG2 (Shinkai, Y. et al., Cell 68 (1992) 855-867) . Fl machos homocigotos para la eliminación de RAG2 y hemicigotos para la eliminación ye puede retrocruzarse en hembras yc'1'RAG2+/+ . El genotipo RAG2 de la descendencia resultante puede determinarse por la cola de ADN PCR (Horton, R.M. et al., BioTechniques 19 (1995) 690-691). Los heterocigotos RAG2 se crían para producir ratones hembras yc~ /~RAG2~/~ y machos yc~/yRAG2~/~ (ye"/RAG2'''¦ Estos ratones tienen un antecedente mezclado de 129 Ola, Balb/c y C57BL/6. La inmuno-reconstitución de acuerdo con la invención se presenta por transplante de cantidades apropiadas de células FL de humano en el hígado del recién nacido y los animales inmunodeficientes irradiados previamente p.ej., ratones o rata . Los anticuerpos monoclonales de humano de acuerdo con la invención puede producirse al inmunizar una animal no humano inmuno-reconstituido de acuerdo con la invención, preferentemente un roedor inmuno-reconstituido, más preferentemente una rata o ratón inmuno-reconstituido, con una preparación purificada o enriquecida del antígeno, ácido nucleico que codifica el antígeno y/o células que expresan el antígeno. Las células B (p.ej., células B esplénicas) del animal después se obtienen y enfocan con un compañero de fusión humano apropiado, como una célula mieloma para formar las células inmortales, hibridoma que secretan anticuerpos monoclonales humanos contra el antígeno vía la fusión con un compañero de fusión humano apropiado, como una célula mieloma o por inmortalización de las células con p.ej., EBV. Por ejemplo, antígenos solubles o fragmentos de estos se conjugan opcionalmente con otras moléculas, y se usan como inmunógenos para generar anticuerpos. Para las moléculas transmembranas, tal como los receptores, fragmentos de estos (p.ej., el dominio extracelular de un receptor) puede usarse como el inmunógeno. Alternativamente, las células que expresan la molécula transmembrana pueden usarse como el inmunógeno. Estas células pueden derivarse de una fuente natural (p.ej., lineas celulares cancerígenas) o pueden ser células que se han transformado por técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembrana. Otros antígenos y formas de estos útiles para preparar anticuerpos serán aparentes para las personas en la técnica. Preferentemente, el animal no humano inmuno-reconstituido tendrá 6-16 semanas de edad con la primera inmunización. Por ejemplo, una preparación purificada o enriquecida del ADN que codifica el antígeno de interés (p.ej., CD20 o antígeno HER3 ) puede usarse para inmunizar el animal no humano inmuno-reconstituido de acuerdo con la invención intramuscularmente . La respuesta inmune puede monitorearse con el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma que se obtienen por sangrados retro-orbitales. El plasma puede tamizarse por ELISA, y el no humano inmuno-reconstituido con suficientes títulos de anticuerpos contra el antígeno puede usarse para la inmortalización de las correspondientes células B. Los ratones pueden activarse intravenosamente con el antígeno de interés antes del sacrificio y la remoción del vaso y nodulos linfáticos y sangre periférica. Se encontró que las fusiones 2-3 de cada antígeno puede ser necesario que se desarrollen. Diferentes ratones serán inmunizados para cada antigeno. Los linfocitos de ratón pueden aislarse y fusionarse con una célula heteromieloma o humana que usa PEG o electrofusión a base de protocolos estándar para generar hibridoma. La electrofusión se basa con un cambio estructural reversible de las membranas celulares, lo cual se origina por los efectos de un campo eléctrico y es aplicable para un amplio espectro de células para la fusión de dos o más células con orígenes diferentes o similares, incluyendo sus estructuras completas (núcleo, membranas, organelo, plasma celular) para crear una célula nueva, viable. Los hibridomas resultantes después se tamizan para la producción -de anticuerpos del antígeno específico. Por ejemplo, las suspensiones de célula simple de linfocitos derivados de nodulos linfáticos y esplénicos de los ratones inmunizados se fusionan con las células heteromieloma no tamizada K6H6/B5 (ATCC, CRL, 1823). Las células se colocaron en placas aproximadamente 2 x 105 en placas de microtítulo planas, seguidas por aproximadamente dos semanas de incubación en el medio selectivo. Los pozos individuales después se tamizan por ELISA para los anticuerpos monoclonales de humano contra el antígeno (p.ej., IgG) . Una vez que se presenta el crecimiento hibridoma extensivo, se analiza el medio, usualmente después de 10-14 días. Los hibridomas que tamizan anticuerpos se repitieron, tamizaron de nuevo, y si aun es positivo para los anticuerpos monoclonales de humano contra el antígeno, puede subclonarse al menos dos veces por dilución limitante. Los subclones estables después se cultivan in vitro para producir anticuerpos en el medio de cultivo tisular para la caracterización . El antígeno puede introducirse en el animal por cualquier medio adecuado. Preferentemente, el animal se inmuniza intrasplénica, intravenosa, intraperitoneal , intradérmica, intramuscular, subcutáneamente solo o en combinación con los agentes inmunomodulados apropiados (p.ej., CFA) . La dosis de cada antígeno preferentemente deberá está en el intervalo entre 1-500 yg. Preferentemente, el método de la invención comprende el paso adicional de suministrar el animal con una dosis activada del antígeno 1-500 yg, un activador 7-28 días después de la última inyección. Preferentemente, los animales se activan 1 a 5 veces. La inmunización del animal puede realizarse con o sin vehículos farmacéuticos. Los vehículos adecuados p.ej., IFA, Al3(OH) , Abisco. Adicionalmente , los vehículos pueden funcionar como agentes de inmunoestimulacion ("adyuvantes") . La inmunización del animal puede realizarse con o sin adyuvantes además de los vehículos farmacéuticos. Los adyuvantes preferidos para mejorar la efectividad de la composición incluye, pero no se limita a: p.ej., CFA, IFA, Al3(OH) , Abisco. Las células que producen anticuerpos preferidos que se usan en la invención incluyen células B. Estas células que producen anticuerpos que se usan en la invención pueden recuperarse por la eliminación de cualquier componente celular adecuado para el sistema inmunitario del animal. Preferentemente, las células que producen anticuerpos se recuperan del animal por la extirpación del baso, nodulos linfáticos, sangre periférica o médula ósea o porciones de estos .

E emplos Materiales & Métodos Ratones: Ratones Rag2'/'yc'/' en una base BALB/c se criaron y mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicos de acuerdo con las guías de ICH, AAALAC y EU Directive en Animal Welfare, 86/609.

Ensayo de repoblación de recién nacidos: El día del nacimiento, los ratones recién nacidos se irradiaron en con un intervalo de 3-4 horas con 2x2 Gy con una fuente Cesio 137 (Biobeam 8000, STS GmbH, Braunschweig, Alemania) con 2 Gy/min., una dosis que se tituló para que no fuera letal. A las 4-12 horas posteriores a la irradiación, los ratones se transplantaron con p.ej., células FL CD133+ solas o en combinación con células hepáticas CD133" no hematopoyética en 25 µ? de PBS o en combinación con los factores de crecimiento en el hígado (i.h.) usando una aguja medidora 30 (Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Suiza) . Los recién nacidos siempre recibieron células de donantes simples . Los ratones se destetaron a las 3 semanas de edad. El análisis de los ratones: para obtener células sanguíneas periféricas y plasma, los ratones se criaron con el seno venoso retroviral bajo anestesia de éter.

Análisis del Flujo citométrico y clasificación. Para el análisis FACS y células que clasifican anticuerpos monoclonales , biotinilados o conjugados ya sea con FITC, PE o APC contra los siguientes antígenos se usaron: CD3 (UCHT1), CD4 (13B8.2), CD8 (B9.ll), CD40 (MAB89 ) , CD80 (MAB104), CD83 (HBl5a) , CD86 (HA5.2B7) (todos de Inmunotech/Beckman Coulter, Marsella, Francia), CD19 (HIB19), CD20 (2H7), CD34 (581), IL-3Ra/CDl23 (9F5), CDllc (B-ly6) CD14 (M5E2) (todos BD Pharmingen, San Diego, CA) , CD45 (H130), CD45RA (MEM56), HLA- DR (TU36) (todos de Caltag, Burlingame, CA) , TLR2 (TLR2.1), TLRR4 (HTA125) , TCRab (IP26), (Todos de Bioscience, San Diego, CA), BDCA-1, BDCA-2, BDCA-4, CD25 (4E3) (todos de Miltenyi Biotech) , IgM (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) , CCR7 (3D12, proporcionado por M. Lipp, Berlín, Alemania) . Se usó IOTest Beta Mark para Vbanalysis ( Imunotech/Beckman Coulter) . FITC, PE o APC conjugado con estreptavidina (todos de BD Pharmingen) se usaron para la visualización de anticuerpos biotinilados . Las células muertas se excluyeron por marcado con yoduro de propodio. El mAbs de control irrelevante, acoplado con el isotipo apropiado se usó para determinar el nivel de mercado base. Las células se analizaron usando un citómetro FACS modelo Calibur y Clasificación usando un FACSVantage SE (Benton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA) .

Células Hepáticas Fetales. Fuentes de células hepáticas fetales: Cambrex Corp. USA y StemCell Technologies Corp. USA.

Ejemplo 1 Procedimiento de inmunización de los ratones reconstituidos Los ratones Rag2'/'yc'/' (3 hembras), se inmunizaron con 100 pg de ADN plásmido que codifican la proteína HER3 de humano. En total se proporcionaron hasta seis inmunizaciones intramuscularmente (i.m.) . Los títulos de suero de anti-HER3 se encontraron que fueron suficientes, los ratones se activaron adicionalmente tres veces con 30 de prote na HER3 en 100 µ? de PBS intravenosa (i.v.) 3,. 2 y 1 día después de la fusión.

Ejemplo 2 Análisis de flujo citométrico de sangre periférica de ratones reconstituidos en la semana 15 después del injerto Los ratones se anestesiaron con isofurano y después se recolectó la sangre periférica del plexo venoso orbital para medir la relación positiva de los hemocitos de humano con el uso del flujo citométrico. La sangre recolectada se mezcló instantáneamente con EDTA-2Na y se mantuvo a temperatura ambiente hasta el análisis. Una cantidad óptima de anticuerpos CD45 anti-humano conjugados con FITC se adicionaron y se hicieron reaccionar con 50 µ? de toda la sangre a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de esto, se efectuó hemolisis e inmovilización usando la solución FACS y se midió la relación usando el citómetro FACS Calibur. Las Figs . 1A-1C muestran la relación (%) de células positivas CD45 de humano en sangre periférica de tres ratones probados .

Ejemplo 3 Examen de la capacidad de producción de anticuerpos HER3 de humano en los ratones reconstituidos La cantidad de IgG de humano total en la sangre periférica de los ratones reconstituidos se midió por ELISA. El suero de ratón diluido se recubrió sobre placa de 96 pozos MaxiSorb (NUNC) y se incubó durante lh a temperatura ambiente. Después de bloquear con solución al 2% de CroteinC durante 1 h a temperatura ambiente se desarrolló el lavado y después de esto se adicionaron los anticuerpos monoclonales IgG anti-humano conjugados con peroxidasa. Después de la incubación durante 45 minutos a temperatura ambiente se realizó el lavado y se agregó la solución de sustrato ABTS durante 10 minutos de reacción a temperatura ambiente. Después se midió la absorbancia a 405 nm (Fig. 2) . La concentración de IgG se calculó de acuerdo con la curva estándar.

Ejemplo 4 Análisis de flujo citométrico de anticuerpos HER3 de humano en sangre periférica de ratones reconstituidos en la 7a semana después de la inmunización 17 semanas después de que los ratones reconstituidos se inmunizaron con la proteína de humano de interés. Se realizó la inmunización intramuscularmente con 25-100 g/ratón de ADN que codifica una proteína de humano de interés junto con el coctel de citosina como adyuvante para mejorar la respuesta inmunológic . La misma inmunización se realizó cada cuatro semanas y se tomó el suero para medir los anticuerpos específicos de proteína humana por FACS . Se adicionó el antisuero diluido brevemente a las células que expresan la proteína de humano y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado se agregó una cantidad óptima de anticuerpos anti-humano conjugados con FITC y reaccionaron con las células después de 20 minutos a temperatura ambiente. Después de esto se midió la relación positiva de las células que expresan la proteína de humano marcadas utilizando FACS Calibur. Las Figs . 3A-3D muestran la relación (%) de células positivas de humano marcadas con diferente dilución de suero (1/20 y 1/150) uno de los ratones reconstituidos e inmunizados comparado con el suero de ratón normal ( MS) como control negativo o con los anticuerpos específicos de proteína de humano purificados como un control positivo.

Ejemplo 5 Selección positiva de células CD19+ usando Dynabeads® Las células B CD19+ se aislaron directamente de la sangre periférica o suspensiones de esplenocitos de acuerdo con los protocolos Dynal estándar Dynabeads® CD19 (Pan B) (número de producto 111.03/111.04) y DETACHaBEAD® CD19 (Prod. No . 125.06 ) : - Adición de 25 µ? de Dynabeads® a p.ej., 2.5xl07 de células preparadas - Incubado durante 20 minutos a 2-8aC con agitación suave y rotación - Colocar el tubo en un magneto durante 2 minutos - Descargar el sobrenadante y lavar suavemente las células unidas en gránulos 4 veces, usando el siguiente procedimiento: - Agregar 1 mi de Tampón por lxl O7 Dynabeads® - Colocar el tubo en el magneto durante 1 min y descargar el sobrenadante - Volver a suspender las células en tampón/medio durante la aplicación corriente abajo Ejemplo 6 Electrofusión para la generación de hibridoma Se contaron y fusionaron las células CD19+ aisladas por medio de los protocolos de electrofusión (Aplicación Eppendorf para Electrofusión No. 58) : - Cultivo tanto de células CD19+ aisladas como del compañero de fusión p.ej., K6H6/B5 por centrifugación (200 x g, 10 min. TA) . - Volver a suspender los gránulos en el medio de crecimiento y determinar el número de células - Fijar el número de células de cada compañero de fusión a p.ej., 3xl05 por fusión - Pipetear ambos compañeros juntos y centrifugar a 200 x g durante 10 minutos y a temperatura ambiente) - Lavar los gránulos dos veces en tampón de electrofusión, centrifugar como se describe anteriormente - Volver a suspender los gránulos en 200 µ? de tampón de electrofusión por fusión - Llenar la cámara de fusión y fusionar inmediatamente (ver aplicación de protocolo del dispositivo de fusión, Eppendorf) - Después de la fusión, permitir que la cámara repose durante 10 minutos a temperatura ambiente - Enjuagar la cámara con el medio y transferir las células fusionadas en placas de clonación - Agregar el medio de la selección HAT después de 24 horas de incubación (5% C02, 372C) - Después de 7-21 días de incubación contar y analizar los híbridos. Se analizaron los hibridomas de humano que crecieron (40 clones) 14 días después de la fusión para el total y los IgG específicos de proteína de humano en ELISA establecido y al menos ' se detectaron 6 clones como positivos .

Hibridoma CONC. ELISA CONC. ELISA CONC. ELISA HER3 ( g ml) IgG ( g ml) IgF ( g/ml) G2 :1 0.006 0.015 <0 G3 :1 0.165 0.017 <0 C4 : 1 <0.001 0.015 <0 E9 :1 0.001 0.010 <0 G9 :1 0.002 0.020 <0 C10 : 1 0.055 0.014 <0.001 E emplo 7 Procedimiento de inmunización de los ratones reconstituidos Se inmunizaron tres ratones Rag2~/~yc'/' (4 hembras), con 100 de ADN plásmido que codifica la proteina CXCR5de humano. En total hasta seis inmunizaciones se proporcionaron intramuscularmente (i.m.).

Activación de los ratones Cuando se encontró que los títulos del suero anti-CXCR5 fueron suficientes, se activaron adicionalmente los ratones tres veces con 5xl06 células de expresión CXCR5 en 100 µ? PBS intravenosamente (i.v.) 3, 2 y 1 día antes de la fusión.

Ejemplo 8 Examen de la capacidad de producción de anticuerpos CXCR5 de humano en los ratones reconstituidos La cantidad de IgG de humano total en la sangre periférica de ratones reconstituidos se midió por ELISA. El suero diluido de los ratones se recubrió sobre la placa de 96 pozos MaxiSorb (NU C) y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Después de bloquear con una solución al 2% de CroteinC durante 1 h a temperatura ambiente se realizó el lavado y después de esto se agregaron los anticuerpos monoclonales IgG anti-humano conjugados con peroxidasa. Después de la incubación durante 45 minutos a temperatura ambiente se llevó a cabo el lavado y se agregó la solución del sustrato ABTS durante 10 minutos de reacción a temperatura ambiente. Después se midió la absorbancia a 405 nm (Fig. 4). Se calculó la concentración de IgG de acuerdo con la curva estándar (250 pg/ml de IgG de humano total) .

Ejemplo 9 Análisis de anticuerpos CXCR5 de humano en ratones reconstituidos después de la tercera inmunización La cantidad de IgG de humano total en el suero de los ratones reconstituidos se midió por ELISA específico para CXCR5. El suero diluido de los ratones se recubrió sobre la placa de 96 pozos MaxiSorb (NUNC) y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Después de bloquear con una solución al 2% de CroteinC durante 1 h a temperatura ambiente se realizó el lavado y después de esto se agregaron los anticuerpos monoclonales IgG anti-humano conjugados con peroxidasa. Después de la incubación durante 45 minutos a temperatura ambiente se llevó a cabo el lavado y se agregó la solución del sustrato ABTS durante 10 minutos de reacción a temperatura ambiente. Después se midió la absorbancia a 405 nm . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Método para la producción de un anticuerpo monoclonal de humano de un animal no humano inmunodeficiente , caracterizado porque comprende poner en contacto un animal no humano inmunodef iciente recién nacido con una célula madre hepática fetal humana (célula FL) para generar un animal no humano transplantado inmune (animal reconstituido), posteriormente poner en contacto al animal reconstituido con un antígeno, recolectar del animal reconstituido una célula humana que produce anticuerpo humano contra el antígeno, y aislar el anticuerpo de la célula que produce el anticuerpo.
2. 2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el animal no humano inmuno-reconstituido es un roedor .
3. 3. Método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el animal no humano reconstituido es un ratón o una rata.
4. 4. Método de conformidad con la reivindicación 1 ó 3, caracterizado porque el ratón reconstituido es un ratón Rag2~/~YC~/~ , lampiño Rag2~/~ , NOD o beige SCID.
5. 5. Método de conformidad con la reivindicación 1 ó 4, caracterizado porque la célula FL es una célula madre hepática fetal hematopoyética de humano (célula HFL) .
6. 6. Método de conformidad con la reivindicación 1 ó 5, caracterizado porque la célula FL es una combinación de una célula HFL y una célula madre hepática fetal no hematopoyética de humano.
7. 7. Método de conformidad con la reivindicación 1 ó 6, caracterizado porque la célula que produce el anticuerpo es una célula B de humano.
8. 8. Método de conformidad con la reivindicación 1 ó 7, caracterizado porque el antígeno es un polipéptido.
9. 9. Método de conformidad con la reivindicación 1 ó 8, caracterizado porque el antigeno se pone en contacto con el animal reconstituido es antígeno, fragmento de antígeno, complejo MHC/péptido, ADN que codifica el antígeno y/o célula que porta el antígeno.
10. 10. Método de conformidad con la reivindicación 1 ó 9, caracterizado porque el animal no humano reconstituido se irradia sub-letalmente antes de ponerse en contacto con la célula FL .
11. 11. Método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el ratón se pone en contacto por primera vez con en antígeno 5 a 18 semanas después de ponerse en contacto el ratón con la célula FL .
12. 12. Método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el ratón se pone en contacto hasta diez veces con el antígeno.
13. 13. Método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la célula recolectada es una célula humana CD19+ ó CD22+.
14. 14. Método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la célula se establece por tecnología de hibridoma.
15. 15. Método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la línea celular compañera de fusión es una línea celular MFP-2, HK-128, K6H6/B5 o Karpas 707.
16. 16. Método para la producción de una pluralidad de células B humanas que producen una pluralidad de anticuerpos humanos contra un antígeno, caracterizado porque se pone en contacto un animal no humano inmuno-deficiente recién nacido con una célula FL para generar un animal inmuno-reconstituido, posteriormente poner en contacto al animal reconstituido con un antígeno, recolectar las células B humanas que producen la pluralidad de anticuerpos fuera del animal no humano.
17. 17. Pluralidad de células B humanas, caracterizada porque produce una completa pluralidad de anticuerpos humanos contra una proteína humana.
18. 18. Composición de células inmortales, caracterizada porque proporcionan una completa pluralidad de anticuerpos de humano contra una proteína humana .
19. 19. Uso de un animal reconstituido para la producción de una pluralidad de células B inmortales, que produce una completa pluralidad de anticuerpos humanos contra una proteína humana.
20. 20. Método para la producción recombinante de un anticuerpo, caracterizado porque pone en contacto un animal no humano inmuno-deficiente recién nacido con una célula FL, posteriormente poner en contacto al animal no humano con un antígeno, recolectar del animal no humano una célula humana que produce anticuerpo humano contra el antígeno y aislar el anticuerpo, secuenciar las regiones variables, construir el/los vector (es) de expresión que codifican las cadenas pesadas y/o ligeras en al menos CDRS, combinada con una cadena constante humana, expresar el/los vector (es) en célula(s) huésped apropiada(s) y aislar el anticuerpo (proteína inmuno-reactiva) de la(s) célula (s) huésped o sobrenadantes de fermentación.
21. 21. Método para la producción recombinante de un anticuerpo, caracterizado porque pone en contacto un animal no humano inmuno-deficiente recién nacido con una célula FL, posteriormente poner en contacto al animal no humano con un antígeno, recolectar del animal no humano una célula humana que produce anticuerpo humano contra el antígeno y aislar el ARNm de la célula humana que produce el anticuerpo humano, generar el ADNc específico del anticuerpo (p.ej., con uso de cebadores específicos de inmunoglobul ina ) , construir el/los vector (es) de expresión que codifican las cadenas pesadas y/o ligeras en al menos CDRS, combinada con una cadena constante humana, expresar el/los vector (es) en célula(s) huésped apropiada(s) y aislar el anticuerpo (proteína inmuno-reactiva) de la(s) célula (s) huésped o sobrenadante de fermentación.
22. 22. Uso de la pluralidad de células B de humano que comprende la pluralidad completa de genes inmunoglobulina de humano contra un antígeno para la generación de un anticuerpo contra el antígeno, en donde la pluralidad de células B tiene una concentración al menos 106 células B/ml para la producción de una célula hibridoma.
23. 23. Método para la selección de una célula inmortal que produce un anticuerpo de humano que muestra el enlace específico con un antígeno, caracterizado porque proporciona una pluralidad células B humanas del bazo o de un animal no humano que produce una completa pluralidad de anticuerpos humanos, fusionar las células o un subconjunto con una célula mieloma inmortal o inmortalizar las células B o subconjunto por transformación EBV, y seleccionar una célula hibridoma que produce un anticuerpo de humano que muestra el enlace específico con el antígeno.
24. 24. Método para la selección de una célula inmortal que produce un anticuerpo que muestra la afinidad de enlace específica al menos de 10"6 mol/1 con un antígeno, caracterizado porque proporciona una pluralidad de células B humanas del bazo de un animal no humano que produce una completa pluralidad de anticuerpos humanos, fusionar las células o un subconjunto de éstas con una células mieloma inmortal o inmortalizar las células B o subconjunto por transformación EBV, y seleccionar una célula hibridoma que produce un anticuerpo humano que muestra la afinidad del enlace específico con el antígeno al menos de 10"6 mol/1.