MX2008013488A

MX2008013488A - Vacuna de virus de papiloma basado en hpv-16 (virus de papiloma humano 16).

Info

Publication number: MX2008013488A
Application number: MX2008013488A
Authority: MX
Inventors: Ronald Rooke; Stephane Paul
Original assignee: Transgene Sa
Priority date: 2006-04-21
Filing date: 2007-04-17
Publication date: 2008-10-30
Also published as: US20100061957A1; CA2649392A1; NO20084857L; IL193661A0; CN101426811A; KR20090005011A; WO2007121895A2; WO2007121895A3; EP2013230A2; BRPI0710238A2; RU2008145712A; JP2009534332A; AU2007241406A1

Abstract

La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende uno o más polipéptidos tempranos de virus de papiloma humano (HPV)-16 o un ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una infección o condición patológica causada por al menos un virus de papiloma distinto a HPV-16. La invención es de interés muy especial en la inmunoterapia, particularmente en la prevención o tratamiento de infecciones persistentes por HPV que posiblemente conducen a la neoplasia intraepitelial cervical (CIN) y finalmente al cáncer cervical.

Description

VACUNA DE VIRUS DE PAPILOMA BASADA EN HPV-16 (VIRUS DE PAPILOMA HUMANO 16) Descripción de la Invención La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende uno o más polipéptidos tempranos de virus de papiloma humano 16 (HPV-16) o un ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una infección o condición patológica causada por al menos un virus de papiloma distinto a HPV- 16. La invención es de interés muy especial en la inmunoterapia, particularmente en la prevención o tratamiento de infecciones persistentes por HPV que conducen posiblemente a la neoplasia intraepiteiial cervical (CIN, por sus siglas en inglés) y finalmente al cáncer cervical. Los virus de papiloma son pequeños virus de DNA que se han identificado en una cantidad de organismos superiores incluyendo humanos (ver por ejemplo a Pfister, 1987, en The papovaviridae: The Papillomaviruses , Salzman y Howley edition, Plenum Press, New York, p 1-38). Se asocian a las condiciones patológicas que oscilan de tumores benignos a malignos. En los tumores benignos, el genoma viral es episomal mientras que en los tumores malignos, el DNA de HPV está integrado en los cromosomas del hospedador (Stoler, 2000, Int. J. Gynecol. Path. 19, 16-28).

Los virus del papiloma poseen un ADN circular de doble filamento de aproximadamente 7900 pares de bases que está rodeado por una cápsida de proteína. El genoma comprende una región temprana (E) que contiene las estructuras de lectura E1-E7 y una región tardía (L). La región tardía codifica las proteínas estructurales L1 y L2 que forman la cápsida viral mientras que los genes tempranos codifican las proteínas reguladoras que se encuentran predominante en el núcleo. E1 codifica dos proteínas importantes en el mantenimiento y réplica del genoma viral. E2 codifica las proteínas activadoras y represoras que regulan el promotor viral que dirige la transcripción de E6 y E7 (Bechtold y col., 2003, J. Virol. 77, 2021-2028). La proteína codificada por E4 une e interrumpe la red de queratina citoplásmica y puede desempeñar una función en la maduración viral. La función de la proteína E5 es aún controversial y su expresión se pierde frecuentemente durante la integración viral en los cromosomas hospedadores. Los productos del gen codificado por E6 y E7 de los genotipos de HPV asociados al cáncer, están implicados en la transformación oncogénica de las células infectadas (Kanda y col., 1988, J. Virol. 62, 610-613; Vousden y col., 1988, Oncogene Res. 3, 1-9; Bedell y col., 1987, J. Virol. 61, 3635-3640), que es probablemente debido a la capacidad de estas proteínas virales de unir los productos del gen supresor de tumor celular p53 y la retinoblastoma (Rb, por sus siglas en inglés), respectivamente. Los residuos de aminoácido implicados en la unión del polipéptido nativo de HPV-16 E6 a p53, se han definido claramente a partir de los residuos 118 a 122 ( + 1 es el primer residuo Met encontrado o a partir de los residuos 111 a 115 iniciando preferiblemente con el segundo residuo Met usado) (Crook y col., 1991, Cell 67, 547-556) y los implicados en la unión del polipéptido nativo de HPV-16 E7 a Rb están localizados desde los residuos 21 a 26 (Munger y col., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105; Heck y col., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 89, 4442-4446). Actualmente, más de 100 genotipos de virus de papiloma humano (HPV, por sus siglas en inglés) se han clonado y secuenciado (Stoler, 2000, Int. J. Gynecol. Path 19, 16-28). Solamente 40 genotipos de HPV infectan la mucosa genital de los cuales aproximadamente 15 ponen en riesgo a las mujeres de causar tumores malignos del tracto genital. Más específicamente, los dos genotipos más frecuentes, HPV-16 y HPV-18, se detectan en más del 70% del carcinoma cervical invasivo mientras que HPV-31, HPV-33 y HPV-45 juntos son la causa del 10% de los casos (Cohén y col., 2005, Science 308, 618-621). Aunque existen programas de análisis cervical, casi medio millón de mujeres alrededor del mundo se diagnostican con cáncer cervical cada año y más de 270,000 mueren de acuerdo a los datos de la Agency for Research on cáncer. Los métodos convencionales siguen siendo la cirugía y radioterapia, pero las nuevas estrategias que usan vacunas se han diseñado durante los últimos 15 años, por ejemplo vacunas basadas en péptidos (Feltkamp y col., 1993, Eur. J. Immunol. 23, 2242-2249), vacunas de partículas de tipo virus (VLP, por sus siglas en inglés), vacunas de ADN (Osen y col., 2001, vacuna 19, 4276-4286; Smahel y col., 2001, Virology 281, 231-238) y vacunas de vector viral (EP 462.187, Daemen y col., 2000, Gene Ther. 7:1859-1866; He y col., 2000, Virology 270, 146-161; Borysiewicz y col., 1996, Lancet 347, 1523-1527). Conceptualmente, hay dos métodos que usan vacunas de HPV, profiláctico y terapéutico. El método profiláctico intenta prevenir la infección viral, es decir bloquear el virus antes de que penetre las células hospedadoras principalmente a través de la inducción de anticuerpos neutralizantes. Generalmente, las vacunas profilácticas detectan las proteínas de cápsida expresadas en la superficie del virus. La mayor parte se basan en VLPs producidas de manera recombinante de proteínas L1 o en la mezcla de VLPs de los tipos más frecuentes de HPV. Los ensayos clínicos de fase III correctos ha reportado recientemente, mediante Merck y GlaxoSmithKIine (GSK), una eficacia del 100% en la prevención de infecciones cervicales de tipo específico. La protección cruzada contra los genotipos oncogénicos HPV-31 y HPV-45 se ha descrito después de la administración de una mezcla de VLPs de HPV-16 y HPV-18 (WO 2004/056389). Sin embargo, no se espera que las vacunas preventivas basadas en VLP induzcan el retroceso de las condiciones patológicas que se desarrollan después de la infección por HPV.

El método terapéutico intenta tratar las infecciones establecidas por HPV e induce el retroceso de las condiciones patológicas precancerosas y cancerosas asociadas al HPV principalmente a través de la inducción de una inmunorespuesta celular. Generalmente, la estrategia terapéutica se basa en la inmunización dirigida a las o ncoproteínas E6 y/o E7 que son expresadas por las células tumorales inducidas por HPV. Hasta ahora, la inmunidad proporcionada por los antígenos de HPV E6 y E7 se considera especifica al genotipo y las vacunas terapéuticas actuales en el desarrollo clínico o preclínico se enfocan principalmente en HPV-16 oncogénico más frecuente y a HPV-18 menos común. Sin embargo, una vacuna terapéutica ideal debe permitir proporcionar la protección no sólo contra los genotipos de HPV más frecuentes sino también contra los otros genotipos de HPV menos frecuentes implicados en el 30% restante de los cánceres cervicales. Esto se puede lograr con el desarrollo de candidatos de vacuna alternativos dirigidos a cada genotipo oncogénicos de HPV. Sin embargo, esta estrategia probablemente no es muy atractiva al considerar el costo de los progresos clínicos y preclínicos requeridos por las autoridades reguladoras contra el número limitado de pacientes expuestos a los genotipos de HPV menos frecuentes. Se puede esperar que HPV continúe siendo una amenaza global seria de salud durante muchos años debido a la naturaleza crónica y persistente de la infección, su alto predominio y la morbidez significativa de los cánceres inducidos por HPV. Por lo tanto, hay una necesidad de desarrollar una vacuna que ofrezca una cobertura más amplia que sea capaz de la protección y/o tratamiento contra múltiples genotipos de HPV que incluyen además del genotipo HPV-16 más frecuente otros menos frecuentes y genotipos de HPV potencialmente oncogénicos. Por lo tanto, la presente invención representa un avance significativo para mejorar la prevención y tratamiento de las infecciones por virus de papiloma o lesiones premalignas y malignas asociadas al virus de papiloma en países industrializados así como en países en vías de desarrollo. Este problema técnico es solucionado a través del suministro de las modalidades según lo definido en las reivindicaciones. Otros y adicionales aspectos, características y ventajas de la presente invención son evidentes a partir de la siguiente descripción de las modalidades actualmente preferidas de la invención. Estas modalidades se proporcionan con el propósito de descripción. Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona el uso una composición que comprende uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 o un ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 para la fabricación de un medicamento para de prevenir o tratar una infección o condición patológica causada por al menos un virus de papiloma distinto a HPV-16. Más particularmente, la presente invención se relaciona al uso de una composición que comprende uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 o un ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 para la fabricación de un medicamento para tratar una infección o condición patológica causada por al menos un virus de papiloma humano distinto a HPV-16. La presente invención también se relaciona a un método para tratar una infección o condición patológica causada por al menos un virus de papiloma humano distinto a HPV-16, el método comprende administrar a un organismo hospedador una composición que comprende uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 o un ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16. Según lo utilizado en la presente a través de toda la Solicitud, los términos "un" y "uno" se utilizan en el sentido que significa "por lo menos uno", "por lo menos un primer", "uno o más" o "una pluralidad" de los compuestos o etapas referidos, a menos que el contexto indique lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células incluyendo una mezcla de las mismas. Más específicamente, "por lo menos uno" y "uno o más" significa un número que es uno o mayor de uno, con una preferencia especial por uno, dos o tres. El término "y/o" utilizado en la presente incluye el significado de "y", "o" y "todos o cualquier otra combinación de elementos conectados por tal término". El término "aproximadamente" según lo utilizado en la presente significa dentro de 20%, preferiblemente dentro de 10%, y más preferiblemente dentro de 5% de un valor o intervalo proporcionado. El término "aminoácidos" y "residuos" son sinónimos. Estos términos se refieren a aminoácidos naturales, artificiales y/o sintéticos, incluyendo los isómeros ópticos D o L, aminoácidos modificados y análogos de aminoácido. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan en la presente de manera intercambiable para referirse a los polímeros de residuos de aminoácido que comprenden nueve o más aminoácidos unidos vía enlaces peptídicos. El polímero puede ser lineal, ramificado o cíclico y puede comprenden análogos naturales y/o de aminoácido y pueden interrumpirse por ácidos no aminados. Según una indicación general, si el polímero de aminoácido es largo (por ejemplo más de 50 residuos de aminoácido), es referido preferiblemente como un polipéptido o proteína. Dentro del contexto de la presente invención, los términos "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "polinucleótido" y "secuencia de nucleótido" se utilizan de manera intercambiable y definen un polímero de cualquier longitud de polidesoxiribonucleótidos (ADN, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, ADNc, ADN genómico, plásmidos, vectores, genomas virales, ADN aislado, sondas, cebadores y cualquier mezcla de los mismos) o moléculas de poliribonucleótidos (ARN, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, ARNm, ARN antisentido) o poliribo-polidesoxiribinucleótidos mezclados. Comprenden los polinucleótidos de uno o doble filamento, lineales o circulares, naturales o sintéticos. Por otra parte, un polinucleótido puede comprender nucleótidos artificiales, tales como nucleótidos desnaturalizados y análogos de nucleótido (ver US 5,525,711, 4,711,955 o EPA 302 175 como ejemplos de modificaciones) y se puede interrumpir a través de los componentes no nucleótidos. Si está presente, las modificaciones al nucleótido se pueden impartir antes o después de la polimerización. Según lo utilizado en la presente, el término "comprende" cuando se utiliza para definir los productos, composiciones y métodos, tiene el propósito de significar que los productos, composiciones y métodos incluyen los compuestos o etapas referidos, pero sin excluir los otros. "Consiste esencialmente de" significará que excluye otros compuestos o etapas de cualquier significado esencial. Por lo tanto, una composición que consiste esencialmente de los compuestos citados no excluiría los contaminantes restantes y los portadores farmacéuticamente aceptables. "Consiste de" significará que excluye más oligoelementos de otros compuestos o etapas. Por ejemplo, un polipéptido "consiste de" una secuencia de aminoácido cuando el polipéptido no contiene ningún aminoácido pero sí la secuencia de aminoácido citada. Un polipéptido "consiste esencialmente de" una secuencia de aminoácido cuando tal secuencia de aminoácido está presente junto con solamente algunos residuos de aminoácido adicionales, comúnmente de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 o más residuos adicionales. Un polipéptido "comprende" una secuencia de aminoácido cuando la secuencia de aminoácido es por lo menos parte de la secuencia de aminoácido final del polipéptido. Tal polipéptido puede tener de algunos hasta varios cientos de residuos adicionales de aminoácidos. Tales residuos de aminoácido adicionales pueden desempeñar una función en la trayectoria del polipéptido, facilitan la producción o purificación del polipéptido; prolongar el período de vida, entre otras cosas. Los mismos se pueden aplicar a las secuencias de nucleótido. Según lo utilizado en la presente, el término "aislado" se refiere a una proteína, polipéptido, péptido o ácido nucleico que se purifica o remueve de ambiente natural. El término "purificado" se refiere a una proteína, polipéptido, péptido o ácido nucleico que se separa de por lo menos otro componente al cual está naturalmente asociado. El término "célula hospedadora" se debe entender ampliamente sin ninguna limitación con referencia a la organización particular en el tejido, órgano, o células aisladas. Tales células pueden estar de un tipo único de células o de un grupo de diferentes tipos de células y comprenden líneas de células cultivadas, células primarias y células proliferativas. El término "organismo hospedador" se refiere a un vertebrado, particularmente miembro de la especie mamífera y especialmente animales domésticos, animales deportivos, y primates incluyendo humanos. "HPV" significa "virus de papiloma humano". Su clasificación se basa en el grado de relación de sus genomas. Más de 100 genotipos de HPV se han identificado actualmente y se han enumerado siguiendo el orden cronológico de su aislamiento. Comúnmente, dos aislados constituyen tipos distintos si comparten una identidad de menos del 90% en aproximadamente 2000 porciones largas de nucleótidos de su genoma que contiene las estructuras de lectura abiertas E6, E7 y L1. Un árbol filogenético fue construido a partir de la alineación de la secuencia de nucleótido disponible (Van Ranst y col., 1992, J. Gen Virol 73, 2653; De Villiers y col., 2004, Virology 324, 17-27).

Según lo utilizado en la presente el término "polipéptido temprano" se refiere a una proteína no estructural reconocida en la técnica, seleccionada entre el grupo que consiste de polipéptidos E1, E2, E4, E5, E6 y E7 con una preferencia especial por E6 y E7. En el contexto de la invención, uno o más polipéptidos tempranos incluidos en la composición o codificados por el ácido nucleico incluido en la composición usada de acuerdo a la invención, se originan de HPV-16. El término "se origina" significa que se aisla, clona, deriva o relaciona. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 pueden originarse de un' polipéptido temprano nativo de HPV-16 o un derivado del mismo. Un "polipéptido temprano nativo de HPV-16" se refiere a una proteína, polipéptido o péptido que se pueden encontrar o aislar de una fuente en la naturaleza, a diferencia de modificarse o alterarse artificialmente por alguien en el laboratorio. Tales fuentes en la naturaleza incluyen muestras biológicas (por ejemplo sangre, plasma, suero, fluido vaginal y cervical, secciones de tejido, biopsias, muestras citológicas de pacientes infectados con HPV-16), células cultivadas, así como materiales recombinantes (por ejemplo virus o genoma de HPV-16, bibliotecas genómicas o ADNc, plásmidos que contienen fragmentos de genoma de HPV-16, polipéptidos tempranos recombinantes de HPV-16 y similares). Por lo tanto, el término "polipéptido temprano nativo de HPV-16" incluiría los polipéptidos de HPV-16 y fragmentos tempranos nativos de los mismos. Un fragmento es preferiblemente de por lo menos 9 residuos de aminoácido y comprende por lo menos un epítope inmunogenético. Las secuencias de nucleótido y aminoácido de genes tempranos/polipéptidos de HPV-16 se han descrito en la literatura y están disponibles en los bancos de datos especializados, por ejemplo en Genbank bajo el número de acceso NC_01526 y K02718, respectivamente. Sin embargo, los polipéptidos tempranos nativos de HPV-16 no se limitan a estas secuencias ejemplares. Las secuencias de aminoácido pueden variar de hecho entre diferentes aislados de HPV-16 y este alcance natural de la variación genética es incluido dentro del alcance de la invención. Los fragmentos convenientes para el uso en la presente invención incluyen los péptidos ilustrados en la sección de ejemplo, especialmente el péptido R9F de la SEC ID NO: 5, péptido E9L de SEC ID NO: 9, péptido de polipéptido HPV-16 E6 que corresponde a S9S (SEC ID NO: 8) y el péptido de polipéptido de HPV-16 E7 que corresponde a T9L (SEC ID NO: 10). Tales péptidos se pueden utilizar independientemente o en combinación (por ejemplo en fusión). Un derivado de un polipéptido temprano de HPV-16 incluye uno o más modificaciones con respecto al polipéptido temprano nativo de HPV-16, tal como las definidas abajo. Las modificaciones se pueden generar por mutación y/o adición de porciones químicas (por ejemplo alquilación, acetilación, amidación, fosforilación y similares) o porciones de etiquetado. La mutación incluye la supresión, sustitución o adición de uno o más residuos de aminoácido o cualquier combinación de estas posibilidades. Cuando se contemplan varias modificaciones, pueden referirse a residuos consecutivos y/o a residuos no consecutivos. Las modificaciones se pueden hacer de un número de maneras conocidas por los expertos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio (por ejemplo usando el sistema de mutagénesis in vitro Sculptor™ de Amersham, Les Ullis, Francia), mutagénesis de PCR y estructuración de ADN. Ventajosamente, un polipéptido temprano modificado de HPV-16 conserva un alto nivel de identidad de secuencia de aminoácido con el polipéptido temprano correspondiente nativo de HPV-16 sobre la secuencia de aminoácido integral o un fragmento más corto del mismo (por ejemplo de por lo menos 9, 20, 30, 40, 50, 100 aminoácidos de longitud), que es mayor del 75%, ventajosamente mayor al 80%, deseablemente mayor al 85%, preferiblemente mayor al 90%, más preferiblemente mayor al 95%, aún muy preferiblemente mayor al 97% (por ejemplo 100% de identidad de secuencia). La identidad porcentual entre dos polipéptidos es una función numérica de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, considerando el número de separaciones que necesitan introducirse para la alineación óptima y longitud de cada espacio. Varios programas de computadora y algoritmos matemáticos están disponibles en la técnica para determinar las identidades porcentuales entre las secuencias de aminoácido como por ejemplo el software W2H HUSAR y el programa Blast (por ejemplo Altschul y col., 1997, Nucleic Acid Res. 25, 3389-3402; Altschul y col., 2005, FEBS J. 272, 5101-5109) disponible en NCBI. Deseablemente, el polipéptido temprano modificado de HPV-16 usado de acuerdo a la invención, conserva la actividad inmu nogenética del polipéptido temprano nativo de HPV-16 tal como la capacidad de estimular una inmunorespuesta transmitida por las células. En una modalidad, la composición se utiliza para tratar la infección por HPV y/o condiciones patológicas, especialmente en la zona anogenital, piel o cavidad bucal, causada por al menos un genotipo de HPV distinto a HPV-16. En un aspecto, el genoma por lo menos un virus de papiloma humano comparte menos del 90%, ventajosamente menos del 87% y deseablemente menos del 85% de identidad de secuencia de nucleótido con la porción del genoma de HPV-16 que codifica los polipéptidos E6 o E7 pero más del 50%, ventajosamente más del 55% y deseablemente más del 60% de identidad de secuencia de nucleótido con la porción del genoma de HPV-16 que codifica los polipéptidos E6 o E7. La identidad porcentual entre las porciones de los genomas de HPV es una función numérica de las posiciones idénticas compartidas por las dos secuencias, considerando el número de espacios que necesitan introducirse para la alineación óptima y para la longitud de cada espacio. Varios programas de computadora y algoritmos matemáticos están disponibles en la técnica para determinar las identidades porcentuales entre las secuencias de nucleótido. Los ejemplos representativos de tales genotipos de HPV incluyen sin limitación HPV-2, HPV-6, HPV-11, HPV-13, HPV-18, HPV-30, HPV-31, HPV-32, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-40, HPV-42, HPV-44, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-61 , HPV-64 y HPV-68.

Preferiblemente, por lo menos un virus de papiloma humano distinto a HPV-16 se selecciona entre el grupo que consiste de HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59 y HPV-68V1, y especialmente es cualquiera de HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-52, y HPV-58 o cualquier combinación posible. Los ejemplos representativos de tales combinaciones incluyen HPV-31 y por lo menos uno de HPV-33, HPV-35, HPV-52, y HPV-58; HPV-33 y por lo menos uno de HPV-31, HPV-35, HPV-52, y HPV-58; HPV-35 y por lo menos uno de HPV-31, HPV-33, HPV-52, y HPV-58; HPV-52 y por lo menos uno de HPV-31, HPV-33, HPV-35, y HPV-58; HPV-58 y por lo menos uno de HPV-31, HPV-33, HPV-35 y HPV-52. Las secuencias de nucleótido y aminoácido de estos genotipos de HPV se han descrito en la literatura y están disponibles en los bancos de datos especializados, según lo ilustrado en la Tabla I. Tabla I: Números de acceso de Genbank HPV18 X05015 HPV 31 J04353 HPV33 M12732 HPV35 NC_001529 HPV39 NC_001535 HPV45 X74479 HPV 51 NC_001533 HPV 52 NC_001592 HPV 56 X74483 HPV 58 D90400 HPV 59 NC_001635 HPV68 X67160 En otra modalidad, la composición usada de acuerdo a la invención comprende o codifica un polipéptido E6 de HPV-16, un polipéptido E7 de HPV-16 o ambos. Debido a las observaciones citadas anteriormente en la energía de transformación de los polipéptidos E6 y E7 de HPV-16, los polipéptidos de HPV-16 modificados E6 y/o E7 utilizados preferiblemente, son variantes no oncogénicas transformadas en la región implicada en la interacción con los productos del gen supresor tumoral celular p53 y Rb respectivamente. La presente invención comprende el uso de cualquier polipéptido E6 de HPV-16 que uniéndose a p53 se altera o por lo menos se reduce significativamente y/o el uso de cualquier polipéptido E7 de HPV-16 que al unirse a Rb se altera o por lo menos se reduce significativamente (Munger y col., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105; Crook y col., 1991, Cell 67, 547-556; Heck y col., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 4442-4446; Phelps y col., 1992, J. Virol. 66, 2148-2427). Una variante no oncogénica de HPV-16 E6 que es conveniente para el propósito de la presente invención, se suprime de uno o más residuos de aminoácido localizados aproximadamente desde la posición 118 a aproximadamente la posición 122 (a partir de el primer residuo de metionina del polipéptido nativo E6 de HPV-16 o aproximadamente desde la posición 111 a aproximadamente la posición 115 iniciando en segundo residuo de metionina), con una preferencia especial por la supresión completa de los residuos 118 a 122 (CPEEK). La mayoría de las variantes no oncogénicas preferidas del polipéptido E6 de HPV-16 comprenden o consisten esencialmente de manera alternativa de, o consiste alternativamente de una secuencia de aminoácido que es homologa o idéntica a la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 1. Una variante no oncogénica E7 de HPV-16 que es conveniente para el propósito de la presente invención se suprime de uno o más residuos de aminoácido localizados aproximadamente desde la posición 21 a aproximadamente a posición 26 ( + 1 que representa el primer aminoácido del polipéptido nativo E7 de HPV-16, con una preferencia especial por la supresión completa de los residuos 21 a 26 (DLYCYE). La mayoría de las variante no oncogénicas preferidas del polipéptido E7 de HPV-16 comprenden o consisten de manera alternativa esencialmente de, o consiste alternativamente de una secuencia de aminoácido que sea homologa o idéntica a la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 2. En un aspecto preferido, uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 durante el uso en la invención se modifican adicionalmente para mejorar la presentación de MHC clase I y/o MHC clase II, y/o estimular la inmunidad anti-HPV. Los polipéptidos E6 y E7 de HPV-16 son proteínas nucleares y se ha mostrado previamente que la presentación de membrana permite mejorar su eficacia terapéutica (ver por ejemplo WO99/03885). Por lo tanto, puede ser recomendable modificar por lo menos uno de los polipéptidos tempranos de HPV-16 para fijarse a la membrana celular. La fijación de membrana puede lograrse fácilmente incorporando en el polipéptido temprano de HPV-16 una secuencia de fijación de membrana y si el polipéptido nativo carece de una secuencia secretora (es decir un péptido señal), los polipéptidos E6 y/o E7 de HPV-16 son modificados preferiblemente incorporando una secuencia de fijación de membrana y una secuencia secretora. Las secuencias de fijación de membrana y secretoras se conocen en la técnica. Brevemente, las secuencias secretoras están presentes en la terminal N de los polipéptidos presentados o secretados en la membrana e inician su paso en el retículo endopl ásmico. Comprenden generalmente de 15 a 35 aminoácidos esencialmente hidrofóbicos que entonces se remueven por una endopeptidasa específica localizado por ER para proporcionar el polipéptido maduro. Las secuencias de fijación de membrana por lo general son altamente hidrofóbicas en su naturaleza y sirven para fijar los polipéptidos en la membrana celular (ver por ejemplo a Branden y Tooze, 1991, en Introduction to Protein Structure p. 202-214, NY Garland). Es extensa la elección de las secuencias de fijación de membrana y secretoras que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención. Se pueden obtener de cualquier polipéptido fijado a la membrana y/o secretado que la comprende (por ejemplo los polipéptidos celulares o virales), tal como la glicoproteína de virus rábico, de la glicoproteína que cubre el virus de VIH o de la proteína de virus de sarampión F o pueden ser sintéticas. Las secuencias de fijación de membrana y secretoras insertadas en cada uno de los polipéptidos tempranos de HPV-16 usados de acuerdo a la invención, pueden tener un origen común o diferente. El sitio preferido de inserción de la secuencia secretor es la terminal N hacia abajo del codón para el inicio de la traducción y el de la secuencia de fijación de membrana es la terminal C, por ejemplo inmediatamente hacia arriba desde el codón de parada. Por otra parte, un péptido de enlace se puede utilizar para conectar la secuencia secretora con el polipéptido temprano de HPV-16 durante el uso en la invención o para conectar el polipéptido temprano de HPV-16 con la secuencia de fijación de membrana. Los péptidos de enlace se conocen en la técnica. Contienen comúnmente de 2 a 20 aminoácidos que incluyen alanina, glicina, prolina y/o serina. El polipéptido E6 de HPV-16 durante el uso en la presente invención es modificado preferiblemente por la inserción de las señales secretoras y de fijación de membranas de la proteína del sarampión F, con una preferencia especial por un polipéptido que comprende o consiste de manera alternativa esencialmente de, o que consiste alternativamente de una secuencia de aminoácido que es homologa o idéntica a la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 3. Opcionalmente o en combinación, el polipéptido E7 de HPV-16 durante el uso en la presente invención es modificado preferiblemente por la inserción de las señales secretoras y de fijación de membranas de la glicoproteína del virus rábico rabia, con una preferencia especial por un polipéptido que comprende o consiste de manera alternativa esencialmente de, o que consiste alternativamente de una secuencia de aminoácido que es homologa o idéntica a la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 4. En otro y más preferido aspecto, la eficacia terapéutica de la composición durante el uso en la invención también puede ser mejorado usando uno o más polipéptidos ¡nmunopotenciadores o uno o más ácido nucleicos que codifican tales polipéptidos ¡nmunopotenciadores. Por ejemplo, puede ser ventajoso unir los polipéptidos tempranos de HPV-16 a un polipéptido tal como calreticulina (Cheng y col., 2001, J. Clin. Invest. 108, 669-678), proteína 70 de choque térmico de tuberculosis de micobacteria (HSP70) (Chen y col., 2000, Cáncer Res. 60, 1035-1042), ubiquitina (Rodríguez y col., 1997, J. Virol. 71, 8497 -8503) o una toxina bacteriana tal como el dominio de desplazamiento de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (ETA (dlll)) (Hung y col., Cáncer Res. 2001 61, 3698-3703). Alternativamente, la composición durante el uso en la presente invención puede comprender adicionalmente una citocina o un ácido nucleico que codifica un citocina. Los citocinas convenientes incluyen sin limitación la interleucina-2, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21 e IFNg, con una preferencia especial por IL-2. De acuerdo a otra y preferida modalidad, la composición durante el uso de acuerdo a la invención comprende un ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 según lo definido anteriormente. Se prefiere un ácido nucleico que codifica por lo menos: o un polipéptido E6 de HPV-16 que comprende o que consiste de manera alternativa esencialmente de, o que consiste alternativamente de una secuencia de aminoácido que es homologa o idéntica a la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 3; y o un polipéptido E7 de HPV-16 que comprende o que consiste de manera alternativa esencialmente de, o que consiste alternativamente de una secuencia de aminoácido que es homologa o idéntica a la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 4. Si se necesita, la molécula de ácido nucleico durante el uso en la invención se puede optimizar para proporcionar la expresión de alto nivel de los polipéptidos tempranos de HPV-16 en una célula o organismo hospedador particular, por ejemplo una célula o organismo hospedador humano. Comúnmente, la optimización del codón es realizada sustituyendo uno o más codones "nativos" (por ejemplo HPV) que corresponden a un codón utilizado en pocas ocasiones en la célula hospedadora mamífera por uno o más codones que codifican el mismo aminoácido que se utiliza con más frecuencia. Esto se puede lograr por la mutagénesis convencional o por técnicas sintéticas químicas (por ejemplo dando por resultado un ácido nucleico sintético). No es necesario sustituir todos los codones nativos que corresponden a los codones usados con poca frecuencia, puesto que la expresión creciente se puede lograr incluso con el reemplazo parcial. Por otra parte, algunas desviaciones de la adherencia estricta al codón optimizado se pueden hacer para ajustar la introducción de sitios de restricción. Preferiblemente, el ácido nucleico de codificación de polipéptido temprano de HPV-16 durante el uso en la invención está en una forma conveniente para su expresión en una célula o organismo hospedador, así que significa que la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido E6 y/o la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido E7, están colocadas bajo control de uno o más elementos reguladores necesarios para la expresión en la célula o organismo hospedador. Según lo utilizado en la presente, el término "elemento regulador" se refiere a cualquier secuencia que permita, contribuya o module la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora dada, incluyendo la réplica, duplicación, transcripción, unión, traducción, estabilidad y/o transporte del ácido nucleico o su derivado (es decir mARN) en la célula hospedadora. Será apreciado por los expertos en la técnica que la elección de los elementos reguladores pueda depender de factores tales como la célula hospedadora , vector y nivel de expresión deseados. El promotor es de importancia especial y la presente invención comprende el uso de los promotores constitutivos que dirigen la expresión del ácido nucleico en muchos tipos de células hospedadoras y que dirigen la expresión solamente en ciertas células hospedadoras o en respuesta a acontecimientos específicos o factores exógenos (por ejemplo por temperatura, aditivo nutriente, hormona u otro ligando). Los promotores convenientes se describen ampliamente en la literatura y se puede citar a promotores virales más específicamente tales como promotores de RSV (virus de sarcoma de Rous), SV40 (virus 40 de simio), promotores CMV (citomegalovirus) y MLP (promotor principal). Los promotores preferidos para el uso en un vector poxviral incluyen sin limitación los promotores de vacuna 7.5K, H5R, TK, p28, p 11 y K1L, promotores quiméricos entre los promotores poxvirales temprano y tardío así como promotores sintéticos tales como ésos descritos en Chakrabarti y col. (1997, Biotechniques 23, 1094-1097), Hammond y col. (1997, Virologic Methods 66, 135-138 del J.) y Kumar y Boyle (1990, Virology 179, 151-158). Los expertos en la técnica apreciarán que los elementos reguladores que controlan la expresión del ácido nucleico puedan comprender adicionalmente los elementos adicionales para la iniciación apropiada, regulación y/o terminación de la transcripción (por ejemplo secuencias de terminación de transcripción de polyA), transporte de mARN (por ejemplo secuencias señal nucleares de localización), procesamiento (por ejemplo señales de unión), estabilidad (por ejemplo intrones y secuencias 5' y 3' no codificadoras), y traducción (por ejemplo secuencias principales tripartitas, sitios de unión de ribosoma, secuencias Shine-Dalgamo, etc.) en la célula o organismo hospedador. De acuerdo a otra modalidad preferida, el ácido nucleico usado de acuerdo a la presente invención está comprendido en un vector. El término "vector" según lo utilizado en la presente se refiere a vectores virales así como no virales (por ejemplo de ADN de plásmido), incluyendo vectores extracromosómicos (por ejemplo episoma), multicopia y de integración (es decir para incorporarse en los cromosomas del hospedador). Son particularmente importantes en el contexto de la invención los vectores de terapia genética (es decir que son capaces de entregar el ácido nucleico a un organismo hospedador) asi como los vectores de expresión para el uso en varios sistemas de expresión. Los vectores no virales convenientes incluyen plásmidos tales como pREP4, pCEP4 (Invitrogene), pCI (Promega), pCDM8 (Seed, 1987, naturaleza 329, 840), pVAX y pgWiz (Gene Therapy System Inc; Himoudi y col., 2002, J. Virol. 76, 12735-12746). Los vectores virales convenientes se pueden derivar de una variedad de diferentes virus (por ejemplo retrovirus, adenovirus, AAV, poxvirus, virus del herpes, virus del sarampión, virus espumoso y similares). Según lo utilizado en la presente, el término "vector viral" comprende la ADN vectorial así como partículas virales generadas del mismo. Los vectores virales pueden ser competentes para la replicación, o pueden ser lisiados de manera genética para que sean defectuosos para la replicación o deteriorados para la replicación. El término "competente para la replicación" según lo utilizado en la presente comprende los vectores virales selectivos para la replicación y los replicados de manera condicional que se diseñan para replicarse mejor o selectivamente en las células hospedadoras específicas (por ejemplo células tumorales). En un aspecto, el vector durante el uso en la invención es un vector adenoviral (para una revisión, ver los "Adenoviral vectors for gene therapy", 2002, Ed D. Curiel y J. Douglas, Academic Press). Puede derivarse de una variedad de fuentes humanas o anímales y cualquier serotipo se puede utilizar de los serotipos de adenovirus 1 a 51. Particularmente preferidos son los adenovirus humanos 2 (Ad2), 5 (Ad5), 6 (Ad6), 11 (Ad11), 24 (Ad24) y 35 (Ad35). Tal adenovirus está disponible de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, d.) y ha sido sujeto de numerosas publicaciones que describen su secuencia, organización y métodos de producción, permitiendo que el experto los aplique (ver por ejemplo US 6,133,028; US 6.110.735; WO 02/40665; WO 00/50573; EP 1016711; Vogels y col., 2003, J. Virol. 77, 8263-8271). El vector adenoviral durante el uso en la presente invención puede ser competente para la replicacion. Los numerosos ejemplos de vectores adenovirales competentes para la replicacion están fácilmente disponibles para los expertos en la técnica (Hernández-Alcoceba y col., 2000, Human Gene Ther. 11, 2009-2024; Nemunaitis et al., 2001, Gene Ther. 8, 746-759; Alemany et al., 2000, Nature Biotechnology 18, 723-727). Por ejemplo, pueden ser diseñados a partir de un genoma de adenovirus silvestre por la supresión en el dominio E1A CR2 (por ejemplo WO00/24408) y/o por el reemplazo de los promotores nativos E1 y/o E4 con los promotores de estado específicos de tejido, tumor o célula (por ejemplo US 5,998,205, WO99/25860, US 5,698,443, WO00/46355, WO00/15820 y WO01/36650). Alternativamente, el vector adenoviral durante el uso en la invención es defectuoso para la replicacion (ver por ejemplo W094/28152; Lusky y col., 1998, J. Virol 72, 2022-2032). Los vectores adenoviral defectuosos para la replicacion preferidos son los defectuosos a E1 (por ejemplo US 6,136,594 y US 6,013.638), con una supresión de E1 que se extiende de aproximadamente las posiciones 459 a 3328 o de aproximadamente las posiciones 459 a 3510 (por referencia a la secuencia del adenovirus humano tipo 5 descrito en GeneBank bajo número de acceso M 73260 y en Chroboczek y col., 1992, Virol. 186, 280-285). La capacidad de clonación puede ser mejorada adicionalmente suprimiendo las porciones adicionales del genoma adenoviral (todo o una parte de la región no esencial E3 o de otras regiones esenciales E2, E4). La inserción del ácido nucleico se puede realizar con la recombinación homologa en cualquier localización del genoma adenoviral según lo descrito en Chartier y col (1996, J. Virol. 70, 4805-4810). Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica el polipéptido E6 de HPV-16 se puede insertar en lugar de la región E1 y el ácido nucleico que codifica el polipéptido E7 de HPV-16 en lugar de la región E3 o viceversa.

En otro y preferido aspecto, el vector durante el uso en la invención es un vector poxviral (ver por ejemplo Cox y col. en "Viruses in Human Gene Therapy" Ed J. M. Hos, Carolina Academic Press). Se puede obtener de cualquier miembro de los poxvirus, particularmente canaripox, fowlpox y virus de vacuna, este último es preferido. Los virus de vacuna convenientes incluyen sin limitación la cepa Copenhaguen (Goebel y col., 1990, Virol. 179, 247-266 y 517-563; Johnson y col., 1993, Virol. 196, 381-401), cepa Wyeth y la cepa Ankara (MVA) modificada altamente atenuada (Mayr y col., 1975, Infection 3, 6-16). La determinación de la secuencia completa del genoma de MVA y la comparación con el genoma Copenhaguen ha permitido la identificación exacta de siete supresiones (I a VII) que ocurrieron en el genoma de MVA (Antoine y col., 1998, Virology 244, 365-396), que se pueden utilizar para insertar el ácido nucleico de codificación de polipéptido temprano de HPV-16. La técnica básica para insertar el ácido nucleico y los elementos reguladores asociados requeridos para la expresión en un genoma poxviral se describen en numerosos documentos accesibles para el experto en la técnica (Paul y col., 2002, Cáncer gene Ther. 9, 470-477; Piccini y col., 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563; US 4,769,330; US 4,772,848; US 4,603,112; US 5,100,587 y US 5,179,993). Generalmente, se procede a través de la recombinación homologa entre secuencias de traslapo (es decir flanqueando el sitio deseado de inserción) presentes en el genoma viral y en un plásmido que lleva el ácido nucleico para la inserción. El ácido nucleico se inserta preferiblemente en un lugar no esencial del genoma poxviral, para que el poxvirus recombinante siga siendo viable e infeccioso. Las regiones no esenciales son las regiones intergenéticas de no codificación o cualquier gen para el cual la inactivación o supresión no deteriora significativamente el crecimiento, réplica o infección viral. También se puede considerar la inserción en un lugar viral esencial con la condición que la función defectuosa se suministre in trans durante la producción de partículas virales, por ejemplo usando una línea celular auxiliar que lleva las secuencias de complementación que corresponden a las suprimidos en el genoma poxviral. Al usar el virus de vacuna de Copenhaguen, el ácido nucleico que codifica el polipéptido temprano de HPV-16 se inserta preferiblemente en el gen de timidina cinasa (tk) (Hruby y col., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci USA 80, 3411-3415; Weir y col., 1983, J. Virol. 46, 530 -537). Sin embargo, otros sitios de inserción también son apropiados, por ejemplo en el gen de hemaglutinina (Guo y col., 1989, J. Virol. 63, 4189-4198), en el lugar de K1L, en el gen u (Zhou y col., 1990, J. Gen Virol 71, 2185-2190) o en el extremo izquierdo del genoma del virus de vacuna donde una variedad de supresiones espontáneas o diseñadas se han descrito en la literatura (Altenburger y col., 1989, Archives Virol. 105, 15-27; Moss y col. 1981, J. Virol. 40, 387- 395; Panicali y col., 1981, J. Virol. 37, 1000-1010; Perkus y col., 1989, J. Virol. 63, 3829- 3836; Perkus y col., 1990, Virol. 179, 276-286; Perkus y col., 1991, Virol. 180, 406-410). Al usar MVA, el ácido nucleico de codificación de polipéptido temprano de HPV-16 se puede insertar en cualquiera de las supresiones identificadas I a VII así como en el lugar de D4R, pero la inserción en la supresión II ó III es preferida (Meyer y col., 1991, J. Gen Virol 72, 1031 -1038; Sutter y col., 1994, Vaccine 12, 1032-1040). Al usar el virus fowlpox, aunque la inserción dentro del gen de timidina cinasa pueda considerarse, el ácido nucleico de codificación de polipéptido temprano de HPV-16 se introduce preferiblemente en la región intergenéticoa situada entre ORFs 7 y 9 (ver por ejemplo EP 314 569 y US 5,180,675).

Como se describió anteriormente, la composición durante el uso en la invención puede comprender adicionalmente un ácido nucleico de expresión de citocina. Puede ser llevado por el vector que codifica uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 o por un vector independiente que puede ser de una mismo o diferente origen. Una modalidad preferida de la invención se dirige al uso de una composición que comprende un vector de MVA que codifica el polipéptido E6 de HPV-16 colocado debajo del promotor 7.5K, el polipéptido de HPV-16 E7 colocado debajo del promotor 7.5K y el gen humano IL-2 colocado bajo control del promotor H5R. Preferiblemente, los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido E6 de HPV-16, el polipéptido E7 de HPV-16 y IL-2 humana se insertan en la supresión III del genoma de MVA. Además, la composición durante el uso en la invención puede incluir uno o más sustancias estabilizadoras, tales como lípidos (por ejemplo lípidos, liposomas, lípidos catiónicos según lo descrito en W098/44143), los inhibidores de nucleasa, hidrogel, hialuronidasa (W098/53853) , colagenasa, polímeros catiónicos, polisacáridos, agentes quelantes (EP890362), para mantener su degradación dentro del cuerpo animal/humano y/o para mejorar la transfección/i nfección del vector en la célula o organismo hospedador. Tales sustancias se pueden utilizar solas o en combinación (por ejemplo lípidos catiónicos y neutrales). Las partículas virales infecciosas que comprenden el ácido nucleico o los vectores descritos antes se pueden producir por un proceso rutinario. Un proceso ejemplar comprende las etapas de: (a) introducir el vector viral en una línea celular conveniente, (b) cultivar la línea celular bajo condiciones convenientes para permitir la producción de partículas virales infecciosas, (c) recuperar de las partículas virales infecciosas producida a partir del cultivo de la línea celular, y (d) opcionalmente purificar las' partículas virales infecciosas recuperadas. Cuando el vector viral es defectuoso, las partículas infecciosas se producen generalmente en una línea celular de complementación o vía el uso de un virus auxiliar, que suministra in trans los genes virales no funcionales. Por ejemplo, líneas celulares convenientes para complementar los vectores adenovirales suprimidos de E1, incluyen 293 células (Graham y col., 1997, J. Gen Virol 36, 59-72) así como las células PER-C6 (Fallaux y col., 1998, Human Gene Ther. 9, 1909-1917). Las células apropiadas para propagar los vectores de poxvirus son células aviares, y más preferiblemente fibroblastos primarios de embrión de pollo y se prepararon a partir de embriones de pollo obtenidos de huevos fertilizados. Las partículas virales infecciosas se pueden recuperar del cultivo flotante o de las células después de lisis (por ejemplo por medios químicos, congelamiento/descongelamiento, choque osmótico, choque mecánico, tratamiento sónico y similares). Las partículas virales se pueden aislar por ciclos consecutivos de purificación de placa y después purificarse usando las técnicas conocidas (métodos cromatográficos, ultracentrifugación en cloruro de cesio o gradiente de sucrosa). La presente invención también comprende el uso de vectores o partículas virales que se han modificado para permitir la detección preferencial de una célula hospedadora objetivo particular (ver por ejemplo a Wickam y col., 1997, J. Virol. 71, 8221-8229; Arnberg y col., 1997, Virol. 227, 239-244; Michael y col., 1995, Gen Therapy 2, 660-668; W094/10323; WO02/96939 y EP 1 146 125). Una característica de los vectores detectados y de partículas virales es la presencia en su superficie de un ligando capaz de reconocimiento y unión a un componente celular y expuesto superficialmente tal como un marcador específico celular (por ejemplo una célula infectada con HPV), un marcador tisular específico (por ejemplo un marcador cervical específico), así como un antígeno viral (por ejemplo HPV). Los ejemplos de lígandos convenientes incluyen los anticuerpos o fragmentos de los mismos dirigidos a un dominio antigénico de HPV. El ligando generalmente genético se inserta en un polipéptido presente en la superficie del virus (por ejemplo fibra adenoviral, penton, pIX o producto genético de vacuna pl4). La composición durante el uso la presente invención se puede producir por cualquier método conveniente, por ejemplo, por técnicas estándar de sintetización de péptido (por ejemplo Bodanszky, 1984 en Principies of peptide synthesis, Springer-Verlag) y por la tecnología de ADN recombinante en células hospedadoras apropiadas. Por ejemplo, la codificación de ácido nucleico para los polipéptidos tempranos E6 y E7 de HPV-16, se puede aislar directamente de las células que contienen HPV (por ejemplo células de Caski), bibliotecas de ADNc y genómicas, los genomas virales o cualquier vector de la técnica anterior conocidos por incluirlo, por biología molecular convencional o técnicas de PCR. Si es necesario, se puede modificar adicionalmente por técnicas de mutagénesis rutinaria. Alternativamente, el ácido nucleico durante el uso en la invención también se puede generar por síntesis química en un proceso automatizado (por ejemplo montado desde los oligonucleótidos sintéticos traslapados según lo descrito por ejemplo en Edge, 1981, Nature 292, 756; Nambair y col., 1984, Science 223, 1299; Jay y col., 1984, J. Biol. Chem. 259, 6311). Los expertos en la técnica están bien informados con respecto a los numerosos sistemas de expresión disponibles para producir los polipéptidos tempranos de HPV-16 en células hospedadoras apropiadas y con respecto a los métodos para introducir un vector o partícula viral infecciosa en una célula hospedadora. Un uso preferido de la composición de acuerdo a la invención es para tratar una variedad de enfermedades y condiciones patológicas, especialmente las asociadas a una infección por HPV causada por al menos uno de los genotipos de HPV enumerados anteriormente. Aunque la invención también comprende la profilaxis, es especialmente útil para la terapia, por ejemplo tratar la infección persistente de HPV, condiciones precancerosas así como cancerosas que pueden desarrollarse en pacientes infectados con HPV. Los ejemplos de condiciones cancerosas asociadas a HPV incluyen carcinoma cervical, carcinoma anal y cáncer oral. Las condiciones precancerosas asociadas HPV oscilan de lesiones de bajo grado a lesiones de alto grado incluyendo neoplasia intraepitelial cervical (CEST, por sus siglas en inglés) del grado 1, 2 ó 3. Preferiblemente, sobre la administración en un organismo hospedador de acuerdo a las modalidades descritas en la presente, la composición de la invención proporciona una ventaja terapéutica al organismo hospedador tratado. La ventaja terapéutica se puede evidenciar por un número de maneras con respecto a antes del tratamiento, por ejemplo en un nivel de población por una disminución de la frecuencia de infecciones por HPV, por un retardo del desarrollo de una condición patológica asociada comúnmente a la infección por HPV (por ejemplo retardo en el desarrollo de las lesiones de CIN o cánceres cervicales) o en el nivel individual por una disminución de viremia de HPV, y/o una inhibición de la expresión de gen viral (por ejemplo una disminución de ARNs de expresión de E6 o E7 de HPV) y/o por una mejora del resultado clínico (por ejemplo estabilización, retroceso parcial o total de una lesión asociada a HPV) y/o por un estímulo del sistema inmunológico dando por resultado el desarrollo de una respuesta anti-HPV mejorada si es humoral o celular o ambas (por ejemplo producción de anticuerpos anti-HPV y/o inmunidad mediada por células T) y/o por una respuesta mejorada del organismo hospedador a las terapias convencionales. Por ejemplo, la composición usada de acuerdo a la invención proporciona una ventaja cuando su administración a las mujeres positivas a HPV es seguida por (i) una detección negativa a HPV que sigue a uno o más detecciones positivas, (ii) una regresión de las lesiones de alto grado CIN2/3 a grado bajo CIN 1 o (iii) una estabilización o regresión de un carcinoma cervical invasivo. Es recomendado un seguimiento regular de los pacientes después del tratamiento durante un mínimo de 6 meses.

La presencia de HPV se puede determinar en el fluido biológico (por ejemplo fluidos cervicales o vaginales, sangre, suero, plasma), muestras ginecológicas recolectadas usando el dispositivo de muestreo cervical convencional, secciones tisulares, y biopsias. Una variedad de métodos están disponibles para los expertos en la técnica para evaluar la presencia de ADN y ARN de HPV en una muestra, tal como el sistema LiPA (W099/14377; Labo Biomedical producís, Países Bajos), Pre Tect HPV Proofer (NorChip COMO, Noruega), sistema Hybrid Capture II (Digen Corp, US), Thin Prep System (Cytyc corporativo; Marlborough, MA) y sistemas de PCR/RT-PCR. Los cebadores convenientes son conocidos por el experto o se pueden sintetizar fácilmente en base a la secuencia de nucleótido del genotipo de HPV de interés. También se puede proceder por análisis de inmunogeneticidad (por ejemplo ELISA) usando los anticuerpos convenientes. La regresión o estabilización de una lesión inducida por HPV puede ser determinada midiendo el tamaño real de la lesión durante el transcurso del tiempo. La observación directa (por ejemplo colposcopía), métodos radiológicos de representación gráfica, métodos inmunológicos de representación gráfica o ultrasonido se pueden utilizar para calcular el tamaño de la lesión en un cierto periodo de tiempo. Además, una variedad de métodos in vitro se pueden utilizar para pronosticar la estabilización o regresión de una lesión asociada a HPV en un organismo hospedador, tal como el análisis citológico e histológico para calcular la presencia de células anormales. El estímulo de una inmunorespuesta anti-HPV se puede calcular con un número de técnicas rutinarias tales como las descritas más abajo con respecto al uso de la composición para inducir o estimular una inmunorespuesta. Convenientemente, la composición de la invención adicionalmente comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Según lo utilizado en la presente, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" tiene el propósito de incluir cualquiera y todos los portadores, solventes, diluyentes, excipientes, adyuvantes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antihongos, y agentes de retrasóte absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluidos en la composición también deben permitir conservar su estabilidad bajo condiciones de fabricación y almacenamiento de larga duración (es decir durante al menos un mes) en congelamiento (por ejemplo -70°C, -20°C), en refrigeración (por ejemplo 4°C) o temperatura ambiente (por ejemplo 20°C) o en un estado liofilizado. La composición durante el uso en la invención se amortigua convenientemente para ser apropiada para el uso humano a un pH fisiológico o ligeramente básico (por ejemplo entre aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 9). Los amortiguadores convenientes incluyen sin limitación el amortiguador de fosfato (por ejemplo PBS), amortiguador de bicarbonato y/o amortiguador de Tris. Además puede comprender un diluyente apropiado para el uso humano o animal. Tal diluyente es preferiblemente isotónico, hipotónico o débilmente hipertónico y tiene una fuerza iónica relativamente baja. Los ejemplos representativos incluyen agua estéril, solución salina fisiológica (por ejemplo cloruro sódico), solución de Ringer, glucosa, soluciones de trehalosa o sacarosala solución de Hank, y otras soluciones de sal acuosas fisiológicamente equilibradas (ver por ejemplo la edición más actual de Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A.

Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins). La composición también puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables para proporcionar características farmacéuticas o farmacodinámicas deseables, incluyendo por ejemplo la modificación o mantenimiento de la osmolaridad, viscosidad, claridad, color, esterilidad, estabilidad, índice de disolución de la formulación, liberación o absorción de modificación o mantenimiento en el organismo humano o animal, promoviendo el transporte a través de la barrera de sangre o penetración en un órgano particular (por ejemplo hígado). Los excipientes convenientes incluyen los aminoácidos. Además, la composición se puede utilizar en combinación con los adyuvantes convencionales convenientes para la aplicación sistémica o en la mucosa en humanos. La composición se puede administrar al organismo hospedador por una variedad de modos de administración, incluyendo la administración sistémica, tópica y localizada. Las rutas convenientes de administración incluyen sin limitación la inyección subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intravascular, e intrarterial. Las inyecciones se pueden hacer con jeringas y agujas convencionales, o cualquier otro dispositivo apropiado disponible en la técnica. La composición se puede administrar alternativamente vía una ruta de mucósica, tal como la ruta oral/alimenticia, nasal, intratraqueal, intrapulmonar, intravaginal o ¡ntrarrectal. La administración tópica también puede ser realizada usando los medios transdérmicos (por ejemplo parches y similares). En el contexto de la invención, las administraciones intramusculares y subcutáneas constituyen las rutas preferidas. La administración puede ocurrir en una sola dosis o una dosis repetida de una o varia veces después de cierto intervalo de tiempo que variara a partir de un día a un año. Deseablemente, los intervalos son cuestión de una semana a un mes. La dosificación apropiada se puede adaptar en función de varios parámetros, particularmente el modo de administración; composición utilizada; edad, salud, y peso del organismo hospedador; naturaleza y grado de síntomas; clase de tratamiento concurrente; frecuencia de tratamiento; y/o necesidad de prevención o terapia. Además el refinamiento de los cálculos necesarios para determinar la dosificación apropiada es hecho de manera rutinaria por un médico, considerando las circunstancias relevantes. Para la dirección general, la dosificación conveniente para una composición que contiene la vacuna variará de aproximadamente 1 O4 a 109 pfu (unidades de formación de placa), deseablemente aproximadamente 105 y 108 pfu mientras que la composición que comprende el adenovirus variará de aproximadamente 105 a 1013 iu (unidades infecciosas), deseablemente de aproximadamente 107 y 1011 iu. Una composición basada en plásmidos vectoriales se puede administrar en una dosis de entre 10 ng y 20 pg, ventajosamente entre 100 pg y 2 mg. Una composición de proteína se puede administrar en dosis entre 10 ng y 20 mg, con una preferencia especial por una dosificación de aproximadamente 0.1 pg a aproximadamente 2 mg por kg de peso corporal. En una modalidad preferida, la composición durante el uso en la invención comprende el vector de MVA descrito antes y es administrada en tres dosis de 5 x 1 O5 pfu a 5 x 107 pfu por la ruta subcutánea en intervalos semanales. Si se desea, el uso de la invención se puede realizar en combinación con una o más modalidades terapéuticas convencionales (por ejemplo radiación, quimioterapia y/o cirugía).

Los métodos terapéuticos múltiples proporcionan al paciente una intervención basada más amplia. En una modalidad, el método de la invención se puede preceder o seguir preferiblemente por una escisión quirúrgica de la lesión asociada a HPV (por ejemplo conización). En otra modalidad, se puede preceder o seguir por radioterapia (por ejemplo radiación gamma). Los expertos en la técnica pueden formular fácilmente los protocolos y parámetros apropiados de radioterapia que pueden utilizarse (ver por ejemplo Pérez y Brady, 1992, 1992, Principies and Practice of Radiation Oncology, 2nd Ed. JB Lippincott Co; usando las adaptaciones y modificaciones apropiadas como será fácilmente evidente para los expertos en el campo). En aún otra modalidad, el método o uso de la invención se asocia a la quimioterapia con uno o más fármacos que se utilizan convencionalmente para tratar o prevenir infecciones por HPV, condiciones patológicas asociadas a HPV. En otra modalidad, el uso de la invención se realiza de acuerdo a una primera modalidad terapéutica de refuerzo que comprende la administración secuencial de una o más composiciones de cebado y una o más composiciones de refuerzo. Comúnmente, las composiciones de cebado y refuerzo utilizan diferentes vehículos que comprenden o codifican por lo menos un dominio inmunogenético de campo común. La composición de cebado se administra inicialmente al organismo hospedador y la composición de refuerzo se administra posteriormente después de un periodo de tiempo que varía de un día a doce meses. Por otra parte, las composiciones de cebado y refuerzo se pueden administrar en el mismo sitio o en sitios alternativos por la misma ruta o por diferentes rutas de administración. Por ejemplo, una composición de cebado basada en polipéptidos tempranos de HPV-16 se puede administrar por una ruta mucósica mientras que una composición de refuerzo basada en vector de ácido nucleico se inyecta preferiblemente, por ejemplo inyección subcutánea para un vector de MVA, inyección intramuscular para un plásmido de ADN y para un vector adenoviral. La presente invención también pertenece al uso de una composición que comprende uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 o un ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 para inducir o estimular una inmunorespuesta contra por lo menos un virus de papiloma humano distinto a HPV-16. La invención también se relaciona a un método para inducir o estimular en un mamífero una inmunorespuesta contra por lo menos un virus de papiloma humano distinto a HPV-16, el método comprende administrar al mamífero una composición que comprende uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 o un ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16. La inmunorespuesta es preferiblemente una inmunorespuesta celular dirigida a un polipéptido temprano de HPV, con una preferencia por una inmunorespuesta mediada por CD4 + , CD8+ o CD4+ y CD8 + . La capacidad de inducir o estimular una inmunorespuesta anti-HPV durante la administración en un organismo animal o humano se puede evaluar in vitro o in vivo usando una variedad de análisis que sea estándar en la técnica. Para una descripción general de las técnicas disponibles para evaluar el inicio y estímulo de una inmunorespuesta, ver por ejemplo Coligan y col. (1992 y 1994, Current Protocols in Immunology; ed J Wiley and Sons inc, National Institute of Health). La medición de la inmunidad celular se puede realizar por la medición de los perfiles de citocina secretados por las células efectoras activadas incluyendo las derivados de las células T CD4+ y CD8+ (por ejemplo cuantificación de IL-10 o células de producción de IFNgde por ELIspot), por la determinación del estado de activación de las células efectoras inmunes (por ejemplo análisis de proliferación de células T por una absorción clásica de [3H] timidina), probando los linfocitos T de antígeno específico en un tema sensibilizado (por ejemplo lisis de péptido específico en un análisis de citotoxicidad), por actividad citolítica antitumor mediada por linfocitos determinada por ejemplo, por un análisis de liberación de 51Cr. La capacidad de estimular una respuesta humoral se puede determinar por la unión de anticuerpo y/o competición de unión (ver por ejemplo 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press) o por generación in Vitro de la inhibición mediada por anticuerpo de tumor específico del crecimiento celular (Gazit y col., 1992, Cáncer Immunol. Immunother 35, 135-144). El método de la invención también se puede validar adicionalmente en los modelos animales desafiados con un agente de inducción tumoral apropiado (por ejemplo células TC1 de expresión de E6 y E7) a determinar la actividad antitumoral, reflejando una inducción o estímulo de una inmunorespuesta anti-HPV. La invención se ha descrito de una manera ilustrativa, y se debe entender que la terminología que se ha utilizado está pensada para estar en la naturaleza descriptiva de las palabras en lugar de ser una limitación. Obviamente, muchas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles en el campo de las enseñanzas anteriores. Por lo tanto se debe entender que dentro del alcance de las reivindicaciones anexas, la invención se puede practicar de una manera diferente qué se describe específicamente en la presente. Todas las descripciones citadas anteriormente de las patentes, publicaciones y entradas de base de datos, son incorporadas específicamente en la presente por referencia en su totalidad al mismo grado como si cada patente, publicación o entrada individual indicada específica e individualmente estuviera incorporada por referencia. Descripción de las figuras La figura ilustra MVATG8042. La figura 2 ilustra el análisis ELISPOT de IFNg de E7/E6 específicos (medios/grupo). Los grupos son definidos por el inmunógeno usado, MNA N33 (blanco) o MVATG8042 (gris). Los resultados se representan como el punto medio del grupo inmunizado. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención. Ejemplos Materiales y métodos Virus MVATG8042 (figura 1) es un virus recombinante de MVA que expresa variantes fijas a la membrana y no oncogénícas de los poiipéptidos E6 y E7 de HPV-16 (E6*TMF y E7*TMR) así como IL-2 humana. MVATG8042 se describe en WO99/03885 y US 6,884,786. Las secuencias del gen HPV-16 se colocan bajo control del promotor p7.5K mientras que el gen IL-2 es conducido por el promotor H5R y todos se insertan en la región de supresión III del genoma de MVA. Las partículas del virus VATG8042 se producen en células CEF de acuerdo a las técnicas convencionales. La acción del virus fue mantenida a -80°C hasta el día de la inyección. La suspensión viral fue descongelada rápidamente, y diluida antes de la administración en un amortiguador TG0008 que contiene Tris-HCI 10 mM pH 8, 5% sacarosa (peso/volumen), y 50 mM NaCI, para obtener la dosis viral de 5 x 107 pfu en un volumen de 100 µ?. Modelo animal Los ratones C57B1/6 hembra sanos SPF fueron obtenidos de Charles River (Les Oncins, Francia). Los animales fueron alojados en una sola habitación, exclusiva con aire acondicionado para proporcionar un mínimo de 11 cambios de aire por hora. Los intervalos de temperatura y humedad relativa estuvieron dentro de 18°C y 22°C y de 40 a 70% respectivamente. La iluminación fue controlada automáticamente para dar un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. A través del estudio, los animales tuvieron acceso libre al RM1 esterizado de tipo dietético (SDS, Francia). El agua estéril fue proporcionada libremente vía botellas. Los ratones C57B1/6 hembras de 7 semanas de edad fueron inmunizados subcutáneamente 3 veces el día 0, 7 y 14 con 5 x 107 pfu de MVATGN33 o VATG8042. Las inyecciones subcutáneas fueron realizadas cada vez en una diferente localización del flanco derecho de los animales. Los bazos fueron extraídos el día 21 después de la última inmunización. Las células frescas del bazo fueron preparadas usando técnicas convencionales conicidad. Una placa de nitrocelulosa de 96 pozos estuvo cubierta con 3 Mg/ml de anticuerpo monoclonal de IFNg anti-ratón de rata (Clone R4-6A2; Pharmingen, Cat No. 551216, 100 µ?/????) en amortiguador de carbonato sódico. Las placas fueron incubadas durante la noche a 4°C o 1 h a 37°C. Las placas fueron lavadas tres veces con DME 10% FCS y saturadas 2 horas a 37°C con 100 µ? DMEM 10% FSC/pozo. Los esplenocitos fue colocados en placas a una concentración de 106 células/100 µ?. IL-2 fue agregada a los pozos a una concentración de 6U/50 µ?/???? (R&D Systems; 10 ng/ml). La concan avilina A fue utilizada como control positivo (5 pg/ml).

Todos los péptidos fueron sintetizados por Neosystem. Cada péptido fue disuelto en DMSO a 10 mg/ml y se almacenaron a 4°C. Los péptidos fueron utilizados a una concentración de 5 pg/ml. Las placas fueron incubadas 48 horas a 37°C, en 5% C02.

La placa fue lavada una vez con PBS IX y 5 veces con 0.05% PBS-Tween. El IFNg anti-ratón biotinilado (clon XMG1.2, Pharmingen) fue agregado a una concentración de 0.3 g/100 µ?/???? e incubado 2 horas a temperatura ambiente bajo agitación lenta. La placa fue lavada 5 veces con 0.05%PBS-Tween . Se diluyó Extravidin AKP (sigma, St. Louis, MO) a 1/5000 en 0.05% PBS-Tween-1% FCS, también fue agregado a los pozos (100 µ?/????). La placa fue incubada 45 minutos a temperatura ambiente y después lavada 5 veces con 0.05% PBS-Tween. La secreción de IFNg fue revelada con Biorad Kit. 100 µ? de sustrato (NBT + BCIP) fue agregado por pozo y la placa se dejo a temperatura ambiente durante 0.5 horas. La placa fue lavada con agua y se dejo secar durante la noche a temperatura ambiente. Las manchas fueron contadas usando un microscopio de disección.

Resultados Las secuencias de aminoácido E6 y E7 de diferentes genotipos de HPV fueron alineadas usando el programa de alineación múltiple HUSAR (CLUSTAL) (https://genius.embnet.dkfz-heidelberg . de/me nu/cgi-bin/w2h/w2h.start). Los péptidos restringidos por H2b (restringido por DB o Kb) fueron identificados usando el software de unión de péptido BIMAS disponible en Internet (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/). El péptido R9F presente en la proteína HPV16-E7 (RAHYNIVTF: SEC ID NO: 5) fue utilizado como péptido de referencia. Se ha descrito en la técnica como es capaz del reconocimiento por CTL de E7 específico y fue identificado en los datos de BIMAS con un conteo de unión de 6. La secuencia de aminoácido de péptidos E6 y E7 de no HPV-16 identificados con el mismo conteo o por encima de este valor, fue alineada con la del péptido correspondiente en E6 y E7 de HPV-16. Los péptidos que mostraron una o dos diferencias de aminoácido con respecto a los polipéptidos E6 y E7 de HPV-16 de la secuencia de aminoácido, fueron elegidos para este análisis de reactividad cruzada. Seis péptidos fueron probados: SCVYCKKEL (HPV56 E6 Db): PÉPTIDO S9L (SEQ ID NO: 6) RCIICQRPL (HPV33, E6 HPV 58 E6 Db): PÉPTIDO R9L (SEQ ID NO: 7) SEYRHYQYS (HPV52, E6 Kb): PÉPTIDO S9S (SEQ ID NO: 8) ECVYCKQQL (HPV16, E6 Db): PÉPTIDO E9L (SEQ ID NO: 9) TDLHCYEQL (HPV31, E7 Kb): PÉPTIDO T9L (SEQ ID NO: 10); y RAHYNIVTF (HPV16, E7 Db): PÉPTIDO R9F (SEQ ID NO: 5) como control positivo Péptido irrelevante: como control negativo Por ejemplo, el péptido T9L se ha identificado con un conteo de unión de 20 en polipéptidos E7 de HPV-31 y HPV-52. Muestra una diferencia de aminoácido con respecto al péptido correspondiente E7 de HPV-16 (TDLYCYEQL). El péptido S9S se ha identificado con un conteo de unión de 15.8 en el polipéptido de E6 HPV-52 y demuestra una diferencia de aminoácido con respecto al péptido correspondiente E6 de HPV-16 (SEYRHYCYS).

La reactividad cruzada fue determinada por el análisis de IFNg ELISPOT en los esplenocitos obtenidos de los ratones inmunizados con MVATG8042 según lo descrito en Materiales y Métodos. Los resultados se demuestran en la figura 2. La inmunización de los ratones con MVATGN33 no recombinante no indujo ninguna respuesta de Th1 (producción de IFNg debajo del nivel básico). Por una parte, la inmunización con MVATG8042 induce una respuesta de Th1 de los multi-epítopes en ratones. Según lo esperado, la cultivo de los esplenocitos inmunizados con el péptido de R9F estimula la producción de IFNg mientras que la adición de un péptido Flu irrelevante en el cultivo de los esplenocitos no tiene ningún efecto significativo (producción de IFNg al nivel básico). Sin embargo, asombrosamente, otros péptidos distintos al péptido R9F restringido por H2b" E7 conocido, son reconocidos por CTL tal como los péptidos S9S, E9L y T9L. Por otra parte, el estímulo de la célula T con los péptidos específicos HPV31 o HPV52 parece ser tan potente como el generado con el péptido E7 R9F reconocido por CTL.

Estas observaciones se han hecho en base a las moléculas MHC clase I. No se podría excluir que otros genotipos se podrían presentar por las moléculas MHC clase II. Además, se debe observar que la secuencia de péptido T9L específico de HPV31 y HPV-52 es igual a la secuencia de péptido correspondiente de las secuencias de HPV 33, 35, y 58 con la excepción de un aminoácido.

Experimento de estimulación cruzada Un experimento de estimulación cruzada fue realizado para determinar si los esplenocitos de ratones inmunizados con MVATG8042 se podrían estimular por los péptidos específicos a otros genotipos de HPV. Para limitar el número de péptidos que se probarán, las regiones de la proteína E6 ó E7 con alta probabilidad de asociación con las moléculas MHC de clase I (DB y Kb), fueron identificadas usando el software de Bimass. Una serie de péptidos fue probada, la cual exhibió una, dos o tres diferencias de aminoácido con respecto al péptido correspondiente de E6 ó E7 de HPV-16 (ver la tabla 1). Todos los péptidos fueron sintetizados por Neosystem (Francia) al nivel de grado inmunológico. Cada péptido fue disuelto en 10 mg/ml de DMSO y almacenado a 4°C. El número de células de producción de IFNy por 106 esplenocitos fue evaluado en los esplenocitos estimulados por el péptido tomados de animales no tratados y vacunados con MVATG8042.

Tabla 1 : Lista de péptidos probados Denominación Seuencia Proteína Secuencia SEC ID de péptido SEC ID NO: D8L-1 DLYCYEQL E7 16,33,35 11 SEC ID NO: D8L-2 DLHCYEQL E7 31 ,52 12 SEC ID NO: D8L-3 DLFCYEQL E7 58 13 SEC ID NO: D8L-4 DLLCYEQL E7 18,45 14 SEC ID NO: E9L ECVYCKQQL E7 16 9 SEC ID NO: L8L-1 LQPETTDL E7 16,52 15 SEC ID NO: L8L-2 LQPEATDL E7 31 16 SEC ID NO: L8L-3 LEPEATDL E7 35 17 SEC ID NO: L8L-4 LYPEPTDL E7 33 18 SEC ID NO: L8L-5 LHEPTDL E7 58 19 R9F RAHYNIVTF E7 16 SEC ID NO: 5 Denominación Seuencia Proteína Secuencia SEC ID de péptido SEC ID NO: R8L-1 RCLRCQPL E6 18,45 20 SEC ID NO: R8L-2 RCHRCQPL E6 51 21 SECID NO: R9L RCIICQRPL E6 33,58 7 SEC ID NO: R9L-2 RCINCQRPL E6 16 22 SEC ID NO: R9L-3 RCIjCQKPL E6 35 23 SEC ID NO: R9L-4 RCITCQRPL E6 31 24 SEC ID NO: R9L-5 RCUCQTPL E6 52 25 SEC ID NO: S9L-3 SCVYCKKEL E6 56 6 SEC ID NO: S9S SEYRHYQYS E6 52 8 SEC ID NO: S9S-2 SEYRHYCYS E6 16 26 SEC ID NO: S9S-3 SEYRHYNYS E6 33,58 27 Denominaciónd Seuencia Proteína Secuencia SEC ID e péptido SEC ID NO: S9S-4 SEYRWYRYS E6 52 28 SEC ID NO: S9S-5 SEFRWYRYS E6 31 29 SEC ID NO: T9F TSNYNIVTF E7 31 30 SEC ID NO: T9L TDLHCYEQL E7 31 10 SEC ID NO: T9S TSNYNIVTS E7 35 31 SEC ID NO: T9Y TSNYNIVTY E7 52 32 Brevemente, los ratones C57B1/6 hembras fueron inmunizados tres veces subcutáneamente con 5 x 107 pfu de MVATGN33 (un ratón como control negativo) o MVATG8042 (tres ratones). Las inyecciones subcutáneas fueron realizadas cada vez en una diferente localización del flanco derecho de los animales. Los bazos fueron extraídos en día 21 después de la última inmunización y las células frescas del bazo fueron preparadas usando un tamiz celular (BD Falcon). La estimulación crazada de varios péptidos con respecto a los esplenocitos inmunizados de HPV-16 fue evaluada por Elispot usando el kit Mabtech AB mouse IFNy ELISPOTPLUS or el kit mouse IL-4 ELISPOTPLUS (Mabtech, Francia) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La placa fue lavada con agua y se dejo secar durante la noche a temperatura ambiente. Las manchas fueron contadas usando el lector de Elispot Bioreader 4000 Pro-X (BIOSYS-GmbH; Serlabo Francia) . Para cada péptido, el número de manchas representa el medio del duplicado a partir del cual fue sustraído el medio de duplicado base. Los valores base son el número de manchas obtenido con un péptido irrelevante restringido por Kb. Los péptidos de los genotipos no HPV-16 fueron considerados como capaces del estimulo cruzado de los esplenocitos de los animales inmunizados con MVATG8042 cuando por lo menos 30 manchas fueron vistas y cuando el número fue dos veces el valor considerado para el mismo péptido en el animal no tratado.

La estimulación repetida del péptido en animales sin tratar no inyectados no estimuló ninguna inmunorespuesta celular significativa. En contraste marcado y según lo esperado, un número elevado de manchas fue observado después de que la estimulación repetida de los esplenocitos fue obtenida de los ratones inmunizados con VATG8042 con el péptido R9F E7 restringido por H2b'. Sin embargo, asombrosamente, otros péptidos distintos al péptido R9F son reconocidos por CTL, especialmente los péptidos T9L (HPV-31 ), T9F (HPV-31 ), T9S (HPV-35) y T9Y (HPV-52).

En conjunto, estos datos proporcionan una tendencia positiva que la vacunación con los polipéptidos E6 y/o E7 de HPV-16 o vectores de expresión (por ejemplo MVATG8042) también podría ser eficaz para tratar las infecciones con HPV poco frecuentes y oncogénicos de los genotipos 31 , 33, 35, y 52.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de una composición que comprende uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 o un ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una infección o condición patológica causada por al menos un virus de papiloma distinto a HPV-16.

2. Uso una composición que comprende uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 o un ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 para la fabricación de un medicamento para tratar una infección o condición patológica causada por al menos un virus de papiloma humano distinto a HPV-16.

3. Uso de una composición que comprende uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 o un ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 para inducir una ¡nmunorespuesta contra por lo menos un virus de papiloma humano distinto a HPV-16.

4. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde por lo menos un virus de papiloma humano distinto a HPV-16 se selecciona entre el grupo que consiste de HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59 y HPV-68V1.

5. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 es un polipéptido E6, polipéptido E7 o ambos.

6. Uso de acuerdo a la reivindicación 5, en donde el polipéptido E6 y/o E7 de HPV-16 es una variante no oncogénica.

7. Uso de acuerdo a la reivindicación 6, en donde la variante no oncogénica del polipéptido E6 de HPV-16 comprende una secuencia de aminoácido que sea homologa o idéntica a la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 1.

8. Uso de acuerdo a la reivindicación 6, en donde la variante no oncogénica del polipéptido E7 de HPV-16 comprende una secuencia de aminoácido que es homologa o idéntica a la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 2.

9. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde el polipéptido E6 y/o E7 de HPV-16 se modifica para fijarse a la membrana celular incorporando una secuencia de fijación de membrana y una secuencia secretora.

10. Uso de acuerdo a la reivindicación 9, en donde la secuencia de fijación de membrana y/o la secuencia secretora se obtienen de la glicoproteína de virus rábico, glicoproteína de cobertura de virus VIH o proteína del virus de sarampión F.

11. Uso de acuerdo a la reivindicación 10, en donde el polipéptido E6 de HPV-16 comprende una secuencia de aminoácido que es homologa o idéntica a la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 3.

12. Uso de acuerdo a la reivindicación 10, en donde el polipéptido E7 de HPV-16 comprende una secuencia de aminoácido que es homologa o idéntica a la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 4.

13. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la composición comprende adicionalmente una citocina o un ácido nucleico que codifica una citocina.

14. Uso de acuerdo a la reivindicación 13, en donde la citocina es IL-2.

15. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos tempranos de HPV-16 está contenido en un vector.

16. Uso de acuerdo a la reivindicación 15, en donde el vector viral es un vector de vacuna.

17. Uso de acuerdo a la reivindicación 16, en donde el vector de vacuna es un vector de MVA.

18. Uso de acuerdo a la reivindicación 17, en donde el vector de MVA comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido E6 de HPV-16 colocado debajo del promotor 7.5K, un ácido nucleico que codifica el polipéptido E7 de HPV-16 colocado debajo del promotor 7.5K y un gen de IL-2 humano colocado bajo el control del promotor de H5R.

19. Uso de acuerdo a la reivindicación 18, en donde el ácido nucleico que codifica el polipéptido E6 de HPV-16, polipéptido E7 de HPV-16 y el gen de IL-2 humano, se inserta en la supresión III del genoma de MVA.

20. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde la condición patológica es una infección persistente por HPV, una condición precancerosa o cancerosa.

21. Uso de acuerdo a la reivindicación 20, en donde la condición cancerosa asociada a HPV es un carcinoma cervical, carcinoma anal o cáncer oral.

22. Uso de acuerdo a la reivindicación 20, en donde la condición precancerosa asociada a HPV es una neoplasia intraepitelial cervical (CIN) de grado 1, 2 ó 3.

23. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en donde la composición es administrada por ruta subcutánea o intramuscular.

24. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde la composición se administra en dosis que comprenden de 5 x 105 pfu a 5 x 107 pfu de vector de vacuna.

25. Uso de acuerdo a la reivindicación 24, en donde la composición comprende un vector de MVA según lo definido en la reivindicación 17, 18 ó 19 y se administra en tres dosis de 5 x 105 pfu a 5 x 107 pfu por la ruta subcutánea en intervalos semanales.