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MX2008012323A - Dispositivo y metodo para la deteccion de componentes biologicos marcados con fluorescencia. - Google Patents

Dispositivo y metodo para la deteccion de componentes biologicos marcados con fluorescencia.

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Publication number
MX2008012323A
MX2008012323A MX2008012323A MX2008012323A MX2008012323A MX 2008012323 A MX2008012323 A MX 2008012323A MX 2008012323 A MX2008012323 A MX 2008012323A MX 2008012323 A MX2008012323 A MX 2008012323A MX 2008012323 A MX2008012323 A MX 2008012323A
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MX
Mexico
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sample
acquisition device
fluorophore
measuring cavity
further characterized
Prior art date
Application number
MX2008012323A
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English (en)
Inventor
Stellan Lindberg
Original Assignee
Hemocue Ab
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Filing date
Publication date
Application filed by Hemocue Ab filed Critical Hemocue Ab
Publication of MX2008012323A publication Critical patent/MX2008012323A/es

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Abstract

Un dispositivo de adquisición de muestras para la detección de componentes biológicos en una muestra de líquido, comprende: una cavidad de medición para recibir una muestra de líquido, en donde la cavidad de medición tiene un espesor fijo predeterminado, y un reactivo, el cual está dispuesto en una forma seca dentro de la cavidad de medición; el reactivo comprende una molécula conjugada con fluoróforo.

Description

DISPOSITIVO Y METODO PARA LA DETECCION DE COMPONENTES BIOLOGICOS MARCADOS CON FLUORESCENCIA CAMPO TECNICO La presente invención se refiere a un dispositivo de adquisición de muestras, un método y un sistema para la detección y enumeración volumétrica de componentes biológicos marcados con fluorescencia en una muestra de líquido.
TECNICA ANTECEDENTE Cuando se analiza una muestra biológica, tal como una muestra de células, es deseable poder identificar los diferentes componentes de la muestra, por ejemplo, los diferentes tipos de células presentes. Estos diferentes componentes exhiben estructuras moleculares respectivas, tales como marcadores de superficie de la célula, por los cuales pueden distinguirse los componentes. Mediante el uso de moléculas conjugadas con fluoróforo dispuestas para unirse con estas estructuras moleculares, los componentes biológicos pueden ser marcados con fluorescencia. Unas cuantas técnicas para detectar y analizar componentes marcados con fluorescencia, principalmente células, se conocen en la técnica, predominantemente las técnicas de citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. En citometría de flujo, células suspendidas marcadas con fluorescencia se hacen pasar, una por una, a través de un canal de flujo enfrente de un haz de láser, y puede medirse la fluorescencia de varias longitudes de onda diferentes, así como la dispersión de luz hacia delante y ortogonal. De esta manera, puede analizar la marcación de varios fluoróforos diferentes, así como el tamaño y la granularidad de las células. Métodos de citometría de flujo se describen, por ejemplo, en los documentos US 3,826,364, US 4,248,412 y US 5,047,321. La microscopía de fluorescencia se lleva a cabo en general irradiando una muestra fluorescente que se va a estudiar, usualmente extendida sobre un portaobjetos de microscopio, con radiación electromagnética de una longitud de onda más corta específica, que hace que los fluoróforos en la muestra absorban dicha radiación y emitan después radiación electromagnética de una longitud de onda más larga específica. La radiación emitida es detectada usando un microscopio equipado con un filtro cromático, o un monocromador equivalente, que esencialmente sólo permite que pase la radiación de longitud de onda más larga emitida. En los documentos US 4,125,828 y US 2006/0017001 se describen miscroscopios de fluorescencia, y métodos para detectar una muestra fluorescente que ha sido extendida sobre un portaobjetos de microscopio.
En el documento US 5,932,428 se describe una mezcla de muestra y prueba para la enumeración de componentes objetivo teñidos con fluorescencia de una muestra de sangre, por un instrumento de formación de imágenes. En un aspecto del documento US 5,932,428, se mezcla sangre entera con un anticuerpo secado rápidamente marcado con fluorescencia y un detergente zwiterriónico, después de lo cual la mezcla de sangre es extraída en un capilar de exploración. El capilar lleno es explorado usando un haz de láser el cual es estrechado en la forma de una cintura Gaussiana que intersecta el capilar. El láser ilumina de esta manera una región columnar del capilar que iguala el diámetro de la cintura Gaussiana veces la profundidad del lumen del capilar, y excita cualquier materia fluorescente en esta región. La fluorescencia de esta región es detectada por un detector de luz. El láser ilumina entonces otra región del capilar, y la fluorescencia de esa región es detectada también, etc. De esta manera, un volumen predeterminado de la muestra es explorado por fluorescencia. En el documento US 2006/0024756 se describe un dispositivo, método y algoritmo para la enumeración de células marcadas con fluorescencia y magnéticamente. De acuerdo con el método descrito, todas las células son marcadas con fluorescencia, pero sólo las células objetivo son también marcadas magnéticamente. La muestra de células marcadas se pone en una cámara o recipiente de mezclado entre dos imanes en forma de cuña que mueven selectivamente las células marcadas magnéticamente hacia una superficie de observación del recipiente de mezclado. Un LED ilumina las células, y una cámara de CCD captura las imágenes de la luz fluorescente emitida por las células objetivo. La marcación de las células puede ocurrir en el recipiente de mezclado o la cámara usados para el análisis, o la muestra es transferida a dicho recipiente de mezclado o cámara después de que se deja que tiempo suficiente permita la marcación de las células. El volumen del recipiente de mezclado se conoce y se usa para determinar la concentración absoluta de las células objetivo en la muestra de sangre. Sin embargo, esto requiere esperar hasta que todas las células objetivo hayan sido movidas magnéticamente hacia una superficie de observación antes de que puedan ser detectadas y contadas. El documento EP 0 422 708 describe un dispositivo para su uso en procedimientos de prueba químicos. El dispositivo comprende una cavidad definida por dos paredes planas y paralelas, una de las cuales sostiene anticuerpos inmovilizados covalentemente, y ésta u otra pared sostiene anticuerpos secos marcados con fluorescencia pero no inmovilizados covalentemente. El objetivo es usar el dispositivo para pruebas en sandwich de un antígeno que puede unirse a los anticuerpos inmovilizados y marcados. Una muestra de líquido que contiene al antígeno que se va a analizar, es succionada por fuerza capilar en el dispositivo, disolviendo los anticuerpos marcados. El antígeno es unido por los anticuerpos inmovilizados y también los anticuerpos marcados se unen al antígeno, por lo cual anticuerpos marcados con fluorescencia son concentrados en la pared que sostiene a anticuerpos inmovilizados covalentemente. Esta pared se hace de vidrio, u otro material que transmita luz, y tiene la capacidad de conducir luz tal como una fibra óptica o guía de ondas. La presencia del antígeno en la muestra de líquido se detecta midiendo la intensidad de luz en el borde de la pared, es decir, la luz guiada por la pared que emana de los anticuerpos fluorescentes presentes en dicha pared.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Es un objetivo de la invención, proveer un análisis simple para detectar componentes biológicos marcados con fluorescencia de una muestra de líquido. De conformidad con un aspecto de la invención, es un objetivo proveer un análisis simple para la enumeración volumétrica de componentes biológicos marcados con fluorescencia de una muestra de líquido. Es otro objetivo de la invención, proveer un análisis rápido sin la necesidad de aparatos complicados o preparaciones extensivas de muestras. Estos objetivos se logran parcialmente o enteramente mediante un dispositivo de adquisición de muestras, un método y un sistema de conformidad con las reivindicaciones independientes. Modalidades preferidas son evidentes de las reivindicaciones dependientes. De conformidad con un aspecto, la presente invención se refiere de esta manera a un dispositivo de adquisición de muestras para la detección de componentes biológicos en una muestra de líquido, dicho dispositivo de adquisición de muestras comprendiendo una cavidad de medición para recibir una muestra de líquido, en donde la cavidad de medición tiene un espesor fijo predeterminado. El dispositivo de adquisición de muestras comprende también un reactivo, que está dispuesto en una forma seca dentro de la cavidad de medición, dicho reactivo comprendiendo una molécula conjugada con fluoróforo. De conformidad con otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la detección de componentes biológicos marcados con fluoróforo en una muestra de líquido. El método comprende mezclar un reactivo que comprende una molécula conjugada con fluoróforo con una muestra de líquido, de modo que la molécula conjugada con fluoróforo se une a una estructura molecular específica de un componente biológico en la muestra de líquido, introducir la muestra de líquido en una cavidad de medición de un dispositivo de adquisición de muestras, dicha cavidad de medición teniendo un espesor fijo predeterminado; irradiar un área de la muestra en la cavidad de medición con radiación electromagnética de una longitud de onda que corresponda a una longitud de onda de excitación del fluoróforo; y detectar componentes biológicos marcados con fluoróforo en el espesor entero de la cavidad de medición, dicha detección comprendiendo adquirir una imagen digital del área irradiada en la cavidad de medición. El dispositivo de adquisición de muestras provee una posibilidad para obtener directamente una muestra de sangre entera en la cavidad de medición, y proveerla para análisis. No hay necesidad de preparación de la muestra. De hecho, una muestra de sangre puede ser succionada en la cavidad de medición directamente de un dedo pinchado de un paciente. La provisión del dispositivo de adquisición de muestras con un reactivo, permite una reacción dentro del dispositivo de adquisición de muestras que hace que la muestra esté lista para análisis. La reacción se inicia cuando la muestra de sangre entra en contacto con el reactivo. De esta manera, no hay necesidad de preparar manualmente la muestra, lo cual hace que el análisis sea especialmente adecuado para ser realizado directamente en un sitio de examen mientras el paciente está esperando. Puesto que el reactivo se provee en una forma seca, el dispositivo de adquisición de muestras puede ser transportado y almacenado por un largo tiempo sin que se afecte la utilidad del dispositivo de adquisición de muestras. De esta manera, el dispositivo de adquisición de muestras con el reactivo puede fabricarse y prepararse mucho antes de que se haga el análisis de una muestra de sangre. El dispositivo de adquisición de muestras de la presente invención puede ser de esta manera usado fácilmente y reproduciblemente incluso por una persona no entrenada, y no necesariamente en un ambiente de laboratorio estandarizado regular, ya que el dispositivo de adquisición de muestras puede formar un equipo listo para su uso en donde la entrada de muestras del dispositivo de adquisición de muestras sólo necesita ser puesta en contacto con la muestra para proveer la muestra en una forma lista para ser analizada.
Además, el espesor fijo de la cavidad de medición provee una posibilidad para determinar el conteo de componentes biológicos por unidad volumétrica de la muestra de líquido. Puesto que el método está dispuesto para detectar componentes biológicos marcados con fluoróforo en el espesor entero de la cavidad de medición, es posible realizar rápidamente el análisis de la muestra de líquido. No hay necesidad de esperar a que los componentes biológicos de interés se asienten dentro de la cavidad de medición, o sean llevados hacia una superficie de observación. Los componentes biológicos de la muestra de líquido pueden ser, por ejemplo, células eucarióticas, tales como células de mamífero (por ejemplo, leucocitos y plaquetas); bacterias; virus; y macromoléculas, tales como ADN. La muestra de líquido puede ser, por ejemplo, un fluido corporal, tal como sangre entera no diluida, orina o fluido espinal; o un cultivo de células, tal como un cultivo de células de mamífero o un cultivo de bacterias. La muestra de líquido puede ser un fluido biológico no diluido que no haya sufrido algún pretratamiento. El pretratamiento de una muestra biológica, tal como dilución, centrifugación y lisis, lleva a una menor precisión cuando se relacionan células objetivo enumeradas con el volumen analizado. Cuanto mayor sea el número de pasos de pretratamiento, menor es la precisión de la enumeración. Al no usarse algún tipo de pretratamiento antes de poner la muestra en el dispositivo de adquisición de muestras listo para su uso, el método se simplifica más.
De esta manera, es posible detectar la presencia o la cantidad de, por ejemplo, un tipo de célula específico en una muestra de sangre. El dispositivo de adquisición de muestras puede comprender un miembro de cuerpo que tiene dos superficies planas que definen dicha cavidad de medición. Las superficies planas pueden estar dispuestas a una distancia predeterminada una de la otra para determinar un espesor de muestra para una medición óptica. Esto implica que el dispositivo de adquisición de muestras provea un espesor bien definido para la medición óptica, la cual puede usarse para determinar con precisión el conteo de componentes biológicos marcados con fluoróforo por unidad volumétrica de la muestra de líquido. Un volumen de una muestra de líquido analizada será bien definida por el espesor de la cavidad de medición y un área de la muestra que está siendo representada por una imagen. De esta manera, el volumen bien definido podría usarse para asociar el número de componentes biológicos marcados con fluoróforo con el volumen de la muestra, de modo que sea determinado el conteo volumétrico de componentes biológicos marcados con fluoróforo. La cavidad de medición tiene de preferencia un espesor uniforme de 50 a 170 micrómetros. Un espesor de por lo menos 50 micrómetros implica que la cavidad de medición no fuerce una muestra de líquido, tal como una muestra de células, a ser extendida en una monocapa que permite que un volumen más grande de muestra de líquido sea analizado sobre una pequeña área en sección transversal. De esta manera, un volumen suficientemente grande de la muestra de liquido para dar valores confiables del conteo de componentes biológicos marcados con fluoróforo, puede analizarse usando una imagen relativamente pequeña de la muestra de células. El espesor es más preferiblemente de por lo menos 100 micrómetros, lo cual permite que se analice un área en sección transversal incluso más pequeña, o que se analice un volumen de muestra más grande. Además, el espesor de por lo menos 50 micrómetros, y más preferiblemente 100 micrómetros, simplifica también la fabricación de la cavidad de medición que tiene un espesor bien definido entre dos superficies planas. Para la mayoría de las muestras, por ejemplo, una muestra de sangre, dispuestas en una cavidad que tiene un espesor no mayor de 170 micrómetros, el conteo de componentes biológicos marcados con fluoróforo, tales como células de una muestra de sangre, es tan bajo que habrán sólo desviaciones menores debido a componentes que están dispuestos traslapándose entre sí. Sin embargo, el efecto de dichas desviaciones se relacionará con el conteo de componentes biológicos marcados con fluoróforo, y de esta manera puede manejarse, por lo menos hasta cierto grado, por medio de resultados que corrigen estadísticamente por lo menos grandes valores del conteo de componentes biológicos marcados con fluoróforo. Esta corrección estadística puede basarse en calibraciones del aparato de medición. Las desviaciones serán incluso menores para una cavidad de medición que tenga un espesor no mayor de 150 micrómetros, por lo cual puede usarse una calibración más simple. Este espesor puede no requerir incluso alguna calibración para componentes biológicos que se traslapan. Además, el espesor de la cavidad de medición es suficientemente pequeño, que permite que el aparato de medición obtenga una imagen digital, de modo que la profundidad entera de la cavidad de medición puede analizarse simultáneamente. Si se va a usar un sistema de aumento en el aparato de medición, no será simple obtener una gran profundidad de campo. Por lo tanto, el espesor de la cavidad de medición no excedería de preferencia 150 micrómetros, para que el espesor entero sea analizado simultáneamente en una imagen digital. La profundidad de campo puede disponerse para manejar un espesor de la cavidad de medición de 170 micrómetros. La imagen digital puede adquirirse con una profundidad de campo que corresponda por lo menos al espesor de la cavidad de medición. Esto implica que se obtenga un foco suficiente del espesor entero de la muestra, de modo que el espesor entero de la cavidad de medición pueda ser analizado simultáneamente en la imagen digital de la muestra. De esta manera, no hay necesidad de esperar a que, por ejemplo, células se asienten en la cavidad de medición, por lo cual se reduce el tiempo para hacer un análisis. No eligiendo enfocarse muy agudamente en una parte específica de la muestra, se obtiene un foco suficiente del espesor entero de la muestra que permite la identificación del número de componentes biológicos marcados con fluoróforo en la muestra. Esto implica que un componente fluorescente puede ser un poco confuso, y se considere aún que está en foco de la profundidad de campo. El espesor fijo de la cavidad de medición, permite un análisis de un volumen bien definido de la muestra. En particular, un área de la cavidad de medición es adaptada para ser representada por una imagen para proveer el análisis de un volumen bien definido de la muestra, por lo cual puede obtenerse una enumeración volumétrica de un componente biológico en la muestra. El área que está siendo representada por una imagen, junto con el espesor de la cavidad de medición, provee un volumen bien definido de la muestra. Mediante el conteo del número de componentes biológicos marcados dentro de este volumen estático, puede obtenerse fácilmente el conteo volumétrico de los componentes biológicos en la muestra. El conteo volumétrico puede obtenerse analizando una imagen digital del volumen. De esta manera, puede obtenerse un conteo volumétrico sin la necesidad de hacer pasar una muestra frente a un analizador, como se realiza de acuerdo con el principio de citometría de flujo. El dispositivo de adquisición de muestras puede proveerse con un reactivo que haya sido aplicado a la superficie resuelta en un líquido volátil que se ha evaporado para dejar el reactivo en una forma seca. Se ha comprendido que el reactivo es resuelto en forma ventajosa en un líquido volátil, antes de que sea insertado en la cavidad de medición. Esto implica que el liquido puede estar en una manera efectiva para ser evaporado del espacio estrecho de la cavidad de medición durante la fabricación y preparación del dispositivo de adquisición de muestras. El reactivo puede resolverse de preferencia en un solvente orgánico, y más preferiblemente puede resolverse en metanol. Dichos solventes son volátiles, y pueden usarse adecuadamente para secar el reactivo sobre una superficie de la cavidad de medición. El reactivo, incluyendo todos sus componentes, de la presente invención, es de preferencia disolvible y/o suspendible en la muestra de líquido que se va a analizar, y se pretende de preferencia que permanezca en solución/suspensión durante el análisis. Puesto que, como se indicó anteriormente, el método está dispuesto para detectar componentes biológicos marcados con fluoróforo en el espesor entero de la cavidad de medición, y no hay necesidad de llevar o inmovilizar los componentes biológicos de interés hacia una superficie de observación, tampoco existe la necesidad de inmovilizar, o de cualquier otra manera evitar la disolución/suspensión, del reactivo o cualquier componente del reactivo. Por el contrario, mediante el uso de un reactivo disolvible/suspendible, de preferencia un reactivo fácilmente disolvible/suspendible, se facilita el mezclado del reactivo con la muestra de líquido, y se acelera cualquier reacción entre el reactivo y la muestra de líquido, incluyendo el componente biológico que se va a medir. El reactivo de la presente invención comprende una molécula conjugada con fluoróforo. Un fluoróforo, o fluorocromo, se define en la presente como una porción de una molécula que hace que la molécula sea fluorescente. Una molécula es fluorescente, si emite radiación electromagnética de una longitud de onda específica como una respuesta de que está siendo sometida a radiación de una longitud de onda diferente. Fluoróforos o fluorocromos usados comúnmente incluyen, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), proteína peridinina de la clorofila (PerCP), aloficocianina (APC) y cianina-5.5 (Cy5.5). La molécula conjugada con fluoróforo está dispuesta de preferencia para unirse con una estructura molecular específica de un componente biológico. Ejemplos de dichas moléculas incluyen, pero no están limitados a, ligandos, receptores, antígenos, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo son, por ejemplo, fragmento de unión a antígeno (Fab) y fragmento variable de cadena sencilla (scFv). Se prefieren anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, ya que se obtienen relativamente fácil con afinidad contra todos los tipos de estructuras moleculares, y se conocen muchos esquemas para conjugarlos con diferentes tipos de fluoróforos. La estructura molecular puede ser cualquier estructura molecular específica de un componente biológico, por ejemplo, un marcador de superficie de la célula, tal como CD4 o CD8, o una estructura intracelular, tal como ADN. Un marcador de superficie de la célula se define en la presente, como cualquier característica molecular de la membrana plasmática de una célula que es accesible desde el exterior de la célula, tal como un antígeno o epítope. Esto implica que pueda detectarse cualquier tipo de célula para cualquier propósito, tal como detección y enumeración de células CD4+ por consideración al monitoreo de una infección por VIH. La cantidad de molécula conjugada con fluoróforo se selecciona de preferencia, de modo que exista una cantidad suficiente que se una a los componentes biológicos. Para asegurar esencialmente que todas las moléculas biológicas elegidas como objetivo sean marcadas adecuadamente por las moléculas conjugadas con fluoróforo dentro de tiempo razonable, las moléculas conjugadas con fluoróforo no necesitan estar presentes en exceso. Sin embargo, habrán aún moléculas conjugadas con fluoróforo no unidas en la muestra mixta, y se desea que esta concentración no unida se mantenga suficientemente baja para no dejar subir la fluorescencia de fondo cuando la muestra es analizada. De esta manera, las moléculas conjugadas con fluoróforo no deben estar presentes en exceso demasiado grande. La relación de moléculas conjugadas con fluoróforo unidas a no unidas, depende de la afinidad entre las moléculas conjugadas con fluoróforo y el componente biológico, y el tiempo permitido para el mezclado de las moléculas conjugadas con fluoróforo con el componente biológico. El dispositivo de adquisición de muestras puede comprender además una entrada de muestras que comunica la cavidad de medición con el exterior del dispositivo de adquisición de muestras, dicha entrada estando dispuesta para adquirir una muestra de líquido. La entrada de muestras puede estar dispuesta para hacer uso de una muestra de líquido por fuerza capilar, y la cavidad de medición puede llevar además líquido de la entrada en la cavidad. Como resultado, la muestra de líquido puede ser adquirida fácilmente en la cavidad de medición, simplemente poniendo la entrada de muestras en contacto con el líquido. Entonces, las fuerzas capilares de la entrada de muestras y la cavidad de medición harán uso de una cantidad bien definida de líquido en la cavidad de medición. En forma alternativa, la muestra de líquido puede ser seccionada o llevada en la cavidad de medición por medio de la aplicación de una fuerza de bombeo externa al dispositivo de adquisición de muestras. De conformidad con otra alternativa, la muestra de líquido puede ser adquirida en una pipeta, e introducida entonces en la cavidad de medición por medio de la pipeta. El dispositivo de adquisición de muestras puede ser desechable, es decir, está dispuesto para ser usado sólo una vez. El dispositivo de adquisición de muestras provee un equipo para realizar un conteo de componentes biológicos marcados con fluoróforo, puesto que el dispositivo de adquisición de muestras es capaz de recibir una muestra de líquido, y contiene todos los reactivos necesarios para presentar la muestra a conteo. Esto es permitido particularmente, puesto que el dispositivo de adquisición de muestras está adaptado para usarse sólo una vez, y puede formarse sin consideración de posibilidades de limpiar el dispositivo de adquisición de muestras y volver a aplicar un reactivo. Asimismo, el dispositivo de adquisición de muestras puede ser moldeado en un material plástico, y de esta manera puede ser fabricado a un bajo costo. De esta manera, será aún efectivo en costos usar un dispositivo de adquisición de muestras desechable. De conformidad con una modalidad del método para la detección de componentes biológicos marcados con fluoróforo en una muestra de liquido, el dispositivo de adquisición de muestras comprende un reactivo, el cual está dispuesto en una forma seca dentro de la cavidad de medición, en donde el reactivo comprende una molécula conjugada con fluoróforo. Entonces, el mezclado se logra introduciendo la muestra de líquido en la cavidad de medición que hace contacto con el reactivo. Esto implica que no haya necesidad de preparación de la muestra. Una reacción puede iniciarse cuando la muestra de sangre entra en contacto con el reactivo. De esta manera, no hay necesidad de preparar manualmente la muestra, lo cual hace que el análisis sea especialmente adecuado para ser realizado directamente en un sitio de examen mientras el paciente está esperando. Sin embargo, de conformidad con una modalidad alternativa, el mezclado del reactivo con la muestra de líquido puede realizarse antes de que la muestra de líquido sea introducida en la cavidad de medición. De conformidad con otra alternativa, el mezclado puede realizarse en por lo menos dos pasos, en donde un primer paso se realiza antes de que la muestra sea introducida en la cavidad de medición, y el segundo paso se realiza en la cavidad de medición. Esto implica que la preparación de la muestra se haga por lo menos parcialmente fuera del dispositivo de adquisición de muestras. Sin embargo, se mantiene aún la ventaja del uso de un dispositivo de adquisición de muestras que tiene una cavidad de medición con un espesor fijo. De esta manera, el método provee una posibilidad para determinar el conteo de componentes biológicos por unidad volumétrica de la muestra de líquido. Además, no hay necesidad de esperar a que los componentes biológicos de interés se asienten dentro de la cavidad de medición, o sean llevados hacia una superficie de observación. Para la irradiación de la muestra que se va a estudiar, se prefiere usar una fuente de radiación dispuesta no para permitir radiación de longitudes de onda que correspondan a, o estén cerca de, las longitudes de onda que son emitidas por los fluoróforos de la muestra, hasta alcanzar la muestra, ya que esto interferiría con la detección de la radiación emitida. Para obtener esta radiación de longitud de onda limitada, se usa de preferencia una fuente de radiación en conjunto con un filtro cromático. En forma alternativa, puede usarse un rayo láser que radie con una longitud de onda específica que sea absorbida por el fluoroforo. Un prisma o una cuadrícula (rejilla), puede usarse también para dirigir sólo ciertas longitudes de onda de radiación de una fuente de radiación a la muestra. La fuente de radiación es de preferencia un diodo emisor de luz (LED), pero podría usarse cualquier fuente de radiación, tal como un rayo láser o una bombilla regular. Se prefiere un LED, ya que es relativamente económico y confiable. La detección de los componentes biológicos marcados con fluoroforo comprende de preferencia adquirir una imagen digital de la muestra irradiada en la cavidad de medición, en donde componentes biológicos que exhiben el fluoróforo se distinguen como puntos de fluorescencia que emiten radiación electromagnética de una longitud de onda que corresponde a una longitud de onda de emisión del fluoróforo. La imagen digital es adquirida convenientemente a través del uso de una cámara de CCD incorporada en un microscopio de fluorescencia, el microscopio estando adaptado de preferencia, convenientemente a través del uso de un filtro cromático, para permitir esencialmente que sólo la longitud de onda de la radiación electromagnética emitida por el fluoróforo llegue a la cámara. La detección de los componentes biológicos marcados con fluoróforo, comprende además de preferencia analizar digitalmente la imagen digital para identificar componentes biológicos que exhiben el fluoróforo, y determinar el número de componentes biológicos que exhiben el fluoróforo en la muestra. Esto implica que la detección y/o el conteo de los componentes biológicos pueda lograrse fácilmente por análisis de imágenes basada en computadora. De esta manera, pueden obtenerse resultados confiables y reproducibles. La muestra de líquido es de preferencia introducida en la cavidad de medición del dispositivo de adquisición de muestras a través de una entrada de muestras capilar por medio de fuerza capilar. La imagen digital puede ser adquirida usando un poder de aumento de 3 a 50x, más preferiblemente de 3 a 10x. Dentro de estas escalas de poder de aumento, la mayoría de componentes biológicos tales como células de mamífero, elegidas como objetivo por el presente método, son aumentados suficientemente para ser detectados, mientras que la profundidad de campo puede estar dispuesta para cubrir el espesor de la muestra. Un bajo poder de aumento, implica que puede obtenerse una gran profundidad de campo. Sin embargo, si se usa un bajo poder de aumento, los componentes biológicos pueden ser difíciles de detectar. Puede usarse un menor poder de aumento incrementando el número de pixeles en la imagen adquirida, es decir, mejorando la resolución de la imagen digital. De esta manera, ha sido posible usar un poder de aumento de 3 a 4x, mientras permita aún que sean detectados los componentes biológicos, tales como células de mamífero. El análisis puede comprender identificar áreas de alta emisión de radiación electromagnética, de una longitud de onda específica que corresponda a la longitud de onda de emisión del fluoróforo con la cual el componente biológico es marcado, en la imagen digital. El análisis puede comprender además identificar puntos de luz en la imagen digital que resulten de radiación electromagnética emitida específica. Puesto que las moléculas conjugadas con fluoróforo pueden acumularse en torno a los componentes biológicos elegidos como objetivo, la emisión de la fluorescencia específica puede tener picos en puntos separados. Estos puntos formarán puntos de luz en la imagen digital, que puede detectarse corresponden a un componente biológico elegido como objetivo. El análisis puede comprender además aumentar electrónicamente la imagen digital adquirida. Mientras que la muestra está siendo aumentada para adquirir una imagen digital aumentada de la muestra, la imagen digital adquirida misma puede ser aumentada electrónicamente para simplificar el distinguir entre objetos que son representados por una imagen muy estrechamente entre sí en la imagen digital adquirida. Si dos o más moléculas conjugadas con fluoróforo diferentes, conjugadas con respectivamente diferentes fluoróforos, emitiendo radiación electromagnética a respectivamente diferentes longitudes de onda, y dispuestas para unirse con respectivamente diferentes estructuras moleculares, están comprendidas en el reactivo, puede adquirirse una imagen de cada longitud de onda emitida de la radiación de la muestra. Estas imágenes pueden sobreponerse entonces, por lo cual el análisis puede mostrar algunos componentes biológicos exhibiendo una estructura molecular, algunos otros exhibiendo otra estructura molecular, y algunos exhibiendo ambas estructuras moleculares. Si se usan más de dos diferentes moléculas conjugadas con fluoróforo, el razonamiento es similar. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un sistema para la enumeración volumétrica de componentes biológicos marcados con fluoróforo en una muestra de líquido, dicho sistema comprendiendo un dispositivo de adquisición de muestras como se definió anteriormente; y un aparato de medición que comprende un soporte del dispositivo de adquisición de muestras dispuesto para recibir el dispositivo de adquisición de muestras que contiene una muestra de líquido en la cavidad de medición, una fuente de luz dispuesta para irradiar la muestra de líquido con radiación electromagnética de una longitud de onda predeterminada, un sistema de formación de imágenes que comprende medios para la adquisición de imágenes digitales para adquirir una imagen digital de la muestra irradiada en la cavidad de medición, en donde componentes biológicos conjugados con fluoróforo se distinguen en la imagen digital por formación de imágenes selectiva de longitud de onda electromagnética, y un analizador de imágenes dispuesto para analizar la imagen digital adquirida para identificar componentes biológicos conjugados con fluoróforo y determinar el número de componentes biológicos conjugados con fluoróforo en la muestra de líquido. El aparato de medición puede usar las propiedades del dispositivo de adquisición de muestras como se describió anteriormente, para hacer un análisis de una muestra de líquido que ha sido adquirida directamente en la cavidad de medición. El aparato de medición puede representar por una imagen un volumen determinado de la muestra para hacer una enumeración volumétrica de los componentes biológicos en la muestra.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La invención se describirá ahora en más detalle por medio de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos acompañantes. La figura 1 es una vista esquemática de un dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con una modalidad de la invención.
La figura 2 es una vista esquemática de un dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con otra modalidad de la invención. La figura 3 es una vista esquemática de un sistema de medición de conformidad con una modalidad de la invención. La figura 4 es un diagrama de flujo de un método de conformidad con una modalidad de la invención.
DESCRIPCION DETALLADA DE UNA MODALIDAD PREFERIDA Con relación ahora a la figura 1 , se describirá un dispositivo de adquisición de muestras 10 de conformidad con una modalidad de la invención. El dispositivo de adquisición de muestras 10 es desechable, y será desechado después de haber sido usado para el análisis. Esto implica que el dispositivo de adquisición de muestras 10 no requiere manejo complicado. El dispositivo de adquisición de muestras 10 se forma en un material plástico, y se fabrica mediante moldeo por inyección. Esto hace que la fabricación del dispositivo de adquisición de muestras 10 sea simple y económica, por la cual no se deja que aumente el costo del dispositivo de adquisición de muestras 10. El dispositivo de adquisición de muestras 10 comprende un miembro de cuerpo 12, que tiene una base 14, que puede ser tocada por un operador sin que cause alguna interferencia en los resultados del análisis. La base 14 tiene también proyecciones 16 que adaptan un soporte en un aparato de análisis. Las proyecciones 16 están dispuestas de modo que el dispositivo de adquisición de muestras 10 sea posicionado correctamente en el aparato de análisis. El dispositivo de adquisición de muestras 10 comprende además una entrada de muestras 18. La entrada de muestras 18 está definida entre paredes opuestas dentro del dispositivo de adquisición de muestras 10, las paredes estando dispuestas tan cerca entre sí, que se crea una fuerza capilar en la entrada de muestras 18. La entrada de muestras 18 comunica con el exterior del dispositivo de adquisición de muestras 0 para permitir que sangre sea llevada en el dispositivo de adquisición de muestras 10. El dispositivo de adquisición de muestras 10 comprende además una cámara para el conteo de componentes biológicos marcados con fluoróforo, tales como células, en la forma de una cavidad de medición 20 dispuesta entre paredes opuestas dentro del dispositivo de adquisición de muestras 10. La cavidad de medición 20 está dispuesta en comunicación con la entrada de muestras 18. Las paredes que definen la cavidad de medición 20 están dispuestas más cerca entre sí que las paredes de la entrada de muestras 18, de modo que una fuerza capilar puede llevar sangre de la entrada de muestras 18 en la cavidad de medición 20. Las paredes de la cavidad de medición 20 están dispuestas a una distancia entre sí de 140 micrómetros. La distancia es uniforme sobre la cavidad de medición 20 entera. El espesor de la cavidad de medición 20 define el volumen de sangre que está siendo examinado. Puesto que el resultado del análisis se va a comparar con el volumen de la muestra de sangre que está siendo examinada, el espesor de la cavidad de medición 20 necesita ser muy preciso, es decir, sólo se permiten variaciones muy pequeñas en el espesor dentro de la cavidad de medición 20, y entre las cavidades de medición 20 de diferentes dispositivos de adquisición de muestras 10. El espesor permite que un volumen de muestras relativamente grande sea analizado en un área pequeña de la cavidad. El espesor permite teóricamente que células sean dispuestas unas arriba de otras dentro de la cavidad de medición 20. Sin embargo, la cantidad de células dentro de una muestra, tal como una muestra de sangre, es tan baja que la probabilidad de que esto ocurra es muy baja. El dispositivo de adquisición de muestras 10 está adaptado para medir conteos de células marcadas con fluoróforo arriba de 0.5 x 109 células/litro de sangre. A menores conteos de células, el volumen de la muestra será demasiado pequeño para permitir el conteo de cantidades estadísticamente significativas de células. Además, cuando el conteo de células marcadas con fluoróforo excede 12 x 09 células/litro de sangre, el efecto de las células que están siendo dispuestas traslapándose entre sí comenzará a ser significativo en el conteo de células medido. A este conteo de células marcadas con fluoróforo, las células marcadas cubrirán aproximadamente 8% de la sección transversal de la muestra que está siendo irradiada cuando el espesor de la cavidad de medición es de 140 micrómetros. De esta manera, para obtener conteos correctos de células marcadas con fluoróforo, este efecto necesitará ser explicado. Por lo tanto, puede usarse una corrección estadística de valores del conteo de células marcadas arriba de 12 x 109 células marcadas/litro de sangre. Esta corrección estadística estará aumentando para conteos crecientes de células marcadas con fluoróforo, puesto que el efecto de células marcadas traslapantes será más grande para conteos más grandes de células. La corrección estadística puede determinarse por medio de calibración de un aparato de medición. Como una alternativa, la corrección estadística puede determinarse a un nivel general para establecer aparatos de medición que se usarán con relación al dispositivo de adquisición de muestras 10. Se contempla que el dispositivo de adquisición de muestras 10 pueda usarse para analizar conteos de células marcadas con fluoróforo tan grandes como 50 x 109 células marcadas/litro de sangre. De conformidad con una modalidad alternativa, la detección de componentes biológicos marcados con fluoróforo se usa para determinar si un componente biológico específico está presente en la muestra. En esta modalidad, no hay necesidad de realizar un conteo volumétrico y, de esta manera, la presencia de un componente biológico puede detectarse incluso para cantidades muy pequeñas del componente en la muestra. Una superficie de una pared de la cavidad de medición 20 está cubierta por lo menos parcialmente con un reactivo 22. El reactivo 22 puede ser liofilizado, secado con calor o secado en vacío, y puede ser aplicado a la superficie de la cavidad de medición 20. Cuando se adquiere una muestra en la cavidad de medición 20, la muestra hará contacto con el reactivo 22 secado, e iniciará una reacción de unión entre el reactivo 22 y los componentes de la muestra. El reactivo 22 se aplica insertando el reactivo 22 en la cavidad de medición 20 usando una pipeta o dispensador. El reactivo 22 es resuelto en metanol cuando se inserta en la cavidad de medición 20. El solvente con el reactivo 22 llena la cavidad de medición 20. Entonces, se realiza el secado de modo que el solvente es evaporado, y el reactivo 22 es unido a las superficies de la cavidad de medición 20. Puesto que el reactivo va a ser secado sobre una superficie de un espacio estrecho, el líquido tendrá una superficie muy pequeña en contacto con la atmósfera ambiente, por lo cual la evaporación del líquido se hace más difícil. De esta manera, es ventajoso usar un líquido volátil, tal como metanol, que permite que el líquido sea evaporado en una manera efectiva del espacio estrecho de la cavidad de medición. De conformidad con un método de fabricación alternativo, el dispositivo de adquisición de muestras 10 se forma uniendo dos piezas entre sí, por lo cual una pieza forma la pared del fondo de la cavidad de medición 20, y la otra pieza forma la pared superior de la cavidad de medición 20. Esto permite que un reactivo 22 sea secado sobre una superficie abierta antes de que las dos piezas sean unidas entre sí. De esta manera, el reactivo 22 puede ser resuelto en agua, puesto que el solvente no necesita ser volátil.
El reactivo 22 puede comprender uno o más anticuerpos conjugados con fluoróforo. Los anticuerpos están adaptados para unirse con una estructura molecular específica característica del componente biológico elegido como objetivo, tal como una célula. La estructura puede ser un marcador de superficie de la célula, tal como CD4 o CD8. Cuando una muestra de sangre hace contacto con el reactivo 22, los anticuerpos actuarán para unirse con la estructura molecular específica de las células sanguíneas elegidas como objetivo, acumulándose de esta manera en las células. El reactivo 22 debe contener de preferencia cantidades suficientes de anticuerpo para marcar distintamente porciones de las células elegidas como objetivo, cubriendo esencialmente las células enteras. Esto implica que esencialmente las células marcadas enteras sean fluorescentes, y de esta manera pueden detectarse fácilmente en una imagen digital de la muestra. Además, habrá con frecuencia un excedente de anticuerpos conjugados con fluoróforo, que se entremezclarán en el plasma sanguíneo. El excedente de anticuerpos dará un bajo nivel de fondo homogéneo de fluorescencia en el plasma sanguíneo. Los anticuerpos acumulados en las células elegidas como objetivo serán distinguibles sobre el nivel de fondo de fluorescencia. El reactivo 22 puede comprender también otros constituyentes, que pueden ser activos, es decir, participando en la unión química a, por ejemplo, células de una muestra de sangre, o no activos, es decir, no participando en la unión. Los constituyentes activos pueden estar dispuestos, por ejemplo, para facilitar la unión de los anticuerpos a sus estructuras moleculares objetivo respectivas. Los constituyentes no activos pueden estar dispuestos, por ejemplo, para mejorar la unión del reactivo 22 a la superficie de una pared de la cavidad de medición 20. Dentro de unos cuantos minutos, la muestra de sangre habría reaccionado con el reactivo 22, de modo que los anticuerpos marcados con fluoróforo se habrán unido a las células elegidas como objetivo. Con relación a la figura 2, se describirá otra modalidad del dispositivo de adquisición de muestras. El dispositivo de adquisición de muestras 1 10 comprende una cámara 120 que forma la cavidad de medición. El dispositivo de adquisición de muestras 1 10 tiene una entrada 1 18 en la cámara 120 para transportar sangre en la cámara 120. La cámara 120 está conectada a una bomba (no mostrada) por medio de un tubo de succión 121 . La bomba puede aplicar una fuerza de succión en la cámara 120 por medio del tubo de succión 121 , de modo que la muestra sea succionada en la cámara 120 a través de la entrada 1 18. El dispositivo de adquisición de muestras 1 10 puede ser desconectado de la bomba antes de que se haga la medición. Al igual que la cavidad de medición 20 del dispositivo de adquisición de muestras 10 de conformidad con la primera modalidad, la cámara 120 tiene un espesor bien definido que define el espesor de la muestra que se va a examinar. Además, un reactivo 122 se aplica a las paredes de la cámara 120 para que reaccione con la muestra. Con relación ahora a la figura 3, se describirá un sistema para la detección y enumeración volumétrica de componentes biológicos marcados con fluoróforo. El sistema 30 comprende un soporte de muestras 32 para recibir un dispositivo de adquisición de muestras 10 con una muestra de sangre. El soporte de muestras 32 está dispuesto para recibir el dispositivo de adquisición de muestras 10 de modo que la cavidad de medición 20 del dispositivo de adquisición de muestras 10 sea posicionada correctamente dentro del sistema 30. El sistema 30 comprende una fuente de luz 34 para iluminar la muestra dentro del dispositivo de adquisición de muestras 10. La fuente de luz 34 puede ser un LED, el cual en conjunto con un filtro cromático irradia luz 48 que corresponde a una longitud de onda de excitación del fluoróforo usado con la muestra. La longitud de onda debe seleccionarse además de modo que la absorción de los componentes fluorescentes de la muestra diferentes de los componentes marcados con fluoróforo, sea relativamente baja. Además, las paredes del dispositivo de adquisición de muestras 10 deben ser esencialmente transparentes a la longitud de onda. Después de que pasa a través del filtro cromático, la luz es dirigida hacia la muestra a través del uso de un espejo dicroico 35. Los fluoróforos que se acumulan alrededor (o dentro) de los componentes biológicos marcados de la muestra, tales como células, absorberán esta luz 48 de una longitud de onda específica, y emitirán luz 50 de una longitud de onda más larga específica. Se deja que esta luz emitida 50 de una longitud de onda más larga pase a través del espejo dicroico y llegue a un sistema de formación de imágenes 36, de modo que los componentes emerjan en una imagen digital de la muestra como áreas o puntos de luz. Si se adquiere una imagen en color, las células marcadas emergerán como puntos coloreados específicos. Si se adquiere una imagen en blanco y negro, las células marcadas emergerán como puntos claros contra un fondo más oscuro. La fuente de luz 34 puede ser en forma alternativa una luz incandescente en conjunto con un filtro cromático, o un rayo láser. En forma alternativa, la luz 48 puede ser dirigida directamente hacia la muestra, a un ángulo, sin el envolvimiento de un espejo dicroico. El sistema 30 comprende además un sistema de formación de imágenes 36, que está dispuesto arriba del soporte de muestras 32. De esta manera, el sistema de formación de imágenes 36 está dispuesto para recibir radiación 50 que ha sido emitida por la muestra de sangre. El sistema de formación de imágenes 36 puede comprender un sistema de aumento óptico 38 y medios para la adquisición de imágenes 40. Para prevenir que luz no emitida por los fluoróforos de la muestra lleguen a los medios para la adquisición de imágenes 40, puede usarse un filtro cromático. El sistema de aumento 38 puede estar dispuesto para proveer un poder de aumento de 3 a 50x, más preferiblemente de 3 a 100x, y muy preferiblemente de 3 a 4x. Dentro de estas escalas de poder de aumento, es posible distinguir células marcadas. La imagen puede adquirirse con una resolución mejorada, para permitir que se use poder de aumento menor. Además, la profundidad de campo del sistema de aumento 38 puede estar dispuesta aún para corresponder por lo menos con el espesor de la cavidad de medición 20.
El sistema de aumento 38 puede comprender una lente o sistema de lentes objetivo 42, que está dispuesto cerca del soporte de muestras 32, y una lente o sistema de lentes ocular 44, que está dispuesto a una distancia de la lente objetivo 42. La lente objetivo 42 provee un primer aumento de la muestra, que es aumentada adicionalmente por la lente ocular 44. La lente objetivo 42 puede estar dispuesta entre el espejo dicroico 35 y el soporte de muestras 32. El sistema de aumento 38 puede comprender más lentes para lograr un aumento y formación de imágenes adecuados de la muestra. El sistema de aumento 38 está dispuesto de modo que la muestra en la cavidad de medición 20 cuando se pone en el soporte de muestras 32, sea enfocada sobre un plano de imagen de los medios para la adquisición de imágenes 40. Los medios para la adquisición de imágenes 40 están dispuestos para adquirir una imagen digital de la muestra. Los medios para la adquisición de imágenes 40 pueden ser cualquier tipo de cámara digital, tal como una cámara de CCD. El tamaño de pixeles de la cámara digital ajusta una restricción sobre el sistema de formación de imágenes 36, de modo que el círculo de confusión en el plano de imagen puede no exceder el tamaño de pixeles dentro de la profundidad de campo. Sin embargo, células marcadas pueden detectarse aún incluso si son un poco confusas y, por lo tanto, puede dejarse que el círculo de confusión exceda el tamaño de pixeles, mientras que se considere que está dentro de la profundidad de campo. La cámara digital 40 adquirirá una imagen digital de la muestra en la cavidad de medición 20, en donde el espesor entero de la muestra sea suficientemente enfocado en la imagen digital para el conteo de las células sanguíneas marcadas. El sistema de formación de imágenes 36 definirá un área de la cavidad de medición 20, que será representada por una imagen en la imagen digital. El área que está siendo representada por una imagen junto con el espesor de la cavidad de medición 20, define el volumen de la muestra que está siendo representada por una imagen. El sistema de formación de imágenes 36 está establecido para ajustar la formación de imágenes de muestras de sangre en dispositivos para la adquisición de muestras 10. No hay necesidad de cambiar la organización del sistema de formación de imágenes 36. De preferencia, el sistema de formación de imágenes 36 está dispuesto dentro de un alojamiento, de modo que la organización no sea cambiada accidentalmente. En forma alternativa, el sistema 30 puede comprender más de un sistema de formación de imágenes 36, por lo cual fluorescencia emitida de diferentes longitudes de onda puede ser dirigida hacia diferentes sistemas de formación de imágenes respectivos. La orientación de diferentes longitudes de onda de luz a diferentes sistemas de formación de imágenes 36 puede lograrse usando, por ejemplo, uno o más espejos dicroicos o rejillas. Asimismo, puede usarse una pluralidad de fuentes de luz 34, por lo cual la muestra puede ser irradiada con luz de diferentes longitudes de onda específicas al mismo tiempo o secuencialmente. Esto puede lograrse usando una pluralidad de LEDs en conjunto con por lo menos un filtro cromático cada uno. Convenientemente, todos los filtros cromáticos usados dentro del sistema 30 pueden estar dispuestos sobre ruedas, sobre las cuales pueden estar dispuestos todos los filtros cromáticos más comúnmente necesarios, de modo que el filtro específico necesario para una detección específica pueda ser fácilmente señalado en una posición activa. Un filtro está en una posición activa, cuando intersecta la luz del LED antes de que llegue a la muestra, si el filtro se usa para la luz de excitación, o cuando intersecta la luz de fluorescencia de la muestra antes de que llegue a los medios para la adquisición de imágenes 40, si el filtro se usa para la luz emitida. El sistema 30 comprende además un analizador de imágenes 46. El analizador de imágenes 46 está conectado a la cámara digital 40 para recibir imágenes digitales adquiridas por la cámara digital 40. El analizador de imágenes 46 está dispuesto para identificar patrones en la imagen digital que correspondan a una célula marcada para el conteo del número de células marcadas que están presentes en la imagen digital. De esta manera, el analizador de imágenes 46 puede estar dispuesto para identificar puntos de luz contra un fondo más oscuro. El analizador de imágenes 46 puede estar dispuesto para primero aumentar electrónicamente la imagen digital antes del análisis de la imagen digital. Esto implica que el analizador de imágenes 46 pueda ser capaz de distinguir más fácilmente células marcadas que son representadas por una imagen que están cercanamente unas de otras, aún cuando el aumento electrónico de la imagen digital haga que la imagen digital sea un poco más confusa.
El analizador de imágenes 46 puede calcular el número de células sanguíneas marcadas por volumen de sangre, dividiendo el número de células sanguíneas marcadas que se identifican en la imagen digital con el volumen de la muestra de sangre, que es bien definido como se describió anteriormente. El conteo volumétrico de células sanguíneas marcadas puede presentarse en un dispositivo visualizador del aparato 30. El analizador de imágenes 46 puede comprenderse como una unidad de procesamiento, que comprende códigos para realizar el análisis de la imagen. Con relación a la figura 4, se describirá un método aplicable a componentes biológicos marcados con fluorescencia. El método se describirá específicamente con relación a un método para la detección y enumeración volumétrica de linfocitos T marcados. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que el método puede modificarse para la detección y la enumeración volumétrica de otros componentes biológicos. Necesita usarse un reactivo adecuado para la marcación de los componentes biológicos de interés, y necesita adaptarse la irradiación y detección a las longitudes de onda de excitación y emisión de los fluoróforos seleccionados, como lo apreciarán los expertos en la técnica. El método para la detección y enumeración volumétrica de linfocitos T, comprende adquirir una muestra de sangre en un dispositivo de adquisición de muestras, paso 102, que tiene un espesor fijo de 140 pm. Una muestra no diluida de sangre entera humana es adquirida en el dispositivo de adquisición de muestras. La muestra puede adquirirse de sangre capilar o sangre venosa. Una muestra de sangre capilar puede ser llevada en la cavidad de medición directamente a partir de un dedo pinchado de un paciente. La muestra de sangre hace contacto con el reactivo 22 en el dispositivo de adquisición de muestras, iniciando una reacción de unión. El reactivo comprende un anticuerpo anti-CD4 marcado con FITC y un anticuerpo anti-CD8 marcado con APC. Dentro de unos cuantos minutos, la muestra de sangre habrá reaccionado con el reactivo 22, de modo que los anticuerpos marcados con fluoróforo se han unido a los marcadores de CD4 de los linfocitos auxiliares T y a los marcadores de CD8 de los linfocitos asesinos T de la muestra de sangre, respectivamente, y la muestra está lista ahora para ser analizada. El dispositivo de adquisición de muestras se pone en un aparato de análisis, paso 104. Un análisis puede iniciarse oprimiendo un botón del aparato de análisis. En forma alternativa, el análisis es iniciado automáticamente por el aparato que detecta la presencia del dispositivo de adquisición de muestras. La muestra es irradiada usando un LED en conjunto con un filtro cromático dispuesto para sólo dejar que pase luz de aproximadamente 450 nm, paso 106. La luz permitida es dirigida directamente a la muestra, a un ángulo ligero respecto a la superficie superior del dispositivo de adquisición de muestras. La luz del LED es absorbida por los fluoróforos de FITC que marcan a los linfocitos CD4+, por lo cual el FITC emite luz a alrededor de 500 nm. Una cámara de CCD se usa para adquirir una imagen de la muestra fluorescente sin algún aumento óptico, paso 108. La cámara está en conjunto con un filtro cromático dispuesto para dejar que sólo pase luz de una longitud de onda de aproximadamente 500 nm en la cámara. Esto implica que la imagen digital contendrá áreas/puntos de luz en las posiciones de las células auxiliares T marcadas. La muestra es entonces de nuevo, en la misma forma como se indicó anteriormente, irradiada con un LED, ahora en conjunto con un filtro cromático que deja que sólo pase luz de longitud de onda de alrededor de 590 nm a través de la muestra, excitando de esta manera los fluoróforos de APC que marcan a las células asesinas T CD8+. En analogía con la detección de las células marcadas con FITC, se usa un filtro cromático que deja que sólo pase luz de longitud de onda de alrededor de 640 nm hacia la cámara de CCD, por lo cual se obtiene una segunda imagen digital, esta vez conteniendo áreas/puntos de luz en las posiciones de las células asesinas T marcadas presentes en la muestra. Las imágenes digitales adquiridas son transferidas hacia un analizador de imágenes, realizando un análisis de imagen de aumento electrónico, paso 1 10, para contar el número de puntos de luz en la imagen digital respectiva. El analizador de imágenes es de esta manera capaz de determinar las concentraciones de células auxiliares T y células asesinas T, respectivamente, en la muestra de sangre. El analizador de imágenes es también capaz de sobreponer las dos imágenes para determinar si existe alguna célula que, contrariamente a la expectativa, exhibe CD4 y CD8.
En forma alternativa, la muestra de líquido, sangre entera en este caso, puede hacerse reaccionar, o puede hacerse reaccionar parcialmente, con el reactivo 22 (anticuerpos) fuera del dispositivo de adquisición de imágenes 10, después de lo cual la muestra que se hizo reaccionar o que se hizo reaccionar parcialmente, puede adquirirse en el dispositivo de adquisición de muestras 10. En una modalidad, el reactivo 22 comprende un anticuerpo secundario marcado con fluoróforo, que tiene una afinidad por un anticuerpo primario, cuyo anticuerpo secundario está presente en la cavidad de medición 20 del dispositivo de adquisición de muestras 10 en una forma seca. La muestra de líquido es de esta manera, fuera del dispositivo de adquisición de muestras 10, tratada primero con el anticuerpo primario, que se une a una estructura molecular prescrita específica de los componentes biológicos elegidos como objetivo de la muestra. La muestra, incluyendo los anticuerpos primarios, es adquirida entonces en el dispositivo de adquisición de muestras 10 que contiene al anticuerpo secundario. Los anticuerpos secundarios son de esta manera entremezclados con la muestra, y se unen a los anticuerpos primarios que, a su vez, se unen a los componentes biológicos elegidos como objetivo, por lo cual los componentes biológicos elegidos como objetivo son marcados con el fluoróforo. Esta modalidad implica que el anticuerpo seco conjugado con el fluoróforo puede usarse para marcar muchos diferentes tipos de componentes biológicos, en tanto estos componentes hayan sido pretratados con un anticuerpo primario que tenga una afinidad por los mismos.
De esta manera, el pretratamiento de la muestra permite que el dispositivo de adquisición de muestras 10 se use en muchas aplicaciones diferentes, y no haya necesidad de adaptar el dispositivo de adquisición de muestras 10 para su uso en la detección de sólo un componente biológico. Debe enfatizarse que las modalidades preferidas descritas en la presente de ninguna manera son limitativas, y que muchas modalidades alternativas son posibles dentro del alcance de la protección definida por las reivindicaciones anexas.

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES
1. - Un dispositivo de adquisición de muestras para la detección de componentes biológicos en una muestra de líquido, dicho dispositivo de adquisición de muestras comprendiendo: una cavidad de medición para recibir una muestra de líquido, dicha cavidad de medición teniendo un espesor fijo predeterminado, y dicha cavidad de medición teniendo un área que está adaptada para ser representada por una imagen para proveer el análisis de un volumen bien definido de la muestra, por lo cual puede lograrse la enumeración volumétrica de un componente biológico en la muestra, y un reactivo, el cual está dispuesto en una forma seca dentro de la cavidad de medición, dicho reactivo comprendiendo, como componentes del mismo, una molécula conjugada con fluoróforo, que está dispuesta para unirse con los componentes biológicos, así como todos los demás componentes del reactivo, si lo hay, dentro de la cavidad de medición, los cuales están dispuestos para unirse con los componentes biológicos, en donde todos los componentes del reactivo dentro de la cavidad de medición que están dispuestos para unirse con los componentes biológicos, son disolvibles o suspendibles en la muestra de líquido.
2. - El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la molécula conjugada con fluoróforo está dispuesta para unirse con una estructura molecular específica de un componente biológico.
3. - El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el dispositivo de adquisición de muestras comprende un miembro de cuerpo que tiene dos superficies planas que definen dicha cavidad de medición.
4. - El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque las superficies planas están dispuestas a una distancia predeterminada de alguna otra para determinar un espesor de la muestra para una medición óptica.
5. - El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la cavidad de medición tiene un espesor uniforme de 50 a 170 micrómetros.
6. - El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la cavidad de medición tiene un espesor uniforme de por lo menos 100 micrómetros.
7. - El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizado además porque la cavidad de medición tiene un espesor uniforme no mayor de 150 micrómetros. 8.- El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque comprende una entrada de muestras que comunica la cavidad de medición con el exterior del dispositivo de adquisición de muestras, dicha entrada estando dispuesta para adquirir una muestra de líquido. 9. - El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la entrada está dispuesta para adquirir una muestra de líquido a través de fuerza capilar. 10. - El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el reactivo ha sido aplicado a la superficie resuelta en un líquido volátil que se ha evaporado para dejar el reactivo en una forma seca. 1 .- El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la molécula conjugada con fluoróforo es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. 12. - El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el dispositivo de adquisición de muestras es desechable. 13. - Un método para la detección de componentes biológicos marcados con fluoróforo en una muestra de líquido, dicho método comprendiendo: mezclar un reactivo que comprenda una molécula conjugada con fluoróforo con una muestra de líquido, de modo que la molécula conjugada con fluoróforo se una a una estructura molecular específica de un componente biológico en la muestra de líquido; introducir la muestra de líquido en una cavidad de medición de un dispositivo de adquisición de muestras, dicha cavidad de medición teniendo un espesor fijo predeterminado; irradiar un área de la muestra en la cavidad de medición con radiación electromagnética de una longitud de onda que corresponda a una longitud de onda de excitación del fluoróforo; detectar componentes biológicos marcados con fluoróforo en el espesor entero de la cavidad de medición, dicha detección comprendiendo adquirir una imagen digital del área irradiada en la cavidad de medición; y analizar digitalmente la imagen digital para identificar componentes biológicos que exhiben el fluoróforo, y determinar el número de componentes biológicos que exhiben el fluoróforo en la muestra; en donde los componentes biológicos que exhiben el fluoróforo se distinguen en la imagen digital como puntos de fluorescencia que emiten radiación electromagnética de una longitud de onda que corresponde a una longitud de onda de emisión del fluoróforo. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho dispositivo de adquisición de muestras comprende un reactivo, que está dispuesto en una forma seca dentro de la cavidad de medición, dicho reactivo comprendiendo una molécula conjugada con fluoróforo, y en donde dicho mezclado se logra introduciendo la muestra de líquido en la cavidad de medición para hacer contacto con el reactivo. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque la imagen digital es adquirida usando un poder de aumento óptico de 3 a 50x, más preferiblemente de 3 a 10x. 16.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado además porque dicho análisis comprende identificar áreas de la imagen digital que resultan de radiación electromagnética emitida. 17.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado además porque dicho análisis comprende identificar puntos en la imagen digital que resultan de radiación electromagnética emitida. 1
8. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado además porque dicho análisis comprende sobreponer dos o más imágenes obtenidas, cada imagen exhibiendo longitudes de onda emitidas específicas respectivas. 1
9. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, caracterizado además porque dicho análisis comprende aumentar electrónicamente la imagen digital adquirida. 20. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, caracterizado además porque la muestra de líquido es introducida en la cavidad de medición del dispositivo de adquisición de muestras a través de una entrada de muestras capilar por medio de fuerza capilar. 21. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, caracterizado además porque dicha imagen digital es adquirida con una profundidad de campo que corresponde por lo menos con el espesor de la cavidad de medición. 22. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21 , caracterizado además porque un volumen de la muestra de líquido analizado es bien definido por el espesor de la cavidad de medición y un área de la imagen que está siendo representada por una imagen. 23. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 22, caracterizado además porque dicha irradiación es realizada por una fuente de luz que comprende un diodo emisor de luz. 24. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 23, caracterizado además porque dicha longitud de onda que corresponde a una longitud de onda de excitación se obtiene a través del uso de un diodo emisor de luz en combinación con un filtro cromático.
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