MX2008012178A - Metodo para modular el crecimiento de celulas madre hematopoyeticas. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos para modular poblaciones de células madre hematopoyéticas al utilizar moduladores de HSC, que son agentes que ya sea que incrementan los números de HSC o disminuyen los números de HSC como sea deseado por una indicación particular. Por ejemplo, los moduladores de HSC encontrados para incrementar los números de HSC incluyen prostaglandina E2 (PGE2) y agentes que estimulan la ruta de PGE2. A la inversa, los moduladores que previenen la síntesis de PGE2 disminuyen los números de HSC. Los moduladores de HSC pueden ser utilizador in vitro, in vivo o ex vivo.

Description

MÉTODO PARA MODULAR EL CRECIMIENTO DE CÉLULAS MADRE HEMATOPOYETICAS CAMPO DE LA INVENCIÓN Las presentes modalidades proporcionan moduladores que ya sea incrementan o disminuyen las poblaciones de células madre hematopoyéticas in vitro, in vivo y ex vivo. ANTECEDENTES La investigación de células madre sostiene potencial extraordinario para el desarrollo de terapias que pueden cambiar el futuro para aquellos que sufren de enfermedades tales como leucemia, diabetes, y anemia. Mucha investigación se enfoca sobre la exploración de la biología de células madre como una clave para tratamientos para enfermedades. A través de un entendimiento de la función de las células madre en el desarrollo normal, los investigadores buscan capturar y dirigir las capacidades innatas de las células madre para tratar muchas condiciones. La investigación está en curso en un número de áreas simultáneamente: el examen de activadores genéticos y moleculares que impulsan a las células madre embriónicas a desarrollarse en varios tejidos; el aprendizaje de cómo empujar esas células para dividirse y formar tejidos especializados; cultivar células madre embriónicas y desarrollar nuevas líneas para trabajar con las mismas; la investigación para maneras de eliminar o controlar la Enfermedad de Injerto contra Hospedero al eliminar la necesidad por . donadores; y la generación de una linea de células universalmente transplantables. Las células madre hematopoyéticas (HSCs) se derivan durante la embriogénesis en distintas regiones donde eventos inductivos específicos convierten el mesodermo a células madre sanguíneas y progenitoras . Aun permanece una necesidad para poner en claro las relaciones entre biomoléculas particulares, agentes químicos y otros factores particulares en estos eventos inductivos. Por ejemplo, aun permanece una necesidad para identificar que biomoléculas o agentes químicos muestran promesa en la manipulación de la población de HSC para un propósito deseado, tal como el incremento de una población de HSC para investigación o terapéutica. BREVE DESCRIPCIÓN Las composiciones y métodos de la presente invención proporcionan moduladores de HSC, que son agentes que ya sea que incrementan los números de HSC o disminuyen los números de HSC como es deseado por una indicación particular. Por ejemplo, los moduladores de HSC encontrados para incrementar números de HSC incluyen prostaglandina E2 (PGE2) y agentes que estimulan la ruta de PGE2. A la inversa, los moduladores de HSC que previenen la síntesis de PGE2 disminuyen los números de HSC. Una modalidad proporciona un método para promover el crecimiento de células madre hematopoyéticas en un sujeto, que comprende administrar por lo menos un modulador de células madre hematopoyéticas (HSC) y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, el modulador de HSC incrementa HSCs al modificar la ruta de prostaglandina . Un modulador de HSC que aumenta las poblaciones de HSC al modificar la ruta de prostaglandina puede ser por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de PGE2, dmPGE2, PGI2, Acido Linoleico, 13(s)-HODE, LY171883, Acido de Aguamiel, Acido Eicosatrienoico, Acido Epoxieicosatrienoico, ONO-259, Cay 1039, un agonista de receptor de PGE2, y un derivado de cualquiera de estos agentes. En una modalidad más particular, el modulador de HSC es un derivado de PGE2 seleccionado del grupo que consiste de 16, 16-dimetil PGE2, 19 ( R) -hidroxi PGE2, 16, 16-dimetil PGE2 éster p- (p-acetamidobenzamido) fenilico, 11 deoxi-16, 16-dimetil PGE2, 9-deoxi-9-metilen-16, 16-dimetil PGE2, 9-deoxi-9-metilen PGE2, Butaprost, Sulprostona, PGE2 serinol amida, éster metílico de PGE2, 16-fenil tetranol PGE2 , 15 (S) -15-metil PGE2 y 15 (R) -15-metil PGE2. En otra modalidad, el modulador de HSC incrementa HSCs al modificar la ruta de nt . Un modulador de HSC que aumenta las poblaciones de HSC al modificar la ruta de Wnt puede ser por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de PGE2, dmPGE2, BIO, LiCl y derivados de estos compuestos . En todavía otra modalidad, el modulador de HSC incrementa HSCs al modificar el segundo mensajero de CAMP/P13K/AKT . Un modulador de HSC que aumenta las poblaciones de HSC al modificar el segundo mensajero de cAMP/P13K/AKT puede ser por lo menos un compuesto seleccionado del ' grupo que consiste de 8-bromo-cAMP, Forscolin y derivados de estos agentes. En todavía otra modalidad, el modulador de HSC incrementa las poblaciones de HSC al modificar el segundo mensajero de Ca2+. Un modulador de HSC que aumenta las poblaciones de HSC al modificar el segundo mensajero de Ca2+ puede ser por lo menos un agente seleccionado del grupo que consiste de Bapta-AM,' Fendilina, Nicardipina y derivados de estos compuestos. En otra modalidad, el modulador de HSC incrementa HSCs al modificar la señalización de NO/Angiotensina. Un modulador de HSC que aumenta las poblaciones de HSC al modificar la señalización de NO/Angiotensina puede ser por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de L-Arg, Nitroprúsido de Sodio, Vanadato de Sodio, Bradiquinina, y derivados de los mismos. En todavía otra modalidad, el modulador de HSC que aumenta las poblaciones de HSC puede ser por lo menos un agente seleccionado del grupo que consiste de Mebeverina, Flurandrenólido, Atenolol, Pindolol, Gaboxadol, Acido Quinurénico, Hidralazina, Tiabendazol, Bicuclina, Vesamicol, Peruvósido, Imipramina, Cloropropamida , 1,5- Pentame ilentetra zol , 4 -Aminopiridina , Diazóxido, Benfotiamina , ácido 12-Metoxidodecenóico, N-Formil-Met-Leu-Phe, Galamina, IAA 94, Clorotrianiseno y derivados de estos compuestos . Otra modalidad proporciona un método para promover el crecimiento de HSC al poner en contacto una población de células madre nacientes con por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que . consiste de PGE2, PGI2, Acido Linoleico, 13(s)-HODE, LY1 71883, Acido de Aguamiel, Acido Eicosatrienoico, Acido epoxieicosatrienoico, ONO-259, Cayl039, un agonista de receptor de PGE2, de 16, 16-dimetil PGE2, 19 (R) -hidroxi PGE2, 16, 16-dimetil PGE2, éster p- (p-acetamidobenzamido) fenilico, ll-deoxi-16, 16-dimetil PGE2 , 9-deoxi-9-metilen-16, 16-dimetil PGE2, 9-deoxi-9-metilen PGE2, Butaprost, Sulprostona, PGE2 serinol amida, éster metílico de PGE2, 16-fenil tetranor PGE2, 15 (S) -15-metil PGE2, 15(R)-15-metil PGE2, BIO, 8-bromo-cAMP, Forscolin, Bapta-AM, Fendilina, Nicardipina , Nifedipina , Pimózido, Estrofantidina , Lanatósido, L-Arg, Nitroprúsido de Sodio, Vanadato de Sodio, Bradiquinina, Mebeverina, Flurandrenólido, Atenolol, Pindolol, Gaboxadol, Acido Quinurénico, Hidralazina, Tiabendazol, Bicuclina, Vesamicol, Peruvósido, Imipramina, Cloropropamida, 1, 5-Pentametilenetetrazol, 4 -Aminopiridina , Diazóxido, Benfot iamina , ácido 12-Metoxidodecanoico, N-Formil-Met-Leu-Phe, Galamina, IAA 94, Clorotrianiseno y derivados de los mismos. La población de células madre nacientes se puede recolectar de la sangre periférica, sangre del cordón umbilical, villi coriónico, fluido amniótico, sangre de placenta o médula ósea. Otra modalidad de la presente invención proporciona un método para promover la expansión de HSC ex vivo, que comprende incubar HSC en la presencia de por lo menos un modulador de HSC. Otra modalidad de la presente invención proporciona un método para promover la expansión de HSC ex vivo, que comprende recolectar muestra de muestra de fuente de HSC (por ejemplo, sangre periférica, sangre de cordón umbilical, fluido amniótico, sangre de placenta, médula ósea, villi coriónico) y almacenarlo en la presencia de por lo menos un modulador de HSC tal como PGE2. Una modalidad particular proporciona un equipo que comprende un contenedor adecuado para el almacenamiento de la muestra de fuente de HSC en la cual el contenedor es precargado con por lo menos un modulador de HSC que incrementa HSCs. Una modalidad adicional proporciona un equipo que comprende un contenedor adecuado para el almacenamiento de la muestra de fuente de HSC y un frasquito que contiene una cantidad adecuada de por lo menos un modulador de HSC que incrementa HSCs. Una modalidad adicional de la presente invención proporciona un método para promover la expansión de HSC ex vivo, en la cual la fuente de HSC naciente se pone en contacto con PGE2, o un derivado del mismo, en recolección inicial, durante el procesamiento, el almacenamiento, en congelación o durante la transfusión . En otra modalidad de la presente invención, el modulador de HSC inhibe HSCs al modificar la ruta de prostaglandina. Un modulador de HSC que inhibe las poblaciones de HSC al modificar la ruta de prostaglandina puede ser por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de Indometacina , Fenbufen, NS398, SC560, Sulindac, Suxibuzona, Aspirina, Naproxeno, Ibuprofeno, Celecoxib, PGJ2, Acido Aristolóquico, AH6809, . AH23848 y derivados de éstos. En otra modalidad, el modulador de HSC inhibe HSCs al modificar la ruta de Wnt . Un modulador de HSC que inhibe las poblaciones de HSC al modificar la ruta de Wnt puede ser por lo menos uno de los agentes seleccionados del grupo que consiste de inhibidores de prostaglandina, Quenpaulona, Acido Valproico, o un derivado del mismo. En todavía otra modalidad de la presente invención, . el modulador HSC inhibe HSCs al modificar el segundo mensajero cAMP/P13K/AKT . Un modulador de HSC que inhibe las poblaciones de HSC al modificar el segundo mensajero CAMP/P13K/AKT puede ser uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de PD98059, KT5720, H89, U0126, ortmannina y derivados de los mismos. En otra modalidad, el modulador de HSC inhibe HSCs al modificar el segundo mensajero de Ca2+. Un modulador de HSC que inhibe las poblaciones de HSC al modificar el segundo mensajero de Ca2+ puede ser por lo menos un agente seleccionado del grupo que consiste de BayK-8644, T.hioridazina y derivados de estos agentes. En todavía otra modalidad, el modulador de HSC inhibe HSCs al modificar la señalización de NO/Angiotensina. Un modulador de HSC que inhibe las poblaciones de HSC al • modificar la señalización de NO/Angiotensina puede ser por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de L- ÑAME , Enalapril, Captopril, AcSDKP, Losartan, ' AcSDKP, Losartan, Telimasartan, Histamina, Ambroxol, Crisina, Cicloheximida , Azul de Metileno, Epinefrina, Dexametazona , Proadifen, Isotiocianato de bencilo, Efedrina y derivados de los mismos. En una modalidad adicional de la invención, el modulador de HSC que inhibe las poblaciones de HSC es por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de Paragilina, Propranolol, Etanidazol, Metimazol, Cinoxacina, Penicilamina , Furosemida, Eburnamininona , Aclarubicina, Warfarina, Acido gamma-aminobutírico , Norethindrona, Lupinidina, Hidroquinidina , Todralazina, Metoxamina, Hidroxiurea, Dihidroergotamina , Antazolina, Acido 3-Nitropropiónico, Acido N-Fenilantranílico, Fenazopiridina , Acido Dicloroquinurénico, 3-estradiol, L-Leu, Fenoxibenzamina , Mefentermina , Guvacina, Guaiazuleno, Imidazol, Beta-Caroteno, Clorofibrato y derivados de estos compuestos . Todavía otra modalidad proporciona un método para inhibir el crecimiento de HSC en un sujeto, que comprende administrar por lo menos un modulador de HSC y un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad particular, el modulador de HSC es uno o más de los compuestos seleccionados del grupo que consiste de Indotemacina , Celecoxib, Fenbufen, Prosteglandina J2, Suxibuzona, Sulindac y derivados de los mismos. Otra modalidad proporciona un método para disminuir el crecimiento de HSC al poner en contacto una población de células madre nacientes con por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de Indotemacina, Fenbufen, NS398, SC560, Sulindac, Suxibuzona, Aspirina, Naproxeno, Ibuprofeno, Celecoxib, PGJ2, Acido Aristoloquico, AH6809, AH23848, Quenpaulona, Acido Valproico, PD98059, KT5720, H89, U0126, ortmannina, BayK 8644, Tiridazina, L-NAME, Enalapril, Captopril, AcSDKP, Losartan, AcSDKP, Losartan, Telimasartan, Histamina, Ambroxol, Crisina, Cicloheximida , Azul de Metileno, Epinefrina, Dexametazona, Proadifen, Isotiocianato de bencilo, Efedrina, Paragilina, Propranolol, Etanidazol, Metimazol, Cinoxacin, Penicilamina , Furosamida, Eburnamininona, Aclarubicin, ¦ Warfarina, Acido Gamma-aminobutirico, Noretindrona , Lupinidina, Hidroquinidina , Todralazina, Metoxamina, Hidroxiurea, Dihidroergotamina , Antazolina, Acido 3-Nitropropiónico, Acido N-Fenilantranílico, Fenazopiridina , Acido Dicloroquinurénico , 3-estradiol, L-Leu, Fenoxibenzamina , Mefentermina , Guvacina, Guaiazuleno, Imidazol, Beta-Caroteno, Clorofibrato, un antagonista de receptor PGE2 y derivados de estos compuestos. DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 presenta una representación esquemática de una clasificación para sustancias químicas que afectan las células madre en el AGM utilizando embriones de Pez cebra. Las Figuras 2A y 2B se relacionan a agonistas y antagonistas de prostaglandina que alteran la expresión runxl/cmyb sin afectar el desarrollo vascular. La Figura 2A muestra los perfiles de expresión de microarreglo de poblaciones de células clasificadas por FACS aisladas durante la hematopoyesis primitiva (gatal e Imo2) y definitiva (Imo2 y cd41) . La expresión relativa de coxl (gris claro) y cox-2 (gris oscuro) en cada fracción clasificada de GFP+ comparada con las células GFP es mostrada. La Figura 2B muestra los perfiles qPCR de la expresión de gen específica de endotelio y HSC después de la exposición a dmPGE2 de acción larga (10 µ?, segunda barra en cada triplete, gris oscuro) o el inhibidor cox no especifico endometacina (10 µ?, tercera barra en triplete) contra el control (primera barra en el triplete) . Ambos tratamientos dieron por resultado diferencias estadísticamente significantes comparadas con los controles para cada gen examinado (ANOVA, p<0.05, n=8). La Figura 3 representa datos que indican que los agonistas y antagonistas de prostaglandina alteran la expresión de runxl/cmyb mediante el análisis cuantitativo de números HSC en embriones de Pez cebra ' bigénicos detectados por microscopía confocal: DMSO 23.3±5.0 (media+SD) , dmPGE2 (10 µ?) 38.012.2, Indotemacina (10 µ?) (ANOVA, p<0.00001, n=10/tratamiento) . Las Figuras 4A y 4B muestran que el tratamiento con dmPGE2 aumenta la recuperación hematopoyética en el Pez cebra adulto subletalmente irradiado. Se realizaron experimentos de recuperación de irradiación de KM completa de Pez cebra. Asteriscos (*) indican diferencias estadísticamente significantes: * = 50 µ? contra control, ** = 50 µ? contra 10 µ? y 50 µ? contra control, *** = todas las variables significantes (ANOVA, p<0.05, n=15/variable) . La Figura 4A muestra perfiles FACS FSC/SSC de linajes de células hematopoyéticas en el KM en los días 0, 4, 7, 10 y 14 de recuperación de irradiación en el Pez cebra tratado con DMSO y dmPGE2 (50 µ?) . La Figura 4B muestra la cinética de la reconstitución KM de las células precursoras, linfoides y mieloides en el pez de control (triángulo) y el pez tratado con dmPGE2 (cuadro, 10 µ?; circulo, 50 µ?) . Las Figuras 5A y 5B representan la modulación de la ruta de PG que altera la expresión de genes relacionados con HSC .y la recuperación en el Pez cebra adulto subletalmente irradiado. La Figura 5A muestra el efecto del tratamiento de dmPGE2 sobre marcadores de célula madre y endoteliales , como es medido mediante qPCR sobre KM aislada en el día 3 de post radiación. Un asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significante (prueba t de dos . extremos, n=15, runxl: p=0.0001; lmo2 : p=0.014; flil: p=0.049). La Figura 5B representa el efecto de coxl (SC560, 10 µ?) y cox2 (NS398, 10 µ?) de la inhibición sobre la recuperación de irradiación (n=5/tratamiento) . Para el pez tratado con SC560 o NS398 no se podría obtener el análisis en el día 14 debido a la muerte excesiva en estos grupos de tratamiento. Las Figuras 6A y 6B muestran que el número de colonia muestran que dmPGE2 modula el número de colonia y la diferenciación hematopoyética en células ES de ratón. Los ensayos de formación de colonia de células ES con M3434 y OP9 se realizaron; los conteos son para 100,000 células en placa. Las barras indican células CS tratadas con control y el tratamiento con dosis incrementadas de dmPGE2 (10 µ?, 20 µ?, 100 µ?) o células ES tratadas con Indotemacina (10 µ?, 100 µ?) . Un asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significante (prueba t de dos extremos, n=5/variable ) . La Figura 6A, efecto de la dosis incrementada de dmPGE2 e inhibición de la actividad de ciclohexigenasa por Indotemacina en la diferenciación hematopoyética y metilcelulosa ; números de eritroides (E) definitivos, granulocito/monocito mezclados (GM) , y colonias progenitoras multipotentes (GEMM) son mostradas (10 µ? dmPGE2: GM p=0.005, GEMM p=0.017; 20 µ? dmPGE2 : dE p=0.04, GM p=0.007, GEMM 0.016; 100 µ? Indotemacina: GM p=0.024). Figura 6B, Efecto de dmPGE2 e Indotemacina sobre el número de colonia hematopoyética OP9 (20µ?: p=0.047). Las Figuras 7A y 7B representan la influencia de PGE2 sobre el número de colonia'. Más específicamente, las Figuras 7A y 7B ilustran el rescate mediado por dmPGE2 (10 µ?) de la inhibición de Indotemacina (100 µ?) de la formación de colonia en (A) metilcelulosa y (B) ensayos OP9. Las Figuras 8A - Figura 8F indican que la exposición de BM murino a dmPGE2 incrementa el número de CFU-S y la repoblación de HSCs . Un asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significante. Las Figuras 8A y 8B, Efecto del tratamiento ex vivo de WBM (2 hrs en hielo) con el control de EtOH o dmPGE2 (1 µ?/106 células) sobre CFU-S8 y CFU-S12 (60,000 células/recipiente; CFU-S12: prueba t de dos extremos, n=10, p<.0001). Figura 8C, Efecto sobre CFU-SI2 después del tratamiento ex vivo con Indotemacina (1 µ /106 células) (100,000 células/recipiente; prueba t de dos extremos, n=10, p=0.0002). Figura 8D, evaluación de CFU-S12 después del tratamiento de las células madre de linaje ckit+scal con dmPGE2 o control de EtOH (prueba t de dos extremos, 100 células: n=10, p=0.013; 300 células : p=0.0003 ) . Figuras 8E y 8F, ensayo de repoblación competitivo de dilución limitante. El número de recipientes negativos, es determinado mediante el análisis de FACS (e) en relación al número total de células transplantadas para el control (cuadrado) o muestras de células tratadas con dmPGE2 (circulo) se muestran en 12 semanas. La frecuencia del injerto (Panel F) en 6, 12 y 24 de post transplante en recipientes de EtOH contra WBM tratado con dmPGE2 calculado por la estadística de Poisson (ANOVA, n=10/variable, 6 semanas: p=0.005; 12 semanas: p=0.002; 24 semanas: p=0.05); el número de recipientes que sobreviven al análisis de cada punto de tiempo se muestra en la Tabla 6-Tabla 8. Figuras 9A - 9N representan los datos que demuestra que la exposición de BM murino a dmPGE2 incrementa el peso del bazo y los injertos de 1 HSC. La Figura 9 A y 9B, Efecto del tratamiento ex vivo de WBM y HSCs aisladas con control de EtOH o dmPGE2 sobre el peso del bazo en el día (a) ocho y (b) doce (prueba t de dos extremos, CFU-S8: n=5, p=0.339; CFU-Si2: ?=9, ?<0.00001). Figura 9C, peso Esplénico después del tratamiento de Indotemacina (verde) comparado con el control prueba t de dos extremos: n=10, p=0.00026). Figura 9D, número de colonia del bazo después del tratamiento con dtnPGE2 de las células KSL (prueba t de dos extremos, 100 células: n=4, p=0.0013; 300 células: n=5, p=0.009) . Figura 9E, gráficas de FACS representativas que ilustran los niveles del injerto de CD45.1 (cuadrante izquierdo superior) en recipientes de control y células BM expuestas a dmPGE2. Figuras 9F - 9J, quimerismo promedio (F, H, I) y frecuencia calculada del injerto (Figuras 9G y 9J) en recipientes de WBM tratado con dmPGE2 (circulo) contra control (cuadros) . Las Figuras 9K y 9-L, Efecto del tratamiento ex vivo de WBM con coxl (SC560, 10 µ?) y cox2 (NS398, 10 µ?) inhibidores en el ensayo CFU-S12 sobre el número de colonias (prueba t emparejada, n=10, SC560 p=0.00016, NS398 p<0.00001 y peso esplénico (prueba t emparejada, n=10, SC560 p=0.0'25, NS398 p=0.00075). Figuras 9M y 9N, Sangre periférica (día 14 de post tratamiento) y médula ósea (día 16 de post tratamiento) de los conteos de WBC después de la lesión de médula ósea de 5-FU; exposición in vivo a SC560 o NS398 significativamente inhibió la recuperación de WBC, mientras que dmPGE2 aumentó los conteos de WBC . La Figura 10 representa un diagrama de la ruta de señalización de Wnt .

Las Figuras 11A y 11B representan datos de que la modulación de actividad de wnt afecta la homeostasis adulta. La Figura 11A muestra una representación esquemática del ensayo de irradiación; la Figura 11B representa el análisis de FACS de la médula de riñon completo en el día diez de post irradiación en wt, hs:wnt8, hs:dkk y adultos hs:dnTCF. La Figura 12 muestra la cuantificación de qPCR de las alteraciones en la actividad wnt en el embrión en desarrollo causado por la señalización de prostaglandina en un ensayo de ToprdGFP in vivo. La Figura 13 presenta un modelo que representa los puntos potenciales de interacción de las rutas de PG y wnt. (1) PGE2 no puede rescatar dkk, axina, dnTCF; Indotemacina no puede bloquear wnt8. (2) PGE2 rescata dkk, pero no axina y dnTCF; indometicina puede bloquear wnt8; PGE2 rescata dkk y axina, pero no dnTCF; Indotemacina puede bloquear wnt8. (4) PGE2 rescata dkk, axina y dnTCF; Indotemacina puede bloquear wnt8. La Figura 14 muestra el por ciento de células positivas GFP en la médula de riñon de adultos ToprdGFP en el día tres después de la irradiación y tratamiento con dmPGE2 o Indotemacina . DESCRIPCIÓN DETALLADA A menos que se defina de otra manera en la presente, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente solicitud tendrán los significados que son comúnmente entendidos por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y términos plurales incluirán lo singular. Se debe entender que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos y reactivos particulares, etc., descritos en la presente y como tales pueden variar. La terminología utilizada en la presente es para propósitos de describir modalidades particulares solamente, y no se propone para limitar el alcance de la presente invención, que es definido solamente por las reivindicaciones. Diferente de los ejemplos de operación, o donde es indicado de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizadas en la presente deben ser entendidos como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente." El término "aproximadamente" cuando se utiliza en relación con porcentajes puede significar ±1%. Todas las patentes y otras publicaciones identificadas son incorporadas expresamente en la presente por referencia para propósito de descripción y divulgación, por ejemplo, de las metodologías descritas en tales publicaciones que podrían ser utilizadas en relación con la presente invención. Estas publicaciones se proponen solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada a este respecto debe ser considerado como una admisión de que los inventores no están enterados de ante fecha de tal descripción en virtud de la invención previa o por cualquier otra razón. Todas las declaraciones en cuanto a la fecha o representación para los contenidos de estos documentos está basado en la información disponible para los solicitantes y no constituye ninguna admisión en cuanto a la capacidad de corrección de las fechas o contenidos de estos documentos. La homeostasis de célula madre hematopoyética (HSC) es herméticamente controlada por factores de crecimiento, moléculas de señalización y factores de transcripción. Las HSCs definitivas derivadas durante la embriogénesis en la región de aorta-gónada-mesonefros (AGM) subsecuentemente colonizan el nicho en órganos hematopoyéticos fetales y adultos. Dzierzak, 12 Curr. Opin. Hematol. 197-202 (2004); Galloway & Zon, 53 Curr. Top. Devel. Biol. 139-58 (2003). La presente invención proporciona métodos para modular el crecimiento de HSC y la renovación in vitro, in vivo o ex vivo. El método comprende poner en contacto una población de células madre nacientes con por lo menos un modulador de HSC. Esta población puede ser contenida dentro de la sangre periférica, sangre del cordón umbilical, médula ósea, fluido amniótico, villa coriónica, placenta, u otros nichos de células madre hematopoyéticas . En una modalidad, la invención proporciona métodos para promover el crecimiento de células madre hematopoyéticas y la renovación en una población de células. En otra modalidad, la invención proporciona métodos para inhibir el crecimiento de células madre hematopoyéticas y la renovación en una población de células. La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento de PGE2 y agentes que aumentan la síntesis de PGE2 que causan un incremento en los números de HSC. A la inversa, los agentes que bloquean la síntesis de PGE2 disminuyen HSCs. A este respecto, los agentes que afectan la síntesis de PGE2 pueden ser considerados moduladores de HSC. Por ejemplo, las ciclooxigenasas (cox) responsables para la síntesis de PGE2 pueden ser requeridas para la formación de HSC. Adicionalmente, los agentes vasodilatadores promueven la expansión de HSC, a la inversa, los vaso constrictores disminuyen los números de HSC. Por ejemplo, hidralazina, un vasodilatador anti-hipertensivo, incrementó HSCs mientras que fenbufen, un vasoconstrictor de fármaco antiinflamatorio no esferoidal disminuyó HSCs. Estos agentes de esta manera también se consideran moduladores de los moduladores de HSC. Como se utiliza en la presente, los moduladores de HSC pueden ya sea promover o inhibir el crecimiento y renovación de HSC. Los moduladores de HSC influencian los números de HSC en una población de células. Los moduladores de HSC influencian la expansión de HSC en cultivos (ir¡ vitro) , durante la incubación de corto plazo (ex vivo) o in vivo. Ver la Tabla 1, enseguida, los moduladores de HSC que incrementan los números de HSC incluyen agentes que regulan hacia arriba la síntesis de PGE2. Un incremento en los números de HSC puede ser un incremento de aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 100%, aproximadamente 150%, aproximadamente 200% o más, que los números de HSC exhibidos por el sujeto previo al tratamiento. Los moduladores de HSCs que causan una disminución en los números HSC regulan hacia abajo la síntesis de PGE2 y/o promueven la vasoconstricción. Ver, por ejemplo, la Tabla 2, enseguida. Una disminución en los números de HSC puede ser una disminución de aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 100%, aproximadamente 150%, aproximadamente 200% o más, que los números de HSC exhibidos por el sujeto previo al tratamiento. Los números de HSC pueden ser evaluados por el alivio de los síntomas de la enfermedad, por ejemplo, conteo de plaquetas incrementado, hematocrito incrementado, en donde el conteo de plaquetas o hematocrito es incrementado aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 100%, aproximadamente 150%, aproximadamente 200% o más. El efecto sobre los números de HSC se pueden evaluar por el alivio de los síntomas de la enfermedad, por ejemplo, conteo de plaquetas incrementado, hematocrito incrementado, en donde el conteo de plaquetas y hematocrito es incrementado aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 100%, aproximadamente 150%, aproximadamente 200% o más. En una modalidad, PGE2 o dmPGE2 se utilizan como moduladores de HSC para incrementar la población de HSC. Los moduladores de HSC de la presente invención también incluyen derivados de moduladores de HSC. Los derivados, como se utilizan en la presente, incluyen un compuesto químicamente modificado en donde la modificación se considera de rutina por el químico experto ordinario, tales como porciones químicas adicionales (por ejemplo, un éster o una amida de un ácido, grupos protectores tal como un grupo bencílico o un alcohol o tiol, y grupo ter-butoxicarbonilo para una amina) . Los derivados también incluyen moduladores de HSC radioactivamente marcados, conjugados de moduladores de HSC (por ejemplo, biotina o avidina, con enzimas tales como peroxidasa de rábano picante y los similares, con agentes bioluminiscentes , agentes quimioluminiscentes o agentes fluorescentes). Adicionalmente , las porciones se pueden adicionar al modulador de HSC o una porción del mismo para incrementar la vida media in vivo. Los derivados, como se utiliza en la presente, también abarcan análogos, tal como un compuesto que comprende una formula químicamente modificada de un compuesto específico o clase del mismo, y que mantiene las actividades farmacéuticas y/o farmacológicas características del compuesto o clase, también están abarcados en la presente invención. Los derivados, como se utilizan en la presente, también abarcan profármacos de los moduladores de HSC, que son conocidos que aumentan las calidades deseables novedosas de las sustancias farmacéuticas (por ejemplo, solubilidad, biodisponibilidad, manufactura, etc . ) . La administración ex vivo directa de los moduladores de HSC puede habilitar la expansión in vivo significante de las células madre hematopoyéticas , tal que aun cantidades más pequeñas de células madre hematopoyéticas luego pueden ser bastantes en el transplante. Consecuentemente, por ejemplo, el transplante de células madre de sangre de cordón umbilical ahora se puede aplicar a no solamente niños sino también a adultos. Tales células madre pueden ser recolectadas de fuentes que incluyen, por ejemplo, sangre periférica, sangre de cordón umbilical, médula ósea, fluido amniótico o sangre de placenta. Alternativamente, la muestra de sangre fuente que contiene HSC se puede recolectar y luego almacenar inmediatamente en la presencia de un modulador de HSC, tal como PGE2, e inicialmente incubado (antes de la diferenciación) en la presencia del modulador de HSC antes de la introducción en un suj eto . Adicionalmente , uno o más moduladores de HSC se pueden utilizar in vivo para incrementar el número de células madre en la médula ósea u otras fuentes (tal como la sangre de cordón umbilical) . Al incrementar el número de células madre, la recolección total de células madre de un sujeto se pueden ' mej orar significativamente. Además, al incrementar el número de células madre recolectadas del sujeto, el número de células madre disponibles del transplante nuevamente al sujeto u otro sujeto también se pueden mejorar significativamente, para de esta manera potencializar la reducción del tiempo para el injerto, y consecuentemente conducir una' disminución en el tiempo durante el cual el sujeto tiene neutrófilos y plaquetas insuficientes, previniendo de esta manera infecciones, sangrado y otras complicaciones. Además, .la presente invención puede reducir la proporción de sujetos quienes de otra manera son incapaces de movilizar bastantes células para la recolección de células madre para proceder con el tratamiento para su enfermedad primaria, por ejemplo, quimioterapia y otros tratamientos ablativos de médula ósea. Asi, la proporción del número de sujetos con injerto primario retardado también se puede reducir. Además, la presente invención puede promover la recuperación subsecuente a los tratamientos ablativos de médula ósea al incrementar los números de HSC. Los moduladores de HSCs, tales como aquellos en la Tabla 1 y divulgados en la presente, se pueden utilizar in vivo para incrementar la producción de HSC y ex vivo para incrementar el número de HSC. Esto se realiza al administrar uno o más de los compuestos de un sujeto o a las células madre . Los moduladores de HSCs también se pueden utilizar para proporcionar HSCs autólogos 'a un sujeto. Típicamente, esto involucra las etapas de administrar moduladores de HSC a un sujeto en necesidad del mismo para aumentar la expansión de la población de células madre dentro de la médula ósea y/o para inmovilizar las células madre en circulación periférica; recolectar una o más de las células madre de médula ósea o una o más de las células madre en la circulación periférica; y transplantar la una o más células madre recolectadas nuevamente al sujeto. Además, las células madre obtenidas de la recolección de acuerdo con el método de la presente invención descrito en lo anterior pueden ser criopreservadas utilizando técnicas conocidas en el arte para la criopreservación de células madre. Por consiguiente, la utilización de criopreservación, las células madre pueden ser mantenidas tal que una vez que se determina que un sujeto está necesidad de un transplante de células madre, las células madre pueden ser descongeladas y transplantadas nuevamente al sujeto. Como es mencionado previamente, el uso o más moduladores de HSC, por ejemplo PGE2, durante las técnicas de criopreservación puede aumentar la población de HSC. Más específicamente, otra modalidad de la presente invención, proporciona el aumento de HSCs recolectadas de la sangre de cordón umbilical o una fuente de células madre neonatal o fetal equivalente, que puede ser criopreservada , para los usos terapéuticos de tales células madre en la descongelación. Tal sangre puede ser recolectada por varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, debido a que la sangre de cordón umbilical es una fuente rica de HSCs (ver Nakahata & Ogawa, 70 J. Clin. Invest. 1324-28 (1982); Prindull y colaboradores, 67 Acta. Paediatr. Scand. 413-16 (1978) ; Tchemia y colaboradores, 97(3) J. Lab. CHn. Med. 322-31 (1981) ), una fuente excelente para la sangre neonatal es el cordón umbilical y la placenta. La sangre neonatal puede ser obtenida mediante el drenaje directo del cordón umbilical y/o mediante la aspiración con aguja de la placenta suministrada en la raíz y en venas distendidas. Ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas No. 7,160,714; No. 5,114,672; No. 5,004,681; solicitud de patente norteamericana No. 10/076180, publicación No. 20030032179. En realidad, las células madre de sangre de cordón umbilical se han utilizado para reconstituir la hematopoyesis en niños con enfermedades malignas y no malignas después del tratamiento con dosis mieloablat ivas de quimio-radioterapia . Sirchia & Rebulla, 84 Haematologica 738-47 (1999) . Ver también, Laughlin 27 Bone Maixow Transplant. 1-6 (2001); la patente norteamericana No. 6,852,534. Adicionalmente , se ha reportado que las células madre progenitoras en la sangre del cordón umbilical aparecen para tener una capacidad proliferativa más grande en el cultivo que aquellas en la médula ósea de adulto. Salahuddin y colaboradores, 58 Blood 931-38 (1981) ; Cappellini y colaboradores, 57 Brit . J. Haematol. 61-70 (1984) . Alternativamente, la sangre fetal puede ser tomada de la circulación fetal en la raíz de la placenta con el uso de una aguja guiada por ultrasonido (Daffos y colaboradores, 153 Am. J. Obstet. Gynecol . 655-60 (1985); Daffos y colaboradores, 146 Am. J. Obstet. Gynecol. 985-87 (1983), por placentocentesis (Valenti, 115 Am. J. Obstet. Gynecol. 851-53 (1973); Cao y colaboradores, 19 J. Med. Genet . 81-87 (1982)), por fetoscopia (Rodeck, in PRENATAL DIAGNOSIS, (Rodeck & Nicolaides, eds . , Royal College of Obstetricians & Gynaecologists, London, 1984)). En realidad, la villa coriónica y el fluido amniótico, además de la sangre de cordón umbilical y placenta, son fuentes de células madre fetales pluripotentes (ver WO 2003 042405) que pueden ser tratadas mediante los moduladores de HSC de la presente invención . Varios equipos y dispositivos de recolección son conocidos para la recolección, procesamiento y almacenamiento de sangre de cordón umbilical. Ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas No. 7,147,626; No. 7,131,958. Las recolecciones deben ser hechas bajo condiciones estériles, y la sangre se puede tratar con un anticoagulante. Tales anticoagulantes incluyen citrato-fosfato-dextrosa , ácido citrato-dextrosa , solución de Alsever (Alsever & Ainslie, 41 N. Y. St. J. Med. 126-35 (1941), Solución de DeGowin (DeGowin y colaboradores, 114 J.A.M.A. 850-55 (1940)), Edglugato-Mg (Smith y colaboradores, 38 J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 573- 85 (1959)), Solución de Rous-Turner (Rous & Turner 23 J. Exp. Med. 219-37 (1916) ) , otras mezclas de glucosa, heparina o biscoumacetato de etilo. Ver Hum Storage of Blood 26-160 (Acad. Press, NY, 1968) . Varios procedimientos son conocidos en la técnica y se pueden utilizar para enriquecer la sangre de cordón umbilical recolectada para HSCs . Estos incluyen pero no están limitados a la centrifugación de densidad de equilibrio, sedimentación de velocidad en gravedad unitaria, roseta inmune y adherencia inmune, elutriación centrifuga de contraflujo, agotamiento de linfocito T, clasificación de célula activada por fluorescencia, sola o en combinación. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,004,681. Típicamente, la sangre recolectada se prepara mediante almacenamiento criogénico mediante la adición de agentes crioprotectores tal como DMSO (Lovelock & Bishop, 183 Nature 1394-95 (1959); Ashwood-Smith 190 Nature 1204-05 (1961)), glicerol, polivinilpirrolidina (Rinfret 85 Ann. N. Y. Acad. Sci. 576-94 (1960)), polietilenglicol (Sloviter & Ravdin 196 Nature 899-900 (1962)), albúmina, dextrano, sacarosa, etilenglicol , i-eritritol, D-ribitol, D-manitol (Rowe, 3(1) Cryobiology 12-18 (1966)), D-sorbitol, i-inositol, D-lactosa, cloruro de colina (Bender y colaboradores, 15 J. Appl . Physiol. 520-24 (1960)), aminoácidos (Phan & Bender, 20 Exp. Cell Res. 651-54 (1960)), metanol, acetamida, monoacetato de glicerol (Lovelock, 56 Biochem. J. 265-70 (1954)), y sales inorgánicas (Phan & Bender, 104 Proc. Soc. Exp. Biol . Med. (1960)). La adición de plasma (por ejemplo, a una concentración de 20-25%) puede aumentar el efecto protector de DMSO. La sangre recolectada debe ser enfriada a una proporción controlada para el almacenamiento criogénico. Diferentes agentes crioprotectores y diferentes tipos de células tienen diferentes proporciones de enfriamiento óptimas. Ver, por ejemplo, Rapatz, 5(1) Cryobiology 18-25 (1968), Rowe & Rinfret, 20 Blood 636-37 (1962); Rowe, 3(1) Cryobiology 12-18 (1966); Lewis y colaboradores, 7(1) Transfusión 17-32 (1967); Mazur 168 Science 939-49 (1970). Las consideraciones y los procedimientos para la manipulación, criopreservación y almacenamiento a largo plazo en las fuentes de HSC son conocidas en la técnica. Ver por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 4,199,022; No.3, 753, 357; No. 4,559,298; No. 5,004,681. También existen varios dispositivos con protocolos asociados para el almacenamiento de sangre. Patentes norteamericanas No. 6,226,997; No. 7,179, 643. Las consideraciones en la descongelación y la reconstitución de fuentes de HSC también son conocidas en la técnica. Las patentes norteamericanas No. 7,179,643; No. 5,004,681. La sangre de fuente de HSC también puede ser tratada para prevenir la formación de grumos (ver Spitzer, 45 Cáncer 3075-85 (1980); Stiff y colaboradores, 20 Cryobiology 17-24 (1983), y para remover agentes crioprotectores tóxicos (patente norteamericana No. 5,004,681). Además, existen varios procedimientos para determinar una dosis de célula de injerto de unidades de transplante de HSC. Ver la patente norteamericana No. 6,852,534; Kuchler Biochem. METHODS IN CELL CULTURE & VIROLOGY 18-19 (Dowden, Hutchinson & Ross, Strodsburg, PA, 1964); 10 Methods in Medical Research 39-47 (Eisen, y colaboradores, eds . , Year Book Med. Pub., Inc., Chicago, IL, 1964) . Asi, no siendo limitado por algún protocolo de recolección, tratamiento o almacenamiento particular, una modalidad de la presente invención proporciona la adición de un modulador de HSC, tal como PGE2 o dmPGE2 a la sangre neonatal. Esto se puede hacer en el tiempo de recolección, o en el tiempo de preparación para almacenamiento, o en la descongelación y antes de la infusión. Por ejemplo, las células madre aisladas de un sujeto, por ejemplo, con o sin tratamiento previo del sujeto con los moduladores de HSC, se puede incubar en la presencia de los moduladores de HSC, por ejemplo, moduladores de HSC tal como PGE2 o aquellos listados en la Tabla 1, con el fin de expandir el número de HSCs. Las HSCs expandidas pueden ser subsecuentemente reintroducidas en el sujeto del cual se obtuvieron o se pueden introducir en otro sujeto. Los moduladores de HSC, incluyendo PGE2 y los compuestos expuestos en la Tabla 1 y divulgados en la presente, de esta manera se pueden utilizar para, ínter alia: reducir el tiempo para el injerto después de la reinfusión de las células madre en un sujeto; reducir la incidencia del injerto primario retardado; reducir la incidencia de la falla secundaria de la producción de plaquetas; y reducir el tiempo de recuperación de plaquetas y/o neutrófilos después de la reinfusión de las células madre en un sujeto. Estos métodos típicamente incluyen las etapas de administrar un modulador de HSC a un sujeto en necesidad del mismo para aumentar la expansión de la población de células madre dentro de la célula ósea y/o movilizar las células madre en la circulación periférica y recolectar uno o más de las células madre de médula ósea o las células madre en la circulación periférica y luego transplantar las células madre recolectadas al sujeto en un tiempo apropiado, como es determinado por las necesidades particulares del sujeto. Los moduladores de HSC, por ejemplo, moduladores de HSC que pueden causar un incremento de los números de HSC, pueden proporcionar una terapia de una sola dosis conveniente para mejorar la eficiencia del transplante de células madre, para permitir el tratamiento más agresivo de tumores sólidos, mieloma y linfoma y para incrementar le número de candidatos para el transplante de células madre. El método de la invención también se puede utilizar para incrementar el número de células madre de un sujeto donador (incluyendo células de médula ósea o células de sangre de cordón umbilical) cuyas células luego son utilizadas para el rescate de un sujeto recipiente quien ha recibido quimioterapia de ablación de médula ósea o terapia de irradiación. Como se utiliza en la presente, un sujeto incluye cualquiera quien es un candidato para el transplante de células madre autólogas o médula ósea durante el curso de tratamiento para enfermedad maligna o como un componente de la terapia génica. Otros candidatos posibles son sujetos quienes donan células madre o médula ósea a sujetos para el transplante alogeneico para la enfermedad maligna o de la terapia génica. Los sujetos pueden tener terapia de radiación implícita, por ejemplo, como un tratamiento para la malignidad del tipo de célula diferente a la hematopoyé'tica . Los sujetos pueden estar sufriendo de anemia, por ejemplo, anemia de célula palciforme, talecemia, anemia aplásica u otra deficiencia de derivados de HSC. El método de la invención así proporciona los siguientes beneficios: (1) permite que el transplante proceda en pacientes quienes de otra manera no sería considerados como candidatos debido al riesgo inaceptablemente alto del injerto fallido; (2) recude el número de aféresis requerido para generar una recolección inaceptable mínima; (3) reduce la incidencia de la falla primaria y secundaria del injerto al incrementar el número de HSC disponibles para el transplante; y (4) reduce el tiempo requerido para el injerto primario al incrementar el número de precursores comprometidos de los linajes hemopoyéticos importantes. Los moduladores de HSC de la invención pueden tener los beneficios clínicos en el transplante de células madre de la mejora de rendimientos a aféresis y mejora del potencial de injerto de células aferesadas. Los moduladores de HSC de la invención, por ejemplo, moduladores de HSC que causan una disminución de los números de HSC, también pueden ser de uso en el tratamiento de sujetos que sufren de desórdenes hiperproliferativos del sistema hematopoyético . Los desórdenes hiperproliferativos pueden incluir, pero no están limitados a, policitemia vera, trombocitemia esencial, mielofibrosis con metaplasia mieloide, y leucemia mielógena crónica. Los compuestos o agentes de la presente invención pueden ser contenidos en formulaciones farmacéuticamente aceptables. Tal formulación farmacéuticamente aceptable puede incluir un portador (es) y/o excipiente ( s ) farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungales , agentes isotónicos y retardantes de absorción, y los similares que son fisiológicamente compatibles. Por ejemplo, el portador puede ser adecuado para la inyección en- el fluido cerebroespinal. Los excipientes incluyen estabilizadores farmacéuticamente aceptables. La presente invención pertenece a cualquiera de las formulaciones farmacéuticamente aceptables, incluyendo polímeros sintéticos o naturales en la forma de complejos macromoleculares , nanocápsulas , microesferas o cuentas y formulaciones basadas en lípido que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mezcladas, vesículas de membrana sintética y eritrocitos resellados. Cuando los agentes o compuestos se suministran a un paciente, ellos se pueden administrar mediante cualquier ruta adecuada, incluyendo, por ejemplo, oralmente, (por ejemplo, en cápsulas, suspensiones o tabletas) o mediante administración parenteral. La administración parenteral puede incluir, por ejemplo, administración intramuscular, intravenosa, intraarticular , intraarterial , intratecal, subcutánea o intraperitoneal . El agente también e puede administrar oralmente, transdérmicamente, tópicamente, mediante inhalación (por ejemplo, intrabronquial , intranasal, inhalación oral o gotas intranasales ) o rectalmente. La administración puede ser local o sistémica como se ha indicado. Los agentes también se pueden suministrar utilizando vectores virales, que son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. La administración tanto local como sistémica son contempladas por la invención. Las características deseables de la administración local incluyen lograr concentraciones locales efectivas del compuesto activo así como evitar efectos secundarios adversos de la administración sistémica del compuesto activo. En una modalidad preferida, el antagonista se administra localmente. Las técnicas de suministro localizadas son descritas en, por ejemplo, 51 J. Biomed. Mat . Res. 96-106 (2000); 100(2) J. Control Reléase 211-19 (2004); 103(3). J. Control Reléase 541-63 (2005); 15(3) Vet. Clin. North Am. Equine Pract. 603-22 (1999); 1(1) Semin. Interv. Cardiol. 17-23 (1996). Las formulaciones farmacéuticamente aceptables pueden ser suspendidas en vehículos acuosos e introducidas a través de agujas hipodérmicas convencionales o utilizando bombas de infusión. La cantidad de agente administrado del individuo dependerá de las características del individuo, tal como la salud general, edad, sexo, peso del cuerpo y tolerancia a fármacos así como el grado, severidad y tipo de rechazo. La persona experta será capaz de determinar las dosificaciones apropiadas dependiendo de estos y otros factores.

Los moduladores de HSC dentro del alcance de la presente invención pueden ser identificados de una variedad de maneras, tal como el sistema genético del pez cebra. El pez cebra es un excelente sistema genético para el estudio del desarrollo y enfermedades de vertebrados Ver por ejemplo, Hsia & Zon, 33(9) Exp. Hematol . 1007-14 (2005); de Jong & Zon; 39 Ann. Rev. Genet . 481-501 (2Q05) ; Paffett- Lugassy & Zon, 105 Meth. Mol. Med. 171-98 (2005) ; Haffiier & Nusslein-Volhard, 40 Int'l J. Devel. Biol. 221-27 (1996) . El embrión que se desarrolla externamente es transparente y los órganos fácilmente pueden ser visualizados. El pez cebra y los mamíferos comparten muchos de los mismos programas génicos en el desarrollo. Cuando el pez cebra se aparea, da origen a números grandes (100-200 semanalmente ) de embriones transparentes. Muchos embriones pueden ser colocados en un espacio relativamente pequeño, y hay un tiempo de generación corto (aproximadamente 3 meses) . Clasificaciones a gran eScala han generado más de 2000 mutantes genéticos con defectos específicos que afectan virtualmente cada aspecto de la embriogénesis . Driever y colaboradores, 123 Devel. 37-46 (1996); Eisen, 87 Cell 969-77 (1996) . Muchos de los mutantes sanguíneos han sido útiles en describir eventos claves en hematopoyesis. Dooley & Zon, 10 Curr. Op . Genet. Devel. 252-56 (2000) . El pez cebra se ha utilizado para realizar clasificaciones de molécula pequeña basada en organismo completo debido a que números grandes de los embriones pueden ser arreglados en placas de microtítulo que contienen compuestos de una librería química. Por ejemplo, Peterson y colegas probaron 1,100 compuestos para efectos de desarrollo. Peterson y colaboradores, 97 P.N.A.S. USA 12965-69 (2000). A partir de esta clasificación, aproximadamente 2% de los compuestos fueron letales y 1% causó un fenotipo específico. Por ejemplo, un compuesto suprimió la información de estructuras de oído interno llamadas otolitos, pero no causó otros defectos. También es posible clasificar supresores químicos de fenotipos mutantes. Peterson y colaboradores, 22 Nat. Biotech. 595-99 (2004); Stern y colaboradores, 1 Nat. Chem. Biol. 366-70 (2005). En una clasificación de tal clase, las sustancias químicas se encontraron que rescatan el mutante de cierre de rejilla, un modelo de coartación congénito de la aorta. Peterson y colaboradores, 2004. El mecanismo de este rescate involucró la inducción de VEGF que corrió el defecto de angiogénesis . Estos datos demuestran que compuestos altamente potentes y específicos pueden ser identificados utilizando pez cebra. Además, considerando el pez cebra, un mapa genético de alta densidad se ha construido de modo que incluye marcadores de microsatélite , genes y etiquetas de secuencia expresadas (ESTs). Knapuk y colaboradores, 18 Nat. Genet . 338-43 (1998); Shimoda y colaboradores, 58 Genomic 219-32 (1999); Kelly y colaboradores, 10 Genome Res. 558-67 (2000); Woods y colaboradores, 20 Genome Res. 1903-14 (2000). Un proyecto de cDNA de longitud completa también se ha llevado a cabo como una extensión al proyecto de EST de pez cebra. Un mapa RH denso se ha construido e integrado con los datos para el proyecto de secuenciación de genoma en el Sanger Center. Un recurso de lá red importante soportado por la NIH es la red de información del pez cebra (ZFIN), un punto focal para la comunidad. Un centro de extractos y laboratorio de soporte llamado el Zebrafish International Resource Center (ZIRC) también grandemente ayuda en el campo. El Sanger Center es la secuenciación del genoma del pez cebra que pudo ser completado en el 2007. El inicio de la hematopoyesis definitiva se ha estudiado en un número de especies vertebradas. En el trabajo seminal en la especie de aves, las quimeras de pollo-codorniz demostraron que las células madre hematopoyéticas definitivas no surgen en el saco vitelino, sino que surgen dentro del propio embrión. Dieterien-Lievre 33 J. Embryol . Exp. Morphol . 607-19 (1975). Estudios similares en el embrión de Xenopus utilizando quimeras diploides/triploides elusidaron que la isla de sangre ventral (el equivalente de saco vitelino) diseñó una función menor en la hematopoyesis adulta comparada con la placa lateral dorsal. Kau & Turpén 131 J. Immunol . 2262-66 (1983). Basado en el descubrimiento de que el mesodermo de placa dorsolateral contuvo células hematopoyéticas putativas que dieron origen a la hematopoyesis definitiva, varios grupos además investigaron la región de aorta gónada mesonefros (AGM) en desarrollo. Medvinsky y colaboradores, 364 Nature 64-67 (1993); Godin y colaboradores, 364 Nature 67-70 (1993) . Dentro de esta región, existen agrupaciones de células en la pared ventral de la aorta que se reconocieron originalmente en el cerdo. Sabin, 9 Contrib. to Embryol. 213-62 (1920). Otros han sugerido que estas agrupaciones representan células madre hematopoyéticas tempranas que son derivadas de células endoteliales "hemogénicas" . El proceso de hematopoyesis de AGM es evolutivamente conservado en el vertebrado. Galloway & Zon, 53 Curr. Topics Dev. Biol. 139-58 (2003) . En el ratón, el inicio de células madre ocurre en 8.5 días a 9 días, precisamente como la circulación está comenzando. Las células madre hematopoyéticas de la región AGM en el día 7 pueden ser transplantadas , sin embargo, las células en el dia 10 no conducirán al injerto a largo plazo. Estudios adicionales han puesto en claro que la aorta es polarizada y los factores de las regiones ventrales y dorsales modificarán el comportamiento de las células. Por ejemplo, la región dorsal de la aorta es derivada del mesodermo somítico. Éste está bajo la influencia de TGFa, BMP y la señalización sónica de erizo. Parnanud & Dieterien-Lievre, 126 Devel ..617-27 (1999). Los estudios de marcación celular han demostrado que la HSC putativa en el AGM tiene el potencial para invadir la mesenquima subaórtica y también una variedad de tejidos. Jaffredo y colaboradores, 125 Devel. 4575-83 (1998); Jaffredo y colaboradores, 224 Devel. Biol. 204-14 (2000). Estos estudios de marcación celular utilizaron tinta india o células infectadas por retrovirus etiquetados con LacZ infusionados en la vasculatura. Estos experimentos de mapeo destinados mostraron' marcación de células hematopoyéticas dentro de los tejidos. Estos estudios ponen en claro el inicio de las células madre hematopoyéticas dentro de la aorta en el embrión vertebrado. Varios genes se han encontrado que son requeridos para la hematopoyesis de AGM. El gen, runxl (previamente oncoproteina AML1), se expresa en la pared aórtica en la región ventral donde las células hematopoyéticas son encontradas; esa función del gen es requerida para la hematopoyesis de AGM. Cal y colaboradores, 13 Immunity 423-31 (2000) . El ratón mutante runxl carece de una AGM y tiene hematopoyesis defectuosa. El defecto en el mutante runxl se puede rescatar por un transgen runxl inducido por el promotor Tie2, demostrando que la expresión endotelial e inducida hematopoyética de runxl es suficiente regular la hematopoyesis de AGM. Miller y colaboradores, 32 Nature Genet . 645-49 (2002) ·. En una inactivación de runxl, existen células mesenquimales subaórticas que son marcadas con LacZ, y esta observación se ha interpretado que significa que alguna de las células subaórticas puede dar origen a células madre hemtopoyéticas . North y colaboradores, 126 Devel. 2563-75 (1999) . Estudios recientes han demostrado que las células endoteliales subaórticas empujan a través de la capa endotelial y forman agrupaciones hematopoyéticas . Bertrand y colaboradores, 102 P.N.A.S. USA 134-39 (2005); Tavian & Peault, 33 Exp. Hemat. 1062-69 (2005); Tavian & Peault, 49 Int'l J. Devel. Biol. 243-50 (2005); Tavian y colaboradores, 1044 Ann. NY Acad. Sci.41-50 (2005). Asi, se puede disputar si las células endoteliales hemogénicas con las células mesodérmicas subaórticas son los precursores verdaderos de las HSCs. Una vez que las células, madre hematopoyéticas brotan fuera de la pared endotelial, ellas son CD45+ y expresan los factores de transcripción runxl y c-myb. Las células AGM también están bajo el control mediante la señalización de muesca. Las células madre hematopoyéticas AGM de ratón bloqueado notchl y la expresión runxl y c-myb están ausentes en la región de la aorta. Kumano y colaboradores, 18 Immunity 699-711 (2003) ; Robert-Moreno y colaboradores, 132 Devel. 1117-26 (2005). Además, el factor de transcripción coupTF también carece de células hematopoyéticas AGM, aunque no se ha estudiado tan completamente. You y colaboradores, 435 Nature 98-104 (2005). Aunque runxl, cymb, notch, y coup aparecen para ser importantes para la hematopoyesis de AGM, la interacción, relación temporal y espacial de esos factores y la función de otros factores potencialmente desconocidos no se conoce. Un mejor entendimiento del programa genético del inicio de la hematopoyesis es claramente necesario. Una clasificación genética química se condujo para identificar rutas novedosas que modulan la formación de HSC definitiva durante la embriogénesis del pez cebra. La Figura 1. Los genes tales como runxl y cmyb, requeridos para el desarrollo de HSC durante la hematopoyesis mamífera, son expresados en la' pared ventral de la aorta dorsal en una región análoga a la AGM mamífera entre treinta y seis horas de post-fertilización (hpf) . North y colaboradores, 16 Immunity 661-72 (2002); Mukouyama y colaboradores, 9 Curr. Biol. 833-86 (1999); Kalev-Zylins ka y colaboradores, 129 Devel. 2015-30 (2002); Burns y colaboradores, 30 Exp. Hematol . 1381-89 (2002). "Los embriones de tipo silvestre se incubaron con compuestos individuales de la etapa de tres somitos y treinta y seis hpf. Las sondas para runxl y cmyb se combinaron y se utilizaron para detectar HSCs mediane la hibridación in situ. La mayoría de sustancias químicas, 2275 de 2357 (91.7%), no lograron alterar la expresión de runxl/cmyb, mientras que 35 (1.4%) y 47 (1.9%) condujeron a HSCs de AGM incrementada o disminuida, respectivamente. De las ochenta y dos sustancias que cambiaron la expresión de runxl/cmyb, diez afectan la ruta de prostaglandina (PG). Las PGs se forman del ácido araquidónico mediante coxl, cox2 e isomerasas especificas de tejido. Por lo menos cinco compuestos de ruta de PG incrementaron la expresión del gen HSC (Tabla 1) y cinco disminuyeron la expresión del gen HSC (Tabla 2) . En treinta y seis hpf, runxl/cmyb+ HSCs comprenden una linea de células endoteliales aplanadas y agrupaciones hematopoyéticas en la aorta. El ácido Linoleico (10 µ?) , un precursor de PG, incrementó runxl/cmyb+ HSCs (22 alteradas/30 registradas) mientras que celecoxib (20 µ?) , un inhibidor selectivo se cox2, disminuyó HSCs (26/31). El marcador vascular flkl permaneció relativamente sin cambio. La prostaglandina E2 es el prostanoide efector principal producido en el pez cebra (Grosser y colaboradores, 99 P.N.A.S. USA 8418-23 (2002)), y es regulado por tanto coxl y cox2. Los embriones de pez cebra se expusieron a inhibidores de síntesis de prostaglandina, así como prostanoides exógenos . El tratamiento con PGE2 (25/49) dio por resultado la expresión más fuerte de runxl/cmyb que PGI2 (28/47) a 20 µ?, mientras que la inhibición selectiva de isoforma de la actividad cox con SC560 (coxl, 10 µ?, 30/36) y NS398 (cox2, 20 µ?, 35/44) así como inhibidores de no específicos condujeron a HSCs disminuidas. Estos descubrimientos argumentan persuasivamente una función específica de PGs en la formación de HSCs de AGM. Tabla 1. Moduladores de HSC de ejemplo que incrementan HSCs Los compuestos de la ruta de PG identificados como que modulan runxl/cmyo HSCs se listan en la columna uno. La columna dos denota la frecuencia en la cual se identificó un compuesto particular. La tercera columna del compuesto sobre la expresión del gen HSC (# embriones alterados/! embriones registrados ) . Tabla 2. Moduladores de HSC de ejemplos que disminuyen HSCs Compuesto # de veces Efecto sobre la expresión identificado de HSC (# de embriones alterados/! de embriones registrados ) Celecoxib 2 Disminución (26/31) Fenbufen 1 Disminución (20/26) Prostaglandina J2 1 Disminución (12/22) Suxibuzona 1 Disminución (16/30) Sulindac 1 Disminución (18/31) Los compuestos de ruta de PG identificados como que modulan runxl/cmyb+ HSCs se listan en la columna uno. La columna dos denota la frecuencia en la cual se identificó un compuesto particular. La tercera columna muestra el efecto del compuesto sobre la expresión del gen HSC (# embriones alterados/# embriones registrados). Los modificadores de ruta de prostaglandina de HSC adicionales se identificaron utilizando las técnicas de clasificación de pez cebra descritos en la presente tales como aquellos mostrados en la Tabla 3. Tabla 3. Modificadores de la ruta de prostaglandina ejemplo Inhibidores de HSC Aumentadores de HSC Indometacina dmPEG2 SC560 PEG2 NS398 PEG12 Aspirina Ácido Eicosatrienoico Ibuprofen ONO-259 Naproxeno Cayl0397 Ácido Aristoloquico AH6809 (EPl/2 antag) AH23848 (EP4 antag) expresión de coxl en la vasculatura fue descrita previamente, la inactivación de la actividad de coxl inhibió el desarrollo del limite endotelial entre la aorta y la vena. Cha y colaboradores, 282 Devel. Biol. 274-83 (2005). Conforme las HSCs surgen de una población de células endoteliales hemogénicas, la pérdida de la función coxl impactaria al desarrollo de HSC. Mediante la hibridación in situ, cox2 se expresó difusamente en la región de extremo que abarca la AGM en treinta y seis hpf. Las poblaciones de células de sangre aisladas de FACS y endoteliales, tanto coxl y cox2 se encontraron que son reguladas hacia arriba durante el intercambio de la hematopoyesis primitiva a definitiva. Altos niveles de expresión de coxl se detectaron en ambas células endoteliales Imo2+ y en HSCs CD41+, mientras que cox2 fue solamente regulada hacia arriba en la fracción de HSC (Figura 2, Panel A) . Estos resultados sugieren que coxl y cox2 participan en la inducción de HSCs de AGM a través de la regulación del nicho de células madre, asi como en la HSC misma . El Ácido Linoélico y el Ácido de Aguamiel pueden actuar como sustratos para la producción de prostaglandina y se aislaron en la clasificación como agentes que regulan hacia arriba la formación de HSC. Para determinar qué prostaglandina estuvo mediando el incremento en HSC en el AGM, el pez cebra se expuso a prostaglandinas purificadas exógenas de tres sómitos a 36 hpf y se mancharon como es descrito previamente. En el pez cebra, la-s prostaglandinas fisiológicamente activas mayores son PGE2, PGI2 y PGF2. Pini y colaboradores, 25 Arterioscler . Thromb. Vase. Biol. 315-20 (2005); Grosser y colaboradores, 2002. Cada una de estas pruebas se probaron para su efecto sobre HSCs de AGM. Tanto PGE2 y PGI2, se encontraron que incrementan moderadamente los números de células Runxl+Cmyb+en el AGM, mientras que PEF2 no tuvo efecto. Debido a la regulación hermética de la producción de prostaglandina y la destrucción in vivo, también se examinó una versión lentamente metabolizada de PGE2. Un derivado de acción larga, 16, 16-dimetil-PGE2 (dmPGE2, 10 µ?) causó un incremento en runxl/cmyb+HSCs AGM en 78% de embriones examinados (97/124). HSCs de AGM se inhibieron mediante tratamiento de Indometacina (10 µ?) en 90% de embriones analizados (92/102) . PGE2 fue el PG más abundante medido mediante la espectrometría de masas en 36 embriones hpf (18+/-6pg/50 embriones; n=4), y el tratamiento de Indometacina disminuyó la formación de PGE2 por debajo de niveles detectables (<2pg/50 embriones; n=3) 7. El tratamiento con dmPGE2 tuvo efectos mínimos sobre la vasculatura mediante el manchado de flkl; la Indometacina ligeramente alteró los niveles intersomiticos en 30% de embriones examinados (15/49). cmyb transgénico: Pez cebra GFP con HSCs fluorescentes verdes y células progenitoras mieloides se cruzaron con el pez rojo lmo2:ds que tuvo células endoteliales fluorescentes rojas y HSCs para visualizar los efectos de la exposición química in vivo. En 36 hpf, los embriones vivos se formaron en imagen mediante microscopía confocal que exhibió números significativamente disminuidos de HSCs a lo largo del piso de la aorta después del tratamiento en Indometacina y significativamente incrementó las HSCs después de la exposición a dmPGE2. Figura 3. Esto indica que PG afecta el número total de HSCs formadas a lo largo de la pared dorsal de la aorta; y la inducción de HSCs que en localizaciones aberrantes no es evidente. Mediante la expresión de qPCR runxl fue 3. veces aumentada después de la adición dmPGE2, mientras que la Indometacina causó una reducción de 50% significante en la expresión runxl; alteraciones significantes en la expresión de cmyb también se observaron (Figura 2, Panel B) . Para confirmar el requerimiento de la actividad de PGE2, morfolino oligonucleótidos (MO) de baja dosis (40 µ?) se utilizaron para inactivar la expresión de coxl y cox2; la inhibición de baja dosis de la actividad de coxl permitió a los embriones proceder a través de la gastrulación, mientras que se imitan los defectos de desarrollo dependientes de cox.

Grosser y colaboradores, (2002). MO inhibition of cox decreased AGM HSCs (coxl 54/74; cox2 60/71). El análisis de espectroscopia de masas demostró que PEG2 fue de niveles detectables bajos en estos embriones, consistentes con la supresión media por MO de la síntesis de prostaglandina endógena (n=4). Los efectos sobre HSCs se revirtieron mediante la incubación de los embriones indicados con MO con 10 µ? dmPGE2 (coxl/dmPGE2 29/52 rescatado; cox2/dmPGE2 43/60) . La inactivación de MO de la sintasa de PGE2 causó una reducción de las HSCs (35/50), que se rescató mediante la adición de dmPGE2 (25/45), indicando que la señalización a través de PGE2 fue suficiente para modular la formación de HSC. Las señales de PGE2 a través de varios receptores, EP 1-4, todos los cuales están presentes en el genoma del pez cebra. Cha y colaboradores, 20 Genet . Devel . 77-86 (2002). La inactivación de MO de los receptores EP2 ¦ y EP4 dio por resultado la expresión disminuida de runxl/cmyb (EP2 39/63; EP444/67) que no se revirtió por la exposición al dmPGE2 exógeno. El análisis mediante qPCR demostró que EP2 y EP4 estuvieron presentes en ambos de CD41+HSC y células no madre CD41 FACS clasificadas de poblaciones de células en 36 hpf. Estos experimentos confirmar que la señalización mediada por PGE2 regula al formación de HSCs en la región de AGM. Para explorar adicionalmente las interacciones entre las prostaglandinas y la producción de HSC, numerosos derivados de prostaglandina se clasificaron utilizando la técnica de embrión de pez cebra descrita en la presente. En general, los ensayos indicaron que derivados que aumentaron la estabilidad de PGE2 incrementaron los HSCs . Estos para los cuales no se observó aumento con relación a los controles tendieron a ser compuestos que enlazan preferencialmente a los receptores que no fueron actives en HSCs. Los efectos de estos compuestos sobre los números HSC se indican en la Tabla 4 : Tabla 4. Derivados de prostaglandina que afectan la producción de HSC ft PEG2 ím 16, 16-dimetil PEG2 20-hidroxi PEG2 19 (R) -hidroxi PEG2 16, 16-dimetil PEG2 (p- (p-acetamidobenzamido) éster fenilico ll-deoxi-16, 16-dimetil PEG2 ím 9-deoxi-9-metilen-16, 16-dimetil PEG2 ím 9-deoxi-9-metilen PEG2 9-ceto Flupostrenol Butaprost íí Sulprostona 5-trans PEG2 17-fenil trinor PEG2 1? PEG2 serinol amida fifí PEG2 éster metílico m 16-fenil tetranor PEG2 n 15 (S) -15-metil PEG2 ttft 15 (R) -15-metil PEG2 8-iso-15-ceto PEG2 8 iso PEG2 éster isopropílico í indica la potencia relativa para incrementar la producción de HSC. Ninguna flecha indica aumento insignificante de HSC con relación al control. Para examinar la función de PGE2 en la homeostasis de HSC en el pez cebra adulto, se realizó un ensayo de recuperación por irradiación de médula de riñon (KM) . Burns y colaboradores, 19 Genes & Devel. 2331-42 (2005). El pez de tipo silvestre fue subletalmente irradiado, expuesto a dmPGE2, y evaluado para la cinética de la recuperación de KM mediante FACS 11 (Figura 4A) . La proporción de reconstitución hematopoyética de la KM fue significativamente aumentada en el pez expuesto a 50 µ? de dmPGE2 comparado con controles expuestos en DMSO (Figura 4A, B) . La elevación en el porcentaje de progenitores precedió la recuperación de las poblaciones mieloides y linfoides, respectivamente. Los niveles de expresión de los marcadores de células madre, progenitoras y endoteliales por qPCR o KM tratada con PGE2 en el día tres de post-irradiación mostró regulación hacia arriba significante de runxl y lmo2 (Figura 5) . La inhibición de la actividad de cox mediante inhibidores no selectivos y selectivos significativamente disminuyó la recuperación de KM y afectó la supervivencia total (Figura 5). Los resultados de los inventores indican que PGE2 desempeña una función importante en la homeostasis de KM. Los efectos de la ruta de prostaglandina sobre HSC mamífera y poblaciones progenitoras también se evaluaron. La adición de dmPGE2 a las células ES durante la expansión del cuerpo embrioide incrementó el número de colonias hematopoyéticas sobre una capa de células estromales 0P9 y en los ensayos de formación de colonia de metil celulosa (Figura 6A, B) . Nakano y colaboradores, 272 Sci. 722-24 (2002). OP9, el eritroide definitivo (dE) y las colonias granulocito/monocito (GM) se incrementaron en una manera dependiente de la dosis después de la exposición a 10 µ? (GM p=0.005) y 20µ? (OP9 p=0.047; dE p=0.04; GM p=0.007) dmPGE2. El número de colonias de granulocito/eritrocito/monocito/macrófago (GEMM) multipotentes se aumentó 2.9 veces después del tratamiento con dmPGE2 (10 µ?: p=0.017; 20µ?: p=0.016). En 100 µ?, dmPGE2 fue tóxico a las células ES. qPCR se realizó para determinar si los componentes de la ruta de PG estuvieron presentes en las- células ES: Coxl, Cox2, PGE2 sintasa y los receptores PGE 1-4 estuvieron presentes en todas las etapas examinadas. La indometacina inhibió el crecimiento de colonia en 20 µ? (OP9 p=0.047) y 100 µ? (GM p=0.024) (Figura 6A, B) ; los efectos inhibidores se rescataron mediante la dmPGE2 exógena en ambos de los ensayos de formación de colonia (Figura 7A, B) . Estos datos sugieren que la función de la ruta de prostaglandina en la hematopoyesis es conservada entre el pez cebra y los mamíferos . Alternativamente, la expansión de las células hematopoyéticas o endoteliales en la región de AGM (aorta-gónada-mesonefros ) se puede estudiar al aparear ratones, luego al dosificar las hembras recientemente preñadas con PGE2 en su agua de beber iniciando en el día 8.5 del desarrollo embriónico. Los niveles de PGE2 pueden tener un efecto sobre el implante de embriones de murino; esperando hasta el día 8.5 para comenzar el tratamiento mientras que procede la implantación, pero todavía proporciona el tiempo para el fármaco afecte la población de células madre que se puede encontrar en la región de AGM en el día 10.5. Las hembras preñadas se sacrifican con C02 en el día 11.5 del desarrollo embriónico y los embriones se aislan del útero y se fijan con paraformaldehído . Los embriones fijados pueden ser procesados para montar completamente la hibridación in situ para marcadores de HSCs, tales como Runxl, c-myb o Seal, o sometidos a inmunohistoquímica con anticuerpos a HSCs para encontrar evidencia de una población de células madre expandida. Diferentes dosis, por ejemplo, 10 (-1), 10 (-3) y 10 (-5) microgramos/g de peso del cuerpo, se pueden utilizar. Tres ratones hembra preñadas pueden ser utilizadas para cada dosis mencionada en lo anterior, y para una variable de control no expuesta. La dosis efectiva luego se utiliza en experimentos de transplante que involucran células disectadas de la región de AGM de los embriones. La expansión de CFU-S y Repoblación a Largo plazo de HSCs se pueden estudiar en ratones también. La dosis individual de PGE2 encontrada que expande células madre potenciales en la región de AGM se puede alimentar a hembras preñadas después del implante (aproximadamente E8.5) en el agua de beber. Las hembras de control se tratan en paralelo. Las hembras preñadas se eutanizan en 11.5 dpc. Los embriones se recolectan del útero, la región de AGM aislada mediante microdisección y las células de AGM preparadas para el transplante. Una combinación de un equivalente de embrión de células experimentales y/o control será inyectada en la vena de la cola de ratones recipientes irradiados, donde se alojarán al bazo (corto plazo) y médula ósea (largo plazo). La contribución de las células experimentales contra las células de control se puede analizar en doce dias de post-transplante mediante un ensayo CFU-S estándar para el número de colonias del bazo de ratones recipientes sacrificados, o mediante la citometría de flujo de la médula ósea en un mes de post-transplante para determinar la repoblación de HSCa largo plazo competitiva. Debido a que el desarrollo del sistema cardiovascular está intimamente ligado a la producción de células madre hematopoyéticas durante la embriogénesis , el efecto de la presión sanguínea sobre la señalización de PGE2 y la inducción de HSCs de AGM puede ser relevante. El sitio más conservado para la hematopoyesis en cualquier vertebrado es la pared ventral de la aorta. Las células en la aorta surgen en treinta horas de desarrollo en el pez cebra y se desarrollan ahí hasta aproximadamente cuarenta y seis horas cuando entran en circulación o invaden los tejidos. La producción de HSC de AGM se puede sincronizar para que ocurra después del primer latido del corazón y cuando la presión sanguínea dentro de la vasculatura alcanza un nivel crítico. En el pez cebra, el primer latido del corazón ocurre en veintitrés horas. En este tiempo, el latido del corazón es lento y la contracción del corazón es relativamente débil. En treinta horas, se establece la circulación robusta. La indicación para hacer células madre de AGM puede ser una alteración en la presión sanguínea. Varias sustancias químicas identificadas en la clasificación del pez cebra regulan la presión sanguínea y la contractilidad cardiaca. Por ejemplo, la sustancia química hidralazina, un hipertensivo comúnmente utilizado, se sabe que incrementa la expresión de prostaglandina E2. El análisis in situ de embriones expuestos a Hidralazina demuestra muy pocas oportunidades en la angiogénesis , pero un gran incremento en el número de células madre sanguíneas. Además, el fármaco estrofantidina , un glicósido cardiaco, incrementa la contractilidad del corazón y también incrementa las células madre de AGM. Además, el beta-bloqueador , atenolol, conduce a vasodilación y también conduce a la producción elevada de células madre de AGM. Las sustancias químicas que perturban el latido cardiaco, tal como BDM y Epinefrina, así como el mutante silent heart pueden alterar la producción de células madre de AGM, y pueden establecer si la circulación necesaria para la producción de AGM. Para establecer adicionalmente de la relación entre la presión sanguínea y la ruta de prostaglandina, Hidralazina, estrofantidina y atenolol se pueden incubar con el pez cebra en la presencia de inhibidores COX2. Estudios similares se pueden hacer con el COX2 morfolino para determinar si son capaces de bloquear la activación de las células madre mediadas por Hidralazina. Para explorar los efectos potenciales in vivo, médula ósea completa de murino (WBM) se expuso ex vivo a dmPGE2 (1 µ?/106 células) y recipientes irradiados se transplantaron con 6xl04 células WBM tratadas. El número de CFU-S12 se incrementó tres veces (p<0.0001) en recipientes de WBM tratados con dmPGE2 (Figura 8b, Figura 9A, Tabla 6 - Tabla 8); de manera similar, las colonias CFU-S8 más maduras también se aumentaron (Figura 9A, Tabla 5). Para estimar el requerimiento de PGE2 endógeno, células WBM se incubaron ex vivo con Indometacina (1 µ?/106 células). Después del transplante de lxlO5 células, una disminución del 70% (p=0.0002) en el número de CFU-S12 se observó en recipientes de células tratadas con Indometacina (Figura 8C, Figura 9C, Tabla 4 - Tabla 6); resultados similares se observaron con la inhibición de coxl y cox2 especificas (Figura 9K, L) . Estos resultados sugieren que el tratamiento de PGE2 no solamente aumenta la formación de células madre hematopoyéticas, sino que es requerido para la actividad de CFU-S. Tabla 5. Efecto de dmPGE2 sobre CFU peso del bazo y la actividad de CFU-S se estimó en el día doce en recipientes irradiados inyectados con ya sea WBM o células clasificadas con FACS de ckit+Scal+linaj e tratadas con EtOH, dmPGE2 o Indometacina (1 µ?/106 células) . Tabla 6. Efecto de dmPGE2 sobre la repoblación de BM competitiva radioprotectora WBM (CD45.1) se trató ex vivo con el vehículo EtOH o dmPGE2 y se transplantó en recipientes subletalmente irradiados (CD45.2) con un número fijo de células competidoras (CD 5.1/CD 5.2 ) en las relaciones mostradas en las columnas 2 y 3. La columna 4 ilustra el número de animales con más de 5% de CD45.1 de quimerismo en seis semanas, y la columna 5 demuestra el porcentaje medio de quimerismo. La última columna indica el número de recipientes CD45.2 analizados. Tabla 7. Efecto de dmPGE2 sobre la repoblación de competitiva radio-protectora WBM (CD45.1) se trató ex vivo con vehículo EtOH o dmPGE2 y se transplantó en recipientes subletalmente irradiados (CD45.2) con un número fijo de células competidoras (CD45.1/CD45.2 ) en las relaciones mostradas en las columnas 2 y 3. La columna 4 ilustra^ el número de animales con más de 5% de CD45.1 de quimerismo en doce semanas, y la columna 5 demuestra el porcentaje medio de quimerismo. La última columna indica el número de recipientes CD45.2 analizados.

Tabla 8. Efecto de dmPGE2 sobre la repoblación competitiva radio-protectora BM (CD45.1) se trató ex vivo con vehículo EtOH o dmPGE2 y se transplantó en recipientes subletalmente irradiados (CD45.2) con un número fijo de (CD45.1/CD45.2 ) de células competidoras en las relaciones mostradas en las columnas 2 y 3. La columna 4 ilustra el número de animales con más de 5% de CD45.1 quimerismo en veinticuatro semanas y la columna 5 demuestra el porcentaje medio de quimerismo. La última columna indica el número de recipientes CD45.2 analizados. Los componentes de la ruta de PG se presentan en ambas de las poblaciones de célula estromal y HSC en ratones y humanos (Princeton Stem Cell y Stromal cell databases). Ivanova y colaboradores, 298 Sci. 601-04 (2002); Nakano y colaboradores, 101 Blood 383-89 (2003) . Coxl, Cox2, PGE2-sintasa y los receptores EP2 y EP4 están presentes en HSCs de hígado fetal y en HSC de BM después de la lesión con 5-fluorouracilo (5FU), sugiriendo que la señalización de PGE2 es utilizada mediante HSCs. Venezia y colaboradores, PLoS Biol 2, e301 (2004) . Para determinar si el incremento del número de CFU-S es debido a un efecto directo de PGE2 sobre la población de células madre, células BM de ckit+Scal+linaj e- ( SL) aisladas de FACS (se expusieron a dmPGE2 y se transplantaron en 100 o 300 células por recipiente irradiado. Ambos pesos esplénicos (Figura 9D) y CFU-S12 se incrementaron significativamente en recipientes de células tratadas con dmPGE2 (Figura 9D, Tabla 6 - Tabla 8) . Estos resultados indican que dmPGE2 puede conducir a la activación autónoma de células de las HSCs y las progenitoras inmaduras . Para determinar si la exposición de dmPGE2 puede aumentar la reconstitución de HSC, se condujo el análisis de repoblación competitivo de dilución limitativa. Zhang & Lodish, 103 Blood 2513-21 (2004). BM (CD45.1-) expuesta a dmPGE2 ex vivo se mezcló independientemente en dosis variables con un número fijo de células competidoras no tratadas (CD45.1/CD45.2) y se inyectaron en ratones recipientes congénicos (CD45.2). La sangre periférica se obtuvo en seis, doce y veinticuatro semanas de post-transplante y se examinó mediante FACS para determinar la contribución de las células de prueba tratadas con la repoblación hematopoyética (Figuras 9E - 9J) . La reconstitución positiva se definió como el quimerismo de multi-linaje de célula de prueba >5% (Figuras 9F, H , I). Un incremento significante en el número de células de repoblación como es determinado por el análisis estadístico de Poisson se observó en dmPGE2 tratada con dmPGE2 (Figura 8E, Figuras 9G, 9J) . En seis semanas, la frecuencia calculada de células de injerto por 106 células WBM se aumentó 3.3 veces (p=0.005) en los recipientes WBM tratados con dmPGE2, y la frecuencia de HSCs de repoblación a corto plazo fue 4 veces (p=0.002) más alta en doce semanas de post-transplante (Figura 8E, 8F, Figura 9G) . En veinticuatro semanas, la frecuencia de las HSCs de repoblación a largo plazo fue 2.3-veces aumentada (p=0.05) en recipientes de células tratadas con dmPGE2 (Figura 8F, Figura 9J) . En ambos de los análisis doce y veinticuatro semanas, la reconstitución y todos los recipientes fue de multilinaje, indicando que el tratamiento con .dmPGE2 transiente incrementó la frecuencia de las HSCs de repoblación en el ratón sin retirar la capacidad diferenciativa . Nada de declinación en la contribución de las HSCs tratadas con dmPGE2 a hematopoyesis se observó. Para determinar si el tratamiento con dmPGE2 aumentó el albergamiento al nicho de BM, WBM se marcó con un tinte vital, CDFA, luego se expuso a dmPGE2 y se transplantó . En doce horas de post-transplante , no hubo diferencia significante en el albergamiento entre las células de control y tratadas con dmPGE2 (p=0.83). En un esfuerzo para caracterizar precisamente el requerimiento de la ruta de prostaglandina en la producción de células madre, se utilizaron varios inhibidores de ciclooxigenasa (COX) comercialmente disponibles, adicionales. Los inhibidores de COX generales indometican, naproxen, ibuprofen y aspirina, asi como el inhibidor especifico de Cox2 NS-398, todos se probaron para los efectos sobre HSCs de AGM por la vía del ensayo descrito en lo anterior. Cada inhibidor químico Coxl o Cox2 redujo las células madre en la aorta. Cox es responsable para el procesamiento de PG' s al alterar el ácido aracadónico. La basculogénesis y la especificación de la aorta permanecieron intacta en embriones tratados como es observado por el manchado de efrinB2 y Flkl, sin embargo algunos aspectos de la angiogénesis , particularmente la morfología de los vasos sanguíneos inter-somíticos, fueron perturbados por algunas de las sustancias químicas. Los oligonucleótidos de antisentido de morfolino para Coxl y C0X2 también se inyectaron individualmente en embriones de pez cebra para confirmar que la reducción de células madre en la aorta fue debido a la inhibición de Cox . Las células Runxl+Cmyb+ se redujeron en la región de AGM con ya sea morfolino. Como es reportado previamente, muy altas concentraciones del Coxl MO causó defectos en la especificación de la aorta y la vena, mientras que el cox2 morfolino causó una detención de gastrulación en altas concentraciones. Cha y colaboradores, 20 Genes & Devel . 77-86 (2006); Cha y colaboradores, 282 Devel. Biol. 274-83 (2005). La reducción en HSCs se observó en concentraciones inferiores de ya sea MO, y las estructuras del vaso en la cola no se alteraron severamente. Adicionalmente, el pez cebra transgénico flil GFP que precisamente delinea la vasculatura, se utilizaron para evaluar el efecto de los morfolinos y las sustancias químicas sobre la angiogénesis . La inhibridización de Coxl o Cox2 no afecta el desarrollo de la aorta por las sustancias químicas o morfolinos. Los vasos sanguíneos intersomíticos son alterados por algunos tratamientos. La prostaglandina E2 es la prostaglandina mayor que se hace durante la embriogénesis de pez cebra y regula los tejidos vasculares. Pini y colaboradores, 25 Arterioscler Thromb Vase Biol. 315-20 (2005); Grosser y colaboradores, 99 P.N.A.S. USA 8418-23 (2002). Precisamente que las prostaglandinas sean afectadas por tanto la inhibición de la sustancia química y/o morfolino de los componentes de la ruta de prostaglandina se puede analizar mediante el análisis de espectroscopia de masas. De manera similar, la espectroscopia de masas puede confirmar la inducción de E2 después de la exposición a los sustratos de ruta de prostaglandina tal como ácido lineólico o Ácido de Aguamiel. El análisis de la función de PGE2 en la formación de HSCs de AGM lógicamente conduce a análisis de qué receptores son activos en la señalización de propagación de prostaglandina a los efectores corriente abajo. Cuatro receptores de PGE2 se han identificado en el pez cebra. Agonistas y antagonistas específicos de los receptores PGE ayudan en esta identificación. Adicionalmente los receptores específicos que están mediando la inducción de HSC pueden ser estudiados mediante el bloqueo funcional utilizando morfolinos como es descrito en ' lo anterior. La expresión de cada uno de los receptores de prostaglandina, así como ciclooxigenasas se puede estudiar mediante la hibridación in situ para evaluar la localización de estos productos génicos a través del desarrollo, particularmente enfocándose sobre la región de AGM . La presente invención demuestra que PGE2 aumenta el número de células madre hematopoyéticas y progenitoras multipotentes en dos especies de vertebrados, pez cebra y ratones. Estudios previos han documentado que PGE2 no modificado puede afectar la maduración de célula sanguínea en el ratón (Boer y colaboradores, 100 Blood 467-73 (2002); Rocca y colaboradores, 99 P.N.A.S. USA 7634-39 (2002)), y la estimulación del ciclo celular en los protenitores CFU-S8 (Feher & Gidali, 247 Nature 550-551 (1974)); los efectos de la señalización de célula mediada por PG sobre HSCs no se ha examinado previamente, sin embargo, coxl y cox2 aparecen para tener funciones distintas en la formación de HSC de AGM: coxl es importante en la formación del nicho hematopoyético, particularmente el endotelio hemogénico, mientras que cox2 es probablemente involucrado en la auto-renovación y proliferación de HSCs por si mismas. A la inversa, los ratones bloqueados de Coxl o Cox2 homocigotos son viables sin defectos aparentes en la formación de HSC (Langenbach y colaboradores, 58 Biochem. Pharmacol. 1237-46 (1999)); esto se cree que es debido a la contribución maternal y fraternal de PGE2. Cha y colaboradores, 282 Devel. Biol . 274-83 (2005); Langenbach y colaboradores, 83 Cell 483-92 (1995) . Significativamente, los análisis de los ratones Cox2-/- demostraron alteraciones en niveles de hematocrito y una incapacidad para recuperarse de la lesión de BM inducida por 5-FU (Lorenz y colaboradores, 27 Exp. Hematol . 1494-502 (1999); estos descubrimientos implican la presencia de defectos de HSC en ratones Cox2-/- adultos compatibles con la función propuesta por los inventores para PG en homeostasis de HSC. Para poner en claro las funciones de Coxl y Cox2 en regular la homeostasis de HSC en el adulto, los inventores realizaron un ensayo de recuperación de médula ósea CFUS12 (Figura 9k, 1) y 5-FU utilizando inhibidores químicos selectivos de ya sea coxl (SC560) o cox2 (NS398) . La inhibición de cualquier enzima se encontró que significativamente altera la actividad de CFUS, así como la recuperación de la sangre periférica y los números de WBC de BM (Figura 9m, n) comparada con los controles. Adicionalmente , la administración de dmPGE2 después del tratamiento de 5FU significativamente aumentó la recuperación de BM. Con untamente, estos datos sugieren que tanto Coxl como Cox2 mantienen una función en regular la homeostasis de HSC en el ratón adúlto, como en el pez cebra, y que PGE2 es el mediador de esta regulación de HSC. Los pacientes que se someten al transplante de BM exhiben niveles de PGE2 endógenos incrementados. Cayeux y colaboradores, 12 Bone Marrow Transplant 603-08 (1993) . Aunque los inhibidores de cox no son generalmente dados de post-transplante debido a la inhibición de plaquetas, los estudios de los inventores elevaron la posibilidad de que la. administración de tales agentes después del transplante de BM humano podría deteriorar el injerto de HSC. PGE2 y sus análogos se han administrado de manera segura a humanos. Talosi y colaboradores, 32 J. Perinat. Med. 368-74 (2004); Thanopoulos y colaboradores, 146 Eur. J. Pediatrics 279-82 (1987) . Estos pueden ser útiles para la expansión ex vivo o in vivo de HSCs . La concentración de dmPGE2 utilizada para expandir HSCs de murino cae dentro del intervalo fisiológico de PGE2 en el suero humano. Hertelendy y colaboradores, 3 Prostaglandins 223-37 (1973). La presente descripción ilustra que PGE2 funciona como un potente regulador de HSCs en invertebrados, y se puede probar útil en tratar pacientes con falla de médula ósea o después del transplante. El estudio de hematopoyesis en el pez cebra se ha enfocado previamente sobre la primera onda de hematopoyesis, llamada primitiva, y la derivación de células madre hematopoyéticas definitivas en la región de aorta, gónadas y mesonefros (AGM) del embrión de pez cebra. Poco es conocido acerca de la producción de las células madre de AGM en vertebrados, pero tanto runxl como notchl se han mostrado que son requeridos para la formación de HSC de AGM. También hay una relación genética mediante lo cual notchl regula runxl. Una clasificación genética química a gran escala para efectores de inducción de células madre utilizando una librería de aproximadamente 2500 compuestos con acción conocida indicó que las sustancias químicas que condujeron a la producción de prostaglandina (PG) E2 causó un incremento en el número de células madre, mientras que las sustancias químicas .que previnieron la síntesis de PGE2 condujeron a una reducción de células madre. Otras sustancias químicas tales como vasodilatadores y vasoconstrictores también se encontraron que alteran el número de células madre, estableciendo una hipótesis de que el tono bascular durante la embriogénesis es un activador para la producción de células madre. Los miembros de la ruta de señalización Wnt se han planteado como hipótesis que regulan los números de células madre hematopoyéticas , aunque hasta la fecha estos estudios han examinado exclusivamente la homeostasis de médula ósea de adulto. La función de la señalización de Wnt en la producción de AGM embriónico para identificar interacciones genéticas potenciales con la ruta de notch-runx, o con las prostaglandinas , es investigado. Para definir genes adicionales que participan en la formación de células madre AGM, una clasificación a gran escala para mutantes con defectos en la producción de AGM continúa. Por lo menos doce mutantes se han aislado. Los genes y las rutas identificadas pueden tener un impacto significante sobre el entendimiento de los inventores de la biología de las células madre básica, y podría conducir a nuevas terapias para enfermedades tal como la anemia de célula falsiforme, talesemia y anemia aplásica . Los procedimientos para caracterizar las rutas de señalización involucraron en definitivo la derivación de células madre hematopoyéticas durante la embriogénesis, utilizando el pez cebra como un modelo, que incluye evaluar la hipótesis de que las prostaglandinas regulan la producción de células madre AGM utilizando mutantes, morfantes, transgénicos y sustancias químicas y examinando la función de la ruta wnt en la formación de HSCs de AGM e investigar interacciones potenciales con otras rutas de señalización conocidas que son activas en la región de AGM. La genética del pez cebra se puede utilizar para definir nuevas rutas involucradas en la formación de HSC de AGM durante la embriogénesis y permitir las clasificaciones de mutagénesis a gran escala para defectos en hematopoyesis definitiva en el pez cebra. Esto permite el aislamiento y la caracterización de algunos de los genes mutados responsables para la producción de HSC de AGM normal. El trabajo en la definición de nuevas rutas que regulan la producción de hematopoyesis embriónica ha abierto luz sobre la ruta de CDX-HOX. Se descubrió que el gen defectuoso responsable para el número disminuido de HSCs en el kugelig de pez cebra mutante. Davidson y colaboradores, 425 Nature 300-06 (2003) . El mutante kgg tiene un déficit de células madre hematopoyéticas SCL+ durante la embriogénesis temprana y carece de la expresión de los marcadores progenitores, GATA-1 y runxl. La vasculatura en los embriones mutantes forma normalmente, pero muy pocas células rojas circulan en la vasculatura. El gen mutado codificado de CDX4, un miembro de la familia caudal. Los mamíferos tienen tres genes CDX que incluyen CDX1, 2 y 4. Los genes caudales son conocidos que actúan al regular los genes HOX. Los genes HOX posteriores mostraron expresión disminuida en mutantes kgg . Se ha establecido que los genes HOX actúan corriente abajo de CDX4 en el desarrollo de la sangre. La sobreexpresión de hoxb7 o hoxa9 condujo a un rescate robusto del defecto hematopoyético en mutantes kgg. Para evaluar si CDX4 es suficiente para especificar la ausencia de células madre hematopoyéticas durante la embriogénesis , mRNA de CDX4 se inyectó en embriones de pez cebra. Un número de células positivas SCL se encontró en regiones del embrión que normalmente no formarían sangre. El hecho de que cdx4 sea suficiente para inducir las células madre de la sangre ectópicas permite a este trabajo traducirse en el sistema mamífero. A pesar del potencial de formación de sangre in vitro significante de las células madre embriónicas (ESCs) de murino, las células madre hematopoyéticas derivadas (HSCs) que pueden reconstituir ratones irradiados se ha probado que es estimulante. Los investigadores han injertado exitosamente ratones adultos letalmente irradiados con ESCs diseñadas para expresar ectópicamente hoxB4. Kyba y colaboradores, 109 Cell 29-37 (2002). La reconstitución de sangre mostró una predominancia mieloide, probablemente debido a una incapacidad para el patrón completo de la HSC adulta de estas poblaciones embriónicas. La co-expresión de CDX4 y hoxb4 promueve la expansión robusta de blastocitos hematopoyéticos sobre los cultivos estromales 0P9 soportivos. Cuando se inyectan intravenosamente en los ratones letalmente irradiados, estas poblaciones de células proporcionan radio-protección robusta y la constituyen quimerismo de donador linfoide-mieloide de alto nivel. Wang y colaboradores, 102 P.N.A.S.EUA 1981-86 (2005). Para explorar las rutas que podrían estar corriente abajo de la ruta cdx-hox, un análisis de microarreglo se utilizó para identificar genes diferencialmente expresados en mutantes kgg y embriones de tipo silvestre. Raldh2, una enzima requerida para la producción de ácido retinoico (RA) , es sobreexpresada en mutantes kgg durante las etapas tempranas de la formación de sangre. Perz-Edwards y colaboradores, 229 Devel. Biol. 89-101 (2001); Begemann y colaboradores, 128 Devel. 3081-94 (2001). Estos datos condujeron a la hipótesis de que RA puede actuar para suprimir la formación de sangre y que la ruta de CDX-HOX funciona para limitar la producción de RA, para de esta manera permitir que ocurra la formación de sangre. En otras palabras, la ruta de cdx-hox controla la señalización de ácido retinoico. Para probar esto, embriones de pez cebra de tipo silvestre se trataron con RA y, en realidad, ellos llegaron a ser severamente anémicos. El tratamiento de los embriones kgg con DEAB ( Perz-Edwards , 2001), una sustancia química que bloquea la actividad de raldh2, restauró la hematopoyesis en mutantes kgg. El tratamiento con DEAB no logró rescatar la expresión de hoxa9a, indicando que RA actúa corriente abajo de los genes hox. DEAB también indujo una expansión de las células eritroides en embriones de tipo silvestre. DEAB y RA también afectaron la formación de progenitores hamatopoyéticos de ratón que surgen de los cuerpos embrioides (EBs) derivados de célula ES. Además de DEAB a EBs entre los días dos a tres de desarrollo dio por resultado un incremento de cinco-ocho veces en las colonias eritroides 'primitivas' (CFU-EP) , análogos a los resultados en el pez cebra. La estimulación similar de las células eritroides del saco vitelino primitivas se observaron con DEAB. En contraste, el tratamiento de RA, causó una inhibición general en el crecimiento de todos los tipos de colonia. Tomados conjuntamente, estos resultados sugieren un nuevo modelo en el cual la supresión de RA mediante la ruta de CDX-HOX es necesaria para que ocurra la hematopoyesis del saco vitelino. Ver también, Davidson y colaboradores, 425 Nature 300-06 (2003); Davidson & Zon, 292(2) Devel. Biol . 506-18 (2006). Un gen adicional identificado es moonshine, un gen que es requerido para eritropoyesis primitiva y definitiva normal. El gen mutado es Tifly, un regulador putativo de cromatina. Ransom y colaboradores, 2 PloS 1188-96 (2004). Este factor contiene una extensión PHD, dominio de bromo, extensión de anillo y recientemente se ha enlazado a la señalización de BMP a través de una interacción con SMAD2 y SMAD437. Dupont y colaboradores, 121 Cell 87-99 (2005). La función de este factor en la hematopoyesis puede ser determinado utilizando clasificaciones aumentadoras supresoras . Un mutante adicional se ha designado bloodless . Este gen es requerido para tanto la hematopoyesis primitiva como la hematopoyesis de AGM, aunque se recupera la hematopoyesis definitiva. El fenotipo bloodless se presenta que es no autónomo de célula y todavía bloodless controla la expresión SCL y GATA1. Hay dificultad en mapear este gen mutante. Liao y colaboradores, 129 Devel. 649-59 (2002) . El trabajo que pone en claro el mecanismo del cambio de destino de eritroide a mieloide que muestra que GATA1 es requerido para la supresión del linaje mieloide. Galloway y colaboradores, 8(1) Devel. Cell 109-16 (2005). Más específicamente, la investigación del mutante de pez cebra deficiente de GATA1, conocido como vlad tepes, y reveló que la isleta de sangre completa transformada al destino mieloide. Este cambio del destino de célula interesante ilustra que GATA1 y PU .1 antagoniza la actividad entre sí. Ellos pueden formar un complejo que regula los programas mieloides y eritroides. Además el trabajo demostró que la inactivación de PU .1 cambió los progenitores de célula mieloide en células eritroides .39 Rhose y colaboradores, 8 Devel. Cell 97-108 (2005). Este estudio proporciona una exposición razonada para la plasticidad dentro del sistema hematopoyético . El estudio de la dependencia de la expresión del gen objetivo y de células eritroides de GATA1 y GATA2 ha mostrado que la mayoría de los genes son absolutamente dependientes sobre GATA1, pero algunos genes requieren tanto GATA1 y GATA2 para la expresión completa. Varios genes novedosos se han encontrado que son absolutamente independientes de GATA. La caracterización de morfantes deficientes de SCL indicó que este fenotipo SCL MO fue muy similar a aquel de SCL inactivado en biología mamífera. SCL es requerido para las células hematopoyéticas tempranas para desarrollarse. La regulación anormal de SCL es evidente en ambos de los mutantes cloche y spadetail que son deficientes en la hematopoyesis normal. Dooley y colaboradores, 277(2) Devel. Biol. 522-36 (2005) . En un esfuerzo para entender el desarrollo de isleta de sangre, los investigadores aislaron el promotor LM02 y demostraron que los próximos 163 pares de bases del promotor son suficientes para inducir la expresión de GFP en la isleta de sangre en desarrollo así como la vasculatura.

Estas líneas de peces transgénicas han sido invalorables para experimentos de transplante. Tanto DsRed así como GFP se han enlazado al promotor LM02 , permitiendo la construcción de dobles líneas transgénicas. Estas células positivas de LM02 de linaje primitivo no confieren la reconstitución a largo plazo en los modelos de transplante de embriones tempranos o en adultos. Zhu y colaboradores, 281(2) Devel. Biol. 256-269 (2005) ; Mead y colaboradores, 128 Devel. 2301-08 (2001); Oates y colaboradores, 98 Blood 1792-1801 (2001) ; Pratt y colaboradores, 11 Physiological Genomics 91-98 (2002); Huber y colaboradores, 11 Current Biology 1456-61 (2001) . Un objetivo mayor fue desarrollar el transplante de células hematopoyéticas para el sistema de pez cebra. Los ensayos de población hematopoyét icos mediante la citometría de flujo encontraron que la simple dispersión delantera y la dispersión lateral pueden separar todos los linajes del sistema hematopoyét ico en el pez cebra. Las células eritroides, mieloides y linfoides podrían ser separadas así como una fracción precursora. Esto dio el transplante de poblaciones de células específicas en embriones mutantes que carecen de sangre. La médula de riñon positiva de GFP de un donador se inyectó en estos embriones que son típicamente bloodless. Seis meses después del transplante, todas las células en circulación fueron verdes, indicando que fueron derivadas de donador. Los embriones vlad tepes y bloodless aparecieron que son excelentes hospederos. Además, los transplantes secundarios demostraron la actividad reconstituyente a largo plazo en la médula de riñon. También se demostró que la médula de adulto podría ser utilizada para rescatar la hematopoyesis en el pez cebra adulto letalmente irradiado. Traver y colaboradores, 104 Blood 1298- 1305 (2004). Este protocolo de transplante ha sido muy útil para los estudios de biología de células madre subsecuentes. Ver también, Traver y colaboradores, 4 Nature Immunol. 1238-46 (2003) . Los análisis de dilución limitativa de células de médula de riñon completo de pez cebra (WKM) pueden mostrar la frecuencia de HSCs en la médula de riñon de pez cebra. Debido a que estos estudios cuantifican el número de células madre transplantables , ellos proporcionan un ensayo funcional para la comparación de la función de célula madre en el pez cebra de tipo silvestre contra mutante . Para este fin, los estudios de reconstitución se realizaron al ablasionar el sistema hematolinfoide de un recipiente no marcado utilizando .dosis de irradiación gamma subletales y luego al transplantar diluciones, que varían de 5,000 a 500,000 de células WKM marcadas con GFP en el hospedero. La sangre periférica se utilizó como células portadoras en el ensayo de dilución de WKM y sirvió como un control negativo cuando se inyectó solo. Después de tres meses de post-transplante, la WKM se disectó de los hospederos y se analizó mediante la citometria de flujo para medir el porcentaje de células donadoras GFP+ en la puerta mieloide. Los recipientes se registraron ya sea como un "éxito" o "falla" para el injerto de donador. Utilizando la estadística de límites máximos binomiales, se determinó que la incidencia de HSCs en KM de pez cebra es 1 en 61,910 células con un intervalo de confidencia de 95% entre 50,798-79,244 células. Este número es muy similar a aquel de un ratón, que tiene ~1 en 50,000 a 130,000 HSCs por volumen de célula de médula ósea. Smith y colaboradores, 88 P.N.A.S. EUA 2788-92 (1991). Por lo tanto, estos datos sugieren que el número de células madre en la población de médula es evolutivamente conservado. El trabajo también ha explorado la producción de células madre AGM de pez cebra y la ruta de muesca. El AGM se cree que se forma del mesodermo lateral presente durante la somitogénesis temprana. El tejido expresa flkl. A medida que migra, este comienza a expresar un marcador específico de arteria llamado gridlock. Después, por dieciocho somitos, las células expresan tiel y tie2, y continúan migrando medialmente y forman un cordón umbilical sólido. El cordón umbilical llega a ser hueco y con vuelta a la aorta. En treinta horas el factor de transcripción runxl es inicialmente expresado ventralmente . Poco tiempo después, las células hematopoyéticas positivas c-myb se encuentran en la pared ventral de la aorta. La parte dorsal de la aorta expresa un factor de transcripción T box, llamado tbx20. El proceso en el pez cebra parece muy similar a aquel de otros vertebrados que incluyen humanos, ratones, pollos y sapos. Galloway & Zon, 53 Curr. Topics Devel. Biol . 139-58 (2002). La función de runxl en el desarrollo del AGM también se examinó. Similar al ratón bloqueado, un bloqueo de runxl en el pez cebra condujo a un número disminuido de células en el AGM que están expresando c-myb. La sobreexpresión de runxl condujo una expansión del número de células madre en la aorta, y la expresión ectópica de c-myb n en la vena. La hematopoyesis primitiva procede normalmente en el moríante runxl. Eso proporciona evidencia de un requerimiento de runxl para la formación de AGM, y adicionalmente establece runxl como un factor que es suficiente para generar células madre definitivas. La evaluación de la función de la ruta de notch en la formación de AGM reveló que runxl actuó corriente abajo o paralelo a la señalización de notch. El mutante mindbomb carece de una · ligasa de ubicuitina E3 para delta, el ligando de los receptores notch. Como tal, los mutantes mindbomb completamente carecen de la señalización notch, y no logran hacer cualquiera de las células madre hematopoyéticas en el AGM. Itoh y colaboradores, 4 Devel. Cell 67-82 (2003). La sobreexpresión de runxl rescata el número de células positivas de c-myb en el AGM en mindbomb. Esto implica que runx es un objetivo importante de notch. En estudios preliminares, la adición de prostaglandina E2 de acción larga al mutante mindbomb no logró demostrar cualquier tipo de rescate. Esto puede ser debido a un defecto en la habilidad de las células para responder a la prostaglandina E2; la señalización de notch es probable que sea requerida más temprano el desarrollo de la región AGM que la prostaglandina E2. Las curvas de dosis respuesta con prostaglandina E2 en el mutante mindbomb puede dar a luz sobre esto. A la inversa, los embriones Notch ICD que tienen número de células madre incrementadas por 36hpf se pueden incubar con inhibidores Cox para ver si la señalización de prostaglandina tiene una función en mediar la regulación hacia arriba de AGM HSC. Otros mutantes hematopoyéticos pueden ser estudiados de manera similar. Un sistema transgénico único se utilizó para examinar la ruta notch. Una linea transgénica que lleva el promotor de choque térmico (HS) que induce gal4 se acopló a otra linea que tiene secuencias UAS que inducen el dominio intracelular de notch (la forma activada llamada NICD) . Lawson y colaboradores, 128 Devel. 3675-83 (2001). Esto proporciona la señal notch activada al embrión en el choque térmico. Después del choque térmico, la AGM de estos embriones mostró que c-myb y runxl expresaron intensidad incrementada y durante un área más grande que ahora incluye la aorta tanto dorsal como ventral y la vena. Esta expresión ectópica no fue acompañada por un cambio en la proliferación celular basada en el inmunomanchado con el articuerpo fosfo-histona H3 o mediante la marcación con BrdU. Este cambio de destino podría ser prevenido por los morfolinos runxl, que demuestran formalmente que runxl actúa corriente abajo de notch . Si la activación de notch desempeñó una función similar en la hematopoyesis de adulto se estudió utilizando el pez transgénico doble para sobreexpresar condicionalmente notch. Los peces fueron irradiados subletalmente con 2000 rads, y luego se sometieron a choque térmico, activando notch. La hematopoyesis de medula se analizó mediante FACS para la dispersión delantera y lateral, para examinar las fracciones mieloides, linfoides y precursoras. Por el día siete después del choque térmico, el pez que expresa NICD ha incrementado las fracciones mieloides y precursoras, y por el día catorce hubo un incremento en las células linfoides comparadas con el tipo silvestre. La recuperación después de la irradiación es más rápida después de la activación de notch. Adicionalmente , runxl, sel y lmo2 se regulan hacia arriba en adultos en poco tiempo después del choque térmico. Esto confirma que la ruta de notch-runx que los inventores descubrieron en embriones también opera en el pez cebra adulto. Ver Burns y colaboradores, 19(19) Genes & Devel. 2331-42 (2005) . El pez cebra también se ha probado útil en la caracterización de enfermedades. Un número de peses mutantes se han desarrollado que tiene el equivalente de la enfermedad humana. Ver, por ejemplo, Dooley & Zon, 10 Curr. Op. Genet . Devel. 252-56 (2000) . Por ejemplo un número de defectos de membrana se han encontrado en el sistema del pez cebra que afecta la erit ropoyesis . Entre los estudios, los genes mutantes identificados' fueron BAND 3, BAND 4.1 y espectrina. De manera interesante, el mutante BAND 3 apareció que tiene un defecto que fue muy similar a HEMPAS o CDA tipo 2. El BAND 3 localiza a los agujeros de hilado en el precursor eritroide divisor donde regula la anemia congénita disert ropoyética . Ver, por ejemplo, Liao y colaboradores, 127(3) Devel. 127 (3) : 5123-32 (2000) ; Paw y colaboradores, 34(1) Nature Genet. 59-64 (2003) . Recientemente, grx5 se aisló como el gen mutante shiraz. Shaw y colaboradores, 440 Nature 96-100 (2006) . Glutaredoxina está localizada en los mitocondrios y es requerida para la producción de agrupación de hierro azufre. El gen importador de hierro mitocóndrico defectuoso en el mutante frascati también se aisló, y el ratón bloqueado de frascati desarrolla anemia, similar al pez. Ver también Donovan y colaboradores, 403 Nature 776-81 (2000); Donovan y colaboradores, 100 Blood 4655-60 (2002); Wingert y colaboradores, 131(24) Devel. 6225-35 (2004); Fraenkel y colaboradores, 115 J. CHn. Invest. 1532- 41. (2005); Wingert y colaboradores, 436 Nature 1035-39 (2005) . Como parte de la Iniciativa del Genoma de Pez Cebra Trans-NIH, un chip Affymetrix se diseñó. Este involucró la investigación de arriba de diez mutantes que afectan la hamatopoyesis de pez cebra al estudiar los patrones de expresión de gen en mutantes y los tipos silvestres en diferentes puntos de tiempo. Weber y colaboradores, 106(2) Blood 521-30 (2005) . Los inventores también han evaluado el perfilamiento de expresión a gran escala mediante las clasificaciones de hibridación in situ individuales que también se han evaluado. Ese trabajo ha identificado arriba de 160 genes como parte del programa específico de sangre. La función de la ruta wnt en la formación de HSCs de AGM y la interacción potencial con otras rutas de señalización conocidas que son activas en la región AGM también son relevantes. Basado en el trabajo elegante sobre la función de la ruta wnt en HSC de autorrenovación en médula de adulto, Reya y colaboradores423 Nature 409-14 (2003)), la ruta wnt puede regular la producción de HSC de AGM. La ruta canónica para la señalización de wnt involucra la activación de GSfp y la translocación subsecuente de ß-catenina al núcleo, donde luego interactúa con uno de dos factores de transcripción similares, TCF o LEF1 para activar los genes regulados de nt (Figura 10). La ruta Wnt es negativamente regulada por dickkopf y APC. La expresión de Wnt3 estimula tres veces la expansión del ratón de HSCs (Reya, 2003; ilbert y colaboradores, 423 Nature 448-52 (2003)), pero sorprendentemente la inactivación de ß-catenina en HSCs no conduce a un defecto en la autorrenovación . Cobas y colaboradores, 199 J. Exp. Med. 221-29 (2004). Estudios más recientes han demostrado que los inhibidores GSK3B conducen a una reducción en la diferenciación de HSC. A pesar de lo que es conocido acerca de la acción de la señalización de wnt en la regulación de la autorrenovación de célula madre, hay poca información acerca de la inducción de wnt de células madre definitivas en el AGM. En el soporte de la hipótesis de que la señalización wnt desempeña una función en la inducción de HSC, ß-catenina se identificó a través de los métodos de RT-PCR de exhibición diferenciales como es expresado diferencialmente en la región AGM en el momento de la formación de HSC en el ratón (REF) . Para definir una función para la señalización de Wnt en el AGM, las lineas inducibles especificas de la ruta Wnt de peces transgénicos puede ser estudiada. Un número de peces transgénicos se han hecho en el cual el promotor de choque térmico induce la expresión de varios miembros de la ruta Wnt. El pez de ejemplo para el estudio incluye: Wnt8 de choque térmico, dickkopf de choque térmico, y mutantes TCF negativos dominantes de choque térmico. Un simple impulso de calor, similar a aquel utilizado en los estudios notch, se puede utilizar para estudiar el efecto de la inhibición o regulación hacia arriba de la señalización nt sobre la producción de HSC de AGM. En un esfuerzo para mejor entender la función de la señalización de wnt en la formación de AGM, el pez wntQ de choque térmico puede ser examinado. wntS se expresa en el aspecto posterior del embrión en la región tailbud. El choque térmico del embrión entre 18-22 somitos condujo a una regulación hacia arriba significante de las poblaciones de célula madre en el AGM basado en la expresión runxl y c-myb-La activación de wtS conduce a la expansión de células madre pero otros wnts pueden similarmente desempeñar una función de este proceso. Puede ser relevante determinar qué proteínas wnt son expresadas en la región AGM en desarrollo. Las células CDX4+ serán examinadas mediante el análisis de microarreglo . La informática se puede utilizar para examinar la identidad de los receptores wnts y wnt expresado en estas HSCs . Adicionalmente , los cDNAs de wnt3, wnt5 y wnt8 serán estudiados mediante la hibridación in situ. Otros wnts deducidos de los microarreglos serán estudiados mediante ISH. Un curso de tiempo completo de choque térmico durante el desarrollo puede localizar el período precisó de tiempo en el cual la señalización de wnt es requerida para la formación de HSC. El TCF negativo dominante de choque térmico y las lineas dickkopf de choque térmico para inhibir la señalización de wnt en el AGM también se pueden examinar. El TCF negativo dominante elimina la ruta clásica, mientras que la construcción de choque térmico dickkopf inhibe las rutas de wnt tanto clásicas como no clásicas. Las células madre hematopoyéticas estuvieron ausentes completamente después de la exposición al calor de estas lineas. Para analizar adicionalmente si wnt es requerido para la formación de HSC de AGM, varias sustancias químicas agonistas y antagonistas de wnt se pueden probar, por ejemplo, por los métodos descritos en la presente. Los estudios de expresión génica después del choque térmico en los embriones transgénicos HS wnt8, HS dkk y HS-DN TCF se examinaron por la vía de la técnica de hibridación de expresión y el análisis de y Q-PCR. Los marcadores de células madre hematopoyéticas incluyendó SCL, LM02, GATA-2, GATA-1 , runxl, PU.l, e ikaros pueden ser relevantes para determinar el efecto de la señalización wnt sobre la población HSC. Del mismo modo la expresión de marcadores de población de células de sangre linfoides terminalmente diferenciadas (ragl, LCK, inmunoglobulina célula T), mieloide (mieloperoxidasa , L-plastina) y eritroides (receptor de eritropoyetina , Erb2) así como células endoteliales (flil, flkl, tie2 y tiel) serán examinados después de la inducción e inhibición de wnt. Adicionalmente , la expresión wnt en la región AGM puede ser monitoreado directamente utilizando la linea de peces cebra TOP-FLASH. El pez reportador TOP-FLASH expresa GFP bajo un promotor inducible hecho de sitios de enlace LEF1 multimeri zados . Dorsky y colaboradores, 241 Devel. Biol. 229-37 (2002) . El reportador se conoce que es activo en la formación de mesodermo posterior. Es probable que cdx4 descrito previamente, sea emulado por wnt. La' expresión del reportador TOP-FLASH puede ser examinado en profundidad en la región AGM en desarrollo. El pez de choque térmico de ruta wnt es útil para investigar adicionalmente la función de la señalización de wnt en la homeostasis de médula de adulto. La recuperación de medula de riñon de evaluación después de la irradiación en el pez transgénico HS Wnt8 y HS-DN TCF descifraría el requerimiento para la señalización de wnt en la proliferación y mantenimiento de HSC. Además, la dilución limitativa y los estudios de repoblación competitivos con la médula inducida por choque térmico comparada con la médula normal son útiles. La relación de las rutas wnt y notch con la inducción de prostaglandina de las células madre AGM también puede ser importante en -la hematopoyesis. Los genotipos embriónicos de la pérdida de función de notch y la pérdida de función de wnt son muy similares, con ambos que conducen una deficiencia dramática de las células madre AGM. Esto conduce a la hipótesis de que una ruta puede regular cruzadamente la otra. Los inventores planean evaluar si la construcción wnt8 de choque térmico rescatará el mutante mindbomb y de manera similar si el mutante TCF dominante negativo puede ser rescatado al activar ICD de notch. Esta tipo de análisis debe conducir a un mejor entendimiento de la sincronización precisa de activación de estas rutas durante la embriogénesis . Esto también permitirá entender más acerca de la interacción de esta ruta. El pez mutante TCF (y/o el pez inyectado con morfolino) también se puede utilizar para combinarse con las deficiencias de notch y wnt así como la ganancia de fenotipos de función. El examen del marcador molecular como es descrito en lo anterior y para la caracterización de notch debe establecer si ambas rutas cooperan para regular la inducción de las células madre y/o proliferación, renovación y diferenciación de las células madre . Los miembros de la ruta wnt se han mostrado que interactúan con prostaglandinas . Por ejemplo, para modelos de cáncer de colon inducidos por wnt, no esteroidales que bloquean Coxl o 2 previenen la formación de cáncer. Como es descrito en lo anterior, PGE2 conduce a un incremento en las células madre en el AGM. PGE2 puede rescatar los embriones deficientes de wnt. El inhibidor de C0X2 puede bloquear los efectos de HS-wnt8. Otros modificadores de HSC abarcados por la presente invención incluyen modificadores de ruta de wnt. Los modificadores de ruta de Wnt de ejemplo se encuentran que inhiben HCSs fueron Kenpaulones (efecto HDAC, no GSK3b) , y Acido Valproico (efecto HDAC, no GSK3b) . Los aumentadores de HSC encontrados para modificar la ruta de Wnt fueron cloruro de litio y BIO. Utilizando peces cebras transgénicos que expresan activadores o represores de wnt, los efectos de señalización de wnt sobre el desarrollo de HSCs en la región de aorta-gónada-mesonefros (AGM) se examinaron. La inducción de la señalización de wnt condujo a la formación de HSC aumentada, mientras que la inhibición redujo la producción de HSC. En el pez cebra adulto, la actividad de wnt incrementada aumentó el número de células progenitores durante la recuperación de médula de riñon después de la irradiación. Debido a que (PG) E2 regula la formación de HSC y la homeostasis en vertebrados, la interacción de las rutas de wnt y PG durante el desarrollo de HSC y en la recuperación de médula ósea se exploró al exponer embriones TOP:dGFP a fármacos que regulan la señalización de prostaglandina . Dimetil-PGE2 (dmPGE2), un potente inductor de formación de HSC, se encontró que aumenta la señalización de wnt, mientras que el inhibidor de ciclooxigenasa Indometacina (indo), dio por resultado la ausencia virtual de la actividad de wnt. La inhibición de formación de HSC mediante la represión de wnt se rescató parcialmente mediante el tratamiento de dmPGE2, mientras que la inducción de HSCs mediante la sobreexpresión de wnt fue revertida por la exposición a indo. Indo también bloqueó el incremento mediado por wnt en los precursores de médula ósea después de la irradiación en el pez adulto. PEG2 indujo la actividad en el AGM de ratones TOPrgal indicando la conservación molecular de la interacción wnt y PG y la función de wnt en la formación de HSC. Más específicamente, la señalización de wnt a través de su mediador transcripcional principal ß-catenina desempeña una función importante en controlar la modulación de tejido, las decisiones de destino de la célula y la proliferación en muchos contextos embriónicos, incluyendo el desarrollo y diferenciación de órganos. Ver la Figura 10. La actividad de wnt se ha mostrado que incrementa la autorrenovación de HSC de adulto y aumenta la repoblación de células madre después del transplante de HSC en ratones NOD/SCID. ß-catenina también se encontró que es diferencialmente expresada en las regiones AGM en embriones de ratón en elO-12. En el caso de que la señalización wnt tiene una función durante la formación de HSC en el pez cebra se determinó utilizando activadores inducibles de choque térmico y represores de la ruta wnt. Brevemente, los embriones inducibles por wnt se recolectaron y se les aplicó 9! el choque térmico durante veinte minutos a 38°C. Los genotipos se clasificaron mediante la expresión de GFP, y las HSCs de AGM se analizaron mediante la expresión de runxl/cmyb in situ. La inducción de wnt8 mediante el choque térmico en cinco somitos condujo a la formación de HSC incrementada en el AGM en 36 hpf, mientras que la anulación de la señalización de wnt mediante la inducción de dkk y dnTCF significativamente inhibió la expresión de runxl/cmyb. Esta es la primera evidencia en cualquier organismo de que la señalización de wnt es requerida para la formación de HSC de AGM. Un ensayo de recuperación de irradiación también se empleó para investigar la función de la señalización de wnt en la homeóstasis hematopoyética en el pez cebra. Los peces transgénicos que expresan genes relacionados con wnt se irradiaron subletalmente y la inducción del gen por choque térmico se inició mediante la incubación durante la noche a 38°C en el día dos de post-irradiación . La médula de riñon se recolectó en varios puntos de tiempo de post-irradiación como es resumido previamente para los experimentos de prostaglandina . La Figura 11. La utilización del pes wnt8 con choque térmico demostró que un incremento en la población precursora comparada con los controles en el día diez de post-irradiación, similar a aquel observado con PGE2. La inhibición de la señalización de wnt, mediante dkk o dnTCF con choque térmico, drásticamente altera la cinética de la recuperación de la médula y puede dar por resultado la falla completa de la regeneración de la médula y letalidad. La experiencia clínica en pacientes con mutaciones APC ha mostrado que la inhibición de la síntesis de prostaglandina da por resultado la formación de pólipo mediada por wnt disminuida. Además estudios recientes en líneas de células de cáncer sugiere una interacción de colon de la prostaglandina y la ruta de señalización de wnt. Estas interacciones se examinaron in vivo utilizando una línea transgénica de pez cebra reportadora de wnt, TOPrdGFP. El cincuenta por ciento de epibolio, los embriones se sometieron a ya sea a nada (control), Indometacina o PGE2, y la cantidad de señalización de wnt activada en el embrión se estimó mediante la inducción de GFP inducida del sitio de enlace de wnt. El análisis de alteraciones en la expresión de GFP en la cabeza se analizó mediante la hibridación in situ. Comparado con el control, el tratamiento con PGE2 notablemente aumentó la actividad de wnt, mientras que la Indometacina severamente redujo la expresión de GFP. Figura 12. Estos datos comprenden la primera documentación in vivo de la interacción de las rutas de wnt y prostaglandina durante el desarrollo embriónico . Adicionalmente, la Indotemacina y dmPGE2 se utilizó para investigar la interacción de las rutas de wnt y prostaglandina durante el desarrollo de HSC y en la recuperación de la médula después de la lesión. La Figura 13 refleja los puntos potenciales de interacción de las rutas de PG y wnt . El aumento mediado por wnt de la expresión runxl/cmyb en embriones wnt8 aplicados con choque térmico en cinco somitos se puede bloquear mediante el tratamiento con Indometacina . Además, dmPGE2 puede rescatar los efectos inhibidores de la activación de dkk sobre la formación de HSC de AGM en 36 hpf, como es mostrado mediante la hibridación in situ para runxl/cmyb. Resultados preliminares muestran que el tratamiento de dmPGE2 no es suficiente, sin embargo, para rescatar la formación de HSC en embriones que sobreexpresan dnTCF. Para determinar si la manipulación de la ruta de prostaglandina puede alterar la actividad de wnt en la repoblación de médula de riñon en adulto, los efectos de dmPGE2 e indometacano se examinaron además en lineas ToprdGFP. DmPGE2 significativamente aumentó' la actividad de wnt en el día tres de post-irradiación , mientras que la Indometacina inhibió la expresión de GFP. La Figura 14. Para discernir si la modulación de la señalización de prostaglandina puede modificar los efectos mediados por wnt sobre la recuperación de la médula de riñon después de la irradiación, genes wnt se activaron mediante el choque térmico a 38°C en dos días de post-irradiación y luego la exposición a fármacos de ruta de prostaglandina en un día de post-choque térmico. El pez hs:wnt8-GFP se expuso a Indotemacina, mientras que el dkkl, axina y el pez transgénico de dnTCF se expusieron a dmPGE2. La médula de riñon complete se analizó mediante FACS en el día diez de post-irradiación . El tratamiento con Indometacina se observó que disminuye severamente el aumento mediado por wnt en la población de células precursoras, sugiriendo que los niveles de PGE2 pueden modular directamente la señalización de wnt in vivo. Estos experimentos sugieren que la manipulación farmacológica de la actividad de wnt a través de- la modulación de la señalización de PG proporcionaron un medio novedoso para regular terapéuticamente la homeóstasis de HSC. Varias modalidades ahora serán descritas adicionalmente por los ejemplos no limitativos. EJEMPLOS ¦ Ejemplo 1. Diseño de clasificación química y prueba confirmatoria Embriones igualados en edad de tipo silvestre se arreglaron en placas de 48 cavidades (~5 embriones/cavidad) de compuestos de prueba individuales y se expusieron de 3 somitos hasta 36 hpf. Tres librerías de compuesto se utilizaron: Colección Custom NINDS (1040), Colección SpecPlus (960) y Bioactivos Conocidos BIOMOL ICCB (480) . Cinco por ciento (123/2480) de los compuestos fueron tóxicos, dando por resultado muerte o severas anormalidades morfológicas. La hibridación in situ para runxl y cmyb se realizó para estimar HSCs . Los compuestos se volvieron a probar en 10 µ?, 20 µ? y 50 µ?. La especificidad de las células madre se estimó utilizando flkl en 36hpf. PGE2 , PGI2, dmPGE2 y todos los inhibidores cox (Sigma) se utilizaron en 10 µ? a 20µ?. El registro cualitativo (# embriones con HSCs alteradas/# registrado) de runxl/cmyb se condujo utilizando los siguientes criterios: Normal/sin cambio = linea continua de células endoteliales runxl/cmyb+ y agrupaciones hematopoyéticas ocasionales. Disminuido/ausente = reducción en células runxl/cmyb+, incluyendo la presencia de espacios grandes en la linea de HSCs, células positivas aisladas, o ausencia de expresión. Incrementado/exceso = aumento en las células runxl/cmyb+, incluyendo muchas agrupaciones HSC, una linea engrosada de HSCs, o expresión ectópica. Formación de Imagen Confocal Embriones de peces cebras bigénicos tratados con 36 hpf vivos se incrustaron en agarosa de bajo punto de fusión al 1% que contiene 0.4 mg/ml de Tricaina-S para formación de imagen confocal. Las lineas reportadoras transgénicas cmyb-GFP se crearon de un BAC que contiene la secuencia genómica de promotor cmyb (Galloway, Zhu, Lin, Zon, no publicados) ; el pez Imo2 : DsRed se crearon como es descrito27. Para cuantificación de HSC, las células positivas de cmyb/lmo2,+ se contaron en proyecciones de imágenes apiladas de z (n=10/tratamiento) . Inactivación de Morfolino Oligonucleótidos de morfolino (GeneTools) dirigido contra el pez cebra coxl y cox2, PGE2 sintasa y EP2 y EP4 (Grosser y colaboradores, 2002; Cha y colaboradores, 2006, Pina y colaboradores, 25 Arterioscler . Thromb. Vase. Biol. 315-20 (2005)), se inyectaron (40 µ ) en embriones de pez cebra en la etapa de una célula. Para experimentos de rescate, embriones inyectados con MO de etapas de tres somitos se expusieron a 10 µ? dmPGE2. Perfilamiento de Expresión de Gen de Microarreglo GatalrGFP (12 somitos), lmo2:GFP (12 somitos y 35 hpf) y cd41:GFP (35 hpf) de células positivas se clasificaron con FACS; el RNA total se purificó y se analizó utilizando los chips del gen de pez cebra Affymetrix como es descrito previamente. eber y colaboradores, 106 Blood 521-30 (2005). PCR Cuantitativa La qPCR se realizó utilizando conjunto de cebadores previamente descritos. Bums y colaboradores, 19 Genet Devel. 2331-42 (2005) . Los embriones (n=50) se trataron como es descrito. qPCR (recocido de 60°C) se realizó utilizando la Supermezcla Verde SYBR sobre el Sistema de Detección iQ5 Multicolor RTPCR (BioRad) (n=10 replicados) y los niveles de expresión relativos se determinaron. Los pares de cebadores para EP2 y EP4 se determinaron por métodos bien conocidos en la técnica. qPCR de RNA de KM completo ( n=15/variable ) se realizó en el día tres de post-irradiación como es descrito. Burns y colaboradores, 19 Genes Devel. 2331-42 (2005) . qPCR sobre RNA de célula S (recolectada en Stat-60, Tel-Test) se realizó utilizando el equipo Stratagene Sybrgreen sobre la máquina Stratagene qPCR. Las secuencias cebadoras de PG se determinaron por métodos bien conocidos en la técnica. Espectroscopia de Masas PGE2 y el metabolito de PGI2 estable, 6-ceto-PGFia, se midieron utilizando la espectrometría de masas en tándem de HPLC. Extractos de acetato de etilo de embriones homogenizados se recolectaron con el isótopo correspondiente estable marcado con estándares internos (c^ PGE2 y d4-6-ceto PGFia) y se dejaron reaccionar con metoxilamina . Las siguientes transiciones de masa se monitorearon : m/z 384?272 (PGE), m/z 39S-368 (6-ceto PGFi„ y TxB2). Ensayo de recuperación de radiación Peces cebra adultos se expusieron a 23 Gy de ?-irradiación. En el día dos de . post-irradiación, los peces se expusieron durante la noche al control DMSO, dmPGE2 (10 o 50 µ?) , Indotemacina (10 µ?) , SC560 (10 µ?) o NS398 (10 µ?) en agua de peces. La KM completa aislada en los días 0, 2, 4, 7, 10, 14 se sometió al análisis FACS de FSC/SSC para identificar linajes hematopoyéticos (n=5/tratamiento x 3 replicados) . Traver y colaboradores, 104 Blood 12980305 (2004) . Ensayos de diferenciación de células ES Los ensayos de diferenciación hematopoyéticos de células ES se realizaron como es descrito previamente. yba y colaboradores 100(1) P.N.A.S. 'EUA 11904-10 (2003); Wang y colaboradores, 102 P.N.A.S. EUA 19081-86 (2005). dmPGE2 (10, 20 o 100 µ ) o Indotemacina (20, 100 µ?) se adicionaron en el día cuatro y el día cinco durante la expansión de EB. La formación de colonia con metilcelulosa M3434 y los ensayos de colonia OP9 se condujeron en el día 6 y se analizaron en los días 8 y 5, respectivamente. El tipo de colonias se identificó mediante el análisis morfológico; las exposiciones químicas por duplicado se promediaron para determinar el número de colonias reportadas (n=3 replicados mínimo) . Unidades de formación de colonia-bazo (CFU-S) de murino Células BM de los férmurs de ratones C57B1/6 de 8 semanas de edad se incubaron ex vivo con (1 µ?/106 células) de dmPGE2, Indotemacina, SC560, NS398 o control EtOH sobre hielo por dos horas. Dos muestras de BM independientes se trataron (n=5/tratamiento x 2 replicados) para cada variable. Los ratones recipientes se irradiaron letalmente con una dosis dividida de 10 Gy. 6xl04 de dmPGE2 no fraccionado o células BM tratadas con control se inyectaron retroorbitalmente en- ratones recipientes irradiados. Los bazos se disectaron en el día ocho o doce, se pesaron y se fijaron con solución de Bouin; colonias hematopoyéticas por bazo se contaron. lxlO5 células/recipiente se transplantaron después del tratamiento con inhibidores cox . Las células BM de linaje" ckit+scal+ clasificadas con FACS se trataron como el lo anterior y se transplantaron en dosis en ya sea 100 células/recipiente o 300 células/recipiente. Lesión de médula ósea con 5-fiorouracilo Ratones se trataron con 5-FU (150 mg/kg) como es descrito. Venezia y colaboradores, 2004. SC560, NS398, dtnPGE2 (1 mg/kg) o control de EtOH se administraron mediante inyección IP en los días 1, 5, 9, 13 y 17 de post-inyección . La sangre periférica se obtuvo en el día siete y el día catorce, se cuantificó y se sometió al análisis FACS de multilinaje utilizando anticuerpos (eBioscience) a B220/IgM (B-linfoide) , CD4/8 (T-linfoide ) , Macl/Grl (mieloide), Terll9/CD71 (eritroide) y ckit/scal (madre/progenitora) . Los ratones se sacrificaron en el día 1, y la médula ósea se aisló, se cuantificó y se analizó mediante FACS. Transplante competitivo de dilución limitante BM de ratones C57B1/6 se incubó con dmPGE2 o control de EtOH ex vivo como es descrito. Las células de prueba tratadas se transplantaron independientemente y se irradiaron en recipientes CD45.2 ( n=5/variable x 2) con el competidor CD45.1/CD45.2 no tratado en las siguientes relaciones: 15,000:200,000 (0.075:1), 50,000:200,000 (0.25:1), 200,000:200,000 (1:1), 2,000,000:200,000 (10:1). La sangre periférica (PB) se obtuvo en seis, doce y veinticuatro semanas de post-transplante y los glóbulos blancos se analizaron por FACS para determinar la reconstitución de prueba para cada serie de poblaciones de tratamiento. La frecuencia del quimerismo de PB >5 se utilizó para calcular el número de células de repoblación utilizando el programa L-Cale (Stem Cell Technologies) . Para muestras de PB de doce semanas y veinticuatro semanas, la reconstitución de multilinaje se midió mediante el análisis FACS como en lo anterior . Ejemplo 2. Moduladores de HSC adicionales Los embriones de peces cebra se clasificaron como es descrito en lo anterior. Otro grupo de modificadores de HSC identificados por las técnicas descritas en la presente y abarcadas por la presente invención son modificadores de segundo mensajero cAMP/P13K/AKT, que pueden estar corriente debajo de la señalización de PG . Aquellos que inhiben HSC incluyen PD9805, KT5720, H89, U0126 y Wortmannina. Aquellos que aumentan HSC incluyen 8-bromo-cAMP y Forscolina. Otro grupo de modificadores de HSC que también puede actuar corriente abajo de la señalización de PG son los modificadores de segundo mensajero Ca2+. Estos incluyen inhibidores de HASC y aumentadores de HSC listados en Tabla 9: Tabla 9. Modificadores de segundo mensajero Ca2+ de ejemplo Un grupo adicional de modificadores de identificados por las técnicas de clasificación descritas la presente y abarcados por la presente invención son los modificadores de señalización de NO/Angiotensina, que pueden, interactuar con PG y la señalización de wnt . Estos incluyen inhibidores de HSC y aumentadores de HSC listados en la Tabla 10: Tabla 10. Modificadores de señalización de NO/Angiotensina ej emplo Inhibidores de HSC Aumentadores de HSC L-NAME L-Arg Enapril Nitroprúsido de Sodio Captopril Vanadato de Sodio AcsDKP Bradiquinina Losartan Telimasartán Histamina Ambroxol C isina Cicloheximida Azul de Metileno Epinefriña Dexametasona Proadifen Isotiocianato de Bencilo Efedrina Los métodos de clasificación de peces cebra de la presente invención también se aplicaron para identificar otros moduladores de HSC cuyas interacciones con la señalización de PG o wnt están actualmente no claras. Estos compuestos, también abarcados por la presente invención, incluyen aquellos que ya sea inhiben o aumentan las HSCs como es indicado en la Tabla 11: Tabla 11. Moduladores de HSC de ejemplo. Inhibidores de HSC Aumentadores de HSC Paragilina Meberina Propanolol Flurandrenolido Etanidazol Atenolol Metimazol Pindolol Cinoxacina Gaboxadol Penicilamina Ácido quinurénico Furosemida Hidralazina Eburnamininona Tiabendazol Aclararubícina Bicuclina Warfarina Vesamicol Acido Gamma Aminobutírico Peruvósido Noretindrona Imipramina Lupinidina Clorpropamida Hidroquinidina 1, 5- Pentametilentretazol Todralazina 4 -Ami opiridina Metoxamina Día zóxido Hidroxiurea Benfotiamina Dihidroergotamina Ácido 12-Metoxidodecenoico Antazolina N-Formil-Met-Leu-Phe Ácido 3-Nitropropiónico Galamina Ácido N-Fenilantranilico IAA 94 Fenazopiridina Clorotrianiseno Acido Dicloroquinurénico 3-estradiol L-Leu Fenoxibenzamina Mefentermina Guvacina ' Guaiazuleno Imidazol Beta-Caroteno Clofibrato

Claims (14)

1. • REIVINDICACIONES 1. Un método para promover el crecimiento de células- madre hematopoyéticas en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar por lo menos un modulador de células madre hematopoyéticas (HSC) ¦ y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el modulador de HSC se selecciona del grupo que consiste de PGE2, PGI2, Ácido Linoleico, 13(s)-HODE, LY171883, Ácido de Aguamiel, Ácido Eicosatrienoico, Ácido Epoxieicosatrienoico, ONO-259, Cay 1039, un agonista de receptor de PGE2, de 16, 16-dimetil PGE2, 19 (R) -hidroxi PGE2, 16, 16-dimetil ' PGE2 p- (p-acetamidobenzainido) éster fenilico, ll-deoxi-16, 16-dimetil PGE2, 9-deoxi-9-metilen-16, 16-dimetil PGE2, 9-deoxi-9-metilen PGE2, Butaprost, Sulprostona, PGE2 serinol amida, Éster metílico de PGE2, 16-fenil tetranol PGE2, 15 (S) -15-metil PGE2 y 15 (R) -15-metil PGE2, BIO, 8-bromo-cAMP, Forscolina, Bapta-AM, Fendilina, Nicardipina, Nifedipina, Pimozido, Estrofantidina , Lanatósido, L-Arg, Nitroprúsido de Sodio, Vanadato de Sodio, Bradiquinina , Mebeverina, Flurandrenólido, Atenolol, Pindolol, Gaboxadol, Ácido Kinurenico, Hidralazina, Tiabendazol, Bicuclina, Vesamicol, Peruvósido, Imipramina, Clorpropamida, 1 , 5-Pentametilentetrazol , -Aminopiridina , Diazóxido, Benfotiamina , Ácido 12- etoxidodecenoico, N-Formil-Met-Leu-Phe, Galamina, IAA 94, Clorotrianiseno y derivados de los mismos.
2. 2. Un método para promover la expansión de HSC ex vivo, caracterizado porque comprende incubar HSCs en la presencia de por lo menos un modulador de HSC seleccionado del grupo que consiste de PGE2, dmPGE2, PGI2, Ácido Linoleico, 13(s)-HODE, LY171883, Ácido de Aguamiel, Ácido Eicosatrienoico, Ácido Epoxieicosatrienoico, ONO-259, Cay 1039, un agonista de receptor de PGE2, de 16, 16-dimetil PGE2, 19 (R) -hidroxi PGE2, 16, 16-dimetil PGE2 p- (p-acetamidobenzainido ) éster fenilico, ll-deoxi-16, 16-dimetil PGE2, 9-deoxi-9-metilen-16, 16-dimetil PGE2, 9-deoxi-9-metilen PGE2, Butaprost, Sulprostona, PGE2 serinol amida, Éster metílico de PGE2, 16-fenil tetranol PGE2, 15 (S) -15-metil PGE2 y 15 (R) -15-metil PGE2, BIO, 8-bromo-cAMP, Forscolina, Bapta-AM, Fendilina, Nicardipina, Nifedipina, Pimócido, estrofantidina, Lanatósido, L-Arg, Nitroprúsido de Sodio, Vanadato de Sodio, Bradiquinina , Mebeverina, Flurandrenólido, Atenolol, Pindolol, Gaboxadol, Ácido Kinurenico, Hidralazina, Tiabendazol, Bicuclina, Vesamicol, Peruvósido, Imipramina, Clorpropamida , 1 , 5-Pentametilentetrazol , 4-Aminopiridina, Diazoxido, Benfotiamina , Ácido 12-Metoxidodecenoico, N-Formil-Met-Leu-Phe, Galamina, IAA 94, Clorotrianiseno y derivados de los mismos.
3. 3. Un método para promover la expansión de HSC ex vivo, caracterizado porque comprende incubar HSCs en la presencia de por lo menos un modulador de HSC seleccionado del grupo que comprende PGE2, 16, 16-dimetil-PGE2, PGI2, Ácido Linoleico, 13(s)-HODE, LY171883, Ácido de Aguamiel, Ácido Eicosatrienoico, Ácido Epoxieicosatrienoico, ONO-259, Cay 1039, un agonista de receptor, de PGE2 y derivados de los mismos.
4. 4. Un equipo para la recolección y almacenamiento de una muestra de fuente de HSC, caracterizado porque comprende un contenedor de almacenamiento criogénico precargado con una cantidad adecuada de un modulador de HSC que incrementa HSCs.
5. 5. Un equipo para recolección y almacenamiento de una muestra de fuente de HSC, caracterizado porque comprende un contenedor de almacenamiento criogénico y un frasquito que contiene una cantidad adecuada de un modulador de HSC que incrementa HSCs.
6. 6. El equipo de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque el modulador de HSC se selecciona del grupo que consiste de PGE2, PGI2, Ácido Linoleico, 13 (s)-HODE, LY171883, Ácido de Aguamiel, Ácido Eicosatrienoico, Ácido Epoxieicosatrienoico, ONO-259, Cay 1039, un agonista de receptor de PGE2, de 16, 16-dimetil PGE2, 19 (R) -hidroxi PGE2, 16, 16-dimetil PGE2 p- (p-acetamidobenzainido) éster fenilico, ll-deoxi-16, 16-dimetil PGE2, 9-deoxi-9-met ilen-16, 16-dimetil PGE2, 9-deoxi-9-metilen PGE2, Butaprost, Sulprostona, PGE2 serinol amida, Éster metílico de PGE2, 16-fenil tetranol PGE2, 15 (S) -15-metil PGE2 y 15 (R) -15-metil PGE2 , BIO, 8 -bromo-cAMP, Forscolina, Bapta-??, Fendilina, Nicardipina, Nifedipina, Pimócido, estrofantidina , Lanatósido, L-Arg, Nitroprúsido de Sodio, Vanadato de Sodio, Bradiquinina , Mebeverina , Flurandrenól'ido, Atenolol, Pindolol, Gaboxadol, Ácido Kinurenico, Hidralazina, Tiabendazol, Bicuclina, Vesamicol, Peruvósido, Imipramina, Clorpropamida , 1,5-Pentametilentetrazol , -Aminopiridina , Diazóxido, Benfotiamina , Ácido 12-Metoxidodecenoico, N-Formil- et-Leu-Phe, Galamina, IAA 94, Clorotrianiseno y derivados de los mismos .
7. 7. El equipo de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque la muestra de fuente de HSC es sangre de cordón umbilical humano. •
8. 8. El equipo de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque el modulador de HSC es PGE2 o 16, 16-dimetil-PGE2.
9. 9. Un contenedor de almacenamiento criogénico, caracterizado porque comprende una cantidad adecuada de un modulador de HSC que incrementa HSCs.
10. 10. El contenedor de almacenamiento criogénico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el modulador de HSC se selecciona del grupo que consiste de PGE2, PGI2, Ácido Linoleico, 13(s)-HODE, LY171883, Ácido de Aguamiel, Ácido Eicosatrienoico, Ácido Epoxieicosatrienoico, ONO-259, Cay 1039, un agonista de receptor de PGE2 , de 16,16-dimetil PGE2, 19 (R) -hidroxi PGE2, 16, 16-dimetil PGE2 p- (p-acetamidobenzainido) éster fenilico, ll-deoxi-16, 16-dimetil PGE2, 9-deoxi-9-metilen-16, 16-dimetil PGE2, 9-deoxi-9-metilen PGE2, Butaprost, Sulprostona, PGE2 serinol amida, Éster metílico de PGE2, 16-fenil tetranol PGE2, 15 (S) -15-metil PGE2 y 15 (R) -15-metil PGE2, BIO, 8-bromo-cAMP, Forscolina, Bapta-??, Fendilina, Nicardipina, Nifedipina, Pimócido, estrofantidina , Lanatósido, L-Arg, Nitroprúsido de Sodio, Vanadato de Sodio, Bradiquinina , Mebeverina, Flurandrenólido, Atenolol, Pindolol, Gaboxadol, Ácido Kinurenico, Hidralazina, Tiabendazol, Bicuclina, Vesamicol, Peruvósido, Imipramina, Clorpropamida, 1, 5-Pentametilentetrazol, · 4 -Aminopiridina , Diazoxido, Benfotiamina , Ácido 12-Metoxidodecenoico, . N-Formil-Met-Leu-Phe, Galamina, IAA 94, Clorot ianiseno y derivados de los mismos.
11. 11. El contenedor de almacenamiento criogénico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el modulador de HSC es PGE2 o 16, 16-dimetil-PGE2.
12. 12. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una HSC de mamífero y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde la HSC se deriva de sangre del cordón umbilical y se ha puesto en contacto con un modulador de HSC que incrementa HSCs .
13. 13. Un método para inhibir el crecimiento de HSC en ] 10 un sujeto, caracterizado porque comprende administrar por lo menos un modulador de HSC y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el modulador de HSC se selecciona del grupo que consiste de Indometacina , Indotemacina , Fenbufen, NS398, SC560, Sulindac, Suxibuzona, Aspirina, Naproxen, Ibuprofen, Celecoxib, PGJ2, Ácido Aristolóquico, AH6809, AH23848, Kenpaulona, Acido Valproico, PD98059, KT5720, H89, U0126, ortmannina, BayK 8644, Tiridazina, L-NAME, Enalapril, Captopril, AcSDKP, Losartan, AcSDKP, Losartan, Telimasartan, Histamina, Ambroxol, Crisina, Cicloheximida , Azul de Metileno, Epinefrina, Dexameta zona , Proadifen, Isotiocianato de bencilo, Efedrina, Paragilina, Propranolol, Etanidazol, Metimazol, Cinoxacina, Penicilamina , Furosamida, Eburnamininona , Aclarubicin, arfarina, Ácido gamma-aminobutírico, Noretindrona , Lupinidina, Hidroquinidina, Todralazina, etoxamina , Hidroxiurea, Dihidroergotamina , Antazolina, Ácido 3-Nitropropiónico, Ácido N- Fenilantranílico, Fenazopiridina , Ácido Dicloroquinurénico, 3-estradiol, L-Leu, Fenoxibenzamina , Mefentermina , Guvacina, Guaiazuleno, Imidazol, Beta-Caroteno, Clorfibrato, un antagonista del receptor PGE2 y derivados de los mismos.
14. 14. Un método para inhibir el crecimiento de HSC en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar por lo menos un modulador de HSC y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el modulador de HSC se selecciona del grupo que consiste de Indometacina , Fenbufen, NS398, SC560, Sulindac, Suxibuzona, Aspirina, Naproxen, Ibuprofen, Celecoxib, PGJ2, Ácido Aristolóquico, AH6809, AH23848 y derivados de los mismos.