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MX2008011625A - Semilla y composiciones de aceite de soya y metodos para hacer los mismos. - Google Patents

Semilla y composiciones de aceite de soya y metodos para hacer los mismos.

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Publication number
MX2008011625A
MX2008011625A MX2008011625A MX2008011625A MX2008011625A MX 2008011625 A MX2008011625 A MX 2008011625A MX 2008011625 A MX2008011625 A MX 2008011625A MX 2008011625 A MX2008011625 A MX 2008011625A MX 2008011625 A MX2008011625 A MX 2008011625A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
soybean
fad3
gene
transgene
plant
Prior art date
Application number
MX2008011625A
Other languages
English (en)
Inventor
Joanne J Fillatti
Toni Voelker
Tim Ulmasov
Greg E Keithly
Original Assignee
Monsanto Technology Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38510177&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MX2008011625(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Monsanto Technology Llc filed Critical Monsanto Technology Llc
Publication of MX2008011625A publication Critical patent/MX2008011625A/es

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Abstract

Se revelan métodos para obtener plantas de soya que producen semillas con bajos niveles de ácido linolénico y niveles oleicos moderadamente elevados; también se revelan métodos para producir semillas con bajos niveles de ácido linolénico, niveles oleicos moderadamente elevados y niveles de ácido graso saturado bajos; estos métodos conllevan la combinación de transgenes que proporcionan niveles moderados de ácido oleico con germoplasma de soya que contiene mutaciones en genes de soya que confieren fenotipos de ácido linolénico bajos; estos métodos también conllevan la combinación de transgenes que proporcionan tanto niveles moderados de ácido oleico y niveles de grasa saturada bajos con germoplasma de soya que contiene mutaciones en genes de soya que confieren fenotipos de ácido linolénico bajos; también se describen plantas y semillas de soya producidas por estos métodos.

Description

SEMILLA DE SOYA Y COMPOSICIONES DE ACEITE Y METODOS PARA HACER LAS MISMAS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad a la solicitud de patente provisional de E.U.A. No. 60/781 ,519 presentada el 10 de marzo de 2006 que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.
Incorporación de listado de secuencias Una copia en papel del listado de secuencias y una forma legible por computadora del listado de secuencias en diskette, que contiene el archivo denominado "38-77(54449) SEQ LIST", que es de 71 ,278 bytes en tamaño (medido en MS-DOS), se incorporan aquí por referencia. Este listado de secuencias consiste de SEQ ID NOS:1 -63.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION 1. Campo de la invención Esta invención se refiere generalmente a métodos para hacer planas de soya que produce semillas de soya con composiciones de aceite alteradas y, muy particularmente, a métodos en donde se produce semilla de soya con un fenotipo de ácido oleico medio, ácido linolénico bajo o semilla de soya con un fenotipo de ácido oleico medio, ácido graso saturado bajo, ácido linolénico bajo. 2. Técnica relacionada Los aceites vegetales se usan en una variedad de aplicaciones.
Composiciones de aceite vegetal novedosas y enfoques mejorados para obtener composiciones oleosas, de fuentes biosintéticas o de plantas naturales, son necesarios. Dependiendo del uso del aceite destinado, se desean varias composiciones de ácido graso diferentes. Las plantas, especialmente especies que sintetizan grandes cantidades de aceites en semillas, son una fuente importante de aceites tanto para usos comestibles como industriales. Los aceites de semilla están compuestos casi en su totalidad de triacilgliceroles en los cuales los ácidos grasos son esterificados a los tres grupos hidroxilo de glicerol. El aceite de soya típicamente contiene aproximadamente 16- 20% de ácidos grasos saturados: 13-16% de palmitato y 3-4% de estearato. Véase generalmente Gunstone et al., The Lipid Handbook, Chapman & Hall, London ( 994). Los aceites de soya han sido modificados por varios métodos de reproducción para crear beneficios para mercados específicos. Sin embargo, un aceite de soya que es ampliamente benéfico para usuarios de aceite de soya mayor tales como consumidores de aceite para ensaladas, aceite para cocinar y aceite para freír, y mercados industriales tales como mercados de biodiesel y biolubricación, no están disponibles. Los aceites de soya anteriores en donde o bien eran demasiado costosos o carecían de una propiedad de calidad alimenticia importante tales como estabilidad oxidativa, buen sabor del alimento frito o contenido de grasas saturadas, o una propiedad de biodiesel importante tal como emisiones de óxido nítrico apropiadas o tolerancia al frío o flujo en frío. Las plantas superiores sintetizan ácidos grasos por medio de una vía metabólica común - la vía de ácido graso sintetasa (FAS), que está localizada en los plástidos. Las ß-cetoacil-ACP sintasas son enzimas limitantes de velocidad importantes en la FAS de células vegetales y existen en varias versiones. La ß-cetoacil-ACP sintasa I cataliza alargamiento de cadena a palmitoil-ACP (C16:0), mientras que la ß-cetoacil-ACP sintasa II cataliza el alargamiento de cadena a estearoil-ACP (C18.0). La ß-cetoacil-ACP sintasa IV es una variante de ß-cetoacil-ACP sintasa II, y también puede catalizar alargamiento de cadena a 18:0-ACP. En soya, los productos mayores de FAS son 16:0-ACP y 18:0-ACP. La desaturación de 18:0-ACP para formar 18:1 -ACP es catalizada por una delta-9-desaturasa soluble localizada en plástidos (también referida como "estearoilo-ACP desaturasa"). Véase Voelker et al., 52 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 335-61 (2001 ). Los productos de la FAS de plástidos y delta-9-desaturasa, 16:0- ACP, 18:0-ACP, y 18:1 -ACP, son hidrolizados por tioesterasas específicas (FAT). Las tioesterasas vegetales se pueden clasificar en dos familias de genes basadas en homología de secuencia y preferencia de sustrato. La primera familia, FATA, incluye acil-ACP-tioesterasas de cadena larga que tienen actividad principalmente sobre 18.1 -ACP. Las enzimas de la segunda familia, FATB, comúnmente utilizan 16:0-ACP (palmitoil-ACP), 18:0-ACP (estearoil-ACP), y 18:1 -ACP (oleoil-ACP). Dichas tioesterasas tienen un papel importante en la determinación de la longitud de cadena durante la biosíntesis de ácido graso de novo en plantas, y por lo tanto esas enzimas son útiles para proveer varias modificaciones de composiciones de acilo graso, particularmente con respecto a las proporciones relativas de varios grupos acilo graso que están presentes en aceites de almacenamiento de semilla. Los productos de las reacciones de FATA y FATB, los ácidos grasos libres, dejan los plástidos y se convierten a sus acil-CoA ésteres respectivos. Los Acil-CoAs son sustratos para la vía de biosíntesis de lípidos (vía de Kennedy), que está localizada en retículo endoplásmico (ER). Esta vía es responsable de formación de lípidos de membrana así como de la biosíntesis de triacilgliceroles, que constituyen el aceite de semilla. En el ER hay desaturasas unidas a membranas adicionales, que pueden desaturar adicionalmente 18:1 a ácidos grasos poliinsaturados. Una delta-12-desaturasa (FAD2) cataliza la inserción de un doble enlace a 18:1 (ácido oleico), formando ácido linoleico (18:2). Una delta-15-desaturasa (FAD3) cataliza la inserción de un doble enlace a 18:2, formando ácido linolénico (18:3). Se ha mostrado que la inhibición del gen FAD2 endógeno a través del uso de transgenes que inhiben la expresión de FAD2 confiere un fenotipo de un ácido oleico medio deseable (18:1 ) (es decir, semilla de soya que comprende 50% y 75% de ácido oleico en peso). Los transgenes y plantas transgénicas que proveen la inhibición de la expresión de gen FAD2 endógeno y un fenotipo oleico medio se describen en la patente de E.U.A. No. 7,067,722. Por el contrario, las plantas de soya de tipo silvestre que carecen de transgenes inhibidores de FAD2 típicamente producen semilla con composiciones de ácido oleico de menos de 20%. El aceite de soya típicamente contiene aproximadamente 8% de ácido linolénico (18:3) que da por resultado estabilidad y sabor reducidos. Los niveles de ácido linolénico (18:3) en aceite de soya se pueden reducir mediante la hidrogenación para mejorar tanto la estabilidad como el sabor (Dutton et al., 1951 ; Lui y White, 1992). Infortunadamente, la hidrogenación da por resultado la producción de ácidos grasos trans, que incrementan el riesgo de enfermedad cardiaca coronaria cuando se consume (Hu et al., 1997). La reproducción convencional también se ha usado para generar líneas de soya con los niveles linolénicos variando de 1 %-6% (Ross et al. Crop Science, 40:383; 2000; Wilson et al. J. Oleo Sci., 50:5, 87, 2001 : Wilson Lipid Technology Sept. 1999). Variedades de soya de ácido linolénico bajo se han producido a través de mutación, selección y reproducción (Fehr et al., 1992; Rahman y Takagi, 1997; Ross et al., 2000; Byrum et al., 1997; Stoisin et al., 1998). Ciertas variedades de soya con un contenido de ácido linolénico de aproximadamente 1% o menor se han obtenido (patentes de E.U.A. Nos. 5,534,425 y 5,714,670). Muy recientemente, métodos para obtener plantas de soya con niveles bajos de ácido linolénico así como rendimiento y características de crecimiento de variedades de soya agronómicamente de élite se han descrito (solicitud de patente de E.U.A. 2006/0107348). El ácido oleico tiene un doble enlace, pero aún es relativamente estable a altas temperaturas, y los aceites con altos niveles de ácido oleico son adecuados para cocinar y otros procesos en donde se requiere calentamiento. Recientemente, el consumo incrementado de ácidos oleicos altos ha sido recomendado, porque el ácido oleico parece reducir los niveles en la sangre de lipoproteínas de baja densidad ("LDLs") sin afectar los niveles de lipoproteínas de alta densidad ("HDLs"). Sin embargo, alguna limitación de los niveles de ácido oleico es deseable, porque cuando el ácido oleico es degradado a altas temperaturas, crea compuestos de sabor negativo y disminuye los sabores positivos creados por la oxidación de ácido linoleico. NET et al., JAOCS, 77:1303-1313 (2000); Warner et al., J. Agrie. Food Chem. 49:899-905 (2001 ). Por lo tanto, es preferible usar aceites con niveles de ácido oleico que sean de 65-85% o menos en peso, a fin de limitar sabores desagradables en aplicaciones alimenticias tales como aceite para freír y alimento frito. Otros aceites preferidos tienen niveles de ácido oleico que son mayores de 55% en peso a fin de mejorar la estabilidad oxidativa. Para muchas aplicaciones de aceite, los niveles de ácido graso saturado menores de 8% en peso o incluso menores de aproximadamente 2-3% en peso son deseables. Los ácidos grasos saturados tienen puntos de fusión altos que son indeseables en muchas aplicaciones. Cuando se usan como un material de alimentación o combustible, los ácidos grasos saturados producen turbidez a bajas temperaturas, y confieren propiedades de flujo en frío eficientes tales como puntos de vaciado y puntos de taponamiento de filtro en frío al combustible. Los productos de aceite que contienen niveles de ácido graso saturado bajos pueden ser preferidos por los consumidores y la industria de alimentos debido a que se perciben como más sanos y/o pueden ser marcados como "ácidos grasos saturados" de conformidad con los lineamientos de la FDA. Además, los aceites saturados bajos reducen o eliminan la necesidad de acondicionar para el invierno el aceite para aplicaciones alimenticias tales como aceites para ensaladas. En aplicaciones de biocombustible y lubricante, los aceites con bajos niveles de ácido graso saturado confieren propiedades de flujo en frío mejoradas y no se enturbian a bajas temperaturas. Las líneas de soya que producen semilla con contenido de ácido linoleico bajo, oleico medio serían muy deseables. Infortunadamente, los intentos para combinar los rasgos de ácido oleico medio y ácido linolénico bajo mediante enfoques de ingeniería genética han sido problemáticos. Las líneas transgénicas en donde tanto los genes de delta-12 desaturasa (FAD2) como de delta-15-desaturasa (FAD3) han sido suprimidos tienen semilla con bajos niveles linolénicos, pero los niveles de ácido oleico están típicamente por arriba del intervalo definido para oleico medio. Sin embargo, los métodos descritos aquí permiten la producción de semillas de soya con ácido linolénico bajo que también tienen niveles de ácido oleico en el intervalo de ácido oleico medio de 55-80%. Además estos métodos no implican procesos de hidrogenación y por lo tanto evitan la producción de grasas trans indeseables. Las líneas de soya que producen semilla con contenido de ácido oleico bajo, ácido graso saturado bajo, ácido linoleico bajo serían también muy deseables. Los métodos descritos aquí permiten la producción de semillas de soya de ácido linolénico bajo que también tienen niveles de ácido oleico en el intervalo de oleico medio de 55-80% y de niveles de ácido graso saturado menores de 8%.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En vista de los problemas anteriores se desarrolló la presente invención. La invención primero se refiere a un método de producción de una planta de soya que comprende un contenido de ácido linolénico menor que aproximadamente 6% de ácidos grasos de semilla total en peso y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% de ácidos grasos de semilla total en peso. El método de la invención se realiza por un primer paso de hacer una o más plantas de soya que comprenden un transgén que disminuye la expresión de un gen de FAD2-1 de soya endógeno y por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen de FAD3 de soya endógeno, un segundo paso de obtener por lo menos semilla de dicha planta de soya obtenida a partir del primer paso, un tercer paso de determinar un porcentaje del contenido de ácido graso de semilla total en peso de ácido linolénico y ácido oleico para la semilla a partir del segundo paso, y después identificar una planta de soya que produzca semilla que tenga una composición de ácido graso de semilla que comprenda un contenido de ácido linolénico menor que aproximadamente 6% de ácidos grasos de semilla total en peso y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% de ácidos grasos de semilla total en peso. En otras modalidades de este método, las plantas de soya que se hacen en el primer paso comprenden por lo menos dos mutaciones de pérdida de función en por lo menos dos genes de FAD3 de soya endógena. Estas mutaciones de pérdida de función se pueden localizar en los genes FAD3-1 B y FAD3-1 C de soya endógenos. En esta modalidad del método, las plantas de soya identificadas en el tercer paso del método comprenden un contenido de ácido linolénico menor que aproximadamente 3% de los ácidos grasos de semilla total en peso y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% de los ácidos grasos de semilla total en peso. En ciertas modalidades de este método, el transgén puede comprender además un transgén que confiera tolerancia a herbicidas. El transgén de tolerancia a herbicidas puede conferir tolerancia a glifosato. En modalidades específicas de la invención, el transgén comprende secuencias localizadas entre las secuencias limítrofes de T-ADN de pMON68504, pCGN5469, pCGN5471 , o pCGN5485 que se integran en un cromosoma de dicha planta. En el tercer paso del método, el porcentaje del contenido de ácido graso de semilla total en peso de ácido linolénico y ácido oleico se determina por una técnica de análisis de lípido. Esta técnica de análisis de lípido comprende una o más técnicas seleccionadas del grupo que consiste de cromatografía de gases/detección por ionización de llama, cromatografía de gases/espectroscopia de masa, cromatografía de capa delgada/detección de ionización de llama, cromatografía de líquidos/espectrometría de masa, cromatografía de líquidos/ionización por electroaspersión-espectrometría de masa y cromatografía de líquidos/ionización por electroaspersión-espectroscopía de masa en tándem. La planta de soya que comprende un transgén que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 de soya endógeno y por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno se puede hacer cruzando una primera línea progenitora de soya que comprende el transgén con una segunda línea progenitora de soya que comprende por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno para obtener una planta de soya F1 que es heterocigótica para el transgén y heterocigótica para por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FD3 y después autoreproducir plantas de progenie F1 de la cruza para obtener una planta de soya F2 que es homocigotica para dicho transgén y homocigotica para por lo menos una mutación de pérdida de función de un gen FAD3. En ciertas modalidades de este método, la segunda línea progenitora de soya comprende por lo menos dos mutaciones de pérdida de función en por lo menos dos genes FAD3 de soya endógenos. Los dos genes FAD3 de soya endógenos pueden ser FAD3-1 B y FAD3-1 C. En este método, la planta de soya F1 que es heterocigótica para el transgén y para por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 se obtiene en el paso (i) sometiendo una pluralidad de plantas F1 para por lo menos una técnica de análisis de ADN que permite la identificación de una planta F1 que es heterocigótica para dicho transgén y para por lo menos una mutación de pérdida de función de un gen FAD3. De manera similar, la planta de soya F2 que es homocigótica para el transgén y homocigótica para por lo menos una mutación de pérdida de función de un gen FAD3 se obtiene en el paso (ii) sometiendo una pluralidad de plantas F2 a por lo menos una técnica de análisis de ADN que permite la identificación de una planta F2 que es homocigótica para dicho transgén y homocigótica para por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3. La técnica de análisis de ADN comprende una o más técnicas seleccionadas del grupo que consiste de análisis de PCR, análisis de PCR cuantitativo, análisis de SNP, análisis de AFLP, análisis de RFLP y análisis de RAPD. En ciertas modalidades de esta invención, la técnica de análisis de ADN comprende la detección de por lo menos un polimorfismo de un solo morfismo en una posición en la secuencia de gen FAD3-1C correspondiente al nucleótido 687, 1129, 1203, 2316, 3292, 3360 ó 3743 de SEQ ID NO: 62, detección de una deleción en el gen FAD3-1 C de SEQ ID NO: 62, o detección de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido en una secuencia de promotor de FAD3-1 C de soya que corresponde a una guanina en el nucleótido 334, una citosina en el nucleótido 364, una timina en el nucleotido 385, una adenina en el nucleotido 386, una citosina en el nucleotido 393, una guanina en el nucleotido 729 y una citosina en el nucleotido 747 de SEQ ID NO: 63. En otras modalidades de esta invención, la técnica de análisis de ADN comprende la detección de un polimorfismo de un solo nucleotido en un gen FAD3-1 B de soya que comprende una sustitución de un residuo de citosina por residuo de timina en la posición de la secuencia de gen FAD3-1 b correspondiente al nucleotido 2021 de SEQ ID NO: 61. En este método, el transgén puede comprender además un transgén que confiere tolerancia a herbicidas y la planta de soya F1 que es heterocigótica para dicho transgén se obtiene en el paso (i) sometiendo una pluralidad de plantas F1 a selección de herbicidas para dicho transgén. De manera similar, cuando el transgén además comprende un transgén que confiere tolerancia a herbicidas, una pluralidad de plantas F2 enriquecidas para plantas de soya F2 que son homocigóticas para dicho transgén se obtienen en el paso (ii) sometiendo la pluralidad de plantas F2 a selección de herbicidas para dicho transgén. Este método también puede comprender además el paso (¡ii) de autoreproducir la planta de progenie F2 que son homocigóticas para el transgén y homocigóticas para por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 del paso (ii) para obtener una planta de soya F3. Un método alternativo de hacer plantas de soya que comprende un transgén que disminuye la expresión de un gen FD2-1 de soya endógeno y por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno implica la transformación directa de plantas de soya o células que comprenden la mutación con el transgén. Por lo tanto, esta planta de soya se hace en el primer paso de la invención transformando una planta de soya o célula vegetal que comprende por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno con un transgén que disminuye la expresión del gen FAD2- de soya endógeno para obtener una planta de soya RO con por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 que es heterocigótico para dicho transgén, auto-reproduciendo la planta de progenie RO del paso anterior para obtener una planta de soya R1 que es homocigótica para el transgén y homocigótica para por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3, obteniendo así una planta de soya que comprende un transgén que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 de soya endógeno y por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FD3 de soya endógeno. En ciertas modalidades de este método, el transgén además comprende secuencias que confieren un rasgo de tolerancia a herbicidas. En otras modalidades de la invención, el transgén además comprende secuencias que confieren tolerancia a glifosato. Esta invención también abarca plantas de soya producidas por los métodos antes mencionados de la invención así como partes de plantas de plantas de soya producidas por los métodos de la invención. La parte de planta de soya producida pueden ser un polen, un óvulo, un meristema, una hoja, un tallo, una raíz o una célula. Las plantas de soya de progenie de las plantas de soya producidos por estos métodos también se contemplan en esta invención. La invención también abarca semillas de la planta de soya producidas por los métodos de la invención, en donde la semilla tiene una composición de ácido graso que comprende un contenido de ácido linolénico menor que aproximadamente 6% en peso de los ácidos grasos de semilla totales y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% en peso de los ácidos grasos de semilla totales. La invención además abarca semilla de la planta de soya producida por métodos en donde las plantas de soya que comprende por lo menos dos mutaciones de pérdida de función en por lo menos dos genes FAD3 de soya endógeno se usan, dicha semilla teniendo una composición de ácido graso que comprende un contenido de ácido linolénico menor que aproximadamente 3% en peso de los ácidos grasos de semilla totales y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% en peso de los ácidos grasos de semilla totales. Esta invención también provee un método para obtener una planta de soya con una composición de ácido graso de aceite de semilla alterado que comprende los pasos de: a) cruzar una primera línea progenitora de soya que tiene una composición de ácido graso de aceite de semilla que comprende un contenido de ácido linolénico menor que aproximadamente 3% de los ácidos grasos totales en peso con una segunda línea progenitora de soya que tiene una composición de ácido graso de aceite de semilla en donde el contenido de por lo menos un ácido graso distinto al ácido linoleico es alterado por lo menos en 50% cuando se ocmpara con el contenido de ácido graso correspondiente de un aceite de soya del producto, dicha segunda línea progenitora de aceite de soya comprende un transgén que altera el contenido de por lo menos un ácido graso distinto al ácido linoleico; y b) obtener una planta de progenie que presente una composición de ácido graso de aceite de semilla que comprende un contenido de ácido linolénico menor que 3% de ácidos grasos totales en peso y un contenido de por lo menos un ácido graso distinto al ácido linoleico que es alterado por lo menos en 50% cuando se compara con el contenido de ácido graso correspondiente de un aceite de soya de producto, obteniendo así una planta de soya con una composición de ácido graso de aceite de semilla alterada. En este método, el ácido graso distinto al ácido linolénico se selecciona del grupo que consiste de ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido estearidónico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido ?-linoleico, ácido eicosapentanoico y ácido decosahexanoico. La invención también se refiere a un método para producir una planta de soya que comprende un contenido de ácido linolénico menor que aproximadamente 6% de ácidos grasos de semilla totales en peso, un contenido de ácido graso saturado menor que aproximadamente 8% en peso y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% de ácidos grasos de semilla totales en peso. Este método de la invención se lleva a cabo por un primer paso de hacer una o más plantas de soya que comprende por lo menos un transgén que disminuye la expresión tanto de FAD2-1 endógeno como el gen FATB endógeno, y por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 endógeno, un segundo paso de obtener por lo menos una semilla de dicha planta de soya obtenida por el primer paso, un tercer paso de determinar un porcentaje del contenido de ácido graso de semilla total en peso de ácido linolénico, ácidos grasos saturados y ácido oleico para la semilla del segundo paso, y después identificar una planta de soya que produce semilla que tiene una composición de ácido graso de semilla que comprende un contenido de ácido linolénico menor que aproximadamente 6% en peso de los ácidos grasos de semilla totales, un contenido de ácido graso saturado menor que aproximadamente 8% en peso y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% de ácidos grasos de semilla totales en peso. En otras modalidades de este método, las plantas de soya que se hacen en el primer paso comprenden por lo menos dos mutaciones de pérdida de función en por lo menos dos genes FAD3 de soya endógenos. Estas mutaciones de pérdida de función se pueden localizar en los genes FAD3-1 B y FAD3-1C de soya endógenos. En esta modalidad del método, las plantas de soya identificadas en el tercer paso del método pueden comprender un contenido de ácido linolénico menor que aproximadamente 3% de ácidos grasos de semilla totales en peso, un contenido de ácidos grasos saturado menor que aproximadamente 8% en peso y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% de ácidos grasos de semilla totales en peso. En ciertas modalidades de este método, el transgén puede comprender además un transgén que confiere tolerancia a herbicidas. El transgén puede conferir tolerancia a glifosato. El transgén que confiere resistencia a glifosato puede codificar un gen CP4EPSPS. En el tercer paso del método, el porcentaje del contenido de ácido graso de semilla total en peso de ácido linolénico, ácidos grasos saturados y ácido oleico se determina por una técnica de análisis de Iípido. La técnica de análisis de Iípido comprende una o más técnicas seleccionadas del grupo que consiste de cromatografía de gases/detección por ionización de flama, cromatografía de gases/espectroscopia de masa, cromatografía de capa delgada/detección por ionización de flama, cromatografía de líquidos/espectrometría de masa, cromatografía de líquidos/ionización por electroaspersión-espectrometría de masa y cromatografía de líquidos/ionización por electroaspersión-espestroscopía de masa en tándem. La planta de soya que comprende por lo menos un transgén que disminuye la expresión tanto de un gen FAD2-1 de soya endógeno como un gen FATB endógeno y por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 endógeno se puede hacer cruzando una primera línea progenitora de soya que comprende el transgén con una segunda línea progenitora de soya que comprende por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno para obtener una planta de soya F1 que es heterocigótica para el transgén(s) y heterocigótica para por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 y después autoreproducir plantas de progenie F1 de la cruza para obtener una planta de soya F2 que es homocigótica para dicho transgén y homocigótica para por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3. En ciertas modalidades de este método, la segunda línea progenitora de soya comprende por lo menos dos mutaciones de pérdida de función en por lo menos dos genes FAD3 de soya endógenos. Los dos genes FAD3 de soya endógenos pueden ser FAD3-1 B y FAD3-1 C. En este método, la planta de soya F1 que es heterocigótica para el transgén y por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 se obtiene en el paso (i) sometiendo una pluralidad de plantas F1 a por lo menos una técnica de análisis de ADN que permite la identificación de una planta F1 que es heterocigótica para dicho transgén y para por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3. De manera similar, la planta de soya F2 que es homocigótica para el transgén y homocigótica para por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 se obtiene en el paso (ii) sometiendo una pluralidad de plantas F2 a por lo menos una técnica de análisis de ADN que permite la identificación de una planta F2 que es homocigótica para dicho transgén y homocigótica para por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3. La técnica de análisis de ADN comprende una o más técnicas seleccionadas del grupo que consiste de análisis de PCR, análisis de PCR cuantitativo, análisis de SNP, análisis de AFLP, análisis de RFLP y análisis de RAPD. En ciertas modalidades de esta invención, la técnica de análisis de ADN comprende la detección de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 C correspondiente al nucleótido 687, 1 129, 1203, 2316, 3292, 3360 ó 3743 de SEQ ID NO: 62, detección de una deleción en el gen FAD3-1C de SEQ ID NO: 62, o detección de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido en una secuencia de promotor de FAD3-1 C correspondiente a una guanina en el nucleótido 334, una citosina en el nucleótido 364, una timina en el nucleótido 385, una adenina en el nucleótido 387, una citosina en el nucleótido 393, una guanina en el nucleótido 729 y una citosina en el nucleótido 747 de SEQ ID NO: 63. En otras modalidades de esta invención, la técnica de análisis de ADN comprende la detección de polimorfismo de un solo nucleótido en un gen FAD3-1 B de soya que comprende una sustitución de un residuo de citosina por un residuo de timina en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 b correspondiente al nucleótido 2021 de SEQ ID NO: 61. En este método, el transgén puede comprender además un transgén que confiere tolerancia a herbicida y la planta de soya F1 que es heterocigótica para dicho transgén se obtiene en el paso (i) sometiendo una pluralidad de plantas F1 a selección de herbicidas para dicho transgén. De manera similar, cuando el transgén además comprende un transgén que confiere tolerancia a herbicida, una pluralidad de plantas F2 enriquecidas para plantas F2 que son homocigóticas para dicho transgén se obtienen en el paso (ii) sometiendo la pluralidad de plantas F2 a selección de herbicidas para dicho transgén. Este método también puede comprender además el paso (iii) de autoreproducir la planta de progenie F2 que son homocigóticas para el transgén y homocigóticas para por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 del paso (ii) para obtener una planta de soya F3. Un método alternativo de hacer plantas de soya que comprende por lo menos un transgén que disminuye la expresión tanto de un gen FAD2-1 de soya endógeno como un gen FATB de soya endógeno y un gen FATB endógeno y por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno implica la transformación directa de plantas de soya o células que comprenden la mutación con el transgén(es). Por lo tanto, esta planta de soya se hace en el primer paso de la invención transformando una planta de soya o célula vegetal que comprende por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno con uno o más transgenes que disminuyen la expresión tanto del gen FAD2-1 de soya endógeno como un gen FATB de soya endógeno para obtener una planta de soya R0 con por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 que es heterocigótico para dicho transgén, autoreproduciendo la planta de progenie RO del paso anterior para obtener una planta de soya R1 que es homocigótica para el transgén y homocigótica para por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3, obteniendo así una planta de soya que comprende un transgén que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 de soya endógeno y por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno. En ciertas modalidades de este método, el transgén además comprende secuencias que confieren un rasgo de tolerancia a herbicida. En otras modalidades de la invención, el transgén además comprende secuencias que confieren tolerancia a glifosato.
Esta invención también abarca plantas de soya producidas por los métodos antes mencionados de la invención así como partes de plantas de plantas de soya producidas por los métodos de la invención. La parte de planta de soya producida pueden ser un polen, un óvulo, un meristema, una hoja, un tallo, una raíz o una célula. Las plantas de soya de progenie de las plantas de soya producidos por estos métodos también se contemplan en esta invención. La invención también abarca semillas de la planta de soya producidas por los métodos de la invención, en donde la semilla tiene una composición de ácido graso que comprende un contenido de ácido linolénico menor que aproximadamente 6% en peso de los ácidos grasos de semilla totales, un contenido de ácidos grasos saturado de menos de 8% en peso y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% en peso de los ácidos grasos de semilla totales. La invención además abarca semilla de la planta de soya producida por métodos en donde las plantas de soya que comprenden por lo menos dos mutaciones de pérdida de función en por lo menos dos genes FAD3 de soya endógeno se usan, dicha semilla teniendo una composición de ácido graso que comprende un contenido de ácido linolénico menor que aproximadamente 3% en peso de los ácidos grasos de semilla totales, un contenido de ácidos grasos saturado de menos de 8% en peso y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% en peso de los ácidos grasos de semilla totales. Características y ventajas adicionales de la presente invención, así como la estructura y operación de varias modalidades de la presente invención se describen con detalle más adelante con referencia a los dibujos anexos.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Los dibujos anexos, que se incorporan en la especificación, y forman parte de ésta, ilustran las modalidades de la presente invención y junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención. En los dibujos: La figura 1 ilustra pCGN5469, un vector de planta para disminuir la expresión del gen FAD2-1 de soya; La figura 2 ilustra pCGN5471 , un vector de planta para disminuir la expresión del gen FAD2-1 de soya; La figura 3 ilustra pCGN5485, un vector de planta para disminuir la expresión del gen FAD2-1 de soya; y La figura 4 ilustra con figuraciones de vector de planta ilustrativas para disminuir la expresión de uno o más genes al usar los elementos de secuencia de ADN de los genes de soya listados en el cuadro 1 . La figura 5 ilustra con figuraciones de vector de planta ilustrativas para disminuir la expresión de uno o más genes al usar los elementos de secuencia de ADN de los genes FAD2-1 de soya y/o FATB de soya listados en el cuadro 2. La figura 6 ilustra vectores de planta ilustrativos para disminuir la expresión tanto de los genes FAD2-1 como FATB de soya endógenos.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Descripción de las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO: 1 es una secuencia de ácido nucleico de un intrón 1 de FAD2-1 A. SEQ ID NO: 2 es una secuencia de ácido nucleico de un intrón 1 de FAD2-1 B. SEQ ID NO: 3 es una secuencia de ácido nucleico de un promotor de FAD2-1 B. SEQ ID NO: 4 es una secuencia de ácido nucleico de un clon genómico de FAD2-1 A. SEQ ID NOs: 5 y 6 son secuencias de ácido nucleico de una 3' UTR de FAD2-1A y 5'UTR, respectivamente. SEQ ID NOs: 7-13 son secuencias de ácido nucleico de intrones 1 , 2, 3A,4, 5, 3B, y 3C de FAD3-1 A, respectivamente. SEQ ID NO: 14 es una secuencia de ácido nucleico de un intrón 4 de FAD3-1 C. SEQ ID NO: 15 es una secuencia de ácido nucleico de un clon genómico de FAD3-1 A parcial. SEQ ID NOs: 16 y 17 son secuencias de ácido nucleico de una 3'UTR y 5'UTR de FAD3-1 A, respectivamente.
SEQ ID NO: 18 es una secuencia de ácido nucleico de un clon genómico de FAD3-1 B parcial. SEQ ID NOs: 19-25 son secuencias de ácido nucleico de intrones 1 , 2, 3A, 3B, 3C, 4 y 5, de FAD3-1 , B respectivamente. SEQ ID NOs: 26 y 27 son secuencias de ácido nucleico de una 3'UTR y 5'UTR de FAD3-1 B, respectivamente. SEQ ID NO: 28 es una secuencia de ácido nucleico de un clon genómico de FATB-1 . SEQ ID NO: 29-35 son secuencias de ácido nucleico de intrones I, II, III, IV, V, VI y VII de FATB- , respectivamente. SEQ ID NOs: 36 y 37 son secuencias de ácido nucleico de una 3'UTR y 5'UTR de FATB-1 , respectivamente. SEQ ID NO: 38 es una secuencia de ácido nucleico de un gen KAS I de Cuphea pulcherrima. SEQ ID NO: 39 es una secuencia de ácido nucleico de un gen KAS IV de Cuphea pulcherrima. SEQ ID NOs: 40 y 41 son secuencias de ácido nucleico de genes de delta-9 desaturasa de Ricinus communis y Simmondsia chinensis, respectivamente. SEQ ID NO: 42 es una secuencia de ácido nucleico de un ADNc de FATB-2. SEQ ID NO: 43 es una secuencia de ácido nucleico de un clon genómico de FATB-2.
SEQ ID NOs: 44-47 son secuencias de ácido nucleico de ¡ntrones I, II, III y IV de FATB-2, respectivamente. SEQ ID NOs: 48-60 son secuencias de ácido nucleico de iniciadores de PCR. SEQ ID NO: 61 es una secuencia de gen de FAD3-1 B que corresponde a SEQ ID NO: 1 de la solicitud de patente de E.U.A. No. 10/176,149. SEQ ID NO: 62 es una secuencia de gen de FAD3-1C que corresponde a SEQ ID NO: 2 de la solicitud de patente de E.U.A. No. 10/176,149. SEQ ID NO: 63 es una secuencia de promotor de FAD3-1 C que corresponden a SEQ ID NO: 3 de la solicitud de patente de E.U.A. 10/176,149.
Definiciones "ACP" se refiere a una porción de proteína portadora de acilo. "Composición de aceite de semilla alterada" se refiere a una composición de aceite de semilla de una planta transgénica o transformada de la invención que tiene niveles alterados o modificados de los ácidos grasos en la misma, en relación con un aceite de semilla de una planta que tiene un fondo genético similar pero que no ha sido transformada. "Supresión de antisentido" se refiere a silenciamiento específico de gen que es inducido por la introducción de una molécula de ARN de antisentido.
"Agronómicamente élite", como se usa aquí, significa un genotipo que tiene una culminación de muchos rasgos distinguibles tales como emergencia, vigor, vigor vegetativo, resistencia a enfermedades, conjunto de semillas, capacidad de estándar y capacidad de umbral que permiten a un productor cosechar un producto de importancia comercial. "Alelo", como se usa aquí, se refiere a cualquiera de una o más formas alternativas de un locus de gen, todos los alelos se relacionan con un rasgo o característica. En una célula u organismo diploide, los dos alelos de un gen dado ocupan loci correspondientes en un par de cromosomas homólogos. "Retrocruza", como se usa aquí, se refiere a un proceso en el cual un reproductor cruza repetidamente progenie híbrida, por ejemplo, un híbrido de primera generación (F1 ), de nuevo con uno de los progenitores de la progenie híbrida. La retrocruza se puede usar para introducir una o más conversiones de un solo locus de un fondo genético a otro. La "coexpresión de más de un agente tal como un ARNm o proteína" se refiere a la expresión simultánea de un agente en marcos de tiempo de traslape y en la misma célula o tejido que otro agente. "Expresión coordinada de más de un agente" se refiere a la coexpresión de más de un agente cuando la producción de transcripciones y proteínas de dichos agentes se lleva a cabo utilizando un promotor compartido o idéntico. "Complemento" de una secuencia de ácido nucleico se refiere al complemento de la secuencia a lo largo de su longitud completa.
"Cosupresión" es la reducción en niveles de expresión, usualmente al nivel de ARN, de un gen o familia de genes endógenos particular por la expresión de una construcción de sentido homologa que es capaz de transcribir ARNm de la misma capacidad de cadena que la transcripción del gene endógeno. Napoli et al., Plant Cell 2:279-289 ( 1990); van der Krol et al., Plant Cell 2:291 -299 (1990). Un gen de "CP4 EPSPS" o "CP4 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa" codifica una enzima (CP4 EPSPS) capaz de conferir un grado sustancial de resistencia a glifosato en la célula vegetal y plantas generadas a partir de la misma. La secuencia de CP4 EPSPS puede ser una secuencia de CP4 EPSPS derivada de Agrobacterium tumefaciens sp. CP4 o una variante o forma sintética de la misma, como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,633,435. Secuencias de CP4 EPSPS representativas incluyen, sin limitación, aquellas expuestas en las patentes de E.U.A. Nos. 5,627,061 y 5,633,435. "Cruza", como se usa aquí, se refiere al apareamiento de dos plantas progenitoras. "Polinización cruzada", como se usa aquí, se refiere a fertilización por la unión de dos gametos de diferentes plantas. "Fr o "F1 ", como se usa aquí, se refiere a progenie de primera generación de la cruza de dos plantas. "Híbrido FV O Híbrido F1 ", como se usa aquí, se refiere a progenie de primera generación de la cruza de dos plantas no isogénicas.
"F2" o "F2", como se usa aquí, se refiere a progenie de segunda generación de la cruza de dos plantas. "F3" o "F3", como se usa aquí, se refiere a progenie de tercera generación de la cruza de dos plantas. "Aceite de soya crudo" se refiere un aceite de soya que ha sido extraído de semillas de soya, pero no ha sido refinado, procesado o mezclado, aunque puede ser desgomado. "CTP" se refiere a un péptido de tránsito cloroplástico, codificado por la "secuencia codificadora de péptido de tránsito cloroplástico". Cuando se refiere a proteínas y ácidos nucleicos aquí, "derivado" se refiere ya sea a directamente (por ejemplo, viendo la secuencia de una proteína o ácido nucleico conocido y preparando una proteína o ácido nucleico que tiene una secuencia similar, por lo menos en parte, a la secuencia de la proteína o ácido nucleico conocido) o indirectamente (por ejemplo, obteniendo una proteína o ácido nucleico a partir de un organismo que está relacionado con una proteína o ácido nucleico conocido) obteniendo una proteína o ácido nucleico a partir de proteína o ácido nucleico conocido. Otros métodos de "derivación" de una proteína o ácido nucleico a partir de una proteína o ácido nucleico conocido son conocidos por un experto en la técnica. ARN de doble cadena ("dsARN"), interferencia de ARN de doble cadena ("dsARNi") e interferencia de ARN ("ARNi") se refieren todos a siienciamiento específico de gen que es inducido por la introducción de una construcción capaz de transcribir por lo menos parcialmente una molécula de ARN de doble cadena. Una "molécula de dsARN" y una "molécula de ARNi" se refieren ambas a una región de una molécula de ARN que contiene segmentos con secuencias de nucleotidos complementarias y por lo tanto pueden hibridar unas con otras y formar ARN de doble cadena. Dichas moléculas de ARN de doble cadena son capaces, cuando se introducen en una célula u organismo, de por lo menos reducir parcialmente el nivel de una especie de ARNm presente en una célula o una célula de un organismo. Además, el dsARN se puede crear después del ensamble in vivo de fragmentos de ADN apropiados a partir de recombinación ilegítima y recombinación específica del sitio como se describe en la solicitud internacional No. PCT/US2005/004681 , presentada el 1 1 de febrero de 2005, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. "Exón" se refiere al sentido normal del término como un segmento de moléculas de ácido nucleico, usualmente ADN, que codifica parte de o toda una expresada. "FAD2" se refiere a un gen o proteína codificada capaz de catalizar la inserción de un doble enlace en una porción acilo graso en la posición doce contada desde el carboxilo terminal. Las proteínas FAD2 también se refieren como "?12 desaturasa" u "omega-6 desaturasa". El término "FAD2-1 " se usa para referirse a un gen o proteína FAD2 que es naturalmente expresada de una manera específica en tejido de semilla, y el término "FAD2-2" se usa para referirse a un gen o proteína FAD2 que es (a) un gen diferente a partir de un gen o proteína FAD2-1 y (b) es naturalmente expresado en múltiples tejidos, incluyendo la semilla. Las secuencias de FAD2 representativas incluyen, sin limitación, aquellas expuestas en la solicitud de patente de E.U.A. No. 10/176,149 presentada el 21 de junio de 2002, y en SEQ ID NOs: 1 -6. Un gen de "FAD3", "?15 desaturasa" u "omega-3 desaturasa" codifica una enzima (FAD3) capaz de catalizar la inserción de un doble enlace en una porción acilo graso en la posición quince contada desde el carboxilo terminal. Los términos "FAD3-1 , FAD3-A, FAD3-B y FAD3-C" se usan para referirse a miembros de la familia de genes FAD3 que son naturalmente expresados en múltiples tejidos, incluyendo la semilla. Secuencias de FAD3 representativas incluyen, sin limitación, aquellas expuestas en la solicitud de patente de E.U.A. No. 10/176,149 presentada el 21 de junio de 2002, y en SEQ ID NOs: 7-27. Una "FATB" o "palmitoil-ACP tioesterasa" se refiere a un gene que codifica una enzima (FATB) capaz de catalizar la digestión hidrolítica del enlace de tioéster de carbono-azufre en el grupo prostético de pantoteno de palmitoil-ACP como su reacción preferida. La hidrólisis de otros tioésteres de ácido graso-ACP también pueden ser catalizados por esta enzima. Secuencias de FATB-1 representativas incluyen, sin limitación, aquellas expuestas en la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/390,185 presentada el 21 de junio de 2002; patentes de E.U.A. Nos. 5,955,329; 5,723,761 ; 5,955,650; y 6,331 ,664; y SEQ ID NOs: 28-37. Las secuencias de FATB-2 representativas incluyen, sin limitación, aquellas expuestas en SEQ ID NOs: 42-47. "Acido graso" se refiere a ácidos grasos libres y grupos acilo graso. "Gen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que abarca una región de promotor 5' asociada con la expresión del producto de gen, cualesquiera regiones de intrón y exón y regiones no traducidas 3' ó 5' asociadas con la expresión del producto de gen. "Silenciamiento de genes" se refiere a la supresión de expresión de genes o regulación descendente de expresión de genes. Una "familia de genes" es dos o más genes en un organismo que codifican proteínas que presentan atributos funcionales similares, y un "miembro de familia de genes" es cualquier gen de la familia de genes encontrada dentro del material genético de la planta, v.gr., un "miembro de familia de gen FAD2" es cualquier gen FAD2 encontrado dentro del material genético de la planta. Un ejemplo de dos miembros de una familia de gen son FAD2-1 y FAD2-2. Una familia de gen se puede clasificar adicionalmente por la similitud de las secuencias de ácido nucleico. Un gen, FAD2, por ejemplo, incluye alelos en ese locus. Preferiblemente, un miembro de la familia de gen presenta por lo menos 60%, muy preferiblemente por lo menos 70%, muy preferiblemente aún por lo menos 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico en la porción de secuencia codificadora del gen. "Genotipo", como se usa aquí, se refiere a la constitución genética de una célula u organismo.
Como se usa aquí, "heterólogo" significa que no ocurren juntos naturalmente. Se dice que una molécula de ácido nucleico es "introducida" si es insertada en una célula u organismo como resultado de manipulación humana, sin importar qué tan indirecta sea. Ejemplos de moléculas de ácido nucleico introducidas incluyen, pero no se limitan a ácidos nucleicos que han sido introducidos en células mediante transformación, transfección, inyección y proyección, y aquellos que han sido introducidos en un organismo mediante métodos que incluyen pero no se limitan a conjugación, endocitosis y fagocitosis. "Intrón" se refiere al sentido normal del término como un segmento de molécula de ácido nucleico, usualmente ADN, que no codifican parte de o toda una proteína expresada, y que en condiciones endógenas es transcrito a moléculas de ARN, pero que es separado del ARN endógeno antes de que el ARN sea traducido a proteína. Una "molécula de dsARN de intrón" y "una molécula de ARNi de intrón" se refieren ambas a una molécula de ARN de doble cadena que, cuando es introducida en una célula u organismo, es capaz de reducir por lo menos parcialmente el nivel de una especie de ARNm presente en una célula o una célula de un organismo en donde la molécula de ARN de doble cadena presenta identidad suficiente a un intrón de un gen presente en la célula u organismo para reducir el nivel de ARNm que contiene esta secuencia de intrón. Una composición de aceite de semilla se soya "de saturación baja" contiene entre 3.6 y 8 por ciento de ácidos grasos saturados en peso. Una composición de aceite de "ácido linolénico bajo" contiene menos que aproximadamente 3% de ácido linolénico en peso de los ácidos grasos totales en peso. Una "semilla de soya de ácido oleico medio" es una semilla que tiene entre 55% y 85% de ácido oleico presente en la composición de aceite de la semilla en peso. El término "no codificadora" se reíiere a secuencias de moléculas de ácido nucleico que no codifican parte o toda una proteína expresada. Secuencias no codificadoras incluyen pero no se limitan a intrones, regiones promotoras, regiones 3' no traducidas (3'UTRs), y regiones 5' no traducidas (5'UTRs). El término "composición de aceite" se refiere a los niveles de ácidos grasos. "Fenotipo", como se usa aquí, se refiere a las características detectables de una célula u organismo, dichas características son la manifestación de expresión de gen. Un promotor que es "operablemente enlazado" a una o más secuencias de ácido nucleico es capaz de impulsar la expresión de una o más secuencias de ácido nucleico, incluyendo secuencias de ácido nucleico codificadoras o no codificadoras múltiples dispuestas en una configuración policistrónica. Secuencias de ácido nucleico "físicamente enlazadas" son secuencias de ácido nucleico que se encuentran en una sola molécula de ácido nucleico. Una "planta" incluye referencia a plantas enteras, órganos de planta (v.gr., hojas, tallos, raíces, etc.), semillas y células vegetales y progenie de las mismas. El término "célula vegetal" incluye, sin limitación, cultivos en suspensión de semilla, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces, vástagos, gametófitos, esporofitos, polen y microesporas. "Promotores de platas" incluyen, sin limitación, promotores virales de plantas, promotores derivados de plantas y promotores sintéticos capaces de funcionar en una célula vegetal para promover la expresión de un ARNm. Un "gen policistrónico" o "ARNm policistrónico" es cualquier gen o ARNm que contiene secuencias de ácido nucleico transcritas que corresponden a secuencias de ácido nucleico de más de un gen objetivo para supresión. Se entiende que dichos genes policistrónicos o ARNm pueden contener secuencias que corresponden a intrones, 5'UTRs, 3'UTRs, secuencias codificadoras de péptido transitorias, exones o combinaciones de los mismos, y que un gen policistrónico recombinante o ARNm, por ejemplo, sin limitación, podría contener secuencias que corresponden a una o más UTRs de un gen y uno o más intrones de un segundo gen. Como se usa aquí, el término "R0", "R0", "generación R0" o "generación R0" se refiere a una planta trasformada obtenida por regeneración de una célula vegetal transformada. Como se usa aquí, el término "Ri" "R1 ", "generación R/ o "generación R1 " se refiere a semillas obtenidas de una planta R0 transgénica autocruzada. Las plantas Ri crecen a partir de las semillas Un "promotor específico de semillas" se refiere a un promotor que es activo preferiblemente o exclusivamente en una semilla. "Actividad preferencial" se refiere a una actividad promotora que es sustancialmente mayor en la semilla que en otros tejidos, órganos u organelos de la planta. "Específico de semilla" incluye sin limitación actividad en la capa de aleurona, endospermo y/o embrión de la semilla. "Supresión de intrón de sentido" se refiere a silenciamiento de genes que es inducido por la introducción de un intrón de sentido o fragmento del mismo. La supresión de intrón de sentido se describe, por ejemplo, en Fillatti en PCT WO 01/14538 A2. "Expresión simultánea" de más de un agente tal como de un ARNm o proteína se refiere a la expresión de un agente al mismo tiempo que otro agente. Dicha expresión puede únicamente traslaparse en parte y puede ocurrir también en diferentes tejidos o a diferentes niveles. "Nivel de aceite total" se refiere a la cantidad de agregado toral de ácido graso sin importar el tipo de ácido graso. Como se usa aquí, el nivel de aceite total no incluye la estructura de base de glicerol. "Transgén" se refiere a una secuencia de ácido nucleico asociada con la expresión de un gen introducido en un organismo. Un transgén incluye, pero no se limitan a, un gen endógeno o un gen que no ocurre naturalmente en el organismo. Una "planta transgénica" es una planta que incorpora establemente un transgén de una manera que facilita la transmisión de ese transgén de una planta por cualquier método sexual o asexual. Una composición de aceite de semilla de soya de "saturación cero" contiene menos de 3.6 por ciento de ácidos grasos saturados en peso. Una "mutación de pérdida de función" es una mutación en el sentido de codificación de un gen, que hace que la función de producto de gen, usualmente una proteína, sea reducido o completamente ausente. Una mutación de pérdida de función, por ejemplo, puede ser causada por el truncamiento de un producto de gen debido a cambio de marco o mutación que no es de sentido. Un fenotipo asociado con un alelo con una mutación de pérdida de función puede ser ya sea recesivo o dominante. Una célula u organismo puede tener una familia de más de un gen que codifica una enzima particular, y la letra mayúscula que sigue la terminología de genes (A, B, C) se usa para designar el miembro de la familia, es decir, FAD2-1 A es un miembro de familia de gen diferente de FAD2- 1B. De manera similar, FAD3-1A, FAD3-1 B, y FAD3-1 C representan distintos miembros de la familia de gen FAD3-1. Alelos de pérdida de función de varios genes son representados en minúsculas seguido por un signo de menos (es decir, fad3- 1b- y fad3- 1c- representan alelos de pérdida de función de los genes FAD3-1 B y FAD3-1 C, respectivamente). Como se usa aquí, cualquier intervalo expuesto es inclusivo de los puntos extremos del intervalo a menos que se establezca de otra manera.
A. Transgenes que disminuyen la expresión del gen FAD2-1 de soya endógeno Varios transgenes que disminuyen la expresión del gen FAD2-1 de soya endógeno se pueden usar para poner en práctica los métodos de la invención. Mediante supresión, reducción por lo menos parcial, reducción, reducción sustancial o eliminación efectiva de la expresión del gen FAD2 endógeno, la cantidad de proteína FAD2 disponible en una célula vegetal es disminuida, es decir, los niveles de estado estable de la proteína FAD2 son reducidos. Por lo tanto, una disminución en la expresión de proteína FAD2 en la célula de soya puede dar por resultado una proporción incrementada de ácidos grasos monoinsaturados tales como oleato (C18:1 ). Plantas de soya que contienen transgenes que disminuyen la expresión de FAD2-1 de soya endógeno y producen semilla con ácido oleico incrementado se describen en la patente de E.U.A. No. 7,067,722. Varios transgenes que disminuyen la expresión de FAD2-1 de soya endógeno y un gen FATB de soya endógeno se pueden usar para poner en práctica los métodos de la invención para la producción de plantas de soya con un genotipo de ácido linolénico bajo, ácido oleico medio, de baja saturación. Mediante supresión, por lo menos reducción parcial, reducción, reducción sustancial o eliminación efectiva de la expresión del gen FATB endógeno, la cantidad de proteína FATB disponible en una célula vegetal es disminuida, es decir, los niveles de estado constante de la proteína FATB son reducidos. Cuando la cantidad de FATB es disminuida en una célula vegetal, una cantidad disminuida de ácidos grasos saturados tales como palmitato y estearato se pueden proveer. Por lo tanto, una disminución de FATB puede dar por resultado una proporción incrementada de ácidos grasos insaturados tales como oleato (18:1 ). Varios métodos para disminuir la expresión de: 1 ) el gen(es) de FAD2-1 soya endógeno o 2) los genes FAD2-1 y FATB de soya endógenos en plantas de soya y semilla se contemplan en esta invención, incluyendo pero sin limitarse a, supresión de antisentido, co-supresión, ribozimas, combinaciones de sentido y antisentido (ARN/ de doble cadena), silenciamiento de promotor y uso de proteínas de unión de ADN tales como proteínas de dedo de zinc. La práctica general de estos métodos con respecto a varios genes de plantas endógenos se describe en WO 98/53083, WO 01/14538, y patente de E.U.A. 5,759,829. La supresión de expresión de gen en plantas, también conocida como silenciamiento de genes, ocurre tanto a nivel de transcripción como a nivel de post-transcripción. Ciertos de estos mecanismos de silenciamiento de genes están asociados con homología de ácido nucleico al nivel de ADN o ARN. Dicha homología se refiere a similitud en secuencias de ADN o proteína dentro de la misma especie o entre diferentes especies. El silenciamiento de gen ocurre si la secuencia de ADN introducida a una célula hospedero es suficientemente homologa a un gen endógeno de modo que la transcripción de la secuencia de ADN introducida inducirá silenciamiento de gen de transcripción o de post-traducción del gen endógeno. Para poner en práctica esta invención, secuencias de ADN con por lo menos 50%, aproximadamente 60%, o aproximadamente 70% idénticas sobre la longitud total de una secuencia de ADN una región codificadora o región no codificadra de FAD2-1 o FATB de soya, o a una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una región codificadora o no codificadora de FAD2-1 o FATB de soya, tienen suficiente homología para supresión de niveles de expresión de estado estable de FAD2-1 o FATB cuando se introducen en plantas de soya como transgenes. Los transgenes de la invención muy preferiblemente comprenden secuencias de ADN que son, en toda su longitud, por lo menos 80% idénticas; por lo menos 85% idénticas; por lo menos 90% idénticas; por lo menos 95% idénticas; por lo menos 97% idénticas; por lo menos 98% idénticas; por lo menos 99% idénticas; o 100% idénticas a una región codificadora o región no codificadora de FAD2-1 o FATB de soya o a una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una región codificadora o no codificadora de gen FAD2-1 o FATB de soya. Las secuencias de ADN con los niveles indicados anteriormente de identidad del gen FAD2-1 o FAT de soya pueden ser secuencias codificadoras, secuencias de intrón, secuencias de 3'UTR, secuencias de 5'UTR, secuencias de promotor, otras secuencias no codificadoras, o cualquier combinación de las anteriores. El intrón puede estar localizado entre exones, o localizado dentro de una 5' o 3' UTR de un gen. La secuencia codificadora es preferiblemente una fracción de un marco de codificación de proteína que no codifica una proteína con actividad enzimática de FAD2. Sin embargo, se reconoce que en ciertos casos, tales como en cosupresión, las secuencias de ADN que codifican una proteína FAD2 o FATB enzimáticamente activa se pueden usar para disminuir la expresión del gen(es) FAD2-1 o FATB de soya endógeno. Cabe entender también que las secuencias de ADN con los niveles indicados anteriormente de identidad al gen FAD2-1 de soya que son útiles en los métodos de esta invención se pueden derivar de cualquier gen FAD2 de soya, el gen FAD2-1 A de soya (SEQ ID NO:4), el intrón FAD2-1 A de (SEQ ID NO:1 ), intrones FAD2-1 B de soya (SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3), el gen FAD2-2 de soya, alelos del gen FAD2-1 de soya, alelos del gen FAD2-2 de soya y de genes FAD2 derivados de otras plantas leguminosas tales como Medicago sp., Pisum sp., Vicia sp., Phaseolus sp., y Pisum sp. Esta claro que la secuencia de ADN con los niveles indicados de identidad a la secuencia FAD2-1 de soya se puede derivar de fuentes múltiples. Secuencias de ADN con los niveles indicados de identidad de secuencia también se pueden obtener de manera sintética. De manera similar, también se entiende que las secuencias de ADN con los niveles indicados anteriormente de identidad para el gen FATB de soya que son útiles en los métodos de esta invención se pueden derivar de cualquier gen FATB de soya, un gen FATB-1 de soya (SEQ ID NO:28), intrones FATB-1 de soya (SEQ ID NO:29-35), 5'UTR de FATB-1 de soya (SEQ ID NO:36), 3'UTR de FATB-1 de soya (SEQ ID NO:37), gen FATB-2 de soya (SEQ ID NO:43), alelos de FATB-1 de soya, alelos del gen FATB-2 de soya, y de genes FATB derivados de otras plantas leguminosas tales como Medicago sp., Pisum sp., Vicia sp., Phaseolus sp., y Pisum sp. Por lo tanto, está claro que la secuencia de ADN con los niveles indicados de identidad a la secuencia FAD2-1 de soya se puede derivar de fuentes múltiples. La secuencia de ADN con los niveles indicados de identidad de secuencia también se puede obtener de manera sintética. En los métodos de esta invención, transgenes específicamente diseñados para producir moléculas de ARN de doble cadena (dsARN) con homología del gen FAD2-1 también pueden inducir silenciamiento específico de secuencia de FAD2-1 y se pueden usar par disminuir la expresión de gen FAD2-1 de soya endógeno. Las secuencias de cadena de sentido de dsARN se pueden separar de las secuencias de antisentido por una secuencia separadora, preferiblemente una que promueva la formación de una molécula de dsARN. Ejemplos de dichas secuencias separadoras incluyen aquellas expuestas en Wesley et al., Plant J., 27(6):581 -90 (2001 ), y Hamilton et al., Plant J., 15:737-746 (1988). En un aspecto preferido, la secuencia separadora es capaz de formar una estructura de pasador como se ilustra en Wesley et al., supra. Las secuencias separadoras particularmente preferidas en este contexto son intrones de plantas o partes de los mismos. Un intrón de planta particularmente preferido es un intrón emplamable. Los intrones empalmables incluyen, pero no se limitan a, un intrón seleccionado del grupo que consiste de intrón PDK, intrón FAD3-1A o FAD3-1 B #5, intrón FAD3 #1 , intrón FAD3 #3A, intrón FAD3 #3B, intrón FAD3 #3C, intrón FAD3 #4, intrón FAD3 #5, intrón FAD2 #1 , e intrón FAD2-2. Las moléculas no codificadoras orientadas a sentido pueden ser opcionalmente separadas de las moléculas orientadas a antisentido correspondientes por un segmento separador de ADN. El segmento separador puede ser un fragmento de gen o ADN artificial. El segmento separador puede ser corto para facilitar la formación de dsARN de pasador o largo para facilitar dsARN sin una estructura de pasador. El separador se puede proveer extendiendo la longitud de una de las moléculas de sentido o antisentido como se describe en US 2005/0176670 A1 . Alternativamente, una secuencia de borde derecho-borde derecho ("RB-RB") se puede crear después de la inserción en el genoma de la planta como se describe en la solicitud de patente de E.U.A. 2005/0183170. Los transgenes de la invención típicamente incluirán un promotor funcional en una célula vegetal, un promotor de planta, que está operablemente enlazado a una secuencia de ADN antes mencionada que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 o FATB de soya endógeno. El diseño de dicho vector está generalmente dentro del alcance de la técnica (véase, v.gr., Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark (ed.), Springer, New York (1997)). Sin embargo, se reconoce que construcciones o vectores también pueden contener un gen sin promotor que puede utilizar un promotor endógeno bajo inserción. Un número de promotores que son activos en células vegetales se han descrito en la literatura tales como los promotores CaMV 35S y FMV. Versiones incrementadas o duplicadas de los promotores CaMV 35S y FMV 35S también se pueden usar para expresar una secuencia de ADN antes mencionada que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 endógeno (Odell et al., Nature 313: 810-812 (1985); patente de E.U.A. No. 5,378,619). Promotores adicionales que se pueden utilizar se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. 5,378,619; 5,391 ,725; 5,428,147; 5,447,858; 5,608,144; 5,608,144; 5,614,399; 5,633,441 ; 5,633,435; y 4,633,436. Además, un incrementador específico de tejido se puede usar con un promotor de planta basal. Los promotores básales típicamente comprenden una caja "TATA" y un sitio de tapa de ARNm pero carecen de elementos incrementadores requeridos para niveles de expresión altos. Los promotores particularmente preferidos para usarse en los transgenes de la presente invención son promotores que expresan una secuencia de ADN que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 o FATB de soya endógeno en semillas o frutas. De hecho, en una modalidad preferida, el promotor usado es un promotor específico de semilla. Ejemplos de dichos promotores específicos de semilla incluyen las regiones reguladoras 5' para genes tales como napin (Kridl et al., Seed Sci. Res. 1 :209-219 (1 991 )), faseolin, estearoil-ACP desaturasa, 7Sa, 7Sa' (Chen et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 83:8560-8564 (1986)), USP, arcelina y oleosina. Los promotores preferidos para expresión en semillas son los promotores 7Sa, 7Sa', napin, y FAD2-1 A. Construcciones o vectores también incluirán típicamente un terminador transcripcional 3' o señal de poliadenilación 3' que está operablemente enlazada a una secuencia de ADN antes mencionada que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 o FATB de soya endógeno. La señal de terminación transcripcional puede ser cualquier señal de terminación transcripcional funcional en una planta, o cualquier señal de terminación trancripcional de plantas. Las señales de terminación transcripcional preferidas incluyen pero no se limitan a secuencia de Rubisco E9 3' de guisante, una secuencia 3' de napin de Brassica, una secuencia 3' de tml y una secuencia 3' de gen de plásmido nopalina sintasa (NOS) inductor de tumor (Ti) de Agrobacterium. Se entiende que este grupo de regiones de poliadenilación ilustrativas no es limitante y que un experto en la técnica podría utilizar otras regiones de poliadenilación que no se citan explícitamente en la práctica de esta invención. Finalmente, también se reconoce que transgenes de la invención pueden ser insertados en vectores de transformación de plantas que también comprenden genes que codifican marcadores seleccionabas o marcables. El gen de marcador seleccionable puede ser un gen que codifica una proteína de neomicina fosfotransferasa, una proteína de fosfinotricina acetiltransferasa, una proteína de 5-enol-piruvilshiquimato-3-fosfato sintasa resistente a glifosato (EPSPS), una proteína de higromicina fosfotransferasa, una proteína de dihidropteroato sintasa, una proteína de acetolactato sintasa insensible a sulfonilurea, una proteína Q insensible a atrazina, una proteína de nitrilasa capaz de degradar bromoxinil, una proteína de deshalogenasa capaz de degradar dalapon, una proteína de 2,4-diclorofenoxiacetato monoxigenasa, una proteína de dihidrofolato reductasa insensible a metotrexato y una proteína de octopina sintasa insensible a aminoetilcisteína. Los agentes selectivos correspondientes usados junto con cada gen pueden ser: neomicina (para selección de proteína de neomicina fosfotransferasa), fosfinotricina (para selección de proteína de fosfinotricina acetiltransferasa), glifosato (para selección de proteína de 5-enol-piruvilshiquimato-3-fosfato sintasa resistente a glifosato (EPSPS)), higromicina (para selección de proteína de higromicina fosfotransferasa), sulfadiazina (para una selección de proteína de dihidropteroato sintasa), clorosulfuron (para una selección de proteína de acetolactato sintasa sensible a sulfonilurea), atrazina (para una selección de proteína Q insensible a atrazina), bromoxinil (para una selección de proteína de nitrilasa), dalapon (para una selección de proteína de deshalogenasa), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (para una selección de proteína 2,4-diclorofenoxiacetato monoxigenaso), metotrexato (para una selección de proteína de dihidroíolato reductasa sensible a metotrexato), o aminoetilcisteína (para una selección de proteína octopina sintasa insensible a aminoetilcisteína). Un gen de marcador seleccionare preferido es un gen CP4 EPSPS que confiere resistencia al herbicida glifosato. El gen marcador marcable puede ser un gen que codifica una proteína de beta-glucuronidasa, una proteína fluorescente verde, una proteína fluorescente amarilla, una proteína de beta-galactosidasa, una proteína de luciferasa derivada de un gen luc, una proteína de luciferasa derivada de un gen lux, una proteína de sialidasa, una proteína de estreptomicina fosfotransferasa, una proteína de nopalina sintasa, una proteína de octopina sintasa o una proteína de cloranfenicol acetil transferasa.
Las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas son modalidades que logran los objetos, características y ventajas de la presente invención. No se pretende que la presente invención esté limitada a las modalidades ilustradas. La disposición de las secuencias en el primer y segundo conjuntos de secuencias de ADN dentro de la molécula de ácido nucleico no está limitada a las disposiciones ilustradas y descritas, y puede ser alterada de cualquier manera adecuada para lograr los objetos, características y ventajas de la presente invención como se describe aquí y como se ilustra en los dibujos anexos.
B. Organismos transqénicos y métodos para producir los mismos Cualquiera de las moléculas de ácido nucleico y construcciones de la invención se pueden introducir en una planta o célula vegetal de soya de una manera permanente o transitoria. Los métodos y tecnología para la introducción de ADN en células vegetales de soya son bien conocidos por los expertos en la técnica, y virtualmente cualquier método por el cual las moléculas de ácido nucleico pueden ser introducidas en una célula es adecuado para usarse en la presente invención. Ejemplos no limitantes de métodos adecuados incluyen: métodos químicos; métodos físicos tales como microinyección, electroporación, la pistola de genes, el bombardeo de microproyectiles y la infiltración de vacío; vectores virales; y mecanismos mediados por receptor. Otros métodos de transformación de células también se pueden usar e incluyen pero no se limitan a la introducción de ADN en plantas por transferencia de ADN directa en polen, por inyección directa de ADN en órganos reproductores de una planta, o por inyección directa de ADN en las células de embriones inmaduros seguido por la rehidratación de embriones disecados. La transferencia mediada por Agrobacterium es un sistema ampliamente aplicable para introducir genes en células vegetales. Véase, v.gr., Fraley et al., Bio/Technology 3: 629-635 (1985); Rogers et al., Methods Enzymol. 153:253-277 (1987). La región de ADN que ha de ser transferida es definida por las secuencias de borde y ADN de intervención es usualmente insertado en el genoma de la planta. Spielmann et al., Mol. Gen. Genet. 205:34 (1986). Los vectores de transformación de Agrobacterium modernos son capaces de replicacion en E. coli así como en Agrobacterium, permitiendo manipulaciones convenientes. Klee et al., En: Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell (eds.), Sphnger-Verlag, New York, pp. 179-203 (1985). La transformación mediada por Agrobacterium de soya es específicamente descrita en la patente de E.U.A. No. 7,002,058. Las plantas transgénicas se obtienen típicamente mediante enlace del gen de interés (es decir, en el caso de un transgén que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 de soya endógeno o que disminuye la expresión tanto de un gen FAD2-1 como un gen FATB) a un gen marcador seleccionable, introduciendo los transgenes enlazados en una célula vegetal, un tejido vegetal o una planta por cualquiera de los métodos descritos anteriormente, y regenerando o de otra manera recuperando la planta transgénica bajo condiciones que requieren expresión de dicho gen marcador seleccionable para crecimiento de la planta. Los genes de marcador seleccionable ilustrativos y los agentes selectivos correspondientes se han descrito en secciones anteriores de esta descripción de la invención. Las plantas transgénicas también se pueden obtener mediante enlace de un gen de interés (es decir, en este caso un transgén que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 de soya endógeno disminuye la expresión tanto del gen FAD2-1 como del gen FATB) a un gen marcador marcable, introduciendo los transgenes enlazados en una célula vegetal por cualquiera de los métodos descritos anteriormente, y regenerando las plantas transgénicas a partir de células vegetales transformadas que prueban positivas para expresión del gen marcador marcable. Genes marcadores marcables ilustrativos se han descrito en secciones anteriores de esta descripción de la invención. La regeneración, desarrollo y cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplasto de plantas individuales o de varios explantes transformados es bien conocida en la técnica. Véase generalmente, Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995); Weissbach and Weissbach, En: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, CA (1988). Las plantas de la presente invención pueden ser parte de o pueden ser generadas a partir de un programa de reproducción, y también pueden ser reproducidas usando apomixis. Los métodos para la producción de plantas apomícticas son conocidos en la técnica. Véase, v.gr., patente de E.U.A. 5,81 1 ,636. Un método particular para obtener plantas de soya con ácido linolénico bajo/ácido oleico mediano contempladas aquí abarca la transformación directa de variedades de soya que comprende por lo menos una mutación de pérdida de función de un gen FAD3 de soya endógeno con un transgén que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 de soya endógeno. Ejemplos de variedades de soya que comprenden por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno incluye A5, C1640, 6P248, N98-44, T271 1 1 , T27190, T26767, T26830, y soya Soyola™ (véase solicitud de patente de E.U.A. 20060107348 y Burton et al., Crop Sci. 44:687-688, 2004). También se contempla que otras líneas de soya que comprenden por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno y que posee crecimiento de élite agronómicamente y/o características de rendimiento producidas por métodos de producción asistidos por marcador descritos en la solicitud de patente de E.U.A. 20060107348 podrían ser directamente transformados con un transgén que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 de soya endógeno. Alternativamente, también se contempla que las líneas de soya que comprenden por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno y que están sujetos a transformación pueden ser producidos por métodos de reproducción asistidos por marcador descritos en la solicitud de patente de E.U.A. No. 1 1/239,676. Las plantas de soya que comprenden por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno y que están sujetos a trasformación también pueden ser directamente transformadas con un transgén que disminuye la expresión del gen FAD2-1 de soya endógeno. Otras tres soyas linolénicas que podrían ser directamente transformadas por los métodos de la invención incluyen BARC12, que es una línea #3 del grupo de madurez determinante, las líneas de soya Vistive™ (Monsanto, St. Louis, MO., E.U.A.) o 0137648/01 AHKW-38, que es una línea L2 NUL de hilum amarillo. También se contempla que las plantas de soya con ácido linolénico bajo que son directamente transformadas con el transgén en los métodos de la invención se pueden derivar del germoplasma de soya que comprende regiones genómicas de plantas de soya que contienen alelos fad3- 1b; fad3- 1c-, o tanto fad3- 1b- y fad3- 1c- y que confieren contenido de ácido linolénico disminuido. Dichos polimorfismos de un solo nucleotido asociados con el fenotipo de soya con ácido linolénico bajo se describen en la solicitud de patente de E.U.A. No. 1 1/239,676. En ciertas modalidades, una región genómica de soya que confiere el fenotipo de contenido de ácido linolénico bajo es caracterizado por un polimorfismo de un solo nucleotido en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 B correspondiente al nucleotido 2021 de SEQ ID NO: 61 . En otra modalidad, la región genómica de soya que confiere el fenotipo de contenido de ácido linolénico bajo se caracteriza por un polimorfismo de un solo nucleotido en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 C correspondiente al nucleotido 687, 1 129, 1203, 2316, 3292, 3360 o 3743 de SEQ ID NO: 62. En otra modalidad, la región genómica de soya que confiere el fenotipo de contenido de ácido linolénico bajo se caracteriza por un polimorfismo de una solo nucleotido en una posición en el promotor FAD3-1 C correspodiente al nucleotido 334, 364, 385, 387, 393, 729 o 747 de SEQ ID NO: 63. En otra modalidad, la región genómica de soya que confiere el fenotipo de contenido de ácido linolénico bajo se caracteriza por una deleción en el gen FAD3-1C. Las regiones genómicas de soya que confiere el fenotipo de contenido de ácido linolénico bajo también se pueden caracterizar por un polimorfismo de un solo nucleotido en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 B correspondiente al nucleotido 2021 de SEQ ID NO: 61 y una deleción en la secuencia de gen FAD3-1c. Las regiones genómicas de soya que confieren el fenotipo de contenido de ácido linolénico bajo también pueden ser caracterizadas por un polimorfismo de un solo nucleotido en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 B correspondiente al nucleotido 2021 de SEQ ID NO: 61 y un polimorfismo en el promotor FAD3-1C, tal como un polimorfismo de un solo nucleotido en una posición correspondiente al nucleotido 334, 364, 385, 387, 393, 729 o 747 de SEQ ID NO: 63. El germoplasma de soya que comprende una deleción en el gen FAD3-1 C de soya es útil en la práctica de estos métodos y se puede obtener a partir de líneas de soya que incluyen pero no se limitan a las líneas de soya 6P248, T27111 , T27190, T26767, T26830 y A5, descritas en la solicitud de patente de E.U.A. No. 11/239,676. La detección de los polimorfismos de un solo nucleotido se pueden llevar a cabo por cualquier método, incluyendo PCR, análisis de polimorfismo conformacional de una sola cadena, electroforesis de gel de gradiente desnaturalizante, análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de digestión y/o secuenciación de ADN como se describe en la solicitud de patente de E.U.A. No. 1 1/239,676. Alternativamente, el polimorfismo de un solo nucleótido puede ser detectado por cualquiera de las pruebas seleccionadas del grupo que consiste de extensión de una sola base (SBE), secuenciación de extensión de iniciador específica de alelo (ASPE), secuenciación, PCR universal, extensión específica de alelo, hibridación, espectrometría de masa, ligación, extensión-ligación y pruebas medidas por endonucleasa de Flap. Los iniciadores y métodos para detección de los polimorfismos genéticos FAD3-1B y FAD3- 1C antes mencionado se describen en la solicitud de patente de E.U.A. No. 1 1/239,676. Las deleciones tales como aquellas en el gen FAD3-1 C pueden ser detectadas por métodos que incluyen pero no se limitan a PCR, hibridación, análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de digestión y/o métodos basados en secuenciación de ADN. Los métodos de transformación directa como se describió antes también se pueden usar para obtener plantas de soya con ácido linolénico bajo/saturación baja/ácido linolénico mediano. En estos métodos, las plantas de soya con ácido linolénico bajo antes mencionadas son directamente transformadas con transgenes que disminuyen la expresión de un gen FAD2-1 de soya endógeno y un gen FATB de soya endógeno para la producción de plantas de soya con un fenotipo de ácido linolenico bajo, saturación baja, ácido oleico mediano. Los transgenes que se pueden usar en transformación o transfección de plantas pueden ser cualquiera de los transgenes que disminuyen la expresión de: 1 ) un gen FAD2-1 de soya endógeno o 2) genes FAD2-1 y FATB de soya endógenos. Además se contempla que vectores que comprenden transgenes que disminuyen la expresión de: 1 ) gen FAD2-1 de soya endógeno o 2) genes FAD2-1 y FATB de soya endógenos también pueden comprender o estar genéticamente combinados con transgenes adicionales. Por ejemplo, los transgenes adicionales que expresan otros genes que afectan la composición del aceite, resistencia a patógenos, rendimiento, morfología, composición de proteína, composición de aminoácidos, composición de almidón y nivel de fitato se describen en la solicitud de patente de E.U.A. No. 11/239,676 y se pueden combinar con los transgenes y mutantes de ácido linolénico bajo descritos aquí. No se pretende que la presente invención se limite a las modalidades ilustradas. Moléculas de ácido nucleico ilustrativas se han descrito en la parte A de la descripción detallada y moléculas de ácido nucleico ilustrativas no limitantes adicionales se describen más adelante y se ilustran en las figuras 1-4 y en los ejemplos.
C. Cuzas de plantas de soya que contienen transqenes En otro aspecto, una planta de la invención puede ser cruzada con otra planta que sea transgénica o no transgénica. Una planta puede ser cruzada con otra planta que tenga una composición de aceite que contenga niveles modificados de ácidos grasos, por ejemplo sin limitación, una variedad con una composición de aceite que tenga un nivel más bajo de ácido linolénico. En una modalidad preterida, una planta de la presente invención se cruza con una variedad con menos de 3% en peso de ácido linolénico. En otra modalidad de la invención, una planta de la presente invención es cruzada con otra planta que tiene más de 20% en peso de ácido esteárico. Dichas plantas que tienen niveles modificados de ácidos grasos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Hawkins y Kridl (1998) Plant Journal 13(6):743-752 y en la patente de E.U.A. No. 6,365,802. En particular, las cruzas de plantas de soya que comprenden un transgén que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 de soya endógeno o disminuye la expresión de genes FAD2-1 y FATB de soya endógenos con variedades de soya que comprenden por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno se contemplan por los métodos de esta invención. Ejemplos de variedades de soya que comprenden por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno incluye A5, C1640, 6P248, N98-44, T271 11 , T27190, T26767, T26830, y soya Soyola™ (véase solicitud de patente de E.U.A. 20060107348 y Burton et al., Crop Sci. 44:687-688, 2004). También se contempla que otras líneas de soya que comprenden por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno y que poseen características de crecimiento y/o rendimiento de élite agronómicamente producidas por los métodos de reproducción asistidos por marcador descritos en la solicitud de patente de E.U.A. 20060107348 se podrían cruzar con plantas de soya que comprendan un transgén que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 de soya endógeno. Otros tres progenitores de cruza de ácido linolénico bajo que se podrían usar en los métodos de la invención incluyen BARC12, que es una línea #3 de grupo de madurez determinante, líneas de soya Vistive™ o 0137648/01 AHKW-38, que es una línea L2 NUL de hilum amarillo. También se contempla que las plantas de soya con ácido linolénico bajo usadas en la cruza para el transgén(es) se pueden derivar a partir del germplasma de soya que comprende regiones genómicas de planta de soya que contienen alelos fad3- 1b-, fad3- 1c-, o tanto fad3- 1b- como fad3- 1c- que confieren contenido de ácido linolénico disminuido. Dichos polimorfismos de un solo nucleótido asociados con el fenotipo de soya de ácido linolénico bajo se describen en la solicitud de patente de E.U.A. No. 1 1/239,676. En ciertas modalidades, una región genómica de soya que confiere el fenotipo de contenido de ácido linolénico bajo se caracteriza por un polimorfismo de un solo nucleótido en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 B correspondiente al nucleótido 2021 de SEQ ID NO: 61 . En otra modalidad, la región genómica de soya que confiere el fenotipo de contenido de ácido linolénico bajo se caracteriza por un polimorfismo de un solo nucleótido en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 C correspondiente al nucleótidos 687, 1 129, 1203, 2316, 3292, 3360 o 3743 de SEQ ID NO: 62. En otra modalidad, la región genómica de soya que confiere el fenotipo de contenido de ácido linolénico bajo se caracteriza por un polimorfismo de un solo nucleótido en una posición en el promotor FAD3-1C correspondiente al nucleótido 334, 364, 385, 387, 393, 729 o 747 de SEQ ID NO: 63. En otra modalidad, la región genómica de soya que confiere el fenotipo de contenido de ácido linolénico bajo se caracteriza por una deleción en el gen FAD3-1 C. Las regiones genómicas de soya que confieren el fenotipo de contenido de ácido linolénico bajo también se pueden caracterizar por un polimorfismo de un solo nucleótido en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 B correspondiente al nucleótidos 2021 de SEQ ID NO: 61 y una deleción en la secuencia de gen FAD3-1C. Las regiones genómicas de soya que confieren el fenotipo de contenido de ácido linolénico bajo también se pueden caracterizar por un polimorfismo de un solo nucleótido en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 B correspondiente al nucleótido 2021 de SEQ ID NO: 61 y un polimorfismo en el promotor FAD3-1 C, tal como un polimorfismo de un solo nucleótido en una posición correspondiente al nucleótido 334, 364, 385, 387, 393, 729 o 747 de SEQ ID NO: 63. El germoplasma de soya que comprenden una deleción en el gen FAD3-1 C de soya es útil en la práctica de estos métodos y se puede obtener a partir delineas de soya que incluyen pero no se limitan a las líneas de soya 6P248, T27111 , T27190, T26767, T26830 y A5, descritas en la solicitud de patente de E.U.A. No. 11/239,676. Los cuadros 3 y 4 de los ejemplos describen la asociación de polimorfismos específicos con el germoplasma de soya específico o líneas de soya que despliegan fenotipos de ácido linolénico bajo.
Sin estar limitado por la teoría, cabe notar además que ciertos polimorfismos y deleciones en ciertos genes FAD3-1C son potencialmente responsables en parte de los fenotipos de ácido linolénico bajo desplegados por plantas de soya que portan estos polimorfismos o deleciones. El SNP en la posición 2021 en SEQ ID NO: 61 es una mutación de sentido que cambia un residuo de aminoácido de histidina a tirosina. Se ha encontrado que el residuo de histidina es crítico en un número de genes implicados con desaturación. Este SNP particular encontrado causó una mutación en el motivo His-Val-lle- His-His to His-Val-lle-His-Tyr en sus líneas de ácido linolénico bajo. El motivo ha sido asociado con un fenotipo de ácido linolénico bajo y es una probable causa del fenotipo de ácido linolénico reducido observado en frijoles de soya con este polimorfismo. La detección del polimorfismo de un solo nucleotido se puede llevar a cabo por cualquier método, incluyendo PCR, análisis de polimorfismo conformacional de una sola cadena, electroforesis de gel de gradiente desnaturalizador, análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de digestión y/o secuenciación de ADN como se describe en la solicitud de patente de E.U.A. NO. 11/239,676. Alternativamente, el polimorfismo de un solo nucleotido puede ser detectado por cualquier prueba seleccionada del grupo que consiste de extensión de una sola base (SBE), secuenciación de extensión de iniciador específico de alelo (ASPE), secuenciación, PCR universal, extensión específica de alelo, hibridación, espectrometría de masa, ligación, extensión-ligación, y pruebas mediadas por Flap Endonucleasa. Los iniciadores y métodos para detección de los polimorfismos genéticos FAD3-1 B y FAD3-1 C antes mencionados se describen en la solicitud de patente de E.U.A. NO. 11/239,676. Deleciones tales como aquellas en el gen FAD3-1C pueden ser detectadas por métodos que incluyen pero no se limitan a PCR, hibridación, análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de digestión y/o métodos basados en secuenciación de ADN. Los métodos de cruza, como se describió antes, también se pueden usar para obtener plantas de soya de ácido linolénico bajo/baja saturación/ácido oleico mediano. En estos métodos, las plantas de soya con ácido linolénico bajo antes mencionadas se cruzan con plantas de soya que comprenden transgenes que disminuyen la expresión tanto de un gen FAD2-1 de soya endógeno como un gen FATB de soya endógeno para la producción de plantas de soya con un fenotipo de ácido linolénico bajo, ácido graso saturado bajo, ácido oleico mediano. Además se contempla que las cruzas del transgén(es) a las líneas de soya de ácido lenolénico bajo pueden ser facilitadas por enlace de un marcador seleccionable que confiere resistencia a un herbicida. Por ejemplo, en cruzas de plantas de soya que son heterocigoticas para el transgén con plantas que son ya sea homocigóticas o heterocigoticas para el alelo(s) que confiere el rasgo de ácido linolénico bajo, progenie F1 que son heterocigoticas para el transgén pueden ser seleccionadas por tratamiento con herbicida. También, plantas F2 derivadas de plantas F1 que son heterocigoticas para el transgén pueden ser enriquecidas para plantas de soya F2 que son homocigoticas para dicho transgén al someter dicha pluralidad de plantas F2 a selección de herbicida para el transgén. Marcadores moleculares que pueden distinguir plantas de soya que son ya sea heterocigoticas u homocigoticas para el transgén también se pueden usar para identificar plantas de soya que son homocigoticas para la inserción del transgén. Las plantas de soya (nivel máximo de glicina) pueden ser cruzadas ya sea mediante técnicas naturales o mecánicas. La polinización natural ocurre en frijoles de soya ya sea por autopolinización o polinización cruzada natural, que típicamente es auxiliada por organismos polinizadores. En cruzas ya sea naturales o artificiales, la floración y el tiempo de floración son una consideración importante. La soya es una planta de día corto, pero hay variación genética considerable para sensibilidad al fotoperíodo. La longitud del día crítica para la floración varía de aproximadamente 13 hr para genotipos adaptados a latitudes tropicales a 24 hr para genotipos insensibles al fotoperíodo que crecen a latitudes más altas. Los frijoles de soya parecen ser insensibles a la longitud del día por 9 días después de la emergencia. Los fotoperíodos más cortos que la longitud del día crítica se requieren para 7 a 26 días para completar la inducción de la flor. Las flores de soya típicamente son autopolinizadas en el día que se abre la corola. El estigma es receptivo al polen aproximadamente 1 día antes de la antesis y permanece receptivo por 2 días después de la antesis, si los pétalos de la flor no son removidos. Los filamentos de nueve estambres son fusionados, y el más cercano al estándar es libre. Los estambres forman un anillo por abajo del estigma hasta aproximadamente 1 día antes de la antesis, después sus filamentos empiezan alargarse rápidamente y elevan las anteras alrededor del estigma. Las anteras se abren el día de la antesis, los granos de polen caen en el estigma, y dentro de 10 hr los tubos de polen alcanzan el ovario y la fertilización se completa. La autopolinización ocurre naturalmente en soya sin manipulación de las flores. Para la cruza de dos plantas de soya, es típicamente preferible, aunque no requerido, utilizar hibridación artificial. En la hibridación artificial, la flor usada como sexo femenino en una cruza se somete a polinización cruzada manualmente antes de la maduración del polen de la flor, evitando así la auto-fertilización, o alternativamente, las partes masculinas de la flor son emasculadas usando una técnica conocida en la técnica. Las técnicas para emasculación de las partes de la flor de soya incluyen, por ejemplo, remoción física de las partes masculinas, el uso de un factor genético que confiere esterilidad masculina y la aplicación de un gametocida químico a las partes masculinas. Ya sea con o sin emasculación de la flor femenina, la polinización manual se puede llevar a cabo removiendo los estambres y pistilo con unas pinzas de una flor del progenitor masculino y cepillando suavemente las anteras contra el estigma de la flor femenina. El acceso a los estambres se puede lograr removiendo el sépalo frontal y pétalos de la carina, o perforando la carina con pinzas cerradas y dejando que se abran para empujar los pétalos separándolos. El cepillado de las anteras en el estigma hace que se rompan, y el porcentaje más alto de cruzas exitosas se obtiene cuando el polen es claramente visible en el estigma. El polen desprendido puede ser verificado golpeando ligeramente las anteras antes de cepillar el estigma. Varias flores masculinas pueden tener que usarse para obtener polen adecuado desprendido cuando las condiciones son desfavorables, o la misma flor masculina se puede usar para polinizar varias flores con buen desprendimiento de polen. La esterilidad masculina genética está disponible en frijoles de soya y puede ser útil para facilitar la hibridación en el contexto de la presente invención, particularmente para programas de selección recurrentes. La distancia requerida para aislamiento completo de un bloque de cruza no es clara; sin embargo, el cruzamiento externo es menor que 0.5% cuando las plantas estériles masculinas están a 12 m o más de una fuente de polen extraña (Boerma and Moradshahi, Crop ScL, 15:858-861 , 1975). Las plantas en los límites de un bloque de cruza probablemente sostienen la mayor parte del cruzamiento externo con polen extraño y pueden ser eliminadas en la cosecha para reducir al mínimo la contaminación. Una vez cosechadas, las vainas son típicamente secadas con aire a no más de 38°C hasta que las semillas contienen 13% de humedad o menos, entonces las semillas son removidas con la mano. La semilla se puede almacenar satisfactoriamente a aproximadamente 25°C hasta por un año si la humedad relativa es 50% o menos. En climas húmedos, el porcentaje de germinación declina rápidamente a menos que la semilla se seque a 7% de humedad y se almacene en un contenedor hermético al aire a temperatura ambiente. El almacenamiento a largo plazo en cualquier clima es mejor acompañado secando la semilla a 7% de humedad y almacenándola a 10°C o menos en un cuarto mantenido a 50% de humedad relativa o en un contenedor hermético al aire.
F. Productos de la presente invención Las plantas de la presente invención se pueden usar en su totalidad o en parte. Las partes de plantas preferidas incluyen partes reproductivas o de almacenamiento. El término "partes de plantas", como se usa aquí, incluye, sin limitación, semilla, endospermo, óvulo, polen, raíces, tubérculos, tallos, hojas, pedúnculos, frutos, bayas, nueces, corteza, vainas, semilla y flores. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, la parte de la planta es una semilla. Cualquiera de las plantas o partes de la misma de la presente invención pueden ser procesadas para producir una preparación de alimento para animales, harina, proteína o aceite. Una parte de la planta particularmente preferida para este propósito es una semilla. En una modalidad preferida, la preparación de alimento para animales, harina, proteína o aceite está diseñada para animales de ganado, peces o humanos, o cualquier combinación. Los métodos para producir preparaciones de alimento para animales, harina, proteína o aceite son conocidos en la técnica. Véase, v.gr., patentes de E.U.A. 4,957,748, 5,100,679, 5,219,596, 5,936,069, 6,005,076, 6,146,669 y 6,156,227. En una modalidad preferida, la preparación de proteína es una preparación con proteína alta. Dicha preparación con proteína alta preferiblemente tiene un contenido de proteína mayor que 5% p/v, muy preferiblemente 10% p/v, y muy preferiblemente aún 15% p/v. En una preparación de aceite preferida, la preparación de aceite es una preparación de aceite alto con un contenido de aceite derivado de una planta o parte de la misma de la presente invención de más de 5% p/v, muy preferiblemente 10% p/v, y muy preferiblemente aún 15% p/v. En una modalidad preferida, la preparación de aceite es un líquido y de un volumen mayor que 1 , 5, 10 ó 50 litros. La presente invención provee aceite producido por plantas de la presente invención o generado por un método de la presente invención. Dicho aceite puede presentar estabilidad oxidativa incrementada. También, dicho aceite puede ser un componente menor o mayor de cualquier producto resultante. Más aún, dicho aceite se puede mezclar con otros aceites. En una modalidad preferida, el aceite producido por plantas de la presente invención o generado por un método de la presente invención constituye más de 0.5%, 1 %, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ó 90% en volumen o peso del componente de aceite de cualquier producto. En otra modalidad, la preparación de aceite se puede mezclar y puede constituir más de 10%, 25%, 35%, 50% ó 75% de la mezcla en volumen. El aceite producido por una planta de la presente invención se puede mezclar con uno o más solventes orgánicos o destilados de petróleo.
Las semillas de las plantas se pueden colocar en un contenedor. Como se usa aquí, un contenedor es cualquier objeto capaz de contener dichas semillas. Un contenedor preferiblemente contiene más de aproximadamente 500, 1 ,000, 5,000 ó 25,000 semillas en donde por lo menos aproximadamente 10%, 25%, 50%, 75% ó 100% de las semillas se derivan de una planta de la presente invención. La presente invención también provee un contenedor por arriba de aproximadamente 10,000, muy preferiblemente aproximadamente 20,000 y muy preferiblemente aún aproximadamente 40,000 semillas en donde por arriba de aproximadamente 10%, muy preferiblemente aproximadamente 25%, muy preferiblemente 50% y muy preferiblemente aún aproximadamente 75% ó 90% de las semillas son semillas derivadas de una planta de la presente invención. La presente invención también provee un contenedor por arriba de aproximadamente 10 kg, muy preferiblemente aproximadamente 25 kg, y muy preferiblemente aún aproximadamente 50 kg semillas en donde por arriba de aproximadamente 10%, muy preferiblemente aproximadamente 25%, muy preferiblemente aproximadamente 50% y muy preferiblemente aún aproximadamente 75% ó 90% de las semillas son semillas derivadas de una planta de la presente invención. Las semillas de soya producidas por los métodos de la invención pueden comprender varias composiciones de aceite. Un aceite producido por semillas de soya producido por los métodos de la invención se refiere más adelante com un "aceite de la presente invención".
Un aceite preferido de la presente invención tiene una composición de aceite con baja saturación, o una composición de aceite con saturación cero. En otras modalidades preferidas, los aceites de la presente invención tienen niveles de ácido oleico incrementados, niveles de ácido graso saturado reducidos, y niveles de ácidos grasos poliinsaturados reducidos. En modalidades preferidas adicionales, los aceites de la presente invención tienen niveles de ácido oleico incrementados y niveles de ácido graso saturado reducidos. En una modalidad preferida, el aceite es un aceite de soya. Los porcentajes de contenido de ácido graso, o niveles de ácido graso, usados aquí se refieren a porcentajes en peso. En una primera modalidad, un aceite de la presente invención preferiblemente tiene una composición de aceite que es 55 a 80% ácido oleico, aproximadamente 12 a 43% ácidos grasos poliinsaturados, y 2 a 8% ácidos grasos saturados; muy preferiblemente tiene una composición de aceite que es 55 a 80% ácido oleico, aproximadamente 14 a 42% ácidos grasos poliinsaturados, y 3 a 6% ácidos grasos saturados; y muy preferiblemente aún tiene una composición de aceite que es 55 a 80% ácido oleico, aproximadamente 16.5 a 43% ácidos grasos poliinsaturados, y 2 a 3.6% ácidos grasos saturados. En una segunda modalidad, un aceite de la presente invención preferiblemente tiene una composición de aceite que es 65 a 80% ácido oleico, aproximadamente 12 a 33% ácidos grasos poliinsaturados, y 2 a 8% ácidos grasos saturados; muy preferiblemente tiene una composición de aceite que es 65 a 80% ácido oleico, aproximadamente 14 a 32% ácidos grasos poliinsaturados, y 3 a 6% ácidos grasos saturados; y muy preferiblemente aún tiene una composición de aceite que es 65 a 80% ácido oleico, aproximadamente 16.5 a 33% ácidos grasos poliinsaturados, y 2 a 3.6% ácidos grasos saturados. En una tercera modalidad, un aceite de la presente invención preferiblemente tiene una composición de aceite que es aproximadamente 42 a aproximadamente 85% ácido oleico y aproximadamente 8% a aproximadamente 1 .5% ácidos grasos saturados. En una cuarta modalidad, un aceite de la presente invención tiene una composición de aceite que es aproximadamente 42 a aproximadamente 85% ácido oleico, aproximadamente 8% a aproximadamente 1 .5% ácidos grasos saturados, aproximadamente 6% a aproximadamente 15% en peso ácido linolénico; muy preferiblemente tiene una composición de aceite que es aproximadamente 42 a aproximadamente 85% ácido oleico, aproximadamente 8% a aproximadamente 1 .5% ácidos grasos saturados, menos de 35% en peso ácido linolénico; y muy preferiblemente aún tiene una composición de aceite que es aproximadamente 42 a aproximadamente 85% ácido oleico, aproximadamente 8% a aproximadamente 1.5% ácidos grasos saturados, aproximadamente 9% en peso ácido linolénico. En una quinta modalidad, un aceite de la presente invención tiene una composición de aceite que es aproximadamente 50% a aproximadamente 85% ácido oleico y aproximadamente 8% a aproximadamente 1.5% ácidos grasos saturados; muy preferiblemente aproximadamente 50% a aproximadamente 85% ácido oleico, aproximadamente 8% a aproximadamente 1.5% ácidos grasos saturados, aproximadamente 4% a aproximadamente 14% en peso ácido linolénico; muy preferiblemente tiene una composición de aceite que es aproximadamente 50% a aproximadamente 85% ácido oleico, aproximadamente 8% a aproximadamente 1.5% ácidos grasos saturados, menos de 35% en peso ácido linolénico; y muy preferiblemente aún tiene una composición de aceite que es aproximadamente 42 a aproximadamente 85% ácido oleico, aproximadamente 8% a aproximadamente 1.5% ácidos grasos saturados, aproximadamente 2% a aproximadamente 45% en peso ácido linolénico. En otra modalidad, un aceite de la presente invención tiene una composición de aceite que es aproximadamente 65-80% ácido oleico, aproximadamente 3-8% ácidos grasos saturados, y aproximadamente 12-32% ácidos grasos poliinsaturados. En otra modalidad, un aceite de la presente invención tiene una composición de aceite que es aproximadamente 65-80%) ácido oleico, aproximadamente 2-3.5% ácidos grasos saturados, y aproximadamente 16.5-33% ácidos grasos poliinsaturados. En una modalidad particularmente preferida, un aceite de la presente invención tiene una composición de aceite que es aproximadamente 47-83% ácido oleico y aproximadamente 5% ácidos grasos saturados; aproximadamente 60- 80% ácido oleico y aproximadamente 5% ácidos grasos saturados; aproximadamente 50-85% ácido oleico y aproximadamente 2-7% ácidos grasos saturados; aproximadamente 55-85% ácido oleico y aproximadamente 2.5-7% ácidos grasos saturados; aproximadamente 47-88% ácido oleico y aproximadamente 3-7% ácidos grasos saturados; aproximadamente 43-85% ácido oleico y aproximadamente 5-7% ácidos grasos saturados; aproximadamente 81 -85% ácido oleico y aproximadamente 5% ácidos grasos saturados; aproximadamente 74-83% ácido oleico y aproximadamente 6% ácidos grasos saturados; aproximadamente 65-87% ácido oleico y aproximadamente 6% ácidos grasos saturados; aproximadamente 66-80% ácido oleico y aproximadamente 6% ácidos grasos saturados; aproximadamente 42-77% ácido oleico y aproximadamente 5-8% ácidos grasos saturados; aproximadamente 60-77% ácido oleico y aproximadamente 6% ácidos grasos saturados; aproximadamente 70-81 % ácido oleico y aproximadamente 5-7% ácidos grasos saturados; aproximadamente 52-71 % ácido oleico y aproximadamente 5-7% ácidos grasos saturados; aproximadamente 44-71% ácido oleico y aproximadamente 6% ácidos grasos saturados; aproximadamente 61-71% ácido oleico y aproximadamente 8% ácidos grasos saturados; aproximadamente 57-71% ácido oleico y aproximadamente 7% ácidos grasos saturados; aproximadamente 23-58% ácido oleico y aproximadamente 8-14% ácidos grasos saturados; aproximadamente 20-70% ácido oleico y aproximadamente 6% ácidos grasos saturados; aproximadamente 21 -35% ácido oleico y aproximadamente 5-6% ácidos grasos saturados; o aproximadamente 19-28% ácido oleico y aproximadamente 5% ácidos grasos saturados. En otras modalidades, el porcentaje de ácido oleico es 50% o mayor; 55% o mayor; 60% o mayor; 65% o mayor; 70% o mayor; 75% o mayor; o 80% o mayor; o es un intervalo de 50 a 80%; 55 a 80%; 55 a 75%; 55 a 65%; 60 a 85%; 60 a 80%; 60 a 75%; 60 a 70%; 65 a 85%; 65 a 80%; 65 a 75%; 65 a 70%; o 69 a 73%. Los intervalos de porcentaje adecuados para contenido de ácido oleico en aceites de la presente invención también incluyen intervalos en los cuales el límite inferior se selecciona de los siguientes porcentajes: 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ó 80 por ciento; y el límite superior se selecciona de los siguientes porcentajes: 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 ó 90 por ciento. En otras modalidades, el porcentaje de ácido linolénico en un aceite de la presente invención es 10% o menor; 9% o menor; 8% o menor; 7% o menor; 6% o menor; 5% o menor; 4.5% o menor; 4% o menor; 3.5% o menor; 3% o menor; 3.0% o menor; 2.5% o menor; o 2% o menor; o es un intervalo de 0.5 a 2%; 0.5 a 3%; 0.5 a 4.5%; 0.5% a 6%; 3 a 5%; 3 a 6%; 3 a 8%; 1 a 2%; 1 a 3%; o 1 a 4%. En estas otras modalidades, el porcentaje de ácidos grasos saturados en una composición de aceite de la presente invención es 15% o menor; 14% o menor; 13% o menor; 12% o menor, 1 1 % o menor; 10% o menor; 9% o menor; 8% o menor; 7% o menor; 6% o menor; 5% o menor; 4% o menor; o 3.6% o menor; o es un intervalo de 2 a 3%; 2 a 3.6%; 2 a 4%; 2 a 8%; 3 a 15%; 3 a 10%; 3 a 8%; 3 a 6%; 3.6 a 7%; 5 a 8%; 7 a 10%; o 10 a 15%. En otras modalidades, ácidos grasos saturados en un aceite de la presente invención incluye la combinación de los ácidos grasos palmítico y esteárico. En una modalidad, el porcentaje de ácidos grasos saturados varía de aproximadamente 10% o menor; aproximadamente 9% o menor; aproximadamente 8% o menor; aproximadamente 7% o menor; aproximadamente 6% o menor; aproximadamente 5% o menor; aproximadamente 4.5% o menor; aproximadamente 4% o menor; aproximadamente 3.5% o menor; aproximadamente 3% o menor; aproximadamente 3.0% o menor; aproximadamente 2.5% o menor; o aproximadamente 2% o menor; o es un intervalo de 0.5 a 2%; 0.5 a 3%; 0.5 a 4.5%; 0.5 a 6%; 0.5 a 7%; 0.5 a 8%; 0.5 a 9%; 1 a 4%; 1 a 5%; 1 a 6%; 1 a 7%; 1 a 8%; 1 a 9%; 1.5 a 5%; 1.5 a 6%; 1.5 a 7%; 1.5 a 8%; 1.5 a 9%; 2 a 5%; 2 a 6%; 2 a 7%; 2 a 8%; 2 a 9%; 3 a 5%; 3 a 6%; 3 a 7%; 3 a 8%; 3 a 9%; 4 a 7%; 4 a 8%; 4 a 9%; 5 a 7%; 5 a 8%; y 5 a 9%. En estas modalidades, intervalos de porcentaje adecuados para contenido de ácido graso saturado en aceites de la presente invención también incluyen intervalos en los cuales el límite inferior se selecciona de los siguientes porcentajes: 0.5, 1 , 1.5, 2., 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6 ó 6.5 por ciento; y el límite superior se selecciona de los siguientes porcentajes: 11 , 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1 ó 0.5 por ciento.
G. Modulación de supresión Otra modalidad de la invención está dirigida a un método de modulación de niveles de supresión de gen. La modulación de supresión de gen puede dar por resultado más o menos supresión de gen. La supresión de un producto de gen puede ser el resultado de inserción de una construcción de la presente invención en un genoma de planta. De manera similar, la modulación de supresión de gen puede ser el resultado de inserción de una construcción de la presente invención en un genoma de planta. Otros ejemplos de métodos para modular la supresión de gen incluyen, sin limitación, técnicas de antisentido, cosupresión, interferencia de ARN (dsRNAi), animales transgénicos, híbridos y ribozimas usando una construcción de la presente invención. Los siguientes ejemplos se proveen a manera de ilustración, y no deben considerarse como limitantes de la presente invención. La supresión de un gen puede ser modulada alterando la longitud del ADN transcribible usado para supresión, dicha secuencia se deriva del gen objetivo para supresión. Muchos métodos se pueden usar para suprimir un gen usando mecanismos de silenciamiento de genes post-transcripcional. Sin estar limitado por la teoría, se cree que estos métodos tienen en común la expresión de una molécula de ARN que híbrida a otra molécula de ARN. De manera sorprendente, puede haber ventajas para usar una molécula de ARN de longitud particular para modular o moderar la supresión de los niveles de expresión de estado estable de un gen endógeno objetivo. La supresión de gen de FAD2-1 conduce a niveles elevados de ácido oleico y reducción de niveles de ácido linoleico. Cuando FAD2-1 es fuertemente suprimido, los niveles de ácido oleico pueden ser mayores que 65%, que causa una reducción en los niveles de ácido palmítico y ácido linolénico. Por ejemplo, cuando el FAD2-1 es suprimido, los noveles de ácido oleico pueden alcanzar 85% y los niveles combinados de ácido palmítico y esteárico son reducidos a aproximadamente 10%. De manera similar, la regulación descendente de FATB da por resultado niveles disminuidos de ácidos grasos saturados, principalmente palmitato. Cuando FAD2 y FATB son suprimidos por lo que los niveles de ácido oleico son aproximadamente 85%, los niveles de ácido graso saturado son aproximadamente 10%. Cuando FAD2 y FATB son suprimidos de modo que los niveles de ácido oleico son mayores que 85%, los niveles de ácidos grasos saturados pueden caer por abajo de 107o. A la luz de la presente invención, los niveles de ácido graso saturado pueden ser reducidos a menos de 10% sin incrementar el ácido oleico por arriba de 85%. En una modalidad, la supresión de FAD2 es modulada al reducir la longitud de intrón FAD2-1 introducido en la planta. Menos supresión de FAD2 da por resultado niveles moderados de ácido oleico, aproximadamente 40-85% de ácido oleico. La supresión de FAD2 se reduce a medida que la longitud de fragmento de intrón FAD2-1 introducido es reducida. Por ejemplo, un intrón de FAD2-1 reducido en longitud por lo menos por 100 nucleótidos contiguos puede reducir la supresión de FAD2 y el incremento correspondiente en ácido oleico y disminución en los niveles de ácido ácido linoleico. La relación entre la disminución en supresión endógena de gen y la disminución en longitud de ADN homólogo se puede determinar empíricamente al introducir diferentes longitudes de ADN. Por ejemplo, la cantidad de reducción en supresión obtenible al reducir la longitud de ADN introducido homólogo se puede determinar deletando porciones cada vez mayores del ADN homólogo que son introducidas y probando la expresión del gen objetivo. Incluido en la presente invención es un método para moderar la supresión de FAD2 mientras aún tiene una fuerte reducción de niveles saturados en una planta. En dichas plantas, los niveles de ácido oleico pueden variar de 40-85%. De manera similar, menos de supresión completa de FATB ocurre cuando las regiones combinadas 3' y 5' no traducidas son introducidas en comparación con cuando el gen FATB de longitud completa es introducido en una célula hospedero. De una manera similar, los niveles de supresión de FATB son reducidos cuando la parte 5' del marco de lectura abierta, que en su mayoría codifica el péptido de tránsito de cloroplasto, es introducido en una célula hospedero. En células con FAD2 y FATB suprimido usando métodos de conformidad con la presente invención, los niveles de ácido oleico puede ser 40-85% mientras que los niveles saturados pueden ser entre 1 a 9 por ciento.
En una modalidad, la presente invención está dirigida a un método de modular la supresión de gen para reducir la supresión en relación con la supresión de un elemento de gen entero, en donde un elemento de gen entero puede ser un gen entero, un exon entero, un intrón entero, una secuencia de señal entera, o una UTR entera, entonces la construcción de una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un fragmento de la secuencia endógena del elemento de gen; iniciando la expresión de la molécula de ácido nucleico recombinante en una célula hospedero; y suprimiendo el gen endógeno con la molécula de ácido nucleico recombinante. El gen que es suprimido puede ser cualquier gen, incluyendo FAD2 y FATB. En una modalidad, la presente invención está dirigida a un método de modulación de supresión de FAD2 o FATB que comprende la expresión de una secuencia de elemento de gen FAD2 o FATB parcial en una célula hospedero, en donde un elemento de gen FAD2 o FATB es de un gen FAD2 o FATB endógeno en la célula hospedero y una secuencia de elemento de gen FAD2 o FATB puede ser un gen FAD2 o FATB, un exon FAD2 o FATB, un intrón FAD2 o FATB, una región codificadora de péptido de tránsito FAD2 o FATB, o una UTR de FAD2 o FATB; y la secuencia de elemento de gen FAD2 o FATB parcial es menor que la secuencia de elemento de gen FAD2 o FATB entera; y suprimiendo un FAD2 o FATB endógeno con la secuencia de elemento de gen FAD2 o FATB parcial, en donde los niveles de supresión del gen endógeno FAD2 o FATB en la célula hospedero son menores que los niveles de supresión del gen endógeno FAD2 o FATB en una célula hospedero con un fondo genético similar y una segunda secuencia de ácido nucleico FAD2 o FATB que comprende la secuencia de elemento de gen FAD2 o FATB entera del elemento de gen FAD2 o FATB. En otra modalidad, la presente invención está dirigida a un método de alterar la composición de aceite de una célula vegetal al transformar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ADN que suprime la expresión endógena de FAD2, FATB, o FAD2 y FATB en donde la secuencia de ADN comprende una secuencia de ácido nucleico de FAD2, FATB, o FAD2 y FATB que es más corta que la secuencia entera de un elemento genético entero seleccionado de un gen, un exón, un intrón, una región codificadora de péptido de tránsito, una 3'-UTR, una 5'-UTR, y un marco de lectura abierta; y haciendo crecer la célula vegetal bajo condiciones en donde transcripción de dicha secuencia de ADN es iniciada, por lo que la composición de aceite es alterada en relación con una célula vegetal con un fondo genético similar pero que carece de la molécula de ácido nucleico recombinante. Un elemento de gen de FAD2 o FATB puede ser acortado en longitud por 50, 75, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 800, 1000, 2000, 3000 ó 4000 nucleótidos. Una longitud de un elemento de gen de FAD2 o FATB puede ser 50, 75, 100, 150, 175, 200, 220, 250, 300, 320, 350, 400, 420, 450, 500, 550, 600, 800 ó 1000 nucleótidos. En otra modalidad, la presente invención está dirigida a un método para incrementar el contenido de ácido oleico y al reducir el contenido de ácido graso saturado en una semilla de una planta al: i) acortar la longitud de una secuencia de ADN de FAD2 exógena en una célula hospedero hasta que la cantidad de supresión de expresión de FAD2 de una planta transformada es por lo menos parcialmente reducida en relación con la supresión de expresión de FAD2 en una célula hospedero con un fondo genético similar y una secuencia de ADN de gen FAD2 exógeno entera; y ii) hacer crecer una planta con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ADN de FAD2 acortada, en donde la secuencia de ADN de FAD2 acortada suprime por lo menos parcialmente expresión endógena de FAD2; y tii) cultivar una planta que produce semilla con un contenido reducido de ácido graso saturado en relación con semilla de una planta que tiene un fondo genético similar pero que carece de la secuencia de ADN de FAD2 acortada. La cantidad de que el ADN de FAD2 exógeno es acortado hasta por lo menos redcucir parcialmente la supresión del FAD2 endógeno se puede determinar empíricamente al introducir diferentes longitudes de ADN. Por ejemplo, la cantidad de reducción en supresión obtenible al reducir la longitud de ADN introducida análoga se puede determinar deletando porciones cada vez mayores del ADN homólogo que es introducido y probando para la expresión del gen objetivo. La cantidad de supresión de expresión de FAD2 se puede obtener como un promedio de tres o more, seis o más, diez o más, quince o más, o veinte o más semillas de una planta. En otra modalidad, la presente invención está dirigida a un método de producción de una planta transformada que tiene semilla con una reducida contenido de ácido graso saturado al transformar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ADN que suprime la expresión endógena de FAD2 y FATB, en donde la secuencia de ADN comprende una secuencia de ácido nucleico de FAD2 que es más corta que la secuencia entera de un elemento genético entero seleccionado de un gen, un exón, un intrón, una región codificadora de péptido de tránsito, y una UTR; y hacer crecer la planta transformada, en donde la planta transformada produce semilla con un contenido reducido de ácido graso saturado en relación con semilla de una planta que tiene un fondo genético similar pero que carece de la molécula de ácido nucleico recombinante. En otra modalidad, la presente invención está dirigida a un método de modular la composición de ácido graso de aceite de una semilla de una cosecha de semilla oleaginosa templada al aislar un elemento genético de por lo menos 40 nucleótidos de longitud que es capaz de suprimir la expresión de un gen endógeno en la vía de síntesis de ácido graso; generar más de un fragmento acortado del elemento genético; introducir cada uno de los más de un fragmentos acortados en una célula vegetal del cultivo de semilla oleaginosa templada para producir plantas transgénicas; y seleccionar una planta transgénica que comprende un fragmento acortado de longitud y secuencia determinada que efectúa un cambio deseable en composición de ácido graso de aceite de semilla. En una modalidad preferida, el método anterior también incluye construir una construcción de ADN recombinante que tiene por lo menos dos fragmentos acortados de dos genes endógenos diferentes que efectúan diferentes cambios deseables en composición de ácido graso de aceite de semilla; introducir la construcción de ADN recombinante en una célula vegetal de la cosecha de semilla oleaginosa templada para producir plantas transgénicas; y seleccionar una planta transgénica que comprende por lo menos los dos fragmentos acortados y una composición de ácido graso de aceite de una semilla que tiene más de un cambio deseable efectuado por lo menos por dos fragmentos acortados. En otra modalidad, la presente invención está dirigida a una semilla de soya que presenta una composición de aceite que tiene un contenido fuertemente reducido de ácido graso saturado y un contenido de ácido oleico moderadamente incrementado que tiene una secuencia de ADN que suprime la expresión endógena de FAD2 en una célula hospedero, en donde la secuencia de ADN tiene una secuencia de ácido nucleico de FAD2 que es más corta que la secuencia entera de un elemento genético entero seleccionado de un gen, un exón, un intrón, una región codificadora de péptido de tránsito, y una UTR.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar modalidades preferidas de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención, y por lo tanto se pueden considerar para constituir modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica, a la luz de la presente descripción, apreciarán que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y sin embargo obtienen un resultado semejante o similar sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. De manera más específica, será evidente que ciertos agentes que son tanto químicamente como fisiológicamente relacionado pueden sustituir a los agentes descritos aquí mientras los mismos o similares resultados se lograrían. Todos esos sustitutos similares y modificaciones evidentes para los expertos en la técnica se considera que están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define en las reivindicaciones anexas EJEMPL0 1 Aislamiento de secuencias de FATB-2 Tejido foliar se obtiene de variedad de soya A3244 de Asgrow, triturado en nitrógeno líquido y almacenado a 80°C hasta el uso. Seis mi de regulador de pH de extracción SDS (650 mi de ddH20 estéril, 100 mi de Tris-Cl 1 M, pH 8, 100 mi de EDTA 0.25M, 50 mi de SDS al 20%, 100 mi de NaCI 5M, 4 µ? de beta-mercaptoetanol) se añade a 2 mi de tejido foliar congelado/triturado, y la mezcla se incuba a 65°C durante 45 minutos. La muestra se agita cadsa 15 minutos. 2 mi de acetato de potasio 5M enfriado en hielo se añade a la mezcla, la muestra se agita, y después se incube sobre hielo durante 20 minutos. 3 mi de CHCI3 se añade a la muestra y la muestra se agita durante 10 minutos. La muestra se centrifuga a 10,000 rpm durante 20 minutos y se recoge el sobrenadante. 2 mi de isopropanol se añade al sobrenadante y se mezcla. La muestra después se centrifuga a 10,000 rpm durante 20 minutos y el sobrenadante se drena. La pastilla se vuelve a suspender a 200 µ? ARNsa y se incuba a 65°C durante 20 minutos. 300 µ? de acetato de amonio/isopropanol (1 :7) se añade y se mezcla. La muestra después se centrifuga a10,000 rpm durante 15 minutos y el sobrenadante se desecha. La pastilla se enjuaga con 500 µ? de etanol al 80% y se deja secar con aire. La pastilla de ADN genómico se vuelve a suspender después en 200 µ? de T10E1 (10 mM de Tris: 1 mM de EDTA). Una secuencia de contigo de ADNc de FATB-2 de soya (SEQ ID NO: 42) se usa para diseñar trece oligonucleótidos que abarcan el gen: F1 (SEQ ID NO: 48), F2 (SEQ ID NO: 49), F3 (SEQ ID NO: 50), F4 (SEQ ID NO: 51), F5 (SEQ ID NO: 52), F6 (SEQ ID NO: 53), F7 (SEQ ID NO: 54), R1 (SEQ ID NO: 55), R2 (SEQ ID NO: 56), R3 (SEQ ID NO: 57), R4 (SEQ ID NO: 58), R5 (SEQ ID NO: 59), y R6 (SEQ ID NO: 60). Los oligonucleótidos se usan en pares para amplificación por PCR del par de ADN genómico de soya aislado: par 1 (F1 + R1 ), par 2 (F2 + R1), par 3 (F3 + R2), par 4 (F4 + R3), par 5 (F5 + R4), par 6 (F6 + R5), y par 7 (F7 + R6). La amplificación por PCR para el par 5 se lleva a cabo como sigue: 1 ciclo, 95°C durante 10 minutos; 30 ciclos, 95°C durante 15 seg, 43°C durante 30 seg, 72°C durante 45 seg; 1 ciclo, 72°C durante 7 minutos. Para todos los otros pares de oligo, las amplificaciones por PCR se llevan a cabo como sigue: 1 ciclo, 95°C durante 0 minutos; 30 ciclos, 95°C durante 15 seg, 48°C durante 30 seg, 72°C durante 45 seg; 1 ciclo, 72°C durante 7 minutos. Los fragmentos positivos se obtienen de pares de iniciador 1 , 2, 4, 5, 6 y 7. Cada fragmento se clona en el vector pCR2.1 (Invitrogen). Los fragmentos 2, 4, 5 y 6 se confirman y secuencias. Estas cuatro secuencias están alineadas para formar una secuencia genómica para el gen FATB-2 (SEQ ID NO: 43). Cuatro intrones se identifican en el gen de FATB-2 de soya en comparación de la secuencia genómica a la secuencia de ADNc: intrón I (SEQ ID NO: 44) abarca la base 119 a base 1333 de la secuencia genómica (SEQ ID NO: 43) y es 1215 pb de longitud; intrón II (SEQ ID NO: 45) abarca la base 2231 a base 2568 de la secuencia genómica (SEQ ID NO: 43) y es 338 pb de longitud; intrón III (SEQ ID NO: 46) abarca la base 2702 a base 3342 de la secuencia genómica (SEQ ID NO: 43) y es 641 pb de longitud; y el intron IV (SEQ ID NO: 47) abarca la base 3457 a base 3823 de la secuencia genómica (SEQ ID NO: 43) y es 367 pb de longitud.
EJEMPLO 2 Construcciones de supresión 2A. Construcciones de FAD2-1 El intrón de FAD2-1A #1 (SEQ ID NO: 1 ) es clonado en el cásete de expresión, pCGN3892, en orientaciones de sentido y antisentido. El vector vector pCGN3892 contiene el promotor 7S de soya y un rbcS 3' de guisante. Ambas fusiones de genes se ligan después por separado en pCGN9372, un vector que contiene el gen CP4 EPSPS regulado por el promotor FMV. Las construcciones de expresión resultantes (sentido pCGN5469 y antisentido pCGN5471 , ilustrado en las figuras 1 y 2, respectivamente) se usan para transformación de soya. El intrón FAD2-1 B (SEQ ID NO: 2) es fusionado en el extremo 3' del intrón # 1 de FAD2-1 A en el plásmido pCGN5468 (contiene el promotor 7S de soya fusionado al intrón FAD2-1 A (sentido) y un rbcS 3' de guisante) o pCGN5470 (contiene el promotor 7S de soya fusionado al intrón FAD2-1 A (antisentido) y un rbcS 3' de guisante) en orientación de sentido y antisentido, respectivamente. Las fusiones de combinación de intrón resultantes después son ligadas por separado en pCGN9372, un vector que contiene el gen CP4 EPSPS regulado por el promotor FMV. Las construcciones de expresión resultantes (pCGN5485, sentido de intrón FAD2-1 A y FAD2-1 B y pCGN5486, antisentido de intrón FAD2-1 A y FAD2-1 B) se usan para la transformación de soya. 2B. Construcciones de FAD3-1 Intrones #1 , #2, #4 y #5 de FAD3-1A (SEQ ID NOs: 7, 8, 10 y 11 , respectivamente), intrones #3C (SEQ ID NO: 23) y #4 (SEQ ID NO: 24) de FAD3-1 B, son ligados por separado en pCGN3892, en orientación de sentido o antisentido. pCGN3892 contiene el promotor 7S de soya y un rbcS 3' de guisante. Estas fusiones son ligadas a pCGN9372, un vector que contiene el gen CP4 EPSPS regulado por el promotor FMV para transformación en soya. Las construcciones de expresión resultantes (pCGN5455, sentido de intrón # 4 de FAD3-1A; pCGN5459, antisentido de intrón # 4 de FAD3-1A; pCGN5456, sentido de intrón # 5 de FAD3; pCGN5460, antisentido de intrón # 5 de FAD3-1A; pCGN5466, antisentido de intrón # 2 de FAD3-1A; pCGN5473, antisentido de intrón # 1 de FAD3-1A) se usan para transformación de soya. 2C. Construcciones de FatB La secuencia de intrón II de FATB-1 de soya (SEQ ID NO: 30) es amplificada por PCR usando un clon genómico parcial de FATB-1 como una plantilla. La amplificación por PCR se lleva a cabo como sigue: 1 ciclo, 95°C durante 10 min; 25 ciclos, 95°C durante 30 seg, 62°C durante 30 seg, 72°C durante 30 seg; 1 ciclo, 72°C durante 7 min. La amplificación por PCR da por resultado un producto que es 854 pb de largo, incluyendo sitios de restricción manipulados genéticamente en ambos extremos. El producto de PCR es clonado directamente en el cásete de expresión pCGN3892 en orientación de sentido, por medio de sitios Xhol manipulados genéticamente en los extremos 5' de los iniciadores de PCR, para formar pMON70674. El vector pCGN3892 contiene el promotor 7S de soya y un rbcS 3' de guisante. pMON70674 es después cortado con Notl y ligado en pMON41 164, un vector que contiene el gen CP4 EPSPS regulado por el promotor FMV. La construcción de expresión de gen resultante, pMON70678, se usa para la transformación de soya usando métodos de Agrobacterium. 2D Construcciones de combinación Se hacen construcciones de expresión que contienen varias permutaciones de: 1 ) una secuencia de FAD2-1 sola (para métodos de producción de soya con ácido linolénico bajo, ácido oleico medio) y 2) combinaciones de secuencias de ADN de FAD2-1 y FATB. Las secuencias de ADN son cualquiera de aquellas descritas, o ilustradas en el cuadro 2, o cualquier otro conjunto de secuencias de ADN que contienen varias combinaciones de regiones no codificadoras o codificadoras de FAD2 y/o FATB de sentido, antisentido, o sentido y antisentido por lo que son capaces de formar construcciones de dsARN, construcciones de cosupresión de sentido, construcciones de antisentido, o varias combinaciones de las anteriores. La figura 4 ilustra secuencias de ADN que son capaces de expresar construcciones de cosupresión de sentido o antisentido de conformidad con la presente invención, las secuencias no codificadoras de las cuales se describen en los cuadros 1 y 2 más adelante. Las secuencias no codificadoras pueden ser secuencias individuales, combinaciones de secuencias (v.gr., la 5'UTR ligada a la 3'UTR), o cualquier combinación de las anteriores. Para expresar una construcción de cosupresion de sentido, todas las secuencias no codificadoras son secuencias de sentido, y para expresar una construcción de antisentido, todas las secuencias no codificadoras son secuencias de antisentido. Para expresar construcciones de sentido y antisentido, se proveen tanto las secuencias de sentido como de antisentido. La figura 5 ilustra varios primeros conjuntos de secuencias de ADN que son capaces de expresar construcciones de dsARN de conformidad con la presente invención, las secuencias no codificadoras de las cuales se describen en los cuadros 1 y 2 más adelante. El primer conjunto de secuencias de ADN ilustrado en la figura 5 comprende pares de secuencias de sentido y antisentido relacionadas, dispuestas de tal manera que, v.gr., el ARN expresado por la secuencia de primer sentido es capaz de formar un ARN de doble cadena con el ARN de antisentido expresado por la primera secuencia de antisentido. Por ejemplo, haciendo referencia al vector más arriba de la figura 5 y combinación ilustrativa No. 1 (del cuadro 1 ), el primer conjunto de secuencias de ADN comprende una secuencia de FAD2-1 de sentido, una secuencia de FAD3-1 de sentido, una secuencia de FAD2-1 ed antisentido y una secuencia de FAD3-1 de antisentido. Ambas secuencias de antisentido corresponden a las secuencias de sentido de modo que los productos de expresión del primer conjunto de secuencias de ADN son capaces de formar un ARN de doble cadena unas con otras. Las secuencias de sentido pueden ser separadas de las secuencias de antisentido por una secuencia separadora, preferiblemente uno que promueve la formación de una molécula de dsARN. Ejemplos de dichas secuencias separadoras incluyen aquellas expuestas en Wesley et al., supra, y Hamilton et al., Plant J., 15:737-746 (1988). El promotor es cualquier promotor funcional en una planta, o cualquier promotor de planta. Ejemplos no limitantes de promotores adecuados se describen en la parte A de la descripción detallada. El primer conjunto de secuencias de ADN es insertado en la construcción de expresión ya sea en la orientación de sentido o anti-sentido usando una variedad de técnicas de manipulación de ADN. Si los sitios de restricción conveniente están presentes en las secuencias de ADN, se insertan en la construcción de expresión al digerir con las endonucleasas de restricción y ligación en la construcción que ha sido digerida en uno o más de los sitios de clonación disponibles. Si los sitios de clonación convenientes no están disponibles en las secuencias de ADN, el ADN ya sea de la construcción a las secuencias de ADN secuencias es modificada en una variedad de formas para facilitar la clonación de las secuencias de ADN en la construcción. Ejemplos de métodos para modificar el ADN incluyen por PCR, ligación por enlazador sintético o adaptador, mutagénesis dirigida al sitio in vitro, llenado o corte de extremos 5' o 3' colgantes, y similares. Estos y otros métodos de manipulación de ADN son bien conocidos por los expertos en la técnica.
CUADRO 1 Combinaciones Secuencias codificadoras o no codificadoras (sentido o antisentido) ilustrativas Primera Segunda Tercera Cuarta 1 FAD2-1AoB FAD3-1AoBoC 2 FAD3-1AoBoC FAD2-1A o B 3 FAD2- 1A o B FAD3-1AoBoC secuencia FAD3- 1A o B o C diferente 4 FAD2- 1A o B FAD3-1Ao BoC FATB-1 5 FAD2- 1A o B FATB-1 FAD3-1AoBoC 6 FAD3-1AoBoC FAD2-1A o B FATB-1 7 FAD3-1AoBoC FATB-1 FAD2-1A 0 B 8 FATB-1 FAD3-1AoBoC FAD2-1A 0 B 9 FATB-1 FAD2-1A o B FAD3-1AoBoC 10 FAD2-1A o B FAD3-1AoBoC secuencia FAD3- FATB-1 1A o B o C diferente 11 FAD3-1A o BoC FAD2-1A o B secuencia FAD3- FATB-1 1A o B o C diferente 12 FAD3-1A o B o C secuencia FAD3- FAD2-1A o B FATB-1 1A o B o C diferente 13 FAD2-1A o B FAD3-1AO BoC FATB-1 secuencia FAD3- 1A o B o C diferente 14 FAD3-1AoBoC FAD2-1A o B FATB-1 secuencia FAD3- 1A o B o C diferente 15 FAD3-1AoBoC secuencia FAD3- FATB-1 FAD2-1A o B 1A o B o C diferente 16 FAD2-1A o B FATB-1 FAD3-1AoBoC secuencia FAD3- 1A o B o C diferente 17 FAD3-1AO BoC FATB-1 FAD2-1A 0 B secuencia FAD3- 1A o B o C diferente 18 FAD3-1AoBoC FATB-1 secuencia FAD3- FAD2-1A o B 1A o B o C diferente 19 FATB-1 FATB-1 FAD3-1AoBoC secuencia FAD3- 1A o B o C diferente 20 FATB-1 FAD3-1AoBoC FAD2-1A o B secuencia FAD3- 1A o B o C diferente 21 FATB-1 FAD3-1AoBoC secuencia FAD3- FAD2-1A o B 1A o B o C diferente FAD2-1AoB FAD3-1A 0B0C FATB-2 FAD2-1A o B FATB-2 FAD3-1A 0 B 0 C FAD3-1AoBoC FAD2- 1A 0 B FATB-2 FAD3-1A O BO C FATB-2 FAD2- 1AoB FATB-2 FAD3-1A O BoC FAD2- 1AoB FATB-2 FAD2- 1A 0 B FAD3- IA0B0C FAD2-1A o B FAD3-1A 0 B 0 C secuencia FAD3- FATB-2 1A 0 B 0 C diferente FAD3-1AoBoC FAD2-1A 0 B secuencia FAD3- FATB-2 1A 0 B 0 C diferente FAD3-1AoBoC secuencia FAD3- FAD2-1A 0 B FATB-2 1A 0 B 0 C diferente FAD2-1A o B FAD3-1A 0B0C FATB-2 secuencia FAD3- 1A 0 B 0 C diferente FAD3-1AoBoC FAD2-1A 0 B FATB-2 secuencia FAD3- 1A 0 B 0 C diferente FAD3-1AoBoC secuencia FAD3- FATB-2 FAD2-1A 0 B 1A 0 B 0 C diferente FAD2- 1A o B FATB-2 FAD3- 1A 0 B 0 C secuencia FAD3- 1A 0 B 0 C diferente FAD3-1AoBoC FATB-2 FAD2-1A 0 B secuencia FAD3- 1A 0 B 0 C diferente FAD3- 1AoBoC FATB-2 secuencia FAD3- FAD2-1A 0 B 1A 0 B 0 C diferente FATB-2 FAD2-1A 0 B FAD3-1A O BoC secuencia FAD3- 1A 0 B 0 C diferente FATB-2 FAD3-1A 0 B 0 C FAD2- 1A 0 B secuencia FAD3- 1A 0 B 0 C diferente FATB-2 FAD3-1A 0 B 0 C secuencia FAD3- FAD2- 1A 0 B 1A 0 B 0 C diferente FAD2-1A 0 B FATB-1 FAD2-1A 0 B FATB-2 FAD2-1A 0 B FATB-1 FATB-2 FAD2-1A FAD2-1B FATB-1 FAD2-1A FAD2-1B FATB-1 FATB-2 FAD2-1A 0 B FAD2-1A 0 B FATB-1 0 FATB- FATB-1 0 FATB-2 2 CUADRO 2 EJEMPLO 3 3A. Construcciones de antisentido Haciendo referencia ahora a la figura 6, secuencias no codificadoras de FATB-2 (SEQ ID NOs: 44-47), secuencias no codificadoras de FATB-1 (SEQ ID NOs: 29-37) y secuencias no codificadoras de FAD2-1 de soya (SEQ ID NOs: 1 y 5-6) son amplificadas por PCR para dar por resultado productos de PCR que incluyen sitios de restricción manipulados genéticamente en ambos extremos. Los productos de PCR son clonados directamente en orientación de sentido y antisentido en un vector que contiene el promotor de 7Sa' de soya y una secuencia de terminación de tml 3'. El vector se corta después con una endonucleasa de restricción apropiada y se liga en pMON80612, un vector que contiene el gen CP4 EPSPS regulado por el promotor de FMV y una secuencia de terminación de Rubisco E9 3' de guisante. La construcción de expresión de gen resultante se ilustra en la construcción más abajo de la figura 6 y se usa para la transformación usando métodos como se describe aquí. 3B. Ensamble in vivo Un aspecto de la presente invención incluye una construcción de ADN que se ensambla en una unidad de transcripción recombinante en un cromosoma vegetal en la planta que es capaz de formar ARN de doble cadena. El ensamble de dichas construcciones y los métodos para ensamblar in vivo una unidad de transcripción recombinante para supresión de gen se describen en la solicitud internacional No. PCT/US2005/00681 , incorporada aquí por referencia en su totalidad. pMON95829 es una construcción usada para ensamble in vivo que tiene dos segmentos de T-ADN, cada uno flanqueado por elementos de borde de T-ADN de Agrobacterium, es decir, ADN de borde derecho (RB) y ADN de borde izquierdo (LB). El primer T-ADN contiene un promotor de 7Sa' de soya operablemente ligado a un intrón 1 de FAD2-1 A de soya (SEQ I D NO: 1 ), que es reducido por 100 nucleótidos contiguos desde el extremo 3' y ligados a 42 nucleótidos contiguos de una 5' UTR de FATB-1 a, seguido por la región codificadora de péptido de tránsito de cloroplasto ("CTP") de FATB-1A , y un gen CP4 EPSPS operablemente ligado a un promotor FMV incrementado y una secuencia de terminación de Rubisco E9 3' de guisante, todos flanqueados por elementos de borde de T-ADN de Agrobacterium, es decir, ADN de borde derecho (RB) y ADN de borde izquierdo (LB). En el mismo vector en el segundo segmento de T-ADN, flanqueado por otro RB y LB, está una secuencia de terminación 3' de H6 operablemente ligada a un intrón 1 de FAD2-1 A de soya (SEQ ID NO: 1 ), que es reducida por 100 nucleótidos contiguos desde el extremo 3' y ligado a 42 nucleótidos contiguos de una 5' UTR de FATB-1 a, seguido por la región codificadora de péptido de tránsito de cloroplasto ("CTP") de FATB-1A. La construcción de expresión de gen resultante se usa para transformación usando métodos como se describe aquí. pMON97595 es una construcción usada para ensamble in vivo que tiene dos segmentos de T-ADN, cada uno flanqueado por elementos de borde de T-ADN de Agrobacterium, es decir, ADN de borde derecho (RB) y ADN de borde izquierdo (LB). El primer T-ADN contiene un promotor de 7Sa' de soya operablemente ligado a un intrón 1 de FAD2-1 A de soya (SEQ ID NO: 1 ), que es reducido por 320 nucleótidos contiguos desde el extremo 3' y ligados a 42 nucleótidos contiguos de una 5' UTR de FATB- a, seguido por la región codificadora de péptido de tránsito de cloroplasto ("CTP") de FATB-1A , y un gen CP4 EPSPS operablemente ligado a un promotor FMV incrementado y una secuencia de terminación de Rubisco E9 3' de guisante, todos flanqueados por elementos de borde de T-ADN de Agrobacterium, es decir, ADN de borde derecho (RB) y ADN de borde izquierdo (LB). En el segundo segmento de T-ADN, flanqueado por otro RB y LB, está una secuencia de terminación 3' de H6 operablemente ligada a un intrón 1 de FAD2-1 A de soya (SEQ ID NO: 1 ), que es reducida por 320 nucleótidos contiguos desde el extremo 3' y ligado a 42 nucleótidos contiguos de una 5' UTR de FATB-1 a, seguido por la región codificadora de FATB-1 A CTP. La construcción de expresión de gen resultante se usa para transformación usando métodos como se describe aquí. pMON97581 es una construcción usada para ensamble in vivo que tiene dos segmentos de T-ADN, cada uno flanqueado por elementos de borde de T-ADN de Agrobacterium, es decir, ADN de borde derecho (RB) y ADN de borde izquierdo (LB). El primer segmento de T-ADN contiene un promotor de 7Sa' de soya operablemente ligado a un intrón 1 de FAD2-1 A de soya (SEQ ID NO: 1 ), que es reducido por 320 nucleótidos contiguos desde el extremo 3' y ligados a la región codificadora de péptido de tránsito de cloroplasto ("CTP") de FATB-1 a, y un gen CP4 EPSPS operablemente ligado a un promotor FMV incrementado y una secuencia de terminación de Rubisco E9 3' de guisante, todos flanqueados por elementos de borde de T-ADN de Agrobacterium, es decir, ADN de borde derecho (RB) y ADN de borde izquierdo (LB). En la misma construcción, en el segundo segmento de T-ADN, flanqueado por otro RB y LB, está una secuencia de terminación 3' de H6 operablemente ligada a un intrón 1 de FAD2-1 A de soya (SEQ ID NO: 1 ), que es reducida por 320 nucleótidos contiguos desde el extremo 3' y ligado a la región codificadora de FATB-1 a CTP. La construcción de expresión de gen resultante se usa para transformación usando métodos como se describe aquí. pMON97596 es una construcción usada para ensamble in vivo que tiene dos segmentos de T-ADN, cada uno flanqueado por elementos de borde de T-ADN de Agrobacterium, es decir, ADN de borde derecho (RB) y ADN de borde izquierdo (LB). El primer segmento de T-ADN contiene un promotor de 7Sa' de soya operablemente ligado a un intrón 1 de FAD2-1 A de soya (SEQ ID NO: 1 ), que es reducido por 320 nucleótidos contiguos desde el extremo 3' y ligados a los 5' 180 pb de la región codificadora de péptido de tránsito de cloroplasto ("CTP") de FATB-1 a, y un gen CP4 EPSPS operablemente ligado a un promotor FMV incrementado y una secuencia de terminación de Rubisco E9 3' de guisante, todos flanqueados por elementos de borde de T-ADN de Agrobacterium, es decir, ADN de borde derecho (RB) y ADN de borde izquierdo (LB). En la misma construcción, en el segundo segmento de T-ADN, flanqueado por otro RB y LB, está una secuencia de terminación 3' de H6 operablemente ligada a un intrón 1 de FAD2-1A de soya (SEQ ID NO: 1 ), que es reducida por 320 nucleótidos contiguos desde el extremo 3' y ligado a los 5' 180 pb de la región codificadora de FATB-1 a CTP.
La construcción de expresión de gen resultante se usa para transformación usando métodos como se describe aquí. pMON97597 es una construcción usada para ensamble in vivo que tiene dos segmentos de T-ADN, cada uno flanqueado por elementos de borde de T-ADN de Agrobacterium, es decir, ADN de borde derecho (RB) y ADN de borde izquierdo (LB). El primer segmento de T-ADN contiene un promotor de 7Sa' de soya operablemente ligado a un intrón 1 de FAD2-1A de soya (SEQ ID NO: 1 ), que es reducido por 320 nucleótidos contiguos desde el extremo 3' y ligados a los 5' 120 pb de la región codificadora de péptido de tránsito de cloroplasto ("CTP") de FATB-1 a, y un gen CP4 EPSPS operablemente ligado a un promotor FMV incrementado y una secuencia de terminación de Rubisco E9 3' de guisante, todos flanqueados por elementos de borde de T-ADN de Agrobacterium, es decir, ADN de borde derecho (RB) y ADN de borde izquierdo (LB). En la misma construcción, en el segundo segmento de T-ADN, flanqueado por otro RB y LB, está una secuencia de terminación 3' de H6 operablemente ligada a un intrón 1 de FAD2-1 A de soya (SEQ ID NO: 1 ), que es reducida por 320 nucleótidos contiguos desde el extremo 3' y ligado a los 5' 120 pb de la región codificadora de FATB-1 a CTP. La construcción de expresión de gen resultante se usa para transformación usando métodos como se describe aquí. pMON97598 es una construcción usada para ensamble in vivo que tiene dos segmentos de T-ADN, cada uno flanqueado por elementos de borde de T-ADN de Agrobacterium, es decir, ADN de borde derecho (RB) y ADN de borde izquierdo (LB). El primer segmento de T-ADN contiene un promotor de 7ScT de soya operablemente ligado a un intrón 1 de FAD2-1A de soya (SEQ ID NO: 1 ), que es reducido por 340 nucleótidos contiguos desde el extremo 3' y ligados a la región codificadora de péptido de tránsito de cloroplasto ("CTP") de FATB 1 a, y un gen CP4 EPSPS operablemente ligado a un promotor FMV incrementado y una secuencia de terminación de Rubisco E9 3' de guisante, todos flanqueados por elementos de borde de T-ADN de Agrobacterium, es decir, ADN de borde derecho (RB) y ADN de borde izquierdo (LB). En la misma construcción, en el segundo segmento de T-ADN, flanqueado por otro RB y LB, está una secuencia de terminación 3' de H6 operablemente ligada a un intrón 1 de FAD2-1 A de soya (SEQ ID NO: 1 ), que es reducida por 340 nucleótidos contiguos desde el extremo 3' y ligado a la región codificadora de FATB-1 a CTP. La construcción de expresión de gen resultante se usa para transformación usando métodos como se describe aquí. Cuando los dos segmentos de T-ADN de cualquiera de las construcciones anteriores (es decir, pMON95829, pMON97595, pMON97581 , pMON97597, pMON97598) se insertan en un solo locus del cromosoma de un organismo hospedero en una orientación RB a RB, la unidad de transcripción ensamblada tiene un promotor de 7Sa' de soya que enlaza operablemente un intrón 1 de FAD2-1 A de soya orientado de sentido y anti-sentido y fragmentos de ADN de FATB-1 a. Cuando se transcriben, las secuencias de ARN orientadas en sentido y antisentido operablemente ligadas son capaces de formar ARN de doble cadena efectivo para supresión de FAD2-1 A y FATB.
EJEMPLO 4 Transformación y análisis de la planta Las construcciones de los ejemplos 2 y 3 son establemente introducidas en soya (por ejemplo, Asgrow variedad A4922 o Asgrow variedad A3244 o Asgrow variedada A3525) por los métodos descritos anteriormente, incluyendo los métodos de McCabe et al., Bio/Technology, 6:923-926 (1988), o transformación mediada por Agrobacterium. Las plantas de soya transformadas se identifican por selección en un medio que contiene un agente o herbicida seleccionable. El herbicida puede ser glifosato cuando se usa un transgén que confiere resistencia a glifosato. Las composiciones de ácido graso se analizan a partir de semilla de líneas de soya transformadas con las construcciones usando cromatografía de gases. Para algunas aplicaciones, las composiciones de ácido grado modificadas son detectadas en semillas en desarrollo, mientras que en otros casos, tales como para análisis de perfil de aceite, la detección de modificaciones de ácido graso que ocurren posteriormente en la vía de FAS, o para detección de modificaciones menores a la composición de ácido graso, el análisis de ácido graso o aceite de semillas maduras se realiza. Además, el análisis de aceite y/o contenido de ácido graso de semillas individuales puede ser deseable, especialmente en la detección de modificación de aceite en las poblaciones de semilla R1 segregantes. Como se usa aquí, la generación RO indica una planta que surge de protocolo de transformación/regeneración descrita aquí, la generación R1 indica semillas que crecen en la planta RO transgénica autónoma. Las plantas R1 se hacen crecer a partir de las semillas R1 . Las composiciones de ácido graso se determinan para la semilla de líneas de soya transformadas con las construcciones del ejemplo 3. Una a diez semillas de cada una de las líneas de soya transgénicas y de control se trituran individualmente usando un homogenizador de tejido (Pro Scientific) para extracción de aceite. El aceite de semilla de soya triturada se extrae durante la noche en 1 .5 mi de heptano que contiene triheptadecanoin (0.50 mg/ml). Alícuotas de 200 µ? del aceite extraído se derivan a ésteres metílicos con la adición de 500 µ? de metóxido de sodio en metanol absoluto. La reacción de derivación se deja progresar durante 20 minutos a 50°C. La reacción se detiene mediante la adición simultánea de 500 µ? de cloruro de sodio al 10% (p/v) y 400 µ? de heptano. Los ésteres metílicos de ácido graso resultante extraídos en hexano se resuelven por cromatografía de gases (CG) en un Hewlett-Packard modele 6890 GC (Palo Alto, CA). La CG se ajustó con una columna Supelcowax 250 (30 m, 0.25 mm id, 0.25 mieras de espesor de película) (Supelco, Bellefonte, PA). La temperatura de la columna es de 175°C durante la inyección y la temperatura programada de 175°C a 245°C a 175°C a 40°C/min. Las temperaturas del inyector y detector son de 250°C y 270°C, respectivamente.
EJEMPLO 5 Este ejemplo ilustra transformación de planta para producir plantas de soya con genes suprimidos. Un vector de transformación pMON68537 se usa para introducir una construcción formadora de ARN de doble cadena de intrón/3'UTR en soya para suprimir los genes de ?12 desaturasa, ?15 desaturasa, y FATB. El vector pMON68537 también contiene los genes de delta-9 desaturasa (FAB2) y CP4. El vector pMON68537 está diseñado para transformación de plantas para suprimir los genes FAD2, FAD3, y FATB y sobreexpresar delta-9 desaturasa en soya. En particular, la construcción comprende un promotor 7S alfa operablemente ligado a intrón orientado a sentido de soya y 3'UTRs, es decir, un intrón #1 de FAD2-1 A, una 3'UTR de FAD3-1A, una 3'UTR de FATB-1 , un intrón empalmable formador de bucle horquillado, y una serie complementaria de intrón orientado a antisentido de soya y 3'UTR's, es decir, 3'UTR de FATB-1 , 3'UTR de FAD3-1 A, y un intrón # 1 de FAD2-1A y el promotor FAD2 de soya que impulsa la delta-9 desaturasa. El vector es establemente introducido en soya (Asgrow variedad A4922) mediante la cepa ABI de Agrobacterium tumefaciens (Martinell, patente de E.U.A. No. 6,384,301 ). El marcador seleccionable de CP4 permite que las plantas de soya transformadas sean identificadas por selección en un medio que contiene herbicida de glifosato. Las composiciones de ácido graso son analizadas de semilla de líneas de soya transformadas con construcciones de expresión de dsARNi de ¡ntrón/3'UTR usando cromatografía de gases. Semilla de acervo de R1 y composiciones de aceite de semilla individuales de R1 demuestran que las composiciones de ácido graso mono y poliinsaturado son alteradas en el aceite de semillas de líneas de soya transgénicas en comparación con las de soya no transformada (véase cuadro 3). Por ejemplo, la supresión de FAD2 provee plantas con cantidad incrementada de compuestos de éster de ácido oleico. La supresión de FAD3 provee plantas con compuestos de éster de ácido linolénico disminuido; y la supresión de FATB provee plantas con compuestos de éster de ácido graso saturado reducido, v.gr., palmitatos y estearatos. Las selecciones se pueden hacer de dichas líneas dependiendo de la composición de ácido graso relativa deseada. Las composiciones de ácido grasos son analizadas de semilla de líneas de soya transformadas con construcciones usando cromatografía de gases.
CUADRO 3 Composición de ácido graso de semillas individuales de R1 a partir de eventos de pMON68537 Construcción Evento 18:1 18:3 16:0 18:0 18:2 PMON68537 GM_A36305 74.92 4.42 6.35 2.93 10.24 PMON68537 GM_A36305 74.8 4.33 6.57 2.93 10.23 PMON68537 GM_A36305 74.43 3.95 5.98 2.82 1 1.81 PMON68537 GM_A36305 73.32 3.99 6.79 3.24 1 1.48 PMON68537 GM_A36305 72.87 4.33 7.06 3.08 1 1 .7 PMON68537 G A36305 16.63 9.53 13.5 4.06 55.31 PMON68537 GM_ A36305 16.52 9.61 13.92 4.24 54.79 PMON68537 GM_ A36305 15.67 9.66 13.64 4.19 55.89 PMON68537 GM_ A36306 77.45 3.93 6.76 2.47 8.4 PMON68537 GM_ A36306 74.51 4.38 6.58 2.47 10.94 PMON68537 GM_ A36306 73.21 4.64 7.04 3.08 .04 PMON68537 GM_ A36306 72.78 4.4 6.97 2.55 12.21 PMON68537 GM A36306 71.67 4.76 6.94 3.25 12.2 PMON68537 GM A36306 71.01 4.86 7.64 3.05 12.41 PMON68537 GM_ A36306 69.72 4.76 7.66 2.95 13.75 PMON68537 GM_ A36306 17.41 8.88 13.35 3.85 55.63 PMON68537 GM_ A36307 77.22 3.71 6.8 2.77 8.5 PMON68537 GM A36307 76.79 3.65 6.76 2.85 8.75 PMON68537 GM_ A36307 71.44 4.54 7.2 3.58 12.17 PMON68537 GM A36307 18.83 8.62 13.94 4.02 53.61 PMON68537 GM_ A36307 18.81 8.38 . 13.27 3.7 54.97 PMON68537 GM A36307 15.68 9.97 14.06 4.55 54.79 PMON68537 GM_ A36307 15.28 10.64 14.68 4.43 53.97 PMON68537 GM_ A36307 14.08 9.36 14.39 4.31 56.89 PMON68537 GM_ A36309 78.67 3.53 6.09 2.5 8.18 PMON68537 GM A36309 75.43 3.96 6.7 2.53 10.3 PMON68537 GM. .A36309 71.41 4.19 6.92 2.74 13.67 PMON68537 GM. _A36309 70.51 4.14 6.85 3.16 4.33 PMON68537 GM. _A36309 67.51 5.01 7.45 3.15 15.69 PMON68537 GM. _A36309 66.99 4.92 7.15 3.9 15.79 P ON68537 GM. _A36309 20.09 8.46 12.41 5 52.97 P ON68537 GM _A36309 15.15 9.73 14.61 3.85 55.79 PMON68537 GM. _A36310 74.28 4.77 7.31 1.85 10.9 PMON68537 GM. _A36310 74.03 5.43 8.23 1.63 9.66 PMON68537 GM. _A36310 73.07 5.09 7.37 1.76 1 1.75 PMON68537 GM A36310 71.83 5.04 7.78 1.86 12.54 PMON68537 GM. _A36310 68.01 6.26 9.8 1.97 13.13 PMON68537 GM A36310 67.22 6.28 8.71 3.28 13.45 PMON68537 GM _A36310 65.37 6.87 10.01 1.94 14.9 P ON68537 GM. _A36310 15.76 10.09 13.4 4.28 55.52 PMON68537 GM. _A36311 77.87 3.56 5.9 2.46 9.05 PMON68537 GM. _A36311 75.8 3.87 5.91 2.93 10.22 PMON68537 GM A36311 75.61 3.71 6.21 2.56 10.75 PMON68537 GM _A36311 73.68 4.06 6 3.09 1 1.98 PMON68537 G . _A36311 72.66 4.11 6.41 3.14 12.48 PMON68537 GM _A36311 70.89 4.39 6.52 3.11 13.93 PMON68537 GM _A36311 70.82 3.97 6.52 3.18 14.29 PMON68537 GM _A3631 1 16.67 9.39 13.65 4.44 54.77 PMON68537 GM _A36312 78.32 4.3 6.36 1.79 8.16 PMON68537 GM _A36312 77.55 4.46 6.51 2.13 8.23 PMON68537 GM _A36312 77.43 4.17 6.31 1.81 9.24 PMON68537 GM A36312 76.98 4.29 6.25 2.27 9.05 PMON68537 GM_ A36312 76.43 4.55 6.82 2.16 8.96 PMON68537 GM A36312 76.38 4.5 6.46 2.04 9.54 PMON68537 GM_ A36312 75.25 4.27 6.41 1.97 1 1.06 P ON68537 GM A36312 18.24 9.43 13.6 3.07 54.75 PMON68537 GM A36313 80.18 4.07 6.17 2.59 5.85 PMON68537 GM_ A36313 79.96 4.16 6.03 2.59 6.11 PMON68537 GM_ A36313 78.88 3.9 5.6 2.8 7.65 PMON68537 GM A36313 78.76 3.92 5.44 2.91 7.82 PMON68537 GM_ A36313 77.64 4.22 5.88 2.9 8.25 P ON68537 GM A36313 76.15 4.14 6.06 3.13 9.42 PMON68537 GM A36313 19.05 8.87 13.45 3.71 54.03 P ON68537 GM_ A36313 18.47 8.46 13.13 3.63 55.41 PMON68537 GM_ A36314 80.27 3.17 5.77 3.4 6.03 PMON68537 GM A36314 79.66 3.24 5.72 3.19 6.91 PMON68537 GM_ A36314 79.5 3.45 5.83 3.23 6.74 PMON68537 GM_ A36314 77.42 3.52 5.76 3.57 8.42 PMON68537 GM_ .A36314 77.33 3.71 6.36 3.34 8.01 PMON68537 GM_ _A36314 76.83 3.71 6.38 3.24 8.59 PMON68537 GM. _A36314 16.6 9.3 12.63 4.43 55.99 PMON68537 GM. .A36314 15.26 8.59 13.71 4.54 56.84 PMON68537 GM_ .A36315 20.21 8.25 13.61 3.59 53.37 PMON68537 GM. _A36315 17.47 9.22 13.46 3.35 55.57 PMON68537 GM _A36315 16.75 9.3 13.61 3.66 55.75 P ON68537 GM. _A36315 16.54 9.18 13.54 3.88 55.9 PMON68537 GM. _A36315 16.06 10.07 13.44 4.01 55.42 PMON68537 GM. _A36315 16.05 9.58 12.82 4.25 56.29 PMON68537 GM. _A36315 15.95 10.42 13.12 3.63 55.91 PMON68537 GM _A36315 15.5 10.22 13.25 3.78 56.3 PMON68537 GM. _A36316 79.61 3.56 5.79 2.94 6.87 PMON68537 GM. _A36316 75.11 4.01 6.45 3.44 9.76 PMON68537 GM. _A36316 75.07 4.25 6.74 3.09 9.64 PMON68537 GM. _A36316 73.92 3.97 6.53 3.56 10.75 PMON68537 GM. _A36316 17.26 9.59 13.1 4.26 54.78 PMON68537 GM _A36316 17.15 9.03 12.81 4.04 55.97 PMON68537 GM. _A36316 16.62 9.2 13.15 3.99 56.03 PMON68537 GM. _A363 6 16.6 9.44 13.19 3.95 55.84 PMON68537 GM. _A36317 18.96 7.55 13.2 3.75 55.51 PMON68537 GM _A36317 16.19 9.43 13.33 3.96 56.04 PMON68537 GM. _A36317 16.05 9.1 14.02 3.94 55.91 PMON68537 GM. _A36317 15.33 9.4 13.91 4.22 56.11 PMON68537 GM. _A36317 15.28 9.2 13.87 4.27 56.36 PMON68537 GM. _A36317 14.58 10.15 13.74 4.38 56.15 PMON68537 G _A36317 13.95 9.47 13.98 4.76 56.79 PMON68537 GM _A36317 13.91 9.88 14.26 4.62 56.25 PMON68537 GM A36318 78.82 3.64 5.7 2.77 7.87 PMON68537 GM A36318 77.94 3.73 5.9 2.94 8.29 PMON68537 GM A36318 75.18 4.11 6.08 3.48 9.95 PMON68537 GM_ A36318 75.1 3.93 6.02 3.04 0.75 P ON68537 GM_ A36318 75.01 4.22 6.57 3.29 9.72 PMON68537 GM A36318 74.17 4.2 6.51 3.27 10.68 PMON68537 GM_ A36318 73.47 4.27 6.7 3.22 1 1.16 PMON68537 GM A36318 30.57 10.54 14.83 5.55 36.92 PMON68537 GM A36319 80 3.65 5.83 2.31 7.02 PMON68537 G _ A36319 79.89 3.65 5.64 2.35 7.26 PMON68537 GM_ A36319 79.4 3.59 5.73 1.76 8.46 PMON68537 GM A36319 78 3.87 6.11 2.35 8.5 PMON68537 GM A36319 76.08 4.22 6.5 2.35 9.74 PMON68537 G A36319 75.56 3.89 6.41 1.78 1.3 PMON68537 GM_ A36319 75.26 4.27 6.47 2.37 10.5 PMON68537 GM A36319 75.16 4.1 6.48 2.49 10.66 PMON68537 GM_ A36320 81.27 3.19 5.84 2.4 6.09 PMON68537 GM .A36320 80.21 3.27 5.18 2.44 7.76 PMON68537 GM_ A36320 79.64 3.38 5.5 2.67 7.63 PMON68537 GM A36320 79.46 3.38 5.82 2.67 7.42 PMON68537 GM. _A36320 78.5 3.59 6.24 2.49 8 PMON68537 GM A36320 73.83 3.79 6.72 2.78 1 1.74 PMON68537 GM. .A36320 73.1 3.95 6.9 2.39 12.48 PMON68537 GM _A36320 22.99 8.03 12.19 4.81 50.89 PMON68537 GM. _A36324 75.93 3.77 6.58 2.76 9.76 P ON68537 GM _A36324 75.1 4.05 7.01 2.83 9.8 PMON68537 GM A36324 17.83 8.79 12.78 4.11 55.49 PMON68537 GM. _A36324 16.46 8.88 12.84 4.48 56.29 PMON68537 GM _A36324 16.35 9.25 13.51 4.17 55.66 PMON68537 GM. _A36324 15.25 8.99 13.73 4.28 56.69 PMON68537 GM A36324 14.16 10.17 13.95 4.11 56.58 PMON68537 GM. _A36324 13.59 9.87 14.61 4.5 56.33 PMON68537 GM. _A36357 80.19 3.03 5.59 3.2 6.62 PMON68537 GM A36357 79.78 3.19 5.51 3.24 6.89 PMON68537 GM. _A36357 78.5 3.55 5.75 3.17 7.71 PMON68537 GM _A36357 77.48 3.68 5.71 3.55 8.23 PMON68537 GM _A36357 77.28 3.79 5.66 3.48 8.46 PMON68537 GM _A36357 77.1 3.51 5.43 3.65 8.99 PMON68537 GM A36357 71.9 4.24 6.47 3.67 12.39 PMON68537 GM. _A36357 17.66 9.32 13.26 4.21 54.51 PMON68537 GM _A36359 77.91 3.35 5.67 3.24 8.53 PMON68537 GM. _A36359 77.85 3.29 5.42 3.29 8.87 PMON68537 G _A36359 76.71 3.65 6.07 3.35 8.95 PMON68537 GM. _A36359 71.73 4.01 6.79 3.49 12.68 PMON68537 GM. _A36359 69.32 4.51 6.99 3.66 14.13 PMON68537 GM_ A36359 68.63 4.44 6.91 3.76 14.89 PMON68537 GM_ A36359 18.87 8.03 13.38 3.86 54.81 PMON68537 GM A36359 16.81 9.83 13.08 4.68 54.55 PMON68537 GM_ A36360 79.34 3.29 5.99 3.15 6.88 PMON68537 GM_ A36360 75.42 3.47 6.47 3.08 10.26 PMON68537 GM A36360 75.3 3.86 6.69 3.2 9.64 PMON68537 GM_ A36360 74.51 3.8 6.39 3.32 10.67 PMON68537 GM_ A36360 21.49 6.95 13.07 3.92 53.46 PMON68537 GM_ A36360 20.05 7.4 13.09 3.83 54.57 PMON68537 GM_ A36360 16.08 9.14 13.02 4.64 56.03 PMON68537 GM_ A36360 15.86 9.07 13.44 4.49 56.04 PMON68537 GM A36361 82.13 2.83 5.67 3.13 4.81 PMON68537 GM_ A36361 80.99 3.2 5.79 3.01 5.64 PMON68537 GM A36361 74.39 3.85 6.33 3.5 10.59 PMON68537 GM_ A36361 18.01 8.46 13.18 3.92 55.41 PMON68537 GM_ A36361 17.99 8.11 13.05 4.09 55.7 P ON68537 GM_ A36361 17.35 8.31 13.4 4 55.88 PMON68537 GM A36361 16.81 10.2 12.9 4.32 54.87 PMON68537 GM_ .A36361 16.55 8.5 13.21 4.22 56.45 PMON68537 GM .A36362 78.05 ' 3.89 6.29 2.81 7.76 PMON68537 GM .A36362 76.89 3.69 6.32 3.12 8.76 PMON68537 GM. .A36362 76.1 4 6.57 3.02 9.24 PMON68537 GM. _A36362 76.01 4.08 6.24 3.03 9.48 PMON68537 GM. _A36362 75.86 3.76 5.68 3.56 9.95 PMON68537 GM. _A36362 75.79 4.07 6.43 3.15 9.34 PMON68537 GM A36362 74.89 4.14 6.63 3.11 10.07 PMON68537 GM. _A36362 17.22 8.8 13.75 3.77 55.54 PMON68537 GM. _A36363 79.15 3.57 6.2 3.03 6.84 PMON68537 GM. _A36363 75.69 3.83 7.07 2.73 9.53 PMON68537 GM _A36363 73.97 4.22 6.82 3.39 10.33 PMON68537 GM _A36363 72.53 4.31 6.64 3.7 1 .59 PMON68537 GM. _A36363 68.42 4.5 7.05 3.95 14.79 PMON68537 GM _A36363 18.39 8.7 13.61 4.1 54.28 PMON68537 GM _A36363 17.54 8.87 14.08 4.07 54.56 PMON68537 GM _A36363 15.87 9.66 14.56 4.2 54.69 PMON68537 GM _A36365 78.79 3.11 5.87 1.27 9.9 PMON68537 GM. _A36365 76.76 3.86 5.79 1.66 10.91 PMON68537 GM _A36365 75.41 3.49 6.06 1.83 12.15 PMON68537 GM _A36365 73.57 3.65 6.11 1.5 14.19 PMON68537 GM _A36365 71.55 3.56 6.62 1.24 16.08 PMON68537 GM _A36365 70.41 4 6.07 2.15 16.33 PMON68537 GM. _A36365 66.66 3.9 6.84 1.5 20.21 PMON68537 GM. _A36365 63.96 4.22 7.08 2.27 21.52 PMON68537 GM. _A36366 75.44 4.33 6.49 3.21 9.32 PMON68537 GM. _A36366 74.75 4.21 6.87 2.71 0.33 PMON68537 GM_A36366 74.69 4.65 6.91 3.06 9.65 PMON68537 GM_A36366 73.23 4.89 7.23 2.99 10.52 PMON68537 GM_A36366 72.53 4.76 7.42 3.26 10.85 PMON68537 GM_A36366 67.15 5.05 7.47 3.33 15.87 PMON68537 GM_A36366 65.81 5.6 7.9 3.37 16.09 PMON68537 GM_A36366 62.31 6.19 8.71 3.22 18.55 P ON68537 GM A36367 80.56 3.3 6.07 2.58 6.34 PMON68537 GM_A36367 77.78 3.58 6.47 2.66 8.45 PMON68537 GM_A36367 77.78 3.46 6.25 2.84 8.51 PMON68537 GM_A36367 77.39 3.81 6.71 2.86 8.1 1 PMON68537 GM_A36367 77.32 3.74 6.17 3.12 8.47 PMON68537 GM A36367 75.93 3.97 6.23 3.43 9.29 PMON68537 GM A36367 72.82 4.09 6.85 3.25 1 1.88 PMON68537 GM_A36367 19.31 7.58 13.7 3.59 55 PMON68537 GM_A36410 21.67 7.62 13.38 3.43 53.1 PMON68537 GM_A36410 20.9 8.33 12.93 3.64 53.33 PMON68537 GM_A36410 20.21 8.04 13.28 3.86 53.66 PMON68537 GM_A36410 20.02 8.71 12.79 3.71 53.87 PMON68537 GM_A36410 18.96 8.95 13.3 3.77 54.15 PMON68537 GM_A36410 18.18 8.98 13.56 3.74 54.66 PMON68537 GM_A36410 17.61 9.29 12.93 4.12 55.13 PMON68537 GM_A36410 16.78 9.8 13.78 3.92 54.83 PMON68537 GM_A36411 75.06 4.33 6.49 2.93 0.08 PMON68537 GM_A36411 74.32 4.46 6.76 2.96 10.38 PMON68537 GM_A36411 73.41 4.76 6.91 3.11 10.78 PMON68537 GM_A36411 73.24 4.87 7.28 2.89 10.67 PMON68537 GM_A36411 22.38 8.17 13.47 3.6 51.51 PMON68537 GM_A36411 18.26 9.07 14.14 3.81 54.02 PMON68537 GM_A36411 17.52 10.1 13.1 4.03 54.36 PMON68537 GM_A36411 17.02 9.71 13.45 4.02 54.89 A3244 A3244 18.29 7.79 13.69 4.15 55.08 A3244 A3244 17.54 8.19 13.32 4.32 55.57 A3244 A3244 17.13 8.13 13.21 4.46 56.04 A3244 A3244 15.47 9.56 13.04 4.43 56.46 A3244 A3244 15.17 8.95 13.79 4.3 56.78 A3244 A3244 15.05 9.03 14.16 4.01 56.8 A3244 A3244 13.51 10.07 12.95 5.07 57.3 A3244 A3244 13.49 9.91 13.31 4.56 57.67 EJEMPLO 6 Construcción de dsARNi de FAD2-1/FATB en soya transgénica La construcción p ON95829 como se describe en el ejemplo 3D se usa para introducir una construcción formadora de ARN de doble cadena, intrón FAD2-1 , FATB en soya para suprimir el gen FAD2 y los genes FATB. El vector es establemente introducido en soya (Asgrow variedad A4922) por medio de la cepa Agrobacterium tumeíaciens ABI (Martinell, patente de E.U.A. No. 6,384,301 ). El marcador seleccionare de CP4 permite que las plantas de soya transformadas sean identificadas por selección sobre el medio que contiene herbicida de glifosato. Subsecuentemente, los genomas de plantas transformadas son determinados selectivamente para inspección en tándem concurrente del primer T-ADN y el segundo T-ADN, es decir, en el ensamble de "borde derecho a borde derecho". La determinación selectiva se hace con métodos de mapeo de hibridación de Southern. Las plantas de soya transformadas que contienen una configuración preferida en su genoma son transferidas a un invernadero para producción de semilla. Por ejemplo, el tejido foliar se obtuvo de las plantas R0 transformadas con la construcción pMON95829 y el análisis de Southern se realizó. Las sondas y digestiones de enzima de restricción se escogen para identificar eventos que contienen un ensamble de borde derecho-borde derecho ("RB-RB") de ambos T-ADNs. Típicamente, aproximadamente 25% de todos los transformantes tienen T-ADNs de RB-RB apropiadamente ensamblados. Las composiciones de ácido graso se analizan de semilla de líneas de soya transformadas con una construcción pMON95829 usando cromatografía de gases como se describe en el ejemplo 4 para identificar ésteres metílicos de compuestos de ácido graso extraídos de semillas. Primero, seis semillas R1 obtenidas de plantas de soya transformadas con construcción pMON95829 son cosechadas, y la composición de ácido graso de cada semilla individual se determina. Puesto que las plantas R1 de cada evento están segregando para los transgenes y por lo tanto producen semillas con composición de soya convencional, así como versiones modificadas, las semillas positivas se ponen en acervo y se promedian para cada evento. Los promedios positivos en acervo demuestran que las composiciones de ácido graso mono y poliinstaurado son alteradas en el aceite de semillas de líneas de soya transgénicas en comparación con los de la semilla de soya no transformada (véase cuadro 4). Por ejemplo, la supresión de FAD2 provee plantas con una cantidad incrementada de compuestos de éster de ácido oleico y la supresión de FATB provee plantas con compuestos de éster de ácido graso saturado reducido, v.gr., palmitatos y estearatos.
CUADRO 4 Composición de ácido graso de semillas individuales de R1 de eventos de PMON95829 EJEMPLO 7 pMON93505 es una construcción usada para ensamble in vivo y tiene dos segmentos T-ADN, cada uno flanqueado por elementos de borde de T-ADN de Agrobacterium, es decir, ADN de borde derecho (RB) y ADN de borde izquierdo (LB). El primer segmento de T-AND contiene un promotor 7Sa" de soya operablemente ligado a un intrón 1 de FAD2-1 A se soya (SEQ ID NO: 1 ), que es reducido por 100 nucleótidos continuos del extremo 3' y ligado a la 3" UTR de FATB- 1a seguida por una 5'UTR de FATB- 1a, un gen KAS IV de C. pulcherrima (SEQ ID NO: 39) operablemente ligado a un promotor de napin de Brassica y una secuencia de terminación 3' de napin de Brassica, un gen de delta-9- desaturasa de Ricinus communis (publicación de solicitud de patente de E.U.A. No. 2003/00229918 A1 ) operablemente ligado a un promotor 7Sa de soya y una secuencia de terminación 3' nos, y un gen CP4 EPSPS operablemente ligado a un promotor eFMV y una secuencia de terminación 3' de Rubisco E9 de guisante todos flanqueados por elementos de borde de T-ADN de Agrobacterium, es decir, ADN de borde derecho (RB) y ADN de borde izquierdo (LB). En la misma construcción, en el segundo segmento de T-AND, flanqueado por otro RB y LB, es una secuencia de terminación 3' de H6 operablemente ligado a un intrón 1 de FAD2-1 A de soya (SEQ ID NO: 1 ), que es reducido por 100 nucleótidos contiguos desde el extremo 3' y ligado a la 3'UTR de FATB-1 A seguido por una 5'UTR de FATB-1 a. La construcción pMON93505 es establemente introducida en soya (Asgrow variedad A4922) mediante la cepa ABI de Agrobacterium tumefaciens (Martinell, patente de E.U.A. No. 6,384,301 ). El marcador seleccionable de CP4 permite que las plantas de soya transformadas sean identificadas por selección sobre el medio que contiene herbicida de glifosato. Subsecuentemente, los genomas de plantas transformadas son determinados selectivamente para inspección en tándem concurrente del primer T-ADN y el segundo T-ADN, es decir, en el ensamble de "borde derecho a borde derecho". La determinación selectiva se hace con métodos de mapeo de hibridación de Southern. Las plantas de soya transformadas que contienen la configuración preferida en su genoma son transferidas a un invernadero para producción de semilla. Por ejemplo, el tejido foliar se obtuvo de las plantas R0 transformadas con la construcción pMON93505 y el análisis de Southern se realizó. Las sondas y digestiones de enzima de restricción se escogen para identificar eventos que contienen un ensamble de borde derecho-borde derecho ("RB-RB") de ambos T-ADNs. Típicamente, aproximadamente 25% de todos los transformantes tienen T-ADNs de RB-RB apropiadamente ensamblados. Las composiciones de ácido graso se analizan de semilla de líneas de soya transformadas con una construcción pMON93505 usando cromatografía de gases como se describe en el ejemplo 4 para identificar ésteres metílicos de compuestos de ácido graso extraídos de semillas. Primero, seis semillas Ri obtenidas de plantas de soya transformadas con construcción pMON93505 son cosechadas, y la composición de ácido graso de cada semilla individual se determina. Puesto que las plantas R1 de cada evento están segregando para los transgenes y por lo tanto producen semillas con composición de soya convencional, así como versiones modificadas. Las semillas positivas se ponen en acervo y se promedian para cada evento. Los promedios positivos en acervo demuestran que las composiciones de ácido graso mono y poliinstaurado son alteradas en el aceite de semillas de líneas de soya transgénicas en comparación con los de la semilla de soya no transformada (véase cuadro 10). Por ejemplo, la supresión de FAD2 provee plantas con una cantidad incrementada de compuestos de éster de ácido oleico. Por ejemplo, la supresión de FAD2 provee plantas con cantidad incrementada de compuestos de éster de ácido oleico, la supresión de FAD3 provee plantas con compuestos de éster de ácido linolénico disminuido, y la supresión de FATB provee plantas con compuestos de éster de ácido graso saturado reducido, v.gr., palmitatos y estearatos. CUADRO 5 Composición de ácido graso de semillas individuales de R1 de eventos de P ON93505 Construcción Evento # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 PMON93505 GM_A87814 1.3 1.0 84.9 5.5 6.3 PMON93505 GM_A86449 1.5 0.9 84.9 4.9 6.8 PMON93505 GM_A86032 1.5 1.1 83.5 6.3 7.0 PMON93505 GM_A86159 1.5 0.9 82.8 6.7 7.5 PMON93505 GM_A86178 1.7 1.0 82.5 6.7 7.3 PMON93505 GM_A86075 1.4 0.9 81.4 6.6 8.5 PMON93505 GM_A86303 1.0 0.6 81.4 7.4 8.8 PMON93505 GM_A86454 1.4 0.9 79.9 7.4 8.8 PMON93505 GM_A86799 1.4 1.1 79.4 9.6 7.7 PMON93505 GM_A85997 2.2 2.5 79.3 7.7 7.4 PMON93505 GM_A86058 1.8 1.0 76.8 11.3 8.3 PMON93505 GM_A86274 1.2 0.7 74.6 10.2 11.9 PMON93505 GM_A86325 1.1 0.7 72.8 15.4 9.2 PMON93505 GM_A85969 2.0 0.7 70.7 13.6 12.1 PMON93505 GM_A86033 1.7 0.9 69.1 18.2 9.5 PMON93505 GM_A86372 1.7 1.0 65.7 12.6 17.6 PMON93505 GM_A86403 1.5 0.9 64.6 16.8 15.4 PMON93505 GM_A87803 1.1 0.6 57.7 26.0 13.8 PMON93505 GM_A86036 3.1 1.5 54.8 30.4 9.7 PMON93505 GM_A86269 4.9 1.8 51.4 31.9 9.5 EJEMPLO 8 Frijoles de soya transgénicos con composiciones de ácido graso alteradas pMON97563 contiene un promotor 7Sa' de soya operablemete ligado a un intrón 1 de FAD2-1A de soya 1 (SEQ ID NO: 1 ), que es reducido por 100 nucleótidos contiguos del extremo 3' y ligado a una 5'UTR de FAD3-1A, seguido por una 3'UTR de FAD3-1A, ligado a una 5'UTR de FAD3-1 B, seguido por una 3'UTR de FAD3-1 B, ligada a una 5'UTR de FAD3-1 C, seguido por una 3'UTR de FAD3-1 C, seguido por una región codificadora de FATB-1 a CTP, seguido por una región codificadora de FATB-2a CTP operablemente ligada a 70 nucleótidos de intrón 4 de FAD3-1A, operablemente ligada a una región codificadora FATB-2a CTP en la orientación antisentido seguida por una región codificadora de FATB-1 a CTP en la orientación antisentido, liagada a una 3'UTR de FAD3-1 C en antisentido, seguida por una 5'UTR de FAD3-1 C en antisentido, ligada a una 3'UTR de FAD3-1 B en antisentido, seguida por una 5'UTR de FAD3-1 B en antisentido, ligada a una 3'UTR de FAD3-1 A en antisentido, seguida por una 5'UTR de FAD3-1A en antisentido, seguida por un intrón 1 de FAD2-1A de soya (SEQ ID NO: 1 ), que es redudido por 400 nucleótidos contiguos del extremo 3' y la orientación antisentido, operablemente ligada a un segmento de poliadenilacion 3' de H6 con un gen CP4 EPSPS operablemente ligado a un promotor eFMV y una secuencia de terminación 3' de Rubisco E9 de guisante, todas flanqueadas por RB y LB en la misma molécula de ADN. La construcción de expresión de gen resultante se usa para transformación de planta usando métodos como se describe aquí. Las composiciones de ácido graso se determinan a partir de semilla de línea de soya transformada con esta construcción usando cromatografía de gases como se describe en el Ejemplo 4. El cuadro 26 da las composiciones de semilla representativas. El nivel de 18:3 es reducido a aproximadamente 1 %.
CUADRO 6 Composición de ácido graso de semillas individuales de R1 de eventos de PMON97563 Construcción Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 PMON97563 GIVLA109156 2.21 2.78 85.05 8.48 0.69 PMON97563 G _A109196 2.07 2.31 84.4 9.42 0.97 PMON97563 GM_A 109207 2.24 2.78 83.98 9.36 0.82 PMON97563 GM_A103543 2.21 2.63 83.94 10.28 0.95 PMON97563 GM_A 103547 2.06 2.47 83.97 10.47 0.89 PMON97563 GM_A109 46 1 .71 2.34 81 .14 13.71 0.91 PMON97563 GM_A109155 2.33 2.7 80.76 12.28 1 .1 1 PMON97563 GM_A109164 2.07 2.61 78.8 14.6 1 PMON97563 GM_A109170 2.68 1 .95 78.78 14.14 1 .55 PMON97563 GM_A 109277 2.49 3.19 78.19 14.51 0.93 PMON97563 GM_A109194 2.46 2.81 76.62 16.26 0.92 PMON97563 GM_A109177 2.56 2.49 72.64 20.14 1 .44 PMON97563 GM_A 109201 2.46 2.9 72.21 20.13 1 .1 1 PMON97563 GM_A 103550 2.18 2.67 70.84 22.25 1 .17 PMON97563 GM_A 109203 2.18 2.81 69.93 22.91 0.98 EJEMPLO 9 Cruzas de soya transqénica de ácido oleico medio con soya de ácido linolénico bajo Una planta de soya de una línea con semillas que tiene niveles de ácido oleico medio en su aceite se cruza con una planta de una línea con niveles de ácido oleico normales pero aproximadamente 2.8% de ácido linoénico (18:3). Esta cruza da por resultado una línea de soya que produce aceite con las propiedades combinadas, ácido oleico medio y ácido linolénico bajo. En breve, la reproducción de plantas se realiza como se describe a continuación. Una línea progenitora, una línea de soya transgénica, evento GM_A22234 marcado, contiene el plámido pMON68504 en un cromosoma. pMON68504 es una construcción 2T-ADN que tiene promotor 7S operablemente ligado a intrón # 1 de FAD2-1A (SEQ ID NO: 2; publicación del PCT WO 200101 538) en orientación de sentido para suprimir parcialmente el gen FAD2 endógeno y un gen marcador seleccionare de CP4. El aceite extraído de las semillas de esta línea contiene aproximadamente 65% de ácido oleico, hasta 20% de aceite de soya convencional (véase cuadro 25 del documento anteriormente mencionado). Otra línea progenitora es una variedad no transgénica 6p248-5 (línea C1640) que tiene un contenido de ácido linolénico de aproximadamente 3% en peso de ácidos grasos totales en sus semillas, en comparación con el ácido linolénico convencional de 8-9% encontrado en aceite de soya normal (véase cuadro 25 del documento anteriormente mencionado). La reducción en ácido linolénico es causada por un mutante doble fad3-1b-/fad3-1c-. (Véase Wilcox, J. R. y J. F. Cavins, Inheritance of low linolenic acid contení of the seed of a mutant of Glycine max., Theoretical and Applied Genetics 71 : 74-78, 1985). Plantas de la línea trangénica GM_A22234 (usada como la planta femenina) y la línea mutante 6p248-5 (usada como la pata masculina) se cruzaron. Treinta semillas de F1 se produjeron y se plantaron para producir 1 .44 kg de semillas de F2 autocruzadas. Semillas homocigóticas triples putativas se identificaron a partir de 200 semillas F2 a través de un solo análisis de éster metílico de ácido graso de semilla (FAME) de chips de semilla. Veintisiete semillas con aproximadamente 60% de 18:1 , aproximadamente 20% de 18:2, y aproximadamente 2-3% de 18:3 se identificaron y se plantaron para producir semillas F3 autocruzadas. Para análisis de marcador, muestras de tejido foliar F2 se recolectaron y marcadores moleculares establecidos para los alelos mutantes de FAD3 se usaron para identificar plantas positivas dobles (pantas que tenían mutaciones FAD3-1 B y FAD3-1 C)). Tres genotipos fueron el objetivo para recuperarse de este experimento: 1 ) mutantes homocigóticos dobles fad3- 1b-/fad3- 1c-; 2) plantas homocigóticas individuales para alelo fad3- 1c-solo; y 3) homocigótico individual para alelo fad3-1b- solo. Las plantas F2 fueron plantas individuales cosechadas, y 10 submuestras de semilla F3 fueron analizadas. De 27 semillas con aproximadamente 60% de 18:1 (ácido oleico), aproximadamente 20% de 18:2 (ácido linoleico), y aproximadamente 2-3% de 18:3 (ácido linolénico), 5 plantas fueron identificadas como muíante FAD3 doble putativo y fueron almacenadas juntas para crecimiento posterior. El cuadro 25 del documento anteriormente mencionado resume los datos de composición de semilla F3 de 20 plantas F2.
CUADRO 7 Fenotipo de combinación de ácido oleico medio/ mutante fad3- composición de ácido graso de semilla F3 La línea triple íad3-1b-, fad3-1c-, de ácido oleico medio (GM_AA22234) tiene 1 .9% de 18:3 de ácido linolénico y 74.3% de ácido oleico. La combinación de mutantes fad3- 1b- y fad3- 1c- con el locus de ácido oleico medio transgénico (GM_AA22234) conduce a reducción adicional de ácido linolénico e incremento de ácido oleico en relación con las líneas progenitoras respectivas.
Para evaluar la eficacia de campo de la línea triple de fad3- 1b-, fad3-1c- de ácido oleico medio (GM_AA22234), las entradas de combinación de reproducción se plantaron en un diseño de bloques de grupo con las combinaciones y controles progenitores agrupados y distribuidos aleatoriamente dentro del bloque de prueba, y las muestras de semilla se analizaron. Un perfil de ácido graso para la combinación triple de fad3- 1b-, fad3-1c-, ácido oleico medio (GM_AA22234) se generó con semilla F4 crecida en el campo usando semilla individual FAME. El perfil de ácido graso F4 demostró aproximadamente 68% de 18:1 , 13% de ácidos grasos saturados totales, 16% de 18:2 y 2.3% de 18:3. Los niveles de aceite y proteína son similares a las líneas progenitoras.
EJEMPLO 10 Cruzas de soya transgénica de ácidos grasos saturados bajos, ácido oleico medio con aceite de soya de ácido linolénico bajo Una planta de soya de una línea con semillas que tenían un nivel de ácido oleico medio y ácidos grasos saturados bajo en su aceite se cruzó con una planta de una línea con niveles de ácido oleico y ácidos grasos saturados normal pero aproximadamente 2.8% de ácido linolénico (18:3). La cruza da por resultado una línea de soya que produce aceite con las propiedades combinadas, niveles de ácido oleico medio, ácidos grasos saturados bajo y ácido linolénico bajo.
En breve, la reproducción de la planta se realizó como se describe más adelante. Una línea progenitora es una línea de soya transgénica que porte ADN recombinante para supresión parcial de los genes endógenos FAD2-1 y FATB así como el gen marcador seleccionable CP4 que hace a la planta tolerante al glifosato. El aceite extraído de las semillas de esta línea contiene aproximadamente 55-85% de ácido oleico, hasta el 20% de aceite de soya convencional. También contiene menos de 8% de ácidos grasos saturados (16:0 más 18:0), reducido del 14-16% convencional de aceite de soya normal. Una línea progenitora es una variedad no transgénica 6p248-5 (líneas C1640) que tiene niveles de aproximadamente 3% de ácido linolénico en sus semillas, en comparación con el 8-9% convencional de ácido linolénico encontrado en el aceite de soya normal. La reducción en ácido linolénico es causada por un mutante doble fad3- 1b-/fad3- 1c- (véase Wilcox, J. R. y J. F. Cavins, Inheritance of low linolenic acid content of the seed of a mutant of Glycine max., Theoretical and Applied Genetics 71 : 74-78, 1985.) Plantas de la línea transgénica de ácido oleico medio-alto/ácidos grasos saturados bajos se cruzan con plantas de la línea mutante 6p248-5. Semillas F1 son producidas y plantadas para producir semilla F2 autónoma. Semillas homocigóticas triples putativas son identificadas de semillas F2 a través de análisis individual de ácido graso-éster metílico (FAME) de semilla de chips de semillas. Las semillas son rasgos de aceite combinados se identifican y se plantan para producir semillas F3 autocruzadas. Para análisis de marcador, muestras de tejido foliar F2 son recolectadas y marcadores moleculares establecidos de los alelos mutantes de FAD3 se usan para identificar plantas positivas dobles (plantas que tienen ambas deleciones FAD3). Lotes de semilla F3 que indican homocigocidad para el locus del transgén así como las dos mutaciones FAD3 se seleccionan y se usan para establecimiento de línea. Para evaluar la eficacia e campo de las líneas fad3- 1b-, fad3- 1c-, ácido oleico medio/ácidos grasos saturados bajos, las entradas de combinación de reproducción se plantan en un diseño de bloque de grupo con las aombinaciones y controles progenitores agrupados y distribuidos aleatoriamente dentro del bloque de prueba, y las muestras de semilla se analizan. Un perfil de ácido graso para la combinación triple de fad3- 1b-, fad3- 1c-, ácido oleico bajo/ácidos grasos saturados bajos se determina con semilla que crece en el campo F4 usando FAME de semilla individual. El perfil de ácido graso F4 muestra 55-85% de 18:1 , menos de 8% de ácidos grasos saturados y 2-3% de 18:3. Los niveles de aceite y proteína son similares a las líneas progenitoras.
EJEMPLO 11 Uso de polimorfismos en FAD3-1 b Para poner en práctica los métodos de la invención, los polimorfismos asociados con el gen de FAD3-1 B de soya se pueden usar para identificar la presencia de regiones genómicas de soya asociadas con ciertos fenotipos de ácido linolénico bajo. Un polimorfismo de nucieótido individual en una posición correspondiente a la posición 2021 de SEQ ID NO: 61 se detecta entre todas las líneas en una longitud de secuencia entera de 2683 pb (cuadro 3) y se está asociada con un fenotipo de ácido linolénico bajo. Las líneas de ácido linolénico bajo 6P248, T27111 , T27190, T26767 y T26830 portan un alelo "C" en esta posición mientras que otras líneas portan una "T". Consecuentemente, la presencia de un alelo "C" se puede usar para identificar la presencia de las regiones genómicas de soya de ácido linolénico bajo en cruzas en donde el germoplasma de ácido linolénico bajo derivado de 6P248, T27111 , T27 90, T26767 y T26830 se usa. Otras líneas de ácido linolénico bajo tales como A5, Soyola, y N98-4445 portan un alelo del tipo silvestre en este locus, indicando que uno o más de otros loci contribuyen al fenotipo de ácido linolénico bajo en las líneas A5, Soyola, y N98-4445.
CUADRO 8 Polimorfismos en el locus FAD3-1 B Líneas Pe ición 2021 de SEQ ID NO: 61 Secuencia original C 6P248 T T271 1 1 T) T27190 T T26767 T T26830 T A5 c C1640 c Soyola c N98-4445 c A2247 c AG1701 c AG1902 c AG2402 c AG2703 c AG3201 c AG3302 c AG3702 c AJB2102J0C c AJB2302K0C c CSR2533 c CSR2622N c CSR3922N c DKB19-51 c DKB23-95 c WP25920 c EJEMPLO 12 Identificación de polimorfismos en el gen FAD3-1C Para poner en práctica los métodos de la invención, los polimorfismos asociados con el gen de FAD3-1 C de soya se pueden usar para identificar la presencia de regiones genómicas de soya asociadas con ciertos fenotipos de ácido linolénico bajo. Cuatro SNPs y un indel (inserción /deieción) se identifican en FAD3-1 C que están asociados con ciertos fenotipos de ácido linolénico bajo (cuadro 4). Los SNPs correspondientes a las posiciones 687, 2316, 3743, así como el indel en 1 129 de SEQ ID NO: 62 están asociados con el fenotipo de ácido linolénico bajo. Líneas de ácido linolénico bajo, Soyola y N98-4445 portan un alelo diferente en las posiciones 687 y 1 129 de todas las otras líneas. Líneas mutantes 6P248, T271 1 1 , T27190, T26767, T26830 y A5 no amplificarán con ciertos iniciadores específicos de locus FAD3-1 C ya que hay una deieción grande en el locus FAD3-1 C en estas líneas. La falla de estas regiones para ser amplificadas, acoplado con reacciones de control positivo apropiadas (es decir, usando ADN genómico de soya que contiene un gen FAD3-1 C intacto con iniciadores FAD3-1 C de la región deletada así como el uso de iniciadores a otros genes no-FAD3-1 C con el ADN genómico de soya de la deieción FAD3-1 C), es diagnóstico para deleciones FAD3-1 .
CUADRO 9 Polimorfismos en el locus FAD3-1 C Posición de secuencia Líneas 687 1 129 1203 2316 3292 3360 3743 6P248 NA NA NA NA T271 1 1 NA NA NA N/A T27190 NA NA NA N/A T26767 NA NA NA N/A T26830 NA NA NA N/A A5 NA NA NA T C1640 T * A Soyola C T A T C A A N98-4445 C T A A2247 T * A G T * * AG1701 T * A G T * * AG1902 T * A T * * AG2402 T * A G T * * * AG2703 T A AG3201 T * G AG3302 T + A AG3702 T * A AJB2102J0C T * A AJB2302K0C T * A CSR2533 T * A CSR2622N T * G CSR3922N * T A DKB19-51 T * A DKB23-95 * T A * WP25920 T A Nota: 1 . NA significa que no ha amplificación.
EJEMPLO 13 Identificación de polimorfismos de promotor FAD3-1C de soya Para poner en práctica los métodos de la invención, los polimorfismos asociados con el gen de FAD3-1 C de soya se pueden usar para identificar la presencia de regiones genómicas de soya asociadas con ciertos fenotipos de ácido linolénico bajo. Como se observa en el cuadro 5, las líneas de ácido linolénico bajo Soyola y N98-4445 portaron un alelo diferencie en todas las siete posiciones de las otras líneas de tipo silvestre. La presencia de estos polimorfismos se podría usar para identificar la presencia de gemoplasma de Soyola o N98-4445 en cruzas para germoplasma de tipo silvestre.
CUADRO 10 Polimorfismos en la región de promotor FAD3-1 C Posición 334 364 385 387 393 729 747 Soyola G C T A C G C N98-4445 G C T A C G C Tipo silvestre (16 líneas) A G G T T T T Todas las composiciones y/o métodos descritos y reivindicados aquí se pueden hacer ejecutar sin experimentación extraordinaria a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de modalidades preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y/o métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito aquí sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. De manera más específica, será evidente que ciertos agentes que están tanto químicamente como fisiológicamente relacionados pueden sustituir a los gentes descritos aquí aunque los mismos o similares resultados se lograrían. Todos esos sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica se consideran dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como lo definen las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en esta especificación se incorporan aquí por referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada para ser incorporada por referencia.

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método para producir una planta de soya que comprende un contenido de ácido linolénico de menos de aproximadamente 6% en peso de los ácidos grasos de la semilla totales y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% en peso de los ácidos grasos de la semilla totales, que comprende los pasos de: a) hacer una o más plantas de soya que comprenden un transgén que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 de soya endógeno y por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno; b) obtener por lo menos una semilla de dicha planta de soya obtenida en el paso (a); c) determinar un porcentaje en peso del contenido de ácido graso de semilla total de ácido linolénico y ácido oleico para la semilla del paso (b); y d) identificar una planta de soya que produce semilla que tiene una composición de ácido graso de semilla que comprende un contenido de ácido linolénico de menos de aproximadamente 6% en peso de ácidos grasos de semilla total y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% en peso de ácidos grasos de semilla total. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde las plantas de soya que se hacen en el paso (a) comprenden por lo menos dos mutaciones de pérdida de función en por lo menos dos genes FAD3 de soya endógenos. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde los genes FAD3 de soya endógenos son FAD3-1 B y FAD3-1C. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde la planta de soya identificada en el paso 3 comprende un contenido de ácido linolénico de menos de aproximadamente 3% en peso de ácidos grasos de semilla totales y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% en peso de ácidos grasos de semilla totales. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la planta de soya se hace en el paso (a) al: I) cruzar una primera línea progenitora de soya que comprende el transgén con una segunda línea progenitora de soya que comprende por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno para obtener una planta de soya F1 que es heterocigótica para dicho transgén y heterocigótica por lo menos para una mutación de pérdida de función en un gen FAD3; y ii) autocruzar plantas de progenie F1 de (i) para obtener una planta de soya F2 que es homocigótica para dicho transgén y homocigótica por lo menos para una mutación de pérdida de función en un gen FAD3, obteniendo así una planta de soya que comprende tanto un transgén que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 de soya endógeno y por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde la segunda línea progenitora de soya comprende por lo menos dos mutaciones de pérdida de función en por lo menos dos genes FAD3 de soya endógenos. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde dichos genes FAD3 de soya endógenos son FAD3-1 B y FAD3-1 C. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde la planta de soya F1 que es heterocigotica para dicho transgén y por lo menos para una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 gene se obtiene en el paso (i) al someter una pluralidad de plantas F1 a por lo menos una técnica de análisis de ADN que permite la identificación de una planta F1 que es heterocigotica para dicho transgén y por lo menos para una mutación de pérdida de función en un gen FAD3. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde la planta de soya F2 que es homocigótica para dicho transgén y homocigótica por lo menos para una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 se obtiene en el paso (ii) al someter una pluralidad de plantas F2 a por lo menos una técnica de análisis de ADN que permite la identificación de una planta F2 que es homocigótica para dicho transgén y homocigoticas por lo menos para una mutación de pérdida de función en un gen FAD3. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde la técnica de análisis de ADN comprende una o más técnicas seleccionadas del grupo que consiste de análisis de PCR, análisis de PCR cuantitativo, análisis de SNP, análisis de AFLP, análisis de RFLP y análisis de RAPD. 11. - El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde la técnica de análisis de ADN comprende una o más técnicas seleccionadas del grupo que consiste de análisis de PCR, análisis de PCR cuantitativo, análisis de SNP, análisis de AFLP, análisis de RFLP y análisis de RAPD. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde la técnica de análisis de ADN comprende la detección de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido en una posición en la secuencia de gen FAD3-1C correspondiente al nucleótido 687, 1129, 1203, 2316, 3292, 3360 ó 3743 de SEQ ID NO: 62, la detección de una deleción en el gen FAD3-1C de SEQ ID NO: 62, o la detección de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido en una secuencia de promotor de FAD3-1C de soya correspondiente a una guanina en el nucleótido 334, una citosina en el nucleótido 364, una timina en el nucleótido 385, una adenina en el nucleótido 387, una citosina en el nucleótido 393, una guanina en el nucleótido 729 y una citosina en el nucleótido 747 de SEQ ID NO: 63. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde la técnica de análisis de ADN comprende la detección de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido en una posición en la secuencia de promotor de FAD3-1 C correspondiente al nucleótido 687, 129, 1203, 2316, 3292, 3360 ó 3743 de SEQ ID NO: 62, la detección de una deleción en el gen FAD3-1C de SEQ ID NO: 62, o la detección de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido en una secuencia de promotor de FAD3-1C de soya correspondiente a una guanina en el nucleótido 334, una citosina en el nucleótido 364, una timina en el nucleótido 385, una adenina en el nucleótido 387, una citosina en el nucleótido 393, una guanina en el nucleótido 729 y una citosina en el nucleótido 747 de SEQ ID NO: 63. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde la técnica de análisis de ADN comprende la detección de un polimorfismo de un solo nucleótido en el gen FAD3-1 B de soya que comprende una sustitución de un residuo de timina en vez de un residuo de citosina en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 B correspondiente al nucleótido 2021 de SEQ ID NO: 61. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde la técnica de análisis de ADN comprende la detección de mutación en el gen FAD3-1 B de soya que comprende una sustitución de un residuo de timina en vez de un residuo de citosina en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 B correspondiente al nucleótido 2021 de SEQ ID NO: 61. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el transgén además comprende un transgén que confiere tolerancia a herbicida. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde el transgén además comprende un transgén que confiere tolerancia a herbicida y en donde dicha planta de soya F1 que es heterocigótica para dicho transgén se obtiene en el paso (i) al someter una pluralidad de plantas F1 a selección de herbicida para ese transgén. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde el transgén además comprende un transgén que confiere tolerancia a herbicida y en donde una pluralidad de F2 plantas enriquecidas para plantas de soya F2 que son homocigótica para el transgén se obtienen en el paso (ii) al someter la pluralidad de plantas F2 a selección de herbicida para el transgén. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde el herbicida es glifosato. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde el transgén comprende secuencias localizadas entre las secuencias de borde de T-ADN de pMON68504, pCGN5469, pCGN5471 ó pCGN5485 que están integradas en un cromosoma de la planta. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la planta de soya se hace en el paso (a) al: a) transformar una planta de soya o célula de planta de soya que comprende por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno con a transgén que disminuye la expresión de gen FAD2-1 de soya endógeno para obtener una planta de soya R0 con por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 que es heterocigótico para el transgén; b) autocruzar la planta de progenie Ro de (i) para obtener una planta de soya R1 que es homocigótica para el transgén y homocigótica por lo menos para una mutación de pérdida de función en un gen FAD3, obteniendo así una planta de soya que comprende un transgén que disminuye la expresión de un gen FAD2-1 de soya endógeno y por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , en donde el transgén además comprende secuencias que confieren un rasgo de tolerancia a herbicida. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde el herbicida es glifosato. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 5, que comprende además el paso iii) autocruzar la planta de progenie F2 que es homocigótica para el transgén y homocigótica para por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de (ii) para obtener una planta de soya F3. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el porcentaje en peso de contenido de ácido graso de semilla total de ácido linolénico y ácido oleico se determina en el paso (c) por una técnica de análisis de lípido. 26. - El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde la técnica de análisis de lípido comprende una o más técnicas seleccionadas del grupo que consiste de cromatografía de gases/detección por ionización de llama, cromatografía de gases/espectroscopia de masa, cromatografía de capa delgada/detección de ionización de llama, cromatografía de líquidos/espectrometría de masa, cromatografía de líquidos/ionización por electroaspersión-espectrometría de masa y cromatografía de líquidos/ionización por electroaspersión-espectroscopía de masa en tándem. 27. - Una planta de soya producida por el método de la reivindicación 1. 28. - Una parte de planta de la planta de soya de la reivindicación 27. 29. - La parte de la planta de conformidad con la reivindicación 28, en donde dicha parte de la planta es polen, un óvulo, un meristema, una hoja, un tallo, una raíz o una célula. 30. - Una planta de soya de progenie de la planta de soya de la reivindicación 27. 31. - Una semilla de la planta de soya producida por el método de la reivindicación 1 , dicha semilla teniendo una composición de ácido graso que comprende un contenido de ácido linolénico de menos de aproximadamente 6% en peso de ácidos grasos de semilla totales y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% en peso de ácidos grasos de semilla totales. 32.- Una semilla de la planta de soya producida por el método de la reivindicación 4, dicha semilla teniendo una composición de ácido graso que comprende un contenido de ácido linolénico de menos de aproximadamente 3% en peso de ácidos grasos de semilla totales y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% en peso de ácidos grasos de semilla totales. 33.- Un método para obtener una planta de soya con una composición de ácido graso de aceite de semilla alterada que comprende los pasos de: a) cruzar una primera línea progenitora de soya que tiene una composición de ácido graso de aceite de semilla que comprende un contenido de ácido linolénico de menos de aproximadamente 3% en peso de ácidos grasos totales con una segunda línea progenitora de soya que tiene una composición de ácido graso de aceite de semilla en donde el contenido de por lo menos un ácido graso distinto del ácido linoleico es alterado por lo menos por 50% cuando se compara con el contenido de ácido graso correspondiente de un aceite de soya comercial, dicha segunda línea progenitora de soya que comprende un transgén que altera el contenido de por lo menos un ácido graso distinto al ácido linoleico; y b) obtener una planta de progenie que presenta una composición de ácido graso de aceite de semilla que comprende un contenido de ácido linolénico de menos de 3% de ácidos grasos totales en peso y un contenido de por lo menos un ácido graso distinto de ácido linoleico que es alterado por lo menos por 50% cuando se compara con el contenido de ácido graso correspondiente de un aceite de soya comercial, obteniendo así una planta de soya con una composición alterada de ácido graso de aceite de semilla. 34. - El método de conformidad con la reivindicación 33, en donde el ácido graso distinto del ácido linolénico se selecciona del grupo que consiste de ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmitíco, ácido esteárico, ácido estearidónico, ácido oleico, ácido linoleico ácido ?-linoleico, ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico. 35. - El método de conformidad con la reivindicación 24, en donde el ácido graso distinto del ácido linolénico se selecciona del grupo que consiste de ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmitíco, ácido esteárico, ácido estearidónico, ácido oleico, ácido linoleico ácido ?-linoleico, ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico. 36. - Un método para producir una planta de soya que comprende un contenido de ácido linolénico de menos de aproximadamente 6% en peso de ácidos grasos de semilla totales, un contenido de ácido graso saturado de menos de aproximadamente 8% en peso y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% en peso de ácidos grasos de semilla totales, que comprende los pasos de: a) hacer una o más plantas de soya que comprenden por lo menos un transgén que disminuye la expresión tanto de un gen FAD2-1 de soya endógeno y un gen FATB endógeno, y por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno; b) obtener por lo menos una semilla de la planta de soya obtenida en el paso (a); c) determinar un porcentaje en peso del contenido de ácido graso de semilla total de ácido linolénico, ácidos grasos saturados y ácido oleico para la semilla del paso (b); y d) identificar una planta de soya que produce semilla que tiene una composición de ácido graso de semilla que comprende un contenido de ácido linolénico de menos de aproximadamente 6% en peso de ácidos grasos de semilla totales, un contenido de ácido graso saturado de menos de aproximadamente 8% en peso, y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% en peso de ácidos grasos de semilla totales. 37. - El método de conformidad con la reivindicación 36, en donde las plantas de soya que se hacen en el paso (a) comprenden por lo menos dos mutaciones de pérdida de función en por lo menos dos genes FAD3 de soya endógenos. 38. - El método de conformidad con la reivindicación 37, en donde los genes FAD3 de soya endógenos son FAD3-1 B y FAD3-1C. 39. - El método de conformidad con la reivindicación 38, en donde la planta de soya identificada en el paso 3 comprende un contenido de ácido linolénico de menos de aproximadamente 3% en peso de ácidos grasos de semilla totales, un contenido de ácido graso saturado de menos de aproximadamente 8% en peso y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% en peso de ácidos grasos de semilla totales. 40. - El método de conformidad con la reivindicación 36, en donde la planta de soya se hace en el paso (a) al: i) cruzar una primera línea progenitora de soya que comprende el transgén con una segunda línea progenitora de soya que comprende por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno para obtener una planta de soya F1 que es heterocigótica para el transgén y heterocigótica por lo menos para una mutación de pérdida de función en un gen FAD3; y ii) autocruzar plantas de progenie F1 de (i) para obtener una planta de soya F2 que es homocigotica para los transgenes y homocigotica por lo menos para una mutación de pérdida de función en un gen FAD3, obteniendo así una planta de soya que comprende por lo menos un transgén que disminuye la expresión tanto de un gen FAD2-1 de soya endógeno como un gen FATB endógeno y por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno. 41 .- El método de conformidad con la reivindicación 40, en donde la planta de soya F1 que es heterocigótica para el transgén y por lo menos para una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 se obtiene en el paso (i) al someter una pluralidad de plantas F1 para por lo menos una técnica de análisis de ADN que permite la identificación de una planta F1 que es heterocigótica para el transgén y por lo menos para una mutación de pérdida de función en un gen FAD3. 42.- El método de conformidad con la reivindicación 40, en donde la planta de soya F2 que es homocigótica para el transgén y homocigótica por lo menos para una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 se obtiene en el paso (ii) al someter una pluralidad de plantas F2 a por lo menos una técnica de análisis de ADN que permite la identificación de una planta F2 que es homocigótica para el transgén y homocigótica por lo menos para una mutación de pérdida de función en un gen FAD3. 43.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , en donde la técnica de análisis de ADN comprende la detección de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 C correspondiente al nucleótido 687, 1 129, 1203, 2316, 3292, 3360 ó 3743 de SEQ ID NO: 62, la detección de una deleción en el gen FAD3-1 C de SEQ ID NO: 62, o la detección de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido en una secuencia de promotor de FAD3-1 C de soya correspondiente a una guanina en el nucleotido 334, una citosina en el nucleotido 364, una timina en el nucleotido 385, una adenina en el nucleotido 387, una citosina en el nucleotido 393, una guanina en el nucleotido 729 y una citosina en el nucleotido 747 de SEQ ID NO: 63. 44.- El método de conformidad con la reivindicación 42, en donde la técnica de análisis de ADN comprende la detección de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleotido en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 C correspondiente al nucleotido 687, 1129, 1203, 2316, 3292, 3360 ó 3743 de SEQ ID NO: 62, la detección de una deleción en el gen FAD3-1 C de SEQ ID NO: 62, o la detección de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleotido en una secuencia de promotor de FAD3-1 C de soya correspondiente a una guanina en el nucleotido 334, una citosina en el nucleotido 364, una timina en el nucleotido 385, una adenina en el nucleotido 387, una citosina en el nucleotido 393, una guanina en el nucleotido 729 y una citosina en el nucleotido 747 de SEQ ID NO: 63. 45. - El método de conformidad con la reivindicación 41 , en donde la técnica de análisis de ADN comprende la detección de un polimorfismo de un solo nucleotido en el gen FAD3-1 B de soya que comprende una sustitución de un residuo de timina en vez de un residuo de citosina en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 B correspondiente al nucleotido 2021 de SEQ ID NO: 61. 46. - El método de conformidad con la reivindicación 42, en donde la técnica de análisis de ADN comprende la detección de un polimorfismo de un solo nucleótido en el gen FAD3-1 B de soya que comprende una sustitución de un residuo de timina en vez de un residuo de citosina en una posición en la secuencia de gen FAD3-1 B correspondiente al nucleótido 2021 de SEQ ID NO: 61. 47.- El método de conformidad con la reivindicación 36, en donde el transgén además comprende un transgén que confiere tolerancia a herbicida. 48. - El método de conformidad con la reivindicación 40, en donde el transgén además comprende un transgén que confiere tolerancia a herbicida y en donde dicha planta de soya F1 que es heterocigótica para dicho transgén se obtiene en el paso (i) al someter una pluralidad de plantas F1 a selección de herbicida para ese transgén. 49. - El método de conformidad con la reivindicación 40, en donde el transgén además comprende un transgén que confiere tolerancia a herbicida y en donde una planta F2 plantas enriquecidas para plantas de soya F2 que son homocigóticas para dicho transgén se obtienen en el paso (¡i) al someter la pluralidad de plantas F2 a selección de herbicida para ese transgén. 50. - El método de conformidad con la reivindicación 47, en donde el herbicida es glifosato. 51. - El método de conformidad con la reivindicación 47, en donde el transgén comprende un gen CP4 EPSPS. 52. - El método de conformidad con la reivindicación 36, la planta de soya se hace en el paso (a) al: a) transformar una planta de soya o célula de planta de soya que comprende por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno con por lo menos un transgén que disminuye la expresión tanto de un gen FAD2-1 de soya endógeno como un gen FATB de soya endógeno para obtener una planta de soya Ro con por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 que es heterocigótico para el transgén; b) autocruzar la planta de progenie R0 de (i) para obtener una planta de soya R1 que es homocigótica para dicho transgén y homocigótica por lo menos para una mutación de pérdida de función en un gen FAD3, obteniendo así una planta de soya que comprende el transgén y por lo menos una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de soya endógeno. 53. - El método de conformidad con la reivindicación 52, en donde el transgén además comprende secuencias que confieren un rasgo de tolerancia a herbicida. 54. - El método de conformidad con la reivindicación 53, en donde el herbicida es glifosato. 55. - El método de conformidad con la reivindicación 40, que comprende además el paso iii) autocruzar la planta de progenie F2 que es homocigótica para el transgén y homocigótica por lo menos para una mutación de pérdida de función en un gen FAD3 de (ii) para obtener una planta de soya F3. 56. - El método de conformidad con la reivindicación 36, en donde el porcentaje en peso de contenido de ácido graso de semilla total de ácido linolénico, ácidos grasos saturados y ácido oleico se determina en el paso (c) por una técnica de análisis de lípido. 57. - El método de conformidad con la reivindicación 56, en donde la técnica de análisis de lípido comprende una o más técnicas seleccionadas del grupo que consiste de cromatografía de gases/detección por ionización de llama, cromatografía de gases/espectroscopia de masa, cromatografía de capa delgada/detección de ionización de llama, cromatografía de líquidos/espectrometría de masa, cromatografía de líquidos/ionización por electroaspersión-espectrometría de masa y cromatografía de líquidos/ionización por electroaspersión-espectroscopía de masa en tándem. 58. - Una planta de soya producida por el método de la reivindicación 36. 59.- Una parte de planta de la planta de soya de la reivindicación 58. 60.- La parte de la planta de conformidad con la reivindicación 59, en donde dicha parte de la planta es polen, un óvulo, un meristema, una hoja, un tallo, una raíz o una célula. 61.- Una planta de soya de progenie de la planta de soya de la reivindicación 58. 62.- Una semilla de la planta de soya producida por el método de la reivindicación 36, dicha semilla teniendo una composición de ácido graso que comprende un contenido de ácido linolénico de menos de aproximadamente 6% en peso de ácidos grasos de semilla totales, un contenido de ácido graso saturado de menos de aproximadamente 8% en peso y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% en peso de ácidos grasos de semilla totales. 63.- Una semilla de la planta de soya producida por el método de la reivindicación 39, dicha semilla teniendo una composición de ácido graso que comprende un contenido de ácido linolénico de menos de aproximadamente 3% en peso de ácidos grasos de semilla totales, un contenido de ácido graso saturado de menos de aproximadamente 8% en peso y un contenido de ácido oleico de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% en peso de ácidos grasos de semilla totales.
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Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR045290A1 (es) 2003-08-21 2005-10-19 Monsanto Technology Llc Acido graso desaturasas de primula
EP2902021B1 (en) 2004-04-16 2018-11-14 Monsanto Technology LLC Expression of fatty acid desaturases in corn
WO2006039449A1 (en) 2004-09-29 2006-04-13 Monsanto Technology Llc High yielding soybean plants with low linolenic acid
WO2010078498A1 (en) 2008-12-31 2010-07-08 Battelle Memorial Institute Use of fatty acids as feed material in polyol process
US8877952B2 (en) 2005-04-26 2014-11-04 Battelle Memorial Institute Pre-esterification of primary polyols to improve solubility in solvents used in the polyol process
WO2007092569A1 (en) 2006-02-07 2007-08-16 Battelle Memorial Institute Esters of 5 -hydroxymethylfurfural and methods for their preparation
BR122018075948B1 (pt) * 2006-03-10 2023-05-16 Monsanto Technology Llc Métodos de produzir uma planta de soja com teor de ácidos graxos de semente alterados
US8435790B2 (en) * 2008-07-25 2013-05-07 The Regents Of The University Of California Methods of modulating lipid concentrations in eukaryotic cells
WO2010037016A1 (en) * 2008-09-29 2010-04-01 Monsanto Technology Llc Soybean transgenic event mon87705 and methods for detection thereof
TWI604053B (zh) * 2008-09-29 2017-11-01 孟山都科技有限責任公司 大豆基因轉殖品系ｍｏｎ８７７０５及其檢測方法
BRPI0923801B1 (pt) 2008-12-31 2020-10-13 Battelle Memorial Institute Métodos para produzir um éster, e para produzir amidas
CA2748622C (en) 2008-12-31 2016-11-01 Battelle Memorial Institute Preparation of esters and polyols by initial oxidative cleavage of fatty acids followed by esterification reactions
US9359572B2 (en) 2009-03-13 2016-06-07 Battelle Memorial Institute Modified vegetable oil lubricants
CN103002727B (zh) 2009-07-08 2016-04-27 密苏里大学管委会 利用传统大豆育种技术培育高油酸大豆的方法
US9480271B2 (en) 2009-09-15 2016-11-01 Monsanto Technology Llc Soybean seed and oil compositions and methods of making same
US20120240289A1 (en) 2009-10-20 2012-09-20 Ivo Feussner Methods and means to alter lipid biosynthesis by targeting multiple enzymes to suborganelle domains
US8653328B2 (en) * 2009-12-17 2014-02-18 The Curators Of The University Of Missouri Plant genes associated with seed oil content and methods of their use
CN102984935B (zh) 2009-12-18 2016-01-13 嘉吉公司 产生具有低总饱和脂肪酸含量的油的芸苔属植物
AR085892A1 (es) 2011-01-14 2013-11-06 Univ Missouri Metodo para desarrollar soja con un contenido elevado de acido oleico usando tecnicas de desarrollo convencionales
CN102498794A (zh) * 2011-11-08 2012-06-20 东华理工大学 一种十字花科种子活力的检测方法
US9049872B2 (en) 2012-06-03 2015-06-09 Monsanto Technology Llc Soybean variety A1026244
US20150225734A1 (en) 2012-06-19 2015-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
CA2878287A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Bayer Cropscience Nv Soybean rod1 gene sequences and uses thereof
CA2890281C (en) 2012-11-01 2021-12-07 Daniel F. Voytas Plants for production of therapeutic proteins
US20140178561A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Cellectis Potatoes with reduced cold-induced sweetening
US10113162B2 (en) 2013-03-15 2018-10-30 Cellectis Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the FAD2-1A/1B genes
US9192119B2 (en) 2013-06-10 2015-11-24 Monsanto Technology Llc Soybean variety A1036554
EP3080250A1 (en) * 2013-12-10 2016-10-19 The University of York Desaturase nucleic acids and polypeptides
CA2952906A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Cellectis Potatoes with reduced granule-bound starch synthase
BR102015006156B1 (pt) * 2015-03-19 2023-12-05 Embrapa-Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuaria Método de produzir planta de soja com composição diferenciada de ácidos graxos na semente, planta de soja, semente de planta de soja e óleo de semente de soja
EP3274435A1 (en) 2015-03-25 2018-01-31 CL Products International LLC Candle products comprising vegetable oil that is low in polyunsaturation and gelling agent
CN105132531B (zh) * 2015-07-23 2017-11-28 中国农业科学院作物科学研究所 一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒棕榈酸含量的方法及其应用
US10837024B2 (en) 2015-09-17 2020-11-17 Cellectis Modifying messenger RNA stability in plant transformations
WO2017134601A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Cellectis Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the fad3a/b/c genes
US9999186B2 (en) 2016-06-07 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01059533
US9968056B2 (en) 2016-06-07 2018-05-15 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01051641
US9974266B2 (en) 2016-06-07 2018-05-22 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01059566
US11312972B2 (en) 2016-11-16 2022-04-26 Cellectis Methods for altering amino acid content in plants through frameshift mutations
US20200208166A1 (en) 2016-12-22 2020-07-02 Toolgen Incorporated Oleic Acid-Enriched Plant Body Having Genetically Modified FAD2 And Production Method Thereof
BR112019018200B1 (pt) 2017-03-03 2024-02-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc Método para medir a quantidade de um sucrosil-oligossacarídeo,método para medir estaquiose, método para processar sementes de soja geneticamente modificadas
AU2018260469B2 (en) 2017-04-25 2024-09-05 Cellectis Alfalfa with reduced lignin composition
US10064380B1 (en) 2017-07-06 2018-09-04 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01063585
US10194615B2 (en) 2017-07-06 2019-02-05 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01063576
US10058058B1 (en) 2017-07-06 2018-08-28 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01063616
US10058059B1 (en) 2017-07-14 2018-08-28 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01067522
US10743493B2 (en) 2018-08-27 2020-08-18 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077438
US10743492B2 (en) 2018-08-27 2020-08-18 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077433
US10660293B2 (en) 2018-08-27 2020-05-26 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077434
US10743491B2 (en) 2018-08-27 2020-08-18 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077432
US10660294B2 (en) 2018-08-27 2020-05-26 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077435
US10602706B2 (en) 2018-08-27 2020-03-31 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077437
US10512242B1 (en) 2018-08-27 2019-12-24 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077436
JP2023505039A (ja) * 2019-11-27 2023-02-08 カリックス インコーポレイテッド 遺伝子編集のためのｔａｌエフェクターヌクレアーゼ
CR20220534A (es) 2020-04-24 2023-02-17 Monsanto Technology Llc Evento de maíz transgénico mon95275, métodos para su detección y usos de este
WO2022072846A2 (en) * 2020-10-02 2022-04-07 Impossible Foods Inc. Transgenic plants with altered fatty acid profiles and upregulated heme biosynthesis
CN114192725B (zh) * 2021-12-09 2022-06-28 睿恩特智能装备(东莞)有限公司 一种自动化防错漏铆压方法及铆压设备
WO2023151004A1 (en) * 2022-02-11 2023-08-17 Northeast Agriculture University Methods and compositions for increasing protein and oil content and/or modifying oil profile in plant

Family Cites Families (126)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB715352A (en) 1952-02-06 1954-09-15 Melville Edward Dunkley Process for the treatment of oil-bearing vegetable material
US4089880A (en) * 1975-03-13 1978-05-16 Sullivan Systems Inc. Proces for refining fatty oils
DE2922146A1 (de) 1979-01-19 1980-07-24 Intercell Ag Verfahren und anlage zur verlustfreien lagerung von koernerfruechten und samen, sowie anwendung des verfahrens
JPS5846118A (ja) 1981-09-10 1983-03-17 Teijin Ltd 感湿捲縮複合繊維
MX7580E (es) 1981-10-15 1989-11-23 Cpc International Inc Procedimiento para la refinacion de aceites vegetales crudos
US5428147A (en) 1983-04-15 1995-06-27 Mycogen Plant Science, Inc. Octopine T-DNA promoters
US4633436A (en) 1983-12-16 1986-12-30 International Business Machines Corp. Real-time rub-out erase for an electronic handwriting facility
US5447858A (en) 1984-04-13 1995-09-05 Mycogen Plant Sciences, Inc. Heat shock promoter and gene
US4789554A (en) 1985-12-05 1988-12-06 The Procter & Gamble Company High temperature vacuum steam distillation process to purify and increase the frylife of edible oils
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US4944954A (en) * 1986-04-23 1990-07-31 Epe Incorporated Vegetable oil extraction process
JPS6344843A (ja) 1986-08-13 1988-02-25 Kao Corp 油中水中油型乳化油脂組成物
JPS6344843U (es) 1986-09-10 1988-03-25
US4957748A (en) 1987-03-23 1990-09-18 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Ruminant feed, method of making and method of using
US5638637A (en) * 1987-12-31 1997-06-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of improved rapeseed exhibiting an enhanced oleic acid content
ES2063054T3 (es) 1987-12-31 1995-01-01 Pioneer Hi Bred Int Produccion de colza con contenido en acido oleico modificado.
US4915972A (en) * 1988-01-05 1990-04-10 Prosoya Corporation Food processing in oxygen-free environment
US4948811A (en) * 1988-01-26 1990-08-14 The Procter & Gamble Company Salad/cooking oil balanced for health benefits
US5534425A (en) 1988-02-03 1996-07-09 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybeans having low linolenic acid content and method of production
CA1339684C (en) 1988-05-17 1998-02-24 Peter H. Quail Plant ubquitin promoter system
GB8813766D0 (en) 1988-06-10 1988-07-13 Efamol Holdings Essential fatty acid compositions
US5286886A (en) * 1988-06-21 1994-02-15 Van Den Bergh Foods Co., Division Of Conopco, Inc. Method of refining glyceride oils
GB8814732D0 (en) 1988-06-21 1988-07-27 Unilever Plc Method of refining clyceride oils
CH678181A5 (es) * 1989-05-22 1991-08-15 Nestle Sa
US5633441A (en) 1989-08-04 1997-05-27 Plant Genetic Systems, N.V. Plants with genetic female sterility
ES2150900T3 (es) 1989-10-31 2000-12-16 Monsanto Co Promotor para plantas transgenicas.
US5557037A (en) * 1989-12-05 1996-09-17 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybeans having elevated contents of saturated fatty acids
US5391725A (en) 1989-12-08 1995-02-21 New York University Medical Center Organ-specific plant promoter sequences
US5585535A (en) * 1990-01-05 1996-12-17 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybeans and soybean products having low palmitic acid content
GB2241503A (en) 1990-02-15 1991-09-04 Unilever Plc Edible fatty composition containing bleached fish oils
WO1991015578A1 (en) * 1990-04-04 1991-10-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of improved rapeseed exhibiting a reduced saturated fatty acid content
US6483008B1 (en) 1990-08-15 2002-11-19 Calgene Llc Methods for producing plants with elevated oleic acid content
US5219596A (en) 1990-08-24 1993-06-15 Cargill, Incorporated Composition and method thereof for increasing milk production in dairy cattle
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5100679A (en) 1990-10-03 1992-03-31 Cargill B.V. Method of making a modified proteinaceous product and composition thereof
US6022577A (en) * 1990-12-07 2000-02-08 Nabisco Technology Company High stearic acid soybean oil blends
US5208058A (en) * 1991-01-09 1993-05-04 Amano Jitsugyo Co., Ltd. Method for treating nuts
US5658767A (en) * 1991-01-24 1997-08-19 Martek Corporation Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
US5260077A (en) * 1991-02-12 1993-11-09 The Lubrizol Corporation Vegetable oil compositions
EP0779024B1 (en) 1991-09-30 2005-11-16 Cargill Incorporated A canola producing a seed with reduced glucosinolates and linolenic acid yielding an oil with low sulfur
US5750827A (en) * 1991-09-30 1998-05-12 Cargill Incorporated Canola variety producing a seed with reduced glucosinolates and linolenic acid yielding an oil with low sulfur, improved sensory characteristics and increased oxidative stability
US6270828B1 (en) * 1993-11-12 2001-08-07 Cargrill Incorporated Canola variety producing a seed with reduced glucosinolates and linolenic acid yielding an oil with low sulfur, improved sensory characteristics and increased oxidative stability
US5710365A (en) 1991-10-24 1998-01-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean products with improved carbohydrate composition and soybean plants
CA2109811A1 (en) 1992-04-03 1993-10-14 Kevin C. Spencer Method of improving the aroma and flavor of stored beverages and edible oils
US5315020A (en) * 1992-07-29 1994-05-24 Praxair Technology, Inc. Method of recovering waste heat from edible oil deodorizer and improving product stability
US6872872B1 (en) 1992-11-17 2005-03-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
AU5407594A (en) 1992-11-17 1994-06-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
US6372965B1 (en) 1992-11-17 2002-04-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants
DK0672096T3 (da) 1992-12-03 1997-11-03 Unilever Plc Fremgangsmåde til raffinering af spiselige olier.
WO1994019929A2 (en) * 1993-02-25 1994-09-15 Cargill, Incorporated LOW LEVEL GLUCOSINOLATE $i(BRASSICA)
US5696278A (en) * 1993-03-17 1997-12-09 Unilever Patent Holdings B.V. Degumming of crude glyceride oils not exposed to prior enzymatic activity
EP0696885B1 (en) * 1993-04-27 1999-09-15 Cargill, Incorporated Non-hydrogenated canola oil for food applications
DK0703728T3 (da) * 1993-06-17 2002-11-04 Cargill Inc Hældelig rapsolie til fødevareanvendelse
DE69326949T2 (de) 1993-08-20 2000-02-17 Societe Des Produits Nestle S.A., Vevey Lipidzusammensetzung für Nahrungsmittel
AU692791B2 (en) * 1993-10-12 1998-06-18 Agrigenetics, Inc. Brassica napus variety AG019
JPH09505470A (ja) 1993-11-10 1997-06-03 カルジーン，インコーポレイティド 植物アシルａｃｐチオエステラーゼ配列
US5530183A (en) 1994-01-10 1996-06-25 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybean variety 9253
US5520708A (en) * 1994-04-26 1996-05-28 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybean oil ester fuel blends
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
AU706866B2 (en) 1994-08-31 1999-06-24 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleotide sequences of canola and soybean palmitoyl-acp thioesterase genes and their use in the regulation of fatty acid content of the oils of soybean and canola plants
US5625130A (en) * 1995-03-07 1997-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Oilseed Brassica bearing an endogenous oil wherein the levels of oleic, alpha-linolenic, and saturated fatty acids are simultaneously provided in an atypical highly beneficial distribution via genetic control
US5955329A (en) 1995-05-15 1999-09-21 Calgene, Inc. Engineering plant thioesterases for altered substrate specificity
AU5816096A (en) 1995-05-16 1996-11-29 Unilever Plc Method for refining an edible oil
DE69618594T2 (de) 1995-06-12 2002-08-22 Unilever N.V., Rotterdam Schonendes raffinieren von triglyceridölen
US5811636A (en) 1995-09-22 1998-09-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Apomixis for producing true-breeding plant progenies
US5936069A (en) 1995-12-06 1999-08-10 Iowa State University Research Foundation Process for producing improved soy protein concentrate from genetically-modified soybeans
US5844086A (en) 1996-01-31 1998-12-01 Stilts Corporation Oil seed protein extraction
ZA973565B (en) * 1996-04-26 1998-10-26 Du Pont Soybean oil having high oxidative stability
US6340485B1 (en) * 1996-06-03 2002-01-22 Croda International Plc Compositions and uses thereof
US5850026A (en) * 1996-07-03 1998-12-15 Cargill, Incorporated Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content
US5850030A (en) 1996-12-23 1998-12-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Reduced linolenic acid production in soybeans
JPH10191885A (ja) 1997-01-14 1998-07-28 Nisshin Oil Mills Ltd:The 大豆・菜種配合油
US6376754B1 (en) * 1997-03-07 2002-04-23 Asgrow Seed Company Plants having resistance to multiple herbicides and its use
US6331664B1 (en) 1997-05-05 2001-12-18 Dow Agrosciences Llc Acyl-ACP thioesterase nucleic acids from maize and methods of altering palmitic acid levels in transgenic plants therewith
GB9710475D0 (en) 1997-05-21 1997-07-16 Zeneca Ltd Gene silencing
MY124156A (en) * 1997-08-29 2006-06-30 Lipogenics Inc Process for stabilization of oil from plant materials
CA2303407C (en) * 1997-09-12 2011-01-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Regulation of gene expression in plants
DE69840378D1 (de) 1998-02-13 2009-02-05 Lipidia Holding S A Raffinieren von essbaren Ölen mit höchstem antioxidativem Wirkungsgrad
US6426448B1 (en) * 1998-05-11 2002-07-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Gene combinations that alter the quality and functionality of soybean oil
EP1161877B1 (en) 1998-05-11 2005-11-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Fat products from high stearic soybean oil and a method for the production thereof
US6229033B1 (en) * 1998-05-11 2001-05-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fat products from high stearic soybean oil and a method for the production thereof
US6146669A (en) 1998-05-14 2000-11-14 Cargill Incorporated Method for processing oilseed material
EP1895009A1 (en) 1998-06-12 2008-03-05 Calgene LLC Polyunsaturated fatty acids in plants
US6365802B2 (en) 1998-08-14 2002-04-02 Calgene Llc Methods for increasing stearate content in soybean oil
US6303849B1 (en) * 1998-11-12 2001-10-16 Saskatchewan Wheat Pool Brassica juncea lines bearing endogenous edible oils
US6172248B1 (en) * 1998-11-20 2001-01-09 Ip Holdings, L.L.C. Methods for refining vegetable oils and byproducts thereof
JP2002534129A (ja) 1999-01-14 2002-10-15 モンサント テクノロジー エルエルシー ダイズ形質転換方法
CA2260397A1 (en) 1999-01-29 2000-07-29 Atlantis Marine Inc. Method of converting rendered triglyceride oil from marine sources into bland, stable food oil
US6313328B1 (en) * 1999-02-11 2001-11-06 Cargill, Incorporated Extraction of corn oil from flaked corn grain
US6388110B1 (en) * 1999-02-11 2002-05-14 Cargill, Incorporated High oil corn processing
US6610867B2 (en) * 2000-08-10 2003-08-26 Renessen Llc Corn oil processing and products comprising corn oil and corn meal obtained from corn
US6156227A (en) 1999-03-01 2000-12-05 Cargill, Incorporated Deicer composition which includes a plant material which is a corrosion inhibitor
US6388113B1 (en) * 1999-06-04 2002-05-14 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas ( Csic) High oleic/high stearic sunflower oils
EP1208203B1 (en) * 1999-08-16 2010-01-13 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method for the production of calendic acid, a fatty acid containing delta-8,10,12 conjugated double bonds and dimorphecolic acid, a fatty acid containing a 9-hydroxy group and delta-10,12 conjugated double bonds
US7531718B2 (en) * 1999-08-26 2009-05-12 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
WO2001014538A2 (en) 1999-08-26 2001-03-01 Calgene Llc Plants with modified polyunsaturated fatty acids
US7067722B2 (en) 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
US6184442B1 (en) 2000-01-06 2001-02-06 Asgrow Seed Company Llc Soybean cultivar 9323265446452
US6369302B1 (en) 2000-03-08 2002-04-09 Asgrow Seed Company, Llc Soybean cultivar 958361722350
WO2001089674A2 (en) * 2000-05-24 2001-11-29 The Texas A & M University System Degumming of edible oils by ultrafiltration
US20020058340A1 (en) * 2000-08-02 2002-05-16 Clemente Thomas E. Down-regulation of single genes and simultaneous down-regulation of multiple genes by nuclear localization of RNA transcripts
US6667064B2 (en) * 2000-08-30 2003-12-23 Pilot Therapeutics, Inc. Composition and method for treatment of hypertriglyceridemia
SE523094C2 (sv) * 2001-01-11 2004-03-30 Karlshamns Ab Förfarande för framställning av en fettkomposition som innehåller sterolestrar, fria steroler och glycerider, fettkomposition framställd genom förfarandet samt fettkompositionens användning
US6511690B1 (en) * 2001-02-01 2003-01-28 Carolina Soy Products, Inc. Soybean oil process
JP4995377B2 (ja) * 2001-04-26 2012-08-08 花王株式会社 油脂組成物
US20070004678A1 (en) 2001-05-14 2007-01-04 Gerhard Kohn Production and use of a polar lipid-rich fraction containing stearidonic acid and gamma linolenic acid from plant seeds and microbes
US7419596B2 (en) 2001-12-12 2008-09-02 Martek Biosciences Corporation Extraction and winterization of lipids from oilseed and microbial sources
US20040107460A1 (en) * 2002-03-21 2004-06-03 Fillatti Joanne J. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
US7166771B2 (en) 2002-06-21 2007-01-23 Monsanto Technology Llc Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs
CA2479587A1 (en) 2002-03-21 2003-10-02 Monsanto Technology Llc Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
US7566813B2 (en) 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
WO2003092362A2 (en) 2002-05-03 2003-11-13 Monsanto Technology, Llc Seed specific usp promoters for expressing genes in plants
AU2003281542A1 (en) 2002-06-19 2004-02-09 Dsm Ip Assets B.V. Preparation of microbial oil containing polyunsaturated fatty acids
AU2003251579B2 (en) 2002-06-21 2008-04-03 Monsanto Technology Llc Intron double stranded RNA constructs and uses thereof
US20050262588A1 (en) * 2002-06-21 2005-11-24 Katayoon Dehesh Thioesterase-related nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified fatty acid composition
US6791016B1 (en) * 2003-01-31 2004-09-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean variety 93M40
US20040172682A1 (en) 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
US7973212B2 (en) * 2003-08-01 2011-07-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean plants having superior agronomic performance and methods for their production
US7579492B2 (en) * 2003-09-30 2009-08-25 Carolina Soy Products Llc Two-stage extraction of soybean oil
US6924381B2 (en) * 2003-12-24 2005-08-02 Carolina Soy Products, Llc Modified physical refining of soybean oil
US7855323B2 (en) 2004-02-10 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Recombinant DNA for gene suppression
EP1766032B1 (en) 2004-02-13 2012-10-10 Monsanto Technology, LLC In vivo assembly of transcription units
WO2006039449A1 (en) 2004-09-29 2006-04-13 Monsanto Technology Llc High yielding soybean plants with low linolenic acid
WO2006052664A2 (en) * 2004-11-04 2006-05-18 Monsanto Technology Llc Processes for preparation of oil compositions
BR122018075948B1 (pt) 2006-03-10 2023-05-16 Monsanto Technology Llc Métodos de produzir uma planta de soja com teor de ácidos graxos de semente alterados
US9480271B2 (en) * 2009-09-15 2016-11-01 Monsanto Technology Llc Soybean seed and oil compositions and methods of making same

Also Published As

Publication number Publication date
EP1993349A2 (en) 2008-11-26
AR093018A2 (es) 2015-05-13
US9062319B2 (en) 2015-06-23
EP3133162A1 (en) 2017-02-22
EP2562260A1 (en) 2013-02-27
US20110239335A1 (en) 2011-09-29
US20070214516A1 (en) 2007-09-13
BR122018075948B1 (pt) 2023-05-16
CN105475116A (zh) 2016-04-13
CA2645148A1 (en) 2007-09-20
EP1993349A4 (en) 2010-05-05
US20160130600A1 (en) 2016-05-12
BRPI0708748A2 (pt) 2011-06-28
BRPI0708748B1 (pt) 2023-09-26
WO2007106728A3 (en) 2008-12-04
US20140082774A1 (en) 2014-03-20
CA2645148C (en) 2018-05-22
US20100218269A1 (en) 2010-08-26
CN105475117B (zh) 2019-05-28
ZA200807770B (en) 2015-08-26
CA2988226C (en) 2022-04-26
AR059811A1 (es) 2008-04-30
CN105475117A (zh) 2016-04-13
US20180087066A1 (en) 2018-03-29
US20130067621A1 (en) 2013-03-14
US7943818B2 (en) 2011-05-17
US7790953B2 (en) 2010-09-07
CN101500403A (zh) 2009-08-05
CA2988226A1 (en) 2007-09-20
US20140351996A1 (en) 2014-11-27
US8609953B2 (en) 2013-12-17
US9410161B2 (en) 2016-08-09
US10570406B2 (en) 2020-02-25
EP2562260B1 (en) 2018-08-15
AR093019A2 (es) 2015-05-13
EP3133162B1 (en) 2021-04-21
AU2007226680B2 (en) 2013-10-24
US9873887B2 (en) 2018-01-23
WO2007106728A2 (en) 2007-09-20
AU2007226680A1 (en) 2007-09-20

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US10570406B2 (en) Soybean seed and oil compositions and methods of making same
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