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MX2008011442A - Aldolasas, acidos nucleicos que las codifican, y metodos para hacer y usar las mismas. - Google Patents

Aldolasas, acidos nucleicos que las codifican, y metodos para hacer y usar las mismas.

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Publication number
MX2008011442A
MX2008011442A MX2008011442A MX2008011442A MX2008011442A MX 2008011442 A MX2008011442 A MX 2008011442A MX 2008011442 A MX2008011442 A MX 2008011442A MX 2008011442 A MX2008011442 A MX 2008011442A MX 2008011442 A MX2008011442 A MX 2008011442A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
seq
polypeptide
sequence
aldolase
nucleic acid
Prior art date
Application number
MX2008011442A
Other languages
English (en)
Inventor
Paula M Hicks
Lishan Zhao
Ellen Burke
Peter Luginbuhl
Toby Richardson
David P Weiner
Original Assignee
Verenium Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Verenium Corp filed Critical Verenium Corp
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Abstract

La invención se refiere a polipéptidos que tienen una actividad de aldolasa, incluyendo actividad de aldolasa de piruvato tal como, sin limitación, actividad de aldolasa de HMG y/o KHG, polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, y métodos de hacer y usar estos polinucleótidos y polipéptidos. En algunas formas de realización, la invención está dirigida a polipéptidos que tienen actividad de aldolasa, incluyendo actividad de aldolasa de piruvato tal como, sin limitación, actividad de aldolasa de HMG y/o KHG, incluyendo actividad termoestable y termo-tolerante, y polinucleótidos que codifican estas enzimas, y hacer y usar estos polinucleótidos y polipéptidos. Los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden ser usados en una variedad de contextos farmacéuticos, agrícolas e industriales. En algunas formas de realización, la invención proporciona polipéptidos y trayectorias bio-sintéticas que son útiles en la producción de ácido R-2-hidroxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-ceto glucárico (R-MP) y ciertos estéreo-isómeros de monatina, tales como R,R y S,R monatina, y sus sales, así como ciertos estéreo-isómeros de derivados de monatina, tales como las configuraciones R,R y S,R, y sus sales.

Description

ALDOLASAS, ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LAS CODIFICAN, Y MÉTODOS PARA HACER Y USAR LAS MISMAS Campo de la Invención Esta invención se refiere a la biología molecular y celular y la bioquímica. De manera mas específica, la invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de aldolasa, polinucleotidos que codifican estos polipéptidos, y métodos de hacer y usar estos polinucleótidos y polipéptidos. Antecedentes de la Invención El almidón es un carbohidrato complejo que se encuentra con frecuencia en la dieta humana. La estructura del almidón es de polímeros de glucosa enlazados por enlaces glucósídicos a-1,4 y a-1,6. La aldolasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de los almidones en azúcares. Las aldolasas hidrolizan los enlaces OÍ-1, 4 -glucósídicos internos en el almidón, en gran parte de una manera aleatoria, para producir malto-dextrinas de peso molecular más pequeño. La descomposición del almidón es importante en el sistema digestivo y comercialmente . Las aldolasas son de un valor comercial considerable, que se utilizan en las etapas iniciales (licuefacción) del procesamiento de almidón; en la molienda húmeda del maíz; en la producción de alcohol; como agentes limpiadores en matrices detergentes; en la industria textil para desapresto de almidón; en las aplicaciones de horneado; en la industria de bebidas; en los campos de petróleo en los procesos de perforación; en el desentintado del papel reciclado; y en alimentos para animales. Las aldolasas son producidas por una amplia variedad de microorganismos, incluyendo Bacillus y Aspergillus, produciéndose las aldolasas más comerciales a partir de fuentes bacterianas, tales como Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, o Bacillus stearother ophilus . En los años recientes, las enzimas de uso comercial han sido aquéllas a partir de Bacillus licheniformis , debido a su estabilidad al calor y desempeño, cuando menos en pHs neutros y levemente alcalinos . Comercialmente , las glucoaldolasas se utilizan para hidrolizar adicionalmente el almidón de maíz, el cual ya se ha hidrolizado parcialmente con una alfa-aldolasa . La glucosa producida en esta reacción se puede entonces convertir hasta una mezcla de glucosa y fructosa mediante una enzima de glucosa-isomerasa. Esta mezcla, o una enriquecida con fructosa, es el jarabe de maíz alto en fructosa comercializado a través de todo el mundo. En general, el procesamiento del almidón hasta fructosa consiste en cuatro pasos: licuefacción del almidón granular, sacarificación del almidón licuado en dextrosa, purificación, e isomerización hasta fructosa. El objeto de un proceso de licuefacción de almidón es convertir una suspensión concentrada de gránulos poliméricos de almidón en una solución de dextrinas solubles de longitud de cadena más corta y de una baja viscosidad. La glucoaldolasa más ampliamente utilizada se produce a partir del hongo Aspergillus niger. Uno de los problemas con el uso comercial de esta enzima, es su termoestabilidad relativamente baja. Se ha reportado un número de otras glucoaldolasas fúngicas, incluyendo Rizopus, Thielavia , Thermoascus y Talaromy-ces, y una glucoaldolasa a partir del hongo termofílico Thermomy-ces lanuginosus . En general, el procesamiento del almidón hasta fructosa consiste en cuatro pasos: licuefacción del almidón granular, sacarificación del almidón licuado hasta dextrosa, purificación, e isomerización hasta fructosa. El objeto del proceso de licuefacción del almidón es convertir una suspensión concentrada de gránulos poliméricos de almidón en una solución de dextrinas solubles de longitud de cadena más corta y de una baja viscosidad. Este paso es esencial para el manejo conveniente , con equipo convencional, y para una conversión eficiente hasta glucosa y otros azúcares. Con el fin de licuar el almidón granular, es necesario gelatinizar los gránulos elevando la temperatura del almidón granular hasta más de aproximadamente 72°C. El proceso de calentamiento altera instantáneamente los gránulos de almidón insolubles, para producir una solución de almidón soluble en agua. Luego se licúa la solución de almidón solubilizada mediante aldolasa. Un gránulo de almidón se compone de: del 69 al 74 por ciento de amilopectina, del 26 al 31 por ciento de amilosa, del 11 al 14 por ciento de agua, del 0.2 al 0.4 por ciento de proteína, del 0.5 al 0.9 por ciento de lípido, del 0.05 al 0.1 por ciento de cenizas, del 0.02 al 0.03 por ciento de fósforo, y el 0.1 por ciento de pentosano. aproximadamente el 70 por ciento de un gránulo es amorfo, y el 30 por ciento es cristalino. Un proceso de licuefacción enzimática común involucra ajustar el pH de una pasta de almidón granular hasta 6.0 y 6.5, el pH óptimo de la alfa-aldolasa derivada a partir de Bacillus licheniformis, con la adición de hidróxido de calcio, hidróxido de sodio, o carbonato de sodio. La adición de hidróxido de calcio tiene la ventaja de proporcionar también iones de calcio, los cuales se sabe que estabilizan a la alfa-aldolasa contra la inactivación. Después de la adición de la alfa-aldolasa, la suspensión se bombea a través de un chorro de vapor para elevar instantáneamente la temperatura hasta entre 80°C y 115°C. El almidón se gelatiniza inmediatamente, y, debido a la presencia de la alfa-aldolasa , se despolimeriza a través de hidrólisis aleatoria de los enlaces ( 1 , 4 - ) -glicosídicos mediante la alfa-aldolasa hasta tener una masa fluida que se bombea fácilmente. En una segunda variación del proceso de licuefacción, se agrega la alfa-aldolasa a la suspensión de almidón, la suspensión se mantiene a una temperatura de 80°C a 1Ó0°C para hidrolizar parcialmente los gránulos de almidón, y la suspensión de almidón parcialmente hidrolizada se bombea a través de un chorro a temperaturas mayores de aproximadamente 105°C, para gelatinizar completamente cualquier estructura granular restante. Después de enfriar el almidón gelatinizado, se puede hacer una segunda adición de alfa-aldolasa para hidrolizar adicionalmente el almidón. Una tercera variación de este proceso se denomina como el proceso de molienda seca. En la molienda seca, el grano entero se muele y se combina con agua. Opcionalmente se remueve el germen mediante separación por flotación o técnicas equivalentes. La mezcla resultante, la cual contiene almidón, fibra, proteína, y otros componentes del grano, se licúa utilizando alfa-aldolasa . La práctica general en la materia es emprender la licuefacción enzimática a una temperatura más baja cuando se utiliza el proceso de molienda seca. En general, se cree que la licuefacción a baja temperatura es menos eficiente que la licuefacción a alta temperatura para convertir el almidón hasta dextrinas solubles. Típicamente, después de la gelatinización, la solución de almidón se mantiene a una temperatura elevada en la presencia de alfa-aldolasa, hasta que se alcanza un equivalente de dextrosa de 10 a 20, usualmente en un período de 1 a 3 horas. El equivalente de dextrosa (DE) es el estándar industrial para medir la concentración de azúcares reductores totales, calculado como D-glucosa sobre una base de peso seco. El almidón granular no hidrolizado tiene un equivalente de dextrosa virtualmente de cero, mientras que el equivalente dextrosa de la D-glucosa se define como en 100. La molienda húmeda del maíz es un proceso que produce aceite de maíz, harina de gluten, alimento de gluten, y almidón. La aldolasa alcalina se utiliza en la licuefacción del almidón, y se utiliza glucoaldolasa en la sacarificación, produciendo glucosa. El maíz, una semilla que consiste en un recubrimiento externo de la semilla (fibra) , almidón, una combinación de almidón y glucosa, y el germen interno, se somete a un proceso de cuatro pasos, el cual da como resultado la producción de almidón. El maíz se remoja, se le quita el germen, se le quita la fibra, y finalmente se separa el gluten. En el proceso de remojo, se extraen los solubles. El producto restante después de remover los solubles es el desgerminado, el cual da como resultado la producción de aceite de maíz y la producción de una torta de aceite, que se agrega a los solubles el paso de remojo. Al producto restante se le quita la fibra, y los sólidos de fibra se agregan a la mezcla de torta de aceite/solubles. Esta mezcla de sólidos de fibra, torta de aceite, y solubles, forma un alimento de gluten. Después de quitar la fibra, el producto restante se somete a la separación del gluten. Esta separación da como resultado una harina de gluten y almidón. Luego el almidón se somete a licuefacción y sacarificación para producir glucosa. El ranciamiento de los productos horneados (tales como el pan) ha sido reconocido como un problema que llega a ser más serio a medida que pasa más tiempo entre el momento de la preparación del producto de pan y el momento del consumo. El término "ranciamiento" se utiliza para describir los cambios indeseables para el consumidor en las propiedades del producto de pan después de que se sale del horno, tales como un aumento de la firmeza de la costra, una reducción de la elasticidad del migajón, y cambios en la costra, que llega a ser dura y ahulada. La firmeza del migajón de pan aumenta adicionalmente durante el almacenamiento hasta un nivel que se considera como negativo. El aumento en la firmeza del migajón, que se considera como el aspecto más importante del ranciamiento, es reconocido por el consumidor mucho tiempo antes de que el producto de pan haya llegado a ser de otra manera inadecuado para su consumo. Existe una necesidad en la industria de identificar y optimizar las aldolasas, útiles para diferentes usos, incluyendo para los procesos de licuefacción de almidón de maíz comerciales. Estas aldolasas de ácido de la segunda generación ofrecerán mejores características de manufactura y/o desempeño sobre las enzimas estándares de la industria a partir de Bacillus licheni-formis, por ejemplo. También existe una necesidad de identificar y optimizar las aldolasas que tengan utilidad en los productos para lavado de trastes automático (ADW) y en los detergentes para lavado de ropa. En los productos para lavado de trastes automático, la aldolasa funcionará a un pH de 10 a 11 y a 45-60OC en la presencia de quelantes de calcio y condiciones oxidativas. Para lavado de ropa, se requerirá la actividad a un pH de 9 a 10 y 40°C en la matriz detergente apropiada. Las aldolasas también son útiles en el desapresto textil, en los procesos de preparación de cerveza, en la modificación del almidón en la industria de papel y pulpa, y en otros procesos descritos en la materia. Las aldolasas se pueden utilizar comercialmente en las etapas iniciales (licuefacción) del procesamiento del almidón; en la molienda húmeda del maíz; en la producción de alcohol; como agentes limpiadores en matrices detergentes; en la industria textil para desapresto del almidón; en las aplicaciones de horneado; en la industria de bebidas; en los campos de petróleo en los procesos de perforación; en el desentintado del papel reciclado, y en alimentos .para animales. Las aldolasas también son útiles en el desapresto textil, en los procesos de preparación de cerveza, en la modificación de almidón en la industria de papel y pulpa, y en otros procesos. Las publicaciones descritas en la presente se proporcionan exclusivamente por su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo contenido en la presente debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a una fecha anterior a dicha divulgación en virtud de la invención previa. Compendio La invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, el 51 por ciento, el 52 por ciento, el 53 por ciento, el 54 por ciento, el 55 por ciento, el 56 por ciento, el 57 por ciento, el 58 por ciento, el 59 por ciento, el 60 por ciento, el 61 por ciento, el 62 por ciento, el 63 por ciento, el 64 por ciento, el 65 por ciento, el 66 por ciento, el 67 por ciento, el 68 por ciento, el 69 por ciento, el 70 átomos de carbono, el 71 átomos de carbono, el 72 por ciento, el 73 por ciento, el 74 por ciento, el 75 por ciento, el 76 por ciento, el 77 por ciento, el 78 por ciento, el 79 por ciento, el 80 por ciento, el 81 por ciento, el 82 por ciento, el 83 por ciento, el 84 por ciento, el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o más, o completa (100 por ciento), con un ácido nucleico de la invención, por ejemplo un ácido nucleico de ejemplo de la invención, sobre una región de cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 o más residuos. En un aspecto, el ácido nucleico codifica cuando menos un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, y las identidades de secuencia se determinan mediante un análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. En otro aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos para utilizarse como sondas, moléculas inhibidoras (por ejemplo, anti-sentido, ARNis) , regulación de transcripción o traducción, y similares. Los ácidos nucleicos de ejemplo de la invención incluyen los ácidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: : 105, SEQ ID NO :107, SEQ ID NO: : 109, SEQ ID NO; ;111, SEQ ID NO: : 113 , SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: : 117 , SEQ ID NO: :119, SEQ ID NO: : 121, SEQ ID NO: : 123 , SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: : 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: :133, SEQ ID NO: :135, SEQ ID NO: : 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143 , SEQ ID NO: : 145, SEQ ID NO: :147, SEQ ID NO: : 149, SEQ ID NO: :151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: : 159, SEQ ID NO: 161 SEQ ID NO: 163 SEQ ID NO: 165 SEQ ID NO:167 SEQ ID NO: 189 SEQ ID NO:191 SEQ ID NO: 193 SEQ ID NO:203 SEQ ID NO: 205 SEQ ID NO: 207 SEQ ID NO:209 SEQ ID NO: 211 SEQ ID NO:322 SEQ ID NO: 324 SEQ ID NO:326 SEQ ID NO: 328 SEQ ID NO:330 SEQ ID NO: 332 SEQ ID NO -.334 SEQ ID NO: 336 SEQ ID NO : 338 SEQ ID NO:340 SEQ ID NO:342 SEQ ID NO:344 SEQ ID NO : 346 SEQ ID NO:348 SEQ ID NO: 350 SEQ ID NO:352 SEQ ID NO: 354 SEQ ID NO: 356 SEQ ID NO:358 SEQ ID NO:360 SEQ ID NO: 362 SEQ ID NO:364 SEQ ID NO:366 SEQ ID NO:368 SEQ ID NO:370 SEQ ID NO:372 SEQ ID NO:374 SEQ ID NO:376 SEQ ID NO: 378 SEQ ID NO: 380 SEQ ID NO: 382 SEQ ID NO:384 SEQ ID NO : 386 SEQ ID NO:388 SEQ ID NO:390 SEQ ID NO: 392 SEQ ID NO: 394 SEQ ID NO:396 SEQ ID NO:398 SEQ ID NO: 400 SEQ ID NO: 402 SEQ ID NO:404 SEQ ID NO:406 SEQ ID NO:408 SEQ ID NO : 410 SEQ ID NO:412 SEQ ID NO:414 SEQ ID NO:416 SEQ ID NO:418 SEQ ID NO:420 SEQ ID NO:422 SEQ ID NO:424 SEQ ID NO:426 SEQ ID NO:428 SEQ ID NO:430 SEQ ID NO:432 SEQ ID NO: 434 SEQ ID NO:436 SEQ ID NO:438 SEQ ID NO:440 SEQ ID NO:442 SEQ ID NO: 444 SEQ ID NO:446 SEQ ID NO:448 SEQ ID NO : 450 SEQ ID NO: 452 SEQ ID NO:454 SEQ ID NO:456 SEQ ID NO:458 SEQ ID NO:460 SEQ ID NO: 460 SEQ ID NO: 462 SEQ ID NO : 465 SEQ ID NO :467 SEQ ID NO :473 SEQ ID NO: 475 SEQ ID NO: 478 SEQ ID NO:480 SEQ ID NO: 484 SEQ ID NO: 486 SEQ ID NO: 492 SEQ ID NO:494 SEQ ID NO:498 SEQ ID NO:500 SEQ ID NO : 509 SEQ ID NO: 511 SEQ ID NO:515 SEQ ID NO:517 SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO : 519, SEQ ID NO :522, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 527 , SEQ ID NO : 529, SEQ ID NO: :532, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO : 541, SEQ ID NO :544, SEQ ID NO: 546, SEQ ID NO: 552 , SEQ ID NO -.554, SEQ ID NO: : 558, SEQ ID NO : 560, SEQ ID NO: 565, SEQ ID NO : 567, SEQ ID NO :569, . SEQ ID NO: 571, SEQ ID NO: 573 , SEQ ID NO :575, SEQ ID NO: : 577, SEQ ID NO: 579, SEQ ID NO: 581, SEQ ID NO : 583 , SEQ ID NO; : 585, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 593, SEQ ID NO : 603 , SEQ ID NO : 605, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO :611, SEQ ID NO: 613 , SEQ ID NO: 615, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO : 619, o SEQ ID NO : 621, y subsecuencias de las mismas , por ejemplo de aproximadamente 10, : 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500 o más residuos de longitud, o sobre la longitud completa de un gen o transcripción. Los ácidos nucleicos de ejemplo de la invención también incluyen ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican un polipéptido de la invención, por ejemplo un polipéptido de ejemplo que tiene una secuencia como se estipula en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NC :92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, 3EQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO 104 SEQ ID NO 106, SEQ ID NO : 108 , SEQ ID NO 110, SEQ ID NO 112 , SEQ ID NO :114, SEQ ID NO : 116, SEQ ID NO 118, SEQ ID NO 120 SEQ ID NO 122, SEQ ID NO :124, SEQ ID NO 126, SEQ ID NO 128 SEQ ID NO 130, SEQ ID NO : 132 , SEQ ID NO: 134 , SEQ ID NO 136 SEQ ID NO 138, SEQ ID NO :140, SEQ ID NO 142 , SEQ ID NO 144 SEQ ID NO 146, SEQ ID NO 148, SEQ ID NO 150 , SEQ ID NO 152 SEQ ID NO : 154 , SEQ ID NO : 156, SEQ ID NO 158, SEQ ID NO 160 SEQ ID NO 162, SEQ ID NO : 164 , SEQ ID NO 166 , SEQ ID NO 168 SEQ ID NO 190, SEQ ID NO : 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO204 SEQ ID NO 206, SEQ ID NO :208, SEQ ID NO 210, SEQ ID NO 212 SEQ ID NO 323, SEQ ID NO 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO 329 SEQ ID NO 331, SEQ ID NO :333, SEQ ID NO 335, SEQ ID NO. 337 SEQ ID NO. 339, SEQ ID NO 341, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO 347 SEQ ID NO :349, SEQ ID NO :351, SEQ ID NO: 353 , SEQ ID NO: 355 SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO :359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO 363 SEQ ID NO 365, SEQ ID NO 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371 SEQ ID NO. 373 , SEQ ID NO :375, SEQ ID NO: 377 , SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO 383, SEQ ID NO: 385, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO 389, SEQ ID NO :391, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO 399, SEQ ID NO: 401, SEQ ID NO: 403 SEQ ID NO:405 SEQ ID NO:407 SEQ ID NO: 409 SEQ ID NO : 411 SEQ ID NO:413 SEQ ID NO:415 SEQ ID NO: 417 SEQ ID NO:419 SEQ ID NO:421 SEQ ID NO:423 SEQ ID NO: 425 SEQ ID NO: 427 SEQ ID NO: 429 SEQ ID NO -.431 SEQ ID NO :433 SEQ ID NO : 435 SEQ ID NO:437 SEQ ID NO:439 SEQ ID NO: 441 SEQ ID NO: 443 SEQ ID NO:445 SEQ ID NO:447 SEQ ID NO: 449 SEQ ID NO : 451 SEQ ID NO:453 SEQ ID NO:455 SEQ ID NO: 457 SEQ ID NO : 459 SEQ ID NO: 461 SEQ ID NO: 461 SEQ ID NO: 463 SEQ ID NO: 464 SEQ ID NO:466 SEQ ID NO:468 SEQ ID NO: 469 SEQ ID NO : 470 SEQ ID NO: 471 SEQ ID NO: 472 SEQ ID NO: 474 SEQ ID NO:476 SEQ ID NO: 477 SEQ ID NO:479 SEQ ID NO: 481 SEQ ID NO:482 SEQ ID NO:483 SEQ ID NO:485 SEQ ID NO: 487 SEQ ID NO:488 SEQ ID NO: 489 SEQ ID NO:490 SEQ ID NO: 491 SEQ ID NO: 493 SEQ ID NO: 495 SEQ ID NO:496 SEQ ID NO:497 SEQ ID NO:499 SEQ ID NO:501 SEQ ID NO:502 SEQ ID NO: 503 SEQ ID NO: 504 SEQ ID NO:505 SEQ ID NO:506 SEQ ID NO: 507 SEQ ID NO: 508 SEQ ID NO:510 SEQ ID NO: 512 SEQ ID NO: 513 SEQ ID NO: 514 SEQ ID NO:516 SEQ ID NO:518 SEQ ID NO: 518 SEQ ID NO: 520 SEQ ID NO: 521 SEQ ID NO:523 SEQ ID NO: 525 SEQ ID NO: 526 SEQ ID NO:528 SEQ ID NO:530 SEQ ID NO: 531 SEQ ID NO: 533 SEQ ID NO:535 SEQ ID NO:536 SEQ ID NO: 537 SEQ ID NO: 538 SEQ ID NO:540 SEQ ID NO: 542 SEQ ID NO: 543 SEQ ID NO: 545 SEQ ID NO: 547 SEQ ID NO: 548 SEQ ID NO: 549 SEQ ID NO: 550 SEQ ID NO: 551 SEQ ID NO: 553 SEQ ID NO: 555 SEQ ID NO: 556 SEQ ID NO: 557 SEQ ID NO:559 SEQ ID NO: 561 SEQ ID NO:: 562 , SEQ ID NO: 563 , SEQ ID NO::564, SEQ ID NO :566, SEQ ID NO: :568, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: :572, SEQ ID NO: 574 , SEQ ID NO: : 576, SEQ ID NO: ; 578, SEQ ID NO :580, SEQ ID NO :582, SEQ ID NO: :584, SEQ ID NO: 586, SEQ ID NO: : 588, SEQ ID NO: : 589, SEQ ID NO: :590, SEQ ID NO :591, SEQ ID NO :592, SEQ ID NO :594, SEQ ID NO: :604, SEQ ID NO: 606, SEQ ID NO: : 608, SEQ ID NO : 610, SEQ ID NO : : 612 , SEQ ID NO: :614, SEQ ID NO : 616, SEQ ID NO :618, SEQ ID NO: : 620, o SEQ ID NO: i 522 , y subsecuencias de las mismas y variantes de las mismas, y los polipéptidos que tienen una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento (o más, como se describe más adelante) con un polipéptido de ejemplo de la invención. En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad de aldolasa, por ejemplo una actividad de alfa-aldolasa o glucoaldolasa (las actividades de aldolasa alternativas se describen adicionalmente más adelante) . En un aspecto, el polipéptido actúa como un inmunógeno o epítopo. En un aspecto, la invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican aldolasa, con una novedad común, en que se derivan a partir de cultivos mixtos. La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican aldolasa aislados a partir de cultivos mixtos, los cuales comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, el 51 por ciento, el 52 por ciento, el 53 por ciento,, el 54 por ciento, el 55 por ciento, el 56 por ciento, el 57 por ciento, el 58 por ciento, el 59 por ciento, el 60 por ciento, el 61 por ciento, el 62 por ciento, el 63 por ciento, el 64 por ciento, el 65 por ciento, el 66 por ciento, el 67 por ciento, el 68 por ciento, el 69 por ciento, el 70 átomos de carbono, el 71 átomos de carbono, el 72 por ciento, el 73 por ciento, el 74 por ciento, el 75 por ciento, el- 76 por ciento, el 77 por ciento, el 78 por ciento, el 79 por ciento, el 80 por ciento, el 81 por ciento, el 82 por ciento, el 83 por ciento, el 84 por ciento, el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o más, o completa (100 por ciento) con un ácido nucleico de ejemplo de la invención, sobre una región de cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 residuos, en donde el ácido nucleico codifica cuando menos un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, y las identida'des de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican aldolasa aislados a partir de cultivos mixtos que comprenden un ácido nucleico de la invención, por ejemplo un ácido nucleico de ejemplo de la invención, por ejemplo una secuencia como se estipula en las SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 11, etcétera, y subsecuencias de las mismas, por. ejemplo de cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500 o más residuos de longitud, o sobre la longitud completa de un gen o transcripción; o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. En un aspecto, la invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican aldolasa, con una novedad común, en que se derivan a partir de fuentes medio-ambientales, por ejemplo fuentes medio-ambientales mixtas. En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican aldolasa aislados a partir de fuentes medio-ambientales, por ejemplo fuentes medioambientales mixtas, que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, el 51 por ciento, el 52 por ciento, el 53 por ciento, el 54 por ciento, el 55 por ciento, el 56 por ciento, el 57 por ciento, el 58 por ciento, el 59 por ciento, el 60 por ciento, el 61 por ciento, el 62 por ciento, el 63 por ciento, el 64 por ciento, el 65 por ciento, el 66 por ciento, el 67 por ciento, el 68 por ciento, el 69 por ciento, el 70 átomos de carbono, el 71 átomos de carbono, el 72 por ciento, el 73 por ciento, el 74 por ciento, el 75 por ciento, el 76 por ciento, el 77 por ciento, el 78 por ciento, el 79 por ciento, el 80 por ciento, el 81 por ciento, el 82 por ciento, el 83 por ciento, el 84 por ciento, el 85/ por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o más, o completa (100 por ciento), con un ácido nucleico de ejemplo de la invención, sobre una región de cuando menos aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 o más residuos, en donde el ácido nucleico codifica cuando menos un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, y las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican aldolasa aislados a partir de fuentes medio-ambientales, por ejemplo fuentes medio-ambientales mixtas, que comprenden un ácido nucleico de la invención, por ejemplo una secuencia de ácido nucleico de ejemplo de la invención como se estipula en las SEQ ID N0:1, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 11, etcétera, SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO: 585, y subsecuencias de las mismas, por ejemplo de cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500 o más residuos de longitud, o sobre la longitud completa de un gen o transcripción; o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. En un aspecto, la invención también proporciona aldolasas, y ácidos nucleicos que codifican aldolasa, con una novedad común, en que se derivan a partir de fuentes arquéales, incluyendo las aldolasas derivadas de arquéales de las SEQ ID NO:80 (codificada por la SEQ ID NO:79), SEQ ID NO:82 (codificada por la SEQ ID NO: 81), SEQ ID NO:116 (codificada por la SEQ ID NO:115), SEQ ID NO:323 (codificada por la SEQ ID NO:322), SEQ ID NO:570 (codificada por la SEQ ID NO: 169). En un aspecto, el algoritmo de comparación de secuencias es un algoritmo BLAST versión 2.2.2, en donde se establece una posición de filtración en blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, y todas las demás opciones se establecen por omisión. Otro aspecto de la invención es un ácido nucleico aislado o recombinante que incluye cuando menos diez bases consecutivas de una secuencia de ácido nucleico de la invención, secuencias sustancialmente idénticas a la misma, y secuencias complementarias para la misma. En un aspecto, la actividad de la aldolasa comprende la actividad de la alfa-aldolasa, incluyendo la capacidad para hidrolizar los enlaces alfa- 1 , 4 -glucosídicos internos en el almidón, para producir malto-dextrinas de peso molecular más pequeño. En un aspecto, la actividad de alfa-aldolasa incluye hidrolizar los enlaces alfa- 1 , 4 -glucosídicos internos en el almidón al azar. La actividad de aldolasa puede comprender una actividad de -aldolasa, una actividad de ß-aldolasa, una actividad de glicoaldolasa, una actividad de 1 , 4 -a-D-glucan-glucohidrolasa, una actividad de exoaldolasa, una actividad de a-malto-tetrahidrolasa, una actividad de maltasa, una actividad de isomaltasa, una actividad de glucan- 1 , 4 -a-glucosidasa , una actividad de a-glucosidasa , una actividad de sucrasa, o una actividad de agarasa (por ejemplo, una actividad de ß-agarasa) . La actividad de aldolasa puede comprender hidrolizar los enlaces glucosídicos. En un aspecto, los enlaces glucosídicos comprenden un enlace a- 1 , 4 -glucosídico . En otro aspecto, los enlaces glucosídicos comprenden un enlace a- 1 , 6 -glucosídico . En un aspecto, la actividad de aldolasa comprende hidrolizar los enlaces glucosídicos en el almidón, por ejemplo en el almidón licuado. La actividad de aldolasa puede comprender además hidrolizar los enlaces glucosídicos en maltodextrinas . En un aspecto, la actividad de aldolasa comprende disociar una maltosa o una unidad de D-glucosa a partir del extremo no reductor del almidón . En un aspecto, el ácido nucleico aislado o recombinante codifica un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa que es termoestable . El polipéptido puede retener una actividad de aldolasa bajo condiciones que comprendan un intervalo de temperatura en cualquier parte entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 37°C, o entre aproximadamente 37°c y aproximadamente 95°C o más, por ejemplo, 98°C, 100°C o más; entre aproximadamente 550c y aproximadamente 85°C, entre 70°C y aproximadamente 95°C, o entre aproximadamente 90°C y aproximadamente 95°C. Por ejemplo, el polipéptido de ejemplo que tiene una secuencia como se estipula en la SEQ ID NO:437 es termoestable , y retiene una actividad del 50 por ciento después de 25 minutos a 100°C en ausencia de calcio agregado. En otro aspecto, el ácido nucleico aislado o recombi-nante codifica un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa que es termotolerante . El polipéptido puede retener una actividad de aldolasa después de exponerse a una temperatura en el intervalo desde más de 37°C hasta aproximadamente 95°C, o en cualquier parte en el intervalo desde más de 55°C hasta aproximadamente 85°C En un aspecto, el polipéptido retiene una actividad de aldolasa después de exponerse a una temperatura en el intervalo desde más de 90°C hasta aproximadamente 95°C a un pH de 4.5. La invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia que se híbrida bajo condiciones restringentes a un ácido nucleico de la invención, por ejemplo un ácido nucleico de ejemplo de la invención, un ácido nucleico que comprende una secuencia como se estipula en las SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: : 101 , SEQ ID NO : 103 , SEQ ID NO : 105 , SEQ ID NO: : 107, SEQ ID NO: : 109, SEQ ID NO: :111, SEQ ID NO : :113, SEQ ID NO: : 115, SEQ ID NO: :117, SEQ ID NO: :119, SEQ ID" NO: : 121, SEQ ID NO : 123 , SEQ ID NO: : 125, SEQ ID NO: : 127, SEQ ID NO : 129, SEQ ID NO: :131, SEQ ID NO: : 133 , SEQ ID NO: : 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO : 139, SEQ ID NO: :141, SEQ ID NO: : 143, SEQ ID NO : 145, SEQ ID NO: : 147, SEQ ID NO: : 149, SEQ ID NO: :151, SEQ ID NO: 153 , SEQ ID NO: :155, SEQ ID NO: :157, SEQ ID NO :159, SEQ ID NO :161, SEQ ID NO: : 163 , SEQ ID NO: : 165, SEQ ID NO: : 167, SEQ ID NO: : 189, SEQ ID NO: : 191, SEQ ID NO: : 193 , SEQ ID NO: :203, SEQ ID NO: :205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: :209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: :322, SEQ ID NO: :324, SEQ ID NO: :326, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 330 , SEQ ID NO: 332 , SEQ ID NO: : 334 , SEQ ID NO: : 336, SEQ ID NO; : 338, SEQ ID NO: :340, SEQ ID NO: 342 , SEQ ID NO: 344 , SEQ ID NO : 346, SEQ ID NO: : 348 , SEQ ID NO: 350 SEQ ID NO:352 SEQ ID NO:354 SEQ ID NO:356 SEQ ID NO:358 SEQ ID NO:360 SEQ ID NO: 362 SEQ ID NO:364 SEQ ID NO:366 SEQ ID NO:368 SEQ ID NO:370 SEQ ID NO:372 SEQ ID NO: 374 SEQ ID NO:376 SEQ ID NO:378 SEQ ID NO:380 SEQ ID NO: 382 SEQ ID NO: 384 SEQ ID NO:386 SEQ ID NO: 388 SEQ ID NO: 390 SEQ ID NO: 392 SEQ ID NO: 394 SEQ ID NO:396 SEQ ID NO: 398 SEQ ID NO:400 SEQ ID NO:402 SEQ ID NO: 404 SEQ ID NO:406 SEQ ID NO:408 SEQ ID NO:410 SEQ ID NO: 412 SEQ ID NO: 414 SEQ ID NO:416 SEQ ID NO:418 SEQ ID NO:420 SEQ ID NO:422 SEQ ID NO:424 SEQ ID NO:426 SEQ ID NO:428 SEQ ID NO:430 SEQ ID NO:432 SEQ ID NO: 434 SEQ ID NO:436 SEQ ID NO:438 SEQ ID NO:440 SEQ ID NO:442 SEQ ID NO: 444 SEQ ID NO:446 SEQ ID NO:448 SEQ ID NO: 450 SEQ ID NO:452 SEQ ID NO: 454 SEQ ID NO:456 SEQ ID NO:458 SEQ ID NO:460 SEQ ID NO:460 SEQ ID NO: 462 SEQ ID NO:465 SEQ ID NO:467 SEQ ID NO:473 SEQ ID NO:475 SEQ ID NO:478 SEQ ID NO: 480 SEQ ID NO: 484 SEQ ID NO:486 SEQ ID NO: 492 SEQ ID NO: 494 SEQ ID NO:498 SEQ ID NO:500 SEQ ID NO:509 SEQ ID NO:511 SEQ ID NO: 515 SEQ ID NO:517 SEQ ID NO:517 SEQ ID NO:519 SEQ ID NO : 522 SEQ ID NO: 524 SEQ ID NO:527 SEQ ID NO: 529 SEQ ID NO: 532 SEQ ID NO: 534 SEQ ID NO: 539 SEQ ID NO: 541 SEQ ID NO: 544 SEQ ID NO:546 SEQ ID NO: 552 SEQ ID NO: 554 SEQ ID NO: 558 SEQ ID NO:560 SEQ ID NO:565 SEQ ID NO: 567 SEQ ID NO: 569 SEQ ID NO:571 SEQ ID NO: 573 SEQ ID NO:575 SEQ ID NO: 577 SEQ ID NO:579 SEQ ID NO: 581 SEQ ID NO:583 SEQ ID NO:585, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 593, SEQ ID NO: 603, SEQ ID NO:605, SEQ ID NO:607, SEQ ID NO:609, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: 613, SEQ ID NO: 615, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 619, o SEQ ID NO: 621, o fragmentos o subsecuencias de las mismas. En un aspecto, el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa. El ácido nucleico puede ser de cuando menos aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500 o más residuos de longitud, o de la longitud completa del gen o transcripción. En un aspecto, las condiciones restringentes incluyen un paso de lavado que comprende un lavado en SSC 0.2X a una temperatura de aproximadamente 65°C durante aproximadamente 15 minutos. La invención proporciona una sonda de ácido nucleico para identificar un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, en donde la sonda comprende cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más bases consecutivas de una secuencia que comprende una secuencia de la invención, o fragmentos o subsecuencias de la misma, en donde la sonda identifica el ácido nucleico mediante enlace o hibridación. La sonda puede comprender un oligonucleóti-do que comprenda cuando menos de aproximadamente de 10 a- 50, de aproximadamente 20 a 60, de aproximadamente 30 a 70, de aproximadamente 40 a 80, o de aproximadamente 60 a 100 bases consecutivas de una secuencia que comprenda una secuencia de la invención, o fragmentos o subsecuencias de la misma. La invención proporciona una sonda de ácido nucleico para identificar un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, en donde la sonda comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más residuos, la cual tiene una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, el 51 por ciento, el 52 por ciento, el 53 por ciento, el 54 por ciento, el 55 por ciento, el 56 por ciento, el 57 por ciento, el 58 por ciento, el 59 por ciento, el 60 por ciento, el 61 por ciento, el 62 por ciento, el 63 por ciento, el 64 por ciento, el 65 por ciento, el 66 por ciento, -el 67 por ciento, el 68 por ciento, el 69 por ciento, el 70 átomos de carbono, el 71 átomos de carbono, el 72 por ciento, el 73 por ciento, el 74 por ciento, el 75 por ciento, el 76 por ciento, el 77 por ciento, el 78 por ciento, el 79 por ciento, el 80 por ciento, el 81 por ciento, el 82 por ciento, el 83 por ciento, el 84 por ciento, el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento,, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o más, o completa (100 por ciento) , con un ácido nucleico de la invención, en donde las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual . La sonda puede comprender un oligonucleótido que comprenda cuando menos de aproximadamente 10 a 50, de aproximadamente 20 a 60, de aproximadamente 30 a 70, de aproximadamente 40 a 80, o de aproximadamente 60 a 100 bases consecutivas de una secuencia de ácido nucleico de la invención, o una subsecuencia de la misma. La invención proporciona un par de secuencias cebadoras de amplificación para amplificar un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, en donde el par cebador es capaz de amplificar un ácido nucleico que comprenda una secuencia de la invención, o fragmentos o subse-cuencias de la misma. Uno o cada miembro del par de secuencias cebadoras de amplificación puede comprender un oligonucleótido que comprenda cuando menos de aproximadamente 10 a 50 bases consecutivas de la secuencia. La invención proporciona métodos para amplificar un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, los cuales comprenden la amplificación de un ácido nucleico de plantilla con un par de secuencias cebadoras de amplificación capaz de amplificar una secuencia de ácido nucleico de la invención, o fragmentos o subsecuencias de la misma . La invención proporciona casetes de expresión que comprenden un ácido nucleico de la invención o una subsecuencia del mismo. En un aspecto, el cásete de expresión puede comprender al ácido nucleico que esté operativamente enlazado con un promotor. El promotor puede ser un promotor viral, bacteriano, de mamífero, o de planta. En un aspecto, el promotor de planta puede ser un promotor de papa, arroz, maíz, trigo, tabaco, o cebada. El promotor puede ser un promotor constitutivo. El promotor constitutivo puede comprender CaMV35S. En otro aspecto, el promotor puede ser un promotor inducible. En un aspecto, el promotor puede ser un promotor específico de tejido, o un promotor regulado por el medio ambiente o regulado por el desarrollo. Por consiguiente, el promotor puede ser, por ejemplo, un promotor específico de semillas, específico de las hojas, específico de la raíz, específico del tallo, o inducido por abscisión. En un aspecto, el cásete de expresión puede comprender además un vector de expresión de planta o de virus de planta. La invención proporciona vehículos de clonación que comprenden un cásete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención, o un ácido nucleico de la invención. El vehículo de clonación puede ser un vector viral, un plásmido, un fago, un fagémido, un cósmido, un fósmido, un bacteriófago, o un cromosoma artificial. El vector viral puede comprender un vector de adenovirus, un vector retroviral, o un vector viral adeno-asociado. El vehículo de clonación puede comprender un cromosoma artificial bacteriano (BAC) , un plásmido, un vector derivado del bacteriófago Pl (PAC) , un cromosoma artificial de levadura (YAC) , o un cromosoma artificial de mamífero (MAC) . La invención proporciona una célula transformada que comprende un ácido nucleico de la invención, o un cásete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención, o un vehículo de clonación de la invención. En un aspecto, la célula transformada puede ser una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula de insecto, o una célula de planta. En un aspecto, la célula de planta puede ser una célula de papa, trigo, arroz, maíz, tabaco, o cebada. La invención proporciona animales no humanos transgéni-cos que comprenden un ácido nucleico de la invención o un cásete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención. En un aspecto, el animal es un ratón. La invención proporciona plantas transgénicas que comprenden un ácido nucleico de la invención o un cásete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención. La planta transgénica puede ser una planta de maíz, una planta de papa, una planta de jitomate, una planta de trigo, una planta de semilla de aceite, una planta de semilla de colza, una planta de semilla de soya, una planta de arroz, una planta de cebada, o una planta de tabaco . La invención proporciona semillas transgénicas que comprenden un ácido nucleico de la invención o un cásete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención. La semilla transgénica puede ser una semilla de maíz, una semilla de trigo, una semilla de aceite, una semilla de colza, una semilla de soya, una semilla de palmera, una semilla de girasol, una semilla de ajonjolí, un cacahuate, o una semilla de planta de tabaco. La invención proporciona un oligonucleótido anti-sentido que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria para, o capaz de hibridarse bajo condiciones restringentes a, un ácido nucleico de la invención. La invención proporciona métodos para inhibir la traducción de un mensaje de aldolasa en una célula, los cuales comprenden administrar a la célula, o expresar en la célula, un oligonucleótido anti-sentido que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria para, o capaz de hibridarse baj o , condiciones restringentes a, un ácido nucleico de la invención. La invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, el 51 por ciento, el 52 por ciento, el 53 por ciento, el 54 por ciento, el 55 por ciento, el 56 por ciento, el 57 por ciento, el 58 por ciento, el 59 por ciento, el 60 por ciento, el 61 por ciento, el 62 por ciento, el 63 por ciento, el 64 por ciento, el 65 por ciento, el 66 por ciento, el 67 por ciento, el 68 por ciento, el 69 por ciento, el 70 átomos de carbono, el 71 átomos de carbono, el 72 por ciento, el 73 por ciento, el 74 por ciento, el 75 por ciento, el 76 por ciento, el 77 por ciento, el 78 por ciento, el 79 por ciento, el 80 por ciento, el 81 por ciento, el 82 por ciento, el 83 por ciento, el 84 por ciento, el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o más, o completa (100 por ciento) , con un pólipéptido o péptido de ejemplo de la invención, sobre una región de cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 o más residuos, o sobre la longitud completa del pólipéptido, y las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Las secuencias de polipéptidos o péptidos de ejemplo de la invención incluyen las SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO:4, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO : 20 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO : 46 , SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO : 64 , SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 74 , SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82 , SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92 , SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102 SEQ ID NO: 104 , SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO : 108 , SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112 , SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118 SEQ ID NO : 120, SEQ ID NO 122 , SEQ ID NO : 124 , SEQ ID NO : 126, SEQ ID NO: 128 , SEQ ID NO 130 , SEQ ID NO : 132 , SEQ ID NO 134 , SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO 138, SEQ ID NO : 140, SEQ ID NO : 142, SEQ ID NO: 144 , SEQ ID NO 146, SEQ ID NO : 148, SEQ ID NO 150, SEQ ID NO: 152 , SEQ ID O 154, SEQ ID NO :156, SEQ ID NO 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID O 162, SEQ ID NO : 164 , SEQ ID NO : 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID O 190 , SEQ ID NO : 192 , SEQ ID NO 194 , SEQ ID NO : 204 , SEQ ID O 206 , SEQ ID NO :208 , SEQ ID NO : 210 , SEQ ID NO: 212 , SEQ ID O 323 , SEQ ID NO :325, SEQ ID NO 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID O 331, SEQ ID NO : 333 , SEQ ID NO :335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID O 339, SEQ ID NO 341, SEQ ID NO 345, SEQ ID NO: 347, SEQ ID O 349, SEQ ID NO :351, SEQ ID NO 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID O: 357, SEQ ID NO 359 , SEQ ID NO :361, SEQ ID NO: 363, SEQ ID O : 365, SEQ ID NO 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO : 371, SEQ ID O: 373 , SEQ ID NO : 375, SEQ ID NO •377, SEQ ID NO: 379, SEQ ID O: 381, SEQ ID NO 383, SEQ ID NO: 385, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO : 389 SEQ ID NO:391 SEQ ID NO: 393 SEQ ID NO:395 SEQ ID NO: 397 SEQ ID NO:399 SEQ ID NO: 401 SEQ ID NO:403 SEQ ID NO:405 SEQ ID NO:407 SEQ ID NO: 409 SEQ ID NO:411 SEQ ID NO: 413 SEQ ID NO:415 SEQ ID NO: 417 SEQ ID NO:419 SEQ ID NO: 421 SEQ ID NO:423 SEQ ID NO: 425 SEQ ID NO:427 SEQ ID NO: 429 SEQ ID NO:431 SEQ ID NO: 433 SEQ ID NO: 435 SEQ ID NO : 437 SEQ ID NO:439 SEQ ID NO: 441 SEQ ID NO:443 SEQ ID NO: 445 SEQ ID NO:447 SEQ ID NO: 449 SEQ ID NO:451 SEQ ID NO: 453 SEQ ID NO: 455 SEQ ID NO: 457 SEQ ID NO:459 SEQ ID NO : 461 SEQ ID NO:461 SEQ ID NO: 463 SEQ ID NO:464 SEQ ID NO:466 SEQ ID NO:468 SEQ ID NO: 469 SEQ ID NO: 470 SEQ ID NO : 471 SEQ ID NO:472 SEQ ID NO: 474 SEQ ID NO:476 SEQ ID NO:477 SEQ ID NO:479 SEQ ID NO: 481 SEQ ID NO:482 SEQ ID NO : 483 SEQ ID NO: 485 SEQ ID NO: 487 SEQ ID NO: 488 SEQ ID NO : 489 SEQ ID NO:490 SEQ ID NO:491 SEQ ID NO:493 SEQ ID NO:495 SEQ ID NO:496 SEQ ID NO: 497 SEQ ID NO: 499 SEQ ID NO: 501 SEQ ID NO:502 SEQ ID NO: 503 SEQ ID NO: 504 SEQ ID NO: 505 SEQ ID NO: 506 SEQ ID NO: 507 SEQ ID NO: 508 SEQ ID NO : 510 SEQ ID NO: 512 SEQ ID NO: 513 SEQ ID NO:514 SEQ ID NO: 516 SEQ ID NO:518 SEQ ID NO: 518 SEQ ID NO:520 SEQ ID NO: 521 SEQ ID NO: 523 SEQ ID NO: 525 SEQ ID NO:526 SEQ ID NO: 528 SEQ ID NO: 530 SEQ ID NO: 531 SEQ ID NO:533 SEQ ID NO: 535 SEQ ID NO:536 SEQ ID NO: 537 SEQ ID NO:538 SEQ ID NO: 540 SEQ ID NO: 542 SEQ ID NO: 543 SEQ ID NO: 545 SEQ ID NO: 547 SEQ ID NO: 548 SEQ ID NO : 549 SEQ ID NO:550 SEQ ID NO:: 551, SEQ ID NO : 553 , SEQ ID NO::555, SEQ ID NO:: 556, SEQ ID NO: :557, SEQ ID NO : 559, SEQ ID NO: 561, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: : 563 , SEQ ID NO :564, SEQ ID NO: : 566, SEQ ID NO: : 568, SEQ ID NO: :570, SEQ ID NO :572, SEQ ID NO: 574, SEQ ID NO: : 576, SEQ ID NO : :578, SEQ ID NO : 580, SEQ ID NO: : 582 , SEQ ID NO: : 584 , SEQ ID NO: : 586, SEQ ID NO :588, SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: :590, SEQ ID NO: :591, SEQ ID NO : 592 , SEQ ID NO: :594, SEQ ID NO: :604, SEQ ID NO: : 606, SEQ ID NO :608, SEQ ID NO: :610, SEQ ID NO: : 612, SEQ ID NO : :614, SEQ ID NO: 616, SEQ ID ] N0.618, SEQ ID NO: 620, o SEQ ID NO: 622, y subsecuencias de las mismas y variantes de las mismas, por ejemplo de cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500 o más residuos de longitud, o sobre la longitud completa de una enzima. Las secuencias de polipéptidos o péptidos de ejemplo de la invención incluyen la secuencia codificada por un ácido nucleico de la invención. Las secuencias de polipéptidos o péptidos de ejemplo de la invención incluyen los polipéptidos o péptidos específicamente enlazados por un anti-cuerpo de la invención. En un aspecto, un polipéptido de la invención tiene cuando menos una actividad de aldolasa, por ejemplo una actividad de alfa-aldolasa . Otro aspecto de la invención es un polipéptido o péptido aislado o recombinante que incluye cuando menos 10 bases consecutivas de una secuencia de polipéptido o péptido de 1¾ invención, secuencias sustancialmente idénticas a la misma, y las secuencias complementarias para la misma. . En un aspecto, la actividad de aldolasa de un polipéptido o péptido de la invención comprende una actividad de alfa-aldolasa, incluyendo la capacidad para hidrolizar los enlaces a-1 , 4 -glucosídicos internos en el almidón, para producir malto-dextrinas de peso molecular más pequeño. En un aspecto, la actividad de alfa-aldolasa incluye hidrolizar los enlaces a-1,4-glucosídicos internos en el almidón de una manera aleatoria. La actividad de aldolasa puede comprender una actividad de glucoal -dolasa, una actividad de 1 , 4 -a-D-glucan-glucohidrolasa , una actividad de -aldolasa, una actividad de exoaldolasa, o una actividad de ß-aldolasa. La actividad de aldolasa puede comprender hidrolizar los enlaces glicosídicos . En un aspecto, los enlaces glucosídicos comprenden un enlace a-1 , 4 -glucosídico . En otro aspecto, los enlaces glucosídicos comprenden un enlace a-1 , 6 -glucosídico . En un aspecto, la actividad de aldolasa comprende hidrolizar los enlaces glucosídicos en el almidón, por ejemplo en el almidón licuado. La actividad de aldolasa puede comprender además hidrolizar los enlaces glucosídicos en maltodextrinas . En un aspecto, la actividad de aldolasa comprende disociar una unidad de maltosa o de D-glucosa a partir de un extremo no reductor del almidón. En un aspecto, la actividad de aldolasa de la invención comprende una actividad de glucoaldolasa, la cual puede comprender la catalizacion de la hidrólisis de los enlaces glucosidicos . La actividad de glucoaldolasa de la invención puede comprender la catalizacion de la liberación hidrolítica por pasos de la D-glucosa a partir de los extremos no reductores del almidón u otras dextrinas relacionadas. La actividad de glucoaldolasa puede comprender una actividad de 1 , 4 - -D-glucan-glucohidralasa . La actividad de glucoaldolasa puede comprender la catalizacion de la hidrólisis de las malto-dextrinas que dan como resultado la generación de glucosa libre. La actividad de glucoaldolasa puede comprender una actividad de exoaldolasa. La actividad de glucoaldolasa puede comprender una actividad de a-aldolasa o de ß-aldolasa. Los enlaces glucosidicos hidrolizados pueden comprender enlaces -1 , 4 -glucosidicos o enlaces OÍ- 1 , 6 -glucosidi -eos. La actividad de glicosaldolasa puede comprender hidrolizar los enlaces glucosidicos en un almidón. La actividad de glucoaldolasa puede comprender además hidrolizar los enlaces glucosidicos del almidón para producir maltodextrinas . La actividad de glucoaldolasa puede comprender disociar una maltosa o una unidad de D-glucosa a partir del extremo no reductor del almidón. En un aspecto, la actividad de aldolasa puede ser termoestable . El polipéptido puede retener una actividad de aldolasa bajo condiciones que comprendan un intervalo de temperatura de entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 95°C, de entre aproximadamente 55°C y aproximadamente 85°c, de entre aproximadamente 70°c y aproximadamente 95°C, o de entre aproximadamente 90oC y aproximadamente 95°C. En otro aspecto, la actividad de aldolasa puede ser termotolerante . El polipéptido puede retener una actividad de aldolasa después de exponerse a una temperatura en el intervalo desde más de 37°c hasta aproximadamente 95°C, o en el intervalo desde más de 55°C hasta aproximadamente 85oC. En un aspecto, el polipéptido puede retener una actividad de aldolasa después de exponerse a una temperatura en el intervalo desde más de 90°C hasta aproximadamente 95°C a un pH de 4.5. En un aspecto, el polipéptido aislado o recombinante puede comprender al polipéptido de la invención que carezca de una secuencia de señal. En un aspecto, el polipéptido aislado o recombinante puede comprender al polipéptido de la invención comprendiendo una secuencia de señal heteróloga, tal como una secuencia de señal de aldolasa o no de aldolasa heteróloga. En un aspecto, la invención proporciona una secuencia de señal que comprende un péptido como se estipula en la Tabla 3. En un aspecto, la invención proporciona una secuencia de señal que consiste en un péptido como se estipula en la Tabla 3. En un aspecto, la invención proporciona proteínas quiméricas que comprenden un primer dominio que comprende una secuencia de señal de la invención y cuando menos un segundo dominio. La proteína puede ser una proteína de fusión. El segundo dominio puede comprender una enzima. La enzima puede ser una aldolasa (por ejemplo, una aldolasa de la invención, u otra aldolasa) . En un aspecto, la actividad de aldolasa comprende una actividad específica a aproximadamente 31°C en el intervalo desde aproximadamente 10 hasta 10,000 o de 100 a aproximadamente 1000 unidades por mg de proteína. En otro aspecto, la actividad de aldolasa comprende una actividad específica desde aproximadamente 500 hasta átomos de carbono 750 unidades por mg de proteína. De una manera alternativa, la actividad de aldolasa comprende una actividad específica a 37°C en el intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 1200 unidades por mg de proteína. En un aspecto, la actividad de aldolasa comprende una actividad específica a 37°C en el intervalo desde aproximadamente 750 hasta aproximadamente 1000 unidades por mg de proteína. En otro aspecto, la termotolerancia comprende la retención de cuando menos la mitad de la actividad específica de la aldolasa a 37oc, después de haberse calentado a la temperatura elevada. De una manera alternativa, la termotolerancia puede comprender la retención de la actividad específica a 37°C en el intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 1200 unidades por mg de proteína, después de haberse calentado a la temperatura elevada. La invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes de la invención, en donde el polipéptido comprende cuando menos un sitio de glicosilación. En un aspecto, la glicosilación puede ser una glicosilación N-enlazada. En un aspecto, el polipéptido se puede glicosilar después de expresarse en un P. pastoris o en un S. pombe. La invención también proporciona métodos para agregar glicosilación a un polipéptido, ya sea después de la traducción o químicamente, para cambiar la propiedad de los polipéptidos , por ejemplo su estabilidad térmica, solubilidad, tendencia a acumularse, y similares. En un aspecto, el polipéptido puede retener una actividad de aldolasa bajo condiciones que comprendan aproximadamente un pH de 6.5 , un pH de 6, un pH de 5.5 , un pH de 5 , un pH de 4.5, o un pH de 4. En otro aspecto, el polipéptido puede retener una actividad de aldolasa bajo condiciones que comprendan aproximadamente un pH de 7 , un pH de 7.5, un pH de 8.0, un pH de 8.5, un pH de 9, un pH de 9.5 , un pH de 10, un pH de 10.5, o un pH de 11. La invención proporciona preparaciones de proteína que comprenden un polipéptido de la invención, en donde la preparación de proteína comprende un líquido, un sólido, o un gel. La invención proporciona heterodímeros que comprenden un polipéptido de la invención y un segundo dominio. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un polipéptido, y el heterodímero puede ser una proteína de fusión. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un epítopo o una marca. En un aspecto, la invención proporciona homodímeros que comprenden un polipéptido de la invención. La invención proporciona polipéptidos inmovilizados que tienen una actividad de aldolasa, en donde el polipéptido comprende un polipéptido de la invención, un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, o un polipéptido que comprende un polipéptido de la invención y un segundo dominio. En un aspecto, el polipéptido se puede inmovilizar sobre una célula, un metal, una resina, un polímero, una cerámica, un vidrio, un microelectrodo , una partícula grafitica, una perla, un gel, una placa, un arreglo, o un tubo capilar. La invención proporciona arreglos que comprenden un ácido nucleico inmovilizado de la invención. La invención proporciona arreglos que comprenden un anti -cuerpo de la invención . La proporciona anti -cuerpos aislados o recombinantes que se enlazan específicamente a un polipéptido de la invención, o a un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. El anti -cuerpo puede ser un anti -cuerpo monoclonal o policlonal. La invención proporciona hibridomas que comprenden un anti-cuerpo de la invención, por ejemplo un anti-cuerpo que se enlaza específicamente a un polipéptido de la invención o a un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. La invención proporciona complementos alimenticios para un animal, los cuales comprenden un polipéptido de la invención, por ejemplo un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la invención. En un aspecto, el polipéptido en el complemento alimenticio puede ser glicosilado. La invención proporciona matrices de suministro enzimático comestibles que comprenden un polipéptido de la invención, por ejemplo un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la invención. En un aspecto, la matriz de suministro comprende un gránulo. En un aspecto, el polipéptido puede ser glicosilado. En un aspecto, la actividad de aldolasa es termotolerante . En otro aspecto, la- actividad de aldolasa es termoestable . La invención proporciona un método para aislar o identificar un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, el cual comprende los pasos de: (a) proporcionar un anti-cuerpo de lá invención; (b) proporcionar una muestra que comprenda polipéptidos ; y (c) poner en contacto la muestra del paso (b) con el anti-cuerpo del paso (a) bajo condiciones en donde el anticuerpo pueda enlazarse de una manera específica con el polipéptido, aislando o identificando de esta manera un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa. La invención proporciona métodos para hacer un anticuerpo anti -aldolasa, los cuales comprenden administrar a un animal no humano, una ácido nucleico de la invención, o un polipéptido de la invención, o subsecuencias del mismo, en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune humoral, haciendo de esta manera un anti-cuerpo anti-aldolasa . La invención proporciona métodos para hacer una respuesta inmune anti-aldolasa, los cuales comprenden administrar a un animal no humano, un ácido nucleico de la invención, o un polipéptido de la invención, o subsecuencias del mismo, en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune. La invención proporciona métodos para producir un polipéptido recombinante, los cuales comprenden los pasos de: (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención operativamente enlazado a un promotor; y (b) expresar el ácido nucleico del paso (a) bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido, produciendo de esta manera un polipéptido recombinante. En un aspecto, el método puede comprender además transformar una célula huésped con el ácido nucleico del paso (a) , seguido por la expresión del ácido nucleico del paso (a) , produciendo de esta manera un polipéptido recombinante en una célula transformada. La invención proporciona métodos para identificar un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido de la invención; o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un sustrato de aldolasa; y (c) poner en contacto el polipéptido o un fragmento o una variante del mismo, del paso (a) , con el sustrato del paso (b) , y detectar una reducción en la cantidad de sustrato o un aumento en la cantidad de producto de reacción, en donde una reducción en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad del producto de reacción detecta un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa. En un aspecto, el sustrato puede ser un almidón, por ejemplo un almidón licuado. La invención proporciona métodos para identificar un sustrato de aldolasa, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido de la invención; o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un sustrato de prueba; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con el sustrato de prueba del paso (b) , y detectar una reducción en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad de producto de reacción, en donde una reducción en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad del producto de reacción identifica el sustrato de prueba como un sustrato de aldolasa . La invención proporciona métodos para determinar si un compuesto de prueba se enlaza de una manera específica a un polipéptido, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) expresar un ácido nucleico o un vector que comprenda al ácido nucleico, bajo condiciones que permitan la traducción del ácido nucleico hasta un polipéptido, en donde el ácido nucleico comprenda un ácido nucleico de la invención, o, proporcionar un polipéptido de la invención; (b) proporcionar un compuesto de prueba; (c) poner en contacto el polipéptido con el compuesto de prueba; y (d) determinar si el compuesto de prueba del paso (b) se enlaza de una manera especifica con el polipéptido. La invención proporciona métodos para identificar un modulador de una actividad de aldolasa, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un compuesto de prueba; (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con el compuesto de prueba del paso (b) , y medir una actividad de la aldolasa, en donde un cambio en la actividad de aldolasa medido en la presencia del compuesto de prueba, comparándose con la actividad en ausencia del compuesto de prueba, proporciona una determinación de que el compuesto de prueba modula la actividad de aldolasa. En un aspecto, la actividad de aldolasa se puede medir proporcionando un sustrato de aldolasa, y detectando una reducción en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad del producto de reacción, o, un aumento en la cantidad del sustrato o una reducción en la cantidad del producto de reacción. Una reducción en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de prueba, comparándose con la cantidad de sustrato o producto de reacción sin el compuesto de prueba, identifica el compuesto de prueba como un activador de la actividad de aldolasa. Un aumento en la cantidad del sustrato o una reducción en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de prueba, comparándose con la cantidad de sustrato o producto de reacción sin el compuesto de prueba, identifica al compuesto de prueba como un inhibidor de la actividad de aldolasa . La invención proporciona sistemas de computación que comprenden un procesador y un dispositivo de almacenamiento de datos, en donde este dispositivo de almacenamiento de datos tiene almacenada en el mismo, una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención) . En un aspecto, el sistema de computación puede comprender además un algoritmo de comparación de secuencias y un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene cuando menos una secuencia de referencia almacenada en el mismo. En otro aspecto, el algoritmo de comparación de secuencias comprende un programa de computadora que indica polimorfismos. En un aspecto, el sistema de computación puede comprender además un identificador que identifique una o más características en esta secuencia. La invención proporciona un medio legible por computadora que tiene almacenada en el mismo una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico de la invención. La invención proporciona métodos para identificar una característica en una secuencia, los cuales comprenden los pasos de: (a) leer la secuencia utilizando un programa de computadora que identifique una o más características en una secuencia, en donde la secuencia comprenda una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico de la invención; y (b) identificar una o más características en la secuencia con el programa de computadora. La invención proporciona métodos para comparar una primera secuencia con una segunda secuencia, los cuales comprenden los pasos de: (a) leer la primera secuencia y la segunda secuencia a través del uso de un programa de computadora que compare secuencias, en donde la primera secuencia comprenda una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico de la invención; y (b) determinar las diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia con el programa de computadora. El paso de determinar las diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia, puede comprender además el paso de identificar los polimorfismos. En un aspecto, el método puede comprender además un identificador que identifique una o más características en una secuencia. En otro aspecto, el método puede comprender leer la primera secuencia utilizando un programa de computadora, e identificar una o más características en la secuencia. La invención proporciona métodos para aislar o recuperar un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa a partir de una muestra de medio ambiente, los cuales comprenden los pasos de: (a) proporcionar un par de secuencias cebadoras de amplificación para amplificar un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, en donde el par cebador sea capaz de amplificar un ácido nucleico de la invención; (b) aislar un ácido nucleico a partir de la muestra de medio ambiente, o tratar la muestra de medio ambiente de tal manera que sea accesible el ácido nucleico de la muestra para hibridarse al par cebador de amplificación; y (c) combinar el ácido nucleico del paso (b) con el par cebador de amplificación del paso (a) , y amplificar el ácido nucleico a partir de la muestra de medio ambiente, aislando o recuperando de esta manera un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa a partir de una muestra de medio ambiente . Uno o cada miembro del par de secuencias cebadoras de amplificación puede comprender un oligonucleótido que comprenda cuando menos de aproximadamente 10 a 50 bases consecutivas de una secuencia de la invención. La invención proporciona métodos para aislar o recuperar un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa a partir de una muestra de medio ambiente, los cuales comprenden los pasos de: (a) proporcionar una sonda de polinucleótido que comprenda un ácido nucleico de la invención o una subsecuencia del mismo; (b) aislar un ácido nucleico a partir de la muestra de medio ambiente, o tratar la muestra de medio ambiente de tal manera que sea accesible el ácido nucleico de la muestra para hibridarse a una sonda de polinucleótido del paso (a) ; (c) combinar el ácido nucleico aislado o la muestra de medio ambiente tratada del paso (b) con la sonda de polinucleótido del paso (a) ; y (d) aislar un ácido nucleico que se hibride de una manera específica con la sonda de polinucleótido del paso (a) , aislando o recuperando de esta manera un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa a partir de una muestra de medio ambiente. La muestra de medio ambiente puede comprender una muestra de agua, una muestra de líquido, una muestra de tierra, una muestra de aire, o una muestra biológica. En un aspecto, la muestra biológica se puede derivar a partir de una célula bacteriana, una célula de protozoario, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula de planta, una célula fúngica, o una célula de mamífero. La invención proporciona métodos para generar una variante de un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, los cuales comprenden los pasos: (a) proporcionar un ácido nucleico de plantilla que comprenda un cido nucleico de la invención; y (b) modificar, suprimir, o agregar uno o más nucleotidos en la secuencia de plantilla, o una combinación de los mismos, para generar una variante del ácido nucleico de plantilla. En un aspecto, el método puede comprender además expresar el ácido nucleico variante para generar un polipéptido de aldolasa variante. Las modificaciones, adiciones, o supresiones se pueden introducir mediante un método que comprenda reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error, mezcla, mutagénesis dirigida al oligonucleótido, reacción en cadena de la polimerasa de ensamble, mutagénesis con reacción en cadena de la polimerasa sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de cásete, mutagénesis de ensamble recursivo, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamble de genes, mutagénesis saturada del sitio genético (GSSM) , reensamble de ligamiento sintético (SLR) , o una combinación de los mismos. En otro aspecto, las modificaciones, adiciones, o supresiones se introducen mediante un método que comprende recombinación, recombinación de secuencias recursiva, mutagénesis de ADN modificado con fosfotioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, mutagénesis dúplex con huecos, mutagénesis de reparación de mal emparejamiento puntual, mutagénesis de cepa huésped deficiente en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de restricción-selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de ensamble, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, y una combinación de los mismos. En un aspecto, el método se puede repetir de una manera iterativa hasta que se produzca una aldolasa que tenga una actividad alterada o diferente, o una estabilidad alterada o diferente, de aquélla de un polipéptido codificado por el ácido nucleico de plantilla. En un aspecto, el polipéptido de aldolasa variante es termotolerante , y retiene alguna actividad después de haberse expuesto a una temperatura elevada. En otro aspecto, el polipéptido de aldolasa variante tiene una mayor glicosilación, comparándose con la aldolasa codificada por un ácido nucleico de plantilla. De una manera alternativa, el polipéptido de aldolasa variante tiene una actividad de aldolasa bajo alta temperatura, en donde la aldolasa codificada por el ácido nucleico de plantilla no es activa bajo la alta temperatura. En un aspecto, el método se puede repetir de una manera iterativa, hasta que se produzca una secuencia de codificación de aldolasa que tenga un uso de codones alterado de aquél del ácido nucleico de plantilla. En otro aspecto, el método se puede repetir de una manera iterativa, hasta que se produzca un gen de aldolasa que tenga un nivel más alto o más bajo de expresión de mensaje o de estabilidad, de aquélla del ácido nucleico de plantilla. La invención proporciona métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, para aumentar su expresión en una célula huésped, comprendiendo el método los siguientes pasos: (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención que codifique un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa; y (b) identificar un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico del paso (a) , y reemplazarlo con un codón preferido o neutralícente utilizado que codifique el mismo aminoácido que el codón reemplazado, en donde un codón preferido es un codón sobre-representado en las secuencias de codificación de los genes de la célula huésped, y un codón no preferido o menos preferido es un codón sub-representado en las secuencias de codificación de los genes de la célula huésped, modificando de esta manera el ácido nucleico para aumentar su expresión en una célula huésped. La invención proporciona métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa; comprendiendo el método los siguientes pasos: (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención; y (b) identificar un codón en el ácido nucleico del paso (a) , y reemplazarlo con un codón diferente que codifique el mismo aminoácido que el codón reemplazado, modificando de esta manera los codones en un ácido nucleico que codifique una aldolasa. La invención proporciona métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa para aumentar su expresión en una célula huésped, comprendiendo el método los siguientes pasos: (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención que codifique un polipéptido de aldolasa; y (b) identificar un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico del paso (a) , y reemplazarlo con un codón preferido o neutralmente utilizado que codifique el mismo aminoácido que el codón reemplazado, en donde un codón preferido es un codón sobre-representado en las secuencias de codificación de los genes de la célula huésped, y un codón no preferido o menos preferido es un codón sub-representado en las secuencias de codificación de los genes de la célula huésped, modificando de esta manera el ácido nucleico para aumentar su expresión en una célula huésped. La invención proporciona métodos para modificar un codón en un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, para reducir su expresión en una célula huésped, comprendiendo el método los siguientes pasos: (A) proporcionar un ácido nucleico de la invención; y (b) identificar cuando menos un codón preferido en el ácido nucleico del paso (a) , y reemplazarlo con un codón no preferido o menos preferido que codifique el mismo aminoácido que el codón reemplazado, en donde un codón preferido es un codón sobre-representado en las secuencias de codificación de los genes de una célula huésped, y un codón no preferido o menos preferido es un codón sub-represen-tado en las secuencias de codificación de los genes de la célula huésped, modificando de esta manera el ácido nucleico para reducir su expresión en una célula huésped. En un aspecto, la célula huésped puede ser una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula de planta, o una célula de mamífero. La invención proporciona métodos para producir una biblioteca de' ácidos nucleicos que codifiquen una pluralidad de sitios activos de aldolasa modificados o sitios de enlace de sustrato, en donde los sitios activos modificados o los sitios de enlace de sustrato se derivan a partir de un primer ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un primer sitio activo o un primer sitio de enlace de sustrato, comprendiendo el método los siguientes pasos: (a) proporcionar un primer ácido nucleico que codifique un primer sitio activo o un primer sitio de enlace de sustrato, en donde la primera secuencia de ácido nucleico comprenda una secuencia que se hibride bajo condiciones restringentes a un ácido nucleico de la invención, y el ácido nucleico codifica un sitio activo de aldolasa o un sitio de enlace de sustrato de aldolasa; proporcionar un conjunto de oligonucleótidos mutagénicos que codifiquen variantes de aminoácidos que se presenten naturalmente en una pluralidad de codones dirigidos del primer ácido nucleico; y (c) utilizar el conjunto de oligonucleótidos mutagénicos para generar un conjunto de ácidos nucleicos ácidos nucleicos variantes que codifiquen el sitio activo o que codifiquen el sitio dé enlace de sustrato, los cuales codifiquen un número de variaciones de aminoácidos" en cada codón de aminoácido que se haya mutado, produciendo de esta manera una biblioteca de ácidos nucleicos que codifiquen una pluralidad de sitios activos de aldolasa modificados o de sitios de enlace de sustrato. En un aspecto, el método comprende mutar el primer ácido nucleico del paso (a) mediante un método que comprende un sistema de evolución dirigida optimizada, mutagénesis de saturación del sitio genético (GSSM) , reensamble de ligamiento sintético (SRL) , reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error, mezcla, mutagénesis dirigida al oligonucleó-tido, reacción en cadena de la polimerasa de ensamble, mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de cásete, mutagénesis de ensamble recursivo, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica del sitio', reensamble de genes, mutagénesis saturada del sitio genético (GSSM) , reensamble de ligamiento sintético (SLR) , y una combinación de los mismos. En otro aspecto, el método comprende mutar el primer ácido nucleico del paso (a) o las variantes, mediante un método que comprende recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis del ADN modificado por fosfo-tioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, mutagéne-sis dúplex con huecos, mutagénesis de reparación de mal emparejamiento puntual, mutagénesis de cepa huésped deficiente en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de restricción-selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de ensamble, creación de multímero de ácido nucleico quimérico, y una combinación de los mismos. La invención proporciona métodos para hacer una molécula pequeña, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar una pluralidad de enzimas biosintéticas capaces de sintetizar o modificar una molécula pequeña, en donde una de las enzimas comprende una enzima de aldolasa codificada por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un sustrato para cuando menos una de las enzimas del paso (a) ; y (c) hacer reaccionar el sustrato del paso (b) con las enzimas, bajo condiciones que faciliten una pluralidad de reacciones biocatalí-ticas, para generar una molécula pequeña mediante una serie de reacciones biocatalíticas . La invención proporciona métodos para modificar una molécula pequeña, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar una enzima de aldolasa, en donde la enzima comprende un polipéptido de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, o una subsecuencia del mismo; (b) proporcionar una molécula pequeña; y (c) hacer reaccionar la enzima del paso (a) con la molécula pequeña del paso (b) , bajo condiciones que faciliten una reacción enzimática catalizada por la enzima aldolasa, modificando de esta manera una molécula pequeña mediante una reacción enzimática de aldolasa. En un aspecto, el método puede comprender una pluralidad de sustratos de moléculas pequeñas para la enzima del paso (a) , generando de esta manera una biblioteca de moléculas pequeñas modificadas producidas mediante cuando menos una reacción enzimática catalizada por la enzima aldolasa. En un aspecto, el método puede comprender una pluralidad de enzimas adicionales, bajo condiciones que faciliten una pluralidad de reacciones biocatalíticas mediante las enzimas, para formar una biblioteca de moléculas pequeñas modificadas producidas por la pluralidad de reacciones enzimáticas. En otro aspecto, el método puede comprender además el paso de probar la biblioteca para determinar si una molécula pequeña modificada particular que exhiba una actividad deseada, está presente adentro de la biblioteca. El paso de probar la biblioteca puede comprender además los pasos de eliminar de una manera sistemática todas salvo una de las reacciones biocatalíticas empleadas para producir una porción de la pluralidad de moléculas pequeñas modificadas dentro de la biblioteca, mediante la prueba de la porción de la molécula pequeña modificada para determinar la presencia o ausencia de la molécula pequeña modificada particular con una actividad deseada, y la identificación de cuando menos una reacción biocatalítica específica que produzca la molécula pequeña modificada particular de la actividad deseada. La invención proporciona métodos para determinar un fragmento funcional de una enzima aldolasa, los cuales comprenden los pasos de: (a) proporciona una enzima aldolasa, en donde la enzima comprenda un polipéptido de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, o una subse-cuencia del mismo; y (b) suprimir una pluralidad de residuos de aminoácidos de la secuencia del paso (a) , y probar la subsecuen-cia restante para determinar una actividad de aldolasa, determinando de esta manera un fragmento funcional de una enzima aldolasa. En un aspecto, la actividad de aldolasa se mide proporcionando un sustrato de aldolasa, y detectando una reducción en la cantidad del sustrato, o un aumento en la cantidad de un producto de reacción. La invención proporciona métodos para diseñar células enteras de fenotipos nuevos o modificados, mediante la utilización de análisis de fluj o -metabólico en tiempo real, comprendiendo el método los siguientes pasos: (a) hacer una célula modificada mediante la modificación de la composición genética de una célula, en donde la composición genética se modifica mediante la adición a la célula de un ácido nucleico de la invención; (b) cultivar la célula modificada para generar una pluralidad de células modificadas;- (c) medir cuando menos un parámetro metabólico de la célula mediante el monitoreo del cultivo celular del paso (b) en tiempo real; y (d) analizar los datos del paso (c) , para determinar si el parámetro medido difiere de una medición comparable en una célula no modificada bajo condiciones similares, identificando de esta manera un fenotipo diseñado en la célula utilizando el análisis de flujo metabolico en tiempo real. En un aspecto, la composición genética de la célula se puede modificar mediante un método que comprende la supresión de una secuencia o la modificación de una secuencia en la célula, o la eliminación genética de la expresión de un gen. En un aspecto, el método puede comprender además seleccionar una célula que comprenda un fenotipo recién diseñado. En otro aspecto, el método puede comprender cultivar la célula seleccionada, generando de esta manera una nueva cepa celular, la cual comprende un fenotipo recién diseñado. La invención proporciona métodos para hidrolizar un almidón, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, en donde el polipéptido comprende un polipéptido de la invención; (b) proporcionar una composición que comprenda un almidón; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con la composición del paso (b) bajo condiciones en donde el polipéptido hidrolice al almidón. En un aspecto, la composición que comprende almidón comprende un enlace a- 1 , 4 -glucosídico o un enlace a- 1 , 6 -glucosí -dico. En un aspecto, la actividad de aldolasa es una actividad de alfa-aldolasa . En un aspecto, la actividad de alfa-aldolasa hidroliza los enlaces internos en un almidón o en otro polisacá-rido . La invención proporciona métodos para licuar o remover un almidón a partir de una composición, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, en donde el polipéptido comprende un polipéptido de la invención; (b) proporcionar una composición que comprenda un almidón y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con la composición del paso (b) bajo condiciones en donde el polipéptido remueva o licué el almidón. La invención proporciona métodos para aumentar la termotolerancia o la termoestabilidad de un polipéptido de aldolasa, comprendiendo él método glicosilar un polipéptido de aldolasa, en donde el polipéptido comprende cuando menos 30 aminoácidos contiguos de un polipéptido de la invención; o un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico de la invención, aumentando de esta manera la termotolerancia o la termoestabilidad del polipéptido de aldolasa. En un aspecto, la actividad específica de la aldolasa puede ser termoestable o termotolerante a una temperatura en el intervalo desde más de aproximadamente 37°C hasta aproximadamente 95°C La invención proporciona métodos para sobreexpresar un polipéptido de aldolasa recombinante en una célula, los cuales comprenden expresar un vector que comprenda un ácido nucleico que comprenda un ácido nucleico de la invención o una secuencia de ácido nucleico de la invención, en donde las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual, en donde la sobreexpresión se efectúa mediante la utilización de un promotor de alta actividad, un vector dicistrónico, o mediante amplificación genética del vector. La invención proporciona composiciones detergentes que comprenden un polipéptido de la invención o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, en donde el polipéptido comprende una actividad de aldolasa. En un aspecto, la aldolasa puede ser una aldolasa que no sea de actividad superficial. En otro aspecto, la aldolasa puede ser una aldolasa de actividad superficial. La invención proporciona métodos para lavar un objeto, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar una composición que comprenda un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, en donde el polipéptido comprende: un polipéptido de la invención o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un objeto; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) y el objeto del paso (b) bajo condiciones en donde la composición pueda lavar el objeto. La invención proporciona métodos para hidrolizar almidón, por ejemplo en un alimento o en un producto alimenticio antes de su consumo por parte de un animal, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) obtener una composición, por ejemplo un material alimenticio, la cual comprende un almidón, en donde el polipéptido comprende: un polipéptido de la invención o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; y (b) agregar el polipéptido del paso (a) a la composición, por ejemplo al alimento o al material alimenticio, en una cantidad suficiente y durante un período de tiempo suficiente para causar la hidrólisis del almidón, hidrolizando de esta manera el almidón. En un aspecto, el alimento o el material alimenticio comprende arroz, maíz, cebada, trigo, legumbres, o papa. La invención proporciona métodos para el desapresto textil, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, en donde el polipéptido comprenda un polipéptido de la invención o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una tela; y (c) poner el contacto el polipéptido del paso (a) y la tela del paso (b) bajo condiciones en donde la aldolasa pueda desaprestar la tela. La invención proporciona métodos para desentintar papel o fibras, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, en donde el polipéptido comprenda un polipéptido de la invención; (b) proporcionar una composición que comprenda papel o fibra; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) y la composición del paso (b) bajo condiciones en donde el polipéptido pueda desentintar el papel o la fibra. La invención proporciona métodos para el tratamiento de fibras lignocelulósicas , los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, en donde el polipéptido comprenda ün polipéptido de la invención; (b) proporciona una fibra lignocelulósica ; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) y la fibra del paso (b) bajo condiciones en donde el polipéptido pueda tratar la fibra, mejorando de esta manera las propiedades de la fibra. La invención proporciona métodos para producir un jarabe alto en maltosa o alto en glucosa, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, en donde el polipéptido comprenda una enzima de la invención; (b) proporcionar una composición que comprenda un almidón; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) y la tela del paso (b) bajo condiciones en donde el polipéptido del paso (a) pueda licuar la composición del paso (b) , produciendo de esta manera un hidrolizado de almidón soluble, y sacarificar el hidrolizado de almidón soluble, produciendo de esta manera el jarabe. En un aspecto, el almidón puede ser a partir de arroz, maíz, cebada, trigo, legumbres, papa, o camote. La invención proporciona métodos para mejorar el flujo de los fluidos de producción que contienen almidón, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, en donde el polipéptido comprenda un polipéptido de la invención; (b) proporcionar un fluido de producción; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) y el fluido de producción del paso (b) bajo condiciones en donde la aldolasa pueda hidrolizar el almidón en el fluido de producción, mejorando de esta manera su flujo al reducir su densidad. En un aspecto, el fluido de producción puede ser a partir de una formación subterránea. La invención proporciona composiciones contra el ranciamiento, las cuales comprenden un polipéptido de la invención o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. La invención proporciona métodos para prevenir el ranciamiento de los productos horneados, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, en donde el polipéptido comprenda un polipéptido de la invención; (b) proporcionar una composición que contenga almidón utilizado para hornear; (c) combinar el polipéptido del paso (a) con la composición del paso (b) bajo condiciones en donde el polipéptido pueda hidrolizar el almidón en la composición utilizada para hornear, previniendo de esta manera el ranciamiento del producto horneado. En un aspecto, el producto horneado puede ser pan. La invención proporciona métodos para utilizar aldolasa en la producción de cerveza o alcohol, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido que tenga una actividad de aldolasa, en donde el polipéptido comprenda un polipéptido de la invención; (b) proporcionar una composición que contenga almidón y que se utilice para la producción de cerveza o alcohol; (c) combinar el polipéptido del paso (a) con la composición del paso (b) bajo condiciones en donde el polipéptido pueda hidrolizar el almidón en la composición utilizada para la producción de cerveza o alcohol. En un aspecto, la composición que contiene almidón puede ser cerveza. La invención proporciona métodos para hacer una planta transgénica, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) introducir una secuencia de ácido nucleico heteróloga en la célula, en donde la secuencia de ácido nucleico heteróloga comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención, produciendo de esta manera una célula de planta transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula transformada. En un aspecto, el paso (a) puede comprender además introducir la secuencia de ácido nucleico heteróloga mediante electroporacion o microinyeccion de protoplastos de células de plantas. En otro aspecto, el paso (a) puede comprender además introducir la secuencia de ácido nucleico heteróloga directamente en el tejido de la planta mediante bombardeo de partículas de ADN. De una manera alternativa, el paso (a) puede comprender además introducir la secuencia de ácido nucleico heteróloga en el ADN de la célula de planta, utilizando un huésped de Agrobacte-rium turnefaciens . En un aspecto, la célula de planta puede ser una célula de papa, maíz, arroz, trigo, tabaco, o cebada. La invención proporciona métodos para expresar una secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula de planta, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) transformar la célula de planta con una secuencia de ácido nucleico heteróloga operativamente enlazada a un promotor, en donde la secuencia de ácido nucleico heteróloga comprende un ácido nucleico de la invención; (b) cultivar la planta bajo condiciones en donde se exprese la secuencia de ácido nucleico heteróloga en la célula de planta . La invención también proporciona un proceso para preparar una masa o un producto horneado preparado a partir de la masa, el cual comprende agregar una aldolasa de la invención a la masa en una cantidad que sea efectiva para retardar el rancia-miento del pan. La invención también proporciona una masa que comprende esta aldolasa, y una premezcla que comprende harina junto con esta aldolasa. Finalmente, la invención proporciona un aditivo enzimático para hornear, el cual contiene dicha aldolasa. El uso de la aldolasa de conformidad con la presente invención proporciona un mejor efecto contra el ranciamiento, medido, por ejemplo, por menos firmeza del migajón, retención de la elasticidad del migajón, mejor posibilidad de rebanado (por ejemplo, menos migajas, migajón no gomoso), mejor sabor. La invención proporciona composiciones de liberación demorada ("liberación controlada"), las cuales comprenden un ingrediente deseado recubierto por un recubrimiento de polímero de látex (o equivalente) . En un aspecto, el ingrediente deseado comprende una enzima, por ejemplo una enzima de la invención. En un aspecto, el ingrediente deseado comprende una molécula pequeña, un fármaco, un polisacárido , un lípido, un ácido nucleico, una vitamina, un antibiótico, o un insecticida. En un aspecto, el ingrediente deseado comprende un gránulo o una matriz, por ejemplo un gránulo o una matriz que comprenda un material comestible (por ejemplo, como un alimento o material alimenticio para animales, o un complemento, o un medicamento) . La invención también proporciona métodos para "liberación controlada" o "liberación demorada" de una composición, en donde la composición se recubre mediante un recubrimiento de polímero de látex (o equivalente) . En un aspecto, el recubrimiento de polímero de látex comprende una pintura de látex, o su equivalente. El recubrimiento de polímero de látex puede comprender un (met ) acrilato , un acetato de vinilo, un estireno, un etileno, un cloruro de vinilo, un butadieno, un cloruro de vinilideno, un versatato de vinilo, un propionato de vinilo, un acrilato de terbutilo, un acriloni-trilo, un neopreno, un maleato, un fumarato, equivalentes de los mismos, combinaciones de los mismos, y/o derivados de los mismos. Los detalles de una o más modalidades de la invención se estipulan en los dibujos acompañantes y en '' la siguiente descripción. Otras características, objetos, y ventajas de la invención llegarán a quedar más claros a partir de la descripción y de los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.
Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente, secuencias GenBank y depósitos ATCC, citados en la presente, se incorporan a la presente de una manera expresa como referencia para todos los propósitos. Descripción de los Dibujos La Figura 1 es un diagrama de bloques de un sistema de computación . La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso para comparar una nueva secuencia de nucleótido o de proteína con una base de datos de secuencias, con el objeto de determinar los niveles de homología entre la nueva secuencia y las secuencias de la base de datos. La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso en una computadora para determinar si dos secuencias son homologas. La Figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso identificador 300, para detectar la presencia de una característica en una secuencia. La Figura 5 es una gráfica que muestra la actividad residual de diferentes aldolasas en seguida del calentamiento a 90°C durante 10 minutos en el Ejemplo 1. La Figura 6 es una gráfica que muestra el porcentaje neto de almidón removido contra la concentración de enzima en una prueba de lavado de trastes automático con blanqueador y quelantes .
La Figura 7 es una gráfica que muestra la actividad de las aldolasas progenitoras a un pH de 8 , a 40°c, en una formulación de lavado de trastes ¦ automático a 55°C. La Figura 8 es una gráfica de datos con respecto a la tolerancia al H202 de las enzimas novedosas del Ejemplo 4. La Figura 9 es una gráfica de los datos de pH y temperatura para una selección de las aldolasas caracterizadas. La Figura 9a muestra los datos a un pH de 8 y a 40°C, y la Figura 9b muestra los datos a un pH de 10 y a 50°C. La Figura 10 estipula las secuencias que se van a utilizar en los experimentos de reensamble con las enzimas. La Figura 11 ilustra una curva estándar de muestra del ensayo del Ejemplo 5. La Figura 12 ilustra los perfiles de índice de pH para la SEQ ID NO: 127, que tiene un pH óptimo neutro, y para la SEQ ID NO: 211, que tiene un pH óptimo alrededor de 10. La Figura 13 muestra la estabilidad de las aldolasas de ejemplo contra una enzima comercial, como se describe en el Ej emplo 2. La Figura 14 muestra las alineaciones de secuencias de las alfa-aldolasas hipotermofí licas , como se estipulan en el Ejemplo 8. la Figura 14a muestra una alineación de secuencias de aldolasa. SEQ ID NO: 81 = un clon medio-ambiental; pyro = Pyrococcus sp . (cepa:KODl) , Tachibana (1996) J. Ferment . Bioeng. 82:224-232; pyro2 = Pyrococcus furiosus, Appl . Environ. Micro-biol . 63.(9) : 3569-3576, 1997; Thermo = Thermococcus sp. ; Thermo2 Thermococcus hydrothermalis , Leveque E. y colaboradores, patente FR 98.05655 05-mayo-1998. La Figura 14b muestra la alineación de secuencias de aminoácidos, de las secuencias identificadas :' SEQ ID NO: 81; pyro; SEQ ID N0:75; SEQ ID NO:77; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 85; thermo2 ; SEQ ID NO: 79 thermo; pyro2 ; clon A; thermo3. La Figura 14c muestra la alineación de la secuencia de ácido nucleico correspondiente a la secuencia del polipéptido de las Figuras 5 y 6. SEQ ID NO: 81; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 77; SEQ ID NO: 83;. SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 79; clon A; y SEQ ID NO: 73. ' La Figura 15 es un árbol de unión de vecinos para Thermococcales . Los símbolos de referencia iguales en los diferentes dibujos indican elementos iguales. Descripción Detallada La invención proporciona enzimas de aldolasa, por ejemplo alfa-aldolasa, polinucleótidos que codifican las enzimas, métodos para hacer y usar estos polinucleótidos y polipéptidos . La invención se refiere a polipéptidos novedosos que tienen una actividad de aldolasa, por 'ejemplo una actividad de alfa-aldolasa, ácidos nucleicos que los codifican, y anti-cuerpos que se enlazan con ellos. Los polipéptidos de la invención se pueden utilizar en una variedad de contextos de diagnóstico, terapéuticos, e industriales. Los polipéptidos de la invención se pueden utilizar, por ejemplo, como un aditivo para un detergente, para el procesamiento de alimentos, y para síntesis química utilizando una reacción inversa. Adicionalmente, los polipéptidos de la invención se pueden utilizar en el tratamiento de telas, en la producción de alcohol, y como aditivos para alimentos o materiales alimenticios para animales. En un aspecto, las aldolasas de la invención son activas a una temperatura alta y/o baja, o sobre un amplio intervalo de temperatura. Por ejemplo, pueden ser activas en las temperaturas en el intervalo entre 20oC y 90°C, entre 30°C y 80oc, o entre 40°C y 70°C. La invención también proporciona aldolasas que tienen actividad en pHs alcalinos o en pHs ácidos, por ejemplo una baja acidez del agua. En los aspectos alternativos, las aldolasas de la invención pueden tener actividad en pHs ácidos tan bajos como pH de 5.0, pH de 4.5, pH de 4.0, y pH de 3.5. En los aspectos alternativos, las aldolasas de la invención pueden tener actividad en pHs alcalinos tan altos como pH de 9.5, pH de 10, pH de 10.5, y pH de 11. En un aspecto, las aldolasas de la invención son activas en el intervalo de temperatura de entre aproximadamente 40°c y aproximadamente 70°C, bajo condiciones de una baja actividad del agua (bajo contenido de agua) . . La invención también proporciona métodos para modificar adicionalmente las aldolasas de ejemplo de la invención, con el fin de generar proteínas con propiedades deseables. Por ejemplo, las aldolasas generadas mediante los métodos de la invención pueden tener una alteración en la actividad enzimática, la estabilidad térmica, el perfil de actividad/pH, el perfil de estabilidad/pH (tal como una mayor estabilidad en valores de pH bajos, por ejemplo pH <6 o pH <5, o altos, por ejemplo pH <9) , estabilidad hacia la oxidación, dependencia en Ca2+, actividad específica, y similares. La invención proporciona la alteración de cualquier propiedad de interés. Por ejemplo, la alteración puede dar como resultado una variante que, comparándose con enzima progenitora, tenga una alteración en la actividad enzimática, o en los perfiles de actividad en el. pH o en la temperatura . Definiciones El término "aldolasa" incluye todos los polipéptidos , por ejemplo enzimas, que catalizan la hidrólisis de un polisacá-rido, por ejemplo un almidón. El término "aldolasa" incluye los polipéptidos que tienen una actividad de a-aldolasa, una actividad de ß-aldolasa, una actividad de glucoaldolasa , una actividad de 1 , 4 -a-D-glucan-glucohidrolasa , una actividad de exoaldolasa, una actividad de glucan-a-malto-tetrahidrolasa , una actividad de maltasa, una actividad de isomaltasa, una actividad de glucan- 1 , 4 -a-glucosidasa , una actividad de a-glucosidasa , una actividad de sucrasa, o una actividad de agarasa (por ejemplo, una actividad de ß-agarasa) . Por ejemplo, una actividad de aldolasa de la invención incluye una actividad de a-aldolasa, incluyendo la capacidad para hidrolizar los enlaces a-1,4-glucosídicos internos en el almidón, para producir malto-dextrinas de peso molecular más pequeño. En un aspecto, la actividad de alfa-aldolasa incluye hidrolizar los enlaces a-1,4-glucosídicos internos en el almidón de una manera aleatoria. Una actividad de aldolasa de la invención incluye los polipéptidos que tienen actividad de glucoaldolasa, tal como la capacidad para hidrolizar los polímeros de glucosa enlazados por enlaces a-1,4-y a-1 , 6-glucos£dicos . En un aspecto, los polipéptidos de la invención tienen actividad de glucoaldolasa, hidrolizando los enlaces a- 1 , 4 -glucosídicos internos para producir malto-dextrinas de peso molecular más pequeño. Una actividad de aldolasa de la invención también incluye una actividad de glucan- 1 , 4 - -glucosi -dasa, o de 1 , 4.-a-D-glucan-glucohidrolasa , comúnmente denominada como glucoaldolasa, pero también denominada como amilo-glucosida-sa y ? -aldolasa que, en un aspecto, libera la ß-D-glucosa de los glucanos 1,4-a-, 1,6- -, y 1 , 3 -a-enlazados . Una actividad de aldolasa de la invención también incluye una actividad de exoaldolasa . En un aspecto, la actividad de glucoaldolasa comprende la catalización de la hidrólisis de los enlaces glucosídicos. La actividad de glucoaldolasa puede comprender catalizar la liberación hidrolítica por pasos de la D-glucosa a partir de los extremos no reductores del almidón u otras dextrinas relacionadas. La actividad de glucoaldolasa puede comprender una actividad de 1 , 4 -a-D-glucan-glucohidrolasa . La actividad de glucoaldolasa puede comprender la catalización de la hidrólisis de las malto-dextrinas, que dan como resultado la generación de glucosa libre. La actividad de glucoaldolasa puede comprender una actividad de exoaldolasa. La actividad de glucoaldolasa puede comprender una actividad de -aldolasa o de ß-aldolasa. Los enlaces glucosídicos hidrolizados pueden comprender enlaces a-1, 4 -glucosídicos o enlaces a-1 , 6 -glucosídicos . La actividad de glucoaldolasa puede comprender hidrolizar los enlaces glucosídicos en un almidón. La actividad de glucoaldolasa puede comprender además hidrolizar los enlaces glucosídicos en el almidón, para producir maltodextrinas . La actividad de glucoaldolasa puede comprender disociar una maltosa o una unidad de D-glucosa a partir de un extremo no reductor del almidón. Una actividad de aldolasa de la invención también incluye hidrolizar un polisacárido, por ejemplo un almidón, a altas temperaturas, a bajas temperaturas, en pHs alcalinos, y en pHs ácidos. Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona polipéptidos , y ácidos nucleicos que los codifican, que tienen una actividad de aldolasa, por ejemplo de a-glucoaldolasa , que es termoestable . El polipéptido puede retener una actividad de aldolasa bajo condiciones que comprendan un intervalo de temperatura de entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 95°C; de entre aproximadamente 55°C y aproximadamente 85°C, de entre aproximadamente 70°C y aproximadamente 95°C, o de entre aproximadamente 90°c y aproximadamente 95°C. En otro aspecto, un polipép-tido de la invención puede tener una actividad de glucoaldolasa que sea termotolerante . El polipéptido puede retener una actividad de aldolasa, por ejemplo, de a-glucoaldolasa, después de exponerse a una temperatura en el intervalo desde más de 37°C hasta aproximadamente 95°C, o en cualquier parte en el intervalo desde más de 55°C hasta aproximadamente 85°C. En un aspecto, el polipéptido retiene una actividad de aldolasa después de exponerse a una temperatura en el intervalo desde más de 90°C hasta aproximadamente 95°C a un pH de 4.5. Una "variante de aldolasa" comprende una secuencia de aminoácidos que se deriva a partir de la secuencia de aminoácidos de una "aldolasa precursora" . La aldolasa precursora puede incluir aldolasas que se presenten naturalmente, y aldolasas recombinantes . La secuencia de aminoácidos de la variante de aldolasa se puede "derivar" a partir de la secuencia de aminoácidos de la aldolasa precursora mediante la sustitución, supresión, o inserción de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora. Esta modificación puede ser de la "secuencia de ADN precursora" que codifique la secuencia de aminoácidos de la aldolasa precursora, en lugar de la manipulación de la enzima aldolasa precursora por sí misma. Los métodos adecuados para esta manipulación de la secuencia de ADN precursora incluyen los métodos dados a conocer en la presente, así como los métodos conocidos por los técnicos en la materia. El término "anti-cuerpo" incluye un péptido o polipép-tido derivado a partir de, modelado después de, o sustancialmente codificado por, un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobu-lina, o fragmentos de los mismos, capaces de enlazarse de una manera específica con un antígeno o epítopo; ver, por ejemplo, Fundamental Immunology, Tercera Edición, W.E. Paul, Editor, Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys . Methods 25:85-97. El término "anti-cuerpo" incluye las porciones de enlace de antígeno, es decir, los "sitios de enlace de antígeno" (por ejemplo, fragmentos, subsecuencias , regiones determinantes de complementariedad (CDRs) ) , que retengan la capacidad para enlazarse con el antígeno, incluyendo (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente consistente en los dominios VL, VH, CL, y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd consistente en los dominios VH y CH1 ; (iv) un fragmento Fv consistente en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anti-cuerpo, (v) un fragmento de dAb (Ward y colaboradores (1989), Nature 341:544-546), el cual consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. También se incluyen los anti -cuerpos de una sola cadena por referencia en el término "anti-cuerpo". Los términos "arreglo" o "microarreglo" o "biochip" o "chip", como sé utilizan en la presente, son una pluralidad de elementos objetivos, comprendiendo cada elemento objetivo una cantidad definida de uno o más polipéptidos (incluyendo anticuerpos) o ácidos nucleicos inmovilizados sobre un área definida de una superficie de un sustrato, como se describe con mayor detalle más adelante. Como se utilizan en la presente, los términos "computadora", "programa de computadora", y "procesador", se utilizan en sus contextos generales más amplios, e incorporan' todos esos dispositivos, como se describen con detalle más adelante. Una "secuencia de codificación de" o una "secuencia codifica" un polipéptido o proteína particular, es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe y se traduce en un polipéptido o proteína cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas . El término "cásete de expresión", como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de nucleótidos que es capaz de afectar la expresión de un gen estructural (es decir, una secuencia de codificación de proteína, tal como una aldolasa de la invención) en un huésped compatible con esas secuencias. Los casetes de expresión incluyen cuando menos un promotor operativamente enlazado con la secuencia de codificación del polipéptido; y opcionalmente con otras secuencias, por ejemplo señales de terminación de transcripción. También se pueden utilizar factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, por ejemplo potenciadores . Por ejemplo, los casetes de expresión también incluyen plásmidos, vectores de expresión, virus recombinantes , cualquier forma de vector de "ADN desnudo" recombinante , y similares. "Operativamente enlazado", como se utiliza en la presente, se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) . Típicamente, se refiere a la relación funcional de la secuencia reguladora de transcripción con una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor está operativamente enlazado con una secuencia de codificación, tal como un ácido nucleico de la invención, si estimula o modula la transcripción de la secuencia de codificación en una célula huésped apropiada o en otro sistema de expresión. En términos generales, las secuencias reguladoras de transcripción promotoras que están operativamente enlazadas a una secuencia transcrita, están físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, son de acción-cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de transcripción, tales como las potencia-doras, no necesitan estar físicamente contiguas o localizadas en estrecha proximidad a las secuencias de codificación cuya transcripción potencian. Un "vector" comprende un ácido nucleico que puede infectar, transfectar, transducir transitoria o permanentemente una célula. Se reconocerá que un vector puede ser un ácido nucleico desnudo, o un ácido nucleico formando complejo con una proteína o lípido. El vector comprende opcionalmente ácidos nucleicos y/o proteínas virales o bacterianos, y/o membranas (por ejemplo, una membrana celular, una envoltura de lípido viral, etcétera) . Los vectores incluyen, pero no se limitan a, replicones (por ejemplo, replicones de ARN, bacteriófagos) a los que se pueden unir fragmentos de ADN, y se pueden llegar a replicar. Por consiguiente, los vectores incluyen, pero no se limitan a, ARN, ADN o ARN circular o lineal de auto-réplica autónoma (por ejemplo, plásmidos, virus, y similares, ver, por ejemplo, la patente US 5,217,879), e incluyen tanto los plásmidos de expresión como los que no son de expresión. Cuando se describe que un microorganismo o cultivo celular recombinante aloja a un "vector de expresión", éste incluye tanto ADN circular y lineal extra-cromosómico como ADN que se ha incorporado en los cromosomas del huésped. Cuando una célula huésped está manteniendo un vector, el vector puede ser establemente replicado por las células durante la mitosis como una estructura autónoma, o bien se incorpora dentro del genoma del huésped. Como se utiliza en la presente, el término "promotor" incluye todas las secuencias capaces de impulsar la transcripción de una secuencia de codificación en una célula, por ejemplo en una célula de planta. Por consiguiente, los promotores utilizados en las construcciones de la invención incluyen los elementos de control de transcripción de acción- cis, y las secuencias reguladoras que están involucradas en la regulación o modulación del tiempo y/o velocidad de transcripción de un gen. Por ejemplo, un promotor puede ser un elemento de control de transcripción de acción-cis, incluyendo un potenciador, un promotor, un terminador de transcripción, un origen de réplica, una secuencia de integración cromosómica, regiones no traducidas 5' y 3', o una secuencia intrónica, que estén involucrados en la regulación de la transcripción. Estas secuencias de acción-cis típicamente interactúan con las proteínas u otras biomoléculas para llevar a cabo (activar/desactivar, regular, modular, etcétera) la transcripción. Los promotores "constitutivos" son aquéllos que impulsan la expresión continuamente bajo la mayoría de las condiciones medio-ambientales y estados de desarrollo o de diferenciación celular. Los promotores "inducibles" o "regulables" dirigen la expresión del ácido nucleico de la invención bajo la influencia de las condiciones del medio ambiente o de las condiciones del desarrollo. Los ejemplos de las condiciones del medio ambiente que pueden afectar la transcripción por parte de los promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, sequía, o la presencia de luz. Los promotores "específicos del tejido" son elementos de control de transcripción que solamente son activos en células o tejidos u órganos particulares, por ejemplo en plantas o en animales. La regulación específica del tejido se puede lograr mediante ciertos factores intrínsecos que aseguran que se expresen los genes que codifican las proteínas específicas para un tejido dado. Se sabe que estos factores existen en mamíferos y en plantas para permitir que se desarrollen tejidos específicos . El término "planta" incluye plantas enteras, partes de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, flores, raíces, etcétera), protoplastos de plantas, semillas, y células de plantas, y la progenie e las mismas. La clase de plantas que se puede utilizar en el método de la invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas · superiores susceptibles a las técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), así como gimnospermas . Incluye las plantas de una variedad de niveles ploideos, incluyendo los estados poliploideo, diploideo, aploideo, y hemicigótico . Como se utiliza en la presente, el término "planta transgénica" incluye las plantas o células de plantas en las cuales se ha insertado una secuencia de ácido nucleico heteróloga, por ejemplo los ácidos nucleicos y las diferentes construcciones recombinantes (por ejemplo, casetes de expresión) de la invención. Los "plásmidos" pueden estar comercialmente disponibles, públicamente disponibles en una base no restringida, o se pueden construir a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con los procedimientos publicados. Los plásmidos equivalentes son aquéllos descritos en la presente como conocidos en la materia, y serán aparentes para el técnico ordinario. El término "gen" incluye una secuencia de ácido nucleico que comprende un segmento de ADN involucrado en la producción de un producto de transcripción (por ejemplo, un mensaje) , el cual a su vez se traduce para producir una cadena de polipéptido, o regula la transcripción genética, reproducción, o estabilidad. Los genes pueden incluir regiones precedentes y siguientes a la región codificante, tal como la delantera y la trasera, promotores y potenciadores , así como, cuando sea aplicable, las secuencias que intervengan (intrones) entre los segmentos codificantes individuales (exones) . Las frases "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" incluyen oligonucleótido, nucleótido, polinucleótido, o un fragmento de cualquiera de los mismos, ADN o ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt) de origen genómico o sintético, que pueden ser de una' sola cadena o de doble cadena, y pueden representar una cadena en sentido o anti-sentido, ácido nucleico peptídico (PNA) , o cualquier material tipo ADN o tipo ARN, de origen natural o sintético, incluyendo, por ejemplo, AR i , ribonucleoproteínas (por ejemplo, iRNPs) . El término abarca los ácidos nucleicos, es decir, los oligonucleótidos , que contengan análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término también abarca las estructuras tipo ácido nucleico con estructuras base sintéticas; ver, por ejemplo, Mata (1997) Toxicol. Appl . Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6 : 153-156. "Aminoácido" o "secuencia de aminoácidos" incluyen un oligopéptido, péptido, polipéptido, o secuencia de proteína, o un fragmento, porción, o subunidad de cualquiera de los mismos, y moléculas que se presenten naturalmente o sintéticas. Los términos "polipéptido" y "proteína" incluyen los aminoácidos unidos unos con otros por enlaces peptídicos, o por enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídicos, y pueden contener aminoácidos modificados diferentes de los 20 aminoácidos codificados por el gen. El término "polipéptido" también incluye péptidos y fragmentos de polipéptidos , motivos, y similares. El término también incluye polipéptidos glicosilados . Los péptidos y polipéptidos de la invención también incluyen todas las formas "miméticas" y "peptidomiméticas " , como se describen con mayor detalle más adelante. El término "aislado" incluye un material removido de su medio ambiente original, por ejemplo el medio ambiente natural si se presenta naturalmente. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que se presente naturalmente, que se encuentre en un animal vivo, no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o todos los materiales coexis-tentes en el sistema natural, está aislado. Estos polinucleótidos podrían ser parte de un vector, y/o estos polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y todavía estar aislados, porque ese vector o composición no sea parte de su medio ambiente natural. Como se utiliza en la presente, un material o composición aislada también puede ser una composición "purificada", es decir, no requiere de una pureza absoluta; más bien, se pretende como una definición relativa. Los ácidos nucleicos individuales obtenidos a partir de una biblioteca se pueden purificar convencionalmente hasta la homogeneidad electroforética . En los aspectos alternativos, la invención proporciona ácidos nucleicos que se han purificado a partir del ADN genómico, o a partir de otras secuencias de una biblioteca un otro medio ambiente por cuando menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, o más órdenes de magnitud. Como se utiliza en la presente, el término "recombinan-te" puede incluir los ácidos nucleicos adyacentes a un ácido nucleico de "estructura base" al que no están adyacentes en su medio ambiente natural. En un aspecto, los ácidos nucleicos representan el 5 por ciento o más del número de insertos de ácidos nucleicos en una población de "moléculas de estructura base" de ácidos nucleicos. "Moléculas de estructura base" de acuerdo con la invención, incluyendo los ácidos nucleicos tales como vectores de expresión, ácidos nucleicos de auto-réplica, virus, ácidos nucleicos de integración, y otros vectores o ácidos nucleicos utilizados para mantener o manipular un inserto de ácido nucleico de interés. En un aspecto, los ácidos nucleicos enriquecidos representan el 50 por ciento, el 51 por ciento, el 52 por ciento, el 53 por ciento, el 54 por ciento, el 55 por ciento, el 56 por ciento, el 57 por ciento, el 58 por ciento, el 59 por ciento, el 60 por ciento, el 61 por ciento, el 62 por ciento, el 63 por ciento, el 64 por ciento, el 65 por ciento, el 66 por ciento, el 67 por ciento, el 68 por ciento, el 69 por ciento, el 70 átomos de carbono, el 71 átomos de carbono, el 72 por ciento, el 73 por ciento, el 74 por ciento, el 75 por ciento, el 76 por ciento, el 77 por ciento, el 78 por ciento, el 79 por ciento, el 80 por ciento, el 81 por ciento, el 82 por ciento, el 83 por ciento, el 84 por ciento, el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o más del número de insertos de ácidos' nucleicos en la población de las moléculas de estructura base recombinantes. Polipéptidos o proteínas "recombinantes" se refieren a los polipéptidos o proteínas producidos mediante técnicas de ADN recombinante; por ejemplo, producidos a partir de células transformadas por una construcción de ADN exógena que codifique el polipéptido o la proteína deseada. Los polipéptidos o proteínas "sintéticos", son los preparados mediante síntesis química, como se describe con mayor detalle más adelante. Una secuencia promotora puede estar "operativamente enlazada a" una secuencia de codificación, cuando la polimerasa de ARN que inicie la transcripción en el promotor transcriba la secuencia de codificación en el ARNm, como se describe adicional -mente más adelante.
"Oligonucleótido" incluye ya sea un polidesoxinucleótido de una sola cadena, o bien dos cadenas complementarias de polidesoxinucleótido, que pueden sintetizarse químicamente. Estos oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato 5', y por lo tanto, no se ligarán a otro oligonucleotido sin agregar un fosfato con un ATP en la presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético puede ligarse a un fragmento que no se haya desfosfori-lado . La frase " sustancialmente idénticos", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos , puede referirse a dos o más secuencias que tengan, por ejemplo, una identidad (de secuencia) de nucleótidos o de residuos de aminoácidos de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, el 51 por ciento, el 52 por ciento, el 53 por ciento, el 54 por ciento, el 55 por ciento, el 56 por ciento, el 57 por ciento, el 58 por ciento, el 59 por ciento, el 60 por ciento, el 61 por ciento, el 62 por ciento, el 63 por ciento, el' 64 por ciento, el 65 por ciento, el 66 por ciento, el 67 por ciento, el 68 por ciento, el 69 por ciento, el 70 átomos de carbono, el 71 átomos de carbono, el 72 por ciento, el 73 por ciento, el 74 por ciento, el 75 por ciento, el 76 por ciento, el 77 por ciento, el 78 por ciento, el 79 por ciento, el 80 por ciento, el 81 por ciento, el 82 por ciento, el 83 por ciento, el 84 por ciento, el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o más, cuando son comparadas y alineadas para una máxima correspondencia, medida utilizando cualquier algoritmo de comparación de secuencias conocido, como se describe con detalle más adelante, o mediante inspección visual. En los aspectos alternativos, la invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos y de polipéptidos que tienen una identidad sustancial con una secuencia de ejemplo de la invención sobre una región de cuando menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más residuos, o una región en el intervalo desde entre aproximadamente 50 residuos y la longitud completa del ácido nucleico o polipéptido. Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención pueden ser sustancialmente idénticas sobre toda la longitud de una región codificante del polipéptido. Una secuencia de aminoácidos "sustancialmente idéntica" también puede incluir una secuencia que difiera de una secuencia de referencia por una o más sustituciones, supresiones, o inserciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, en particular cuando esta sustitución se presente en un sitio que no sea el sitio activo de la molécula, y en el entendido de que el polipéptido retenga esencialmente sus propiedades funcionales. Una sustitución de aminoácido conservadora, por ejemplo, sustituye un aminoácido por otro de la misma clase (por ejemplo, sustitución de un aminoácido hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina, o metionina, por otro, o sustitución de un aminoácido polar por otro, tal como sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina) . Uno o más aminoácidos se pueden suprimir, por ejemplo, de una aldolasa, dando como resultado la modificación de la estructura del polipéptido, sin alterar de una manera significativa su actividad biológica. Por ejemplo, se pueden remover los aminoácidos amino- o carboxi -terminales que no se requieran para la actividad de la aldolasa. "Hibridación" incluye el proceso mediante el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria a través de emparejamiento de bases. Las reacciones de hibridación pueden ser sensibles y selectivas, de tal manera que se puede identificar una secuencia particular de interés, inclusive en las muestras en donde esté presente en bajas concentraciones. Las condiciones restringentes se pueden definir, por ejemplo, por las concentraciones de sal o formamida en las soluciones de prehibri -dación y de hibridación, o por la temperatura de hibridación, y son bien conocidas en la materia. Por ejemplo, se puede aumentar la restringencia mediante la reducción de la concentración de sal, el aumento de la concentración de formamida, o la elevación de la temperatura de hibridación, la alteración del tiempo de hibridación, como se describe con detalle más adelante. En los aspectos alternativos, los ácidos nucleicos de la invención se definen por su capacidad para hibridarse bajo diferentes condiciones de restringencia (por ejemplo, alta, media, y baja), como se estipula en la presente. "Variante" incluye los polinucleótidos o polipéptidos de la invención modificados en uno o más pares de bases, codones, intrones, exones, o residuos de aminoácidos (respectivamente), y no obstante, todavía retienen la actividad biológica de una aldolasa de la invención. Las variantes se pueden producir mediante cualquier número de medios, incluyendo métodos tales como, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error, mezcla, mutagénesis dirigida al oligonucleótido, reacción en cadena de la polimerasa de ensamble, mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de cásete, mutagénesis de ensamble recursivo, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica del sitio, reénsamble de genes, GSS , y cualquier combinación de las mismas. Las técnicas para producir aldolasa variante que tenga actividad a un pH o temperatura, por ejemplo, que sea diferente de una aldolasa de tipo silvestre, se incluyen en la presente. El término "mutagénesis de saturación" o "GSSM", incluye un método que utiliza cebadores de oligonucleótidos degenerados para introducir mutaciones puntuales en un polinu-cleótido, como se describe con detalle más adelante. El término "sistema de evolución dirigida optimizada" o "evolución dirigida optimizada", incluye un método para reensamblar fragmentos de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas, por ejemplo genes relacionados, y como se explica con detalle más adelante. El término "reensamble de ligamiento sintético" o "SLR" incluye un método para ligar los fragmentos de oligonucleótidos en una forma no estocástica, y como se explica con detalle más adelante . Generación y Manipulación de Ácidos Nucleicos En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, el 51 por ciento, el 52 por ciento, el 53 por ciento, el 54 por ciento, el 55 por ciento, el 56 por ciento, el 57 por ciento, el 58 por ciento, el 59 por ciento, el 60 por ciento, el 61 por ciento, el 62 por ciento, el 63 por ciento, el 64 por ciento, el 65 por ciento, el 66 por ciento, el 67 por ciento, el 68 por ciento, el 69 por ciento, el 70 átomos de carbono, el 71 átomos de carbono, el 72 por ciento, el 73 por ciento, el 74 por ciento, el 75 por ciento, el 76 por ciento, el 77 por ciento, el 78 por ciento, el 79 por ciento, el 80 por ciento, el 81 por ciento, el 82 por ciento, el 83 por ciento, el 84 por ciento, el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o más, o completa (100 por ciento), con un ácido nucleico de ejemplo de la invención, sobre una región de cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1300, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 o más residuos. En un aspecto, el ácido nucleico codifica cuando menos un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, por ejemplo una actividad de alfa-aldolasa . Por ejemplo, la siguiente tabla describe algunos ácidos nucleicos que codifican aldolasa de ejemplo de la invención, por ejemplo, la invención proporciona una .aldolasa que tiene una secuencia como se estipula en la SEQ ID NO: 474, que tiene una secuencia de codificación de ejemplo como se estipula en la SEQ ID NO: 473, y en un aspecto, es codificada por un gen, incluyendo intrones y exones, que tiene una secuencia como se estipula en la SEQ ID NO: 467 (incluyendo los exones que tienen las secuencias estipuladas en las SEQ ID NO:468, SEQ ID NO:469, SEQ ID NO:470, SEQ ID NO:471, y SEQ ID NO:472); etcétera: Aldolasa SEQ ID NO: SEQ ID NO: de SEQ ID NO: de SEQ ID NO: de TOTAL del gen comsecuencias de la secuencia la secuencia pleto (exones exones de ADN de la de proteina de e intrones) secuencia de la secuencia codificación de codifica¬ (exones solación (exones mente) solamente) A 460,461 N/A 460 461 460,461 B 462 463 , 464 465 466 462-466 C 467 468-472 473 474 467-474 D 475 476-477 478 479 475-479 E 480 481-483 484 485 480-485 F 486 487-491 492 493 486-493 G 494 495-497 498 499 494-499 H 500 501-508 509 510 500-510 I 511 512-514 515 516 511-516 J 517,518 N/A 517 518 517-518 K 519 520-521 522 523 519-523 L 524 525-526 527 528 524-528 M 529 530-531 532 533 529-533 N 534 535-538 539 540 534-540 0 541 542-543 544 545 541-545 P 546 547-551 552 553 546-553 Q 554 555-557 558 559 554-559 R 560 561-564 565 566 560-566 S 587 588-592 593 594 587-594 Las aldolasas anteriormente enlistadas (descritas como A a S) y los ácidos nucleicos que las codifican, tienen una novedad común, en que inicialmente se aislaron/derivaron a partir de fuentes fúngicas. La invención también proporciona glucoaldolasas , tales como la enzima que tiene una secuencia como se estipula en la SEQ ID NO: 594, codificada por los 4111 residuos de la SEQ ID NO: 587 genómica, o el ADNc de 1854 residuos de largo de la SEQ ID NO: 593. La SEQ ID NO: 587 genómica comprende intrones y exones, y los exones se pueden describir por codificar fragmentos de polipéptido que tienen una secuencia como se estipula en las SEQ ID NO:588, SEQ ID NO:589, SEQ ID NO:590, SEQ ID NO:591, SEQ ID NO: 592. En un aspecto, la glucoaldolasa procesada "madura" consiste en los residuos 32 a 617 de la SEQ ID NO: 594. La invención proporciona ácidos nucleicos aislados y recombinante , incluyendo casetes de expresión, tales como vectores de expresión que codifican los polipéptidos de la invención. La invención proporciona sondas que comprenden o consisten en los ácidos nucleicos de la invención. La invención también incluye métodos para descubrir nuevas secuencias de aldolasa utilizando los ácidos nucleicos de la invención. La invención también incluye métodos para inhibir la expresión de los genes de aldolasa, transcripciones y polipéptidos, utilizando los ácidos nucleicos de la invención. También se proporcionan métodos para modificar los ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo, mediante reensamble de ligamiento sintético, sistema de evolución dirigida optimizada, y/o mutagénesis de saturación del sitio genético (GSSM) . Los ácidos nucleicos de la invención se pueden hacer, aislar, y/o manipular, por ejemplo, mediante clonación y expresión de bibliotecas de ADNc, amplificación de ADN de mensaje o genómico mediante reacción en cadena de la polimerasa, y similares. En la práctica de los métodos de la invención, los genes homólogos se pueden modificar mediante la manipulación de un ácido nucleico de plantilla, como se describe en la presente. La invención se puede practicar en conjunto con cualquier método o protocolo o dispositivo conocido en este campo, los cuales están bien descritos en la literatura científica y de patente. Técnicas Generales Los ácidos nucleicos utilizados para practicar esta invención, ya sean ARN, AR i , ácido nucleico anti- sentido, ADNc, ADN genómico, vectores, virus, o híbridos de los mismos, se pueden aislar a partir de una variedad de fuentes, se pueden diseñar genéticamente, amplificar, y/o expresar/generar de una manera recombinante . Los polipéptidos recombinantes generados a partir de estos ácidos nucleicos se pueden aislar o clonar individualmente, y se pueden probar para determinar una actividad deseada. Se puede utilizar cualquier sistema de expresión recombinante, incluyendo sistemas de expresión de células de bacterias, de mamífero, de levadura, de insecto, o de planta. De una manera alternativa, estos ácidos nucleicos se pueden sintetizar in vitro mediante técnicas de síntesis química bien conocidas, como se describen, por ejemplo, en Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radie. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett . 22:1859; patente US 4,458,066. Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, subclonación, sondas marcadoras (por ejemplo, marcado con cebador aleatorio utilizando polimerasa Klenow, traducción de apriete, amplificación) , secuenciación, hibridación, y similares, se describen bien en la literatura científica y de patente, ver, por ejemplo, Sambrook, editor, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (SEGUNDA EDICIÓN) , Volúmenes 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, editor John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHE-MISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Parte I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, editor Elsevier, N.Y. (1993) . Otro medio útil para obtener y manipular ácidos nucleicos utilizado para practicar los métodos de la invención, es clonar a partir de muestras genómicas, y si se desea, rastrear y volver a clonar los insertos aislados o amplificados, por ejemplo, a partir de clones genómicos o clones de ADNc . Las fuentes de ácido nucleico utilizadas en los métodos de la invención incluyen bibliotecas de ADNc o genómicas contenidas, por ejemplo, en los cromosomas artificiales de mamífero (MACs) , ver, por ejemplo, patentes US 5,721,118; y 6,025,155; cromosomas artificiales humanos, ver, por ejemplo, Rosenfeld (1997) Wat. Genet . 15:333-335; cromosomas artificiales de levadura (YAC); cromosomas artificiales bacterianos (BAC) ; cromosomas artificiales de Pl, ver, por ejemplo, Woon (1998) Genomics 50:306-316; vectores derivados de Pl (PACs) , ver, por ejemplo, Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; cósmidos, virus recombinantes , fagos, o plásmidos . En un aspecto, un ácido nucleico que codifique un polipéptido de la invención se ensambla en la fase apropiada con una secuencia líder capaz de dirigir la secreción del polipéptido traducido o el fragmento del mismo. La invención proporciona proteínas de fusión y ácidos nucleicos que las codifican. Un polipéptido de la invención se puede fusionar con un péptido o polipéptido heterólogo, tal como los péptidos de identificación N-terminal que imparten características deseadas, tal como una mayor estabilidad o una purificación simplificada. Los péptidos y polipéptidos de la invención también se puede sintetizar y expresar como proteínas de fusión con uno o más dominios adicionales enlazados a los mismos, por ejemplo, para producir un péptido más inmunogénico, para aislar más fácilmente un péptido recombinantemente sintetizado, para identificar y aislar anti -cuerpos y células B que expresen anticuerpos, y similares. Los dominios que facilitan la detección y purificación incluyen, por ejemplo, péptidos quelantes de metales, tales como los tramos de polihistidina y los módulos de histidina- riptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, los dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación por afinidad/extensión FLAGS (Immunex Corp. Seattle WA) . La inclusión de secuencias enlazadoras disociables, tales como el Factor Xa o la enteroqui-nasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre un dominio de purificación y el péptido o polipéptido que comprenda el motivo, facilitan la purificación. Por ejemplo, un vector de expresión puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifique al epítopo enlazada a seis residuos de histidina, seguida por una tio-redoxina y un sitio de disociación de enteroquinasa (ver, por ejemplo, Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr . Purif. 12:404-414) . Los residuos de histidina facilitan la detección y purificación, mientras que el sitio de disociación de enteroquinasa proporciona un medio para purificar el epítopo del resto de la proteína de fusión. La tecnología perteneciente a los vectores que codifican proteínas de fusión, y la aplicación de las proteínas de fusión, se describen bien en la literatura científica y de patente, ver, por ejemplo, Kroll (1993) DNA Cell.
Biol., 12:441-53. Secuencias de Control de Transcripción y de Traducción La invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) de la invención, operativamente enlazadas con secuencias de control de expresión (por ejemplo, de transcripción 0 de traducción), por ejemplo, promotores o potenciadores , para dirigir o modular la síntesis/expresión del ARN. La secuencia de control de expresión puede estar en un vector de expresión. Los promotores bacterianos de ejemplo incluyen lacl, lacZ, T3 , T7 , gpt, lambda PR, PL, y trp. Los promotores eucarióticos de ejemplo incluyen el CMV inmediato temprano, la quinasa de timidina de HSV, SV40 temprano. y tardío, LTRs de retrovirus, y metalotioneína 1 de ratón. Los promotores adecuados para expresar un polipéptido en bacterias incluyen los promotores lac o trp de E. coli, el promotor lacl, el promotor lacZ, el promotor T3 , el promotor T7 , el promotor gpt, el promotor lambda PR, el promotor lambda PL, los promotores a partir de operones que codifican enzimas glicolíticas , tales como quinasa de 3 - fosfoglicerato (PGK) , y el promotor de fosfatasa de ácido. Los promotores eucarióticos incluyen al promotor CMV inmediato temprano, al promotor de quinasa de timidina de HSV, los promotores de choque por calor, el promotor SV40 temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y el promotor de metalotioneína- I de ratón. También se pueden utilizar otros promotores que se sepa que controlan la expresión de genes en células procarióticas o eucarióticas , o sus virus. Promotores de Planta Específicos del Tejido La invención proporciona casetes de expresión que se pueden expresar de una manera específica del tejido, por ejemplo que pueden expresar una aldolasa de la invención de una manera específica del tejido. La invención también proporciona plantas o semillas que expresan una aldolasa de la invención de una manera específica del tejido. La especificidad del tejido puede ser específica de la semilla, específica del tallo, específica de la hoja, específica de la raíz, específica de la fruta, y similares . En un aspecto, se puede utilizar un promotor constitutivo, tal como el promotor CaMV 35S, para la expresión en partes específicas de la planta o la semilla, o a través de toda la planta. Por ejemplo, para la sobre-expresión, se puede emplear un fragmento de promotor de planta, el cual dirigirá la expresión de un ácido nucleico en algunos o todos los tejidos de una planta, por ejemplo una planta regenerada. Estos promotores son referidos en la presente como promotores "constitutivos", y son activos bajo la mayoría de las condiciones medio-ambientales y estados de desarrollo o de diferenciación celular. Los ejemplos de los promotores constitutivos incluyen la región de inicio de transcripción 35S del virus de mosaico de coliflor (CaMV) , el promotor 1' o 2' derivado a partir del ADN-t de Agrobacterium turnefaciens , y otras regiones de inicio de transcripción a partir de diferentes genes de plantas conocidos por los técnicos. Estos genes incluyen, por ejemplo, ACT11 de Arabidopsis (Huang (1996) Plant Mol. Biol . 33:125-139); Cat3 de Arabidopsis (GenBank No. U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251:196-203); el gen que codifica la proteína portadora de estearoílo-acilo , desaturasa, a partir de Brassica napus (GenBank No. X74782, Solocombe (1994) Plant. Physiol. 104:1167-1176); GPcl de maíz (GenBank No. X15596; Martínez (1989) J. Mol. Biol. 208:551-565); GPc2 de maíz (GenBank No. U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33:97-112); los promotores de plantas descritos en las patentes US 4,962,028 y 5,633,440. La invención utiliza promotores específicos del tejido o constitutivos derivados a partir de virus, los cuales pueden incluir, por ejemplo, el promotor subgenómico de tobamovirus (Kumagai (1995) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 92:1679-1683); el virus baciliforme de arroz tungro (RTBV) , el cual se replica solamente en las células de floema de las plantas de arroz infectadas, con su promotor que impulsa una fuerte expresión del gen reportero específico del floema; el promotor del virus de mosaico de vena de cassava (CV V) , con su actividad más alta en los elementos vasculares, en las células de mesófilo de las hojas, y en las puntas de las raíces (Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol . 31 : 1129-1139) . De una manera alternativa, el promotor de planta puede dirigir la expresión del ácido nucleico que expresa aldolasa en un tipo específico de tejido, órgano, o célula (es decir, promotores específicos del tejido) , o puede estar de otra manera bajo un control más preciso del medio ambiente o del desarrollo, o bajo el control de un promotor inducible. Los ejemplos de las condiciones medio-ambientales que pueden afectar la transcripción incluyen condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, la presencia de luz, o el rociado con productos químicos/hormonas. Por ejemplo, la invención incorpora al promotor inducible por sequía del maíz (Busk (1997) supra) ; el promotor inducible por frío, sequía, y alto contenido de sal de la papa (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33:897-909) . Los promotores específicos del tejido pueden promover la transcripción solamente dentro de cierto marco de tiempo de la etapa de desarrollo dentro de ese tejido. Ver, por ejemplo, Blazquez (1998) Plant Cell 10:791-800, que caracteriza el promotor del gen LEAFY de Arabidopsis . Ver también Cardón (1997) Plant J. 12:367-77, que describe el factor de transcripción SPL3, el cual reconoce un motivo de secuencia conservado en la región del promotor del gen de identidad de meristemo floral API de A. thaliana; y Mandel (1995) Plant Molecular Biology, Volumen 29, páginas 995-1004, que describe el promotor de meristemo eIF4. Se pueden utilizar promotores específicos del tejido que sean activos a través de todo el ciclo de vida de un tejido particular. En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención se enlazan operativamente con un promotor activo primordialmente sólo en las células de fibra de algodón. En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención se enlazan operativamente a un promotor activo primordialmente durante las etapas de elongación de la célula de la fibra de algodón, por ejemplo, como es descrito por Rinehart (1996) supra . Los ácidos nucleicos se pueden enlazar operativamente al promotor del gen Fbl2A, para expresarse de preferencia en las células de fibra de algodón (Ibid).. Ver también John (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5769-5773; John y colaboradores, patentes US 5,608,148 y 5,602,321, que describen promotores específicos de fibra de algodón, y métodos para la construcción de plantas de algodón transgénicas . También se pueden utilizar los promotores específicos de la raíz para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Los ejemplos de los promotores específicos de la raíz incluyen al promotor del gen de deshidrogenasa de alcohol (DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123:39-60) . Otros promotores que se pueden utilizar para expresar los ácidos nucleicos de la invención incluyen, por ejemplo, los promotores específicos del óvulo, específicos del embrión, específicos del endosperma, específicos del integumento, específicos del recubrimiento de la semilla, o alguna combinación de los mismos; un promotor específico de la hoja (ver, por ejemplo, Busk (1997) Plant J. 11:1285 1295, que describe un promotor específico de la hoja en el maíz) ; el promotor ORF13 de Agrobacterium rizogenes (que exhibe una alta actividad en las raíces, ver, por ejemplo, Hansen (1997) supra) ; un promotor específico del polen de maíz (ver, por ejemplo, Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet . 224:161-168); un promotor de jitomate activo durante la maduración de la fruta, senectud, y abscisión de las hojas, y hasta un menor grado, de las flores (ver, por ejemplo, Blume (1997) Plant J. 12:731-746); un promotor específico del pistilo del gen SK2 de la papa (ver, por ejemplo, Picker (1997) Plant Mol. Biol. 35:425-431); el gen Blec4 de chícharo, que es activo en el te ido epidérmico de los ápices del vástago florales y vegetativos de la alfalfa transgé-nica, que lo hacen una herramienta útil para dirigir la expresión de genes extraños hacia la capa epidérmica de los vástagos o las fibras que crecen activamente; el gen BEL1 específico del óvulo (ver, por ejemplo, Reiser (1995) Cell 83:735-742, GenBank No. U39944) ; y/o el promotor de Klee, patente US 5,589,583, que describe una región del promotor de planta que es capaz de conferir altos niveles de transcripción en el tejido meristemáti-co y/o en las células que se dividen rápidamente. De una manera alternativa, se utilizan promotores de plantas que sean inducibles al exponerse a hormonas de plantas, tales como auxinas, para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Por ejemplo, la invención puede utilizar el fragmento del promotor del elemento El de respuesta a auxina (AuxRes) de la semilla de soya (Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407); el promotor GST6 de Arabidopsis que responde a la auxina (que también responde al ácido salicílico y al peróxido de hidrógeno) (Chen (1996) Plant J. 10:955-966); el promotor parC inducible por auxina del tabaco (Sakai (1996) 37:906-913); un elemento de respuesta a biotina de planta (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937); y el promotor que responde al ácido abscísico de la hormona de tensión (Sheen (1996) Science 274 : 1900-1902) . Los ácidos nucleicos de la invención también se pueden enlazar operativamente a promotores de plantas que sean inducibles al exponerse a reactivos químicos que se puedan aplicar a la planta, tales como herbicidas o antibióticos. Por ejemplo, se puede utilizar el promotor In2-2 de maíz, activado por el herbicida de bencensulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577) ; la aplicación de diferentes aseguradores de herbicidas induce distintos patrones de expresión genética, incluyendo la expresión en la raíz, en los hidátodos, y en el meristemo apical del vástago. La secuencia de codificación puede estar bajo el control, por ejemplo, de un .promotor inducible por tetraciclina, por ejemplo como se describe con las plantas de tabaco transgénicas que contienen el gen de descarboxilasa de arginina de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473); o un elemento que responde al ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324) . Utilizando los promotores químicamente inducidos (por ejemplo, por hormonas o plaguicidas) , es decir, un promotor que responda a un producto químico, el cual se pueda aplicar a la planta transgénica en el campo, se puede inducir la expresión de un polipéptido de la invención en una etapa particular del desarrollo de la planta. Por consiguiente, la invención también proporciona plantas transgénicas que contienen un gen inducible que codifica los polipéptidos de la invención, cuyo intervalo de huéspedes está limitado a las especies de plantas objetivas, tales como cultivos de maíz, arroz, cebada, trigo, papa, u otros cultivos, inducibles en cualquier etapa de desarrollo del cultivo. Un técnico reconocerá que un promotor de planta específico del tejido puede impulsar la expresión de secuencias operativamente enlazadas en tejidos diferentes del tejido objetivo. Por lo tanto, un promotor específico del tejido es uno que impulsa la expresión de preferencia en el tejido o tipo de célula objetivo, pero también puede conducir a alguna expresión en otros tejidos.
Los ácidos nucleicos de la invención también se pueden enlazar operativamente a promotores de plantas que sean induci-bles al exponerse a reactivos químicos. Estos reactivos incluyen, por ejemplo, herbicidas, auxinas sintéticas, o antibióticos, que se pueden aplicar, por ejemplo, rociar, sobre las plantas transgénicas. La expresión inducible de los ácidos nucleicos productores de aldolasa de la invención permitirá que el cultivador seleccione las plantas con una proporción óptima de almidón/azúcar. De esta manera se puede controlar el desarrollo de las partes de las plantas. De este modo, la invención proporciona el medio para facilitar la cosecha de plantas y partes de plantas. Por ejemplo, en diferentes modalidades, se utiliza el promotor In2-2 de maíz, activado por los aseguradores de herbicidas de bencensulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577) ; la aplicación de diferentes aseguradores de herbicidas induce distintos patrones de expresión genética, incluyendo la expresión en la raíz, en los hidátodos, y en el meristemo apical del vástago. Las secuencias de codificación de la invención también están bajo el control de un promotor inducible por tetraciclina, por ejemplo, como se describe con las plantas de tabaco transgénicas que contienen el gen de descarbo-xilasa de arginina de Avena sativa L. (avena) ( asgrau (1997) Plant J. 11:465-473); o un elemento que responda al ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11: 1315-1324) . Si se desea una expresión apropiada del polipéptido, se debe incluir una región de poliadenilación en el extremo 3 ' 'de la región codificante. La región de poliadenilación se puede derivar a partir del gen natural, a partir de una variedad de otros genes de plantas, o a partir de genes en el ADN-T de Agrobacteria . Vectores de Expresión y Vehículos de Clonación La invención proporciona vectores de expresión y vehículos de clonación que comprenden los ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo, secuencias que codifican las aldolasas de la invención. Los vectores de expresión y los vehículos de clonación de la invención pueden comprender partículas virales, baculovirus, fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, fósmidos, cromosomas artificiales bacterianos, ADN viral (por ejemplo, vacuna, adenovirus, virus de varicela de aves de corral, pseudo-rabia, y derivados de SV40) , cromosomas artificiales basados en Pl, plásmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura, y cualesquiera otros vectores específicos para huéspedes específicos de interés (tales como bacillus , Aspergillus , y levadura) . Los vectores de la invención pueden incluir secuencias de ADN cromosómicas , no cromosómicas , y sintéticas. Los técnicos en este campo conocen grandes números de vectores adecuados, y están comercialmente disponibles. Los vectores de ejemplo incluyen: bacterianos: pQE (Qiagen) , plásmidos pBluescript, vectores pNH, (vectores lambda-ZAP (Stratagene) ) ; ptrc99a, pKK223-3; pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eucarióticos : pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3 , pBPV, p SG, pSVLSV40 (Pharmacia) . Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro plásmido o vector, siempre que se puedan replicar y sean viables en el huésped. Se pueden emplear vectores de un bajo número de copias o de un alto número de copias con la presente invención. El vector de expresión puede comprender un promotor, un sitio de enlace de ribosoma para el inicio de la traducción, y un terminador de transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Los vectores de expresión de mamífero pueden comprender un origen de réplica, cualesquiera sitios de enlace de ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios de donador y aceptor de empalme, secuencias de terminación de transcripción, y secuencias no transcrita de flanqueo 5'. En algunos aspectos, se pueden utilizar secuencias de ADN derivadas a partir del empalme SV40 y de los sitios de poliadenilación, para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos. En un aspecto, los vectores de expresión contienen uno o más genes marcadores seleccionables para permitir la selección de células huéspedes que contengan al vector. Estos marcadores seleccionables incluyen genes que codifican reductasa de dihidrofolato , o genes que confieren resistencia a la neomicina para un cultivo celular eucariótico, genes que confieren resistencia a la tetraciclina o a la ampicilina en E. coli, y el gen TRP1 de S. cerevisiae . Las regiones promotoras se pueden seleccionar a partir de cualquier gen deseado, utilizando vectores de transferasa de cloranfenicol (CAT) , u otros vectores con marcadores seleccionables . Los vectores para expresar el polipéptido o fragmento del mismo en células eucarióticas , también pueden contener potenciadores para aumentar los niveles de expresión. Los potenciadores son elementos de ADN de acción- cis, usualmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 300 pares de bases de longitud, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen al potenciador de SV40 sobre el lado tardío del origen de réplica de los pares de bases 100 a 270, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma sobre el lado tardío del origen de réplica, y los potenciadores de adenovirus . Se puede insertar una secuencia de ácido nucleico en un vector mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia se liga a la posición deseada en el vector en seguida de la digestión del inserto y el vector con endonucleasas de restricción apropiadas. De una manera alternativa, se pueden ligar los extremos romos tanto del inserto como del vector. En este campo se conocen una variedad de técnicas de clonación, por ejemplo, como se describen en Ausubel y Sambrook. Estos procedimientos y otros se consideran dentro del alcance de la experiencia en la materia. El vector puede estar en la forma de un plásmido, una partícula viral, o un fago. Otros vectores incluyen secuencias de ADN cromosómicas , no cromosómicas , y sintéticas, derivados de SV40; plásmidos bacterianos, ADN de fagos, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados a partir de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN viral tal como vacuna, adenovirus, virus de varicela de aves de corral, y pseudo-rabia . Una variedad de vectores de clonación y expresión para utilizarse con huéspedes procarióticos y eucarióticos son descritos, por ejemplo, por Sambrook. Los vectores bacterianos particulares que se pueden utilizar incluyen los plásmidos comercialmente disponibles, los cuales comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017) , pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) , GEMI (Promegá Biotec, Madison, WI , USA) , pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) , pDIO, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNHl8A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 y pCM7. Los vectores eucarióticos particulares incluyen pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3 , pBPV,pMSG, y pSVL (Pharmacia) . Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro vector, siempre que sea replicable y viable en la célula huésped. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden expresar en casetes de expresión, vectores, o virus, y se pueden expresar de una manera transitoria o estable en células y semillas de plantas. Un sistema de expresión transitoria de ejemplo utiliza sistemas de expresión episomal, por ejemplo el ARN viral del virus de mosaico de coliflor (CaMV) generado en el núcleo mediante la transcripción de un ADN super-enrollado que contiene mini- cromosoma episomal, ver, por ejemplo, Covey (1990) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 87:1633-1637. De una manera alternativa, se pueden insertar secuencias de codificación, es decir, todas o sub- fragmentos de secuencias de la invención, en un genoma de célula huésped de planta que llegue a ser una parte integral del ADN cromosómico del huésped. Las transcripciones en sentido o anti-sentido se pueden expresar de esta manera. Un vector que comprenda las secuencias (por ejemplo, promotores o regiones codificantes) de los ácidos nucleicos de la invención, puede comprender un gen marcador que confiera un fenotipo seleccionable a la célula de planta o a la semilla. Por ejemplo, el marcador puede codificar resistencia a biocidas, en particular resistencia a antibióticos, tal como resistencia a la kanamicina G418, bleomicina, higromicina, o resistencia a herbicidas, tal como resistencia al clorosulfurón o al Basta. Los vectores de expresión capaces de expresar ácidos nucleicos y proteínas en plantas son bien conocidos en la materia, y pueden incluir, por ejemplo, los vectores a partir de Agrobacterium spp. , virus X de papa (ver, por ejemplo, Angelí (1997) EMBO J. 16:3675-3684), virus de mosaico de tabaco (ver, por ejemplo, Casper (1996) Gene 173:69-73), virus de añublo de arbusto de jitomate (ver, por ejemplo, Hillman (1989) Virology 169:42-50), virus de añublo de tabaco (ver, por ejemplo, Dolja (1997) Virology 234:243-252), virus de mosaico dorado de frijol (ver, por ejemplo, Morinaga (1993) Microbíol Immunol. 37:471-476), virus de mosaico de coliflor (ver, por ejemplo, Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:1094-1101), elemento transpondible Ac/Ds de maíz (ver, por ejemplo, Rubín (1997) Mol. Cell. Biol. 17:6294-6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbíol . Immunol. 204:161-194) , y el elemento transpondible del supresor-mutador de maíz (Spm) (ver, por ejemplo, Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32:717-725); y derivados de los mismos. En un aspecto, el vector de expresión puede tener dos sistemas de réplica para permitirle mantenerse en dos organismos, por ejemplo en células mamífero o de insecto para la expresión, y en un huésped procariótico para la clonación y la amplificación. Adicionalmente , para integrar los vectores de expresión, el vector de expresión puede contener cuando menos una secuencia homologa al genoma de la célula huésped. Puede contener dos secuencias homologas que flanqueen la construcción de expresión. El vector de integración se puede dirigir hacia un locus específico en la célula huésped, mediante la selección de la secuencia homologa apropiada para incluirse en el vector. Las construcciones para los vectores de integración son bien conocidas en la materia. Los vectores de expresión de la invención también pueden incluir un gen marcador seleccionable para permitir la selección de cepas bacterianas que se hayan transformado, por ejemplo genes que hagan que la bacteria sea resistente a fármacos, tales como ampicilina, cloranfenicol , eritromicina , kanamicina, neomicina, y tetraciclina . Los marcadores seleccionables también pueden incluir genes biosinteticos, tales como aquéllos de las sendas biosintéticas de histidina, triptófano, y leucina. Células Huéspedes y Células Transformadas La invención también proporciona una célula transformada que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención, por ejemplo una secuencia que codifica una aldolasa de la invención, o un vector de la invención. La célula - huésped puede ser cualquiera de las células huéspedes familiares para los técnicos en este campo, incluyendo células procarióticas , células eucarióticas , tales como células bacterianas, células fúngicas, células de levadura, células de mamífero, células de insecto, o células de planta. Las células bacterianas de ejemplo incluyen E. coli, o cualesquiera de Streptomyces o Bacillus (por ejemplo, Bacillus cereus, Bacillus subtilis) , Salmonella typhimurium y diferentes especies dentro de los géneros de Bacillus , Streptomyces , y Staphylococcus . Las células de insecto de ejemplo incluyen Drosophila S2 y Spodoptera Sf9. Las células de animales de ejemplo incluyen CHO, COS, o melanoma de Bowes, o cualquier línea celular de ratón o humana. La selección de un huésped apropiado está dentro de la capacidad de los técnicos en la materia. Las técnicas para transformar una amplia variedad de especies de plantas superiores son bien conocidas, y se describen en la literatura técnica y científica. Ver, por ejemplo, Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477, patente US 5,750,870. El vector se puede introducir en las células huéspedes empleando cualquiera de una variedad de técnicas, incluyendo transformación, transfeccion, transducción, infección viral, pistolas genéticas, o transferencia genética mediada por Ti. Los métodos particulares incluyen transfeccion con fosfato de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación (Davis, L., Dibner, M . , Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986) ) . En un aspecto, los ácidos nucleicos o vectores de la invención se introducen en las células para el rastreo, y de esta manera, los ácidos nucleicos entran a las células de una forma adecuada para la expresión subsecuente del ácido nucleico. El método de introducción es en gran parte dictado por el tipo de célula dirigido. Los métodos de ejemplo incluyen precipitación con CaP04, fusión de liposoma, lipofección (por ejemplo, LIPOFECTIN) , electroporación, infección viral, etcétera. Los ácidos nucleicos candidatos se pueden integrar establemente en el genoma de la célula huésped (por ejemplo, con introducción retroviral) , o pueden existir ya sea de una manera transitoria o estable en el citoplasma (es decir, a través del uso de plásmidos tradicionales, utilizando secuencias reguladoras convencionales, marcadores de selección, etcétera) . Debido a que muchos rastreos farmacéuticamente importantes requieren de objetivos de células humanas o de mamífero modelo, se prefieren los vectores retrovirales capaces de transfectar estos objetivos. Cuando sea apropiado, las células huéspedes diseñadas se pueden cultivar en un medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes de la invención. En seguida de la transformación de una cepa huésped adecuada, y del crecimiento de la cepa huésped hasta una densidad celular apropiada, se puede inducir el promotor seleccionado por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) , y las células se pueden cultivar durante un período adicional para permitirles producir el polipéptido deseado o el fragmento del mismo. Las células se pueden cosechar mediante centrifugación, se pueden alterar mediante elementos físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se retiene para una purificación adicional . Las células microbianas empleadas para la expresión de proteínas se pueden alterar mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclo de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica, o uso de agentes de lisado celular. Estos métodos son bien conocidos por los técnicos en la materia. El polipéptido expresado o el fragmento del mismo se puede recuperar y purificar a partir de los cultivos de células recombinantes mediante métodos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol , extracción con ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía con interacción hidrofóbica, cromatografía por afinidad, cromatografía con hidroxilapatita , y cromatografía con lectina. Se pueden emplear pasos de repliegue de proteína, como sean necesarios, para llevar a cabo la configuración del polipéptido. Si se desea, se puede emplear cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) para los pasos de purificación finales. También se pueden emplear diferentes sistemas de cultivo celular de mamífero para expresar la proteína recombinante . Los ejemplos de los sistemas de expresión de mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono, y otras líneas celulares capaces de expresar proteínas a partir de un vector compatible, tales como las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Las construcciones de las células huéspedes se pueden utilizar de una manera convencional para producir el producto genético codificado por la secuencia recombinante. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos producidos por las células huéspedes que contengan al vector pueden estar glicosilados o pueden no estar glicosilados. Los polipéptidos de la invención pueden o no incluir también un residuo de aminoácido de metionina inicial .
También se pueden emplear sistemas de traducción sin células para producir un polipéptido de la invención. Los sistemas de traducción sin células pueden utilizar ARNms transcritos a partir de una construcción de ADN que comprenda un promotor operativamente enlazado a un ácido nucleico que codifique al polipéptido o fragmento del mismo. En algunos aspectos, la construcción de ADN se puede linearizar antes de conducir una reacción de transcripción in vitro. Luego se incuba el ARNm transcrito con un extracto de traducción sin células apropiado, tal como un extracto de reticulocitos de conejo, para producir el polipéptido deseado o el fragmento del mismo. Los vectores de expresión pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo genot pico para la selección de las células huéspedes transformadas, tales como reductasa de dihidrofolato o resistencia a la neomicina para un cultivo celular eucariótico, o tales como resistencia a la tetraciclina o a la ampicilina en E. coli. Amplificación de Ácidos Nucleicos En la práctica de la invención, los ácidos nucleicos de la invención y los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención, o los ácidos nucleicos modificados de la invención, se pueden reproducir mediante amplificación. También se puede utilizar la amplificación para clonar o modificar los ácidos nucleicos de la invención. Por consiguiente, la invención proporciona pares de secuencias cebadoras de amplificación para amplificar los ácidos nucleicos de la invención. Un técnico en la materia puede diseñar pares de secuencias cebadoras de amplificación para cualquier parte de, o la longitud completa de, estas secuencias. También se pueden utilizar reacciones de amplificación para cuantificar la cantidad de ácido nucleico en una muestra (tal como la cantidad de mensaje en una muestra celular) , para marcar el ácido nucleico (por ejemplo, para aplicarlo a un arreglo o a una mancha) , para detectar el ácido nucleico, o para cuantificar la cantidad de un ácido nucleico específico en una muestra. En un aspecto de la invención, se amplifica el mensaje aislado a partir de una célula o de una biblioteca de ADNc . El técnico puede seleccionar y diseñar cebadores de amplificación de oligonucleótidos adecuados. Los métodos de amplificación son bien conocidos en este campo, e incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, PCR (ver, por ejemplo, PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO ETHODS AND APPLICATIONS, editor Innis, Academic Press, N. Y. (1990) y PCR STRATEGIES (1995), editor Innis, Academic Press, Inc., N.Y., reacción en cadena de la ligasa (LCR) (ver, por ejemplo, Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117); amplificación de transcripción (ver, por ejemplo, Kwoh (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:1173); y réplica de secuencia auto-sostenida (ver, por ejemplo, Guatelli (1990) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87:1874); amplificación de replicasa Q Beta (ver, por ejemplo, Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35: 1477-1491) , ensayo de amplificación de replicasa Q-beta automatizado (ver, por ejemplo, Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271) y otras técnicas mediadas por polimerasa de ARN (por ejemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario) ; ver también Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel ; patentes US 4,683, 195 y 4,683,202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564. Determinación del Grado de Identidad de Secuencia La invención proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias que tienen una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, el 51 por ciento, el 52 por ciento, el 53 por ciento, el 54 por ciento, el 55 por ciento, el 56 por ciento, el 57 por ciento, el 58 por ciento, el 59 por ciento, el 60 por ciento, el 61 por ciento, el 62 por ciento, el 63 por ciento, el 64 por ciento, el 65 por ciento, el 66 por ciento, el 67 por ciento, el 68 por ciento, el 69 por ciento, el 70 átomos de carbono, el 71 átomos de carbono, el 72 por ciento, el 73 por ciento, el 74 por ciento, el 75 por ciento, el 76 por ciento, el 77 por ciento, el 78 por ciento, el 79 por ciento, el 80 por ciento, el 81 por ciento, el 82 por ciento, el 83 por ciento, el 84 por ciento, el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o más, o completa (100 por ciento) , con un ácido nucleico de ejemplo de la invención, sobre una región de cuando menos aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200,. 1250, 1300,' 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 o más residuos. La invención proporciona polipéptidos que comprenden secuencias que tienen una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, el 51 por ciento, el 52 por ciento, el 53 por ciento, el 54 por ciento, el 55 por ciento, el 56 por ciento, el 57 por ciento, el 58 por ciento, el 59 por ciento, el 60 por ciento, el 61 por ciento, el 62 por ciento, el 63 por ciento, el 64 por ciento, el 65 por ciento, el 66 por ciento, el 67 por ciento, el 68 por ciento, el 69 por ciento, el 70 átomos de carbono, el 71 átomos de carbono, el 72 por ciento, el 73 por ciento, el 74 por ciento, el 75 por ciento, el 76 por ciento, el 77 por ciento, el 78 por ciento, el 79 por ciento, el 80 por ciento, el 81 por ciento, el 82 por ciento, el 83 por ciento, el 84 por ciento, el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o más, o completa (100 por ciento) , con un polipéptido de ejemplo de la invención. El grado de identidad de secuencia (homología) se puede determinar utilizando cualquier programa de computadora y los parámetros asociados, incluyendo los descritos en la presente, tales como BLAST 2.2.2 o FASTA versión 3.0t78, con los parámetros por omisión . La Figura 35 es una gráfica que describe las características seleccionadas de los ácidos nucleicos y polipéptidos de ejemplo de la invención, incluyendo la comparación de identidad de secuencias de las secuencias de ejemplo con las bases de datos públicas. Todas las secuencias descritas en la Figura 35 se han sometido a una búsqueda de BLAST (como se describe con detalle más adelante) , contra dos conjuntos de bases de datos. El primer conjunto de base de datos está disponible a través de NCBI (National Center for Biotechnology Information) . Todos los resultados de las búsquedas contra estas bases de datos se encuentran en las columnas tituladas "descripción NR" , "código de acceso NR", "valorE NR", u "organismo NR" . "NR" se refiere a la base de datos de nucleotidos No Redundante mantenida por NCBI . Esta base de datos es un compuesto de GenBank, actualizaciones de GenBank, y actualizaciones de EMBL. Las anotaciones en la columna de "descripción NR" se refieren a la línea de definición en cualquier registro NCBI, que incluye una descripción de- la secuencia, tal como el organismo fuente, el nombre del gen/nombre de la proteína, o alguna descripción de la función de la secuencia. Las anotaciones en la columna de "Código de Acceso NR" se refieren al identificador único dado a un registro de secuencia. Las anotaciones en la columna de "ValorE NR" se refieren al valor Esperado (valorE) , que representa la probabilidad de que un puntaje de alineación sea tan bueno como el que se encuentra entre la secuencia pedida (las secuencias de la invención) y una secuencia de la base de datos, que se encontraría en el mismo número de comparaciones entre secuencias aleatorias como se hizo en la presente búsqueda BLAST. Las anotaciones en la columna de "Organismo NR" se refieren al organismo fuente de la secuencia identificada como el impacto BLAST más cercano. El segundo conjunto de bases de datos se conoce colectivamente como la base de datos Geneseq, que está disponible a través de Thomson Derwent (Philadelphia, Pennsylvania , Estados Unidos) . Todos los resultados de las búsquedas contra esta base de datos se encuentran en las columnas tituladas "Descripción de Proteína Geneseq", "Código de Acceso de Proteína Geneseq" , "ValorE de Proteína Geneseq" , "Descripción de ADN Geneseq", "Código de Acceso de ADN Geneseq", o "ValorE de ADN Geneseq" . La información que se encuentra en estas columnas es comparable con la información que se encuentra en las columnas NR descritas anteriormente, con la excepción de que se derivó a partir de las búsquedas BLAST contra la base de datos Geneseq, en lugar de las bases de datos NCBI . En adición, esta tabla incluye la columna "No. EC predicho" . Un número EC es el número asignado a un tipo de enzima de acuerdo con un esquema de nomenclatura de enzimas estandarizada, desarrollada por la Enzyme Commission of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB B) . Los resultados de la columna de "No. EC predicho" se determinan mediante una búsqueda BLAST contra la base de datos Kegg (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) . Si el emparejamiento BLAST superior tiene un valorE igual o menor que e~6, el número EC asignado al emparejamiento superior se anota en la tabla. El número EC del impacto superior se utiliza como una guía a lo que podría ser el número EC de la secuencia de la invención. Las columnas de "Longitud de ADN Pedido" y "Longitud de Proteína Pedida" se refieren el número de nucleótidos o al número de aminoácidos, respectivamente, en la secuencia de la invención, que se buscó o que se pidió, contra cualquiera de las bases de datos NCBI o Geneseq. Las columnas "Longitud de ADN Geneseq o NR" y "Longitud de Proteína Geneseq o NR" , se refieren al número de nucleótidos o al número de aminoácidos, respectivamente, en la secuencia del emparejamiento superior a partir de la búsqueda BLAST. Los resultados proporcionados en estas columnas son de la búsqueda que devolvió el valorE más bajo, ya sea a partir de las bases de datos NCBI o bien de la base de datos Geneseq. Las columnas de "%ID Proteína Geneseq o NR" y "%ID ADN Geneseq o NR" , se refieren al porcentaje de identidad de secuencia entre la secuencia de la invención y la secuencia del emparejamiento BLAST superior. Los resultados proporcionados en estas columnas son de la búsqueda que devolvió el valorE más bajo, ya sea a partir de las bases de datos NCBI o bien de la base de datos Geneseq. Las secuencias homologas también incluyen secuencias de ARN en donde las uridinas reemplazan a las timinas en las secuencias de ácidos nucleicos. Las secuencias homologas se pueden obtener utilizando cualquiera de los procedimientos descritos en la presente, o pueden resultar de la corrección de un error de secuenciación . Se apreciará que las secuencias de ácidos nucleicos estipuladas en la presente se pueden representar en el formato de un solo carácter tradicional (ver, por ejemplo, Stryer, Lubert . Biochemistry, Tercera Edición, W.H. Freeman & Co . , Nueva York), o en cualquier otro formato que registre la identidad de los nucleótidos en una secuencia. En este aspecto de la invención, se utilizan diferentes programas de comparación de secuencias identificados en la presente. Las identidades de secuencias de proteínas y/o de ácidos nucleicos (homologías) se pueden evaluar utilizando cualquiera de la variedad de algoritmos de comparación de secuencias y programas conocidos en la materia. Estos algoritmos y programas incluyen, pero no se limitan a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, y CLUSTAL (Pearson y Lipman, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 85 (8) -.2444-2448, 1988; Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215 (3) :403-410, 1990; Thompson y colaboradores, Nucleic Acids Res. 22 (2 ) : 4673 -4680 , 1994; Higgins y colaboradores, Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215 (3 ) : 403 -410 , 1990; Altschul y colaboradores , Nature Genetics 3:266-272, 1993). La homología o la identidad de secuencia se puede medir utilizando el software de análisis de secuencias (por ejemplo, el Paquete de Software de Análisis de Secuencias del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, I 53705) . Este software empareja secuencias similares asignando grados de homología a diferentes supresiones, sustituciones, y otras modificaciones. Los términos "homología" e "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos , se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que sean iguales o que tengan un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o de nucleótidos que sean iguales al compararse y alinearse para una máxima correspondencia sobre una ventana de comparación o una región designada como medida utilizando cualquier número de algoritmos de comparación de secuencias, o mediante alineación manual e inspección visual. Para la comparación de secuencias, una secuencia puede actuar como una secuencia de referencia, por ejemplo una secuencia de la invención, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en una computadora, se designan las coordenadas de la subsecuencia , si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Se pueden utilizar los parámetros del programa por omisión, o se pueden designar parámetros alternativos. Entonces el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia , de referencia, basándose en los parámetros del programa . Una "ventana de' comparación", como se utiliza en la presente, incluye la referencia a un segmento de cualquiera dé los números de residuos contiguos. Por ejemplo, en los aspectos alternativos de la invención, se comparan los residuos contiguos que estén en cualquier parte desde 20 hasta la longitud completa de una secuencia de polipéptido o ácido nucleico de ejemplo de la invención, con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de alinear óptimamente las dos secuencias. Si la secuencia de referencia tiene la identidad de secuencia requerida con una secuencia de polipéptido o ácido nucleico de ejemplo de la invención, por ejemplo una identidad de secuencia del 50 por ciento, del 51 por ciento, el 52 por ciento, el 53 por ciento, el 54 por ciento, el 55 por ciento, el 56 por ciento, el 57 por ciento, el 58 por ciento, el 59 por ciento, el 60 por ciento, el 61 por ciento, el 62 por ciento, el 63 por ciento, el 64 por ciento, el 65 por ciento, el 66 por ciento, el 67 por ciento, el 68 por ciento, el 69 por ciento, el 70 átomos de carbono, el 71 átomos de carbono, el 72 por ciento, el 73 por ciento, el 74 por ciento, el 75 por ciento, el 76 por ciento, el 77 por ciento, el 78 por ciento, el 79 por ciento, el 80 por ciento, el 81 por ciento, el 82 por ciento, el 83 por ciento, el 84 por ciento, el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o más, con una secuencia de la invención, esa secuencia está dentro del alcance de la invención. En las modalidades alternativas, se comparan subsecuencias en el intervalo de aproximadamente 20 a 600, de aproximadamente 50 a 200, y de aproximadamente 100 a 150, con una secuencia de referencia del mismo número de . posiciones contiguas, después de alinear óptimamente las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la materia. En los aspectos alternativos, se puede conducir una alineación óptima de secuencias para comparación, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl . Math. 2:482,1981, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante el método de búsqueda de similitudes de Person y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, mediante implementaciones computari zadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, I) , o mediante alineación manual e inspección visual. Otros algoritmos para determinar homología o identidad incluyen, por ejemplo, en adición al programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool en el National Center for Biological Information) , ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences) , AMPS (Protein Múltiple Sequence Alignment) , ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool) , BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node) , BLIMPS (BLocks IMProved Searcher) , FASTA, Intervals & Points, BMB , CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS , LCONSENSUS, WCONSENSUS , algoritmo de Smith-Waterman, DARWIN, algoritmo Las Vegas, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool) , Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package) , GAP (Global Alignment Program) , GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison) , LALIGN (Local Sequence Alignment) , LCP (Local Content Program) , MACAW (Múltiple Alignment Construction & Analysis Workbench) , MAP (Múltiple Alignment Program) , MBLKP , MBLKN, PIMA (Pattern-Induced Multi- sequence Alignment) , SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) y WHAT-IF. Estos programas de alineación también se pueden utilizar para rastrear bases de datos de genomas, con el fin de identificar secuencias de polinucleótidos que tengan secuencias sustancialmente idénticas. Hay un número de bases de datos de genomas disponibles, por ejemplo, una porción sustancial del genoma humano está disponible como parte del Proyecto de Secuenciación del Genoma Humano (Gibbs, 1995) . Se han secuenciado varios genomas , por ejemplo, M. genitalium (Fraser y colaboradores, 1995) , M. jannaschii (Bult y colaboradores, 1996) , H. influenzae (Fleischmann y colaboradores, 1995), E. coli (Blattner y colaboradores, 1997), y levadura (S. cerevisiae) (Mewes y colaboradores, 1997) , y D. melanogaster (Adams y colaboradores, 2000) . También se ha hecho un progreso, significativo en la secuenciación de los genomas del organismo modelo, tal como ratón, C. elegans y Arabidopsis sp. Las bases de datos que contienen información genómica anotada con alguna información funcional, son mantenidos por diferentes organizaciones, y están accesibles por medio de la Internet. Los algoritmos BLAST, BLAST 2.0, y BLAST 2.2.2, también se pueden utilizar para practicar la invención. Éstos se describen, por ejemplo, en Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol . 215:403-410. El software para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo involucra identificar primero pares de secuencias de alto puntaje (HSPs) , mediante la identificación de palabras cortas de una longitud W en la secuencia pedida, las cuales se emparejan o satisfacen algún puntaje T umbral de valor positivo cuando quedan alineadas con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T es referido como un umbral de puntaje de palabra vecina (Altschul (1990) supra) .
Estos impactos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas con el fin de encontrar HSPs más largos que las contengan. Los impactos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia por tanto como se pueda incrementar el puntaje de alineación acumulativo. Los puntajes acumulativos se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros (puntaje de recompensa para un par de residuos que se emparejan; siempre >0) . Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntaje para calcular el puntaje acumulativo. La extensión de los impactos de palabra en cada dirección se detiene cuando: el puntaje de alineación acumulativo cae fuera por la cantidad X de su máximo valor alcanzado; el puntaje acumulativo llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntaje negativo; o se llega al final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T, y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por omisión una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por omisión una longitud de palabra de 3, y expectativas (E) de 10, y la matriz de puntaje BLOSU 62 (ver Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89 : 10915) , alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873) . Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se presentaría por azar un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0.2, más preferiblemente menor que aproximadamente 0.01, y de una manera muy preferible menor que aproximadamente 0.001. En un aspecto, las homologías de secuencias de proteínas y de ácidos nucleicos se evalúan utilizando la Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST") . Por ejemplo, se pueden utilizar cinco programas BLAST específicos para llevar a cabo la siguiente tarea: (1) BLASTP y BLAST3 comparan una secuencia de aminoácidos pedida contra una base de datos de secuencias de proteínas; (2) BLASTN compara una secuencia de nucleótidos pedida contra una base de datos de secuencias de nucleótidos; (3) BLASTX compara los productos de traducción conceptuales de seis marcos de una secuencia de nucleótidos pedida (ambas cadenas) contra una base de datos de secuencias de proteínas; (4) TBLASTN compara una secuencia de proteína pedida contra una base de datos de secuencias de nucleotidos traducida en los seis marcos de lectura (ambas cadenas) ; y (5) TBLASTX compara las traducciones de seis marcos de una secuencia de nucleotidos pedida contra las traducciones de seis marcos de una base de datos de secuencias de nucleotidos. Los programas BLAST identifican secuencias homologas mediante la identificación de segmentos similares, los cuales son referidos en la presente como "pares de segmentos de alto puntaje", entre una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico pedida, y una secuencia de prueba, que de preferencia se obtiene a partir de una base de datos de secuencias de proteínas o de ácidos nucleicos. Los pares de segmentos de alto puntaje de preferencia se identifican (es decir, se alinean) por medio de una matriz de puntaje, muchas de las cuales son conocidas en la materia. De preferencia, la matriz de puntaje utilizada es la matriz BLOSUM62 (Gonnet y colaboradores, Science 256:1443-1445, 1992; Henikoff y Henikoff, Proteins 17:49-61, 1993) . De una manera menos preferible, también se pueden utilizar las matrices PAM o PAM250 (ver, por ejemplo, Schwartz y Dayhoff, editores, 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships : Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation) . En un aspecto de la invención, con el fin de determinar si un ácido nucleico tiene la identidad de secuencia requerida para estar dentro del alcance de la invención, se utilizan los programas NCBI BLAST 2.2.2, con las opciones por omisión en blastp. Hay aproximadamente 38 opciones de establecimiento en el programa BLAST 2.2.2. En este aspecto de ejemplo de la invención, se utilizan todos los valores por omisión, excepto por el establecimiento de filtración por omisión (es decir, todos los parámetros se establecen por omisión, excepto la filtración, que se establece en DESACTIVADA) ; . en su lugar, se utiliza un establecimiento de "-F F", que deshabilita la filtración. El uso de la filtración por omisión con frecuencia da como resultado violaciones de Karlin-Altschul , debido a la corta longitud de la secuencia. Los valores por omisión utilizados en este aspecto de ejemplo de la invención, y para determinar los valores de la Figura 35, como se describe en lo anterior, incluyen: "Filtro para baja complejidad: ACTIVADO Tamaño de Palabra: 3 Matriz: BLOSUM62 Costos de Huecos: Existencia: 11 Extensión : 1 " . Otros establecimientos por omisión pueden ser: filtro para baja complejidad DESACTIVADO, tamaño de palabra de 3 para proteína, matriz BLOSUM62, multa por existencia de hueco de -11, y una multa por extensión de hueco de -1'. Un establecimiento del programa NCBI BLAST 2.2.2 de ejemplo tiene la opción "-W" por omisión en cero. Esto significa que, si no se establece, el tamaño de palabra da por omisión en 3 para las proteínas, y en 11 para los nucleótidos. Sistemas de Computación y Productos de Programas de Computadora Con el fin de determinar e identificar las identidades de secuencias, las homologías estructurales, los motivos, y similares, in silico, la secuencia de la invención se puede almacenar, registrar, y manipular en cualquier medio que pueda ser leído y accesado por una computadora. De conformidad con lo anterior, la invención proporciona computadoras, sistemas de computación, medios legibles por computadora, productos de programas de computadora, y similares, registrados o almacenados en los mismos con las secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención. Como se utilizan en la presente, las palabras "registrado" y "almacenado", se refieren a un proceso para almacenar información en un medio de computación. Un técnico puede adoptar fácilmente cualquier método conocido para registrar información en un medio legible por computadora, con el fin de generar manufacturas que comprendan una o más de las secuencias de ácidos nucleicos y/o polipéptidos de la invención. Otro aspecto de la invención es un medio legible por computadora que tiene registrada en el mismo cuando menos una secuencia de ácido nucleico y/o polipéptido de la invención. Los medios legibles por computadora incluyen medios magnéticamente legibles, medios ópticamente legibles, medios electrónicamente legibles, y medios magnéticos/ópticos. Por ejemplo, el medio legible por computadora puede ser un disco duro, un disco flexible, una cinta magnética, CD-ROM, Disco Versátil Digital (DVD) , Memoria de Acceso Aleatorio (RAM) , o Memoria de Sólo Lectura (ROM) , así como otros tipos de otros medios conocidos por los técnicos en este campo. Los aspectos de la invención incluyen sistemas (por ejemplo, sistemas basados en Internet) , en particular sistemas de computación, que almacenan y manipulan las secuencias y la información de secuencias descrita en la presente. Un ejemplo de un sistema de computación 100 se ilustra en el diagrama de bloques de la Figura 1, como se utiliza en la presente, "un sistema de computación" se refiere a los componentes de hardware, los componentes de software, y los componentes de almacenamiento de datos utilizados para analizar una secuencia de nucleotidos o de polipéptidos de la invención. El sistema de computación 100 puede incluir un procesador para procesar, accesar, y manipular los datos de secuencia. El procesador 105 puede ser cualquier tipo bien conocido de unidad de procesamiento central, tal como, por ejemplo, el Pentium III de Intel Corporation, o un procesador similar de Sun, Motorola, Compaq, AMD, o International Bussines Machines. El sistema de computación 100 es un sistema para propósitos generales que comprende el procesador 105 y uno o más componentes de almacenamiento de datos internos 110 para almacenar datos, y uno o más dispositivos de recuperación de datos para recuperar los datos almacenados en los componentes de almacenamiento de datos. Un técnico puede apreciar fácilmente que es adecuado cualquiera de los sistemas de computación actualmente disponibles . En un aspecto, el sistema de computación 100 incluye un procesador 105 conectado a una barra colectora que se conecta a una memoria principal 115 (de preferencia implementada como una RAM) , y uno o más dispositivos de almacenamiento de datos internos 110, tal como un disco duro y/u otro medio legible por computadora que tenga datos registrados en el mismo. El sistema de computación 100 puede incluir además uno o más dispositivos de recuperación de datos 118, para leer los datos almacenados en los dispositivos de almacenamiento de datos internos 110. El dispositivo de recuperación de datos 118 puede representar, por ejemplo, una unidad de disco flexible, una unidad de disco compacto, una unidad de cinta magnética, o un módem capaz de conectarse a un sistema de almacenamiento de datos remoto (por ejemplo, por medio de la Internet), etcétera. En algunas modalidades, el dispositivo de almacenamiento de datos interno 110 es un medio legible por computadora removible, tal como un disco flexible, un disco compacto, una cinta magnética, etcétera, que contenga la lógica de control y/o los datos registrados en el mismo. El sistema de computación 100 puede incluir convenientemente, o se puede programar mediante el software apropiado para leer la lógica de control y/o los datos a partir del componente de almacenamiento de datos una vez insertado en el dispositivo de recuperación de datos. El sistema de computación 100 incluye un despliegue visual 120 que se utiliza para exhibir la salida a un usuario de la computadora. También se debe observar que el sistema de computación 100 se puede enlazar a otros sistemas de computación 125a-c en una red, o en una red de área amplia, para proporcionar un acceso centralizado al sistema de computación 100. El software para accesar y procesar las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos de la invención puede residir en la memoria principal 115 durante la ejecución. En algunos aspectos, el sistema de computación 100 puede comprender además un algoritmo de comparación de secuencias para comparar una secuencia de ácido nucleico de la invención. El algoritmo y las secuencias se pueden almacenar en un medio legible por computadora. Un "algoritmo de comparación de secuencias" se refiere a uno o más programas que se implementan (localmente o remotamente) en el sistema de computación 100, para comparar una secuencia de nucleótidos con otras secuencias de nucleótidos y/o compuestos almacenados dentro de un elemento de almacenamiento de datos. Por ejemplo, el algoritmo de comparación de secuencias puede comparar las secuencias de nucleótidos de la invención almacenadas en un medio legible por computadora, con las secuencias de referencia almacenadas en un medio legible por computadora, para identificar las homologías o los motivos estructurales . Los parámetros utilizados con los algoritmos anteriores se pueden adaptar dependiendo de la longitud de la secuencia y del grado de homología estudiado. En algunos aspectos, los parámetros pueden ser los parámetros por omisión utilizados por los algoritmos en ausencia de instrucciones del usuario. La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 200 para comparar una secuencia de nucleótidos o de proteína nueva, con una base de datos de secuencias, con el objeto de determinar los niveles de homología entre la secuencia nueva y las secuencias de la base de datos. La base de datos de secuencias puede ser una base de datos privada almacenada dentro del sistema de computación 100, o una base de datos pública, tal como GENBA K, que está disponible a través de la Internet . El proceso 200 empieza en un estado de inicio 201, y luego se mueve hasta un estado 202, en donde se almacena la nueva secuencia que se vaya a comparar en una memoria de un sistema de computación 100. Como se describió en lo anterior, la memoria podría ser cualquier tipo de memoria, incluyendo una RAM o un dispositivo de almacenamiento interno. Luego el proceso 200 se mueve hasta un estado 204, en donde se abre una base de datos de secuencias para el análisis y la comparación. Luego el proceso 200 se mueve hasta un estado 206, en donde se lee la primera secuencia almacenada en la base de datos en una memoria de la computadora. Luego se lleva a cabo una comparación en un estado 210, para determinar si la primera secuencia es igual que la segunda secuencia. Es importante observar que este paso no está limitado a llevar a cabo una comparación exacta entre la nueva secuencia y la primera secuencia de la base de datos. Los métodos bien conocidos son sabidos por los técnicos en la materia para comparar dos secuencias de nucleótidos o de proteínas, inclusive cuando no sean idénticas. Por ejemplo, se pueden introducir huecos en_ una secuencia con el objeto de elevar el nivel de homología entre las dos secuencias probadas. Los parámetros que controlan si se introducen huecos u otras características en una secuencia durante la comparación, normalmente son introducidos por el usuario del sistema de computación. Una vez que se ha llevado a cabo una comparación de las dos secuencias en el estado 210, se hace una determinación, en el estado de decisión 210, de si las dos secuencias son iguales. Por supuesto, el término "iguales" no se limita a secuencias que sean absolutamente idénticas. Las secuencias que estén dentro de los parámetros de homología introducidos por el usuario, se marcarán como "iguales" en el proceso 200. Si se hace una determinación de que las dos secuencias son iguales, el proceso 200 se mueve hasta el estado 214, en donde se exhibe el nombre de la secuencia a partir de la base de datos ante el usuario. Este estado notifica al usuario que la secuencia con el nombre exhibido satisface las limitaciones de homología que se introdujeron. Una vez que se exhibe el nombre de la secuencia almacenada para el usuario, el proceso 200 se mueve hasta un estado de decisión 218, en donde se hace una determinación de si existen más secuencias en la base de datos. Si no existen más secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 termina en el estado de fin 220. Sin embargo, si existen más secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 se mueve hasta el estado 224, en donde se mueve un cursor hasta la siguiente secuencia de la base de datos, de tal manera que se puede comparar con la nueva secuencia. De esta manera, la nueva secuencia se alinea y se compara con cada secuencia de la base de datos. Se debe observar que, si se hubiera hecho una determinación en el estado de decisión 212 de que las secuencias no eran homologas, entonces el proceso 200 se movería inmediatamente hasta el estado de decisión 218, con el objeto.de determinar si estuvieron disponibles cualesquiera otras secuencias en la base de datos para la comparación. De conformidad con lo anterior, un aspecto de la invención es un sistema de computación que comprende un procesador, un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene almacenada en el mismo una secuencia de ácido nucleico de la invención, y un comparador de secuencias para conducir la comparación. El comparador de secuencias puede indicar un nivel de homología entre las secuencias comparadas, o identificar los motivos estructurales, o puede identificar los motivos estructurales en las secuencias que se comparen con estos códigos de ácidos nucleicos y códigos de polipéptidos . La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra una modalidad de un proceso 250 en una computadora para determinar si dos secuencias son homologas. El proceso 250 empieza en un estado de inicio 252, y luego se mueve hasta un estado 254, en donde se almacena en una memoria una primera secuencia que se vaya a comparar. La segunda secuencia que se vaya a comparar se almacena entonces en una memoria en el estado 256. Luego el proceso 250 se mueve hasta el estado 260, en donde se lee el primer carácter de la primera secuencia, y luego hasta un estado 262 en donde se lee el primer carácter de la segunda secuencia. Se debe entender que, si la secuencia es una secuencia de nucleótidos, entonces el carácter normalmente sería cualquiera de A, T, C, G, o U. Si la secuencia es una secuencia de proteína, entonces puede ser un código de aminoácido de una sola letra, de tal manera que se pueden comparar fácilmente las primeras y siguientes secuencias. Luego se hace una determinación, en el estado de decisión 264, de si los dos caracteres son iguales. Si son iguales, entonces el proceso 250 se mueve hasta el estado 268, en donde se leen los siguientes caracteres de las primera y segunda secuencias. Entonces se hace una determinación de si los siguientes caracteres son iguales. Si lo son, entonces el proceso 250 continúa este ciclo hasta que dos caracteres no sean iguales. Si se hace una determinación de que los siguientes dos caracteres no son iguales, el proceso 250 se mueve hasta el estado de decisión 274, para determinar si hay más caracteres qué leer de cualquier secuencia. Si no hay más caracteres para leer, entonces el proceso 250 se mueve hasta el estado 276, en donde se exhibe el nivel de homología entre las primera y segunda secuencias para -el usuario. El nivel de homología se determina calculando la proporción de caracteres entre las secuencias que fueron iguales del número total de secuencias en la primera secuencia. Por consiguiente, si cada carácter de la primera secuencia de 100 nucleótidos se alinea con cada carácter de una segunda secuencia, el nivel de homología sería del 100 por ciento. De una manera alternativa, el programa de computadora puede comparar una secuencia de referencia con una secuencia de la invención, para determinar si las secuencias difieren en una o más posiciones. El programa puede registrar la longitud e identidad de los nucleótidos o residuos de aminoácidos insertados, suprimidos, o sustituidos, con respecto a la secuencia ya sea de la referencia o de la invención. El programa de computadora puede ser un programa que determine si una secuencia de referencia contiene un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) con respecto a una secuencia de la invención, o si una secuencia de la invención comprende un polimorfismo de un solo nucleótido de una secuencia conocida. Por consiguiente, en algunos aspectos, el programa de computadora es un programa que identifica los polimorfismos de un solo nucleótido. El método se puede implementar mediante los sistemas de computación descritos anteriormente y el método ilustrado en la Figura 3. El método se puede llevar a cabo leyendo una secuencia de la invención y las secuencias de referencia, a través del uso del programa de computadora, e identificando las diferencias con el programa de computadora . En otros aspectos, el sistema basado en computadora comprende un identificador para identificar las características dentro de un ácido nucleico o polipéptido de la invención. Un " identificador" se refiere a uno o más programas que identifican ciertas características dentro de una secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un identificador puede comprender un programa que identifique un marco de lectura abierta (ORF) en una secuencia de ácido nucleico. La Figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso identificador 300 para detectar la presencia de una característica en una secuencia. El proceso 300 empieza en un estado de inicio 302, y luego se mueve hasta un estado 304, en donde se almacena una primera secuencia que se vaya a verificar para determinar sus características, en la memoria 115 del sistema de computación 100. Entonces el proceso 300 se mueve hasta el estado 306, en donde se abre una base de datos de características de secuencias. Esta base de datos incluiría una lista de atributos de cada característica junto con el nombre de la característica. Por ejemplo, un nombre de característica podría ser "Codón de Inicio", y el atributo sería "ATG" . Otro ejemplo sería el nombre de característica "Cuadro TAATAA" , y el atributo de la característica sería "TAATAA" . Un ejemplo de esta base de datos es presentado por el University of Wisconsin Genetics Computer Group. De una manera alternativa, las características pueden ser motivos de polipéptidos estructurales, tales como hélices alfa, hojas beta, o motivos de polipéptido funcionales, tales como sitios activos enzimáticos, motivos de hélice-vuelta-hélice, u otros motivos conocidos por los técnicos en la materia. Una vez que se abre la base de datos de características en el estado 306, el proceso 300 se mueve hasta el estado 308, en donde se lee la primera característica a partir de la base de datos. Entonces se hace una comparación del atributo de la primera característica con la primera secuencia en el estado 310. Luego se hace una determinación, en el estado de decisión 316, de si el atributo de la característica se encontró en la primera secuencia. Si se encontró el atributo, entonces el proceso 300 se mueve hasta el estado 318, en donde se exhibe el nombre de la característica encontrada para el usuario. Luego el proceso 300 se mueve hasta el estado de decisión 320, en donde se hace una determinación de si existen características para mover en la base de datos. Si no existen más características, entonces el proceso 300 termina en un estado de fin 324. Sin embargo, si existen más características en la base de datos, entonces el proceso .300 lee la siguiente característica de la secuencia en el estado 326, y cicla de regreso hasta el estado 310, en donde se compara el atributo de la siguiente característica contra la primera secuencia. Si el atributo de la característica no se encuentra en la primera secuencia en el estado de decisión 316, el proceso 300 se mueve directamente hasta el estado de decisión 320, con el objeto de determinar si existen más características en la base de datos. Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un programa de computadora que identifica marcos de lectura abierta (ORFs) . Una secuencia de polipéptido o de ácido nucleico de la invención se puede almacenar y manipular en una variedad de programas procesadores de datos y en una variedad de formatos. Por ejemplo, una secuencia se puede almacenar como texto en un archivo de procesamiento de palabras, tal como MicrosoftWORD o WORDPERFECT, o como un archivo ASCII, en una variedad de programas de bases de datos familiares para los técnicos en este campo, tales como DB2 , SYBASE, u ORACLE. En adición, se pueden utilizar muchos programas de computadora y bases de datos como algoritmos de comparación de secuencias, identificadores , o fuentes de secuencias de nucleótidos o de secuencias de polipéptidos de referencia, para compararse con una secuencia de ácido nucleico de la invención. Los programas y bases de datos utilizados para practicar la invención incluyen, pero no se limitan a: MacPattern (EMBL) , DiscoveryBase (Molecular Applications Group) , GeneMine (Molecular Applications Group) , Look (Molecular Applications Group) , MacLook (Molecular Applications Group) , BLAST y BLAST2 (NCBI) , BLASTN y BLASTX (Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol . 215:403, 1990), FASTA (Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85:2444, 1988), FASTDB (Brutlag y colaboradores, Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990), Catalyst (Molecular Simulations Inc.), Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc. ), Cerius2. DBAccess (Molecular Simulations Inc.), HypoGen (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations Inc.), Discover (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Félix (Molecular Simulations Inc.), DelPhi, (Molecular Simulations Inc.), QuanteMM, (Molecular Simulations Inc.), Homology (Molecular Simulations Inc.), Modeler (Molecular Simulations Inc.), ISIS (Molecular Simulations Inc.),. Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WebLab (Molecular Simulations Inc.), WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.), SeqFold (Molecular Simulations Inc.), la base de datos MDL Available Chemicals Directory, la base de datos MDL Drug Data Report , la base de datos Comprehensive Medicinal- Chemistry, la base de datos Derwent ' s World Drug Index, la base de datos BioByteMasterFile , la base de datos Genbank, y la base de datos Genseqn. Muchos otros programas y bases de datos serían aparentes para un técnico en la materia, dada la presente divulgación. Los motivos que se pueden detectar utilizando los programas anteriores incluyen las secuencias que codifican cremalleras de leucina, motivos de hélice-vuelta-hélice, sitios de glicosilación, sitios de ubiquitinación, hélices alfa, y hélices beta, secuencias de señales que codifiquen péptidos de señales que dirijan la secreción de las proteínas codificadas, secuencias implicadas en la regulación de la transcripción, tales como homeocuadros , estiramientos ácidos, sitios activos enzimáticos, sitios de enlace de sustrato, y sitios de disociación enzimática. Hibridación de Ácidos Nucleicos La invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que se hibridan bajo condiciones restringentes a una secuencia de ejemplo de la invención, o un ácido nucleico que codifique un polipéptido de la invención. Las condiciones restringentes pueden ser condiciones altamente restringentes, condiciones medianamente restringentes, o condiciones de restringencia baja, incluyendo las condiciones de restringencia alta y reducida descritas en la presente. En un aspecto, es la restringencia de las condiciones de lavado la que estipula las condiciones que determinan si un ácido nucleico está dentro del alcance de la invención, como se describe más adelante. En las modalidades alternativas, los ácidos nucleicos de la invención, como se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones restringentes, pueden ser de entre aproximadamente 5 residuos y la longitud completa del ácido nucleico de la invención; por ejemplo, pueden ser de cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más residuos de longitud. También se incluyen ácidos nucleicos más cortos que la longitud completa.
Estos ácidos nucleicos pueden ser útiles, por ejemplo, como sondas de hibridación, sondas de marcado, sondas de oligonucleótidos de reacción en cadena de la polimerasa, ARNi , péptidos anti-sentido o de enlace de anti-cuerpos que codifiquen las secuencias (epítopos) , motivos, sitios activos, y similares. En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención se definen por su capacidad para hibridarse bajo alta restringencia, que comprende condiciones de aproximadamente el 50 por ciento de formamida a aproximadamente 37°c a 42°C. En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención se definen por su capacidad para hibridarse bajo una restringencia reducida que comprende condiciones de aproximadamente el 35 por ciento al 25 por ciento de formamida, a aproximadamente 30°C a 35°C. De una manera alternativa, los ácidos nucleicos de la invención se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de alta restringencia que comprenden a 42°C en el 50 por ciento de formamida, SSPE 5X, SDS al 0.3 por ciento, y un ácido nucleico de bloqueo de secuencia repetitivo, tal como cot-1 o ADN de esperma de salmón (por ejemplo, 200 nanogramos/ml de ADN de esperma de salmón desgarrado y desnaturalizado) . En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de restringencia reducida que comprenden el 35 por ciento de formamida a una temperatura de 35oC. Enseguida de la hibridación, el filtro se puede lavar con ssc 6x, SDS al 0.5 por ciento, a 50°C. Estas condiciones se consideran como condiciones "moderadas" arriba del 25 por ciento de formamida', y como condiciones "bajas" debajo del 25 por ciento de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderada" es cuando la hibridación anterior se conduce con el 30 por ciento de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "baja restringencia" es cuando la hibridación anterior se conduce con el 10 por ciento de formamida. El intervalo de temperatura correspondiente a un nivel particular de restringencia se puede estrechar adicionalmente calculando la proporción de la purina a la pirimidina del ácido nucleico de interés, y ajustando la temperatura de conformidad con lo mismo. Los ácidos nucleicos de la invención también se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de restringencia alta, media, y baja, como se estipula en Ausubel y Sambrook. Las variaciones sobre los intervalos y condiciones anteriores son bien conocidas en la materia. Las condiciones de hibridación se discuten adicionalmente más adelante. El procedimiento anterior se puede modificar para identificar los ácidos nucleicos que tengan niveles decrecientes de homología con la secuencia de sonda. Por ejemplo, con el fin de obtener ácidos nucleicos de una homología decreciente con la secuencia detectable, se pueden emplear condiciones menos restringentes . Por ejemplo, la temperatura de hibridación se puede reducir en incrementos de 5°C desde 68°C hasta 42°C en un regulador de hibridación que tenga una concentración de Na+ de aproximadamente 1M. En seguida de la hibridación, el filtro se puede lavar con SSC 2X, SDS al 0.5 por ciento, a la temperatura de la hibridación. Estas condiciones se consideran como condiciones "moderadas" arriba de 50°C, y como condiciones "bajas" debajo de 50°C. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderada", es cuando la hibridación anterior se conduce a 55°C. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "baja restringencia" es cuando la hibridación anterior se conduce a 45°C. De una manera alternativa, la hibridación se puede llevar a cabo en reguladores, tales como SSC 6X, conteniendo formamida, a una temperatura de 42°C. En este caso, la concentración de formamida en el regulador de hibridación se puede reducir en incrementos del 5 por ciento desde el 50 por ciento hasta el 0 por ciento, para identificar los clones que tengan niveles decrecientes de homología con la sonda. En seguida de la hibridación, el filtro se puede lavar con SSC 6X, SDS al 0.5 por ciento, a 50°C. Estas condiciones se consideran como condiciones "moderadas" arriba del 25 por ciento de formamida, y como condiciones "bajas" debajo del 25 por ciento de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderadas", es cuando la hibridación anterior se conduce con el 30 por ciento de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "baja restringencia" es cuando la hibridación anterior se conduce con el 10 por ciento de formamida. Sin embargo, la selección de un formato de hibridación no es crítica - es la restringencia de las condiciones de lavado la que estipula las condiciones que determinan si un ácido nucleico está dentro del alcance de la invención. Las condiciones de lavado utilizadas para identificar ácidos nucleicos dentro del alcance de la invención incluyen, por ejemplo: una concentración de sal de aproximadamente 0.02 molar a un pH de 7 y a una temperatura de cuando menos aproximadamente 50°C o de aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C; o una concentración de sal de NaCl aproximadamente 0.15 M a 72°C durante aproximadamente 15 minutos; o una concentración de sal de aproximadamente SSC 0.2 a una temperatura de cuando menos 50°C o de aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C, durante aproximadamente 15 a aproximadamente 20 minutos; o el complejo de hibridación se lava dos veces con una solución con una concentración de sal de aproximadamente SSC 2X conteniendo SDS al 0.1 por ciento, a temperatura ambiente durante 15 minutos, y luego se lava dos veces con SSC 0. IX conteniendo SDS al 0.1 por ciento, a 68°C durante 15 minutos; o condiciones equivalentes.
Ver Sambrook, Tijssen y Ausubel para una descripción del regulador SSC y condiciones equivalentes. Estos métodos se pueden emplear para aislar los ácidos nucleicos de la invención. Sondas de Oligonucleótidos ? Métodos para Utilizarlas La invención también proporciona sondas de ácidos nucleicos que se pueden utilizar, por ejemplo, para identificar ácidos nucleicos que codifiquen un polipéptido con una actividad de aldolasa, o fragmentos del mismo, o para identificar genes de aldolasa. En un aspecto, la sonda comprende cuando menos 10 bases consecutivas de un ácido nucleico de la invención. De una manera alternativa, una sonda de la invención puede ser de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150 o de aproximadamente 10 a 50, de aproximadamente 20 a 60, de aproximadamente 30 a 70 bases consecutivas de una secuencia como se estipula en un ácido nucleico de la invención. Las sondas identifican un ácido nucleico mediante enlace y/o hibridación. Las sondas se pueden utilizar en arreglos de la invención; ver la descripción más adelante, incluyendo, por ejemplo, arreglos capilares. Las sondas de la invención también se pueden utilizar para aislar otros ácidos nucleicos o polipéptidos . Las sondas de la invención se pueden utilizar para determinar si una muestra biológica, tal como una muestra de tierra, contiene un organismo que tenga una secuencia de ácido nucleico de la invención, o un organismo a partir del cual se obtuvo el ácido nucleico. En estos procedimientos, se obtiene una muestra biológica que aloje potencialmente al organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico, y se obtienen ácidos nucleicos a partir de la muestra. Los ácidos nucleicos se ponen en contacto con la sonda bajo condiciones que permitan que la sonda se hibride específicamente a cualesquiera secuencias complementarias presentes en la muestra. Cuando sea necesario, se pueden determinar las condiciones que permitan que la sonda se hibride específicamente a secuencias complementarias, poniendo la sonda en contacto con las secuencias complementarias a partir de muestras que se sepa que contienen la secuencia complementaria, así como secuencias de control que no contengan la secuencia complementaria. Se pueden variar las condiciones de hibridación, tales como la concentración de sal del regulador de hibridación, la concentración de formamida del regulador de hibridación, o la temperatura de hibridación, para identificar las condiciones que permitan que la sonda se hibride específicamente a los ácidos nucleicos complementarios (ver la descripción sobre las condiciones específicas de hibridación) . Si la muestra contiene al organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico, entonces se detecta la hibridación específica de la sonda. La hibridación se puede detectar marcando la sonda con un agente detectable, tal como un isótopo radioactivo, un tinte fluorescente, o una enzima capaz de catalizar la formación de un producto detectable. Muchos métodos para utilizar las sondas marcadas con el fin de detectar la presencia de ácidos nucleicos complementarios en una muestra son familiares para los técnicos en la materia. Éstos incluyen Southern Blots, Northern Blots, procedimientos de hibridación de colonias, y manchas de puntos. Los protocolos para cada uno de estos procedimientos se proporcionan en Ausubel y Sambrook. De una manera alternativa, se puede utilizar más de una sonda (cuando menos una de las cuales sea capaz de hibridarse específicamente a cualesquiera secuencias complementarias que estén presentes en la muestra de ácido nucleico) , en una reacción de amplificación, para determinar si la muestra contiene un organismo que contenga una secuencia de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico) . En un aspecto, las sondas comprenden oligonucleótidos . En un aspecto, la reacción de amplificación puede comprender una reacción en cadena de la polimerasa. Los protocolos de reacción en cadena de la polimerasa se describen en Ausubel y Sambrook (ver la descripción sobre las reacciones de amplificación) . En estos procedimientos, los ácidos nucleicos de la muestra se ponen en contacto con las sondas, se lleva a cabo la reacción de amplificación, y se detecta cualquier producto de amplificación resultante. El producto de amplificación se puede detectar llevando a cabo electroforesis en gel sobre los productos de reacción, y tiñendo el gel con un intercalador, tal como bromuro de etidio. De una manera alternativa, una o más de las sondas se pueden marcar con un isótopo radioactivo, y se puede detectar la presencia de un producto de amplificación radioactivo mediante auto-radiografía después de la electroforesis en gel.
También se pueden utilizar sondas derivadas a partir de secuencias cercanas a los extremos 3 ' o 51 de una secuencia de ácido nucleico de la invención, en los procedimientos de avance de cromosomas, para identificar los clones que contengan secuencias adicionales, por ejemplo genómicas. Estos métodos permiten el aislamiento de genes que codifiquen proteínas adicionales de interés a partir del organismo huésped. En un aspecto, las secuencias de ácidos nucleicos de la invención se utilizan como sondas para identificar y aislar ácidos nucleicos relacionados. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos relacionados así identificados pueden ser ADNcs, o ADNs genómicos a partir de organismos diferentes de aquél a partir del cual se aisló primeramente el ácido nucleico de la invención. En estos procedimientos, se pone en contacto una muestra de ácido nucleico con la sonda bajo condiciones que permitan que la sonda se hibride específicamente a las secuencias relacionadas. Luego se detecta la hibridación de la sonda a los ácidos nucleicos del organismo relacionado empleando cualquiera de los métodos descritos anteriormente. . En las reacciones de hibridación de ácidos nucleicos, las condiciones utilizadas para alcanzar un nivel particular de restringencia pueden variar, dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se estén hibridando. Por ejemplo, se pueden considerar la longitud, el grado de complementariedad, la composición de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, contenido de GC contra AT) , y el tipo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN contra ADN) de las regiones que se hibriden de los ácidos nucleicos, en la selección de las condiciones de hibridación. Una consideración adicional es si uno de los ácidos nucleicos está inmovilizado, por ejemplo, sobre un filtro. La hibridación se puede llevar a cabo bajo condiciones de restringencia baja, restringencia moderada, o restringencia alta. Como un ejemplo de la hibridación de ácidos nucleicos, primero se prehibrida una membrana polimérica que contenga ácidos nucleicos desnaturalizados inmovilizados durante 30 minutos a 45°C, en una solución consistente en NaCl 0.9 M, NaH2P04 50 mM, pH de 7.0, Na2 EDTA 5.0 mM, SDS al 0.5 por ciento, Denhardt 10X, y 0.5 mg/ml de ácido poli -riboadenílico . Entonces se pueden agregar aproximadamente 2 x 107 cpm (actividad específica de 4-9 X 108/microgramo) de sonda de oligonucleótido marcada en el extremo con 32P a la solución. Después de 12 a 16 horas de incubación, la membrana se lava durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) en SET IX (NaCl 150 mM, clorhidrato de Tris 20 mM, pH de 7.8, Na2EDTA 1 mM) conteniendo SDS al 0.5 por ciento, seguido por un lavado de 30 minutos en SET IX fresco a una Tm-10°C para la sonda de oligonucleótido. Luego se expone la membrana a película auto-radiográfica para la detección de las señales de hibridación. Mediante la variación de la restringencia de las condiciones de hibridación empleadas para identificar ácidos nucleicos, tales como ADNcs o ADNs genómicos, que se hibriden a la sonda detectable, se pueden identificar y aislar ácidos nucleicos que tengan diferentes niveles de homología con la sonda. La restringencia se puede variar mediante la conducción de la hibridación a diferentes temperaturas debajo de las temperaturas de fusión de las sondas. La temperatura de fusión, Tm, es la temperatura (bajo la concentración iónica y el Ph definidos) a la cual se híbrida el 50 por ciento de la secuencia objetiva a una sonda perfectamente complementaria. Las condiciones muy restringentes se seleccionan iguales a, o aproximadamente 5°C menos que, la Tm, para una sonda particular. La temperatura de fusión de la sonda se puede calcular utilizando las siguientes fórmulas de ejemplo. Para las sondas de entre 14 y 70 nucleótidos de longitud, la temperatura de fusión (Tm) se calcula utilizando la fórmula: Tm=81.5+16.6 (log [Na+] ) +0.41 (fracción G+C) - (600/N) , en donde N es la longitud de la sonda. Si la hibridación se lleva a cabo en una solución que contenga formamida, la temperatura de fusión se puede calcular utilizando la ecuación: Tm=81.5+16.6 ( log [Na+] ) +0.41 (fracción G+C) -(0.63% formamida)- (600/N), en donde N es la longitud de la sonda. La prehibridación se puede llevar a cabo en SSC 6X, reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0.5 por ciento, 100 microgramos de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, o SSC 6X, reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0.5 por ciento, 100 microgramos de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, y el 50 por ciento de formamida. Las fórmulas para SSC y reactivo de Denhardt y otras soluciones se enlistan, por ejemplo, en Sambrook. La hibridación se conduce mediante la adición de la sonda detectable a las soluciones de prehibridación enlistadas anteriormente. Cuando la sonda comprenda ADN de doble cadena, se desnaturaliza antes de agregarse a la solución de hibridación. El filtro se pone en contacto con la solución de hibridación durante un período de tiempo suficiente para permitir que la sonda se hibride a los ADNcs o a los ADNs genómicos que contengan secuencias complementarias para la misma u homologas a la misma. Para las sondas de más de 200 nucleótidos de longitud, la hibridación se puede llevar a cabo de 15 a 25°C debajo de la Tm. Para sondas más cortas, tales como sondas de oligonucleótidos , la hibridación se puede conducir de 5 a 10°C debajo de la Tm. En un aspecto, las hibridaciones en SSC 6X se conducen a aproximadamente 68°C. En un aspecto, las hibridaciones en soluciones que contengan el 50 por ciento de formamida, se conducen a aproximadamente 42°C. Todas las hibridaciones anteriores se considerarían como bajo condiciones de alta restringencia . En seguida de la hibridación, el filtro se lava para remover cualquier sonda detectable no específicamente enlazada. La restringencia utilizada para lavar los filtros también se puede variar dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se estén hibridando, de la longitud de los ácidos nucleicos que se estén hibridando, del grado de complementariedad, de la composición de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, contenido de GC contra AT) , y del tipo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN contra ADN) . Los ejemplos de los lavados en condiciones de restringencia progresivamente más alta son como sigue: SSC 2X, SDS al 0.1 por ciento a temperatura ambiente durante 15 minutos (restringencia baja); SSC 0.1X, SDS al 0.5 por ciento a temperatura ambiente durante 30 minutos a 1 hora (restringencia moderada); SSC 0.1X, SDS al 0.5 por ciento durante 15 a 30 minutos entre la temperatura de hibridación y 68oc (restringencia alta) ; y NaCl 0.15M durante 15 minutos a 72°C (restringencia muy alta) . Se puede conducir un lavado de baja restringencia final en SSC 0. IX a temperatura ambiente. Los ejemplos anteriores son meramente ilustrativos de un conjunto de condiciones que se pueden emplear para lavar los filtros. Un técnico en la materia sabría que existen numerosas recetas para lavados de diferente astringencia. Los ácidos nucleicos que se hayan hibridado a la sonda se pueden identificar mediante auto-radiografía u otras técnicas convencionales. El procedimiento anterior se puede modificar para identificar los ácidos nucleicos que tengan niveles decrecientes de homología con la secuencia de sonda. Por ejemplo, con el fin de obtener ácidos nucleicos de una homología decreciente con la sonda detectable, se pueden utilizar condiciones menos restringentes . Por ejemplo, la temperatura de hibridación se puede reducir en incrementos de 5°C desde 68°C hasta 42°C en un regulador de hibridación que tenga una concentración de Na+ de aproximadamente 1M. En seguida de la hibridación, el filtro se puede lavar con SSC 2X, SDS al 0.5 por ciento, a la temperatura de hibridación. Estas condiciones se consideran como condiciones "moderadas" arriba de 50°C, y como condiciones "bajas" debajo de 50°C. Un ejemplo de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación anterior se conduce a 55°C. Un ejemplo de condiciones de hibridación de "baja restringencia " es cuando la hibridación anterior se conduce a 45oC. De una manera alternativa, la hibridación se puede llevar a cabo en reguladores, tales como SSC 6X, que contengan formamida, a una temperatura de 42°C. En este caso, la concentración de formamida en el regulador de hibridación se puede reducir en incrementos del 5 por ciento desde el 50 por ciento hasta el 0 por ciento, para identificar los clones que tengan niveles decrecientes de homología con la sonda. En seguida de la hibridación, el filtro se puede lavar con SSC 6X, SDS al 0.5 por ciento, a 50°C. Estas condiciones se consideran como condiciones "moderadas" arriba del 25 por ciento de formamida, y como condiciones "bajas" debajo del 25 por ciento de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderadas", es cuando la hibridación anterior se conduce con el 30 por ciento de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "baja restringencia", es cuando la hibridación anterior se conduce con el 10 por ciento de formamida. Estas sondas y métodos de la invención se pueden utilizar para aislar ácidos nucleicos que tengan una secuencia con una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, el 51 por ciento, el 52 por ciento, el 53 por ciento, el 54 por ciento, el 55 por ciento, el 56 por ciento, el 57 por ciento, el 58 por ciento, el 59 por ciento, el 60 por ciento, el 61 por ciento, el 62 por ciento, el 63 por ciento, el 64 por ciento, el 65 por ciento, el 66 por ciento, el 67 por ciento, el 68 por ciento, el 69 por ciento, el 70 átomos de carbono, el 71 átomos de carbono, el 72 por ciento, el 73 por ciento, el 74 por ciento, el 75 por ciento, el 76 por ciento, el 77 por ciento, el 78 por ciento, el 79 por ciento, el 80 por ciento, el 81 por ciento, el 82 por ciento, el 83 por ciento, el 84 por ciento, el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento ("homología") con una secuencia de ácido nucleico de la invención que comprenda cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, o más bases consecutivas de la misma, y las secuencias complementarias para la misma. La homología se puede medir utilizando un algoritmo de alineación, como se describe en la presente. Por ejemplo, los polinucleótidos homólogos pueden tener una secuencia de codificación que sea una variante alélica que se presente naturalmente de una de las secuencias de codificación descritas en la presente. Estas variantes alélicas pueden tener una sustitución, supresión, o adición de uno o más nucleótidos, al compararse con un ácido nucleico de la invención. Adicionalmente , las sondas y métodos de la invención se pueden utilizar para aislar ácidos nucleicos que codifiquen polipéptidos que tengan una identidad de secuencia (homología) de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, el 51 por ciento, el 52 por ciento, el 53 por ciento, el 54 por ciento, el 55 por ciento, el 56 por ciento, el 57 por ciento, el 58 por ciento, el 59 por ciento, el 60 por ciento, el 61 por ciento, el 62 por ciento, el 63 por ciento, el 64 por ciento, el 65 por ciento, el 66 por ciento, el 67 por ciento, el 68 por ciento, el 69 por ciento, el 70 átomos de carbono, el 71 átomos de carbono, el 72 por ciento, el 73 por ciento, el 74 por ciento, el 75 por ciento, el 76 por ciento, el 77 por ciento, el 78 por ciento, el 79 por ciento, el 80 por ciento, el 81 por ciento, el 82 por ciento, el 83 por ciento, el 84 por ciento, el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento, con un polipéptido de la invención que comprenda cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos, como se determina utilizando un algoritmo de alineación de secuencias (por ejemplo, tal como el algoritmo FASTA versión 3.0t78, con los parámetros por omisión, o un programa BLAST 2.2.2 con los establecimientos de ejemplo estipulados en la presente) . Inhibición de la Expresión de Aldolasa La invención proporciona ácidos nucleicos complementarios para (por ejemplo, secuencias anti- sentido para) las secuencias de ácidos nucleicos de la invención. Las secuencias anti-sentido son capaces de inhibir · el transporte, empalme, o transcripción de los genes que codifican aldolasa. La inhibición se puede efectuar a través de la dirección del ADN genómico o del ARN mensajero. La transcripción o función del ácido nucleico digerido se puede inhibir, por ejemplo, mediante hibridación y/o disociación. Un conjunto particularmente útil de inhibidores proporcionado por la presente invención incluye los oligonucleótidos que sean capaces de enlazarse con el gen o el mensaje de aldolasa, en cualquier caso impidiendo o inhibiendo la producción o la función de la aldolasa. La asociación puede ser a través de hibridación específica de la secuencia. Otra clase útil de inhibidores incluye los oligonucleótidos que provocan la inactivación o disociación del mensaje de aldolasa. El oligonucleótido puede tener actividad enzimática que provoque dicha disociación, tal como de ribozimas. El oligonucleótido se puede modificar químicamente, o se puede conjugar con una enzima o composición capaz de disociar el ácido nucleico complementario. Se puede rastrear una reserva de muchos oligonucleótidos diferentes para buscar aquéllos con la actividad deseada. Oligonucleótidos Anti-Sentido La invención proporciona oligonucleótidos anti-sentido capaces de enlazar el mensaje de aldolasa, que puede inhibir la actividad proteolítica mediante la dirección al ARNm. Las estrategias para diseñar oligonucleótidos anti-sentido están bien descritas en la literatura científica y de patente, y el técnico puede diseñar estos oligonucleótidos de aldolasa utilizando los reactivos novedosos de la invención. Por ejemplo, los protocolos de avance de genes/mapeo de ARN para rastrear oligonucleótidos anti-sentido efectivos, son bien conocidos en este campo; ver, por ejemplo, Ho (2000) Methods Enzymol .¦ 314 : 168 - 183 , que describe un ensayo de mapeo de ARN, que se basa en las técnicas moleculares convencionales, para proporcionar un método fácil y confiable para la selección potente de la secuencia anti-sentido. Ver también Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci . 11:191-198. Los ácidos nucleicos que se presentan naturalmente se utilizan como oligonucleótidos anti-sentido. Los oligonucleótidos anti-sentido pueden ser de cualquier longitud; por ejemplo, en los aspectos alternativos, los oligonucleótidos anti-sentido son de entre aproximadamente 5 y 100, de entre aproximadamente 10 y 80, de entre aproximadamente 15 y 60, y de entre aproximadamente 18 y 40. La longitud óptima se puede determinar mediante rastreo de rutina. Los oligonucleótidos anti-sentido pueden estar presentes en cualquier concentración. La concentración óptima se puede determinar mediante rastreo de rutina. Se conocen una amplia variedad de nucleótidos y análogos de ácidos nucleicos que no se presentan naturalmente, sintéticos, los cuales pueden resolver este problema potencial. Por ejemplo, se pueden utilizar ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) que contengan estructuras base no iónicas, tales como las unidades de N- (2 -aminoetil ) -glicina . También se pueden utilizar oligonucleótidos anti -sentido que tengan enlaces de fosforotioato , como se describen en las publicaciones internacionales WO 97/03211 y WO 96/39154; en Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189-197; Antisense Therapeutics , editor Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996) . Los oligonucleótidos anti-sentido que tienen análogos de estructura base de ADN sintética proporcionados por la invención, también pueden incluir ácidos nucleicos de fosforo-dioato, metil-fosfonato, fosforamidato, alquil -fosfotriéster, sulfamato, 3'-tioacetal, metilen (metil - imino) , 31 -N-carbamato, y morfolino-carbamato, como se describe en lo anterior. Se puede utilizar la metodología química de combinación para crear grandes números de oligonucleótidos que se puedan rastrear rápidamente para buscar oligonucleótidos específicos que tengan afinidades y especificidades de enlace apropiadas hacia cualquier objetivo, tales como las secuencias de aldolasa en sentido y anti-sentido de la invención (ver, por ejemplo, Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270:13581-13584) . Ribozimas Inhibidoras La invención proporciona ribozimas capaces de enlazarse con el mensaje de aldolasa. Estas ribozimas pueden inhibir la actividad de aldolasa, por ejemplo, dirigiéndose al ARNm. Las estrategias para diseñar ribozimas y seleccionar la secuencia anti-sentido específica de aldolasa para la dirección, están bien descritas en la literatura científica y de patente, y el técnico puede diseñar estas ribozimas utilizando los reactivos novedosos de la invención. Las ribozimas actúan mediante su enlace con un ARN objetivo a través de la porción de enlace del ARN objetivo de una ribozima que se mantiene en estrecha proximidad a una porción enzimática del ARN que disocia el ARN objetivo. Por consiguiente, la ribozima reconoce y se enlace con un ARN objetivo a través de emparejamiento de bases complementarias, y una vez enlazada el sitio correcto, actúa enzimá icamente para disociar e inactivar el ARN objetivo. La disociación de un ARN objetivo de esta manera destruirá su capacidad para dirigir la síntesis de una proteína codificada si se presenta la disociación en la secuencia de codificación. Después de que una ribozima se ha enlazado y ha disociado su ARN objetivo, se puede liberar de ese ARN para enlazarse con, y disociar, nuevos objetivos repetidamente. En algunas circunstancias, la naturaleza enzimática de una ribozima puede ser conveniente sobre otras tecnologías, tales como la tecnología anti-sentido (en donde una molécula de ácido nucleico simplemente se enlaza con un objetivo de ácido nucleico para bloquear su transcripción, traducción, o asociación con otra molécula) , debido a que la concentración efectiva de ribozima necesaria para efectuar un tratamiento terapéutico puede ser más baja que aquélla de un oligonucleótido anti-sentido . Esta ventaja potencial refleja la capacidad de la ribozima para actuar enzimáticamente . , Por lo tanto, una sola molécula de ribozima es capaz de disociar muchas moléculas de ARN objetivo. En adición, una ribozima normalmente es un inhibidor altamente específico, dependiendo la especificidad de inhibición no solamente del mecanismo de enlace de emparejamiento de bases, sino también del mecanismo mediante el cual la molécula inhibe la expresión del ARN con el que se enlaza. Es decir, la inhibición es causada por la disociación del objeto de ARN, y de esta manera, la especificidad se define como la proporción del índice de disociación del ARN objetivo sobre el índice de disociación del ARN no objetivo. Este mecanismo de disociación depende de factores adicionales a los implicados en el emparejamiento de bases. Por consiguiente, la especificidad de acción de una ribozima puede ser mayor que aquélla del oligonucleótido antisentido que se enlace con el mismo sitio de ARN. La ribozima de la invención, por ejemplo, una molécula de ARN de ribozima enzimática, se puede formar en un motivo de cabeza de martillo, en un motivo de horquilla, como un motivo de virus de hepatitis delta, un motivo de intrón del grupo I, y/o un ARN tipo ARNsaP en asociación con una secuencia guía de ARN. Los ejemplos de los motivos de cabeza de martillo son descritos, por ejemplo, por Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183; los motivos de horquilla por Hampel (1989) Biochemistry 28:4929, y Hampel (1990) Nuc. ñcids Res. 18:299; el motivo del virus de hepatitis delta por Perrotta (1992) Biochemistry 31:16; el motivo de ARNsaP por Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849; y el intrón del grupo I por Cech, patente US 4,987,071. La relación de estos motivos específicos no pretende ser limitante. Los técnicos en este campo reconocerán que una ribozima de la invención, por ejemplo una molécula de ARN enzimática de esta invención, puede tener un sitio de enlace de sustrato específico complementario con una o más de las regiones de ARN del gen objetivo. Una ribozima de la invención puede tener una secuencia de nucleotidos dentro o alrededor de ese sitio de enlace de sustrato que imparta una actividad de disociación de ARN a la molécula. Interferencia de ARN (ARNi) En un aspecto, la invención proporciona una molécula inhibidora de ARN, la denominada molécula de "ARNi", la cual comprende una secuencia de aldolasa de la invención. La molécula de ARNi comprende una molécula de ARN de doble cadena (ARNds) . El ARNi puede inhibir la expresión de un gen de aldolasa. En un aspecto, el ARNi es de aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más nucleotidos dúplex de longitud. Aunque la invención no está limitada por algún mecanismo de acción particular, el ARNi puede entrar a una célula y provocar la degradación de un ARN de una sola cadena (ARNss) de secuencias similares o idénticas, incluyendo ARNms endógenos. Cuando se expone una célula al ARN de doble cadena (ARNds) , se degrada selectivamente el ARNm a partir del gen homólogo mediante un proceso denominado como interferencia de ARN (ARNi) . Un posible mecanismo básico detrás del AR i, es el rompimiento de un ARN de doble cadena (ARNds) que se empareje con una secuencia genética específica en pedazos cortos denominados ARN de interferencia corto, los cuales desencadenan la degradación del ARNm que empareja su secuencia. En un aspecto, los ARNis de la invención se utilizan en la terapia de silenciamiento de genes, ver, por ejemplo,. Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046. En un aspecto, la invención proporciona métodos para degradar selectivamente el ARN utilizando el ARNi de la invención. El proceso se puede practicar in vitro, ex vivo, o in vivo. En un aspecto, las moléculas de ARNi de la invención se pueden utilizar para generar una mutación de pérdida de función en una célula, un órgano, o un animal. Los métodos para hacer y usar moléculas de ARNi para degradar selectivamente el ARN son bien conocidos en la materia, ver, a guisa de ejemplo, las patentes US 6,506,559; 6,511,824; 6,515,109; 6,489,127. Modificación de Ácidos Nucleicos La invención proporciona métodos para generar variantes de los ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo los que codifican una aldolasa. Estos métodos se pueden repetir o utilizar en diferentes combinaciones para generar aldolasas que tengan una actividad alterada o diferente, o una estabilidad alterada o diferente, de aquélla de una aldolasa codificada por el ácido nucleico de plantilla. Estos métodos también se pueden repetir o utilizar en diferentes combinaciones, por ejemplo, para generar variaciones en la expresión del gen/mensaje, en la traducción del mensaje, o en la estabilidad del mensaje. En otro aspecto, la composición genética de una célula se altera, por ejemplo, mediante la modificación de un gen homólogo ex vivo, seguida por su reinserción en la célula. Un ácido nucleico de la invención se puede alterar por cualquier medio. Por ejemplo, mediante métodos aleatorios o estocásticos , o mediante métodos no estocásticos o de "evolución dirigida", ver, por ejemplo, la patente US 6,361,974. Los métodos para la mutación aleatoria de genes son bien conocidos en la materia, ver, por ejemplo, la patente US 5,830,696. Por ejemplo, se pueden utilizar mutágenos para mutar aleatoriamente un gen. Los mutágenos incluyen, por ejemplo, irradiación de luz ultravioleta o gamma, o un mutágeno químico, por ejemplo mitomicina, ácido nitroso, psoralenos fotoactivados , solos o en combinación, para inducir rompimientos del ADN susceptibles a reparación mediante recombinación. Otros mutágenos químicos incluyen, por ejemplo, bisulfito de sodio, ácido nitroso, hidroxilamina , hidrazina, o ácido fórmico. Otros mutágenos son análogos de precursores de nucleótidos, por ejemplo nitrosoguanidina , 5 -bromouracilo , 2 -aminopurina, o acridina.
Estos agentes se pueden agregar a una reacción en cadena de la polimerasa en lugar del precursor del nucleotido, mutando de esta manera la secuencia. También se pueden utilizar agentes intercaladores ( tales como proflavina, acriflavina, quinacrina, y similares. Se puede emplear cualquier técnica en biología molecular, por ejemplo, mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa aleatoria, ver, por ejemplo, Rice (1992) 'Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5467-5471; o mutagénesis de múltiples casetes de combinación, ver, por ejemplo, Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196. De una manera alternativa, los ácidos nucleicos, por ejemplo los genes, se pueden reensamblar después de la fragmentación aleatoria o "estocástica" , ver, por ejemplo, las patentes US 6,291,242; 6,287,862; 6,287,861; 5,955,358; 5,830,721; 5,824,514; 5,811,238; 5,605,793. En los aspectos alternativos, se introducen modificaciones, adiciones, o supresiones mediante reacción en cadena de · la polimerasa susceptible a error, mezcla, mutagénesis dirigida al oligonucleótido, reacción en cadena de la polimerasa de ensamble, mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de cásete, mutagénesis de ensamble recursivo, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamble de genes, mutagénesis saturada del sitio genético (GSSM) , reensamble de ligamiento sintético (SLR) , recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificado con fosfotioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, mutagénesis dúplex con huecos, mutagénesis de reparación de mal emparejamiento puntual, mutagénesis de cepa huésped deficiente en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de restricción-selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de ensamble, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, y/o una combinación de estos y otros métodos . Las siguientes publicaciones describen una variedad de procedimientos y/o métodos de recombinación recursiva que se pueden incorporar en los métodos de la invención: Stemmer (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties" Tumor Targeting 4:1-4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893-896; Chang (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 11:192-191; Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding" Current Opinión in Chemical Biology 3:284-290; Christians (1999) "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391:288-291; Crameri (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling" , Nature Biotechnology 15 : 436-438 ; Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening" Proc . Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten y colaboradores (1997) "Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines" Current Opinión ín Biotechnology 8:724-733; Crameri y colaboradores (1996) "Construction and evolution of antibody-phage librarles by DNA shuffling" Nature Medicine 2:100-103; Gates y colaboradores (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide librarles through display on a lac repressor 'headpiece dimer ' " Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" En: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publisher, Nueva York, páginas 447-457; Crameri y Stemmer (1995) " Combinatorial múltiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtyp cassettes" BioTechniques 18:194-195; Stemmer y colaboradores (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides " Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation" Science 270 : 1510 ; Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bío/Technology 13 : 549-553 ; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370:389-391; y Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751. Los métodos de mutación para generar diversidad incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio (Ling y colaboradores (1997) "Approaches to DNA mutagenesis : an overview" Anal Biochem. 254 (2) : 157-178 ; Dale y colaboradores (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method" Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) "In vitro mutagenesis" Ann . Rev. Genet . 19:423-462; Botstein y Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis" Science 229:1193-1201; Cárter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J. 237:1-7; y Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D. M. J. editores, Springer Verlag, Berlín)); mutagénesis utilizando plantillas que contienen uracilo (Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel y colaboradores (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Methods in Enzymol. 154, 367-382; y Bass y colaboradores (1988) " utant Trp repressors with new DNA-binding specificities " Science 242:240-245); mutagénesis dirigida al oligonucleótido (Methods in Enzymol . 100:468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987); Zoller y Smith (1982) "Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller y Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragmente cloned into I3 vectors" Methods in Enzymol. 100:468-500; y Zollery y Smith (1987) Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single- stranded DNA témplate" Methods in Enzymol. 154:329-350); mutagénesis de ADN modificado con fosforotioato (Taylor y colaboradores (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA" Nucí. Acids Res. 13:8749-8764; Taylor y colaboradores (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA" Nucí. Acids Res. 13:8765-8787 (1985) ; Nakamaye (1986) "Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucí. Acids Res. 14:9679-9698; Sayers y colaboradores (1988) "Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucí. Acids Res. 16:791-802; y Sayers y colaboradores (1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide" Nucí. Acids Res. 16:803-814); mutagénesis utilizando ADN dúplex con huecos (Kramer y colaboradores (1984) "The gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction" Nucí. Acids Res. 12:9441-9456; Kramer y Fritz (1987) Methods in Enzymol. "Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped dúplex DNA" 154:350-367; Kramer y colaboradores (1988) "Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations" Nucí. Acids Res. 16:7207; y Fritz y colaboradores (1988) "Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped dúplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro" Nucí. Acids Res. 16:6987-6999) . Los protocolos adicionales que se pueden emplear para practicar la invención incluyen reparación de mal emparejamiento puntual (Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38:879-887), mutagénesis utilizando cepas huéspedes deficientes en reparación (Cárter y colaboradores (1985) "Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors" Nucí. Acids Res. 13:4431-4443; y Cárter (1987) " Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154:382-403), mutagénesis de supresión (Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonucleotides to genérate large deletions" Nucí. Acids Res. 14:5115), restricción- selección, y restricción-selección y restricción-piurificación (Wells y colaboradores (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317:415-423), mutagénesis mediante síntesis genética total (Nambiar y colaboradores (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223:1299-1301; Sakamar y Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin) " Nucl . Acids Res. 14:6361-6372; Wells y colaboradores (1985) "Cassette mutagénesis: an efficient method for generation of múltiple mutations at defined sites" Gene. 34:315-323; y Grundstrom y colaboradores (1985) "Oligonucleotide-directed mutagénesis by microscale ' shot -gun 1 gene synthesis" Nucl. Acids Res. 13:3305-3316), reparación de rompimiento de doble cadena (Mandecki (1986); Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environments " Current Opinión in Biotechnology 4:450-455.
"Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site- specific mutagénesis" Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181) . Los detalles adicionales sobre muchos de los métodos anteriores se pueden encontrar en Methods in Enzymology, Volumen 154, que también describe controles útiles para la resolución de problemas con diferentes métodos de mutagénesis. Los protocolos que se pueden utilizar para practicar la invención se describen, por ejemplo, en la patente US 5,605,793 a Stemmer (25 de febrero de 1997) , "Methods for In Vitro Recombination" ; patente US 5,811,238 a Steemer y colaboradores (22 de septiembre de 1998) , "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; patente US 5,830,721 a Stemmer y colaboradores (3 de noviembre de 1998) , "DNA Mutagénesis by Random Fragmentar;ion and Reassembly" ; patente US 5,834,252 a Stemmer y colaboradores (10 de noviembre de 1998) , "End-Complementary Polymerase Reaction" ; patente US 5,837,458 a Minshull y colaboradores (17 de noviembre de 1998), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering" ; publicación internacional WO 95/22625, Stemmer y Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; publicación internacional WO 96/33207 por Stemmer y Lipschutz, "End Complementary Polymerase Chain Reaction"; publicación internacional WO 97/20078 por Stemmer y Crameri, "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination" ; publicación internacional WO 97/35966 por Minshull y Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; publicación internacional WO 99/41402 por Punnonen y colaboradores "Targeting of Genetic Vaccine Vectors"; publicación internacional WO 99/41383 por Punnonen y colaboradores "Antigen Library Immunization" ; publicación internacional WO 99/41369 por Punnonen y colaboradores "Genetic Vaccine Vector Engineering" ; publicación internacional WO 99/41368 por Punnonen y colaboradores, "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines"; patente EP 752008 por Stemmer y Crameri, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; patente EP 0932670 por Stemmer, "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination"; publicación internacional WO 99/23107 por Stemmer y colaboradores, "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling"; publicación internacional WO 99/21979 por Apt y colaboradores, "Human Papillomavirus Vectors"; publicación internacional WO 98/31837 por del Cardayre y colaboradores, "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination"; publicación internacional WO 98/27230 por Patten y Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering" ; publicación internacional WO 98/27230 por Stemmer y colaboradores, "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection" ; publicación internacional WO 00/00632, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries"; publicación internacional WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences"; publicación internacional WO 98/42832 por Arnold y colaboradores, "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers"; publicación internacional WO 99/29902 por Arnold y colaboradores, "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences"; publicación internacional WO 98/41653 por Vind, "An in Vitro Method for Construction of a DNA Library"; publicación internacional 98/41622 por Borchert y colaboradores, "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling"; y publicación internacional WO 98/42727 por Pati y Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination". Los protocolos que se pueden utilizar para practicar la invención (que proporcionan detalles con respecto a varios métodos generadores de diversidad) se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente US 09/407,800, " SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES", por Patten y colaboradores, presentada el 28 de septiembre de 1999; "EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION" , por del Cardayre y colaboradores, patente US 6,379,964; "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION", por Crameri y colaboradores, patentes US 6,319,714; 6,368,861; 6,376,246; 6,423,542; 6,426,224, y solicitud internacional PCT/US00/01203 ; "USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING" por Welch y colaboradores, patente US 6,436,675; "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS " por Selifonov y colaboradores, presentada el 18 de enero de 2000, (PCT/USOO/01202 ) , y, por ejemplo, ,"METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" por Selifonov y colaboradores, presentada el 18 de julio de 2000 (solicitud de patente US 09/618,579); "METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS" por Selifonov y Stemmer, presentada el 18 de enero de 2000 (solicitud internacional PCT/USOO/01138) ; y "SINGLE- STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION" por Affholter, presentada el 6 de septiembre de 2000 (solicitud de patente US 09/656,549); y patente US 6,177,263 y 6, 153 , 10. Los métodos no estocásticos o de "evolución dirigida" incluyen, por ejemplo, mutagénesis de saturación del sitio genétic'o (GSSM) , reensamble de ligamiento sintético (SLR) , o una combinación de los mismos, y se utilizan para modificar los ácidos nucleicos de la invención, con el fin de generar aldolasas con propiedades nuevas o alteradas (por ejemplo, actividad bajo condiciones altamente ácidas o alcalinas, altas temperaturas, y similares) . Los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos modificados se pueden rastrear para determinar una actividad, antes de probar la actividad proteolítica u otra actividad. Se puede utilizar cualquier modalidad o protocolo de prueba, por ejemplo, utilizando una plataforma de arreglo capilar. Ver, por ejemplo, las patentes US 6,361,974; 6,280,926; 5,939,250. Mutagénesis de Saturación o GSSM En un aspecto, se utilizan cebadores de codones que contengan una secuencia ?,?-G/T degenerada, para introducir mutaciones puntuales en un polinucleótido, por ejemplo una aldolasa o un anti-cuerpo de la invención, con. el objeto de generar un conjunto de polipéptidos de progenie en donde esté representado un rango completo de sustituciones de aminoácidos individuales en cada posición de aminoácido, por ejemplo, un residuo de aminoácido en un sitio activo enzimático o en un sitio de enlace de ligando dirigido para ser modificado. Estos oligonucleótidos pueden comprender una primera secuencia homologa contigua, una secuencia , , G/T degenerada, y opcionalmente , una segunda secuencia homologa. Los productos de traducción de progenie corriente abajo a partir del uso de estos oligonucleótidos incluyen todos los cambios de aminoácidos posibles en cada sitio de aminoácido a lo largo del polipéptido, debido a que la degeneración de la secuencia N,N,G/T incluye los codones para los 20 aminoácidos. En un aspecto, este oligonucleotido degenerado (comprendido, por ejemplo, de un cásete N,N,G/T degenerado) se utiliza para someter a cada codón original de una plantilla de polinucleótido progenitora, a un rango completo de sustituciones de codones. En otro aspecto, se utilizan cuando menos dos casetes degenerados - ya sea en el mismo oligonucleotido o no, para someter a cuando menos dos codones originales de una plantilla de polinucleótido progenitor a un rango completo de sustituciones de codones. Por ejemplo, puede haber más de una secuencia N, , G/T contenida en un oligonucleotido para introducir mutaciones de aminoácidos en más de un sitio. Esta pluralidad de secuencias N, N, G/T pueden estar directamente contiguas, o separadas por una o más secuencias de nucleótidos adicionales. En otro aspecto, se pueden utilizar oligonucleótidos que sirvan para introducir adiciones y supresiones, ya sea solos o en combinación con los codones que contengan una secuencia N, N, G/T, para introducir cualquier combinación o permutación de adiciones, supresiones, y/o sustituciones de aminoácidos.
En un aspecto, se hace mutagénesis simultánea de dos o más posiciones de aminoácidos contiguas utilizando un oligonucleótido que contenga tripletes de N,N,G/T contiguos, es decir, una secuencia (N,N,G/T)n degenerada. En otro aspecto, se utilizan casetes degenerados que tengan menos degeneración que la secuencia N,N,G/T. Por ejemplo, puede ser deseable, en algunos casos, utilizar (por ejemplo, en un oligonucleótido) una secuencia triplete degenerada comprendida de solamente un N, en donde dicho N puede estar en la primera, segunda, o tercera posición del triplete. Se pueden utilizar cualesquiera otras bases, incluyendo cualesquiera combinaciones y permutaciones de las mismas, en las dos posiciones restantes del triplete. De una manera alternativa, puede ser deseable, en algunos casos, utilizar (por ejemplo, en un oligonucleótido) una secuencia triplete ?,?,? degenerada. En un aspecto, el uso de tripletes degenerados (por ejemplo, tripletes N,N,G/T) permite hacer una generación sistemática y fácil de un rango completo de posibles aminoácidos naturales (para un total de 20 aminoácidos) en cada posición de aminoácido de un polipéptido (en los aspectos alternativos, el método también puede incluir la generación de menos que todas las posibles sustituciones por residuo de aminoácido, o codón, o posición) . Por ejemplo, para un polipéptido de 100 aminoácidos, se pueden generar 2,000 especies distintas (es decir, 20 posibles aminoácidos por posición X 100 posiciones de aminoácidos) . A través del uso de un oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos que contengan un triplete N,N,G/T degenerado, 32 secuencias individuales pueden codificar los 20 posibles aminoácidos naturales. Por consiguiente, en un recipiente de reacción en donde una secuencia de polinucleotido progenitor se someta a mutagénesis de saturación utilizando cuando menos un oligonucleótido, se generan 32 polinucleótidos de progenie distintos que codifican 20 polipéptidos distintos. En contraste, el uso de un oligonucleótido no degenerado en la mutagénesis dirigida al sitio, conduce solamente a un producto de polipéptido de progenie por recipiente de reacción. Opcionalmente se pueden utilizar oligonucleótidos no degenerados en combinación con los cebadores degenerados dados a conocer; por ejemplo, se pueden utilizar oligonucleótidos no degenerados para generar mutaciones puntuales específicas en un polinucleotido de procesamiento. Esto proporciona un medio para generar mutaciones puntuales silenciosas específicas, mutaciones que conduzcan a cambios de aminoácidos correspondientes, y mutaciones puntuales que ocasionen la generación de codones de paro y la expresión correspondiente de fragmentos de polipéptidos. En un aspecto, cada recipiente de reacción de mutagénesis de saturación contiene los polinucleótidos que codifican cuando menos 20 moléculas del polipéptido de progenie (por ejemplo, aldolasas) , de tal manera que están representados los 20 aminoácidos naturales en la posición de aminoácido específica correspondiente a la posición del codón mutado en el polinucleótido progenitor (otros aspectos utilizan menos que las 20 combinaciones naturales) . Los polipéptidos de progenie degenerados 32 veces, generados a partir de cada recipiente de reacción de mutagénesis de saturación, se pueden someter a amplificación clonal (por ejemplo, se clonan en un huésped adecuado, por ejemplo en un huésped de E. coli, utilizando, por ejemplo, un vector de expresión) , y se someten al rastreo de expresión. Cuando se identifica un polipéptido de progenie individual mediante rastreo por exhibir un cambio favorable en las propiedades (al compararse con el polipéptido progenitor, tal como una mayor actividad proteolítica bajo condiciones alcalinas o ácidas) , se puede secuenciar para identificar la sustitución de aminoácido correspondientemente favorable contenida en el mismo. En un aspecto, después de mutar cada posición de aminoácido de un polipéptido progenitor utilizando mutagénesis de saturación como se da a conocer en la presente, se pueden identificar cambios de aminoácidos favorables en más de una posición de aminoácido. Se pueden generar una o más moléculas de progenie nuevas que contengan una combinación de todas o parte de estas sustituciones de aminoácidos favorables. Por ejemplo, si se identifican dos cambios de aminoácidos favorables específicos en cada una de tres posiciones de aminoácidos de un polipéptido, las permutaciones incluyen tres posibilidades en cada posición (ningún cambio del aminoácido original, y cada uno de dos cambios favorables) y tres posiciones. Por consiguiente, hay 3 3 x 3, o 27 posibilidades en total, incluyendo 7 que se examinaron previamente - 6 mutaciones puntuales individuales (es decir, 2 en cada una de tres posiciones) , y ningún cambio en cualquier posición . En otro aspecto, se puede utilizar la mutagénesis de saturación del sitio junto con otro medio estocastico o no estocástico para variar la secuencia, por ejemplo reensamble de ligamiento sintético (ver más adelante) , mezcla, quimerización, recombinación, y otros procesos de mutación y agentes de mutación. Esta invención proporciona el uso de cualesquiera procesos de mutación, incluyendo mutagénesis de saturación, de una manera iterativa. Reensamble de Ligamiento Sintético (SLR) La invención proporciona un sistema de modificación genética no estocástico denominado como "reensamble de ligamiento sintético", o simplemente como "SLR", un "proceso de evolución dirigida", para generar polipéptidos , por ejemplo aldolasas o anti-cuerpos de la invención, con propiedades nuevas o alteradas. El reensamble de ligamiento sintético es un método para ligar fragmentos de oligonucleótidos entre sí de una manera no estocástica. Este método difiere de la mezcla estocástica de oligonucleótidos, en que los bloques de construcción de ácidos nucleicos no están mezclados, concatenados, o quimerizados aleatoriamente, sino que más bien se ensamblan de una manera no estocástica. Ver, por ejemplo, la solicitud de patente US 09/332,835 titulada "Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution", y presentada el 14 de junio de 1999 ("USSN 09/332,835"). En un aspecto, el reensamble de ligamiento sintético comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar un polinucleotido de plantilla, en donde el polinucleotido de plantilla comprende la secuencia que codifica un gen homólogo; (b) proporcionar una pluralidad de polinucleotidos de bloques de construcción, en donde los polinucleotidos de bloques de construcción se diseñan para reensamblarse cruzadamente con el polinucleotido de plantilla en una secuencia previamente determinada, y un polinucleotido de bloque de construcción comprende una secuencia que es una variante del gen homólogo, y una secuencia homologa al polinucleotido de plantilla que flanquea a la secuencia variante; (c) combinar un polinucleotido de bloque de construcción con un polinucleotido de plantilla, de tal manera que el polinucleotido de bloque de construcción se reensambla cruzadamente con el polinucleotido de plantilla para generar polinucleotidos que comprenden variaciones de secuencias genéticas homologas. El reensamble de ligamiento sintético no depende de la presencia de altos niveles de homología entre los polinucleotidos que se vayan a reconfigurar . Por consiguiente, este método se puede emplear para generar de una manera no estocástica bibliotecas (o conjuntos) de moléculas de progenie comprendidas de más de 10100 quimeras diferentes. El reensamble de ligamiento sintético se puede utilizar para generar bibliotecas comprendidas de más de io1000 quimeras de progenie diferentes. Por consiguiente, los aspectos de la presente invención incluyen métodos no estocásticos para producir un conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricas finalizadas que tienen un orden de ensamble global que se selecciona por diseño. Este método incluye los pasos de generar por diseño una pluralidad de bloques de construcción de ácidos nucleicos específicos que tengan extremos ligables mutuamente compatibles servibles, y ensamblar estos bloques de construcción de ácidos nucleicos, de tal manera que se logre un orden de ensamble global diseñado. Los extremos ligables mutuamente compatibles de los bloques de construcción de ácidos nucleicos que se vayan a ensamblar, se consideran como "servibles" para este tipo de ensamble ordenado, si hacen posible que los bloques de construcción se acoplen en órdenes previamente determinados. Por lo tanto, el orden de ensamble global en el que se pueden acoplar los bloques de construcción de ácidos nucleicos es especificado por el diseño de los extremos ligables. Si se va a utilizar más de un paso de ensamble, entonces el orden de ensamble global en el que se puedan acoplar los bloques de construcción de ácidos nucleicos también se especifica por el orden en secuencia de los pasos de ensamble. En un aspecto, las piezas de construcción templadas se tratan con una enzima, tal como una ligasa (por ejemplo, ligasa de ADN T4) , para lograr el enlace covalente de las piezas de construcción. En un aspecto, el diseño de los bloques de construcción de oligonucleótidos se obtiene analizando un conjunto de plantillas de secuencias de ácidos nucleicos progenitoras que sirvan como una base para producir un conjunto de progenie de polinucleótidos quiméricos finalizados. Estas plantillas de oligonucleótidos progenitoras sirven de esta manera como una fuente de información de secuencia que ayuda en el diseño de los bloques de construcción de ácidos nucleicos que se vayan a mutar, por ejemplo, a quimerizar o mezclar. En un aspecto de este método, se alinean las secuencias de una pluralidad de plantillas de ácidos nucleicos progenitoras son el objeto de seleccionar uno o más puntos de demarcación. Los puntos de demarcación se pueden localizar en un área de homología, y están comprendidos de uno o más nucleótidos. Estos puntos de demarcación de preferencia son compartidos por cuando menos dos de las plantillas progenitoras. De esta manera, los puntos de demarcación se pueden utilizar para delinear los límites de los bloques de construcción de oligonucleótidos que se vayan a generar, con el objeto de reconfigurar los polinucleótidos progenitores. Los puntos de demarcación identificados y seleccionados en las moléculas progenitoras, sirven como puntos de quimerización potenciales en el ensamble de las moléculas de progenie quiméricas finales. Un punto de demarcación puede ser un área de homología (comprendida de cuando menos una base de nucleótido homologa) compartida por cuando menos dos secuencias de polinucleótidos progenitoras . De una manera alternativa, un punto de demarcación puede ser un área de homología que sea compartida por cuando menos la mitad de las secuencias de polinucleótidos progenitoras, o puede ser un área de homología que sea compartida por cuando menos dos terceras partes de las secuencias de polinucleótidos progenitoras. De una manera todavía más preferible, un punto de demarcación servible es un área de homología que es compartida por cuando menos tres cuartas partes de las secuencias de polinucleótidos progenitoras, o puede ser compartida por casi todas las secuencias de polinucleótidos progenitoras. En un aspecto, un punto de demarcación es un área de homología que es compartida por todas las secuencias de polinucleótidos progenitoras. En un aspecto, el proceso de reensamble de ligamiento se lleva a cabo de una manera exahustiva con el objeto de generar una biblioteca exahustiva de polinucleótidos quiméricos de progenie. En otras palabras, todas las posibles combinaciones ordenadas de los bloques de construcción de ácidos nucleicos están representadas en el conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricos finalizadas. Al mismo tiempo, en otro aspecto, el orden de ensamble (es decir, el orden de ensamble de cada bloque de construcción en la secuencia 5 ' a 3 ' de cada ácido nucleico quimérico finalizado) en cada combinación, por diseño (o de una manera no estocástica) es como se describe anteriormente.
Debido a la naturaleza no estocástica de esta invención, se reduce mucho la posibilidad de productos secundarios indeseados. En otro aspecto, el método de réensamble de ligamiento se lleva a cabo de una manera sistemática. Por ejemplo, el método se lleva a cabo con el objeto de generar una biblioteca sistemáticamente compartimentalizada de moléculas de progenie, con compartimientos que se puedan rastrear de una manera sist.emática, por ejemplo uno por uno. En otras palabras, esta invención dispone que, a través del uso selectivo y juicioso de los bloques de construcción de ácidos nucleicos específicos, junto con el uso selectivo y juicioso de reacciones de ensamble secuencialmente escalonadas, se puede lograr un diseño en donde se hagan conjuntos específicos de productos de progenie en cada uno de los diferentes recipientes de reacción. Esto permite que se lleve a cabo un procedimiento sistemático de examen y rastreo. Por consiguiente, estos métodos permiten que se examinen sistemáticamente un número potencialmente muy grande de moléculas de progenie en grupos más pequeños. Debido a su capacidad para llevar a cabo quimerizaciones de una manera que es altamente flexible, y no obstante es exahustiva y sistemática también, en particular cuando hay un bajo nivel de homología entre las moléculas progenitoras , estos métodos proporcionan la generación de una biblioteca (o conjunto) comprendida de un gran número de moléculas de progenie. Debido a la naturaleza no estocástica del reensamble de ligamiento de la presente invención, las moléculas de progenie generadas de preferencia comprenden una biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos quiméricas finalizadas que tienen un orden de ensamble global que se selecciona por diseño. También se pueden utilizar los métodos de mutagénesis de saturación y de evolución dirigida optimizada, para generar diferentes especies moleculares de progenie. Se aprecia que la invención proporciona libertad de elección y control con respecto a la selección de los puntos de demarcación, el tamaño, y el número de los bloques de construcción de ácidos nucleicos, y el tamaño y diseño de los acoplamientos. Además, se aprecia que el requerimiento de homología intermolecular está altamente relajado para la operación > de esta invención. De hecho, se pueden incluso seleccionar puntos de demarcación en áreas de poca o ninguna homología intermolecular. Por ejemplo, debido a la ondulación de los codones, es decir, la degeneración de los codones, se pueden introducir sustituciones de nucleótidos en los bloques de construcción de ácidos nucleicos sin alterar el aminoácido originalmente codificado en la plantilla progenitora correspondiente. De una manera alternativa, se puede alterar un codón, de tal manera que se altere la codificación de un aminoácido original . Esta invención dispone que se puedan introducir estas sustituciones en el bloque de construcción de ácido nucleico, con el objeto de aumentar la incidencia de puntos de demarcación homólogos intermoleculares, y por lo tanto, permitir que se logre un mayor número de acoplamientos entre los bloques de construcción, lo cual a su vez permite que se genere un mayor número de moléculas quiméricas de progenie. En otro aspecto, la naturaleza sintética del paso en el que se generan los bloques de construcción, permite el diseño y la introducción de nucleótidos (por ejemplo, uno o más nucleótidos, los cuales pueden ser, por ejemplo, codones o intrones o secuencias reguladoras) que posteriormente se pueden remover de manera opcional en un proceso in vitro (por ejemplo, mediante mutagénesis) , o en un proceso in vivo (por ejemplo, mediante la utilización de la capacidad de empalme de genes de un organismo huésped) . Se aprecia que, en muchos casos, también puede ser deseable la introducción de estos nucleótidos por muchas otras razones en adición al beneficio potencial de crear un punto de demarcación servible. En un aspecto, se utiliza un bloque de construcción de ácido nucleico para introducir un intrón. Por consiguiente, se introducen intrones funcionales en un gen hecho por el hombre fabricado de acuerdo con los métodos descritos en la presente. Los intrones artificialmente introducidos pueden ser funcionales en una célula huésped para el empalme de genes, de una manera muy parecida a la forma en que los intrones que se presentan naturalmente sirven funcionalmente en el empalme de genes. Sistema de Evolución Dirigida Optimizada La invención proporciona un sistema de modificación genética no estocástico denominado como "sistema de evolución dirigida optimizada" para generar polipéptidos , por ejemplo aldolasas o anti -cuerpos de la invención, con propiedades nuevas o alteradas. La evolución dirigida optimizada se refiere al uso de ciclos repetidos de reclasificación reductiva, recombinación, y selección, que permiten la evolución molecular dirigida de los ácidos nucleicos a través de recombinación. La evolución dirigida optimizada permite la generación de una gran población de secuencias quiméricas evolucionadas, en donde la población generada está significativamente enriquecida en secuencias que tienen un número de eventos cruzados previamente determinado. Un evento cruzado es un punto en una secuencia quimérica en donde se presenta un cambio en la secuencia desde una variante progenitora hasta otra variante progenitora. Este punto normalmente está en la unión en donde se ligan entre sí los oligonucleótidds de dos progenitores, para formar una sola secuencia. Este método permite calcular las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleótidos , de tal manera que se enriquece la población quimérica final de secuencias para el número seleccionado de eventos cruzados. Esto proporciona más control sobre la selección de las variantes quiméricas que tengan un número previamente determinado de eventos cruzados . En adición, este método proporciona un medio conveniente para explorar una tremenda cantidad del posible espacio variante de proteína en comparación con otros sistemas. Previamente, si se generaban, por ejemplo, 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, era extremadamente difícil probar este número tan alto de variantes quiméricas para determinar una actividad particular. Más aún, una porción significativa de la población de progenie tendría un número muy alto de eventos cruzados, que daría como resultado proteínas que tuvieran menos probabilidades de tener mayores niveles de una actividad particular. Mediante la utilización de estos métodos, se puede enriquecer la población de moléculas quiméricas para las variantes que tengan un número particular de eventos cruzados. Por consiguiente, aunque todavía se pueden generar 1013· moléculas quiméricas durante una reacción, cada una de las moléculas seleccionadas para el análisis adicional más probablemente tiene, por ejemplo, sólo tres eventos cruzados. Debido a que se puede desfasar la población de progenie resultante para tener un número previamente determinado de eventos cruzados, se reducen los límites sobre la variedad funcional entre las moléculas quiméricas. Esto proporciona un número más manejable de variables cuando se calcula cuál oligonucleótido a partir de los polinucleótidos progenitores originales, podría ser responsable de afectar un rasgo particular. Un método para crear una secuencia de polinucleótido de progenie quimérica, es crear oligonucleótidos correspondientes a fragmentos o porciones de cada secuencia progenitora. Cada oligonucleótido de preferencia incluye una región única de traslape, de tal manera que la mezcla de los oligonucleótidos entre sí da como resultado una nueva variante que tiene cada fragmento de oligonucleótido ensamblado en el orden correcto. Se puede encontrar también información adicional, por ejemplo, en la solicitud de patente US 09/332,835; y en la patente US 6,361,974. El número de oligonucleotidos generados para cada variante parental tiene una relación con el número total de cruces resultantes en la molécula quimérica que se crea finalmente. Por ejemplo, se podrían proporcionar tres variantes de secuencias de nucleótidos progenitoras para sufrir una reacción de ligamiento, con el objeto de encontrar una variante quimérica que tenga, por ejemplo, una mayor actividad a alta temperatura. Como un ejemplo, se puede generar un conjunto de 50 secuencias de oligonucleotidos correspondientes a cada una de las porciones de cada variante progenitora. De conformidad con lo anterior, durante el proceso de reensamble de ligamiento, podría haber hasta 50 eventos cruzados dentro de cada una de las secuencias quiméricas. La probabilidad de que cada uno de los polinucleótidos quiméricos generados contenga oligonucleotidos a partir de cada variante parental en orden alternado, es muy baja. Si cada fragmento de oligonucleótido está presente en la reacción de ligamiento en la misma cantidad molar, es probable que, en algunas posiciones, los oligonucleotidos a partir del mismo polinucleótido progenitor se liguen unos en seguida de otros, y por lo tanto, no den como resultado un evento cruzado. Si se mantiene constante la concentración de cada oligonucléotido a partir de cada progenitor durante cualquier paso de ligamiento en este ejemplo, hay 1/3 de oportunidad (asumiendo tres progenitores) de que un oligonucleótido a partir de la misma variante progenitora se ligue dentro de la secuencia quimérica y no produzca cruce. De conformidad con lo anterior, se puede determinar una función de densidad de probabilidad (PDF) para predecir la población de eventos cruzados que tienen probabilidades de presentarse durante cada paso en una reacción de ligamiento, dado un número establecido de variantes progenitoras , un número de oligonucleótidos correspondientes a cada variante, y las concentraciones de cada variante durante cada paso en la reacción de ligamiento. Más adelante se describen las estadísticas y matemáticas detrás de la determinación de la función de densidad de probabilidad. Mediante la utilización de estos métodos, se puede calcular la función de densidad de probabilidad, y de esta manera enriquecer la población de progenie quimérica para un número previamente determinado de eventos cruzados resultantes de una reacción de ligamiento particular. Más aún, se puede determinar previamente un número objetivo de eventos cruzados, y luego se programa el sistema para calcular las cantidades de partida de cada oligonucleótido progenitor durante cada paso en la reacción de ligamiento, para dar como resultado una función de densidad de probabilidad que se centre en un número previamente determinado de eventos cruzados. Estos métodos se refieren al uso de ciclos repetidos de reclasificación reductiva, recombinación, y selección, que permiten la evolución molecular dirigida de un ácido nucleico que codifique un polipéptido a través de recombinación. Este sistema permite la generación de una gran población de secuencias quiméricas evolucionadas, en donde la población generada se enriquece de una manera significativa en secuencias que tienen un número previamente determinado de eventos cruzados. Un evento cruzado es un punto en una secuencia quimérica en donde se presenta un cambio en la secuencia desde una variante progenitora hasta otra variante progenitora. Este punto normalmente está en la unión en donde se ligan entre sí los oligonucleotidos a partir de dos progenitores para formar una sola secuencia. El método permite calcular las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleotidos, de tal manera que se enriquece la población quimérica final de secuencias en el número seleccionado de eventos cruzados. Esto proporciona más control sobre la selección de variantes quiméricas que tengan un número previamente determinado de eventos cruzados. En adición, estos métodos proporcionan un medio conveniente para explorar una tremenda cantidad del posible espacio variante de proteína en comparación 'con otros sistemas. Mediante la utilización de los métodos descritos en la presente, la población de moléculas quiméricas se puede enriquecer en las variantes que tengan un número particular de eventos cruzados. Por consiguiente, aunque todavía se pueden generar 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, cada una de las moléculas seleccionadas para un análisis adicional más probablemente tiene, por ejemplo, solamente tres eventos cruzados. Debido a que la población de progenie resultante se puede desfasar para tener un número previamente determinado de eventos cruzados, se reducen los límites sobre la variedad funcional entre las moléculas quiméricas. Esto proporciona un número más manejable de variables cuando se calcula cuál oligonucleótido a partir de los polinucleótidos progenitores originales, podría ser responsable de afectar un rasgo particular. En un aspecto, el método crea una secuencia de polinucleótido de progenie quimérica mediante la creación de oligonucleótidos correspondientes a fragmentos o porciones de cada secuencia progenitora. Cada oligonucleótido de preferencia incluye una región única de traslape, de tal manera que la mezcla de los oligonucleótidos entre sí da como resultado una nueva variante que tiene cada fragmento de oligonucleótido ensamblado en el orden correcto. Ver también la solicitud de patente US 09/332, 835. Determinación de Eventos Cruzados Los aspectos de la invención incluyen un sistema y software que reciben una función de densidad de probabilidad (PDF) de cruce deseada, el número de genes progenitores que se van a reensamblar, y el número de fragmentos en el reensamble como entradas. La salida de este programa es una "función de densidad de probabilidad de fragmento" que se puede utilizar para determinar' una receta para producir genes reensamblados, y la función de densidad de probabilidad de cruce estimada de estos genes. El procesamiento descrito en la presente de preferencia se lleva a cabo en MATLAB (The athworks, Natick, Massachusetts , Estados Unidos) , un lenguaje de programación y un medio ambiente de desarrollo para computación técnica. Procesos Iterativos En la práctica de la invención, estos procesos se pueden repetir de una manera iterativa. Por ejemplo, un ácido nucleico (o el ácido nucleico) responsable de un fenotipo de aldolasa alterado o nuevo, se identifica, se vuelve a aislar, se modifica nuevamente, se vuelve a probar para determinar su actividad. Este proceso se puede repetir de una manera iterativa hasta que se diseñe un fenotipo deseado. Por ejemplo, se puede diseñar una senda anabólica o catabolica bioquímica entera en una célula, incluyendo, por ejemplo, la actividad de la hidrólisis de almidón. De una manera similar, si se determinar que un oligonucleotido particular no tiene efecto alguno sobre el rasgo deseado (por ejemplo, un nuevo fenotipo de aldolasa) , se puede remover como una variable, sintetizando oligonucleótidos progenitores más grandes que incluyan la secuencia que se vaya a remover. Debido a que la incorporación de la secuencia dentro de una secuencia más grande impide cualquier evento cruzado, ya no habrá variación alguna de esta secuencia en los polinucleótidos de progenie . Esta práctica iterativa de determinar cuáles oligonucleótidos están más relacionados con el rasgo deseado, y cuáles no están relacionados, permite hacer una exploración más eficiente de todas las variantes de proteína posible que podrían proporcionar un rasgo o actividad particular. Mezcla In Vivo La mezcla in vivo de moléculas es el uso en los métodos de la invención que proporciona variantes de polipéptidos de la invención, por ejemplo anti -cuerpos , aldolasas, y similares. La mezcla in vivo se puede llevar a cabo utilizando la propiedad natural de las células para recombinar multímeros. Aunque la recombinación in vivo ha proporcionado la principal ruta natural hacia la diversidad molecular, la recombinación genética sigue siendo un proceso relativamente complejo que involucra: 1) el reconocimiento de homologías; 2) la disociación de cadena, invasión de cadena, y pasos metabólicos que conducen a la producción de quiasma recombinante ; y finalmente 3) la resolución del quiasma en moléculas recombinadas separadas. La formación del quiasma requiere del reconocimiento de secuencias homologas. En un aspecto, la invención proporciona un método para producir un polinucleótido híbrido a partir de cuando menos un primer polinucleótido (por ejemplo, una aldolasa de la invención) y un segundo polinucleótido (por ejemplo, una enzima, tal como una aldolasa de la invención o cualquier otra aldolasa, o una marca o un epítopo) . La invención se puede utilizar para producir un polinucleótido híbrido mediante la introducción de cuando menos un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido que compartan cuando menos una región de homología de secuencia parcial en una célula huésped adecuada. Las regiones de homología de secuencia parcial promueven procesos que dan como resultado una reorgnización de la secuencia, produciendo un polinucleótido híbrido. El término "polinucleótido híbrido", como se utiliza en la presente, es cualquier secuencia de nucleótidos que resulte del método de la presente invención, y que contenga la secuencia a partir de cuando menos dos secuencias de polinucleótidos originales. Estos polinucleótidos híbridos pueden resultar de eventos de recombinación intermolecular que promueven la integración de secuencia entre las moléculas de ADN. En adición, estos polinucleótidos híbridos pueden resultar de los procesos de reclasificación reductiva intramolecular, que utilizan secuencias repetidas para alterar una secuencia de nucleótidos dentro de una molécula de ADN. Producción de Variantes de Secuencia La invención también proporciona métodos adicionales para hacer variantes de secuencia de las secuencias de ácidos nucleicos (por ejemplo, aldolasa) de la invención. La invención también proporciona métodos adicionales para aislar aldolasas utilizando los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención.
En un aspecto, la invención proporciona variantes de una secuencia de codificación de aldolasa (por ejemplo, un gen, ADNc, o mensaje) de la invención, las cuales se pueden alterar por cualquier medio, incluyendo, por ejemplo, métodos aleatorios o estocásticos , o métodos no estocásticos o de "evolución dirigida", como se describen en lo anterior. Las variantes aisladas pueden presentarse naturalmente. Las variantes también se pueden crear in vi tro. Las variantes se pueden crear empleando técnicas de ingeniería genética, tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis química aleatoria, procedimientos de supresión de exonucleasa III, y técnicas de clonación convencionales. De una manera alternativa, estas variantes, fragmentos, análogos, o derivados, se pueden crear empleando procedimientos de síntesis o modificación química. Otros métodos para hacer variantes también son familiares para los técnicos en este campo. Éstos incluyen procedimientos en donde se modifican las secuencias de ácidos nucleicos obtenidas a partir de aislados naturales, para generar ácidos nucleicos que codifiquen polipéptidos que tengan características que mejoren su valor en las aplicaciones industriales o de laboratorio. En estos procedimientos, se generan y caracterizan un gran número de secuencias variantes que tienen una o más diferencias de nucleotidos con respecto a la secuencia obtenida a partir del aislado natural . Estas diferencias de nucleotidos pueden dar como resultado cambios de aminoácidos con respecto a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos a partir de los aislados naturales. Por ejemplo, se pueden crear variantes utilizando reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error. En la reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error, se lleva a cabo la reacción en cadena de la polimerasa bajo condiciones en donde la fidelidad de copiado de la polimerasa de ADN sea baja, de tal manera que se obtenga un alto índice de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de reacción en cadena de la polimerasa. La reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error se describe, por ejemplo, en Leung, D. W. y colaboradores, Technique, 1:11-15,1989, y Caldwell, R. C. y Joyce G. F., PCR Methods Applic, 2:28-33, 1992. Dicho de una manera breve, en estos procedimientos, los ácidos nucleicos que se vayan a mutar se mezclan con los cebadores de reacción en cadena de la polimerasa, el regulador de reacción, MgCl2, MnCl2, polimerasa Taq, y una concentración apropiada de dNTPs, para alcanzar un alto índice de mutación puntual a lo largo de toda la longitud del producto de reacción en cadena de la polimerasa. Por ejemplo, la reacción se puede llevar a cabo utilizando 20 ficomoles de ácido nucleico que se vaya a mutar, 30 picomoles de cada cebador de reacción en cadena de la polimerasa, un regulador de reacción que comprenda KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH de 8.3), y gelatina al 0.01 por ciento, MgCl2 7 mM, MnCl2 0.5 mM, 5 unidades de polimerasa Taq, dGTP 0.2 mM, dATP 0.2 mM, dCTP 1 mM, y dTTP 1 mM. La reacción en cadena de la polimerasa se puede llevar a cabo por 30 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 45°C durante 1 minuto, y 72°C durante 1 minuto. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se pueden variar según sea apropiado. Los ácidos nucleicos mutados se clonan en un vector apropiado, y se evalúan las actividades de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos mutados. También se pueden crear variantes utilizando mutagénesis dirigida al oligonucleotido, para generar mutaciones específicas del sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis del oligonucleotido se describe, por ejemplo, en Reidhaar-Olson (1988) Science 241:53-57. Brevemente, en estos procedimientos, una pluralidad de oligonucleótidos de doble cadena que lleven una o más mutaciones que se vayan a introducir en el ADN clonado, se sintetizan y se insertan en el ADN clonado que se vaya a mutar. Se recuperan los clones que contengan el ADN mutado, y se evalúan las actividades de los polipéptidos que codifiquen. Otro método para generar variantes es la reacción en cadena de la polimerasa de ensamble. La reacción en cadena de la polimerasa de ensamble involucra el ensamble de un producto de reacción en cadena de la polimerasa a partir de una mezcla de fragmentos de ADN pequeños. Se presentan un gran número de reacciones en cadena de la polimerasa diferentes en paralelo en el mismo frasco, cebando los productos de una reacción a los productos de otra reacción. La reacción en cadena de la polimerasa de ensamble se describe, por ejemplo, en la patente US 5, 965, 408. Todavía otro método para generar variantes, es la mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa sexual. En la mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa sexual, se presenta una recombinación homologa forzada entre las moléculas de ADN de secuencias de ADN diferentes pero altamente relacionadas in vitro, como un resultado de la fragmentación aleatoria de la molécula de ADN, basándose en la homología de secuencias, seguida por fijación del cruce mediante extensión del cebador en una reacción en cadena de la polimerasa. La mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa sexual se describe, por ejemplo, en Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:10747-10751. Dicho de una manera breve, en estos procedimientos, una pluralidad de ácidos nucleicos que se vayan a recombinar, se digieren con ADNsa para generar fragmentos que tengan un tamaño promedio de 50 a 200 nucleótidos. Los fragmentos del tamaño promedio deseado se purifican y se vuelven a suspender en una mezcla de reacción en cadena de la polimerasa. La reacción en cadena de la polimerasa se conduce bajo condiciones que faciliten la recombinación entre los fragmentos de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa se puede llevar a cabo volviendo a suspender los fragmentos purificados en una concentración de 10 a 30 nanogramos/ml en una solución de 0.2 mM de cada dNTP, MgCl2 2.2 mM, KC1 50 mM, Tris-Hcl 10 mM, pH de 9.0, y Tritón X-100 al 0.1 por ciento. Se agregan 2.5 unidades de polimerasa Taq por 100:1 de mezcla de reacción, y se lleva a cabo la reacción en cadena de la polimerasa empleando el siguiente régimen: 94°C durante 60 segundos, 94°C durante 30 segundos, 50-55QC durante 30 segundos, 72°c durante 30 segundos (de 30 a 45 veces) , y 72°C durante 5 minutos. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se pueden variar según sea apropiado. En algunos aspectos, se pueden incluir oligonucleótidos en las reacciones en cadena de la polimerasa. En otros aspectos, se puede utilizar el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN en un primer conjunto de reacciones en cadena de la polimerasa, y se puede utilizar polimerasa Taq en un conjunto subsecuente de reacciones en cadena de la polimerasa. Se aislan las secuencias recombinantes , y se evalúan las actividades de los polipéptidos que codifiquen. También se pueden crear variantes mediante mutagénesis in vivo. En algunos aspectos, se generan mutaciones aleatorias en una secuencia de interés, mediante la propagación de la secuencias de interés en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli, la cual lleve mutaciones en una o más de las sendas de reparación de ADN. Estas cepas "mutadoras" tienen un índice de mutación aleatoria más alto que aquél de una progenitora de tipo silvestre. La propagación del ADN en una de estas cepas eventualmente generará mutaciones aleatorias adentro del ADN. Las cepas mutadoras adecuadas para utilizarse para la mutagénesis in vivo se describen, por ejemplo, en la publicación internacional WO 91/16427: También se pueden generar variantes utilizando mutagénesis de cásete. En la mutagénesis de cásete, una pequeña región de una molécula de ADN de doble cadena es reemplazada con un "cásete" de oligonucleótido sintético que difiera de la secuencia nativa. El oligonucleótido con frecuencia contiene a la secuencia nativa completamente y/o parcialmente aleatorizada . También se puede emplear mutagénesis de ensamble recursivo para generar variantes. La mutagénesis de ensamble recursivo es un algoritmo para el diseño de proteínas (mutagénesis de proteínas) desarrollado para producir poblaciones diversas de mutantes fenotípicamente relacionados cuyos miembros difieren en la secuencia de aminoácidos. Este método utiliza un mecanismo de retroalimentación para controlar las rondas sucesivas de mutagénesis de cásete de combinación. La mutagénesis de ensamble recursivo se describe, por ejemplo, en Arkin (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:7811-7815. En algunos aspectos, se crean variantes utilizando mutagénesis de ensamble exponencial . La mutagénesis de ensamble exponencial es un proceso para generar bibliotecas de combinación con un alto porcentaje de mutantes únicos y funcionales, en donde pequeños grupos de residuos se seleccionan aleatoriamente en paralelo para identificar, en cada posición alterada, los aminoácidos que conduzcan a las proteínas funcionales. La mutagénesis de ensamble exponencial se describe, por ejemplo, en Delegrave (1993) Biotechnology Res . 11:1548-1552. La mutagénesis aleatoria y dirigida al sitio se describen, por ejemplo, en Arnold (1993) Current Opinión in Biotechnology 4:450-455. En algunos aspectos, las variantes se crean utilizando procedimientos de mezcla, en donde se fusionan entre sí porciones de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifiquen polipéptidos distintos, para crear secuencias de ácidos nucleicos quiméricas que codifiquen polipéptidos quiméricos, como se describe, por ejemplo, en las patentes US 5,965,408 y 5,939,250 (ver también la discusión anterior) . La invención también proporciona variantes de polipéptidos de la invención (por ejemplo, aldolasas) que comprenden secuencias en donde uno o más de los residuos de aminoácidos (por ejemplo, de un polipéptido de ejemplo de la invención) son sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (por ejemplo, un residuo de aminoácido conservado) , y este residuo de aminoácido sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético. Las sustituciones conservadoras son aquéllas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Por consiguiente, los polipéptidos de la invención incluyen aquéllos con sustituciones conservadoras de secuencias de la invención, por ejemplo los polipéptidos de ejemplo de la invención, incluyendo, pero no limitándose a, los siguientes reemplazos: los reemplazos de un aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina, e isoleucina, con otro aminoácido alifático; el reemplazo de una serina con una treonina o viceversa; el reemplazo de un residuo ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico, con otro residuo ácido; el reemplazo de un residuo que lleve un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, con otro residuo que lleve un grupo amida; el intercambio de un residuo básico, tal como lisina y arginina, con otro residuo básico; y el reemplazo de un residuo aromático, tal como fenilalanina , tirosina, con otro residuo aromático. Otras variantes son aquéllas en donde uno o más de los residuos de aminoácidos de los polipéptidos de la invención incluyen un grupo sustituyente . Otras variantes dentro del alcance de la invención son aquéllas en donde el polipéptido está asociado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido, por ejemplo polietilenglicol . Las variantes adicionales dentro del alcance de la invención son aquéllas en donde se fusionan aminoácidos adicionales al polipéptido, tales como una secuencia líder, una secuencia secretora, una secuencia de proproteína, o- una secuencia que facilite la purificación, el enriquecimiento, o la estabilización del polipéptido. En algunos aspectos, las variantes, fragmentos, derivados, y análogos de los polipéptidos de la invención, retienen la misma función o actividad biológica que los polipéptidos de ejemplo, por ejemplo la actividad de aldolasa, como se describe en la presente. En otros aspectos, la variante, fragmento, derivado, o análogo incluye una proproteína, de tal manera que la variante, el fragmento, derivado, o análogo puede ser activado por la disociación de la porción de proproteína para producir un polipéptido activo. Optimización de Codones para Alcanzar Altos Niveles de Expresión de Proteína en las Células Huéspedes La invención proporciona métodos para modificar ácidos nucleicos que codifican aldolasa, con el fin de modificar el uso de codones. En un aspecto, la invención proporciona métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica una aldolasa, con el fin de aumentar o reducir su expresión en una célula huésped. La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican una aldolasa modificada para aumentar su expresión en una célula huésped, la aldolasa así modificada, y métodos para hacer las aldolasas modificadas. El método comprende identificar un codón "no preferido" o un codón "menos preferido" en el ácido nucleico que codifica aldolasa, y reemplazar uno o más de estos codones no preferidos o menos preferidos con un "codón preferido" que codifique el mismo aminoácido que el codón reemplazado, y cuando menos un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico ha sido reemplazado por un codón preferido que codifique el mismo aminoácido. Un codón preferido es un codón sobre -representado en las secuencias de codificación de los genes de la célula huésped, y un codón no preferido o menos preferido es un codón sub- representado en las secuencias de codificación de los genes de la célula huésped. Las células huéspedes para expresar los ácidos nucleicos, los casetes de expresión, y los vectores de la invención, incluyen bacterias, levadura, hongos, células de plantas, células de insectos, y células de mamíferos. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para optimizar el uso de codones en todas estas células, ácidos nucleicos y polipéptidos con los codones alterados hechos mediante los ácidos nucleicos con los codones alterados. Los ejemplos de las células huéspedes incluyen bacterias gram-negativas , tales como Escherichia coli; bacterias gram-positivas , tales como Bacillus cereus , Streptomyces , Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris , Bacillus subtilis . Las células huéspedes de ejemplo también incluyen organismos eucarióticos , por ejemplo diferentes levaduras, tales como Saccharomyces sp. , incluyendo Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, y Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha , Aspergillus niger, y células y lineas celulares de mamífero, y células y líneas celulares de insecto. Por consiguiente, la invención también incluye ácidos nucleicos y polipéptidos optimizados para su expresión en estos organismos y especies.
Por ejemplo, los codones de un ácido nucleico que codifique una aldolasa aislada a partir de una célula bacteriana, se modifican de tal manera que el ácido nucleico se exprese de una manera óptima en una célula bacteriana diferente de la bacteria a partir de la cual se derivó la aldolasa, en una levadura, un hongo, una célula de planta, una célula de insecto, o una célula de mamífero. Los métodos para optimizar los codones son bien conocidos en la materia, ver, por ejemplo, la patente US 5,795,373; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118; Hale (1998) Protein Expr . Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun . 69:7250-7253. Ver también Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253, que describe la optimización de codones en sistemas de ratón; Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24, que describe la optimización de codones en levadura; Feng (2000) Biochemistry 39:15399-15409, que describe la optimización de codones en E. coli; Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264, que describe la optimización del uso de codones que afecta la secreción en E. coli. Animales No Humanos Transqénicos La invención proporciona animales no humanos transgénicos que comprenden un ácido nucleico, un polipéptido (por ejemplo, una aldolasa), un cásete o vector de expresión, o una célula transfectada o transformada de la invención. La invención también proporciona métodos para hacer y usar estos animales no humanos transgénicos.
Los animales no humanos transgénicos pueden ser, por ejemplo, cabras, conejos, ovejas, cerdos, vacas, ratas, y ratones, que comprendan a los ácidos nucleicos de la invención. Estos animales se pueden utilizar, por ejemplo, como modelos in vivo para estudiar la actividad de la aldolasa, o como modelos para rastrear agentes que cambien la actividad de la aldolasa in vivo. Las secuencias de codificación para los polipéptidos que se vayan a expresar en los animales no humanos transgénicos se pueden diseñar como constitutivas, o bajo el control de factores reguladores de transcripción específicos del tejido, específicos del desarrollo, o inducibles. Los animales no humanos transgénicos se pueden diseñar y generar empleando cualquier método conocido en la materia; ver, por ejemplo, las patentes US 6,211,428; 6,187,992; 6,156,952; 6,118,044; 6,111,166; 6,107,541; 5,959,171; 5,922,854; 5,892,070; 5,880,327; 5,891,698; 5,639,940; 5,573,933; 5,387,742; 5,087,571, que describen la fabricación y uso de células y huevos transformados, y de ratones, ratas, conejos, ovejas, cerdos, y vacas transgénicas . Ver también, por ejemplo, Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157, que describe la producción de proteínas recombinantes en la leche de animales lecheros transgénicos; Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17:456-461, que demuestra la producción de cabras transgénicas. La patente US 6,211,428 describe la fabricación y uso de mamíferos no humanos transgénicos que expresan en sus cerebros una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN. La patente US 5,387,742 describe la inyección de secuencias de ADN recombinantes o sintéticas clonadas en huevos de ratón fertilizados, la implantación de huevos inyectados en hembras pseudo-preñadas , y el crecimiento hasta término de ratones transgénicos cuyas células expresan proteínas relacionadas con la patología de la enfermedad de Alzheimer. La patente US 6,187,992 describe la fabricación y uso de un ratón transgénico cuyo genoma comprende una alteración del gen que codifica la proteína precursora amiloide (APP) . También se pueden utilizar "animales con eliminación genética" para practicar los métodos de la invención. Por ejemplo, en un aspecto, los animales transgénicos o modificados de la invención comprenden un "animal con eliminación genética", por ejemplo un "ratón con eliminación genética", diseñado para no expresar un gen endógeno, el cual es reemplazado con un gen que exprese una aldolasa de la invención, o una proteína de fusión que comprenda una aldolasa de la invención. Plantas y Semillas Transqénicas La invención proporciona plantas y semillas transgénicas qué comprenden un ácido nucleico, un polipéptido (por ejemplo, una aldolasa, tal como una alfa-aldolasa) , un cásete o vector de expresión, o una célula transfectada o transformada de la invención. La invención también proporciona productos de plantas, por ejemplo aceites, semillas, hojas, extractos, y similares, que comprenden un ácido nucleico y/o un polipéptido (por ejemplo, una aldolasa, tal como una alfa-aldolasa) de la invención. La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot) . La invención también proporciona métodos para hacer y usar estas plantas y semillas transgénicas . La planta o célula de planta transgénica que exprese un polipéptido de la invención, se puede construir de acuerdo con cualquier método conocido en este campo. Ver, por ejemplo, la patente US 6,309,872. Se pueden introducir ácidos nucleicos y construcciones de expresión de la invención en una célula de planta por cualquier medio. Por ejemplo, los ácidos nucleicos o las construcciones de expresión se pueden introducir en el genoma de una planta huésped deseada, o los ácidos nucleicos o construcciones de expresión pueden ser episomas. La introducción en el genoma de una planta deseada puede ser tal que se regule la producción de alfa-aldolasa del huésped mediante elementos de control de transcripción o de traducción endógenos. La invención también proporciona "plantas con eliminación genética", en donde la inserción de la secuencia genética mediante, por ejemplo, recombinación homologa, ha alterado la expresión del gen endógeno. Los medios para generar plantas "con eliminación genética" son bien conocidos en la materia, ver, por ejemplo, Strepp (1998) Proc Natl. Acad. Sci. USA 95:4368-4373; Miao (1995) Plant J. 7:359-365. Ver la discusión sobre plantas transgénicas más adelante .
Los ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar para conferir rasgos deseados a esencialmente cualquier planta, por ejemplo a plantas productoras de almidón, tales como papa, trigo, arroz, cebada, y similares. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar para manipular las sendas metabólicas de una planta, con el objeto de optimizar o alterar la expresión de alfa-aldolasa del huésped. Pueden cambiar la proporción de 'la conversión de almidón/azúcar en una planta. Esto puede facilitar el procesamiento industrial de una planta. De una manera alternativa, las alfa-aldolasas de la invención se pueden utilizar en la producción de una planta transgénica para producir un compuesto que no sea naturalmente producido por esa planta. Esto puede reducir los costos de producción o crear un producto novedoso . En un aspecto, el primer paso en la producción de una planta transgénica involucra hacer una construcción de expresión para expresarse en una célula de planta. Estas técnicas son bien conocidas en este campo. Pueden incluir seleccionar y clonar un promotor, una secuencia de codificación para facilitar el enlace eficiente de los ribosomas al ARNm, y seleccionar las secuencias terminadoras de genes apropiadas. Un promotor constitutivo de ejemplo es el CaMV35S, a partir del virus de mosaico de coliflor, que en general da como resultado un alto grado de expresión en plantas . Otros promotores son más específicos y responden a claves en el medio ambiente interno o externo de la planta. Un promotor inducible por luz de ejemplo es el promotor a partir del gen cab, que codifica la proteína de enlace de clorofila a/b mayor . En un aspecto, el ácido nucleico se modifica para lograr una mayor expresión en una célula de planta. Por ejemplo, es probable que una secuencia de la invención tenga un porcentaje más alto de pares de nucleotidos A-T, comparándose con lo que se ve en una planta, algunas de las cuales prefieren pares de nucleotidos G-C. Por consiguiente, los nucleotidos A-T de la secuencia de codificación pueden ser sustituidos con nucleotidos G-C, sin cambiar de una manera significativa la sécuencia de aminoácidos, para mejorar la producción del producto genético en células de plantas. Se puede agregar un gen marcador seleccionable a la construcción genética con el objeto de identificar células o tejidos de plantas que hayan integrado con éxito el transgén. Esto puede ser necesario debido a que el logro de la incorporación y expresión de genes en células de plantas es un evento raro, que se presenta en solamente un pequeño porcentaje de los tejidos o células dirigidos. Los genes marcadores seleccionables codifican proteínas que proporcionan resistencia a agentes que normalmente son tóxicos para las plantas, tales como antibióticos o herbicidas. Solamente sobrevivirán las células de plantas que hayan integrado el gen marcador seleccionable cuando se cultiven en un medio que contenga el antibiótico o herbicida apropiado. Como para otros genes insertados, los genes marcadores también requieren de secuencias promotoras y de terminación para su función apropiada. En un aspecto, el hacer plantas o semillas transgénicas comprende incorporar las secuencias de la invención, y opcionalmente genes marcadores, en una construcción de expresión objetiva (por ejemplo, un plásmido) , junto con la colocación del promotor y de las secuencias terminadoras . Esto puede involucrar transferir el gen modificado a la planta a través de un método adecuado. Por ejemplo, se puede introducir una construcción directamente en el ADN genómico de la célula de planta empleando técnicas tales como electroporación y microinyección de protoplastos de células de plantas, o se pueden introducir las construcciones directamente en el tejido de la planta empleando métodos balísticos, tales como bombardeo de partículas de ADN. Por ejemplo, ver, por ejemplo, Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35:197-203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol . 6:17-30; Klein (1987) Nature 327:70-73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72:63-69, que describen el uso del bombardeo de partículas para introducir transgenes en el trigo; y Adam (1997) supra , que utiliza el bombardeo de partículas para introducir cromosomas artificiales de levadura en células de plantas. Por ejemplo, Rinehart (1997) supra, utilizó bombardeo de partículas para generar plantas de algodón transgénicas. El aparato para acelerar las partículas se describe en la patente US 5,015,580; y el instrumento de aceleración de partículas comercialmente disponible BioRad (Biolistics) PDS-2000; ver también John, patente US 5,608,148; y Ellis, patente US 5,681,730, que describen la transformación de gimnospermas mediada por partículas . En un aspecto, los protoplastos se pueden inmovilizar e inyectar con un ácido nucleico, por ejemplo una construcción de expresión. Aunque no es fácil la regeneración de la planta a partir de protoplastos con los cereales, es posible la regeneración de la planta con las legumbres utilizando embriogénesis somática a partir de callo derivado del protoplasto. Los tejidos organizados se pueden transformar con ADN desnudo empleando la técnica de la pistola genética, en donde se recubren microproyectiles de tungsteno con ADN, disparados a 1/100 del tamaño de las células, que llevan al ADN profundamente hacia adentro de las células y los organelos. Luego se induce al tejido transformado para regenerarse, usualmente mediante embriogénesis somática. Esta técnica ha tenido éxito en varias especies de cereales, incluyendo maíz y arroz. Los ácidos nucleicos, por ejemplo las construcciones de expresión, también se pueden introducir en las células de plantas utilizando virus recombinantes . Las células de plantas se pueden transformar utilizando vectores virales, tales como, por ejemplo, vectores derivados de virus de mosaico de tabaco (Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999), ver Porta. (1996) "Use of viral replicons for the expression of genes in plants", Mol. Biotechnol. 5:209-221. De una manera alternativa, los ácidos nucleicos, por ejemplo una construcción de expresión, se pueden combinar con las regiones de flanqueo de ADN-T adecuadas, y se pueden introducir en un vector huésped de Agrobacterium tumefaciens convencional. Las funciones de virulencia del huésped de Agrobacterium tumefaciens dirigirán la inserción de la construcción y del marcador adyacente hacia adentro del ADN de la célula de planta cuando la célula sea infectada por la bacteria. Las técnicas de transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens , incluyendo el desarmado y uso de vectores binarios, están bien descritas en la literatura científica. Ver, por ejemplo, Horsch (1984) Science 233:496-498; Fraley (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983) ; Gene Transfer to Plants, Potrykus, editor (Springer-Verlag, Berlín 1995) . El ADN en una célula de A. tumefaciens está contenido en el cromosoma bacteriano, así como en otra estructura conocida como un plásmido Ti (inductor de tumor) . El plásmido Ti contiene un estiramiento de ADN denominado ADN-T (de aproximadamente 20 kb de largo) que se transfiere a la célula de planta en el proceso de infección, y una serie de genes vir (de virulencia) que dirigen el proceso de infección. A. tumefaciens solamente puede infectar una planta a través de las heridas; cuando se hiere una raíz o tallo de planta, desprende ciertas señales químicas, en respuesta a las cuales, llegan a activarse los genes vir de A. turnefaciens , y dirigen una serie de eventos necesarios para la transferencia del ADN-T a partir del plásmido Ti hasta el cromosoma de la planta. Luego el ADN-T entra a la célula de la planta a través de la herida. Una especulación es que el ADN-T ' espera hasta que se esté replicando o transcribiendo el ADN de la planta, y luego se inserta en el ADN de la planta expuesto. Con el objeto de utilizar A. turnefaciens como un vector de transgén, se tiene que remover la sección inductora de tumor del ADN-T, mientras que se retienen las regiones del borde del ADN-T y los genes vir. Entonces se inserta el transgén entre las regiones de borde del ADN-T, en donde se transfiere a la célula de planta y llega a integrarse en los cromosomas de la planta. La invención proporciona la transformación de plantas monocotiledóneas utilizando los ácidos nucleicos de la invención, incluyendo cereales importantes, ver Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218. Ver también, por ejemplo, Horsch, Science (1984) 233:496; Fraley (1983) Proc . Nati Acad. Sci USA 80:4803; Thykjaer (1997) supra; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135-1148, que describen la integración del ADN-T en el ADN genómico. Ver también D'Halluin, patente US 5,712,135, que describe un proceso para la integración estable de un ADN que comprende un gen que es funcional en una célula de un cereal, o de otra planta monocotiledónea .
En un aspecto, el tercer paso puede involucrar la selección y regeneración de plantas enteras capaces de transmitir el gen objetivo incorporado a la siguiente generación. Estas técnicas de regeneración se apoyan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejido, que se apoya típicamente en un marcador de biocida y/o herbicida que se haya introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans y colaboradores, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, páginas 124-176, Mac illilan Publishing Company, Nueva York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts , páginas 21-73, CRC Press, Boca Ratón, 1985. La regeneración también se puede obtener a partir de callo de plantas, explantes, órganos, o partes de los mismos. Estas técnicas de regeneración se describen en general en Klee (1987) Ann . Rev. of Plant Phys. 38:467-486. Con el fin de obtener plantas enteras a partir de los tejidos transgénicos , tales como embriones inmaduros, se pueden cultivar bajo condiciones medio-ambientales controladas, en una serie de medios que contengan nutrientes y hormonas, un proceso conocido como cultivo de tejido. Una vez que se generan plantas i enteras y producen semillas, empieza la evaluación de la progenie . Después de que se incorpora establemente el cásete de expresión en las plantas transgénicas , se puede introducir en otras plantas mediante cruza sexual. Se puede emplear cualquiera de un número de técnicas de reproducción convencionales, dependiendo de la especie que se vaya a cruzar. Debido a que la expresión transgénica de los ácidos nucleicos de la invención conduce a cambios fenotípicos, las plantas que comprendan los ácidos nucleicos recombinantes de la invención se pueden cruzar sexualmente con una segunda planta para obtener un producto final. Por consiguiente, la semilla de la invención se puede derivar a partir de una cruza entre dos plantas transgénicas de la invención, o de una cruza entre una planta de la invención y otra planta. Los efectos deseados (por ejemplo, la expresión de los polipéptidos de la invención para producir una planta en donde se altere el comportamiento del florecimiento) se pueden mejorar cuando ambas plantas progenitoras expresen los polipéptidos (por ejemplo, una aldolasa, tal como una alfa-aldolasa) de la invención. Los efectos deseados se pueden pasar a las generaciones futuras de las plantas por medios de propagación convencionales. Los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención se expresan en, o se insertan en, cualquier planta o semilla. Las plantas transgénicas de la invención pueden ser dicotiledóneas o monocotiledóneas . Los ejemplos de las plantas transgénicas monocotiledóneas de la invención son pastos, tales como pasto de prados (pasto azul, Poa) , pasto de forraje tal como festuca, lolio, pasto templado, tal como Agrostis , y cereales, por ejemplo trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y maíz. Los ejemplos de las plantas transgénicas dicotiledóneas de la invención son tabaco, legumbres, tales como lupinas, papa, remolacha azucarera, chícharo, frijol y semilla de soya, y las plantas cruciferas (familia Brassicaceae) , tales como coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo estrechamente relacionado de Arabidopsis thaliana. Por consiguiente, las plantas y semillas transgénicas de la invención incluyen un amplio rango de plantas, incluyendo, pero no limitándose a, las especies de los géneros Anacardium , Arachis, Asparagus , Atropa, Avena, Brassica , Citrus, Citrullus , Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea,Cucumis, Cucúrbita, Daucus, Elaeis, Fragaria , Glycine, Gossypium , Helianthus , Heterocallis , Hordeum, Hyoscyamus , Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus , Lycopersicon , Malus, Manihot, Majorana , Medicago, Nicotiana , Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus , Prunus, Raphanus , Ricinus , Sécale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella , Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, y Zea. En las modalidades alternativas, los ácidos nucleicos de la invención se expresan en plantas que contengan células de fibra, incluyendo, por ejemplo, algodón, árbol de algodón de seda (Kapok, Ceiba pentandra) , cedro del desierto, arbusto de creosota, gaulteria, balsa, ramie, kenaf, cáñamo, rosella, yute, sisal abacá, y lino. En las modalidades alternativas, las plantas transgénicas de la invención pueden ser miembros del género Gossypium, incluyendo los miembros de cualquier especie de Gossypium, tales como G. arboreum ;. G. herbaceum , G. barbadense, y G. hirsutum . La invención también proporciona plantas transgénicas con el fin de utilizarse para producir grandes cantidades de los polipéptidos (por ejemplo, una aldolasa, tal como una alfa-aldolasa) de la invención. Por ejemplo, ver Palmgren (1997) Trends Genet. 13:348; Chong (1997) Transgenic Res . 6:289-296 (que produce la proteína beta-caseína de leche humana en plantas de papa transgénicas utilizando un promotor de sintasa de manopina bidireccional inducible por auxina (masl',2') con métodos de transformación de disco de hoja mediada por Agrobacterium turnefaciens) . Empleando los procedimientos conocidos, un técnico puede rastrear las plantas de la invención mediante la detección del aumento o la reducción del ARNm o proteína del transgén en plantas transgénicas. Los medios para detectar y cuantificar ARNms o proteínas son bien conocidos en la materia. Polipéptidos y Péptidos En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que tienen una identidad de secuencia (por ejemplo, una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, e.1 51 por ciento, el 52 por ciento, el 53 por ciento, el 54 por ciento, el 55 por ciento, el 56 por ciento, el 57 por ciento, el 58 por ciento, el 59 por ciento, el 60 por ciento, el 61 por ciento, el 62 por ciento, el 63 por ciento, el 64 por ciento, el 65 por ciento, el 66 por ciento, el 67 por ciento, el 68 por ciento, el 69 por ciento, el 70 átomos de carbono, el 71 átomos de carbono, el 72 por ciento, el 73 por ciento, el 74 por ciento, el 75 por ciento, el 76 por ciento, el 77 por ciento, el 78 por ciento, el 79 por ciento, el 80 por ciento, el 81 por ciento, el 82 por ciento, el 83 por ciento, el 84 por ciento, el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento o más, o completa (100 por ciento)) con una secuencia de ejemplo de la invención, por ejemplo las SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 110 SEQ ID NO: 112 SEQ ID NO: 114 SEQ ID NO: 116 SEQ ID NO:118 SEQ ID NO: 120 SEQ ID NO: 122 SEQ ID NO: 124 SEQ ID NO:126 SEQ ID NO: 128 SEQ ID NO:130 SEQ ID NO: 132 SEQ ID NO: 134 SEQ ID NO: 136 SEQ ID NO:138 SEQ ID NO: 140 SEQ ID NO: 142 SEQ ID NO: 144 SEQ ID NO:146 SEQ ID NO: 148 SEQ ID NO: 150 SEQ ID NO: 152 SEQ ID NO: 154 SEQ ID NO: 156 SEQ ID NO: 158 SEQ ID NO: 160 SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 164 SEQ ID NO:166 SEQ ID NO: 168 SEQ ID NO:190 SEQ ID NO: 192 SEQ ID NO: 194 SEQ ID NO: 204 SEQ ID NO: 206 SEQ ID NO:208 SEQ ID NO: 210 SEQ ID NO: 212 SEQ ID NO:323 SEQ ID NO: 325 SEQ ID NO:327 SEQ ID NO:329 SEQ ID NO:331 SEQ ID NO:333 SEQ ID NO:335 SEQ ID NO:337 SEQ ID NO: 339 SEQ ID NO: 341 SEQ ID NO:343 SEQ ID NO: 345 SEQ ID NO:347 SEQ ID NO : 349 SEQ ID NO:351 SEQ ID NO: 353 SEQ ID NO:355 SEQ ID NO:357 SEQ ID NO:359 SEQ ID NO:361 SEQ ID NO:363 SEQ ID NO:365 SEQ ID NO:367 SEQ ID NO: 369 SEQ ID NO: 371 SEQ ID NO: 373 SEQ ID NO:375 SEQ ID NO: 377 SEQ ID NO: 379 SEQ ID NO : 381 SEQ ID NO:383 SEQ ID NO: 385 SEQ ID NO:387 SEQ ID NO : 389 SEQ ID NO:391 SEQ ID NO: 393 SEQ ID NO:395 SEQ ID NO: 397 SEQ ID NO:399 SEQ ID NO: 401 SEQ ID NO:403 SEQ ID NO:405 SEQ ID NO:407 SEQ ID NO: 409 SEQ ID NO: 411 SEQ ID NO: 413 SEQ ID NO:415 SEQ ID NO: 417 SEQ ID NO: 419 SEQ ID NO:421 SEQ ID NO:423 SEQ ID NO: 425 SEQ ID NO: 427 SEQ ID NO:429 SEQ ID NO:431 SEQ ID NO: 433 SEQ ID NO:435 SEQ ID NO:437 SEQ ID NO:439 SEQ ID NO: 441 SEQ ID NO:443 SEQ ID NO: 445 SEQ ID NO:447 SEQ ID NO:449 SEQ ID NO:451 SEQ ID NO:453 SEQ ID NO:455 SEQ ID NO: 457 SEQ ID NO:459 SEQ ID NO:461 SEQ ID NO: 461 SEQ ID NO:463 SEQ ID NO: 464 SEQ ID NO: 466 SEQ ID NO:468 SEQ ID NO:469 SEQ ID NO:470 SEQ ID NO : 471 SEQ ID NO:472 SEQ ID NO:474 SEQ ID NO:476 SEQ ID NO: 477 SEQ ID NO:479 SEQ ID NO: 481 SEQ ID NO:482 SEQ ID NO:483 SEQ ID NO:485 SEQ ID NO:487 SEQ ID NO:488 SEQ ID NO : 489 SEQ ID NO:490 SEQ ID NO:491 SEQ ID NO: 493 SEQ ID NO: 495 SEQ ID NO:496 SEQ ID NO:497 SEQ ID NO:499 SEQ ID NO : 501 SEQ ID NO:502 SEQ ID NO: 503 SEQ ID NO:504 SEQ ID NO : 505 SEQ ID NO:506 SEQ ID NO:507 SEQ ID NO:508 SEQ ID NO : 510 SEQ ID NO: 512 SEQ ID NO: 513 SEQ ID NO: 514 SEQ ID NO: 516 SEQ ID NO:518 SEQ ID NO:520 SEQ ID NO:521 SEQ ID NO: 523 SEQ ID NO:525 SEQ ID NO:526 SEQ ID NO: 528 SEQ ID NO: 530 SEQ ID NO: 531 SEQ ID NO:533 SEQ ID NO:535 SEQ ID NO: 536 SEQ ID NO: 537 SEQ ID NO: 538 SEQ ID NO: 540 SEQ ID NO: 542 SEQ ID NO: 543 SEQ ID NO: 545 SEQ ID NO:547 SEQ ID NO: 548 SEQ ID NO: 549 SEQ ID NO: 550 SEQ ID NO:551 SEQ ID NO: 553 SEQ ID NO: 555 SEQ ID NO: 556 SEQ ID NO:557 SEQ ID NO: 559 SEQ ID NO:561 SEQ ID NO:562 SEQ ID NO:563 SEQ ID NO : 564 SEQ ID NO:566 SEQ ID NO:568 SEQ ID NO: 570 SEQ ID NO: 572 SEQ ID NO: 574 SEQ ID NO:576 SEQ ID NO: 578 SEQ ID NO : 580 SEQ ID NO:582 SEQ ID NO: 584 SEQ ID NO:586 SEQ ID NO: 588 SEQ ID NO:589 SEQ ID NO: 590 SEQ ID NO: 591 SEQ ID NO: 592 SEQ ID NO:594 SEQ ID NO: 604 SEQ ID NO:606 SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 610, SEQ ID NO: 612, SEQ ID NO: 614, SEQ ID NO: 616, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 620, o SEQ ID NO: 622, y subsecuencias de las mismas y variantes de las mismas. En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad de aldolasa, por ejemplo una actividad de alfa-aldolasa o una actividad de gluco-aldolasa . La identidad puede ser sobre la longitud completa del polipéptido, o la identidad puede estar sobre una región de cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o más residuos. Los polipéptidos de la invención también pueden ser más cortos que la longitud completa de los polipéptidos de ejemplo. En los aspectos alternativos, la invención proporciona polipéptidos (péptidos, fragmentos) de un tamaño en el intervalo de entre aproximadamente 5 y la longitud completa de un polipéptido, por ejemplo una enzima, tal como una aldolasa; los tamaños de ejemplo son de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o más residuos, por ejemplo residuos contiguos de una aldolasa de ejemplo de la invención. Los péptidos de la invención pueden ser útiles, por ejemplo, como sondas marcadoras, antígenos, tolerágenos, motivos, sitios activos de aldolasa. Por ejemplo, la siguiente tabla resume las características (por ejemplo, actividad, fuente inicial, localización de la secuencia de señal, y secuencia de señal de ejemplo) de los polipéptidos de ejemplo de la invención. Por ejemplo, el polipéptido que tiene una secuencia como se estipula en la SEQ ID NO: 437, codificada por la SEQ ID NO: 436, se generó artificialmente; el polipéptido que tiene una secuencia como se estipula en la SEQ ID NO: 439, codificada por la SEQ ID NO: 438, tiene actividad de aldolasa bajo condiciones alcalinas, y se derivó inicialmente (se aisló a partir de una fuente desconocida; el polipéptido que tiene una secuencia como se estipula en la SEQ ID NO: 441, codificada por la SEQ ID NO: 440, tiene actividad de aldolasa bajo condiciones alcalinas, y se derivó inicialmente (se aisló) a partir de una fuente desconocida, y tiene una secuencia de señal que consiste en los residuos de aminoácidos 1 a 32 de la SEQ ID NO:441 ( "AA 1-32"); ver también la siguiente descripción con respecto a las secuencias de señales de la invención, etcétera: SEQ ID NOTAS Fuente Locali Secuencia NO:P zación de Señal de Señal 436, 437 Aldolasa Artificial reensamblada 438,439 Aldolasa Desconocida ALCALINA 440, 441 Aldolasa Desconocida AA1-32 MNQIVNFKSHF ALCALINA YRKIALLFSIT FIWAAGSLSA 442 , 443 Aldolasa Desconocida AA1-27 MNRYLRLAALT ALCALINA LALAPLAYPWG NLVRA 444 , 445 Aldolasa Desconocida AA1-24 TPFGQPMMPG ALCALINA ARMAAANMAPV RA 446 , 447 Aldolasa Desconocida ALCALINA 448, 449 Aldolasa Desconocida AA1-23 MRLIMKKMIIL ALCALINA ITLA VFTGCE S 450,451 Aldolasa Desconocida AA1-49 MNDSINLYNFF ALCALINA PYNRPMSINKT NTMKQMIN LG SLALLMLLLSC GEATE 452,453 Aldolasa Desconocida AA1-34 MMQLNPWFSTT ALCALINA LKAAGLATALA AVSACQPASES A 454 ,455 Aldolasa Desconocida AA1-37 MDLLEYKNTIQ ALCALINA RRQTMTDRKLL FIVATVILAVL VSFS 456, 457 Aldolasa Desconocida AA1-26 MMQLNPWFSAS ALCALINA LKAAGLATALA AVSA 458, 459 Aldolasa Desconocida AA1-29 MFKVSLRSKDM ALCALINA KKLSLIVTILV LALTLSA 460, 461 Fúngico Cochliobolus heterostrophus ATCC 48331 462-466 Fúngica Fúngica AA1-22 MSRSSTILFVL AAANLASLVDA 467-474 Fúngica Cochliobolus NOTA : AA1-22 se heterostrophus pueden remover, y ATCC 48331 las secuencias de ADN/protelna restantes todavía codifican para una aldolasa 480-485 Fúngica Fúngica AA1-19 KFSLLATIVA SISPLARA 486-493 Fúngica Fúngica AA1-54 MRRKSTDKYKK VSIRAHLAACE QLAISKMLFSR TATILSLLCVQ ATAISPRGSA 494-499 Fúngica Fúngica AA1-22 MGFSKMLLGAL IGIASLNGVQS 511-516 Fúngica Fúngica AA1-21 MKYSIIPFVPL FAGLSRAASS 517, 518 Fúngica Fúngica AA1-26 MNMNIFLLIIS LAFFSTVNCYT MSNA 519-523 Fúngica Fúngica 524-528 Fúngica Fúngica 529-533 Fúngica Cochliobolus heterostrophus ATCC 48331 534-540 Fúngica Cochliobolus AA1-20 MLLLNIFTTLF heterostrophus FYITCIVSA ATCC 48331 541-545 Fúngica Fúngica 546-553 Fúngica Fúngica AA1-23 MASSLLSSLSS ISTFNSTQILQ A 554-559 Fúngica Cochliobolus AA1-19 MTTALSSGQVA heterostrophus PTPHTAAA ATCC 48331 560-566. Fúngica Fúngica AA1-33 MLTTSERKTST AFVT SMLWW LLTSFVKDVHA 567, 568 Aldolasa Desconocida ALCALINA 569,570 Thermococcus alcaliphilus AEDII12RA 571, 572 Desconocida AA1-28 MQSNGNVKGRS AVLALALLLLT AVAATA 573 , 574 Bacteria AA1-27 KKTFKLILVL MLSLTLVFGLT APIQA 575, 576 Desconocida 577, 578 Desconocida AA1-34 MKPFLKKSIIT LLASTCCLFTA WLIPSIAVPTV SA 579,580 Desconocida AA1-29 MFKRRALGFLL AFLLVFTAVFG SMPMEFA 581, 582 Desconocida AA1-27 KKFYKLTTAL ALSLSLALSLL GPAHA 583, 584 Desconocida 585,586 Bacteria AA1-2.8 MSLFKKSFPWI LSLLLLFLFIA PFSIQT 587-594 GLUCOAldolas Thermomyces AA1-23 MLFQPTLCAAL a lanuginosus GLAALIVQGGE ATCC 200065 A 603 , 604 Desconocida AA1-31 MQNTAK SIWQ RVRHSAIALSA LSLSFGLQA 605, 606 Desconocida AA1-34 MVNHLKKWIAG MALTLALLTGT WPGLPVQVAS A 607,608 Desconocida 609, 610 Desconocida AA1-31 MQNTAKNSIWQ RVRHSAIALSA LSLSFGLQA 611, 612 Desconocida 613 , 614 Desconocida AA1-31 MQNTAKNSIWQ RVRHSAIALSA LSLSFGLQA 615, 616 Desconocida AA1-34 MSERGVRRAVR TALVGLAAAAT AAVTLGAPTAQ A 617 , 618 Desconocida AA1-27 MNRYLRLAALT LALAPLAYP G NLARA 619, 620 Bacteria AA1-29 MARKSVAAALA LVAGAAAVAVT GNTAAQA 621 , 622 Desconocida AA1-31 MQNTAKNSIWQ RVRHSAIALSA LSLSFGLQA Los polipéptidos y péptidos de la invención se pueden aislar a partir de fuentes naturales, ya sean polipéptidos sintéticos o bien recombinantemente generados. Los péptidos y proteínas se pueden expresar de una manera recombinante in vitro o in vivo. Los péptidos y polipéptidos de la invención se pueden hacer y aislar empleando cualquier método conocido en la materia. Los polipéptidos y péptidos de la invención también se pueden sintetizar, del todo o en parte, empleando métodos químicos bien conocidos en este campo. Ver, por ejemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A. K. , Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co . , Lancaster, PA. Por ejemplo, la síntesis de péptidos se puede llevar a cabo empleando diferentes técnicas en fase sólida (ver, por ejemplo, Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13), y la síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, utilizando el Sintetizador de Péptidos ABI 431A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Los péptidos y polipéptidos de la invención también se pueden glicosilar. La glicosilacion se puede agregar después de la traducción, ya sea. químicamente, o mediante mecanismos biosintéticos celulares, en donde los últimos incorporan el uso de motivos de glicosilacion conocidos, los cuales pueden ser nativos para la secuencia, o se pueden agregar como un péptido, o se pueden agregar en la secuencia de codificación del ácido nucleico. La glicosilacion puede estar O-enlazada o N-enlazada. La glicosilacion se puede agregar a cualquier polipéptido de la invención con el fin de generar una enzima que sea más termotolerante o termoestable que la enzima "progenitora" (a la que se agregó la glicosilacion) . La glicosilacion se puede agregar ya sea químicamente, o bien mediante mecanismos biosintéticos celulares. La invención proporciona aldolasas que tienen un amplio rango de actividad específica sobre un amplio rango de temperaturas, por ejemplo a aproximadamente 37°C, en el intervalo de aproximadamente 10 a 10,000, o de 100 a aproximadamente 1,000 unidades por mg de proteína. Las aldolasas de la invención también pueden tener actividad a temperaturas tan altas como de 120OC. En los aspectos alternativos, la aldolasa utilizada en estos métodos es activa a estas temperaturas, por ejemplo es activa a temperaturas en un intervalo de entre aproximadamente 80°C y aproximadamente 115°C, de entre aproximadamente 100°C y aproximadamente 110°C, y de entre aproximadamente 105°C y aproximadamente 108°C. Sin embargo, las aldolasas de la invención pueden tener también actividad a bajas temperaturas, por ejemplo tan bajas como de 4oc a 5°C . La temperatura de fusión (Tm) de una enzima de la invención se puede cambiar (por ejemplo, se puede cambiar entre aproximadamente 10°C y 90°C) mediante activación por calor. Por ejemplo, la temperatura de fusión de la SEQ ID NO:336/337 se puede cambiar de aproximadamente 17oC hasta 87°c mediante activación por calor: por ejemplo, una preincubación a 80°C durante 5 minutos . Los péptidos y polipéptidos de la invención, como se definen anteriormente, incluyen todas las formas "miméticas" y "peptidomiméticas " . Los términos "miméticas" y "peptidomiméticas " se refieren a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales de los polipéptidos de la invención. El mimético puede estar enteramente compuesto de análogos de aminoácidos no naturales, sintéticos, o bien es una molécula quimérica de parcialmente aminoácidos peptídicos naturales y parcialmente análogos de aminoácidos no naturales. El mimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservadoras de aminoácidos naturales, siempre que estas sustituciones no alteren de una manera sustancial la estructura y/o actividad del mimético. Como con los polipéptidos de la invención que son variantes conservadoras, la experimentación de rutina determinará si un mimético está dentro del alcance de la invención, es decir, que no se altere sustancialmente su estructura y/o función. Por consiguiente, en un aspecto, una composición mimética está dentro del alcance de la invención si tiene una actividad de aldolasa. Las composiciones mimeticas de polipéptidos de la invención pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales. En el aspecto alternativo, las composiciones miméticas de la invención incluyen uno o todos los siguientes tres grupos estructurales: a) grupos de enlace de residuos diferentes de los enlaces de amida naturales ("enlace peptídico") ; b) residuos no naturales en lugar de los residuos de aminoácidos que se presentan naturalmente; o c) residuos que inducen mimetismo estructural secundario, es decir, inducen o estabilizan una estructura secundaria, por ejemplo, una vuelta beta, vuelta gamma, hoja beta, conformación de hélice alfa, y similares. Por ejemplo, un polipéptido de la invención se puede caracterizar como un mimético cuando todos o algunos de sus residuos estén unidos por medios químicos diferentes de los enlaces peptídicos naturales. Los residuos peptidomiméticos individuales se pueden unir mediante enlaces peptídicos, otros enlaces químicos, o medios de acoplamiento, tales como, por ejemplo, glutaraldehído, N-hidroxi - succinimida-ésteres , maleimidas bifuncionales, ?,?' -diciclo-hexil-carbodi-imida (DCC) , o ?,?' -di-isopropil-carbodi-imida (DIC) . Los grupos de enlace que pueden ser una alternativa para los enlaces de amida tradicionales ("enlace peptídico") incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(=0)-CH2- para -C(=0)-NH-), amino-metileno (CH2-NH) , etileno, olefina (CH=CH) , éter (CH20) , tioéter (CH2-S) , tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tioamida, o éster (ver, por ejemplo, Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Volumen 7, páginas 267-357, "Peptide Backbone Modifications " , Marcell Dekker, NY) . Un polipéptido de- la invención también se puede caracterizar como un mimético al contener todos o algunos residuos no naturales en lugar de los residuos de aminoácidos que se presentan naturalmente. Los residuos no naturales están bien descritos en la literatura científica y de patente; unas cuantas composiciones no naturales de ejemplo útiles como miméticos de los residuos de aminoácidos naturales, y los lineamientos , se describen en seguida. Se pueden generar miméticos de aminoácidos aromáticos, reemplazando, por ejemplo, por D- o L-naftil -alanina ; D- o L-fenil-glicina; D- o L-2-tienil-alanina; D- o L-1,-2,3-, o 4-pirenilalanina; D- o L-3 -tienil -alanina ; D- o L- (2 -piridinil ) -alanina; D- o L- (3 -piridinil ) -alanina ; D- o L- (2 -pirazinil ) -alanina; D- o L- (4 - isopropil ) -fenil-glicina; D- (trifluorometil ) -fenil -glicina ; D- (trifluorometil )- fenil -alanina ; D-p-fluoro-fenil -alanina ; D- o L-p-bifenil - fenil -alanina ; D- o L-p-metoxi-bifenil-fenil-alanina; D- o L-2 - indol (alquil ) -alaninas ; y D- o L-alquilalaninas , en donde alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, isobutilo, isobutilo secundario, isopentilo, o un aminoácido no ácido, sustituidos o insustituidos . Los anillos aromáticos de un aminoácido no natural incluyen, por ejemplo, anillos aromáticos de tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo, y piridilo. Se pueden generar miméticos de aminoácidos mediante sustitución, por ejemplo, por aminoácidos que no sean de carboxilato, mientras que se mantenga una carga negativa; ( fosfono) alanina ; treonina sulfatada. Los grupos laterales de carboxilo (por ejemplo, aspartilo o glutamilo) también se pueden modificar de una manera selectiva mediante su reacción con carbodi - imidas (R ' -N-C-N-R ' ) , tales como, por ejemplo, 1-ciclohexil -3 - (2 -morfolinil- (4-etil) -carbodi - imida o l-etil-3- (4-azonia-4 , 4 -dimetil -pentil ) -carbodi - imida . El aspartilo o el glutamilo también se pueden convertir en residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante su reacción con iones de amonio. Se pueden generar miméticos de aminoácidos básicos mediante sustitución, por ejemplo, con (en adición a lisina y arginina) los aminoácidos ornitina, citrulina, o ácido (guanidino) -acético, o ácido (guanidino) -alquil -acético, en donde alquilo es como se define anteriormente. Se puede utilizar el derivado de nitrilo (por ejemplo, que contenga la fracción CN en lugar de COOH) para sustituir asparagina o glutamina. Los residuos de asparaginilo y glutaminilo se pueden desaminar hasta los residuos de aspartilo o glutamilo correspondientes. Se pueden generar miméticos de residuos de arginina mediante la reacción de arginilo con, por ejemplo, uno o más reactivos convencionales, incluyendo, por ejemplo, fenil-glioxal , 2 , 3-butanodiona, 1 , 2 -ciclo-hexanodiona , o ninhidrina, de preferencia bajo condiciones alcalinas. Se pueden generar miméticos de residuos de tirosina mediante la reacción de tirosilo con, por ejemplo, compuestos de diazonio aromáticos o con tetranitro-metano . Se pueden utilizar N-acetil-imidazol y tetranitro-metano para formar especies de O-acetil-tirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Se pueden generar miméticos de residuos de cisteína mediante la reacción de los residuos de cisteinilo con, por ejemplo, alfa-haloacetatos , tales como ácido 2 -cloro-acético o cloro-acetamida y las aminas correspondientes; para dar los derivados de carboxi -metilo o carboxi -amido-metilo . También se pueden generar miméticos de residuos de cisteína mediante la reacción de los residuos de cisteinilo con, por ejemplo, bromo-trifluoro-acetona, ácido alfa-bromo-beta- (5-imidazolil) -propiónico ; fosfato de cloro-acetilo , N-alquil -maleimidas , disulfuro de 3 -nitro-2 -piridilo ; disulfuro de metil-2-piridilo; p-cloro-mercuri-benzoato; 2 -cloro-mercuri-4 -nitro-fenol; o cloro- 7 -nitrobenzo-oxa- 1 , 3 -diazol . Se pueden generar miméticos de lisina (y se pueden alterar los residuos amino- erminales) mediante la reacción de lisinilo con, por ejemplo, anhídrido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. También se pueden generar miméticos de residuos de lisina u otros residuos que contengan alfa-amino mediante su reacción con imido-ésteres , tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitro-bencen-sulfónico, O-metil-isourea, 2 , 4 -pentanodiona , y reacciones catalizadas por transamidasa con glioxilato. Se pueden generar miméticos de metionina mediante la reacción con, por ejemplo, sulfóxido de metionina. Los miméticos de prolina incluyen, por ejemplo, ácido pipecólico, ácido tiazolidin-carboxílico, 3- o 4 -hidroxi -prolina , deshidro-prolina, 3- o 4-metil-prolina, o 3 , 3 -dimetil -prolina . Se pueden generar miméticos de residuos de histidina mediante la reacción de histidilo con, por ejemplo, procarbonato de dietilo o bromuro de para-bromofenacilo . Otros miméticos incluyen, por ejemplo, aquéllos generados mediante la hidroxilación de prolina y lisina; la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos de serilo o treonilo; la metilación de los grupos alfa-amino de lisina, arginina, e histidina; la acetilación de la amina N-terminal; la metilación de los residuos de amida de la cadena principal, o la sustitución con N-metil -aminoácidos ; o la amidación de los grupos carboxilo C-terminales . Un residuo, por ejemplo un aminoácido, de un polipéptido de la invención, también puede ser reemplazado por un aminoácido (o un residuo peptidomimético) de la quiralidad opuesta. Por consiguiente, cualquier aminoácido que se presente naturalmente en la configuración L (que también puede ser referida como L o S, dependiendo de la estructura de la entidad química) puede ser reemplazado con el aminoácido del mismo tipo estructural químico o por un peptidomimético, pero de la quiralidad opuesta, referido como el D-aminoácido, pero también puede ser referido como la forma R o S. La invención también proporciona métodos para modificar los polipéptidos de la invención ya sea mediante procesos naturales, tales como procesamiento posterior a la traducción (por ejemplo, fosforilación, acilación, etcétera), o bien mediante técnicas de modificación química, y los polipéptidos modificados resultantes. Las modificaciones se pueden presentar en cualquier parte del polipéptido, incluyendo en la estructura base del péptido, en las cadenas laterales de aminoácidos, y en los términos amino o carboxilo. Se apreciará que puede estar presente el mismo tipo de modificación en el mismo grado o en diferentes grados en varios sitios de un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede tener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ribosilación con ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una fracción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de un fosfatidilinositol , delación reticulante, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes , formación de cisteína, formación de piroglutamato , formilación, carboxilación-gamma , glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, y adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a la proteína, tal como arginilación . Ver, por ejemplo, Creighton, T.E., Proteins-Structure and Molecular Properties 2 a Edición, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, editor, Academic Press, Nueva York, páginas 1-12 (1983) . También se pueden emplear los métodos de síntesis química de peptidos en fase sólida para sintetizar el polipéptido o los fragmentos de la invención. Este método se ha conocido en la materia desde principios de la década de 1960 (Merrifield, R. B . , J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154, 1963) (Ver también Stewart, J. M. y Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Edición, Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, páginas 11-12)), y recientemente se ha empleado en los estuches de diseño y síntesis de péptidos de laboratorio comercialmente disponibles (Cambridge Research Biochemicals) . Estos estuches de laboratorio comercialmente disponibles han empleado en general las enseñanzas de H. M. Geysen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . , USA, 81:3998 (1984), y proporcionan la síntesis de péptidos sobre las puntas de una multitud de "varillas" o "picos", todos los cuales se conectan a una sola placa. Cuando se utiliza este sistema, una placa de varillas o picos se invierte y se inserta en una segunda placa de pozos o cavidades correspondientes, que contienen soluciones para unir o anclar un aminoácido apropiado a las puntas de los picos o varillas. Mediante la repetición de este paso del proceso, es decir, invertir e insertar las puntas de las varillas y picos en las soluciones apropiadas, se construyen los aminoácidos hasta obtener los péptidos deseados. En adición, está disponible un número de sistemas de síntesis de péptidos FMOC. Por ejemplo, el ensamble de un polipéptido o fragmentó se puede llevar a cabo sobre un soporte sólido utilizando un sintetizador de péptidos automatizado Applied Biosystems, Inc., modelo 431A. Este equipo proporciona un acceso fácil a los péptidos de la invención, ya sea mediante síntesis directa, o bien mediante la síntesis de una serie de fragmentos que se pueden acoplar empleando otras técnicas conocidas. La invención proporciona aldolasas novedosas (por ejemplo, alfa-aldolasas) , incluyendo las enzimas de ejemplo de la invención, ácidos nucleicos que las codifican, anti -cuerpos que las e'nlazan, y métodos para hacerlas y usarlas. En un aspecto, los polipéptidos de la invención tienen una actividad de aldolasa, como se describe en la presente, incluyendo, por ejemplo, la capacidad para hidrolizar almidones en azúcares. En un aspecto, los polipéptidos de la invención tienen una actividad de alfa-aldolasa . En los aspectos alternativos, las aldolasas de la invención tienen actividades que se han modificado de aquéllas de las aldolasas de ejemplo descritas en la presente. La invención incluye las aldolasas de la invención con y sin secuencias de señales (incluyendo las secuencias de señales de la invención, ver, por ejemplo, la Tabla 3 más adelante, u otras secuencias de señales) , y las secuencias de señales mismas (por ejemplo, ver la Tabla 3 más adelante) . La invención también incluye polipéptidos (por ejemplo, proteínas de fusión) que comprenden una secuencia de señal de la invención, ver, por ejemplo, la Tabla 3 más adelante. El polipéptido que comprende una secuencia de señal de la invención puede ser una aldolasa de la invención, u otra aldolasa, u otra enzima, u otro polipéptido. La invención aldolasas inmovilizadas, anti-cuerpos anti -aldolasa , y fragmentos de los mismos. La invención proporciona métodos para inhibir la actividad de aldolasa, por ejemplo utilizando mutantes negativos dominantes o anti-cuerpos anti -aldolasa de la invención. La invención incluye heterocomplej os , por ejemplo, proteínas de fusión, heterodímeros , etcétera, que comprenden a las aldolasas de la invención. En un aspecto, las aldolasas (por ejemplo, alfa-aldolasas) de la invención hidrolizan los enlaces de polisacárido internos, por ejemplo los enlaces a-1,4- y 1 , 6 -glucosídicos del almidón, para producir maltodextrinas de peso molecular más pequeño. En un aspecto, esta hidrólisis es en gran parte aleatoria. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para producir maltodextrinas de peso molecular más pequeño. Las aldolasas de la invención se pueden utilizar en establecimientos de laboratorio e industriales para hidrolizar el almidón o cualquier compuesto que comprenda maltodextrina para una variedad de propósitos. Estas aldolasas se pueden utilizar solas para proporcionar una hidrólisis específica, o se pueden combinar con otras aldolasas para proporcionar un "cóctel" con un amplio espectro de actividad. Los usos de ejemplo incluyen la remoción o la hidrólisis parcial o completa del almidón o de cualquier compuesto que comprenda maltodextrina, a partir de muestras biológicas, alimenticias, de alimentos para animales, farmacéuticas, o industriales. Por ejemplo, las aldolasas de la presente invención se pueden formular en detergentes para lavado de ropa, con el objeto de ayudar en la remoción de las manchas que contengan almidón. En un aspecto, la invención proporciona detergentes que comprenden las aldolasas de la invención, incluyendo aldolasas activas bajo condiciones alcalinas, y métodos para hacerlas y usarlas. Estas composiciones detergentes incluyen soluciones para lavado de ropa y para lavado de trastes (por ejemplo, lavado de trastes automático) , y su aplicación. Las aldolasas de la invención se pueden utilizar como agentes limpiadores en cualesquiera matrices detergentes (ver las aplicaciones industriales más adelante) . Las aldolasas de la presente invención se pueden utilizar en las etapas iniciales (licuefacción) del procesamiento de almidón, en la molienda húmeda del maíz, en la producción de alcohol, en la industria textil para el desapresto de almidón, en aplicaciones de horneado, en la industria de bebidas, en los campos de petróleo en los procesos de perforación; en el desentintado de papel reciclado; y en alimentos para animales. Las aldolasas de la invención pueden tener una actividad de aldolasa bajo diferentes condiciones, por ejemplo en extremos de pH y/o temperatura, con agentes oxidantes, y similares. La invención proporciona métodos que conducen a preparaciones alternativas de aldolasa con diferentes eficiencias y estabilidades catalíticas, por ejemplo hacia la temperatura, los agentes oxidantes, y las condiciones de lavado cambiantes. En un aspecto, se pueden producir variantes de aldolasa empleando las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y/o mutagénesis aleatoria. En un aspecto, se puede emplear la evolución dirigida para producir una gran variedad de variantes de aldolasa con especificidades y estabilidades alternativas. Las proteínas de la invención también son útiles como reactivos de investigación para identificar los moduladores de aldolasa, por ejemplo los activadores o inhibidores de la actividad de la aldolasa. Dicho de una manera breve, se agregan muestras de prueba (compuestos, caldos, extractos, y similares) a los ensayos de aldolasa, para determinar su capacidad para inhibir la disociación del sustrato. Los inhibidores identificados de esta manera se pueden utilizar en la industria y en investigación para reducir o prevenir la proteólisis indeseada. Como con las aldolasas, los inhibidores se pueden combinar para aumentar el espectro de actividad. La invención también proporciona métodos para descubrir nuevas aldolasas utilizando los ácidos nucleicos, polipéptidos , y anti-cuerpos de la invención. En un aspecto, se rastrean bibliotecas de fagos lambda para el descubrimiento de aldolasas basado en la expresión. En un aspecto, la invención utiliza bibliotecas de fagos lambda en el rastreo para permitir la detección de los clones tóxicos; un mejor acceso al sustrato; una necesidad reducida de diseñar un huésped, derivando el potencial de cualquier inclinación resultante de la separación de masa de la biblioteca; y un crecimiento más rápido en bajas densidades de clones. El rastreo de bibliotecas de fagos lambda puede hacerse en fase líquida o en fase sólida. En un aspecto, la invención proporciona el rastreo en fase líquida. Esto da una mayor flexibilidad en las condiciones de ensayo; flexibilidad adicional del sustrato; más alta sensibilidad para los clones débiles; y facilidad de automatización sobre el rastreo en fase sólida. La invención proporciona métodos de rastreo utilizando las proteínas y ácidos nucleicos de la invención, y automatización robótica para hacer posible la ejecución de muchas miles de reacciones biocatalíticas y ensayos de rastreo en un corto período de tiempo, por ejemplo al día, así como se asegura un alto nivel de precisión y reproducibilidad (ver la descripción de los arreglos más adelante) . Como un resultado, se puede producir una biblioteca de compuestos derivados en materia de semanas. Para las enseñanzas adicionales sobre la modificación de moléculas, incluyendo moléculas pequeñas, ver la solicitud internacional PCT/US94/09174. La presente invención incluye enzimas de aldolasa que son variantes de carbonil -hidrolasa que no se presentan naturalmente (por ejemplo, variantes de aldolasa), que tienen diferente actividad proteolítica, estabilidad, especificidad del sustrato, perfil de pH, y/o características de desempeño, comparándose con la carbonil -hidrolasa precursora a partir de la cual se deriva la secuencia de aminoácidos de la variante. De una manera específica, estas variantes de aldolasa tienen una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza, la cual se deriva mediante sustitución de una pluralidad de residuos de aminoácidos de una aldolasa precursora con aminoácidos diferentes. La aldolasa precursora puede ser una aldolasa que se presente naturalmente, o una aldolasa recombinante . Las variantes de aldolasa útiles abarcan la sustitución de cualquiera de los L-aminoácidos que se presentan naturalmente, en las posiciones de residuos de aminoácidos designadas. Secuencias de Señales de Aldolasa La invención proporciona secuencias de señales que consisten en, o que comprenden, un péptido que tiene una secuencia que comprende los residuos 1 a 12 , 1 a 13, 1 a 14 , l a 15, 1 a 16, 1 a 17, l a 18, 1 a 19, l a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 28, 1 a 30 o 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, o 1 a 39, o más largas, de un polipéptido de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona secuencias de señales de aldolasa (por ejemplo, alfa-aldolasa o glucoaldolasa) , y ácidos nucleicos que codifican estas secuencias de señales, por ejemplo los péptidos de ejemplo de la invención que tienen las secuencias estipuladas en la Tabla 3, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 213 a 257, y los polipéptidos que comprenden (o que consisten en) las secuencias estipuladas en la Tabla 3, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 213 a 257. La invención también proporciona secuencias de señales de aldolasa y ácidos nucleicos que codifican estas secuencias de señales, por ejemplo los péptidos que comprenden o que consisten en los residuos 1 a 27 de la SEQ ID NO: 323 (codificada por la SEQ ID NO:322), péptidos que comprenden o que consisten en los residuos 1 a 22 de la SEQ ID NO: 333 (codificada por la SEQ ID NO: 332) , péptidos que comprenden o que consisten en los residuos 1 a 20 de la SEQ ID NO: 335 (codificada por la SEQ ID NO: 334) , péptidos que comprenden o que consisten en los residuos 1 a 35 de la SEQ ID NO: 337 (codificada por la SEQ ID NO:336), etcétera; ver la Tabla 3 para ver, en adición a estas secuencias de señales, las secuencias de señales de aldolasa adicionales y los ácidos nucleicos que codifican estas secuencias de señales. La invención también proporciona secuencias de señales de aldolasa y ácidos nucleicos que codifican estas secuencias de señales, que comprenden o que consisten en los residuos 1 a 32 o 1 a 33 de la SEQ ID NO:441; los residuos 1 a 27 o 1 a 28 de la SEQ ID NO: 443; los residuos 1 a 24 o 1 a 25 de la SEQ ID NO : 445; los residuos 1 a 23 o 1 a 24 de la SEQ ID NO: 449; los residuos 1 a 49 o 1 a 50 de la SEQ ID NO: 451; los residuos 1 a 34 o 1 a 35 de la SEQ ID NO: 453; los residuos 1 a 37 o 1 a 38 de la SEQ ID NO: 455; los residuos 1 a 26 o 1 a 27 de la SEQ ID NO: 457; los residuos 1 a 29 o 1 a 30 de la SEQ ID NO:459; los residuos 1 a 22 o 1 a 23 de la SEQ ID NO: 466; los residuos 1 a 19 o 1 a 20 de la SEQ ID NO: 485; los residuos 1 a 54 o 1 a 55 de la SEQ ID NO: 493; los residuos 1 a 22 o 1 a 23 de la SEQ ID NO: 499; los residuos 1 a 21 o 1 a 22 de la SEQ ID NO: 516; los residuos 1 a 26 o 1 a 27 de la SEQ ID NO: 518; los residuos 1 a 20 o 1 a 21 de la SEQ ID NO: 540; los residuos 1 a 23 o 1 a 24 de la SEQ ID NO: 553; los residuos 1 a 19 o 1 a 20 de la SEQ ID NO: 559; los residuos 1 a 33 o 1 a 34 de la SEQ ID NO: 566. Por ejemplo, con respecto a la Tabla 3, la invención proporciona péptidos que comprenden o que consisten en los residuos de aminoácidos 1 a 23 (SEQ ID NO: 213) de la SEQ ID NO: 87, etcétera. Tabla 3 SEO ID NO: Secuencia de Señal SEQ ID NO: 87 AA1 -23 (SEQ ID NO :213) SEQ ID NO: 91 AA1 -23 (SEQ ID NO :214) SEQ ID NO: 93 AA1 -33 (SEQ ID NO :215) SEQ ID NO: 97 AA1 -31 (SEQ ID NO :216) SEQ ID NO: 99 AA1 -30 (SEQ ID NO :217) SEQ ID NO: 103 AA1 -22 (SEQ ID NO :218) SEQ ID NO: 105 AA1 -33 (SEQ ID NO •219) SEQ ID NO: 109 AA1 -25 (SEQ ID NO 220) SEQ ID NO: 111 AA1 -35 (SEQ ID NO 221) SEQ ID NO: 113 AA1 -28 (SEQ ID NO 222) SEQ ID NO: 117 AA1 -21 (SEQ ID NO 223) SEQ ID NO: 119 AA1 -30 (SEQ ID NO 224) SEQ ID NO: 123 AA1 -35 (SEQ ID NO 225) SEQ ID NO: 125 AA1 -28 (SEQ ID NO 226) SEQ ID NO: 127 AA1 -30 (SEQ ID NO 227) SEQ ID NO: 131 AA1 -30 (SEQ ID NO 228) SEQ ID NO: 133 AA1 -30 (SEQ ID NO 229) SEQ ID NO: 137 AA1 -28 (SEQ ID NO 230) SEQ ID NO: 139 AA1 -23 (SEQ ID NO 231) SEQ ID NO: 141 AA1 -23 (SEQ ID NO: 232) SEQ ID NO: 143 AA1 -30 (SEQ ID NO: 233) SEQ ID NO: 145 AA1 -27 (SEQ ID NO: 234) SEQ ID NO: 147 AA1 -29 (SEQ ID NO: 235) SEQ ID NO: 149 AA1 -28 (SEQ ID NO: 236) SEQ ID NO: 69 AA1 -27 SEQ ID NO 237) SEQ ID NO: 153 AA1 -26 SEQ ID NO 238) SEQ ID NO: 155 AA1 -33 SEQ ID NO 239) SEQ ID NO: 157 AA1 -25 ( SEQ ID NO 240) SEQ ID NO: 159 AA1 -25 SEQ ID NO 241) SEQ ID NO: 161 AA1 -36 SEQ ID NO 242) SEQ ID NO: 167 AA1 -36 ( SEQ ID NO 243) SEQ ID NO: 169 AA1 -23 SEQ ID NO 244) SEQ ID NO: 173 AA1 -25 ( SEQ ID NO 245) SEQ ID NO: 175 AA1 -22 ( SEQ ID NO 246) SEQ ID NO: 177 AA1 -23 ( SEQ ID NO 247) SEQ ID NO: 179 AA1 -23 ( SEQ ID NO 248) SEQ ID NO: 185 AA1 -25 ( SEQ ID NO 249) SEQ ID NO: 189 AA1 -36 ( SEQ ID NO250) SEQ ID NO: 191 AA1 -25 ( SEQ ID NO 251) SEQ ID NO: 193 AA1 -25 ( SEQ ID NO: 252) SEQ ID NO : 197 AA1 -23 ( SEQ ID NO: 253) SEQ ID NO:199 AA1 -23 ( SEQ ID NO 254) SEQ ID NO: 201 AA1 -30 ( SEQ ID NO: 255) SEQ ID NO: 203 AA1 -25 ( SEQ ID NO: 256) SEQ ID NO: 205 AA1 -16 ( SEQ ID NO: 257) SEQ ID NO: 73 AA1 -16 ( SEQ ID NO: 7) SEQ ID NO: 79 AA1 -26 ( SEQ ID NO: 8) SEQ ID NO:322,323 Residuos 1 a 27 SEQ ID NO: 332 , 333 Residuos 1 a 22 SEQ ID NO: 334, 335 Residuos 1 a 20 SEQ ID NO: :336, 337 Residuos 1 a 35 SEQ ID NO: :338, 339 Residuos 1 a 50 SEQ ID NO: ;342,343 Residuos 1 a 23 SEQ ID NO: :344, 345 Residuos 1 a 22 SEQ ID NO: :346,347 Residuos 1 a 21 SEQ ID NO : : 350, 351 Residuos 1 a 21 SEQ ID NO: :352 ,353 Residuos 1 a 27 SEQ ID NO: :354, 355 Residuos 1 a 24 SEQ ID NO: :358,359 Residuos 1 a 29 SEQ ID NO: : 362 , 363 Residuos 1 a 20 SEQ ID NO : : 364 , 365 Residuos 1 a 29 SEQ ID NO: :366, 367 Residuos 1 a 24 SEQ ID NO: : 370 , 371 Residuos 1 a 22 SEQ ID NO : : 372 , 373 Residuos 1 a 25 SEQ ID NO: : 374 , 375 Residuos 1 a 21 SEQ ID NO: :376, 377 Residuos 1 a 37 SEQ ID NO : :378,379 Residuos 1 a 27 SEQ ID NO: : 380 , 381 Residuos 1 a 29 SEQ ID NO: :382,383 Residuos 1 a 35 SEQ ID NO: :384,385 Residuos 1 a 37 SEQ ID NO: :386, 387 Residuos 1 a 25 SEQ ID NO: :388, 389 Residuos 1 a 21 SEQ ID NO: :390, 391 Residuos 1 a 58 SEQ ID NO: :394,395 Residuos 1 a 57 SEQ ID NO::396, 397 Residuos 1 a 19 SEQ ID NO: :400,401 Residuos 1 a 19 SEQ ID NO: :402,403 Residuos 1 a 19 SEQ ID NO: : 404 ,405 Residuos 1 a 26 SEQ ID NO: :406, 407 Residuos 1 a 21 SEQ ID NO: :408,409 Residuos 1 a 51 SEQ ID NO : :410,411 Residuos 1 a 21 SEQ ID NO: :416, 417 Residuos 1 a 24 SEQ ID NO: :418,419 Residuos 1 a 44 SEQ ID NO: :420, 421 Residuos 1 a 44 SEQ ID NO: : 422 , 423 Residuos 1 a 27 SEQ ID NO: :424,425 Residuos 1 a 37 SEQ ID NO: :428,429 Residuos 1 a 30 SEQ ID NO: :430,431 Residuos 1 a 33 SEQ ID NO: :432 , 433 Residuos 1 a 34 SEQ ID NO: :434,435 Residuos 1 a 27 Las secuencias de señales de aldolasa de la invención pueden ser péptidos aislados, o secuencias unidas con otra aldolasa o con un polipéptido que no sea de aldolasa, por ejemplo como una proteína de fusión. En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos que comprenden secuencias de señales de aldolasa de la invención. En un aspecto, los polipéptidos que comprenden secuencias de señales de aldolasa de la invención comprenden secuencias heterólogas para una aldolasa de la invención (por ejemplo, una proteína de fusión que comprende una secuencia de señal de aldolasa de la invención y secuencias de otra aldolasa o de una proteína que no sea aldolasa) . En un aspecto, la invención proporciona las aldolasas de la invención con secuencias de señales heterólogas, por ejemplo secuencias con una secuencia de señal de levadura. Por ejemplo, una aldolasa de la invención que comprende una secuencia de señal heteróloga en un vector, por ejemplo, un vector de la serie pPIC (Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos) . En un aspecto, las secuencias de señales de la invención se identifican en seguida de la identificación de los péptidos de aldolasa novedosos. Las sendas mediante las cuales se seleccionan las proteínas y se transportan hasta su localización celular apropiada, con frecuencia son referidas como sendas de dirección de proteína. Uno de los elementos más importantes en todos estos sistemas de dirección es una secuencia de aminoácidos corta en el término amino de un polipéptido recién sintetizado denominado como la secuencia de señal . Esta secuencia de señal dirige una proteína hasta su localización apropiada en la célula, y se remueve durante el transporte o cuando la proteína llega a su destino final. La mayoría de las proteínas lisosomales, de membrana, o secretadas, tienen una secuencia de señal amino-terminal que las marca para translocalizarse en el lumen del retículo endoplásmico . Se han determinado más de 100 secuencias de señales para las proteínas de este grupo. Las secuencias de señales pueden variar en su longitud desde 13 hasta 36 residuos de aminoácidos. Diferentes métodos de reconocimiento de secuencias de señales son conocidos por los técnicos en la materia. Por ejemplo, en un aspecto, los péptidos de señales de aldolasa novedosos se identifican mediante un método referido como SignalP. SignalP utiliza una red neural combinada que reconoce tanto los péptidos de señales como sus sitios de disociación. (Nielsen y colaboradores, "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites". Protein Engineering, volumen 10, No. 1, páginas 1-6 (1997) ) . Se debe entender que, en algunos aspectos, las aldolasas de la invención pueden no tener secuencias de señales. En un aspecto, la invención proporciona las aldolasas de la invención que carecen de toda o parte de una secuencia de señal, por ejemplo las secuencias de señales de la invención (ver la Tabla 3) . En un aspecto, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de señal a partir de una aldolasa operativamente enlazada a una secuencia de ácido nucleico de una aldolasa diferente, u opcionalménte , se puede desear una secuencia de señal a partir de una proteína que no sea aldolasa. La Tabla 3 muestra las secuencias de señales de ejemplo de la invención. Secuencias Prepro y de Señales de Aldolasa, y Dominios Catalíticos En adición a las secuencias de señales (por ejemplo, los péptidos de señales (SPs) ) , como se describen en lo anterior, la invención proporciona dominios prepro y dominios catalíticos (CDs) . Los péptidos de señales, los dominios prepro, y/o los dominios catalíticos de la inyención, se pueden aislar, o los péptidos recombinantes pueden ser parte de una proteína de fusión, por ejemplo como un dominio heterólogo en una proteína quimérica. La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican estos dominios catalíticos (CDs) (por ejemplo, "sitios activos") , dominios prepro, y secuencias de señales (polipéptidos de señales, por ejemplo, un péptido que tiene una secuencia que comprende/que consiste en los residuos amino-terminales de un polipéptido de la invención) . Las secuencias de señales de aldolasa (SPs) , los dominios catalíticos (CDs) , y/o las secuencias prepro de la invención, pueden ser péptidos aislados, o secuencias unidas a otra aldolasa o a un polipéptido que no sea aldolasa, por ejemplo como una proteína de fusión (quimérica) . En un aspecto, los polipéptidos que comprenden secuencias de señales de aldolasa SPs y/o prepro de la invención, comprenden secuencias heterólogas a las aldolasas de la invención (por ejemplo, una proteína de fusión que comprende un péptido de señal y/o prepro de la invención, y secuencias a partir de otra aldolasa o de una proteína que no sea aldolasa) . En un aspecto, la invención proporciona aldolasas de la invención con dominios catalíticos heterólogos, péptidos de señales, y/o secuencias prepro, por ejemplo secuencias con una secuencia de señal de levadura. Una aldolasa de la invención puede comprender un dominio catalítico, péptido de señal, y/o prepro heterólogos en un vector, por ejemplo, un vector de la serie pPIC (Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos) . En un aspecto, las secuencias de péptidos de señales, dominios catalíticos, y/o prepro de la invención, se identifican siguiendo la identificación de los polipéptidos de aldolasa novedosos. Las sendas mediante las cuales se seleccionan las proteínas y se transportan hasta su localización celular apropiada, con frecuencia son referidas como sendas de dirección de proteína. Uno de los elementos más importantes en todos estos sistemas de dirección, es una secuencia de aminoácidos corta en el término amino de un polipéptido recién sintetizado denominada como la secuencia de señal. Esta secuencia de señal dirige una proteína hasta su localización apropiada en la célula, y se remueve durante el transporte o cuando la proteína llega a su destino final. La mayoría de las proteínas lisosomales, de membrana, o secretadas tienen una secuencia de señal amino-terminal que las marca para translocalizarse en el lumen del retículo endoplásmico . Las secuencias de señales pueden variar en su longitud desde 13 hasta 45 o más residuos de aminoácidos. Los técnicos en la materia conocen diferentes métodos de reconocimiento de secuencias de señales. Por ejemplo, en un aspecto, los péptidos de señales de hidrolasa novedosos se identifican mediante un método referido como SignalP. SignalP utiliza una red neural combinada que reconoce tanto los péptidos de señales como sus sitios de disociación. (Nielsen y colaboradores, "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites" . Protein Engineering, volumen 10, No. 1, páginas 1-6 (1997)) . En algunos aspectos, una aldolasa de la invención puede no tener péptidos de señales y/o secuencias prepro, y/o dominios catalíticos (CDs) . En un aspecto, la invención proporciona aldolasas que carecen de todo o parte, de un péptido de señal, un dominio catalítico, y/o un dominio prepro. En un aspecto, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de señal (SP) , un dominio catalítico, y/o prepro, a partir de una aldolasa operativamente enlazada a una secuencia de ácido nucleico de una aldolasa diferente, u opcionalmente , se puede desear una secuencia de señal (SPs) , un dominio catalítico, y/o un dominio prepro a partir de una proteína que no sea aldolasa. La invención también proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden secuencias de señales (SPs) , dominios prepro, y/o dominios catalíticos (CDs) de la invención, y secuencias heterólogas . Las secuencias heterólogas son secuencias que no están naturalmente asociadas (por ejemplo, con una aldolasa) con un péptido de señal, dominio prepro, y/o dominio catalítico. La secuencia con la que el péptido de señal, el dominio prepro, y/o el dominio catalítico no están naturalmente asociados, puede estar sobre, el extremo amino-terminal del péptido de señal, el dominio prepro, y/o del dominio catalítico, el extremo carboxi-terminal y/o sobre ambos extremos del péptido de señal y/o del dominio catalítico. En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende (o que consiste en) un polipéptido que comprende una secuencia de señal (SP) , un dominio prepro, y/o un dominio catalítico (CD) de la invención, con la condición de que no esté asociado con cualquier secuencia con la que esté naturalmente asociado (por ejemplo, la secuencia de aldolasa) . De una manera similar, en un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican estos polipéptidos . Por consiguiente, en un aspecto, el ácido nucleico aislado o recombinante de la invención comprende la secuencia de codificación para una secuencia de señal (SP) , un dominio prepro, y/o un dominio catalítico (CD) de la invención, y una secuencia heteróloga (es decir, una secuencia que no está naturalmente asociada con la secuencia de señal (SP) , el dominio prepro, y/o el dominio catalítico (CD) de la invención) . La secuencia heteróloga puede estar sobre el extremo terminal 3 ' , el extremo terminal 5', y/o sobre ambos extremos de la secuencia de codificación del péptido de señal, del dominio prepro, y/o del dominio catalítico. Los polipéptidos de la invención incluyen aldolasas en una forma activa o inactiva. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención incluyen proproteínas antes de la "maduración" , o el procesamiento de secuencias ¦ prepro, por ejemplo mediante una enzima de procesamiento de proproteína, tal como una convertasa de proproteína, para generar una proteína madura "activa". Los polipéptidos de la invención incluyen las aldolasas inactivas por otras razones, por ejemplo antes de la "activación" por un evento de procesamiento posterior a la traducción, por ejemplo una acción de endo- o exo-peptidasa o proteinasa, un evento de fosforilación, una amidación, una glicosilación o una sulfatación, un evento de dimerización, y similares. Los métodos para identificar las secuencias del dominio "prepro", los dominios catalíticos, y las secuencias de señales, son bien conocidos en la materia, ver, por ejemplo, Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4(2) : 115-136. Por ejemplo, con el fin de identificar una secuencia prepro, la proteína se purifica del espacio extracelular , y se determina la secuencia de proteína N-terminal , y se compara con la forma no procesada. Los polipéptidos de la invención incluyen todas las formas activas, incluyendo las subsecuencias activas, por ejemplo los dominios catalíticos (CDs) o los sitios activos, de una enzima de la invención. En un aspecto, la invención proporciona dominios catalíticos o sitios activos estipulados más adelante. En un aspecto, la invención proporciona un péptido o polipéptido que comprende o que consiste en un dominio de sitio activo como se predice, a través del uso de una base de datos, tal como Pfam (que es una gran colección de múltiples alineaciones de secuencias y modelos de Markov ocultos que cubren muchas familias de proteínas comunes, la base de datos de las familias de proteínas Pfam, a A. Bateman, E. Birney, L. Cerruti, R. Durbin, L. Etwiller, S.R. Eddy, S. Griffiths-Jones , K.L. Howe, M. Marshall, y E.L.L. Sonnhammer, Nucleic Acids Research, 30 (1) : 276-280 , 2002), o su equivalente. Aldolasas Híbridas y Bibliotecas de Péptidos En un aspecto, la invención proporciona aldolasas híbridas y proteínas de fusión, incluyendo bibliotecas de péptidos, que comprenden las secuencias de la invención. Las bibliotecas de péptidos de la invención se pueden utilizar para aislar moduladores peptídicos (por ejemplo, activadores o inhibidores) de los objetivos, tales como sustratos de aldolasa, receptores, enzimas. Las bibliotecas de péptidos de la invención se pueden utilizar para identificar los componentes de enlace formales de los objetivos, tales como ligandos, por ejemplo citoquinas, hormonas, y similares. En un aspecto, las proteínas de fusión de la invención (por ejemplo, la fracción peptídica) se estabilizan conformacionalmente (en relación con los péptidos lineales) , para permitir una afinidad de enlace más alta para los objetivos. La invención proporciona fusiones de aldolasas de la invención y otros péptidos, incluyendo péptidos conocidos y aleatorios. Se pueden fusionar de una manera tal que no se perturba de una forma significativa la estructura de las aldolasas, y el péptido se estabiliza conformacionalmente de una manera metabólica o estructural. Esto permite la creación de una biblioteca de péptidos que se monitorea fácilmente, tanto para determinar su presencia adentro de las células, como su cantidad. Las variantes de secuencias de aminoácidos de la invención se pueden caracterizar por una naturaleza previamente determinada de la variación, una característica que las establece aparte de la forma que se presenta naturalmente, por ejemplo una variación alélica o inter-especies de una secuencia de aldolasa. En un aspecto, las variantes de la invención exhiben la misma actividad biológica cualitativa que el análogo que se presenta naturalmente. De una manera alternativa, se pueden seleccionar las variantes por tener características modificadas. En un aspecto, aunque el sitio o la región para introducir una variación de secuencia de aminoácidos se determina previamente, la mutación por sí misma no necesita determinarse previamente. Por ejemplo, con el objeto de optimizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, se puede conducir mutagénesis aleatoria en el codón o en la región objetiva, y se rastrean las variantes de aldolasa expresadas para determinar la combinación óptima de la actividad deseada. Las técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios previamente determinados del ADN que tenga una secuencia conocida, son bien conocidas, y se describen en la presente, por ejemplo, mutagénesis del cebador M13 y mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa. El rastreo de los mutantes se puede hacer utilizando ensayos de las actividades proteolíticas . En los aspectos alternativos, las sustituciones de aminoácidos pueden ser de residuos individuales; se pueden hacer inserciones del orden de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos, aunque se pueden hacer inserciones considerablemente más grandes. Las supresiones pueden ser desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70 residuos o más. Con el fin de obtener un derivado final con las propiedades óptimas, se pueden utilizar sustituciones, supresiones, inserciones, o cualquier combinación de las mismas. En general, estos cambios se hacen sobre unos cuantos aminoácidos para minimizar la alteración de la molécula. Sin embargo, se pueden tolerar cambios más grandes en ciertas circunstancias. La invención proporciona aldolasas en donde se ha modificado la estructura base del polipéptido, la estructura secundaria o terciaria, por ejemplo una estructura de hélice alfa o de hoja beta. En un aspecto, se ha modificado la carga o la hidrofobicidad . En un aspecto, se ha modificado el volumen de una cadena lateral . Se hacen cambios sustanciales en la función o en la identidad inmunologica mediante la selección de sustituciones que sean menos conservadoras. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones que afecten de una forma más significativa a: la estructura base del polipéptido en el área de la alteración, por ejemplo una estructura de hélice alfa o de hoja beta; una carga o un sitio hidrofóbico de la molécula, que puede estar en un sitio activo; o una cadena lateral. La invención proporciona sustituciones en el polipéptido de la invención, en donde (a) un residuo hidrofílico, por ejemplo serilo o treonilo, es sustituido por cualquiera de un residuo hidrofóbico, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo, o alanilo; (b) una cisteína o prolina es sustituida por cualquier otro residuo; (c) un residuo que tenga una cadena lateral electropositiva, por ejemplo lisilo, arginilo, o histidilo, es sustituido por un residuo electronegativo, por ejemplo glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tenga una cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina, es sustituido por uno que no tenga cadena lateral, por ejemplo glicina. Las variantes pueden exhibir la misma actividad biológica cualitativa (es decir, actividad de aldolasa) , aunque se pueden seleccionar las variantes para modificar las características de las aldolasas como sea necesario . En un aspecto, las aldolasas de la invención comprenden epítopos o marcas de purificación, secuencias de señales u otras secuencias de fusión, etcétera. En un aspecto, las aldolasas de la invención se pueden fusionar a un péptido aleatorio para formar un polipéptido de fusión. "Fusionado" u "operativamente enlazado", significa en la presente que el péptido aleatorio y la aldolasa se enlazan entre sí, de tal manera que se minimiza la alteración a la estabilidad de la estructura de aldolasa, por ejemplo, retiene su actividad de aldolasa. El polipéptido de fusión (o el polinucleótido de fusión que codifica al polipéptido de fusión) puede comprender componentes adicionales también, incluyendo múltiples péptidos en múltiples ciclos. En un aspecto, los polipéptidos y ácidos nucleicos que los codifican se seleccionan de manera aleatoria, ya sea de una manera completamente aleatoria, o se fuerzan en su selección aleatoria, por ejemplo en la frecuencia de nucleótidos/residuos generalmente, o por posición. "Selección aleatoria" significa que cada ácido nucleico y péptido consiste en nucleótidos y aminoácidos esencialmente aleatorios, respectivamente. En un aspecto, los ácidos nucleicos que dan lugar a los péptidos, se pueden sintetizar químicamente, y por lo tanto, pueden incorporar cualquier nucleótido en cualquier posición. Por lo tanto, cuando se expresan los ácidos nucleicos para formar péptidos, se puede incorporar cualquier residuo de aminoácido en cualquier posición. El proceso sintético se puede diseñar para generar ácidos nucleicos seleccionados de manera aleatoria, con el fin de permitir la formación de todas o la mayoría de las posibles combinaciones sobre la longitud del ácido nucleico, formando de esta manera una biblioteca de ácidos nucleicos aleatoriamente seleccionados. La biblioteca puede proporcionar una población suficientemente diversa estructuralmente de productos de expresión seleccionados aleatoriamente, para afectar a un intervalo probabilísticamente suficiente de respuestas celulares, para proporcionar una o más células que exhiban una respuesta deseada. Por consiguiente, la invención proporciona una biblioteca de interacción suficientemente grande para que cuando menos uno de. sus miembros tenga una estructura que le dé afinidad para alguna molécula, proteína, u otro factor. Metodologías de Rastreo y Dispositivos de Monitoreo "En Línea" En la práctica de los métodos de la invención, se pueden utilizar una variedad de aparatos y metodologías en conjunto con los polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo, para "rastrear los polipéptidos con el fin de determinar su actividad de aldolasa, para rastrear compuestos como moduladores potenciales, por ejemplo activadores o inhibidores, de una actividad de aldolasa, para buscar anticuerpos que se enlacen con un polipéptido de la invención, para buscar ácidos nucleicos que se hibriden a un ácido nucleico de la invención, para rastrear células que expresen un polipéptido de la invención, y similares. Arreglos Capilares Los arreglos capilares, tales como el GIGAMATRIX, Diversa Corporation, San Diego, California, Estados Unidos, se pueden utilizar en los métodos de la invención. Los ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención se pueden inmovilizar en, o se pueden aplicar a, un arreglo, incluyendo arreglos capilares. Los arreglos se pueden utilizar para rastrear o monitorear las bibliotecas de las composiciones (por ejemplo, moléculas pequeñas, anti-cuerpos, ácidos nucleicos, etcétera) , con el fin de determinar su capacidad para enlazarse a, o modular la actividad de, un ácido nucleico o un polipéptido de la invención. Los arreglos capilares proporcionan otro sistema para contener y rastrear muestras. Por ejemplo, un aparato de rastreo de muestras puede incluir una pluralidad de capilares formados en un arreglo de capilares adyacentes, en donde cada capilar comprenda cuando menos una pared que defina un lumen para retener una muestra. El aparato puede incluir además un material intersticial dispuesto entre los capilares adyacentes del arreglo, y una o más indicaciones de referencia formadas dentro del material intersticial. Un material para rastrear una muestra, en donde el capilar se adapte para enlazarse en un arreglo de capilares, puede incluir una primera pared que defina un lumen para retener la muestra, y una segunda pared formada de un material filtrador, para filtrar la energía de excitación proporcionada al lumen para excitar la muestra. Se puede introducir un polipéptido o ácido nucleico, por ejemplo un ligando, en un primer componente, en cuando menos una porción de un capilar de un arreglo capilar. Cada capilar del arreglo capilar puede comprender cuando menos una pared que defina un lumen para retener al primer componente. Se puede introducir una burbuja de aire en el capilar detrás del primer componente . Se puede introducir un segundo componente en el capilar, en donde el segundo componente se separa del primer componente por la burbuja de aire. Se puede introducir una muestra de interés como un primer líquido marcado con una partícula detectable en un capilar de un arreglo capilar, en donde capilar del arreglo capilar comprenda cuando menos una pared que defina un lumen para retener al primer líquido y la partícula detectable, y en donde la cuando menos una pared se recubre con un material de enlace para enlazar la partícula detectable a la cuando menos una pared. El método puede incluir además remover el primer líquido del tubo capilar, en donde se mantenga la partícula detectable enlazada adentro del capilar, e introducir un segundo líquido en el tubo capilar. El arreglo capilar puede incluir una pluralidad de capilares individuales que comprendan cuando menos una pared externa que defina un lumen. La pared externa del capilar puede ser de una o más paredes fusionadas entre sí . De una manera similar, la pared puede definir un lumen que sea cilindrico, cuadrado, hexagonal, o de cualquier otra forma geométrica, siempre que las paredes formen un lumen para la retención de un líquido o de una muestra. Los capilares del arreglo capilar se pueden mantener juntos en estrecha proximidad para formar una estructura plana. Los capilares se pueden enlazar entre sí, al fusionarse (por ejemplo, en donde los capilares se hagan de vidrio), adherirse, enlazarse, o sujetarse lado a lado. El arreglo capilar se puede formar de cualquier número de capilares individuales , por ejemplo, un intervalo de 100 a 4,000,000 capilares. Un arreglo capilar puede formar una placa de microtitulación que tenga aproximadamente o más capilares individuales enlazados entre sí . Arreglos o "Biochlps" Los ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención se pueden inmovilizar en, o aplicar a, un arreglo. Los arreglos se pueden utilizar para rastrear o monitorear bibliotecas de composiciones (por ejemplo, moléculas' pequeñas, anti -cuerpos , ácidos nucleicos, etcétera), para determinar su capacidad para enlazarse a, o modular la actividad de, un ácido nucleico o un polipéptido de la invención. Por ejemplo, en un aspecto de la invención, un parámetro monitoreado es la expresión de transcripción de un gen de aldolasa. Una o más, o todas las transcripciones de una célula, se pueden medir mediante la hibridación de una muestra que comprenda transcripciones de la célula, o los ácidos nucleicos representativos de, o complementarios para, las transcripciones de una célula, mediante hibridación a los ácidos nucleicos inmovilizados sobre un arreglo, o "biochip" . mediante la utilización de un "arreglo" de ácidos nucleicos sobre un microchip, se pueden cuantificar simultáneamente algunas o todas las transcripciones de una célula. De una manera alternativa, también se pueden utilizar arreglos que comprendan ácido nucleico genómico, con el fin de determinar el genotipo de una cepa recién diseñada hecha mediante los métodos de la invención. También se pueden utilizar "arreglos de polipéptidos" para cuantificar simultáneamente una pluralidad de proteínas. La presente invención se puede practicar con cualquier "arreglo" conocido, también referido como un "microarreglo" o "arreglo de ácido nucleico" o "arreglo de polipéptido" o "arreglo de anti-cuerpo" o "biochip", o una variación de los mismos. Los arreglos son genéricamente una pluralidad de "puntos" o "elementos objetivos", comprendiendo cada elemento objetivo una cantidad definida de una o más moléculas biológicas , por ej emplo oligonucleótidos , inmovilizadas sobre un área definida de una superficie de sustrato para su enlace específico con una molécula de muestra, por ejemplo transcripciones de ARNm. En la práctica de los métodos de la invención, se puede incorporar cualquier arreglo conocido y/o método para hacer y usar los arreglos, del todo o en parte, o variaciones de los mismos, como se describen, por ejemplo, en las patentes US 6,277,628; 6,277,489; 6,261,776; 6,258,606; 6,054,270; 6,048,695; 6,045,996; 6,022,963; 6,013,440; 5,965,452; 5,959,098; 5,856,174; 5,830,645; 5,770,456; 5,632,957; 5,556,752; 5,143,854; 5,807,522; 5,800,992; 5,744,305; 5,700,637; 5,556,752; 5,434,049; ver también, por ejemplo, las publicaciones internacionales WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958; ver también, por ejemplo, Johnston (1998) Curr. Biol. 8 : R171 -R174 ; Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092; Kern (1997)' Biotechniques 23 : 120-124 ; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cáncer 20:399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Sup . 21:25-32. Ver también las solicitudes de patente US publicadas 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765. Anti-Cuerpos y Métodos de Rastreo Basados en los Anti-Cuerpos La invención proporciona anti -cuerpos aislados o recombinantes que se enlazan específicamente a una aldolasa de la invención. Estos anti-cuerpos se pueden utilizar para aislar, identificar, o cuantificar las aldolasas de la invención, o polipéptidos relacionados. Estos anti-cuerpos se pueden utilizar para aislar otros polipéptidos dentro del alcance de la invención, u otras aldolasas relacionadas. Los anti-cuerpos se pueden diseñar para enlazarse a un sitio activo de una aldolasa. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para inhibir las aldolasas utilizando los anti-cuerpos de la invención. Los anti-cuerpos se pueden utilizar en inmunoprecipitación, teñido, columnas de inmunoafinidad, y similares. Si se desea, se pueden generar secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen los antígenos específicos mediante inmunización, seguida por el aislamiento del polipéptido o ácido nucleico, amplificación o clonación e inmovilización del polipéptido sobre un arreglo de la invención. De una manera alternativa, los métodos de la invención se pueden utilizar para modificar la estructura de un anti -cuerpo producido por una célula que se vaya a modificar, por ejemplo se puede aumentar o reducir la afinidad de un anti -cuerpo. Adicionalmente , la capacidad para hacer o modificar anti-cuerpos puede ser un fenotipo diseñado en una célula mediante los métodos de la invención . Los métodos de inmunización, producción, y aislamiento de anti-cuerpos (policlonales y monoclonales) son conocidos por los técnicos en la materia, y se describen en la literatura científica y de patente, ver, por ejemplo, Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMU OLOGY, Wiley/Greene , NY (1991) ; Stites (editores) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7a Edición) , Lange Medical Publications , Los Altos, CA ("Stites"); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES : PRINCIPLES AND PRACTICE (2a Edición), Academic Press, Nueva York, NY (1986) ; Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York. Los anti-cuerpos también se pueden generar in vitro, por ejemplo utilizando bibliotecas de exhibición de fagos que expresen sitios de enlace de anti-cuerpos recombinantes, en adición a los métodos tradicionales in vivo utilizando animales. Ver, por ejemplo, Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys . Biomol. Struct. 26:27-45. Los polipéptidos o péptidos se pueden utilizar para generar anti-cuerpos que se enlacen específicamente a los polipéptidos, por ejemplo a las aldolasas de la invención. Los anti-cuerpos resultantes se pueden utilizar en procedimientos de cromatografía por inmunoafinidad para aislar o purificar el polipéptido, o para determinar si el polipéptido está presente en una muestra biológica. En estos procedimientos, una preparación de proteína, tal como un extracto, o una muestra biológica, se pone en contacto con un anti -cuerpo capaz de enlazarse específicamente con uno de los polipéptidos de la invención. En los procedimientos de inmunoafinidad, el anti-cuerpo se une a un soporte sólido, tal como una perla u otra matriz de columna. La preparación de proteína se pone en contacto con el anti-cuerpo bajo condiciones en las cuales el anti-cuerpo se enlace de una manera específica con uno de los polipéptidos de la invención. Después de un lavado para remover las proteínas no específicamente enlazadas, se eluyen los polipéptidos específicamente enlazados. Se puede determinar la capacidad de las proteínas de una muestra biológica para enlazarse con el anti-cuerpo, utilizando cualquiera de una variedad de procedimientos familiares para los técnicos en este campo. Por ejemplo, se puede determinar el enlace mediante el marcado del anti-cuerpo con una marca detectable, tal como un agente fluorescente, una marca enzimática, o un radioisótopo. De una manera alternativa, se puede detectar el enlace del anti-cuerpo con la muestra utilizando un anti-cuerpo secundario que tenga esta marca detectable en el mismo. Los ensayos particulares incluyen ensayos ELISA, ensayos de emparedado, radioinmunoensayos , y Western Blots. Se pueden obtener anti-cuerpos policlonales generados contra los polipéptidos de la invención mediante inyección directa de los polipéptidos en un animal, o mediante la administración de los polipéptidos a un animal no humano. El anti -cuerpo así obtenido se enlazará entonces con el polipéptido mismo. De esta manera, inclusive se puede utilizar una secuencia que codifique solamente un fragmento del polipéptido para generar anti-cuerpos que puedan enlazarse al polipéptido nativo entero. Estos anti-cuerpos se pueden utilizar luego para aislar el polipéptido de las células que expresen ese polipéptido. Para la preparación de anti-cuerpos monoclonales , se puede emplear cualquier técnica que proporcione anti-cuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuos. Los ejemplos incluyen la técnica de hibridoma, la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas, y la técnica de hibridoma-EBV (ver, por ejemplo, Colé (1985) en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96) . Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (ver, por ejemplo, la patente US 4,946,778), se pueden adaptar para producir anti-cuerpos de una sola cadena para los polipéptidos de la invención. De una manera alternativa, se pueden utilizar ratones transgénicos para expresar anti-cuerpos humanizados para estos polipéptidos o fragmentos de los mismos. Los anti-cuerpos generados contra los polipéptidos de la invención se pueden utilizar en el rastreo de polipéptidos similares (por ejemplo, aldolasas) a partir de otros organismos y muestras. En estas técnicas, los polipéptidos a partir del organismo se ponen en contacto con el anti -cuerpo, y se detectan los polipéptidos que se enlacen de una manera específica con el anti-cuerpo. Se puede emplear cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente para detectar el enlace del anti-cuerpo. Estuches Terapéuticos La invención proporciona estuches terapéuticos que comprenden las composiciones, por ejemplo los ácidos nucleicos, casetes de expresión, vectores, células, semillas o plantas o partes de plantas transgénicas , polipéptidos (por ejemplo, aldolasas), y/o anti-cuerpos de la invención. Los estuches terapéuticos también pueden contener material de instrucción que enseñe las metodologías y los usos industriales de la invención, como se describe en la presente. Medición de los Parámetros Metabólieos Los métodos de la invención proporcionan una evolución de la célula entera, o un diseño de la célula entera, para que una célula desarrolle una nueva cepa celular que tenga un nuevo fenotipo, por ejemplo una actividad de aldolasa nueva o modificada, mediante la modificación de la composición genética de la célula. La composición genética se puede modificar mediante la adición a la célula de un ácido nucleico de la invención. Con el fin de detectar el nuevo fenotipo, se monitorea cuando menos un parámetro metabólico de una célula modificada en un marco de "tiempo real" o "en línea". En un aspecto, se monitorean una pluralidad de células, tal como un cultivo celular, en "tiempo real" o "en línea". En un aspecto, se monitorean una pluralidad de parámetros metabólicos en "tiempo real" o "en línea". Los parámetros metabólicos se pueden monitorear utilizando las aldolasas de la invención. El análisis del flujo metabólico (MFA) se basa en una estructura bioquímica conocida. Se construye una matriz metabólica linealmente independiente basándose en la ley de la conservación de masas y en la hipótesis de estado pseudo-continuo (PSSH) sobre los metabolitos intracelulares . En la práctica de los métodos de la invención, se establecen redes metabólicas, incluyendo : • la identidad de todos los sustratos de senda, productos, y metabolitos intermediarios, • la identidad de todas las reacciones químicas que interconvierten los metabolitos de senda, la estequiometría de las reacciones de senda, • la identidad de todas las enzimas que catalizan las reacciones, la cinética de la reacción enzimática , • las interacciones reguladoras entre los componentes de senda, por ejemplo las interacciones aloestéricas, las interacciones de enzima-enzima, etcétera, • la compartimentalización intracelular de las enzimas o cualquier otra organización supramolecular de las enzimas, y • la presencia de cualesquiera gradientes de concentración de metabolitos, enzimas, o moléculas efectoras o barreras de difusión a su movimiento. Una vez que se construye la red metabólica para una cepa dada, se puede introducir la presentación matemática mediante noción de matriz, para estimar los flujos metabólicos intracelulares si están disponibles los datos del metaboloma en línea. El fenotipo metabólico se apoya en los cambios de la red metabólica entera dentro de una célula. El fenotipo metabólico se apoya en el cambio de la utilización de senda con respecto a las condiciones del medio ambiente, la regulación genética, el estado de desarrollo, y el genotipo, etcétera. En un aspecto de los métodos de la invención, después del cálculo del análisis de flujo metabólico en línea, se analizan el comportamiento dinámico de las células, su fenotipo y otras propiedades, mediante la investigación de la utilización de la senda. Por ejemplo, si se aumenta el suministro de glucosa y se reduce el oxígeno durante la fermentación de levadura, se reducirá y/o se detendrá la utilización de las sendas respiratorias, y dominará la utilización de las sendas de fermentación. El control del estado fisiológico de los cultivos celulares llegará a ser posible después del análisis de la senda. Los métodos de la invención pueden ayudar a determinar la manera de manipular la fermentación, mediante la determinación de cómo cambiar el suministro de sustrato, la temperatura, el uso de inductores, etcétera, para controlar el estado fisiológico de las células, con el fin de moverse a lo largo de la dirección deseable. En la práctica de los métodos de la invención, los resultados del análisis de flujo metabólico se pueden comparar también con los datos del transcriptoma y del proteoma, para diseñar experimentos y protocolos para el diseño metabólico o la mezcla de genes, etcétera . En la práctica de los métodos de la invención, se puede conferir y detectar cualquier fenotipo modificado o nuevo, incluyendo las características nuevas o mejoradas en la célula. Se puede monitorear cualquier aspecto del metabolismo o del crecimiento . Monitoreo de la Expresión de una Transcripción de ARNm En un aspecto de la invención, el fenotipo diseñado comprende aumentar o reducir la expresión de una transcripción de ARNm (por ejemplo un mensaje de aldolasa) , o la generación de nuevas transcripciones (por ejemplo, aldolasa) en una célula. Esta expresión aumentada o reducida se puede rastrear probando para determinar la presencia de una aldolasa de la invención, o mediante ensayos de la actividad de aldolasa. Las transcripciones o mensajes del ARNm también se pueden detectar y cuantificar mediante cualquier método conocido en este campo, incluyendo, por ejemplo, Northern Blots, reacciones de amplificación cuantitativa, hibridación a arreglos, y similares. Las reacciones de amplificación cuantitativa incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, incluyendo, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa, o RT-PCR; reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real, o "reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cinética en tiempo real" (ver, por ejemplo, Kreuzer (2001) Br. J. Haematol. 114:313-318; Xia (2001) Transplanta tion 72 : 907 -914) . En un aspecto de la invención, el fenotipo diseñado se genera eliminando la expresión de un gen homólogo. Se puede eliminar la secuencia de codificación del gen, o uno o más elementos de control de transcripción, por ejemplo, promotores o potenciadores . Por consiguiente, se puede ablacionar completamente o solamente reducir la expresión de una transcripción . En un aspecto de la invención, el fenotipo diseñado comprende aumentar la expresión de un gen homólogo. Esto se puede efectuar eliminando genéticamente un elemento de control negativo, incluyendo un elemento regulador de transcripción que actúe en cis o trans, o mutando un elemento de control positivo. Una o más, o todas las transcripciones de una célula, se pueden medir mediante la hibridación de una muestra que comprenda las transcripciones de la célula, o los ácidos nucleicos representativos de, o complementarios para, las transcripciones de una célula, mediante hibridación a los ácidos nucleicos inmovilizados sobre un arreglo. Monitoreo de la .Expresión de Polipéptidos, Péptidos, y Aminoácidos En un aspecto de la invención, el fenotipo diseñado comprende aumentar o reducir la expresión de un polipéptido (por ejemplo, una aldolasa), o generar nuevos polipéptidos en una célula. Esta expresión aumentada o reducida se puede rastrear mediante la determinación de la cantidad de aldolasa presente, o mediante ensayos de la actividad de aldolasa. Los polipéptidos, péptidos, y aminoácidos, también se pueden detectar y cuantificar mediante cualquier método conocido en la materia, incluyendo, por ejemplo, resonancia magnética nuclear (RMN) , espectrofotometría , radiografía (radiomarcado de proteína), electroforesis , electroforesis capilar, cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) , cromatografía de capa delgada (TLC) , cromatografía de hiperdifusión , diferentes métodos inmunológicos , por ejemplo inmunoprecipitación, inmunodifusión, inmuno-electroforesis , radioinmunoensayos (RIAs), ensayos inmunosorbentes enlazados con enzima (ELISAs) , ensayos inmuno-fluorescentes, electroforesis en gel (por ejemplo, SDS-PAGE) , teñido con anti -cuerpos , seleccionador celular activado por fluorescencia (FACS) , espectrometría de masas por pirólisis, Espectrometría Infrarroja de Transformación Fourier, espectrometría de Raman, GC- S, y espectrometrías de masas por LC-Electropulverización y electropulverizacion en fila de LC de tapa, y similares. Las bioactividades novedosas también se pueden rastrear empleando los métodos, o variaciones de los mismos, descritos en la patente US 6,057,103. Además, como se describe más adelante con detalle, uno o más, o todos los polipéptidos de una célula, se pueden medir utilizando un arreglo de proteína. Aplicaciones Industriales Composiciones Detergentes La invención proporciona composiciones detergentes que comprenden uno o más polipéptidos de la invención, por ejemplo las aldolasas de la invención, tales como alfa-aldolasas , gluco-aldolasas, etcétera, y métodos para hacer y usar estas composiciones . La invención incorpora todos los métodos para hacer y usar composiciones detergentes, ver, por ejemplo, las patentes US 6,413,928; 6,399,561; 6,365,561; 6,380,147. Las composiciones detergentes pueden ser una composición acuosa de una y dos partes, una composición líquida no acuosa, un sólido vaciado, una forma granular, una forma en partículas, una tableta comprimida, un gel y/o una pasta, y una forma de pasta acuosa. La invención también proporciona métodos capaces de remover rápidamente la suciedad de alimentos, películas de residuos de alimentos, y otras composiciones alimenticias menores utilizando estas composiciones detergentes. Las aldolasas de la invención pueden facilitar la remoción de las manchas de almidón por medio de hidrólisis catalítica del polisacárido de almidón. Las aldolasas de la invención se pueden utilizar en detergentes para lavado de trastes, y en detergentes para lavado de textiles. El contenido enzimático activo real depende del método de fabricación de una composición detergente, y no es crítico, asumiendo que la solución detergente tenga la actividad enzimática deseada. En un aspecto, la cantidad de aldolasa presente en la solución final es de aproximadamente 0.001 mg a 0.5 mg por g de la composición detergente. La enzima particular seleccionada para utilizarse en el proceso y los productos de esta invención depende de las condiciones de utilidad final, incluyendo la forma física del producto, el pH de uso, la temperatura de uso, y el tipo de suciedad que se vaya a degradar o a alterar. La enzima se puede seleccionar para proporcionar una actividad y estabilidad óptimas para un conjunto dado de condiciones utilitarias. En un aspecto, los polipéptidos de la presente invención son activos en los intervalos de pH desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 12, y en el intervalo de temperatura de aproximadamente 20oc a aproximadamente 95°C. Los detergentes de la invención pueden comprender tensoactivos catiónicos, semi -polares , no iónicos, o zwiteriónicos , o mezclas de los mismos. Las aldolasas de la presente invención se pueden formular en detergentes en polvo y líquidos que tengan un pH de entre 4.0 y 12.0, en niveles de aproximadamente el 0.01 a aproximadamente el 5 por ciento (de preferencia del 0.1 por ciento al 0.5 por ciento en peso) . Estas composiciones detergentes también pueden incluir otras enzimas, tales como proteasas conocidas, celulasas, lipasas, o endoglicosidasas , así como mejoradores de detergencia y estabilizantes. La adición de las aldolasas de la invención a las composiciones limpiadoras convencionales no crea ninguna limitación de uso especial. En otras palabras, cualquier temperatura y pH adecuados para el detergente también son adecuados para las presentes composiciones, siempre que el pH esté dentro del intervalo anterior, y la temperatura esté debajo de la temperatura de desnaturalización de la enzima descrita. En adición, los péptidos de la invención se pueden utilizar en una composición limpiadora sin detergentes, nuevamente solos o en combinación con mejoradores de detergencia y estabilizantes. La presente invención proporciona composiciones limpiadoras, incluyendo composiciones detergentes, para limpiar superficies duras, composiciones detergentes para limpiar telas, composiciones para lavado de trastes, composiciones para limpieza oral, composiciones limpiadoras de dentaduras, y soluciones limpiadoras de lentes de contacto. En un aspecto, la invención proporciona un método para lavar un objeto, el cual comprende poner en contacto el objeto con un polipéptido de la invención bajo condiciones suficientes para lavarse. En un aspecto, se utiliza un polipéptido de la invención (por ejemplo, una aldolasa activa alcalina) en un detergente, es decir, como un aditivo de detergente. La composición detergente de la invención, por ejemplo, se puede formular como una composición detergente para lavado de ropa a mano o a máquina que comprenda un polipéptido de la invención. Las composiciones detergentes de la invención incluyen soluciones y aplicaciones de lavado de ropa y lavado de trastes (por ejemplo, lavado de trastes automático) . El aditivo para lavado de ropa adecuado para él tratamiento previo de telas manchadas puede comprender un polipéptido de la invención. Una composición suavizante de telas puede comprender un polipéptido de la invención. De una manera alternativa, se puede formular un polipéptido de la invención como una composición detergente para utilizarse en las operaciones generales de limpieza de superficies duras del hogar. En los aspectos alternativos, los aditivos de detergentes y las composiciones detergentes de la invención pueden comprender una o más enzimas diferentes, tales como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, otra aldolasa, una carbohidrasa , una celulasa, una pectina, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa por ejemplo una lactasa y/o una peroxidasa. Las propiedades de las enzimas de la invención se seleccionan para ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, Ph óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etcétera) , y las enzimas están presentes en cantidades efectivas. En un aspecto, las enzimas de aldolasa de la invención se utilizan para remover materiales de mal olor de las telas. Se pueden utilizar diferentes composiciones detergentes y métodos para fabricarlos en la práctica de la invención, como se describen, a guisa de ejemplo, en las patentes US 6,333,301; 6,329,333; 6,326,341; 6,297,038; 6,309,871; 6,204,232; 6,197,070; 5,856,164. Tratamiento de Telas La invención proporciona métodos para el tratamiento de telas utilizando uno o más polipéptidos de la invención. Los polipéptidos de la invención se pueden utilizar en cualquier método de tratamiento de telas, los cuales son bien conocidos en este campo, ver, por ejemplo, la patente US 6,077,316. Por ejemplo, en un aspecto, se mejora la sensación y apariencia de una tela mediante un método que comprende poner en contacto la tela con una aldolasa de la · invención en una solución. En un aspecto, la tela se trata con la solución bajo presión. En un aspecto, las enzimas de la invención se aplican durante o después del hilado de textiles, o durante la etapa de desapresto, o uno o más pasos adicionales del procesamiento de telas. Durante el hilado de textiles, los hilos se exponen a una tensión mecánica considerable. Antes de hilarse en los telares mecánicos, los hilos de la urdimbre con frecuencia se recubren con almidón o derivados de almidón de apresto, con el objeto de aumentar su resistencia a la tracción y para prevenir el rompimiento. Las enzimas de la invención se pueden aplicar para remover estos almidones o derivados de almidón de apresto. Después de que se han hilado los textiles, una tela puede proceder hacia una etapa de desapresto ., Ésta puede ser seguida por uno o más pasos adicionales del procesamiento de la tela. El desapresto es el acto de remover el apresto de los textiles. Después de hilarse, se debe remover el recubrimiento de apresto antes del procesamiento adicional de la tela, con el objeto de asegurar un resultado homogéneo y a prueba de lavado. La invención proporciona un método para el desapresto, el cual comprende la hidrólisis enzimática del apresto por la acción de una enzima de la invención. Las enzimas de la invención se pueden utilizar para desaprestar telas, incluyendo telas que contienen algodón, como aditivos de detergentes, por ejemplo en composiciones acuosas. La invención proporciona métodos para producir una apariencia lavada a las telas y ropas de mezclilla teñidas de índigo. Para la fabricación de ropa, la tela se puede cortar y coser para formar telas o ropas, las cuales después se terminan. En particular, para la fabricación de pantalones de mezclilla, se han desarrollado diferentes métodos de acabado enzimático. El acabado de la ropa de mezclilla normalmente se inicia con un paso de desapresto enzimático, durante el cual la ropa se somete a la acción de enzimas amilolíticas con el objeto de proporcionar suavidad a la tela y hacer que el algodón sea más accesible a los pasos de acabado enzimático subsecuentes. La invención proporciona métodos para terminar ropa de mezclilla (por ejemplo, un "proceso de bio-suavizamiento" ) , para el desapresto enzimático, y para proporcionar suavidad a las telas utilizando las aldolasas de la invención. La invención proporciona métodos para suavizar rápidamente la ropa de mezclilla en un proceso de desapresto y/o de acabado. Alimentos y Procesamiento de Alimentos : Licuefacción del Almidón Las enzimas de la invención tienen numerosas aplicaciones en la industria del procesamiento de alimentos. Las aldolasas de la invención se utilizan en el procesamiento del almidón hasta fructosa. El procesamiento del almidón hasta fructosa puede consistir en cuatro pasos: licuefacción del almidón granular, sacarificación del almidón licuado en dextrosa, purificación, e isomerización hasta fructosa. La invención proporciona métodos de licuefacción del almidón, utilizando las enzimas de la invención. Las suspensiones concentradas de gránulos poliméricos de almidón se convierten en una solución de dextrinas solubles de una longitud de cadena más corta, de baja viscosidad. Este paso es útil para un manejo conveniente con el equipo convencional, y para la conversión eficiente hasta glucosa u otros azúcares 103. En un aspecto, el almidón granular se licúa mediante la gelatinización de los gránulos elevando la temperatura del almidón granular hasta más de aproximadamente 72°C. El procesamiento de calentamiento altera instantáneamente los gránulos de almidón insolubles para producir una solución de almidón soluble en agua. Luego la solución de almidón solubilizada se puede licuar mediante una aldolasa de la invención. Por consiguiente, la invención proporciona procesos de licuefacción enzimática de almidón utilizando una aldolasa de la invención . La Figura 26, la Figura 27, y la Figura 28 ilustran procesos de almidón de ejemplo alternativos, incluyen procesos de licuefacción de almidón, de la invención (utilizando cuando menos una enzima de la invención) . Por ejemplo, la Figura 26 ilustra un proceso de licuefacción de almidón de ejemplo de la invención, el cual comprende tratar una pasta de almidón (por ejemplo, que tiene de aproximadamente el 30 por ciento al 35 por ciento de sólidos) con vapor para la licuefacción primaria (por ejemplo, a aproximadamente 105°C durante aproximadamente 5 minutos) , introducirla en un tanque de evaporación instantánea, seguido por licuefacción secundaria (por ejemplo, de aproximadamente 90°C a 950C durante aproximadamente 90 minutos) , involucrando cada uno de estos pasos el uso de una enzima de la invención. La Figura 27 ilustra otro proceso de licuefacción de almidón de ejemplo de la invención, el cual comprende tratar una pasta de almidón a aproximadamente entre un pH de 4 y un pH de 5, por ejemplo un pH de 4.5, ajustar el pH, agregar calcio, licuar a aproximadamente un pH de 5 a un pH de 6, por ejemplo un pH de 5.4, a aproximadamente 95oc, utilizando una alfa-aldolasa de la invención, seguido por otro ajuste de pH y temperatura para la sacarificación a aproximadamente entre un pH de 4 y un pH de 5, por ejemplo un pH de 4.5, a una temperatura de entre aproximadamente 60°C y 65°C, utilizando una glucoaldolasa de la invención. La Figura 28 ilustra otro proceso de almidón de ejemplo de la invención, el cual comprende tratar una pasta de almidón a aproximadamente entre un pH de 4 y un pH de 5, por ejemplo un pH de 4.5 (ajuste de pH opcional, adición de calcio) , combinado con licuefacción-sacarificación utilizando una alfa-aldolasa y/o una glucoaldolasa de la invención a aproximadamente entre un pH 4 y un pH de 5, por ejemplo un pH de 4.5 , a una temperatura mayor a aproximadamente 90oC, o mayor a aproximadamente 95oC, seguido por otro ajuste de pH y temperatura para la sacarificación a aproximadamente entre un pH de 4 y un pH de 5, por ejemplo un pH de 4.5, a una temperatura de entre aproximadamente 60oC y 65°C, utilizando una glucoaldolasa de la invención. En un aspecto, la licuefacción-sacarificación combinada de la invención es un proceso de "un recipiente" . En un aspecto, todo el proceso es un proceso de "un recipiente". Cualquiera de estos procesos, y cualquiera de estos pasos, pueden comprender también, o pueden comprender además, otra enzima de la invención (por ejemplo, una glucosidasa, tal como una a-1,6-glucosidasa, una maltasa, etcétera) , u otra enzima, tal como una pululanasa o una isomerasa.
Un proceso de licuefacción enzimática de ejemplo involucra ajustar el pH de la pasta de almidón granular hasta entre 6.0 y 6.5, y la adición de hidróxido de calcio, hidróxido de sodio, o carbonato de sodio. En un aspecto, se agrega hidróxido de calcio. Esto proporciona iones de calcio para estabilizar . la glucoaldolasa de la invención contra la inactivación. En un aspecto, después de la adición de aldolasa, la suspensión se bombea a través de un chorro de vapor para elevar instantáneamente la temperatura hasta entre 80°C y 115°C. En un aspecto, el almidón se gelatiniza inmediatamente, y, debido a la presencia de aldolasa, se despolimeriza a través de hidrólisis aleatoria de los enlaces a- 1 , 4 -glicosídicos mediante la aldolasa, hasta obtener una masa fluida. La masa fluida se puede bombear fácilmente. La invención proporciona diferentes procesos de licuefacción de almidón enzimática utilizando una aldolasa de la invención. En un aspecto, el proceso de licuefacción de la invención, se agrega una aldolasa a la suspensión de almidón, y la suspensión se mantiene a una temperatura de entre aproximadamente 80°C y 100°C, para hidrolizar parcialmente los gránulos de almidón. En un aspecto, la suspensión de almidón parcialmente hidrolizada se bombea a través de un chorro a temperaturas mayores de aproximadamente 105°C, para gelatinizar completamente cualquier estructura granular restante. En un aspecto, después de enfriar el almidón gelatinizado, se hace una segunda adición de aldolasa para hidrolizar adicionalmente el almidón . La invención proporciona enzimas y procesos para hidrolizar el almidón líquido (licuado) y granular. Este almidón se puede derivar a partir de cualquier fuente, por ejemplo maíz, trigo, mijo, sorgo, centeno o cebada. La invención se aplica a cualquier fuente de almidón de grano que sea útil en la licuefacción, por ejemplo, cualquier otro grano o fuente vegetal que se sepa que produce almidón adecuado para la licuefacción. Los métodos de la invención comprenden licuar el almidón a partir de cualquier material natural, tal como arroz, arroz germinado, maíz, cebada, mijo, trigo, legumbres, y camote. El proceso de licuado puede hidrolizar sustancialmente el almidón para producir un jarabe. El intervalo de temperatura de la licuefacción puede ser cualquier temperatura de licuefacción que se sepa que es efectiva para licuar el almidón. Por ejemplo, la temperatura del almidón puede ser de entre aproximadamente 80oC y aproximadamente 115°C, de entre aproximadamente 100°C y aproximadamente 110°C, y de aproximadamente 105oC a aproximadamente 108°C. En los aspectos alternativos, la aldolasa utilizada en estos métodos es activa a estas temperaturas, por ejemplo es activa a temperaturas en un intervalo de entre aproximadamente 80oc y aproximadamente 115°C, de entre aproximadamente lOOoc y aproximadamente 110°C, y de aproximadamente 105°C a aproximadamente 108oc. La invención proporciona métodos para la sacarificación con licuefacción como se ilustra en la Figura 17. En un aspecto, las alfa-aldolasas de la invención se utilizan en el paso de licuefacción ilustrado (algunos métodos industriales actuales utilizan la -aldolasa de B. licheniformis) . En un aspecto, el proceso tiene lugar a aproximadamente un pH de 6.0, a una temperatura en cualquier parte en el intervalo de entre aproximadamente 95°C y 105°C, durante un tiempo en cualquier parte entre aproximadamente 0.5 y 5 horas, por ejemplo de 60, 90, o 120 minutos. En un aspecto, en un proceso de remojo de maíz, antes de licuar las celulasas, se agregan proteasas y/o tio-reductasas de proteína. En un aspecto de un proceso de licuefacción de la invención, se agrega una aldolasa de la invención que tenga actividad a aproximadamente un pH de 4.5 (o en cualquier parte entre aproximadamente un pH de 4 y un pH de 5) , que puede o no depender del Ca2+ . Si se elimina la adición de sales en el extremo frontal del proceso, se elimina la necesidad de removerlas en el extremo posterior del proceso. En un aspecto de un proceso de. licuefacción de la invención, se utiliza una aldolasa que sea más activa. Esto puede permitir reducir la cantidad de enzima necesaria. En un aspecto, la licuefacción y sacarificación se hacen en el mismo recipiente, como un "proceso de un recipiente", por ejemplo, bajo condiciones que comprenden de aproximadamente 90°C a 95°C (o en cualquier parte entre aproximadamente 80°C y 105oC) , como un proceso de aproximadamente 3 horas (o como un proceso que dure entre aproximadamente 1 y 5 horas) . En este aspecto, al carga enzimática se puede cortar nuevamente a la mitad . En un aspecto de un proceso de sacarificación de la invención se utiliza una glucoaldolasa de la invención. En un aspecto, las glucoaldolasas de la invención se utilizan en el paso de sacarificación ilustrado (algunos métodos industriales actuales utilizan glucoaldolasa de A. niger) . En un aspecto, el proceso tiene lugar a aproximadamente un pH de 4.5, en un intervalo de temperatura de entre aproximadamente 60°C y 62°C (o en cualquier parte en el intervalo de entre aproximadamente 50°C y 72°C, o de entre aproximadamente 40°C y 80°C) , como un proceso que dura entre aproximadamente 12 y 96 o más horas. En un aspecto de un proceso de sacarificación de la invención, se utiliza una glucoaldolasa de la invención para dar un nivel más alto de dextrosa en el jarabe. En un aspecto, se agregan otras enzimas, por ejemplo pululanasas, para aumentar la cantidad de glucosa. En un aspecto, las aldolasas de la invención se utilizan en el paso de isomerización ilustrado (algunos métodos industriales actuales utilizan isomerasa de glucosa de Estreptomyces sp) . En un aspecto, la reacción de isomerización de la invención tiene lugar bajo condiciones que comprendan cualquiera entre aproximadamente un pH de 5 y un pH de 10, o cualquiera entre aproximadamente un pH de 6 y un pH de 9 , o cualquiera entre aproximadamente un pH de 7.5 y 8.5. En un aspecto, la reacción de isomerización de la invención tiene lugar bajo condiciones que comprendan entre aproximadamente 40°C y 75°C, o entre aproximadamente 50°C y 65°C, o entre aproximadamente 55°C y 60°C. En un aspecto de un proceso de isomerización de la invención, se utiliza una isomerasa de xilosa. En un aspecto, se utiliza cobalto en la reacción (algunas isomerasas de glucosa termoestables conocidas requieren de cobalto) . En un aspecto, se utiliza una enzima de la invención que carezca de dependencia, o que tenga menos dependencia, en el cobalto. En un aspecto, se utiliza una enzima de la invención que tenga actividad a un pH más bajo, por ejemplo a un pH de 7.0 , a un pH de 6.5, a un pH de 6 , a un pH de 5.5 , a un pH de 5 , a un pH de 4.5 , a un pH de 4 , a un pH de 3.5 o menor, o, por ejemplo, en un intervalo entre aproximadamente un pH de 3.5 y 7.0) . En un aspecto, esto permite tener menos formación de color (de otra manera, se puede tener que remover el exceso de color) . En un aspecto, la temperatura se aumenta durante la isomerización, por ejemplo hasta entre aproximadamente 80°C y 110°C, de 85°C a 105°C, o de 90°C a 100°C. Esto puede aumentar la cantidad de fructosa producida, por ejemplo hasta aproximadamente el 51 por ciento. Sin embargo, en un aspecto, para las sodas (por ejemplo, refrescos y similares), el nivel de fructosa puede estar en cualquier parte entre aproximadamente el 45 por ciento y el 65 por ciento, o entre el 50 por ciento y el 60 por ciento, por ejemplo en aproximadamente el 55 por ciento. En un aspecto, una, algunas, o todas las enzimas utilizadas en los procesos de la invención (incluyendo las enzimas de la invención) se inmovilizan, por ejemplo se inmovilizan sobre cualquier superficie, por ejemplo una superficie plana o una columna enzimática, por ejemplo se inmovilizan sobre un arreglo, una perla, una fibra, un poro, un capilar, y similares. En un aspecto, al inmovilizarse, se pueden volver a utilizar. En un aspecto, la invención proporciona "cócteles de enzimas" utilizando cuando menos una enzima de la invención. En un aspecto, los "cócteles de enzimas" se utilizan en los procesos de la invención, por ejemplo, incluyendo los métodos de licuefacción y sacarificación, como se ilustran en la Figura 17. Por ejemplo, en un aspecto, se utilizan enzimas degradantes de la pared celular (CWDE) , por ejemplo para los procesos de textiles, pulpa y papel, y de lavado de ropa de la invención, incluyendo, por ejemplo, combinaciones de celulasas, hemicelulasas , xilanasa, galactomananasas , glucomananasas , arabinofuranosidasas , y otras. En un aspecto, los "cócteles de enzimas" utilizados en los procesos de la invención para bio-blanquear (por ejemplo, pulpa y papel, procesos de lavado de ropa), incluyen combinaciones de lacasas, peroxidasas, oxidasas, y similares. En un aspecto, las enzimas degradantes de la pared celular se combinan con enzimas bio-blanqueadoras y las enzimas de 'la invención para degradar las paredes celulares de plantas con el fin de liberar los agentes de color. Procesos para Producir Jarabes de Dextrosa de Alto Peso Molecular La invención proporciona procesos para producir jarabes de dextrosa de alto peso molecular utilizando las enzimas de la invención, incluyendo métodos para producir oligosacáridos que tengan grupos de un peso molecular estrecho en aproximadamente un peso molecular de 20,000. En un aspecto, se utilizan las aldolasas de la invención de origen arqueal, incluyendo las aldolasas derivadas de arquéales de las SEQ ID NO: 80 (codificada por la SEQ ID NO:79), SEQ ID NO:82 (codificada por la SEQ ID NO:81), SEQ ID NO: 116 (codificada por la SEQ ID NO:115), SEQ ID NO:323 (codificada por la SEQ ID NO:322), SEQ ID NO:570 (codificada por la SEQ ID NO:169), y las enzimas de la invención que tengan la misma actividad que estas aldolasas arquéales, para licuar una composición que comprenda almidón, por ejemplo un almidón de maíz, con el fin de producir un patrón de oligosacárido que esté apretadamente agrupado en un peso molecular de aproximadamente 20,000 (las aldolasas de bacillus producirán jarabes que contengan fragmentos de un peso molecular mucho más alto, y los oligosacáridos de alto peso molecular no se convierten completamente en glucosa mediante las glucoaldolasas , por ejemplo las glucoaldolasas de Aspergillus , durante la sacarificación) . Utilizando las aldolasas de la invención de origen arqueal para catalizar la hidrólisis de una composición que comprende almidón, por ejemplo un almidón de maíz, se producen los fragmentos de un peso molecular de aproximadamente 20,000. Estos fragmentos de un peso molecular de aproximadamente 20,000 se pueden convertir rápida y completamente en glucosa. Por consiguiente, en un aspecto, los jarabes sacarificados resultantes de la licuefacción de aldolasa de Bacillus , contienen menos dextrosa que los jarabes sacarificados a partir de la licuefacción utilizando las aldolasas de la invención. Procesos para Producir Maltodextr nas Homogéneas La invención proporciona procesos para producir maltodextrinas homogéneas utilizando las enzimas de la invención. Las maltodextrinas homogéneas producidas mediante los métodos de la invención se pueden utilizar en una amplia variedad de aplicaciones de alimentos, fármacos, y recubrimientos. En un aspecto, las aldolasas de la invención de origen arqueal , incluyendo las aldolasas arquéales de las SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323, y las enzimas de la invención que tienen la misma actividad que estas aldolasas arquéales, pueden generar una composición de maltodextrina extremadamente uniforme (los procesos de fabricación convencionales utilizando hidrólisis con ácido o enzimática del almidón, dan como resultado una amplia distribución de peso molecular, típicamente bimodal, de los oligosacáridos) . Las maltodextrinas homogéneas producidas mediante los métodos de la invención tienen una distribución de peso molecular homogénea, y se pueden utilizar en una variedad de productos que comprenden maltodextrina , dando como resultado una viscosidad más baja, soluciones transparentes (sin nebulosidad) , mejores propiedades de recubrimiento, mejores propiedades de formación de película, y similares. En un aspecto, las aldolasas de la invención de origen arqueal (y las enzimas de la invención que tienen la misma actividad que estas aldolasas arquéales) se utilizan para licuar almidón de maíz con el fin de producir una composición que comprende maltodextrina uniforme) . En un aspecto, la licuefacción se conduce a un pH de entre aproximadamente un pH de 4.5 y aproximadamente un pH de 6.5, por ejemplo de 5.0 o de 5.5, a temperaturas hasta de aproximadamente 105°C. La composición de maltodextrina uniforme se puede producir en equivalentes de dextrosa de aproximadamente 5 hasta tanto como aproximadamente 20. Los jarabes producidos por estas aldolasas derivadas de arquéales de la invención se pueden filtrar, tratar con carbón, y/o secar por pulverización, para producir el producto que comprende maltodextrina. Procesos de Molienda. Seca Enz mática La invención proporciona procesos de molienda seca enzimática utilizando una aldolasa de la invención. En la molienda seca, el grano entero se muele y se combina con agua. El germen opcionalmente se remueve mediante técnicas de separación por flotación o equivalentes. La mezcla resultante, la cual contiene almidón, fibra, proteína, y otros componentes del grano, se licúa utilizando aldolasa. En un aspecto, la licuefacción enzimática se hace a temperaturas más bajas que los procesos de licuefacción de almidón descritos anteriormente. En un aspecto, después de la gelatinización, la solución de almidón se mantiene a una temperatura elevada en la presencia de aldolasa hasta que se alcance un equivalente de dextrosa de 10 a 20. En un aspecto, esto es en un período de aproximadamente 1 a 3 horas. El equivalente de dextrosa (DE) es el estándar industrial para medir la concentración de azúcares reductores totales, calculados como D-glucosa sobre una base de peso seco. El almidón granular no hidrolizado tiene un equivalente de dextrosa virtualmente de cero, mientras que el equivalente de dextrosa de la D-glucosa se define como en 100. Proceso de Molienda Húmeda Enzimática La invención proporciona procesos de molienda húmeda, por ejemplo molienda húmeda de maíz, utilizando una enzima, por ejemplo una aldolasa de la invención. La molienda húmeda del maíz es un proceso que produce aceite de maíz, harina de gluten, alimento de gluten, y almidón. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para hacer aceite de maíz, harina de gluten, alimento de gluten, y almidón, utilizando una enzima de la invención. En un aspecto, se utiliza una aldolasa alcalina de la invención en la licuefacción del almidón. En un aspecto, se utiliza una glucoaldolasa de la invención en la sacarificación para producir glucosa. Un proceso de molienda húmeda de maíz de ejemplo de la invención (que utiliza cuando menos una enzima de la invención) se ilustra en la Figura 25. La Figura 25 ilustra un proceso de aceite de maíz de ejemplo de la invención, el cual comprende remojar, desgerminar, desfibrar, y separar el gluten, seguido por licuefacción utilizando una enzima de la invención (por ejemplo, una alfa-aldolasa) , y la sacarificación utilizando una enzima de la invención (por ejemplo, glucoaldolasa) . En un aspecto, el maíz (una semilla que consiste en un recubrimiento externo de la semilla (fibra) , almidón, una combinación de almidón y glucosa, y el germen interno) se somete a un proceso de cuatro pasos, el cual da como resultado la producción de almidón. En un aspecto, el maíz se remoja, se le quita el germen, se le quita la fibra, y se separa el gluten. En un proceso de remojo, se extraen los solubles. Al producto restante después de remover los solubles se le quita el germen, dando como resultado la producción de aceite de maíz, y la producción de una torta de aceite, la cual se agrega a los solubles del paso de remojo. Al producto restante se le quita la fibra, y se agregan los sólidos de fibra a la mezcla de torta de aceite/solubles. Esta mezcla de sólidos de fibra, torta de aceite, y solubles, forma un alimento de gluten. Después de quitar la fibra, el producto restante se somete a la separación del gluten. Esta separación da como resultado una harina de gluten y almidón. Luego el almidón se somete a licuefacción y sacarificación utilizando los polipeptidos de la invención para producir glucosa. La Figura 25 ilustra un proceso de molienda húmeda de maíz de ejemplo de la invención (utilizando cuando menos una enzima de la invención) . La Figura 26, la Figura 27, y la Figura 28 ilustran procesos de almidón de ejemplo alternativos, incluyendo procesos de licuefacción de almidón, de la invención (utilizando cuando menos una enzima de la invención) . Procesos Contra, el Rancia i ento La invención proporciona procesos contra el ranciamiento (por ejemplo, de productos horneados tales como pan) utilizando una aldolasa de la invención. La invención proporciona métodos para hacer más lento el aumento de la firmeza del mig'ajón (del producto horneado) , y una reducción de la elasticidad del migajón, utilizando una aldolasa de la invención. El ranciamiento de los productos horneados (tales como pan) es más serio a medida que pasa el tiempo entre el momento de la preparación del producto de pan y el momento del consumo. El término "ranciamiento" se utiliza para describir los cambios indeseables para el consumidor en las propiedades del producto de pan después de salir del horno, tales como un aumento en la firmeza del migajón, una reducción de la elasticidad del migajón, y cambios en la corteza, la cual llega a ser dura y ahulada. La firmeza del migajón de pan aumenta además durante el almacenamiento hasta cierto nivel, lo cual se considera como negativo. Las aldolasas de la invención se utilizan para retardar el ranciamiento del pan, como se describe, por ejemplo, en las patentes US 6,197,352; 2,615,810 y 3,026,205; Silberstein (1964) Baker 1 s Digest 38 : 66-72. En un aspecto, se utiliza una enzima de la invención para retardar el ranciamiento de los productos horneados, mientras que no se hidroliza el almidón en las dextrinas ramificadas. Las dextrinas ramificadas se forman mediante la disociación de las cadenas ramificadas de las dextrinas generadas por la hidrólisis de a-aldolasa, que no se pueden degradar adicionalmente mediante la -aldolasa. Esto puede producir un migajón gomoso en el pan resultante. De conformidad con lo anterior, la invención proporciona un proceso para retardar el ranciamiento de los productos horneados (por ejemplo, los productos horneados con levadura) , el cual comprende agregar una enzima de la invención que comprenda actividad de exoaldolasa, a una harina o a una masa utilizada para producir un producto horneado. Las exoaldolasas de la invención pueden tener actividad de glucoaldolasa , a-aldolasa (que libera maltosa en la configuración beta), y/o de aldolasa maltogénica. La invención también proporciona un proceso para preparar una masa o un producto horneado preparado a partir de la masa, el cual comprende agregar una aldolasa de la invención a la masa, en una cantidad que sea efectiva para retardar el ranciamiento del pan. La invención también proporciona una masa que comprende esta aldolasa y una premezcla que comprende harina junto con dicha aldolasa. Finalmente, la invención proporciona un aditivo enzimático para hornear, el cual contiene esta aldolasa. La invención también proporciona un proceso de alto rendimiento para producir goma de fibra de maíz de alta calidad, mediante el tratamiento de la fibra de maíz con una enzima de la invención, seguido por tratamiento con peróxido de hidrógeno, para obtener un extracto de fibra de maíz molida. Ver, por ejemplo, la patente US 6,147,206. Alimentos para Animales y Aditivos La invención proporciona métodos para el tratamiento de alimentos para animales y aditivos utilizando las enzimas de aldolasa de la invención. La invención proporciona alimentos para animales y aditivos que comprenden las aldolasas de la invención. En un aspecto, el tratamiento de los alimentos para animales y los aditivos utilizando las enzimas de aldolasa de la invención, puede ayudar en la disponibilidad de almidón en el alimento para animales o en el aditivo. Esto puede dar como resultado la liberación de azúcares fácilmente digeribles y fácilmente absorbidos . El uso de una aldolasa de la invención puede aumentar la capacidad digestiva de los animales y de las aves. El uso de una aldolasa de la invención puede asegurar la disponibilidad de un suministro de nutriente adecuado para un mejor crecimiento y desempeño. En un aspecto, las enzimas de la invención se pueden agregar como aditivos de alimentos para animales. En otro aspecto, el alimento para animales se puede tratar con las aldolasas antes del consumo por parte del animal. En otro aspecto, las aldolasas se pueden suministrar mediante la expresión de las enzimas directamente en los cultivos alimenticios transgénicos (como, por ejemplo, plantas transgénicas , semillas, y similares) , tales como el maíz. Como se describió en lo anterior, la invención proporciona plantas, partes de plantas, y células de plantas transgénicas, las cuales comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. En un aspecto, el ácido nucleico se expresa de tal manera que se produce aldolasa en cantidades recuperables. La aldolasa se puede recuperar a partir de cualquier planta o parte de planta. De una manera alternativa, la planta o la parte de planta que contenga el polipéptido recombinante , se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o material alimenticio, por ejemplo para mejorar el valor nutricional, el sabor, y las propiedades reológicas, o para destruir un factor anti-nutritivo. Tratamiento de Papel o Pulpa Las enzimas de la invención se pueden utilizar en el tratamiento de papel o pulpa, o en el desentintado de papel. Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona un proceso de tratamiento de papel utilizando las aldolasas de la invención. En un aspecto, las enzimas de la invención se pueden utilizar para modificar el almidón en el papel, convirtiéndolo de esta manera en una forma licuada. En otro aspecto, se tratan los componentes del papel fotocopiado reciclado durante el proceso de desentintado químico y enzimático. En un aspecto, las aldolasas de la invención se pueden utilizar en combinación con celulasas. El papel se puede tratar mediante los siguientes tres procesos: 1) desintegración en la presencia de una enzima de la invención, 2) desintegración con un producto químico desentintador y una enzima de la invención, y/o 3) desintegración después de remojar con una enzima de la invención. El papel reciclado tratado con aldolasa puede tener una brillantez más alta debido a la remoción de las partículas de tóner, comparándose con el papel tratado solamente con celulasa. Aunque la invención no está limitada por cualquier mecanismo particular, el efecto de una aldolasa de la invención se puede deber a su comportamiento como agente de actividad superficial en la suspensión de la pulpa. La invención proporciona métodos para el tratamiento de papel y pulpa de papel, utilizando uno o más polipéptidos de la invención. Los polipéptidos de la invención se pueden utilizar en cualquier método de tratamiento de papel o pulpa, los cuales son bien conocidos en la materia, ver, por ejemplo, las patentes US 6,241,849; 6,066,233; 5,582,681. Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona un método para desentintar y decolorar un papel impreso que contenga un tinte, el cual comprende empulpar un papel impreso para obtener una pasta de pulpa, y desalojar la tinta de la pasta de pulpa en la presencia de una enzima de la invención (también se pueden agregar otras enzimas) . En otro aspecto, la invención proporciona un método para mejorar la libertad de la pulpa, por ejemplo la pulpa hecha de fibra secundaria, mediante la adición de una mezcla enzimática que comprenda una enzima de la invención (que también puede incluir otras enzimas, por ejemplo enzimas de pectinasa) a la pulpa, y tratar bajo condiciones que hagan que una reacción produzca una pulpa enzimáticamente tratada. La libertad de la pulpa enzimáticamente tratada aumenta por la libertad inicial de la pulpa de fibra secundaria sin perder la brillantez. Reempulpado : Tratamiento de Materiales Lignocelulósicos La invención también proporciona un método para el tratamiento de fibras lignocelulósicas , en donde las fibras se tratan con un polipéptido de la invención, en una cantidad que es eficiente para mejorar las propiedades de la fibra. Las aldolasas de la invención también se pueden utilizar en la producción de materiales lignocelulósicos, tales como pulpa, papel, y cartón, a partir del papel y cartón de desecho reforzados con almidón, en especial cuando el reempulpado se presenta a un pH mayor de 7, y en donde las aldolasas pueden facilitar la desintegración del material de desecho a través de la degradación del almidón de refuerzo. Las aldolasas de la invención pueden ser útiles en un proceso para producir una pulpa de fabricación de papel a partir de papel impreso recubierto con almidón. El proceso se puede llevar a cabo como se describe, por ejemplo, en la publicación internacional WO 95/14807. Un proceso de ejemplo comprende desintegrar el papel para producir una pulpa, tratar con una enzima degradante de almidón antes, durante, o después de la desintegración, y separar las partículas de tinta de la pulpa después de la desintegración y del tratamiento enzimático. Ver también la patente US 6,309,871 y otras patentes US citadas en la presente. Por consiguiente, la invención incluye un método para el desentintado enzimático de la pulpa de papel reciclado, en donde el polipéptido se aplica en una cantidad que es eficiente para un desentintado efectivo de la superficie de la fibra. Tratamiento de Desechos Las enzimas de la invención se pueden utilizar en una variedad de otras aplicaciones industriales, por ejemplo en el tratamiento de desechos. Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona un proceso de digestión de desechos sólidos utilizando las enzimas de la invención. Los métodos pueden comprender reducir la masa y el volumen del desecho sólido sustancialmente no tratado. El desecho sólido se puede tratar con un proceso digestivo enzimático en la presencia de una solución enzimática (incluyendo una enzima de la invención) a una temperatura controlada. Esto da como resultado una reacción sin una fermentación bacteriana apreciable por los microorganismos agregados. El desecho sólido se convierte en un desecho licuado y en cualquier desecho sólido residual. El desecho licuado resultante se puede separar del desecho solidificado residual . Ver, por ejemplo, la patente US 5,709,796. Productos para el Cuidado Oral La invención proporciona un producto para el cuidado oral, el cual comprende una aldolasa de la invención. Los productos para el cuidado oral de ejemplo incluyen pastas dentales, cremas dentales, geles o polvos para dientes, odónticos, enjuagues bucales, formulaciones de enjuague para antes o después de cepillarse, gomas de mascar, grageas, o dulces. Ver, por ejemplo, la patente US 6,264,925. Elaboración de Cerveza y Fermentación La invención proporciona métodos para la elaboración de cerveza (por ejemplo, fermentación) , los cuales comprenden una aldolasa de la invención. En un proceso de ejemplo, la materia prima que contiene almidón se desintegra y se procesa para formar una malta. Se utiliza una aldolasa de la invención en cualquier punto del proceso de fermentación. Por ejemplo, se pueden utilizar las aldolasas de la invención en el procesamiento de la malta de cebada. La materia prima principal de la elaboración de cerveza es la malta de cebada. Éste puede ser un proceso en tres etapas. Primero, se puede remojar el grano de cebada para aumentar el contenido de agua, por ejemplo hasta alrededor de aproximadamente el 40 por ciento. Segundo, se puede germinar el grano mediante incubación de 15°C a 25°C durante 3 a 6 días, cuando se estimula la síntesis de la enzima bajo el control de las giberelinas. Durante este tiempo, se elevan los niveles de aldolasa de una manera significativa. En un aspecto, las aldolasas de la invención se agregan en esta (o en cualquier otra) etapa del proceso. La acción de la aldolasa da como resultado un aumento en los azúcares reductores fermentables . Esto se puede expresar como la potencia diaestática, DP, la cual puede elevarse desde alrededor de 80 hasta 190 en 5 días a 12°c. Las aldolasas de la invención se pueden utilizar en cualquier proceso de producción de cerveza, como se describe, por ejemplo, en las patentes US 5,762,991; 5,536,650; 5,405,624; 5,021,246; 4,788,066. Uso en la Perforación de Pozos y en las Operaciones de Minería La invención también incluye métodos que utilizan las enzimas de la invención en las operaciones de pozos y de perforación, por ejemplo en las operaciones de gas, petróleo, u otras operaciones de perforación o minería. Por ejemplo, en un aspecto, las enzimas de la invención se utilizan para aumentar el flujo de los fluidos de producción desdé una formación subterránea, por ejemplo un pozo o una mina. En un aspecto, las enzimas de la invención se utilizan para remover los fluidos viscosos que contienen almidón, que pueden ser dañinos, por ejemplo los fluidos formados durante las operaciones de producción. Estos fluidos que contienen almidón se pueden encontrar dentro de una formación subterránea que rodee a un agujero de pozo terminado. En un aspecto, se utiliza una aldolasa de la invención en un fluido de perforación de pozos de petróleo, para ayudar a extraer el fango de perforación. En un aspecto, el método comprende permitir que fluyan los fluidos de producción (que comprenden las enzimas de la invención) desde el agujero del pozo o desde una mina. Los métodos pueden comprender reducir el flujo de los fluidos de producción desde la formación debajo de las velocidades de flujo esperadas, y formular un tratamiento enzimático mezclando entre sí un fluido acuoso y un polipéptido de la invención. Los métodos pueden comprender bombear el tratamiento enzimático hacia una localización deseada adentro del agujero del pozo u otra flecha perforada, y permitir que el tratamiento enzimático degrade el dañino fluido viscoso que contiene almidón. Los métodos pueden comprender remover el fluido desde la formación subterránea hacia la superficie del pozo o de la flecha. En un aspecto, el tratamiento enzimático es efectivo para atacar los enlaces alfa-glucosídicos en el fluido que contiene almidón. En un aspecto, las aldolasas de la invención se utilizan en la perforación de minas, en la perforación de pozos (por ejemplo, perforación de pozos de gas o de petróleo) , y similares, para extraer el fango de perforación, por ejemplo mientras se perfora el agujero (el agujero del pozo o la flecha) . Las enzimas de la invención se pueden utilizar en cualquier operación de perforación de pozo, flecha, o mina, muchas de las cuales son bien conocidas en este campo. Por ejemplo, la invención proporciona métodos para introducir una enzima de la invención, la cual, en un aspecto también puede comprender un producto químico de producción de campo de petróleo o de gas, en una formación rocosa que comprenda petróleo y/o gas, los cuales comprenden pasar una microemulsión que comprenda la enzima (y en un aspecto, el producto químico) bajando por un pozo de producción y luego hacia adentro de la formación. En un aspecto, un pozo de producción se somete a un tratamiento de "confinación", mediante el cual se inyecta una composición acuosa que comprende una enzima de la invención en el pozo de producción bajo presión, y se "exprime" en la formación y se mantiene allí. Ver, por ejemplo, la patente US 6,581,687. En un aspecto, las aldolasas de la invención utilizadas en las operaciones de gas, petróleo, u otras operaciones de perforación o minería, son activas a un pH alto o bajo, y/o a temperaturas altas o bajas, por ejemplo las aldolasas de la invención utilizadas en estos procedimientos son activas bajo condiciones que comprenden aproximadamente un pH de 6.5, un pH de 6, un pH de 5.5, un pH de 5 , un pH de 4.5 , o un pH de 4 , o menos, o bajo condiciones que comprenden aproximadamente un pH de 7 , un pH de 7.5, un pH de 8.0, un pH de 8.5, un pH de 9 , un pH de 9.5, un pH de 10, un pH de 10.5, o un pH de 11 o más alto. En un aspecto, las aldolasas de la invención utilizadas en estos procesos son activas bajo condiciones que comprenden un intervalo de temperatura en cualquier parte entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 37°c , o entre aproximadamente 37°c y aproximadamente 95°C o más, o entre aproximadamente 80°C y aproximadamente 120°C, por ejemplo de 85oc, 90°C, 95°c , 98°C, 100°C, 105°C, 110°C, 115oC, 120oC o más. Composiciones de Liberación Demorada La invención proporciona composiciones de liberación demorada o de "liberación controlada", las cuales comprenden una composición deseada recubierta por un polímero de látex, por ejemplo una pintura de látex, o equivalente. Las composiciones de liberación demorada/liberación controlada de la invención pueden comprender cualquier composición deseada, incluyendo enzimas o cualquier ingrediente, incluyendo moléculas pequeñas, fármacos, polisacáridos , lípidos, ácidos nucleicos, vitaminas, antibióticos, insecticidas, y similares. En un aspecto, el recubrimiento se no disolverá fácilmente a una temperatura relativamente baja, pero se descompondrá para liberar la composición deseada (por ejemplo, la enzima) a una temperatura relativamente más alta. La invención proporciona métodos para la liberación demorada/liberación controlada de las composiciones, en donde la composición se recubre con un polímero de látex, por ejemplo una pintura de látex, o su equivalente. Las composiciones de liberación demorada/liberación controlada y los métodos de la invención, se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones médicas e industriales, por ejemplo, en un aspecto, las composiciones enzimáticas de liberación demorada/liberación controlada de la invención comprenden las enzimas involucradas en la fracturación con guar de los fluidos en operaciones de recuperación de petróleo mejoradas. La aplicación de degradación con guar del campo de petróleo de la invención se facilita mediante un recubrimiento que no se disuelva fácilmente a baja temperatura, pero que se descomponga para liberar la enzima a temperaturas más altas. En otro aspecto, las composiciones enzimáticas de liberación demorada/liberación controlada de la invención comprenden alimentos para animales o complementos nutricionales que comprenden, por ejemplo, enzimas, vitaminas, antibióticos y/u otros alimentos, fármacos, o complementos nutricionales. Estos compuestos activos en los alimentos para animales o en los complementos nutricionales se protegen de las condiciones de granulación o de la digestión gástrica mediante el recubrimiento sobre una composición de liberación demorada/liberación controlada de la invención. En un aspecto, la liberación es una liberación activada por la temperatura, por ejemplo, la composición deseada (por ejemplo, la enzima) se libera a una temperatura elevada, por ejemplo entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 95°C o más, por ejemplo a 85oC , 90°C , 95°C , 98oC , 100°C o más. La velocidad de la liberación se puede controlar por el grosor o la cantidad de polímero de "barrera" o de látex, aplicada a la composición deseada, por ejemplo un gránulo o matriz que comprenda la composición deseada. Por consiguiente, la invención proporciona gránulos o matrices que tienen un intervalo de grosores de polímero de látex o equivalente, y métodos para utilizarlos. La invención proporciona composiciones enzimáticas de liberación demorada/liberación controlada, por ejemplo, en un aspecto, que comprenden una enzima de la invención. En un aspecto, la invención proporciona una enzima (por ejemplo, una enzima de la invención) , o una composición granulada que comprende una enzima (una enzima de la invención) , recubierta con un polímero de látex, por ejemplo una pintura de látex o su equivalente. En un aspecto, la invención proporciona métodos para hacer las composiciones enzimáticas de liberación demorada, los cuales comprenden el recubrimiento de una enzima (por ejemplo, una enzima de la invención) , o una composición granulada que comprende una enzima (por ejemplo, una enzima de la invención), con un polímero de látex, por ejemplo una pintura de látex, o su equivalente. En un aspecto, la invención proporciona métodos para hacer composiciones de liberación demorada/liberación controlada, los cuales comprenden recubrir un compuesto deseado con un polímero de látex, por ejemplo una pintura de látex, o su equivalente . Los polímeros de látex que se utilizan en las composiciones de liberación demorada/liberación controlada (por ejemplo, las composiciones enzimáticas de liberación demorada/liberación controlada) y en los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, diferentes tipos tales como los siguientes: acrílieos; alquidos; celulosas; cumarona- indenos ; epoxies; ásteres; hidrocarburos; maleicos; melaminas; resinas naturales, oleo-resinas; fenólicos; poliamidas ; · poliésteres ; rosinas; siliconas; estírenos; terpenos; ureas; uretanos; vinilos; y similares. Los polímeros de látex que se utilizan en las composiciones de liberación demorada, y en los métodos de la invención, también incluyen, pero no se limitan a, uno o más homo- o co-polímeros que contengan uno o más de los siguientes monómeros : (met ) acrilatos ; acetato de vinilo; estireno; etileno; cloruro de vinilo; butadieno; cloruro de vinilideno; versatato de vinilo; propionato de vinilo; acrilato de terbutilo; acrilonitrilo ; neopreno; maleatos; fumaratos; y similares, incluyendo los derivados plastificados u otros derivados de los mismos . La cantidad de polímero de látex utilizada en la composición de látex de la invención no es crítica, pero puede ser cualquier cantidad que siga los procedimientos bien establecidos para utilizar polímeros de látex. En los aspectos alternativos, la cantidad de polímero de látex seco es de cuando menos aproximadamente el 1, o de aproximadamente el 2 a aproximadamente el 50, o de aproximadamente el 3 a aproximadamente el 40 por ciento en peso de la composición de látex total. La composición de látex de la invención puede contener opcionalmente otros componentes, tales como los que se utilizan en general en las composiciones de látex. Estos componentes adicionales incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: solventes, tales como hidrocarburos alifáticos o aromáticos, alcoholes, ásteres, cetonas, glicoles, glicol-éteres, nitroparafinas , o similares; pigmentos; rellenos; secantes; agentes aplanadores; plastificantes ; estabilizantes; dispersantes; tensoactivos ; viscosantes, incluyendo los espesantes asociativos poliméricos, los espesantes basados en polisacáridos , etcétera; agentes de suspensión; agentes de control de flujo; desespumantes; agentes contra la separación; conservadores; extensores; auxiliares de formación de película; reticulantes ; mej oradores de superficies; inhibidores de corrosión; y otros ingredientes útiles en las composiciones de látex. En un aspecto, las composiciones de látex de la invención que tienen una reología y estabilidad mejoradas, se proporcionan mediante la combinación de látex y un polisacárido con agua siguiendo los procedimientos establecidos. Ver, por ejemplo, las patentes US 6,372,901; 5,610,225. En un aspecto, en la fabricación de una composición que comprenda gránulos o matriz de la invención, que comprenda una composición activa, por ejemplo, una enzima (por ejemplo, una enzima de la invención) recubierta con un polímero de látex, por ejemplo una pintura de látex o su equivalente, la composición activa (por ejemplo, la enzima) se empotra en el cuerpo del gránulo (en un aspecto, una mayor parte, o toda la composición activa (por ejemplo, la enzima) se empotra en el gránulo) . Por consiguientes, se pueden utilizar productos químicos fuertes, por ejemplo el recubrimiento de látex, el cual puede ser un inactivador del ingrediente activo deseado, para recubrir la superficie del gránulo o matriz. La composición del recubrimiento se puede romper mediante agentes tales como calor, ácido, base, presión, enzimas, otros productos químicos, y similares, para tener una liberación controlada de la actividad enzimática deseada desencadenada por la exposición al agente degradante del recubrimiento . En un aspecto, una composición activa, por ejemplo una enzima (por ejemplo, una enzima de la invención, u otra enzima, por ejemplo una mananasa) , se dispersa en una harina de maíz y/o en una matriz de almidón de maíz (por ejemplo, como un gránulo) . Esta mezcla (por ejemplo, el gránulo) se desintegra dentro de 10 minutos en agua a temperatura ambiente (por ejemplo, a aproximadamente 22°C) para liberar toda (el 100 por ciento) la composición activa, por ejemplo libera toda la actividad enzimática. A temperaturas más altas, se incrementa la velocidad de liberación. Ésta no es una velocidad de desintegración aceptable para muchos usos. Sin embargo, como una composición de liberación demorada/ liberación controlada de la invención, es decir, cuando esta mezcla se recubre con un polímero de látex, por ejemplo una pintura de látex, o su equivalente, se demora la desintegración de la mezcla (por ejemplo, gránulo, matriz) . La velocidad y el grado de liberación se pueden controlar mediante el grosor del recubrimiento (barrera) aplicado al gránulo o matriz. Por ejemplo, una partícula recubierta liberará solamente el 30 por ciento de la actividad después de 6 horas en agua 22°c. A 60°C, se libera el 50 por ciento de la enzima en 90 minutos. A 80°C, se libera el 80 por ciento de la enzima durante 1 hora. La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, se debe entender que la invención no está limitada a estos ejemplos. EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Identificación y Caracterización de ot-aldolasas Termoestables El siguiente ejemplo describe un método de ejemplo para determinar si un polipéptido está dentro del alcance de la invención. Este ejemplo describe la identificación de las aldolasas de ácido novedosas de la invención. El programa de rastreo se llevó a cabo bajo condiciones de un pH neutro y bajo. Se dirigieron bibliotecas de ADN generadas a partir de muestras a un pH bajo para el descubrimiento. Este esfuerzo proporcionó el descubrimiento de cientos de clones que tienen la capacidad para degradar el almidón. Los análisis de secuencias de ADN y bioinformáticos clasificaron muchos de estos genes como aldolasas previamente no identificadas. Estudios Bioquímicos El análisis bioquímico de los clones genómicos de aldolasa mostró que muchos tenían un pH óptimo menor a un pH de 6. Se probaron los lisados de estos clones genómicos para determinar la tolerancia térmica mediante incubación a 70°C, 8O0C, 90°C, o 100OC durante 10 minutos, y mediante la medición de la actividad residual a un pH de 4.5. Se seleccionaron los clones que retuvieron una actividad de >50 por ciento después del tratamiento con calor a 80oC para un análisis adicional. Estos clones se incubaron a 90°C durante 10 minutos a un pH de 6.0 y de 4.5, y se probaron para determinar la actividad residual a un pH de 4.5 (Figura 5) . Un número de clones retuvieron >40 por ciento de su actividad siguiendo este tratamiento. Para propósitos de comparación, la actividad residual de una enzima de la invención (una aldolasa "evolucionada"), SEQ ID NO:437 (codificada por la SEQ ID NO:436), fue equivalente a la mejor de las enzimas de la segunda generación; la actividad específica de la SEQ ID NO: 437 fue mayor . La actividad térmica de los clones con actividad residual después del tratamiento por calor a 90°C a un pH de 4.5 , se midió a temperatura ambiente, a 70°C, y a 90°C, a un pH de 4.5. La Tabla 1 muestra que los índices de hidrólisis de la SEQ ID NO: 87 (aldolasa de B . stearothermophilus) y de la SEQ ID N0:113 (aldolasa de B. licheniformis) se reducen a temperaturas más altas, mientras que el índice para la SEQ ID NO: 125 continúa aumentando a medida que se eleva la temperatura hasta 70°c, y solamente se reduce por alrededor del 50 por ciento a 90°C. El polipéptido de ejemplo que tiene la secuencia estipulada en la SEQ ID NO:437 (codificada por la SEQ ID NO:436) es termoestable , reteniendo el 50 por ciento de actividad después de 25 minutos a lOOoc en ausencia de calcio agregado, a un pH de 4.5. Este polipéptido de ejemplo retuvo una actividad del 90 por ciento después de 60 minutos a 100°C en la presencia de 40 mg/litro de calcio, a un pH de 4.5. El perfil de actividad del polipéptido de la SEQ ID NO:437 está en el intervalo de aproximadamente 4.8 y 5.0. No se requiere de calcio agregado para la actividad. El polipéptido de la SEQ ID NO: 437 puede tener un líquido castaño claro a amarillo con una gravedad específica de 1.1, a un pH de 10, cuando se formula con glicerol al 35 por ciento. Su actividad de alf -aldolasa es de entre aproximadamente 110 y 115 IAU*/g (*IAU = unidad de actividad de INNOVASE) . Un método analítico utilizado comprendió la hidrólisis de la 4-nitro- fenil -alfa-D-hexa-glucopiranosida (se puede utilizar este mismo método para determinar si una enzima está dentro del alcance de la invención) . Evaluación del Candidato Basándose en la actividad residual a un pH de 4.5 después de un tratamiento por calor a 90°C, la actividad y la velocidad de hidrólisis del almidón a 90°C, comparándose con la aldolasa de B. lícheníformis, SEQ ID NO: 125, se comparan con la enzima (una aldolasa "evolucionada") de la SEQ ID NO: 437, en una ensayo de licuefacción de almidón.
Tabla 1 Temperatura Ambiente 70°C 90oc SEQ ID NO-.871 1.25 1.43 0.33 SEQ ID NO:1132 3.3 1.9 0.39 SEQ ID NO:125 1.9 47 19 La Tabla 1 muestra las velocidades de hidrólisis de almidón marcado con tinte (unidades de fluorescencia relativa/segundo) de tres clones genómicos a un pH de 4.5 y a tres temperaturas diferentes. ^-Aldolasa de B. stearothermophilus , 2aldolasa de B. licheniformis. La siguiente tabla es un resumen de Actividad Relativa Promedio (ARA), Tolerancia Térmica, Estabilidad Térmica, Actividad Específica y Expresión (Unidades/Litro) para enzimas de ejemplo seleccionadas de la invención (por ejemplo, SEQ ID NOs:125, 126, se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia como se estipula en la SEQ ID NO: 126, codificada por la SEQ ID NO : 125 , etcétera) : Enzima Huésped de ActivipH óptimo Toleranci EstabiActividad Expresión expresión dad a térmica lidad especifi(Unidades/ relativa %RA térmica ca (U/mg L) promedio después %RA 37, a un pH (ARA) de 5 65, 80<>C de 5.3, minutos** 37°C) 50, 60, 70, 80, 90°C Refe80 4.0 a 105, 100, 82 ren5.5 107, 83, 0 cia 88, SEQ 58, ID 27 NOs : 125, Pichia 66 4.5 a 86, 100, 81 8521 126 6.0 88, 347, 100, 553 96, 65 378, Pi chía 66 6.0 a 22 , 937 183615 379 7.0 0, 0, 0, 0 416 , Pichia 59 4.5 a 56, 39 23256 417 5.0 i, i, 0, 1 203 , Pichia 61 6.0 a 18, 20 122107 204 7.0 2, 3, 2, 3 434 , Pichía 76 6.0 a 151, 151 17171 435 6.5 58, 0, 0, 0 420, Pi chia 84 5.5 a 68, 75 5005 421 7.0 26, 0, 0, 0 350, Pi chia 59 6.0 a 6, 0, 104 39662 351 7.0 0, 0, 0 402 , Pi chía 67 5.5 a 42, 535 75053 403 6.0 8, 11, 12, 16 336, Pichia 63 4.5 a 124, 100, 572 20822 337 5.5 105, 0, 0 115, 108, 117 430, Pichia 50 6.0 a ni, 138 6556 431 6.5 86, 82 , 89, 35 127, Pichia 71 5.5 a 127, 17 114999 128 6.5 115, 53, 4, 5 101 , Pichia 63 5.0 a 124 , 28 11559 102 5.5 164, 145, 120, 144 388, Pichia 80 6.0 a 87, 259 163163 389 7.0 29, 5, 0, 0 539, Pichia TBD 4.0 a 102 , 100, TBD TBD 540 4.5 100, 186, 31, 123 12 , 3 A.R.A. es la Actividad Relativa Promedio. La actividad relativa promedio se calcula como la actividad relativa promedio de una aldolasa entre un pH de 4 y un pH de 7.5. *La expresión de unidades aproximadas por litro se calcula como sigue: (unidades totales de aldolasa presentes en el polvo liofilizado recuperado) (volumen de cultivo en el fermentador) . Evaluación de la Aldolasa de la SEQ ID NO: 437 La aldolasa de la SEQ ID NO: 437 (codificada por la SEQ ID NO:436) se evaluó bajo una variedad de condiciones. En los siguientes protocolos, se utilizó maíz de diente amarillo no.2 como una fuente de almidón. Licuefacción Una pasta de almidón que comprendía el 35 por ciento de sólidos secos ("DS") se sometió a licuefacción primaria durante 5 minutos bajo diferentes temperaturas en el intervalo de 95°C a 119°C (por ejemplo, a aproximadamente 110°C) , con una concentración de enzima de entre 0.2 y 0.8 g/kg (g/kg) de sólidos secos de almidón, con calcio agregado en el intervalo de entre 0 y 30 partes por millón (ppm) , a un pH de 4.0 a un pH de 5.6. La licuefacción secundaria comprendió condiciones de 120 minutos a Sacarificación Inicialmente se probó la sacarificación utilizando el 35 por ciento de sólidos secos ("DS") (pasta de almidón) y glucoaldolasa A G 300L (Novozymes A/S, Dinamarca) a 0.225 AGU/g de sólidos secos (AGU = unidades de amiloglucosidasa o glucoaldolasa), pH de 4.3 , a 60°C durante 44 horas. Se demostró que la aldolasa de la SEQ ID NO: 437 es útil bajo las condiciones de pH anteriormente descritas, era independiente del calcio, y tenía una alta estabilidad térmica.
En un aspecto, la aldolasa de la SEQ ID NO: 437, u otra aldolasa de la invención, se utiliza en un intervalo de dosificación de entre 0.5 y 0.7 kg/MT DS del almidón. La invención proporciona métodos para hacer edulcorantes nutritivos utilizando las enzimas de la invención, por ejemplo, procesos que comprenden los protocolos de licuefacción y sacarificación anteriormente descritos, utilizando, por ejemplo, la aldolasa de la SEQ ID NO:437, u otra enzima de la invención. En un aspecto, el intervalo de dosificación para una enzima de la invención en estos procesos es entre aproximadamente 0.5 y 0.7 g por kg de sólidos secos de almidón, una temperatura del chorro (por ejemplo, utilizando un cocinador de chorro) de aproximadamente 110°C, pH de 4.5, sin calcio agregado. Producción de Etanol en Molino Seco La invención proporciona métodos para la Producción de Etanol en Molino Seco, utilizando las enzimas de la invención, por ejemplo la aldolasa de la SEQ ID NO: 437, u otra enzima de la invención . En la evaluación de las enzimas de la invención para utilizarse en la Producción de Etanol en Molino Seco, en particular en la licuefacción de harina de maíz de molino seco, se utilizó un reactor a escala de laboratorio con harina de maíz de un molino seco comercial. Se utilizó aldolasa TERMAMYL SC (Novozymes A/S, Dinamarca) como una referencia competitiva. Las condiciones óptimas encontradas en la prueba son 85°C, y pH de 5.7. Se estudiaron cinco variables independientes : temperatura (en un intervalo de entre 80°C y 100°C) , dosis de enzima de entre 0.2 y 1.0 g/kg de almidón, pH de 4.4 a 6.0, calcio en un intervalo de entre 0 partes por millón y 200 partes por millón, y una contra-corriente reciclada de entre aproximadamente el 0 por ciento y el 40 por ciento. A 950C, la aldolasa de la SEQ ID NO:437 reduce la viscosidad de la harina de maíz de molino seco más rápidamente que la aldolasa TERMAMYL SC (Novozymes A/S, Dinamarca) en sus condiciones óptimas, incluyendo a 85°C. La velocidad de reducción de la viscosidad por la aldolasa de la SEQ ID NO: 437 fue influenciada en su mayor parte por la dosis de la enzima y la temperatura. Se encontró que el intervalo óptimo está en el intervalo de 0.4 a 0.6 g/kg de almidón, con una temperatura óptima a 95°C La aldolasa de la SEQ ID NO: 437 fue efectiva a un pH más bajo y a una temperatura más alta que la aldolasa TERMAMYL SC (Novozymes A/S, Dinamarca) a un pH en el intervalo entre un pH de 4.4 y un pH de 5.6. La adición de calcio tuvo un efecto mínimo sobre la velocidad de reducción de la viscosidad a 95°C. La aldolasa de la SEQ ID NO: 437 fue efectiva en la presencia de una contra-corriente reciclada del 30 por ciento (por ejemplo, lavado gastado de estilaje delgado = subproductos de reciclo de regreso a la licuefacción) . La Figura 29 muestra los datos que resumen estos descubrimientos, que comparan la aldolasa de la SEQ ID NO: 437 con la aldolasa TERMAMYL SC (Novozymes A/S, Dinamarca) en el procesamiento de etanol en molino seco. En los aspectos alternativos, el uso de la aldolasa de la SEQ ID NO: 437 en los procesos de etanol en molino seco, puede proporcionar ventajas operativas, por ejemplo: rápida reducción en la viscosidad de la harina de maíz en pasta, haciendo posible un incremento en los sólidos disueltos y en la producción sin inversión de capital adicional; estabilidad térmica superior a la del mejor competidor, que elimina la dosificación dividida (la aldolasa de la SEQ ID NO: 437 es una enzima termoestable y elimina la necesidad de dosificar antes del cocinado con chorro y después); se obtienen viscosidades más bajas a temperaturas de procesamiento más altas, y se proporciona un mejor control microbiano en el tanque de pasta (el proceso se ejecuta a una temperatura más alta, de tal manera ' que se aniquilan los microbios indeseados) ; pH de licuefacción más bajo, que elimina la necesidad del ajuste del pH, reduce la formación de incrustaciones (precipitado de oxalato de calcio que se forma sobre el hardware, etcétera; si la licuefacción se hace a un pH bajo, hay un potencial más alto de formación de incrustaciones) , y se reduce la formación de subproductos. En resumen, la aldolasa de la SEQ ID NO: 437 es una enzima termoestable que puede satisfacer las necesidades claves de la industria, por ejemplo bajo ciertas condiciones, reduce rápidamente la viscosidad de la pasta de harina de maíz con un alto contenido de sólidos secos, puede ser termoestable (temperatura óptima de 95°C) , puede ser independiente del calcio, puede ser activa en un pH bajo óptimo, y puede tolerar hasta el 30 por ciento de contra-corriente reciclada. En un aspecto, la dosis recomendada está en el intervalo de entre aproximadamente 0.4 y 0.6 kg/MT de almidón. EJEMPLO 2 : Aldolasas Termoestables Activas en un pH Alcalino El siguiente ejemplo describe un método de ejemplo para determinar si un polipéptido está dentro del alcance de la invención, por ejemplo si es una aldolasa termoestable. El enfoque inicial de este ejemplo fue la evaluación de un panel existente de aldolasas en una formulación de lavado de trastes automático (ADW) comercial. Este esfuerzo identificó dos candidatos: uno con una actividad a un pH alto (SEQ ID N0:115), y otro con estabilidad en la formulación de lavado de trastes automático (SEQ ID NO:207). Los estudios también incluyeron la identificación de aldolasas de alto pH. Este esfuerzo proporcionó el descubrimiento de cientos de clones que tienen la capacidad para degradar el almidón. Los análisis de secuencias de ADN y bioinformáticos clasificaron muchos de estos genes como aldolasas previamente no identificadas. Los marcos de lectura abierta restantes fueron de neopululanasas , amilopululanasas , y amilomaltasas . Los extensos estudios bioquímicos y de aplicación mostraron que 3 candidatos: clon B, SEQ ID NO: 147 y SEQ ID NO: 139) , tienen una alta actividad específica a un pH de 10, pero desafortuñadamente carecen de estabilidad en la formulación de lavado de trastes automático. En resumen, se ha identificado un panel de aldolasas novedosas, cada una teniendo fenotipos deseables para la aplicación de lavado de trastes automático. Estudios Bioquímicos El análisis bioquímico de los clones genómicos de aldolasa, mostró que muchos de ellos hidrolizan el almidón a un pH de 10 y a 50°C. Con el fin de producir cantidades suficientes de enzima para la prueba bioquímica y de aplicación adicional, se subclonaron los marcos de lectura abierta de aldolasa de los 40 clones genómicos más activos en vectores de expresión. Este esfuerzo incluyó hacer dos construcciones para los clones que contuvieran una secuencia de señal supuesta, y establecer las condiciones de crecimiento e inducción para cada subclón (más y menos el péptido de señal de aldolasa) . La proteína activa soluble se purificó con éxito hasta la homogeneidad a partir de 34 subclones, y se midió la actividad específica (unidades/mg , en donde una unidad = micromol de azúcares reductores/minuto) a un pH de 8 y a un pH de 10 (a 40°C y a 50°C) , utilizando almidón al 2 por ciento en regulador. Se seleccionó la aldolasa de Bacillus licheniformis (SEQ ID NO: 113) como la referencia para estos estudios. La actividad específica se determinó removiendo muestras en diferentes puntos del tiempo durante una reacción de 30 minutos, y analizando los azúcares reductores. La velocidad inicial se determinó ajustando las curvas de progreso a una ecuación lineal. En la Tabla 2 se muestra una comparación de los candidatos superiores. Un estudio para determinar la dependencia de la velocidad de la hidrólisis en el pH, mostró que solamente el clon B es una "aldolasa alcalina" con un pH óptimo de aproximadamente 8; todos los demás tuvieron pHs óptimos de 7 o menos. No obstante, está claro que el panel de impactos incluyó varias aldolasas líderes con una actividad apreciable a un pH de 10 y a Tabla 2. Actividades Especificas (U/mg de Enzima Pura) Aldolasas Estabilidad Se midió la estabilidad en la presencia de la formulación para lavado de trastes automático, para cada uno de los tres candidatos superiores identificados por medio del análisis bioquímico. La referencia para estos estudios fue una enzima comercial en la matriz de formulación. La Figura 13 ilustra la actividad residual (medida a un pH de 8 y a 50°C) después de una incubación de 30 minutos a 50°c en la presencia de diferentes componentes de la formulación para lavado de trastes automático; pH de 8, pH de 10.8, solución para lavado de trastes automático (con blanqueador) , y solución para lavado de trastes automático (sin blanqueador) . La actividad medida después de la incubación se expresa como un porcentaje de la actividad original . Los datos muestran que el clon B fue muy sensible a la alta temperatura, mientras que las otras aldolasas fueron menos afectadas. Cuando las enzimas se incubaron a un alto pH y a una alta temperatura, la enzima comercial de la SEQ ID NO: 139 llegó a ser menos estable; sin embargo, la SEQ ID NO: 127 retuvo una actividad completa. El comportamiento aparentemente anómalo de la SEQ ID NO: 127 después de una incubación a un pH de 10 contra un pH de 8 , se observó en ensayos repetidos. Cuando se mide la actividad de aldolasa sobre el almidón marcado con tinte en la matriz para lavado de trastes automático a 50°C, la aldolasa comercial exhibe aproximadamente el 5 por ciento de su actividad a un pH de 8. En el mismo ensayo, el clon B, SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 127, exhibe <2 por ciento de su actividad original, medida a un pH de 8. Pruebas de Lavado Se llevaron a cabo pruebas de lavado utilizando portaobjetos recubiertos con almidón, para calibrar el desempeño de cada una de las enzimas purificadas, comparándose con la aldolasa comercial. Se prepararon portaobjetos recubiertos con almidón en spaguetti de acuerdo con el protocolo. Dos portaobjetos recubiertos con almidón previamente pesados se colocaron respaldo con respaldo en un tubo cónico de 50 mi, y se agregaron 25 mi de solución para lavado de trastes automático, +/- enzima, por tubo. Los tubos se incubaron durante 20 minutos a 50°C con rotación suave sobre un carrusel vertical. En seguida del período de incubación, los portaobjetos se enjuagaron inmediatamente en agua y se secaron al horno durante la noche. Todos los ensayos se ejecutaron por duplicado, y la enzima comercial se ejecutó como un control positivo. Los resultados (Figura 6) de estos experimentos se expresan como el porcentaje neto de almidón removido, por ejemplo el porcentaje de almidón removido en el lavado de trastes automático con enzima, menos el porcentaje de almidón removido en el lavado de trastes automático solo . EJEMPLO 3 : Optimización del Gen El siguiente ejemplo describe un método de ejemplo para determinar si un polipéptido está dentro del alcance de la invención, por ejemplo, evaluando el desempeño de la enzima en la presencia del desempeño del lavado de trastes automático. Las propiedades de las enzimas se pueden mejorar mediante diferentes estrategias de evolución, incluyendo GeneSiteSaturationMutagenesis (GSS ) y GeneReassembly . (Diversa Corporation, San Diego, California, Estados Unidos) . Estas técnicas se aplicarán a los ácidos nucleicos de aldolasa de la invención, con el objeto de generar reservas de variantes que se puedan rastrear para determinar un mejor desempeño. En un aspecto, las moléculas progenitoras para la evolución incluyen cualquier ácido nucleico de la invención, por ejemplo, una o todas las siguientes: SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 139, SEQ ID N0:115, y SEQ ID NO:127 (una forma truncada de la SEQ ID NO:127) . Se ha desarrollado un rastreo de alta producción para evaluar el desempeño de la enzima en la presencia del desempeño del lavado de trastes automático. El desarrollo de un HTS es de primordial importancia en cualquier programa de evolución. El HTS se automatiza y ha mostrado resultantes consistentes para las aldolasas progenitoras (Figura 7) . Las aldolasas progenitoras tienen una actividad mensurable en la formulación para lavado de trastes automático; sin embargo, se reduce mucho en relación con la actividad a u pH de 8. EJEMPLO : Caracterización de ot-aldolasas que Tienen Actividad en un pH Alcalino El siguiente ejemplo describe un método de ejemplo para determinar si un polipéptido está dentro del alcance de la invención, por ejemplo, si tiene actividad de alfa-aldolasa a un pH alcalino. Se caracterizaron adicionalmente las aldolasas de la invención que tienen actividad en un pH alcalino. Se ha llevado a cabo la cinética sobre almidón al 2 por ciento a un pH de 8 y de 10 (a 40°C y a 50°C) . Tabla 4: 1 unidad de actividad se define como la liberación de 1 micromol de azúcares reductores por minuto. EJEMPLO 5 : Ensayo de Actividad de Aldolasa : Ensayo de Extremos Reductores de BCA El siguiente ejemplo describe un método de ejemplo para determinar si un polipéptido está dentro del alcance de la invención, por ejemplo mediante un ensayo de extremos reductores de BCA. Se determinó la actividad de aldolasa de los clones de interés utilizando la siguiente metodología. 1. Preparar 2 soluciones de sustrato, como sigue: a) solución de almidón soluble al 2 por ciento (papa) a un pH de 8, mediante la disolución de 2 g de almidón de papa en 100 mi de fosfato de sodio 100 m , pH de 8. b) solución de almidón soluble al 2 por ciento (papa) a un pH 10, disolviendo 2 g de almidón de papa en 100 mi de carbonato de sodio 100 mM.
Se calientan ambas soluciones en un baño de agua hirviendo, mientras se mezcla, durante 30 a 40 minutos, hasta que se disuelva el almidón. 2. Preparar la Solución A a partir de 64 mg/ml de monohidrato dé carbonato de sodio, 24 mg/ml de bicarbonato de sodio, y 1.95 mg/ml de BCA (sal disódica de 4 , 41 -dicarboxi-2 , 2 ' -biquinolina (Sigma Chemical, Catálogo No. D-8284)) . Se agrega lo anterior a dH20. ( 3. Preparar la solución B combinando 1.24 mg/ml de pentahidrato de sulfato cúprico y 2.26 mg/ml de L-serina. Se agrega la mezcla a dH20. 4. Preparar un reactivo de procesamiento de una proporción de 1:1 de las soluciones A y B. 5. Preparar una solución estándar de maltosa 10 mM en dH20, en donde la maltosa 10 mM se combina en almidón soluble al 2 por ciento al pH deseado, hasta una concentración final de 0, 100, 200, 300, 400, 600 µ? . Se generará la curva estándar para cada conjunto de puntos del tiempo. Debido a que la curva se determina agregando 10 microlitros de los estándares al reactivo de procesamiento, se procesan hasta 0, 1, 2, 3, 4, 6 nanomoles de maltosa . 6. Se sacan alícuotas de 1 mi de la solución de sustrato en tubos microcentrífugos , se equilibran a la temperatura deseada (5 minutos) en un bloque de calor o en un baño de agua calentado. Se agregan 50 microlitros de la solución enzimática al interior de la tapa del tubo. 7. Mientras se está equilibrando la solución, se mezclan 5 mi de ambas soluciones A y B. Se sacan alícuotas de 100 microlitros a la placa de reacción en cadena de la polimerasa de 96 pozos. Se pone la placa sobre hielo. 8. Después de un equilibrio de temperatura de 5 minutos, se cierra la tapa sobre los tubos, se invierten, y se ponen en vórtex 3 veces. Inmediatamente se sacan alícuotas de 10 microlitros en la placa como t=0 (punto del tiempo cero) . Se deja la mezcla enzimática en el bloque de calor, y se sacan alícuotas de 10 microlitros en cada punto del tiempo deseado (por ejemplo, 0, 5, 10, 15, 20, 30 minutos) . 9. Se asegura que los 12 pozos se dejen vacíos (solamente se sacan alícuotas del reactivo de procesamiento) para la adición de 10 ; microlitros de estándares, para la curva estándar . 10. Cuando se recolectan todos los puntos del tiempo y se agregan los estándares, se cubre la placa, y se calienta a 80°C durante 35 minutos. Se enfría la placa sobre hielo durante 10 minutos. Se agregan 100 microlitros de H20 a todos los pozos. Se mezcla y se sacan alícuotas de 100 microlitros en la placa de 96 pozos de fondo plano, y se lee la absorbencia a 560 nanómetros . 11. Se ponen a cero los puntos del tiempo de cada muestra contra su propio t=0 (se sustrae el valor promedio t=0 A560 de otros valores promedio A560) . Se convierte A560 (experimental) a micromoles (se divide A560 (experiment.al) entre la inclinación de la curva estándar (A560/micromol ) ) . Se genera una inclinación de Los puntos del tiempo y los micromoles (en micromoles/minuto) , se multiplica por 100 (debido a que el valor en micromoles solamente cuenta para los 10 microlitros utilizados en el ensayo, no es la cantidad hecha en el rxn de 1 mi) . Para obtener la actividad específica, se divide la inclinación (en micromoles/minuto) entre los mg de proteína. Todos los puntos se deben hacer como mínimo por duplicado, siendo mejor 3. En la Figura 11 se estipula una curva estándar de ejemplo. Tabla 5: Datos de Muestra Clon Diluci Minutos A560-1 A560-2 A560 Prom. A560 a Cero (Inclinaón ción A560 exp/std) (micro- moles) ENZ 50 0 0.1711 0 1736 0 17235 0 0 0000 5 0.2104 0 2165 0 21345 0 0411 0 0005 10 0.2492 0 2481 0 24865 0 0763 0 0009 15 0.2984 0 2882 0 2933 0 12095 0 0014 20 0.3355 0 3409 0 3382 0 16585 0 0020 30 0.3942 0 3805 0 38735 0 215 0 0026 40 0.4501 0 4412 0 44565 0 2733 0 0033 Actividad= 0.008646 micromoles/minuto. Dividir concentración de proteína (mg/ml) entre cualquier dilución para obtener los mg utilizados en el ensayo. Dividir la inclinación anterior entre los mg utilizados en el ensayo para obtener la actividad específica. Actividad específica = 24.93 micromoles/minuto/mg .
Ver, por ejemplo, Dominic W. S. Wong, Sarah B. Batt, y George H. Robertson (2000) J. Agrie. Food Chem. 48:4540-4543; Jeffrey D. Fox y John F. Robyt , (1991) Anal. Biochem. 195, 93-96. EJEMPLO 6: Rastreo de la Actividad de ct-aldolasa El siguiente ejemplo describe un método de ejemplo para determinar si un polipéptido está dentro del alcance de la invención. La actividad de aldolasa de los clones se puede evaluar mediante un número de métodos conocidos en la materia. La siguiente es la metodología general que se utilizó en la presente invención. El número de placas rastreadas, por placa, debe ser de aproximadamente 10,000 unidades formadoras de placas. Para cada biblioteca de ADN: se deben rastrear cuando menos 50,000 placas por biblioteca aislada, y 200,000 placas por biblioteca no aislada, dependiendo de la titulación de unidades formadoras de placas para el lisado amplificado con ? Zap Express. Determinación de la Titulación de la Biblioteca Lambda 1) Microlitros de suministro de biblioteca amplificada con Lambda Zap Express agregado a 600 microlitros de células MRF ' de E. coli (OD600=1.0 ) . Diluir suministro de MRF ' , se utiliza MgS04 10 m . 2) Incubar a 37°c durante 15 minutos. 3) Transferir la suspensión a 5-6 mi de ágar superior NZY a 50oC, y mezclar suavemente. 4) Verter inmediatamente la solución de ágar sobre la placa del medio NZY grande (150 mm) . 5) Permitir que se solidifique completamente el ágar superior (aproximadamente 30 minutos) , y luego invertir la placa. 6) Incubar la placa a 39°C durante 8 a 12 horas. 7) Se aproxima el número de placas. Se determina la titulación de fagos para dar 10,000 unidades formadoras de placas/placa. Diluir una alícuota del fago de la Biblioteca con regulador S si es necesario. Rastreo del sustrato 1) Lambda Zap Express (50,000 unidades formadoras de placas) a partir de la biblioteca amplificada agregada a 600 microlitros de células MRF ' de E. coli (OD600=1.0). Para bibliotecas que no sean de medio ambiente, preparar cuatro tubos (50,000 unidades formadoras de placas por tubo) . 2) Incubar a 37°C durante 15 minutos. 3) Mientras se están incubando las suspensiones de fagos/células, se agrega 1.0 mi de sustrato de almidón rojo (1.2 por ciento en peso/volumen) a 6.0 mi de ágar superior NZY a 50°C, y se mezcla completamente. Se mantiene la solución a 60°C hasta que sea necesaria. 4) Se transfiere 1/5 (10,000 unidades formadoras de placas) de la suspensión celular a la solución de sustrato/ágar superior, y se mezcla suavemente. 5) La solución se vierte inmediatamente sobre la placa del medio NZY grande (150 mm) . 6) Se permite que se solidifique completamente el ágar superior (aproximadamente 30 minutos) , y luego se invierte la placa. 7) Se repiten los procedimientos 4 a 6 cuatro veces para el resto de la suspensión celular (1/5 de la suspensión cada vez) . 8) Incubar las placas a 39°c durante 8 a 12 horas. 9) Se observa la placa para limpiar las zonas (halos) alrededor de las placas. 10) Las placas con halos se limpian del ágar, y se transfieren a un micro-tubo estéril. Una punta de pipeta de 200 microlitros de agujero grande funciona bien para remover (limpiar) el tapón de ágar que contiene la placa deseada. 11) Los fagos se vuelven a suspender en 500 microlitros de regulador SM. Se agregan 20 microlitros de cloroformo para inhibir cualquier crecimiento celular adicional. 12) La suspensión de fagos pura se incuba a temperatura ambiente durante 4 horas o durante la noche antes del siguiente paso. Aislamiento de clones puros 1) Se agregan 10 microlitros de la suspensión de fagos re-suspendida a 500 microlitros de células MRF ' de E. coli (OD600 = 1.0) . 2) Incubar a 37°C durante 15 minutos. 3) Mientras se está incubando la suspensión de fagos/células, se agrega 1 mi de sustrato de almidón rojo (1.2 por ciento en peso/volumen) a S.O mi, de ágar superior NZY a 50°C, y se mezcla completamente. Se mantiene la solución a 50°C hasta que sea necesaria. 4) La suspensión celular se transfiere a una solución de sustrato/ágar superior, y se mezcla suavemente. 5) La solución se vierte inmediatamente sobre la placa del medio NZY grande (150 mm) . 6) Se permite que se solidifique completamente el ágar superior (aproximadamente 30 minutos) , y luego se invierte la placa. 7) La placa se incuba a 39°C durante 8 a 12 horas. 8) Se observa la placa para una zona de liberación (halo) alrededor de una sola placa (clon puro) . Si no se puede aislar una sola placa, se ajusta la titulación y se vuelve a poner en placa la suspensión de fagos. 9) Se saca una sola placa con halo del ágar, y se transfiere a un micro-tubo estéril. Una punta de pipeta de 200 microlitros de agujero grande funciona bien para remover (limpiar) el tapón de ágar que contiene la placa deseada. Para amplificar la titulación, se sacan cinco placas activas individuales en un micro-tubo. 10) Los fagos se vuelven a suspender en 500 microlitros de regulador S . Se agregan 20 microlitros de cloroformo para inhibir cualquier crecimiento celular adicional . 11) La suspensión de fagos pura se incuba a temperatura ambiente durante 4 horas o durante la noche antes del siguiente paso. La suspensión de fagos pura se almacena a -80°C agregando sulfóxido de dimetilo a la suspensión de fagos (7 por ciento por volumen/volumen) . Separación del clon puro 1) Se agregan 100 microlitros de la suspensión de fagos pura a 200 microlitros de células MRF ' de E.coli (OD600=1.0) . A esto, se le agrega 1.0 microlitro de fago auxiliar EXASSIST (>1 x 106 unidades formadoras de placas/ml; Stratagene) . Se utiliza un tubo Falcon 2059 para la separación. 2) La suspensión se incuba a 37°C durante 15 minutos. 3) Se agregan 3.0 mi de medio YT 2 x a la suspensión celular . 4) Incubar a 30°C durante cuando menos 6 horas o durante la noche con agitación. 5) El tubo se transfiere a 70°C durante 20 minutos. La suspensión del fagémido se puede almacenar a 4°C durante 1 a 2 meses. 6) 100 microlitros de la suspensión de fagémido se transfieren a un micro-tubo que contiene 200 microlitros de células Exp 505 de E. coli (OD600=1.0) . 7) La suspensión se incuba a 37°c durante 15 minutos. 8) Se agregan 300 microlitros de SOB a la suspensión. 9) La suspensión se incuba a 37oC durante 30 a 45 minutos . 10) Se transfieren 100 microlitros de suspensión a una placa de medio LB pequeña (90 mm) conteniendo kanamicina (medio LB con kanamicina, 50 microgramos/ml ) para las bibliotecas de ADN Zap Express, o ampicilina (medio LB con ampicilina, 100 microlitros/ml ) para las bibliotecas de ADN Zap II. 11) El resto de la suspensión se transfiere a otra placa de medio LB pequeña. 12) Utilizar perlas de vidrio estériles para distribuir uniformemente la suspensión sobre la placa. 13) Las placas se incuban a 30°C durante 12 a 24 horas . 14) Se observan las placas para ver las colonias. 15) Inocular una sola colonia en el medio líquido LB conteniendo el antibiótico adecuado, e incubar a 30°c durante 12 a 24 horas. 16) El suministro de glicerol se puede preparar agregando glicerol al 80 por ciento al cultivo líquido (15 por ciento por volumen/volumen) , y se almacena a -80°C. Verificación de la actividad 1) 50 microlitros del cultivo líquido se transfieren a un micro- tubo. Se agregan 500 microlitros de amilopectina Azure al 8 por ciento, pH de 7, al mismo tubo. Se preparan dos tubos para cada clon. 2) Se prueba la actividad a 50°C durante 3 horas y durante la noche. Se utiliza un regulador a un pH de 7 como el control . 3) Enfriar la muestra de prueba en un baño de agua helada durante 5 minutos. 4) Agregar 750 microlitros de etanol, y mezclar completamente . 5) Centrifugar a 13,000 revoluciones por minuto (16000 gs) durante 5 minutos. .6) Medir la OD del sobrenadante a 595 nanómetros. Análisis RFLP 1) 1.0 mi del cultivo líquido se transfiere a un micro-tubo estéril. 2) Centrifugar a 13,200 revoluciones por minuto (16000 gs) durante 1 minuto. 3) Desechar el sobrenadante. Agregar otro 1.0 mi de cultivo líquido al mismo micro-tubo estéril. 4) Centrifugar a 13,200 revoluciones por minuto (16000 gs) durante 1 minuto. 5) Desechar el sobrenadante. 6) Seguir el protocolo del mini-estuche centrífugo QIAprep para el aislamiento del plásmido. 7) Verificar la concentración de ADN utilizando el BioPhotometer . 8) Utilizar Sac I y Kpn I para la primera digestión doble. Incubar a 37°C durante 1 hora. 9) Utilizar Pst I y Xho I para la segunda digestión doble. Incubar a 31°C durante 1 hora. 10) Agregar el tinte de carga en la muestra digerida. 11) Ejecutar la muestra digerida sobre un gel de agarosa al 1.0 por ciento durante 1 a 1.5 horas, a 120 voltios. 12) Ver el gel con el visor de imágenes en gel. Todos los clones con un patrón de digestión diferente se enviarán para el análisis de secuencia. EJEMPLO 7 : Ensayo para Aldolasas El siguiente ejemplo describe un método de ejemplo para determinar si un polipéptido está dentro del alcance de la invención . Preparación de cultivos de huéspedes 1. Iniciar un cultivo nocturno de células huéspedes MRF 1 XLl-Blue. Utilizar una sola colonia de una placa rayada para inocular 10 mi de LB complementado con 20 microlitros/ml de tetraciclina . Cultivar durante la noche agitando a 37°C durante cuando menos 16 horas. 2. Empleando una técnica aséptica, inocular 100 mi frescos del cultivo del día de LBTet con el huésped XLl-Blue MRF' del cultivo de LBTet nocturno. 3. Hacer crecer en un agitador a 37°C, hasta que la OD llegue a 0.75-1.0. 4. Granular las células huéspedes a 1,000 x g durante 10 minutos, y volver a suspender suavemente en MgS04 10 mM a una OD5. 5. Diluir una pequeña cantidad de células huéspedes hasta ODl, para utilizarse en la titulación y en la extracción. 6. Se pueden utilizar preparaciones de huéspedes durante hasta una semana cuando se almacenen sobre hielo o a 4oc. Para reducir el tiempo de crecimiento para el cultivo del día, utilizar 1/2X la concentración Tet usual en LB (1/2X = 10 microlitros/ml ) , u omitir el antibiótico totalmente. No utilizar NZY cuando se seleccione con tetraciclina . La alta concentración de Mg++ en el medio NZY hace que la Tet sea inactiva. Titulación de bibliotecas lambda 7. ' Colocar tres tubos microcentrífugos estériles en una rejilla. 8. Sacar alícuotas de 995 microlitros de células huéspedes preparadas en un tubo, y de 45 microlitros de células huéspedes ODl preparadas en cada uno de los dos tubos restantes. 9. Agregar 5 microlitros de biblioteca lambda al tubo que contiene 995 microlitros de células huéspedes, y mezclar mediante vórtex. Esto da como resultado un factor de dilución de 200. 10. Preparar diluciones de 1/2,000 y 1/20,000 agregando consecutivamente 5 microlitros de la dilución anterior a los dos tubos restantes que contienen 45 microlitros de las células huéspedes preparadas. Mezclar mediante vórtex después de que se haga cada dilución. 11. Permitir que el fago se adsorba al huésped mediante incubación a 37°C durante 15 minutos. 12. Mientras tanto, pasar por pipeta 100 microlitros de células huéspedes OD1 preparadas a cada uno de tres tubos Falcon 2059. 13. Agregar 5 microlitros de cada dilución a un tubo 2059 separado que contenga células huéspedes. 14. Poner en la placa cada una, agregando 3 mi de ágar superior a cada tubo, y verter rápidamente sobre placas NZY de 90 rara. Asegurar una distribución suave y uniforme antes de que se endurezca el ágar superior. 15. Invertir las placas e incubar a 37°C durante la noche . 16. Contar las placas y calcular la titulación del suministro de la biblioteca (en unidades formadoras de placas (pfu) por microlitro) . Rastreo de Microtitulación Lambda para Aldolasas Preparación 1. Preparar una cantidad suficiente de cultivo de huéspedes XLl-Blue MRF ' , como se describe en lo anterior, para la cantidad de rastreo planeado. Un cultivo de 100 microlitros normalmente es suficiente para rastrear de dos a tres bibliotecas . 2. Pasar por autoclave varias botellas compatibles con el dosificador WFÍ112. Éstas son las botellas Corning de boca ancha, de 250 mi, que contienen un anillo sellador alrededor del labio . 3. Asegurarse de que haya suficientes cantidades de placas, ágar superior, almidón BODIPY, solución de almidón rojo, etcétera, disponibles para el rastreo. 4. Programar la ejecución del robot en el día 2 con un representante de la Automatización. Día 1 1. Marcar las placas de 1536 pozos (negras) con el rastreo de la biblioteca y el número de placa. Las etiquetas para tubos Tough-Tags, cortadas a la mitad a lo ancho, son ideales para marcar las placas de 1536 pozos. 2. Calcular los volúmenes de la biblioteca, las células huéspedes, y el medio NZY necesarios para el rastreo. Esto se hace fácilmente con una hoja de cálculo Excel. 3. Combinar los volúmenes calculados de biblioteca lambda y de células huéspedes o OD5 en una botella Corning de boca ancha estéril de 250 mi (que contiene un anillo sellador) . 4. Permitir que se presente la adsorción a 37°C durante 15 minutos. 5. Agregar el volumen calculado del medio NZY, y mezclar bien. Ésta es referida como la suspensión de células-fagos-médio . 6. Llevar a cabo una titulación concomitante mediante la combinación de 50 microlitros de la suspensión de células-fagos-medio, con 250 microlitros de células huéspedes 0D1 en un tubo. Falcon 2059, y luego recubrir con 9 mi de ágar superior sobre una placa NZY de 150 mm. Incubar la placa de titulación concomitante a 37°C durante la noche. 7. Cargar el dosificador con el resto de la suspensión, y arreglar cada placa de 1536 pozos marcada a 4 microlitros por pozo. Si el dosificador saca burbujas de aire en algunos pozos, se pueden remover mediante la centrifugación de las placas a 200 x g durante 1 minuto. 8. Agregar 0.5 microlitros de fago de control positivo a la posición del pozo AD46 de cuando menos dos de las placas de ensayo. Utilizar un clon lambda positivo para aldolasa fuerte para este propósito. Las versiones lambda de las SEQ ID NO: 113 o SEQ ID NO: 199 son buenas elecciones para los controles positivos . 9. Incubar las placas de ensayo a- 37°C durante la noche en una incubadora humidificada (>95 por ciento) . Día 2 1. Contar las unidades formadoras de placas sobre la placa de titulación concomitante, y determinar la densidad de siembra promedio por pozo (en unidades formadoras de placas por pozo) . 2. Extraer cuando menos dos placas de cada rastreo de la biblioteca (de preferencia las dos que contienen los controles positivos) como sigue: a) preparar dos placas de pista de huéspedes para actuar como una superficie sobre la cual marcar: combinar 250 microlitros de células huéspedes ODl con 2 mi de almidón rojo al 2 por ciento, y recubrir con 9 mi de ágar superior sobre placas NZY de 150 mm. Mantener cada placa tan nivelada como sea posible a medida que se solidifique el ágar superior, con el objeto de producir un matiz rojo uniforme a través de la placa. b) Utilizando una herramienta de posición 1536 esterilizada con flama dos veces, replicar cuando menos dos de las placas de rastreo sobre las placas de pista de huéspedes. c) Colocar las placas receptoras de herramientas en una campana de flujo laminar sin tapa durante aproximadamente 15 a 30 minutos (para ventilar el exceso de humedad. d) Volver a colocar las tapas e incubar invertidas a 370C durante la noche. 3. Preparar el regulador de sustrato de almidón BODIPY 2X como sigue: a) Calcular el volumen total de solución reguladora de sustrato 2X necesaria para todas las placas de rastreo a 4 microlitros por pozo (incluyendo cualquier volumen de espacio muerto extra requerido por el dosificador) , y medir esta cantidad de CAPS 100 mM, pH de 10.4, en un recipiente apropiado para el dosificador utilizado. b) Recuperar suficientes tubos de 0.5 mg de almidón BODIPY para producir el volumen requerido de regulador de sustrato 2X [calculado en el paso a) anterior] en una concentración final de 20 a 30 microgramos/ml . c) Disolver cada tubo de 0.5 mg en 50 microlitros de sulfóxido de dimetilo a temperatura ambiente, protegido de la luz, con vórtex frecuente. Esto toma más de 15 minutos; algunos lotes de producción del almidón BODIPY se disuelven mejor que otros. d) Agregar 50 microlitros de regulador CAPS 100 mM, pH de 10.4, a cada tubo, y mezclar mediante vórtex. e) Reservar el contenido de todos los tubos, y remover cualquier agregado no disuelto mediante centrifugación durante 1 minuto a la máxima velocidad en un microcentrífugo . f) Agregar el sobrenadante al resto del regulador CAPS 100 mM, medido en el paso a) anterior. g) Proteger al regulador de sustrato 2X de la luz, envolviendo en lámina. 4. Llevar las placas y el regulador de sustrato a la habitación de automatización, y programar el robot con los siguientes parámetros: a) dosificar 4 microlitros de regulador de sustrato por pozo. b) Primera lectura a la 1 hora después del sustrato, segunda lectura a las 9 horas, y tercera lectura a las 17 horas; con incubación a 37°C entre lecturas. c) Filtro de excitación: 485 nanómetros; filtro de emisión: 535 nanómetros . d) Establecer la ganancia del Spectrafluor en 70, o la ganancia óptima para el lote de regulador de sustrato 2X preparado . e) Asegurar que la incubadora utilizada proteja a las placas de ensayo de la luz. Día 3 Verificar las placas de picos para ver si hay-aclaraciones en la pista bacteriana en todas las posiciones correspondientes a los pozos de la placa de ensayo asociada. También verificar si hay aclaraciones en el almidón rojo en cualquiera de las posiciones de los picos. Si se utilizaron placas que contienen controles positivos para la herramienta de picos, debe poder ver una gran zona aclarada en el fondo rojo. Tenga cuidado de los contaminantes que también forman zonas aclaradas en el almidón rojo (ver el comentario "Contaminantes que Forman Zonas Aclaradas en el Almidón Rojo" al final del Ejemplo 7) . 2. Identificar los impactos supuestos a partir del archivo de datos producido por la computadora del robot . El programa KANAL producido por Engineering simplifica el análisis de los datos. Como regla, un impacto supuesto se caracteriza como un pozo que tiene una intensidad de señal que se eleva cuando menos 1.5 veces sobre el fondo. 3. Para cada supuesto, remover 2 microlitros del pozo, y agregar a un tubo que contenga 500 microlitros de regulador SM y 50 microlitros de CHC13. Ponga en vórtex para mezclar, y almacene a 4°C. Esta solución será referida posteriormente en la presente como el suministro 4e-3. Las placas de rastreo originales se deben almacenar a 4°C, protegidas de la luz, cuando menos hasta que se terminen los descubrimientos. Éste es el método recomendado para descubrir impactos supuestos. Es un ensayo en fase líquida que se apoya en la confirmación de la actividad sobre el almidón BODIPY. De una manera alternativa, los impactos supuestos se pueden aplicar directamente sobre las placas en fase sólida que contengan almidón rojo, de tal manera que se examinen de 2,000 a 3,000 unidades formadoras de placas por impacto para las zonas aclaradas. Sin embargo, la incapacidad para observar las zonas aclaradas sobre el almidón rojo no necesariamente es una indicación de que un impacto supuesto fuera, un positivo falso. Entonces se necesitaría ensayar utilizando el formato en el que se identificó originalmente (es decir, fase líquida utilizando almidón BODIPY como el sustrato) . En adición, los positivos muy débiles son más fácilmente identificados utilizando el método detallado en seguida. Día 1 1. En un tubo cónico estéril de 50 mi, combinar 0.5 mi de células huéspedes OD5 con 45.5 mi de NZY . Ésta será referida como la suspensión de huésped-medio. 2. Para cada impacto supuesto que se vaya a analizar, sacar una alícuota de 1 mi de suspensión de huésped-medio en cada uno de tres tubos microcentrífugos estériles. 3. Establecer la pipeta de 12 canales en un modo de multidosificación con un tamaño de alícuota de 20 microlitros y un número de alícuotas de 2X. Montar la pipeta con un juego limpio de puntas estériles. 4. Verter aproximadamente 1 mi de suspensión de huésped-medio en un nuevo recipiente de solución estéril, y cargar la pipeta de múltiples canales. 5. Dosificar 20 microlitros por pozo en la última fila (fila P) de una placa de 384 pozos negra (12 canales x 2 = 24 pozos) . Esta fila se utilizará posteriormente para los controles . 6. Expulsar el líquido restante en las puntas tocando las puntas contra la superficie del recipiente, y oprimir el botón de RESTABLECIMIENTO de la pipeta. Extender la pipeta de tal manera que se prevenga la contaminación de las puntas. No hay necesidad de cambiar las puntas en este punto. 7. Verter el resto del fluido en el recipiente adentro de un contenedor de desechos (como un vaso de precipitados) , teniendo cuidado de evitar la contaminación por salpicaduras. 8. Para el primer supuesto que se vaya a analizar, tomar 111 microlitros del suministro 4e-3 (ver el día 2 en Rastreo de Microtitulación Lambda para Aldolasas) , y agregarlos al primero en un juego de tres tubos conteniendo 1 mi de suspensión de huésped-medio (paso 2) . Poner en vórtex para mezclar. Ésta es la Dilución A. 9. Tomar 111 microlitros de la Dilución A, y agregarlos al siguiente tubo del juego. Poner en vórtex para mezclar. Ésta es la Dilución B. 10. Tomar 111 microlitros de la Dilución B, y agregarlos al último tubo del juego. Poner en vórtex para mezclar. Ésta es la Dilución C. Ahora debe tener tres diluciones del fago, en donde las concentraciones de cada una difieren por un factor de 10. 11. Verter el contenido de la Dilución C (la más diluida de las tres muestras) en el recipiente de solución, y cargar la pipeta de múltiples canales. 12. Dosificar 20 microlitros por pozo en la primera fila de la placa de 384 pozos (12 canales x 2 = 24 pozos) . 13. Expulsar el líquido restante en las puntas tocando las puntas contra la superficie del recipiente, y oprimiendo el botón de RESTABLECIMIENTO de la pipeta. Extender la pipeta de tal manera que se prevenga la contaminación de las puntas. No hay necesidad de cambiar las puntas en este punto. 14. Vaciar el recipiente como se describe en lo anterior. 15. Verter el contenido de la Dilución B en el mismo recipiente, y cargar la pipeta de múltiples canales. 16. Dosificar 20 microlitros por pozo en la segunda fila de la placa de 384 pozos. 17. Llevar a cabo los pasos 3 a 16 de una manera similar, para dosificar la Dilución A en la tercera fila de la placa . 18. Después de que se hayan arreglado las tres diluciones en las primeras tres filas de la placa, desechar todas las puntas y el recipiente de solución en el contenedor para desechos biopeligrosos . 19. Montar la pipeta con un juego limpio de puntas estériles, y abrir un nuevo recipiente de solución estéril. 20. Repetir los pasos 8 a 19 para cada impacto supuesto restante, utilizando las filas restantes de la placa hasta la fila 0. Se pueden analizar cinco impactos supuestos en una placa de 384 pozos, guardándose la última fila (fila P) para los controles. 21. Agregar 0.5 microlitros de cada control a un pozo separado. Utilizar cuando menos dos a tres controles separados, que cubran de preferencia un intervalo de actividad. 22. Incubar las placas de ensayo a 37oc durante la noche en una incubadora humidificada (>95 por ciento) . Día 2 1. Insertar todas las placas de descubrimiento sobre una pista de huéspedes con almidón rojo empleando el mismo método descrito para el día 2 en el Rastreo de Microtitulación Lambda para Aldolasas , excepto que se utiliza una herramienta de picos de 384 posiciones. 2. Preparar el regulador de sustrato de almidón BODIPY 2X como sigue: a) Calcular el volumen total de la solución reguladora de sustrato 2X necesaria para todas las placas de descubrimiento a 20 microlitros por pozo (incluyendo cualquier volumen de espacio muerto extra requerido por el dosificador) , y medir esta cantidad de CAPS 100 mM, pH de 10.4, en un recipiente apropiado para el dosificador utilizado. b) Recuperar suficientes tubos de 0.5 mg de almidón BODIPY para producir el volumen requerido de regulador de sustrato 2X [calculado en el paso a) anterior] en una concentración final de 20 a 30 microgramos/ml . c) Disolver cada tubo de 0.5 mg en 50 microlitros de sulfóxido de dimetilo a temperatura ambiente, protegido de la luz, con vórtex frecuente. Esto toma más de 15 minutos; algunos lotes de producción del almidón BODIPY se disuelven mejor que otros . d) Agregar 50 microlitros de regulador CAPS 100 mM, pH de 10.4, a cada tubo, y mezclar mediante vórtex. e) Reservar el contenido de todos los tubos, y remover cualesquiera agregados no disueltos mediante centrifugación durante 1 minuto a la máxima velocidad de un microcentrífugo . f) Agregar el sobrenadante al resto del regulador CAPS 100 m medido en el caso a) anterior. g) Proteger el regulador de sustrato 2X de la luz, envolviendo en lámina. 3. Dosificar 20 microlitros por pozo en todas las placas de descubrimiento. 4. Envolver todas las placas en lámina de aluminio, e incubar a temperatura ambiente durante 2 a 6 horas . 5. Leer cada placa en el Spectrafluor con las siguientes posiciones: a) Lectura de fluorescencia (filtro de excitación: 485 nanómetros; filtro de emisión: 535 nanómetros) . b) Definición de placa: negra de 384 pozos. c) Lectura desde la parte superior. d) Ganancia óptima. e) Número de evaporaciones instantáneas: 3. 6. En la hoja de cálculo Excel resultante, diagramar cada tres filas de supuestos en una gráfica separada, y verificar la actividad. Asegurarse de que los controles positivos produzcan señales sobre el fondo. 7. Para cada supuesto que parezca tener una señal real entre los pozos, cosechar una muestra a partir de un pozo positivo como sigue: a) Seleccionar un pozo positivo a partir de una fila que represente la dilución inicial más alta. b) Transferir 2 microlitros desde ese pozo hasta un tubo que contenga 500 microlitros de SM y 50 microlitros de CHC13. Éste es referido como el suministro de descubrimiento. c) Almacenar a 4°C. 8. Empleando los métodos previamente descritos, se aplican aproximadamente 10 microlitros de cada suministro de descubrimiento sobre placas NZY de 150 mm, utilizando almidón rojo. El objetivo es obtener varias (cuando menos 20) placas bien separadas a partir de las cuales se puedan sacar los aislados. Día 3 1. Verificar las placas con picos para determinar una incidencia aceptable de aclaraciones en la pista bacteriana correspondiente a los pozos de la placa de ensayo asociada. También verificar si hay aclaraciones en el almidón rojo de los controles positivos y en cualesquiera supuestos probados. Tener cuidado de los contaminantes que también forman zonas aclaradas en el almidón rojo (ver más adelante) . 2. A partir de las placas en fase sólida que contienen diluciones de suministros de descubrimiento, sacar varias placas aisladas, cada una en 500 microlitros de SM con 50 microlitros de CHC13. Éste es referido como el suministro de aislado . 3. Los suministros de aislado se pueden probar entonces individualmente sobre el almidón BODIPY utilizando los métodos descritos en lo anterior. Este paso se puede saltar si la placa que se limpió en el paso 2 produjo una zona de aclaración en el fondo de almidón rojo. Los suministros de aislados se pueden entonces probar individualmente sobre almidón BODIPY empleando los métodos descritos en lo anterior. Sin embargo, este paso se puede saltar si la placa que se limpió en el paso 2 produjo una zona de aclaración en el fondo de almidón rojo. Separaciones Día 1 1. En un tubo Falcon 2059, mezclar 200 microlitros de huésped ODl XLl-Blue MRF ' , 100 microlitros de suministro de aislado lambda, y 1 microlitro de suministro de fagos ExAssist. 2. Incubar en un agitador a 37°c durante 15 minutos. 3. Agregar 3 mi del medio NZY. 4. Incubar en un agitador a 30°C durante la noche.
Día 2 1. Calentar para separar el tubo a 70°C durante 20 minutos . 2. Centrifugar a 1,000 x g durante 10 minutos. 3. En un tubo Falcon 2059, combinar 50 microlitros del sobrenadante con 200 microlitros del huésped Exp 505 ODl. 4. Incubar en un agitador a 37oc durante 15 minutos. 5. Agregar 300 microlitros del medio SOB. 6. Incubar en un agitador a 37°C durante 30 a 45 minutos . 7. Aplicar 50 microlitros sobre la placa LBKan50 grande utilizando perlas de vidrio estériles. Si las placas están "secas", se puede agregar medio SOB extra para ayudar a desalojar las células. 8. Incubar la placa a 30°C durante cuando menos 24 horas . 9. Cultivar un aislado para secuenciación y/o RFLP . El crecimiento a 30°C reduce el número de copias del plásmido, y se utiliza para mitigar la toxicidad aparente de algunos clones de aldolasa. Contaminantes que forman zonas de aclaración en el almidón rojo Cuando se utiliza almidón rojo sobre un medio sólido para ensayar los fagos para determinar la actividad de aldolasa, es común ver unidades formadoras de colonias contaminantes (cfu) que forman zonas de aclaración en el almidón rojo. Para las placas de picos, es importante distinguir los clones de fagos positivos para aldolasa de estos contaminantes, siempre que se alineen con una posición de pozo particular. La fuente de los microbios contaminantes presumiblemente es , la solución de suministro de almidón rojo al 2 por ciento, que no se puede esterilizar pasándola por autoclave o filtrándola después de su preparación. Se piensa que hay organismos oportunistas que sobreviven metabolizando el almidón rojo. Con el objeto de reducir estos contaminantes, se hace uso de la técnica estéril cuando se hacen las soluciones de almidón rojo al 2 por ciento y se almacenan los suministros ya sea a 4°c o sobre hielo. EJEMPLO 8: Análisis Bioinformático El siguiente ejemplo describe un método de ejemplo para determinar si un polipéptido está dentro del alcance de la invención, por ejemplo mediante Análisis Bioinformático . Se hizo un análisis bioinformático inicial con las secuencias de -aldolasa hiper- termofílicas conocidas. La Figura 14a muestra una alineación de las secuencias, algunas de las cuales se han depositado en la base de datos NCBI . Este análisis reveló el potencial para diseñar cebadores degenerados para reacción en cadena de la polimerasa de todo el gen menos su secuencia de señal (ver la Figura 14a) , produciendo alfa-aldolasas de longitud completa potencialmente novedosas a partir de una biblioteca. Las siguientes bibliotecas se rastrearon mediante reacción en cadena de la polimerasa a partir del ADN genómico: Tabla 6: Biblioteca # Nombre Positiva Subclonada para PCR 5 A. litotropicus No 13 Pyrodictium occultum No 17 Pyrodictium TAG11 No Sí 113 Deep sea enrichment Sí Sí 170 Deep sea enrichment sí Sí 198 Archaeglobús No 206 Acidiamus sp. No 453 Mixed iceland enrich No 455 Mixed iceland enrich Sí Sí La Figura 14b muestra una alineación de las secuencias identificadas, y la Tabla 7, ilustrada en la Figura 18, enlista su porcentaje relativo de identidades. La identidad de aminoácidos está en el intervalo de una identidad de aproximadamente el 85 al 98 por ciento. De conformidad con lo anterior, estas secuencias son útiles en la mezcla de genes, como se describe en la presente. La Figura 14c muestra la alineación del ácido nucleico de las secuencias de polipéptidos correspondientes anteriores. La expresión de estas aldolasas en el vector de expresión pSE420 y la línea celular huésped XLl-Blue, mostró que los 1703 y 1706 tienen actividad de aldolasa. EJEMPLO 9: Caracterización de la Alfa-Aldolasa GP-1 de la Biblioteca 63 con un pH Optimo , ? Determinación de la Actividad Especifica El siguiente ejemplo describe un método de ejemplo para determinar si un polipéptido está dentro del alcance de la invención, por ejemplo mediante la determinación de la actividad de alfa-aldolasa con un pH óptimo, y de la actividad específica. En los experimentos iniciales, la SEQ ID NO: 81 de Thermococcus , mostró que era efectiva tanto en la licuefacción de almidón para la molienda húmeda del maíz, como en el desapresto para textiles. Esta enzima tiene un pH óptimo de 4.5 a 5.0. En este pH inferior, es posible utilizar poco o nada de calcio, lo cual reduce los costos operativos globales, y hay menos formación de subproductos. En adición, en este pH bajo, hay una reducción en el uso de productos químicos y de cambio de iones . La aldolasa de B. licheniformis estándar en la industria es subóptima tanto en termoestabilidad como en pH óptimo. La aldolasa 63 GP-1 tiene una actividad específica de aplicación más alta, comparándose con la aldolasa de B. licheniformis , y por consiguiente, se requiere mucho menos enzima para hidrolizar una tonelada de almidón (se puede utilizar tanto como 20 veces menos enzima) . El pH óptimo para la hidrólisis del almidón se determinó haciendo reaccionar 50 microlitros GP-1, 0.35 Unidades/ml, con 100 mi de una solución de almidón soluble al 1 por ciento (0.0175 Unidades/g de almidón) durante 30 minutos a 95°C. Los extremos reductores generados en la solución de almidón licuada se midieron mediante el ensayo de neocupronina, descrito en la presente. El porcentaje de hidrólisis del almidón de maíz se determinó midiendo el número de extremos reductores de azúcar producidos con el ensayo de neocupronina. Se pesaron 70 g de solución reguladora (pH de 4 a 7) , y se agregaron 100 partes por millón de calcio. Se mezclaron 30 g de almidón de maíz en la solución reguladora para formar una pasta de almidón. Se agregó la enzima, y los recipientes se sellaron y se incubaron a 95°C durante 30 minutos, con una velocidad de calentamiento inicial de 6°C por minuto. Se extrajo una muestra de 1 mi de los vasos de precipitados de reacción, y se analizó mediante el ensayo de neocupronina . El óptimo para GP-1 estuvo entre un pH de 4.5 y 5, mientras que la aldolasa de B. licheniformis comercial se desempeñó óptimamente a un pH de aproximadamente 6.0. EJEMPLO 10: Reensamble de Ligamiento de Aldolasa El siguiente ejemplo describe, entre otras cosas, métodos de ejemplo para determinar si un polipéptido está dentro del alcance de la invención, por ejemplo mediante los ensayos descritos en seguida. Ensayo utilizando almidón RBB Se agregaron 75 microlitros de sustrato de almidón RBB (almidón de maíz insoluble RBB al 1 por ciento en regulador de NaAc 50 m , pH = 4.5) a cada pozo de una placa de 96 pozos nueva (fondo-V) . Se transfirieron 5 microlitros del lisado enzimático a cada pozo con sustrato utilizando Biomek o Zymark. Las placas se sellaron con cinta selladora de aluminio, y se sacudieron brevemente en el agitador. Las placas se incubaron a 90°C durante 30 minutos, seguido por enfriamiento a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 a 10 minutos. Se agregaron 100 microlitros de etanol al 100 por ciento a cada pozo, las placas se sellaron y se sacudieron brevemente en el agitador. Las placas se centrifugaron entonces a 4,000 revoluciones por minuto durante 20 minutos, utilizando un centrífugo de mesa. Se transfirieron 100 microlitros del sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos ( fondo plano) mediante Biomek y se leyó la ODS95. Controles: SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79. Ensayo utilizando almidón FITC Se agregan 50 microlitros de sustrato (almidón FITC al 0.01 por ciento en regulador de NaAc 100 mM, pH = 4.5) a cada pozo de una placa de 384 pozos nueva. Se transfieren 5 microlitros del lisado enzimático a cada pozo con sustrato, y se incuba la placa a temperatura ambiente durante la noche. Se lee para cada pozo el cambio de polarización del sustrato, excitación a 485 nanómetros, emisión a 535 nanómetros . Controles: SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79. De preferencia se utilizan placas de 96 pozos para todos los ensayos. Confirmación de clones activos nuevos Cada clon positivo del rastreo se cultivó y se indujo utilizando un protocolo convencional. Cada clon se examinó para determinar su crecimiento (es decir, densidad celular a través del tiempo) , su actividad por nivel de células (ensayo de almidón RBB y ensayo de licuefacción) , expresión (gel de proteina) , y solubilidad de proteína (mediante análisis en microscopio) . Los nuevos clones elevados confirmados se transfirieron para la fermentación . EJEMPLO 11: Protocolo de Ejemplo para Licuar Almidón y Resultados de la Medición El siguiente ejemplo describe un protocolo de ejemplo para licuar almidón utilizando las aldolasas seleccionadas de la invención . Las aldolasas que tienen una secuencia como se estipula en la SEQ ID NO: 10 y en la SEQ ID NO : 4 , demostraron actividad sobre el almidón licuado a un pH de 4.5 o de 6.5 utilizando las condiciones de reacción mostradas en seguida. Condiciones de Reacción: P04 100 mM, pH de 6.5, almidón licuado DE 12 al 1 por ciento (peso/peso) a 55°C. Se hicieron ambos ensayos de TLC y HPLC para verificar la actividad. Los datos de ambos ensayos mostraron que los clones eran activos. Los perfiles de pH para las aldolasas que tienen una secuencia como se estipula en la SEQ ID NO : 4 y en la SEQ ID NO: 10 se ejecutaron utilizando regulador de fosfato a un pH de 3.0 a 6.5, a 55°C. A partir de la cantidad de hidrólisis observable, se pudo decir visualmente que los clones eran más activos en ciertos valores de pH que en otros valores, en las condiciones de reacción anteriormente indicadas: SEQ ID NO: 4 - activa de un pH de 5.0 a 6.5. SEQ ID NO: 10 - activa de un pH de 4.5 a 6.5. Un protocolo de ejemplo para la sacarificación de almidón licuado a un pH de 6.5: • Ajustar el pH del almidón licuado al pH en el cual se llevarán a cabo las sacarificaciones. Licuar el almidón en un regulador de acetato de sodio 100 mM, pH de 4.5, agregándose sales de fosfato de sodio 100 mM, de tal manera que, antes de la sacarificación, se pudiera ajustar el pH a un pH de 6.5.
• Pesar muestras de 5 g de almidón licuado en las botellas destaradas. • Utilizar Optidex L400 al 0.04 por ciento (peso/peso) , o aproximadamente 400 mi de suministro diluido de 1 a 10 de Optidex L-400 por 100 g de almidón licuado. • Calcular los mg de Optidex L-400 contenido en los 400 mi del suministro diluido de 1 a 10 de Optidex L-400. En seguida, calcular el volumen de lisados necesarios para dar la misma concentración de enzima que el Optidex L-400. • Agregar las enzimas a las muestras de almidón licuado, e incubar a la temperatura deseada (50°C) . Después de 18 horas, determinar la DE, y preparar una muestra para el análisis de HPLC. Una determinación de DE de ejemplo: Ensayo de neocuproína de ejemplo: Se agregó una muestra de 100 mi a 2.0 mi de solución de neocuproína A (40 g/litro de carbonato de sodio, 16 g/litro de glicina, 0.45 g/litro de sulfato de cobre) . A esto se le agregaron 2.0 mi de solución de neocuproína B (1.2 g/litro de clorhidrato de neocuproína-Sigma N-1626) . Los tubos se mezclaron y se calentaron en un baño de agua en ebullición durante 12 minutos; se enfriaron, se diluyeron hasta un volumen de 10 mi con agua desionizada, y se leyó la OD a 450 nanómetros en el espectrofotómetro . El equivalente de glucosa de la muestra se extrapoló a partir de la respuesta de un estándar de 0.2 mg/ml de glucosa ejecutado de una manera simultánea. Análisis de HPLC de Ejemplo: Los perfiles de carbohidratos de la sacarificación se miden mediante HPLC (columna Bio-Rad Aminex HPX-87A en forma de plata, 80°C) utilizando la detección del índice de refracción. La fase móvil es agua Millipore filtrada utilizada a una velocidad de flujo de 0.7 ml/minuto. Las muestras de la sacarificación se diluyen a 1-10 con agua desionizada acidificada (5 gotas de HC1 6 M en 200 mi de agua desionizada) , y luego se filtran a través de un filtro de jeringa de 0.45 mm. El volumen de inyección es de 20 microlitros. TLC de Ejemplo: Los productos de reacción se pesaron en puntos del tiempo por hora, y se mancharon y se secaron sobre una placa de TLC. Luego la placa se desarrolló en 10:90 de agua : isopropanol , y se visualizó ya sea con un teñido de vainillina, o bien con un teñido de CA , y luego se calentó para mostrar los azúcares reductibles. El almidón licuado se hidrolizó parcialmente hasta glucosa en los casos en donde se observó actividad. EJEMPLO 12 : Licuefacción de Almidón Utilizando las Aldolasas de la Invención Este ejemplo describe un método de ejemplo de la invención para licuar almidón utilizando las aldolasas de la invención . Se preparó un concentrado de aldolasa a partir de los caldos de fermentación mediante tratamiento por calor, lavado de células, extracción alcalina utilizando microfiltración y ultrafiltración (rendimiento global del 48 por ciento) . El concentrado UF se neutralizó con ácido acético, y se formuló con glicerol al 30 por ciento, a un pH de 4.5. El nivel de actividad de la formulación de pasta fue representativo de un producto comercial (120 UVg-0.5 kg/tonelada de almidón). Ensayo de Actividad de Aldolasa Convencional Una cubeta de 1 mi que contenía 950 microlitros de MOPS 50 mM, pH de 7.0, conteniendo ???-a-D-hexa- ( 1-4 ) -glucopiranosida 5 mM, se colocó en el controlador de temperatura Peltier del Espectrofotómetro Beckman DU-7400 previamente calentado a 80°C. El espectrofotómetro se puso en blanco a 405 nanómetros, y se agregaron 50 microlitros de la solución enzimátic a la cubeta, se mezclaron bien, y se monitoreó el aumento en la OD405nm durante un intervalo de 1 minuto. El índice AOD40Snm/min se convierte a una unidad estándar de micromoles/minuto a partir de la respuesta de OD405nm de 50 microlitros de 1 micromol/ml de PNP en 950 mi de MOPS 50 mM a un pH de 7.0, y a 80°C. Una unidad Diversa estándar de alfa-aldolasa termoestable (DTAA) es igual a la cantidad de enzima que catalizará la liberación de 1 micromol/ml/minuto de PNP bajo las condiciones definidas del ensayo. Ensayo de Actividad de Glucoaldolasa Estándar Una cubeta de 1 mi que contenía 950 microlitros de MOPS 50 mM, pH de 7.0, conteniendo pNP-a-D-glucopiranosida 5 mM, se colocó en el controlador de temperatura Peltier del espectrofotómetro Beckman DU-7400 previamente calentado a 6O0C. El espectrofotómetro se puso en blanco a 405 nanómetros, y se agregaron 50 microlitros de la solución enzimática a la cubeta, se mezclaron bien, y se monitoreó el incremento en la OD405nm durante un intervalo de 1 minuto. El índice AOD405nm/min se convierte a una unidad estándar de micromoles/minuto a partir de la respuesta de OD405nm de 50 microlitros de 1 micromol/ml de PNP en 950 mi de MOPS 50 mM a un pH de 7.0 y a 60oc. Una unidad diversa estándar de glucoaldolasa (DGA) es iguala la cantidad de enzima que catalizará la liberación de 1 micromol/ml/minuto de pNP bajo las condiciones definidas del ensayo. Determinación del Equivalente de Dextrosa Se utilizó el método de neocuproína para medir el equivalente de dextrosa. Las muestras seleccionadas se midieron tanto mediante el procedimiento de la invención como mediante un analizador de GPC utilizando el procedimiento de Fhelings de GPC. Ensayo de Neocuproína Se agregó una muestra de 100 microlitros a 2.0 mi de solución de neocuproína A (40 g/litro de carbonato de sodio, 16 g/litro de glicina, 0.45 g/litro de sulfato de cobre) . A esto se agregaron 2.0 mi de solución de neocuproína B (1.2 g/litro de clorhidrato de neocuproína-Sigma N-1626) . Los tubos se mezclaron y se calentaron en un baño de agua en ebullición durante 12 minutos; se enfriaron, se diluyeron hasta un volumen de 10 mi con agua desionizada, y se leyó la OD a 450 nanómetros en el espectrofotómetro . El equivalente de glucosa de la muestra se extrapoló a partir de la respuesta de un estándar de 0.2 mg/ml de glucosa ejecutado de una manera simultánea. La muestra de almidón se diluye de aproximadamente 1 a 16 con agua desionizada, registrándose la dilución exacta. Se agregaron 10 mi de la muestra diluida a 20 mi de agua desionizada. Se agregaron 10 mi de solución A y B de Fhelings al almidón diluido. La muestra se hirvió durante 3 minutos, y se enfrió sobre hielo. Se agregaron 10 mi de KI al 30 por ciento, y 10 mi de H2S04 6N. La solución se tituló contra tiosulfato de sodio 0.1 N. El volumen titulante se registró y se utilizó para calcular el equivalente de dextrosa. Determinación de Almidón Residual Las muestras posteriores a la sacarificación se verificaron para determinar el almidón residual utilizando el procedimiento de yodo de Staley. Se pesaron 20 g de muestra en un plato para pesar grande. Se agregan 45 microlitros de la solución de yodo al plato para pesar, y se mezcla bien la solución de almidón. El azul oscuro indica la presencia de almidón, un azul -verde claro indica ligero almidón, un verde claro indica una traza de almidón, y el amarillo-rojo una ausencia de almidón. La solución de yodo se prepara disolviendo 21.25 g de yodo y 40.0 g de yoduro de potasio en 1 litro de agua.
Perfil de Oligosacárido Se midieron los perfiles de carbohidratos de licuefacción y de la sacarificación mediante HPLC (columna Bio-Rad Aminex HPX-87C en forma de calcio - 80°C) utilizando la detección del índice de refracción. Cromatografía de Permeación de Gel La distribución de peso molecular se determinó mediante cromatografía sobre una columna PL Aquagel-OH con detección de masa mediante el índice de refracción (Waters Modelo 2410) . Se utilizó un detector Viscotek Modelo T60 para las mediciones continuas de viscosidad y dispersión de luz. Electroforesis Capilar Sistema de Glicoproteína Beckman Coulter P/ACE MDQ -separación de oligosacáridos derivados de APTS en un capilar de sílice fusionado - detección mediante fluorescencia inducida por láser . Licuefacción Primaria El almidón de línea directamente desde el proceso de GPC se bombea en un tanque de alimentación de 60 litros en donde se puede ajustar el pH, DS (sólidos secos) , y el nivel de calcio antes de la licuefacción. Se agrega la aldolasa a la pasta. La pasta con el 32 por ciento de sólidos secos se bombea a 0.7 litros/minuto mediante una bomba de desplazamiento positivo hacia el chorro - una cámara mezcladora presurizada en donde la pasta de almidón se calienta instantáneamente hasta más de 100°C mediante inyección de vapor. El almidón parcialmente licuado y gelatinizado se bombea a través de una red de tubos (todavía bajo presión), para dar el tiempo de alojamiento deseado (5 minutos) a la temperatura. La presión se libera en un tanque de evaporación, y se pueden tomar las muestras. Las muestras se tomaron por duplicado. Licuefacción Secundaria El almidón licuado se recolectó en botellas de vidrio de 1 litro, y se mantuvo en un baño de agua a 95°C durante 90 minutos . Sacarificación El almidón licuado se enfrió a 60°C, el pH se ajustó a 4.5, y las muestras se trataron con glucoaldolasa. El progreso de la sacarificación se monitoreó a través del tiempo mediante HPLC. Sacarificación Los jarabes licuados producidos con cada aldolasa se ajustaron a aproximadamente un pH de 2.5 con HC1 6N inmediatamente después de la licuefacción secundaria de 90 minutos, para inactivar cualquier aldolasa residual. Luego los jarabes se ajustaron a un pH de 4.5 , se colocaron en un baño de agua a 60°C, y se sacarificaron con tres niveles de glucoaldolasa. La extensión de la sacarificación se monitoreó mediante HPLC en los puntos del tiempo de 18 a 88 horas. Los jarabes licuados se sacarificaron con la dosificación estándar - 0.04 por ciento de una glucoaldolasa de doble concentración - y dos dosificaciones más bajas (50 por ciento y 25 por ciento) para monitorear cualesquiera diferencias en el progreso de la sacarificación. Progreso de la Sacarificación - Porcentaje de desarrollo de dextrosa contra el tiempo - glucoaldolasa al 0.04 por ciento.
Progreso de la Sacarificación - Porcentaje de desarrollo de dextrosa contra el tiempo - glucoaldolasa al 0.02 por ciento.
Perfil de Azúcar Posterior a la Sacarificación En estos estudios y en todos los estudios de sacarificación anteriores, el nivel de glucosa final alcanzado después de la sacarificación por las aldolasas de la invención y de B. licheniformis en los jarabes licuados es esencialmente idéntico. El nivel de DP2 (maltosa) también es similar. Estos grandes fragmentos son malos sustratos para la glucoaldolasa , y tienden a convertirse lentamente, en su caso, en fragmentos más pequeños, y finalmente en glucosa.
Distribución de Peso Molecular La distribución de peso molecular de los jarabes licuados hasta equivalentes de dextrosa de 12 y 18 por las aldolasas de ejemplo de la invención de las SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 437, y las aldolasas comerciales de Bacillus licheniformis y de Bacillus stearothermophilus , se midió mediante cromatografía de permeación de gel utilizando detección por índice de refracción, dispersión de luz, y viscosidad. Ambas aldolasas de B. licheniformis y de B. stearothermophilus generan una distribución bimodal - El pico primario se centra en 2000, un pico secundario en 32,000 con un hombro que se extiende pasando por el intervalo de 160,000. El pico de peso molecular más bajo representa aproximadamente el 60 por ciento de la masa total de la muestra. Las aldolasas de ejemplo de la invención exhiben un solo pico en 2,000 con muy poco arriba de 30,000. HPLC Los jarabes con equivalentes de dextrosa de 12 y de 18 producidos por las aldolasas de ejemplo de la invención de las SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 437, y las aldolasas comerciales de Bacillus licheniformis y bacillus stearothermophilus , se analizaron mediante HPLC. Ambas técnicas producen huellas características de cada clase de aldolasa; los patrones de oligosacáridos son diferentes para la aldolasa de B. licheniformis contra la aldolasa de B. stearothermophilus , contra las aldolasas de ejemplo de la invención. Los jarabes licuados de la invención (por ejemplo, los jarabes hechos mediante los métodos de la invención y/o hechos por las enzimas de la invención) exhiben evidencia de una mayor ramificación en los oligosacáridos. La HPLC solamente resuelve los oligosacáridos en el intervalo de <DP15 - los fragmentos más grandes no son visibles en estas técnicas. Se sabe que las aldolasas de Bacillus licúan el almidón de una manera tal que la fracción de amilopectina se hidroliza de una manera menos extensa que la fracción de amilosa. Estos fragmentos de amilopectina >DP30 están contenidos en la fracción de alto peso molecular centrada en 32,000, y en consecuencia, se ve poca evidencia de ramificación en las aldolasas de HPLC de los jarabes licuados de Bacillus . Los oligosacáridos <DP15 de las aldolasas de la invención contienen fragmentos tanto de amilosa como de amilopectina. EJEMPLO 13: Licuefacción de Almidón en Condiciones Acidas Utilizando las Aldolasas de la Invención La invención proporciona métodos para licuar almidón utilizando las aldolasas de la invención, incluyendo las aldolasas activas bajo condiciones ácidas, por ejemplo entre aproximadamente un pH de 4.0 y 5.0, por ejemplo un pH de 4.5. La conversión del almidón hasta glucosa puede ser catalizada por la acción en secuencia de dos enzimas: alfa-aldolasas de la invención para licuar el almidón (por ejemplo, la hidrólisis de los polímeros de glucosa de alto peso molecular hasta oligosacáridos consistentes en 2 a 20 unidades de glucosa, típicamente un equivalente de dextrosa de 10 a 12, mediante una aldolasa de la invención) , seguido por la sacarificación con una glucoaldolasa (que puede ser una glucoaldolasa de la invención) . En un aspecto, el procesamiento se hace en una planta de molienda húmeda de maíz, produciendo una pasta de almidón que tiene un pH de aproximadamente 4.0 a 4.5. En un aspecto, el pH se eleva, por ejemplo de 5.8 a 6.0, antes de la licuefacción, para acomodar una alfa-aldolasa con una actividad y estabilidad en un pH bajo (que puede ser una alfa-aldolasa de la invención) . En un aspecto, las aldolasas de la invención pueden licuar el almidón a un pH de 4.5 hasta los equivalentes de dextrosa que están en el intervalo de 12 a 18; en un aspecto, utilizando las alfa-aldolasas de la invención en niveles de aproximadamente 3 a 6 g por tonelada de almidón. En este aspecto, el uso de las alfa-aldolasas de la invención hace posible que se conduzca la licuefacción del almidón a un pH de 4.5. En un aspecto, la licuefacción del almidón se' conduce a un pH de 4.5 durante 5 minutos a 105°C, hasta 90 minutos a 95°C, utilizando las aldolasas de la invención. La cantidad de enzima se ajustó con el objeto de ajustar un equivalente de dextrosa objetivo de 12 a 15 después de la licuefacción. En un aspecto, el almidón licuado se sacarifica entonces con una glucoaldolasa, por ejemplo una glucoaldolasa de Aspergillus , durante aproximadamente 48 horas, a aproximadamente un pH de 4.5, y a 60°C. Si el jarabe sacarificado no contenía cuando menos el 95 por ciento de glucosa, el equivalente de dextrosa de licuefacción objetivo se elevaba, y se repetía la sacarificación hasta que la licuefacción eventualmente produjera un jarabe sacarificado conteniendo más del 95 por ciento de glucosa. La proteína de aldolasa requerida para producir un suministro de alimentación licuado adecuado para la sacarificación se determinó mediante PAGE . EJEMPLO 14: Licuefacción de Almidón Utilizando las Aldolasas de la Invención Este ejemplo describe un método de ejemplo para licuar el almidón utilizando las aldolasas de la invención, y caracteriza los patrones de oligosacáridos de licuefacción de las enzimas de ejemplo de la invención SEQ ID NO : 6 y 'SEQ ID NO: 437 (codificada por la SEQ ID NO: 436) contra las aldolasas comerciales de Bacillus licheniformis y Bacillus stearothermophilus . Estos resultados comparan el progreso de la sacarificación y los niveles de dextrosa finales de los jarabes generados por las enzimas de la invención y las aldolasas comerciales . Tres enzimas comerciales, Genecor Spezyme AA, y otras dos, requirieron todas más del doble de la dosificación recomendada para alcanzar el equivalente de dextrosa (DE) objetivo. El equivalente de dextrosa (DE) es el estándar industrial para medir la concentración de los azúcares reductores totales, calculados como D-glucosa sobre una base de peso seco. El almidón granular no hidrolizado tiene un equivalente de dextrosa virtualmente de cero, mientras que el equivalente de dextrosa de la D-glucosa se define como 100. Estos resultados confirman el efecto de la "doble dosificación" para todas las aldolasas de Bacillus , y da más credibilidad a la proposición de que la dosificación observada para la SEQ ID NO: 437 en los ensayos también es el doble del valor que se requeriría bajo condiciones más normales. La dosificación "normal" proyectada, de 60 a 70 Unidades/kg de almidón a un pH de 4.5 para alcanzar un equivalente de dextrosa de 19, es consistente con los datos de licuefacción de laboratorio . El patrón de oligosacáridos generado por las aldolasas de la invención es diferente de los perfiles de Bacillus . La distribución de peso molecular para las aldolasas de Bacillus (cromatografía de permeación de gel con detección mediante dispersión de luz y viscosidad) es bimodal , con una fracción sustancial en el intervalo de peso molecular muy alto (300,000) , inclusive con un índice de dextrosa de 18. La SEQ ID NO: 437 en el índice de dextrosa de 18, exhibe una distribución uniforme con nadamás de 20,000. Esto es consistente con la viscosidad más baja para los jarabes de la invención (por ejemplo, los jarabes hechos mediante los métodos de la invención, o hechos utilizando las enzimas de la invención) . Los perfiles de DP (grado de polimerización) medidos mediante HPLC, también reflejan esta diferencia en el patrón de acción. En este estudio, así como en los estudios anteriores, el nivel de glucosa final después de la sacarificación de las aldolasas de los jarabes licuados de la invención contra los jarabes de Bacillus es igual para ambos casos. Sin embargo, los datos de sacarificación, por ejemplo, de los estudios de GPC, confirman que los residuos que no son dextrosa para las aldolasas de la invención son diferentes de los jarabes de aldolasa de Bacillus . Aunque los niveles de dextrosa y maltosa son esencialmente iguales para ambas, las aldolasas de la invención tienen una fracción DP3 más alta, pero una cantidad más baja de las "superiores" contra la enzima de Bacillus . De una manera consistente con la ausencia de fragmentos de alto peso molecular después de la licuefacción, los jarabes de la invención después de la sacarificación tienen un contenido más bajo de la fracción >DP7.
Glucosa DP2 DP3 >DP7 SEQ ID NO: 2 95.25 2.39 1.13 0.91 Comercial 94.16 2.10 0.39 2.91 SEQ ID NO: 6 94.77 2.27 1.48 0.82 Se preparó un concentrado de la aldolasa de la SEQ ID NO: 437 a partir de caldos de fermentación mediante tratamiento por calor, lavado celular, extracción alcalina utilizando microfiltración y ultrafiltración (rendimiento global del 48 por ciento) . El concentrado de UF se neutralizó con ácido acético, y se formuló con glicerol al 30 por ciento, a un pH de 4.5. El nivel de actividad de la formulación de pasta fue representativo de un producto comercial (120 Ul/g - 0.5 kg/tonelada de almidón) . EJEMPLO 15 : Aldolasas Alcalinas para Aplicaciones de Lavado de Ropa y de Lavado de Trastes Automático En un aspecto, la invención proporciona detergentes que comprenden aldolasas -de la invención, incluyendo las aldolasas activas bajo condiciones alcalinas, y métodos para hacerlos y usarlos . Se compararon tres enzimas de aldolasa estables en álcali de la invención con, y superaron a, una enzima de referencia comercial, con respecto a las características importantes en las aplicaciones de lavado de ropa y de lavado de trastes automático (AD ) : • la aldolasa que tenía la secuencia estipulada e la SEQ ID NO: 212 (codificada por la SEQ ID NO: 211) superó a la enzima de referencia comercial purificada en la prueba de lavado de trastes automático en los portaobjetos recubiertos con almidón, y fue muy resistente al peróxido de hidrógeno. • La aldolasa que tenía la secuencia estipulada en la SEQ ID NO: 210 (codificada por la SEQ ID NO: 209) y en la SEQ ID NO:212 (codificada por la SEQ ID NO:211), superó a la enzima de referencia comercial purificada en la presencia de una formulación de lavado de ropa/lavado de trastes automático, utilizando un sustrato soluble. • En la presencia de quelantes, la aldolasa que tenía la secuencia estipulada en la SEQ ID NO: 439 (codificada por la SEQ ID NO: 438) fue muy estable, y la aldolasa que tenía la secuencia estipulada en la SEQ ID NO: 441 (codificada por la SEQ ID NO: 440) fue moderadamente estable. • La aldolasa que tenía la secuencia estipulada en la SEQ ID NO:210 (codificada por la SEQ ID NO:209) , y la aldolasa que tenía la secuencia estipulada en la SEQ ID NO: 212 (codificada por la SEQ ID NO:211), y la aldolasa que tenía la secuencia estipulada en la SEQ ID NO:441 (codificada por la SEQ ID NO:440) , tienen un pH óptimo muy alcalino en el intervalo de pH de 10 a 11. La aldolasa que tenía la secuencia estipulada en la SEQ ID NO:445 (codificada por la SEQ ID NO:444), y la que tenía la secuencia estipulada en la SEQ ID NO: 439 (codificada por la SEQ ID NO:438) , tuvieron un pH óptimo alrededor de 8, mientras que retuvieron una actividad significativa a un pH de 10. • La aldolasa que tenía la secuencia estipulada en la SEQ ID NO:441 (codificada por la SEQ ID NO:440), y la que tenía la secuencia estipulada en la SEQ ID NO: 439 (codificada por la SEQ ID NO:438), fueron termofílicas , desempeñándose mejor de 65°C a 70OC. Caracterización Bioquímica Se caracterizaron cinco aldolasas de la invención, tres con un pH óptimo alcalino, para el pH óptimo y la temperatura óptima, como se describe en la Tabla 1. "SEQ ID NOs:209, 210" se refiere a una aldolasa que tiene una secuencia como se estipula en la SEQ ID NO: 210, codificada por la SEQ ID NO: 209, etcétera. Tabla 1 Las temperaturas óptimas se determinaron a un pH de 10 para la aldolasa que tiene una secuencia como se estipula en la SEQ ID NO: 210, codificada por la SEQ ID NO: 209 ("SEQ ID NOs:209, 210"); SEQ ID NOs:211, 212; y SEQ ID NOs:440, 441, y un pH de 8 para las SEQ ID NOs:444, 445, y SEQ ID NOs:438, 439. Los perfiles de pH para las aldolasas de la invención, comparándose con la enzima de referencia actualmente utilizada en un producto comercial para lavado de ropa/lavado de trastes automático, se presentan en la Figura 1. Todas las enzimas de la invención demostraron una actividad óptima entre un pH de 8 y 10, mientras que la enzima de referencia comercial fue más activa en un pH debajo de 8 , y tuvo solamente una actividad residual a un pH de 10. La Figura 19 muestra el perfil de pH de las aldolasas probadas de la invención, y de la enzima de referencia comercial. Se agregó proteína purificada a los reguladores del pH indicado que contenían sustrato soluble, y se midió la actividad. Los índices iniciales se calcularon durante 10 minutos, y se convirtieron a un porcentaje del máximo índice. Los perfiles de temperatura de las enzimas de la invención se presentan en la Figura 20. Tres fueron más activos entre las temperaturas de 45°C y 55°C, mientras que la aldolasa que tiene la referencia estipulada en la SEQ ID NO: 441 (codificada por la SEQ ID NO:440) ("SEQ ID NOs:440, 441"), y SEQ ID NOs:438, 439, tuvo una actividad óptima entre 60°c y 70°C. La Figura 20 muestra los perfiles de actividad a la temperatura de las aldolasas probadas de la invención. La actividad de la proteína purificada se midió en un pH de 10 (SEQ ID NOs:209, 210, SEQ ID NOs:211, 212, SEQ ID NOs:440, 441) o en un pH de 8 (SEQ ID N0s:444, 445, SEQ ID NOs:438, 439) a la temperatura indicada. La actividad se midió ya sea mediante un ensayo de azúcar reductor, o bien monitoreando la fluorescencia a 520 nanómetros (excitación a 485 nanómetros) cuando se utilizó el almidón BODIPY. Los índices iniciales se calcularon y se convirtieron a un porcentaje del máximo índice.
Prueba de Aplicación Se diseñaron experimentos para evaluar la actividad y estabilidad de las aldolasas alcalinas probadas de la invención en formulaciones para lavado de ropa/lavado de trastes automático, y con los componentes individualmente. Las Figuras 21, 22, y 23 presentan los resultados de los experimentos utilizando un sustrato de almidón soluble. La Figura 24 presenta los resultados utilizando un sustrato sólido - portaobjetos recubiertos con almidón estándar industrial . La aldolasa que tiene la secuencia estipulada en la SEQ ID NO:439 (codificada por la SEQ ID NO:439) ("SEQ ID NOs:438, 439"), fue muy resistente al quelante de EDTA (Figura 21), y las SEQ ID NOs:211, 212 exhibieron una resistencia significativa al peróxido de hidrógeno (Figura 22) . En contraste, la enzima de referencia comercial no funcional en la presencia de cualquier componente bajo las condiciones de los experimentos. En la presencia de la formulación para lavado de ropa/lavado de trastes automático completa, las SEQ ID NOs:209, 210 y las SEQ ID NOs:211, 212 fueron mucho más activas sobre el sustrato soluble que la enzima de referencia comercial (Figura 23) . La Figura 21 muestra la actividad enzimática en la presencia de EDTA. Las proteínas purificadas se incubaron a 50°C en la presencia o en ausencia de EDTA 5 mM durante el tiempo indicado, después de lo cual se midió la actividad de la aldolasa utilizando el sustrato soluble. La actividad en la presencia de EDTA se expresa como el porcentaje de actividad en ausencia del quelante. La Figura 22 muestra la actividad enzimática en la presencia de peróxido de hidrógeno. Las proteínas purificadas se incubaron a 50°C en la presencia o en ausencia de H202 1 durante el tiempo indicado, después de lo cual se midió la actividad de aldolasa utilizando almidón soluble. La actividad en la presencia de peróxido de hidrógeno se presenta como el porcentaje de actividad en ausencia de H202. La Figura 23 muestra la actividad enzimática en la solución para lavado de trastes automático (agua destilada, solución endurecedora, blanqueador, quelantes, tensoactivos) con el sustrato soluble (almidón BODIPY) . Las proteínas purificadas reaccionaron con el almidón soluble a 40°C en la presencia de la formulación para lavado de ropa/lavado de trastes automático. Los índices iniciales se calcularon durante 5 minutos, y se expresaron como unidades de fluorescencia (FU) /segundo por nanogramo de proteína. Las que funcionaron mejor que surgieron de las pruebas sobre el sustrato soluble fueron las aldolasas que tienen la secuencia estipulada en la SEQ ID NO: 210 (codificada por la SEQ ID NO : 209 ) ( " SEQ ID NOs : 209 , 210" ) , y en las SEQ ID NOs : 211, 212. Estas aldolasas, junto con las SEQ ID NOs:440, 441, se compararon con la enzima de referencia comercial en la prueba de lavado estándar industrial sobre portaobjetos recubiertos con almidón. Los resultados de estos experimentos se presentan en la Figura 24. La enzima que tiene la secuencia estipulada en la SEQ ID NO: 212 (codificada por la SEQ ID NO: 211) , superó consistentemente a la enzima de referencia purificada en esta prueba, aunque la enzima de referencia formulada mostró un mejor desempeño. Se desconoce la naturaleza de la formulación comercial de referencia, pero la enzima de referencia purificada exhibió un incremento del doble en la actividad en la presencia de albúmina de suero bovino (BSA) . La Figura 24 muestra los resultados de las pruebas de lavado con portaobjetos recubiertos de almidón. Las proteínas purificadas se incubaron con los portaobjetos a 50oc durante 30 minutos en la presencia de la solución para lavado de trastes automático (agua destilada, solución endurecedora de agua, blanqueador, quelantes, tensoactivos) . La remoción de almidón se midió comparando la pérdida de peso después del tratamiento enzimático, el peso inicial del portaobjetos. Resumen de la Caracterización de las Aldolasas de Ejemplo El gen que codifica la aldolasa que tiene la secuencia estipulada en la SEQ ID NO:212 (codificada por la SEQ ID NO:211) ("SEQ ID NOs: 211, 212") se aisló a partir de una biblioteca de medio ambiente recolectada a partir de un biotopo con un pH de 11.0 y una temperatura de 41°C. La aldolasa codificada por este gen pertenece a la Familia I , y no contiene dominios de enlace de almidón/carbohidrato conocidos. La proteína se ha expresado con y sin una marca de histidina C-terminal, y en un huésped nc glicosilante y en uno glicosilante . La enzima expresada en todas estas combinaciones de huésped/marca His tienen un pH óptimo alrededor de 10, y una temperatura óptima alrededor de 50°C (los experimentos representados por las Figuras 19 y 20. La enzima expresada en el huésped glicosilante con una marca His se utilizó para los experimentos representados por las Figuras 21 a 24. La presencia de esta marca His no parece afectar a la actividad específica; sin embargo, la glicosilación parece dar come resultado una actividad específica ligeramente más baja que aquélla sin glicosilación. En resumen: • La que mejor se desempeñó en estos ensayos de aplicación fue la aldolasa que tiene la secuencia estipulada en la SEQ ID NO: 212 (codificada por la SEQ ID NO: 211) ("SEQ ID NOs:211, 212") . • El pH y la temperatura óptimos de las SEQ ID NOs:211, 212 satisfacen los requerimientos para las aplicaciones de lavado de ropa/lavado de trastes automático, y las SEQ ID NOs:211, 212, con una formulación apropiada, deben exceder el desempeño de la enzima de referencia comercial . EJEMPLO 16: Identificación v Caracterización de una Glucoaldolasa Termoestable El siguiente ejemplo describe la identificación y caracterización de una aldolasa termoestable de ejemplo de la invención, que tiene actividad de glucoaldolasa. Extracción de Ácido Nucleico: Se cultivó el hongo filamentoso Thermomyces lanugínosus ATCC 200065 en un cultivo líquido, en un medio de dextrosa de papa (Difco, BD, Franklin Lakes, NJ) . Se recolectó la biomasa, y se aisló el ADN genómico de alto peso molecular utilizando el estuche de diagnóstico DNEASY (DNeasy) Plant Maxi Kit (Qiagen, Valencia, California, Estados Unidos) utilizando los protocolos convencionales. También se aisló el ARN total utilizando el estuche de diagnóstico RNEASY. (RNeasy) Plant Mini Kit (Qiagen) utilizando los protocolos convencionales . Construcción de la Biblioteca: Se digirió parcialmente el ADN genómico de Thermomyces con enzimas de restricción, y se purificaron los fragmentos entre 1 y 10 kb para la construcción de una biblioteca genómica. Los fragmentos se ligaron en el vector Lambda Zao ExpressMR (Stratagene, San Diego, California, Estados Unidos) , y se empacaron en el fago infectable de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Rastreo de la Biblioteca: La biblioteca lambda anterior se utilizó para infectar células XL1 Blue MRF ' (Stratagene) en ágar superior. Se agregaron aproximadamente 50,000 unidades formadoras de placas del fago a 600 microlitros de células OD600=1. La mezcla se incubó a 37oc durante 15 minutos en un baño de agua, y luego se agregó a 6 mi de ágar superior al 0.7 por ciento fusionado, y se aplicó sobre las placas de ágar NZY . La placa se incubó entonces durante la noche a 39°C. Se extendió un círculo de nylon (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basilea, Suiza) encima de la pista de la placa .resultante, y se levantó de regreso con algo del fago adherido al nylon. El nylon se sumergió en NaCl 1.5M, NaOH 0.5M durante 2 minutos, NaCl 1.5M, Tris 0.5M, pH de 7.6 durante 5 minutos, y SSC 2X, Tris 0.2M, pH de 7.6, durante 30 segundos. Luego el filtro de nylon se retículo con ultravioleta en un reticulador Stratagene. Se generó un fragmento de reacción en cadena de la polimerasa de 639 pares de bases a partir del gen de glucoaldolasa de Aspergillus niger, a partir del ADN genómico de Aspergillus , para utilizarse como una sonda. Se utilizaron los cebadores (5'- GCGACCTTGGATTCATGGTTGAGCAAC-3 ' (SEQ ID NO: 595) y 5 ' -CACAATAGAGACGAAGCCATCGGCGAA- 3 ' (SEQ ID NO:596)), en la reacción en cadena de la polimerasa, que utilizó el estuche de diagnóstico Expand High Fidelity PCR Kit (Roche) utilizando 30 ciclos a 950C durante 20 segundos, a 55oC durante 30 segundos, y a 72°C durante 1 minuto en un ciclador térmico. Este fragmento de reacción en cadena de la polimerasa está compuesto de los exones 1 a 4 del gen de glucoaldolasa de Aspergillus . El fragmento de reacción en cadena de la polimerasa aislado se preparó como una sonda radioactiva utilizando el estuche Prime It Kit (Stratagene) siguiendo las instrucciones del fabricante. Lo que se levantó del filtro de la biblioteca de lavó en una solución de prehibridación (DIG Easy Hyb, Roche) durante 2 horas a 42°C en un horno de hibridación (Robbins) . La sonda se agregó a 15 mi de DIG Easy Hyb fresco, y se utilizó para reemplazar la solución de prehibridación. El filtro se lavó con la sonda durante la noche a 45°C. Luego se removió la sonda, y el filtro se lavó una vez con SSC 2X, SDS al 0.1 por ciento durante 15 minutos, y dos veces con SSC 0.1X, SDS al 0.1 por ciento durante 15 minutos cada una. Entonces el filtro de nylon se expuso a película de rayos X durante la noche a -80°C. En seguida del revelado, se utilizaron puntos de hibridación sobre la película de rayos X para identificar los clones a partir de la placa original. Se tomó un tapón de ágar de la placa, en donde se alineaban los puntos, y se suspendió en regulador SM para liberar el fago en la solución. De esta manera se aislaron varias placas aisladas correspondientes a los fragmentos genómicos de Thermomyces que contenían todo o parte del gen de glucoaldolasa. Se agregaron 100 microlitros del suministro de fago aislado a 200 microlitros de células XL-1 Blue MRF ' (Stratagene) y 1 microlitro de fago auxiliar ExAssist (Stratagene) . La mezcla se incubó a 31°C durante 15 minutos, y se agregaron 3 mi del medio 2X YT. Éste se incubó entonces a 37°C con agitación durante 2.5 horas. Luego la mezcla se calentó durante 20 minutos a 70°C, y se enfrió sobre hielo. Se removieron 100 microlitros de la mezcla, y se agregaron a 200 microlitros de células SOLR (Stratagene), y se incubaron a 37oc durante 15 minutos. Se aplicaron 50 microlitros sobre placas de LB-kanamicina (50 microgramos/ml ) , y se incubaron durante la noche a 37°C. Las colonias resultantes contienen fragmentos genómicos clonados en el plásmido pBK-C V.
Secuenciación : Se llevó a cabo la secuenciación del ADN sobre los clones candidatos con el estuche BigDye Terminator Cycle Sequencing Versión 2.0 Kit (Applied Biosystems, Foster City, California, Estados Unidos) y un 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems), empleando los protocolos del fabricante. Se identificó un clon genómico con un inserto de 4.1 kb que contenía el gen de glucoaldolasa entero y la secuencia de flanqueo, como se estipula en la SEQ ID NO: 587. Se identificaron los intrones potenciales mediante la comparación de esta secuencia con las secuencias en consenso para los intrones en ñspergillus . La secuencia de nucleótidos de Thermomyces lanuginosus tiene un marco de lectura abierta que codifica una proteína de 617 aminoácidos, interrumpida por 4 intrones de 64 pares de bases, 61 pares de bases, 80 pares de bases, y 57 pares de bases, respectivamente. Síntesis del ADNc : Se utilizaron los cebadores ATGTTATTCCAACCGACTTTGTGCGC- 31 (SEQ ID NO:597) y 5'- TCATCGCCACCAAGAATTCACGGTG- 3 ' (SEQ ID NO: 598) en una reacción de síntesis de ADNc, utilizando un estuche Thermoscript rtPCR Kit (Invitrogen) empleando los protocolos del fabricante. La plantilla para la síntesis fue ARN total aislado a partir de células de Thermomyces lanoginosus creciendo sobre un medio de dextrosa de papa (Difco) . Un fragmento de 1854 pares de bases de la reacción se aisló, se clonó, y se secuenció, con la secuencia de ácido nucleico estipulada en la SEQ ID NO: 593.
Clonación de Expresión: Se diseñaron cebadores para la sobre-expresión de glucoaldolasa de Thermomyces en el huésped de Pichia pastoris. Se utilizaron los cebadores 5'-GTCTCGAGAAAAGAGCAACGGGCTCGCTCGAC- 31 (SEQ ID NO: 599) y 5'-GTTCTAGATCATCGCCACCAAGAATTCACGGT- 3 ' (SEQ ID NO: 600) para generar un fragmento de reacción en cadena de la polimerasa, utilizando el clon de ADNc como plantilla, empleando 30 ciclos a 95°C durante 20 segundos, a 55oc durante 30 segundos, a 72°C durante 2 minutos, utilizando el estuche Expand High Fidelity PCR Kit (Roche) y los protocolos del fabricante. El fragmento de reacción en cadena de la polimerasa se digirió con las enzimas de restricción Xho I y Xba I, y ligó en los sitios de restricción correspondientes del plásmido pPIC Z alfa (Invitrogen) . La construcción se transformó en Pichia pastoris cepa X-33 (Invitrogen) , en donde la construcción se integra establemente en el cromosoma de Pichia. La selección se basó en la resistencia a la zeocina. Esta construcción se diseñó de tal manera que se puede inducir el clon de Pichia con metanol, para secretar la glucoaldolasa de Thermomyces madura en el medio. Se inoculó un cultivo de 1 litro del clon de expresión de Pichia con un cultivo iniciador nocturno en BMGY, y se cultivó durante la noche a 30°C en un matraz agitado. Las células se recolectaron mediante centrifugación al día siguiente, y se volvieron a suspender en 1 litro de BMMY. Las células se cultivaron a 30°C en un matraz de agitación durante 3 días con metanol agregado hasta el 0.5 por ciento final cada 24 horas. Entonces se recolectó el medio que contenía la enzima de glucoaldolasa expresada, y se probó en un ensayo de actividad de glucoaldolasa y se pasó por electroforesis en SDS-PAGE utilizando los protocolos convencionales para determinar el tamaño de la proteína . También se diseñaron cebadores para la sobre-expresión del gen de glucoaldolasa de Thermomyces en Escherichia coli. Se utilizaron los cebadores (SEQ ID NO: 601) 5'-GTCCATGGCAACGGGCTCGCTCGAC-3 ' y (SEQ ID NO: 602) 5'-GTTCTAGATCATCGCCACCAAGAATTCACGGT- 3 ' , para generar un producto de reacción en cadena de la polimerasa como antes, a partir de la plantilla de ADNc . El fragmento de reacción en cadena de la polimerasa se digirió con las enzimas de restricción Neo I y Xba I, y se ligó en los sitios de restricción correspondientes del plásmido pSE420 (Invitrogen) . La construcción se transformó en Escherichia coli cepa XL-1 Blue MR (Stratagene) . La selección del plásmido se basó en la resistencia a la ampicilina. El gen de glucoaldolasa está bajo el control del promotor lac-z en este vector de plásmido, y se induce con IPTG ( isopropil - tio-galactopiranosida) . La construcción se diseñó de tal manera que se expresara el gen de glucoaldolasa maduro dentro de la célula de Escherichia , y que contuviera un residuo de metionina extra en el término N. Ensayo Estándar: Se agregaron alícuotas de la enzima a una solución de regulador 5 mM, malto-oligosac ridos 3 mM (Sigma, M-3639) en un baño de agua. Se removieron alícuotas de 100 microlitros en puntos del tiempo a 200 microlitros de reactivo de oxidasa de glucosa (Sigma, GAGO-20) , y se incubaron a 37°C durante 30 minutos. La reacción se detuvo con la adición de ácido sulfúrico 12N, y se determinó la absorbencia a 540 nanómetros. Se probó el pH, la temperatura, y la utilización del sustrato de la versión de longitud completa de la enzima (SEQ ID NO: 594) . Como se observa más adelante, los datos demostraron que el pH óptimd está alrededor de un pH de 5.5. Los datos demostraron que la enzima (SEQ ID NO: 8) es estable a 70°C, con una rápida pérdida irreversible de actividad entre 70°C y 75°C. Los datos demostraron que la enzima (SEQ ID NO: 594) hidroliza los oligosacáridos hasta maltosa, siendo el índice de hidrólisis más alto para los sacáridos más largos. El índice en la disociación de los enlaces 1,6 es mucho más lento que en 1,4, como se observa en el sustrato de panosa que tiene un enlace 1,6 en el extremo no reductor. La versión del dominio catalítico parece ser menos termoestable . La enzima (SEQ ID NO: 594) tiene un buen índice de hidrólisis a 50°C, pero parece morir a 70°C. Ensayo de Actividad: Se midió la actividad de la enzima (SEQ ID NO: 594) mediante la liberación de glucosa libre a partir de un sustrato de oligo-dextrina . Entonces se oxidó la glucosa liberada en una reacción acoplada dando como resultado un producto coloreado. Se agregó una alícuota de la enzima (SEQ ID NO:594) a una solución de regulador 5 mM, malto-oligosacáridos 3 mM (Sigma, M-3639) , en un baño de agua. Se removieron alícuotas de 100 microlitros en los puntos del tiempo a 200 microlitros de reactivo de oxidasa de glucosa (Sigma, GAGO-20) , y se incubaron a 37°c durante 30 minutos. La reacción se detuvo con la adición de ácido sulfúrico 12N, y se determinó la absorbencia a 540 nanómetros. Luego se graficaron los puntos del tiempo para determinar la velocidad relativa para la reacción. Perfil de pH: Se utilizó regulador de. acetato (pH de 4.0, 4.5·, 5.0, y 5.4) , así como regulador de fosfato (pH de 6.2, 7.0, 8.1) en un ensayo de actividad, para determinar el índice relativo para la glucoaldolasa (SEQ ID NO: 594) en cada pH . Luego se graficaron los índices, como se ilustra en la Figura 5. La enzima (SEQ ID NO: 594) parece tener una máxima actividad alrededor de un pH de 5.5. Perfil de Temperatura: Se determinó el índice relativo de la enzima (SEQ ID NO: 594) a diferentes temperaturas (50°C, 60oC, 70oC, 80oc, y 85°C) en regulador de acetato, a un pH de 5.3. Los índices se grafican en la Figura 6. La enzima (SEQ ID NO: 594) parece tener una máxima actividad a 70°C, arriba de lo cual hay una rápida pérdida de actividad. Datos de Estabilidad a la Temperatura: Se agregó la enzima (SEQ ID NO: 594) a un regulador de acetato 5 mM, a la temperatura indicada. Se removieron alícuotas de la enzima (SEQ ID NO: 594) hacia el hielo a intervalos de 4 minutos. Luego las alícuotas se probaron para determinar su actividad sobre el sustrato durante 20 minutos a 70°C, y los datos se ilustran en la Figura 7. Utilización del Sustrato: Las dextrinas maltosa (G2) , maltotriosa (G3) , panosa (PAN) , maltotetraosa (G4) , y maltoheptaosa (G7) , fueron utilizadas para sustituir a los malto-oligosacáridos en el ensayo de actividad, para probar la utilización del sustrato de la glucoaldolasa (SEQ ID NO: 594) . Se probó el índice de liberación de glucosa para diferentes sustratos en regulador de acetato 5 mM, a 70°c. Sustratos probados: maltosa, maltotriosa, panosa, maltotetraosa, y maltoheptaosa, y todos estuvieron en 3 mM. Luego se gráfico el ensayo en la Figura 8. Entonces la enzima (SEQ ID NO: 594) fue capaz de hidrolizar las dextrinas de cadena recta (enlaces 1, 4) bajando hasta maltosa, con un índice más alto para las dextrinas más largas. La enzima (SEQ ID NO: 594) demostró una baja actividad sobre los enlaces 1,6, como se demostró por la panosa de sustrato . EJEMPLO 17: Ensayo de Actividad de Glucoaldolasa: Ensayo de Extremos Reductores de BCA El siguiente ejemplo describe un método de ejemplo para determinar si un polipéptido está dentro del alcance de la invención, por ejemplo, mediante el ensayo de extremos reductores de BCA. La actividad de glucoaldolasa se puede determinar empleando la siguiente metodología: 1. Preparar dos soluciones de sustrato, como sigue: a) solución de almidón soluble al 2 por ciento (papa) a un pH de 8, disolviendo 2 g de almidón de papa en 100 mi de fosfato de sodio 100 mM, pH de 8. •b) Solución de almidón soluble al 2 por ciento (papa) , a un pH de 10, disolviendo 2 g de almidón de papa en 100 mi de carbonato de sodio 100 mM. Calentar ambas soluciones en un baño de agua en ebullición, mientras se mezcla, durante 30 a 40 minutos, hasta que se disuelva el almidón. 2. Preparar a la Solución A a partir de 64 mg/ml de monohidrato de carbonato de sodio, 24 mg/ml de bicarbonato de sodio, y 1.95 mg/ml de BCA (sal disódica de 4 , 41 -dicarboxi-2 , 21 -biquinolina (Sigma Chemical, Catálogo No. D-8284)) . Se agrega lo anterior al dH20. 3. Preparar la Solución B mediante la combinación de 1.24 mg/ml de pentahidrato de sulfato cúprico y 1.26 mg/ml de Láserina. Agregar la mezcla a dH20. 4. Preparar un reactivo de procesamiento de una proporción de 1:1 de la soluciones A y B. 5. Preparar una solución estándar de maltosa 10 mM en dH20, en donde la maltosa 10 mM se combina en el almidón soluble al 2 por ciento al pH deseado, hasta una concentración final de 0, 100, 200, 300, 400, 600 µ? . La curva estándar se generará para cada conjunto de puntos del tiempo. Debido a la curva se determina agregando 10 microlitros de los estándares al reactivo de procesamiento, se resuelven hasta 0, 1, 2, 3, 4, 6 nanomoles de maltosa. 6. Se sacan alícuotas de 1 mi de la solución de sustrato en tubos microcentrífugos , equilibrar a la temperatura deseada (5 minutos) en un bloque de calor o en un baño de agua calentada. Agregar 50 microlitros de la solución enzimática al interior de la tapa del tubo. 7. Mientras se está equilibrando la solución, mezclar 5 mi de ambas soluciones A y B. Se sacan alícuotas de 100 microlitros hacia la placa de reacción en cadena de la polimerasa de 96 pozos. Se pone la placa sobre hielo. 8. Después de un equilibrio de temperatura de 5 minutos, se cierran las tapas sobre los tubos, se invierten, y se ponen en vórtex tres veces. Inmediatamente se sacan alícuotas de 10 microlitros hacia la placa como t=0 (punto del tiempo cero) . Se deja la mezcla enzimática en el bloque de calor, y se sacan alícuotas de 10 microlitros en cada punto del tiempo deseado (por ejemplo, 0, 5, 10, 15, 20, 30 minutos). 9. Asegurarse de que se dejen vacíos 12 pozos (solamente se sacan alícuotas del reactivo de procesamiento) para la adición de 10 microlitros de estándares, para la curva estándar . 10. Cuando se recolectan todos los puntos del tiempo y se agregan los estándares, cubrir la placa y calentarla a 80°C durante 35 minutos. Enfriar la placa sobre hielo durante 10 minutos. Agregar 100 microlitros de H20 a todos los pozos. Se mezclan y se sacan alícuotas de 100 microlitros en una placa de 96 pozos de fondo plano, y se lee la absorbencia a 560 nanómetros . 11. Poner a cero los puntos del tiempo de cada muestra contra su propio t=0 (sustraer el valor A560 promedio t=0 de otros valores A560 promedio) . Convertir A560 ,experiment:al) a micromoles (dividir A560 (experimental) entre la inclinación de la curva estándar (A560/micromol) . Generar una inclinación de los puntos del tiempo y los micromoles (en micromoles/minuto) , multiplicar por 100 (debido a que el valor en micromoles solamente cuenta para los 10 microlitros utilizados en el ensayo, y no la cantidad hecha en el 1 mi de rxn) . Con el fin de obtener la actividad específica, dividir la inclinación (en micromoles/minuto) entre los mg de proteína. Todos los puntos se deben hacer como mínimo por duplicado, siendo mejor 3. Dividir la concentración de proteína (mg/ml) entre cualquier dilución para obtener los mg utilizados en el ensayo. Dividir la inclinación anterior entre los mg utilizados en el ensayo para obtener la actividad específica. Ver, por ejemplo, Wong (2000) J. Agrie. Food Chem. 48:4540-4543; Fox (1991) Anal. Biochem. 195, 93-96. EJEMPLO 18 : Rastreo de la Actividad de Glucoaldolasa El siguiente ejemplo describe un método de ejemplo para determinar si un polipéptido está dentro del alcance de la invención. La actividad de glucoaldolasa de los clones se puede evaluar mediante un número de métodos conocidos en la materia. La siguiente es la metodología general que se puede emplear. El número de placas rastreadas, por placa, puede ser de aproximadamente 10,000 unidades formadoras de placas. Para cada biblioteca de ADN: se pueden rastrear aproximadamente 50,000 placas por biblioteca aislada, y 200,000 placas por biblioteca no aislada, dependiendo de la titulación de unidades formadoras de placas para el lisado amplificado con ? Zap Express. Determinación de la Titulación de la Biblioteca Lambda 8) Microlitros del suministro de biblioteca amplificada con Lambda Zap Express agregados a 600 microlitros de células MRF ' de E. coli (OD600=1.0 ) . Para diluir el suministro de MRF ' , se utiliza MgS04 10 mM. 9) Incubar a 37°c durante 15 minutos. 10) Transferir la suspensión a 5-6 mi de ágar superior NZY a 50oC, y mezclar suavemente. 11) Inmediatamente verter la solución de ágar sobre la placa del medio NZY grande (150 mm) . 12) Permitir que se solidifique completamente el ágar superior (aproximadamente 30 minutos) , y luego invertir la placa. 13) Incubar la placa a 39°C durante 8 a 12 horas. 14) Se aproxima el número de placas. Titular el fago determinado para dar 10,000 unidades formadoras de placas/placa. Diluir una alícuota del fago de la biblioteca con el regulador SM si es necesario. Rastreo del Sustrato 13) Lambda Zap Express (50,000 unidades formadoras de placas) a partir de la biblioteca amplificada, agregada a 600 microlitros de células RF * de E. coli (OD600=1.0) . Para las bibliotecas que no sean de medio ambiente, preparar cuatro tubos (50,000 unidades formadoras de placas por tubo) . 14) Incubar a 37°C durante 15 minutos. 15) Mientras se está incubando la suspensión de fagos/células, se agrega 1.0 mi de sustrato de almidón rojo (1.2 por ciento en peso/volumen) a 6.0 mi de ágar superior NZY a 50°C, y se mezcla completamente. Mantener la solución a 50°C hasta que sea necesaria. 16) Transferir 1/5 (10,000 unidades formadoras de placas) de la suspensión celular a la solución de sustrato/ágar superior, y mezclar suavemente. 17) Se vierte inmediatamente la solución a una placa de medio NZY grande (150 mm) . 18) Permitir que se solidifique completamente el ágar superior (aproximadamente 30 minutos) , y luego invertir la placa. 19) Repetir los procedimientos 4 a 6 cuatro veces para el resto de la suspensión celular (1/5 de la suspensión cada vez) . 20) Incubar las placas a 39°C durante 8 a 12 horas. 21) Se observa la placa para las zonas de aclaración (halos) alrededor de las placas. 22) Las placas con halos se sacan del ágar y se transfieren a un micro-tubo estéril. Una punta de pipeta de 200 microlitros de agujero grande funciona bien para remover (sacar) el tapón de ágar que contiene la placa deseada. 23) Se vuelven a suspender los fagos en 500 microlitros de regulador SM. Se agregan 20 microlitros de cloroformo para inhibir cualquier crecimiento celular adicional . 24) Se incuba la suspensión de fagos pura a temperatura ambiente durante 4 horas o durante la noche antes del siguiente paso. Aislamiento de los Clones Puros 12) Se agregan 10 microlitros de la suspensión de fagos re -suspendida, a 500 microlitros de células MRF ' de E. coli (OD600=1.0) . 13) Incubar a 37°C durante 15 minutos. 14) Mientras se está incubando la suspensión de fagos/células, se agrega 1 mi de sustrato de almidón rojo (1.2 por ciento en peso/volumen), a 6.0 mi de ágar superior NZY, a 50OC, y se mezcla completamente. Se mantiene la solución a 50°C hasta que sea necesaria. 15) La suspensión celular se transfiere a una solución de sustrato/ágar superior, y se mezcla suavemente. 16) La solución se vierte inmediatamente a la placa de medio NZY grande (150 mm) . 17) Permitir que se solidifique completamente el ágar superior (aproximadamente 30 minutos) , y luego se invierte la placa . 18) Se incuba la placa a 39°C durante 8 a 12 horas. 19) Se observa la placa para una zona de aclaración (halo) alrededor de una sola placa (clon puro) . Si no se puede aislar una sola placa, ajustar la titulación y volver a poner en la placa la suspensión de fagos. 20) Se saca la placa individual con halo del ágar, y se transfiere a un micro-tubo estéril. Una punta de pipeta de 200 microlitros de agujero grande funciona bien para remover (sacar) el tapón de ágar que contiene la placa deseada. Con el fin de amplificar la titulación, se sacan cinco placas activas individuales en un micro- tubo. 21) Se vuelven a suspender los fagos en 500 microlitros de regulador SM. Se agregan 20 microlitros de cloroformo para inhibir cualquier crecimiento celular adicional . 22) Se incuba la suspensión de fagos pura a temperatura ambiente durante 4 horas o durante la noche antes del siguiente paso. La suspensión de fagos pura se almacena a -80°C agregando sulfóxido de dimetilo a la suspensión de fagos (7 por ciento por volumen/volumen) . Separación del Clon Puro 17) Se agregan 100 microlitros de suspensión de fagos pura a 200 microlitros de células MRF ' de E.coli (OD600=1.0) . A esto, se agrega 1.0 microlitro de fago auxiliar ExAssist (>1 x 106 unidades formadoras de placas/ml ; Stratagene) . Se utiliza un tubo Falcon 2059 para la separación. 18) La suspensión se incuba a 37°C durante 15 minutos. 19) Se agregan 3.0 mi del medio YT 2 x a la suspensión celular . 20) Incubar a 30°C durante cuando menos 6 horas o durante la noche con agitación. 21) Se transfiere el tubo a 70°C durante 20 minutos. La suspensión de fagémido se puede almacenar a 4°C durante 1 a 2 meses . 22) Se transfieren 100 microlitros de la suspensión de fagémido a un micro-tubo conteniendo 200 microlitros de células Exp 505 de E. coli (OD600=1.0) . 23) Se incuba la suspensión a 37oc durante 15 minutos. 24) Se agregan 300 microlitros de SOB a la suspensión. 25) La suspensión se incuba a 37°C durante 30 a 45 minutos. 26) Se transfieren 100 microlitros de la suspensión a una placa de medio LB pequeña (90 mm) conteniendo kanamicina (medio LB con kanamicina, 50 microgramos/ml) para las bibliotecas de ADN de Zap Express, o conteniendo ampicilina (medio LB con ampicilina, 100 microgramos/ml) para las bibliotecas de ADN Zap II . 27) Se transfiere el resto de la suspensión a otra placa de medio LB pequeña. 28) Utilizar perlas de vidrio estériles para distribuir uniformemente „la suspensión sobre la placa. 29) Las placas se incuban a 30oC durante 12 a 24 horas . 30) Se observan las placas para ver las colonias. 31) Inocular una sola colonia en el medio líquido LB conteniendo el antibiótico adecuado, e incubar a 30°C durante 12 a 24 horas. 32) Se puede preparar un suministro de glicerol agregando glicerol al 80 por ciento en un cultivo líquido (15 por ciento por volumen/volumen) , y se almacena a -80°C. Verificación de la Actividad 7) Se transfieren 50 microlitros del cultivo líquido a un micro-tubo. Se agregan 500 microlitros de Amilopectina Azure al 8 por ciento, pH de 7, al mismo tubo. Se preparan dos tubos por cada clon. 8) Se prueba la actividad a 50°C durante 3 horas y durante la noche. Utilizar regulador a un pH de 7 como el control . 9) Enfriar la muestra de prueba en un baño de agua helada durante 5 minutos. 10) Agregar 750 microlitros de etanol, y mezclar completamente. 11) Centrifugar a 13,000 revoluciones por minuto (16,000 gs) durante 5 minutos. 12) Medir la OD del sobrenadante a 595 nanómetros . Análisis RFLP 13) Se transfiere 1.0 mi de cultivo líquido a un micro-tubo estéril. 14) Centrifugar a 13,200 revoluciones por minuto (16,000 gs) durante 1 minuto. 15) Desechar el sobrenadante. Agregar otro 1.0 mi de cultivo líquido al mismo micro-tubo estéril. 16) Centrifugar a 13,200 revoluciones por minuto (16,000 gs) durante 1 minuto. 17) Desechar el sobrenadante. 18) Seguir el protocolo del mini-estuche centrífugo QIAprep para el aislamiento del plásmido. 19) Verificar la concentración del ADN utilizando el BioPhotometer . 20) Utilizar Sac I y Kpn I para la primera digestión doble. Incubar a 37°C durante 1 hora. 21) Utilizar Pst I y Xho I para la segunda digestión doble. Incubar a 37oc durante 1 hora. 22) Agregar el tinte de carga a la muestra digerida. 23) Ejecutar la muestra digerida sobre un gel de agarosa al 1.0 por ciento durante 1 a 1.5 horas, a 120 voltios. 24) Ver el gel con el formador de imágenes en gel. Todos los clones con un patrón de digestión diferente se enviarán para el análisis de secuencia. EJEMPLO 19: Ensayo para Glucoaldolasas El siguiente ejemplo describe un método de ejemplo para determinar si un polipéptido está dentro del alcance de la invención . Preparación de los Cultivos de Huéspedes 5. Iniciar un cultivo nocturno de células huéspedes XLl-Blue MRF 1. Utilizar una sola colonia de cada placa rayada para inocular 10 mi de LB complementado con 20 microgramo/ml de tetraciclina . Hacer crecer el cultivo durante la noche, agitando a 37°C, durante cuando menos 16 horas. 6. Utilizando una técnica aséptica, inocular 100 mi frescos del cultivo del día LBTet con el huésped XLl-Blue MRF' a partir del cultivo nocturno de LBTet . 7. Hacer crecer en un agitador a 37°C hasta que la OD llegue a 0.75-1.0. 8. Granular las células huéspedes a 100,000 x g durante 10 minutos, y volver a suspender suavemente en MgS04 10 mM, a la OD5. 9. Diluir una pequeña cantidad de células huéspedes a la ODl para utilizarse en la titulación y en la herramienta de picos . 10. Se pueden utilizar preparaciones de huéspedes durante hasta una semana cuando se almacenen sobre hielo o a 4°C. Para reducir el tiempo de crecimiento para el cultivo del día, utilizar 1/2X la concentración Tet usual en LB (1/2X = 10 microgramos/ml) , u omitir el antibiótico totalmente. No utilizar NZY cuando se seleccione con tetraciclina . La alta concentración de Mg++ en el medio NZY hace que la Tet sea inactiva. Titulación de Bibliotecas Lambda 11. Colocar tres tubos microcentrífugos estériles en una rejilla. 12. Sacar alícuotas de 995 microlitros de células huéspedes preparadas en un tubo, y de 45 microlitros de células huéspedes OD1 preparadas en cada uno de los dos tubos restantes. 13. Agregar 5 microlitros de la biblioteca lambda al tubo que contiene 995 microlitros de células huéspedes, y mezclar mediante vórtex. Esto da como resultado un factor de dilución de 200. 14. Preparaciones diluciones de 1/2,000 y 1/20,000 agregando consecutivamente 5 microlitros de la dilución anterior a los dos tubos restantes que contienen 45 microlitros de células huéspedes preparadas. Mezclar mediante vórtex después de que se haga cada dilución. 15. Permitir que el fago se adsorba al huésped mediante incubación a 37oc durante 15 minutos. 16. Mientras tanto, pasar por pipeta 100 microlitros de células huéspedes OD1 preparadas, a cada uno de tres tubos Falcon 2059. 17. Agregar 5 microlitros de cada dilución a un tubo 2059 separado que contenga células huéspedes. 18. Poner cada una en placa agregando 3 mi de ágar superior a cada tubo, y verter rápidamente sobre placas NZY de 90 mm. Asegurar una distribución suave y uniforme antes de que se endurezca el ágar superior. 19. Invertir las placas e incubar a 37°c durante la noche . 20. Contar las placas y calcular la titulación del suministro de la biblioteca (en unidades formadoras de placas (pfu) por microlitro) . Rastreo de Microtitulación Lambda para Glucoaldolasas . Preparación 5. Preparar una cantidad suficiente de cultivo de huéspedes XLl-Blue MRF 1 , como se describe en lo anterior, para la cantidad de rastreo planeada. Un cultivo de 100 mi normalmente es suficiente para rastrear de 2 a 3 bibliotecas. 6. Pasar por autoclave varias botellas compatibles con el dosificador QFÍ112. Éstas son las botellas Corning de boca ancha, de 250 mi, que contienen un anillo sellador alrededor del labio . 7. Asegurarse de que haya suficientes cantidades de placas, ágar superior, almidón BODIPY, solución de almidón rojo, etcétera, disponibles para el rastreo. 8. Programar la ejecución del robot en el día 2 con un representante de la Automatización. Día 1 10. Marcar las placas de 1,536 pozos (negras) con el rastreo de la biblioteca y el número de placa. Las etiquetas de tubos Tough-Tags, cortadas a la mitad a lo ancho, son ideales para marcar las placas de 1,536 pozos. 11. Calcular los volúmenes de la biblioteca, de células huéspedes, y de medio NZY, necesarios para el rastreo. Esto se hace fácilmente con una hoja de cálculo Excel. 12. Combinar los volúmenes calculados de biblioteca lambda y células huéspedes OD5 en una botella Corning de boca ancha de 250 mi estéril (que contiene un anillo sellador) . 13. Permitir que se presente la adsorción a 37°c durante 15 minutos. 14. Agregar el volumen calculado de medio NZY, y mezclar bien. Esto es referido como la suspensión de células-fagos-medio . 15. Llevar a cabo una titulación concomitante combinando 50 microlitros de la suspensión de células-fagos-medio con 250 microlitros de células huéspedes OD1 en un tubo Falcon 2059, luego aplicar con 9 mi de ágar superior sobre una placa NZY de 150 mm. Incubar la placa de titulación concomitante a 37°C durante la noche. 16. Cargar el dosificador con el resto de la suspensión, y arreglar cada placa de 1,536 pozos marcada a 4 microlitros por pozo. Si el dosificador saca burbujas de aire en algunos pozos, se pueden remover mediante la centrifugación de las placas a 200 x g durante 1 minuto. 17. Agregar 0.5 microlitros de fago de control positivo a la posición del pozo AD46 de cuando menos dos de las placas de ensayo. Utilizar un clon lambda positivo para glucoaldolasa fuerte para este propósito. Las versiones lambda de las SEQ ID NO: 113 o SEQ ID NO: 199 son buenas elecciones para los controles positivos. 18. Incubar las placas de ensayo a 31°C durante la noche en una incubadora humidificada (>95 por ciento) . Día 2 21. Contar las unidades formadoras de placas sobre la placa de titulación concomitante, y determinar la densidad de siembra promedio por pozo (en unidades formadoras de placas por pozo) . 22. Poner los picos de cuando menos dos placas del rastreo de cada biblioteca (de preferencia las dos que contienen controles positivos) como sigue: a) preparar dos placas de pista de huésped para actuar como una superficie sobre la cual poner los picos: combinar 250 microlitros de células huéspedes OD1 con 2 mi de almidón rojo al 2 por ciento, y aplicar 9 mi de ágar superior sobre las placas NZY de 150 mm. Mantener cada placa tan nivelada como sea posible a medida que se solidifique el ágar superior, con el objeto de producir un matiz rojo uniforme a través de la placa . b) Utilizando una herramienta de picos de 1,536 posiciones esterilizada con flama dos veces, replicar cuando menos dos de las placas de rastreo sobre las placas de pistas de huéspedes . c) Colocar las placas receptoras de los picos en una campana de flujo laminar sin tapas durante aproximadamente 15 a 30 minutos (para ventilar el exceso de humedad) . d) Volver a colocar las tapas e incubar invertidas a 37°C durante la noche. 23. Preparar el regulador dé sustrato de almidón BODIPY como sigue: a) Calcular el volumen total de solución reguladora de sustrato 2X necesaria para rastrear las placas a 4 microlitros por pozo (incluyendo cualquier volumen de espacio muerto extra requerido por el dosificador) , y medir esta cantidad de CAPS 100 mM, pH de 10.4, en un recipiente apropiado para el dosificador utilizado. b) Recuperar suficientes tubos de 0.5 mg de almidón BODIPY para producir el volumen requerido de regulador de sustrato 2X [calculado en el paso a) anterior] en una concentración final de 20 a 30 microgramos/ml . c) Disolver cada tubo de 0.5 mg en 50 microlitros de sulfóxido de dimetilo a temperatura ambiente, protegido de la luz, con vórtex frecuente. Esto toma más de 15 minutos; algunos lotes de producción del almidón BODIPY se disuelven mejor que otros . d) Agregar 50 microlitros de regulador CAPS 100 m , pH de 10.4, a cada tubo, y mezclar mediante vórtex. e) Reservar el contenido de todos los tubos, y remover cualesquiera agregados no disueltos mediante centrifugación durante 1 minuto a la máxima velocidad en un microcentrífugo . f) Agregar el sobrenadante al resto del regulador CAPS 100 mM medido en el paso a) anterior. g) Proteger el regulador de sustrato 2X de la luz envolviendo en lámina. 24. Llevar las placas y el regulador de sustrato a la habitación de automatización, y programar el robot con los siguientes parámetros : a) Dosificar 4 microlitros de regulador de sustrato por pozo. b) Primera lectura a 1 hora después del sustrato, segunda lectura a las 9 horas, y tercera lectura a las 17 horas; con incubación a 37°C entre lecturas. c) Filtro de excitación: 485 nanómetros; filtro de emisión: 535 nanómetros. d) Establecer la ganancia del Spectrafluor a 70, o la ganancia óptima para el lote de regulador de sustrato 2X preparado . e) Asegurar que la incubadora utilizada proteja a las placas de ensayo de la luz. Día 3 4. Verificar las placas con picos para determinar las aclaraciones en la pista bacteriana en todas las posiciones correspondientes a los pozos en la placa de ensayo asociada. También verificar las aclaraciones en el almidón rojo en cualquiera de las posiciones de picos. Si se utilizaron las placas que contenían controles positivos para la herramienta de picos, debe ser capaz de ver una gran zona de aclaración en el fondo rojo. Tenga cuidado de los contaminantes que también forman zonas de aclaración en el almidón rojo (ver el comentario de "Contaminantes que Forman Zonas de Aclaración en el Almidón Rojo" ) . Identifique los impactos supuestos a partir del archivo de datos producido por la computadora del robot. El programa KANAL producido por Engineering simplifica el análisis de los datos. Como regla, un impacto supuesto se caracteriza como un pozo que tiene una intensidad de señal que se eleva cuando menos 1.5 veces sobre el fondo. Para cada supuesto, remover 2 microlitros del pozo, y agregar a un tubo que contenga 500 microlitros de regulador SM y 50 microlitros de CHC13. Poner en vórtex para mezclar, y almacenar a 4°C. Esta solución sera referida posteriormente en la presente como el suministro 4e-3. Las placas de rastreo originales se debe almacenar a 4°C, protegidas de la luz, cuando menos hasta que se terminen los descubrimientos. Éste es el método recomendado para descubrir impactos supuestos. Es un ensayo en fase líquida que se apoya en la confirmación de la actividad sobre el almidón BODIPY. De una manera alternativa, los impactos supuestos se pueden aplicar directamente sobre las placas en fase sólida que contengan almidón rojo, de tal manera que se examinen de 2,000 a 3,000 unidades formadoras de placas por impacto para las zonas de aclaración. Sin embargo, la incapacidad para observar zonas de aclaración sobre el almidón rojo no necesariamente es una indicación de que un impacto supuesto fuera un positivo falso. Entonces se necesitaría ensayar utilizando el formado en donde se identificó originalmente (es decir, fase líquida utilizando almidón BODIPY como el sustrato) . En adición, los positivos muy débiles se identifican muy fácilmente empleando el método detallado en seguida. Día 1 25. En un tubo cónico estéril de 50 mi, combinar 0.5 mi de células huéspedes OD5 con 45.5 mi de ZNY. Ésta será referida como la suspensión de huésped-medio. 26. Para cada impacto supuesto que se vaya a analizar, sacar una alícuota de 1 mi de suspensión de huésped-medio en cada uno de tres tubos microcentrífugos estériles. 27. Establecer la pipeta de 12 canales en el modo de multidosificación con un tamaño de alícuota de 20 microlitros, y un número de alícuotas de 2X. Montar la pipeta con un juego limpio de puntas estériles. 28. Verter aproximadamente 1 mi de suspensión de huésped-medio en un recipiente de solución estéril nueva, y cargar la pipeta de múltiples canales. 29. Dosificar 20 microlitros por pozo en la última fila (fila P) de una placa de 384 pozos negra (12 canales x 2 = 24 pozos) . Esta fila se utilizará posteriormente para los controles . 30. Expulsar el líquido restante en las puntas tocando las puntas contra la superficie del recipiente, y oprimir el botón de RESTABLECIMIENTO en la pipeta. Extender la pipeta de manera que se prevenga la contaminación de las puntas. No hay necesidad de cambiar las puntas en este punto. 31. Verter el resto del fluido en el recipiente, en un contenedor de desechos (como un vaso de precipitados) , teniendo cuidado de evitar una contaminación por salpicaduras. 32. Para el primer supuesto que se vaya a analizar, sacar 111 microlitros del suministro 4e-3 (ver el día 2 en el Rastreo de Microtitulación Lambda para Glucoaldolasas) , y agregarlos al primero en un conjunto de tres tubos que contengan 1 mi de suspensión de huésped-medio (paso 2) . Poner en vórtex para mezclar. Esta es la Dilución A. 33. Sacar 111 microlitros de la Dilución A, y agregarlos al siguiente tubo del conjunto. Poner en vórtex para mezclar. Esta es la Dilución B. 34. Sacar 111 microlitros de la Dilución B, y agregarlos al último tubo del conjunto. Poner en vórtex para mezclar. Esta la Dilución C. Ahora debe tener tres diluciones de fagos, en donde las concentraciones de cada una difieren por un factor de 10. 35. Verter el contenido de la Dilución® C (la más diluida de las tres muestras) en el recipiente de solución, y cargar la pipeta de múltiples canales. 36. Dosificar 20 microlitros por pozo en la primera fila de la placa de 384 pozos (12 canales x 2 = 24 pozos) . 37. Expulsar el líquido restante en las puntas tocando las puntas contra la superficie del recipiente, y oprimir el botón RESTABLECIMIENTO en la pipeta. Extender la pipeta de tal manera que se prevenga la contaminación de las puntas. No hay necesidad de cambiar las puntas en este punto. 38. Vaciar el recipiente como se describe en lo anterior. 39. Verter el contenido de la Dilución B en el mismo recipiente, y cargar la pipeta de múltiples canales. 40. Dosificar 20 microlitros por pozo en la segunda fila de la placa de 384 pozos. - 41. Llevar a cabo los pasos 13 a 16 de una manera similar, para dosificar la Dilución A en la tercera fila de la placa . 42. Después de que se hayan arreglado las tres diluciones en las primeras tres filas de la placa, desechar todas las puntas y el recipiente de solución en el contenedor de desechos biopeligrosos . 43. Montar la pipeta con un juego limpio de puntas estériles, y abrir un nuevo recipiente de solución estéril. 44. Repetir los pasos 8 a 19 para cada impacto supuesto restante, utilizando las filas restantes de la placa hasta la fila O. Se pueden analizar cinco impactos supuestos sobre una placa de 384 pozos, guardándose la última fila (fila P) para los controles . 45. Agregar 0.5 microlitros de cada control a un pozo separado. Utilizar cuando menos dos a tres controles separados, de preferencia cubriendo un intervalo de actividad. 46. Incubar las placas de ensayo a 37oC durante la noche en una incubadora humidificada (>.95 por ciento) . Día 2 47. Poner en la herramienta de picos todas las placas de descubrimiento sobre una pista de huéspedes con almidón rojo utilizando el mismo método descrito para el día 2 en el Rastreo de Microtitulación Lambda para Glucoaldolasas , excepto que se utiliza una herramienta de picos de 384 posiciones. 48. Preparar el regulador de sustrato' de almidón BODIPY 2X como sigue: a) Calcular el volumen total de solución reguladora de sustrato 2X necesaria para todas las placas de descubrimiento en 20 microlitros por pozo (incluyendo cualquier volumen de espacio muerto extra requerido por el dosificador) , y medir esta cantidad de CAPS 100 mM, pH de 10.4, en un recipiente apropiado para el dosificador utilizado. b) Recuperar suficientes tubos de 0.5 mg de almidón BODIPY para producir el volumen requerido de regulador de sustrato 2X [calculado en el paso a) anterior] , en una concentración final de 20 a 30 microgramos/ml . c) Disolver cada tubo de 0.5 mg en 50 microlitros de sulfóxido de dimetilo a temperatura ambiente, protegido de la luz, con vórtex frecuente. Esto toma más de 15 minutos; algunos lotes de producción de almidón BODIPY se disolverán mejor que otros . d) Agregar 50 microlitros de regulador CAPS 100 mM, pH de 10.4 a cada tubo, y mezclar mediante vórtex. e) Reservar el contenido de todos los tubos, y remover cualesquiera agregados no disueltos mediante centrifugación durante 1 minuto a la máxima velocidad en un microcentrífugo . f) Agregar el sobrenadante al resto del regulador CAPS 100 mM, medido en el paso a) anterior. g) Proteger al regulador de sustrato 2X de la luz envolviendo en lámina. 49. Dosificar 200 microlitros por pozo en todas las placas de descubrimiento. 50.. Envolver todas las placas en lámina de aluminio, e incubar a temperatura ambiente durante 2 a 6 horas. 51. Leer cada placa en el Spectrafluor con las siguientes posiciones: a) Lectura de fluorescencia (filtro de excitación: 485 nanómetros; filtro de emisión: 535 nanómetros) . b) Definición de placa: negra de 384 pozos. c) Lectura desde la parte superior. d) Ganancia óptima. e) Número de evaporaciones instantáneas: 3. 52. En la hoja de cálculo Excel resultante, diagramar cada una de las tres filas de supuestos en una gráfica separada, y verificar la actividad. Asegurarse de que los controles positivos produzcan señales sobre el fondo. 53. Por cada supuesto que parezca tener una señal real entre los pozos, cosechar una muestra a partir de un pozo positivo como sigue: a) Seleccionar un pozo positivo a partir de una fila que represente la dilución inicial más alta. b) Transferir 2 microlitros de ese pozo a un tubo que contenga 500 microlitros de SM y 50 microlitros de CHC13. Ésta es referida como la solución de descubrimiento. c) Almacenar a 4°C. 54. Empleando los métodos previamente descritos, aplicar aproximadamente 10 microlitros de cada suministro de descubrimiento sobre las placas NZY de 150 mm, utilizando almidón rojo. El objetivo es obtener varias (cuando menos 20) placas bien separadas a partir de las cuales sacar los aislados. Día 3 55. Verificar las placas con picos para determinar una incidencia aceptable de aclaraciones en la pista bacteriana correspondientes a los pozos en la placa de ensayo asociada. También verificar si hay aclaraciones en el almidón rojo en los controles positivos y en cualesquiera supuestos probados. Tener cuidado de los contaminantes que también forman zonas de aclaración en el almidón rojo (ver más adelante) . 56. A partir de las placas en fase sólida que contienen diluciones de los suministros de descubrimiento, sacar varias placas aisladas, cada una en 500 microlitros de SM con 50 microlitros de CHC13. Éste es referido como el suministro de aislados . 57. Los suministros de aislados se pueden entonces probar individualmente sobre el almidón BODIPY empleando los métodos descritos anteriormente. Este paso se puede saltar si la placa que se sacó en el paso 2 produjo una zona de aclaración en el fondo de almidón rojo. Los suministros de aislados se pueden probar entonces individualmente sobre el almidón BODIPY empleando los métodos descritos en lo anterior. Sin embargo, este paso se puede saltar si la placa que se sacó en el paso 2 produjo una zona de aclaración en el fondo de almidón rojo. Separaciones Día 1 58. En un tubo Falcon 2059, mezclar 200 microlitros de huésped ODl XLl-Blue MRF 1 , 100 microlitros de suministro de aislados lambda, y 1 microlitro de suministro de fagos ExAssist. 59. Incubar en un agitador a 37°C durante 15 minutos. 60. Agregar 3 mi del medio NZY. 61. Incubar en un agitador a 30°C durante la noche.
Día 2 10. Calentar el tubo de separación a 70°C durante 20 minutos 11. Centrifugar a 1,000 x g durante 10 minutos. 12. En un tubo Falcon 2059, combinar 50 microlitros del sobrenadante con 200 microlitros del huésped Exp 505 ODl. 13. Incubar en un agitador a 37oc durante 15 minutos. 14. Agregar 300 microlitros del medio SOB. 15. Incubar en un agitador a 37°C durante 30 a 45 minutos . 16. Aplicar 50 microlitros en la placa de LBKan50 grande utilizando perlas de vidrio estériles. Si las placas están "secas", se puede agregar medio SOB extra para ayudar a desalojar las células. 17. Incubar la placa a 30°C durante cuando menos 24 horas . 18. Cultivar un aislado para la secuenciación y/o RFLP. El crecimiento a 30°C reduce el número de copias del plásmido, y se utiliza para mitigar la toxicidad aparente de algunos clones de glucoaldolasa. Contaminantes que Forman Zonas de Aclaración en el Almidón Rojo Cuando se utiliza almidón rojo sobre un medio sólido para ensayar el fago para la actividad de glucoaldolasa, es común ver unidades formadoras de colonias (cfu) contaminantes que forman zonas de aclaración en el almidón rojo. Para las placas con picos, es importante distinguir los clones de fagos positivos para glucoaldolasa de estos contaminantes, siempre que queden alineados con una posición de pozo particular. La fuente de los microbios contaminantes presumiblemente es la solución de suministro de almidón rojo al 2 por ciento, la cual no se puede esterilizar pasándola por autoclave o filtrándola después de la preparación. Se piensa que son organismos oportunistas que sobreviven metabolizando el almidón rojo. Con el objeto de reducir estos contaminantes, utilizar la técnica estéril cuando se hagan las soluciones de almidón rojo al 2 por ciento, y almacenar los suministros ya sea a 4oC, o sobre hielo. Ensayo Utilizando Almidón RBB Se pueden agregar 75 microlitros de sustrato de almidón RBB (almidón de maíz insoluble RBB al 1 por ciento en regulador de NaAc 50 mM, pH=4.5) a cada pozo de una placa nueva de 96 pozos (fondo-V) . Se pueden transferir 5 microlitros del lisado enzimático a cada pozo con sustrato, utilizando Biomek o Zymark. Las placas se pueden sellar con cinta selladora de aluminio, y se agitan brevemente sobre el agitador. Las placas se pueden incubar a 90°C durante 30 minutos, seguido por enfriamiento a temperatura ambiente durante aproximadamente' 5 a 10 minutos. Se agregan 100 microlitros de etanol al 100 por ciento a cada pozo, las placas se sellan y se sacuden brevemente en el agitador. Luego las placas se centrifugan a 4,000 revoluciones por minuto durante 20 minutos, utilizando el centrífugo de mesa. Se transfieren 100 microlitros del sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos (de fondo plano) mediante Biomek y se lee la OD595. Ensayo Utilizando Almidón-FITC Se agregan 50 microlitros del sustrato (almidón-FITC al 0.01 por ciento en regulador de NaAc 100 mM, pH = 4.5) a cada pozo de una placa nueva de 384 pozos. Se transfieren 5 microlitros del lisado enzimático a cada pozo con sustrato, y se incuba la placa a temperatura ambiente durante la noche. Se lee el cambio de polarización del sustrato, excitación a 485 nanómetros, emisión a 535 nanómetros, para cada pozo. Se pueden utilizar placas de 96 pozos para todos los ensayos. EJEMPLO 20: Protocolo de Ejemplo para Licuar el Almidón, y Resultados de la Medición El siguiente ejemplo describe un protocolo de ejemplo para licuar el almidón. Condiciones de reacción: P04 100 mM, pH de 6.5, almidón licuado DE12 al 1 por ciento (peso/peso) a 55°C. Ambos ensayos de TLC y HPLC se pueden hacer para verificar la actividad . Un protocolo de ejemplo para la sacarificación del almidón licuado a un pH de 6.5: Ajustar el pH del almidón licuado al pH en el cual se llevarán a cabo las sacarificaciones. Licuar el almidón en un regulador de acetato de sodio 100 mM, pH de 4.5, agregándose sales de fosfato de sodio 100 mM, de tal manera que, antes de la sacarificación, se pueda ajustar el pH a 6.5. Pesar muestras de 5 g de almidón licuado en botellas destaradas. Utilizar Optidex L-400 al 0.04 por ciento (peso/peso) , o aproximadamente 400 mi de Optidex L-400 de suministro diluido a 1-10 por 100 g de almidón licuado. Calcular los mg de Optidex L-400 contenidos en los 400 mi de Optidex L-400 de suministro diluido a 1-10. En seguida, calcular el volumen de lisados necesarios para dar la misma concentración de enzima que el Optidex L-400. Agregar las enzimas a las muestras de almidón licuado, e incubar a la temperatura deseada (50°C) . Después de 18 horas, determinar el equivalente de dextrosa, y preparar una muestra para el análisis de HPLC.
Una Determinación del Equivalente de Dextrosa de Ejemplo: Ensayo de Neocuproína de Ejemplo-. Se puede agregar una muestra de 100 mi a 2.0 mi de solución de neocuproína A (40 g/litro de carbonato de sodio, 16 g/litro de glicina, 0.45 g/litro de sulfato de cobre) . A esto se pueden agregar 2.0 mi de solución de neocuproína B (1.2 g/litro de clorhidrato de neocuproína - Sigma N-162S) . Los tubos se pueden mezclar y calentar en un baño de agua en ebullición durante 12 minutos; se enfrían, se diluyen hasta un volumen de 10 mi con agua desionizada, y se lee la OD a 450 nanómetros en el espectrofotómetro . El equivalente de glucosa en la muestra se puede extrapolar a partir de la respuesta de un estándar de 0.2 mg/ml de glucosa ejecutado de una manera simultánea. Análisis de HPLC de Ejemplo: Los perfiles de carbohidratos de la sacarificación se miden mediante HPLC (columna Bio-Rad Aminex HPX-87A en forma de plata, 80°c) , utilizando la detección del índice de refracción. La fase móvil es agua illipore filtrada utilizada a una velocidad de flujo de 0.7 ml/minuto. Las muestras de sacarificación se diluyen a 1-10 con agua desionizada acidificada (5 gotas de HCL 6M en 200 mi de agua desionizada) , y luego se filtran a través de un filtro de jeringa de 0.45 mm. El volumen de inyección es de 20 microlitros. TLC de Ejemplo: Los productos de reacción se pueden pesar en puntos del tiempo por hora, y se manchan y se secan sobre una placa de TLC. La placa se puede revelar entonces en 10:90 de agua : isopropanol , y se visualiza ya sea con un teñido de vainillina o bien con un teñido de CA , y luego se calienta para mostrar los azúcares reductibles. El almidón licuado se puede hidrolizar parcialmente hasta glucosa en los casos en donde se observe actividad. EJEMPLO 21: Licuefacción de Almidón Utilizando Glucoaldolasas Este ejemplo describe un método de ejemplo de la invención para licuar el almidón utilizando las glucoaldolasas de la invención. El concentrado de glucoaldolasa se puede preparar a partir de caldos de fermentación mediante tratamiento por calor, lavado de células, extracción alcalina utilizando microfiltración y ultrafiltración (rendimiento global del 48 por ciento) . El concentrado de UF se puede neutralizar con ácido acético, y se puede formular con glicerol al 30 por ciento, a un pH de 4.5. El nivel de actividad de un producto comercial puede ser de aproximadamente 120 u - 0.5 kg/tonelada de almidón. Ensayo de Actividad de Glucoaldolasa de Ejemplo Una cubeta de 1 mi que contiene 950 microlitros de MOPS 50 mM, pH de 7.0, conteniendo ???-a-D-hexa- ( 1-4 ) -glucopiranosida 5 mM, se coloca en el controlador de temperatura Peltier del espectrofotómetro Beckman DU-7400 previamente calentado a 80°C. El espectrofotómetro se pone en blanco a 405 nanómetros, y se agregan 50 microlitros de la solución enzimática a la cubeta, se mezcla bien, y se monitorea el incremento en la OD405nm durante un intervalo de 1 minuto. El índice AOD405nm/min se convierte a una unidad estándar de micromoles/minuto a partir de la respuesta de OD4osnm de 50 microlitros de 1 micromol/ml de PNP en 950 mi de OPS 50 m a un pH de 7.0 y a 80°C. Una unidad estándar de alfa-glucoaldolasa termoestable (DTAA) es igual a la cantidad de enzima que catalizará la liberación de 1 micromol/ml/minuto de PNP bajo las condiciones definidas del ensayo. Ensayo de Actividad de Glucoaldolasa Estándar Una cubeta de 1 mi que contiene 950 microlitros de MOPS 50 mM, pH de 7.0, conteniendo pNP-a-D-glucopiranosida 5 mM, se coloca en el controlador de temperatura Peltier del espectrofotómetro Beckman DU-7400, previamente calentado a 60°C. El espectrofotómetro se pone en blanco a 405 nanómetros, y se agregan 50 microlitros de la solución enzimática a la cubeta, se mezclan bien, y se monitorea el incremento en la OD405nm durante un intervalo de 1 minuto. El índice OD405nm/min se convierte a una unidad estándar de micromoles/minuto a partir de la respuesta de OD405nm de 50 microlitros de 1 micromol/ml de PNP en 950 mi de MOPS 50 mM a un pH de 7.0 y a 60oc. Una unidad Diversa Estándar de Glucoaldolasa (DGA) es igual a la cantidad de enzima que catalizará la liberación de 1 micromol/ml/minuto de PNP bajo las condiciones definidas del ensayo. Determinación del Equivalente de Dextrosa Se utiliza el método de neocuproína para medir el equivalente de dextrosa. Las muestras seleccionadas se midieron tanto mediante el procedimiento de la invención, como mediante un analizador de GPC utilizando el procedimiento de Fehlings de GPC. Ensayo de Neocuproína Se agrega una muestra de 100 microlitros a 2.0 mi de solución de neocuproína A (40 g/litro de carbonato de sodio, 16 g/litro de glicina, 0.45 g/litro de sulfato de cobre) . A esto se le agregan 2.0 mi de solución de neocuproína B (1.2 g/litro de clorhidrato de neocuproína-Sigma N-1626) . Los tubos se mezclan y se calientan en un baño de agua en ebullición durante 12 minutos; se enfrían, se diluyen hasta un volumen de 10 mi con agua desionizada, y se lee la OD a 450 nanómetros en el espectrofotómetro . El equivalente de glucosa de la muestra se extrapola a partir de la respuesta de un estándar de 2.0 mg/ml de glucosa ejecutado de una manera simultánea. La muestra de almidón se diluye de aproximadamente 1 a 16 con agua desionizada, registrándose la dilución exacta. Se agregan 10 mi de la muestra diluida a 20 mi de agua desionizada. Se agregan 10 mi de solución de Fehlings A y B al almidón diluido. La muestra se hierve durante 3 minutos, y se enfría sobre hielo. Se agregan 10 mi de Ki al 30 por ciento, y 10 mi de H2S04 6N. La solución se titula contra tiosulfato de sodio 0.1N. El volumen de titulación se registra y se utiliza para calcular el equivalente de dextrosa. Determinación de Almidón Residual Se verificaron las muestras posteriores a la sacarificación para determinar el almidón residual utilizando el procedimiento de yodo de Staley. Se pesan 20 g de muestra en un plato para pesar grande. Se agregan 45 microlitros de la solución de yodo al plato para pesar, y se mezcla bien la solución de almidón. El azul oscuro indica la presencia de almidón, un azul-verde claro indica ligero almidón, el verde claro indica una traza de almidón, y el amarillo-rojo una ausencia de almidón. La solución de yodo se prepara disolviendo 21.25 g de yodo y 40.0 g de yoduro de potasio en 1 litro de agua. Perfil de Oligosacárido Se midieron los perfiles de carbohidratos de la licuefacción y la sacarificación mediante HPLC (Columna Bio-Rad Aminex HPX-87C en forma de calcio - 80°c) utilizando la detección del índice de refracción. Cromatografía de Permeación de Gel Se determina la distribución de peso molecular mediante cromatografía sobre una columna PL Aquagel-OH con detección de masa mediante índice de refracción (Waters Modelo 2410) . Se utiliza un detector Viscotek Modelo T60 para las mediciones continuas de viscosidad y dispersión de luz. Electroforesis Capilar Sistema de glicoproteína Beckman Coulter P/ACE MDQ separación de oligosacáridos derivados de APTS sobre un capilai de sílice fusionado - detección mediante fluorescencia inducida por láser. Licuefacción Primaria Se bombea el almidón de línea directamente a partir del proceso de GPC en un tanque de alimentación de 60 litros en donde se puede ajustar el pH, DS (sólidos secos) y el nivel de calcio antes de la licuefacción. Se agrega la glucoaldolasa a la pasta. La pasta de sólidos secos al 32 por ciento se bombea a 0.7 litros/minuto mediante una bomba de desplazamiento positivo hacia el chorro - una cámara mezcladora presurizada en donde la pasta de almidón se calienta instantáneamente hasta más de 100°C mediante inyección de vapor. El almidón parcialmente licuado y gelatinizado se bombea a través de una red de tubos (todavía bajo presión), para dar el tiempo de alojamiento deseado (5 minutos) a la. temperatura. La presión se libera en un tanque de evaporación instantánea, y se pueden tomar las muestras. Las muestras se toman por duplicado. Licuefacción Secundaria El almidón licuado se recolecta en botellas de vidrio de 1 litro, y se mantiene en un baño de agua a 95°C durante 90 minutos . Sacarificación El almidón licuado se enfría a 60°C, se ajusta el pH a 4.5, y las muestras se tratan con glucoaldolasa. El progreso de la sacarificación se monitorea a través del tiempo mediante HPLC. Sacarificación Los jarabes licuados producidos con cada glucoaldolasa se ajustaron a aproximadamente un pH de 2.5 con HC1 6N inmediatamente después de la licuefacción secundaria de 90 minutos, para inactivar cualquier glucoaldolasa residual. Luego los jarabes se ajustaron a un pH de 4.5 , se pusieron en un baño de agua a 60°C, y se sacarificaron con tres niveles de glucoaldolasa. El grado de sacarificación se monitorea mediante HPLC en los puntos del tiempo de 18 a 88 horas. Los jarabes licuados se sacarificaron con la dosificación estándar - 0.04 por ciento de una glucoaldolasa de doble concentración - y dos dosificaciones más bajas (50 por ciento y 25 por ciento) , para monitorear cualesquiera diferencias en el progreso de la sacarificación. Progreso de la Sacarificación - Porcentaje de desarrollo de dextrosa contra el tiempo - 0.04 por ciento de glucoaldolasa . EJEMPLO 22: Licuefacción de Almidón a un pH de 4.5 Utilizando Glucoaldolasas La conversión del almidón hasta glucosa se puede catalizar mediante la acción en secuencia de dos enzimas: aldolasas (por ejemplo, alfa-aldolasas) , incluyendo las enzimas de la invención, para licuar el almidón (por ejemplo, la hidrólisis de los polímeros de glucosa de alto peso molecular hasta los oligosacáridos consistentes en 2 a 20 unidades de glucosa, típicamente un equivalente de dextrosa de 10 a 12, mediante una glucoaldolasa de la invención) , seguida por sacarificación con glucoaldolasa (que puede ser una glucoaldolasa de la invención, por ejemplo la SEQ ID NO: 594) . En un aspecto, el procesamiento se hace en una planta de molienda húmeda de maíz, produciendo una pasta de almidón que tiene un pH de aproximadamente 4.0 a 4.5. En un aspecto, se eleva el pH, por ejemplo de 5.8 a 6.0, antes de la licuefacción, para acomodar una glucoaldolasa con una baja actividad y estabilidad del pH. En un aspecto, las glucoaldolasas de la invención pueden licuar almidón a un pH de 4.5 hasta equivalentes de dextrosa en el intervalo de 12 a 18; en un aspecto, se utilizan las glucoaldolasas de la invención en niveles de aproximadamente 3 a 6 g por tonelada de almidón. En este aspecto, la utilización de las glucoaldolasas de la invención hace posible que se conduzca la licuefacción del almidón a un pH de 4.5. En un aspecto, la licuefacción del almidón se conduce a un pH de 4.5 durante 5 minutos a 105°C, hasta 90 minutos a 95°c utilizando las glucoaldolasas de la invención. La cantidad de enzima se ajusta con el objeto de ajustar el equivalente de dextrosa objetivo de 12 a 15 después de la licuefacción. En un aspecto, se sacarifica entonces el almidón licuado con una glucoaldolasa, por ejemplo una glucoaldolasa de Aspergillus , durante aproximadamente 48 horas a aproximadamente un pH de 4.5 y a 60oC. si el jarabe sacarificado no contuvo cuando menos el 95 por ciento de glucosa, se eleva el equivalente de dextrosa de licuefacción objetivo, y se repite la sacarificación hasta que la licuefacción eventualmente produzca un jarabe sacarificado que contenga más del 95 por ciento de glucosa. La proteína de glucoaldolasa requerida para producir un suministro de alimentación licuado adecuado para la sacarificación, se determina mediante PAGE . En otro aspecto, las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención se puede suministrar mediante la expresión de las enzimas directamente en los cultivos de alimentos transgénicos (como, v.gr., plantas y semillas transgénicas , y similares), tales como granos, cereales, maíz, frijol de soja, semilla de colza, lupina, y similares. Como se describió anteriormente, la invención proporciona plantas, partes de plantas, y células de plantas transgénicas, las cuales comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. En un aspecto, el ácido nucleico se expresa de tal manera que se produce la glucanasa de la invención en cantidades recuperables. Las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención pueden ser recuperadas a partir de cualquier planta o parte de planta. De una manera alternativa, la planta o la parte de planta que contenga el polipéptido recombinante , se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o material alimenticio, v.gr., para mejorar el valor nutricional, el sabor, y las propiedades reológi'cas, o para destruir un factor anti -nutritivo . En un aspecto, la invención provee métodos para remover oligosacáridos de alimentos antes de consumo por un sujeto animal usando las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención. En este proceso se forma un alimento que tiene un valor incrementado de energía susceptible de metabolizarse . En adición a glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención, pueden usarse galactosidasas , celulasas o sus combinaciones. En un aspecto, la enzima es añadida en una- cantidad igual a entre alrededor de 0.1 y 1% por peso del material alimenticio. En un aspecto, el alimento es un material de cereal, trigo, grano, frijol de soja (v.gr., frijol de soja molido). Ver, v.gr., la patente US 6,399,123. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para utilizar glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención como un suplemento nutricional en las dietas de los animales, preparando un suplemento nutricional que contiene una enzima recombinante de la invención, y administrando el suplemento nutricional a un animal para incrementar la utilización del glucano contenido en los alimentos ingeridos por el animal. En todavía otro aspecto, la invención proporciona una matriz de entrega de enzimas comestible, en perlas, y un método de uso para la entrega de glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención a un animal, por ejemplo como un suplemento nutricional. La matriz de entrega de enzimas libera fácilmente una enzima glucanasa, tal como una teniendo una secuencia de aminoácidos de la invención, o al menos 30 aminoácidos contiguos de la misma, en medio acuoso, tal como, por ejemplo, el fluido digestivo de un animal. La matriz de entrega de enzimas de la invención es preparada a partir de un portador comestible granulado seleccionado de componentes tales como germen de granos que está desprovisto de aceite, paja, alfalfa, timoteo, cáscara de soja, harina de semillas de girasol, harina de trigo, y similares, que disperse fácilmente la enzima recombinante ahí contenida en un medio acuoso. En uso, la matriz de entrega de enzimas comestible, en perlas, es administrada a un animal para entrega de la glucanasa al animal . Sustratos adecuados a base de granos pueden comprender o ser derivados de cualquier grano comestible adecuado, tal como trigo, maíz, soja, sorgo, alfalfa, cebada, y similares. Un sustrato ejemplar a base de grano es un sustrato a base de maíz. El sustrato, puede ser derivado de cualquier parte adecuada del grano, pero es en un aspecto un germen de grano aprobado para uso en alimentos para animales, tal como germen de maíz que se obtiene en un proceso de molienda en húmedo o en seco. El germen de grano en un aspecto comprende germen gastado, que es germen de grano del cual se ha extraído el aceite, tal como por medio de prensado o extracción con hexano u otro solvente. De manera alternativa, el germen de grano es extraído en un dispositivo de expulsión, es decir el aceite ha sido removido mediante prensado. La matriz de entrega de enzimas de la invención está en la forma de varias partículas discretas, perlas o gránulos. Por "gránulos" se quiere decir partículas que son comprimidas o compactadas, tales como por formación de perlas, extrusión o compactacion similar para remover agua de la matriz. Tal compresión o compactacion de las partículas también promueve la cohesión intra-partículas de las partículas. Por ejemplo, los gránulos pueden ser preparados formando el sustrato a base de granos en perlas en un molino de perlas. Las perlas preparadas con ello son molidas o desmenuzadas a un tamaño de gránulo adec.uado para uso como un adyuvante en un alimento para animales. Como la matriz está aprobada por sí misma para uso en alimentos para animales, puede usarse como diluyente para la entrega de enzimas en alimentos para animales. En un aspecto, la matriz de entrega de enzimas está en la forma de gránulos teniendo un tamaño de gránulo que varía de alrededor de 4 a alrededor de 400 de malla (USS) ; mas en un aspecto, alrededor de 8 a alrededor de 80 de malla; y en un aspecto alrededor de 14 a alrededor de 20 de malla. Si el germen de grano es gastado vía extracción con solventes, puede ser necesario el uso de un agente de lubricidad, tal como aceite de maíz en el dispositivo de formación de perlas, pero ordinariamente no es necesario tal agente de lubricidad si el germen es extraído en un dispositivo de expulsión. En otros aspectos de la invención, la matriz es preparada por otros procesos de compactacion o compresión tales como, por ejemplo, mediante extrusión del sustrato a base de granos a través de un troquel y la molienda del extrudido a un tamaño de gránulo adecuado . La matriz de entrega de enzimas puede además incluir un componente polisacárido como un agente de cohesión para acrecentar la cohesión de los gránulos de la matriz. Se cree que el agente de cohesión proporciona grupos hidroxilo adicionales, que acrecientan el enlace entre proteínas de grano dentro del gránulo de matriz. Se cree además que los grupos hidroxilo adicionales funcionan de modo de acrecentar el enlace hidrógeno de proteínas al almidón y a otras proteínas. El agente de cohesión puede estar presente en cualquier cantidad adecuada para acrecentar la cohesión de los gránulos de la matriz de entrega de enzimas. Agentes de cohesión adecuados incluyen uno o mas de dextrinas, maltodextrinas , almidones, tales como almidón de maíz, harinas, materiales celulósicos, hemicelulósicos , y similares. Por ejemplo, el porcentaje de germen de grano y el agente de cohesión en la matriz (no incluyendo la enzima) es de 78% de harina de germen de maíz y 20% por peso de almidón de maíz. Debido a que la matriz de liberación de enzimas de la invención es hecha a partir de materiales biodegradables , la matriz puede estar sujeta a descomposición, tal como por enmohecimiento . Para prevenir o inhibir tal enmohecimiento , la matriz puede incluir un inhibidor de moho, tal como una sal propionato, que puede estar presente en cualquier cantidad suficiente para inhibir el enmohecimiento de la matriz que libera enzimas, así proporcionando una matriz de entrega en una formulación estable que no requiere de refrigeración. La enzima glucanasa contenida en la matriz de entrega de enzimas y los métodos de la invención en un aspecto es una glucanasa termo-estable, como se describe en la presente, de modo de resistir la inactivación de la glucanasa durante la manufactura donde pueden emplearse temperaturas elevadas y/o vapor de agua para preparar la matriz de entrega de enzimas de perlas. Durante la digestión del alimento conteniendo la matriz de entrega de enzimas de la invención, los fluidos digestivos acuosos ocasionarán liberación de la enzima activa. Otros tipos de enzimas termo-estables y suplementos nutricionales que son termo-estables pueden también ser incorporados en la matriz de entrega para liberación bajo cualquier tipo de condiciones acuosas . Puede aplicarse un revestimiento a las partículas de la matriz de entrega de enzimas de la invención para muchos propósitos diferentes, tales como para añadir un sabor o un suplemento nutricional al alimento para animales, para retrasar la liberación de los suplementos y enzimas para el alimento para animales en condiciones gástricas, y similares. 0 el revestimiento puede ser aplicado para lograr una meta funcional, por ejemplo siempre que sea deseable hacer mas lenta la liberación de la enzima a partir de las partículas de matriz o para controlar las condiciones bajo las cuales la enzima será liberada. La composición del material de revestimiento puede ser tal que sea desintegrada de manera selectiva por un agente al que sea susceptible (tal como calor, ácido o base, enzimas u otros productos químicos) . De manera alternativa, dos o mas revestimientos susceptibles a diferentes agentes de desintegración pueden ser aplicados de manera consecutiva a las partículas de la matriz. La invención también está dirigida a un proceso para preparar una matriz de liberación de enzimas. De acuerdo con la invención, el proceso comprende proveer varias partículas discretas de un sustrato a base de grano en un tamaño de partícula adecuado para uso como una matriz que libera enzimas, donde las partículas comprenden una enzima glucanasa codificada por una secuencia de aminoácidos de la invención. En un aspecto, el proceso incluye compactar o comprimir las partículas de la matriz que libera enzimas en gránulos, lo que en un aspecto es logrado por formación de perlas. El agente de cohesión e inhibidor de moho, cuando se usa, puede ser añadido en cualquier momento adecuado, y en un aspecto es mezclado con el sustrato a base de grano en las proporciones deseadas antes de formación en perlas del sustrato a base de grano. El contenido de humedad en la alimentación al molino de perlas en un aspecto está en el rango de alrededor de 14-15%. En un aspecto, la humedad es añadida al material de alimentación en la forma de una preparación acuosa de la enzima para llevar el material de alimentación a este contenido de humedad. La temperatura en el molino de perlas en un aspecto es llevada a alrededor de 82 °C con vapor de agua. El molino de perlas puede ser operado bajo cualesquiera condiciones que impartan suficiente trabajo al material de alimentación para proveer perlas. El proceso de formación de perlas mismo es un proceso efectivo en costos para remover agua de la composición que contiene enzimas. En un aspecto, el molino de perlas es operado con un troquel de 1/8 por 2 in (0.317 a 5.08 cm) a una presión de 100 libras/min (45.36 kg/min) a 82°C, para proveer perlas, que entonces son desmenuzadas en un desmenuzador de molino de perlas para proveer varias partículas discretas teniendo un tamaño particular capaz de pasar a través de un tamiz de 8 de malla pero ser retenidas en un tamiz de 20 de malla. Las glucanasas, mananasas o xilanasas termo-estables de la invención pueden ser usadas en las perlas de la invención. Pueden tener temperaturas elevadas óptimas y alta resistencia al calor tal que una reacción enzimática a una temperatura a la que no se ha llevado a cabo hasta ahora pueda ser lograda. El gen que codifica la glucanasa de acuerdo con la presente invención (v.gr., como se señala en cualquiera de las secuencias de la invención) puede ser usado en la preparación de las glucanasas, mananasas o xilanasas (v.gr., usando GSSM, como se describe en la presente) teniendo características diferentes de aquéllas de las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención (en términos de pH óptimo, temperatura óptima, resistencia al calor, estabilidad a solventes, actividad específica, afinidad por el sustrato, capacidad de secreción, tasa de traducción, control de transcripción y similares) . A mayor abundamiento, un polinucleótido de la invención puede ser empleado para análisis y selección de glucanasas, mananasas o xilanasas variantes preparadas por medio de los métodos descritos en la presente para determinar aquéllas que tienen una actividad deseada, tal como una termo-estabilidad o termo-tolerancia mejoradas o modificadas. Por ejemplo, la patente US 5,830,732 describe un ensaye de análisis y selección para determinar la termo-tolerancia de una glucanasa. En un aspecto, las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención en alimentos para animales son activas en el estómago del animal. De esta manera, en un aspecto, una enzima de la invención, v.gr., en un alimento, tiene una actividad a alrededor de 37°C y un bajo pH para animales mono-gástricos (pH 2-4) y pH casi neutro para rumiantes (pH 6.5-7) . La enzima de la invención tiene resistencia a enzimas del intestino del animal, v.gr., proteasas, y estabilidad a las mayores temperaturas implicadas en la formación de perlas de alimentos. En un aspecto, las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención son usadas en aditivos para alimentos, v.gr., alimentos para mono-gástricos, y pueden tener una actividad específica, v.gr., actividad a 35-40°C y un pH de 2-4, una vida media mayor de 30 minutos en SGF y una mida media mayor de 5 minutos a 85 °C en estado formulado. Para alimentos para rumiantes, las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención en aditivos para alimentos tienen una alta actividad específica, v.gr. , actividad a 35-40°C y un pH de 6.5-7.0, una vida media mayor de 30 minutos en SRF y estabilidad como un polvo seco concentrado. Los procesos para producción de alimentos para animales de la invención pueden incluir cualquier combinación de otras enzimas tales como catalasas, otras glucanasas, celulasas, endoglicosidasas , endo-beta-1, 4 -glucanasas , amiloglucosidasas , isomerasas de glucosa, glicosiltransferasas , lipasas, fosfolipasas , lipo-oxigenasas , beta-glucánasas , endo-beta- 1 , 3 (4 ) -glucanasas, cutinasas, peroxidasas, lacasas, aldolasas, glucoaldolasas , petinasas, reductasas, oxidasas, descarboxilasas , fenoloxidasas , ligninasas, pululanasas, fitasas, arabinanasas , hemicelulasas , otras mananasas, xiloglucanasas , xilanasas, acetil esterasas de pectina, acetil esterasas de ramnogalacturonano, poligalacturonasas , ramnogalacturonasas , galactanasas , liasas de pectato, transglutaminasas , metilestarasas de pectina, celobiohidrolasas y/o transglutaminasas. Tratamiento de Desechos Las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención se pueden utilizar en una variedad de otras aplicaciones industriales, v.gr., en el tratamiento de desechos (en adición a, v.gr., conversión de bio-masa en combustibles) . Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona un proceso de digestión de desechos sólidos utilizando las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención. Los métodos pueden comprender reducir la masa y el volumen del desecho sólido sustancialmente no tratado. El desecho sólido se puede tratar con un proceso digestivo enzimático en la presencia de una solución enzimática (incluyendo las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención) a una temperatura controlada. Esto da como resultado una reacción sin una fermentación bacteriana apreciable por los microorganismos agregados. El desecho sólido se convierte en un desecho licuado y cualquier desecho sólido residual. El desecho licuado resultante se puede separar del desecho solidificado residual . Ver, v.gr., la patente US 5,709,796. Los procesos de tratamiento de desechos de la invención pueden incluir el uso de cualquier combinación de otras enzimas tales como catalasas, otras glucanasas, celulasas, endoglicosidasas , endo-beta- 1 , 4 -glucanasas , amiloglucosidasas , isomerasas de glucosa, glicosiltransferasas , lipasas, fosfolipasas , lipo-oxigenasas , beta-glucanasas , endo-beta- 1 , 3 (4 ) -glucanasas, cutinasas, peroxidasas, lacasas, aldolasas, glucoaldolasas , petinasas, reductasas, oxidasas, descarboxilasas , fenoloxidasas , ligninasas, pululanasas, fitasas, arabinanasas , hemicelulasas , otras mananasas , xiloglucanasas , xilanasas, acetil esterasas de pectina, acetil esterasas de ramnogalacturonano, poligalacturonasas , ramnogalacturonasas , galactanasas, liasas de pectato , transglutaminasas , metilestarasas de pectina, celobiohidrolasas y/o transglutaminasas. Productos para el Cuidado Oral La invención proporciona un producto para el cuidado oral, el cual comprende las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención. Los productos para el cuidado oral de ejemplo incluyen pastas dentales, cremas dentales, geles o polvos para dientes, odónticos, enjuagues bucales, formulaciones de enjuague para antes o después de cepillarse, gomas de mascar, grageas, o dulces. Ver, v.gr., la patente US 6,264,925. Los productos para el cuidado oral de la invención pueden incluir cualquier combinación de otras enzimas tales como proteasas, peptidasas, proteinasas, oxidasas de glucosa, peroxidasas, glucanasas, celulasas, endoglicosidasas , endo-beta-1 , 4 -glucanasas , amiloglucosidasas , endo-beta- 1 , 3 (4 ) -glucanasas , amiloglucosidasas y glucosidasas . Elaboración de Cerveza y Fermentación La invención proporciona métodos para la elaboración de cerveza (v.gr., fermentación), los cuales comprenden las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención. En un proceso de ejemplo, la materia prima que contiene almidón se desintegra y se procesa para formar una malta. Se utiliza una enzima de la invención en cualquier punto del proceso de fermentación. Se pueden utilizar las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención en la industria de la cerveza para la degradación de beta-glucanos . En un aspecto, las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención son usadas en la industria cervecera para aclarar la bebida. En un aspecto, las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención pueden ser usadas en el procesamiento de malta de cebada. La materia prima principal de la fermentación de cerveza es la malta de cebada. Este puede ser un proceso de tres etapas. Primero, los granos de cebada pueden ser remojados para incrementar el contenido de agua, v.gr. , a alrededo de 40%. En segundo término, los granos pueden ser germinados por incubación a 15-25°C por tres a seis días cuando la síntesis de enzimas es estimulada bajo el control de giberelinas. En un aspecto, las enzimas de la invención son añadidas en esta (o cualquiera otra) etapa del proceso. En un aspecto, las enzimas de la invención son usadas en procesos de malta remojada y conversión. En las industrias cervecera y de la fermentación, los procesos de malta remojada y conversión son llevados a cabo a temperaturas que son demasiado bajas para promover la adecuada degradación de los glucanos y xilanos solubles en agua. Estos polímeros forman sustratos gomosos que pueden ocasionar una viscosidad incrementada en la infusión de malta remojada, dando como resultado una mas larga corrida de malta remojada, niebla residual y precipitados en el producto final de cerveza debido a la filtración ineficiente y un bajo rendimiento de extracción. Por estas razones, se añaden enzimas durante los procesos de preparación de cerveza para desintegrar glucanos beta-1,4 y beta- 1 , 3 -enlazados . En un aspecto, las enzimas de la invención son usadas en operaciones de cervecería, v.gr., se añade glucanasa al agua de proceso, para acortar los tiempos de germinación y/o para estimular la conversión de cebada de calidad pobre a maltas aceptables. En un aspecto, las enzimas de la invención son usadas para maltas remojadas, v.gr., se añaden para incrementar la capacidad de filtración de la infusión de malta remojada y/o para mejorar la separación de la malta remojada. En un aspecto, las enzimas de la invención son usadas en el termentador y/o en el tanque de asentamiento, v.gr., para ayudar a aclarar la niebla y/o para mejorar la filtración. En un aspecto, las enzimas de la invención son usadas en una preparación de cerveza adjunta, v.gr., se añade una glucanasa de la invención para desintegrar los glucanos de cebada, trigo y/u otros cereales, incluyendo glicanos en la malta. En un aspecto, las enzimas de la invención son usadas en preparación de cerveza con malta, v.gr., se añade una glucanasa de la invención para modificar maltas pobres con alto contenido de glucano. Las glucanasas de la invención se pueden utilizar en cualquier proceso de producción de cerveza o de bebidas alcohólicas, como se describe, v.gr., en las patentes US 5,762,991; 5,536,650; 5,405,624; 5,021,246; 4,788,066. Los procesos cerveceros de la invención pueden incluir el uso de cualquier combinación de otras enzimas, tales como xilanasas, esterasas, celulasas, pectinasas, liasas de pectato, aldolasas, descarboxilasas , lacasas, glucanasas, proteasas, peptidasas, proteinasas, amiloglucosidasas , isomerasas de glucosa, glucoaldolasas , beta-glucanasas , endo-beta- 1 , 3 (4 ) -glucanasas, hemicelulasas , endoglicosidasas , endo-beta- 1 , 4 -glucanasas, glicosiltransferasas , fosfolipasas , lipo-oxigenasas , reductasas, oxidasas, fenoloxidasas , ligninasas, pululanasas, arabinanasas , otras mananasas, xiloglucanasas , acetil esterasas de petina, acetil esterasas de ramnogalacturonano, pol igalacturonasas , ramnogalacturonasas , galactanasas , transglutaminasas , metilesterasas de pectina, celobiohidrolasas y/o transglutaminasas. Aplicaciones médicas y de investigación Las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención pueden ser usadas como agentes anti -microbianos debido a sus propiedades bacteriolíticas y propiedades anti - fúngales . Las glucanasas de la invención pueden ser usadas para eliminar o proteger animales contra salmonella, v.gr., como se describe en las publicaciones internacionales WO 0049890 y WO 9903497. Las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención pueden ser usadas en un método de uso y una composición de una carbohidrasa y/o una glucanasa para la manufactura de un agente para el tratamiento y/o la profilaxis de coccidiosis. El agente elaborado puede estar en la forma de un alimento para animales a base de cereales (ver, por ejemplo, la patente US 5,624,678) . Aplicaciones de perforación Las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención pueden ser usadas en modificar la viscosidad de materiales derivados de plantas. En un aspecto, las enzimas de la invención son usadas en la industria del petróleo donde se usan goma guar y goma guar modificada, v.gr., para romper la alta viscosidad o estructura de gel en el fluido de fractura después de la fractura. En un aspecto, las enzimas de la invención usadas en estas aplicaciones tienen una alta termo-estabilidad. En un aspecto, las enzimas de la invención usadas en estas aplicaciones son resistentes a temperaturas elevadas en la tierra o generadas por medio de procesos de perforación. Las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención pueden ser usadas para tratar lodo de perforación (v.gr., lodo usado) . Otras Aplicaciones Industriales Las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención pueden ser usadas en una amplia variedad de aplicaciones relacionadas con alimentos, alimentos para animales y bebidas. Se descubren nuevas glucanasas, mananasas o xilanasas analizando y seleccionando en bibliotecas existentes y bibliotecas de ADN construidas de lugares mesófilos diversos y termófilos moderadamente así como a partir de fuentes objetivadas que incluyen a la flora digestiva, microorganismos en desechos animales, bacterias de la tierra y hábitats altamente alcalinos.
Son también útiles estrategias de bio-trampas y enriquecimiento primario usando sustratos que comprenden glucano y/o fracciones de polisacáridos no solubles del material de alimentos para animales . Las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención pueden ser usadas en la conversión de bio-masa en combustibles, y en la producción de etanol, v.gr., como se describe en las publicaciones internacionales WO 0043496 y WO 8100857. Las glucanasas de la invención pueden ser usadas para producir azúcares fermentables y bio-masa que contiene glucano que puede convertirse en etanol combustible. Las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención pueden ser usadas en combinación con otras enzimas implicadas en la digestión de celulosa, como celobiohidrolasas y beta-glucosidasas . Las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención pueden ser usadas en varias otras aplicaciones. Por ejemplo, las glucanasas de la invención pueden ser usadas en mejorar la calidad y la cantidad de la producción de proteínas de leche en vacas lactantes (ver, por ejemplo, Kung, L., y colaboradores, J . Dairy Science , 2000 enero 83:115-122) , incrementar la cantidad de sacáridos solubles en el estómago y el intestino pequeño de cerdos (ver, por ejemplo, van der eulen, J. , y colaboradores, Arch. Tierernah . , 2001 54:101-115) , mejorar la eficiencia en la producción tardía de huevos y el rendimiento de huevos en gallinas (ver, por ejemplo, Jaroni , D. , y colaboradores, Poult . Sci . , 1999 junio 78:841-847). De manera adicional, las glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención pueden ser usadas como me oradores de harina, masa y pan (ver, por ejemplo, las patentes US 5,108,765 y 5,306,633), como aditivos y/o suplementos para alimentos, como se señaló anteriormente (ver, por ejemplo, las patentes Nos. US 5,432,074, 5,429,828, 5,612,055, 5,720,971, 5,981,233, 5,948,667, 6,099,844, 6,132,727 y 6,132,716), en la manufactura de soluciones de celulosa (ver, por ejemplo, la patente US 5,760,211) . Composiciones detergentes que comprenden glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención pueden ser usadas para compuestos de frutas, verduras y/o lodo y arcilla (ver, por ejemplo, la patente US 5,786,316) . Usos adicionales para glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención incluyen el uso en la producción de fibra dietética soluble en agua (ver, por ejemplo, la patente US 5,622,738), en mejorar la capacidad de filtración, la separación y producción de almidón (ver, por ejemplo, las patentes US 4,960,705 y 5,023,176), en la industria de las bebidas en mejorar la capacidad de filtración de infusión de malta remojada o cerveza (ver, por ejemplo, la patente US 4,746,517), en una composición de enzimas para promover la secreción de leche de ganado y mejorar la calidad de la leche (ver, por ejemplo, la patente US 4,144,354), en reducir la viscosidad de materiales de plantas (ver, por ejemplo, la patente US 5,874,274), en incrementar la viscosidad o resistencia de gel de productos alimenticios tales como jalea, mermelada, compota, jugo, pasta, sopa, salsa picante, etc. (ver, por ejemplo, la patente US 6,036,981) . Las glucanasas, mananasas o xilanasas pueden también ser usadas en la hidrólisis de la hemicelulosa para la cual son selectivas, particularmente en presencia de celulosa. De manera adicional, el retenido rico en celulasa es adecuado para la hidrólisis de celulosa (ver, por ejemplo, la patente US 4, 725, 544) . Diversos usos de glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención incluyen la transformación de un microbio que produce etanol (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO 99/46362), en la producción de taninos y composiciones enzimáticas enológicos (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO 01/64830), en estimular las defensas naturales de plantas (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO 01/30161) , en la producción de azúcares a partir de sustratos de hemicelulosa (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO 92/03541), en la limpieza de frutas, verduras, terrenos que contienen lodos o arcilla (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO 96/13568) , en la limpieza de membranas de filtración de cerveza (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO 96/23579) , en un método de matar o inhibir células microbianas (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO 97/32480) , y en determinar las características de aguas de proceso a partir de blanqueado de pulpa de madera usando las relaciones de dos mediciones de absorción UV y comparando los espectros (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO 98/40721) . Cualquier producto o proceso de la invención puede incluir cualquier combinación de otras enzimas tales como catalasas, glucanasas, celulasas, endoglicosidasas , endo-beta-1 , 4 -glucanasas , amiloglucosidasas , isomerasas de glucosa, glicosiltransferasas , lipasas, esterasa, fosfolipasas , lipo-oxigenasas, beta-glucanasas , endo-beta- 1 , 3 (4 ) -glucanasas , cutinasas, peroxidasas, lacasas, aldolasas, glucoaldolasas , pectinasas, reductasas, oxidasas, descarboxilasas , fenoloxidasas , ligninasas, pululanasas, fitasas, arabinanasas , hemicelulasas , mananasas, xiloglucanasas , xilanasas, acetil esterasas de pectina, acetil esterasas de ramnogalacturonano , poligalacturonasas , ramnogalacturonasas , galactanasas , liasas de pectato, transglutaminasas, metilesterasas de pectina, celobiohidrolasas y/o transglutaminasas. Dos formatos de análisis y selección (a base de actividad y a base de secuencia) son usados en el descubrimiento de novedosas glucanasas, mananasas o xilansas. El enfoque a base de actividad es análisis y selección directos de actividad glucanasa en placas de ágar usando un sustrato tal como un beta-glucano de cebada-AZO ( egazyme) . De manera alternativa, puede usarse un enfoque a base de secuencia, que se basa en bio-informática y biología molecular para diseñar sondas para hibridación y bio-exploración . Ver, por ejemplo, las patentes US 6,054,267, 6,030,779, 6,368,798, 6,344,328. Los aciertos de análisis y selección son purificados, secuenciados , caracterizados (por ejemplo, determinación de especificidad,, temperatura y pH óptimos) , analizados usando bio-informática, sub-clonados y expresados para caracterización bioquímica básica. Estos métodos pueden ser usados en análisis y selección de glucanasas, mananasas o xilanasas útiles en una miríada de aplicaciones, incluyendo acondicionamiento de masa y como enzimas para aditivos de alimentos para animales. Al caracterizar enzimas obtenidas de análisis y selección, puede determinarse la utilidad ejemplar en el procesamiento de masa y en aplicaciones de horneado. La caracterización puede incluir, por ejemplo, la medición de especificidad de sustrato (glucano, CMC, BBG) , la estabilidad de temperatura y pH y la actividad específica. Una enzima comercial puede usarse como referencia. En un aspecto, las enzimas de la invención pueden tener actividad significativa a un pH = 7 y 25-35°C, son inactivas sobre glucano insoluble, son estables y activas en 50-67% de sacarosa. En otro aspecto, puede determinarse la utilidad como aditivos para alimentos a partir de caracterización de las enzimas candidatas . La caracterización puede incluir, por ejemplo, medición de la especificidad del sustrato (glucano, CMC, BBG) , estabilidad de temperatura y pH, actividad específica y estabilidad gástrica. En un aspecto, el alimento es diseñado para un animal mono-gástrico y en otro aspecto el alimento es diseñado para un animal rumiante. En un aspecto, las enzimas de la invención tienen actividad significativa a un pH de 2-4 y 35-40°C, una vida media mayor de 30 minutos en fluido gástrico, vida media en formulación (en amortiguador o células) mayor de 5 minutos a 85°C, y se usan como aditivo para alimentos para animales mono-gástricos. En otro aspecto, las enzimas de la invención tienen una o mas de las siguientes características: actividad significativa a un pH de 6.5-7.0 y 35-40°C, una vida media mayor de 30 minutos en fluido de rumen, estabilidad de la formulación como polvo seco estable, y se usan como aditivos para alimentos para animales rumiantes. Las enzimas son reactivas hacia un amplio rango de sustratos naturales y no naturales, así permitiendo la modificación de virtualmente cualquier compuesto orgánico líder. Mas aún, a diferencia de los catalizadores químicos tradicionales, las enzimas son altamente enantio y regio-selectivas. El alto grado de especificidad de grupos funcionales exhibido por las enzimas permite seguir el rastro de cada reacción en una secuencia sintética que lleva a un nuevo compuesto activo. Las enzimas son también capaces de catalizador muchas reacciones diversas no relacionadas con su función fisiológica en la naturaleza. Por ejemplo, las peroxidasas catalizan la oxidación de fenoles mediante peróxido de hidrógeno. Las peroxidasas pueden también catalizar reacciones de hidroxilación que no están relacionadas con la función nativa de la enzima. Otros ejemplos son glucanasas que catalizan la desintegración de polipéptidos . En solución orgánica, algunas glucanasas pueden también acilar azúcares, una función no relacionada con la función nativa de estas enzimas. La presente invención explota las propiedades catalíticas únicas de las enzimas. Aunque el uso de bio-catalizadores (es decir, enzimas purificadas o crudas, células vivas o no vivas) en transformaciones químicas normalmente requiere la identificación de un bio-catalizador particular que reaccione con un compuesto inicial específico, la presente invención usa bio-catalizadores y condiciones de reacción seleccionados que son específicos para grupos funcionales que están presentes en muchos compuestos iniciales. Cada bio-catalizador es específico para un grupo funcional, o varios grupos funcionales relacionados y puede reaccionar con muchos compuestos iniciales que contienen este grupo funcional. Las reacciones bio-catalíticas producen una población de derivados a partir de un solo compuesto inicial. Estos derivados pueden estar sujetos a otra ronda de reacciones bio-catalíticas para producir una segunda población de los compuestos derivados. Miles de variaciones del compuesto original pueden ser producidas con cada iteración de derivación bio-catalítica .
Las enzimas reaccionan en sitios específicos de un compuesto inicial sin afectar al resto de la molécula, un proceso que es muy difícil de lograr usando métodos químicos tradicionales. Este alto grado de especificidad bio-catalítica provee los medios para identificar un solo compuesto activo dentro de la biblioteca. La biblioteca es caracterizada por la serie de reacciones bio-catalíticas usadas para producirla, una llamada "historia bio-sintética" . El análisis y selección de la biblioteca respecto de actividades biológicas y el rastreo de la historia bio-sintética identifican la secuencia específica de la reacción que produce el compuesto activo. La secuencia de reacción es repetida y la estructura del compuesto sintetizado es determinada. Este modo de identificación, a diferencia de otros enfoques de síntesis y análisis y selección, no requiere de tecnologías de inmovilización y pueden sintetizarse y probarse compuestos libres en solución usando virtualmente cualquier tipo de ensaye de análisis y selección. Es importante señalar que el alto grado de especificidad de las reacciones enzimáticas sobre grupos funcionales permite el "rastreo" de las reacciones enzimáticas específicas que constituyen la biblioteca producida de manera bio-catalítica. Muchos de los pasos de procedimiento son llevados a cabo usando automatización robótica que permite la ejecución de muchos miles de reacciones bio-catalíticas y ensayes de análisis y selección por día, así como asegurar un alto nivel de precisión y reproducibilidad . Como resultado, puede producirse una biblioteca de compuestos derivados en cuestión de semanas, lo que tomaría años de producir usando los métodos químicos actuales. (Para enseñanzas adicionales sobre la modificación de moléculas, incluyendo moléculas pequeñas, ver la solicitud internacional PCT/US94/09174) . La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, se debe entender que la invención no está limitada a estos ejemplos. EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Descubrimiento de la Enzima Endoqlicosidasa a Base de Placa: Análisis y Selección de Expresión El siguiente ejemplo demuestra el aislamiento de y la confirmación de la actividad enzimática de enzimas ejemplares y ácidos nucleicos de la invención. También pueden usarse estos ensayos para determinar si un polipéptido tiene la actividad de enzima (v.gr. , glucanasa, mananasa o xilanasa) requerida para estar dentro del ámbito de la invención. Determinación de título de biblioteca Lambda: se añade 1.0 µ? de material de biblioteca Lambda Zap Express amplificado a 600 µ? de células MRF ' de E. coli (OD600 = 1.0 ) . Se diluye el material MRF ' con 10 mM MgS04. Se incuba la mezcla a 37°C por 15 minutos, luego se transfiere la suspensión a 5-6 mi de agar superior NZY a 50 °C y se mezcla suavemente. Se vierte de inmediato la solución de agar sobre placas grandes (150 mm) de medio NZY y se permite al agar superior solidificar por completo (aproximadamente 30 minutos). Se invierte la placa. Se incuba la placa a 39°C por 8-12 horas. (El número de placas es aproximado. El título de fagos fue determinado para dar 50,000 pfu/placa. Se diluye una alícuota de fagos de biblioteca con amortiguador SM si fuese necesario.) Análisis y selección de sustrato: se añade material Lambda Zap Express (50,000 pfu) a partir de una biblioteca amplificada a 600 µ? de células MRF' de E. coli (OD600 = 1.0 ) y se incuba la mezcla a 37°C por 15 minutos. Mientras se está incubando la suspensión blanca de fagos/células, se añade 1.0 mi del sustrato de polisacárido marbetado con pigmento deseado (habitualmente 1-2% peso/volumen) . Se transfiere la suspensión de células a una solución de sustrato/agar superior y se mezcla suavemente. Se vierte de inmediato la solución sobre placas grandes de medio NZY (150 mra) . Se permite solidificar el agar superior por completo (aproximadamente 30 minutos), luego se invierte la placa. Se incuba la placa a 39°C por 8-12 horas. Se observa la placa respecto de zonas que aclaran (halos) alrededor de las placas. Las placas de núcleo con halos se sacan del agar y se transfieren a un micro-tubo estéril. (Una punta de pipeta de 200 µ? de perforación grande funciona bien para remover el tapón de agar (núcleo) conteniendo la placa deseada.) Re-suspender los fagos en 500 µ? de amortiguador SM. Añadir 20 µ? de cloroformo para inhibir cualquier desarrollo celular adicional .
Aislamiento de clonas puras: añadir 5 µ? de la suspensión de fagos re-suspendidos á 500 µ? de células MRF' de E. coli (OD600 = 1.0) . Incubar a 37°C por 15 minutos. Mientras la suspensión blanca de fagos/células se está incubando, añadir 600 µ? del sustrato de polisacárido marbetado con pigmento deseado (habitualmente 1-2% peso/volumen) a 3.0 mi de agar superior NZY a 50°C y mezclar intensamente. (Mantener la solución a 50°C hasta que se necesite.) Transferir la suspensión 'de células a una solución de sustrato/agar superior y mezclar suavemente. Verter de inmediato la solución sobre una placa pequeña (90 mm) de medio NZY y permitir al agar superior solidificar por completo (aproximadamente 30 minutos), luego invertir la placa. Incubar la placa a 39°C por 8-12 horas. La placa es observada respecto de una zona que se aclara (halo) alrededor de una sola placa (clona pura) . (Si no puede aislarse una placa sola, ajustar el título y volver a poner en placas la suspensión de fagos.) Los fagos son re-suspendidos en 500 µ? de amortiguador SM, y se añaden 20 µ? de cloroformo para inhibir cualquier crecimiento celular adicional. Extirpación de clona pura: permitir que la suspensión de fagos puros se incube a temperatura de habitación por 2 a 3 horas o durante la noche a 4°C. Añadir 100 µ? de suspensión de fagos puros a 200 µ? de células MRF' de E. coli (OD600 = 1.0 ) . Añadir 1.0 µ? de fagos adyuvantes ExAssist (>1 x 106 pfu/ml; Stratagene) . Incubar la suspensión a 37°C por 15 minutos.
Añadir 3.0 mi de 2 x medio YT a la suspensión celular. Incubar a 37°C por 2-2.5 horas mientras se agita. Transferir el tubo a 70°C por 20 minutos. Transferir 50-100 µ? de la suspensión de fagémidos a un micro-tubo conteniendo 200 µ? de células Exp 505 de E. coli (OD600 = 1.0 ) . Incubar la suspensión a 37°C por 45 minutos. Poner en placas 100 µ? de la suspensión celular sobre medio LBkan 50 (medio LB con kanamicina 50 µg/ml) . Incubar las placas a 37°C por 8-12 horas. Observar las placas respecto de colonias. Cualesquiera colonias que se desarrollen contienen el fagémido puro. Escoger una colonia y desarrollar un pequeño cultivo líquido (3-10 mi) por 8-12 horas. El medio de cultivo es LBkan 50 líquido. Verificación de actividad: transferir 1.0 mi del cultivo líquido a un micro-tubo estéril. Centrifugar a 13,200 rpm (16,000 g's) por un minuto. Desechar el sobrenadante y añadir 200 µ? de amortiguador de fosfato, pH 6.2. Sonicar por 5 a 10 segundos sobre hielo usando una micro-punta. Añadir 200 µ? del sustrato apropiado, mezclar suavemente e incubar a 37°C por 1.5-2 horas. Un control negativo debe también ser corrido, conteniendo únicamente amortiguador y sustrato. Añadir 1.0 mi de etanol absoluto (200 grados) a la suspensión y mezclar. Centrifugar a 13,200 rpm por 10 minutos. Observar el sobrenadante respecto del color. La cantidad de coloración puede variar,, pero cualesquiera tubos con mas coloración que el control son considerados positivos respecto de actividad. Puede usarse un espectro-fotómetro para este paso si así se desea o necesita. (Para beta-glucano de cebada-Azo, Megazyme, leer a 590 nm. ) RFLP de clonas puras de las mismas bibliotecas: transferir 1.0 mi de cultivo líquido a un micro-tubo estéril. Centrifugar a 13,200 rpm (16,000 g's) por un minuto. Seguir el protocolo del mini-kit QIAprep (Qiagen) para aislamiento de plásmido y usar 40 µ? de agua santa como amortiguador de levigación. Transferir 10 µ? de ADN del plásmido a un micro- tubo estéril.. Añadir 1.5 µ? de amortiguador 3 (New England Biolabs) , 1.5 µ? de solución 100X BSA (New England Biolabs) , y 2.0 µ? de agua santa. A esto se añaden 1.0 µ? de endonucleasa de restricción Not 1 y 1.0 µ? de endonucleasa de restricción Pst 1 (New England Biolabs) . Incubar por 1.5 horas a 37°C. Añadir 3.0 µ? de amortiguador de carga 6X (Invitrogen) . Correr 15 µ? de muestra digerida sobre gel de agarosa al 1.0% por 1-1.5 horas a 120 voltios. Observar el gel con un dispositivo de formación de imágenes de gel. Llevar a cabo análisis de secuencias en todas las clonas con un diferente patrón de digestión. La figura 5 es una tabla que contiene la caracterización de las enzimas de la invención, incluyendo resumir las actividades relativas de diversas enzimas ejemplares de la invención bajo diversas condiciones, v.gr. , variando el pH y la temperatura, como se discutió antes. EJEMPLO 2 : Ensayes de Actividad El siguiente ejemplo demuestra la actividad enzimática de enzimas ejemplares de la invención. Estos ensayes pueden ser usados también para determinar si un polipéptido tiene una actividad de enzima (v.gr., glucanasa, mananasa o xilanasa) requerida para estar dentro del ámbito de la invención. Se demostró que polipéptidos de la invención teniendo las secuencias señaladas en las SEQ ID NOs : listadas mas adelante tenían actividad de glucanasa, como se describe mas adelante. La actividad específica fue determinada en beta-glucano de cebada (BBG) o carboximetilcelulosa (CMC) usando el ensaye de azúcar reductor BCA. Una (1) unidad (U) de actividad de glucanasa = 1 µp???/????"1 de equivalentes reductores de glucosa liberados a 37°C, pH de 5.3.
Actividad Especifica (U/mg) Glucanasa MW pi Fam. BBG BBG CMC T pHopt (kDa) GH nativo marcado marcada (°C) con 6H con 6H SEQ ID NO: 6 37.5 5.9 5 22 ND ND =90 5-7 (codificada con la SEQ ID NO: 5) SEQ ID NO: 400 37.9 5.5 5 0.85 ND ND =90 5-7 (codificada por la SEQ ID NO:399 SEQ ID NO: 162 34.0 5.2 5 0.95 ND ND =85 ND (codificada por la SEQ ID NO: 161) SEQ ID NO: 84 36.9 6.3 5 >40 ND ND 80 4-6 (codificada por la SEQ ID NO: 83) SEQ ID NO: 172 29.8 5.0 16 32 ND ND 50 5-6 (codificada por la SEQ ID NO: 171) SEQ ID NO: 104 39.7 5.9 5 ND 3.2 2.8 85 5-6 (codificada por la SEQ ID NO: 103) SEQ ID NO: 10 77.7 4.9 5 ND ND 0.5 85 5-6 (codificada por la SEQ ID NO: 9) SEQ ID NO:222 53.8 9.1 5 >40 16 24 85 5-6 (codificada por la SEQ ID NO:221) SEQ ID NO: 108 78.9 4.3 5 ND 3.8 4.0 75 ND (codificada por la SEQ ID NO: 107) SEQ ID NO: 176 37.2 6.0 5 ND 3.5 21 75 5-6 (codificada por la SEQ ID NO: 175) SEQ ID NO: 110 39.9 6.2 5 ND 13 12 ND ND (codificada por la SEQ ID NO: 109) SEQ ID NO: 268 51.8 4.6 5 ND 3.6 2.8 50 ND (codificada por la SEQ ID NO:267) SEQ ID NO: 324 49.3 6.1 5 ND ND ND ND ND (codificada por la SEQ ID NO:323) SEQ ID NO:370 42.1 5.8 5 ND ND ND ND ND (codificada por la SEQ ID NO: 369) SEQ ID NO: 168 37.3 5.7 5 ND ND ND ND ND (codificada por la SEQ ID NO: 167) SEQ ID NO: 154 35.6 5.4 5 ND ND ND ND ND (codificada por la SEQ ID NO: 153) SEQ ID NO: 118 34.5 6.1 5 ND ND ND ND ND (codificada por la SEQ ID NO: 117) SEQ ID NO: 148 74.1 5.3 5 ND ND ND ND ND (codificada por la SEQ ID NO: 147) ND = no determinado Se demostró que polipéptidos ejemplares de la invención que tienen una secuencia como se señala en las SEQ ID NO : s que aparecen a continuación tienen actividad de endoglucanasa alcalina/celulasa, con pH y temperatura óptimos como se señala mas adelante. Esta actividad fue determinada usando un ensaye de actividad de celulasa (un ensaye de extremos reductores BCA) , como se describe en detalle en el Ejemplo 3 mas adelante.
SEQ ID pH Temp NO: Tipo Opt . Ópt . 409, 410 Endoglucanasa alcalina/celulasa 5 ND 343, 344 Endoglucanasa alcalina/celulasa 6 60 319, 329 Endoglucanasa alcalina/celulasa 6 70 383, 384 Endoglucanasa alcalina/celulasa 7 60 301, 302 Endoglucanasa alcalina/celulasa 7 60 257, 258 Endoglucanasa alcalina/celuíasa 8 42 419, 420 Endoglucanasa alcalina/celulasa 8 70 421, 422 Endoglucanasa alcalina/celulasa 9 60 405 , 406 Endoglucanasa alcalina/celulasa 9 50 329, 330 Endoglucanasa alcalina/celulasa 9 50 325, 326 Endoglucanasa alcalina/celulasa (5- 7) * 70 415, 416 Endoglucanasa alcalina/celulasa (6- 10) * 70 303 , 304 Endoglucanasa alcalina/celulasa (6- 10) * 60 271, 272 Endoglucanasa alcalina/celulasa (6- 7) * 60 175 , 176 Endoglucanasa alcalina/celulasa (6- 7) * 70 9, 10 Endoglucanasa alcalina/ celuíasa (6- 7)* 70 297 , 298 Endoglucanasa alcalina/celulasa (6- 8) * 50 109, 110 Endoglucanasa alcalina/celulasa (6- 8) * 60 267, 268 Endoglucanasa alcalina/celulasa (6- 8) * 70 107 , 108 Endoglucanasa alcalina/celulasa (6- 8) * 70 305, 306 Endoglucanasa alcalina/celulasa (7- 10) * 60 417, 418 Endoglucanasa alcalina/celulasa (7- 8.5)* NA 227, 228 Endoglucanasa alcalina/celulasa (7- 9)* 60 375, 376 Endoglucanasa alcalina/celulasa (7- 9) * 70 335, 336 Endoglucanasa alcalina/celulasa (7- 9) * 50 155, 156 Endoglucanasa alcalina/celulasa (7- 9)* 60 445, 446 Endoglucanasa alcalina/celulasa (7- 9) * 60 259, 260 Endoglucanasa alcalina/celulasa (8- 10) * 50 423 , 424 Endoglucanasa alcalina/celuíasa (8- 10) * 50 345, 346 Endoglucanasa alcalina/celulasa (8- 9) * 25 285, 286 Endoglucanasa alcalina/celulasa (8- 9) * 50 351, 352 Endoglucanasa alealina/celulasa (9- 10) * 80 EJEMPLO 3 : Ensaye de Actividad de Celulasa : Ensaye de Extremos Reductores BCA El siguiente ejemplo describe un ensaye, un ensaye de actividad de celulasa (un ensaye de extremos reductores BCA) que puede ser usado para determinar si un polipéptido tiene la actividad enzimática (v.gr., glucanasa, mananasa o xilanasa) requerida, v.gr., una actividad de endoglucanasa alcalina/ celulasa (ver Ejemplo 2 anterior) para estar dentro del ámbito de la invención. Este ensaye fue diseñado para medir la cantidad de extremos reductores producidos durante la degradación enzimática de carboximetilcelulosa (CMC) en un formato de 96 pozos, muestras múltiples, de alto rendimiento. Materiales : Soluciones de sustrato: 1% CMC Disolver 1 g de CMC en 100 mi de amortiguador Britton-Robinson 50 mM a un pH de aproximadamente 4, calentar la solución de CMC en baño de agua hirviente, mientras se agita, por 20-40 minutos hasta que se disuelva (la solución todavía aparecerá ligeramente lechosa, pero translúcida) . Ajustar el pH deseado con NaOH o HCl 1M. Solución A : 64 mg/ml de mbnohidrato de carbonato de sodio 24 mg/ml de bicarbonato de sodio 1.95 mg/ml de BCA (sal disodio de 4 , 4 ' -dicarboxi-2 , 2 ' -biquinolina (Sigma Chemical catálogo # D-8284) ) Añadir lo anterior a dH20 Puede ser necesario disolver la BCA por medio de calentamiento, no calentar a mas de aproximadamente 80°C Solución B: 1.24 mg/ml de pentahidrato de sulfato cúprico 1.26 mg/ml de L-serina Añadir lo anterior a dH20 Reactivo de trabajo : 1:1 de soluciones A y B, hacer cada día una mezcla reactiva de trabajo fresca (habitualmente solo hacer suficiente para cada ensaye) , hacer soluciones A y B frescas cada semana Solución de glucosa : 10 mM glucosa en dH20. Filtrar por 0.2 pm, almacenar a 4°C Estándares de glucosa : Diluir el material de glucosa 10 mM en 1% de CMC a pH deseado; a una concentración final de 0, 100, 200, 300, 400, 500 µ? . Como la curva es determinada añadiendo 10 µ? de los estándares al reactivo de trabajo, funciona como 0-0.005 pmoles de glucosa/ pozo. La curva estándar necesita ser generada para cada placa de puntos de tiempo de la muestra, pues el ciclo de calentamiento puede afectar la cantidad de señal observada. Método : Instalación : Alícuota de 1 mi de solución de sustrato (1% de CMC) en placas de pozos profundos (si se usa temperatura ambiente) o tubos Acmé en bloques calientes, equilibrar a la temperatura deseada (aproximadamente 5 minutos) en bloques de calor o baño de agua caliente. Mientras la solución se está equilibrando, hacer 10 mi del reactivo de trabajo y alícuota de 100 µ? en placas de PCR de 96 pozos. Fijar la placa en hielo. Reacción/Muéstreo : Después de que está completo el equilibrio de temperaturas, añadir solución enzimática a la solución de sustrato. Mezclar de inmediato volteando la pipeta hacia arriba/aba o. Disponer de inmediato una alícuota de 10 µ? en la placa de PCR (este es t=0, punto de tiempo cero) . Disponer alícuotas de 10 µ? en las placas de PCR en cada punto de tiempo deseado (v.gr., 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30 minutos) . Guardar la última hilera en la placa para adición de estándares de glucosa de 10 µ? (es decir, los pozos solo deben tener el reactivo de trabajo de 100 µ? en ellos) . Ensayar Desarrollo de Color : Cuando se recolectan todos los puntos de tiempo y se añaden los estándares, cubrir la placa y calentar a 100°C por 10 minutos usando la máquina de PCR. Enfriar la placa sobre hielo por 5-10 minutos (o fijar la máquina de PCR a 1°C por 10 minutos) . Añadir 100 µ? de H20 a los pozos. Mezclar. Disponer una alícuota de 100 µ? en una placa de 96 pozos, de fondo plano, clara, y leer la absorbencia a 560 nm. Generar Curva Estándar : Graficar A560 vs . a???eß de glucosa a partir de los pozos que contienen los estándares de glucosa. Usar regresión lineal para calcular la pendiente (Sstd) .
Generar gráfica de la pendiente de la reacción: Graficar A560 vs . puntos de tiempo. Poner en cero los puntos de tiempo de cada muestra contra su propio T=0 (es decir, restar el valor de absorbencia del valor T=0 de la muestra de todos los demás puntos de tiempo de la misma muestra) . Generar la pendiente (Srxn) para cada conjunto de puntos de tiempo de la muestra (A560/tiempo) . Determinación de actividad : Dividir Srxn entre Sstd y multiplicar por 100 (pues las p???eß de producto detectadas son la cantidad de extremos reductores en los 10 µ? usados en el ensaye, no la cantidad total generada en 1 mi de la reacción enzimática) . Determinación de actividad específica : Dividir la actividad (en unidades de moles/min) entre los mg totales de proteína añadidos en la reacción de 1 mi . Determinar la concentración de proteína mediante un ensaye Bradford o similar. Dividir la concentración de proteína entre cualesquiera» diluciones usadas. Multiplicar por el volumen (en mi) usado en la reacción . Todos los puntos deben hacerse por duplicado, siendo mejor por triplicado. La siguiente gráfica fija un conjunto de datos ejemplares ("datos de muestra") que se ilustran en forma de gráfica como una "curva estándar" en la figura 6 Datos de Muestra Pendiente de curva estándar: 88.375 A560/ymoles de glucosa Pendiente de reacción: 0.0076 A560/min Actividad/pendiente reacción/estándar) 8.70061E-05 ymoles/min Actividad cierta/1 mi rxn (=actividad x 100) 0.0087 pmoles/min Actividad específica 10.87 µp?????/?t???, mg EJEMPLO 4 : Optimización de Codones El siguiente ejemplo demuestra una optimización de codones ejemplar de una secuencia de codificación de enzima ejemplar de la invención. Puede usarse cualquier protocolo de optimización de codones conocido en la materia para optimizar en codones cualquier ácido nucleico de la invención. Un ácido nucleico ejemplar que codifica el polipéptido que tiene una secuencia como se señala en la SEQ ID NO: 6, es decir la SEQ ID NO : 5 , fue sometida a optimización de codones para expresión óptima en Pichia pastoris ; el ácido nucleico que codifica la enzima optimizado en codones para Pichia pastoris es la SEQ ID NO: 463. En adición a optimizar los codones del ácido nucleico que codifica la enzima, se modificó un aminoácido (A91V) , y esta nueva secuencia de polipéptido es señalada como la SEQ ID NO: 464. Ensayes de actividad de glucanasa (cuyos datos son ilustrados en las figuras 7 y 8) demostraron expresión mejorada en Pichia pastoris de la SEQ ID NO:464 (codificada, v.gr., por la SEQ ID N0:463), que es la versión optimizada en codones del polipéptido que tiene una secuencia como se señala en la SEQ ID N0:6 (codificada, v.gr., por la SEQ ID N0:5) . El nivel de expresión fue mejorado cambiando el pH. En la figura 7, la actividad de glucanasa durante el curso de la fermentación es mostrada en U/ml de cultivo. 1 unidad (U) de actividad de glucanasa = 1 ymoles/min"1 de equivalentes reductores de glucosa liberados a 37°C, pH 5.3. Se usó la glucanasa optimizada en codones de la SEQ ID NO: 464 (codificada por la SEQ ID NO:463), expresada en Pichia pastoris. La fermentación fue corrida a pH de 5.0. En la figura 8, se muestra la actividad de glucanasa durante el curso de la fermentación en U/ml de cultivo. 1 unidad (U) de actividad de glucanasa = 1 ymoles/min"1 de equivalentes reductores de glucosa liberados a 37°C, pH 5.3.. Se usó la glucanasa optimizada en codones de la SEQ ID NO: 464 (codificada por la SEQ ID NO:463), expresada en Pichia pastoris. La fermentación fue realizada a un pH de 6.2. EJEMPLO 5 : Actividad Enzimática El siguiente ejemplo demuestra la confirmación de la actividad enzimática de las enzimas ejemplares de la invención. Estos ensayos pueden también ser usados para determinar si un polipéptido tiene la actividad enzimática requerida (v.gr., glucanasa, mananasa o xilanasa) para estar dentro del ámbito de la invención. Actividad especifica de la glucanasa codificada por la SEQ ID NO: 6 La actividad específica de la enzima ejemplar de la invención que tiene la secuencia como se señala en la SEQ ID NO: 6 (codificada, v.gr., por la SEQ ID N0:5) fue demostrada usando el siguiente protocolo: La glucanasa codificada por la SEQ ID NO: 6 fue purificada hasta homogeneidad usando cromatografía por intercambio de iones. Las actividades específicas fueron determinadas sobre un sustrato al 1% en amortiguador de acetato de sodio 50 m , pH de 5.3 , a 37°C, usando el ensaye de azúcares reductores de BCA. 1 unidad (U) de actividad de glucanasa = 1 moles/min"1 de equivalentes reductores de glucosa liberados a 37°C, pH 5.3. -Beta-glucano dé cebada (BBG) : 30 U/mg -Beta-glucano de avena (OBG) : 38 U/mg -Carboximetilcelulosa (CMC) : 40 U/mg -Galactomanana de algarrobo: 0.3 U/mg Perfil de temperatura de la glucanasa codificada por la SEQ ID NO: 6 Se determinó el perfil de temperatura sobre tres sustratos separados (BBG, OBG y CMC) . La glucanasa codificada por la SEQ ID NO : 6 tuvo la mas alta actividad a mayores temperaturas . La actividad específica de la glucanasa codificada por la SEQ ID NO : 6 sobre BBG y CMC a 80 °C es 10X mejor que la actividad observada a 37°C. En presencia de mañana, la glucanasa codificada por la SEQ ID NO : 6 mostró la mayor actividad a 100°C, como se ilustra en la figura 9. Reensamble de Ligamiento Sintético (SLR) La invención proporciona un sistema de modificación genética no estocástico denominado "reensamble de ligamiento sintético", o simplemente como "SLR", un "proceso de evolución dirigida", para generar polipéptidos , por ejemplo glucanasas, mananasas o xilanasas, o anti-cuerpos de la invención, con propiedades nuevas o alteradas. SLR es un método para ligar fragmentos de oligonucleótidos entre sí de una manera no estocástica. Este método difiere de la mezcla estocástica de oligonucleótidos, en que los bloques de construcción de ácidos nucleicos no están mezclados, concatenados, o quimerizados aleatoriamente, sino que más bien se ensamblan de una manera no estocástica. Ver, por ejemplo, la solicitud de patente US 09/332,835 intitulada "Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution" , y presentada el 14 de junio de 1999 ("USSN 09/332,835") . En un aspecto, SLR comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar un polinucleótido de plantilla, donde el polinucleótido de plantilla comprende la secuencia que codifica un gen homólogo; (b) proporcionar una. pluralidad de polinucleótidos de bloques de construcción, donde los polinucleotidos de bloques de construcción se diseñan para reensamblarse cruzadamente con el polinucleotido de plantilla en una secuencia previamente determinada, y un polinucleotido de bloque de construcción comprende una secuencia que es una variante del gen homólogo, y una secuencia homologa al polinucleotido de plantilla que flanquea a la secuencia variante; (c) combinar un polinucleotido de bloque de construcción con un polinucleotido de plantilla, de tal manera que el polinucleotido de bloque de construcción se reensambla cruzadamente con el polinucleotido de plantilla para generar polinucleotidos que comprenden variaciones de secuencias genéticas homologas. SLR no depende de la presencia de altos niveles de homología entre los polinucleotidos que se vayan a reconfigurar . Por consiguiente, este método se puede emplear para generar de una manera no estocástica bibliotecas (o conjuntos) de moléculas de progenie comprendidas de más de 10100 quimeras diferentes. El reensamble de ligamiento sintético se puede utilizar para generar bibliotecas comprendidas de más de io1000 quimeras de progenie diferentes. Por consiguiente, los aspectos de la presente invención incluyen métodos no estocásticos para producir un conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricas finalizadas que tienen un orden de ensamble global que se selecciona por diseño. Este método incluye los pasos de generar por diseño una pluralidad de bloques de construcción de ácidos nucleicos específicos que tengan extremos ligables mutuamente compatibles servibles, y ensamblar estos bloques de construcción de ácidos nucleicos, de tal manera que se logre un orden de ensamble global diseñado . Los extremos ligables mutuamente compatibles de los bloques de construcción de ácidos nucleicos que se vayan a ensamblar, se consideran como "servibles" para este tipo de ensamble ordenado, si hacen posible que los bloques de construcción se acoplen en órdenes previamente determinados. Por lo tanto, el orden de ensamble global en el que se pueden acoplar los bloques de construcción de ácidos nucleicos es especificado por el diseño de los extremos ligables. Si se va a utilizar más de un paso de ensamble, entonces el orden de ensamble global en el que se puedan acoplar los bloques de construcción de ácidos nucleicos también se especifica por el orden en secuencia de los pasos de ensamble. En un aspecto, las piezas de construcción templadas se tratan con una enzima, tal como una ligasa (por ejemplo, ligasa de ADN T4) , para lograr el enlace covalente de las piezas de construcción. En un aspecto, el diseño de los bloques de construcción de oligonucleótidos se obtiene analizando un conjunto de plantillas de secuencias de ácidos nucleicos progenitoras que sirvan como una base para producir un conjunto de progenie de polinucleótidos quiméricos finalizados. Estas plantillas de oligonucleótidos progenitoras sirven de esta manera como una fuente de información de secuencia que ayuda en el diseño de los bloques de construcción de ácidos nucleicos que se vayan a mutar, v.gr., a quimerizar o mezclar. En un aspecto de este método, se alinean las secuencias de una pluralidad de plantillas de ácidos nucleicos progenitoras son el objeto de seleccionar uno o más puntos de demarcación. Los puntos de demarcación se pueden localizar én un área de homología, y están comprendidos de uno o más nucleótidos. Estos puntos de demarcación de preferencia son compartidos por cuando menos dos de las plantillas progenitoras. De esta manera, los puntos de demarcación se pueden utilizar para delinear los límites de los bloques de construcción de oligonucleótidos que se vayan a generar, con el objeto de reconfigurar los polinucleótidos progenitores. Los puntos de demarcación identificados y seleccionados en las moléculas progenitoras, sirven como puntos de quimerización potenciales en el ensamble de las moléculas de progenie quiméricas finales. Un punto de demarcación puede ser un área de homología (comprendida de cuando menos una base de nucleótido homologa) compartida por cuando menos dos secuencias de polinucleótidos progenitoras. De una manera alternativa, un punto de demarcación puede ser un área de homología que sea compartida por cuando menos la mitad de las secuencias de polinucleótidos progenitoras, o puede ser un área de homología que sea compartida por cuando menos dos terceras partes de las secuencias de polinucleótidos progenitoras. De una manera todavía más preferible, un punto de demarcación servible es un área de homología que es compartida por cuando menos tres cuartas partes de las secuencias de polinucleotidos progenitoras, o puede ser compartida por casi todas las secuencias de polinucleótidos progenitoras. En un aspecto, un punto de demarcación es un área de homología que es compartida por todas las secuencias de polinucleótidos progenitoras. En un aspecto, el proceso de reensamble de ligamiento se lleva a cabo de una manera exhaustiva con el objeto de generar una biblioteca exhaustiva de polinucleótidos quiméricos de progenie. En otras palabras, todas las posibles combinaciones ordenadas de los bloques de construcción de ácidos nucleicos están representadas en el conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricos finalizadas. Al mismo tiempo, en otro aspecto, el orden de ensamble (es decir, el orden de ensamble de cada bloque de construcción en la secuencia 5 ' a 3 ' de cada ácido nucleico quimérico finalizado) en cada combinación, por diseño (o de una manera no estocástica) es como se describe anteriormente. Debido a la naturaleza no estocástica de esta invención, se reduce mucho la posibilidad de productos secundarios indeseados. En otro aspecto, el método de reensamble de ligamiento se lleva a cabo de una manera sistemática. Por ejemplo, el método se lleva a cabo con el objeto de generar una biblioteca sistemáticamente compartimentalizada de moléculas de progenie, con compartimientos que se puedan analizar de una manera sistemática, v.gr., uno por uno. En otras palabras, esta invención dispone que, a través del uso selectivo y juicioso de los bloques de construcción de ácidos nucleicos específicos, junto con el uso selectivo y juicioso de reacciones de ensamble secuencialmente escalonadas, se puede lograr un diseño donde se hagan conjuntos específicos de productos de progenie en cada uno de los diferentes recipientes de reacción. Esto permite que se lleve a cabo un procedimiento sistemático de examen y análisis. Por consiguiente, estos métodos permiten que se examinen sistemáticamente un número potencialmente muy grande de moléculas de progenie en grupos más pequeños. Debido a su capacidad para llevar a cabo quimerizaciones de una manera que es altamente flexible, y no obstante es exhaustiva y sistemática también, en particular cuando hay un bajo nivel de homología entre las moléculas progenitoras , estos métodos proporcionan la generación de una biblioteca (o conjunto) comprendida de un gran número de moléculas de progenie. Debido a la naturaleza no estocástica del reensamble de ligamiento de la presente invención, las moléculas de progenie generadas de preferencia comprenden una biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos quiméricas finalizadas que tienen un orden de ensamble global que se selecciona por diseño. También se pueden utilizar los métodos de mutagénesis de saturación y de evolución dirigida optimizada, para generar diferentes especies moleculares de progenie. Se aprecia que la invención proporciona libertad de elección y control con respecto a la selección de los puntos de demarcación, el tamaño, y el número de los bloques de construcción de ácidos nucleicos, y el tamaño y diseño de los acoplamientos. Además, se aprecia que el requerimiento de homología intermolecular está altamente relajado para la capacidad de operación de esta invención. De hecho, se pueden incluso seleccionar puntos de demarcación en áreas de poca o ninguna homología intermolecular. Por ejemplo, debido a la ondulación de los codones, es decir, la degeneración de los codones, se pueden introducir sustituciones de nucleotidos en los bloques de construcción de ácidos nucleicos sin alterar el aminoácido originalmente codificado en la plantilla progenitora correspondiente. De una manera alternativa, se puede alterar un codón, de tal manera que se altere la codificación de un aminoácido original . Esta invención dispone que se puedan introducir estas sustituciones en el bloque de construcción de ácido nucleico, con el objeto de aumentar la incidencia de puntos de demarcación homólogos intermoleculares, y por lo tanto, permitir que se logre un mayor número de acoplamientos entre los bloques de construcción, lo cual a su vez permite que se genere un mayor número de moléculas quiméricas de progenie. En un aspecto, la presente invención provee un método no estocástico llamado reensamble genético sintético, que está relacionado en cierta medida con la mezcla estocástica, salvo que los bloques de construcción de ácidos nucleicos no son mezclados o concatenados o quimerizados de manera aleatoria, sino mas bien son ensamblados de manera no estocástica.
El método de reensamble genético sintético no depende de la presencia de un alto nivel de homología entre los polinucleótidos por mezclarse. La invención puede ser usada para generar de manera no estocástica bibliotecas (o conjuntos) de moléculas de progenie compuesta por mas de 10100 quimeras diferentes. De manera concebible, el reensamble genético sintético puede incluso ser usado para generar bibliotecas compuestas por mas de io1000 quimeras de progenie diferente. De esta manera, en un aspecto, la invención provee un método no estocástico de producir un conjunto de moléculas quiméricas de ácidos nucleicos finalizado teniendo un orden de ensamble global que es escogido por diseño, el cual método comprende los pasos de generar por diseño una pluralidad de bloques de construcción de ácidos nucleicos específicos teniendo extremos capaces de ligarse, mutualmente compatibles, susceptibles de servicio, y ensamblando estos bloques de construcción de ácidos nucleicos, tal que se alcance un orden de ensamble global diseñado. Los extremos capaces de ligarse, mutuamente compatibles de los bloques de construcción de ácidos nucleicos por ensamblarse son considerados como "susceptibles de servicio" para este tipo de ensamble ordenado si permiten a los bloques de construcción acoplarse en órdenes predeterminados. De esta manera, en un aspecto, el orden de ensamble global en el cual pueden acoplarse bloques de construcción de ácidos nucleicos es especificado por el diseño de los extremos capaces de ligarse y, si va a usarse mas de un paso de ensamble, entonces el orden de ensamble global en el cual pueden acoplarse los bloques de construcción de ácidos nucleicos también es especificado por el orden secuencial del paso o pasos de ensamble. En un aspecto de la invención, los pedazos de construcción templados son tratados con una enzima, tal como una ligasa (v.gr., ligasa de ADN T4) para lograr el enlace covalente de los pedazos de construcción. En otro aspecto, el diseño de los bloques de construcción de ácidos nucleicos es obtenidos previo análisis de las secuencias de un conjunto de plantillas de ácido nucleicos progenitores que sirve como base para producir un conjunto de progenie de moléculas quiméricas, finalizadas de ácidos nucleicos. Estas plantillas de ácidos nucleicos progenitores de esta manera sirven como una fuente de información de secuencia que ayuda en el diseño de los bloques de construcción de ácidos nucleicos que van a ser mutagenizados , es decir quimerizados o mezclados . En una ej emplificación, la invención dispone la quimerización de una familia de genes relacionados y su familia codificada de productos relacionados. En una ej emplificación particular, los productos codificados son enzimas. Las glucanasas, mananasas o xilanasas de la presente invención pueden ser mutagenizadas de acuerdo con los métodos descritos en la presente .
De esta manera, de acuerdo con un aspecto de la invención, las secuencias de una pluralidad de plantillas de ácidos nucleicos progenitores (v.gr. , polinucleótidos de la invención) son alineadas a fin de seleccionar uno o mas puntos de demarcación, los cuales puntos de demarcación pueden ser usados para delinear los límites de los bloques de construcción de ácidos nucleicos por generarse. De esta manera, los puntos de demarcación identificados y seleccionados en las moléculas progenitoras sirven como potenciales puntos de quimerizacion en el ensamble de las moléculas de progenie. Típicamente, un punto de demarcación susceptible de servicio es un área de homología (compuesta por al menos una base de nucleótido homologa) compartida por al menos dos plantillas progenitoras, pero el punto de demarcación puede ser un área de homología que es compartida por al menos la mitad de las plantillas progenitoras, al menos dos tercios de las plantillas progenitoras, al menos tres cuartos de las plantillas progenitoras y en un aspecto en casi todas las plantillas progenitoras. Incluso mas, en un aspecto, todavía un punto de demarcación capaz de servicio es un área de homología que es compartida por todas las plantillas progenitoras. En un aspecto, el proceso de reensamble de genes es llevado a cabo de manera exhaustiva a fin de generar una biblioteca exhaustiva. En otras palabras, todas las posibles combinaciones ordenadas de los bloques de construcción de ácidos nucleicos están representadas en el conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricas, finalizadas. Al mismo tiempo, el orden de ensamble (es decir, el orden de ensamble de cada bloque de construcción en la secuencia 51 a 3 ' de cada ácido nucleico quimérico finalizado) en cada combinación es por diseño (o no estocástico) . Debido a la naturaleza no estocástica del método, se reduce en gran medida la posibilidad de productos secundarios no deseados. En otro aspecto, el método dispone que el proceso de reensamble de genes sea llevado a cabo de manera sistemática, por ejemplo para generar una biblioteca compartimentalizada de manera sistemática, con compartimientos que pueden ser analizados de manera sistemática, v.gr., uno por uno. En otras palabras, la invención dispone que, mediante el uso selectivo y razonado de bloques de construcción de ácidos nucleicos específicos, acoplado con el uso selectivo y razonado de reacciones de ensamble escalonadas secuencialmente , puede alcanzarse un diseño experimental donde se hacen conjuntos específicos de productos de progenie en cada uno de los diversos recipientes de reacción. Esto permite llevar a cabo un procedimiento sistemático de examen, análisis y selección. De esta manera, permite examinar un potencialmente muy grande número de moléculas de progenie de manera sistemática en grupos mas pequeños. Debido a su capacidad de llevar a cabo la quimerización en una manera que sea altamente flexible pero exhaustiva y sistemática también, particularmente cuando hay un bajo nivel de homología entre las moléculas progenitoras , la presente invención dispone la generación de una biblioteca (o conjunto) compuesta por un gran número de moléculas de progenie. Debido a la naturaleza no estocástica del reensamble de genes de la presente invención, las moléculas de progenie generadas en un aspecto comprenden una biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos quiméricas, finalizadas, teniendo un orden de ensamble global que es seleccionado por diseño. En un aspecto particular, tal biblioteca generada comprende mas de 103 a mas de io1000 diferentes especies moleculares de progenie. En un aspecto, un conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricas, finalizadas, producido como se describió, comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido. De acuerdo con un aspecto, este polinucleótido es un gen, que puede ser un gen hecho por el hombre. De acuerdo con otro aspecto, este polinucleótido es una trayectoria de gen, que puede ser una trayectoria de gen hecha por el hombre. La invención dispone que uno o mas genes hechos por el hombre, generados por la invención, pueden ser incorporados en una trayectoria de gen hecha por el hombre, tal como una trayectoria que opera en un organismo eucariote (incluyendo una planta) . En otra ej emplificación, la naturaleza sintética del paso en el cual se general los bloques de construcción permite el diseño y la introducción de nucleótidos (v.gr., uno o mas nucleótidos , que pueden ser, por ejemplo, codones o intrones o secuencias reguladoras) que pueden después ser removidos opcionalmente en un proceso in vitro (v.gr., por medio de mutagénesis) o un proceso in vivo (v.gr., utilizando la capacidad de empalme de genes de un organismo hospedero) . Se apreciará que en muchos casos la introducción de estos nucleótidos puede también ser deseable por muchas otras razones además del beneficio potencial de crear un punto de demarcación capaz de servicio . De esta manera, de acuerdo con otro aspecto, la invención dispone que un bloque de construcción de ácidos nucleicos puede ser usado para introducir un intrón. De esta manera, la invención dispone que intrones funcionales pueden ser introducidos en un gen hecho por el hombre de la invención. La invención también dispone que intrones funcionales pueden ser introducidos en una trayectoria de gen hecha por el hombre de la invención. En consecuencia, la invención dispone la generación de un polinucleótido quimérico que es un gen hecho por el hombre que contiene uno (o mas) intrones introducidos artificialmente. En consecuencia, la invención también dispone la generación de un polinucleótido quimérico que es una trayectoria de gen hecha por el hombre conteniendo uno (o mas) intrones introducidos artificialmente. En un aspecto, el o los intrones introducidos artificialmente son funcionales en una o mas células hospederas para empalme de genes en gran medida en la manera en que los intrones que ocurren naturalmente sirven funcionalmente en el empalme de genes. La invención dispone un proceso de producir polinucleotidos que contienen uno o mas intrones hechos por el hombre para introducirse en organismos hospederos para recombinación y/o empalme. Un gen hecho por el hombre producido usando la invención puede también servir como un sustrato para recombinación con otro ácido nucleico. De manera similar, una trayectoria de gen hecha por el hombre producida usando la invención puede también servir como un sustrato para recombinación con otro ácido nucleico. En un aspecto, la recombinación es facilitada por, u ocurre en, áreas de homología entre el gen hecho por el hombre que contiene uno o mas intrones y un ácido nucleico, que sirve como un socio de recombinación. En un aspecto, el socio de recombinación puede también ser un ácido nucleico generado por la invención, incluyendo un gen hecho por el hombre o una trayectoria de gen hecha por el hombre. La recombinación puede ser facilitada por o puede ocurrir en áreas de homología que existen en el uno o mas intrones introducidos artificialmente en el gen hecho por el hombre. El método de reensamble genético sintético de la invención utiliza una pluralidad de bloques de construcción de ácido nucleico, cada uno de los cuales en un aspecto tiene dos extremos capaces de ligación. Los dos extremos capaces de ligación en cada bloque de construcción de ácidos nucleicos pueden ser dos extremos chatos (es decir, cada uno teniendo un alero de cero nucleótidos) , o en un aspecto un extremo chato y un alero o mas, en un aspecto todavía dos aleros. Un alero útil para este propósito puede ser un alero 3 ' o un alero 5' . De esta manera, un bloque de construcción de ácidos nucleicos puede tener un alero 3 ' o, de manera alternativa, un alero 5' o, de manera alternativa, dos alertos 3' o, de manera alternativa, dos aleros 5' . El orden global en el cual se ensamblan los bloques de construcción de ácidos nucleicos para formar una molécula de ácidos nucleicos quimérica, finalizada, es determinado por medio de diseño experimental dirigido y no es aleatorio. En un aspecto, un bloque de construcción de ácidos nucleicos es generado mediante síntesis química de dos ácidos nucleicos de una sola hélice (también referidos como oligos de una sola hélice) y poniéndolos en contacto de modo de permitirles templar para formar un bloque de construcción de ácidos nucleicos de doble hélice. Un bloque de construcción de ácidos nucleicos de doble hélice puede ser de tamaño variable. Los tamaños de estos bloques de construcción pueden ser pequeños o grandes. Tamaños ejemplares para bloques de construcción varían de un par de bases (sin incluir alero alguno) a 100,000 pares de bases (no incluyendo aleros) . También se proveen otros rangos de tamaño ejemplares, que tienen límites inferiores de 1 a 10,000 bp (pares de bases) (incluyendo cualquier valor entero entre ellos) y límites superiores de 2 a 100,000 bp (incluyendo cualquier valor entero entre ellos) . Existen muchos métodos mediante los cuales puede generarse un bloque de construcción de ácidos nucleicos de doble hélice que sea capaz de servicio para la invención; y éstos son conocidos en la materia y pueden ser fácilmente llevados a cabo por el técnico en la materia. De acuerdo con un aspecto, se genera un bloque de construcción de ácidos nucleicos de doble hélice primero generando dos ácidos nucleicos de una sola hélice y permitiéndoles templar para formar un bloque de construcción de ácidos nucleicos de doble hélice. Las dos hélices de un bloque de construcción de ácidos nucleicos de doble hélice pueden ser complementarias en cada nucléotido de cualquiera que forme un alero,- así no conteniendo faltas de correspondencia, aparte de cualquier alero. De acuerdo con otro aspecto, las dos hélices de un bloque de construcción de ácidos nucleicos de doble hélice son complementarias en menos que cada nucleotido aparte de cualquiera que forma un alero. De esta manera, de acuerdo con este aspecto, un bloque de construcción de ácidos nucleicos de doble hélice puede ser usado para introducir degeneración de codones . En un aspecto, se introduce la degeneración de codones usando la mutagénesis de saturación de sitio descrita en la presente, usando uno mas cassettes N,N,G/T o, de manera alternativa, usando uno o mas cassettes ?,?,?. El método de recombinación in vivo de la invención puede ser llevado a cabo de manera ciega en un grupo de híbridos o alelos desconocidos de un polinucleótido o una secuencia específicos. Sin embargo, no es necesario conocer la secuencia de ADN o ARN real del polinucleótido específico. El enfoque de usar recombinación dentro de una población mixta de genes puede ser útil para la generación de cualesquiera proteínas útiles, por ejemplo, interleucina I, anticuerpos, tPA y hormona del crecimiento. Este enfoque puede ser usado para generar proteínas que tienen especificidad o actividad alteradas. El enfoque puede también ser útil para la generación de secuencias híbridas de ácidos nucleicos, por ejemplo regiones promotoras, intrones, exones, secuencias acrecentadoras , regiones 31 sin traducir o regiones 51 sin traducir de genes. De esta manera, este enfoque puede ser usado para generar genes que tienen tasas de expresión incrementadas. Este enfoque puede también ser útil en el estudio de secuencias de ADN repetitivas. Finalmente, este enfoque puede ser útil para mutar ribozimas o aptámeros . En un aspecto, la invención descrita en la presente está dirigida al uso de ciclos repetidos de redistribución reductiva, recombinación y selección que permitan evolución molecular dirigida de secuencias lineales altamente complejas, tales como ADN, ARN o proteínas, mediante recombinación.
Sistema, de Evolución Dirigida Optimizada La invención proporciona un sistema de modificación genética no estocástico denominado "sistema de evolución dirigida optimizada" para generar polipéptidos , v.gr., glucanasas, mananasas o xilanasas, o anti-cuerpos de la invención, con propiedades nuevas o alteradas. La evolución dirigida optimizada se refiere al uso de ciclos repetidos de reclasificación reductiva, recombinación, y selección, que permiten la evolución molecular dirigida de los ácidos nucleicos a través de recombinación. La evolución dirigida optimizada permite la generación de una gran población de secuencias quiméricas evolucionadas, en donde la población generada está significativamente enriquecida en secuencias que tienen un número de eventos cruzados previamente determinado. Un evento cruzado es un punto en una secuencia quimérica en donde se presenta un cambio en la secuencia desde una variante progenitora hasta otra variante progenitora. Este punto normalmente está en la unión en donde se ligan entre sí los oligonucleótidos de dos progenitores, para formar una sola secuencia. Este método permite calcular las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleótidos, de tal manera que se enriquece la población quimérica final de secuencias para el número seleccionado de eventos cruzados. Esto proporciona más control sobre la selección de las variantes quiméricas que tengan un número previamente determinado de eventos cruzados .
En adición, este método proporciona un medio conveniente para explorar una tremenda cantidad del posible espacio variante de proteína en comparación con otros sistemas. Previamente, si se generaban, por ejemplo, 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, era extremadamente difícil probar este número tan alto de variantes quiméricas para determinar una actividad particular. Más aún, una porción significativa de la población de progenie tendría un número muy alto de eventos cruzados, que daría como resultado proteínas que tuvieran menos probabilidades de tener mayores niveles de una actividad particular. Mediante la utilización de estos métodos, se puede enriquecer la población de moléculas quiméricas para las variantes que tengan un número particular de eventos cruzados. Por consiguiente, aunque todavía se pueden generar 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, cada una de las moléculas seleccionadas para el análisis adicional más probablemente tiene, por ejemplo, sólo tres eventos cruzados. Debido a que se puede desfasar la población de progenie resultante para tener un número previamente determinado de eventos cruzados, se reducen los límites sobre la variedad funcional entre las moléculas quiméricas. Esto proporciona un número más manejable de variables cuando se calcula cuál oligonucleótido a partir de los polinucleótidos progenitores originales, podría ser responsable de afectar un rasgo particular. Un método para crear una secuencia de polinucleótido de progenie quimérica, es crear oligonucleótidos correspondientes a fragmentos o porciones de cada secuencia progenitora. Cada oligonucleótido de preferencia incluye una región única de traslape, de tal manera que la mezcla de los oligonucleótidos entre sí da como resultado una nueva variante que tiene cada fragmento de oligonucleótido ensamblado en el orden correcto. Se puede encontrar también información adicional, por ejemplo, en la solicitud de patente US 09/332,835; y en la patente US 6,361,974. El número de oligonucleótidos generados para cada variante progenitora tiene una relación con el número total de cruces resultantes en la molécula quimérica que se crea finalmente. Por ejemplo, se podrían proporcionar tres variantes de secuencias de nucleótidos progenitoras para sufrir una reacción de ligamiento, con el objeto de encontrar una variante quimérica que tenga, por ejemplo, una mayor actividad a alta temperatura. Como un ejemplo, se puede generar un conjunto de 50 secuencias de oligonucleótidos correspondientes a cada una de las porciones de cada variante progenitora. De conformidad con lo anterior, durante el proceso de reensamble de ligamiento, podría haber hasta 50 eventos cruzados dentro de cada una de las secuencias quiméricas. La probabilidad de que cada uno de los polinucleotidos quiméricos generados contenga oligonucleótidos a partir de cada variante progenitora en orden alternado, es muy baja. Si cada fragmento de oligonucleótido está presente en la reacción de ligamiento en la misma cantidad molar, es probable que, en algunas posiciones, los oligonucleótidos a partir del mismo polinucleótido progenitor se liguen unos en seguida de otros, y por lo tanto, no den como resultado un evento cruzado. Si se mantiene constante la concentración de cada oligonucléotido a partir de cada progenitor durante cualquier paso de ligamiento en este ejemplo, hay 1/3 de oportunidad (asumiendo tres progenitores) de que un oligonucléotido a partir de la misma variante progenitora se ligue dentro de la secuencia quimérica y no produzca cruce . De conformidad con lo anterior, se puede determinar una función de densidad de probabilidad (PDF) para predecir la población de eventos cruzados que tienen probabilidades de presentarse durante cada paso en una reacción de ligamiento, dado un número establecido de variantes progenitoras , un número de oligonucleótidos correspondientes a cada variante, y las concentraciones de cada variante durante cada paso en la reacción de ligamiento. Más adelante se describen las estadísticas y matemáticas detrás de la determinación de la función de densidad de probabilidad. Mediante la utilización de estos métodos, se puede calcular la función de densidad de probabilidad, y de esta manera enriquecer la población de progenie quimérica para un número previamente determinado de eventos cruzados resultantes de una reacción de ligamiento particular. Más aún, se puede determinar previamente un número objetivo de eventos cruzados, y luego se programa el sistema para calcular las cantidades de partida de cada oligonucleotido progenitor durante cada paso en la reacción de ligamiento, para dar como resultado una función de densidad de probabilidad que se centre en un número previamente determinado de eventos cruzados. Estos métodos se refieren al uso de ciclos repetidos de reclasificación reductiva, recombinación, y selección, que permiten la evolución molecular dirigida de un ácido nucleico que codifique un polipéptido a través de recombinación. Este sistema permite la generación de una gran población de secuencias quiméricas evolucionadas, en donde la población generada se enriquece de una manera significativa en secuencias que tienen un número previamente determinado de eventos cruzados. Un evento cruzado es un punto en una secuencia quimérica en donde se presenta un cambio en la secuencia desde una variante progenitora hasta otra variante progenitora. Este punto normalmente está en la unión en donde se ligan entre sí los oligonucleótidos a partir de dos progenitores para formar una sola secuencia. El método permite calcular las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleótidos, de tal manera que se enriquece la población quimérica final de secuencias en el número seleccionado de eventos cruzados. Esto proporciona más control sobre la selección de variantes quiméricas que tengan un número previamente determinado de eventos cruzados. En adición, estos métodos proporcionan un medio conveniente para explorar una tremenda cantidad del posible espacio variante de proteína en comparación con otros sistemas.
Mediante el empleo de los métodos descritos en la presente, la población de moléculas quiméricas se puede enriquecer para las variantes que tengan un número particular de eventos cruzados. Por consiguiente, aunque todavía se pueden generar 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, cada una de las moléculas seleccionadas para su análisis adicional más posiblemente tiene, por ejemplo, solamente tres eventos cruzados. Debido a que se puede desfasar la población de progenie resultante para tener un número previamente determinado de eventos cruzados, se reducen los límites sobre la variedad funcional entre las moléculas quiméricas. Esto proporciona un número más manejable de variables cuando se calcula cuál oligonucleótido de los polinucleótidos progenitores originales podría ser responsable de afectar a un rasgo particular. En un aspecto, el método crea una secuencia de polinucleótido de progenie quimérica mediante la creación de oligonucleótidos que corresponden a fragmentos o porciones de cada secuencia progenitora. Cada oligonucleótido incluye de preferencia una región única de traslape, de tal manera que la mezcla de los oligonucleótidos entre sí, da como resultado una nueva variante que tenga cada fragmento de oligonucleótido ensamblado en el orden correcto. Ver también la solicitud de patente US 09/332,835. Determinación de Eventos Cruzados Los aspectos de la invención incluyen un sistema y software que reciben una función de densidad de probabilidad (PDF) de cruce deseada, el número de genes progenitores que se van a reensamblar, y el número de fragmentos en el reensamble como entradas. La salida de este programa es una "función de densidad de probabilidad de fragmento" que se puede utilizar para determinar una receta para producir genes reensamblados, y la función de densidad de probabilidad de cruce estimada de estos genes. El procesamiento descrito en la presente de preferencia se lleva a cabo en MATLAB (The Mathworks, Natick, Massachusetts , Estados Unidos) , un lenguaje de programación y un medio ambiente de desarrollo para computación técnica. Procesos Iterativos En la práctica de la invención, estos procesos se pueden repetir de una manera iterativa. Por ejemplo, se identifica un ácido nucleico (o el ácido nucleico) responsable de un fenotipo de glucanasa, mananasa o xilanasa, alterado o nuevo, se vuelve a aislar, se modifica nuevamente, y se vuelve a probar para determinar su actividad. Este proceso se puede repetir de una manera iterativa hasta que se diseñe un fenotipo deseado. Por ejemplo, se puede diseñar una senda anabólica o catabólica bioquímica entera en una célula, incluyendo, por ejemplo, una actividad de glucanasa, mananasa o xilanasa. De una manera similar, si se determina que un oligonucleótido particular no tiene efecto alguno sobre el rasgo deseado (por ejemplo, un nuevo fenotipo de glucanasa) , se puede remover como una variable, sintetizando oligonucleótidos progenitores más grandes que incluyan la secuencia que se vaya a remover. Debido a que la incorporación de la secuencia dentro de una secuencia más grande impide cualquier evento cruzado, ya no habrá variación alguna de esta secuencia en los polinucleótidos de progenie. Esta práctica iterativa de determinar cuáles oligonucleótidos están más relacionados con el rasgo deseado, y cuáles no están relacionados, permite hacer una exploración más eficiente de todas las variantes de proteína posible que podrían proporcionar un rasgo o actividad particular. Mezcla In Vivo La mezcla in vivo de moléculas es el uso en los métodos de la invención que proporciona variantes de polipéptidos de la invención, por ejemplo anti -cuerpos , glucanasas, mananasas, o xilanasas, y similares. La mezcla in vivo se puede llevar a cabo utilizando la propiedad natural de las células para recombinar multímeros. Aunque la recombinación in vivo ha proporcionado la principal ruta natural hacia la diversidad molecular, la recombinación genética sigue siendo un proceso relativamente complejo que involucra: 1) el reconocimiento de homologías; 2) la disociación de cadena, invasión de cadena, y pasos metabólicos que conducen a la producción de quiasma recombinante ; y finalmente 3) la resolución del quiasma en moléculas recombinadas separadas. La formación del quiasma requiere del reconocimiento de secuencias homologas.
En un aspecto, la invención proporciona un método para producir un polinucleotido híbrido a partir de cuando menos un primer polinucleotido y un segundo polinucleotido. La invención se puede utilizar para producir un polinucleotido híbrido mediante la introducción de cuando menos un primer polinucleotido y un segundo polinucleotido que compartan cuando menos una región de homología de secuencia parcial (v.gr., SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 , 59, 61, 63, 65, 67 , 69, 71, 73, 75, 77 , 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105 , 107, 109, 111, 113 , 115, 117, 119, 121 , 123, 125, 127 , 129, 131 , 133, 135, 137, 139 , 141, 143 , 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 , 159, 161, 163 , 165 , 167, 169, 171, 173 , 175, 177, 179, 181, 183 , 185, 187, 189, 191 , 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209 , 211, 213 , 215, 217 , 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233 , 235 , 237, 239, 241, 243 , 245, 247 , 249, 251, 253, 255, 257 y sus combinaciones) en una célula hospedera adecuada. Las regiones de homología de secuencias parcial promueven procesos que dan como resultado reorganización de secuencias produciendo un polinucleotido híbrido. El término "polinucleotido híbrido", como se utiliza en la presente, es cualquier secuencia de nucleótidos que resulte del método de la presente invención, y que contenga la secuencia a partir de cuando menos dos secuencias de polinucleótidos originales. Estos polinucleótidos híbridos pueden resultar de eventos de recombinación intermolecular que promueven la integración de secuencia entre las moléculas de ADN. En adición, tales polinucleótidos híbridos pueden resultar de los procesos de redistribución reductiva intramolecular, que utilizan secuencias repetidas para alterar una secuencia de nucleótidos dentro de una molécula de ADN. La redistribución in vivo se enfoca en procesos "intermoleculares" referidos colectivamente como "recombinación" , lo que en bacterias se observa generalmente como un fenómeno "dependiente de RecA" . La invención puede basarse en procesos de recombinación de una célula hospedera para recombinar y redistribuir secuencias, o la capacidad de las células para mediar procesos reductivos para reducir la complejidad de secuencias cuasi -repetidas en la célula por eliminación. Este proceso de "redistribución reductiva" ocurre por medio de un proceso "intra-molecular" , independiente de RecA. Por tanto, en otro aspecto de la invención, pueden generarse polinucleótidos novedosos mediante el proceso de redistribución reductiva. El método implica la generación de construcciones que contienen secuencias consecutivas (secuencias de codificación originales) , su inserción en un vector apropiado, y su introducción subsecuente en una célula hospedera apropiada. La redistribución de las identidades moleculares individuales ocurre por medio de procesos de combinación entre las secuencias consecutivas en las regiones de homología de procesamiento de construcciones, o entre unidades cuasi-repetidas . El proceso de redistribución recombina y/o reduce la complejidad y la extensión de las secuencias repetidas y da como resultado la producción de especies moleculares novedosas. Pueden aplicarse diversos tratamientos para acrecentar la tasa de redistribución. Estos pueden incluir tratamiento con luz ultravioleta, o productos químicos que dañan el ADN, y/o el uso de líneas de células hospederas que despliegan niveles acrecentados de "inestabilidad genética" . De esta manera, el proceso de redistribución puede implicar recombinación homologa o la propiedad natural de las secuencias cuasi-repetidas para dirigir su propia evolución. Las secuencias repetidas o "cuasi-repetidas" juegan un papel en la inestabilidad genética. En la presente invención, las "cuasi -repeticiones" son repeticiones que no están restringidas a su estructura unitaria original. Las unidades cuasi-repetidas pueden ser presentadas como un arreglo de secuencias en una construcción; unidades consecutivas de secuencias similares. Una vez ligadas, las uniones entre las secuencias consecutivas se tornan esencialmente invisibles y la naturaleza cuasi-repetitiva de la construcción resultante es ahora continua al nivel molecular. El proceso de eliminación que lleva a cabo la célula para reducir la complejidad de la construcción resultante opera entre las secuencias cuasi-repetidas. Las unidades cuasi-repetidas proveen un repertorio prácticamente sin límites de plantillas en las cuales pueden ocurrir eventos de resbalamiento. Las construcciones conteniendo las cuasi-repeticiones de esta manera proveen efectivamente suficiente elasticidad molecular para que puedan ocurrir eventos de eliminación (y potencialmente de inserción) virtualmente en cualquier sitio dentro de las unidades cuasi -repetitivas . Cuando las secuencias cuasi -repetidas están todas ligadas en la misma orientación, por ejemplo cabeza a cola o viceversa, la célula no puede distinguir unidades individuales. En consecuencia, el proceso reductivo puede ocurrir a través de todas las secuencias. En contraste, cuando por ejemplo las unidades están presentadas cabeza a cabeza mas que cabeza a cola, la inversión delinea los puntos de extremo de la unidad adyacente de modo de que la formación de una eliminación favorezca la pérdida de unidades discretas. De esta manera, se prefiere con el presente método que las secuencias estén en la misma orientación. La orientación aleatoria de secuencias cuasi-repetidas dará como resultado la pérdida de eficiencia de redistribución, mientras que la orientación consistente de las secuencias ofrecerá la mas alta eficiencia. Sin embargo, aunque tener menos secuencias contiguas en la misma orientación reduce la eficiencia, puede todavía aportar suficiente elasticidad para la efectiva recuperación de moléculas novedosas. Pueden hacerse construcciones con las secuencias cuasi-repetidas en la misma orientación para permitir una mayor eficiencia. Las secuencias pueden ser ensambladas en una orientación de cabeza a cola usando cualquiera de una variedad de métodos, incluyendo los siguientes: a) pueden usarse cebadores que incluyen una cabeza poli -A y una cola poli-T que, cuando se hacen de una sola hélice, pudieran aportar orientación. Esto es logrado teniendo las primeras pocas bases de los cebadores hechas de ARN y por ende ARNasaH fácilmente removida; b) pueden utilizarse cebadores que incluyen sitios de corte por restricción únicos. Se requerirían sitios múltiples, una batería de secuencias únicas y pasos repetidos de síntesis y ligación; c) pueden tiolarse las pocas bases internas del cebador y usarse una exonucleasa para producir moléculas con colas apropiadas . La recuperación de las secuencias redistribuidas se basa en la identificación de vectores de clonación con un índice repetitivo (RI) reducido. Las secuencias de codificación redistribuidas pueden entonces ser recuperadas por amplificación. Los productos son re-clonados y expresados. La recuperación de vectores de clonación con RI reducido puede ser efectuada por medio de : 1) El uso de vectores mantenidos solamente de manera estable cuando la construcción es reducida en complejidad. 2) La recuperación física de vectores acortados por medio de procedimientos físicos. En este caso, el vector de clonación sería recuperado usando procedimientos estándar de aislamiento de plásmidos y fraccionado en tamaño sobre ya sea un gel de agarosa, o en columna con un bajo corte de peso molecular utilizando procedimientos estándar. 3) La recuperación de vectores conteniendo genes interrumpidos que pueden ser seleccionados cuando se reduce el tamaño del inserto. 4) El uso de técnicas de selección directa con un vector de expresión y la selección apropiada. Secuencias de codificación (por ejemplo, genes) de organismos relacionados pueden demostrar un alto grado de homología y codificar productos de proteína bastante diversos. Estos tipos de secuencias son particularmente útiles en la presente invención como cuasi -repeticiones . Sin embargo, aunque los ejemplos ilustrados mas adelante demuestran la redistribución de secuencias de codificación originales, casi idénticas (cuasi-repeticiones) , este proceso no está limitado a tales repeticiones casi idénticas. El siguiente ejemplo demuestra un método de la invención. Se describe la codificación de secuencias de ácidos nucleicos (cuasi-repeticiones) derivadas de tres (3) especies únicas. Cada secuencia codifica una proteína con un conjunto de propiedades distinto. Cada una de las secuencias difiere por un solo o por unos cuantos pares de bases en una posición única en la secuencia. Las secuencias cuasi-repetidas son amplificadas y ligadas por separado o colectivamente en conjuntos aleatorios tal que estén disponibles todas las permutaciones y las combinaciones posibles en la población de moléculas ligadas. El número de unidades de cuasi-repetición puede ser controlado por las condiciones de ensamble. El número promedio de unidades cuasi -repetidas en una construcción es definido como el índice repetitivo (RI) . Una vez formadas, las construcciones pueden, o no, ser fraccionadas en tamaño sobre un gel de agarosa de acuerdo con protocolos publicados, insertadas en un vector de clonación y transfectadas a una célula hospedera apropiada. Las células son entonces propagadas y se efectúa "redistribución reductiva" . La tasa del proceso de redistribución reductiva puede ser estimulada por la introducción de daño al ADN, si se desea. Es irrelevante que la reducción en el RI sea mediada por formación de eliminaciones entre secuencias repetidas mediante un mecanismo "intra-molecular" , o mediada por eventos similares a recombinación a través de mecanismos "inter-moleculares" . El resultado final es una redistribución de las moléculas en todas las posibles combinaciones. De manera opcional, el método comprende el paso adicional de analizar y seleccionar los miembros de la biblioteca del grupo mezclado para identificar miembros individuales de la biblioteca mezclada teniendo la capacidad de ligarse a o interactuar de otra manera o catalizar una reacción particular (v.gr., tal como el dominio catalítico de una enzima) con una macro-molécula predeterminada, tal como, por ejemplo, un receptor proteico, un oligosacárido, un virión, u otro compuesto o estructura predeterminados. Los polipéptidos que son identificados a partir de tales bibliotecas pueden ser usados para fines terapéuticos, de diagnóstico, de investigación y relacionados (v.gr., catalizadores, solutos para incrementar la osmolaridad de una solución acuosa y similares) y/o pueden someterse a uno o mas ciclos adicionales de mezclado y/o selección. En otro aspecto, se contempla que antes de o durante recombinación o redistribución, los polinucleótidos generados por el método de la invención pueden ser sometidos a agentes o procesos que promuevan la introducción de mutaciones en los polinucleótidos originales. La introducción de tales mutaciones incrementaría la diversidad de los polinucleótidos híbridos resultantes y los polipéptidos codificados a partir de aquéllos. Los agentes o procesos ¦ que promueven la mutagénesis pueden incluir, pero no se limitan a: (+)-CC-1065, o un análogo sintético tal como (+) -CC-1065- (N3 -adenina) (ver Sun y Hurley, (1992); un aducto de 4 ' -fluoro-4 -aminobifenil N-acetilado o desacetilado , capaz de inhibir la síntesis de ADN (ver, por ejemplo, van de Poli y colaboradores (1992); o un aducto de 4-aminobifenil N-acetilado o desacetilado capaz de inhibir la síntesis de ADN (ver, también, van de Poli y colaboradores (1992) , pp . 751-758) ; cromo trivalente, una sal cromo trivalente, un aducto de AND de hidrocarburo aromático policíclico (PAH) capaz de inhibir la replicación de ADN, tal como 7 -bromometil -benz [a] antraceno ("BMA"), tris (2 , 3 -dibromopropil ) fosfato ("Tris-BP" ) , 1 , 2 -dibromo-3 -cloropropano ( "DBCP" ) , 2 -bromoacroleína (2BA) , benzo [a]pireno-7, 8-dihidrodiol-9-10-epóxido ( "BPDE" ) , una sal halógeno de platino (II), N-hidroxi-2 -amino-3 -metilimidazo [4 , 5-f] -quinolina ( "N-hidroxi - IQ" ) , y N-hidroxi-2-amino-l-metil-6-fenilimidazo [ , 5-f] -piridina ( "N-hidroxi-PhIP" ) . Medios ejemplares para hacer mas lenta o detener la amplificación por PCR consisten en luz ultravioleta (+) -CC-1065 y (+) -1065- (N3-adenina) . Medios particularmente englobados son aductos de ADN o polinucleótidos comprendiendo los aductos de ADN de los polinucleótidos o grupo de polinucleótidos , que pueden liberarse o removerse mediante un proceso que incluye calentar la solución comprendiendo los polinucleótidos antes de procesamiento adicional . En otro aspecto, la invención está dirigida a un método de producir proteínas recombinantes que tienen actividad biológica tratando una muestra que comprende polinucleótidos de plantilla de doble hélice codificando una proteína tipo silvestre bajo condiciones de acuerdo con la invención que disponen la producción de polinucleótidos híbridos o redistribuidos.
Producción de Variantes de Secuencia La invención también proporciona métodos adicionales para hacer variantes de secuencia de las secuencias de ácidos nucleicos (v.gr., glucanasa, mananasa o xilanasa) de la invención. La invención también proporciona métodos adicionales para aislar glucanasas, mananasas o xilanasas utilizando los ácidos nucleicos y los polipéptidos de la invención. En un aspecto, la invención proporciona variantes de una secuencia de codificación de glucanasa, mananasa, o xilanasa (v.gr., un gen, ADNc, o un mensaje) de la invención, las cuales se pueden alterar por cualquier medio, incluyendo, v.gr., métodos aleatorios o estocásticos , o métodos no estocásticos o de "evolución dirigida", como se describieron anteriormente. Las variantes aisladas pueden presentarse naturalmente. Las variantes también se pueden crear in vitro. Las variantes se pueden crear empleando técnicas de ingeniería genética, tales como mutagénesis dirigida al sitio, mut-agénesis química aleatoria, procedimientos de supresión de exonucleasa III, y técnicas de clonación convencionales. De una manera alternativa, estas variantes, fragmentos, análogos, o derivados, se pueden crear empleando procedimientos de síntesis o modificación química. Otros métodos para hacer variantes también son familiares para los técnicos en este campo. Éstos incluyen procedimientos en donde se modifican las secuencias de ácidos nucleicos obtenidas a partir de aislados naturales, para generar ácidos nucleicos que codifiquen polipéptidos que tengan características que mejoren su valor en las aplicaciones industriales o de laboratorio. En estos procedimientos, se generan y caracterizan un gran número de secuencias variantes que tienen una o más diferencias de nucleótidos con respecto a la secuencia obtenida a partir del aislado natural. Estas diferencias de nucleótidos pueden dar como resultado cambios de aminoácidos con respecto a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos a partir de los aislados naturales. Por ejemplo, se pueden crear variantes utilizando reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error. En la reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error, se lleva a cabo la reacción en cadena de la polimerasa bajo condiciones en donde la fidelidad de copiado de la polimerasa de ADN sea baja, de tal manera que se obtenga un alto índice de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de reacción en cadena de la polimerasa. La reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error se describe, por ejemplo, en Leung, D.W. y colaboradores , Technique, 1:11-15,1989, Caldwell, R.C. y Joyce G.F., PCR Methods Applic, 2:28-33, 1992. Dicho de una manera breve, en estos procedimientos, los ácidos nucleicos que se vayan a mutar se mezclan con los cebadores de reacción en cadena de la polimerasa, el regulador de reacción, MgCl2, nCl2, polimerasa Taq, y una concentración apropiada de dNTPs, para alcanzar un alto índice de mutación puntual a lo largo de toda la longitud del producto de reacción en cadena de la polimerasa. Por ejemplo, la reacción se puede llevar a cabo utilizando 20 ficomoles de ácido nucleico que se vaya a mutar, 30 picomoles de cada cebador de reacción en cadena de la polimerasa, un regulador de reacción que comprenda KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH de 8.3), y gelatina al 0.01 por ciento, MgCl2 7 mM, MnCl2 0.5 mM, 5 unidades de polimerasa Taq, dGTP 0.2 mM, dATP 0.2 mM, dCTP 1 mM, y dTTP 1 mM. La reacción en cadena de la polimerasa se puede llevar a cabo por 30 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 45°C durante 1 minuto, y 72°C durante 1 minuto. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se · pueden variar según sea apropiado. Los ácidos nucleicos mutados se clonan en un vector apropiado, y se evalúan las actividades de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos mutados. También se pueden crear variantes utilizando mutagénesis dirigida al oligonucleotido, para generar mutaciones específicas del sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis del oligonucleotido se describe, v.gr., en Reidhaar-Olson (1988) Science 241:53-57. Brevemente, en estos procedimientos, una pluralidad de oligonucleótidos de doble hélice que lleven una o más mutaciones que se vayan a introducir en el ADN clonado, se sintetizan y se insertan en el ADN clonado que se vaya a mutar. Se recuperan los clones que contengan el ADN mutado, y se evalúan las actividades de los polipéptidos que codifiquen . Otro método para generar variantes es la reacción en cadena de la polimerasa de ensamble. La reacción en cadena de la polimerasa de ensamble involucra el ensamble de un producto de reacción en cadena de la polimerasa a partir de una mezcla de fragmentos de ADN pequeños . Se presentan un gran número de reacciones en cadena de la polimerasa diferentes en paralelo en el mismo frasco, cebando los productos de una reacción a los productos de otra reacción. La reacción en cadena de la polimerasa de ensamble se describe, por ejemplo, en la patente US 5,965,408. Todavía otro método para generar variantes es la mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa sexual. En la mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa sexual, se presenta una recombinación homologa forzada entre las moléculas de ADN de secuencias de ADN diferentes pero altamente relacionadas in vitro, como un resultado de la fragmentación aleatoria de la molécula de ADN, basándose en la homología de secuencias, seguida por fijación del cruce mediante extensión del cebador en una reacción en cadena de la polimerasa. La mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa sexual se describe, por ejemplo, en Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751. Dicho de una manera breve, en estos procedimientos, una pluralidad de ácidos nucleicos que se vayan a recombinar, se digieren con ADNsa para generar fragmentos que tengan un tamaño promedio de 50 a 200 nucleótidos. Los fragmentos del tamaño promedio deseado se purifican y se vuelven a suspender en una mezcla de reacción en cadena de la polimerasa. La reacción en cadena de la polimerasa se conduce bajo condiciones que faciliten la recombinación entre los fragmentos de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa se puede llevar a cabo volviendo a suspender los fragmentos purificados en una concentración de 10 a 30 nanogramos/ml en una solución de 0.2 mM de cada dNTP, MgCl2 2.2 mM, KCl 50 mM, Tris-Hcl 10 mM( pH de 9.0, y Tritón X-100 al 0.1 por ciento. Se agregan 2.5 unidades de polimerasa Taq por 100:1 de mezcla de reacción, y se lleva a cabo la reacción en cadena de la polimerasa empleando el siguiente régimen: 94°C durante 60 segundos, 94 °C durante 30 segundos., 50-55°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos (de 30 a 45 veces) , y 72°C durante 5 minutos. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se pueden variar según sea apropiado. En algunos aspectos, se pueden incluir oligonucleótidos en las reacciones en cadena de la polimerasa. En otros aspectos, se puede utilizar el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN en un primer conjunto de reacciones en cadena de la polimerasa, y se puede utilizar polimerasa Taq en un conjunto subsecuente de reacciones en cadena de la polimerasa. Se aislan las secuencias recombinantes , y. se evalúan las actividades de los polipéptidos que codifiquen. También se pueden crear variantes mediante mutagénesis in vivo. En algunos aspectos, se generan mutaciones aleatorias en una secuencia de interés, mediante la propagación de la secuencias de interés en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli, la cual lleve mutaciones en una o más de las sendas de reparación de ADN. Estas cepas "mutadoras" tienen un índice de mutación aleatoria más alto que aquél de una progenitora de tipo silvestre. La propagación del ADN en una de estas cepas eventualmente generará mutaciones aleatorias adentro del ADN. Las cepas mutadoras adecuadas para utilizarse para la mutagénesis in vivo se describen, por ejemplo, en la publicación internacional WO 91/16427, publicada el 31 de octubre de 1991, intitulada " ethods for Phenotype Creation from Múltiple Gene Populations" . .También se pueden generar variantes utilizando mutagénesis de cassette. En la mutagénesis de cassette, una pequeña región de una molécula de ADN de doble cadena es reemplazada con un "cassette" de oligonucleótido sintético que difiera de la secuencia nativa. El oligonucleótido con frecuencia contiene a la secuencia nativa completamente y/o parcialmente aleatorizada . También se puede emplear mutagénesis de ensamble recursivo para generar variantes. La mutagénesis de ensamble recursivo es un algoritmo para el diseño de proteínas (mutagénesis de proteínas) desarrollado para producir poblaciones diversas de mutantes fenotipicamente relacionados cuyos miembros difieren en la secuencia de aminoácidos. Este método utiliza un mecanismo de retroalimentación para controlar . las rondas sucesivas de mutagénesis de cassette de combinación. La mutagénesis de ensamble recursivo se describe, por ejemplo, en Arkin, A.P., y Youvan, D.C. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:7811-7815, 1992. En algunos aspectos, se crean variantes utilizando mutagénesis de ensamble exponencial . La mutagénesis de ensamble exponencial es un proceso para generar bibliotecas de combinación con un alto porcentaje de mutantes únicos y funcionales, en donde pequeños grupos de residuos se seleccionan aleatoriamente en paralelo para identificar, en cada posición alterada, los aminoácidos que conduzcan a las proteínas funcionales. La mutagénesis de ensamble exponencial se describe en Delegrave, S., y Youvan, D.C, Biotechnology Research 11:1548-1552, 1993. La mutagénesis aleatoria y dirigida al sitio se describen en Arnold, F.H., Current Opinión in Biotechnology 4:450-455, 1993. En algunos aspectos, las variantes se crean utilizando procedimientos de mezcla, en donde se fusionan entre sí porciones de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifiquen polipeptidos distintos, para crear secuencias de ácidos nucleicos quiméricas que codifiquen polipéptidos quiméricos, como se describe, por ejemplo, en la patente US 5,965,408, presentada el 9 de julio de 1996, intitulada "Method of DNA Reassembly by Interrupting Synthesis" , y la patente US 5,939,250, presentada el 22 de mayo de 1996, intitulada "Production of Enzymes Having Desired Activities by Mutagénesis" . La invención dispone formas de realización alternativas de los polipéptidos de la invención (y los ácidos nucleicos que los codifican) que comprenden al menos una sustitución de aminoácido conservadora, como se discute en la presente (v.gr., las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquéllas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares) . La invención provee polipéptidos (y los ácidos nucleicos que los codifican) donde cualquiera, algunos o todos los residuos de aminoácidos son sustituidos por otro aminoácido de características similares, v.gr., una sustitución de aminoácidos conservadora. Sustituciones conservadoras son aquéllas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Típicamente vistos como sustituciones conservadoras son los siguientes reemplazos: reemplazos de un aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina, e isoleucina, con otro aminoácido alifático; el reemplazo de una serina con una treonina o viceversa; el reemplazo de un residuo ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico, con otro residuo ácido; el reemplazo de un residuo que lleve un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, con otro residuo que lleve un grupo amida; el intercambio de un residuo básico, tal como lisina y arginina, con otro residuo básico; y el reemplazo de un residuo aromático, tal como fenilalanina , tirosina, con otro residuo aromático. En aspectos alternativos, estas sustituciones conservadoras pueden también ser equivalentes sintéticos de estos aminoácidos.
Otras variantes son aquéllas en las cuales uno o mas de los residuos de aminoácidos de un polipéptido de la invención incluyen un grupo sustituyente . Todavía otras variantes son aquéllas donde el polipéptido está asociado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol ) . Variantes adicionales son aquéllas donde se fusionan aminoácidos adicionales al polipéptido, tales como una secuencia líder, una secuencia secretora, una secuencia de proproteína, o una secuencia que facilite la purificación, el enriquecimiento, o la estabilización del polipéptido. En algunos aspectos, los fragmentos, los derivados, y los análogos de los polipéptidos de la invención conservan la misma función o actividad biológica que los polipéptidos de la invención. En otros aspectos, el fragmento, el derivado o el análogo incluyen una proproteína, tal que el fragmento, el derivado, o el análogo pueda ser activado por corte de la porción de proproteína para producir un polipéptido activo. Optimización de Codones para Alcanzar Altos Niveles de Expresión de Proteína en Células Hospederas La invención proporciona métodos para modificar ácidos nucleicos que codifican glucanasa, mananasa o xilanasa, para modificar el uso de codones. En un aspecto, la invención proporciona métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica una glucanasa, con el fin de aumentar o reducir su expresión en una célula hospedera. La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican una glucanasa, mananasa o xilanasa modificada para aumentar su expresión en una célula hospedera, la glucanasa, mananasa o xilanasa así modificada, y métodos para hacer glucanasas, mananasas o xilanasas modificadas. El método comprende identificar un codón "no preferido" o un codón "menos preferido" en el ácido nucleico que codifica una glucanasa, mananasa o xilanasa, y reemplazar uno o más de estos codones no preferidos o menos preferidos con un "codón preferido" que codifique el mismo aminoácido que el codón reemplazado, y cuando menos un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico ha sido reemplazado por un codón preferido que codifique el mismo aminoácido. Un codón preferido es un codón sobre-representado en las secuencias de codificación de los genes de la célula hospedera, y un codón no preferido o menos preferido es un codón sub-representado en las secuencias de codificación de los genes de la célula hospedera. Las células hospederas para expresar los ácidos nucleicos, los cassettes de expresión, y los vectores de la invención, incluyen bacterias, levadura, hongos, células de plantas, células de insectos, y células de mamíferos. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para optimizar el uso de codones en todas estas células, ácidos nucleicos y polipéptidos con los codones alterados hechos mediante los ácidos nucleicos con los codones alterados. Los ejemplos de las células hospederas incluyen bacterias gram-negativas , tales como Escherichia coli; bacterias gram-positivas , tales como cualquier Streptomyces , Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris , cualquier Bacillus , por ejemplo Bacillus subtilis , Bacillus cereus) . Las células hospederas de ejemplo también incluyen organismos eucarioticos, por ejemplo diferentes levaduras, tales como Saccharomyces sp. , incluyendo Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris , y Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha , Aspergillus niger, y células y líneas celulares de mamífero, y células y líneas celulares de insecto. De esta manera, la invención también incluye ácidos nucleicos y polipéptidos optimizados para expresión en estos organismos y especies, v.gr., los ácidos nucleicos de la invención son optimizados en codones para expresión en una célula hospedera, v.gr., Pichia sp., v.gr., P. pastoris, Saccharomyces sp., o Bacillus sp., Streptomyces sp., y similares . Por ejemplo, los codones de un ácido nucleico que codifique un polipéptido de la invención, v.gr., una glucanasa, mananasa o xilanasa, o una enzima similar aislada a partir de una célula bacteriana, se modifican de tal manera que el ácido nucleico (que codifica la enzima) sea expresado de manera óptima en una célula bacteriana diferente de la bacteria a partir de la cual se derivó la enzima (v.gr., glucanasa, mananasa, o xilanasa) , una levadura, un hongo, una célula de planta, una célula de insecto, o una célula de mamífero. Los métodos para optimizar los codones son bien conocidos en la materia, ver, v.gr., la patente US 5,795,373; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118; Hale (1998) Protein Expr . Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253. Ver también Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253, que describe la optimización de codones en sistemas de ratón; Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24, que describe la optimización de codones en levadura; Feng (2000) Biochemistry 39:15399-15409, que describe la optimización de codones en E. coli; Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264, que describe la optimización del uso de codones que afecta la secreción en E. coli; Gao (2004) Biotechnol Prog. 20:443-448, describiendo "UpGene" , una aplicación de un algoritmo de optimización de codones de ADN basado en web. Por ejemplo, como se discute en el Ejemplo 4, mas adelante, el ácido nucleico que codifica el polipéptido que tiene una secuencia como se señala en la SEQ ID NO : 6 (v.gr., SEQ ID NO: 5) fue sometido a optimización de codones para expresión óptima en Pichia pastoris ; el ácido nucleico que codifica la enzima optimizada en codones en Pichia pastoris es la SEQ ID NO: 463. El polipéptido ejemplar que tiene una secuencia como se señala en la SEQ ID NO:464 en la posición 91 es alanina (SEQ ID NO: 464) , y en un aspecto alternativo, valina (como en la SEQ ID NO: 6) . De manera similar, el ácido nucleico ejemplar que codifica la SEQ ID NO:464 (es decir, la SEQ ID NO:463) , en formas de realización alternativas, puede codificar ya sea alanina o valina (u otra sustitución conservadora) en la posición 91. De manera similar, el ácido nucleico ejemplar que codifica la SEQ ID NO: 6 (es decir, la SEQ ID NO: 5), en formas de realización alternativas, puede codificar ya sea alanina o valina (u otra sustitución conservadora) en la posición 91. De hecho, la invención provee formas de realización alternativas de los polipéptidos de la invención (y los ácidos nucleicos que los codifican) comprendiendo al menos una sustitución de aminoácidos conservadora, como se discute en la presente (v.gr. , las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares) , como se discute en la presente . Animales No Humanos Transgénicos La invención proporciona animales no humanos transgénicos que comprenden un ácido nucleico, un polipéptido (v.gr., una glucanasa, mananasa o xilanasa) , un cassette de expresión, o un vector, o una célula transfectada o transformada de la invención. La invención también proporciona métodos para hacer y usar estos animales no humanos transgénicos. Los animales no humanos transgénicos pueden ser, v.gr. , cabras, conejos, ovejas, cerdos, vacas, ratas, y ratones, que comprendan a los ácidos nucleicos de la invención. Estos animales se pueden utilizar, v.gr., como modelos in vivo para estudiar la actividad de glucanasa, mananasa o xilanasa, o como modelos para analizar y seleccionar agentes que cambien la actividad de glucanasa, mananasa o xilanasa in vivo. Las secuencias de codificación para los polipéptidos que se vayan a expresar en los animales no humanos transgénicos se pueden diseñar como constitutivas, o bajo el control de factores reguladores de transcripción específicos del tejido, específicos del desarrollo, o inducibles. Los animales no humanos transgénicos se pueden diseñar y generar empleando cualquier método conocido en la materia; ver, v.gr., las patentes US 6,211,428; 6,187,992; 6,156,952; 6 , 118 , 044 ; 6 , 111 , 166 ; 6,107,541; 5,959,171; 5,922,854; 5,892,070; 5,880,327; 5,891,698; 5,639,940; 5,573,933; 5,387,742; 5,087,571, que describen la fabricación y uso de células y huevos transformados, y de ratones, ratas, conejos, ovejas, cerdos, y vacas transgénicos. Ver también, v.gr., Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157, que describe la producción de proteínas recombinantes en la leche de animales lecheros transgénicos; Baguisi (1999) Wat. Biotechnol . 17:456-461, que demuestra la producción de cabras transgénicas . La patente US 6,211,428 describe la fabricación y uso de mamíferos no humanos transgénicos que expresan en sus cerebros una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN. La patente US 5,387,742 describe la inyección de secuencias de ADN recombinantes o sintéticas clonadas en huevos de ratón fertilizados , la implantación de huevos inyectados en hembras pseudo-preñadas , y el crecimiento hasta término de ratones transgénicos cuyas células expresan proteínas relacionadas con la patología de la enfermedad de Alzheimer. La patente US 6,187,992 describe la fabricación y uso de un ratón transgénico cuyo genoma comprende una alteración del gen que codifica la proteína precursora amiloide (APP) . También se pueden utilizar "animales con eliminación genética" para practicar los métodos de la invención. Por ejemplo, en un aspecto, los animales transgénicos o modificados de la invención comprenden un "animal con eliminación genética", por ejemplo un "ratón con eliminación genética", diseñado para no expresar un gen endógeno, el cual es reemplazado con un gen que exprese una glucanasa, mananasa, o xilanasa de la invención, o una proteína de fusión que comprenda una glucanasa, mananasa, o xilanasa de la invención. Plantas y Semillas Transqénicas La invención proporciona plantas y semillas transgénicas que comprenden un ácido nucleico, un polipéptido (v.gr. , una glucanasa, mananasa o xilanasa) , un cassette o vector de expresión, o una célula transfectada o transformada de la invención. La invención también proporciona productos de plantas, por ejemplo aceites, semillas, hojas, extractos, y similares, que comprenden un ácido nucleico y/o un polipéptido (v.gr., una glucanasa, mananasa o xilanasa) de la invención. La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot) . La invención también proporciona métodos para hacer y usar estas plantas y semillas transgénicas . La planta o célula de planta transgénica que exprese un polipéptido de la invención, se puede construir de acuerdo con cualquier método conocido en este campo. Ver, a guisa de ejemplo, la patente US 6, 309, 872. Se pueden introducir ácidos nucleicos y construcciones de expresión de la invención en una célula de' planta por cualquier medio. Por ejemplo, los ácidos nucleicos o las construcciones de expresión se pueden introducir en el genoma de una planta hospedera deseada, o los ácidos nucleicos o construcciones de expresión pueden ser episomas. La introducción en el genoma de una planta deseada puede ser tal que se regule la producción de glucanasa, mananasa o xilanasa del hospedero mediante elementos de control de transcripción o de traducción endógenos. La invención también proporciona "plantas con eliminación genética", donde la inserción de la secuencia genética mediante, v.gr., recombinación homologa, ha alterado la expresión del gen endógeno. Los medios para generar plantas "con eliminación genética" son bien conocidos en la materia, ver, v.gr., Strepp (1998) Proc Natl. Acad. Sci. USA 95 : 4368 -4373 ; iao (1995) Plant J. 7:359-365. Ver la discusión sobre plantas transgénicas más adelante. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar para conferir rasgos deseados a esencialmente cualquier planta, v.gr., a plantas productoras de almidón, tales como papa, trigo, arroz, cebada, y similares. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar para manipular las sendas metabólicas de una planta, con el objeto de optimizar o alterar la expresión de una glucanasa del hospedero. Pueden cambiar la actividad de glucanasa, mananasa o xilanasa en una planta. De una manera alternativa, una glucanasa, mananasa o xilanasa de la invención se puede utilizar en la producción de una planta transgénica para producir un compuesto que no sea naturalmente producido por esa planta. Esto puede reducir los costos de producción o crear un producto novedoso. En un aspecto, el primer paso en la producción' de una planta transgénica involucra hacer una construcción de expresión para expresarse en una célula de planta. Estas técnicas son bien conocidas en este campo. Pueden incluir seleccionar y clonar un promotor, una secuencia de codificación para facilitar el enlace eficiente de los ribosomas al ARNm, y seleccionar las secuencias terminadoras de genes apropiadas. Un promotor constitutivo de ejemplo es el Ca V35S, a partir del virus de mosaico de coliflor, que en general da como resultado un alto grado de expresión en plantas. Otros promotores son más específicos y responden a claves en el medio ambiente interno o externo de la planta. Un promotor inducible por luz de ejemplo es el promotor a partir del gen cab, que codifica la proteína de enlace de clorofila a/b mayor . En un aspecto, el ácido nucleico se modifica para lograr una mayor expresión en una célula de planta. Por ejemplo, es probable que una secuencia de la invención tenga un porcentaje más alto de pares de nucleotidos A-T, comparándose con lo que se ve en una planta, algunas de las cuales prefieren pares de nucleotidos G-C. Por consiguiente, los nucleotidos A-T de la secuencia de codificación pueden ser sustituidos con nucleotidos G-C, sin cambiar de una manera significativa la secuencia de aminoácidos, para mejorar la producción del producto genético en células de plantas. Se puede agregar un gen marcador seleccionable a la construcción genética con el objeto dé identificar células o tejidos de plantas que hayan integrado con éxito el transgén. Esto puede ser necesario debido a que el logro de la incorporación y expresión de genes en células de plantas es un evento raro, que se presenta en solamente un pequeño porcentaje de los tejidos o células dirigidos. Los genes marcadores seleccionables codifican proteínas que proporcionan resistencia a agentes que- normalmente son tóxicos para las plantas, tales como antibióticos o herbicidas. Solamente sobrevivirán las células de plantas que hayan integrado el gen marcador seleccionable cuando se cultiven en un medio que contenga el antibiótico o herbicida apropiado. Como para otros genes insertados, los genes marcadores también requieren de secuencias promotoras y de terminación para su función apropiada. En un aspecto, hacer plantas o semillas transgénicas comprende incorporar las secuencias de la invención, y opcionalmente , genes marcadores en una construcción de expresión objetiva (por ejemplo, un plásmido) , junto con la colocación del promotor y de las secuencias terminadoras . Esto puede involucrar transferir el gen modificado a la planta a través de un método adecuado. Por ejemplo, se puede introducir una construcción directamente en el ADN genómico de la célula de planta empleando técnicas tales como electroporación y microinyección de protoplastos de células de plantas, o se pueden introducir las construcciones directamente en' el tejido de la planta empleando métodos balísticos, tales como bombardeo de partículas de ADN. Por ejemplo, ver, v.gr. , Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35:197-203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol . 6:17-30; Klein (1987) Nature 327:70-73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72:63-69, que describen el uso del bombardeo de partículas para introducir transgenes en el trigo; y Adam (1997) supra, que utiliza el bombardeo de partículas para introducir cromosomas artificiales de levadura en células de plantas. Por ejemplo, Rinehart (1997) supra, utilizó bombardeo de partículas para generar plantas de algodón transgénicas. El aparato para acelerar las partículas se describe en la patente US 5,015,580; y el instrumento de aceleración de partículas comercialmente disponible BioRad (Biolistics) PDS-2000; ver también John, patente US 5,608,148; así como Ellis, patente US 5,681,730, que describen la transformación de gimnospermas mediada por partículas . En un aspecto, los protoplastos se pueden inmovilizar e inyectar con un ácido nucleico, por ejemplo una construcción de expresión. Aunque no es fácil la regeneración de la planta a partir de protoplastos con los cereales, es posible la regeneración de la planta con las legumbres utilizando embriogénesis somática a partir de callo derivado del protoplasto. Los tejidos organizados se pueden transformar con ADN desnudo empleando la técnica de la pistola genética, en donde se recubren microproyectiles de tungsteno con ADN, disparados a 1/100 del tamaño de las células, que llevan al ADN profundamente hacia adentro de las células y los organelos . Luego se induce al tejido transformado para regenerarse, usualmente mediante embriogénesis somática. Esta técnica ha tenido éxito en varias especies de cereales, incluyendo maíz y arroz. Los ácidos nucleicos, v.gr., las construcciones de expresión, también se pueden introducir en las células de plantas utilizando virus recombinantes . Las células de plantas se pueden transformar utilizando vectores virales, tales como, v.gr., vectores derivados de virus de mosaico de tabaco (Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999), ver Porta (1996) "Use of viral replicons for the expression of genes in plants", Mol. Biotechnol . 5:209-221.
De una manera alternativa, los ácidos nucleicos, v.gr., una construcción de expresión, se pueden combinar con las regiones de flanqueo de ADN-T adecuadas, y se pueden introducir en un vector hospedero de Agrobacterium turnefaciens convencional. Las funciones de virulencia del hospedero de Agrobacterium turnefaciens dirigirán la inserción de la construcción y del marcador adyacente hacia adentro del ADN de la célula de planta cuando la célula sea infectada por la bacteria. Las técnicas de transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens , incluyendo el desarmado y uso de vectores binarios, están bien descritas en la literatura científica. Ver, v.gr., Horsch (1984) Science 233:496-498; Fraley (1983) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 80:4803 (1983); Gene Transfer to Plants, Potrykus, editor (Springer-Verlag, Berlín 1995) . El ADN en una célula de A. turnefaciens está contenido en el cromosoma bacteriano, así como en otra estructura conocida como un plásmido Ti (inductor de tumor) . El plásmido Ti contiene un estiramiento de ADN denominado ADN-T (de aproximadamente 20 kb de largo) que se transfiere a la célula de planta en el proceso de infección, y una serie de genes vir (de virulencia) que dirigen el proceso de infección. A. turnefaciens solamente puede infectar una planta a través de las heridas; cuando se hiere una raíz o tallo de planta, desprende ciertas señales químicas, en respuesta a las cuales, llegan a activarse los genes vir de A. tumefaciens, y dirigen una serie de eventos necesarios para la transferencia del ADN-T a partir del plásmido Ti hasta el cromosoma de la planta. Luego el ADN-T entra a la célula de la planta a través de la herida. Una especulación es que el ADN-T espera hasta que se esté replicando o transcribiendo el ADN de la planta, y luego se inserta en el ADN de la planta expuesto. Con el objeto de utilizar A. turnefacíens como un vector de transgén, se tiene que remover la sección inductora de tumor del ADN-T, mientras que se retienen las regiones del borde del ADN-T y los genes vir. Entonces se inserta el transgén entre las regiones de borde del ADN-T, en donde se transfiere a la célula de planta y llega a integrarse en los cromosomas de la planta. La invención proporciona la transformación de plantas monocotiledoneas utilizando los ácidos nucleicos de la invención, incluyendo cereales importantes, ver Hiei (1997) Plant Mol. Biol . 35:205-218. Ver también, por ejemplo, Horsch, Science (1984) 233:496; Fráley (1983) Proc. Nati Acad. Sci USA 80:4803; Thykjaer (1997) supra; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135-1148, que describen la integración del ADN-T en el ADN genómico. Ver también D'Halluin, patente US 5,712,135, que describe un proceso para la integración estable de un ADN que comprende un gen que es funcional en una célula de un cereal, o de otra planta monocotiledónea . En un aspecto, el tercer paso puede involucrar la selección y regeneración de plantas enteras capaces de transmitir el gen objetivo incorporado a la siguiente generación. Estas técnicas de regeneración se apoyan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejido, que se apoya típicamente en un marcador de biocida y/o herbicida que se haya introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans y colaboradores, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, páginas 124-176, MacMillilan Publishing Company, Nueva York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts , páginas 21-73, CRC Press, Boca Ratón, 1985. La regeneración también se puede obtener a partir de callo de plantas, explantes, órganos, o partes de los mismos. Estas técnicas de regeneración' se describen en general en Klee (1987) Ann . Rev. of Plant Phys . 38:467-486. Con el fin de obtener plantas enteras a partir de los tejidos transgénicos , tales como embriones inmaduros, se pueden cultivar bajo condiciones medio-ambientales controladas, en una serie de medios que contengan nutrientes y hormonas, un proceso conocido como cultivo de tejido. Una vez que se ' generan plantas enteras y producen semillas,, empieza la evaluación de la progenie . Después de que se incorpora establemente el cassette de expresión en las plantas transgénicas , se puede introducir en otras plantas mediante cruza sexual . Se puede emplear cualquiera de varias técnicas de reproducción convencionales, dependiendo de la especie que se vaya a cruzar. Debido a que la expresión transgénica de los ácidos nucleicos de la invención conduce a cambios fenotípicos, las plantas que comprendan los ácidos nucleicos recombinantes de la invención se pueden cruzar sexualmente con una segunda planta para obtener un producto final. Por consiguiente, la semilla de la invención se puede derivar a partir de una cruza entre dos plantas transgénicas de la invención, o de una cruza entre una planta de la invención y otra planta. Los efectos deseados (v.gr., la expresión de los polipéptidos de la invención para producir una planta en donde se altere el comportamiento del florecimiento) se pueden mejorar cuando ambas plantas progenitoras expresen los polipéptidos (por ejemplo, una glucanasa, mananasa o xilanasa) de la invención. Los efectos deseados se pueden pasar a las generaciones futuras de las plantas por medios de propagación convencionales. Los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención se expresan en, o se insertan en, cualquier planta o semilla. Las plantas transgénicas de la invención pueden ser dicotiledóneas o monocotiledóneas . Los ejemplos de las plantas transgénicas monocotiledóneas de la invención son pastos, tales como pasto de prados (pasto azul, . Poa) , pasto de forraje tal como festuca, lolio, pasto templado, tal como Agrostis , y cereales, por ejemplo trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y maíz. Los ejemplos de las plantas transgénicas dicotiledóneas de la invención son tabaco, legumbres, tales como lupinas, papa, remolacha azucarera, chícharo, frijol y semilla de soya, y las plantas cruciferas (familia Brassicaceae) , tales como coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo estrechamente relacionado de Arabidopsis thaliana. Por consiguiente, las plantas y semillas transgénicas de la invención incluyen un amplio rango de plantas, incluyendo, pero no limitándose a, las especies de los géneros Anacardium , Arachis, Asparagus , Atropa, Avena, Brassica , Citrus, Citrullus , Capsicum , Carthamus , Cocos, Coffea,Cucumis, Cucúrbita , Daucus, Elaeis, Fragaria , Glycine, Gossypium, Helianthus , Heterocallis , Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon , Malus, Manihot, Majorana , Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus , Raphanus , Ricinus, Sécale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus , Trigonella , Tríticum, Vicia, Vitis, Vigna , y Zea. En formas de realización alternativas, los ácidos nucleicos de la invención se expresan en plantas que contengan células de fibra, incluyendo, v.gr., algodón, árbol de algodón de seda {Kapok, Ceiba pentandra) , cedro del desierto, arbusto de creosota, gaulteria, balsa, ramie, kenaf, cáñamo, rosella, yute, sisal abacá, y lino. En las modalidades alternativas, las plantas transgénicas de la invención pueden ser miembros del género Gossypium, incluyendo los miembros de cualquier especie de Gossypium, tales como G. arboreum ;. G. herbaceum , G. barbadense, y G. hirsutum. La invención también proporciona plantas transgénicas con el fin de utilizarse para producir grandes cantidades de los polipéptidos (v.gr., una glucanasa, mananasa, o xilanasa, o anticuerpo) de la invención. Por ejemplo, ver Palmgren (1997) Trends Genet. 13:348; Chong (1997) Transgenic Res. 6:289-296 (que produce la proteína beta-caseína de leche humana en plantas de papa transgenicas utilizando un promotor de sintasa de manopina bidireccional inducible por auxina (masl',2') con métodos de transformación de disco de hoja mediada por Agrobacterium tumefaciens) . Empleando los procedimientos conocidos, un técnico puede analizar y seleccionar las plantas de la invención mediante la detección del aumento o la reducción del ARNm o proteína del transgén en plantas transgénicas . Los medios para detectar y cuantificar ARNms o proteínas son bien conocidos en la materia. Polipéptidos y Péptidos En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que tienen una identidad de secuencia (v.gr., de al menos alrededor de 50 por ciento, el 51 por ciento, el 52 por ciento, el 53 por ciento, el 54 por ciento, el 55 por ciento, el 56 por ciento, el 57 por ciento, el 58 por ciento, el 59 por ciento, el 60 por ciento, el 61 por ciento, el 62 por ciento, el 63 por ciento, el 64 por ciento, el 65 por ciento, el 66 por ciento, el 67 por ciento, el 68 por ciento, el 69 por ciento, el 70 por ciento, el 71 por ciento, el 72 por ciento, el 73 por ciento, el 74 por ciento, el 75 por ciento, el 76 por ciento, el 77 por ciento, el 78 por ciento, el 79 por ciento, el 80 por ciento, el 81 por ciento, el 82 por ciento, el 83 por ciento, el 84 por ciento, el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o más, o una identidad de secuencia completa (100 por ciento)) con una secuencia de ejemplo de la invención, v.gr., proteínas teniendo una secuencia como se señala en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO :130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO -.140, SEQ ID NO : 142 , SEQ ID NO: 144 , SEQ ID NO :146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO :154, SEQ ID NO: 156 , SEQ ID NO : 158, SEQ ID NO 160, SEQ ID NO: 162 , SEQ ID NO: 164 , SEQ ID NO 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172 , SEQ ID NO : 174 , SEQ ID NO 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180 , SEQ ID NO :182, SEQ ID NO: 184 , SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188 , SEQ ID NO : 190, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO: 194 , SEQ ID NO: 196 , SEQ ID NO : 198, SEQ ID NO 200, SEQ ID NO: 202 , SEQ ID NO: 204 , SEQ ID NO :206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212 , SEQ ID NO :214, SEQ ID NO 216, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220 , SEQ ID NO : 222 , SEQ ID NO: 224 , SEQ ID NO : 226, SEQ ID NO: 228 , SEQ ID NO :230, SEQ ID NO 232 , SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236 , SEQ ID NO 238, SEQ ID NO 240 , SEQ ID NO: 242 , SEQ ID NO: 244 , SEQ ID NO : 246 , SEQ ID NO 248, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 252 , SEQ ID NO •254 , SEQ ID NO 256, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 260 , SEQ ID NO 262 , SEQ ID NO: 264 , SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 268 , SEQ ID NO :270, SEQ ID NO 272 , SEQ ID NO: 274 , SEQ ID NO: 276 , SEQ ID NO :278, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284 , SEQ ID NO :286, SEQ ID NO 288, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 292 , SEQ ID NO 294, SEQ ID NO 296, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO : 300 , SEQ ID NO :302, SEQ ID NO 304 , SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 308 , SEQ ID NO 310, SEQ ID NO 312, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 316 , SEQ ID NO 318, SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 322 , SEQ ID NO: 324 , . SEQ ID NO :326, SEQ ID NO 328, SEQ ID NO: 330, SEQ ID O: 332 , SEQ ID NO 334 , SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO 340, SEQ ID NO 342 , SEQ ID NO 344 SEQ ID NO 348, SEQ ID NO 350, SEQ ID NO :352, SEQ ID NO 354, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO 358, SEQ ID NO : 360 , SEQ ID NO 362 SEQ ID NO 364, SEQ ID NO 366, SEQ ID NO :368, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO 372, SEQ ID NO 374 , SEQ ID NO : 376, SEQ ID NO 378 SEQ ID NO 380, SEQ ID NO 382 , SEQ ID NO :384, SEQ ID NO 386, SEQ ID NO 388, SEQ ID NO 390, SEQ ID NO : 392 , SEQ ID NO 394, SEQ ID NO 396, SEQ ID NO 398, SEQ ID NO :400, SEQ ID NO :402 SEQ ID NO 404, SEQ ID NO 406, SEQ ID NO :408, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 412 , SEQ ID NO 414 , SEQ ID NO :416, SEQ ID NO •418 SEQ ID NO 420, SEQ ID NO 422 , SEQ ID NO 424 , SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO 428 , SEQ ID NO 430, SEQ ID NO :432, SEQ ID NO 434 SEQ ID NO 436, SEQ ID NO 438, SEQ ID NO 440 , SEQ ID NO 442 , SEQ ID NO 444 , SEQ ID NO 446, SEQ ID NO :448, SEQ ID NO 450, SEQ ID NO 452 , SEQ ID NO 454 , SEQ ID NO 456, SEQ ID NO 458, SEQ ID NO 460, SEQ ID NO 462 , SEQ ID NO :464, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO 470 , SEQ ID NO : 472 , SEQ ID NO 474 , SEQ ID NO 476, SEQ ID NO 478, SEQ ID NO .480, SEQ ID NO: 482 , SEQ ID NO 484 , SEQ ID NO 486, SEQ ID NO :488, SEQ ID NO 490, SEQ ID NO 492 , SEQ ID NO 494 , SEQ ID NO :496, SEQ ID NO 498 SEQ ID NO 500, SEQ ID NO 502 , SEQ ID NO :504, SEQ ID NO 506, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO 510, SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 516, O SEQ ID NO: 518. En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad glucanasa, mananasa o xilanasa, v.gr. , puede hidroxilar un enlace glicosídico en un polisacárido, v.gr., un glucano. En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad glucanasa que comprende catalizar la hidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glicosídicos o enlaces ß-1 , 3 -glicosídicos . En un aspecto, la actividad endoglucanasa comprende una actividad endo-1, 4-beta-endoglucanasa . En un aspecto, la actividad endoglucanasa comprende una actividad endo- 1 , 4 -beta-endoglucanasa . En un aspecto, la actividad endoglucanasa comprende hidrolizar un glucano para producir un glucano de menor peso molecular o un glucano-oligómero . En un aspecto, el glucano comprende un beta-glucano, tal como un beta-glucano soluble en agua. Las enzimas codificadas por los polinucleótidos de la invención incluyen, pero no se limitan a hidrolasas tales como glucanasas, v.gr., endoglucanasas , mananasas, o xilanasas. La figura 5 es una tabla que resume lasa actividades relativas de varias enzimas ejemplares de la invención bajo diversas condiciones, v.gr., pH y temperatura variables. En la figura 5: ND = no determinado; * pH o temperatura óptimos no determinados, pero las actividades de la enzima fueron medidas al pH y/o la temperatura indicados; 1 estabilidad térmica, tiempo que la enzima conservó una actividad significativa (aproximadamente > 50%) o tiempo donde la enzima ha perdido 50% de su actividad (tl/2) a la temperatura indicada; 2 RA = actividad relativa a valores de pH de 2.6 , 4.0, 5.5, 7.0, 8.0, 9.0 o a 25, 37, 50, 65, 75, 85°C con relación a la actividad a pH y temperatura óptimos, respectivamente; 3 RA a valores de pH de 3.75, 5, 5.3, 6.25, 7 para H óptimo y 40, 55, 70, 90 °C para temperatura óptima; 4 BBG beta-glucano-cebada, CMC = carboximetil celulosa. Los agrupamientos de familia de las glucanasas son discutidos mas adelante. En un aspecto, una enzima de la invención puede también tener una actividad de mananasa, v.gr., puede degradar (o hidrolizar) mañanas. Los polisacáridos que contienen mañana son un componente mayor de la fracción de hemi -celulosa tanto en maderas duras como en maderas blandas así como en el endospermo en muchas semillas de leguminosas y en algunas semillas maduras de plantas no leguminosas. En un aspecto, una mananasa de la invención hidroliza enlaces beta, 1-4 en mañanas, glucomananas , galactomananas y galactoglucomananas (las mañanas son polisacáridos que contienen una columna vertebral de mañosa beta-1,4 enlazada, las glucomananas son polisacáridos que tienen una columna vertebral de mañosa y glucosa beta- 1 , 4 -enlazadas , alternadas mas o menos de manera regular) . Por ejemplo, en un aspecto, el polipéptido que tiene una secuencia como se señala en la SEQ ID NO: 454, codificado por, v.gr., la SEQ ID NO:453, tiene una actividad de xilanasa, de glucanasa y de mananasa. Los ensayos para determinar la actividad de mananasa son bien conocidos en la materia; ver, v.gr., las solicitudes de patente US 20030215812 ,-20030119093 ; las patentes US 5,661,021; 5,795,764; 6,376,445; 6,420,331. Los ensayos para determinar la actividad de xilanasa son bien conocidos en la materia; ver, v.gr., las patentes US 5,693,518; 5,885,819; 6,200,797; 6,586,209; y 6,682,923.
La invención también provee polipéptidos quiméricos (y los ácidos nucleicos que los codifican) que comprenden al menos dos enzimas de la invención o sub-secuencias de ellas, v.gr., sitios activos, o dominios catalíticos (CDs) . Una proteína quimérica de la invención (v.gr., una proteína de fusión, u otro heterodímero, v.gr., dos dominios unidos por otros medios, v.gr., un enlazador, o electrostáticamente) puede comprender un polipéptido (v.gr., péptido con sitio activo o dominio catalítico) de la invención y otro polipéptido (v.gr., péptido con sitio activo o dominio catalítico) de la invención u otro polipéptido. Por ejemplo, una proteína quimérica de la invención puede tener actividad de mananasa y xilanasa, actividad de mananasa y glucanasa, etc. En un aspecto, la proteína quimérica de la invención comprende una fusión de dominios, v.gr., un solo dominio puede exhibir actividad de glucanasa/xilanasa/mananasa o cualquier combinación de estas actividades. La invención proporciona glucanasas que tienen una novedad común en tanto a que fueron primero derivadas de familias similares de "glicosidasa hidrolasa" . Las glicosidasa hidrolasas fueron primero ' clasificadas en familias en 1991; ver, v.gr., Henrissat (1991) Biochem J. 280:309-316. Desde entonces, las clasificaciones han sido actualizadas de manera continua; ver, v.gr., Henrissat (1993) Biochem J. 293:781-788; Henrissat (1996) Biochem J. 316:695-696; Henrissat (2000) Plant Physiology 124: 1515-1519. Hay aproximadamente 87 familias identificadas de glicosidasa hidrolasas. En un aspecto, las glucanasas de la invención son categorizadas como familias, v.gr., las familias 3, 5, 6, 8, 9, 12 y 16, como se señala a continuación en la Tabla 2. Tabla 2 SEQ ID NO: Familia 1, 2 5 101, 102 16 103 , 104 5 105, 106 5 107, 108 5 109, 110 5 11, 12 8 111, 112 5 113 , 114 16 115, 116 5 117, 118 5 119, 120 16 121, 122 12 123 , 124 8 125, 126 16 127 , 128 5 129, 130 5 13 , 14 8 131, 132 9 133 , 134 8 135, 136 5+CBD 137, 138 5 139, 140 8 141 , 142 9 143 , 144 5 145, 146 5+CBD+SLH 147, 148 5+CBD+SLH 149, 150 5 15, 16 3 151, 152 16 153, 154 5 155, 156 9+CBD 157, 158 16 159, 160 16 161, 162 16 163, 164 9 165, 166 5 167, 168 5 169, 170 ,5 17, 18 9 y 1 171 , 172 16 173 , 174 16 175 , 176 5 177, 178 16 179, 180 5+CBD 181 , 182 16 183, 184 8 185, 186 NA 187, 188 8 y 1 189, 190 5 19, 20 5 191, 192 16 193 , 194 5 195, 196 16 197 , 198 16 199, 200 16 201, 202 5 203 , 204 3 205, 206 5 207, 208 5 209, 210 16 21, 22 12 211, 212 8 213 , 214 16 215, 216 6 217, 218 16 219, 220 5 221, 222 5 223 , 224 5 225, 226 8 227, 228 5+CBD 229, 230 5 23, 24 12 231, 232 5 233 , 234 5 235, 236 5 237, 238 6 239, 240 NA+CBD 241, 242 5 245, 246 9 247, 248 8 249, 250 5 25, 26 8 251, 252 9+CBD 253, 254 5 255, 256 5 257, 258 9 259, 260 5 261, 262 5 263, 264 1+CBD 265, 266 NA 267, 268 5 269, 270 9 27, 28 8 271, 272 9 273, 274 48+CBD 275, 276 8 277, 278 3 279, 280 5 281, 282 9 283, 284 5 285, 286 5 287, 288 6 289, 290 8 29, 30 9 291, 292 8 293, 294 6 295, 296 9+DOCR 297, 298 9 299, 300 5 3, 4 8 301, 302 5 303, 304 9+CBD 305, 306 5 307, 308 5 309, 310 10 31, 32 5 311, 312 5 313, 314 5 315, 316 5 317, 318 5 319, 320 5 321, 322 5 323, 324 5 325, 326 5 327, 328 5 329, 330 9+CBD 33, 34 8 333, 334 5 335, 336 6 337, 338 5 339, 340 6 341, 342 5 343, 344 5 345, 346 6 347, 348 5 349, 350 5 35, 36 12 351, 352 5+CBD 353, 354 12 355, 356 5+CBD 357, 358 5 359, 360 5 361, 362 5 363, 364 CBD 365, 366 5 367, 368 5 369, 370 5 37, 38 5 y/o 6 371, 372 ' 5 373, 374 5 375, 376 9 377, 378 5 379, 380 3 381, 382 9 383, 384 5 385, 386 8 387, 388 5 389, 390 9 39, 40 5 391, 392 9 395, 396 8 397, 398 3 399, 400 5 401, 402 5 o 6+CBD 403, 404 5 405, 406 5 407, 408 5 409, 410 5 41, 42 12 411, 412 5 413, 414 6 415, 416 9+CBD 417, 418 5 419, 420 5 421, 422 5 423, 424 9 425, 426 44 427, 428 5 429, 430 3 43, 44 16 431, 432 9 433, 434 6 435, 436 5 437, 438 5 439, 440 5 441, 442 9 443 , 444 ?? 445, 446 ?? 447, 448 26 449, 450 5+DOCR 45, 46 9 451, 452 5 453 , 454 5 y 26 455, 456 1 457, 458 5 459, 460 9 461, 462 5 463 , 464 5 465, 466 5 467, 468 10 469, 470 5 · 47, 48 8 471, 472 16 473 , 474 5 475, 476 5 477 , 478 11 481, 482 5 483 , 484 16 485, 486 16 487 , 488 12 489, 490 5 49, 50 5 491, 492 11 493 , 494 16 495, 496 5 497, 498 16 499, 500 16 5, 6 5 501, 502 1 503, ¦ 504 5 505, 506 5 507, 508 1 509, 510 5 51, 52 5 511, 512 26 513 , 514 26 515, 516 5 517, 518 3 53, 54 5 55, 56 5 57, 58 9 59, 60 16 61, 62 12 63, 64 16 65, 66 16 67, 68 9 69, 70 5 7, 8 9 71, 72 16 73, 74 5 75, 56 12 77, 78 5 79, 80 CBD 81, 82 16 83, 84 5 87, 88 16 89, 90 16 9, 10 5 91, 92 3 93, 94 6 95, 96 16 97, 98 5 99, 100 16 Los polipéptidos de la invención incluyen glucanasas, mañanases o xilanasas en una forma activa o inactiva. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención incluyen pro-proteínas antes de la "maduración", o el procesamiento de secuencias prepro, por ejemplo mediante una enzima de procesamiento de pro-proteína, tal como una convertasa de proproteína, para generar una proteína madura "activa" . Los polipéptidos de la invención incluyen glucanasas, mananasas o xilanasas inactivas por otras razones, v.gr., antes de la "activación" mediante un evento de procesamiento posterior a la traducción, v.gr., una acción de endo- o exo-peptidasa o proteinasa, un evento de fosforilación, una amidación, una glicosilación o una sulfatación, un evento de dimerización, y similares. Los polipéptidos de la invención incluyen todas las formas activas, incluyendo sub-secuencias activas, v.gr., dominios catalíticos o sitios activos, de las glucanasas, mananasas o xilanasas. Los métodos para identificar secuencias de dominio "prepro" y secuencias de señales son bien conocidos en la materia; ver, v.gr., Van de Ven (1993), Crit. Rev. Oncog. 4 (2) : 115-136. Por ejemplo, con el fin de identificar una secuencia prepro, la proteína se purifica del espacio extra-celular, y se determina la secuencia de proteína N-terminal y se compara con la forma no procesada. La invención incluye polipéptidos con o sin una secuencia de señal y/o una secuencia prepro. La invención incluye poli -péptidos con secuencias de señales y/o secuencias prepro heterólogas . La secuencia prepro (incluyendo una secuencia de la invención utilizada como un dominio prepro heterologo) se puede localizar sobre el extremo amino- terminal o carboxi- terminal de la proteína. La invención también incluye secuencias de señales aisladas o recombinantes , secuencias prepro, y dominios catalíticos (v.gr., "sitios activos") que comprenden las secuencias de la invención. El porcentaje de identidad de secuencias puede ser en toda la longitud del polipéptido, o la identidad puede ser en una región de al menos alrededor de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o mas residuos. Los polipéptidos de la invención pueden también ser mas cortos que la longitud completa de los polipéptidos ejemplares. En aspectos alternativos, la invención proporciona polipéptidos (péptidos, fragmentos) que varían de tamaño entre alrededor de 5 y la longitud completa de un polipéptido, v.gr., una enzima, tal como una glucanasa, mananasa o xilanasa; los tamaños ejemplares son de alrededor de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o mas residuos, v.gr., residuos contiguos de una glucanasa, mananasa o xilanasa ejemplar de la invención. Los péptidos de la invención (v.gr., una sub-secuencia de un polipéptido ejemplar de la invención) pueden ser útiles como, v.gr., sondas de marbetado, antígenos, tolerágenos, motivos, sitios activos glucanasa, mananasa o xilanasa (v.gr., "dominios catalíticos"), secuencias de señal y/o dominio prepro . Los polipéptidos y péptidos de la invención se pueden aislar a partir de fuentes naturales, ya sean polipéptidos sintéticos o bien recombinantemente generados. Los péptidos y proteínas se pueden expresar de una manera recombinante in vi tro o in vivo. Los péptidos y polipéptidos de la invención se pueden hacer y aislar empleando cualquier método conocido en la materia. Los polipéptidos y péptidos de la invención también se pueden sintetizar, del todo o en parte, empleando métodos químicos bien conocidos en este campo. Ver, v.gr., Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A. K. , Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co . , Lancaster, Pennsylvania, Estados Unidos. Por ejemplo, la síntesis de péptidos se puede llevar a cabo empleando diferentes técnicas en fase sólida (ver, v.gr., Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13), y la síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, utilizando el Sintetizador de Péptidos ABI 431A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Los péptidos y polipéptidos de la invención también se pueden glicosilar. La glicosilación se puede agregar después de la traducción, ya sea químicamente, o mediante mecanismos biosintéticos celulares, en donde los últimos incorporan el uso de motivos de glicosilación conocidos, los cuales pueden ser nativos para la secuencia, o se pueden agregar como un péptido, o se pueden agregar en la secuencia de codificación del ácido nucleico. La glicosilación puede estar O-enlazada o N-enlazada. Los péptidos y polipéptidos de la invención, como se definen anteriormente, incluyen todas las formas "miméticas" y "peptidomiméticas " . Los términos "miméticas" y "peptidomiméticas " se refieren a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales de los polipéptidos de la invención. El mimético puede estar enteramente compuesto de análogos de aminoácidos no naturales, sintéticos, o bien es una molécula quimérica de parcialmente aminoácidos peptídicos naturales y parcialmente análogos de aminoácidos no naturales. El mimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservadoras de aminoácidos naturales, siempre que estas sustituciones no alteren de una manera sustancial la estructura y/o actividad del mimético. Como con los polipéptidos de la invención que son variantes conservadoras, la experimentación de rutina determinará si un mimético está dentro del alcance de la invención, es decir, que no se altere sustancialmente su estructura y/o función. Por consiguiente, en un aspecto, una composición mimética está dentro del alcance dé la invención si tiene una actividad de glucanasa, mananasa o xilanasa. Las composiciones miméticas de polipéptidos de la invención pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales. En el aspecto alternativo, las composiciones miméticas de la invención incluyen uno o todos los siguientes tres grupos estructurales: a) grupos de enlace de residuos diferentes de los enlaces de amida naturales ("enlace peptídico" ) ,· b) residuos no naturales en lugar de los residuos de aminoácidos que se presentan naturalmente; o c) residuos que inducen mimetismo estructural secundario, es decir, inducen o estabilizan una estructura secundaria, v.gr., una vuelta beta, vuelta gamma, hoja beta, conformación de hélice alfa, y similares. Por ejemplo, un polipéptido de la invención se puede caracterizar como un mimético cuando todos o algunos de sus residuos estén unidos por medios químicos diferentes de los enlaces peptídicos naturales. Los residuos peptidomiméticos individuales se pueden unir mediante enlaces peptídicos, otros enlaces químicos, o medios de acoplamiento, tales como, por ejemplo, glutaraldehído , N-hidroxi -succinimida-ésteres , maleimidas bifuncionales , ?,?' -diciclo-hexil-carbodi-imida (DCC) , o ?,?' -di-isopropil-carbodi-imida (DIC) . Los grupos de enlace que pueden ser una alternativa para los enlaces de amida tradicionales ("enlace peptídico") incluyen, v.gr. , cetometileno (por ejemplo, -C(=0)-CH2- para -C(=0)-NH-), amino-metileno (CH2-NH) , etileno, olefina (CH=CH) , éter (CH20) , tioéter (CH2-S) , tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tioamida, o éster (ver, v.gr., Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, volumen 7, páginas 267-357, "Peptide Backbone Modifications " , arcell Dekker, New York). Un polipéptido de la invención también se puede caracterizar como un mimético al contener todos o algunos residuos no naturales en lugar de los residuos de aminoácidos que se presentan naturalmente. Los residuos no naturales están bien descritos en la literatura científica y de patente; unas cuantas composiciones no naturales de ejemplo útiles como miméticos de los residuos de aminoácidos naturales, y los lineamientos , se describen enseguida. Se pueden generar miméticos de aminoácidos aromáticos, reemplazando, v.gr., por D- o L-naftil -alanina ; D- o L-fenil-glicina; D- o L-2-tienil-alanina; D- o L-1,-2,3-, o 4-pirenilalanina; D- o L-3-tienil-alanina; D- o L- (2 -piridinil ) -alanina; D- o L- (3-piridinil) -alanina; D- o L- (2 -pirazinil ) -alanina; D- o L- ( - isopropil ) -fenil-glicina; D- (trifluorometil) -fenil -glicina ; D- (trifluorometil) - fenil -alanina ; D-p-fluoro-fenil-alanina; D- o L-p-bifenil - fenil -alanina ; D- o L-p-metoxi-bifenil-fenil-alanina; D- o L-2-indol (alquil) -alaninas; y D- o L-alquilalaninas , donde alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, isobutilo, isobutilo secundario, isopentilo, o un aminoácido no ácido, sustituidos o insustituidos . Los anillos aromáticos de un aminoácido no natural incluyen, v.gr., anillos aromáticos de tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo, y piridilo . Se pueden generar miméticos de aminoácidos mediante sustitución, v.gr., por aminoácidos que no sean de carboxilato, mientras que se mantenga una carga negativa; ( fosfono) alanina ; treonina sulfatada. Los grupos laterales de carboxilo (por ejemplo, aspartilo o glutamilo) también se pueden modificar de una manera selectiva mediante su reacción con carbodi - imidas (R'-N-C-N-R1), tales como, por ejemplo, 1 -ciclohexil -3 - (2 -morfolinil -(4-etil) -carbodi -imida o l-etil-3- (4 -azonia-4 , 4 -dimetil -pentil ) -carbodi -imida. El aspartilo o el glutamilo también se pueden convertir en residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante su reacción con iones de amonio. Se pueden generar miméticos de aminoácidos básicos mediante sustitución, v.gr., con (en adición a lisina y arginina) los aminoácidos ornitina, citrulina, o ácido (guanidino) -acético, o ácido (guanidino) -alquil -acético, en donde alquilo es como se define anteriormente. Se puede utilizar el derivado de nitrilo (v.gr., que contenga la fracción CN en lugar de COOH) para sustituir asparagina o glutamina. Los residuos de asparaginilo y glutaminilo se pueden desaminar hasta los residuos de aspartilo o glutamilo correspondientes. Se pueden generar miméticos de residuos de arginina mediante la reacción de arginilo con, v.gr., uno o más reactivos convencionales, incluyendo, v.gr., fenil -glioxal , 2 , 3-butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona, o ninhidrina, de preferencia bajo condiciones alcalinas. Se pueden generar miméticos de residuos de tirosina mediante la reacción de tirosilo con, v.gr., compuestos de diazonio aromáticos o con tetranitro-metano . Se pueden utilizar N-acetil-imidazol y tetranitro-metano para formar especies de 0-acetil -tirosilo y derivados de 3 -nitro, respectivamente. Se pueden generar miméticos de residuos de cisteína mediante la reacción de los residuos de cisteinilo con, v.gr., alfa-haloacetatos , tales como ácido 2 -cloro-acético o cloro-acetamida y las aminas correspondientes; para dar los derivados de carboxi-metilo o carboxi-amido-metilo . También se pueden generar miméticos de residuos de cisteína mediante la reacción de los residuos de cisteinilo con, v.gr., bromo-trifluoro-acetona , ácido alfa-bromo-beta- ( 5 - imidazolil ) -propiónico ; fosfato de cloro-acetilo, N-alquil -maleimidas , disulfuro de 3 -nitro-2 -piridilo ; disulfuro de metil-2-piridilo; p-cloro-mercuri-benzoato; 2-cloro-mercuri-4-nitro-fenol ; o cloro-7-nitrobenzo-oxa-l, 3-diazol . Se pueden generar miméticos de lisina (y se pueden alterar los residuos amino-terminales) mediante la reacción de lisinilo con, v.gr., anhídrido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. También se pueden generar miméticos de residuos de lisina u otros residuos que contengan alfa-amino mediante su reacción con imido-ésteres , tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitro-bencen- sulfónico , O-metil - isourea , 2 , 4 -pentanodiona , y reacciones catalizadas por transamidasa con glioxilato. Se pueden generar miméticos de metionina mediante la reacción con, v.gr., sulfóxido de metionina. Los miméticos de prolina incluyen, por ejemplo, ácido pipecólico, ácido tiazolidin-carboxílico, 3- o 4-hidroxi -prolina , deshidro-prolina , 3- o 4-metil-prolina, o 3,3-dimetil -prolina . Se pueden generar miméticos de residuos de histidina mediante la reacción de histidilo con, v.gr., procarbonato de dietilo o bromuro de para-bromofenacilo . Otros miméticos incluyen, v.gr., aquéllos generados mediante la hidroxilación de prolina y lisina; la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos de serilo o treonilo; la metilación de los grupos alfa-amino de lisina, arginina, e histidina; la acetilación de la amina N-terminal; la metilación de los residuos de amida de la cadena principal, o la sustitución con N-metil-aminoácidos; o la amidación de los grupos carboxilo C-terminales : Un residuo, v.gr., un aminoácido, de un polipéptido de la invención, también puede ser reemplazado por un aminoácido (o un residuo peptidomimético) de la quiralidad opuesta. Por consiguiente, cualquier aminoácido que se presente naturalmente en la configuración L (que también puede ser referida como L o S, dependiendo de la estructura de la entidad química) puede ser reemplazado con el aminoácido del mismo tipo estructural químico o por un peptidomimético, pero de la quiralidad opuesta, referido como el D-aminoácido , pero también puede ser referido como la forma R o S . La invención también proporciona métodos para modificar los polipéptidos de la invención ya sea mediante procesos naturales, tales como procesamiento posterior a la traducción (v.gr., fosforilación, acilación, etcétera), o bien mediante técnicas de modificación química, y los polipéptidos modificados resultantes. Las modificaciones se pueden presentar en cualquier parte del polipéptido, incluyendo en la estructura base del péptido, en las cadenas laterales de aminoácidos, y en los términos amino o carboxilo. Se apreciará que puede estar presente el mismo tipo de modificación en el mismo grado o en diferentes grados en varios sitios de un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede tener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ribosilación con ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una fracción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de un fosfatidilinositol , ciclación reticulante, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación-gamma , glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, y adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a la proteína, tal como arginilación . Ver, v.gr., Creighton, T.E., Proteins-Structure and Molecular Properties, segunda edición, W.H. Freeman and Company, Nueva York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, editor, Academic Press, Nueva York, páginas 1-12 (1983) . También se pueden emplear los métodos de síntesis química de péptidos en fase sólida para sintetizar el polipéptido o los fragmentos de la invención. Este método se ha conocido en la materia desde principios de la década de 1960 (Merrifield, R. B . , J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154, 1963) (ver también Stewart, J. M. y Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, segunda edición, Pierce Chemical Co . , Rockford, Illinois, Estados Unidos, páginas 11-12)), y recientemente se ha empleado en los kits de diseño y síntesis de péptidos de laboratorio comercialmente disponibles (Cambridge Research Biochemicals ) . Estos kits de laboratorio comercialmente disponibles han empleado en general las enseñanzas de H. M. Geysen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:3998 (1984), y proporcionan la síntesis de péptidos sobre las puntas de una multitud de "varillas" o "picos", todos los cuales se conectan a una sola placa. Cuando se utiliza este' sistema, una placa de varillas o picos se invierte y se inserta en una segunda placa de pozos o cavidades correspondientes, que contienen soluciones para unir o anclar un aminoácido apropiado a las puntas de los picos o varillas. Mediante la repetición de este paso del proceso, es decir, invertir e insertar las puntas de las varillas y picos en las soluciones apropiadas, se construyen los aminoácidos hasta obtener los péptidos deseados. En adición, está disponible un número de sistemas de síntesis de péptidos FMOC . Por ejemplo, el ensamble de un polipéptido o fragmento se puede llevar a cabo sobre un soporte sólido utilizando un sintetizador de péptidos automatizado Applied Biosystems, Inc., modelo 431A. Este equipo proporciona un acceso fácil a los péptidos de la invención, ya sea mediante síntesis directa, o bien mediante la síntesis de una serie de fragmentos que se pueden acoplar empleando otras técnicas conocidas. La invención incluye glucanasas, mananasas o xilanasas de la invención, con y sin señal. El polipéptido que comprende una secuencia de señal de la invención puede ser una glucanasa de la invención, u otra glucanasa u otra enzima u otro polipéptido. La invención incluye glucanasas, mananasas o xilanasas inmovilizadas, anti-cuerpos anti-glucanasa, y fragmentos de los mismos. La invención proporciona métodos para inhibir la actividad de glucanasa, mananasa o xilanasa, v.gr., utilizando mutantes negativos dominantes o anti-cuerpos anti-glucanasa, anti-mananasa o anti-xilanasa de la invención. La invención incluye hetero-complej os , v.gr., proteínas de fusión, heterodímeros , etcétera, que comprenden las glucanasas de la invención . Los polipéptidos de la invención pueden tener una actividad de glucanasa, mananasa o xilanasa bajo diferentes condiciones, por ejemplo extremos en pH y/o temperatura, agentes oxidantes, y similares. La invención proporciona métodos que conducen a preparaciones alternativas de glucanasa con diferentes eficiencias catalíticas y estabilidades, v.gr., hacia la temperatura, hacia los agentes oxidantes, y hacia las condiciones cambiantes del lavado. En un aspecto, se pueden producir variantes de glucanasa, mananasa o xilanasa empleando técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y/o mutagénesis aleatoria. En un aspecto, se puede utilizar la evolución dirigida para producir una gran variedad de variantes de glucanasa, mananasa o xilanasa con especificidades y estabilidades alternativas. Las proteínas de la invención también son útiles como reactivos de investigación para identificar moduladores de glucanasa, mananasa o xilanasa, v.gr., activadores o inhibidores de la actividad de glucanasa, mananasa o xilanasa. Dicho de una manera breve, se agregan muestras de prueba (compuestos, caldos, extractos, y similares) a los ensayos de glucanasa, mananasa o xilanasa para determinar su capacidad para inhibir la disociación del sustrato. Los inhibidores identificados de esta manera se pueden utilizar en la industria y en la investigación para reducir o prevenir la proteólisis indeseada. Se pueden combinar los inhibidores de glucanasa, mananasa o xilanasa para aumentar el espectro de actividad. Las enzimas de la invención son también útiles como reactivos de investigación para digerir proteínas o en secuenciamiento de proteínas. Por ejemplo, una glucanasa, mananasa o xilanasa puede ser usada para desintegrar polipéptidos en fragmentos mas pequeños para secuenciamiento usando, v.gr., un secuenciador automatizado. La invención también proporciona métodos para descubrir una nueva glucanasa, mananasa, o xilanasa utilizando los ácidos nucleicos, polipéptidos, y anti -cuerpos de la invención. En un aspecto, se analizan y seleccionan bibliotecas de fagos lambda para hacer el descubrimiento de una glucanasa, mananasa o xilanasa basado en la expresión. En otro aspecto, la invención utiliza bibliotecas de fagos lambda para descubrimiento de una glucanasa, mananasa oo xilanasa basado en expresión. El análisis y la selección de las bibliotecas de fagos o fagémidos puede permitir la detección de los clones tóxicos; mejor acceso al sustrato; una necesidad reducida de diseñar un hospedero, sobrepasando el potencial de cualquier forzamiento resultante de la separación de masa de la biblioteca; y un crecimiento más rápido en bajas densidades de clones. El análisis y la selección de bibliotecas de fagos lambda puede hacerse en fase líquida o en fase sólida. En un aspecto, la invención proporciona análisis y selección en fase líquida. Esto da una mayor flexibilidad en las condiciones de ensayo; flexibilidad adicional del sustrato; más alta sensibilidad para los clones débiles; y facilidad de automatización del análisis y la selección en fase sólida. La invención proporciona métodos de análisis y selección que utilizan las proteínas y ácidos nucleicos de la invención, y automatización robótica para hacer posible la ejecución de muchos miles de reacciones bio-catalíticas y ensayos de rastreo en un corto período de tiempo, v.gr. , por día, así como se asegura un alto nivel de exactitud y reproducibilidad (ver la descripción de los arreglos más adelante) . Como un resultado, se puede producir una biblioteca de compuestos derivados en materia de semanas. Para otras enseñanzas sobre la modificación de las moléculas, incluyendo las moléculas pequeñas, ver la solicitud internacional PCT/US94/09174. Otro aspecto de la invención es un polipéptido aislado o purificado, que comprende la secuencia de uno de la invención, o fragmentos que comprenden al menos alrededor de 5 , 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 o 150 aminoácidos consecutivos del mismo. Como se discutió antes, tales polipéptidos pueden ser obtenidos insertando un ácido nucleico que codifica el polipéptido en un vector tal que la secuencia de codificación sea enlazada operativamente a una secuencia capaz de excitar la expresión del polipéptido codificado en una célula hospedera adecuada. Por ejemplo, el vector de expresión puede comprender un promotor, un sitio de ligadura de ribosoma para inicio de traducción y un terminador de transcripción. El vector puede incluir también secuencias apropiadas para amplificar la expresión . Otro aspecto de la invención se refiere a polipéptidos' o fragmentos de los mismos que tengan al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 55%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 65%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, o mas de alrededor de 95% de identidad de secuencias (homología) con uno de los polipéptidos de la invención, o un fragmento que comprende al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 o 150 o mas aminoácidos consecutivos del mismo. La identidad de secuencias (homología) puede ser determinada usando cualquiera de los programas antes descritos que alinea los polipéptidos o fragmentos que estén siendo comparados y determina el grado de identidad o similitud de aminoácidos entre ellos. Se apreciará que equivalencia de aminoácidos, o identidad, u "homología" incluye sustituciones de aminoácidos conservadoras, tales como las anteriormente descritas.
Los polipéptidos o fragmentos que tienen homología con uno de los polipéptidos de la invención, o un fragmento que comprende al menos alrededor de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 o 150 aminoácidos consecutivos del mismo pueden ser obtenidos aislando los ácidos nucleicos que los codifican usando las técnicas antes descritas. De manera alternativa, los polipéptidos o fragmentos homólogos pueden ser obtenidos mediante procedimientos de enriquecimiento bioquímico o purificación. La secuencia de polipéptidos o fragmentos potencialmente homólogos puede ser determinada mediante digestión con glucano hidrolasa, electroforesis en gel y/o micro-secuenciamiento . La secuencia del polipéptido o fragmento homólogo prospectivo puede ser comparada con uno de los polipéptidos de la invención, o un fragmento que comprende al menos alrededor de 5 , 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 o 150 aminoácidos consecutivos del mismo, usando cualquiera de los programas antes descritos. Otro aspecto de la invención es un ensaye para identificar fragmentos o variantes de la invención, los cuales conservan la función enzimática de los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, los fragmentos o variantes de dichos polipéptidos pueden ser usados para catalizar reacciones bioquímicas, que indican que el fragmento o la variante conserva la actividad enzimática de un polipéptido de la invención. El ensaye para determinar si los fragmentos de variantes conservan la actividad enzimática de los polipéptidos de la invención incluye los pasos de: poner en contacto el fragmento o la variante de polipéptido con una molécula de sustrato bajo condiciones que permiten al fragmento o variante de polipéptido funcionar y detectar ya sea una reducción en el nivel del sustrato o un incremento en el nivel del producto de reacción específico entre el polipéptido y el sustrato. Los polipéptidos de la invención o fragmentos que comprenden al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 o 150 aminoácidos consecutivos de los mismos pueden ser usados en una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, los polipéptidos o fragmentos de los mismos pueden ser usados para catalizar reacciones bioquímicas . De acuerdo con un aspecto de la invención, se provee un proceso para utilizar los polipéptidos de la invención o polinucleótidos que codifican tales polipéptidos para hidrolizar enlaces glicosídicos . En tales procedimientos, una sustancia que contiene un enlace glicosídico (v.gr., un almidón) es puesta en contacto con uno de los polipéptidos de la invención, o secuencias sustancialmente idénticas al mismo, bajo condiciones que facilitan la hidrólisis del enlace glicosídico. La presente invención explota las propiedades catalíticas únicas de las enzimas. Aunque el uso de bio-catalizadores (es decir, enzimas purificadas o crudas, células no vivas o vivas) en transformaciones químicos requiere de la identificación de un bio-catalizador particular que reacciona con un compuesto de inicio específico, la presente invención usa bio-catalizadores y condiciones de reacción seleccionados que son específicos para grupos funcionales que están presentes en muchos compuestos iniciales, tales como pequeñas moléculas. Cada bio-catalizador es específico para un grupo funcional, o varios grupos funcionales relacionados, y puede reaccionar con muchos compuestos iniciales que contienen este grupo funcional. Las reacciones bio-catalíticas producen una población de derivados a partir de un solo compuesto inicial. Estos derivados pueden ser sometidos a otra ronda de reacciones bio-catalíticas para producir una segunda población de compuestos derivados. Miles de variaciones de la molécula pequeña o compuesto original pueden ser producidas con cada iteración de la derivación bio-catalítica . Las enzimas reaccionan en sitios específicos de un compuesto inicial sin afectar al resto de la molécula, un proceso que es sumamente difícil de lograr usando métodos químicos tradicionales. Este alto grado de especificidad bio-catalítica provee los medios para identificar un solo compuesto activo dentro de la biblioteca. La biblioteca está caracterizada por la serie de reacciones bio-catalíticas usadas para producirla, una llamada "historia bio-sintética" . El análisis y selección de la biblioteca respecto de actividades biológicas y el rastreo de la historia bio-sintética identifican la secuencia específica de la reacción que produce el compuesto activo. La secuencia de reacción es repetida y la estructura del compuesto sintetizado determinada. Este modo de identificación, a diferencia de otros enfoques de síntesis y análisis y selección, no requiere de tecnologías de inmovilización y pueden sintetizarse y probarse compuestos libres en solución usando virtualmente cualquier tipo de ensaye de análisis. Es importante observar que el alto grado de especificidad de las reacciones enzimáticas sobre los grupos funcionales permite el "rastreo" de reacciones enzimáticas específicas que constituyen la biblioteca producida de manera bio-catalítica. Muchos de los pasos de procedimiento son llevados a cabo usando automatización, permitiendo la ejecución de muchos miles de reacciones bio-catalíticas y ensayes de análisis por día así como asegurando un alto nivel de precisión y reproducibilidad. Como resultado, puede producirse una biblioteca de compuestos derivados en cuestión de semanas, lo que tomaría años producir usando los métodos químicos actuales. En un aspecto particular, la invención provee un método para modificar moléculas pequeñas, que comprende poner en contacto un polipéptido codificado por un polinucleótido descrito en la presente o fragmentos enzimáticamente activos del mismo con una molécula pequeña para producir una molécula pequeña modificada. Se prueba una biblioteca de moléculas pequeñas modificadas para determinar si está presente una molécula pequeña modificada dentro de la biblioteca que exhibe una actividad deseada. Una reacción bio-catalítica específica que produce la molécula pequeña modificada de actividad deseada es identificada eliminando de manera sistemática cada una de las reacciones bio-catalíticas usadas para producir una porción de la biblioteca y luego probando las moléculas pequeñas producidas en la porción de la biblioteca respecto de la presencia o ausencia de la molécula pequeña deseada con la actividad deseada. Las reacciones bio-catalíticas específicas que producen la molécula pequeña modificada de actividad deseada son repetidas opcionalmente . Las reacciones bio-catalíticas son conducidas con un grupo de bio-catalizadores que reaccionan con distintas fracciones estructurales encontradas dentro de la estructura de una molécula pequeña, cada bio-catalizador siendo específico para una fracción estructural o un grupo de fracciones estructurales relacionadas; y cada bio-catalizador reacciona con muchas diferentes moléculas pequeñas que contienen la fracción estructural distinta. Secuencias de Señal, Dominios Prepro y Catalíticos La invención proporciona secuencias de señal de glucanasa, mananasa o xilanasa (v.gr., péptidos de señal (SPs) ) , dominio prepro y dominios catalíticos (CDs) (v.gr., sitios activos) . Los SPs, dominios prepro y/o CDs de la invención pueden ser péptidos aislados o recombinantes o pueden ser parte de una proteína de fusión, v.gr., como un dominio heterólogo en una proteína quimérica. La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican estos dominios catalíticos (CDs) , dominios prepro y secuencias de señal (SPs, v.gr., un péptido teniendo una secuencia que comprende/consiste en residuos amino terminales de un polipéptido de la invención) . En un aspecto, la invención proporciona una secuencia de señal que comprende un péptido que comprende/consiste en una secuencia como se señala en los residuos 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, l a 24, 1 a 25, 1 a 26, l a 27, 1 a 28, l a 29, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32, l a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, 1 a 39, 1 a 40, 1 a 41, 1 a 42, 1 a 43, 1 a 44 de un polipéptido de la invención. En un aspecto, la invención también provee polipéptidos quiméricos (y los ácidos nucleicos que los codifican) que comprenden al menos dos enzimas de la invención o sub-secuencias de las mismas, v.gr., dominios catalíticos (CDs) o sitios activos. Por ejemplo, una proteína quimérica de la invención puede tener actividad de mananasa y xilanasa, actividad de mananasa y glucanasa, etc. En un aspecto, la proteína quimérica de la invención comprende una fusión de dominios, v.gr., un solo dominio puede exhibir actividad de glucanasa/xilanasa/mananasa o cualquier combinación de actividades (v.gr., como una proteína quimérica recombinante) . Se han descrito un número de modalidades de la invención. No obstante, se entenderá que se pueden hacer diferentes modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. De conformidad con lo anterior, otras modalidades están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones

Claims (92)

REIVINDICACIONES
1. Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que comprende (a) un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido, donde el ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o mas de identidad de secuencia o identidad de secuencia completa (100%), con la secuencia de las SEQ ID NO:l, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85,,SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107,' SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO 133 , SEQ ID NO : 135, SEQ ID NO : 137 SEQ ID NO 139, SEQ ID NO 141, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO 145, SEQ ID NO: 147 , SEQ ID NO' 149, SEQ ID NO : 151, SEQ ID NO : 153 SEQ ID NO • 155, SEQ ID NO 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO: 163, y SEQ ID NO 165, SEQ ID NO : 167, SEQ ID NO : 169 SEQ ID NO 171, SEQ ID NO 173 , SEQ ID NO : 175, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 179, SEQ ID NO 181, SEQ ID NO : 183 , SEQ ID NO 185, SEQ ID NO 187, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO : 191, SEQ ID NO : 193 SEQ ID NO 195, SEQ ID NO 197 , SEQ ID NO : 199, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO: 203 , SEQ ID NO 205, SEQ ID NO :207, SEQ ID NO 209, SEQ ID NO 211, SEQ ID NO 213 , SEQ ID NO :215, SEQ ID NO 217 , SEQ ID NO 219, SEQ ID NO 221 , SEQ ID NO : 223 , SEQ ID NO ¦225, SEQ ID NO 227, SEQ ID NO 229, SEQ ID NO 231, SEQ ID NO 233 , SEQ ID NO 235, SEQ ID NO 237, SEQ ID NO :239, SEQ ID NO 241, SEQ ID NO 243 , SEQ ID NO 245, SEQ ID NO 247, SEQ ID NO 249, SEQ ID NO 251, SEQ ID NO. 253 , SEQ ID NO 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO 261, SEQ ID NO : 263 , SEQ ID NO 265, SEQ ID NO 267, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO 271, SEQ ID NO: 273 , SEQ ID NO 275 , SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO :279, SEQ ID NO 281, SEQ ID NO 283 , SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO 287, SEQ ID NO 289, SEQ ID NO 291, SEQ ID NO 293 , SEQ ID NO :295, SEQ ID NO. 297, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO 303, SEQ ID NO 305, SEQ ID NO 307, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO 311, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO : 319, SEQ ID NO 321, SEQ ID NO 323 , SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO 331, SEQ ID NO:333, SEQ ID NO:335,, SEQ ID NO:336, SEQ ID NO:337 y/o SEQ ID NO:338, sobre una región de al menos alrededor de 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 o mas residuos, o la longitud completa de un ADNc, una transcripción (ARNm) , o gen, donde el ácido nucleico codifica al menos un polipépti-do que tiene una actividad de aldolasa o codifica un polipéptido o péptido capaz de generar un anti-cuerpo específico a aldolasa (un polipéptido o péptido que actúa como un epítope o inmunóge-no) , y opcionalmente las identidades de secuencia son determinadas mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual, y opcionalmente el algoritmo de comparación de secuencias en un algoritmo BLAST versión 2.2.2, donde una lectura de filtración es fijada en blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, y todas las demás opciones son fijadas por defecto, (b) un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido, donde el ácido nucleico comprende una secuencia que híbrida bajo condiciones astringentes al complemento de una secuencia de ácido nucleico que la comprende la secuencia de las SEQ ID N0:1, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO : 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ! ID NO: 77, SEQ ID NO :79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: í 37, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ! ID NO: 95, SEQ ID NO :97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO :103, SEQ ID NO : 105, SEQ ' ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID. NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO : 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO :119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO : 123 , SEQ ID O : 125, SEQ ID NO : 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133 , SEQ ID NO : 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID O: 141, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID O : 149, SEQ ID NO : 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID O: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, y SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO : 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID O: 173 , SEQ ID NO : 175, SEQ ID NO: 177 , SEQ ID NO: 179, SEQ ID O: 181, SEQ ID NO :183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID O: 189, SEQ ID NO :191, SEQ ID NO: 193 , SEQ ID NO: 195, SEQ ID O: 197, SEQ ID NO : 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203 , SEQ ID O: 205, SEQ ID NO :207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211 , SEQ ID O: 213 , SEQ ID NO :215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID O: 221, SEQ ID NO :223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID O: 229, SEQ ID NO :231, SEQ ID NO: 233 , SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO:: 237, SEQ ID NO :239, SEQ ID NO::241, SEQ ID NO::243, SEQ ID NO: :245, SEQ ID NO :247, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: :253, SEQ ID NO :255, SEQ ID NO: :257, SEQ ID NO: ;259, SEQ ID NO: :261, SEQ ID NO :263, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: :267, SEQ ID NO: :269, SEQ ID NO :271, SEQ ID NO: :273, SEQ ID NO: :275, SEQ ID NO: :277, SEQ ID NO :279, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: :283 SEQ ID NO: :285, SEQ ID NO :287, SEQ ID NO: :289, SEQ ID NO: :291, SEQ ID NO: :293, SEQ ID NO :295, SEQ ID NO :297, SEQ ID NO: :299, SEQ ID NO: :301, SEQ ID NO :303, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: : 309, SEQ ID NO :311, SEQ ID NO : 313 , SEQ ID NO: :315, SEQ ID NO: : 317, SEQ ID NO : 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO : : 323 , SEQ ID NO: :325, SEQ ID NO :327, SEQ ID NO: :329, SEQ ID NO: : 331, SEQ ID NO: :333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO :337 y/o SEQ ID NO : 338 , donde el ácido nucleico codifica al menos un polipépti-do que tiene una actividad de aldolasa o codifica un polipéptido o péptido capaz de generar un anti-cuerpo específico a aldolasa (o polipéptido o péptido que actúa como un epítope o inmunógeno) , y opcionalmente las condiciones astringentes incluyen un paso de lavado que comprende un lavado en SSC 0.2X a una temperatura de alrededor de 65 °C por alrededor de 15 minutos, y opcionalmente el ácido nucleico es de al menos alrededor de 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o mas residuos de longitud o la longitud completa del gen o la transcripción; (c) un ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, donde el polipéptido comprende la secuencia de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO : 64 , SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO : 74 , SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: : 104 , SEQ ID NO: :106, SEQ ID NO: : 108, SEQ ID NO: :110, SEQ ID NO: : 112 , SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: : 120, SEQ ID NO : : 122, SEQ ID NO: :124, SEQ ID NO: : 126, SEQ ID NO: : 128, SEQ ID NO: : 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: :134, SEQ ID NO: : 136, SEQ ID NO : 138, SEQ ID NO: : 140, SEQ ID NO: : 142, SEQ ID NO: : 144 , SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: : 148, SEQ ID NO: : 150, SEQ .ID NO : : 152 , SEQ ID NO: :154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO : :160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: : 164 , SEQ ID NO: :1'66, SEQ ID NO: : 168, SEQ ID NO: : 170, SEQ ID NO: 172 , SEQ ID NO: 174 , SEQ ID NO: : 176, SEQ ID NO : 178, SEQ ID NO: : 180, SEQ ID NO: :182, SEQ ID NO: : 184 , SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: :190, SEQ I NO 192 , SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO 196, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 200, SEQ ID NO: 202 , SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO 208, SEQ ID NO : 210 , SEQ ID NO 212 , SEQ ID NO 214 , SEQ ID NO 216, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO 222, SEQ ID NO 224 , SEQ ID NO 226, SEQ ID NO 228, SEQ ID NO 230, SEQ ID NO 232 , SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO 238, SEQ ID NO 240 , SEQ ID NO 242, SEQ ID NO 244 , SEQ ID NO 246, SEQ ID NO 248, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO 252, SEQ ID NO 254, SEQ ID NO 256, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 262 , SEQ ID NO 264 , SEQ ID NO : 266, SEQ ID NO 268, SEQ ID NO 270, SEQ ID NO 272 , SEQ ID NO : 274 , SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO 278 , SEQ ID NO 280 , SEQ ID NO 282 , SEQ ID NO 284, SEQ ID NO 286, SEQ ID NO 288, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 292 , SEQ ID NO 294, SEQ ID NO 296, SEQ ID NO298, SEQ ID NO300, SEQ ID NO 302 , SEQ ID NO 304 , SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO 308, SEQ ID NO 310, SEQ ID NO 312 , SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO 320, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO 324 , SEQ ID NO 326, SEQ ID NO 328, SEQ ID NO :330, SEQ ID NO:332 y/o SEQ ID NO 334 , o fragmentos enzimáticamente activos de las mismas; (d) (i) el ácido nucleico de (a) , (b) o (c) que codifica un polipéptido que tiene al menos una sustitución de aminoácido conservadora y conserva su actividad de aldolasa; o (ii) el ácido nucleico de (d) (i) , donde la al menos una sustitución de aminoácido conservadora comprende sustituir un aminoácido con otro aminoácido de características similares; o una sustitución conservadora comprende: el reemplazo de un aminoácido alifático con otro aminoácido alifático; el reemplazo de una serina con una treonina o viceversa; el reemplazo de un residuo ácido con otro residuo ácido; el reemplazo de un residuo que lleva un grupo amida con otro residuo que lleva un grupo amida; el intercambio de un residuo básico con otro residuo básico; o el reemplazo de un residuo aromático con otro residuo aromático ; (e) el ácido nucleico (polinucleótido) de (a) , (b) , (c) o (d) que codifica un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa pero que carece de una secuencia de señal, (f) el ácido nucleico (polinucleótido) de (a) , (b) , (c) , (d) o (e) que codifica un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa que comprende además una secuencia heterologa; (g) el ácido nucleico (polinucleótido) de (f) , donde la secuencia heterologa comprende una secuencia que codifica: (i) una secuencia de señal heterologa; (ii) la secuencia de (ii) , donde la secuencia de señal heterologa es derivada de una enzima heterologa; o (iii) un marbete, un epítope, un péptido de objetivo, una secuencia capaz de ser cortada, una fracción detectable o una enzima; o (h) una secuencia de ácido nucleico complementaria a (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) o (g) .
2. El ácido nucleico aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 1, donde la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia como se señala en las SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 8 7, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO :91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95 , SEQ : :D NO :97, SEQ ID NO: 99, SEQ IDi NO : 101, SEQ NO: 103 , SEQ ID NO : 105, SEQ ID NO: : 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: ni, SEQ ID NO :113, SEQ ID NO :115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO : 121, SEQ ID NO: : 123 , SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO : 129, SEQ ID NO :131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO :137, SEQ ID NO: :139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO : 145, SEQ ID NO : 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO :153, SEQ ID NO: : 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO:163, y SEQ ID NO : 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO : 169, SEQ ID NO :171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO : 177, SEQ ID NO: : 179, SEQ ID NO: 181 , SEQ ID NO: 183 , SEQ ID NO : 185, SEQ ID NO : 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO : 193 , SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO 203 SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 207, SEQ ID NO 209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 213 , SEQ ID NO 215, SEQ ID NO 217, SEQ ID NO 219 SEQ ID NO 221, SEQ ID NO 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO 229, SEQ ID NO 231, SEQ ID NO .233, SEQ ID NO 235 . SEQ ID NO 237, SEQ ID NO 239, SEQ ID NO 241, SEQ ID NO: 243 SEQ ID NO 245, SEQ ID NO 247, SEQ ID NO 249, SEQ ID NO 251 SEQ ID NO 253, SEQ ID NO 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO 259 SEQ ID NO 261, SEQ ID NO 263, SEQ ID NO 265, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO 271, SEQ ID NO 273 , SEQ ID NO 275 SEQ ID NO 277, SEQ ID NO 279, SEQ ID NO 281, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO 285, SEQ ID NO 287, SEQ ID NO 289, SEQ ID NO 291 SEQ ID NO 293 , SEQ ID NO 295, SEQ ID NO 297, SEQ ID NO 299 SEQ ID NO 301, SEQ ID NO 303 , SEQ ID NO 305, SEQ ID NO 307 SEQ ID NO 309, SEQ ID NO 311, SEQ ID NO 313 , SEQ ID NO 315 SEQ ID NO 317, SEQ ID NO 319, SEQ ID NO321, SEQ ID NO: 323 , SEQ ID NO325, SEQ ID NO 327, SEQ ID NO 329, SEQ ID NO 331 SEQ ID NO 333 , SEQ ID NO 335, SEQ ID NO:336, SEQ ID NO: 337 o SEQ ID NC : 338.
3. El ácido nucleico aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 1, donde la actividad de aldolasa comprende una actividad de aldolasa de piruvato.
4. El ácido nucleico aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 1, donde la actividad de aldolasa comprende una actividad de aldolasa de HMG. 5. El ácido nucleico aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 1, donde la actividad de aldolasa comprende una actividad de aldolasa de KHG. 6. El ácido nucleico aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 1, donde (a) la actividad de aldolasa es termo-estable, o (b) el polipéptido codificado por el ácido nucleico conserva una actividad de aldolasa bajo condiciones que comprenden- un rango de temperatura de alrededor de -100 a alrededor de -80°C, de alrededor de -80 a alrededor de -40°C, de alrededor de -40 a alrededor de 20°C, de alrededor de -20 a alrededor de 0°C, de alrededor de 0 a alrededor de 37°C, de alrededor de 0 a alrededor de 5°C, de alrededor de 5 a alrededor de 15°C, de alrededor de 15 a alrededor de 25°C, de alrededor de 25 a alrededor de 37°C, de alrededor de 37 a alrededor de 45°C, de alrededor de 45 a alrededor de 55°C, de alrededor de 55 a alrededor de 70°C, de alrededor de 70 a alrededor de 75°C, de alrededor de 75 a alrededor de 85°C, de alrededor de 85 a alrededor de 90°C, de alrededor de 90 a alrededor de 95°C, de alrededor de 95 a alrededor de 100°C, de alrededor de 100 a alrededor de 105°C, de alrededor de 105 a alrededor de 110°C, de alrededor de 110 a alrededor de 120°C, o 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°C, o mas. 7. El ácido nucleico aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 1, donde (a) la actividad de aldolasa es termo-tolerante o (b) el polipéptido conserva una actividad de aldolasa después de exposición a una temperatura en el rango de -100 a alrededor de -80°C, de alrededor de -80 a alrededor de -40°C, de alrededor de -40 a alrededor de 20°C, de alrededor de -20 a alrededor de 0°C, de alrededor de 0 a alrededor de 37°C, de alrededor de 0 a alrededor de 5°C, de alrededor de 5 a alrededor de 15°C, de alrededor de 15 a alrededor de 25°C, de alrededor de 25 a alrededor de 37°C, de alrededor de 37 a alrededor de 45°C, de alrededor de 45 a alrededor de 55°C, de alrededor de 55 a alrededor de 70°C, de alrededor de 70 a alrededor de 75°C, de alrededor de 75 a alrededor de 85°C, de alrededor de 85 a alrededor de 90°C, de alrededor de 90 a alrededor de 95°C, de alrededor de 95 a alrededor de 100°C, de alrededor de 100 a alrededor de 105°C, de alrededor de 105 a alrededor de 110°C, de alrededor de 110 a alrededor de 120°C, o 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°C, o mas. 8. El ácido nucleico aislado, sintético o recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la actividad de aldolasa conserva actividad bajo condiciones ácidas que comprenden un pH de alrededor de 6.5, de 6, de
5.5, de 5, de 4.5, de 4.0, de 3.5, de 3.0 o menor (mas ácido) , o conserva una actividad de aldolasa después de exposición a condiciones ácidas que comprenden un pH de alrededor de
6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4.0, 3.5, 3.0 o menor (mas ácido) . 9. El ácido nucleico aislado, sintético o recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la actividad de aldolasa conserva actividad bajo condiciones básicas, que comprenden un pH de alrededor de 7.0, 8.5, 8.0, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12.0, 12.5 o mayor (mas básico), o conserva actividad de aldolasa después de exposición a condiciones básicas que comprenden un pH de alrededor de 7,
7.5, 8.0,
8.5, 9,
9.5, 10, 10.5, 11.0, 11.5, 12, 12.5 o mayor (mas básico).
10. Una sonda de ácido nucleico para identificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de aldolasa, donde la sonda comprende al menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225 o mas bases consecutivas de una secuencia como se señala en la reivindicación 1, donde la sonda identifica el ácido nucleico por ligadura o hibridación.
11. Un par cebador de amplificación para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, donde el par cebador de amplificación (a) es capaz de amplificar un ácido nucleico que comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o una sub-secuencia de la misma, o (b) el par cebador de (a) , donde un miembro de par de secuencias cebadoras de amplificación comprende un oligonucleótido que comprende al menos alrededor de 10 a 50 bases consecutivas de la secuencia, o alrededor de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, , 30, 31, 32, 33, 34, 35 o mas bases consecutivas de la secuencia.
12. Un par cebador de amplificación, donde el par cebador comprende un primer miembro que tiene una secuencia como se señala por alrededor de los primeros 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o mas residuos (los residuos 5') de una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y un segundo miembro que tiene una secuencia como se señala por alrededor de los primeros 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o mas residuos (los residuos 5') de la cadena complementaria del primer miembro.
13. Un ácido nucleico que codifica aldolasa, generado por amplificación de un polinucleotido usando un par cebador de amplificación como se señala en la reivindicación 11, donde opcionalmente la amplificación es por medio de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) .
14. El ácido nucleico que codifica aldolasa de la reivindicación 13, donde el ácido nucleico es generado por amplificación de una biblioteca de genes, y opcionalmente la biblioteca de genes es una biblioteca ambiental.
15. Una aldolasa aislada, sintética o recombinante , codificada por el ácido nucleico que codifica aldolasa señalado en la reivindicación 13.
16. Un método de amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, que comprende la amplificación de un ácido nucleico de plantilla con un par de secuencias cebadoras de amplificación capaz de amplificar una secuencia de ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o una sub-secuencia de la misma.
17. Un cassette de expresión, un vector o un vehículo de clonación, que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde opcionalmente el vehículo de clonación comprende un vector viral, un plásmido, un pago, un fagémido, un cósmido, un fósmido, un bacteriófago, o un cromosoma artificial.
18. El vehículo de clonación de la reivindicación 17, donde el vector viral comprende un vector de adenovirus, un vector retroviral o un vector viral adeno-asociado , o el cromosoma artificial comprende un cromosoma artificial bacteriano (BAC) , un vector derivado de Pl de bacteriófago (PAC) , un cromosoma artificial de levadura (YAC) , o un cromosoma artificial de mamífero (MAC) .
19. Una célula transformada, que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o comprendiendo un cassette de expresión, un vector o un vehículo de clonación como se señala en la reivindicación 17, donde opcionalmente la célula es una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de planta.
20. Un animal transgénico, no humano, que comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o que comprende un cassette de expresión, un vector o un vehículo de clonación como se señala en la reivindicación 17, una célula transformada como se señala en la reivindicación 19, donde opcionalmente el animal transgénico no humano es un ratón, una rata, un conejo, una oveja, un cerdo, un pollo, una cabra, u pez, o una vaca.
21. Una planta, parte de planta o semilla transgéni-cas, que comprenden una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde opcionalmente la planta es una planta de maíz, una planta de sorgo, una planta de papa, una planta de jitomate, una planta dé trigo, una planta de semilla oleaginosa, una planta de semilla de colza, una planta de frijol de soja, una planta de arroz, una planta de cebada, un pasto, una planta de algodón, una planta de algodón, una palma, una planta de ajonjolí, una planta de cacahuate, una planta de girasol, o una planta de tabaco.
22. Un oligonucleótido anti-sentido, que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a o capaz de hibridar bajo condiciones astringentes en una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o una sub-secuencia de la misma, donde opcionalmente el oligonucleótido anti-sentido es de al menos alrededor de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85', 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225 o mas bases consecutivas de longitud.
23. Una molécula de ARN de interferencia (ARNi) de doble cadena, que comprende una sub-secuencia de una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde opcionalmente el ARNi comprende un ARNsi o un ARNmi , y opcionalmente la molécula de ARNi es de alrededor de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 o mas nucleótidos dúplex de longitud.
24. Un método de inhibir la traducción de un mensaje de aldolasa en una célula, o inhibir la expresión de una aldolasa en una célula, que comprende administrar a la célula o expresar en la célula un oligonucleotido anti-sentido como se señala en la reivindicación 22 o una molécula de ARN inhibidor (ARNi) de doble cadena como se señala en la reivindicación 23.
25. Un polipéptido o péptido aislado, sintético o-recombinante , que tiene una actividad de aldolasa, que comprende (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o mas de identidad de secuencias, o 100% de identidad de secuencias (completa) con las SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO : 30 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO :40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO : 48 , SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO :58 , SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO :76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO :94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102 , SEQ ID NO: 104, SEQ ' ID NO: : 106, SEQ ID NO: : 108, SEQ ID NO: : 110, SEQ ID NO: 112 , SEQ ID NO: :114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: : 122 , SEQ ID NO : 124, SEQ ID NO: : 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: : 130, SEQ ID NO: 132 , SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: : 138, SEQ ID NO: : 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: : 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: : 150, SEQ ID NO: 152 , SEQ ID NO: ; 154 , SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: ; 162, SEQ ID NO: : 164, SEQ ID NO: : 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: :170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174 , SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: : 178 , SEQ ID NO: : 180, SEQ ID NO: : 182 , SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: : 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: : 190, SEQ ID NO: 192 , SEQ ID NO: : 194, SEQ ID NO: : 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO: :202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: :206, SEQ ID NO:208, SEQ ID NO: :210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: :218, SEQ ID NO: :220, SEQ ID NO: :222, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO::234, SEQ ID NO::236, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO :240, SEQ ID NO: :242, SEQ ID NO: :244, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: :248, SEQ ID NO: :250, SEQ ID NO: : 252 , SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO :256, SEQ ID NO: :258, SEQ ID NO: :260, SEQ ID NO: 262 , SEQ ID NO : 264 , SEQ ID NO: :266, SEQ ID NO :268, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO :272, SEQ ID NO: :274, SEQ ID NO: :276, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO :280, SEQ ID NO: : 282 , SEQ ID NO :284, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: :288, SEQ ID NO: :290, SEQ ID NO: :292, SEQ ID NO: 294 , SEQ ID NO :296, SEQ ID NO: :298, SEQ ID NO: :300, SEQ ID NO: 302 , SEQ ID NO: : 304 , SEQ ID NO: :306, SEQ ID NO: :308, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO :312, SEQ ID NO: : 314 , SEQ ID NO: : 316, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO :320, SEQ ID NO : : 322 , SEQ ID NO : 324 , SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO : 328, SEQ ID NO: :330, SEQ ID : NO: 332 y/o SEQ ID NO :334, sobre una región de al menos alrededor de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 o mas residuos, o sobre toda la longitud del polipéptido o la enzima, y/o sub-secuencias (fragmentos) enzimáticamente activas de los mismos, donde opcionalmente las identidades de secuencia opcionalmente las identidades de secuencia son determinadas mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual, y opcionalmente el algoritmo de comparación de secuencias en un algoritmo BLAST versión 2.2.2, donde una lectura de filtración es fijada en blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, y todas las demás opciones son fijadas por defecto, (b) una secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de la reivindicación 1, donde el polipéptido tiene (i) una actividad de aldolasa o (ii) tiene actividad inmunogénica en que es capaz de generar un anti-cuerpo que se liga de manera específica a un polipéptido que tiene una secuencia de (a) , y/o sub- secuencias (fragmentos) enzimáticamente activas de la misma, (c) la secuencia de aminoácidos de (a) o (b) , o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y comprendiendo al menos una sustitución conservadora de residuos de aminoácido, y el polipéptido conserva una actividad de aldolasa, donde opcionalmente la sustitución conservadora comprende el reemplazo de un aminoácido alifático con otro aminoácido alifático; el reemplazo de una serina con una treonina o viceversa; el reemplazo de un residuo ácido con otro residuo ácido; el reemplazo de un residuo que lleva un grupo amida con otro residuo que lleva un grupo amida; el intercambio de un residuo básico con otro residuo básico; o el reemplazo de un residuo aromático con otro residuo aromático, o una combinación de los anteriores, y opcionalmente el residuo alifático comprende alanina, valina, leucina, isoleucina o un equivalente sintético de las mismas; el residuo ácido comprende ácido aspártico, ácido glutámico o un equivalente sintético de los mismos; el residuo que comprende un grupo amida comprende ácido aspártico, ácido glutámico, o un equivalente sintético de los mismos; el residuo básico comprende lisina, arginina o un equivalente sintético de las mismas; o el residuo aromático comprende fenilalanina , tirosina o un equivalente sintético de las mismas, (d) el polipéptido de (a) , (b) o (c) teniendo una actividad de aldolasa pero careciendo de una secuencia de señal, (e) el polipéptido de (a) , (b) , (c) o (d) teniendo una actividad de aldolasa que comprende además una secuencia heteróloga ; (f) el polipéptido de (e) , donde la secuencia heteróloga comprende: (i) una secuencia de señal heteróloga; (ii) la secuencia de (i) , donde la secuencia de señal heteróloga es derivada de una enzima heteróloga; y/o (iii) un marbete, un epítope, un péptido de objetivo, una secuencia capaz de ser cortada, una fracción detectable o una enzima; o (j) comprendiendo una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las ' reivindicaciones 1 a 9.
26. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 25, donde la actividad de aldolasa comprende una actividad de aldolasa de piruvato.
27. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 25, donde la actividad de aldolasa comprende una actividad de aldolasa de HMG.
28. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 25, donde la actividad de aldolasa comprende una actividad de aldolasa de KHG.
29. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 25, donde (a) la actividad de aldolasa es termo-estable o (b) el polipéptido conserva una actividad de aldolasa bajo condiciones que comprenden un rango de temperatura de alrededor de -100 a alrededor de -80°C, de alrededor de -80 a alrededor de -40°C, de alrededor de -40 a alrededor de 20°C, de alrededor de -20 a alrededor de 0°C, de alrededor de 0 a alrededor de 37°C, de alrededor de 0 a alrededor de 5°C, de alrededor de 5 a alrededor de 15°C, de alrededor de 15 a alrededor de 25°C, de alrededor de 25 a alrededor de 37°C, de alrededor de 37 a alrededor de 45°C, de alrededor de 45 a alrededor de 55°C, de alrededor de 55 a alrededor de 70°C, de alrededor de 70 a alrededor de 75°C, de alrededor de 75 a alrededor de 85°C, de alrededor de 85 a alrededor de 90°C, de alrededor de 90 a alrededor de 95°C, de alrededor de 95 a alrededor de 100°C, de alrededor de 100 a alrededor de 105°C, de alrededor de 105 a alrededor de 110°C, de alrededor de 110 a alrededor de 120°C, o 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°C, o mas , y donde opcionalmente la actividad de aldolasa comprende una actividad específica de alrededor de 1,000 a alrededor de 10,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 5,000 a alrededor de 7,500 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 10 a alrededor de 7,500 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 5,000 a alrededor de 12,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 10 a alrededor de 5,000 unidades por miligramo de proteína y de alrededor de 7,500 a alrededor de 10,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 10 a alrededor de 2,500 unidades por miligramo de proteína o de alrededor de 10 a alrededor de 10,000 unidades por miligramo de proteína.
30. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 25, donde (a) la actividad de aldolasa es termo- tolerante o (b) el polipéptido conserva una actividad de aldolasa después de exposición a una temperatura en el rango de temperatura de alrededor de -100 a alrededor de -80°C, de alrededor de -80 a alrededor de -40°C, de alrededor de -40 a alrededor de 20°C, de alrededor de -20 a alrededor de 0°C, de alrededor de 0 a alrededor de 37°C, de alrededor de 0 a alrededor de 5°C, de alrededor de 5 a alrededor de 15 °C, de alrededor de 15 a alrededor de 25°C, de alrededor de 25 a alrededor de 37°C, de alrededor de 37 a alrededor de 45°C, de alrededor de 45 a alrededor de 55°C, de alrededor de 55 a alrededor de 70°C, de alrededor de 70 a alrededor de 75 °C, de alrededor de 75 a alrededor de 85°C, de alrededor de 85 a alrededor de 90°C, de alrededor de 90 a alrededor de 95°C, de alrededor de 95 a alrededor de 100°C, de alrededor de 100 a alrededor de 105°C, de alrededor de 105 a alrededor de 110°C, de alrededor de 110 a alrededor de 120°C, o 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°C, O mas , donde opcionalmente la termo-tolerancia comprende la conservación de al menos la mitad de la actividad específica de la aldolasa después de ser calentada a temperatura elevada, donde, opcionalmente, la temperatura elevada es de alrededor de 0 a alrededor de 20°C, de alrededor de 20 a alrededor de 37°C, de alrededor de 37 a alrededor de 50°C, de alrededor de 50 a alrededor de 70°C, de alrededor de 70 a alrededor de 75°C, de alrededor de 75 a alrededor de 80°C, de alrededor de 80 a alrededor de 85°C, de alrededor de 85 a alrededor de 90°C, de alrededor de 90 a alrededor de 95°C, de alrededor de 95 a alrededor de 100°C, de alrededor de 100 a alrededor de 110°C, o mas , y donde opcionalmente la actividad de aldolasa comprende una actividad específica de alrededor de 1,000 a alrededor de 10,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 5,000 a alrededor de 7,500 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 10 a alrededor de 7,500 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 5,000 a alrededor de 12,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 10 a alrededor de 5,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 7,500 a alrededor de 10,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 10 a alrededor de 2,500 unidades por miligramo de proteína, o de alrededor de 10 a alrededor de 1,000 unidades por miligramo de proteína.
31. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, donde la actividad de aldolasa conserva actividad bajo condiciones ácidas que comprenden un pH de alrededor de 6.5, de 6, de 5.5, de 5, de 4.5, de 4.0, de 3.5, de 3.0 o menor (mas ácido), o conserva una actividad de aldolasa después de exposición a condiciones ácidas que comprenden un pH de alrededor de 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4.0, 3.5, 3.0 o menor (mas ácido), y donde opcionalmente la actividad de aldolasa comprende una actividad específica de alrededor de 1,000 a alrededor de 10,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 5,000 a alrededor de 7,500 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 10 a alrededor de 7,500 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 5,000 a alrededor de 12,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 10 a alrededor de 5,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 7,500 a alrededor de 10,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 10 a alrededor de 2,500 unidades por miligramo de proteína, o de alrededor de 10 a alrededor de 1,000 unidades por miligramo de proteína.
32. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, donde la actividad de aldolasa conserva actividad bajo condiciones básicas, que comprenden un pH de alrededor de 7.0, 8.5, 8.0, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12.0, 12.5 o mayor (mas básico), o conserva actividad de aldolasa después de exposición a condiciones básicas que comprenden un pH de alrededor de 7, 7.5, 8.0, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11.0, 11.5, 12, 12.5 o mayor (mas básico), y donde opcionalmente la actividad de . aldolasa comprende una actividad específica de alrededor de 1,000 a alrededor de 10,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 5,000 a alrededor de 7,500 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 10 a alrededor de 7,500 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 5,000 a alrededor de 12,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 10 a alrededor de 5,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 7,500 a alrededor de 10,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 10 a alrededor de 2,500 unidades por miligramo de proteína, o de alrededor de 10 a alrededor de 1,000 unidades por miligramo de proteína.
33. El polipéptido aislado, sintético o recombinante señalado en cualquiera de las. reivindicaciones 25 a 32, donde el polipéptido comprende al menos un sitio de glicosilación o comprende además un polisacárido, donde opcionalmente la glicosilación es una glicosilación N-enlazada, y opcionalmente el polipéptido es glicosilado después de ser expresado en P. pastoris o S. pombe .
34. Una preparación de proteína, que comprende un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, donde la preparación de .proteína comprende un líquido, un sólido o un gel .
35. Un heterodímero, que comprende un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33 y un segundo dominio, donde opcionalmente el segundo dominio es un polipéptido y el heterodímero es una proteína de fusión, y opcionalmente el segundo dominio comprende un epítope, un péptido inmunógeno o un marbete.
36. Un homodímero, que comprende un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32.
37. Un polipéptido inmovilizado o un ácido nucleico inmovilizado, donde el polipéptido comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o una sub-secuencia de la misma, o el ácido nucleico comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una sub-secuencia de la misma, o la sonda como se señala en la reivindicación 10, donde opcionalmente el polipéptido o ácido nucleico es inmovilizado sobre una célula, un metal, una resina, un polímero, un material cerámico, un vidrio, un micro-electrodo, una partícula de grafito, un perdigón, un gel, una placa, un arreglo, o un tubo capilar.
38. Un anti-cuerpo aislado, sintético o recombinante que se liga específicamente a un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, donde opcionalmente el anti-cuerpo es un anti-cuerpo monoclonal o policlonal.
39. Un arreglo, que comprende un polipéptido inmovilizado o un ácido nucleico inmovilizado, como se señala en la reivindicación 35, o el anti-cuerpo como se señala en la reivindicación 36.
40. Un hibridoma, que comprende un anti-cuerpo como se señala en la reivindicación 36.
41. Un método de aislar o identificar un polipéptido con una actividad de aldolasa, que comprende los pasos de: (a) proveer un anti-cuerpo como se señala en la reivindicación 36; (b) proveer una muestra que comprende polipéptidos ; y (c) poner en contacto la muestra del paso (b) con el anti-cuerpo del paso (a) bajo condiciones donde el anti-cuerpo puede ligarse de manera específica con el polipéptido, con ello aislando o identificando un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa.
42. Un método de hacer un anti-cuerpo anti -aldolasa , que comprende (a) administrar a un animal no humano un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o una sub-secuencia del mismo, en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune humoral, con ello formando un anticuerpo anti -aldolasa , o (b) administrar a un animal no humano un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o una sub-secuencia del mismo, en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune humoral, con ello haciendo 'un anti-cuerpo anti-aldolasa .
43. Un método de producir un polipéptido recombinante , que comprende los pasos de: (a) proveer un ácido nucleico enlazado operativamente a un promotor, donde el ácido nucleico comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 ; y (b) expresar el ácido nucleico del paso (a) bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido, con ello produciendo un polipéptido recombinante, donde opcionalmente el método comprende además transformar una célula hospedera con el ácido nucleico del paso (a) seguido por expresar el ácido nucleico del paso (a) , con ello produciendo un polipéptido recombinante en una célula transformada.
44. Un método para identificar un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, que comprende los pasos siguientes : (a) proveer un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33; (b) proporcionar un sustrato de aldolasa; y (c) poner en contacto el polipéptido con el sustrato del paso (b) y detectar una reducción en la cantidad de sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción, donde una reducción en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad de producto de reacción detecta un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa.
45. Un método para identificar un sustrato de aldolasa, que comprende los pasos siguientes: . (a) proporcionar un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33; (b) proporcionar un sustrato de prueba; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con el sustrato de prueba del paso (b) y detectar una reducción en la cantidad de sustrato o un incremento en la cantidad de producto de reacción, donde una reducción en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción identifica el sustrato de prueba como un sustrato de aldolasa.
46. Un método de determinar si un compuesto de prueba se liga de manera específica a un polipéptido, que comprende los pasos siguientes: (a) expresar un ácido nucleico o un vector que comprende el ácido nucleico bajo condiciones que permitan la traducción del ácido nucleico en un polipéptido, donde el ácido nucleico tiene una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; (b) proporcionar un compuesto de prueba; (c) poner en contacto el polipéptido con el compuesto de prueba; y (d) determinar si el compuesto de prueba del paso (b) se liga de manera especifica al polipéptido.
47. Un método de determinar si un compuesto de prueba se liga de manera específica a un polipéptido, que comprende los pasos siguientes: (a) proporcionar un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33; (b) proporcionar un compuesto de prueba; (c) poner en contacto el polipéptido con el compuesto de prueba ; y (d) determinar si el compuesto de prueba del paso (b) se liga de manera específica al polipéptido.
48. Un método para identificar un modulador de una actividad de aldolasa, que comprende los pasos siguientes: (a) proporcionar un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33; (b) proporcionar un compuesto de prueba; (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con el compuesto de prueba del paso (b) y medir una actividad de la aldolasa, donde un cambio en la actividad de aldolasa medida en la presencia del compuesto de prueba en comparación con la actividad en ausencia del compuesto de prueba provee una determinación de que el compuesto de prueba modula la actividad de aldolasa.
49. El método de la reivindicación 46, donde la actividad de aldolasa es medida proveyendo un sustrato de aldolasa y detectando una reducción en la cantidad de sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción, o un incremento en la cantidad de sustrato y una reducción en la cantidad de un producto de reacción, donde opcionalmente una reducción en la cantidad de sustrato o un incremento en la cantidad de producto de reacción con el compuesto de prueba en comparación con la cantidad de sustrato o producto de reacción sin el compuesto de prueba identifica al compuesto de prueba como un activador de una actividad de aldolasa, y opcionalmente un incremento en la cantidad del sustrato o una reducción en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de prueba en comparación con la cantidad de sustrato o producto de reacción sin el compuesto de prueba identifica el compuesto de prueba como un inhibidor de una actividad de aldolasa.
50. Un sistema de computador, que comprende un procesador y un dispositivo de almacenamiento de datos, donde dicho dispositivo de almacenamiento de datos tiene almacenada en él una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico, donde la secuencia de polipéptido comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde opcionalmente el método comprende además un algoritmo de comparación de secuencias y un dispositivo de almacenamiento de datos teniendo al menos una secuencia de referencia almacenada en él, o comprende además un identificar que identifica una o mas características en dicha secuencia, y opcionalmente el algoritmo de comparación de secuencias comprende un programa de computador que indica polimorfismos .
51. Un medio legible por computador que tiene almacenado en él una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico, donde la secuencia de polipéptido comprende un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
52. Un método para identificar una característica en una secuencia, que comprende los pasos de: (a) leer la secuencia usando un programa de computador que identifica una o mas características en una secuencia, donde la secuencia comprende una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico, donde la secuencia de polipéptido comprende un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33; un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; y (b) identificar una o mas características en la secuencia con el programa de computador.
53. Un método para comparar una primera secuencia con una segunda secuencia, que comprende los pasos de: (a) leer la primera secuencia y la segunda secuencia mediante el -uso de un programa de computador que compara secuencias, donde la primera secuencia comprende una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico, donde la secuencia de polipéptido comprende un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33 o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; y (b) determinar las diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia con el programa de computador, donde opcionalmente el método comprende además un paso de determinar diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia, u opcionalmente el método comprende además el paso de identificar polimorfismos, u opcionalmente el método comprende además el uso de un identificador que identifica una o mas características en una secuencia, y opcionalmente el método comprende leer la primera secuencia usando un programa de computador e identificar una o mas características en la secuencia.
54. Un método para aislar o recuperar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de aldolasa de una muestra ambiental, que comprende los pasos de: (a) proporcionar un par cebador de amplificación como se señala en la reivindicación 11; (b) aislar un ácido nucleico de la muestra ambiental o tratar la muestra ambiental tal que el ácido nucleico en la muestra sea accesible para hibridación con el par cebador de amplificación; y (c) combinar el ácido nucleico del -paso (b) con el par cebador de amplificación del paso (a) y amplificar el ácido nucleico de la muestra ambiental, con ello aislando o recuperando un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de aldolasa de una muestra ambiental, donde opcionalmente la muestra ambiental comprende una muestra de agua, una muestra de líquida, una muestra de tierra, una muestra de aire, o una muestra biológica, y opcionalmente la muestra biológica es derivada de una célula bacteriana, una célula de protozoario, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula de planta, una célula fúngica, o una célula de mamífero.
55. Un método para aislar o recuperar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de aldolasa de una muestra ambiental, que comprende los pasos de: (a) proporcionar una sonda de polinucleótidos que comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1, o una sub-secuencia de la misma, o una sonda como se señala en la reivindicación 10; (b) aislar un ácido nucleico de la muestra ambiental o tratar la muestra ambiental tal que el ácido nucleico en la muestra sea accesible para hibridación en una sonda de polinu-cleótidos del paso (a) ; (c) combinar el ácido nucleico aislado o la muestra ambiental tratada del paso (b) con la sonda de polinucleótidos del paso (a) ; · y (d) aislar un ácido nucleico que híbrida de manera específica con la sonda de polinucleótido del paso (a) , con ello aislando o recuperando un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de aldolasa de una muestra ambiental , donde opcionalmente la muestra ambiental comprende una muestra de agua, una muestra de líquido, una muestra de tierra, una muestra de aire o una muestra biológica, y opcionalmente la muestra biológica es derivada de una célula bacteriana, una célula de protozoario, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula de planta, una célula fúngica, o una célula de mamífero.
56. Un método de generar una variante de un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de aldolasa, que comprende los pasos de: (a) proporcionar un ácido nucleico de plantilla que comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 ; y (b) modificar, eliminar o añadir uno o mas nucleótidos en la secuencia de plantilla, o una combinación de ellos, para generar una variante del ácido nucleico de plantilla, donde opcionalmente el método comprende además expresar el ácido nucleico variante para generar un polipéptido de aldolasa variante, y opcionalmente las modificaciones, adiciones o eliminaciones son introducidas por un método que comprende PCR susceptible a error, revoltura, mutagénesis dirigida por oligonucleótido, PCR de ensamble, mutagénesis por PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis en cassette, mutagénesis de ensamble recursivo, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica al sitio, re-ensamble de genes, mutagénesis de saturación de sitio de gen (GSSM) , re-ensamble de ligadura sintética (SLR) , recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificado por fosfotioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, mutagénesis dúplex con huecos, mutagénesis de reparación de coincidencias de puntos, mutagénesis de cepa hospedera deficiente en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis por eliminación, mutagénesis por restricción-selección, mutagénesis por restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de ensamble, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, y una combinación de las técnicas anteriores , y opcionalmente el método es repetido de manera iterativa hasta que se produce una aldolasa que tiene una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de la de un polipéptido codificado por el ácido nucleico de plantilla.
57. El método de la reivindicación 54, donde el polipéptido de aldolasa variante: (a) es termo-tolerante , y conserva alguna actividad después de estar expuesto a una temperatura elevada; (b) tiene glicosilación incrementada en comparación con la aldolasa codificada por un ácido nucleico de plantilla; o (c) tiene una actividad de aldolasa bajo una temperatura elevada, donde la aldolasa codificada por el ácido nucleico de plantilla es menos activa bajo alta temperatura.
58. El método de la reivindicación 54, donde el método es repetido de manera iterativa hasta que (a) se produce una secuencia que codifica aldolasa que tiene un uso de codón alterado respecto del ácido nucleico de plantilla, o (b) se produce un gen de aldolasa que tiene un nivel superior o inferior de expresión de mensajes o de estabilidad respecto del ácido nucleico de plantilla.
59. Un método para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido de aldolasa, el método comprendiendo los siguientes pasos: (a) proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de aldolasa que comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; y (b) identificar un codón en el ácido nucleico del paso (a) y reemplazarlo con un codón diferente que codifica el mismo aminoácido que el codón reemplazado, con ello modificando codones en un ácido nucleico que codifica una aldolasa.
60. Un método para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldolasa para incrementar su expresión en una célula hospedera, el método comprendiendo los pasos siguientes: (a) proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de aldolasa que comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 ; y (b) identificar un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico del paso (a) y reemplazarlo con un codón preferido o usado de manera neutra que codifica el mismo aminoácido que el codón reemplazado, donde un codón preferido es un codón sobre-representado en secuencias de codificación en genes en la célula hospedera y un codón no preferido o menos preferido es un codón sub-representado en secuencias de codifica-, ción en genes en la célula hospedera, con ello modificando el ácido nucleico para incrementar su expresión en una célula hospedera , donde opcionalmente la célula hospedera es una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula de planta o una célula de mamífero.
61. Un método para modificar un codón en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa para reducir su expresión en una célula hospedera, el método comprendiendo los pasos siguientes: (a) proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de aldolasa que comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; y (b) identificar al menos un codón preferido en el ácido nucleico del paso (a) y reemplazarlo con un codón no preferido o menos preferido que codifica el mismo aminoácido que el codón reemplazado, donde un codón preferido es un codón sobre-representado en secuencias de codificación en genes en la célula hospedera y un codón no preferido o menos preferido es un codón sub-representado en secuencias de codificación en genes en la célula hospedera, con ello modificando el ácido nucleico para incrementar su expresión en una célula hospedera, donde opcionalmente la célula hospedera es una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula de planta o una célula de mamífero.
62. Un método para producir una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de sitios activos de aldolasa modificada o sitios de ligadura de sustrato, donde los sitios activos modificados o los sitios de ligadura de sustrato son derivados de un primer ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un primer sitio activo o un primer sitio de ligadura de sustrato, el método comprendiendo los pasos siguientes : (a) proporcionar un primer ácido nucleico que codifica un primer sitio activo o primer sitio de ligadura de sustrato, donde la primera secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia que híbrida bajo condiciones astringentes en una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una sub-secuencia de la misma, y el ácido nucleico codifica un sitio activo de aldolasa o un sitio de ligadura de sustrato de aldolasa; (b) proporcionar un conjunto de oligonucleótidos mutagénicos que codifican variantes de aminoácidos que ocurren de manera natural en una pluralidad de codones objetivados en el primer ácido nucleico; y (c) usar el conjunto de oligonucleótidos mutagénicos para generar un conjunto de ácidos nucleicos variantes que codifican sitios activos o sitios de ligadura de sustrato que codifican una gama de variaciones de aminoácidos en cada codón de aminoácido que fue mutagenizado, con ello produciendo una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de sitios activos de aldolasa modificada o sitios de ligadura de sustrato, donde opcionalmente un oligonucleótido mutagénico o un ácido nucleico variante es generado por un método que comprende un sistema de evolución dirigida optimizada, mutagénesis de saturación de sitio de genes (GSSM) , o re-ensamble de ligadura sintética (SLR) , PCR susceptible a error, revoltura, mutagénesis dirigida por oligonucleótido, PCR de ensamble, mutagénesis por PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis en cassette, mutagénesis de ensamble recursivo, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica al sitio, re-ensamble de genes, recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificado por fosfotioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, mutagénesis dúplex con huecos, mutagénesis de reparación de coincidencias de puntos, mutagénesis de cepa hospedera, deficiente en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis por eliminación, mutagénesis por restricción-selección, mutagénesis por restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de ensamble, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, y una combinación de las técnicas anteriores.
63. Un método para hacer una molécula pequeña, que comprende los pasos siguientes: (a) proporcionar una pluralidad de enzimas bio-sintéticas capaces de sintetizar o modificar una molécula pequeña, donde una de las enzimas comprende una enzima aldolasa codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; (b) proporcionar un sustrato para al menos una de las enzimas del paso (a) ; y (c) hacer reaccionar el sustrato del paso (b) con las enzimas bajo condiciones que facilitan una pluralidad de reacciones bio-catalíticas para generar una molécula pequeña mediante una serie de reacciones bio-catalíticas .
64. Un método para modificar una molécula pequeña, que comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una enzima aldolasa, donde la enzima comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 28, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; (b) proporcionar una molécula pequeña; y (c) hacer reaccionar la enzima del paso (a) con la molécula pequeña del paso (b) bajo condiciones que facilitan la reacción enzimática catalizada por la enzima aldolasa, con ello modificando una molécula pequeña mediante una reacción enzimática de aldolasa; donde opcionalmente el paso (b) comprende proporcionar una pluralidad de sustratos de molécula pequeña para la enzima del paso (a) , con ello generando una biblioteca de moléculas pequeñas modificadas producidas por medio de al menos una reacción enzimática catalizada por la enzima aldolasa; y opcionalmente el método comprende además proporcionar una pluralidad de enzimas adicionales bajo condiciones que facilitan una pluralidad de reacciones bio-catalíticas por las enzimas para formar una biblioteca de moléculas pequeñas modificadas producidas por medio de la pluralidad de reacciones enzimáticas ; y opcionalmente el método comprende además el paso de probar la biblioteca para determinar si una molécula pequeña modificada particular que exhibe una actividad deseada está presente dentro de la biblioteca, donde opcionalmente el paso de probar la biblioteca comprende además los pasos de eliminar de manera sistemática todas salvo una de las reacciones bio-catalíticas usadas para producir una porción de la pluralidad de las moléculas pequeñas producidas dentro de la biblioteca probando la porción de la molécula pequeña modificada respecto de la presencia o ausencia de la molécula pequeña modificada particular con una actividad deseada, e identificar al menos una reacción bio-catalítica específica que produce la molécula pequeña modificada particular de actividad deseada.
65. Un método para determinar un fragmento funcional de una enzima aldolasa, que comprende los pasos de: (a) proporcionar una enzima aldolasa, donde la enzima comprende un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 ; y (b) eliminar una pluralidad de residuos de aminoácido de la secuencia del paso (a) y probar la sub-secuencia remanente respecto de actividad de aldolasa, con ello determinando un fragmento funcional de una enzima aldolasa; donde opcionalmente la actividad de aldolasa es medida proveyendo un sustrato de aldolasa y detectando una reducción en la cantidad de sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción.
66. Un método para ingeniería de célula completa de fenotipos nuevos y modificados usando análisis de flujo metabóli-co en tiempo real, el método comprendiendo los siguientes pasos: (a) hacer una célula modificada modificando la composición genética de una célula, donde la composición genética es modificada por la adición a la célula de un ácido nucleico que comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; (b) cultivar la célula modificada para generar una pluralidad de células modificadas; (c) medir al menos un parámetro metabólico de la célula monitoreando el cultivo celular del paso (b) en tiempo real; y (d) analizar los datos del paso (c) para determinar si el parámetro medido difiere de una medición comparable en una * célula no modificada bajo condiciones similares, con ello identificando un fenotipo producto de ingeniería en la célula usando análisis de flujo metabólico en tiempo real, donde opcionalmente la composición genética de la célula es modificada por medio de un método que comprende la eliminación de una secuencia o la modificación de una secuencia en la célula, o parando la expresión de un gen, y opcionalmente el método comprende además seleccionar una célula que comprende un fenotipo producto de ingeniería nuevo, y opcionalmente el método comprende además cultivar la célula seleccionada, con ello generando una nueva cepa celular que comprende un fenotipo producto de ingeniería nuevo.
67. Una secuencia de señal o líder aislada, sintética o recombinante que consiste en una secuencia de aminoácidos como se señala en los residuos amino terminales 1 a 14 , 1 a 15, l a 16, 1 a 17, 1 a 18, l a 19, 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 29, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, l a 35, 1 a 36, 1 a 37, l a 38, 1 a 40, l a 41, 1 a 42, 1 a 43, 1 a 44, de (a) una secuencia de aminoácidos como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33.
68. Un polipéptido quimérico, que comprende al menos un primer dominio que comprende un péptido de señal (SP) o secuencia líder que tiene una secuencia de aminoácidos como se señala en la reivindicación 66, y al menos un segundo dominio que comprende un polipéptido o péptido heterólogo, donde el polipéptido o péptido heterólogo no está asociado de manera natural con el péptido de señal (SP) o la secuencia líder, y opcionalmente el polipéptido o péptido heterólogo no es una aldolasa, y opcionalmente el polipéptido o péptido heterólogo es amino terminal a, carboxi terminal a, o está en ambos extremos del péptido de señal (SP) o la secuencia líder.
69. Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinan-té que codifica un polipéptido quimérico, donde el polipéptido quimérico comprende al menos un primer dominio que comprende un péptido de señal (SP) o secuencia líder que tiene una secuencia de aminoácidos como se señala en la reivindicación 66 y al menos un segundo dominio que comprende un polipéptido o péptido heterólogo, donde el polipéptido o péptido heterólogo no está asociado de manera natural con el péptido de señal (SP) o la secuencia líder.
70. Un método de incrementar termo-tolerancia o termo-estabilidad de un polipéptido de aldolasa, el método comprendiendo glicosilar una aldolasa, donde el polipéptido comprende al menos 30 aminoácidos contiguos de un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, con ello incrementando la termo-tolerancia o termo-estabilidad de la aldolasa.
71. Un método para sobre-expresar una aldolasa recombinante en una célula, que comprende expresar un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, donde la sobre-expresión es lograda mediante el uso de un promotor de alta actividad, un vector dicistrónico o por amplificación de genes del vector.
72. Un método de hacer una planta transgénica, que comprende los pasos siguientes: (a) introducir una secuencia heteróloga de ácido nucleico en la célula, donde la secuencia hete'róloga de ácido nucleico comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, con ello produciendo una célula de planta transformada; (b) producir una planta transgénica a partir de la célula transformada, donde opcionalmente el paso (a) comprende además introducir la secuencia heteróloga de ácido nucleico por electroporación o micro- inyección de protoplastos de células de planta , y opcionalmente el paso (a) comprende introducir la secuencia heteróloga de ácido nucleico directamente en tejido de planta por medio de bombardeo de partículas de ADN o usando un hospedero de Agrobacterium turnefaciens .
73. Un método de expresar una secuencia heteróloga de ácido nucleico en una célula de planta, que comprende los pasos siguientes : (a) transformar la célula de planta con una secuencia heteróloga de ácido nucleico enlazada operativamente a un promotor, donde la secuencia heteróloga de ácido nucleico comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33; (b) cultivar la planta bajo condiciones donde la secuencia heteróloga de ácido nucleico es expresada en la célula de planta.
74. Un método de cortar un enlace carbono-carbono en una composición, que comprende los pasos siguientes: (a) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; (b) proporcionar una composición que comprende un enlace carbono-carbono ; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con la composición del paso (b) bajo condiciones en las cuales la aldolasa corta el enlace carbono-carbono en la composición, donde opcionalmente el polipéptido tiene actividad de aldolasa de piruvato, aldolasa de HMG y/o aldolasa de KHG.
75. Un método para formar un enlace carbono-carbono , que comprende los pasos siguientes: (a) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; (b) proporcionar un compuesto donador y un compuesto aceptor; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con los compuestos del paso (b) bajo condiciones donde la aldolasa forma el enlace carbono-carbono, donde opcionalmente el polipéptido tiene actividad de aldolasa de piruvato, aldolasa de HMG y/o aldolasa de HG.
76. Una masa o producto de pan, que comprende un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde opcionalmente el polipéptido tiene actividad de aldolasa, v.gr., actividad de aldolasa de piruvato, v.gr., actividad de aldolasa de HMG y/o KHG.
77. Un método de tratamiento de masa, que comprende poner en contacto una masa o un producto de pan con al menos un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones l a 9, bajo condiciones suficientes para tratar la masa.
78. Una bebida, que comprende un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde opcionalmente el polipéptido tiene actividad de aldolasa de piruvato, aldolasa de HMG y/o aldolasa de KHG.
79. Un método de producción de bebidas, que comprende la administración de al menos un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, a una bebida o precursor de bebida, bajo condiciones suficientes para reducir la viscosidad de la bebida , donde opcionalmente la bebida o precursor de bebida es una infusión de malta o una cerveza.
80. Un aditivo para alimentos, un aditivo para productos alimenticios, un aditivo para bebidas o un suplemento nutricional, que comprende un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde opcionalmente el polipéptido tiene actividad de aldolasa, v.gr., actividad de aldolasa de piruvato, v.gr., actividad de aldolasa de HMG y/o KHG.
81. Un método para utilizar una aldolasa como un suplemento nutricional en una dieta animal, el método comprendiendo : preparar un suplemento nutricional que contiene una enzima aldolasa que comprende al menos 30 aminoácidos contiguos de un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; y administrar el suplemento nutricional a un animal, donde opcionalmente el animal es un ser humano, o el animal es un rumiante o un animal monogástrico, y opcionalmente la enzima aldolasa es preparada mediante expresión de un polinucleotido que codifica la aldolasa en un organismo seleccionado del grupo que consiste en una bacteria, una levadura, una planta, un insecto, un hongo, y un animal, y opcionalmente el organismo es seleccionado del grupo que consiste en S. pombe, S. cerevisiae, Pichia pastoris , E. coli, Streptomyces s . , Bacillus sp . , y Lactobacillus sp .
82. Una matriz de entrega de enzima, comestible, o una perla o perdigón, que comprende una enzima aldolasa recombinante , termo-estable, que comprende un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde opcionalmente el polipéptido tiene actividad de aldolasa, v.gr., aldolasa de piruvato, v.gr., aldolasa de HMG y/o KHG.
83. Un método para entregar un suplemento de aldolasa a un animal, el método comprendiendo: preparar una matriz de entrega de enzima, comestible, o perlas o perdigones, que comprenden un portador comestible granulado y una enzima aldolasa recombinante , termo-estable, donde las perlas o perdigones dispersan fácilmente la enzima aldolasa ahí contenida en medios l acuosos, y la enzima aldolasa recombinante comprende un polipép-tido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; y administrar la matriz de entrega de enzima, comestible, o perla o perdigón, al animal , donde opcionalmente el portador comestible granulado comprende un portador seleccionado del grupo que consiste en un germen de grano, un germen de grano desprovisto de aceite, una paja, una alfalfa, una planta de timoteo, una cáscara de soja, una harina de semilla de girasol y mezcla de trigo molido grueso con salvado, y opcionalmente el portador comestible comprende germen de grano que está desprovisto de aceite, y opcionalmente la enzima aldolasa es glicosilada para proveer termo-estabilidad en condiciones de formación de perlas o perdigones, y opcionalmente la matriz de entrega es formada convirtiendo en perlas o perdigones una mezcla que comprende un germen de grano y una aldolasa, y opcionalmente las condiciones de formación de perlas o perdigones incluyen la aplicación de vapor de agua, y opcional -mente las condiciones de formación de perlas o perdigones comprenden la aplicación de una temperatura en exceso de alrededor de 80 °C por alrededor de 5 minutos y la enzima conserva una actividad específica de al menos 350 a alrededor de 900 unidades por miligramo de enzima.
84. Una composición farmacéutica o suplemento dietario, que comprende una aldolasa como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde opcionalmente la aldolasa es formulada como una tableta, un gel, una pildora, un implante, un líquido, un rocío, un polvo, un alimento, un perdigón o perla alimenticio, o como una formulación encapsulada, y opcionalmente la actividad de aldolasa comprende actividad de aldolasa de piruvato, de aldolasa de HMG y/o de aldolasa de KHG.
85. Un alimento o producto alimenticio, que comprende un polipéptido como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde opcionalmente el polipéptido tiene una actividad que comprende actividad de aldolasa, v.gr., aldolasa de piruvato, v.gr., de aldolasa de HMG y/o KHG.
86. Un método para hacer un alimento o producto alimenticio, que comprende poner en contacto una composición que comprende un compuesto que contiene un enlace carbono-carbono con un polipéptido como' se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde opcionalmente el polipéptido tiene actividad que comprende actividad de aldolasa, v.gr., aldolasa de piruvato, v.gr. , de aldolasa de H G y/o KHG.
87. Un método para hacer un ácido D-glutámico 4-sustituido, que comprende los pasos siguientes: (a) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 ,· (b) proporcionar un aceptor de ácido a-ceto y un piruvato o donador de piruvato; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con los compuestos del paso (b) bajo condiciones donde la aldolasa cataliza la síntesis de un ácido D-glutámico 4-sustituido, donde opcionalmente el polipéptido tiene una actividad de aldolasa de piruvato, -aldolasa de HMG y/o aldolasa de KHG, y donde opcionalmente el método comprende además el uso de una D-aminotransferasa .
88. El uso del ácido D-glutámico 4-sustituido de la reivindicación 87 como un antibiótico.
89. Un método para hacer un 2 -ceto-glutarato 3,4-sustituido, que comprende los pasos siguientes: (a) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; (b) proporcionar un donador y un compuesto aceptor; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con los compuestos del paso (b) bajo condiciones donde la aldolasa cataliza la síntesis de un 2 -ceto-glutarato 3 , 4-sustituido, donde opcionalmente el polipéptido tiene actividad de aldolasa de piruvato, aldolasa de HMG y/o aldolasa de KHG, y donde opcionalmente el donador y el aceptor son un piruvato o un donador de piruvato y un aceptor de un ácido a-ceto, una cetona y/o un aldehido.
90. Un método para convertir biomasa o cualquier material lignocelulósico en un combustible, que comprende poner en contacto la biomasa o el material lignocelulósico con un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, donde el polipéptido tiene una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o el- polipéptido es codificado por un ácido nucleico que comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un fragmento enzimáticamente activo de la misma, donde opcionalmente la biomasa o el material lignocelulósico ha sido pre-tratado antes de contacto con la aldolasa, donde opcionalmente la biomasa o el materia lignocelulosico ha sido puesto en contacto con una enzima que degrada celulosa y/o hemi-celulosa, antes de contacto con la aldolasa, y donde opcionalmente el combustible es un etanol, metanol , propanol, butanol y/o diesel.
91. El uso de un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, donde el polipéptido tiene una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o el polipéptido es codificado por un ácido nucleico que comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un fragmento enzimáticamente activo de la misma, para convertir una biomasa o cualquier material lignocelulosico en un combustible, donde opcionalmente la biomasa o el material lignocelulosico han sido pre-tratados antes de contacto con la aldolasa, donde opcionalmente la biomasa o el materia lignocelulosico ha sido puesto en contacto con una enzima que degrada celulosa y/o hemi-celulosa, antes de contacto con la aldolasa, y donde opcionalmente el combustible es un etanol, metanol, propanol, butanol y/o diesel.
92. Una composición, que comprende un combustible y un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, donde el polipéptido tiene una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, o el polipéptido es codificado por un ácido nucleico que comprende una secuencia como se señala en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un fragmento enzimáticamente activo de la misma, donde opcionalmente el combustible es un etanol, metanol, propanol, butanol y/o diesel.
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Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8158389B2 (en) * 2005-04-20 2012-04-17 Cargill, Incorporated Products and methods for in vivo secretion of monatin
EP1883817A4 (en) * 2005-04-20 2009-09-23 Cargill Inc PRODUCTS AND PROCEDURES FOR IN VIVO SECRETION OF MONATIN
US8076108B2 (en) 2005-04-26 2011-12-13 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors
US8043837B2 (en) 2006-03-07 2011-10-25 Cargill, Incorporated Aldolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
RU2505606C2 (ru) 2010-10-14 2014-01-27 Адзиномото Ко., Инк. Способ получения монатина
CN102181471B (zh) * 2011-03-23 2014-07-02 深圳大学 莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法
US10436790B2 (en) 2011-09-28 2019-10-08 Waters Technologies Corporation Rapid fluorescence tagging of glycans and other biomolecules with enhanced MS signals
IN2014MN00992A (es) 2011-12-22 2015-04-24 Xyleco Inc
CN102559722B (zh) * 2012-03-12 2017-05-17 杭州师范大学 一种高酶活、耐热醛缩酶基因、酶、载体、工程菌及应用
SG10201604464SA (en) 2012-03-26 2016-07-28 Axcella Health Inc Charged nutritive proteins and methods
EP3715365A1 (en) 2012-03-26 2020-09-30 Axcella Health Inc. Nutritive fragments, proteins and methods
EP2831102A4 (en) 2012-03-26 2015-12-02 Pronutria Inc NUTRITIONAL FRAGMENTS, PROTEINS THEREFOR AND METHOD
EP2831100A4 (en) 2012-03-26 2016-02-10 Pronutria Inc NUTRIENT PROTEINS AND METHOD
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
RU2016110842A (ru) 2013-09-25 2017-10-30 Пронутриа Биосайенсис, Инк. Композиции и составы для предотвращения и уменьшения опухолеобразования, пролиферации и инвазии раковых клеток, и способы их получения и применения при лечении раковых заболеваний
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
DK3748340T3 (da) 2014-10-30 2022-04-19 Waters Technologies Corp Fremgangsmåder til hurtig præparering af mærkede glykosylaminer og til analyse af glykosylerede biomolekyler, som fremstiller samme
EP3218352B1 (en) 2014-11-13 2020-08-05 Waters Technologies Corporation Method for liquid chromatography calibration for labeled n-glycans, method for preparing a dextran ladder calibrant and calibrant
EP3472621A4 (en) 2016-06-21 2020-03-04 Waters Technologies Corporation Methods of electrospray ionization of glycans modified with amphipathic, strongly basic moieties
EP3479103B1 (en) 2016-07-01 2022-04-20 Waters Technologies Corporation Methods for the rapid preparation of labeled glycosylamines from complex matrices using molecular weight cut off filtration and on-filter deglycosylation
CN108079315B (zh) * 2016-11-21 2021-09-24 厦门华绰生物医药科技有限公司 FBP aldolase在制备激活AMPK的药物中的用途
EP3330380A1 (en) * 2016-12-05 2018-06-06 Evonik Degussa GmbH Process for producing l-methionine from methional
CN107541540B (zh) * 2017-10-18 2021-07-20 南京财经大学 一种活性炭串联大孔树脂纯化菜籽肽的方法
EP3820833A4 (en) * 2018-07-12 2022-08-03 Codexis, Inc. MODIFIED AMMONIA-LYASE PHENYLALANINE POLYPEPTIDES
BR112020024296A2 (pt) 2018-08-27 2021-03-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Métodos para produção de um intermediário de purificação de proteína concentrado, para monitoramento e controle dos atributos de qualidade críticos em um intermediário de purificação de proteína e para monitorar e controlar os níveis de excipientes no fluido de cultura de células colhido e/ou intermediário de purificação de proteína, e, intermediário de purificação de proteína
EP3875590A4 (en) * 2018-10-30 2023-02-15 Green Earth Institute Co., Ltd. PROCESS FOR THE PRODUCTION OF AN ORGANIC COMPOUND AND CORYNEFORM BACTERIUM
JP7558167B2 (ja) 2018-12-03 2024-09-30 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム オリゴベンズアミド類似体およびがん処置におけるそれらの使用
WO2021055696A1 (en) * 2019-09-19 2021-03-25 The Regents Of The University Of California Methods for producing d-tryptophan and substituted d-tryptophans
CN114279952B (zh) * 2020-09-27 2024-03-12 瑞辰星生物技术（广州）有限公司 用于造纸系统控制有机污染物沉积的生物酶酶活力的测定方法
CN112301067B (zh) * 2020-11-06 2022-07-05 杭州濡湜生物科技有限公司 一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺
CN112280773B (zh) * 2020-11-06 2022-07-12 杭州濡湜生物科技有限公司 一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺
CN113151551A (zh) * 2021-04-22 2021-07-23 山西农业大学 Caps分子标记在鉴定谷子株高性状的用途及引物和检测试剂盒
CN116987601B (zh) * 2023-09-27 2023-12-15 菏泽学院 一种微生物制剂及其在多环芳烃降解中的应用
CN119685439B (zh) * 2024-12-17 2025-10-03 西安建筑科技大学 一种基于选择性金属离子脱除的微生态菌群原位筛选和厌氧产酸富集方法及装置

Family Cites Families (150)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5366558A (en) 1979-03-23 1994-11-22 Brink David L Method of treating biomass material
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US5087571A (en) 1984-06-22 1992-02-11 President And Fellows Of Harvard College Method for providing a cell culture from a transgenic non-human mammal
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
EP1186660A3 (fr) 1985-03-30 2002-03-20 KAUFFMAN, Stuart A. Procédé d'obtension d'ADN, ARN, peptides, polypeptides ou protéines, par une technique de recombination d'ADN
US5780292A (en) 1987-04-29 1998-07-14 Alko Group Ltd. Production of phytate degrading enzymes in trichoderma
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US5573933A (en) 1987-04-14 1996-11-12 Luminis Pty, Ltd. Transgenic pigs
US6054270A (en) 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5527681A (en) 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5589583A (en) 1990-01-11 1996-12-31 Monsanto Company Plant promoter
GB2240105B (en) 1990-01-19 1993-06-09 Technology Finance Corp Process for the production of 3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl) indole
WO1991016427A1 (en) 1990-04-24 1991-10-31 Stratagene Methods for phenotype creation from multiple gene populations
JPH06507782A (ja) 1990-06-15 1994-09-08 サイオス　ノバ　インコーポレイテッド アルツハイマー病のアミロイド形成開症状を示すヒト以外の組換え哺乳動物
ES2147551T3 (es) 1990-11-23 2000-09-16 Aventis Cropscience Nv Procedimiento para transformar plantas monocotiledoneas.
CA2098824A1 (en) 1990-12-20 1992-06-21 William D. Huse Optimization of binding proteins
US6110700A (en) 1991-03-11 2000-08-29 The General Hospital Corporation PRAD1 cyclin and its cDNA
US5922854A (en) 1991-06-14 1999-07-13 Kumar; Ramesh Purifying Human Hemogloblin from transgenic pig red cells and plasmids containing pig globin nucleic acids
JP2648897B2 (ja) 1991-07-01 1997-09-03 塩野義製薬株式会社 ピリミジン誘導体
CA2075135A1 (en) 1991-08-02 1993-02-03 David E. Ellis Particle-mediated transformation of gymnosperms
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
JPH05236997A (ja) 1992-02-28 1993-09-17 Hitachi Ltd ポリヌクレオチド捕捉用チップ
WO1994012014A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
AU7925094A (en) 1993-09-30 1995-04-18 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous peroxidase
US6045996A (en) 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US5965452A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Nanogen, Inc. Multiplexed active biologic array
US6468742B2 (en) 1993-11-01 2002-10-22 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using bioelectronic microchip
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5639940A (en) 1994-03-03 1997-06-17 Pharmaceutical Proteins Ltd. Production of fibrinogen in transgenic animals
CA2184688A1 (en) 1994-03-09 1995-09-14 Pedro Antonio Prieto Transgenic animals producing oligosaccharides and glycoconjugates
CA2184687A1 (en) 1994-03-09 1995-09-14 Pedro Antonio Prieto Humanized milk
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5750870A (en) 1994-06-17 1998-05-12 Agritope, Inc. Plant genetic transformation methods and transgenic plants
US5959171A (en) 1994-08-17 1999-09-28 Pharming B.V. Method for the production of biologically active polypeptides in a mammal's
EP0778886A4 (en) 1994-09-01 2001-05-02 TRANSGENIC ANIMAL WHICH EXPRESSES A FAMILY FORM OF THE HUMAN AMYLOID FOREQUARTER PROTEIN
US6111166A (en) 1994-09-19 2000-08-29 Medarex, Incorporated Transgenic mice expressing human Fcα and β receptors
US5795737A (en) 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins
US5880327A (en) 1994-09-21 1999-03-09 American National Red Cross Transgenic mammals expressing human coagulation factor VIII
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6187992B1 (en) 1994-12-05 2001-02-13 Merck & Co., Inc. Transgenic mouse having a disrupted amyloid precursor protein gene
US5830645A (en) 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
US5633440A (en) 1994-12-20 1997-05-27 Dna Plant Technology Corporation P119 promoters and their uses
US5705369A (en) 1994-12-27 1998-01-06 Midwest Research Institute Prehydrolysis of lignocellulose
JP3307947B2 (ja) 1995-01-26 2002-07-29 ノボザイムス アクティーゼルスカブ キシラナーゼを含有する動物飼料添加剤
US5959098A (en) 1996-04-17 1999-09-28 Affymetrix, Inc. Substrate preparation process
US5795749A (en) 1995-04-05 1998-08-18 The Scripps Research Institution Use of 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase to prepare 2-deoxyfucose, analogues and derivatives
AU698739B2 (en) 1995-06-06 1998-11-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US5958672A (en) 1995-07-18 1999-09-28 Diversa Corporation Protein activity screening of clones having DNA from uncultivated microorganisms
US6057103A (en) 1995-07-18 2000-05-02 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
US5962258A (en) 1995-08-23 1999-10-05 Diversa Corporation Carboxymethyl cellulase fromthermotoga maritima
US5721118A (en) 1995-10-31 1998-02-24 The Regents Of The University Of California, San Diego Mammalian artificial chromosomes and methods of using same
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US6361974B1 (en) 1995-12-07 2002-03-26 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US6358709B1 (en) 1995-12-07 2002-03-19 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US5939250A (en) 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US5830696A (en) 1996-12-05 1998-11-03 Diversa Corporation Directed evolution of thermophilic enzymes
US20030215798A1 (en) 1997-06-16 2003-11-20 Diversa Corporation High throughput fluorescence-based screening for novel enzymes
US6537776B1 (en) 1999-06-14 2003-03-25 Diversa Corporation Synthetic ligation reassembly in directed evolution
US6740506B2 (en) 1995-12-07 2004-05-25 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6022963A (en) 1995-12-15 2000-02-08 Affymetrix, Inc. Synthesis of oligonucleotide arrays using photocleavable protecting groups
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
US6025155A (en) 1996-04-10 2000-02-15 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US5697987A (en) 1996-05-10 1997-12-16 The Trustees Of Princeton University Alternative fuel
US6057100A (en) 1996-06-07 2000-05-02 Eos Biotechnology, Inc. Oligonucleotide arrays
US6326204B1 (en) 1997-01-17 2001-12-04 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
AU743305C (en) 1997-01-17 2006-03-30 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
DK0973940T3 (da) 1997-03-18 2008-10-20 Novozymes As En in vitro-fremgangsmåde til konstruktion af et DNA-bibliotek
WO1998041622A1 (en) 1997-03-18 1998-09-24 Novo Nordisk A/S Method for constructing a library using dna shuffling
US5948653A (en) 1997-03-21 1999-09-07 Pati; Sushma Sequence alterations using homologous recombination
US6153410A (en) 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
US6333181B1 (en) 1997-04-07 2001-12-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Ethanol production from lignocellulose
US5916780A (en) 1997-06-09 1999-06-29 Iogen Corporation Pretreatment process for conversion of cellulose to fuel ethanol
US7019827B2 (en) 1997-06-16 2006-03-28 Diversa Corporation GigaMatrix holding tray having through-hole wells
AUPO758297A0 (en) 1997-06-27 1997-07-24 Rowe, James Baber Control of acidic gut syndrome
US6826296B2 (en) 1997-07-25 2004-11-30 Affymetrix, Inc. Method and system for providing a probe array chip design database
JP2001514906A (ja) 1997-08-15 2001-09-18 ハイセック，インコーポレーテッド 核酸種を検出または定量するための方法および組成物
ATE319986T1 (de) 1997-09-11 2006-03-15 Bioventures Inc Verfahren zur herstellung von arrays hoher dichte
US6465178B2 (en) 1997-09-30 2002-10-15 Surmodics, Inc. Target molecule attachment to surfaces
AU1124499A (en) 1997-10-28 1999-05-17 Maxygen, Inc. Human papillomavirus vectors
EP1030861A4 (en) 1997-10-31 2001-09-05 Maxygen Inc MODIFICATION OF VIRAL TROPISM AND THE DIVERSITY OF HOST SPECIES BY RECOMBINATION OF THE VIRAL GENOME
US6118044A (en) 1997-11-14 2000-09-12 Sankyo Company, Limited Transgenic animal allergy models and methods for their use
EP1036198B1 (en) 1997-12-08 2012-09-26 California Institute Of Technology Method for creating polynucleotide and polypeptide sequences
MXPA00007889A (es) 1998-02-11 2002-09-18 Maxygen Inc Optimizacion de las propiedades inmunomoduladoras de las vacunas geneticas.
AU3289199A (en) 1998-02-11 1999-08-30 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
AU3463699A (en) 1998-04-03 1999-10-25 Phylos, Inc. Addressable protein arrays
US6156952A (en) 1998-04-09 2000-12-05 Constituent Institution Of The University Of Maryland System HIV transgenic animals and uses therefor
US6048695A (en) 1998-05-04 2000-04-11 Baylor College Of Medicine Chemically modified nucleic acids and methods for coupling nucleic acids to solid support
IL140100A0 (en) 1998-06-29 2002-02-10 Phylos Inc Methods of generating highly diverse libraries
FR2782323B1 (fr) 1998-08-12 2002-01-11 Proteus Procede de production in vitro de sequences polynucleotidiques recombinees, banques de sequences et sequences ainsi obtenues
GB2340755B (en) 1998-08-24 2002-09-25 Cannon Rubber Ltd Breast pump insert
US6277628B1 (en) 1998-10-02 2001-08-21 Incyte Genomics, Inc. Linear microarrays
US6277489B1 (en) 1998-12-04 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Support for high performance affinity chromatography and other uses
US6368861B1 (en) 1999-01-19 2002-04-09 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
US6376246B1 (en) 1999-02-05 2002-04-23 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US7024312B1 (en) 1999-01-19 2006-04-04 Maxygen, Inc. Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics
DE19910464A1 (de) 1999-03-10 2000-09-14 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von Cyclobutanon
US6221653B1 (en) 1999-04-27 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids
MXPA01011279A (es) 1999-05-07 2002-07-02 Genentech Inc Tratamiento de enfermedades autoinmunes con antagonistas que se unene a los marcadores de superficie, de celulas b.
US6653151B2 (en) 1999-07-30 2003-11-25 Large Scale Proteomics Corporation Dry deposition of materials for microarrays using matrix displacement
US6409841B1 (en) 1999-11-02 2002-06-25 Waste Energy Integrated Systems, Llc. Process for the production of organic products from diverse biomass sources
US20010008765A1 (en) 1999-12-06 2001-07-19 Fuji Photo Film Co., Ltd. DNA chip and reactive solid carrier
ES2166316B1 (es) 2000-02-24 2003-02-16 Ct Investig Energeticas Ciemat Procedimiento de produccion de etanol a partir de biomasa lignocelulosica utilizando una nueva levadura termotolerante.
JP2001328984A (ja) 2000-05-19 2001-11-27 Kuraray Co Ltd メバロラクトンの製造方法
EP1294869A2 (en) 2000-06-14 2003-03-26 Diversa Corporation Whole cell engineering by mutagenizing a substantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating
US6423145B1 (en) 2000-08-09 2002-07-23 Midwest Research Institute Dilute acid/metal salt hydrolysis of lignocellulosics
WO2002014261A2 (en) 2000-08-10 2002-02-21 Eli Lilly And Company 4-substituted d-glutamic acid derivatives for use as antibiotic
WO2002029032A2 (en) 2000-09-30 2002-04-11 Diversa Corporation Whole cell engineering by mutagenizing a substantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating
WO2002031203A2 (en) 2000-10-10 2002-04-18 Diversa Corporation High throughput or capillary-based screening for a bioactivity or biomolecule
US6309872B1 (en) 2000-11-01 2001-10-30 Novozymes Biotech, Inc Polypeptides having glucoamylase activity and nucleic acids encoding same
EP1347770A4 (en) 2000-11-30 2005-10-19 Diversa Corp PROCESS FOR PREPARING A PROTEIN POLYMER AND USE OF THE POLYMER
US20060019913A1 (en) 2001-05-18 2006-01-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibtion of protein tyrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
CA2462641A1 (en) 2001-10-01 2003-04-10 Diversa Corporation Whole cell engineering using real-time metabolic flux analysis
US7572607B2 (en) 2002-04-23 2009-08-11 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors
PL208998B1 (pl) 2002-04-23 2011-07-29 Cargill Sposób wytwarzania monatyny
JP4670347B2 (ja) * 2002-08-26 2011-04-13 味の素株式会社 新規アルドラーゼおよび置換α−ケト酸の製造方法
JP2006512086A (ja) * 2002-09-20 2006-04-13 ダイヴァーサ コーポレイション スタチンおよびスタチン中間体の合成のための酵素化学的方法
US6776979B2 (en) 2002-12-30 2004-08-17 Marvin B. Frager Periodontal treatment compound and method of use
AU2004286207B2 (en) * 2003-10-21 2011-02-24 Cargill, Incorporated Production of monatin and monatin precursors
JP4500977B2 (ja) 2003-11-05 2010-07-14 味の素株式会社 新規アミノ酸誘導体及び甘味剤
JP4604524B2 (ja) * 2004-03-16 2011-01-05 味の素株式会社 変異型アルドラーゼ、並びにこれを用いた光学活性ｉｈｏｇ及び光学活性モナティンの製造方法
US20060014260A1 (en) 2004-05-07 2006-01-19 Zhiliang Fan Lower cellulase requirements for biomass cellulose hydrolysis and fermentation
US20060030003A1 (en) 2004-05-12 2006-02-09 Simon Michael R Composition and method for introduction of RNA interference sequences into targeted cells and tissues
US7338763B2 (en) 2004-06-02 2008-03-04 Eppendorf Array Technologies S.A. Method and kit for the detection and/or quantification of homologous nucleotide sequences on arrays
US7799565B2 (en) 2004-06-07 2010-09-21 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering RNA
CN100519756C (zh) * 2004-06-07 2009-07-29 味之素株式会社 新的醛缩酶及光学活性ihog及莫那亭的制备方法
CA2506247C (en) * 2004-06-07 2012-02-21 Ajinomoto Co., Inc. Novel aldolase, and method for producing optically active ihog and monatin
US7635563B2 (en) 2004-06-30 2009-12-22 Massachusetts Institute Of Technology High throughput methods relating to microRNA expression analysis
US20060019258A1 (en) 2004-07-20 2006-01-26 Illumina, Inc. Methods and compositions for detection of small interfering RNA and micro-RNA
US7923231B2 (en) 2004-12-17 2011-04-12 Cargill, Incorporated Production of glucuronic acid using myo-inositol oxygenase from cryptococcus neoformans
US7582455B2 (en) * 2005-04-26 2009-09-01 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors
US8076108B2 (en) * 2005-04-26 2011-12-13 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors
CN105452839B (zh) 2013-06-21 2019-01-15 伯乐生命医学产品有限公司 具有流体收集管的微流体系统

Also Published As

Publication number Publication date
US20160251643A1 (en) 2016-09-01
US8546118B2 (en) 2013-10-01
JP2009531025A (ja) 2009-09-03
EP3153580A2 (en) 2017-04-12
KR20150020722A (ko) 2015-02-26
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