MX2008011141A - Combinacion farmaceutica para el tratamiento y/o quimiosensibilizacion de tumores refractarios a drogas anticancerigenas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con una combinación farmacéutica que incluye un inhibidor de la fosforilación de la Caseína Kinasa 2(denominado P15) y los citostáticos usados en la quimioterapia del cáncer los cuales son administrados simultáneos, separados o secuencialmente. Los citostáticos preferidos son los platinos, taxanos, alcaloides de la Vinca, 5-fluorouracilo, doxorubicina, ciclofosfamida, etoposide, mitomicina C, imatinib, iressa y el velcade (vortezomib). La sinergia entre el péptido P15 y los compuestos químicos anticancerígenos, hace que la concentración eficaz de cada citostático en la combinación sea entre uno y dos órdenes de magnitud menor que la correspondiente a los citostáticos solos. Consecuentemente, la combinación descrita en la invención tiene una toxicidad mucho menor que la reportada para los citostáticos anticancerígenos lo cual representa una ventaja crucial para su uso en el tratamiento del cáncer. Adicionalmente, la combinación administrada de manera secuencial produce la quimiosensibilización de tumores refractarios a los citostáticos mencionados mediante el pretratamiento con el péptido P15.

Description

ANTIGENOS VACUNALES QUIMERICOS CONTRA EL VIRUS DE LA PESTE PORCINA CLASICA CAMPO DE LA TECNICA La presente invención se relaciona con el campo de la salud animal, particularmente con nuevos antigenos quiméricos que comprenden subunidades virales del virus que causa la enfermedad de la Peste Porcina Clásica (VPPC) acoplados a moléculas proteicas estimuladoras del sistema inmune celular y humoral, y desarrollan en los cerdos una respuesta inmune potente y temprana contra dicho virus.

ESTADO DE LA TECNICA ANTERIOR La Peste Porcina Clásica (PPC), también conocida como cólera porcino por su carácter altamente infeccioso y su amplia distribución mundial, es considerada la enfermedad más importante del cerdo, de ahí su inclusión en la lista de enfermedades notificables de la Organización Internacional de Sanidad Animal. El agente etiológico de esta enfermedad, el VPPC, es un virus del género Pestivirus de la familia Flaviviridae. Se conoce que es un virus envuelto, de un diámetro de 40 a 60 nm, y simetría hexagonal, con ácido ribonucleico (ARN) de simple cadena como material genético (Kümmerer et al. (2000) The genetic basis for cytopathogenicity of pestiviruses. Vet. Microbio!. 77:1 17-128; Moennig et al. (2003) Clinical signs and epidemiology of classical swine fever: a review of new knowledge. Vet. Journal 165:1 -20.) La PPC es una enfermedad altamente contagiosa, en su forma aguda se presenta con fiebre, degeneración de los vasos capilares, necrosis de los órganos internos y muerte. Los primeros signos clínicos aparecen después de un período de incubación de 2 a 6 días, produciéndose inicialmente fiebre, reducción de los movimientos y disminución del apetito, que se van agravando en días siguientes y la temperatura puede alcanzar los 42°C. Se desarrolla además una leucopenia con valores de la serie blanca menores de 8000/mm3 de sangre. Los cerdos desarrollan también conjuntivitis, constipación seguida por diarreas, vómitos, incoordinación de movimientos, convulsiones y paresias musculares en la fase terminal. Se evidencia una coloración roja de la piel extendida a todo el abdomen, hocico, orejas, y parte interna de las patas. En la mayoría de los casos fatales la histopatología del cerebro muestra una encefalitis no supurativa con abundante vascularización. (Moennig et al. (2002) Clinical sings and epidemiology of classical swine fever: A review of new Knowledge. Vet.Journal 161 :1-10). El VPPC se comporta como un inmunosupresor durante la infección (Susa et al. (1992) Pathogenesis of classical swine fever:B-lymphocyte defciency caused by hog cholera virus. J. Virol. 66:1 171 -1 175) y se comienzan a detectar los anticuerpos neutralizantes en las semanas 2 y 3, después de la infección (Laevens et al. (1998) An experimental infection with a classical swine fever virus in weaner pigs. II. The use of serological data to estímate the day of virus introduction in natural outbreaks. Vet Q. 20: 46-49). El estado terminal de la infección está asociado con una marcada disminución de linfocitos B en el sistema circulatorio, así como en tejidos linfoides (Susa et al. (1992) Pathogenesis of classical swine fever: B-lymphocyte deficiency caused by hog cholera virus. J. Virol. 66:1171-1 175). La mayoría de los cerdos enfermos mueren entre los 10 y 20 días posteriores a la infección, con una mortalidad superior al 95%. Las lesiones post mortem características de la PPC corresponden a diátesis hemorrágica con petequias en la mayoría de los sistemas de órganos. Estas son más constantes en los ríñones, vejiga urinaria y ganglios linfáticos, aunque también pueden aparecer en bazo, laringe, piel, mucosas y serosas (Mouwen et al. (1983) Atlas of Veterinary Pathology. Bunge, Utrecht, The Netherlands). Otra forma clínica de presentación de la enfermedad es la infección transplacentaria, en la que el virus es capaz de atravesar la placenta de las cerdas gestadas e infectar el feto. Las consecuencias de esta infección pueden ser abortos, crías muertas al nacer, momificaciones, malformaciones, nacimiento de cerdos débiles y afectaciones en la diferenciación de órganos. De las cerdas reproductoras, en dependencia del tiempo de gestación en que ocurre la infección, pueden nacer crías inmunotolerantes al virus, debido a que puede ocurrir una infección a través de la madre (transmisión vertical). Las crías permanecen infectadas y virémicas hasta su muerte, lo que genera un foco estable de diseminación del virus en la población (Moennig et al. (2003) Clinical signs and epidemiology of classical swine fever: a review of new knowledge. Ver. Journal 165:1 1 -20). La mortalidad asociada a la PPC constituye un problema económico para los países afectados, influyendo en el deterioro de la situación económica y social de las naciones en vías de desarrollo. Por estas razones en países con una alta densidad porcina y una elevada prevalencia del virus, se hace imprescindible aplicar programas de control basados en la vacunación. En países desarrollados cuya producción porcina es mayoritariamente subsidiada por el estado, como Europa, Estados Unidos y Canadá, se aplica el método de erradicación por sacrificio. Sin embargo, los costos son muy elevados y estos países son susceptibles aún a posibles reemergencias. La Unión Europea (UE) es considerada como una zona de alto riesgo de reemergencia de la enfermedad debido a la alta densidad de la población porcina, a la política de no vacunación y a su cercanía geográfica con los países de Europa del Este, donde la enfermedad es enzoótica. Uno de los problemas que se han asociado a la reemergencia de la enfermedad en esta región, es la presencia de cerdos salvajes con infecciones endémicas de PPC (Laddomada (2000) Incidence and control of CSF in wild boar in Europe. Vet. Microbiol, 73:121-30). Estas reemergencias han ocurrido a pesar de los sólidos programas de control que se implementan dentro de la UE, que incluyen el sacrificio sanitario de toda la población contagiada y la restricción del comercio de cerdos de áreas afectadas a zonas libres de la enfermedad (van Oirschot (2003) Vaccinology of classical swine fever: from lab to field. Vet. Microbio!, 96:367-384). Urge, por tanto, la necesidad de desarrollar vacunas que induzcan una respuesta inmune temprana y segura que garantice la protección ante la infección y la trasmisión viral. Se han desarrollado vacunas contra el VPPC basadas en virus completo: vacunas con virus inactivado con cristal violeta o formalina (Biront et al. (1988) Classical swine fever and related infections. Liess B.M. Ed. Martinus Nijhoff Publishing, Boston: 181-200), vacunas con virus atenuados mediante pases en conejo como la cepa Sinlak (Baibikov et al. RU 2182495) y la cepa China Lapinizada (Dahle et al. (1995) Assesment of safety and protective valué of a cell culture modified strain C vaccine of hog cholera/classical swine fever virus. Berl- Munch. Tierárztl. Wsch., 108: 20 -25), o vacunas con virus atenuados en cultivos celulares de conejo, curiel, y cerdo (Kachiku et al. JP 73001484; Terpstra et al. (1990) Development and properties of a cell culture produced vaccine for hog cholera based on the Chínese strain. Ditsh. tierárztl. Wsch. 97: 77-79). Estos tipos de vacunas constituyen un riesgo por la posibilidad de contener fracciones de virus activo que, inoculadas en animales susceptibles, producirían nuevos brotes de PPC. Además, se necesitan repetidas inmunizaciones para lograr la respuesta inmunológica protectora porque la inactivación altera las propiedades inmunogénicas del virus. En el caso específico de las vacunas vivas con virulencia atenuada tienen, potencialmente, el riesgo de que ocurra una atenuación parcial o de que ocurra una reversión a la virulencia, en cualquiera de estos casos se producirán partículas virales patógenas que, inoculadas en animales susceptibles, provocan la infección, la enfermedad clínica y la diseminación la enfermedad en los rebaños. Esto acarrea un riesgo mayor para las cerdas gestantes pues el virus puede pasar a los fetos, que son altamente susceptibles y las crías infectadas diseminan la enfermedad. Existen vacunas basadas en cepas de VPPC que han demostrado estar atenuadas como son la cepa china C, la cepa PAV 250, la cepa Thiverval y la cepa IFFA/A-49 (Bjórlund,H.JV. et al. (1998) Molecular characterization of the 3'noncoding región of classical swine fever virus vaccine strains. Virus Genes 16: 307-312; Launais et al. (1978) Hog Cholera Virus: Active immunization of piglets with the Thiverval strain in the presence and absence of calostral passive immunity. Vet. Microbiology 3: 31 -43). Estas cepas solo se usan en países donde la enfermedad es enzoótica, porque tienen como inconveniente que no permiten diferenciar los animales vacunados de los infectados con el virus nativo. Los animales vacunados con estas cepas producen respuestas idénticas, en las pruebas serológicas, que lo animales enfermos. Los anticuerpos específicos anti-VPPC que se generan con las vacunas basadas en virus atenuados interfieren con el diagnóstico de infección de la PPC. El diagnóstico se realiza mediante inmunodetección del virus infectivo en tonsilas y la cepa viral vacunal se multiplica precisamente en tonsilas. Por estas causas, las cepas atenuadas no son idóneas para ser utilizadas en los programas de erradicación. Otro ejemplo es la vacunación con la cepa LK-VNIIWM e hiperinmunización adicional con la cepa purificada Shi-Myng, formulada con adyuvante de Freund, en 40-45 sitios es impracticable en una campaña de vacunación donde se deben vacunar cientos de animales diariamente (Balashova et al. RU2183972). La inmunización con estas vacunas, que contienen el virus completo, interfiere también con el diagnóstico diferencial entre infecciones causadas por el VPPC y las causadas por otros integrantes del género Pestivirus que pueden infectar al cerdo, como son los virus de la diarrea viral bovina (en inglés "Bovine Virus Diarrhoea Virus", abreviado BVDV) y el virus de la enfermedad de la frontera (en inglés "Border Diseases Virus", abreviado BDV), (Dahle et al. (1991 ) Clinical Post mortem and virological findings after simultaneous inoculation of pigs with hog cholera and BVD virus. J. Med. Vet. 38 : 764- 772). Para evadir los inconvenientes de las vacunas basadas en virus completos resulta idóneo utilizar vacunas totalmente inocuas, como las variantes basadas en subunidades, o en proteínas virales obtenidas por vía recombinante. Estas variantes deben proteger a los rebaños de la reintroducción de cepas virulentas, y además permitir la diferenciación entre los animales vacunados y los infectados, por métodos serológicos simples. En este sentido se han desarrollado vacunas basadas en subunidades virales. Las vacunas que contienen solo una proteína del virus, como la glicoproteína E2 de la envoltura viral (Bouma et al. (2000) Duration of the onset of the herd immunity induced by the e2 subunit vaccine against classical swine fever virus. Vaccine 18 :1374-1381 ), son seguras pues su empleo no implica riesgo alguno de reversión a la virulencia y no interfieren con el diagnóstico. Estas permiten diferenciar entre animales infectados y vacunados, debido a que los anticuerpos que se generan son reactivos solo contra un segmento viral. Por ello, resultan idóneas para un programa de erradicación de la PPC. Se han desarrollado vacunas recombinantes que expresan la proteína E2 en procariontes y vacunas basadas en péptidos sintéticos de dicha proteina (Chen et al. WO 200232453). En estos casos la proteina no es glicosilada, por lo que se afecta su inmunogenicidad y capacidad protectora. Otros candidatos vacunales utilizan vectores virales para la expresión del gen heterólogo de la E2 en células eucariotas como son el virus de la pseudorabia porcina (Peeters et al. (1997). Biologycally safe, non-transmissible pseudorabies virus vector vaccine protects pigs against both Aujeszky's disease and classical swine fever. J. Gen. Virol. 78: 331 1 -33 5), el virus de la viruela porcina (Gibbs et al. US6217882) y el adenovirus porcino (Nagy et al. WO200183737). En estos casos, los anticuerpos generados por infecciones naturales contra virus de la misma especie que los vectores virales neutralizan la infección con el vector y por ende afectan la inducción de respuesta inmune contra el VPPC. Además, los vectores basados en el virus de la pseudorabia porcina y el de la viruela porcina no se pueden aplicar en los países declarados libres de estos virus, por problemas regulatorios. También ha sido usado el virus vaccinia como vector pero las regulaciones de la Organización Mundial de la Salud impiden su uso (Meyers et al. EP 10870 4) Las vacunas basadas en ácido desoxirribonucleico (ADN) desnudo para la expresión de la proteína E2 en los miocitos y osteocitos tienen el inconveniente de que se requieren altas concentraciones de ADN para inducir una respuesta, pues la transfeccion con ADN desnudo es muy ineficiente. Este tipo de vacuna está sujeta a fuertes controles regulatorios que dificultan su aplicación de forma expedita (Audonnet et al. WO 200152888). El uso del sistema de expresión en células de insecto, mediado por Baculovirus, para la producción de la E2 como vacuna resultó una alternativa factible (Van-Rijn et al. (1999). An experimental marker vaccine and accompanying serological diagnostic test both based on enveloped glycoprotein E2 of classical swine fever virus. Vaccine, 17: 433-440; Kretzdorn et al. US 20040028701 ). En este sistema la proteína recombinante se expresa en su forma glicosilada, lo que incrementa su inmunogenicidad con respecto a las variantes aglicosiladas. No se producen anticuerpos contra el baculovirus, pues este se inactiva y no resulta patógeno para el cerdo. Sin embargo, la respuesta efectiva frente a la infección se induce después de tres semanas post-vacunacíón y no hay una protección completa frente a la infección intrauterina. Por tanto, un importante problema en la prevención de la PPC es que no existen hasta la fecha vacunas por subunidades que, a la vez que permitan un diagnóstico diferencial entre los animales vacunados y los infectados, sean capaces de producir una protección temprana tras la vacunación, y que eliminen la trasmisión trasplacentaria de gestadas a su descendencia.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención resuelve el problema antes mencionado, proporcionando antígenos quiméricos de interés vacunal que comprenden subunidades virales acopladas a moléculas estimuladoras del sistema inmune, lo que propicia el desarrollo de una temprana respuesta que protege a los cerdos de la infección por el VPPC. Otra ventaja de la solución propuesta es que elimina la trasmisión del virus de las cerdas gestadas que contraen la PPC a sus crías, debido al efecto inmunopotenciador de las moléculas que se encuentran formando parte de los antígenos quiméricos, junto a los antígenos virales. Particularmente, la invención se refiere a antígenos quiméricos contra la PPC que tienen como base la proteína E2 de la envoltura del VPPC. Se utiliza como inmunógeno el segmento extracelular de la glicoproteína E2, a la que se encuentra unida a una proteína estimuladora del sistema inmune (llamado en el contexto de esta invención "adyuvante molecular") para favorecer la estimulación de una respuesta inmune celular temprana, así como altos títulos de anticuerpos neutralizantes contra el VPPC. En una modalidad particular de la invención, la proteína estimuladora del sistema inmune es el interferón alfa o el segmento extracelular de la molécula CD154. En una modalidad preferida, el interferón alfa o el segmento extracelular de la molécula CD154 pueden provenir de cualquier mamífero. Los antígenos vacunales de la presente invención, basados en proteínas quiméricas, garantizan una protección en los cerdos vacunados a partir de la primera semana posterior a la vacunación, cuando son enfrentados a un reto con 105 DL50 (Dosis de virus que causa la muerte del 50% de los anímales infectados por el VPPC). Dicha protección está mediada por una fuerte respuesta inmune de tipo celular contra el VPPC, que se encuentra directamente relacionada con la combinación de los elementos que conforman el antígeno quimérico. También se observa un acortamiento en el tiempo en el que se inducen los anticuerpos neutralizantes, los que aparecen a partir de la segunda semana posterior a la vacunación. Esto contribuye a incrementar la protección contra el VPPC en los cerdos vacunados. Los animales vacunados no presentan evidencias de la enfermedad clínica, ni se pudo aislar VPPC de los fluidos corporales en ninguno de los días posteriores a la confrontación con dicho virus. Los antígenos quiméricos E2-adyuvante molecular permiten detener la transmisión vertical del VPPC de las madres a los fetos. Estas proteínas inducen una protección temprana en cerdas gestantes, que impide el desarrollo de la enfermedad clínica y no permite la multiplicación viral, tanto en las madres como en los fetos, después de un reto con 105 DL50 del VPPC.

En una modalidad preferida, el antígeno vacunal quimérico se caracteriza por contener esencialmente la secuencia aminoacídica del segmento extracelular de la glicoproteína E2 del VPPC, que aparece en el Listado de Secuencias como Identificación de Secuencia (Id. Sec.) No. 1 ; y el segmento extracelular de molécula CD 54 de cerdo identificado en el Listado de Secuencias como Id Sec. No. 2. El antigeno vacunal quimérico comprende esencialmente dichas secuencias aminoacídicas, pero puede comprender el segmento extracelular de la E2 de cualquier aislamiento del VPPC. Otro aspecto de la presente invención es que los antígenos vacunales quiméricos pueden ser obtenidos por vía recombinante, sintética o mediante la conjugación química. En una modalidad particular de la invención, se generó una variante basada en una proteína quimérica conteniendo la E2his (segmento extracelular de la E2 fusionado a una cola de seis histidinas) y un adyuvante molecular, como proteína de fusión. Para ello, se adicionó en el extremo C-terminal de la E2his un péptido espaciador compuesto por cuatro unidades repetidas de Gly Ser (4G S) y una molécula estimuladora del sistema inmune. La incorporación del péptido 4G S tiene la función de aportar un determinado grado de relajamiento a la cadena polipeptídica. Esto garantiza el correcto plegamiento tridimensional de la estructura proteica para obtener las proteínas fusionadas con una conformación tridimensional, similar a la nativa. Uno de los antígenos vacunales objeto de esta invención posee fusionado en su extremo C-terminal el domino extracelular de la molécula CD154 porcina, como adyuvante molecular (E2his-CD154).

Hasta el momento actual, no se habían explorado los sistemas de expresión en animales como biorreactores para la producción de candidatos vacunales recombinantes contra el VPPC. Sin embargo, la capacidad de la glándula mamaria para expresar proteínas recombinantes glicosiladas y con un correcto plegamiento de su estructura tridimensional, constituye un sistema de expresión adecuado para producir la glicoproteína E2 con una elevada inmunogenicidad y capacidad protectora. El sistema de expresión transiente en la glándula mamaria de rumiantes, mediado por vectores adenovirales, constituye una herramienta para obtener altos niveles de expresión de proteínas recombinantes de forma rápida y sencilla (Toledo et al., WO 2004/034780). Este método resulta muy útil para la producción de E2 recombinante con el fin de aplicar programas de vacunación dirigidos a la erradicación de la PPC. En una materialización de la invención, los antígenos vacunales objeto de esta invención se expresan en las células epiteliales mamarias de mamíferos genéticamente modificados, durante el proceso de lactación y son secretados en la leche. Las moléculas quiméricas recombinantes se producen en la leche de mamíferos transgénicos o mediante la transformación directa del epitelio glandular mamario, de mamíferos no transgénicos, con el empleo de vectores adenovirales. En otra materialización de la invención los antígenos vacunales quiméricos son producidos en levaduras modificadas genéticamente. Dichos antígenos son obtenidos en el medio de cultivo de las levaduras transformadas con los genes quiméricos y secuencias reguladoras que permiten la expresión y secreción de las proteínas recombinantes al medio de cultivo. La proteína E2 del VPPC nativa se dispone formando homodímeros en la envoltura viral, estabilizados por puentes disulfuro intercatenarios. Esto determina que los anticuerpos neutralizantes y protectores se generen contra epítopes conformacionales presentes en el homodímero. Los antígenos vacunales desarrollados durante la presente invención se producen en sistemas de expresión que permiten el correcto plegamiento de estas proteínas recombinantes. El diseño de las construcciones genéticas garantiza que no se altere la conformación tridimensional de las proteínas de fusión. Los antígenos vacunales recombinantes descritos son fácilmente purificados mediante un simple paso cromatográfico de afinidad a iones metálicos. El diseño de las construcciones genéticas, la utilización de sistemas de expresión adecuados y la relativa simplicidad del procedimiento de purificación utilizado, hacen que los antígenos vacunales contra el VPPC, descritos en la presente invención, conserven las propiedades antigénicas e inmunogénicas similares a la proteína E2 viral. La inmunización con las moléculas quiméricas, producidas en sistemas de expresión como Pichia pastoris o la glándula mamaria de cabra, conduce a una repuesta inmune potente y temprana. El segmento extracelular de la E2 forma homodímeros que aportan los epítopes conformacionales para la generación de anticuerpos neutralizantes y protectores. El segmento proveniente de CD154 actúa como adyuvante molecular que estimula el sistema inmune de los cerdos vacunados, produciendo una respuesta inmune celular que protege a los animales del VPPC a partir de la primera semana posterior a la vacunación. La combinación de ambas moléculas en la proteína quimérica, que contiene un péptido espaciador, garantiza el correcto plegamiento de cada molécula de forma independiente. Los sistemas de expresión utilizados permiten que las proteínas recombinantes se expresen en su forma glicosilada, lo que favorece también la obtención de las moléculas con la estructura tridimensional adecuada. Otro aspecto de la presente invención son las composiciones vacunales capaces de producir una respuesta inmune protectora contra el VPPC, que se caracterizan por comprender los antígenos quiméricos antes descritos y que contienen el segmento extracelular de la E2 y un adyuvante molecular. Dichas composiciones vacunales pueden ser administradas a los animales por ruta sistémica o mucosal, con el objetivo de prevenir la PPC, y evitar así las cuantiosas pérdidas materiales y económicas que se producen tras la infección de la masa porcina con el VPPC.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1. Análisis mediante SDS-PAGE de la expresión de la E2his en células PK- 5 transducidas con el vector adenoviral Ad-E2his-sec en condiciones reductoras. (A) SDS-PAGE, Carril 1 : medio de cultivo de células transducidas, Carril 2: medio de cultivo de células no tratadas, PPM: patrón de peso molecular. (B) Inmuno-identificación de la E2his mediante "Western-blotting" utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la cola de His, Carril 1 : medio de cultivo de células transducidas, Carril 2: medio de cultivo de células no tratadas, Carril 3: control positivo para la cola de histidina, PPM: patrón de peso molecular. (C) Inmuno-identificación de la E2his mediante "Western-blotting" utilizando un suero policlonal de cerdos infectados con el VPPC, Carril 1 : medio de cultivo de células no tratadas, Carril 2: medio de cultivo de células transducidas con el Ad-E2his, PPM: patrón de peso molecular. Figura 2. Análisis de las condiciones de expresión de la E2his y la E2his-CD154 en células PK-15 transducidas con los vectores adenovirales Ad-E2his-sec y Ad-E2hisCD154-sec. Las proteínas presentes en el medio de cultivo se separaron mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras. La inmuno-identificación de las moléculas de interés se realizó mediante "Western-blotting" utilizando un anticuerpo monoclonal contra la proteína E2 del VPPC (AcM-1 G6). Carril 1 : medio de cultivo de células transducidas con el vector Ad-E2his-sec, Carril 2: medio de cultivo de células transducidas con el vector Ad-E2hisCD154-sec, PPM: patrón de peso molecular. Figura 3. Cinética de expresión de la E2his en la leche de cabras transducidas con el vector Ad-E2his-sec. Las proteínas presentes en las muestras de suero de leche correspondientes a cada día de ordeño se separaron mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras. La inmuno-identificación de la E2his se realizó mediante "Western-blotting" con el AcM-1 G6. Carril PK: control positivo de E2his expresada en el medio de cultivo de células PK- 5 transducidas con el vector Ad-E2his-sec, Carril C-: suero de leche proveniente de cabras no tratadas, Carriles 1-8: sueros de leche de las cabras tranducidas con el vector adenoviral Ad-E2his-sec, correspondientes a cada uno de los 8 días de ordeño posteriores a la infusión adenoviral. Figura 4. Cinética de expresión de la E2his-CD154 en la leche de cabras transducidas con el vector Ad-E2hisCD154-sec. Las proteínas presentes en las muestras de suero de leche correspondientes a cada día de ordeño se separaron mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras. La inmuno-identificación de la molécula de E2his-CD154 se realizó medíante "Western-blotting" con el AcM-1G6. Carriles 1-5: sueros de leche de las cabras tranducidas con el vector adenoviral Ad-E2hisCD154-sec, correspondientes a cada uno de los 5 días de ordeño posteriores a la infusión adenoviral, Carril C-: suero de leche proveniente de cabras no tratadas, Carril PK: control positivo de E2his-CD154 expresada en el medio de cultivo de células PK-15 transducidas con el vector Ad-E2hisCD154-sec.

Figura 5. Análisis de la pureza e identidad de la E2his separada en SDS-PAGE en condiciones no reductoras. La proteína se expresó en la leche de cabras transducidas con el vector Ad-E2his-sec y la purificación se realizó mediante cromatografía de afinidad a iones metálicos. (A) SDS-PAGE de los diferentes pasos de purificación. (B) Inmuno-identificación mediante "Western-blotting" con el AcM-1 G6. Carril 1 : control positivo de E2his expresada en el medio de cultivo de células PK- 5 transducidas con el vector Ad-E2his-sec, Carril 2: suero de leche proveniente de cabras no tratadas, Carril 3: suero de leche de las cabras tranducidas con el vector adenoviral Ad-E2his-sec tomado como material inicial de la cromatografía, Carril 4: material no unido a la matriz, Carril 5: lavado con 20 mM de imidazol, Carril 6: lavado con 50 mM de imidazol, Carril 7: elución a 200 mM de imidazol. Figuras 6A y 6B. Comparación del reconocimiento antigénico de dos isoformas del antígeno vacunal E2his por los anticuerpos presentes en el suero de cerdos infectados con una cepa virulenta del VPPC. La E2his purificada a partir de la leche de cabras, transformadas con el vector adenoviral Ad-E2his-sec, se analizó mediante electroforesis y "Western-blotting" en condiciones reductoras (monómero) y condiciones no reductoras (homodímero). (Figura 6A) SDS-PAGE. (Figura 6B) "Western-blotting" utilizando un suero policlonal de cerdos enfermos, Carril 1 : E2his separada en condiciones no reductoras, Carril 2: E2his separada en condiciones reductoras.

Figura 7. Cinética de anticuerpos neutralizantes obtenidos en dos grupos de cerdos vacunados con una única dosis del antígeno vacunal E2his, los títulos de anticuerpos se determinaron mediante un ensayo de neutralización de la peroxidasa. El grupo A se inoculó con una dosis de 30 pg/animal y el grupo B con una dosis de 50 pg/animal. Ambos grupos fueron retados con 05 DL50 tres semanas después de la vacunación. Los resultados se muestran como la media geométrica del inverso de los títulos. Figura 8. Ensayo de linfoproliferación de linfocitos de cerdo aislados en el día 5 posterior a la vacunación con los antígenos E2-CD154 (Grupos D y E) y E2his (Grupo F). Los resultados se expresan en índices de estimulación (IE), definido como la relación entre los valores de conteos por minuto (cpm) del cultivo estimulado y los valores de cpm del cultivo control no tratado. La respuesta linfoproliferativa que indujo un IE > 2 fue considerada como positiva. Se evaluó la proliferación en los diferentes cultivos tratados con el VPPC, asi como la inhibición de la proliferación en los cultivos tratados con el VPPC y un AcM contra el dominio CD4 porcino. Figura 9. Ensayo de actividad antiviral inducida por los sueros de los cerdos vacunados con los antígenos E2-CD154 (Grupos D y E) y E2his (Grupo F), en células PK-15. Los resultados se expresan como la media geométrica del inverso del título. Figura 10. Cinética de anticuerpos neutralizantes obtenidos en dos grupos de cerdos vacunados con una dosis de 50 pg/animal con los antígenos E2-CD154 (Grupo H) y E2his (Grupo I), los títulos de anticuerpos se determinaron mediante un ensayo de neutralización de la peroxidasa. Los resultados se muestran como la media geométrica del inverso de los títulos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION EJEMPLOS EJEMPLO 1 Obtención de los segmentos génicos que codifican para los dominios extracelulares de la E2 del VPPC y del CD154 porcino, y clonación del plasmidio pMOS- E2his-CD154 El segmento del gen que codifica para la porción extracelular de la E2, de 363 aminoácidos se obtuvo mediante amplificación por transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (TR-RCP), a partir del genoma viral del aislamiento cubano "Margarita" del VPPC anotados en la base de datos del Centro Nacional de Información en Biotecnología de Estados Unidos (en inglés "National Center for Biotechnology Information", abreviado NCBI), número de acceso AJ704817. En el oligo 3' se incluyó la secuencia codificante para una cola de 6 histidinas, para permitir la fácil purificación del antígeno. La secuencia nucleotídica codificante para el dominio extracelular del CD154 porcino, de 210 aminoácidos se obtuvo mediante síntesis química tomando como patrón de secuencia el gen del CD 54 de cerdo "sus scrofa" anotados en la base de datos del NCBI (AB040443). En el extremo 5' del fragmento codificante para dicha molécula se incluyó una región que codifica para un péptido compuesto por cuatro unidades repetidas de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (4G S). Mediante un subclonaje en el plasmidio pMOS-BLUE (Amersham, EEUU) se insertó la secuencia sintetizada (4G4S-CD154) inmediatamente después de la cola de 6 histidinas en la secuencia codificante de la E2h¡s. Se obtuvo el plasmidio pMOS- E2his-CD154.

EJEMPLO 2 Construcción de las variantes de E2his y E2his-CD154 secretables para células de mamíferos La secuencia correspondiente a la E2his obtenida por TR-RCP se insertó en los sitios Bgl II - EcoR V del plasmidio pAEC-SPT (Herrera et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 279:548-551 ). Se obtuvo el vector resultante pE2his-sec que contiene la secuencia codificante para la E2his precedida por la señal de secreción del activador tisular del plasminógeno humano (en inglés, "human tissue Plasminogen Actívator", abreviado htPA) y bajo el control transcripcional del promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano (PCMV). La secuencia correspondiente a la E2his-CD 54, subclonada en el vector pMOS-BLUE, se insertó en los sitios sensibles a corte con las endonucleasas de restricción Bgl II— Sa/ 1 del plasmidio pAEC-SPT. Se obtuvo el vector resultante pE2hisCD154-sec que contiene la secuencia codificante para la E2his-CD154 precedida por la señal de secreción del htPA y bajo el control transcripcional del promotor PCMV.

EJEMPLO 3 Construcción de los vectores adenovirales recombinantes, conteniendo las secuencias codificantes para la E2his y la E2his-CD154 secretables Los vectores adenovirales con replicación defectiva (Ad-AE1 , ??3) fueron construidos basados en el sistema AdEasy (AdEasy™-Vector System, Quantum Biotechnologies, EE.UU). Como vector de transferencia se empleó el plásmido pAdTrack-CMV. La secuencia codificante para la E2his, con la señal de secreción del htPA (E2his-sec), se extrajo del plasmidio pE2his-sec mediante digestión enzimática con las endonucleasas de restricción Neo \-EcoR V y se insertó en el sitio sensible a corte con la endonucleasa de restricción EcoR V presente en el vector de transferencia adenoviral pAdTrack. Se obtuvo el plasmidio pAdT-E2his-sec donde la variante secretable de la E2his se encuentra bajo el control transcripcional del promotor PCMV. La secuencia codificante para la E2his-CD 54 secretable se extrajo del plasmidio pE2his-CD154-sec mediante digestión enzimática con las endonucleasas de restricción Neo I y Sal I y se insertó en los sitios sensibles a corte con las endonucleasas de restricción Kpn I -Xho 1 del vector pAdTrack. Se obtuvo el plasmidio recombinante pAdT-E2hisCD154-sec donde la variante secretable de la E2his-CD154 se encuentra bajo el control transcripcional del promotor PCMV. Para generar los genomas adenovirales recombinantes se linealizaron los vectores de transferencia adenoviral pAdT-E2his-sec y pAdT-E2hisCD154-sec mediante digestión enzimática con la endonucleasa de restricción Pme I. Cada uno de los vectores lineales por separado se coeiectroporaron con el vector pAdEASY-1 en la cepa de Escherichia coli BJ5183. Por recombinación de homólogos se obtuvieron los genomas recombinantes de los dos vectores adenovirales recombinantes pAd-E2his-sec y el pAd-E2hisCD154-sec conteniendo uno la secuencia codificante para la E2his-sec y el otro la secuencia codificante para la molécula de E2his-CD154-sec, en ambos casos bajo el control del PCMV. Los genomas adenovirales recombinantes fueron entonces digeridos con la endonucleasa Pac I y transfectados por separado en la línea celular complementaria HEK-293A donde se obtuvieron los viriones infectivos. Se generaron 2 vectores virales: Ad-E2his-sec y Ad-E2hisCD 54-sec. Los vectores se amplificaron de forma independiente en la línea celular HEK-293A, hasta obtener títulos de 1x1012 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml. Los viriones amplificados se purificaron mediante una doble centrifugación en gradiente de CsCI, se dializaron contra buffer de almacenamiento (10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCb, 4% sacarosa) y se conservaron a -70°C.

La capacidad de los vectores adenovirales Ad-E2his-sec y Ad-E2hisCD154-sec para transformar células de mamíferos y mediar la expresión y secreción de las moléculas de E2his y E2his-CD154 al medio de cultivo se corroboró mediante la infección de la línea celular porcina PK15 con los vectores adenovirales. Las muestras de proteínas presentes en el medio de cultivo de las células infectadas se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida (en inglés "Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis", abreviado SDS-PAGE) en condiciones no reductoras y se analizaron mediante "Western-blotting" con un anticuerpo monoclonal contra la E2 del VPPC (aE2-1 G6) (Figuras 1 y 2). Al analizar las tallas moleculares de la E2his y E2his-CD154 se comprobó que se correspondían con isoformas díméricas y triméricas de las proteínas. En la muestra del Carril 1 , Figura 2, se observan las dos bandas correspondientes al dímero (180 kDa) y la ¡soforma trimérica de la E2-CD154, de aproximadamente 270 kDa.

EJEMPLO 4 Transducción in situ del epitelio glandular mamario de cabras para la producción de las variantes de E2his y E2his-CD154 en la leche Para la transformación del epitelio mamario con los casetes de expresión de las moléculas de E2his y E2his-CD154 se utilizaron los vectores adenovirales recombinantes Ad-E2his-sec y Ad-E2hisCD154-sec. En ambos casos los vectores fueron inoculados en la glándula mamaria de cabras lactantes mediante la infusión directa de la ubre a través del canal del pezón. Los vectores adenovirales infectaron las células epiteliales secretoras que conforman el epitelio mamario lo que produjo la expresión de las proteínas recombinantes. Se emplearon cabras en el segundo mes de la lactancia natural, con una producción promedio de 1 litro de leche por día. Para efectuar la transduccíón adenoviral los animales fueron ¡nicialmente ordeñados hasta eliminar la leche de la ubres, posteriormente se infundió solución salina isosmótica a las cisternas mediante infusión directa a través del canal del pezón, realizando masajes suaves de la ubre para garantizar el lavado total de la glándula mamaria. Se desechó la solución salina mediante un ordeño exhaustivo de la ubre y se repitió el procedimiento. Posteriormente se infundió el inoculo adenoviral a un título de 109 UFC/mL en solución salina, conteniendo 36 mM de EGTA. El volumen infundido en cada ubre fue variable, y se garantizó el llenado total de las cisternas, en dependencia de la capacidad de la ubre. Después de la infusión se aplicaron masajes a la ubre para facilitar que el inoculo adenoviral distribuyera de forma homogénea en la glándula y llegara hasta las células epiteliales secretoras de los alvéolos. La solución infundida se removió 24 h después mediante ordeño. Las glándulas mamarias se lavaron nuevamente mediante la infusión de solución salina con el objetivo de eliminar los vectores adenovirales remanentes en la cisterna y los conductos mamarios.

Transcurridas 24 h se comenzó a colectar la leche de los animales transformados mediante ordeño manual. Se realizaron dos ordeños diarios a intervalos de 12 h. La leche colectada se almacenó a -70°C. Se tomaron muestras de cada ordeño para analizar la cinética de expresión de las proteínas recombinantes E2his y E2his-CD154 a la leche (Figuras 3 y 4). Se comprobó que las tallas moleculares de las proteínas recombinantes se correspondían con isoformas diméricas y trimérícas. Se obtuvo un promedio de expresión de 1.03 g/L de la E2his en los días del 2-8 posteriores a la inoculación, con un rendimiento promedio de 5.22 g por cada animal. Para la molécula recombinante E2his-CD154 se obtuvo un promedio de expresión de 0.73 g/L, con un rendimiento promedio de 3.04 g por animal.

EJEMPLO 5 Purificación de los antígenos E2his y E2his-CD154 a partir de la leche de cabras Las muestras de leche de cada uno de los días de ordeño que contenían los antígenos vacunales recombinantes E2his y E2his-CD154, respectivamente se mezclaron y se centrifugaron a 15000 g, durante 30 min a 4°C. Posteriormente, se separó la fase soluble (suero) y se desechó la fase sólida que contenía mayoritariamente grasas. Al suero se le adicionó una solución tampón de separación (10 mM Tris-HCI, 10 mM CaCI2) en una proporción suero-solución tampón de 1 :4. La mezcla se incubó en hielo durante 30 min y posteriormente se centrifugó a 15 000 g durante 30 min, a 4°C. Los sobrenadantes y los precipitados se analizaron mediante SDS-PAGE y "Western-blotting", y se pudo determinar que un porciento mayoritario de dichas proteínas recombinantes se encontraban en la fase soluble y que el precipitado contenía mayoritariamente caseínas. Las fracciones de suero que contenían los antígenos recombinantes de interés (E2his y E2his-CD154) se clarificaron mediante filtración seriada con membranas de 0.8 µ? y 0.4 µ? (Millipore) y se aplicaron en una columna de purificación XK16 (Amersham, EEUU) empaquetada con una matriz de agarosa Ni-NTA (Qiagen, EEUU). Se realizaron dos pasos de lavado con tampón fosfato 100 mM e imidazol 20 mM (primer lavado) y fosfato 100 mM e imidazol 50 mM (segundo lavado). A continuación la proteína de interés se extrajo con tampón fosfato 100 mM, 200 mM imidazol, pH 7.2. El pico correspondiente a la fracción pura se dializó contra tampón fosfato (Figura 5). El procedimiento para la purificación de la E2his y la E2his-CD154 a partir de la leche de cabra fue igual para ambos antígenos vacunales. Las dos proteínas se obtuvieron con un nivel de pureza superior al 90%. La E2his se obtuvo con un recobrado del 70% y en el caso de la E2his-CD154 se obtuvo un recobrado del 58%. Las proteínas purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE y "Western-blotting" para determinar la formación de agregados proteicos. Se pudo determinar que la isoforma dimérica (homodímero) de la E2his producida en la leche es reconocida más eficientemente por el suero policlonal de cerdos infectados con el VPPC, lo que indica que esta conformación específica de la molécula favorece un mayor grado de antigenicidad de la misma (Figuras 6A y 6B).

EJEMPLO 6 Construcción de los vectores de expresión en la levadura metilotrófica Pichia pastoris El vector de expresión en P. pastoris pPS10 fue digerido con la endonucleasa de restricción Nae I para incorporar las secuencias codificantes de interés hacia el extremo 3' de la señal de secreción de la sucrosa invertasa (Suc2) de Saccharomyces cerevisiae. La secuencia codificante para la E2his se insertó en el sitio sensible a corte con la endonucleasa de restricción Nae I del plasmidio pPS10 a partir de la amplificación por RCP. La secuencia codificante para la molécula E2his-CD 54 se extrajo del plasmidio pMOS-E2his-CD154, mediante digestión enzimática con las endonucleasas de restricción Sma \-EcoR V y se insertó en el sitio de restricción Nae I del plasmidio pPS10. Se obtuvieron los plasmidios pPS-E2his y pPS-E2his-CD154 donde las secuencias codificantes para ambas moléculas se encuentran acopladas a la señal de secreción de Suc2 de S. cerevisiae y bajo el control del promotor AOX1 de la enzima alcohol oxidasa de la levadura P. pastoris.

A partir de los plasmidios pPS-E2his y pPS-E2his-CD1 54 se generaron clones de la cepa MP36 de P. pastoris establemente transformados. Los plasmidios recombinantes se linealizaron con la endonucleasa de restricción Pvu II y se electroporaron en la cepa MP36 electrocompetente. Esta cepa es un muíante auxotrófico para la histidina, los transformantes adquieren un fenotipo His+, que permite su selección. Los transformantes positivos, identificados mediante Dot Blot, fueron analizados además mediante la técnica de Southern Blot para determinar el patrón de integración, que puede ser por remplazamiento del gen AOX1 de P. pastoris, generando un fenotipo Muts-His+ (baja utilización del metanol). El reemplazamiento génico de AOX1 ocurre por entrecruzamientos de la región del promotor de AOX1 y la región 3 AOX1 presentes en el genoma de la levadura y en el plasmidio, como resultado se elimina la región codificadora del gen AOX1. Las cepas recombinantes con fenotipo Muts basan la producción del alcohol oxidasa (AOX) en el gen AOX2 y su tasa de crecimiento en metanol es baja. También se puede obtener un patrón de integración por desplazamiento, fenotipo Mut+-His+. Las secuencias codificantes para las variantes de E2his y E2his-CD154 están bajo la regulación del promotor AOX1 , el cual es inducible por metanol. P. pastoris secreta solamente bajos niveles de proteínas propias y su medio de cultivo no necesita suplementos proteicos, por tanto, se puede esperar que una proteína heteróloga que se secrete, constituya la mayoría del total de proteínas en el medio (hasta más de un 80%). La producción de las proteínas recombinantes se realizó en fermentadores de 5L. La inducción de la expresión se realizó mediante la adición de metanol al cultivo durante 5 días. Las proteínas recombinantes se obtuvieron a partir del medio de cultivo de la fermentación. La E2his se secretó al medio de cultivo de la levadura transformada a niveles de 0.143 mg/mL. En el caso de la E2his-CD154 se obtuvieron niveles de expresión de 0.122 mg/mL.

EJEMPLO 7 Purificación de los antígenos E2his y E2his-CD154 a partir del medio de cultivo de Pichia pastoris El producto de la fermentación se centrifugó a 10 000 g durante 30 min, a 4°C para separar la biomasa de la fase liquida. El medio de cultivo se filtró en membranas de 0.8 µ? y 0.2 µ? (Millipore) y se aplicó en una columna de purificación XK16 (Amersham, EEUU) empaquetada con una matriz de agarosa Ní-NTA (Qiagen, EE.UU). Se realizó un paso de lavado con tampón fosfato 100 mM y 30 mM imidazol, pH 7.2, y a continuación la proteína de interés se extrajo con tampón fosfato 100 mM, 200 mM imidazol, pH 7.2. La fracción pura se dializó contra 10 mM de tampón fosfato. El procedimiento para la purificación de la E2his y la E2his- CD154 a partir del sobrenadante de la fermentación de la levadura P. pastoris, genéticamente transformada, fue igual para ambos antígenos vacunales. Las dos proteínas se obtuvieron con un nivel de pureza superior al 95%. La E2his se obtuvo con un recobrado del 83% y en el caso de la E2his-CD154 se obtuvo un recobrado del 78%.

EJEMPLO 8 Ensayo de protección de cerdos vacunados con la variante de E2his secretable Se seleccionaron 24 cerdos sanos, de 20 kg de peso, serológicamente negativos al VPPC, procedentes de una unidad sin antecedentes de la enfermedad y sin vacunar en los 3 años precedentes. Los cerdos se distribuyeron en grupos de 8 animales cada uno, en tres cuartos experimentales (A, B, C) con agua y pienso ad limitum. A los animales del grupo A y el grupo B se les aplicó una composición vacunal que contenía el antígeno E2his, en una dosis única de 30 pg (grupo A) y 50 pg (grupo B) por animal, y el grupo C se inmunizó con placebo. El antígeno vacunal se formuló en una emulsión de adyuvante oleoso y se inoculó mediante inyección de 2 mL por vía intramuscular (IM) en la tabla del cuello. El placebo constituido por adyuvante y solución salina fosfatada en una proporción 1 :1 (VA/), se inoculó de forma similar. Los animales fueron confrontados con el VPPC mediante inoculación por vía IM con 105 DL50 del aislamiento "Margarita". La confrontación se realizó en la tercera semana posterior a la inmunización.

La inoculación con la composición vacunal basada en la E2his no provocó reacciones adversas, ya que no se observó ninguna alteración de los parámetros clínicos normales. A partir de la segunda semana de inmunización se obtuvieron títulos de anticuerpos neutralizantes, en los grupos vacunados, superiores a 1/50 (considerados protectores), y después de la tercera semana, antes del reto, se elevaron los títulos hasta 1/1 600 - 1/6 400 (Figura 7). No se observaron diferencias en la respuesta entre ambos grupos vacunados (A y B). Los animales vacunados no desarrollaron fiebre, ni síntomas clínicos de la enfermedad, ni se obtuvieron aislamientos virales a partir de los linfocitos en los días posteriores al reto. El grupo placebo desarrolló todos los síntomas clínicos de la enfermedad incluyendo fiebre, hemorragias y encefalitis no purulenta, se obtuvieron aislamientos vírales a partir del cuarto días post-reto en todos los animales placebo y hasta el día de sacrificio. Se demostró que la composición de E2his en dosis de 30 pg administrado a cerdos destetados con el esquema empleado protege de los síntomas clínicos y de la infección por el VPPC.

EJEMPLO 9 Ensayo de protección vertical en cerdas gestantes vacunadas con el antigeno E2his secretable De una unidad de cría sin antecedentes de la enfermedad, ni vacunación contra la PPC en los 3 años precedentes, se seleccionaron 10 cerdas reproductoras, serológicamente negativas a la PPC. En el momento posterior al destete se les realizó la inducción del celo por tratamiento hormonal y tres días más tarde se inseminaron. A un grupo de 5 cerdas se les aplicó la composición vacunal mencionada en el Ejemplo 7 (Grupo B), mediante inyección de 2 mL (vía IM) en la tabla del cuello. La inmunización se realizó de forma simultánea a la inseminación. El grupo de cinco cerdas restantes fue tomado como grupo control negativo y se les aplicó un placebo constituido por 2mL de adyuvante y solución salina en una proporción 1 :1 (VA/). En el grupo previamente inmunizado se realizó una segunda inmunización 21 días después. Las cerdas fueron estudiadas mediante la medición de la tríada clínica (temperatura, pulso cardíaco y frecuencia respiratoria) y se realizaron extracciones de sangre semanales para hematología y detección de anticuerpos neutralizantes contra el VPPC. A los 2 meses de gestación las cerdas se trasladaron a la unidad experimental, donde se confrontaron con el VPPC, mediante inoculación por vía IM con 105 DL50 del aislamiento "Margarita". La presencia del VPPC en linfocitos se analizó mediante aislamiento viral de las muestras de sangre a los 3 y 5 días post confrontación. Dos semanas después las cerdas fueron sacrificadas y los fetos extraídos para análisis virológico, morfológico y anátomo-patológico. Durante el transcurso del ensayo las cerdas tuvieron acceso al agua y pienso ad libitum. La vacuna resultó inocua para las cerdas gestantes, en los días posteriores a las inmunizaciones no se presentaron abortos, ni alteraciones clínicas y desarrollaron títulos de anticuerpos neutralizantes específicos contra el VPPC de 1 :50 a 1 :51 200. Después de la confrontación en las cerdas del grupo vacunado no se observó fiebre, ni otros signos clínicos propios de la PPC, tampoco se detectó leucopenía ni trombocitosis. El análisis de los fetos mediante morfometría y anatomía patológica permitió determinar que los fetos procedentes de las madres vacunadas tenían una talla normal y no presentaban lesiones histopatológicas. No se aisló el VPPC de los leucocitos, a partir de las muestras de sangre de las madres en las extracciones posteriores a la confrontación. Tampoco se aisló en la sangre o los órganos de los fetos sacrificados. Las cerdas del grupo placebo presentaron fiebre y leucopenía después de la confrontación, una de las cerdas abortó a los 8 días posteriores a la confrontación, por lo que se sacrificó a los 9 días posteriores a la confrontación. En estos fetos y en los de las otras cuatro cerdas del grupo placebo, que fueron sacrificadas a las 2 semanas posteriores a la confrontación, se observó una menor talla, momificación, esplenomegalia, numerosas petequias en ríñones y vejiga, y focos de encefalitis no purulenta. Se aisló el VPPC de todos los órganos y sangre de los fetos de este grupo. La vacunación de las cerdas con la composición vacunal basada en E2his impidió la transmisión del VPPC de las madres a su descendencia.

EJEMPLO 10 Ensayo de protección temprana en cerdos vacunados con la composición vacunal basada en E2his-CD154 secretable Se tomaron cuatro grupos de cerdos (en condiciones idénticas al Ejemplo 8) de 6 animales cada uno y a cada animal se le aplicó la composición vacunal con las siguientes cantidades de antígeno: 50 pg de E2his-CD1 54 (Grupo D), 80 pg de E2his-CD154 (Grupo E), 50 pg de E2his (Grupo F). Se tomó como placebo el Grupo G. Los antígenos se formularon en una emulsión de adyuvante oleoso y se inocularon mediante inyección de 2 mL por vía IM. El grupo tomado como placebo se inoculó solamente con adyuvante. Se realizó una sola inmunización. Los animales fueron confrontados con el VPPC, mediante inoculación por vía IM con 105 DL50 del aislamiento "Margarita". La confrontación se realizó en el día 8 posterior a la inmunización. Se realizó un análisis diario de signos clínicos durante todo el período del experimento y una extracción de sangre semanal para análisis hematológico y de anticuerpos neutralizantes. Además, se tomaron muestras de sangre en los días 1 , 3, 5 y 7 posteriores a la vacunación para evaluar la respuesta inmunológica celular medíante un ensayo de línfoproliferación y un ensayo de actividad antiviral en suero. Después de la vacunación se registraron signos clínicos normales y no se observaron respuestas indeseables en el sitio de inoculación. En los animales vacunados con el antígeno E2-CD154 (Grupos D y E) se detectó un aumento de la respuesta de los linfocitos tanto al mitógeno fitohemaglutinina como al VPPC durante el ensayo de linfoproliferación. Esta respuesta fue bloqueada con un anticuerpo monoclonal dirigido contra el dominio CD4, lo que indica que la respuesta inmune estuvo de mediada por linfocitos T (respuesta tipo T cooperadora). Las muestras de linfocitos de animales de los grupos F y G (placebo) no respondieron a la estimulación ni con el mitógeno ni al VPPC durante el ensayo (Figura 8). Se observaron títulos elevados de interferón alfa en las muestras de los días 3, 5 y 7 posteriores a la vacunación con el antígeno E2-CD154 en los grupos D y E, sin embargo en los animales vacunados con el antígeno E2his (Grupo F) y el grupo placebo (G) no se detectaron incrementos en los niveles de interferón alfa en ninguno de los días muestreados. Se realizó un ensayo de actividad antíviral en células de riñon de cerdo PK- 5 contra el virus de la gastroenteritis transmisible porcina. En los grupos D y E se obtuvieron títulos de actividad antiviral de hasta 1/512, sin embargo no se detectó protección antiviral en las muestras de los animales inmunizados con la E2his, ni en el grupo placebo (Figura 9). Con estos experimentos se determinó que el antígeno E2 acoplado a la molécula CD154 potencia una respuesta inmune celular contra el VPPC que está relacionada con la actividad inmunoestimuladora de la molécula CD154.

EJEMPLO 11 Comparación de la cinética de anticuerpos neutralizantes en cerdos vacunados con dosis únicas de las composiciones vacunales que contienen E2his y E2his-CD154 Se tomaron tres grupos de cerdos de aproximadamente 20 kg de peso, serológicamente negativos al virus PPC procedentes de una unidad sin antecedentes de la enfermedad y sin vacunar en los 3 años precedentes. Los cerdos se distribuyeron en grupos de 6 animales, cada uno con agua y pienso ad limitum. A cada animal se le aplicó 50 pg de E2his-CD154 (Grupo H), 50 pg de E2his (Grupo I) y se tomó como placebo el Grupo J. Los antígenos se formularon en una emulsión de adyuvante oleoso y se inocularon mediante inyección de 2 mL por vía IM. El grupo tomado como placebo se inoculó solamente con adyuvante. Se realizó una sola inmunización y se midieron los niveles de anticuerpos neutralizantes desarrollados en los animales en las 5 semanas posteriores a la inmunización mediante un ensayo de neutralización de la peroxidasa. En los dos grupos de cerdos vacunados con las formulaciones conteniendo los antígenos E2-CD 54 y E2his (H e I) se detectaron anticuerpos neutralizantes a partir de la segunda semana de inmunización, con títulos superiores a 1/50 (considerados protectores). En los animales del grupo placebo no se detectaron anticuerpos en ninguna de las muestras tomadas durante el ensayo. En la segunda semana posterior a la inmunización en los animales del Grupo H (antígeno E2-CD154) se detectaron títulos de anticuerpos neutralizantes muy superiores a los del grupo inmunizado con el antígeno E2his, lo que sugiere una estimulación superior de la respuesta humoral en los animales del Grupo H (Figura 10). Con este ensayo se concluye que la composición vacunal que contiene el antígeno de E2his-CD154 en una dosis de 50 pg es inocua, inmunogénica e induce una respuesta humoral más tempana en los cerdos vacunados cuando se la compara con la composición vacunal que contiene el antigeno E2his.

EJEMPLO 12 Ensayo de protección vertical en cerdas gestantes vacunadas con la composición vacunal que contiene E2his-CD154 secretable Se seleccionaron 10 cerdas reproductoras con idénticas condiciones de salud y procedencia de las cerdas utilizadas en el Ejemplo 8. En el momento posterior al destete se les indujo el celo mediante tratamiento hormonal. Tres días más tarde, las cerdas fueron inseminadas y simultáneamente se seleccionó un grupo de 5 que se vacunaron con la composición vacunal de E2his-CD154 a 80 pg/animal (composición utilizada en el Ejemplo 10 para el grupo E) mediante inyección de 2 mL, por vía IM, en la tabla del cuello. El grupo de cinco cerdas restantes fue tomado como grupo control negativo, ya que se les aplicó como placebo el adyuvante oleoso. Las cerdas fueron monitoreadas mediante la toma de la tríada clínica y extracciones de sangre semanales para hematología y detección de anticuerpos neutralizantes contra el VPPC. A los 2 meses de gestación las cerdas fueron trasladadas a la unidad experimental, donde fueron confrontadas con el VPPC salvaje mediante inoculación por vía IM con 105 DL50 del aislamiento "Margarita". La viremia fue analizada por extracción de sangre en los días 3 y 5 posteriores a la confrontación viral. Dos semanas después, las cerdas fueron sacrificadas y los fetos extraídos para análisis virológico, morfológico y anátomo-patológico. Durante el experimento las cerdas tuvieron acceso al agua y pienso ad libitum. La composición vacunal basada en E2his-CD154, en una sola inmunización, resultó inocua para las cerdas gestantes, pues en los días posteriores no se presentaron casos de aborto, ni otro signo clínico. Los animales vacunados desarrollaron títulos de anticuerpos neutralizantes específicos contra VPPC de 1 :50 a 1 :16 000. Después de la confrontación no se observó fiebre, leucopenia ni trombocitosis en el grupo de las cerdas vacunadas. No hubo abortos y los análisis de morfometría y anatomía patológica permitieron determinar que los fetos procedentes de las madres vacunadas tenían una talla normal y no presentaban lesiones histopatológicas. En las muestras de sangre tomadas después de la confrontación, no se aisló virus de los leucocitos de las madres vacunadas, ni en la sangre ni los órganos de los fetos sacrificados.

Las cerdas del grupo placebo presentaron fiebre, leucopenia y falta de apetito después de la confrontación. Los fetos de las cerdas de este grupo tenían una talla reducida y presentaban lesiones histopatológicas compatibles con la PPC, como esplenomegalia, petequias en ríñones y vejiga, focos de necrosis en intestino, numerosas hemorragias en los órganos internos y focos de encefalitis no purulenta. Se aisló el VPPC de todos los órganos y sangre de los fetos de este grupo. La vacunación de las cerdas gestadas con la composición vacunal E2his-CD154 en el esquema evaluado, impidió la transmisión del VPPC de las madres a su descendencia.

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 . - Antígeno vacunal quimérico contra el virus de la Peste Porcina Clásica (VPPC), caracterizado por contener a) el segmento extracelular de la glicoproteína E2 de la envoltura viral del VPPC y b) interferón alfa o el segmento extracelular de la molécula CD 154 como la proteína estimuladora del sistema inmune.

2. - El antígeno vacunal quimérico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el interferón alfa o el segmento extracelular de la molécula CD 154 pueden provenir de cualquier mamífero.

3. - El antígeno vacunal quimérico de conformidad la reivindicación 2, caracterizado además porque contener esencialmente la secuencia aminoacídica del segmento extracelular de la glicoproteína E2 del VPPC (Id. Sec. No. 1 ) y del segmento extracelular de molécula CD154 de cerdo (Id. Sec. No. 2).

4. - El antígeno vacunal quimérico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es obtenido por vía recombinante, sintética o mediante conjugación química.

5. - El antígeno vacunal quimérico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es obtenido a partir de la leche de mamíferos genéticamente modificados.

6.- El antígeno vacunal quimérico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque es obtenido a partir de la leche de mamíferos no transgénicos mediante la transformación genética directa de la glándula mamaria. 7.- El antígeno vacunal quimérico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la transformación genética directa de la glándula mamaria se realiza mediante el empleo de vectores adenovirales. 8. - El antígeno vacunal quimérico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque es obtenido a partir de la leche de mamíferos transgénicos. 9. - El antígeno vacunal quimérico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque es obtenido a partir de levaduras modificadas genéticamente. 10.- Composición vacunal capaz de producir una respuesta inmune protectora contra el VPPC, caracterizada por contener los antígenos quiméricos descritos en las reivindicaciones 1-9. 1 1 .- La composición vacunal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque puede ser administrada a los animales por ruta sistémica o mucosal.