MX2008010842A

MX2008010842A - Peptido de tumor de wilms restringido por antigeno leucocitario humano-a*3303 y composicion farmaceutica que comprenden el mismo.

Info

Publication number: MX2008010842A
Application number: MX2008010842A
Authority: MX
Inventors: Haruo Sugiyama
Original assignee: Int Inst Cancer Immunology Inc
Priority date: 2006-02-22
Filing date: 2007-02-21
Publication date: 2008-09-01
Also published as: PT1988163E; RU2011132212A; PH12012502372B1; US20140193442A1; CA2886615A1; WO2007097358A1; ES2587980T3; ZA200806542B; RU2008137635A; CY1113117T1; US20140193443A1; CN101384716A; CN102702319B; EP2385117A1; CN102702319A; US8933038B2; ES2558330T3; ES2387685T3; SI1988163T1; DK1988163T3

Abstract

Se describe un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos compuesta de nueve residuos de aminoácidos contiguos derivados de una proteína de WT1, en donde un aminoácido en la posición 2 en la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser y Asp, y un residuo de aminoácido en la posición 9 en la secuencia de aminoácidos es Arg; un polinucleótido que codifica el péptido; una composición farmacéutica que comprende el péptico; y otros.

Description

PEPTIDO DE TUMOR DE WILMS RESTRINGIDO POR ANTIGENO LEUCOCITARIO HUMANO-A*3303 Y COMPOSICION FARMACEUTICA QUE COMPRENDE EL MISMO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un péptido restringido por HLA-A*3303, específicamente un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de 9 aminoácidos contiguos de una proteína de WT1 , en donde un aminoácido en la posición 2 de la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de Ala, lie, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser y Asp, y un aminoácido en la posición 9 es Arg. Además, la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica el péptido, una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de un cáncer que comprende el mismo y similares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El gen de WT1 (gen de tumor de Wilms 1) se identificó como un gen responsable de tumor de Wilms que es un cáncer renal en niños (documentos que no son patente 1 y 2). WT1 es un factor de transcripción que tiene una estructura de dedo de zinc. Al principio se consideró que el gen de WT1 era un gen supresor de tumor. Sin embargo, estudios subsecuentes (documentos que no son patente 3, 4, 5 y 6) mostraron que el gen de WT1 funciona también como un oncogén en tumores hematopoyéticos y cánceres sólidos. El gen de WT1 se expresa a niveles altos en muchos tipos de tumores malignos. Se ha examinado si el producto de gen de WT1 libre de mutaciones, que es una proteína autóloga, tiene o no inmunogenicidad en un cuerpo vivo. Los resultados revelaron que la proteína derivada del gen de WT1 que se expresa a niveles altos en células tumorales es fragmentada a través de procesamiento intracelular, los péptidos resultantes forman complejos con moléculas de clase I de MHC, y los complejos se presentan sobre las superficies de las células, y que los CTLs que reconocen dichos complejos pueden ser inducidos por vacunación de péptidos (documentos que no son patente 7, 8 y 9). También se muestra que en un ratón inmunizado con un péptido de WT1 o un ADNc de WT1 , en células tumorales transplantadas que expresan un gen de WT1 son rechazadas con una alta probabilidad (documentos que no son patente 7 y 10), mientras que tejidos normales que expresan fisiológicamente el gen de WT1 no son dañados por los CTLs inducidos (documento que no es patente 7). Se mostró en experimentos in vitro que usaron células humanas que cuando el péptido Db126 o el péptido WH187 (aminoácidos 187-195 de SEQ ID No: 1 , SLGEQQYSV) que tenían una alta capacidad para unirse a una molécula de HLA-A*0201 , que es una de las moléculas de clase I de MHC humanas, se usa para estimular células mononucleares de sangre periférica humana que tienen HLA-A*0201 , Los CTLs específicos de WT1 son inducidos, los CTLs inducidos tienen una actividad citotóxica específica para células tumorales que expresan endógenamente un gen de WT1 a niveles altos, y la actividad citotóxica de dichos CTLs es restringida por HLA-A2 (documento que no es patente 1 1). Se mostró en experimentos in vitro en células humanas que usan péptido de WT1 que se acopla con HI_A-A*2402 (que se encuentra muy frecuentemente en personas japonesas entre alelos HLA-A) (WTI235; aminoácidos 235-243 de SEQ ID No: 1 , CMTWNQMNL) que CTLs específicos de WT1 (TAK-1 ) son inducidos (documento que no es patente 12), y los CTLs inducidos no suprimen la actividad formadora de colonias de células madre hematopoyéticas normales que parcialmente expresan fisiológicamente un gen de WT1 (documentos que no son patente 13 y 14). Estos reportes sugieren fuertemente que no sólo en ratones sino también en seres humanos, los CTLs específicos de WT1 pueden ser inducidos, tales como CTLs tienen una actividad citotóxica contra células tumorales que expresan un gen de WT1 a niveles altos, pero no tienen una actividad citotóxica contra células normales que expresan fisiológicamente un gen de WT1 (documentos que no son patente 7, 10, 1 1 , 12, 13 y 14). El producto de gen de WT1 está presente como una proteína nuclear, y es procesada por proteosomas en el citoplasma para ser fragmentadas en péptidos. Los péptidos fragmentados son transportados al lumen del retículo endoplásmico por moléculas TAP (transportadores asociados con procesadores de antígeno), forman complejos con moléculas de clase I de MHC, y están presentes sobre las superficies de las células. Los CTLs específicos de WT1 son inducidos como resultado de reconocimiento de complejos de péptido de WT1 -molécula de clase I de MHC por células precursoras de CTL mediante TCR, ejerciendo así un efecto citotóxico sobre las células tumorales que presentan un producto de gen de WT1 a través de moléculas de la clase I de MHC (documentos que no son patente 7, 8 y 9). Entonces, se requiere por lo menos un péptido de WT1 usado en inmunoterapia de cáncer que es dirigido a un producto de gen de WT1 está en forma que se une a una molécula de clase I de MHC en un cuerpo vivo. Sin embargo, las moléculas de clase I de MHC son diversas y secuencias de aminoácidos de péptidos WT1 que se unen a moléculas de clase I de MHC respectivas son diferentes unas de otras. Por lo tanto, se requiere proveer un péptido que se acople a cada subtipo de clase I de MHC. Sin embargo, solo los péptidos restringidos por molécula de HLA-A*2402, molécula de HLA-A*0201 y molécula de HLA-A*2601 se conocen como péptidos WT1 restringidos por molécula de HLA hasta la fecha (documento de patente 1 , documento que no es patente 11 y documento de patente 2, respectivamente). HLA*3303 está presente en el siguiente porcentaje más alto a HLA-A*2402 en japonés. Por lo tanto, existe la necesidad de encontrar un péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303. Documento de patente 1 : WO 2003/106682 Documento de patente 2: WO 2005/095598 Documento que no es patente 1 : Daniel A. Haber et al., Cell. 29 de junio de 1990; 61 (7): 1257-69. Documento que no es patente 2: Cali KM et al., Cell. 9 de febrero de 1990; 60 (3):509-20. Documento que no es patente 3: Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998; 181 :151-212. Revisión. Documento que no es patente 4: Yamagami T et al., Blood. 1 de abril de 1996; 87 (7):2878-84. Documento que no es patente 5: Inoue K et al., Blood. 15 de abril de 1998; 91 (8):2969-76. Documento que no es patente 6: Tsuboi A et al., Leuk Res. Mayo de 1999; 23 (5):499-505. Documento que no es patente 7: Oka Y et al., J Immunol. 15 de febrero de 2000; 164 (4): 1873-80. Documento que no es patente 8: Melief CJ et al., Immunol Rev. Junio de 1995; 145:167-77 Documento que no es patente 9: Ritz J, J Clin Oncol. 12 de febrero de 1994; 12 (2):237-8. Documento que no es patente 10: Tsuboi A et al., J Clin Immunol. mayo de 2000; 20 (3):195-202. Documento que no es patente 11 : Oka Y et al., Immunogenetics.

Febrero de 2000; 51 (2):99-107. Documento que no es patente 12: Ohminami H et al., Blood. 1 de enero de 2000; 95 (1):286-93.

Documento que no es patente 13: Gao L et al., Blood. 1 de abril de 2000; 95 (7):2198-203. Documento que no es patente 14: Ohminami H et al., Blood. E de enero de 2000; 95 (1):286-93.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Problemas que han de ser resueltos por la invención Los problemas que han de ser resueltos por la presente invención son para proveer un péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303 y un polinucleótido que codifica el mismo, asi como una composición farmacéutica para el tratamiento/prevención de un cáncer que comprende el mismo, y similares.

Medios para resolver los problemas Como resultado de estudios intensivos en vista de la situación como se describió antes, el inventor de la presente invención ha encontrado que un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de 9 aminoácidos contiguos de una proteína de WT1 , en donde un aminoácido en la posición 2 de la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de Ala, lie, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser y Asp, y un aminoácido en la posición 9 de la secuencia de aminoácidos es Arg puede inducir CTL específico de WT1 con una velocidad alta. Por lo tanto, la presente invención se ha completado. La presente invención provee: (1) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de 9 aminoácidos contiguos de una proteína de WT1 , en donde un aminoácido en la posición 2 de la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de Ala, lie, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser y Asp, y un aminoácido en la posición 9 de la secuencia de aminoácidos es Arg; (2) el péptido de conformidad con (1), en donde la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de: Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg (SEQ ID No: 2), Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg (SEQ ID No: 3), Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID No: 4), y Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg (SEQ ID No: 5); (3) el péptido de conformidad con (2) en donde la secuencia de aminoácidos es Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID No: 4); (4) una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de cáncer, que comprende el péptido de conformidad con (1); (5) un método para el tratamiento o prevención de un cáncer, que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de conformidad con (4) a un sujeto HLA-A*3303-positivo; (6) el uso del péptido de conformidad con (1) para la fabricación de la composición farmacéutica de conformidad con (4); (7) un polinucleótido que codifica el péptido de conformidad con O); (8) un vector de expresión que comprende el polinucleótido de conformidad con (7); (9) una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de un cáncer, que comprende el polinucleótido de conformidad con (7) o el vector de conformidad con (8); (10) un método para el tratamiento o prevención de un cáncer, que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de conformidad con (9) a un sujeto HLA-A*3303-positivo¡ (1 1 ) el uso del polinucleótido de conformidad con (7) o el vector de conformidad con (8) para la fabricación de la composición farmacéutica de conformidad con (9); (12) un CTL específico de WT1 , que es inducible por el péptido de conformidad con (1); (13) un método para la inducción de un CTL específico de WT1 , que comprende cultivar una célula mononuclear de sangre periférica en presencia del péptido de conformidad con (1 ) para inducir el CTL específico de WT1 de una célula mononuclear de sangre periférica; (14) un equipo para la inducción de un CTL específico de WT1 , que comprende el péptido de conformidad con (1) como un componente esencial; (15) una célula que presenta antígeno que presenta un péptido de WT1 , que es inducible por el péptido de conformidad con (1); (16) un método para la inducción de una célula que presenta antígeno que presenta un péptido de WT1 , que comprende cultivar una célula que presenta antígeno inmadura en presencia del péptido de conformidad con (1) para inducir la célula que presenta antígeno que presenta un péptido de WT1 de la célula que presenta antígeno inmadura; (17) un equipo para la inducción de una célula que presenta antígeno que presenta un péptido de WT1 , que comprende el péptido de conformidad con (1) como un componente esencial; (18) un método para el diagnóstico de un cáncer, que comprende usar el CTL de conformidad con (12) o la célula que presenta antígeno de conformidad con (15); (19) un método para la determinación de la presencia o cantidad de CTL específico de WT1 en un sujeto HI_A-A*3303 positivo, que comprende: (a) hacer reaccionar un complejo de un péptido de WT1 y una molécula de HLA-A*3303 con una muestra del sujeto; y (b) determinar la presencia o cantidad de un CTL que reconoce el complejo contenido en la muestra; y (20) el método de conformidad con (19), en donde el complejo es una forma de tetrámero.

Efectos de la invención La presente invención provee un péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303, y un polinucleótido que codifica al mismo, así como una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de un cáncer que comprende el mismo, y similares. Por lo tanto, es posible inducir CTLs específicos de WT1 in vivo e in vitro en sujetos que tienen HLA-A*3303. Debido a que aproximadamente 24% de los japoneses tienen por lo menos una molécula de HLA-A*3303, CTLs específicos de WT1 pueden ser inducidos en un intervalo muy amplio de sujetos.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 representa la actividad citotóxica del CTL inducida La figura 2 representa la actividad citotóxica del CTL inducida con WT136 . La figura 3 representa la actividad citotóxica del CTL inducida con WT1367. La figura 4 representa la actividad citotóxica del CTL inducida La figura 5 representa la actividad citotóxica del CTL inducida con WT1364 contra la célula que expresa un gen de WT1 endógenamente. La figura 6 representa la actividad citotóxica del CTL inducida con WT1367 contra la célula que expresa un gen de WT1 endógenamente. La figura 7 representa la actividad citotóxica del CTL inducida con WT1 0g contra la célula que expresa un gen de WT1 endógenamente.

La figura 8 representa la actividad citotóxica del CTL inducida con contra la célula que expresa un gen de WT1.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Una secuencia de aminoácidos de una proteína de WT1 humana se muestra en SEQ ID No: 1. Un gen de WT1 se expresa en forma nativa a niveles altos, por ejemplo, en tumores hematopoyéticos tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple o linfoma maligno y cánceres sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer cervical o cáncer de ovario. Además, un motivo de anclaje para HLA-A*3303 se caracteriza porque un aminoácido en la posición 2 es cualquiera de Ala, Me, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser y Asp, y un aminoácido en la posición 9 es Arg. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a un péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303 que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de 9 aminoácidos contiguos de una proteína de WT1 , en donde un aminoácido en la posición 2 de la secuencia de aminoácidos es preferiblemente seleccionada del grupo que consiste de Ala, lie, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser y Asp, y un aminoácido en la posición 9 de la secuencia de aminoácidos es preferiblemente Arg (de aquí en adelante referido como un péptido de WT1 ).

La secuencia de aminoácidos que consiste de 9 aminoácidos comprendidos en el péptido de la presente invención es preferiblemente, Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg (SEQ ID No: 2), Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg (SEQ ID No: 3), Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID NO: 4) o Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg (SEQ ID No: 5). Muy preferiblemente, Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID No: 4). Además, puede tener una sustitución de uno a varios, preferiblemente uno a cinco aminoácidos con otros aminoácidos en los 9 aminoácidos de cualquiera de SEQ ID Nos: 2-5. Cualquiera de los 9 aminoácidos u otros aminoácidos sustituidos pueden ser apropiadamente modificados. En cualquier caso, el péptido de la presente invención retiene una capacidad para unirse a una molécula de HLA-A*3303. Como se describió antes, un objeto de la presente invención es obtener un péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303. Por lo tanto el péptido de la presente invención puede ser cualquiera siempre que comprenda una secuencia de aminoácidos que se derive de una proteína de WT1 y consista de 9 aminoácidos contiguos. Por lo tanto, el péptido de la presente invención puede ser, por ejemplo, un péptido que consista únicamente de la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEQ ID Nos: 2-5, o una proteína de WT1 o una parte de la misma que comprenda la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEQ ID Nos: 2-5. Varias sustancias se pueden unir en el N-terminal y/o el C-terminal de la secuencia de aminoácidos que consiste de 9 aminoácidos contiguos en el péptido de la presente invención.

Por ejemplo, un aminoácido, un péptido o un análogo del mismo se pueden unir. Si estas sustancias se unen al péptido de la presente invención, pueden ser procesadas, por ejemplo, por una enzima en un cuerpo vivo o a través de un proceso tal como procesamiento intracelular, y finalmente las secuencia de aminoácidos que consisten de 9 aminoácidos contiguos se pueden producir y presentar como un complejo con una molécula de HLA-A*3303 sobre la superficie de una célula, dando por resultado así el efecto de inducir un CTL. Estas sustancias pueden ser aquellas que modulan la solubilidad de los péptidos de la presente invención, o incrementan su estabilidad (resistencia a proteasa, etc.). Alternativamente, estas sustancias pueden ser aquellas que suministren los péptidos de la presente invención de manera específica, por ejemplo, a un tejido u órgano dado, o pueden tener la acción de incrementar la eficiencia de asimilación por una célula que presenta antígeno o similar. Estas sustancias pueden ser aquellas que incrementen la capacidad para inducir un CTL, tales como péptidos auxiliares o similares. El péptido de la presente invención se puede sintetizar por métodos generalmente usados en la técnica o modificaciones de los mismos. Dichos métodos se describen, por ejemplo, en Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academia Press Inc., New York, 1976; Peptide-Gosei, Maruzen Co., Ltd., 1975; Peptide-Gosei No Kiso To Jikken, Maruzen Co., Ltd., 1985; y lyakuhin No Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide-Gosei, Hirokawa - Book store, 1991. El péptido de la presente invención también se puede preparar usando técnicas de ingeniería genética basadas en información acerca de la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de la presente invención. Dichas técnicas de ingeniería genética son bien conocidas por un experto en la técnica. En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de un cáncer, que comprende el péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303. El gen de WT1 es expresado a niveles altos en tumores hematopoyéticos tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple o linfoma maligno y cánceres sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer cervical o cáncer de ovario. Por lo tanto, la composición farmacéutica de la presente invención se puede usar para el tratamiento o prevención de un cáncer. Cuando la composición farmacéutica de la presente invención se administra a un sujeto HLA-A*3303-positivo, CTLs específico de WT1 son inducidos por el péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303 en la composición farmacéutica y las células cancerosas en el sujeto son dañadas por dichos CTLs. La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además del péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303 como un ingrediente activo, por ejemplo, un vehículo, un excipiente o similar. El péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303 comprendido en la composición farmacéutica de la presente invención induce un CTL específico de WT1. Por lo tanto, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender un adyuvante apropiado, o se puede administrar junto con un adyuvante apropiado a fin de incrementar la eficiencia de inducción. Ejemplos de adyuvantes preferibles incluyen pero no se limitan a adyuvante de Freund completo o incompleto e hidróxido de aluminio. El método de la administración de la composición farmacéutica de la presente invención se puede seleccionar apropiadamente de condiciones tales como el tipo de enfermedad, la condición del sujeto o el sitio objetivo. Ejemplos de dichos métodos incluyen pero no se limitan a administración intradérmica, administración subcutánea, administración intramuscular, administración intravenosa, administración nasal y administración oral. La cantidad de péptido comprendido en la composición farmacéutica de la presente invención, asi como la forma de dosis, el número de veces de la administración y similares de la composición farmacéutica de la presente invención se pueden seleccionar apropiadamente dependiendo de condiciones tales como el tipo de enfermedad, la condición del sujeto o el sitio objetivo. La dosis individual del péptido es usualmente 0.0001 mg - 1000 mg, preferiblemente 0.001 mg - 10000 mg. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento o prevención de un cáncer, que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición farmacéutica a un sujeto HLA-A*3303-positivo. El cáncer que se ha de tratar o prevenir puede ser cualquiera, y ejemplos del mismo incluyen tumores hematopoyéticos tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple o linfoma maligno y cánceres sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer cervical o cáncer de ovario. En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de un péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303 para la fabricación de la composición farmacéutica. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la determinación de la presencia o cantidad de un CTL específico de WT1 en un sujeto HLA-A*3303-positivo, que comprende: (a) hacer reaccionar un complejo de un péptido de WT1 y una molécula de HLA-A*3303 con una muestra del sujeto; y (b) determinar la presencia o cantidad de un CTL que reconoce el complejo contenido en la muestra. La muestra de un sujeto puede ser cualquiera siempre que haya una posibilidad de que contenga un linfocito. Ejemplos de las muestras incluyen fluido corporal tal como sangre o linfa y un tejido. El complejo de un péptido de WT1 y una molécula de HLA-A*3303 se puede preparar, por ejemplo, como un tetrámero o pentámero usando un método conocido por un experto en la técnica tal como un método de biotina-estreptavidina. La presencia o cantidad del CTL que reconoce dicho complejo se puede medir por un método conocido por un experto en la técnica. En este aspecto de la presente invención, el complejo puede ser marcado. Un marcador conocido tal como un marcador fluorescente o un marcador radioactivo se puede usar como marcador. El mareaje hace la determinación de la presencia o cantidad de CTL fácil y rápida. El método de este aspecto de la presente invención se puede usar para diagnosticar un cáncer, pronóstico del mismo o similar. Por lo tanto, la presente invención también provee una composición para la determinación de la presencia o cantidad de un CTL específico de WT1 en un sujeto HLA-A*3303-positivo, que comprende un complejo de un péptido de WT1 y una molécula de HLA-A*3303. Además, la presente invención provee un equipo para la determinación de la presencia o cantidad de un CTL específico de WT1 en un sujeto HI_A-A*3303-positivo, que comprende un complejo de un péptido de WT1 y una molécula de HLA-A*3303. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la producción de un CTL específico de WT1 usando un complejo de un péptido de WT1 y una molécula de HLA-A*3303, que comprende: (a) hacer reaccionar el complejo con una muestra; y (b) obtener un CTL que reconoce el complejo contenido en la muestra. El complejo de un péptido de WT1 y una molécula de HLA-A*3303 se describió anteriormente. La muestra puede ser cualquiera siempre que haya una posibilidad de que contenga un linfocito. Ejemplos de las muestras incluyen una muestra de un sujeto tal como sangre, y un cultivo de células. El CTL que reconoce el complejo se puede obtener usando un método conocido por un experto en la técnica tal como FACS o MACS. La presente invención permite cultivar el CTL específico de WT1 obtenido y usarlo para el tratamiento o prevención de varios cánceres. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un CTL específico de WT1 que es obtenible por un método para la producción de un CTL específico de WT1 usando un complejo de un péptido de WT1 y una molécula de HLA-A*3303. Además, la presente invención se refiere a un equipo para la producción de un CTL específico de WT1 , que comprende un complejo de un péptido de WT1 y una molécula de HLA-A*3303. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica el péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303 (de aquí en adelante referido como un polinucleótido WT1). El polinucleótido de la presente invención puede ser ADN o ARN. La secuencia de bases del polinucleótido de la presente invención se puede determinar con base en la secuencia de aminoácidos del péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303. El polinucleótido se puede preparar, por ejemplo, por un método para la síntesis de ADN o ARN, método de PCR o similar. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión que comprende el polinucleótido (de aquí en adelante referido como vector de expresión de WT1). El tipo del vector de expresión, la secuencia comprendida distinta a la secuencia del polinucleótido y similares se pueden seleccionar apropiadamente dependiendo del tipo de hospedero en el cual el vector de expresión de la presente invención es introducido, el propósito de uso o similares. Es posible tratar o prevenir tumores hematopoyéticos o cánceres sólidos para administrar el vector de expresión de la presente invención a un sujeto HI_A-A*3303-positivo para producir un péptido de WT1 en un cuerpo vivo e inducir un CTL específico de WT1, y dañando las células tumorales hematopoyéticas o células cancerosas sólidas en el sujeto. En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de un cáncer, que comprende el polinucleótido WT1 o el vector de expresión WT1. La composición, el método de la administración y similares de la composición farmacéutica de la presente invención en este aspecto se describieron anteriormente. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento o prevención de un cáncer, que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición farmacéutica que comprende el péptido de WT1 o el vector de expresión de WT1 a un sujeto HLA-A*3303-positivo. Ejemplos de cánceres que se han de tratar o prevenir incluyen tumores hematopoyéticos tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple o linfoma maligno y cánceres sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer cervical o cáncer de ovario. En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de un polinucleótido WT1 o un vector de expresión de WT1 para la fabricación de la composición farmacéutica que comprende el polinucleótido WT1 o el vector de expresión WT1. En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula que comprende el vector de expresión. La célula de la presente invención se puede preparar, por ejemplo, transformando una célula hospedero tal como E. coli, levadura, célula de insecto o célula de animal con el vector de expresión. El método para la introducción del vector de expresión en una célula hospedero se puede seleccionar apropiadamente de varios métodos. Al cultivar la célula transformada, y recuperar y purificar el péptido de WT1 producido, el péptido de la presente invención se puede preparar. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un CTL específico de WT1 , que es inducido por el péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303. El CTL de la presente invención reconoce un complejo de un péptido de WT1 y una molécula de HLA-A*3303. Por lo tanto, el CTL de la presente invención se puede usar para dañar específicamente una célula tumoral positiva para HLA-A*3303 y expresando WT1 a un nivel alto. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento o prevención de un cáncer que comprende administrar un CTL específico de WT1 a un sujeto HLA-A*3303-positivo. El método de administración del CTL específico de WT1 se puede seleccionar apropiadamente dependiendo de condiciones tales como el tipo de enfermedad, la condición del sujeto o el sitio objetivo. Ejemplos de dichos métodos incluyen pero no se limitan a administración intravenosa, administración intradérmica, administración subcutánea, administración intramuscular, administración nasal y administración oral. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la inducción de un CTL específico de WT1 que comprende cultivar una célula mononuclear de sangre periférica en presencia del péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303 para inducir el CTL específico de WT1 de la célula mononuclear de sangre periférica. El sujeto del cual la célula mononuclear de sangre periférica es derivada puede ser cualquiera siempre que sea positivo para HLA-A*3303. Al cultivar las células mononucleares de sangre periférica en presencia de péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303, los CTLs específicos de WT1 son inducidos a partir de células precursoras de CTL contenidas en las células mononucleares de sangre periférica. Es posible tratar o prevenir tumores hematopoyéticos o cánceres sólidos en un sujeto HLA-A*3303-positivo al administrar el CTL específico de WT1 obtenido de conformidad con la presente invención al sujeto. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un equipo para la inducción de un CTL específico de WT1 , que comprende un péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303 como un componente esencial. Preferiblemente, el equipo se usa en el método para la inducción de un CTL específico de WT1. El equipo de la presente invención puede comprender además del péptido de WT1 restringido por HI_A-A*3303, por ejemplo, un medio para obtener una célula mononuclear de sangre periférica, un adyuvante, un recipiente de reacción o similar. En general, un manual de instrucción se anexa al equipo. Al usar el equipo de la presente invención, los CTLs específicos de WT1 pueden ser inducidos de manera eficiente. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una célula que presenta antígeno (tal como una célula dendrítica) que presenta un péptido de WT1 a través de una molécula de HLA-A*3303, que es inducida por el péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303. Al usar la célula que presenta antígeno de la presente invención, los CTLs específicos de WT1 son inducidos de manera eficiente. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento o prevención de un cáncer que comprende administrar la célula que presenta antígeno que presenta un péptido de WT1 a través de una molécula de HLA-A*3303 a un sujeto HLA-A*3303-positivo. El método de administración de la célula que presenta antígeno se puede seleccionar apropiadamente dependiendo de condiciones tales como el tipo de la enfermedad, la condición del sujeto o el sitio objetivo. Ejemplos de dichos métodos incluyen pero no se limitan a, administración intravenosa, administración intradérmica, administración subcutánea, administración intramuscular, administración nasal y administración oral.. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la inducción de una célula que presenta antígeno que presenta un péptido de WT1 a través de una molécula de HLA-A*3303, que comprende cultivar una célula que presenta antígeno inmaduro en presencia de un péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303 para inducir la célula que presenta antígeno que presenta un péptido de WT1 a través de una molécula de HLA-A*3303 de la célula que presenta antígeno inmadura. La célula que presenta antígeno inmadura se refiere a una célula tal como una célula dendrítica inmadura que se puede madurar a una célula que presenta antígeno. Un sujeto del cual se deriva la célula que presenta antígeno inmadura puede ser cualquiera siempre que sea positivo para HLA-A*3303. Debido a que las células que presenten antígeno inmaduras están contenidas, por ejemplo, en células mononucleares de sangre periférica, dichas células pueden ser cultivadas en presencia del péptido de WT1. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un equipo para la inducción de una célula que presenta antígeno que presenta un péptido de WT1 a través de una molécula de HI_A-A*3303, que comprende un péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303 como un componente esencial. Preferiblemente, el equipo se usa en el método para la inducción de una célula que presenta antígeno. Otro componente que ha de ser comprendido en el equipo de la presente invención y similares se describieron antes. El equipo de la presente invención se puede usar para inducir de manera eficiente una célula que presenta antígeno que presenta un péptido de WT1 a través de una molécula de HI_A-A*3303. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo contra un péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303 o un anticuerpo contra un polinucleótido que codifica el péptido. El anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo policlonal o anticuerpo monoclonal. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de un cáncer, que comprende el uso del CTL específico de WT1 , la célula que presenta antígeno que presenta antígeno WT1 a través de una molécula de HLA-A*3303, o el anticuerpo contra un péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303 o el anticuerpo contra un polinucleótido que codifica el péptido. Preferiblemente, el CTL específico de WT1 se usa en el método para el diagnóstico de la presente invención. Por ejemplo, es posible diagnosticar un cáncer al incubar el CTL, la célula que presenta antígeno o el anticuerpo con una muestra de un sujeto HLA-A*3303-positivo, o administrarlo a un sujeto HLA-A*3303-positivo y determinar, por ejemplo, la posición, sitio o cantidad del mismo. El CTL, la célula que presenta antígeno o el anticuerpo pueden ser marcados. Al anexar una etiqueta, el método para diagnóstico de la presente invención se puede poner en práctica de manera eficiente. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un equipo para el diagnóstico de un cáncer, que comprende el CTL específico de WT1 , la célula que presenta antígeno que presenta un péptido de WT1 a través de una molécula de HLA-A*3303, o el anticuerpo contra un péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303 o el anticuerpo contra un polinucleótido que codifica el péptido como un componente esencial. Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención con más detalle pero no deben considerarse como limitantes del alcance de la misma.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Selección de péptido de WT1 El programa NetMHC2.0 (Universidad Técnica de Dinamarca) se usó para seleccionar WTI 337, WT1364, vVT1367 y VVT1409, que son péptidos hidrofílicos que consisten de 9 aminoácidos con el motivo de anclaje adecuados para HLA-A*3303 (el segundo aminoácido del N-terminal es cualquiera de Ala, lie, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser y Asp, y el aminoácido en el C-terminal es Arg) y se espera que tengan una afinidad de unión a una molécula de HLA-A*3303 de un péptido de WT1 de una proteína de WT1 (SEQ ID No: 1). Las secuencias de aminoácidos y las afinidades de unión a una molécula de HLA-A*3303 de estos péptidos se muestran en el cuadro 1.

CUADRO 1 Preparación de células B-LCL Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se separaron por el método de centrifugación por densidad de gradiente de Ficoll-Hypaque de sangre periférica que había sido recolectada de un donador sano HLA-A*3303-positivo (HLA-A*3303/0207). Las PBMCs entonces se sembraron en una placa en cultivo de células de 24 pozos a la densidad de aproximadamente 1 x 107 en un medio RPMI 1640 que contenía un 10% de FCS, y se añadió un sobrenadante de cultivo de células B95-8 (células que producen virus EB). Se cultivaron a 37°C con 5% de CO2 durante aproximadamente 1 mes. Se obtuvieron células B-LCL transformadas con virus EB, que son células tumorales de células B. Se confirmó que las células B-LCL resultantes no expresaron gen de WT1. Las células B-LCL se pulsaron incubándolas con 20 µg/ml de WTI 337, vVT1364, WT1367 o WT1 09 durante 2 horas, y se irradiaron con 80 Gy de radiación. Las células B-LCL resultantes (de aquí en adelante referidas como células B-LCL pulsadas con un péptido de WT1 ) se usaron como célula que presenta antígeno para los siguientes experimentos.

Inducción de WT1 especifico de CTL 3 x 105 de PBMCs (HLA-A*3303/1 01) se cultivaron en una placa de cultivo de células de 24 pozos en medio completo (45% de RPMI, 45% de medio AMI-V y 10% de suero AB humano) que contenía 20 µ9/??? de WTI337, WT1364, WT1367 o WTI 409 a 37°C con 5% de C02 durante 1 semana para obtener células de respuesta. 2 x 106 de las células de respuesta resultantes se co-cultivaron con 1 x 106 de las células B-LCL pulsadas con el mismo péptido de WT1 en un medio completo durante 1 semana (primera estimulación). Las PBMCs se co-cultivaron con las células B-LCL pulsadas con el péptido de WT1 tres veces más (segunda a cuarta estimulaciones) bajo las condiciones en las cuales 20 lU/ml (concentración final) de IL-2 se añadió como sigue: segunda estimulación: dos veces cada dos días desde 3 días después del inicio de la estimulación: tercera y cuarta estimulaciones: tres veces a intervalos de un día desde el día después del inicio de la estimulación. Las células resultantes se concentraron usando equipo de alimentación por gravedad en columnas de selección negativo (StemSp) de modo que la relación de las células T CD8-positivas alcanzó 80%, y se co-cultivaron con las células B-LCL pulsadas con el péptido de WT1 (quinta estimulación). Células T CD8-positivas (CTLs) obtenidas 5 días después de la estimulación final se usaron para la medición de la actividad citotóxica.

Actividad citotóxica de CTL La actividad citotóxica de CTLs se midió usando prueba de liberación de 51Cr. Las células de CTL (de aquí en adelante referidas como células efectoras) se mezclaron a una relación (relación E/T de 1 :1 , 5:1 ó 10:1 en 200 µ? de medio con células objetivo en las cuales 51Cr se había incorporado y cultivado en una placa de cultivo de células de 96 pozos a 37°C con 5% de C02 durante 4 horas. Células B-LCL pulsadas con el mismo péptido de WT1 que el usado para la inducción de CTLs (BLCL-Ps), y células B-LCL sin pulsar con un péptido de WT1 (BLCL-NPs) se usaron como células objetivo. Después del cultivo, los sobrenadantes se recolectaron por centrifugación. Las cantidades de 51 Cr liberadas en los sobrenadantes se midieron usando un contador de escintilación de líquido. La actividad citotóxica (%) se determinó usando la siguiente fórmula: (liberación de 51Cr en sobrenadante de muestra - liberación de 51Cr espontáneo / (liberación de 5 Cr máximo - liberación de 5 Cr espontáneo) x 100) En donde la liberación de 5 Cr espontánea es la liberación de 51Cr es la liberación de 51Cr observada cuando las células objetivo en las cuales 5 Cr se ha incorporado se cultivaron solas bajo la misma condición y la liberación de 5 Cr máxima es liberación de 51Cr observada cuando las células objetivo en las cuales 5 Cr se había incorporado fueron completamente lisadas usando 1 % de Tritón X-100. Los resultados se muestran en las figuras 1-4. En las figuras, los ejes longitudinales representan lisis específica (%), y los ejes horizontales representan relaciones E/T. BLCL-Ps se representan usando líneas completas, y BLCL-NPs se representan usando líneas punteadas. Se confirmó que CTLs inducidas con WTI 337, \???364, WT 367 y WT1409 dañan específicamente BLCL-Ps que presentan el péptido de WT1 como un complejo con una molécula de HLA-A*3303 en comparación con BLCL-NPs. CTLs inducidas con WT1364, WT1367 o WT1409 se usaron para experimentos adicionales siguientes.

Actividad de cite-toxicidad de CTL contra célula que expresa gen de WT1 endógenamente La actividad citotóxica de CTLs inducida con WTI 364, WT1367 o WT14o9 contra células TF-1 que son células tumorales que expresan un gen de WT1 (HLA-A*3303-posit¡vas) se determinó usando el método como se describió antes. Como un control, células K562 que expresan un gen de WT1 y son negativas para HI_A-A*3303 se usaron. Los resultados se muestran en las figuras 5-7. En las figuras, los ejes longitudinales representan lisis específica (%), y los ejes horizontales representan relaciones E/T. TF-1 se representa usando líneas completas, y K562 se representa usando líneas punteadas. Se confirmó que las CTLs inducidas con WT1364, WT1367 o WT1409 también tienen una actividad citotóxica contra la célula que expresa un gen de WT1 exógenamente. La actividad citotóxica de CTLs inducida con WT1367 contra célula B-LCL que expresa WT1 se determinó usando el método que se describió antes. La B-LCL que expresa WT1 (B-LCL-WT1) se refiere a una célula B-LCL en la cual un gen de WT1 humano es introducido y expresa una proteína de WT1 en la célula, y presenta un péptido que consiste de aproximadamente 9 aminoácidos que resulta de procesar una molécula de HLA-A*3303. Como un control, se usó una célula B-LCL (B-LCL-CV) en la cual un gen de control excepto un gen de WT1 es introducido. Los resultados se muestran en la figura 8. En las figuras, los ejes longitudinales representan lisis específica (%), y los ejes horizontales representan relaciones E/T. B-LCL- WT1 se representa usando líneas completas, y B-LCL-CV se representa usando líneas punteadas. Se confirmó que los CTLs inducidos con WT1367 dañan sólo a la célula que es HLA-A*3303 -positiva y expresa WT1.

APLICABILIDAD INDUSTRIAL La presente invención provee un péptido de WT1 restringido por HLA-A*3303, un polinucleótido que codifica el péptido, una composición farmacéutica que comprende el mismo y similares. Por lo tanto, la presente invención se puede usar en los campos de medicina y similares, por ejemplo, en los campos de desarrollo y preparación de una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de varios tumores hematopoyéticos y cánceres sólidos que expresan WT1 a niveles altos.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de 9 aminoácidos contiguos de una proteína de WT1 , en donde un aminoácido en la posición 2 de la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de Ala, lie, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser y Asp, y un aminoácido en la posición 9 de la secuencia de aminoácidos es Arg. 2 - El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque se selecciona del grupo que consiste de: Leu Ser His Leu GIn Met His Ser Arg (SEQ ID No: 2), Phe Ser Arg Ser Asp GIn Leu Lys Arg (SEQ ID No: 3), Ser Asp GIn Leu Lys Arg His GIn Arg (SEQ ID No: 4), y Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg (SEQ ID No: 5). 3. - El péptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la secuencia de aminoácidos es Ser Asp GIn Leu Lys Arg His GIn Arg (SEQ ID No: 4). 4. - Una composición farmacéutica útil para el tratamiento o prevención de cáncer, que comprende el péptido de de conformidad con la reivindicación 1. 5. - El uso del péptido que se reclama en la reivindicación 1 para la fabricación de la composición farmacéutica que se reclama en la reivindicación 4, útil para el tratamiento o la prevención de un cáncer en un sujeto en HLA-A *3303-positivo. 6. - Un polinucleótido que codifica el péptido de la reivindicación

1. 7. - Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 6. 8. - Una composición farmacéutica útil para el tratamiento o prevención de un cáncer, que comprende el polinucleótido que se reclama en la reivindicación 6 o el vector que se reclama en la reivindicación 7. 9. - El uso del polinucleótido que se reclama en la reivindicación 6 o el vector que se reclama en la reivindicación 7 para la fabricación de la composición farmacéutica que se reclama en la reivindicación 8, que es útil para el tratamiento o prevención de un cáncer en un sujeto HLA-A *3303-positivo. 10. - Un CTL específico de WT1 , que es ¡nducible por el péptido de conformidad con la reivindicación 1. 11. - Un método para la inducción de un CTL específico de WT1 , que comprende cultivar una célula mononuclear de sangre periférica en presencia del péptido de la reivindicación 1 para inducir el CTL específico de WT1 de una célula mononuclear de sangre periférica. 12.- Un equipo para la inducción de un CTL específico de WT1 , que comprende el péptido de la reivindicación 1 como un componente esencial. 13.- Una célula que presenta antígeno que presenta un péptido de WT1 , que es inducible por el péptido de la reivindicación 1. 14. - Un método para la inducción de una célula que presenta antígeno que presenta un péptido de WT1 , que comprende cultivar una célula que presenta antígeno inmadura en presencia del péptido de la reivindicación 1 para inducir la célula que presenta antígeno que presenta un péptido de WT1 de la célula que presenta antígeno inmadura. 15. - Un equipo para la inducción de una célula que presenta antígeno que presenta un péptido de WT1 , que comprende el péptido de la reivindicación 1 como un componente esencial. 16.- Un método in vitro para el diagnóstico de un cáncer, que comprende usar el CTL de la reivindicación 10 o la célula que presenta antígeno de la reivindicación 13. 17. - Un método para la determinación de la presencia o cantidad de CTL específico de WT1 en un sujeto HLA-A*3303 positivo, que comprende: (a) hacer reaccionar un complejo de un péptido de WT1 y una molécula de HLA-A*3303 con una muestra del sujeto; y (b) determinar la presencia o cantidad de un CTL que reconoce el complejo contenido en la muestra. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el complejo es una forma de tetrámero.