MX2008010289A - Sistema de enzima talaromyces emersonii. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a cepas de Talaromyces Emersonii que son termoestables y codifican a las enzimas de termoestables. Las enzimas pueden retener la actividad a temperaturas por encima de 550ºC. Esas cepas y enzimas se utilizan en una variedad de procesos que van desde de la reducción de desechos a la producción de nuevos ingredientes y la producción de bio-combustibles.

Description

SISTEMA DE ENZIMA TALAROMYCES EMERSONII Campo de la Invención La presente invención se refiere a una cepa de Talaromyces emersonii y enzimas y sistemas de enzimas que se pueden aislar de la misma para utilizarse en el manejo ambiental y de desecho, producción y procesamiento de químicos y bioquímicos, procedimientos biotecnológicos, en equipos de prueba o diagnóstico, prebióticos y sinbióticos, productos para el cuidado de la salud, productos comestibles y bebidas funcionales y novedosas, producción de tensoactivos, aplicaciones agrícolas y hortícolas. Antecedentes de la Invención Actualmente Europa enfrenta una crisis en el manejo de desechos con 2,000 millones de toneladas de desecho producidas cada año. Mucho de este desperdicio es orgánico, derivado de materiales de planta (biomasa) con alto contenido de carbohidratos (azúcares) y por consiguiente, representa un recurso valioso cuando éstos se rompen en sus azúcares componentes. Otros tipos de desechos, tales como desecho de fruta se pudre e impone un riesgo ambiental. Este desecho se combina generalmente con alimento de cerdo para extraer cierto valor del mismo, sin embargo se considera un desecho de bajo costo. La biomasa representa un producto comestible altamente variado y variable, siendo aún el producto comestible con energía más renovable de la tierra. Si se controla, puede proporcionar una alternativa sustentable para las reservas siempre agotadas de combustibles fósiles. Existe un interés global en convertir la reserva de energía en biomasa a formas de energía utilizables. Aunque un enfoque importante ha sido la producción de biocombustibles, tal como bioetanol, para propósitos del transporte, también se han identificado mercados para co-productos valiosos generados durante la producción de biocombustible (por ejemplo CO2, residuos con alto contenido de lignina, materia prima química). Actualmente, en los Estados Unidos aproximadamente 3 billones de galones de etanol son producidos del maíz anualmente, principalmente para uso en el sector de combustible de transporte. Esto representa únicamente aproximadamente el 1% del consumo de combustible total de los motores, y se anticipa que para el año 2010, la producción de bioetanol habrá incrementado en más de 7 veces, e incluirá otros substratos de biomasa tales como residuos de madera. Si los residuos de madera se derivan de recurso de desecho rápidamente renovables considerados generalmente como "maleza" o matorrales, se puede derivar un valor considerable tanto en términos de costos de proceso, el cumplimiento de objetivos de producción y aspectos ambientales locales. Quedan claras las ventajas del bioetanol como una alternativa para el petróleo limpia y ambientalmente conveniente y otros combustibles fósiles. La adopción global de cómo un combustible de motor principal, puede compensar muchos de sus problemas de contaminación de aire que son una característica de las áreas urbanas densamente pobladas. Los automóviles modernos pueden ser adaptados fácilmente para correr con mezclas de etanol/gasolina ('gasohol') y están disponibles motores nuevos que pueden utilizar etanol puro como la única fuente de combustible. La biomasa de plantas, incluyendo especies de madera blanda, tiene alto contenido en carbohidratos complejos (polisacáridos) que pueden romperse mediante medios enzimáticos o químicos en azúcares simples, fermentadores. Por ejemplo, las maderas suaves tales como el árbol de Sitka y pino, contienen (% en peso) aproximadamente 41 a 43% de celulosa (un polímero de unidades de glucosa enlazadas por ß-1,4), 20 a 30% de hemicelulosa (una mezcla de mañosa, xilosa de galactosa y arabinosa que contiene polisacáridos) y del 25 al 30% de lignina, un polímero polifenólico sin carbohidrato con alto valor calorífico. Por lo tanto, aproximadamente del 65 al 70% del peso en seco de los residuos en madera son carbohidratos complejos que se pueden utilizar para proporcionar materias primas con alto contenido de azúcar para la fermentación a bioetanol. Los hongos representan una de las formas de vida microbianas más importantes que rompen dichos materiales. El Talaromyces emersonii es un hongo aeróbico termofílico que se encuentra en la naturaleza en acumulaciones de composta y otros eco-sistemas que degradan materiales con alto contenido de biomasa. La estabilidad térmica es una características de muchos de los sistemas de enzimas Talaromyces emersonii aislados hasta la fecha. Se considera como una especie de "putrefacción suave", la cual puede dirigirse a todas las partes del material de la planta, este euasomycete produce sistemas de enzimas que modifican carbohidratos integrales que incluyen enzimas celulolíticas, emicelulolíticas, petinolíticas y amilolíticas, así como una formación de oxidasa/óxido de reductasa y actividades proteolíticas. Por lo tanto, Talaromyces emersonii puede accesar a substratos de crecimiento complejos que se encuentran en un hábitat natural. Las Publicaciones PCT Nos. WO 01/70998 y WO 02/24926, describen el aislamiento de celulasas de Talaromyces emersonii, y en particular celulasas que tienen actividad ß-glucanasa y xilanasa. La desventaja de estas enzimas es que únicamente pueden dirigirse a un tipo (o un número limitado) de un constituyente(s) de un substrato. Por lo tanto con el objeto de metabolizar un cierto substrato es necesario identificar los componentes de dicho substrato, producir polipéptidos que tengan actividad de enzimas adecuadas para metabolizar estos componentes, producir una cantidad requerida de I polipéptido a través de procedimientos de rutina tales como técnicas recombinantes, modificar los polipéptidos si es necesario para alterar la termo-estabilidad o pH óptimo, por ejemplo de las enzimas, expresar el polipéptido y utilizar la enzima resultante para dirigirse a dicho constituyente de dicho substrato. Estos son procedimientos muy tardados y costosos. Además, estos procedimientos no toman en cuenta el hecho de que algunas enzimas pueden exhibir más de una actividad, o cuando se utilizan en combinación con otras enzimas, pueden tener una eficacia modificada. Por lo tanto estos métodos pueden conducir a la sobre-producción de enzimas que no son requeridas, conduciendo también por lo tanto a costos de desembolso y tiempo extras. Por consiguiente existe la necesidad de enzimas y sistemas de enzimas aisladas de Talaromyces emersonii y de un método para aislar dichas enzimas y sistemas de enzimas, el cual supera las desventajas antes mencionadas. Un objeto de la presente invención es el desarrollo de composiciones de enzima optimizadas, particularmente composiciones de enzimas térmicamente estables que generan "jarabes" con alto contenido de azúcares fermentables para utilizarse en las iniciativas de biomasa a bioetanol. Ya que los substratos, o materias primas de biomasa objetivo para la producción de etanol pueden variar su procedencia, desde corrientes de desecho (por ejemplo VFCWs y OFMSWs (Fracción de Vegetales de Desechos Recolectados y Fracción Orgánica de Desechos Sólidos Municipales) hasta cosechas agrícolas (por ejemplo, maíz, azúcar, betabel, hierbas, etc.) hasta biomasa de madera, la obtención de la preparación de enzimas correcta, en un proceso de bajo costo, para obtener máxima producciones de azúcares fermentables es un desafío significativo. Durante muchos años, el costo de las enzimas utilizadas en la conversión de biomasa antes de la producción de bioetanol mediante fermentación microbiana, ha sido un factor negativo importante. Por lo tanto es un objeto de la presente invención producir preparaciones de enzimas de bajo costo para estos propósitos. Las preparaciones de enzima de la presente invención se derivan de Fuentes termofílicas, generalmente consideradas como fuentes de hongos seguras (GRAS), ya que las enzimas fúngicas en uso actualmente en aplicaciones de bioetanol comerciales y de investigación son principalmente de fuentes mesofílicas (por ejemplo, especie Trichoderma sp. /especie Gliocladium sp., especie Aspergillus sp. y especie Penicillium sp.). Un objeto adicional de la presente invención, es proporcionar preparaciones de enzimas que trabajan en temperaturas de reacción superiores, es decir, enzimas termoestables que permiten tiempos de reacción/pasos de tratamiento enzimático más cortos, permiten la pasteurización simultánea de la hidrolasa, que da como resultado una hidrólisis/sacarificación general significativa, tiene un potencial para reducir la carga de enzimas y/o potencial para reciclar la preparación de enzimas, lo cual todo sirve para reducir los costos asociados con el uso de estas enzimas. Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a una cepa de Talaromyces emersonii que fue depositada con el International Mycological Institute (CABI Bioscience UK) el 22 de noviembre del 2005 bajo el número IMI 393751. La ventaja de utilizar Talaromyces emersonii como la fuente de enzimas es que es un microorganismo "considerado generalmente como seguro" (GRAS) y tiene un gran historial de uso en los sectores alimenticios, de bebidas, de alimentación agrícola y farmacéuticas. La ventaja novedosa de esta cepa Talaromyces emersonii, es que las enzimas derivadas de las mismas tienen una actividad óptima en temperaturas entre 54°C y 85°C, manteniendo algunas enzimas de actividad en temperaturas de hasta 95°C. Estas enzimas por lo tanto retendrán la actividad incluso cuando se deseen o requieran altas temperaturas de procesamiento, por ejemplo producción de materias primas con alto contenido de azúcar para producción bioquímica, biofarma, química o de biocombustible (etanol o metano) en donde las temperaturas de reacción de 65 a 90°C facilitan los rangos de reacción superiores simultáneos, la conversión de substrato más rápida y la pasteurización simultánea de las materias primas, lo cual mejora el potencial de almacenamiento y transporte. Además, ya que se pueden utilizar temperaturas más altas con estas enzimas, cada proceso tiene un tiempo de reacción más corto por lo que existen ahorro tanto en tiempo como en costo. Una ventaja adicional es que si la temperatura es lo suficientemente alta, ocurrirá una pasteurización que extermine cualesquiera microorganismos indeseables que no puedan soportar dichas altas temperaturas. Además, las enzimas purificadas de esta cepa han mostrado tener una vida en anaquel más larga. De acuerdo con la presente invención, se proporciona además un sistema de enzimas que comprende una celobiohidrolasa I o una celobiohidrolasa II o una mezcla de los mismos, ß-glucosidasa 1, una xilanasa y una endo- -(1 ,3)4-glucanasa. La presente invención también proporciona un método para utilizar, este sistema de enzimas para la bioconversión de plantas o materiales derivados de plantas, tal como materiales de plantas vírgenes de origen terrestre y marino, y corrientes de desecho de las mismas, incluyendo residuos de café, té, de elaboración de cerveza y bebidas, cáscaras/pieles de frutas y frutas, cáscaras de vegetales, abastecimientos de comida y procesamiento de alimentos, desechos de hojas/hortícolas, desechos de flores, cereales y residuos de procesamiento de cereales, otros desechos de agricultura y jardines, producción de panaderías y desechos de tiendas, productos de papel tales como revistas brillosas con color y periódicos a color, periódicos blanco y negro, papel reciclado blanco, y de color, papel café, bolsas de papel, papeles rígidos y cartón, vasos y platos de papel, tejidos, trapos limpiadores, celofán y Sellotape®, empaques biodegradables, desechos de hospital con alto contenido de celulosa tales como vendajes, papeles, paños para limpiar, vendas, máscaras, textiles, tales como ropa de dormir y toallas y para uso subsecuente en la producción de biocombustible (bioetanol y biogas). La presente invención se refiere además a un sistema de enzimas que comprende una celobiohidrolasa I o una celobiohidrolasa II o una mezcla de las mismas, una ß-glucosidasa 1, una xilanasa y una endo- -(1 ,3)4-glucanasa. La presente invención también proporciona un método para utilizar este sistema de enzimas en la producción de materias primas con alto contenido de monosacáridos de residuos de plantas para la generación de productos con alto valor, por ejemplo, antibióticos, antibióticos y antivirales, carotenoides, antioxidantes, solventes y otros químicos y bioquímicos, incluyendo ingredientes de grado alimenticio, aditivos para cosméticos, oligosacáridos, glucopéptidos para glucómicos de investigación y funcionales. La presente invención proporciona una cepa termofílica de Talaromyces emersonii, la cual tiene un rango de temperatura de crecimiento de 30 a 90°C, con un rango óptimo de 30 a 55°C y que produce en forma activa enzimas en temperaturas superiores a 55°C. La cepa de Talaromyces emersonii fue depositada con el No. de depósito IMI 393751. La presente invención se refiere a un mutante de la misma que también codifica enzimas termoestables. Una enzima producida por la cepa que retiene la actividad a temperaturas superiores a 55°C. La enzima puede ser seleccionada del grupo que consiste en enzimas que modifican carbohidratos, enzimas proteolíticas, oxidasas y oxidoreductasas. La presente invención también proporciona una composición de enzimas que comprenden una celobiohidrolasa I o una celobiohidrolasa II o una mezcla de las mismas, una ß-glucosidasa 1, una xilanasa y una endo-p-( 1 , 3)4- glucanasa. La composición de enzimas puede comprender 0.5 a 90% de celobiohidrolasa I o una celobiohidrolasa II o una mezcla de los mismos, 0.1 a 33 % ß-glucosidasa 1, 0.6 a 89% xilanasa y 0.4 a 68% endo- -(1 ,3)4-glucanasa. Se proporciona además un sistema de enzimas que comprende CBH I (10-30%), CBH II (10-15%), ß-(1,3)4-glucanasa (20-45%), ß-glucosidasa (2-15%), y Xilanasa (18-55%). La composición puede comprender además uno o más de los siguientes: ß-Xilosidasa, a-Glucuronidasa, exoxilanasa, a-L-Arabinofuranosidasa, enzimas pectinolíticas, hemicelulasas, enzimas de modificación de almidón, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas; y proteasas. La presente invención también proporciona un método para utilizar este sistema de enzimas para procesar y reciclar maderos, madera y productos derivados de madera. Este sistema de enzimas es efectivo contra materiales de madera altamente lignificados, y es resistente a moléculas inhibidores potenciales que se encuentran en residuos de madera, y materiales procesados (por ejemplo, extractos, resinas, productos de rompimiento de lignina, derivados de furfural e hidroxifurfural). La presente invención se refiere además a un sistema de enzimas que comprende CBH I (15-30%), CBH II (10-40%), ß(1 ,3)4-glucanasa (15-40%), ß-glucosidasa (2-15%), Xilanasa (15-30%), y 1-8 % -Xilosidasa. La composición puede comprender además una o más de las siguientes; Exoxilanasa; a-Glucuronidasa; a-L-Arabinofuranosidasa; enzimas pectinolíticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa; actividad de modificación de almidón; otras hemicelulasas, incluyendo galactosidasas; oxidoreductasa/oxidasa y esterasas; y proteasa. La presente invención también proporciona un método para utilizar este sistema de enzimas en procesamiento y reciclado de textiles. Se proporciona además un sistema de enzimas que comprende CBH I (5-55%), CBH II (8-50%), ß(1 ,3)4-glucanasa (10-30%), ß-glucosidasa (0.5-30%), Xilanasa (5-30%), y ß-Xilosidasa (0.1- 10%). La composición puede comprender además uno o más de los siguientes; a-L-Arabinofuranosidasa; a-glucuronidasa; otras hidrolasas, incluyendo incluyendo enzimas Pectinolíticas seleccionadas, esterasas; Proteasa; y oxidasas. La presente invención también proporciona un método para utilizar este sistema de enzimas en la sacarificación de desechos de papel. La presente invención se refiere además a un sistema de enzimas que comprende CBH I (2-10%), CBH II (2-10%), ß(1 ,3)4-glucanasa (10-45%), ß-glucosidasa (5-10%), y Xilanasa (1-30%). La composición puede comprender además una o más de los siguientes; A/-Acetilglucosaminidasa; quitinasa; ß(1,3)6-glucanasa; ß-Xilosidasa; a-Glucuronidasa; a-L- Arabinofuranosidasa; enzimas pectinolíticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa; actividad de modificación de almidón; otras hemicelulasas, incluyendo galactosidasas; oxidoreductasa/oxidasa y esterasas; y proteasa. La presente invención también proporciona un método para utilizar este sistema de enzimas en estrategias de control anti-fúngico, de biocontrol y de cieno en sectores ambientales, médicos y de la construcción (por ejemplo control de putrefacción en seco), y en la industria de la pulpa y papel (por ejemplo control de cieno).

Se proporciona además un sistema de enzimas que comprende CBH I (1-20%), CBH II (1-28%), ß( 1 ,3)4-glucanasa (15-40%), ß-glucosidasa (2-15%), Xilanasa (18-55%), ß-Xilosidasa (0.1-10%) y a-L-Arabinofuranosidasa (0.5-5.0%). La composición puede comprender además una o más de los siguientes; a-Glucuronidasa; actividad de modificación de almidón; otras hemicelulasas, incluyendo galactosidasas; oxidoreductasa/oxidasa y esterasas; proteasa; exoxilanasa; otras hidrolasas, incluyendo enzimas Pectinolíticas, ácido Fenólico y acetil(xilan)esterasas; Proteasa; y actividades de oxidasa que modifican Lignina. La presente invención también proporciona un método para utilizar este sistema de enzimas en aplicaciones hortícolas, por ejemplo producción de compuestos bioactivos, novedosos para la promoción de crecimiento y resistencia a enfermedades. Por ejemplo este sistema puede ser utilizado para liberar glucósidos flavonoides bioactivos, para la producción de oligogalacturonidas de materiales con alto contenido de pecina, xilogluco-oligosacáridos de xiloglucanos, galacto-oligosacáridos de galactanos, xilooligosacáridos sustituidos de xilanos de planta o 1,3-glucooligosacáridos (laminarioligosacáridos) de ß-glican de pared celular de hongos, o laminaran de algas, para la promoción de crecimiento en plantas, activación de mecanismos de respuesta de defensa de plantas contra patógenos de plantas e incrementar la resistencia a enfermedades, ya que algunos de estos oligosacáridos (por ejemplo, laminarioligosacáridos) pueden iniciar y transmitir las propiedades bioactivas que son anti-fúngicas, anti-bacterianas y anti-nematodo. La presente invención se refiere además a un sistema de enzimas que comprende CBH I (5-30%), CBH II (1-15%), ß(1 ,3)4-glucanasa (10-40%), ß-glucosidasa (2-15%), Xilanasa (18-48%), 0.1-20% ß-Xilosidasa, 1-10%, a-Glucuronidasa y 0.1-5.0 % a-L-Arabinofuranosidasa. La composición puede comprender además uno o más de los siguientes; Exoxilanasa; enzimas pectinolíticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa , exogalacturonasa y galactanasa; y actividad de modificación de almidón; otras hemicelulasas, incluyendo galactosidasas; óxidoreductasa/oxidasa y esterasas y proteasa. La presente invención también proporciona un método para utilizar este sistema de enzimas en producción de alimentos para animales para aumentar la capacidad de digestión y productos comestibles a base de cereales. Este sistema degrada los componentes de fibra de los productos comestibles a base de cereales a oligosacáridos y monosacáridos (azúcares simples), algunos de los cuales son absorbidos en el intestino y son metabolizados. El sistema también produce oligosacáridos "prebióticos" (por ejemplo, gluco-oligosacáridos de ligadura mezclada procedentes de cereales no-celulósicos y ß-glucanos) que refuerzan el crecimiento de las bacterias prebióticas, y pueden liberar los antioxidantes, por ejemplo, ácido ferúlico y producir oligosacáridos (glucurono-xilooligosacáridos sustituidos de xilanos de cereal) que tienen un efecto anti-bacteriano en especies de microflora de intestinos conocidos por producir moléculas carcinogénicas (por ejemplo, fenoles, aminas, etc.). Se proporciona además un sistema de enzimas que comprende CBH I (0.5-10%), CBH II (0.5-10%), ß(1,3)4-glucanasa (15-43%), ß-glucosidasa (2-10%), Xilanasa (30-88%), 0.1-2.0 % -Xilosidasa, 0.1-3.0 % a-Glucuronidasa, 0.1-4.0 % a-L-arabinofuranosidasa. La composición puede comprender además uno o más de los siguientes; enzimas pectinolíticas; actividad de modificación de almidón; óxidoreductasa/oxidasa y esterasas; y proteasa. La presente invención también proporciona un método para utilizar este sistema de enzimas en la producción de productos comestibles a base de cereal que contienen bajo contenido de pentosa para animales monogástricos con capacidad y digestión mejorada y bajos contenidos de ß-glican no celulósicos. Los ß-glucanos no celulósicos y arabinoxilanos de cereales tienen alta capacidad de enlace con agua y generan soluciones altamente viscosas. Los animales monogástricos (por ejemplo, cerdos y aves del corral) no tienen la capacidad de degradas estos carbohidratos, lo cual daña la captación y biodisponibilidad de nutrientes importantes, incrementa la difusión de enzimas digestivas, daña el mezclado adecuado de contenidos en el intestino y actúa como una barrera física para la degradación de proteína y almidón que se encuentra en estos ductos comestibles. En general, estos polisacáridos pueden conducir a características de desempeño de crecimiento deficientes. El sistema de enzimas en la presente invención puede catalizar la degradación de arabinoxilanos de cereal y ß-glucanos no celulósicos para producir oligosacáridos (DP3-10 principalmente), algunos de los cuales tienen propiedades probióticos potenciales, sin la liberación de azúcares de pentosa (arabinosa y xilosa), los cuales se metabolizan deficientemente en los animales monogástricos y pueden tener efectos anti-nutricionales. Por lo tanto la presente invención proporciona un método para utilizar cereales alternativos como productos comestibles, por ejemplo sorgo y maíz. La presente invención se refiere además a un sistema de enzimas que comprende CBH I (3-15%), CBH II (3- 15%), (1,3)4-glucanasa (25-45%), a-glucosidasa (2-15%), Xilanasa (18-55%), 0.5-7.0% ß-Xilosidasa, 0.5-10%, a-Glucuronidasa, y 0.1-5.0 % a-L-Arabinofuranosidasa. La composición puede comprender además uno o más de los siguientes; Exoxilanasa; enzimas pectinolíticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa; actividad de modificación de almidón; otras hemicelulasas, incluyendo galactosidasas; óxidoreductasa/oxidasa y esterasas; y proteasa. La presente invención también proporciona un método para utilizar este sistema de enzimas en la producción de productos comestibles funcionales con el potencial bioactivo para utilizarse en cuidados para la salud veterinarios y humanos. Este sistema puede producir oligosacáridos bioactivos de materiales sin procesar con un estado GRAS para utilizarse en el cuidado de la salud de animales (animales de compañía y animales grandes) incluyendo ß-gluco-oligosacáridos de inmunoestimulacion de plantas y hongos terrestres y marinos, xilo-oligosacáridos con propiedades prebióticas y antimicrobianas de plantas terrestres y marinas, quito-oligosacáridos con promoción de crecimiento, potencial antimicrobiano y anti-viral de crustáceos y paredes celulares de hongos, y compuestos fenólicos con potencial anti-oxidante. Se proporciona además un sistema de enzimas que comprende CBH I (1-15%), CBH II (1- 15%), ß(1 ,3)4-glucanasa (10-45%), a-glucosidasa (2-10%), Xilanasa (1-55%), 0.5-12% ß-Xilosidasa. La composición puede comprender además uno o más de los siguientes; a-Glucuronidasa, a-L-Arabinofuranosidasa; ß(1 ,3)6-glucanasa; N- Acetilglucosaminidasa; enzimas pectinolíticas de quitinasa, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa; actividad de modificación de almidón; otras hemicelulasas, incluyendo galactosidasas; óxidoreductasa/oxidasa y esterasas; proteasa. La presente invención también proporciona un método para utilizar este sistema de enzimas en la producción de productos lácteos y de dieta especializados, por ejemplo productos comestibles y formulaciones de bebida para el cuidado de la salud en las ramas geriátricas y pediátricas. Por ejemplo, este sistema se puede utilizar para producción de productos comestibles fácilmente digeribles, con alto contenido de prebióticos para nutrición pediátrica y de infantes, y también para la producción de productos libres de lactosa para individuos con galactosemia o quienes son intolerantes a la lactosa. La presente invención se refiere además a un sistema de enzimas que comprende CBH I (1-10%), CBH II (5-15%), ß(1 ,3)4-glucanasa (15-40%), ct-glucosidasa (2-30%), Xilanasa (15-55%), 1-12% ß-Xilosidasa, 1-8%, a-Glucuronidasa y 0.5-5.0 % a-L-Arabinofuranosidasa. La composición puede comprender además uno o más de los siguientes; enzimas pectinolíticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa; actividad de modificación de almidón; otras hemicelulasas, incluyendo galactosidasas; óxidoreductasa/oxidasa y esterasas; proteasa. La presente invención también proporciona un método para utilizar este sistema de enzimas en sectores de panadería y dulcería, y en la formulación de productos novedosos de panadería para el cuidado de la salud. Los sistemas de enzimas seleccionados son adecuados para utilización de cereales/materias primas novedosas tales como centeno, maíz y sorgo. El sistema de enzimas puede incrementar el volumen de las hojas y aumentar la vida en anaquel, modificando en forma selectiva los componentes de arabinoxilan de las harinas de cereales, generar oligosacáridos prebióticos e inmuno-estimuladores y efectuar la liberación de moléculas antioxidantes (por ejemplo ácidos ferúlico y coumárico) y modificar la textura, aroma y propiedades sensoriales de productos de panadería y dulcería. Se proporciona además un sistema de enzimas que comprende CBH I (1-20%), CBH II (1-40%), ß(1 ,3)4-glucanasa (15-45%), a-glucosidasa (2-30%), Xilanasa (10-55%), 0.5-10 % ß-Xilosidasa, 0.1-5 % a-L-Arabinofuranosidasa. La composición puede comprender además uno o más de los siguientes; ß(1 ,3)6-glucanasa; /V-Acetilglucosaminidasa; ct-glucuronidasa de quitinasa; enzimas pectinolíticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa; actividad de modificación de almidón; óxidoreductasa/oxidasa y esterasas; proteasa. La presente invención también proporciona un método para utilizar este sistema de enzimas en la generación de compuestos precursores de harina, aroma y sensoriales en la industria alimenticia, que liberan monosacáridos y disacáridos que pueden ser fermentados a una variedad de productos incluyendo ácido cítrico, vanilina, etc, liberación de glucoconjugados de sabor (precursores de aroma) de frutas/pulpas de fruta (por ejemplo, alcoholes aromáticos glucosilados que se encuentran en diversas frutas, incluyendo melón así como geranio, limones, etc), péptidos con sabores, sabores amargos y dulces, aminoácidos para transformación de edulcorante (por ejemplo fenilalanina) y moléculas fenólicas (ácidos cinámicos, glucósidos flavonoides tales como quercetin-3-O-ramnosida), que tienen propiedades de sabor, aroma o sensoriales o son precursores de dichos productos, por ejemplo ramnosa, los cuales pueden ser biotransformados a furaneol, un moléculas con sabor a fresa. Además, algunas de estas moléculas, tales como glucósidos flavonoides tienen actividad antioxidante y antimicrobiana (anti-protozoario). La presente invención se refiere además a un sistema de enzimas que comprende CBH I (1-15%), CBH II (1-15%), ß(1 ,3)4-glucanasa (10-45%), ß-glucosidasa (2-30%), Xilanasa (1-55%), 0.5-12% -Xilosidasa. La composición puede comprender además uno o más de los siguientes; a-L-Arabinofuranosidasa; ß(1 ,3)6-glucanasa; N- Acetilglucosaminidasa; a-Glucuronidasa de quitinasa; enzimas pectinolíticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactánasa; actividad de modificación de almidón; otras hemicelulasas, incluyendo galactosidasas; óxidoreductasa/oxidasa y esterasas; y proteasa. La presente invención también proporciona un método para utilizar este sistema de enzimas para la generación de productos funcionales, específicamente, la modificación de carbohidratos de plantas (terrestres y algunas marinas) para generar productos comestibles con propiedades de promoción de salud mejoradas, por ejemplo productos comestibles enriquecidos con gluco-oligosacáridos inmunoestimuladores, xilooligosacáridos, oligosacáridos de frijol soya, (arabino)galactooligosacáridos, (galacto) y/o (gluco)manooligosacáridos, gentiooligosacáridos, isomaltooligosacáridos y oligosacáridos de palatinosa, y promueve la liberación de moléculas antioxidantes tales como carotenoides y sustancias fenólicas (ácidos cinámico, catequinas y glucósidos flavonoides). Se proporciona además un sistema de enzimas que comprende CBH I (1-15%), CBH II (1-15%), ß(1 ,3)4-glucanasa (10-45%), ß-glucosidasa (1-15%), Xilanasa (1-30%), 0.5-20 %ß-Xilosidasa. La composición puede comprender además uno o más de los siguientes; a-L-Arabinofuranosidasa; ß(1,3)6-glucanasa; /V-Acetilglucosaminidasa; quitinasa; o- Gl ucuronidasa; enzimas pectinolíticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa; actividad de modificación de almidón; óxidoreductasa/oxidasa y esterasas; proteasa. La presente invención también proporciona un método para utilizar este sistema de enzimas para producción de bebidas novedosas diseñadas alcohólicas y no alcohólicas, jugos de fruta y bebidas saludables. Este sistema puede modificar ß-(1 ,3)4-glucanos, sustancias pectica, arabinanos, xilanos, lactosa, proteínas, y sustancias fenólicas para generar cervezas/cervezas doradas con alcohol y sin alcohol con bajo contenido de calorías, jugos de frutas y bebidas saludables con potencial sensorial, antioxidante, de refuerzo inmune, anti-bacteriano y anti-viral mejorados, por ejemplo una cerveza "ligera" con bajo contenido de ß-glican residual para evitar la formación de bruma (aunque ß-glican suficiente para proporcionar características de sensación en la boca) que contienen glucooligosacáridos ligados con bioactivos mezclados y ácidos cinámico (antioxidantes), o un jugo de fruta con alto contenido de fragmentos en pectina (oligosacáridos), que tienen un efecto prebiótico, y ácidos cinámico y glucósidos flavonoides seleccionados que proporcionan potencial antioxidante. La presente invención proporciona una composición de enzimas CBH I (1-25%), CBH II (1-28%), ß(1 ,3)4-glucanasa (18-40%), ß-glucosidasa (2-30%), Xilanasa (15-55%), y ß-Xilosidasa (0.7-20%). La composición puede comprender además uno o más de los siguientes; a-Glucuronidasa (1-10%), a-L-Arabinofuranosidasa (0.1-5.0%), 1-15% exoxilanasa, 5-25%: enzimas pectinolíticas, 2-12% actividad de modificación de almidón, 2-11% hemicelulasas, óxidoreductasas/oxidasa y esterasas 1-15% y proteasa 2-15%. La composición se puede utilizar en la producción de materias primas con alto contenido de monosacáridos de residuos de plantas. La presente invención proporciona una composición de enzimas que comprende CBH I (12-55%), CBH II (15-30%), ß(1 ,3)4-glucanasa (12-26%), ß-glucosidasa (5-12%), Xilanasa (5-30%), ß-Xilosidasa (0.1-10%) y a-L-Arabinofuranosidasa (0.5-3.0%). La composición puede comprender además uno o más de los siguientes; a-Glucuronidasa, otras hidrolasas incluyendo enzimas pectinolíticas, ácido fenólico y acetil(xilan)esterasas, proteasa y actividades de oxidasa de modificación de lignina, proteasas y oxidasas. La composición se puede utilizar en el procesamiento y reciclado de madera, productos de papel y papel. La presente invención proporciona una composición de enzimas que comprende CBH I (3-15%), CBH II (3-15%), ß(1 ,3)4-glucanasa (15-45%), ß-glucosidasa (i-15%), Xilanasa (16-55%), y ß-Xilosidasa (0.5-7%). La composición puede comprender además uno o más de los siguientes; a-Glucuronidasa, a-L-Arabinofuranosidasa, exoxilanasa, enzimas pectinolíticas, enzimas con actividad de modificación de almidón, hemicelulasas, óxidoreductasas/oxidasa y esterasas y proteasas. La composición se puede utilizar en la producción de biofarmacéuticos, tales como oligosacáridos bioactivos (incluyedo 1,3(4) y 1 ,3(6)-glucooligo-sacáridos de ligadura mezclada, xiloglucooligosacáridos de galactooligosacáridos, oligosacáridos pécticos, xilooligosacáridos ramificados y lineales, (galacto)glucomannooligosacáridos), glucopéptidos y glucósidos flavonoides de plantas terrestres y marinas, residuos de plantas, hongos y corrientes de desecho o subproductos con alto contenido de azúcares simple. La presente invención se refiere además a una composición de enzimas que comprende CBH I (1-20%), CBH II (1-40%), ß(1 ,3)4-glucanasa (15-45%), ß-glucosidasa (2-12%), Xilanasa (1-35%), y ß-Xilosidasa (1-5%). La composición de enzimas puede comprender además uno o más de los siguientes; a-Glucuronidasa, a-L-Arabinofuranosidasa, exoxilanasa, enzimas pectinolíticas, actividad de modificación de almidón, hemicelulasas, óxidoreductasas/oxidasa y esterasas y proteasas. La composición se puede utilizar para incrementar la biodisponibilidad de biomoléculas con actividad anti-bacterial y anti-viral natural, incluyendo glucósidos flavonoides y cianogénicos, saponinas, oligosacáridos y fenólicos (incluyendo ácidos ferúlico y p-coumárico, epicatequina, catequina, ácido pirogálico y similares). La presente invención se refiere además a una composición de enzimas que comprende CBH I (3-15%), CBH II (3-15%), ß(1 ,3)4-glucanasa (25-45%), ß-glucosidasa (2-15%), Xilanasa (10-30%), y ß-Xilosidasa (0.5-8%). La composición de enzimas puede comprender además uno o más de los siguientes; a-Glucuronidasa, a-L-Arabinofuranosidasa, exoxilanasa, enzimas pectinolíticas, actividad de modificación de almidón, hemicelulasas, óxidoreductasas/oxidasa y esterasas y proteasa. La composición se puede ser utilizada para incrementar la biodisponibilidad de biomoléculas antioxidantes natuarles, por ejemplo, carotenoides, licopenos, xantofils, antocianinsa, fenólicos y glucósidos todas de materiales, residuos, desechos de plantas incluyendo varias frutas y productos de cerveza. La presente invención se refiere además a una composición de enzimas que comprende CBH I (1-25%), CBH II (1-40%), ß(1 ,3)4-glucanasa (15-40%), ß-glucosidasa (2-15%), Xilanasa (18-35%), y ß-Xilosidasa (0.5-12%). La composición de enzimas puede comprender además uno o más de los siguientes; a-Glucuronidasa, a-L-Arabinofuranosidasa, enzimas pectinolíticas, actividad de modificación de almidón, hemicelulasas, óxidoreductasas/oxidasa y esterasas y proteasa. La composición se puede utilizar para la generación de materias primas de materiales de plantas sin procesar, residuos de plantas y desechos para utilizarse en producción microbiana de antibióticos mediante hongos y bacterias, incluyendo Penicillium sp, y Streptomyces sp. La presente invención se refiere además a una composición de enzimas que comprende CBH I (1-30%), CBH II (1-40%), ß(1 ,3)4-glucanasa (15-40%), ß-glucosidasa (2-15%), Xilanasa (18-35%), y ß-Xilosidasa (0.5-8%). La composición de enzimas puede comprender además una o más de los siguientes; a-Glucuronidasa, a-L-Arabinofuranosidasa, enzimas pectinolíticas, actividad de modificación de almidón, hemicelulasas, óxidoreductasas/oxidasa y esterasas, exoxilanasa y proteasas. La composición se puede utilizar en la generación de materias primas de materiales de plantas sin procesar, residuos de plantas y desechos para utilizarse en producción microbiana de ácido cítrico. La presente invención se refiere además a una composición de enzimas que comprende CBH I (2-15%), CBH II (2-15%), ß(1 ,3)4-glucanasa (20-45%), ß-glucosidasa (2-25%), Xilanasa (1-30%), y ß-Xilosidasa (0.5-8 %). La composición de enzimas puede comprender además una o más de los siguientes; a-Glucuronidasa, a-L-Arabinofuranosidasa, enzimas pectinolíticas, actividad de modificación de almidón, hemicelulasas, óxidoreductasas/oxidasa y esterasas, exoxilanasa y proteasas. La composición se puede utilizar en la producción de oligosacáridos de polisacáridos de algas (por ejemplo, laminaran y fucoidan) y aditivos derivados de extractos de plantas, los cuales son generalmente considerados procesos seguros, en la formulación de cosméticos. La presente invención se refiere además a una composición de enzimas que comprende CBH I (3-30%), CBH II (1-10%), ß(1 ,3)4-glucanasa (10-45%), ß-glucosidasa (2-12%), Xilanasa (1-48%), y ß-Xilosidasa (0.1-8%). La composición de enzimas puede comprender además uno o más de los siguientes; a-Glucuronidasa, a-L-Arabinofuranosidasa, enzimas pectinolíticas, actividad de modificación de almidón, hemicelulasas, óxidoreductasas/oxidasa y esterasas, exoxilanasa y proteasas. La composición se puede utilizar en la producción de oligosacáridos y glucopéptidos para utilizarse como reactivos de investigación, en la producción de biosensores y como herramientas en glucómicos funcionales para probar interacciones de receptor-ligando y en la producción de bibliotecas de substrato para perfilar la especificidad de enzima-substrato. La presente invención se refiere además a una composición de enzimas que comprende CBH I (5-15%), CBH II (5-30%), ß(1 ,3)4-glucanasa (20-45%), ß-glucosidasa (1-12%), Xilanasa (10-30%), y ß-Xilosidasa (0.5-8%). La composición de enzimas puede comprender además una o más de los siguientes; a-Glucuronidasa, a-L-Arabinofuranosidasa, enzimas pectinolíticas, enzimas con actividad de modificación de almidón, hemicelulasas, óxidoreductasas/oxidasa y esterasas, y proteasas. La composición se puede utilizar para la producción de celulosa modificada y ß-glucanos, celooligosacáridos, almidones modificados y maltooligosacáridos, lactulosa y polioles (por ejemplo, manitol, glucitol o dulcitol, xilitol, arabitol). La presente invención proporciona el uso de un substrato producido a través de cualquiera de los métodos anteriores como una materia prima en la producción de biocombustible, y bioetanol o biogas, tal como metano o dióxido de carbono, siempre que se produzca a través de dicho proceso. La ventaja de utilizar este sistema de enzimas para producir bioetanol o biogas, es que este es un método efectivo en costo para producir un producto valioso el cual puede ser utilizado en muchas industrias, de productos de desecho de poco valor. Al mismo tiempo que se produce un producto valioso, existe una reducción en el desecho lo cual a su vez tiene un impacto ambiental positivo. Todos los métodos descritos anteriormente, se pueden llevar a cabo con las composiciones de enzimas aquí definidas, o con las cepas microbianas aquí descritas. La presente invención también proporciona composiciones de enzimas y métodos para utilizarlas que comprenden además enzimas derivadas de otras especies fúngicas que incluyen Chaetomium thermophile y Thermoascus aurantiacus. Preferentemente, la cepa de microorganismos se selecciona del grupo que consiste en uno o más de Talaromyces emersonii, Chaetomium thermophile y Thermoascus aurantiacus. Preferentemente en forma adicional la cepa de microorganismo es Talaromyces emersonii IM 393751 o un mutante del mismo que también tiene la capacidad de producir enzimas con la capacidad de actividad en temperaturas en o arriba de 55°C. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para obtener un sistema de enzimas adecuado para convertir un substrato objetivo, en donde el método comprende: obtener una muestra del substrato objetivo; permitir que un inóculo de una cepa de microorganismo crezca en el substrato objetivo y secrete enzimas; recuperar las enzimas secretadas durante el crecimiento de un substrato objetivo; determinar actividades de enzimas y propiedades de enzimas; construir un perfil de expresión genética; identificar proteínas de enzimas y construir un perfil de expresión de proteína, comparar la expresión de gen con el perfil de expresión de proteína, purificar las enzimas. Las enzimas pueden ser almacenadas posteriormente. El método puede comprender además analizar las enzimas; y/o diseñar un sistema de enzimas. Breve Descripción de los Dibujos La presente invención será comprendida de manera más clara a partir de la descripción de una modalidad de la misma que se encuentra más adelante, proporcionada únicamente a manera de ejemplo con referencia a los dibujos que la acompañan, los cuales: La figura 1, es el perfil de un proceso de un método para diseñar un sistema de enzimas adecuado para convertir un substrato objetivo. La figura 2, es la generación de una materia prima con alto contenido de azúcar para la producción de biocombustible mediante tratamiento de termoenzimas de pulpa/puré de manzana. La figura 3, es un cromatograma de capa delgada de los productos generados durante hidrólisis de vasos de papel. La figura 4, es un microscopio de electrones de vasos de papel antes (0 h) y después (24 h) de tratamiento con el cocktail de enzimas inducido con un vaso de papel con Talaromyces emersonii que demuestra la hidrólisis extensa del substrato objetivo. Las figuras 5A a 5D, son una comparación de la producción de xilanasa mediante la cepa 393751 y CBS 549.92 tipo natural (principalmente CBS 814.70). Las figuras 6A a 6E, son una comparación de la producción de glucanasa y (galacto)mananasa mediante la cepa 393751 y la cepa CBS 549.92 tipo natural. La figura 7, es una reducción de volumen de desecho clínico esterilizado con alto contenido de celulosa catalizado por 10 cocktails de enzimas a una temperatura de 50°C después de 24 horas. La figura 8, es una reducción de volumen del desecho clínico con alto contenido de celulosa esterilizado con STG catalizado por los 10 cocktails de enzimas a una temperatura de 70°C después de 24 horas. Las figuras 9A a 9B, son desecho con alto contenido de glucosa (A) no tratado, y desecho tratado en forma enzimática (B). Las figuras 10A y 10B, son la producción de etanol mediante S. cerevisiae en hidrolizados obtenidos mediante tratamiento de desecho clínico esterilizado con alto contenido de celulosa a una temperatura de 70°c durante 24 horas (605 de humedad) con cocktail 5 (A) y cocktail 8 (B). La figura 111 A , es el efecto del pH en la actividad de celulasa en los cocktails T. emersonii . La figura 11B, es el efecto del pH en la actividad de xilanasa en los cocktails T. emersonii. La figura 12, es el efecto de la temperatura en la actividad de celulasa en los cocktails T. emersonii. La figura 13, es el efecto de temperatura en la actividad de xilanasa en los cocktails T. emersonii . La figura 14, es la actividad de la xilanasa novedosa purificada contra diferentes xilanos, OSX, Xilan de Especie de Trigo de Avena, WSX, xilan paja de trigo, LWX, xilan de madera concava, BWX, xilan madera dea beudl, RM, Rhodymenan (alga roja 1 ,3; 1 ,4-p-D-xilan). La actividad se expresa como un % relativo al Xilan de Especie de Trigo de Avena (100%). Las figuras 15A a 15B, son la actividad de (A) Xyn IV y (B) Xyn VI purificados contra diferentes xilanos. La actividad se expresa como un % relativo a Xilan de Especie de Trigo de Avena (100%). Las figuras 15C a 15D, son la actividad de (C) Xyn VII y (D) Xyn VIII purificados contra diferentes xilanos. La actividad se expresa con un % relativo con Xilan de Especie de Trigo de Avena (100%). Las figuras 15E a 15F, son la actividad de (E) Xyn IX y (F) Xyn X purificados contra diferentes xilanos. La actividad es expresada como un % relativo de Xilan de Especie de Trigo de Avena (100%). La figura 15G, es la actividad de Xyn XI purifivado contra diferentes xilanos. La actividad es expresada como un % relativo de Xilan de Especie de Trigo de Avena (100%). La figura 16, es un % de Actividad Relativa de Xyn XII purificado contra una variedad de polisacáridos purificados. OSX, Xilan de Especie de Trigo de Avena; BBG, ß-glican de Centeno; LIC, Liquenan; CMC, Carboximetilcelulosa; LAM, Laminarina; D1, Dextrano; D2, Dextrina; INU, Inulina; ARA, Arabinan; GAL L, Galactano (Lupin); GAL P, Galactano (Papa); RG, Ramnogalacturonan; LWAG, arabino-galactan de madera cóncava. La figura 17, es la actividad específica de Xyn XII purificado contra ß-xilosidas de arilo y ß-glucósidos de arilo. La figura 18, es una comparación de las actividades específicas de xilanasas seleccionadas expresadas mediante IMI393751 y CBS549.92 contra OSX como un substrato de ensayo. Descripción Detallada de la Invención Haciendo referencia a la figura 1, se proporciona un perfil de proceso para diseñar un sistema de enzimas para convertir un substrato objetivo. En el paso 1, el substrato objetivo es obtenido. En el paso 2 el substrato objetivo es inoculado con el microorganismo el cual es cultivado en el substrato objetivo para proporcionar un cultivo. El microorganismo secreta enzimas y estas enzimas son recuperadas en el paso 3, obteniendo muestras del cultivo. Las muestras de cultivo se separan en una fracción celular y filtrados de cultivo en el paso 4. La fracción celular (mRNA) es analizada en el paso 5, para determinar las actividades y propiedades de enzimas. En el paso 6, el perfil de expresión genética se construye con base en el análisis del paso 5. En el paso 7, el filtrado de cultivo se clasifica con respecto a la actividad de proteína y se construye un perfil de expresión de proteína en el paso 8. En el paso 9, los perfiles de expresión de gen y proteínas son comparados. En el paso 10 las enzimas son purificadas. Las enzimas se pueden almacenar en el paso 11 y en el paso 12 las enzimas pueden ser analizadas en forma adicional y se diseña un sistema de enzimas en el paso 13. Se ha descubierto que cuando se utilizan hongos como el microorganismo, se obtienen mejores resultados cuando el substrato es inoculado con la micelia del hongo. Este cultivo se lleva a cabo preferentemente en un fermentador y las condiciones de reacción variarán dependiendo del tipo de microorganismo y substrato utilizados. El cultivo puede ser ya sea en la forma de fermentación en estado líquido o sólido. Para Talaromyces emersonii, se prefiere una temperatura de cultivo dentro del rango de 45° a 65°, siendo las enzimas óptimamente activas a una temperatura de 85-90°C. Las enzimas son recuperadas del substrato objetivo mediante separación de biomasa celular (hongo) de filtrado de cultivo celular, utilizando centrifugación en el caso de enzimas producidas mediante fermentación líquida, o con la ayuda de un sistema de separación de células para cultivos más grandes. Las enzimas se recuperan posteriormente de la fracción de biomasa celular mediante homogeinizacion de un peso conocido de la biomasa en dos volúmenes de amortiguador. Los amortiguadores adecuados incluyen acetato de amonio 50 mM, pH 4.5-6.0 o fosfato de sodio 50 mM, pH 7.0-8.0. Para la extracción de enzimas para cultivos de estado sólido, los cultivos se mezclan con 10 volúmenes de amortiguador de fosfato de citrato 100 mM, pH 5.0 que contiene 0.01% (v/v) Tween 80, homogeinizado y extractado agitando durante 2 horas en 140 rpm a temperatura ambiente. Posteriormente se recupera mediante centrifugación con alto contenido de enzimas.

Es esencial que se lleve a cabo una comparación del sistema de enzimas en niveles tanto del genoma como de preotoma, es decir, los genes, productos de expresión (mARN) y proteínas identificadas son comparadas. Esto se debe al hecho de que puede haber información genética que es expresada en el nivel de mARN, aunque no se traduce a proteínas funcionales en el nivel de proteína. Son importantes los análisis transcriptómicos, genómicos y proteómicos para determinar la abundancia relativa de ciertas enzimas. Un aislado de la cepa de hongo filamentoso, del cual algunas de las enzimas de la presente invención han sido aisladas ha sido depositado en el International Mycological Institute (IMI) (CABI Bioscience UK), Bakeham Lañe, Englefíeld Green, Egham, Surrey TW20 9TY, Reino unido para los propósitos de procedimientos de patente el 22 de noviembre del 2008-depósito No. IMI 393751. Después de la purificación de las enzimas pueden ser almacenadas opcionalmente o analizadas directamente para obtener (a) información detallada con respecto a la termoestabilidad/actividad térmica individual en las propiedades catalíticas y funcionales generales, (b) información detalla con respecto a su modo de acción y potencial catalítico, individualmente o en combinación, (c) información con respecto a interacciones sinérgicas, (d) información de secuencia parcial que pueda ayudar a clonar los genes, y (e) en algunos casos para obtener suficiente proteína para facilitar la recolección de los datos estructurales 3-D. El análisis de estas enzimas se explota posteriormente para identificar sistemas de enzimas clave u óptimos tiempos de cosecha para estos sistemas. Los sistemas pueden ser optimizados con respecto a niveles de actividades clave y combinaciones de enzimas clave, características y condiciones de desempeño (en escala de laboratorio) para aplicaciones objetivo. Ejemplo 1. Aislamiento de T. emersonii IMI393751 Se colocaron cortes de hierva limpia (césped) recientemente recolectada (-200 g) y otra biomasa de plantas mezclada en un contenedor cerrado para estimular un ambiente de generación de compuestos, se incubó en una cámara de temperatura constante, una temperatura de 65°C, durante aproximadamente 2 horas (pasteurización y equilibrio del substrato combinado). Se mantuvo el contenido de humedad/humidificación en -65-70%. El contenedor se adaptó con una línea que proporciona en intervalos aire filtrado, con baja pulsación de humedad. Después de 2 horas, se utilizó una suspensión de esporas (1 x 108 esporas en 2% de agua estéril) de T. emersonii (reservas de laboratorio de un aislado de 12 años de edad, originalmente de CBS814.70) para inocular la región central de la biomasa. La temperatura de mantuvo en 65°C durante 2 días, e incrementó en intervalos de 2°C cada 24 horas hasta que se alcanzó internamente en la cámara una temperatura en el aire de 70°C. El cultivo se creció durante 7 días adicionales antes de que se eliminará en forma aséptica una muestra del "punto caliente" o región central inoculada y se transfirió a placas de agar (medio de agar se Emerson para hongos termof ílicos) y se sub-cultivo para asegurar la pureza del cultivo; la pureza se revisó en forma cruzada mediante análisis microscópico. El medio líquido que contiene nutrientes básicos (Tuohy y asociados, 1992; Moloney y asociados, 1983) y 2% (p/v) de glucosa se inocularon con piezas de 1 cm2 de estera micelial de cultivos en placas de agar con 36 horas de antigüedad. Los cultivos líquidos se crecieron a una temperatura de 55°C durante 36 horas en frascos Erlenmeyer de 250 mi (que contienen 100 mi de medio de crecimiento), con agitación en 220 rpm. Se eliminaron las alícuotas (2.0 mi) de suspensions miceleales después de 36 horas, se lavaron en forma séptica con agua estéril, se transfirieron a platos de Petri estériles (diámetro 10 mm) y se irradiaron con luz UV durante intervalos programados (10-60 s). El medio de agar estéril (agar noble que contiene 0.2% p/v de represores de catabolitos individuales, tales como 2-desoxiglucosa) se inocularon con muestras del micelio de hongo irradiado. Se incubaron cultivos de replica a una temperatura de 45 y 58°C. Se seleccionaron cuidadosamente colonias simples (aparición de pelusa blanca), se transfirieron en forma aséptica a placas de agar con dextrosa de Sabouraud y se purificaron en forma adicional mediante varias transferencias. La cepa IMI 393751 representa un aislado tomado de las placas incubadas a una temperatura de 58°C. El muíante se evaluó en un estudio comparativo con el organismo de origen, para estabilidad térmica y producción de enzimas mejorada, lo cual reveló claras diferencias entre ambas cepas, en términos de apariencia de cultivo, capacidad de esporular (cepa IMI 39375 sin espora), termofilicidad y estabilidad, patrones de producción de enzimas bajo condiciones de crecimiento idénticas, expresión diferencial y niveles de actividades de enzimas individuales. Diferencias f isiológicas/micológicas entre CBS 814.70 y IMI393751 Apariencia de cultivo durante crecimiento en medio de agar diferente - cuando se cultiva en CBS 814.70 de agar de Emerson se tienen las características típicas de esta especie (Stolk & Samson, 1972), es decir color pálido, cremoso/amarillo crema, con sombras amarillentas pálidas cerca de la superficie del agar (alrededor de la zona de inoculación), lo cual se vuelve de un color amarillo crema oscuro profundo/café rojizo conforme madura el cultivo, y consiste en una estera micelial densa de muchos ascomatos. En contraste, IMI393751 es mucho más blanco y el cultivo tiene una apariencia muy "esponjosa". Diferencias con respecto a esporulación - CBS 814.70 es una cepa esporulante de T. emersonii que produce conidioforas, asci y ascosporos. Los conidioforas parecen como ramificaciones perpendiculares en tejido reticulado de hongos (amarillo pálido de color y septeto). Los asci, o esporas que contienen sacs son un tanto elipsoidales en forma, y con frecuencia se pueden encontrar en cadenas; las ascoporas son lisas y de forma elíptica (apariencia verde en una micrográfica de electrones). En contraste, la micelia IMB 93751 produce muy pocas conidioforas, asci y ascosporas clásicas. En un contraste total con CBS814.70, IMI393751 únicamente produce un número insignificantes de esporas bajo condiciones extremas y muy específicas en tanto que la cepa CBS 814.70 produce esporas en diferentes medios diferentes. Diferencias con Respecto a Termof ilicidad y Rango de Temperatura de Crecimiento Optimo CBS 814.70 tiene un rango de crecimiento estricto a temperatura de 35 a 55°C, con un crecimiento deficiente a temperaturas más bajas o más altas y un rango de crecimiento óptimo a una temperatura de 40 a 45°C. Por otra parte IMI393751, exhibe un rango de temperatura de crecimiento más amplio de 30 a 65°C, con buen crecimiento a una temperatura de 80°C, 85°C y hasta 90°C, con un crecimiento óptimo entre 48 a 55°C. IMI393751 crece muy bien a una temperatura >55°C y continúa produciendo altos niveles de biomasa fúngica (micelia) y secreta en forma activa cantidades significativas de varias proteínas.

Diferencias con respecto a crecimiento con valores de pH superiores - CBS 814.70 no crece bien (de hecho comienza a morir) en valores de pH arriba de 6-6.5 (datos previos Tuohy & Coughlan, 1992), en tanto que IMI393751 crece bien y secreta niveles sustanciales de enzimas en valores de pH de hasta 9.0. Crecimiento bajo condiciones con nutrientes limitados/agotados. IMI393751 sobrevive bien en cultivos con nutrientes agotados durante hasta 55 días, en tanto que CBS 814.70 pasa por autólisis de los 7 días y permanece después de 15 días algunas micelias/células sobrevivientes. Las micelias recolectadas de cultivos líquidos con nutriente agotado de 55 días de antigüedad de IMI393751, pueden ser resucitadas mediante una transferencia a medio de agar de dextrosa Sabouraud en tanto que los remanentes miceliales de la cepa CBS814.70 (55 días de antigüedad) pueden no ser revividos a través del mismo método. Ejemplo 2: un sistema de enzimas de Talaromyces emersonii para convertir materiales hemicelulósicos. La hidrólisis completa de xilan requiera la acción sinérgica de xilanasas, ß-xilosidasa, a-glucuronidasa, a-L-arabinofuranosidasa y esterasas. La tabla 1, proporciona un ejemplo de substratos objetivos seleccionados (incluyendo desechos/residuos) y el porcentaje de inducción de la fuente de carbono utilizado en este ejemplo. El porcentaje de inducción se refiere al peso de la fuente de carbono por volumen de medio (g/100mls).

Tabla 1. Substratos de crecimiento/fuentes de carbono nducción para producción de enzimas a través de emersonii Fuente de carbono Abreviatura % de ¡nducción fuente de carbono Xilan de madera de haya BEX 1.0 Xilan de madera de abedul BWX 1.0 Xilan de especie de trigo de avena OSX 1.0 Xilan de madera cóncava LWX 0.3 Arabinoxilan de trigo WAX 1.0 Recortes de abetos SS 2.0-6.0 Material de empaque PK 0.5-6.0 Paja de cereal CS 1.0-2.0 Vasos de papel PC 2.0-6.0 Papel blanco de oficina WOP 2.0-6.0 Hojas de té TL 2.0-4.0 Metil xilosa MEX 0.2 Xilosa Xyl 1 Ácido glucurónico GlcA 1 Floculo de solea SF Glucosa Glc ? Incluido con propósitos de comparación Con base en los resultados obtenidos, se diseño un sistema de enzimas utilizando enzimas purificadas de Talaromyces emersonii para la degradación de un producto, residuo desecho derivado de madera con alto contenido de hemicelulosa (xilan) o xilan. Las cantidades relativas de las enzimas clave presentes en el sistema de enzimas se tabulan en la tabla 2. Tabla 2. Sistema para degradación de un producto de madera con alto contenido de celulosa o xilan ENZIMA* % REQUERIDO Xilanasa 10-50% Exoxilanasa 4.0 - 25.0% B-Xilosidasa 0.1 - 5.0% a-Glucuronidasa 0.2 - 4.0% a-L-Arabinofuranosidasa 0.1 - 5.0% Actividades de modificación de biopolímero no esencial (por ejemplo celulasa, ß- 25 - 50% glicanasa no celulolítica, actividades pectinolítica, actividades mananolitica, estearasa de acetil(xilan), óxidoreductasa, proteasa) Las cantidades relativas de las actividades del núcleo, el perfil y las cantidades relativas de las actividades no esenciales variarán dependiendo de la composición del substrato objetivo. La tabla 3 señala sistemas de enzimas procedentes de Talaromyces emersonii que han sido diseñados para aplicaciones específicas. Tabla 3. Sistemas de enzima específica adecuada para la degradación de oligosacáridos de residuos de xilanos de madera, periódico y residuos de madera.

? Niveles de xilanasa de midieron con diferentes xilanos de modelos diferentes como substratos *LWX, glucuronoarabinoxilan de madera cóncava "Niveles de xilanasa: 45.2 lU/ml (753.5 nkat/ml), 40.9 lU/ml (681.8 nkat/ml) y 27.5 lU/ml (458.4 nkat/ml) con xilan de madera cóncava, xilan de madera de abedul, y xilan de especie de trigo de avena como substratos de ensayo, respectivamente; al momento de la recolección - en donde nkat = nanokatales (16.67 lU/ml) sDependiendo del grado del periódico, es decir, con color versus blanco y negro, pulido versus acabado rugoso/reciclado, etc. %Celulosa, 40 - 55% y Hemicelulosa, 25-40% como los tipos principales de carbohidratos presentes. AA%Conversión de substrato de madera suave (no molida y fracciones molidas rigurosamente, no tratadas y tratadas previamente con ácido diluido). El % de conversión total se puede incrementar (hasta el 74%) utilizando este sistema de enzimas en una combinación con otros sistemas de enzimas de Talaromyces emersonii o Chaetomium thermophile, o aplicación de actividades de enzima clave mediante adición de enzimas recombinantes.

Ejemplo 3: Sistema de Talaromyces emersonii para convertir cereales, pulpa de betabel y otros materiales (incluyendo desechos) con alto contenido en arabinoxilanos y hemicelulosas acetiladas. La tabla 4 proporciona cantidades relativas de diferentes actividades enzimáticas en sistemas de enzimas diseñados de las tierras de Talaromyces emersonii IMI 39375, dos cepas mutantes identificadas previamente diseñadas para conversión de cereales, pulpa de betabel y otros materiales (incluyendo desechos) con alto contenido de arabinoxilanos y hemicelulosas acetiladas. Tabla 4. Actividades de enzima de sistemas para conversión de materiales con alto contenido de arabinooxilanos y hemicelulosas acetiladas Preparación/composición T. emersonii T. emersonii T. emersonii T. emersonii de enzimas (IMI 393751; 1:1 (IMI 393751; (TC2 mutante; (TC5 mutante; WB/BP como polvo Carob WB como hojas de té inductor) como inductor inductor) como inductor) Perfil de Perfil de Perfil de Perfil de actividad de actividad de actividad de actividad de enzimas (%) enzimas (%) enzimas (%) enzimas (%) Xilanasa 20 - 30% 15-25% 35 - 50% 12-20% Exoxilasa 5- 10% 2 - 5% 10-15% 2 - 8% B-Xilosidasa 0.5 - 2.0% 0.2-1.5% 0.5-1.5% 0.1 - 1.0% a-Glucuron¡dasa 0.5 - 2.0 % 0.2-1.5% 0.2-1.5% 0.2-1.5% a-L-Arabinofuranosidasa 0.5 - 2.0% 0.2 - 2.0% 0.2-1.2% 0.1 - 1.5% Enzimas de modificación de 30 - 45% 32 - 50% 20 - 35% 25 - 60% biopolímero que incluyen esterasa de acetilo y esterasa de xilan de acetilo Ejemplo 4: Sistemas de Talaromyces emersonii para conversión de materiales no celulósicos, tales como hojas de té y polvo carob. Las caracterización de tres endoglucanasas novedosas (EG)), las cuales son importantes tanto para modificación y degradación selectiva de una variedad de residuos de cereal, incluyendo candidatos potenciales para materias primas de producción de cerveza y animales tales como sorgo, maíz, y centeno. Estas tres enzimas han sido purificadas de Talaromyces emersonii IMI393751. El contenido de carbohidratos totales de preparación de enzimas purificadas se determinó a través del método de fenol-ácido sulfúrico (Dubois y asociados) a través de la referencia a curvas estándar de glucosa o mañosa (20-100 pg.mL"1). Técnicas de Separación de Proteína, se requirió filtración se gel Secuencial, intercambio de iones, interacción hidrofóbica y cromatografías de afinidad de lectina y cromatoenfoques (pseudo intercambio de iones) para obtener preparaciones altamente purificadas de EG V, EG VI y EG VII. Se llevó a cabo electroforesis de gel sin desnaturalización y enfoque isoeléctrico seguido de manchado con azul coomassie a través de la metodología estándar conocida para un experto en la técnica y se proporcionan las referencias relevantes (por ejemplo, Murray y asociados, 2001; Tuohy & Coughlan, 1992, Tuohy y asociados, 2002; Maloney y asociados, 2004). Los experimentos iniciales revelaron que los valores pl de EG V-VII fueron de <pH 3.5. Por consiguiente, el cromatoenfoque en PBE 94, equilibrado previamente con 0.025 M piperazina-HCI, pH 3.5, se utilizo para determinar los valores pl precisos para EG V-VII. El pH que corresponde al pico de elución de ß-glucanasa se determinó como el pl. Las diferencias de unidades 0.01 pH pueden ser detectadas produciendo de esta forma valores pl precisos de cada enzima. pH y Temperatura y Estabilidades Optimas. Los valores de pH óptimo se determinaron monitoreando la actividad de enzimas en valores pH entre 2.5 y 9.0, a una temperatura de 50°C, en un amortiguador de fosfato de citrato con resistencia iónica constante. Para evaluar los efectos del pH en la actividad de EG V-VII, se incubaron muestras purificadas de cada enzima en un pH de 4.0, 5.0 y 6.0 a una temperatura de 50°C. Las alícuotas se eliminaron después de 0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48 y hasta 336 horas (14 d), se diluyó en forma adecuada en amortiguador 100 mM NaOAc, pH 5.0 (pH de ensayo normal) y se ensayaron para la actividad residual de acuerdo con el método de ensayo estándar. La estabilidad de cada enzima purificada se investigó a temperatures de 50°C, 60°C, 70°C y 80°C, en la ausencia del substrato. EG V-VII fueron proteínas no modulares ya que ninguna de las tres enzimas absorbió celulosa (u otros carbohidratos insolubles, es decir no contienen enlace de carbohidrato). La especificidad del substrato en varios polisacáridos y glucósidos sintéticos se evaluó midiendo la actividad contra una amplia variedad de carbohidratos (BBG, liquenan, CMC, otros polisacáridos y glucósidos sintéticos) utilizando un procedimiento de ensayo de ß-glucanasa normal. Efecto de Iones de Metal, Reactivos de Modificación Química e Inhibidores Potenciales. Se investigó un rango de iones de metal monovalentes, divalentes y pesados, en concentraciones de ensayo finales de 1.0 mM, se investigaron con respecto a sus efectos potenciales en las actividades EG V, EG VI y EG VII, incubando las enzimas con químicos y posteriormente conduciendo en ensayo de enzimas normal. Finalmente, los efectos inhibidores de glucósidos, tales como disacáridos, lactonas y glucósidos flavonoides en las enzimas purificadas, fueron revisados. Las concentraciones especificadas de cada glucósido se incluyeron en los cocktails de ensayo normal y la actividad residual se determinó mediante comparación con controles (sin glucósido presente). Un resumen de la purificación de EG V, EG VI y EG VII, y los parámetros de purificación tal como rendimiento (%) se proporciona en la tabla 5. en o en en Tabla 5. Resumen de purificación de enzimas de endoglucanasa de Talaromyces emersonii Paso de purificación Actividad Proteína total Actividad Factor de Rendimiento total (IU) (mg) específica purificación (lU.mg-1) (x-veces) Extracto crudo 54,806.2 573.1 95.6 1.00 100.00 Ultrafiltración (Amicon DC2) 50,613.4 452.2 111.9 1.17 92.30 Propan-2-ol pptn. 50,016.9 364.8 137.4 1.44 91.30 Intercambio de aniones (DE-52, pH 5.5) 25,064.7 240.1 104.4 1.10 45.70 Sefarosa de fenilo CL-4B Pico 1 3,862.6 24.9 154.9 1.62 7.10 Pico 2 6,763.5 30.8 219.3 2.29 12.30 Pico 3 14,411.1 42.1 342.3 3.58 26.30 EG VII (Pico 1) Concanavalin A 3,120.2 11.3 275.9 2.89 5.70 Sefacril S-100 HR 670.1 3.2 212.5 2.22 1.20 Cromatoenfoque 400.4 0.53 756.9 7.92 0.71 EGV. EGV1 (Pico 3) Intercambio de aniones (DE-52, pH 4.5) 4,662.3 10.40 447.4 4.68 8.50 Intercambio de aniones (DE-52, pH 7.0) 3,339.2 5.77 579.1 6.06 6.10 BioGel P-60 3,.043.8 3.60 855.7 8.95 5.50 Concanavalin A Pico 1 1 ,115.6 1.60 679.1 7.10 2.10 Pico 2 863.50 1.20 738.7 7.73 1.60 Cromatoenfoque PBE 94' pH 3.5 - 2.0 EG V 415.3 0.54 764.8 7.99 0.76 EGV1 168.7 0.18 947.6 9.09 0.31 Los rendimientos, así como los valores de actividad específica finales, fueron similares para EG V y EG VII, en tanto que EG VI se obtuvo con un rendimiento menor y tuvo una mayor actividad específica. Homogeneidad de Enzima m y valores pl. El manchado positivo con reactivo Schiff (los resultados no se muestra) indicaron que las tres enzimas fueron glucoproteínas de sub-unidad simple. La homogeneidad de cada preparación de enzimas de verificó mediante IEF. Los valores pl obtenidos fueron como se indica a continuación EG V, 2.45; EGVI, 3.00; EG VII, 2.85. Evidencia de glucosilación y estimado de coeficientes de extinción molar. Los contenidos de carbohidrato total (p/p) fueron 22.6 ± 0.1%, 14.7 ± 0.1% y 65.9 ± 0.04% apra EG V, EG VI y EG VII, respectivamente. Los valores de coeficiente de extinción molar calculados (e2ß?) (mol.l .cm"1) fueron 1.04 x 10"5 para EG V, 8.80 x 10~6 para EG VI y 7.05 x 10 6 para EG VH. pH y temperatura óptima y estabilidades. Las tres enzimas fueron activas en rangos de pH relativamente amplios, aunque exhibieron valores óptimos de de pH ácido de 5.7, 5.4 y 5.7 para EG V, EG VI y EGVII, respectivamente. Se obtuvo un pH óptimo de 4.5 para actividad BBGasa en el extracto crudo de T. emersonii. Aproximadamente 75% de la actividad óptima fue evidente entre pH 3.0 y 7.0 (EG V), pH 2.5 y 7.5 (EG VI) y pH 2.8 y 7.5 (EG VII).

La liberación de azúcares de reducción de BBG, en pH 5.0, durante 10 minutos a una temperatura de 30-90°C. Los valores de temperatura óptimos para actividad fueron 78.0°C, 78.0°C y 76.0°C para EG V, EG VI y EG VII, respectivamente. Las energías de activación (Ea), estimados a partir de trazos Arrhenius, fueron 21.2 + 0.05 kJ.mol'1 para EG V, 23.5 ± 0.02 kJ.mor1 para EG VI, y 26.7 ± 0.05 kJ.mor para EG VII. El efecto de pH en estabilidad de enzima se investigó en pH 5.0, pH 5.5 y pH 6.0 (a una temperatura de 50°C y 70°C). La estabilidad de pH fue mayor dentro del rango de pH 4.0-7.0, durante un período de incubación de 1 hora, con una disminución marcada aobservada en un pH < 4.0 y > 7.0. EG V no perdió actividad en un pH 5.0 y temperatura de 50°C durante un período de 15 días, en tanto que EG VI y EG VII perdieron la actividad mínima (13.0% y 11.5% respectivamente). Sin embargo, a una temperatura de 70°C y en el mismo pH, EG V, EG VI y EG VII perdieron 42%, 35% y 33% respectivamente, de la actividad original en cada muestra durante un período de 60 minutos. En un pH de 5.5 (50°C), EG V, EG VI y EG VII perdieron 30%, 22% y 8% de sus actividades originales respectivas durante un período de 15 díasías, aunque a una temperatura de 70°C, EG V fue desestabilizado en forma adicional (58% de disminución en la actividad original después de 60 minutos), en tanto que la actividad de EG VI y EG VII después 60 minutos fue muy similar a la obtenida después de la incubación en un pH de 5.5 a una temperatura de 70°C. EG V fue considerablemente menos estable en pH 6.0 y a una temperatura de 50°C perdiendo 63% de su actividad original en 15 días. EG VI y EG VII fueron considerablemente más estables en el último pH con estabilidades similares a las determinadas en pH 5.5 (30% de pérdida de actividad para ambas enzimas). Al incrementar la temperatura de incubación a una temperatura de 70°C, la actividad de EG V disminuyó en forma marcada (65%) con respecto a un período de incubación de 60 minutos (en un pH 6.0), en tanto que EG VII permaneció remarcadamente estable perdiendo únicamente 22% de su actividad original. Los valores de vida media (T ½) fueron excesivos en 15 días en un pH 5.0 y a una temperatura de 50°C, en tanto que a una temperatura de 70°C, los valores fluctuaron de 67 minutos (EG V) a > 80 minutos (EG VI y EG VII). Evidencia de estructura modular. EG V, EG VI, y EG VII adsorbieron en forma débil Avicel (celulosa microcristalina) en pH 5.0 y a una temperatura de 4°C (8-15% absorción); sin embargo, este grado de absorción no indica la presencia de un módulo de enlace de carbohidrato (CBM). Efecto de iones de metal, modificadores químicos e inhibidores potenciales en la actividad de enzimas. Los efectos de las concentraciones finales mM de un rango de cationes mono, di y multivalentes en la actividad de EG V, EG VI y EG VII, fueron investigados. La actividad se expresión como un % relativo a un control (sin ión de metal presente en la mezcla de incubación). En general, los iones de metal pesados se consideran que desactivan enzimas formando sales covalentes con grupos de cisteína, histidina, o carboxilo. Aunque un número de iones de metal por ejemplo, Mg2 + , Zn2+ y Mo6+ mejoraron la actividad de las tres enzimas y iones, tales como Ag + , Fe2+ y especialmente Hg2+ disminuyeron en forma marcada la actividad de EG V- VI I , se observaron diferencias inter-enzimas notables en los efectos de otros iones de metal. Las sales de cluroro de Na+ y K+ tuvieron ya sea ningún efecto o estimulando ligeramente la actividad de cada enzima, por ejemplo K+ incrementó la actividad de EG VII en un 20%, en tanto que Na+ aumentó la actividad de EG V en un >39%. Ba2+ y Ca2+ disminuyeron la actividad de EG V en un 16.5% y 21.5-24.6%, respectivamente, aunque ambos iones incrementaron la actividad de EG VI en un 37.6% y 10%. Otros cationes divalentes tales como Cd2 + , Co2+ y Cu + ejercieron un efecto inhibidor notable en EG V (-26.5-77.4% de pérdida de actividad). La inhibición casi total de la actividad de las tres enzimas mediante Hg2+ sugiere la presencia de un grupo(s) tiol esencial implicado en la catálisis. Se observó que la valencia modula la actividad, por ejemplo, Fe3+ ejerció un efecto negativo más potente en la actividad de las tres enzimas (35.4-88.0% de disminución de actividad), en contraste con Fe2 + , que realmente mejora la actividad de EG V en un 20%, que tiene efectos mínimos en EG VII y disminuye la actividad de EG VI en un 38.6% (Fe3+ disminuye la actividad de EG VI en un 53.6-59.3%). La naturaleza del contra-anión, es decir CI" versus S042" tuvo un profundo efecto en la actividad cuando se investigaron ambas de las sales de un anión en particular. Las sales SO42" de Ca2+ y Fe3 + , mejoraron selectivamente la actividad de EG VII ~2-veces y ~4.5-veces, respectivamente, con relación a la actividad observada con la sal CI" correspondiente. En contraste, la sal SO42" de Mg + disminuyó marcadamente la actividad de EG V (54.2%) y EG VI (50.1%) en forma relativa a la sal CI" del mismo catión. Una selección de reactivos conocidos por modificar los grupos-R de aminoácidos en proteínas, fueron probados con respecto a sus efectos en EG V, EG VI y EG VII, tanto en la ausencia como en la presencia de substrato (efectos protectores de substrato pueden observarse en esta forma) (ver tabla 6).

N5 en o a? J) Tabla 6. Estudios de modificación química para identificar grupos de aminoácidos esenciales para catálisis en EG V, EG VI y EG VII Reactivo químico Enzima + reactivo3 Substrato + reactivo" EG V EV VI EG VII EG V EGVI EG VII Control 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 DL-DTT 218.9 514.3 575.0 264.3 915.5 348.6 Ditioeritritol 270.6 657.2 773.8 271.9 917.90 360.9 Dimetilsulfóxido 125.5 124.3 194.0 93.6 141.7 100.0 Borohidruro de sodio 96.1 125.0 194.0 81.5 104.8 82.8 Periodato de sodio 181.0 357.1 300.0 283.3 1001.2 469.7 Reactivo K de Woodward 162.7 280.0 305.9 121.1 266.7 143.0 Ácido tioglucólico 211.1 187.1 188.1 148.1 269.0 150.0 o-ftaldialdehído 106.1 100.0 155.0 94.6 139.0 98.8 N-Bromosuccinimida (NBS) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 p-Cloromercuribenzoato 125.4 115.4 105.4 89.7 107.1 91.6 p-Hidroximercuribenzoato 92.8 98.3 99.5 261.7 125.0 94.8 2,3,5-Trifeniltetrazolio 97.5 97.6 98.5 89.1 97.4 100.0 Cloruro Yodoacetamida 103.6 99.9 101.6 87.4 122.6 83.7 Yodo Cisteaína 143.4 180.6 200.0 97.2 147.6 104.8 163.8 170.4 196.5 237.8 370.20 367.7 1o Incubación (30 minutos 2o Incubación EG V EGVI EG VII Enzima + (30 min) + NBS Control X 100.0 100.0 100.0 Cisteína ¦ 1 17.0 217.0 167.0 DDT ¦ 204.3 140.0 94.6 NBS < 0.0 0.0 0.0 Incubación previa de enzimas con reactivos durante 30 minutos (50C) antes de la adición de substrato. b Pre-incubación de substrato con reactivo durante 30 minutos (50C) antes de la adición de enzimas.

El efecto inhibidor potente de N-bromosuccinimida (NBS), sugiere la implicación de triptofán en el enlace y/o catálisis. Sin embargo, o-ftaldialdehído, otro reactivo de modificación de triptofán no tiene un efecto neto en la actividad de EG V, EG VI o EG VII, por consiguiente NBS puede modificar otro residuo de aminoácidos con el cual se sabe que tiene reactividad secundaria, por ejemplo cisteína. Además, la falla del substrato para proteger contra desactivación de enzimas puede indicar un papel directo del triptofán en el enlace o catálisis. Ya que la cisteína y ditiotreitol (DTT) ambos estén protegidos contra desactivación, el efecto de NBS puede ser debido a reacciones secundarias, por ejemplo, oxidación de cisteína. Los reactivos de sulfihidrilo, yodoacetamida, p-hidroximercuri-benzoato y N-etilmaleimida originan poca o nada de inhibición ya sea en la presencia o ausencia del substrato, lo cual puede padecer que sugiere que EG V, EG VI y EG VII no tienen grupos tiol esenciales. Sin embargo, la cisteína DTT y ditioeritritol activan las tres enzimas, especialmente EG VI y EG VII, lo cual puede sugerir la reducción de un disulfuro oxidado posiblemente durante la extracción y/o purificación de enzimas, restaurando de esta forma la conformación nativa de la región de sitio activo de la enzima, o la molécula de enzimas como un total. El borohidruro de sodio, un fuerte agente de reducción, inhibe las tres enzimas (especialmente EG VI) en la presencia de substrato. En contraste, la oxidación de los grupos reactivos en el sitio activo a través de la acción de agentes de oxidación fuertes tales como periodato de sodio, yodo y ácido tioglucólico, mejora notablemente la actividad de las tres enzimas siendo los efectos más pronunciados con periodato de sodio y EG VI, en la presencia de substrato. El reactivo K de Woodward, un reactivo que modifica el carboxilato mejoró la actividad de EG V, EG VI y EG VII, siendo más efectivo en la ausencia del substrato. En general, las sustancias fenólicas tales como m-fenilfenol, (-)epicatequin, ( + )catequin, ácido o-cumárico, ácido cafeíco, ácido ferúlico, ácido siringico, y ácido tánico, por nombras solo algunos de los compuestos probados, no tuvieron un efecto inhibidor marcado en la actividad enzimática (en la ausencia del substrato) con la excepción de ácido tánico el cual es un potente inhibidor debido a su función de precipitación de proteínas. De hecho, algunos compuestos, por ejemplo el ácido protocatecuico, ácido siringico, ácido cafeico, y el alcohol polivinílico activaron en forma marcada las tres enzimas (resultados obtenidos mediante la pre-incubación de enzimas con inhibidor en la ausencia del substrato). Sin embargo, cuando se incubó en conjunto con enzimas y substrato, se observó que varios de los fenólicos efectúan una disminución en la actividad de -7-32% (el substrato no protegió cualesquiera enzimas contra el efecto potente de ácido tánico). En general, la mayoría de los detergentes probados no dieron como resultado la pérdida de actividad enzimática. Sin embargo, el ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, Tween 20 y Tween 80 todos disminuyeron la actividad de EG V, en un 47.7%, 22.7%, 12.7% y 30.8% respectivamente, cuando se incubaron previamente con enzimas antes de la adición del substrato. Con la excepción de Tween 80 (34.2% pérdida de actividad), la incubación simultánea con substrato restauró la actividad completa. Se observó una actividad mejorada cuando se incubaron en forma simultánea el substrato, enzimas y detergente (ácido desoxicólico, CHAPS, ácido taurodesoxicólico y ácido quenodesoxicólico) por ejemplo la actividad de EG VI se incrementó > 2 veces en la presencia de substrato y ácido desoxicólico. Los glucósidos tales como salicin, esculin y arbutin no tuvieron un efecto aparente en la actividad de EG V-VII, similar a la melibiosa de disacáridos, maltosa, sucrosa y el alditol, sorbitol. Sin embargo, las concentraciones de celobiosa de 50-75 mM se inhibieron en forma marcada las tres enzimas, especialmente EG V, la cual también inhibió mediante lactosa en concentraciones de > 75 mM. La lactosa también efectuó -50% de inhibición de EG VI y EG VII y la actividad BBGasa en concentraciones de ~ 120 mM. Glucono-5-lactona y glucoheptono-1 ,4-lactona también inhiben EG V-VII aunque en concentraciones mucho mayores (500 a >750 mM para una inhibición al 50%).

Especificidad del substrato. Los extractos crudos de T. emersonii, catalizan la hidrólisis de una variedad de polisacáridos incluyendo celulosa, CMC, BBG, laminaran, liquenan, xilan, pectina, y espectro de derivados de glucósido sintéticos. Se debe observar que ninguna de las tres enzimas purificadas fueron activas contra derivados 4-nitrofenilo de ß-D-xilopiranosida, o a-D-galactopiranoside (tabla 7).

Tabla 7: Especificidades de substrato de EG V, EG VI y EG VII purificadas de Talaromyces emersonii Substrato Enlace % de actividad relativa3 40.7 kDa EG V EG VI EG VII 'liquenasa' ß-glucan de Barley ß- (1.3)(1 ,4) 100.0 100.0 100.0 100.0 DP BBG mezclado ß- (1 ,3)(1 ,4) 159.0 165.0 230.0 107.6 DP BBG superior ß- (1.3)(1 ,4) 118.0 249.9 342.8 144.1 CMC ß- (1.4) 0.5C 74.9 58.4 57.7 Liquenan ß- (1 ,3)(1 ,4) 118.9 204.3 177.7 166.9 Laminaran ß- (1.3) 0.0 0.0 21.3 18.1 Xilan ß- (1.4) 0.0 1.8 0.7 1.5 Rodimenan (xilan) ß- (1 ,3)(1 ,4) 0.0 35.4 9.3 0.0 Pectina a- (1.4) 0.0 0.0 0.0 0.0 Manan ß- (1.4) 0.0 0.0 0.0 0.0 Avicel ß- (1.4) 0.0 0.0 0.0 0.0 Papel de filtro ß- (1.4) 0.0 0.0 0.0 0.0 4NP- -D-Glucopiranósida ß- (1.4) 0.0 0.0 0.0 0.0 4NP-3-D-Galactopiranósida ß-< (1.4) 0.0 0.0 0.0 0.0 4NP-P-D-Xilopiranósida ß-? (1.4) 0.0 0.0 0.0 0.0 a% de actividad relativa contra BBG, la cual se toma como 100.0%; "liquenasa de Talaromyces emersonii purificada [6]; c Después de 24 horas a una temperatura de 50°C Además, EG V, EG VI y EG VII no muestran actividad alguna contra un papel de filtro, Avicel, galactomanan de goma de algarrobo y no cataliza en la oxidación de celobiosa, incluso en una incubación prolongada con el substrato. Los resultados se expresan en términos del % de actividad relativa con el control (actividad contra BBG se le asignó el valor de 100%). Las tres enzimas exhiben una máxima actividad contra los ß-glucanos, de ligadura mezclada, BBG y liquenan, con una mayor actividad en forma marcada en el último substrato. La actividad de trazo exhibida por las tres enzimas con xilan en períodos de incubación prolongados, puede ser explicada por el hecho de que la preparación de xilan de especies de trigo de avena utilizadas contuvo cantidades menores de contaminación de ß-glucan. Después de llevar a cabo análisis similares en cada una de las enzimas expresadas, el sistema de enzimas fue diseñado utilizando enzimas purificadas de Talaromyces emersonii para la degradación de material no celulósico tal como hojas de té, polvo de carbón y otros materiales similares. La tabla 8 proporciona un ejemplo de las cantidades relativas de diferentes actividades enzimáticas de este sistema de enzimas.

Tabla 8: Sistema para conversión de materiales no celulósicos, por ejemplo, hojas de té, polvo de carob Ejemplo 5: Sistema de T. emersonii para convertir celulosa, desperdicios con alto contenido de celulosa y celooligosacáridos Talaromyces emersonii IMI 393751 se creció en una variedad de desechos de papel y productos de papel como substratos. Las enzimas excretadas, fueron extractadas y se monitoreo la expresión de enzimas y se cuantificó mediante análisis de proteoma y transcriptoma y a través del espectro de ensayos funcionales. Varios desechos de papel probaron ser inductores de celulasas excelentes (y actividades complementarias, por ejemplo enzimas de hidrolización almidón, cuando se utilizaron productos de papel recubiertos/terminados). Las diferencias fueron muy evidentes con respecto a las cantidades relativas/tipos de enzima de celulasa inducidas por diferentes desechos/productos de papel.

Los datos obtenidos confirmaron que las isoenzimas de celobiohidrolasa I (CBH I) y celobiohidrolasa II (CBH II) fueron las actividades de celulasa más importantes, y cuando se deseo una sacarificación/ bioconversión más completa de la celulosa en el substrato objetivo (por ejemplo generación de materias primas con alto contenido de monosacárido para producción de biocombustible), ß-glucosidasa I (BG I) también fue muy importante. Los platos de papel indujeron niveles muy marcados de actividad de degradación de papel de filtro (FP) (1573 lU/g, en donde IU representa pmoles de producto formado/tiempo de reacción mínimo/substrato de inducción g), bajos niveles de endocelulasa (27.5 IU/g) y bajos niveles de ß-glucosidasa (6.05 lU/g). En un nivel de transcriptoma. CBH I fue la celulosa más abundante/altamente expresada, siendo detectada una observación complementada en el nivel funcional con 242.0 IU/g de actividad tipo CBH I. Las enzimas producidas durante el crecimiento en vasos de papel, fueron significativamente más exo-acción, con 495.0 IU/g de actividad de FP y 53.9 IU/g de ß-glucosidasa detectadas. En el último ejemplo, la expresión genética y ensayos funcionales indicaron que CBH II fue la celulosa clave (niveles de transcripción y enzimas para CBH II fueron ~2-veces los niveles correspondientes de enzimas CBH I). CBH II fue nuevamente la celulasa clave inducida por papel café, cartón corrugado y papel de oficina blanco. Los sistemas de enzimas individuales y combinaciones de los mismos (por ejemplo para la amplificación de actividades clave exo o secundarias/accesorias) mostraron ser herramientas efectivas para la conversión de celulosa (y hemicelulosas/otros carbohidratos) en una amplia variedad de materiales secundarios y de desecho vírgenes, con alto contenido de celulosa. Las enzimas fueron aisladas y analizadas mediante procedimientos convencionales (Walsh, (1997) y asociados 2002) CBH IA, que contiene trazos de xilanasa como la única actividad contaminante, se eluyo en una concentración NaCI entre 115 y 170 mM. Se reunieron las fracciones 52-66 y se dializaron durante 16 horas contra 4 cambios de amortiguador de acetato de amonio 100 mM, pH 5.0, y se sometieron a cromatografía por afinidad en una columna (1.4 x 11.3 cm) de CH-Sefarosa 4B sustituida con p-aminobencil-1 -tio-celobiosida. La actividad de xilanasa contaminante residual no enlazó y fue eluida en los amortiguadores de aplicación y lavado. CBH IA se eluyo utilizando 0.1 M de lactosa en 100 mM de amortiguador de acetato de amonio, pH 5.0. Se reunieron las fracciones 13 a 21, se dializaron contra agua destilada para eliminar la lactosa y se almacenaron a temperatura de 4°C hasta que se utilizaron. CBH IB del paso de intercambio de aniones (DE-52 a un pH 5.5) fue diatizada versus 100 mM de amortiguador de acetato de amonio, pH 5.5 y se aplicaron a la columna de afinidad como para CBH IA. Las actividades de contaminación residuales, principalmente endoglucanasa, no enlazaron a la matriz de afinidad y fueron eluidas en el lavado. CBH IB fue eluido específicamente utilizando 0.1 M de lactosa en el amortiguador de afinidad. Las fracciones 43 a 48 fueron reunidas y dializadas contra agua destilada para eliminar lactosa y almacenadas a una temperatura de 4°C hasta su uso adicional. Con base en el análisis anterior, se diseñó el siguiente sistema de enzimas utilizando enzimas purificadas de Talaromyces emersonii para la degradación de desecho de papel y productos de papel, y otros desechos que contienen celooligosacáridos.

Tabla 9: Sistema para conversión de celulosa, desechos con alto contenido de celulosa y celooligosacáridos Composición de enzima Perfil de actividad de enzimas (%) Celobiohidralasa 1Ay 1B 5.0 - 80.0 Celobiohidralasa II 6.0-45.0 Endoglucanasa (Cel 45, EGV, EGVI, EGVII) 4.6 - 66.0 B-xilosidasa 0.1-2.5 Xilanasa 1.0-89.0 Otras hidrolasas (incluyendo enzimas de modificación de 1.2-20.5 pectina, arablnofuranosida, ß-galactosidasa ) Ejemplo 6: Sistema de especies fúngicas termof ílicas, Chaetomium thermophile y Thermoascus aurantiacus. La estrategia señalada para el diseño de sistema de enzimas/composiciones de termozimas de T. emersonii IMI 393751 y los mutantes previamente conocidos fueron adaptados para la producción de composiciones que modifican carbohidratos a través de veintitrés especies fúngicas mesofílicas y termofílicas. Se dio una atención particular a la producción/inducción de hemicelulasa potente (xilanasa, mananasa) y sistemas de enzimas con alto contenido de pectinasa a través de estas especies fúngicas. Chaetomium thermophile y Themoascus aurantiacus fueron cultivadas en forma individual en fermentación líquida, tal como se describió anteriormente, en el medio de nutriente T. emersonii que contiene 1-6% de fuente de carbono de inducción (producción de enzimas mediante fermentación sólida también fue producida). Se obtuvo un sistema de enzimas con degradación de manan potente mediante el cultivo de C. thermophile durante 96 a 120 horas en desecho de café. Esta composición de este sistema estuvo caracterizada y mostró contener 45 - 60% de actividades de hidrolización de manan, 0.7-4.0% de enzimas de modificación de pectina, 35.2-52.0% de actividades de modificación de xilan, siendo el de esto atribuido a actividades de celulasa (se observaron CBH y ß-glucosidasa en niveles muy bajos o de trazo).

El cultivo de los mismos hongos sobre salvado de soya produjo un sistema de enzimas xilanolíticas potente (70.2-86.5% de las actividades totales siendo atribuidas a enzimas de modificación-xilan); -10.6-28.0% y -8.6-22.5% de las actividades de modificación de carbohidratos restantes fueron atribuidas a celulasa, enzimas pectinolíticas y bajos niveles de enzimas mananolíticas. En forma similar, se indujo un sistema de enzimas de modificación de pectina potente durante el cultivo de Th. aurantiacus en cáscara de trigo y pulpa de betabel (1:1), con >56.5-80.0% del perfil de actividad de modificación de carbohidrato total estando representado por actividades pectinolíticas; este sistema de enzimas también contuvo -22.1-40.1 % de enzimas de modificación de xilan, siendo el resto principalmente actividades de modificación de celulasa/ß-glucan. En contraste, el cultivo de Th. aurantiacus en salvado de soya indujo un potente subsistema de enzimas xilanolítica (>62.1 -85.8%), complementado por -3.5-11.0% de enzimas de modificación de pectina siendo predominantemente las actividades restantes de modificación de ß-glucan. En contraste con C. thermophile, Th. aurantiacus elabora niveles significativos de enzimas de degradación de manan durante el cultivo en cualquier substrato. Estos sistemas, por ellos mismos o en combinación uno con el otro u otros sistemas de enzimas (por ejemplo T. emersonü) han mostrado efectuar una sacarificación extensa (liberación de azúcar) de un amplio rango de diferentes materiales agrícolas, de alimentos/vegetal, bebidas, madera/papel y otros materiales de desecho y vírgenes con alto contenido de carbohidrato, y se pueden utilizar para la generación de productos de oligosacárido especializados o materias primas con alto contenido de azúcar para un amplio rango de aplicaciones biotecnológicas (por ejemplo, producción de biocombustible). Ejemplo 7: Sistema de T. emersonü para la generación de materias primas con alto contenido de azúcar de desechos de alimentos/bebidas, papel y madera que serán utilizados en producción de biocombustibles. (a) Bioconversión de un desecho de alimento/bebida: pulpa/puré de manzana Se obtuvieron manzanas (en pulpa) pulpa de manzana y puré de manzana de desecho de proveedores de frutas locales, tiendas de producción y procesamiento de alimentos y de sidra/bebidas. T. emersonü se cultivó en puré/pulpa de manzana del 2 al 6% (tanto mediante fermentación sólida como líquida) y se midieron altos niveles de un rango de enzimas que modifican carbohidratos. Este sistema estuvo caracterizado por altos niveles de hidrolasas de ß-glucan, principalmente ß-glucanasas no celulósicas (-27.4% en 120 horas de filtrado de cultivos líquido), cantidades sustanciales de exo-glucosidasas clave especialmente con altos niveles de a-arabinofuranosidasa (13.3% de la actividad de carbohidrasa total) y ß-galactosidasa (22.6%). Las enzimas de esterasa, pectina y xilan adicionales también fueron detectadas (>7.2-33.5%). Por lo tanto utilizando el análisis anaterior, es posible diseñar un sistema de enzimas adecuado para degradar el desecho de manzana. Los estudios iniciales utilizaron una carga de enzimas que contenía 2,344 nkat de xilanasa, 5,472 nkat de ß-glucanasa enlazada mezclada y 8,529 nkat de liquenanasa por 3.6 Kg de substrato y se utilizó una temperatura de reacción de 70°C. La pasteurización completa del hidrolizado se logró a una temperatura de 70°C, y el hidrolizado se utilizó para alimentar reactores anaeróbicos de flujo ascendente mesofílicos y termofílicos (UAHR). Se ha observado el 100% de la utilización de la materia prima de azúcar, con una producción concomitante de metano (50-70% en la corriente de biogas). Se llevaron a cabo estudios de optimización subsecuentes, que demuestran que la incubación a una temperatura de 80°C, con agitación suave (~120 rpm) durante un período de 24 horas con aproximadamente 2/3 de la dosis de enzima original, lograron el -87% de sacarificación de los carbohidratos presentes en azúcares simples, fermentables. Los azúcares producidos a través este sistema de enzimas se pueden utilizar como una materia prima con alto contenido de monosacárido para producción de biocombustible. (b) Biocon versión de desecho de papel: vasos de papel y productos de papel. T. emersonii se cultivó sin suplemento en una variedad de desechos de papel en fermentación líquida (ver Ejemplo 5). Los vasos de papel probaron ser un inductor de carbohidrasa muy eficiente, produciendo un potente cocktail de enzimas de componentes múltiples con altos niveles de xilanasa y actividades de enzima de degradación-almidón, y niveles de actividades de celulasa mayores a las reportadas en substratos de crecimiento potenciales. El potencial de este sistema de enzimas para liberar en forma eficiente la reducción de azúcares y efectuar la degradación de desechos de papel, fue ilustrado claramente a través de pruebas bioquímicas y Microscopio de Exploración de Electrones. El efecto del tratamiento de termozimas en la integridad y morfología del substrato utilizando el microscopio de exploración de electrones, confirma el potencial de estos cocktails como herramientas biotecnológicas potentes para conversión de desecho de papel. SEM proporcionó una clara evidencia para la degradación de fibra de celulosa extensa (pérdida total de estructura de fibra en ciertas muestras) después del tratamiento del substrato con alto contenido de celulosa con los cocktails T. emersonii. El cocktail de enzima producido por T. emersonii después de 108 horas creció en vasos de papel que contienen una batería de celulosa, hemicelulosa y enzimas de degradación de almidón y los estudios de sacarificación llevados a cabo con este cocktail de componentes múltiples, demuestra su capacidad para liberar en forma efectiva glucosa y otros azúcares de reducción de celulosa convencional y substratos de desecho de papel. Este cocktail de enzima se descubrió como activo en todos los desechos de papel y substratos de celulosa convencionales analizados. Aunque todos los substratos fueron degradados cada vez más con el tiempo se exhibieron diferentes susceptibilidades de biodegradación en respuesta a las diferentes composiciones del substrato. Antes de cualquier tratamiento previo, el empaque biodegradable mostró la susceptibilidad más fuente hacia hidrólisis enzimática seguido del papel de tejido, vasos de papel y cartón corrugado. El sistema de enzimas inducidos por vasos de papel, función en forma óptima, liberando los máximos niveles de azúcar de desechos de papel a una temperatura de 50°C, pH 4.5, en una dosis de enzimas 4 ml/g substrato y manteniendo la agitación en 37 rpm. La homogeinización de los vasos de papel incrementó el nivel de hidrólisis en 2.3-veces. Bajo estas condiciones experimentales (dosis de enzima de 36 FPU) (unidades de papel de filtro) se logró un total de % de hidrólisis del 85% abarcando la glucosa el ~80% de los azúcares de reducción liberados. La glucosa y xilosa fueron los productos principales liberados (ver figura 3). Sin embargo, la disminución de la dosificación de enzimas a 9 FPU efectuó una hidrólisis general de ~76%. El microscopio de electrones demostró las excelentes propiedades hidrolíticas de este cocktail (figura 4). El tratamiento término incrementó la conversión de cartón a través del mismo sistema de enzimas en un factor del 34% (una hidrólisis de carbohidrato general con base en azúcares de reducción liberados de -88%), aunque la combinación tanto del tratamiento térmico como de la homogeinización incrementó los azúcares de reducción liberados en un 80%, produciendo 1.47 mg/ml de glucosa (31.7% de los azúcares totales liberados). Los platos de papel fueron degradados rápidamente a través del cocktail de enzimas inducido por vasos de papel, abarcando la glucosa el -67% de los azúcares totales liberados. La sacarificación enzimática de los desechos de papel y alimentos ha sido investigada en Hidrólisis y Sacarificación secuencial (SHF), por ejemplo, tratamiento previo de enzima seguido por fermentación de levadura para producir etanol, y en Hidrólisis y Sacarificación Simultánea (SSF), en donde la materia prima se genera continuamente y se fermenta inmediatamente a través de levadura. Las temperaturas de reacción de tratamiento previa enzimáticas son diferentes en ambos procesos, por ejemplo, más altas en SHF ya que el hidrolizado se enfría antes de la fermentación y a una temperatura cercana a temperatura ambiente para el crecimiento y fermentación de levadura en SSF. Aunque las enzimas T. emersonii IMI393751 son más eficientes y tienen rangos de reacción superiores, y se logra la pasteurización (y se requiere menos enzimas), las enzimas T. emersonii aún trabajan bien a una temperatura de 25-37°C y se comparan bien con preparaciones de enzimas comerciales de otras fuentes fungicas. Las materias primas con alto contenido de aúcar producidas se descubrieron como adecuadas para producción de biocombustible (bioetanol y biogas). (c) Bioconversión de residuos de madera suave para producción de Bioetanol Los residuos y desechos de madera de fuentes primarias y secundarias (por ejemplo, desechos de corteza, recortes y procesamiento, tal como virutas y aserrín) representan un vasto recurso con tanto como del 65 al 70% del peso seco que comprende carbohidratos complejos tales como hemicelulosa (-19-28% y principalmente xilanos y mananos con algunos otros polisacáridos) y celulosa (-39-46%), los cuales se encajonaron en lignina. T. emersonii IMI 393751 se creció en una fermentación de estado líquido a sólida en residuos de madera, tales como aserrín de abeto sitka y recortes de ceniza para generar sistemas de enzimas con un perfil adecuado de enzimas para la conversión del desecho objetivo. Las temperaturas de reacción/tratamiento previo diferentes y dosis de enzimas fueron investigadas. Los sistemas de enzimas evaluados incluyeron cocktails obtenidos durante el crecimiento de T. emersonii en una variedad de substratos. Las temperaturas de reacción de 50°C, 60°C, 70°C y 80°C fueron investigadas, y se utilizó un número de diferentes substratos, es decir, residuos de madera no tratados y tratados previamente. También se investigó la carga de enzimas, con los estudios iniciales comenzando con 60 FPU, posteriormente incrementados hasta 200 FPU (FPU: unidades de papel de filtro, una medida de actividad de celulasa total). Tabla 10: Sacari icación de residuos de madera mediante cocktail T. emersonii (WB/BP (1:1) Se proporciona el contenido de hexosa como g liberado de un lote de inicio de 10 g en un periodo de reacción de 24 horas. 'Combinación = coctel T. emersonii (WB/BP (1:1) + desecho de café C. thermopile inducido La hidrólisis bajo condiciones amortiguadas y no amortiguadas fue investigado, ya que fue el efecto de los niveles de la humedad de la reacción y dosis de enzimas Los efectos de dosis de enzima en las producciones etanol teóricas se presentan en la tabla 11. Tabla 11: Efecto de dosis de enzima en % de conversión producción de etanol teórica Enzima Dosis Temperatura Hexosa %de Producción de etanol (FPU) de reacción liberada (g) conversión teórica (L/ton material sin procesar) Combinación* 60 70°C 4.5 70.0 325.5 Combinación* 200 70°C 5.1 76.4 345.4 * Combinación = coctel T. emersonii (WB(BP (1:1) + desecho de café C. thermophile inducido; el contenido de hexosa se proporciona como g liberado de un lote de arranque de 10 g en un período de reacción de 24 horas.

Ejemplo 8: Sacarificación de biomasa de madera Preparación del substrato de prueba. Se impregnaron pedazos de abeto (2-10 mm de diámetro) con dióxido de azufre (3% p/v de humedad) durante 20 minutos a temperatura ambiente para un rango de absorción de 2.5% p/p de humedad. El abeto tratado con S02 fue tratado con vapor a una temperatura de 215°C durante 2 a 5 minutos. El contenido de hemicelulosa fue hidrolizado casi completamente. La recuperación sólida fue de 60-65% del material sin procesar de partida. Enzimas MGBG Termozimas: Numerados MGBG 1, MGBG 2, MGBG 3 y MGBG 4. Las enzimas comerciales utilizadas fueron Celluclast 2L de T. reesei y Novozym 188 de A. niger (Novo Industri A/S, Bagsvaerd, Dianamrca). Evaluación de hidrólisis enzimática Se llevó a cabo una hidrólisis enzimática estándar a una temperatura de 37°C, 50°C y 60°C en 300 mL, en envases de reacción de 1 L y 10 L con agitación en -130 rpm. La dosis de enzima fue de 32 FPU de cada preparación de enzimas por g de celulosa en una solución de substrato amortiguada (Gilleran, 2004). El pH del amortiguador de reacción se ajustó a pH 5.0 para las enzimas MGBG y un de pH 4.8 para las preparaciones comerciales. Las muestras fueron eliminadas en intervalos programados y se terminó la acción enzimática hirviendo cada mezcla de reacción (y controles) durante 10 minutos. A las temperaturas de reacción más bajas (37-50°C), 2 de las preparaciones de enzimas de la presente invención se desempeñan también como la preparación comercial Celluclast, y (ii) el desempeño de 3 de las enzimas MGBG enzimas está dentro del mismo rango que la Celluclast comercial (y combinación Cellulclast/Novozym). La producción de glucosa utilizando la composición de la presente invención es similar a las preparaciones comerciales optimizadas, aunque producen mayores niveles de azúcares fermentables adicionales que las enzimas comerciales. Las preparaciones de enzima de la presente invención llevaron a cabo las combinaciones de enzimas/enzima comercial en las condiciones de reacción superiores (60-70°C), en términos de hidrólisis de grado general, rendimiento de producto y estabilidad de enzimas. Se puede utilizar una dosis de enzima menor a temperaturas de reacción más altas para lograr un desempeño de hidrólisis similar (dependiendo de la preparación de enzima, únicamente 62.5-78% de la carga de enzimas comercial requerida). También fueron menos afectadas con las sustancias inhibidores presentes en el substrato tratado previamente con vapor en concentraciones mayores de glucosa y celobiosa en los hidrolizados con alto contenido de azúcar. También producen una mayor cantidad de azúcar en 24 horas a una temperatura de 60°C, que lo que logran las enzimas comerciales en 72 horas a una temperatura de 50°C, la temperatura de trabajo óptima de las enzimas comerciales. Los resultados clave de la hidrólisis enzimática se presentan en la tabla 12, aunque las mejores combinaciones de temperatura de reacción/tiempo de reacción para un porcentaje de hidrólisis óptimo, para cada una de las composiciones comerciales y enzimáticas de la presente invención probadas, se proporcionan en la tabla 13.

Ni G en o en en Tabla 12: Resumen de resultados que comparan el desempeño enzimático/potencial hidrolítico de preparaciones de enzimas Comerciales y MGBG en arbustos tratados previamente Tabla 13: Combinaciones de temperatura de reacción/tiempo de reacción para % de hidrólisis máxima, para cada una de las enzimas comerciales y MGBG investigado Sacarificación y Fermentación Simultánea (SSF) Se llevaron a cabo experimentos SSF por lote con un hidrolizado de abetos para comparar el desempeño de diferentes preparaciones de enzimas. Las fermentación se llevó a cabo en una concentración de fibras de abetos de 4%, en material tratado previamente fue diluido con agua estéril a la concentración deseada. El pH se mantuvo en 5.0 con la adición de 2M NaOH. La temperatura de fermentación fue de 37°C y la velocidad del agitador fue de 500 rpm. El medio del reactor se rocío con nitrógeno (600 ml/min) y el contenido C02 se midió con un analizador de gas. La preparación de enzima se agregó directamente al fermentador en una carga de 25 unidades de papel de filtro (FPU)/g de celulosa. El medio de fermentación fue suplementado con nutrientes: 0.5 g/l (NH4)2HP04, 0.025 g/l MgS04.7H20 y 1.0 g/l de extracto de levadura. La concentración de la masa de la célula de levadura (célula de panadería, Saccharomyces cerevisiae) agregada fue de 5 g/l y todos los experimentos SSF se llevaron a cabo a una temperatura de 37°C durante 72 horas. Las muestras se extrajeron en varios intervalos de tiempo, fueron centrifugadas en tubos de microcentrifugación de 1.5 mi en 14,000 g durante 5 minutos (Z 160 M; Hemle Labortechnik, Alemania), posteriormente el sobrenadante fue preparado para análisis HPLC. Los productos de hidrólisis generados durante la degradación de los materiales lignocelulósicos fueron analizados mediante HPLC. Se separaron celobiosa, glucosa, xilosa, galactosa, mañosa, HMF y furfural en una columna de polímero (Aminex HPX-87P) a una temperatura de 85°C, la fase móvil fue agua de miliporo en un rango de 0.5 ml/min. Se determinaron las concentraciones de etanol, glicerol y acetato utilizando una columna Aminex HPX-87H a una temperatura de 60°C, utilizando un sistema Shimadzu HPLC equipado con un detector de índice refractivo. La fase móvil fue de system equipped con a 5 mM de solución acuosa de H2S04 en un rango de flujo de 0.5 ml/min. El etanol producido también fue determinado utilizando un ensayo enlazado por enzimas (r-Biopharm, Alemania).

El crecimiento de levadura tuvo lugar en dos fases. El dióxido de carbono es un sub-producto importante del proceso de fermentación de etanol, ya que la fermentación anaeróbica de un molde de glucosa produce un modelo etanol y dos moldes de dióxido de carbono. Por consiguiente, la medida de la concentración de dióxido de carbono en el gas de salida, es una medida indirecta del rango de fermentación. En la primera fase de crecimiento, la glucosa disponible es consumida y el etanol se forma, y la respuesta rápida inicial a la glucosa presente, está representada por un surgimiento en la evolución de C02. Los resultados obtenidos durante SSF se proporcionan en la tabla 3. Tal como se mencionó anteriormente, el tiempo total tomado para SSF, para cada preparación de enzimas fue de 72 horas, y la temperatura utilizada para SSF fue de 37°C. La eficiencia de fermentación se determinó dividiendo la concentración real del Etanol producido (g/L) entre el etanol teórico total (g/L) el cual pudiera ser producido si se convirtiera todo el substrato disponible a un azúcar soluble, fermentable y toda el azúcar fuera convertida a etanol, y multiplicándolo por 100. Con base en los datos obtenidos, los rendimientos de etanol para cada combinación de enzima/SSF se proporcionan en L Etanol/tonelada seca, y las unidades US correspondientes, Etanol galones/toneladas US seco.

Tabla 14: Resumen de experimentos SSF *Se utilizó la carga de enzimas de 21.3 FPU en lugar de 32.0 FPU "Combinaciones más optimizadas de MGBG 3 y MGBG 4.

Ejemplo 9 Comparición de las enzimas comerciales y MGBG en una estrategia de Hidrólisis y Fermentación Secuencial (SHF) para producción de bioetanol Los rendimientos de bioetanol obtenidos mediante hidrólisis y fermentación secuencial fueron investigados para las preparaciones comerciales y de enzimas de la presente invención. Una ventaja de SSF, es que el proceso consiste en una fermentación rápida del metabolismo de azúcares monoméricos que resultan del paso de tratamiento previo. Una vez que la glucosa es liberada del substrato a través de la acción de las enzimas hidroliticas que han sido agregadas, la fermentación es rápida, lo cual significa que, en SSF, la concentración de azúcares libres siempre permanece baja. En SSF, el rango de fermentación disminuye eventualmente como resultado ya sea de alguna disminución en el rango de conversión del substrato a través de las enzimas, o la inhibición del metabolismo de levadura, cualquiera que sea en rango limitante. Los datos obtenidos en estos experimentos se resumen en la tabla 15. Tabla 15: Resumen de experimentos SHF 'Preparación de enzimas utilizada a una temperatura de reacción más alta. 'Este coctel de enzimas es particularmente efectivo en la liberación de azúcares fermentables de substratos, con alto contenido de hemicelulosa y puede no esperarse que sea tan efectiva en el substrato, ya que tiene una parte significativa de fracción de hemicelulosa eliminada (paso de tratamiento previo).

El análisis HPLC confirmó que los productos principales formados con monosacáridos (azúcares simples) con muy pequeñas cantidades de oligomeros superiores formados (celobiosa, el cual es un disacárido, siendo el principal, o únicamente, el azúcar de cadena superior presente en los hidrolizados). Ejemplo 10 Aplicaciones en Alimentos para Animales Cada composición de enzimas fue evaluada en aplicaciones objetivo individuales, con estudios modelo conducidos a escala de laboratorio con 5.25 g de substrato (residuos de cereal, harina de cereal u otros residuos de planta) en volúmenes de reacción finales de 50-250 mi, con pH de 2.5 - 7.0 y temperatura de 27.85°C, con o sin agitación. Se evaluó el desempeño de enzimas con y sin tratamiento previo con substrato, es decir, tratamiento previo con vapor suaves (105°C, 8 psi durante 5 minutos), moliendo utilizando una maja y mortero, homogeinización en un homogeinizador Parvalux o Ultraturrax. Para elegir un residuo de frutas y vegetales blandas, un substrato fue macerado fuertemente mediante mezclado e incubado con enzimas sin tratamiento previo. Se monitoreo la hidrólisis de substrato mediante (i) medida de aúcares de reducción liberados y ensayos para detectar y cuantificar azúcares individuales, (ii) análisisTLC y HPLC de confirmación de los productos de azúcar de hidrólisis, (iii) análisis de peso/volumen del residuo, (iv) comparación de celulosa, hemicelulosa, contenidos de almidón y pectina antes y después del tratamiento enzimático y (v) análisis físico de degradación de substrato mediante microscopio de exploraciones de electrones (SEM) para substratos fibrosos tales como desechos de papel y madera.

Tabla 16 Coctel Composición de coctel (%) Aplicación objetivo Substrato Temperatura óptima Productos de tratamiento (°C) MGBG 15 CBH I (28-30%) Capacidad de Trigo, avena >60°C (hasta 75°C) Principalmente CBH II (1-5%) digestión mejorada glucooligosacáridos, (1 ,3)4-glucanasa (10-15%) xilooligosacáridos y ß-glucosidasa (2-10%) algunas otras Xilanasa (44-48%) cantidades menores 0.1-1.5% B-Xilosidasa, de azúcares diversos 0.1-2.0% a-Glucuronidasa 0.1-1.5% a-L-arab¡nofuranos¡dasa; 2-5% enzimas pectinolíticas y esterasas 7-15% proteasa MGBG 16 CBH I (10-15%) Capacidad de Trigo; avena; centeno >60°C (hasta 80- Galactooligosacáridos, CBH II (10-15%) (1,3)4-gluconasa (25-30%) digestión mejorada 85°C) glucooligosacáridos, y ß-glucosidasa (2-8%) xilooligosacáridos Xilanasa (25-30%) Productos 1-2.0% -Xilosidasa, alimenticios 1-2.0% a-L-arabinofuranosidasa; enriquecidos con 00 -10% enzimas pectinolíticas, -5% actividad de Galacto y modificación de almidón; 5-10% de Glucooligosacáridos oxidorreductasa/oxidasa y esterasas 10-15% proteasa Liberación de antioxidantes MGBG 17 CBH I (5-10%) Capacidad de Trigo; avena, >60°C (hasta 80°C) Glucooligosacáridos y CHB II (5-10%) digestión mejorada centeno, maíz, xilooligosacáridos (1,3H-glucanasa (20-30%) cebada; cañóla B-glucosidasa (2-8%) Xilanasa (30-35%) 1-2.0%p-Xilosidasa, 1-30% a-Glucuronidasa 1.5-4.0% a-Larabinofuranosidasa; 5-10% enzimas pectinolíticas, 5-8% de actividad de modificación de almidón; 1-4% oxidorreductasa/oxidasa y esterasas, 18- 25% proteasa r n o OI OI Tabla 16 continuación GBG 13 CBH 1 (5-10%) Capacidad de Trigo; avena; >60°C (hasta Glucooligosacáridos y CBH II (5-10%) digestión mejorada centeno; maíz; 85/90"C) xilooligosacáridos P(1,3)4-glucanasa (25-40%) cebada; cañóla algunos ß-glucosidasa (-5%) Liberación monosacáridos y Xilanasa (15-25%) antioxidante disacáridos de 1-2.0% ß-Xilosidasa, polímeros de pectina 1-3.0%; Exoxilanasa, (por ejemplo 8-10%, a-Glucuronidasa arabinoolígosacáridos, 1.5-5.0% a-L-arabinofuranosidasa; ácido galacturónico, -15% enzimas pectinolíticas ramnosa, etc.) 5-7% actividad de modificación de almidón; 5-10% otras hemicelulosas, 1-4%, oxidorreductasa/oxidasa y esterasas 8-12% prateasa MGBG 9 CBH I (10-15%) Capacidad de Sorghum; cañóla; >60°C (hasta Glucooligosacáridos y CBH II (10-15%) digestión mejorada; también otros 80/85X) xilooligosacáridos, P(1,3)4-glucanasa (25-30%) cereales, por ejemplo algunos (3-glucosidasa (-10-15%) Flexibilidad para trigo; avena; centeno; monosacáridos o Xilanasa (20-27%) utilizar diferentes maíz, cebada algunas otras 4.0-7.0%¿-Xilosidasa, productos cantidades más 5-10%; Exoxilanasa, alimenticios pequeñas de azúcares 1-4% a-Glucuronidasa ' procedentes de 2.0-5.0% a-L-arabinofuranosidasa; polímeros péctícos 5% enzimas pectinolíticas, -5% actividad de modificación de almidón; -5% otras hemicelulosas, 1-4%, oxidorreductasa/oxidasa y esterasas -25% prateasa r G 01 o en en Tabla 16 continuación MGBG 20 CBH I (5-10%) Capacidad de Trigo, Cebada y >60°C (hasta Glucooligosacáridos y CBH II (5-10%) digestión mejorada; Centeno 80/85 ) xilooligosacáridos p(1 ,3)4-glucanasa (20-32%) algunos S-glucosidasa (-2-9.5%) monosacáridos y Xilanasa (15-25%) algunas otras -20.0%P-Xilosidasa, cantidades menores -15%; Exoxilanasa, de azúcares de 2-5%, a-Glucuronidasa polímeros pécticos 1.5-5% a-L-Arab¡nofuranos¡dasa; 10- % enzimas pectinolíticas -10% actividad de modificación de almidón; -5% otras hemicelulosas, 2-5%, oxidorreductasa/oxidasa y esterasas -7-10% proteasa GBG 21 CBH I (5-10%) Capacidad de Trigo, cebada y maíz; >60°C (hasta Glucooligosacáridos y CBH II (5-10%) digestión mejorada; también pulpa de 80/85"C) xilooligosacáridos, P(1 ,3)4-glucanasa (15%) betabel algunos (3-glucosidasa (-2-10%) Liberación de monosacáridos o Xilanasa (50-55%) fructooligosacárído algunas otras 1-5%-Xilosidasa, cantidades más 5-10%; Exoxilanasa, pequeñas de azúcares 1- 4% a-Glucuronidasa de polímeros pécticos 2- 5% a-L-arabinofuranosidasa; y fructooligosacáridos 20-25% enzimas pectinolíticas, 4-6% actividad de modificación de almidón; 7-10% otras hemicelulosas, 2-4%, oxidorreductasa/oxidasa y esterasas -10% proteasa en o en en Tabla 16 continuación MGBG 22 CBH I (1-5%) Capacidad de Trigo, cebada, >60°C (hasta Glucooligosacáridos, CBH II (-5%) digestión mejorada; centeno 85/90°C) xilooligosacáridos P(1.3)4-glucanasa (27-45%) algunos (3-glucosidasa (-1-5%) Formación de monosacáridos u otras Xilanasa (16-25%) glucooligosacárído cantidades más 0.5-4%-XNosidasa, pequeñas de -10%; Exoxilanasa, azúcares, etc. 0.5-4%, a-Glucuronidasa 1.5% a-L-Arabinofuranosidasa; 5-10% enzimas pectinol íticas 4-8% actividad de modificación de almidón; 8-10% otras hemicelulosas, 1-4%, oxidorreductasa/oxidasa y esterasas -5-6% proteasa MGBG 23 CBH 1 (-3-6%) Capacidad de Trigo, cebada, >60°C (hasta Glucooligosacáridos CBH II (-3-6%) digestión mejorada; centeno 85/90°C) bajos DP, P(1,3)4-glucanasa (35-45%) xilooligosacáridos, con 6-glucosidasa (-3-6%) Glucooligosacárído, monosacáridos Xilanasa (-30%) xilooligosa cálidos significativos o 0.5-2.0%-Xilosidasa, algunas otras -2-5%; Exoxilanasa, Alto potencial de cantidades más 0.5-2%, a-Glucuronidasa liberación de pequeñas de 1-5% a-L-arabinofuranosidasa; antioxidantes azúcares, etc. 5- 10% enzimas pectinolítícas, -2-4% actividad de modificación de almidón; -10% otras hemicelulosas, 6- 10%, oxidorreductasa/oxidasa y esterasas -8-10% proteasa Para alimento para Ganado enriquecido con oligosacáridos clavre, por ejemplo Galactooligosacáridos - el mejor cocktail de la enzima MGBG 16 Glucooligosacáridos - los mejores son MGBG 16 y 22 Fructooligosacáridos - el mejor cocktail es MGBG 21. Para preparaciones de alimento para ganado enriquecidas con el antioxidante, los mejores cocktails para utilizarse para tratamiento se preparan en MGBG 13, 16 y 23. Ejemplo 11 Aplicaciones de alimento para Ganado para animales monogástricos Se llevaron a cabo estudios en temperaturas dentro del rango de 50 a 85°C (con agitación en 140 rpm), con fracciones de cereal crudas (lotes 1-5 g). La hidrólisis del candidato en el substrato, a través de cada preparación de enzimas (0.5 IU de dosis máxima por g de substrato), fue monitoreada durante 24 horas cuantificando azúcares de reducción liberados y productos formados en las muestras eliminados de la mezcla de reacción en intervalos periódicos.

Tabla 17 Coctel Composición de coctel (%) Aplicación objetivo Substrato Temperatura óptima Productos de tratamiento (°C) MGBG 24 CBH I (1-5%) Capacidad de Cebada, mijo, trigo, >60"C (hasta 85°C) Principalmente CBH II (1-5%) digestión mejorada. avenas. glucooligosacáridos y P(1 ,3)4-glucanasa (27-43%) Producción de xilooligosacáridos y ß-glucosidasa (2-10%) pentosa de bajo nivel, Dietas de cebada- algunas otras Xilanasa (44-48%) productos frijol soya. Dietas de cantidades menores 0.1-0.4%(3-Xilosidasa, alimenticios a base maíz-trigo-fríjol soya. de azúcares diversos. 0.1-3.0 a-Glucuronidasa de cereal fácilmente Dietas de trigo- Algunos de los 0.1-0.4% a-L-Arabinofuranosidasa; digeridos para aves centeno-frijol soya. productos de 5-10% enzimas pectinolíticas, y esterasas de corral y cerdos, en oligosacárido (y 20-25% proteasa donde se han péptido) pueden tener reducido mediante propiedades que fragmentación refuerzan la salud. enzimática las propiedades de enlace-agua de ß-1 ,3; 1 ,4-glucanos viscosos. MGBG 17 Tal como anteriormente MGBG 25 CBH I (0.5-2.5%) Capacidad de Cebada, avena, >60°C (hasta 85°C) Principalmente CBH II (0.5-2.5%) digestión mejorada, centeno glucooligosacáridos y P(1 ,3)4-glucanasa (15-20%) producción de xilooligosacáridos (DP ß-glucosidasa (4-10%) pentosa de bajo nivel, 2-6) Xilanasa (70-88%) productos 0.1-0.4% ß-Xilosidasa, alimenticios a base 0.1-2.0% a-Glucuronidasa de cereal fácilmente 0.1-1.0% a-L-arabinofuranosidasa; digerido para aves de 1-6% enzimas pectinolíticas, y esterasas corral y cerdos. >30% 8-10% proteasa de hidrólisis de ß- glucan no celulósico presente en centeno, el cual está acompañado por una marcada disminución en viscosidad Se observó una hidrólisis significativa de la fracción de xilan y ß-glican no celulósico, lo cual dio como resultado la formación de productos de hidrólisis, de oligosacárido de cadena media a más larga, los cuales también podrían ser substratos de fermentación adecuados para microorganismos prebióticos. Ejemplo de producción de biogas Se utilizaron dos reactores híbridos anaeróbicos de flujo ascendente de 10 L (UAHR; Reynolds, 1986), uno se mantuvo a una temperatura de 37°C y el otro de 55°C para la producción de biogas a través de poblaciones mezcladas individuales de bacterias mesofílicas y termofílicas, respectivamente. Se bombeo el hidrolizado con alto contenido de azúcar en forma ascendente a través de la cama de sedimento y fue degradado por las comunidades de microorganismos presentes. Se utilizó un aparato de separación en la parte superior del reactor para separa el gas producido de cualesquiera de las partículas de sedimento que puedan haber sido descargadas durante la digestión anaeróbica. Ambos reactores se evaluaron en forma continua a lo largo de un período de operación de 650 días monitoreando la eficiencia de la eliminación COD (APHA, 1992), reducción de carbohidratos totales (método de Dubois) y producción de metano. La producción de ácidos grados, un indicador de metabolismo de azúcar y la producción de metano fueron monitoreadas mediante cromatografía de gas (GC).

El biocombustible puede ser producido de un número de materias primas de los desechos de alimentos y vegetales descritos más adelante para la producción de biogas mediante digestión anaeróbica. n en en Tabla 18 (*% de metano en biogas normalmente es de 50-65% max.); Los datos en la tabla 18 se lograron en tiempos de retención únicamente de 3 días, en contraste con reportes en la literatura, los cuales los tiempos de retención normalmente son entre 9 y 30 días. Los tiempos de retención indican el período tomado (o la fase de retención) para el metabolismo de materias primas de carbohidratos y producción de biogas. Ejemplo 12 Producción de bioetanol Se llevó a cabo la hidrólisis enzimática estándar a temperaturas de 37°C, 50°C y 60°C en envases de 300 mi y 1 L con agitación en -130 rpm. La dosificación de enzimas fue de 32 FPU para cada preparación de enzimas por gramos de celulosa en una solución de substrato amortiguada (tal como lo describe Gilleran, (NUI, Galway, Ph.D. Thesis, 2004) peso total procesado = 100 g a escala de laboratorio). El pH del amortiguador de reacción se ajustó a pH 5.0. Las muestras fueron eliminadas en intervalos programados y la acción enzimática se terminó hirviendo durante 10 minutos. En un período de 0 a 72 horas se midió lo siguiente: • Liberación de azúcares de reducción y detección y cuantificacion de azúcares individuales (expresados como g/L).

• Análisis HPLC de los productos de azúcar de hidrólisis (cantidades de producto expresadas en g/L). • Reducción de peso/volumen del residuo. • Contenido de fibra de celulosa antes y después del tratamiento enzimático.

Microscopio de exploración de electrones (SEM) de la integridad antes y después del tratamiento con enzimas. La producción de ácidos grasos clave durante el metabolismo de azúcares mediante bacterias anaeróbicas y la producción de metano, fueron monitoreadas mediante cromatografía de gas (GC). El bioetanol producido mediante fermentación de levadura fue medida utilizando dos métodos, un equipo de ensato enlazado con enzimas para cuantificación de etanol (r-Biopharm, Alemania) y también mediante cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC). Se probaron en estudios a escala de laboratorio hidrolizado de abeto Sitka, desechos de papel y residuos de madera (mezcla de residuo de coniferas, principalmente abetos sitka). Se investigaron dos formatos de producción de etanol, SHF (Hidrólisis y Fermentación Secuencial) y SSF (Sacarificación y Fermentación Simultánea).

Tabla 19: Composición de coctel de enzimas producción de Bioetanol Enzima MGBG V MGBG 2° MGBG 3C MGBG 4a CBH I 20-28 15-20 15-17 12-15 CBH II 15-20 20-28 22-26 24-30 ß-(1 ,3)4-glucanasa 20-25 20-26 25 20-22 ß-glucosidasa 10-12 10-11 11-15 -10.0 Xilanasa 20-25 18-30 24-27 20-30 ß-Xilosidasa, 5-10 8-10 10-12 5-8 a-Glucuronidasa 5-8 8-10 6-8 8-10 a-L-Arabinofurano- 0.5-2.0 0.5-2.0 2-4.0 1.5-3.0 sidasa (Otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinolíticas, ácido fenólico y enterasas 8-15 6-17 12-15 10-15 de acetilo (xilan), proteasa; actividades de oxidasas que modifican lignina) Datos de estudios de 1 L escala- aboratorio en SHF y SSF; valores de hidrólisis están basados en la celulosa disponible y cualquier hemicelulosa residual en substrato. n ? Jl Tabla 20: Comparación de producción de Bioetanol de hidrolizado de abeto generado mediante composiciones de la presente invención y enzimas comerciales N3 OI O en en Tabla 21 Producción de Bioetanol de desecho de papel y residuos de madera suave generados a través de los cocteles de enzimas termoestables de T. emersonii en comparación con enzimas comerciales (datos de estudios de 1 L escala- laboratorio en SHF y SSF; los valores de hidrólisis están basados en la celulosa disponible y cualquier hemicelulosa residual en el substrato) r r n o en en Tabla 22: Otros cocteles para producción de hidrolizados fermentables con alto contenido de azúcar procedentes de corrientes de desecho vegetales/frutas Coctel Composición de coctel (%) Aplicación objetivo Substrato Temperatura Productos óptima de de azúcar tratamiento (°C) MGBG 18 CBH I (5-10%) Producción de azúcares fermentables Desecho >60°C (hasta Xilosa, CBH II (5-10%) para la fabricación de biocombustible vegetal/fruta 80°C) Glucosa, p(1 ,3)4-glucanasa (25-40%) y/o otros productos de alto valor, por mezclada Acido ß-glucosidasa (~5%) ejemplo reservas alimenticias (restaurant) galacturónico, Xilanasa (18-25%) bio(quimicos)/quimicos, carotenoides, Fructosa, +[1-2.0%P-Xilosidasa, 1-3.0%; Exoxilanasa, 8-10%, a- antibióticos, probióticos, etc. Arabinosa, Glucuronidasa Galactosa, 1.5-5.0% a-L-Arabinofuranosidasa; 10-15% enzimas Ramnosa pectinol ¡ticas, incluyendo ß-galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactasa, 5-7% actividad de modificación de almidón; 5-10% de otras hemicelulasas, incluyendo ß-galactosidasa, 1-4%, oxidorreductasa/oxidasa y esterasas + 8-12% de proteasa] GBG 32 CBH I (1-5%) Producción de azúcares fermentables Desecho >60°C (hasta Xilosa, CBH II (1-5%) para la fabricación de biocombustible vegetal/fruta 80°C) Glucosa, P(1 ,3)4-glucanasa (20-25%) y/o otros productos de alto valor, por mezclada Acido ß-glucosidasa (8-12%) ejemplo reservas alimenticias (restaurant) galacturónico, Xilanasa (30-35%) (bio)químicas/químicas, carotenoides, Fructosa, +[0.5-1.5%B-Xilosidasa, antibióticos, probióticos, También fruta Arabinosa, 1-2.5% a-L-Arabinofuranosidasa; 18-25% enzimas precursores de aroma y sabor, etc. blanda mezclada Galactosa, pectinolíticas, incluyendo ß-galactosidasa, Se pueden utilizar también para una Ramnosa ra m nogalactu ronasa , pol igalactu ronasa , extracción mejorada de jugos y exogalacturonasa y galactasa, -5-10% actividad de producción de "bebidas para la salud" modificación de almidón; 8-15% oxidorreductasa/oxidasa y esterasas + 10-15% de proteasa] MGBG 6 (4% CBH I (1-5%) Producción de azúcares fermentables Desecho >60°C (hasta Xilosa, zanahoria/BP; CBH II (1-5%) para fabricación de biocombustible y vegetal/fruta 85°C) Glucosa, 1 :1) p(1 ,3)4-glucanasa (22-28%) otros productos de alto valor, por mezclada Acido ß-glucosidasa (10-15%) ejemplo reservas alimenticias (restaurant) galacturónico, Xilanasa (25-30%) (bio)qu¡micas/quimicas, carotenoides, Fructosa, +[0.7-2.1 %B-Xilosidasa, antibióticos, probióticos, precursores También fruta Arabinosa, 2-4% a-L-Arabinofuranosidasa; 20-25% enzimas de aroma y sabor, etc. Se pueden blanda mezclada Galactosa, pectinolíticas, incluyendo ß-galactosidasa, utilizar para extracción mejorada de Ramnosa ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, jugos y producción "bebidas para la exogalacturonasa y galactasa, -5-8% actividad de salud" modificación de almidón; 12-15% oxidorreductasa/oxidasa y esterasas + 8-12% de Ni G O en Tabla 23 Cocteles para producción de hidrolizados fermentables con alto contenido de azúcar de corrientes de desecho de hospital con alto contenido de celulosa Coctel Composición de coctel (%) Aplicación objetivo Substrato Temperatura Productos de óptima de azúcar tratamiento (°C) MGBG 1 CBH I (20-28%) Producción de azúcares fermentables Corriente de 65°C (hasta 85°C) Principalmente CBH II (15-20%) para fabricación de biocombustible desecho de glucosa; (1 ,3)4-glucanasa (20-25%) hospital con alto cantidad B-glucosidasa (10-12%) contenido de menor de Xilanasa (20-25%) celulosa xilosa ß-Xilosidasa (5-10%) esterilizado a-Glucuronidasa (5-8%) a-L-Arabinofuranosidasa (0.5-2.0%) (8-15%: Otras hidrolasas incluyendo enzimas pectinolíticas, ácido fenólico y esterasas de acetil(xilan), proteasa; actividades de oxidasa de modificación de lignina) (O D MGBG 2 CBH I (15-20%) Producción de azúcares fermentables Corriente de 60°C (hasta 85"C) Glucosa y CBH II (20-28%) para fabricación de biocombustible desecho de xilosa como ß(1 ,3)4-glucanasa (20-26%) hospital con' alto los azúcares B-glucosidasa (10-11 %) contenido de principales, Xilanasa (18-30%) celulosa con cierto B-Xílosidasa (8-10%) esterilizado contenido de a-Glucuronidasa (8-10%) mañosa, a-L-Arabinofuranosidasa (0.5-2.0%) galactosa y (6-17%: Otras hidrolasas incluyendo enzimas ácido pectinolíticas, ácido fenólico y esterasas de galacturónico acetil(xilan), proteasa; actividades de oxidasa de modificación de lignina) MGBG 4 CBH I (12-15%) Producción de azúcares fermentables Corriente de 60°C (hasta 85°C) Glucosa y CBH II (24-30%) para fabricación de biocombustible desecho de xilosa como ß(1 ,3)4-glucanasa (20-22%) hospital con alto los azúcares B-glucosidasa (-10%) contenido de principales, Xilanasa (20-30%) celulosa con cierto B-Xilosidasa (5-8%) esterilizado contenido de a-Glucuronidasa (8-10%) mañosa, a-L-Arabinofuranosidasa (1.5-3.0%) galactosa y (10-15%: Otras hidrolasas incluyendo enzimas ácido pectinolíticas, ácido fenólico y esterasas de galacturónico acetil(xilan), proteasa; actividades de oxidasa de modificación de lignina) G O a? Tabla 23 continuación GBG 27 CBH I (50-55%) Producción de azúcares fermentables Comente de 60°C (hasta 85°C) Xilosa, CBH II (20-25%) para fabricación de biocombustible desecho de Glucosa, P(1,3)4-glucanasa (12-20%) hospital con alto como en los p-glucosidasa (5-8%) contenido de azúcares Xilanasa (-5%) celulosa principales, ß-Xilosidasa (0.1-0.5%) esterilizado con cierto a-L-Arabinofuranos¡dasa (0.5-2.0%) contenido de (5-8%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas galactosa pectinol ¡ticas seleccionadas, estearasas; 0.5-1.5% Proteasa; 0.5-1.5% actividades de oxidasa) MGBG 31 CBH I (5-10%) Producción de azúcares fermentables Comente de 60°C (hasta 85°C) Glucosa y CBH II (-15%) para fabricación de biocombustible desecho de xilosa como P(1,3)4-glucanasa (28-32%) hospital con alto en los ß-glucosidasa (8-12%) contenido de azúcares Xilanasa (22-30%) celulosa principales ß-Xilosidasa (10-15%) esterilizado con cierto a-Glucuronidasa (2-5%) contenido de a-L-Arabino uranosidasa (1-3.0%) mañosa y (20-25%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas galactosa pectinol ¡ticas, ácido fenólico y esterasas(xilano), proteasa; enzimas de modificación de almidón, actividades de oxidasa de modificación de lignina) MGBG 34 CBH 1 (20-25%) Producción de azúcares fermentables Corriente de 60°C (hasta 85°C) Glucosa y CBH II (10-15%) para fabricación de biocombustible desecho de xilosa como P(1 ,3)4-glucanasa (24-28%) hospital con alto en los ß-glucosidasa (10-15%) contenido de azúcares Xilanasa (25-30%) celulosa principales, B-Xilosidasa (5-8%) esterilizado con cierto a-Glucuronidasa (1-3%) contenido de a-L-Arabinofuranosidasa (2-3.0%) mañosa y (5-10%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas galactosa pectinol ¡ticas, ácido fenólico y esterasas(xilano), proteasa; enzimas de modificación de almidón, actividades de oxidasa de modificación de lignina) r r en o a? OI Tabla 23 continuación GBG 35 CBH 1 (10-12%) Producción de azúcares fermentables Corriente de 60°C (hasta 85°C) Glucosa y CBH II (-15%) para fabricación de biocombustible desecho de xilosa como P(1 ,3)4-glucanasa (30-40%) hospital con alto los azúcares ß-glucosidasa (5-10%) contenido de principales, Xilanasa (15-28%) celulosa con cierto ß-Xilosidasa (2-5%) esterilizado contenido de a-Glucuronidasa (1-3%) mañosa, a-L-Arabinofuranosidasa (1-3.0%) galactosa y (-15%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas ácido pectinoliticas, ácido fenólico y esterases de acetil(xilan) galacturónico proteasa; enzimas de modificación de almidón, actividades de oxidasa de modificación de lignina) MGBG 35 CBH I (10-12%) Producción de azúcares fermentables Comente de 60°C (hasta 85°C) Glucosa y CBH II (-15%) para fabricación de biocombustible desecho de xilosa como P(1 ,3)4-glucanasa (30-40%) hospital con alto los azúcares ß-glucosidasa (5-10%) contenido de principales, Xilanasa (15-28%) celulosa con cierto ß-Xilosidasa (2-5%) esterilizado contenido de a-Glucuronidasa (1-3%) mañosa, a-L-Arabinofuranosidasa (1 -3.0%) galactosa y (-15%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas ácido pectinoliticas tales como ß-galactosidasa, galacturónico ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exo- galacturonasa, enzimas de degradación de manan tal como a-galactosidasa, ácido fenólico y esterasas de acetil(xilan) proteasa; enzimas de modificación de almidón, actividades de oxidasa de modificación de lignina) MGBG 37 CBH 1 (15-20%) Producción de azúcares fermentables Corriente de 60°C (hasta 85°C) Glucosa y CBH II (35-40%) para fabricación de biocombustible desecho de xilosa como P(1,3)4-glucanasa (20-25%) hospital con alto en los ß-glucosidasa (5-10%) contenido de azúcares Xilanasa (15-20%) celulosa principales, -Xilosidasa (1-3%) esterilizado con cierto a-Glucuronidasa (0.5-2%) contenido de a-L-Arabinofuranosidasa (1-3.0%) mañosa y (12-15%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas galactosa pectinoliticas tales como ß-galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exo- galacturonasa, enzimas de degradación de manan tal como a-galactosidasa, ácido fenólico y esterasas de acetil(xilan) proteasa; enzimas de modificación de almidón, actividades de oxidasa de modificación de lignina) Tabla 23 continuación GBG 38 CBH 1 (25-30%) Producción de azúcares fermentados Textiles con alto 60°C (hasta 85 ) Glucosa, CBH II (15-20%) para fabricación de biocombustible y contenido de cierto P(1 ,3)4-glucanasa (15-20%) otros productos de alto valor, algodón, contenido de 6-glucosidasa (2-8%) incluyendo antibióticos, carotenoides especialmente mañosa, Xilanasa (25-30%) compuestos de sabor y aroma de en formas de galactosa y ß-Xilosidasa (1-3%) alimentos, reservas alimenticias algodón ácido a-Glucuronidasa (0.5-2%) químicas, etc. altamente galacturónico, a-L-Arabinofuranosidasa (1-3.0%) purificadas cantidades (15-20%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas menores de pectinolíticas tales como B-galactosidasa, xilosa. ramnogalacturonasa, polígalacturonasa, exo- galacturonasa, enzimas de degradación de manan tal como a-galactosidasa. ácido fenólico y esterasas de acetil(xilan) proteasa; enzimas de modificación de almidón, actividades de oxidasa de modificación de lignina) MGBG 39 CBH I (20-25%) Producción de azúcares fermentados Textiles con alto 60°C (hasta 85°C) Glucosa CBH II (20-25%) para fabricación de biocombustible y contenido de principalmente 3(1,3)4-glucanasa (20-25%) otros productos de alto valor, algodón, con cierto B-glucosidasa (8-12%) incluyendo antibióticos, carotenoides incluyendo fibras contenido de Xilanasa (20-25%) compuestos de sabor y aroma de más mezcladas xilosa y B-Xilosidasa (2-5%) alimentos, reservas alimenticias mañosa a-Glucuronidasa (1-3%) químicas, etc. a-L-Arabinofuranosidasa (1-3.0%) (8-12%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinolíticas tales como B-galactosidasa, ramnogalacturonasa, polígalacturonasa, exo- galacturonasa, enzimas de degradación de manan tal como a-galactosidasa, ácido fenólico y esterasas de acetil(xilan) proteasa; enzimas de modificación de almidón, actividades de oxidasa de modificación de lignina) MGBG 40 CBH I (15-25%) Producción de azúcares fermentados Corriente de 60°C (hasta 85°C) Glucosa y CBH II (15-20%) para fabricación de biocombustible. desecho de xilosa como (1,3)4-glucanasa (25-30%) hospital con alto los azúcares B-glucosidasa (5-10%) contenido de principales, Xilanasa (20-25%) celulosa con cierto ß-Xilosidasa (0.5-2%) esterilizado contenido de a-Glucuronidasa (0.5-2%) mañosa y a-L-Arabinofuranosidasa (1.5-4.0%) galactosa (20-25%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinolíticas tales como ß-galactosidasa, ramnogalacturonasa, polígalacturonasa, exo- galacturonasa, enzimas de degradación de manan tal como a-galactosidasa, ácido fenólico y esterasas de acetil(xilan) proteasa; enzimas de modificación de almidón, actividades de oxidasa de modificación de r en en en Tabla 23 continuación MGBG 43 CBH 1 (10-15%) Producción de azúcares fermentados Corriente de 60°C (hasta 85°C) Glucosa y CBH II (20-25%) para fabricación de biocombustible desecho de xilosa como 3(1,3)4-glucanasa (25-30%) hospital con alto los azúcares ß-glucosidasa (5-10%) contenido de principales, Xilanasa (25-30%) celulosa con cierto ß-Xilosidasa (5-10%) esterilizado) contenido de a-Glucuronidasa (1-3%) mañosa a-L-Arabinofuranosidasa (1-3.0%) (10-14%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinolíticas, ácido fenólico y esterasas de acetil(xilan) proteasa; enzimas de modificación de almidón, actividades de oxidasa de modificación de lignina) ( r n o en en Tabla 24: Cocteles para producción de hidrolizados con alto contenido de azúcar fermentables de corrientes de desecho textil Coctel Composición de coctel (%) Aplicación objetivo Substrato Temperatura Productos de óptima de azúcar tratamiento (°C) GBG 34 CBH 1 (20-25%) Producción de azúcares fermentados Textiles con alto 60°C (hasta 85°C) Glucosa CBH II (10-15%) para fabricación de biocombustible y contenido de principalmente P(1,3)4-glucanasa (24-28%) otros productos de alto valor algodón con cierto ß-glucosidasa (10-15%) incluyendo antibióticos, carotenoides, contenido de Xilanasa (25-30%) compuestos de sabor y aroma de xilosa, B-Xilosidasa (5-8%) alimentos, reservas alimenticias galactosa y a-Glucuron¡dasa (1-3%) químicas, etc. ácido a-L-Arabinofuranosidasa (2-3.0%) galacturónico (5-10%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinolíticas, ácido fenólico y esterasas de acetil(xilan) proteasa; enzimas de modificación de almidón, actividades de oxidasa de modificación de lignina) MGBG 37 CBH I (15-20%) Producción de azúcares fermentados Textiles con alto 65°C (hasta 85°C) Glucosa CBH II (35-40%) para fabricación de biocombustible y contenido de principalmente, P(1 ,3)4-glucanasa (20-25%) otros productos de alto valor algodón, algunas ß-glucosidasa (5-10%) incluyendo antibióticos, carotenoides, incluyendo fibras cantidades Xilanasa (15-20%) compuestos de sabor y aroma de más mezcladas menores de p-Xilosidasa (1-3%) alimentos, reservas alimenticias y textiles de xilosa y a-Glucuronidasa (0.5-2%) químicas, etc. algodón más mañosa a-L-Arabinofuranosidasa (1-3.0%) procesado (12-15%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinolíticas tales ß-galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exo- galacturonasa, enzimas de degradación de manan tal como a-galactosidasa, ácido fenólico y esterasas de acetil(xilan) proteasa; enzimas de modificación de almidón, actividades de oxidasa de modificación de lignina) Tabla 24 continuación MGBG 38 CBH 1 (25-30%) Producción de azúcares fermentados Textiles con alto 60°C (hasta 85°C) Glucosa cierto CBH II (15-20%) para fabricación de biocombustible y contenido de contenido de P(1 ,3H-glucanasa (15-20%) otros productos de alto valor algodón mañosa, B-glucosidasa (2-8%) incluyendo antibióticos, carotenoides, especialmente galactosa y Xilanasa (25-30%) compuestos de sabor y aroma de en formas de ácido B-Xilosidasa (1-3%) alimentos, reservas alimenticias algodón galacturónico. a-Glucuronidasa (0.5-2%) químicas, etc. altamente Cantidades a-L-Arab¡nofuranosidasa (1-3.0%) purificadas menores de (15-20%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinolíticas tales ß-galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exo- galacturonasa, enzimas de degradación de manan tal como a-galactosidasa, ácido fenólico y esterasas de acetil(xilan) proteasa; enzimas de modificación de almidón, actividades de oxidasa de modificación de lignina) MGBG 39 CBH I (20-25%) Producción de azúcares fermentados Textiles con alto 65°C (hasta 85°C) Glucosa CBH II (20-25%) para fabricación de biocombustible y contenido de principalmente, (1 ,3K-glucanasa (20-25%) otros productos de alto valor algodón, con cierto ß-glucosidasa (8-12%) incluyendo antibióticos, carotenoides, incluyendo fibras contenido de Xilanasa (20-25%) compuestos de sabor y aroma de más mezcladas xilosa y B-Xilosidasa (2-5%) alimentos, reservas alimenticias mañosa a-Glucuronidasa (1-3%) químicas, etc. a-L-Arabinofuranosidasa (1-3.0%) (8-12%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinolíticas tales ß-galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exo- galacturonasa, enzimas de degradación de manan tal como a-galactosidasa, ácido fenólico y esterasas de acetil(xilan) proteasa; enzimas de modificación de almidón, actividades de oxidasa de modificación de lignina) Tabla 25: Cocteles para producción de hidrolizados con alto contenido de azúcar fermentable procedentes de cereales, incluyendo cosechas completas, granos, procesamiento de residuos y desechos de elaboración de cerveza r en o en en Tabla 25 continuación GBG 8 CBH 1 (5-10%) Producción de azúcares fermentados para Cereales, >60°C (hasta 80°C) Xilosa, CBH II (5-10%) fabricación de biocombustible y/o otros incluyendo arabinosa, (1,3)4-glucanasa (-20%) productos de alto valor, por ejemplo cosechas Glucosa, B-glucosidasa (4-8%) reservas alimenticias completas, granos, Celobiosa, Xilanasa (25-30%, incluyendo 5-10%, Exoxilanasa) (biojquímicas/qulmicas, carotenoides, procesamiento de xilobiosa, +[1-2.0%p-Xilosidasa, 5-8%; a-Glucuronidasa, 0.5-3.0% a-L- antibióticos, probióticos, edulcorantes residuos y cantidades Arabinofuranosidasa; 8-12% de enzimas pectinolíticas, naturales, etc. desechos de menores de incluyendo ß-galactosidasa, ramnogalacturonasa, elaboración de ácido poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, 8-12% de cerveza - glucurónico, actividad de modificación de almidón; 5-10% de otras especialmente ácidos fenólicos hemicelulasas incluyendo a-galactosidasa, 1-3%, trigo, avena, y galactosa. oxidorreductasa oxidasa y esterasas + 10-12% proteasa] cebada, residuos de malta/masijo (incluyendo granos de destiladores) GBG 9 CBH I (5-10%) Producción de azúcares fermentados para Cereales, >60°C (hasta 80°C) Xilosa, CBH II (5-10%) fabricación de biocombustible y/o otros incluyendo arabinosa, ß(1,3)4 ???3?333 (20-25%, incluyendo liquenanasa de alto productos de alto valor, por ejemplo cosechas Glucosa, nivel) reservas alimenticias completas, granos, Celobiosa, ß-glucosidasa (8-10%) (bio)quimicas/qulmicas, carotenoides, procesamiento de xilobiosa, Xilanasa (25-30%) incluyendo -8-12%, Exoxilanasa) antibióticos, probióticos, edulcorantes residuos y cantidades +[2-5.0%|3-X¡losidasa, 1-4%; a-Glucuronidasa, 2.5-0% a-L- naturales, etc. desechos de menores de Arabinofuranosidasa; 5-10% de enzimas pectinolíticas, elaboración de ácido incluyendo a-galactosidasa, ramnogalacturonasa, cerveza - glucurónico, O poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, 5-10% de especialmente ácidos fenólicos actividad de modificación de almidón; 3-6% de otras trigo, avena, y galactosa. hemicelulasas incluyendo B-galactosidasa, 2-4%, cebada, sorgo y oxidorreductasa/oxidasa y esterasas + 5-10% proteasa] residuos adjuntos más novedosos, residuos de malta/masijo (incluyendo granos de destiladores) MGBG 10 CBH I (3-6%) Producción de azúcares fermentados para Cereales, >60°C (hasta 80°C) Xilosa, CBH II (5-10%) fabricación de biocombustible y/o otros incluyendo arabinosa, P(1,3)4-glucanasa (25-40%, incluyendo liquenanasa de alto productos de alto valor, por ejemplo cosechas Glucosa, nivel) reservas alimenticias completas, granos, Celobiosa, B-glucosidasa (2-5%) (bio)quimicas/qulmicas, carotenoides, procesamiento de xilobiosa, Xilanasa (-25-30%, incluyendo -10-15%, Exoxilanasa) antibióticos, probióticos, edulcorantes residuos y cantidades +5-12%B-Xilosidasa, 2-5%; a-Glucuronidasa, 2.5-0% a-L- naturales, etc. desechos de menores de Arabinofuranosidasa; -5-8% de enzimas pectinolíticas, elaboración de ácido incluyendo ß-galactosidasa, ramnogalacturonasa, cerveza glucurónico, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, 2-5% de especialmente ácidos fenólicos actividad de modificación de almidón; 2-5% de otras trigo, avenas, y galactosa. hemicelulasas incluyendo ß-galactosidasa, 1-3%, cebada, maiz, Cierto contenido oxidorreductasa/oxidasa y esterasas + 3-6% proteasa] centeno, residuos de de malta/masijo oligosacárídos (incluyendo granos superiores. de destiladores) G OI O en en Tabla 25 continuación MGBG 11 CBH 1 (1-5%) Producción de azúcares fermentados Cereales, >60°C (hasta Xilosa, CBH II (5-8%) para fabricación de biocombustible y/o incluyendo 80°C) arabinosa, ß(1,3)4^???3?353 (20-25%, incluyendo actividad otros productos de alto valor, por cosechas Glucosa, against high and médium DP mixed-linkage glucans) ejemplo reservas alimenticias completas, cantidades B-glucosidasa (20-30%) (bio)quimicas/quím¡cas, carotenoides, granos, menores de Xilanasa (-15-20%, incluyendo -3-6%, Exoxilanasa) antibióticos, probióticos, edulcorantes procesamiento ácido +2.6%B-Xilosídasa, 1-3%; naturales, etc. de residuos y glucuróníco, a-Glucuronidasa, desechos de ácido fenólico, 0.5-3.0% a-L-Arabinofuranosidasa; -8-12% de elaboración de galactosa y enzimas pectinolíticas, incluyendo ß-galactosidasa, cerveza - ramnosa. ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, especialmente Cierto exogalacturonasa y galactanasa, 5-10% de actividad trigo, maíz, contenido de de modificación de almidón; 6-11 % de otras avenas, cebada, oligosacáridos hemicelulasas incluyendo a-galactosidasa, 3-7%, maíz, centeno, superiores. oxidorreductasa/oxidasa y esterasas + 10-12% residuos de proteasa] malta/masijo (incluyendo granos de destiladores) MGBG 13 CBH I (5-10%) Producción de azúcares fermentados Cereales, >60°C (hasta Xilosa, O CBH II (5-10%) para fabricación de biocombustible y/o incluyendo 80°C) arabinosa, 00 (1 ,3)4-glucanasa (2S40%) otros productos de alto valor, por cosechas Glucosa, ß-glucosidasa (-5%) ejemplo reservas alimenticias completas, Celobiosa, Xilanasa (18-25%) (bio)quimicas/quím¡cas, carotenoides, granos, xilobiosa, +[1-2.0%P-Xilosidasa, 1-3.0%; Exoxilanasa, 8-10% antibióticos, probióticos, edulcorantes procesamiento Galactosa a-Glucuronidasa, naturales, etc. de residuos y ácido 1.5-5.0% a-L-Arabinofuranosidasa; 10-15% de desechos de glucuróníco, enzimas pectinolíticas, incluyendo B-galactosidasa, elaboración de ciertos ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, cerveza - contenido de exogalacturonasa y galactanasa, 5-7% de actividad de especialmente ácidos modificación de almidón; 5-10% de otras avenas, cebada, fenólicos, hemicelulasas incluyendo a-galactosidasa, 1-4%, trigo, residuos ácido oxidorreductasa/oxidasa y esterasas + 8-12% de malto/masijo Galacturónico proteasa] (incluyendo y Ramnosa granos de destiladores) Tabla 26: Cocteles para producción de hidrolizados fermentados con alto contenido de azúcar de desechos hortícolas a base de no cereal, incluyendo pastos (y ensilaje), hojas, recortes de podas y corrientes de desecho de floristas Coctel Composición de coctel (%) Aplicación objetivo Substrato Temperatura Productos de óptima de azúcar tratamiento (°C) GBG 2 CBH 1 (15-20%) Producción de azúcares fermentados Desechos 60°C (hasta 85°C) Glucosa y xilosa CBH II (8-15%) para fabricación de biocombustible y/o hortícolas, como los ß(1 ,3)4-glucanasa (20-26%) otros productos de alto valor, por incluyendo azúcares principales, con B-glucosidasa (10-11%) ejemplo reservas alimenticias grasas, hojas, cierto contenido Xilanasa (18-30%) (bio)químicas/químicas, carotenoides, recortes de poda de arabínosa, ß-Xilosidasa (8-10%) antibióticos, probióticos, edulcorantes y corrientes de mañosa y a-Glucuronidasa (8-10) naturales, moléculas antioxidantes, desecho de galactosa, ácidos a-L-Arabinofuranosidasa (0.5-2.0%) etc. floristas glucurónico y (6-17%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas mezclados; galacturónico, pectinolíticas, ácido fenólico y esterases de especialmente ciertos ácidos fenólicos y acetil(xilano) proteasa; actividades de oxidasa de bueno para Ramnosa, asi modificación de lignina) materiales con como algunos más contenido oligosacáridos de madera DP superiores MGBG 13 CBH I (5-10%) Producción de azúcares fermentados Desechos 60°C (hasta 80°C) Xilosa, CBH II (5-10%) para fabricación de biocombustible y/o hortícolas, arabínosa, (1 ,3)4-glucanasa (25-40%) de otros productos de alto valor, por incluyendo Glucosa, Celobiosa, B-glucosidasa (~5%) ejemplo reservas alimenticias grasas, hojas, xilobiosa, Xilanasa (18-25%) (b¡o)quimicas/quim¡cas, carotenoides, recortes de poda Galactosa, +[1-2.0%|$-X¡los¡dasa, 1-3.0% Exoxilanasa, 8-10%, a- antibióticos, probióticos, edulcorantes y corrientes de mañosa, ácido Glucuronidasa, 1.5-5.0% a-L-Arabinofuranosidasa; 10- naturales, moléculas antioxidantes, desecho de Glucurónico, 15% de enzimas pectinolíticas, incluyendo a- etc. floristas algunos ácidos galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, mezclados; fenólicos, ácido exogalacturonasa y galactanasa, 5-7% de actividad de especialmente Galacturónico y Ramnosa. modificación de almidón; 5-10% de hemicelulosas, bueno para Algunos incluyendo a-galactosidasa, 1-4 de pastos y ensilaje oligosacáridos oxidorreductasa oxidasa y esterasas + 8-12% superiores. proteasa] MGBG 21 CBH I (5-10%) Producción de azúcares fermentados Desechos >60°C (hasta Xilosa, Glucosa, CBH II (5-10%) para fabricación de biocombustible y/o hortícolas, 80/85°C) Arabínosa, P(1 ,3)4-glucanasa (15%) otros productos de alto valor, por incluyendo Galactosa, mañosa, ácido (3-glucosidasa (-2-10%) ejemplo reservas alimenticias grasas, hojas, Galacturónico, Xilanasa (50-55%) (bio)químicas/químicas, carotenoides, recortes de poda alguna Fructosa, +[1-5%B-Xilosidasa, 5-10% Exoxilanasa, 1-4%, a- antibióticos, probióticos, edulcorantes y corrientes de Ramnosa, Glucuronidasa, 2-5% a-L-Arabinofuranosidasa; 20-25% naturales, moléculas antioxidantes, desecho de algunos ácidos de enzimas pectinolíticas, 4-6% de actividad de etc. floristas fenólicos y modificación de almidón; 7-10% de otras mezclados; sacarosa, hemicelulosas, 2-4% de oxidorreductasa/oxidasa y especialmente algunos oligosacáridos esterasas + -10% proteasa] bueno para superiores corteza Tabla 26 continuación MGBG 32 CBH 1 (1-5%) Producción de azúcares fermentados Desechos 60°C (hasta 80°C) Xílosa, Glucosa, CBH 11 (1-5%) para fabricación de biocombustible y/o hortícolas, Arabinosa, P(1 ,3)4-glucanasa (20-25%) otros productos de alto valor, por incluyendo Galactosa, ácido Galacturónico, B-glucosidasa (8-12%) ejemplo reservas alimenticias grasas, hojas, algunas Xilanasa (30-35%) (bio)químicas/químicas, carotenoides, recortes de poda Fructosa, +[0.5-1.5%B-Xilosidasa, antibióticos, probióticos, precursores y corrientes de Ramnosa, 1-2.5% a-L-Arabinofuranosidasa; 18-25% de enzimas de aroma de sabor, moléculas desecho de algunos ácidos pectinolíticas, incluyendo a-galactosidasa, antioxidantes, etc. floristas fenólicos ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, -5-10% de actividad de modificación de almidón; 5-15% de oxidorreductasa/oxidasa y esterases + 10-15% proteasa] GBG 34 CBH I (20-25%) Producción de azúcares fermentados Desechos 60"C (hasta 85*C) Glucosa, CBH II (10-15%) para fabricación de biocombustible y hortícolas, arabinosa y (1,3)4-glucanasa (24-28%) otros productos de alto valor incluyendo xílosa mainly con alguna lactosa y B-glucosidasa (10-15%) incluyendo antibióticos, carotenoides, grasas, hojas, ácido Xilanasa (25-30%) compuestos de sabor y aroma recortes de poda galacturónico; (5-Xiiosidasa (5-8%) alimenticio, reservas alimenticias y corrientes de ácidos fenólicos, a-Glucuronidasa (1-3%) químicas, etc. desecho de ramnosa, y a-L-Arabinofuranosidasa (2-3.0%) floristas algunos (5-10%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas oligosacárídos pectinolíticas, ácido fenólico y esterases de acetil(xilano) proteasa; enzimas de modificación de almidón, actividades de oxidasa de modificación de lignina) Ni OI OI OI Tabla 27: Cocteles para producción de hidrolizados fermentables con alto contenido de azúcar de corrientes de desecho de papel Los desechos de papel incluyen impresiones de periódicos blanco y negro, periódicos con color, revistas con papel brillante, vasos de papel, platos de papel, tejidos/paños medido, papel café, cartón corrugado, papel blanco de oficina, celofán, toallas de cocina, Kleenex y vendajes de algodón domésticos Coctel Composición de coctel (%) Aplicación objetivo Substrato Temperatura Productos de óptima de azúcar tratamiento (°C) GBG 26 CBH 1 (5-10%) Producción de azúcares fermentados Vasos de papel, 60°C (hasta 85°C) Glucosa, CBH II (45-50%) para fabricación de biocombustible y papel café, arabinosa y P(1 ,3)4-glucanasa (10-15%) otros productos de alto valor, Kleenex™ y xilosa, cierto B-glucosidasa (0.5-2.0%) incluyendo antibióticos, carotenoides, productos de contenido de Xilanasa (15-20%) compuestos de sabor y aroma para desecho de galactosa y S-Xilosidasa (0.2-1.0%) alimentos, reservas alimenticias papel ácido a-Glucuronidasa (0.5-2.0%) químicas, etc. relacionados galacturónico; a-L-Arabinofuranosidasa (0.5-1.5%) algunos Otras hidrolasas, incluyendo 3-6% enzimas oligosacáridos pectinolíticas, 0.2-1.0 ácido fenólico y esterasas de acetil(xilano) 1-5% proteasa; 5-10% enzimas de modificación de almidón, 2-5% oxidorreductasa/ actividades de oxidasa) GBG 27 CBH I (50-55%) Producción de azúcares fermentados Papel blanco de 60°C (hasta 85°C) Glucosa, CBH II (20-25%) para fabricación de biocombustible y oficina, platos de cantidades P(1 ,3)4-glucanasa (12-20%) otros productos de alto valor, papel y menores de B-glucosidasa (5-8%) incluyendo antibióticos, carotenoides, productos arabinosa y Xilanasa (-5%) compuestos de sabor y aroma para relacionados xilosa, B-Xilosidasa (0.1-0.5%) alimentos, reservas alimenticias galactosa y a-L-Arabinofuranosidasa (0.5-2.0%) químicas, etc. ácido (5-8%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas galacturónico, pectinolíticas seleccionadas, esterasas; 0.5-1.5% algunos Proteasa; 0.5-1.5% actividades de oxidasa) oligosacáridos, aunque principalmente monosa cálidos r O! OI Tabla 27 continuación Coctel Composición de coctel (%) Aplicación objetivo Substrato Temperatura Productos de óptima de azúcar tratamiento (°C) MGBG 28 CBH 1 (10-15%) Producción de azúcares fermentados Papel blanco de 60°C (hasta 85°C) Glucosa, CBH II (30-35%) para fabricación de biocombustible y oficina, platos de cantidades (1 ,3)4-glucanasa (15-20%) otros productos de alto valor, papel y menores de ß-glucosidasa (2-5%) incluyendo antibióticos, carotenoides, productos arabinosa y Xilanasa (20-25%) compuestos de sabor y aroma para relacionados xilosa, S-Xilosidasa (0.5-2.0%) alimentos, reservas alimenticias galactosa y a-L-Arabinofuranosidasa (0.5-2.0%) químicas, etc. ácido (17-26%: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas galacturónico; pectinol iticas seleccionadas y enzimas de modificación cierto de almidón, 2-5% esterasas; 8-10% Proteasa; 2-5% contenido de actividades de oxidasa) oligosacáridos, aunque principalmente monosacáridos MGBG 29 CBH I (8-10%) Producción de azúcares fermentados Paños médicos, 60°C (hasta 85°C) Glucosa, CBH II (8-10%) para fabricación de biocombustible y vendajes de cantidades (1 ,3)4-glucanasa (20-30%) otros productos de alto valor, algodón, cartón menores de ß-glucosidasa (25-30%) incluyendo antibióticos, carotenoides, y celofán arabinosa y Xilanasa (20-30%) compuestos de sabor y aroma para xilosa, ß-Xilosidasa (0.5-2.0%) alimentos, reservas alimenticias galactosa y a-L-Arabinofuranosidasa (0.5-2.0%) químicas, etc. ácido Hidrolasas, incluyendo enzimas pectinolíticas galacturónico; seleccionadas y 5-8% enzimas modificación de cierto almidón, 1-3% esterasas; 5-10% Proteasa; 2-5% contenido de oxidases) oligosacáridos, aunque principalmente monosacáridos Tabla 28: Cocteles para producción de hidrolizados fermentables con alto contenido de azúcar de desechos/residuos de empaque biodegradables Coctel Composición de coctel (%) Aplicación objetivo Substrato Temperatura Productos de óptima de azúcar tratamiento (°C) MGBG 30 CBH 1 (20-25%) Producción de azúcares fermentables Desechos/residuos 60°C (hasta 85°C) Xilosa, CBH II (20-25%) para la fabricación de biocombustible de empaque glucosa, (1 ,3)4-glucanasa (15-20%) y otros productos de alto valor, biodegradable galactosa, B-glucosidasa (1-5%) incluyendo antibióticos, carotenoides, pequeñas XNanasa (25-30%) compuestos de sabor y aroma de cantidades de P-Xilosidasa (5-10%) alimentos, reservas alimenticias mañosa, ácido a-L-Arabinofuranosidasa (0.6-2.0%) químicas, etc. galacturónico; (Otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinoliticas y algunos 8-12% seleccionadas, 4-8% enzimas de modificación oligosacárídos de almidón, 1-3% enzimas de degradación de manan, aunque 1-5% esterasas; 3-6.0% Proteasa; 2-5% actividades principalmente de oxidasa) monosacárídos MGBG 35 CBH 1 (10-12%) Producción de azúcares fermentables Desechos/residuos 60°C (hasta 85°C) Glucosa y CBH II (-15%) para la fabricación de biocombustible de empaque xilosa como p(1 ,3)4-glucanasa (30-40%) y otros productos de alto valor, biodegradable los azúcares B-glucosidasa (5-10%) incluyendo antibióticos, carotenoides, principales, Xilanasa (15-28%) compuestos de sabor y aroma de con cierto ß-Xilosidasa (2-5%) alimentos, reservas alimenticias contenido de a-Glucuronidasa (1-3%) químicas, etc. mañosa, a-L-Arabinofuranosidasa (1-3.0%) galactosa y (-15%: Otras hidrolasas, - incluyendo enzimas ácido pectinoliticas tales como a-galactosidasa, galacturónico ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exo- galacturonasa, enzimas de degradación de manan tal como ß-galactosidasa, ácido fenólico y esterasas de acetil(xilan) proteasa; enzimas de modificación de almidón, actividades de oxidasa de modificación de lignina) MGBG 29 CBH 1 (8-10%) Producción de azúcares fermentables Desechos/residuos 60°C (hasta 85°C) Glucosa, CBH II (8-10%) para la fabricación de biocombustible de empaque cantidades (1,3)4-glucanasa (20-30%) y otros productos de alto valor, biodegradable menores de ß-g!ucosidasa (25-30%) incluyendo antibióticos, carotenoides, arabinosa y Xilanasa (20-30%) compuestos de sabor y aroma de xilosa, B-Xilosidasa (0.5-2.0%) alimentos, reservas alimenticias galactosa y a-L-Arabinofuranosidasa (0.5-2.0%) químicas, etc. ácido (Hidrolasas, incluyendo enzimas pectinoliticas 5-10% galacturónico; seleccionadas y enzimas de modificación de almidón principalmente -8%, 1-3% esterasas; 5-10% Proteasa; 2-5% monosacárídos actividades de oxidasa) r en o en en Tabla 29: Cocteles para la producción de hidrolizados fermentables con alto contenido de azúcar de biomasa de hongo (incluyendo biomasa de consumo post-fermentación) y biomasa de alga marina Coctel Composición de coctel (%) Aplicación objetivo Substrato Temperatura Productos de óptima de azúcar tratamiento (°C) MGBG 9 CBH 1 (5-10%) Producción de azúcares fermentados Biomasa de >60°C (hasta Glucosa, CBH II (5-10%) para fabricación de biocombustible levadura y hongos 80°C) Celobíosa, ß(1 ,3)4-glucanasa (20-25 %, incluyendo liquenanasa y/o otros productos de alto valor, por filamentosos mañosa, de alto nivel) ejemplo reservas alimenticias Galactosa y ß-glucosidasa (1-5%) (bio)químicas/químicas, carotenoides, principalmente Xilanasa (25-30%, incluyendo -8-12%; Exoxilanasa) antibióticos, probióticos, edulcorantes algunas +[2-5.0% -Xilosidasa, 1-4%, naturales, etc. oligosacárídos a-Glucuronidasa, 2-5.0% a-L-Arabinofuranosidasa; 5-10% enzimas pectinolíticas, incluyendo B-galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y gaiactanasa, 5-10% actividad de modificación de almidón, 3-6% otras hemicelulasas, incluyendo a-galactosidasa, 2-4% oxidorreductasa/oxidasa y esterasas +· 5-10% proteasa] GBG 13 CBH I (5-10%) Producción de azúcares fermentados Biomasa de >60°C (hasta Glucosa, CBH II (5-10%) para fabricación de biocombustible levadura y hongos 80"C) Celobíosa, P(1 ,3)4-glucanasa (25-40%) y/o otros productos de alto valor, por filamentosos mañosa, ß-glucosidasa (-5%) ejemplo reservas alimenticias Galactosa y Xilanasa (18-25%) (bio)químicas/químicas, carotenoides, principalmente +[1-2.0%p-Xilosidasa, 1-3%, Exoxilanasa, 8-10%, antibióticos, probióticos, edulcorantes algunos a-Glucuronidasa, naturales, etc. oligosacárídos 1.5-5.0% a-L-Arabinofuranosidasa; 10-15% enzimas pectinolíticas, incluyendo B-galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y gaiactanasa, 5-7% actividad de modificación de almidón, 5-10% otras hemicelulasas, incluyendo a-galactosidasa, 1-4% oxidorreductasa/oxidasa y esterasas + 8-12% proteasa] Ni G en o en en Tabla 29 continuación MGB6 44 CBH 1 (2-5%) Producción de azúcares fermentados Biomasa de >60"C (hasta Glucosa, CBH II (2-5%) para fabricación de biocombustible levadura y hongos 80°C) Celobiosa, P(1 ,3)4-glucanasa (20-25%) y/o otros productos de alto valor, por filamentosos mañosa, (1 ,3)6-glucanasa (20-25%) ejemplo reservas alimenticias Galactosa y 2-5% N-acetilglucosaminidasa y/o quitínasa (bio)químicas/químícas, carotenoides, principalmente B-glucosidasa (5-10%) antibióticos, probióticos, edulcorantes algunos Xilanasa (10-15%) naturales, etc. oligosacáridos +[5-10%B-Xilosidasa, 1-5%, a-Glucuronidasa, 1-5.0% a-L-Arabinofuranosidasa; 2-5% enzimas pectinoliticas, incluyendo a-galactosidasa, y galactanasa, 2-5% actividad de modificación de almidón, 3-5% otras hemicelulosas, incluyendo mananasa, 2-5% oxidorreductasa/oxidasa y 2-4% esterasas + 25-30% proteasa] MGBG 45 CBH I (5-10%) Producción de azúcares fermentados Biomasa de >60°C (hasta Glucosa, CBH II (5-10%) para fabricación de biocombustible levadura y hongos 80°C) Celobiosa, P(1 ,3)4-glucanasa (15-20%) y/o otros productos de alto valor, por filamentosos mañosa, (1 ,3)6-glucanasa (25-30%) ejemplo reservas alimenticias Galactosa y -10% N-acetilglucosaminidasa y/o quitínasa (biojquímicas/químicas, carotenoides, O principalmente ß-glucosidasa (5-10%) ' antibióticos, probióticos, edulcorantes algunos Xilanasa (1-4%) naturales, etc. Biomasa de alga y oligosacáridos +[2-5%fS-Xilosidasa, 5-10% enzimas pectinoliticas, procesamiento de incluyendo ß-galactosidasa y galactanasa, 12-15% residuos actividad de modificación de almidón, 2-5% otras hemicelulasas, incluyendo mananasa, 2-5% oxidorreductasa/oxidasa y esterasas + 10-15% proteasa] en o en en Tabla 29 continuación GBG 46 CBH 1 (5-10%) Producción de azúcares fermentados Biomasa de >60°C (hasta Glucosa, CBH II (5-10%) para fabricación de biocombustible levadura y hongos 80°C) Celobiosa, P(1 ,3)4-glucanasa (25-30%) y/o otros productos de alto valor, por filamentosos mañosa, B-glucosidasa (5-10%) ejemplo reservas alimenticias Galactosa, y Xilanasa (20-25%) (bio)quimicas/quimicas, carotenoides, principalmente +[5-10%B-Xilosidasa, antibióticos, probióticos, edulcorantes algunos 1- 4% a-Glucuronidasa, naturales, etc. oligosacárídos 2- 5% a-L-Arabinofuranos¡dasa; 5-8% enzimas pectinolíticas, incluyendo ß-galactosidasa, y galactanasa, 5-10% actividad de modificación de . almidón, 1-2% otras hemicelulosas, incluyendo mananasa, 2-5% oxidorreductasa/oxidasa y 2-5% esterasas + 30-35% proteasa] MGBG 47 CBH I (2-5%) Producción de azúcares fermentados Biomasa de >60°C (hasta Glucosa, CBH II (2-5%) para fabricación de biocombustible levadura y hongos 80°C) Celobiosa, P(1,3)4-glucanasa (10-15%) y/o otros productos de alto valor, por filamentosos mañosa, (1,3)6-glucanasa (40-45%) ejemplo reservas alimenticias Galactosa y B-glucosidasa (8-10%) (bio)qulmicas/quimicas, carotenoides, principalmente Xilanasa (2-5%) antibióticos, probióticos, edulcorantes algunos +[1-3%B-Xilosidasa, naturales, etc. oligosacárídos 1- 2% a-Glucuronidasa 2- 5% a-L-Arabinofuranosidasa; 2-5% enzimas pectinolíticas, incluyendo ß-galactosidasa y galactanasa, 2-5% actividad de modificación de almidón, -5% otras hemicelulasas, incluyendo mananasa, 2-5% oxidorreductasa/oxidasa y 1-3% esterasas] G en o a? n Tabla 29 continuación GBG 48 CBH 1 (5-10%) Producción de azúcares fermentados Biomasa de >60°C (hasta Glucosa, CBH II (5-10%) para fabricación de biocombustible levadura y hongos 80°C) Celobiosa, P(1,3)4-glucanasa (40-45%) y/o otros productos de alto valor, por filamentosos mañosa, (1,3)6-glucanasa (10-15%) ejemplo reservas alimenticias Galactosa, y ß-glucosidasa (8-12%) (bio)químicas/químicas, carotenoides, principalmente Xilanasa (10-15%) antibióticos, probióticos, edulcorantes algunos +[5-8%B-Xilosidasa, naturales, etc. oligosacárídos 0.5-1.5% a-Glucuronidasa, 0.5-1.5% a-L-Arabinofuranosidasa; 2-5% enzimas pectinoliticas, incluyendo ß-galactosidasa, y galactanasa, 2-5% actividad de modificación de almidón, -5% otras hemicelulosas, incluyendo mananasa, 1-3% oxidorreductasa oxidasa y 1-3% esterasas] MGBG 49 CBH I (0.4-2%) Producción de azúcares fermentados Biomasa de >60°C (hasta Glucosa, CBH II (0.4-1.0%) para fabricación de biocombustible levadura y hongos 80°C) Celobiosa, P(1,3)4-glucanasa (7.0-15.0%) y/o otros productos de alto valor, por filamentosos mañosa, (1,3)6-glucanasa (12-15%) ejemplo reservas alimenticias Galactosa y p-glucosidasa (3.0-5.0%) (bio)quimicas/químicas, carotenoides, principalmente Xilanasa (75.0-78.0%) antibióticos, probióticos, edulcorantes algunos +[0.4-2.0%|J-Xilosidasa, naturales, etc. oligosacárídos 0.5-1.5% a-Glucuronidasa 0.2-1.5% a-L-Arabinofuranosidasa; 2-5% enzimas pectinoliticas, incluyendo ß-galactosidasa y galactanasa, 2-5% actividad de modificación de almidón, -4.0-7.0% otras hemicelulasas, incluyendo mananasa, 1-3% oxidorreductasa/oxidasa y 1-3% esterasas] ro ro n o en en Tabla 30: Cocteles para producción de hidrolizados fermentables con alto contenido de azúcar de pulpa de betabel dulce, caña de azúcar y residuos de los mismos Coctel Composición de coctel (%) Aplicación objetivo Substrato Temperatura Productos de óptima de azúcar tratamiento (°C) MGBG 6 CBH 1 (1-5%) Producción de azúcares fermentados Betabel dulce, >60°C (hasta Xilosa, CBH II (1-5%) para fabricación de biocombustible incluyendo parte 85"C) Glucosa, ácido P(1 ,3)4-glucanasa (22-28%) y/o otros productos de alto valor, por superior, pulpa de Galacturónico, ß-glucosidasa (10-15%) ejemplo reservas alimenticias betabel y planta Fructosa, Xilanasa (25-30%) (bio)químicas/químicas, carotenoides, completa, así Arabinosa, +[0.7-2.1 %B-Xilosidasa, antibióticos, probióticos, precursores como caña de Galactosa, 2-4% a-L-Arabinofuranosidasa; 20-25% enzimas de aroma y sabor, etc. azúcar y desechos Ramnosa pectinolíticas, incluyendo ß-galactosidasa, de procesamiento Algunos ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, oligosacárídos; exogalacturonasa y galactanasa, -5-8% actividad de ácido fenólico modificación de almidón, 12-15% liberado oxidorreductasa/oxidasa y esterasas + 8-12% proteasa] MGBG 20 CBH I (5-10%) Producción de azúcares fermentados Betabel dulce, >60°C (hasta Xilosa, CBH II (5-10%) para fabricación de biocombustible incluyendo parte 80/85°C) Glucosa, ácido P(1,3)4-glucanasa (20-32%) y/o otros productos de alto valor, por superior, pulpa de Galacturónico, ß-glucosidasa (-2-10%) ejemplo reservas alimenticias betabel y planta Fructosa, Xilanasa (15-25%) (bio)químicas/químicas, carotenoides, completa, así Arabinosa, +[15-20.0%B-Xilosidasa, 10-15%, Exoxilanasa, 2-5%, antibióticos, probióticos, etc. como caña de Galactosa, a-Glucuronidasa azúcar y desechos Ramnosa 1.5-5% a-L-Arabinofuranosidasa; 10-15% enzimas de procesamiento Algunos pectinolíticas, ~10% actividad de modificación de oligosacárídos; almidón, -5% otras hemicelulasas, 2-5%, ácido fenólico oxidorreductasa/oxidasa y esterasas + -7-10% liberado proteasa] r en o en en Tabla 30 continuación GBG 18 CBH 1 (5-10%) Producción de azúcares fermentados Betabel dulce, >60°C (hasta Xilosa, CBH II (5-10%) para fabricación de biocombustible incluyendo parte 80°C) Glucosa, ácido P(1 ,3)4-glucanasa (25-40%) y/o otros productos de alto valor, por superior, pulpa de Galacturónico, ß-glucosidasa (-5%) ejemplo reservas alimenticias betabel y planta Fructosa, Xilanasa (18-25%) (bio)químicas/químicas, carotenoides, completa, así Sacarosa, +[1-2.0%P-Xilosidasa, 1-3.0%; Exoxilanasa, 8-10%, antibióticos, probióticos, etc. como caña de Arabinosa, a-Glucuronidasa azúcar y desechos Galactosa, 1.5-5.0% a-L-Arabinofuranosidasa; 10-15% enzimas de procesamiento Ramnosa pectinolíticas, incluyendo ß-galactosidasa, Algunos ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, oligosacárídos; exogalacturonasa y galactanasa, 5-7% actividad de ácido fenólico modificación de almidón, 5-10% otras hemicelulosas, liberado incluyendo a-galactosidasa, 1-4%, oxidorreductasa/oxidasa y esterases + 8-12% proteasa] Diversos de los cocktails descritos anteriormente tienen aplicaciones en un amplio rango de otras aplicaciones. En estas aplicaciones, las diferencias claves en el uso de cocktails descansan en (a) dosificación de enzimas, o cantidad utilizada en cada tratamiento, y (b) la duración de la incubación. Por ejemplo, MGBG 18 se adapta bien para el tratamiento de ciertas corrientes de desecho, así como en aplicaciones nutracéuticas. En los pasos del tratamiento/saponificación de "desecho", se utiliza una dosis más alta de enzimas y el tiempo de reacción es de -18-24 horas (-25-32 unidades de papel de filtro). La meta final es lograr un rompimiento extenso del residuo objetivo a monosacáridos fermentables. En contraste, cuando la producción de oligosacáridos bioactivos (ya sea glucooligosacáridos y xilooligosacáridos) es requerida, y/o se empaniza un cambio textural, se requiera una concentración de enzimas menor y el tiempo de modificación (o reacción) puede tomar no más de 1 hora (máximo 2 horas) para lograr el punto final deseado. Cuando el substrato objetivo es principalmente con alto contenido de celulosa, las concentraciones de enzima han estado basadas en "unidades de papel de filtro o FPU". Cuando un oligosacárido bioactivo (por ejemplo, ß-glucooligosacárido no celulósico) está siendo producido, las concentraciones de enzima se basan en la actividad principal requerida para fragmentar el substrato objetivo (por ejemplo, ß- 1 , 3 ; 1 ,4- glucanos o ß-1 ,3; 1 ,6-glucanos enlazados mezclados, no celulósicos de fuentes fúngicas o de algas. Ejemplo 13 Producción de enzimas a través de cepas T. emersonii durante fermentación líquida Las cepas Talaromyces emersonii revisadas fueron: IMI (Imperial Mycological Institute (CABI Bioscience))393751 (cepa de patente), IMI 393753 (CBS(Centraal Bureau voor Schimmelcultures) 180.68), IMI 393755 (CBS 355.92), IMI 393756 (CBS 393.64), IMI 393757 (CBS 394.64), IMI 393758 (CBS 395.64), IMI 393759 (CBS 397.64), IMI 393760 (CBS 472.92), IMI 393752 (CBS 549.92), IMI 393761 (CBS 759.71). La fermentación líquida; Cultivo de tejidos por duplicado de T. emersonii individuales se crecieron a una temperatura de 45°C, en el medio descrito por Moloney y asociados, (1983) y Tuohy & Coughlan (1992), bajo condiciones de pH no controlado. Las cuatro fuentes de carbono seleccionadas fueron: glucosa (monosacárido), xilan de especie de trigo de avena (arabinoglucuronoxilan), polvo carob y una mezcla 1:1 de hojas de té/platos de papel (fragmentados en un mezclador durante -15-20 segundos, los sobrenadantes de cultivo se recuperaron (Tuohy & Coughlan, 1992; Murray y asociados, 2002) y se utilizaron para analizar una producción de enzimas extracelular. Ensayos de Enzimas; La actividad de enzimas se expresó en Unidades de Enzimas Internacionales (IU) por gramo de fuente de carbón de inducción. Una unidad IU libera 1 micromole de producto (azúcar de reducción, 4-nitrofenol etc.) por minuto. Todos los ensayos de enzimas de exoglucosidasa y endo-hidrolasa se llevaron a cabo tal como se describió previamente (Tuohy & Coughlan, 1992; Tuohy y asociados, 1994, 2002; Murray y asociados, 2002; Gilleran, 2004). A menos que se indique lo contrario, todas las medidas de actividad iniciales se llevaron a cabo a una temperatura de 50°C y pH 5.0. Las actividades de exoglucosidasa incluyeron ß-Glucosidasa, a-Glucosidasa, ß-Xilosidasa, ß-Galactosidasa, ß-Manosidasa, ß-Fucosidasa, a-Arabinofuranosidasa, N-Acetilglucosaminidasa, a-Ramnopiranosidasa, a-Galactosidasa, a-Fucosidasa, a-Arabinopiranosidasa, a-Manosidasa, y a-Xilosidasa. La actividad a-Glucuronidasa se ensayó a través de un método de azúcar de reducción utilizando una mezcla de ácidos aldourónicos reducidos como substratos (Megazyme International Ltd). Este substrato contenía aldotriourónico reducido, ácidos aldotetraurónico y aldopentaurónico en una proporción aproximada de 40:40:20. La actividad se midió en un pH 5.0 con una reserve de 5 mg/ml de esta mezcla. Los grupos de reducción liberados durante un período de incubación de 30 minutos fueron detectados a través de un método DNS, ya que algunas de las muestras de enzimas contienen actividad ß-xilosidasa apreciable que podría liberar residuos de xilosa de los ácidos aldourónicos, en ensayos se repitió y se incluyó xilosa en la mezcla de reacción para inhibir la actividad de ß-xilosidasa. Las enzimas xilanolíticas de exo-acción adicionales tales como: arabinofuranohidrolasa de a-arabinoxilan (liberación de arabinosa de arabinoxilan de paja de trigo medido utilizando ensayo enlazado por encima), esterasa de acetilo (utilizando substratos de acetato de 4-nitrofenilo y 4-metilumbeliferilo), actividad de esterasa de xilan acetilo (que monitorea la liberación de acetato de xilan de madera de haya acetilada) esterasa de ácido ferúlico (métodos de ensayo espectrofotométricos y HPLC) atmósfera se midieron. Las actividades de endohidrolasa incluyeron: ß-D-(1 ,3; 1 ,4)-Glucanasa (ß-glican de cebada (BBG) o liquenan como substratos de ensayo), Xiloglucanasa (xiloglican de tamarindo), Laminarinasa (laminaran de Laminaria digitata), endo-1,4-P-glucanasa, (referido como CMCasa), con base en la actividad contra el sub comercial de carboximetilcelulosa, ß-mananasa (galactomanan carob)pectinasa y poligalacturonasa, ramnogalacturonasa (ramnogalacturonan de frijol soya), galactanasa (lupin y galactanos pécticos de altramuz y papa como substratos), arabinanasa (arabinan de betabel dulce), amilasa, glucoamilasa, y dextrinasa. Temperatura/pH óptimo y estabilidades; La temperatura óptima para la actividad se determinó llevando a cabo los ensayos estándar adecuados del incremento de temperatura dentro del rango de 30-100°C, en un amortiguador de ensayo normal (100 mM NaOAc, 5.0). La variación de pH con la temperatura también se tomó en consideración. El pH óptimo se determinó utilizando los siguientes amortiguadores pH 2.2 -7.6: Amortiguador de citrato-fosfato de resistencia iónica constante tipo Mcllvaine; amortiguador Tris-HCI pH 7 - pH 10. Todos los amortiguadores sin importar el pH, fueron ajustados a la misma fuerza iónica con KCI. Se determinaron las temperaturas y estabilidades de pH tal como sescribío anteriormente (Tuohy y asociados, 1993; Gilleran, 2004; Braet, 2005). Determinación de proteína; La concentración de proteína en las muestras de enzimas (muestras de cultivo crudo) se estimaron mediante modificación de Bensadoun y Weinstein del método Lowry (Bensadoun y Weinstein, 1976; Lowry y asociados, 1951) utilizando una fracción BSA V como un estándar (Murray y asociados, 2001). Electroforesis y Zimografía; Para determinar el perfil de proteínas presentes en los filtrados de cultivo, se concentró un volumen conocido de cada muestra mediante liofilización y se analizó mediante SDS-PAGE de renaturalización y/o nativo o enfoque isoeléctrico (IEF; Tuohy & Coughlan, 1992). Las bandas activas de endogluconasa en los geles SDS-PAGE renaturalizados y los geles IEF fueron modificados utilizando una modificación de la técnica de colocación en gel de MacKenzie & Williams (1984), (Tuohy & Coughlan, 1992). Para detectar la actividad de exoglucosidasa, los geles fueron incubados inmediatamente en una solución 50-100 µ? del derivado de glucósido de 4-metilumbeliferilo adecuado (período de reacción de 2-30 minutos). La banda(s) activa de enzima se visualizaron bajo luz UV utilizando Fluor-S™ Multimager (Bio-Rad). Resultados: Se repitió el cultivo líquido de las cepas al menos 3 veces, en experimentos independientes llevados a cabo en diferentes períodos de tiempo. Los filtrados de cultivo recolectados (120 horas) de los frascos por duplicado (para cada combinación de cepa/fuente de carbono) se ensayaron para actividad de enzimas; las replicas múltiples fueron ensayadas en un rango de diluciones de enzima. Además, los resultados fueron validados mediante medidas intra e intraensayo, e indepencia de volúmenes de prueba. Hubieron diferencias claras entre los cultivos en términos de apariencia del cultivo y patrón de crecimiento. Por ejemplo, la cepa IMI393751 produjo rápidamente un cultivo muy tenso, filamentoso sobre glucosa, en tanto que las otras varias cepas (por ejemplo, CBS180.68, CBS355.92, CBS393.64, CBv CBS397.64, CBS 549.92 y CBS 759.71) mostraron crecimiento limitado y morfología atípica, es decir ausencia del crecimiento filamentoso normal y formación de una masa de cultivo limitada, con apariencia babosa. Las cepas CBS394.64 produjo una biomasa de micelia inferior, aunque creció como un cultivo filamentos, en tanto que CBS472.92 adoptó una morfología de pelet bajo condiciones de crecimiento idénticas. Se seleccionó un punto de tiempo de crecimiento de 120 horas, ya que los estudios previos han mostrado que las actividades de exoglucosidasa y endoglucanasa extracelulares están presentes en cantidades significativas durante el crecimiento de T. emersonii en la mayor parte de las fuentes ce carbono (en condiciones de pH no controlado, se han observado "picos y de presiones" de las actividades clave. Sin embargo, la actividad máxima se detecta generalmente hacia el final del ciclo de fermentación). La utilización de glucosa fue únicamente de aproximadamente 15-25% en 120 horas para muchas de las cepas. La cepa CBS 394.64 utilizó -50-55% en tanto que CBS472.92 (la cual desplegó morfología de de pelet) utilizó -20-25% de la glucosa en el medio. En contraste, -95% de la glucosa en el medio de cultivo fue utilizada por la cepa de la presente invención (IMI 393751) en 72 horas y no se detectó glucosa el medio de cultivo en el punto de tiempo de la recolección de 120 horas. Las tablas 31A a la D muestran la producción de exoglucosidasas seleccionadas a través de las cepas. Como lo revelan los resultados, se pueden observar distinciones claras entre la cepa de la presente invención y otras cepas T. emersonii con respecto a la producción de exoglucosidasa. La glucosa no reprime completamente la producción de exoglucosidasa a través de las cepas T. emersonii (Tabla 31A). La cepa 393751 produce niveles significativamente mayors de ß-glucosidasa (BGasa) que las otras cepas y los segundos niveles más altos de A/-acetilglucosaminidasa (vAGasa) durante el crecimiento en glucosa. El patrón de producción obtenido para la cepa 393751 contrasta en forma marcada con el de la cepa CBS549.92 (previamente CBS814.70). La producción de diversas actividades de exoglucosidasa a través de la última cepa parece ser reprimidas por la glucosa. Se deberá observar que los niveles de actividad de exoglucosidasa fueron medidos en filtrados de cultivo no dializados en el caso en el que la glucosa residual en el medio estuviera inhibiendo BGasa y/o vAGasa presentes (se observaron patrones similares en las muestra dializada). Carob induce la producción diferencial de glucosidasas extracelulares a través de las cepas (Tabla 31B). La cepa CBS 394.64 produce una actividad relativamente sin exoglucosidasa además de ct-arabinofuran-oxidasa. Los bajos niveles de todas las exoglucosidasas fueron producidos por las cepas CBS 393.64, CBS 395.64 y CBS 549.92. La cepa 393751 produjo niveles significativos de un amplio rango de exoglucosidasas (niveles más altos de ciertas actividades, por ejemplo, la ß-fucosidasa de exoglucosidasa de modificación de pectina).

Producto de endoglucanasa mediante cepas T. emersonii A. Producción de xilanasa: Dos de los mayores tipo de actividades endohidrolasa requeridas para la conversión de biomasa de plantas y residuos de desecho con alto contenido de polisacáridos sin almidón, son glucanasa y xilanasa. De todas las actividades de degradación de glican polimérico ensayadas, la glucanasa y xilanasa fueron las actividades de glucanasa predominantes presentes. Las tablas 32A a 32D presentan valores de producción de xilanasa a través de todas las cepas en las mismas fuentes de carbono. Los estudios previos han mostrado que (CBS814.70) tipo natural y otras cepas mutantes producen un sistema de enzimas xilanolíticos complejo (Tuohy y asociados, 1993; 1994), con múltiples endoxilanasas. Varias de las xilanasas aisladas muestran especificidad selectiva hacia diferentes tipos de xilanos, por ejemplo, arabinoxilanos, arabinoglucuronoxilanos, glucurononxilanos, más sustituidos versus xilanos no sustituidos (de los resultados previos) y resultados en curso con las enzimas de la cepa de la presente invención). Como lo muestran los resultados, la glucosa es un fuerte represor de la expresión de xilanasa en todas las cepas T. emersonii. Los niveles significativos de actividad de xilanasa activos contra arabinoxilan (OSX) de especies de trigo de avena se expresa mediante la cepa 393751. Este componente no es activo contra arabinoxilanos de centeno o trigo.

Carob, es principalmente rico en galactomananos (contiene cierto xilan), es un inductor potente de niveles muy altos de actividad de xilanasa contra todos los substratos xilanos a través de la cepa 393751. El papel de carob como un inductor de la potente actividad de xilanasa puede no esperarse con base en el conocimiento de su composición. La apariencia de los cultivos obtenidos de un número de cepas CBS (después de 120 horas) fue significativamente diferente y se pueden observar claras diferencias morfológicas entre las cepas 393751 y CBS549.92, es decir crecimiento micelial denso (filentoso) para IMI 393751 y la formación de una masa de cultivo limitada (no filamentosa) de apariencia babosa de la cepa CBS549.92. Tal como se muestra en la tabla 31B, los niveles de xilanasa son significativamente mayores para la cepa 393751 que cualquier otro. En contraste con la cepa 393751, carob es un inductor muy deficiente de xilanasa en cepas CBS394.64, CBS395.64, y CBS549.92. Se puede apreciar otra diferencia marcada en el tipo de actividad de xilanasa inducida mediante carob. En la cepa 393751, se produce una actividad potente contra todos los xilanos. En las otras cepas, en general, se produce muy poca actividad o nada de actividad contra arabinoxilanos de centeno y trigo. Unicamente dos cepas además de la cepa 393751, produce niveles apreciables de actividad contra ambos de estos xilanos, es decir CBS472.92 y CBS759.71. El análisis de zimograma del filtrado del cultivo de las cepa 393751 reveló altos niveles de bandas activas-xilanasa múltiple, incluyendo nuevas xilanasas bifuncionales que habían sido aisladas. La mezcla de hojas de té/platos de papel (TL/PPL) también proporcionó un inductor muy potente de la actividad de xilanasa en la cepa 393751 (Tabla 32C), y mientras que esta mezcla no indujo la expresión de xilanasa en las otras cepas, los niveles fueron significativamente más bajos. Tal como se observa con Carob, se produjo una actividad potente a través de la cepa 393751 contra todos los xilanos, con casi 1.8-veces más actividad contra arabinoxilan de centeno (Rye AX) siendo obtenida y una menor actividad contra OSX y xilan de madera de abedul. Esto sugiere la expresión diferencial de xilanasas individuales a través de los inductores TL/PPL y Carob, lo cual estuvo soportado subsecuentemente por el análisis de zimograma. TL/PPL también induce un sistema de enzimas xilanolítica de múlticomponentes, y actividades de esterasa y oxidasa/peroxidasa complementarias la cepa 393751 y no en otras cepas. Estas actividades complementarias aumentan la efectividad de las hidrolasas de polisacáridos cocktails enzimas optimizadas por aplicaciones de degradación de biomasa clave (por ejemplo cereales, desechos de plantas, residuos de madera, productos de papel). En comparación con Carob, TL/PPL induce una mayor función de xilanasa a través de todas las cepas (especialmente actividad contra los arabinoxilanos), aunque niveles mucho menores que de la cepa 393751. Aunque OSX es un inductor conocido de xilanasa en hongos e indujo la producción de enzimas a través todas las cepas, la inducción más pronunciada fue con la cepa 393751. Sin embargo, en contraste con la cepa 393751, únicamente OSX indujo una alta actividad de xilanasa y TL/PPL fue un inductor deficiente de la producción de xilanasa a través de la cepa 472.92. El patrón de producción de enzimas de OSX es diferente al obtenido con carob y TL/PPL. En general, los resultados de la producción de xilanasa en OSX, sugiere que la cepa 393751 puede metabolizar los substratos crudos muy rápidamente y generar en forma efectiva inductores solubles de xilanasa. La hemicelulosa en substratos crudos más complejos, es más accesible para esta cepa. Los resultados también sugieren que los cocktails de enzimas producidos a través de la cepa 393751 en dichos substratos complejos, puede ser más adecuada para hidrólisis de materiales y residuos de plantas crudas complejas. Los estudios modelo y aplicaciones investigadas hasta la fecha (por ejemplo conversión de biomasa de madera, sacarificación de desechos de alimentos y vegetales con alto contenido de carbohidratos y OFMSW y cereales) han confirmado el potencial de estos cocktails . Finalmente, las figuras 32A a 32D comparan y contrastan la producción de la actividad de xilanasa contra diferentes substratos de ensayo (por ejemplo, OSX, Rye AX, etc.) a través de la cepa 393751 y la cepa de origen CBS549.92 (también CBS814.70) en las cuatro fuentes de carbono. Producción de B. Glucanasa y Mananasa: Los estudios previos han mostrado que (CBS 814.70) tipo natural y las otras cepas mutantes producen un sistema de enzimas glucanolíticas complejas (Murray y asociados, 2001, 2004; Tuohy y asociados, 2002; McCarthy y asociados, 2003, 2005), que incluyen celulasas y una formación de actividades de modificación de ß-glucan no celulolítico. Tal como se observa para el sistema xilanolítico, se producen múltiples endoglucanasas dependiendo de la fuente de carbono. Varias de las ß-glucanasas aisladas muestran especificidad selectiva hacia diferentes tipos de ß-glucanos. La tabla 7A a 7D muestran actividad contra el P-1,4-glican comercial modificado CMC (Sigma Aldrich), ß-1 ,3; 1 ,4-glucanos de cebada (BBG; Megazyme) y liquen Cetraria islándica (Lichenan; Sigma Aldrich), xiloglican (esqueleto de ß-1 ,4-glican; Megazyme) de tamarindo y galactomanan de carob (Megazyme). Los ß-glucanos no celulósicos están presentes en concentraciones significativas en el componente de polisacáridos en almidón en un número de residuos de plantas, especialmente las derivadas de cereales. Las tablas 7A a 7D ilustran inducción esencial de las actividades respectivas en las cepas. Con el patrón de inducción siendo completamente diferente en las fuentes de carbono más complejas (crudad).

La glucosa es un potente represor de la producción de glucanasa y mananasa en casi todas las cepas (Tabla 33A). Para todas las muestras, se midieron actividades en muestras dializadas y no dializadas. Como lo revelan los resultados, Carob es un inductor potente de altos niveles de ß-1,3;1,4-glucanasa (contra BBG y liquenan) en la cepa 393751, los niveles más altos para todas las cepas probadas (Tabla 33B). Los niveles de ß-1 ,4-glucanasa (contra CMC) producidos por la cepa 393751 fueron ~10-veces menores que la actividad contra BBG (el nivel de CMCasa fue mayor par esta cepa cuando se comparó con otras cepas). Incluso se detectó xiloglucanasa de menor nivel, siendo los niveles más altos obtenidos para la cepa 393751. El análisis de zimograma confirmó que los tipos de componentes de endoglucanasa, patrón de expresión y niveles relativos de expresión de los componentes de glucanasa en los filtrados de cultivos T. emersonii respectivos son marcadamente diferentes. Los bajos niveles de (galacto)mananasa se produjeron en todas las cepas durante el crecimiento sobre carob. La mezcla TL/PPL fue incluso un inductor más potente de ß-1 ,3, 1 ,4-glucanasa (tanto BBGasa como liquenanasa), y (galacto)mananasa, a través de la cepa 393751 (Tabla 33C). En general estos resultados señalan la no-equivalencia de la producción ß-glucanasa a través de las cepas T. emersonii y confirma que la cepa 393751 es una fuente excelente de diferentes actividades de ß-glucanasa y la mezcla de TL/PPL induce un potente cocktail de estas actividades. OSX (Tabla 33D), tal como se espera, indujo niveles muicho menores de ß-glucanasa ya sea que carob o TL/PPL. El patrón de producción de enzimas es diferente para las cepas 393751 y CBS 549.92. En la Tabla 33D, los niveles de ß-1,4-Glucanasa (actividad de Carboximetilcelulasa) fueron menores para la mayor parte de las cepas excepto CBS 397.64, que produjo niveles 2-veces mayores que la cepa 393751 (en OSX como el inductor), y no se detectaron filtrados de cultivo para cuatro cepas (es decir, CBS 393.64, CBS 394.64, CBS 395.64 y CBS 549.92). Se produjo una actividad significativa de (galacto)mananasa durante el crecimiento de OSX durante la cepa 393751 (menor con TL/PPL como inductor) y CBS 472.92. Las figuras 6A a 6E comparan y contrastan la producción de glucanasa y mananasa bajo las condiciones experimentales señaladas mediante las cepas 393751 y CBS814.70. En conclusión, los resultados indican que: la cepa 393751 es un productor potente de altos niveles "de un rango de actividades enzimáticas muy importantes, la cepa 393751 es la única cepa de T. emersonii que produce niveles muy altos tanto de xilanasa como de ß-1 ,3; 1 ,4-glucanasa en dos actividades de hemicelulasa de despolimerización clave, en inductors de bajo costo (carob y TL/PPL), y se obtuvieron los niveles de actividad más altos en fuentes de carbón crudo, demostrando de esta manera que la cepa 393751 es una fuente efectiva en costo de una formación potente de cocktails de enzimas. n o en o n Tabla 31 A. Producción de exoglucosidasa después de crecimiento durante 120 horas en glucosa como la fuente de carbono.

Glucosa como inductor Ce as Talarom ces emersonii \Ul Inductor Tabla 31 B: Producción de exoglucosidasa después de crecimiento durante 120 horas sobre Carob como la fuente de carbono.

Carob como inductor Cepas Talaromyces emersonii (lU/g Inductor) CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS 180.68 355.92 393.64 394.64 395.64 397.64 472.92 549.92 759.71 Actividad de IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI exoglucosidasa 393751 393753) 393755) 393756) 393757) 393758) 393759) 393760) 393752) 393761 ) a-Arabinofuranosidasa 0.72 0.22 3.30 1.49 7.04 1.45 1.32 1.05 2.55 1.49 ß-Xilosidasa 7.15 0.39 10.29 1.65 0.00 0.77 2.37 16.45 2.60 11.66 ß-Glucosidasa 23.65 17.22 67.54 6.55 0.00 10.04 24.53 85.36 11.25 74.14 a-Glucos¡dasa 0.99 0.00 0.44 2.26 0.00 0.91 6.27 0.22 1.64 1.43 ß-Galactosidasa 2.97 4.24 1.71 3.52 0.00 1.95 3.30 1.49 1.73 3.03 ß-Manosidasa 1.16 0.77 0.32 2.42 0.00 0.98 3.19 11.17 1.33 7.04 ß-Fucosidasa 36.58 0.00 4.79 1.76 0.00 0.50 3.19 10.12 0.62 6.55 NAcetilGlucosaminidasa 31.02 15.95 19.91 3.85 0.00 7.98 14.85 44.55 6.73 18.15 r n o en Tabla 31 C: Producción de exoglucosidasa después de crecimiento durante 120 horas en hojas de té/platos de papel como la fuente de carbono.

Ho as de té/ latos de a el Ce as Talarom ces emersonii lU/ Inductor Tabla 31 D: Producción de exoglucosidasa después de crecimiento durante 120 horas en Xilan de Spelt (especie de trigo) de o avena como la fuente de carbono.

Xilan Spelt (especie de trigo) de Cepas Talaromyces emersonii (lU/g Inductor) avena CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS 180.68 355.92 393.64 394.64 395.64 397.64 472.92 549.92 759.71 IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI Actividad de exoglucosidasa 393751 393753) 393755) 393756) 393757) 393758) 393759) 393760) 393752) 393761 ) a-Arabinofuranosidasa 15.18 2.97 4.07 5.83 23.60 8.91 0.00 1.10 0.00 5.39 ß-Xilosidasa 9.63 0.00 2.26 0.66 0.00 2.10 11.77 14.91 12.16 6.93 ß-Glucosidasa 32.84 16.83 42.30 24.97 0.00 26.13 15.73 67.27 3.14 61.04 a-Glucosidasa 0.92 0.00 1.05 0.77 0.00 0.17 1.76 0.00 0.44 0.84 ß-Galactosidasa 4.68 0.00 0.83 1.49 0.00 1.30 1.43 0.00 0.00 0.00 ß-Manosidasa 0.00 0.00 2.09 2.97 0.39 2.75 2.53 0.00 0.11 0.48 ß-Fucosidasa 19.64 0.00 0.00 1.60 0.00 1.82 1.65 6.82 0.77 1.26 NAcetilGlucosaminidasa 82.12 20.85 30.86 40.87 0.99 68.15 40.21 118.80 10.89 28.16 Tabla 32A: Producción de xilanasa extracelular a través de cepas T. emersonii en glucosa como la única fuente de carbono T l r emersonii lU/ Inductor Tabla 32B: Actividad de xilanasa extracelular en 120 horas de filtrado y de cultivo T. emersonii en polvo Carob como la única fuente de carbono Carob como inductor Cepas Talaromyces emersonii (lU/g Inductor) CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS 180.68 355.92 393.64 394.64 395.64 397.64 472.92 549.92 759.71 IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI Substrato de ensayo de Xilan 393751 393753) 393755) 393756) 393757) 393758) 393759) 393760) 393752) 393761) Xilan Spelt (especie de trigo) de avena 3168.55 177.87 610.23 266.81 17.77 217.53 238.10 727.65 283.20 361.19 Arabinoxilan de centeno 1212.20 0.00 0.00 15.07 0.00 0.00 0.00 135.47 90.31 201.30 Arabinoxilan de trigo 2464.00 21.89 116.27 108.08 0.00 0.00 49.28 365.31 9.57 271.15 Xilan de "Birchwocxf 2520.27 474.76 607.48 513.10 373.45 428.23 348.92 751.30 348.92 636.35 Tabla 32C: Actividad de xilanasa extracelular en 120 horas de filtrados de cultivo emersonii durante crecimiento en hojas de té/platos de papel como la única fuente de carbono Ho as de té/ latos de a el Ce as Talarom ces emersonii lU/ Inductor Tabla 32D: Actividad de xilanasa extracelular en 120 horas de filtrados de cultivo T. emersonii durante crecimiento en Xilan Spelt (especie de trigo) de avena como la única fuente de carbono Xilan Spelt (especie de trigo) de avena Cepas Talaromyces emersonii (lU/g Inductor) CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS 180.68 355.92 393.64 394.64 395.64 397.64 472.92 549.92 759.71 IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI Substrato de ensayo de Xilan 393751 393753) 393755) 393756) 393757) 393758) 393759) 393760) 393752) 393761 ) Xilan Spelt (especie de trigo) de avena 2725.25 216.15 287.87 295.35 235.35 262.68 389.95 2126.30 789.47 305.09 Arabinoxilan de centeno 2009.15 284.57 220.28 384.45 372.13 247.67 351.62 1543.30 723.80 328.35 Arabinoxilan de trigo 2722.50 180.62 265.43 297.00 191.51 197.01 220.28 1641.75 577.50 281.88 Xilan de "Birchwocxf 2196.15 548.68 567.82 695.20 550.00 489.83 584.21 1908.50 871.53 623.92 en o OI en Tabla 33A: Glucanasa y mananasa extracelular presente en filtrados de cultivo de 120 horas de cepas 7. emersonii durante crecimiento en glucosa como la única fuente de carbono Glucosa como inductor Ce as Talarom ces emersonii lU/ Inductor Tabla 33B: Glucanasa y mananasa extracelular en filtrados de cultivo de 120 horas de cepas 7. emersonii durante crecimiento sobre Carob como la única fuente de carbono Carob como inductor Cepas Talaromyces emersonii (lU/g Inductor) CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS 180.68 355.92 393.64 394.64 395.64 397.64 472.92 549.92 759.71 IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI Substrato de glucanasa/manasa 393751 393753) 393755) 393756) 393757) 393758) 393759) 393760) 393752) 393761 ) Celulosa de carboximetilo 318.34 76.89 246.84 34.93 0.00 64.96 109.40 166.54 7.21 221.71 ß-glucan de cebada 3420.45 145.64 1120.35 81.29 0.00 60.06 281.77 115.05 45.65 1702.47 Liquenan 2162.60 135.52 429.39 47.36 0.00 32.01 203.45 431.97 19.91 914.65 Xiloglucan 180.24 40.15 89.82 45.71 0.00 43.45 39.16 48.68 10.45 112.97 Galactomanan Carob 54.18 108.08 90.15 107.42 110.99 61.05 107.09 94.71 49.01 101.86 IV) OI o en 01 Tabla 33C: Glucanasa y mananasa extracelular presente en filtrados de cultivo de 120 horas de cepas T. emersonii durante crecimiento en hojas de té/platos de papel como la única fuente de carbono Ho as de té/ latos de a el Ce as Talarom ces emersonii lU/ Inductor Tabla 33D: Glucanasa y mananasa extracelular presente en filtrados de cultivo de 120 horas de cepas T. emersonii durante crecimiento en Xilan Spelt (especie de trigo) de avena como la única fuente de carbono Xilan Spelt (especie de trigo) de avena Cepas Talaromyces emersonii (lU/g Inductor) CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS CBS 180.68 355.92 393.64 394.64 395.64 397.64 472.92 549.92 759.71 IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI (IMI Substrato de glucanasa/mananasa 393751 393753) 393755) 393756) 393757) 393758) 393759) 393760) 393752) 393761 ) Celulosa de carboximetilo 101.86 32.62 22.22 0.00 0.00 0.00 213.24 64.35 0.00 25.14 ß-glucan de cebada 375.82 100.27 100.87 44.72 21.23 72.49 283.42 282.76 52.58 117.87 Liquenan 477.68 176.33 197.56 114.62 203.72 135.52 353.27 360.80 115.61 840.40 Xiloglucan 35.26 44.39 0.00 0.00 3.91 6.88 230.84 25.14 0.00 38.23 Galactomanan Carob 653.84 344.80 56.82 85.53 174.02 95.48 298.38 641.30 110.72 139.10 Ejemplo 14: Termozlmas de T. emersonii IMI393751 con potencial para producción de bioenergía El objeto puede reducir el componente biodegradable de desecho clínico con alto contenido de celulosa esterilizado, reduciendo de esta forma el volumen de desecho a basureros, y recuperar la producción líquida con alto contenido de azúcar después del tratamiento de enzimas y recuperar la energía en la forma de biocombustible. La corriente de desecho contuvo una alta proporción de celulosa (>50%) y consistió principalmente en papel, tejidos, algodones médicos y vendajes y ropaje con alto contenido de algodón, lana de algodón, etc. La "fibra" principal en la corriente de desecho celulosa, aunque muchos productos están "terminados" con recubrimientos de polisacárido, agentes de enlace y rellenadores, de modo que es esencial es una mezcla de enzimas no esencial (viz. hemicelulasa, pectinasa y enzimas de degradación de almidón) para aumentar la accesibilidad de celulosa y mejorar la reducción de desecho o conversión a azúcares solubles, simples (por ejemplo, glucosa, galactosa, xilosa, etc.). Método experimental: El perfil de las actividades de la enzima endohidrolasa y exoglucosidasa en cada una de los 10 cocktails de termozima derivados de la cepa 393751, fueron determinados (Tuohy & Coughlan 1992; Tuohy y asociados, 1993, 1994, 2002; Murray y asociados, 2001, 2004). La tabla 34 resume los niveles relativos de actividades clave determinadas en una selección de cocktails. Las preparaciones enzimáticas se agregaron en diferentes concentraciones a lotes de 100 g de desecho con alto contenido de celulosa tratados con STG, a una temperatura de 50°C y 70°C, y se incubaron durante 24-48 horas (en niveles de humedad de 50-60%). Las muestras de licores con alto contenido de azúcar (y materiales con alto contenido de celulosa, por ejemplo tejido, etc.) fueron eliminadas en forma periódica durante 48 horas y analizadas con respecto a (i) reducción de peso y volumen, (ii) volumen de licor con alto contenido de azúcar recuperado, (iii) azúcares de reducción liberados, (iv) estructura física del substrato después de tratamiento enzimático (utilizando un microscopio de exploración con electrones), (v) análisis de calidad de los tipos de azúcares liberados mediante TLC, (vi) análisis cuantitativo de los azúcares producidos mediante HPLC, GC-MS y ESI-Q-TOF-MS, (vii) sustancias potencialmente tóxicas para fermentación de microorganismos (producción de bioenergía), (vüi) esterilidad de hidrolizados, (¡x) producción de bioetanol, y (x) producción de biogas, tal como lo describe Tuohy y asociados, 1993,1994, 2002; Murray y asociados, 2001, 2004, Gilleran (2004) y Braet (2005). Resultados: A. Reducción de peso y volumen, volumen de licor con alto contenido de azúcar recuperado, azúcares de reducción liberados Se registraron los pesos de tratamiento con enzimas previos y posteriores y se realizaron estimados de reducción en volumen registrados para todas las preparaciones de enzimas. Los datos de reducción de volumen y azúcares de reducción obtenidas a una temperatura de 50°C, utilizando los mismos parámetros de reacción (carga de enzimas, 60% de contenido de humedad y tiempo de reacción en 24 horas) se ilustran en la figura 7. En resumen, a una temperatura de 70°C durante 24 horas @ 60% de humedad produjo los mejores resultados en términos de reducción de volumen para todos los cocktails. En estudios repetidos con 6 cocktails seleccionados (y con pruebas por duplicado), la reducción de volumen fue consistente entre -60-75% dependiendo del cocktail (ver figura 8). Los azúcares de reducción liberados se convirtieron en porcentaje de hidrólisis o conversión de la celulosa presente, lo cual fue entre 66-82% de la fracción con alto contenido de celulosa presente en el desecho esterilizado inicial. Se obtuvo en pruebas de laboratorio una reducción de volumen de 60-75%. Por un lote de 100 g, aproximadamente 70-100 mi de la humedad agregada (H20) fueron agregadas para llevar el contenido de humedad final a 50-60%. Los volúmenes de recuperación líquidos, hidrólisis enzimática posterior, fluctuaron de 69-105 mi. Los experimentos también fueron completados a temperaturas de reacción de 75-85°C y diferentes valores de pH. Arriba de una temperatura de 70°C se observó un incremento marginal en (~2-5.5%) en la hidrólisis general, cuando se comparó con valores obtenidos a una temperatura de 70°C, y mientras que el 3.5-4.0 produjo niveles óptimos de hidrólisis, los valores no fueron significativamente mayores (<5%) que los obtenidos utilizando H20. b. Pérdida física de integridad del substrato, productos de azúcar generados y cantidades relativas de cada tipo de azúcar. SEM demostró una pérdida significativa en la estructura de fibra de celulosa (figura 9B). Productos de hidrólisis: Análisis cualitativo mediante TLC; análisis cuantitativo mediante HPLC >76-92% del azúcar liberado fue monosacárido para los 7 mejores cocktails, y esto consistió principalmente en glucosa, con parte de galactosa, mañosa y xilosa. Por ejemplo, los niveles de azúcar fluctuaron de 0.2-0.55 g/ml y los rangos de concentración de monosacáridos determinaron mediante HPLC fueron como se indica a continuación (dependiendo del cocktail de termozimas y lotes de desecho): Glucosa: 43-70%; Mañosa: 5-15%; Galactosa: 4-10%; Xilosa: 20-30%; Celobiosa: 4-12% y oligosacáridos superiores: 5-26%. C. Clasificación de sustancias que son potencia/mente tóxicas para fermentación de microorganismos (producción de bioenergía), antes y después de la fermentación, análisis de esterilidad de hidrolizados, y producción de bioetanol y biogas La fracción líquida recuperada no pareció ser tóxica para especies de levadura clasificadas para fermentación de los hidrolizados con alto contenido de azúcar para bioetanol, es decir, no evitaron el crecimiento de S. cerevisiae (levadura de panadería), Pachysolen tannophilus, Pichia sp., Candida shehatae y Kluveromyces marxianus. Además, el análisis de la producción de etanol (utilizando un equipo de ensayo enlazado por enzimas) indicó que las levaduras produjeron etanol. Se inocularon placas de agar (que contienen el medio de agar adecuado) con muestra de los licores con alto contenido de azúcar y desechos residuales, incubados bajo las condiciones recomendadas (para el microorganismo) y se analizaron con respecto a la presencia de colonias (bacterias y levadura) y crecimiento radial (hongo filamentoso). No ocurrió un crecimiento microbiano en placas inoculadas con licores con alto contenido de azúcar y muestras de desecho de los tratamientos con enzimas a una temperatura de 70°C es decir, no ocurrieron putrefacciones microbianas (y pérdida de azúcar) de los hidrolizados de desecho. Producción de bioetanol La producción de bioetanol de las materias primas con alto contenido de azúcar a través de diferentes especies de levadura, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Pachysolen tannophilus, Pichia sp., Candida shehatae. y Kluveromyces marxianus (y cepas) fue evaluada. Los puntos de extremo medidos incluyeron crecimiento de levadura (y biomasa de levadura), utilización de azúcares, evolución de C02 y etanol producido. Dos de las digestiones de enzimas a una temperatura de 70°C (hidrolizados generados mediante cocktails 5 & 8 en la figura 8) fueron seleccionados como las materias primas de prueba para producción de bioetanol a través de todas las especies de levadura en cultivos a escala de laboratorio de 1 L. Las figuras 10A a 10B ilustran los perfiles de producción de etanol obtenidos S. cerevisiae . Las producciones de etanol son similares con ambas materias primas, incluso aunque el cocktail de termozima 8 produjo marginalmente más azúcares simples en el hidrolizado. Sin embargo, la digestión del cocktail 8 contiene mayor contenido de pentosa (no fermentado mediante S. cerevisiae) que el generador por el cocktail de termozima 5. La digestión del cocktail de termozima 5 contiene parte de celobiosa (y cantidades menores de celooligosacáridos) que son fácilmente metabolizados por la levadura.

Tabla 34. Resultados de un número de combinaciones digestión de levadura más alto contenido de azúcar Análisis de productos de final de fermentación tóxicos potenciales Se utilizaron un rango de técnicas, (HPLC, MS), especialmente GC-MS, para determinar la presencia de productos de final de fermentación tóxicos potenciales. Se logró una utilización de azúcar casi completa (con la excepción de digestiones con alto contenido en azúcares de pentosa (xilosa, arabinosa) para S. cerevisiae, y se detectaron productos del final de fermentación normales (es decir glicerol, acetato y algunos restos de subproductos (solventes)). Producción de biogas Se prepararon lotes mayores de digestiones de cocktail 5 y 8 para alimentar digestores anaerobicos de Reactor Híbrido Anaeróbico de flujo ascendente (UAHR) mesofílico y termofílico. Los niveles de carbohidratos totales de los influentes y efluentes de ambos reactores fueron medidos (Dubois y asociados,. 1956; Laboratory protocol). Los azúcares de reducción presentes en las muestras influentes y efluentes fueron determinados (Tuohy y asociados, 1994). Para determinar la Demanda de Oxígeno Químico (COD), se oxidó un volumen conocido de hidrolisado utilizando dicromato de potasio (ácido sulfúrico concentrado con sulfato de plata como catalizador) durante 2 horas (método de prueba internacional; protocolo de Laboratorio). Se determinó el dicromato restante mediante titulación con una solución estándar de sulfato de amonio ferroso. Se midieron la eficiencia de eliminación de COD y carbohidrato (muestras diarias) a lo largo de la prueba. Se analizó la actividad metanogénica esopecífica (SMA) de los sedimentos, utilizando la técnica de transductor de presión (Colleran y Pistilli, 1994; Coates y asociados 1996). Una muestra del sedimento fue eliminada de la cama de sedimento a través de una puerta de salida y se llevaron a cabo pruebas ya sea a una temperatura de 37°C (para sedimento de reacción mesofílico) o 55°C (para sedimento de reacción termofílico). Los azúcares presentes en las digestiones generadas en forma enzimática fueron metabolizados rápidamente a través de las bacterias en UAHRs tanto mesofílicos (37°C) como termofílicos (55°C), es decir una reducción del 95-97% de los carbohidratos en los rangos de carga de 4.5 g COD/m3/día bajo condiciones no optimizadas. Los niveles de metano en la corriente de biogas obtenidos fueron entre 55-61%, y el tiempo de retención estimado (días) tomado para metabolizar el azúcar y alcanzar niveles de metano máximo fueron de ~3.0-4.0 días. El pH del efluente fue monitoreado y no hubo un cambio notable en el pH de los efluentes de cualquier reactor. C. Optimización del sistema de termozimas para el tratamiento de corrientes de desecho clínicas con alto contenido de celulosa Una combinación de proteómicos genómicos y funcionales se utilizó para identificar las condiciones de crecimiento óptimas y los substratos que se utilizan (con base en la información de los 10 cocktails utilizados en los experimentos iniciales) para obtener un cocktail de enzimas que pueda tener niveles óptimos de todos los componentes de enzimas clave. Se seleccionaron dos combinaciones de inductores: una mezcla 1:1 de las hojas de té gastadas y platos de papel de desecho, y una mezcla 1:1 de betabel sin melasa. Las combinaciones adicionales de cocktails seleccionados de los 10 utilizados anteriormente, también fueron preparadas. El cocktail novedoso y las combinaciones estuvieron caracterizadas con respecto a las enzimas componentes y su capacidad para catalizar la conversión extensiva de celulosas, hemicelulosas y desechos con alto contenido de celulosas esterilizadas comerciales a azúcares fermentables simples. El pH y temperaturas óptimas para una reactividad de enzimas máxima, termoestabilidad del sistema de enzimas optimizados y cocktails combinados, y la inhibición potencial mediante productos finales de reacción, los azúcares simples, moléculas tóxicas potenciales (compuestos fenólicos/derivados de benceno) fueron determinadas. Temperatura óptima: 75-80°C, con una actividad >70-85% que permanece a una temperatura de 85°C, dependiendo de la preparación/combinación de enzimas (actividad de enzimas aún fue detectada a una temperatura de 90-95°C) Termoestabilidad: No hubo pérdida real de actividad después de 24 horas a una temperatura de 50°C y <5-10% de pérdida de actividad después de 1 semana a la misma temperatura. A una temperatura de 70°C, <2-20% de pérdida de actividad en las primeras 24 horas, con <10% de pérdida adicional de actividades después de un período de 5 dias. pH óptimo: Aunque las enzimas no fueron las más activas en pH de entre 4-5, se observó una actividad >60% en un pH 3.0 y pH 6.8, con todas las enzimas desplegando a un actividad en el pH 7.0. Las preparaciones de enzimas fueron más estables entre los pH 3.5-6.0 (temperatura de 4-50°C, durante un período de 1 semana). Aunque el rango de reacción/conversión de substrato a monosacáridos disminuyó o alcanzó una mesera cuando estuvieron presentes altas concentraciones de glucosa y otros monosacáridos, las preparaciones de enzima aún son muy activas en la presencia de altas concentraciones (hasta 100 mM) de los monosacáridos (glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa). Además, aunque los compuestos fenólicos/derivados de benceno no disminuyeron la actividad general de los cocktails, las concentraciones utilizadas en las pruebas fueron significativamente mayores que las potencialmente presentes en el desecho. Sin embargo, ciertos cocktails y cocktails de enzimas optimizados desplegaron una actividad significativa (>50-70%) en la presencia de estos compuestos. En general, las concentraciones de cada enzima requeridas para lograr valores de hidrólisis de -65-75% fueron sorprendentemente bajas (9-16 Celulasa/10 g) y aunque las dosis mayores, dependientes de coctel/combinación (hasta 60 unidades de Celulasa) no incrementaron el gran final de hidrólisis en forma marcada. El escalado de tratamiento de enzimas a lotes de 100 y 10 Kg produjo un grado de hidrólisis final similar, un perfil similar y concentración de los productos de azúcar. Los mejores valores de reducción de volumen obtenidos para los cocktails optimizados fueron de 73-80%, aunque el % de los valores de hidrólisis correspondientes para conversión de la fracción celulósica a azúcares simples fue de 72-81%. Dos de las combinaciones optimizadas produjeron puntos de extremos similares en términos de reducción de volumen e hidrólisis de celulosa. La producción de etanol obtenida fue de 195-210 L/tonelada con S. cerevisiae y 215-220 L/tonelada con P. tannophilus. Aproximadamente, 80-85% del bio-etanol puede ser recuperado mediante destilado, aunque esto puede ser mejorado. Ejemplo 15: Termozims de T. emersonii IMI393751 para generación de materias primas con alto contenido de azúcar de desechos de papel y tejido con alto contenido de celulosa Medidas de actividad enzimática: Se analizaron preparaciones ' de enzimas crudas para un rago de diferentes actividades de enzimas de hidrolización-lignocelulosa utilizando concentraciones de 10-30 mg/ml de los substratos relevantes para enzimas de endo-acción, 50 mg de papel filtro/ml volumen de reacción para "paperasa de filtro" (celulasa general) o 1 mM de un derivado de 4-nitrofenil-glucosida adecuado (Tuohy y asociados, 2002; Murria y asociados, 2001). Los ensayos se llevaron a cabo por triplicado. Todos los resultados son representativos de dos experimentos idénticos utilizando diferentes preparaciones de enzimas crudas. Requerimientos de pH y temperatura para actividad y estabilidad: Los requerimientos de pH y temperatura para actividad y estabilidad de enzima se evaluaron en el rango de pH de 2.6-7.6, y a través de un rango de temperatura de 30-90°C, utilizando los procedimientos de ensayo normales.

Estudios de hidrólisis de escala-modelo Se incubó una alícuota de enzimas individuales que contienen 5-60 FPU (o 2-20 de unidades de xilanasa, según sea lo adecuado), con 1 g del substrato objetivo, en el pH y temperatura de reacción adecuados, durante hasta 24 horas. Las muestras se eliminaron en intervalos de tiempo y se analizó el contenido de azúcar (azúcares de reducción) y composición.

Substratos con alto contenido de azúcar investigados: tejido, mezclado y papel de lavatorios, desecho de papel de oficina, papel café y periódico mezclado. Resumen de los resultados: Los cocktails de termozima desplegaron alta actividad en un amplio espectro de substratos de carbohidrato y por consiguiente reflejan la complejidad y eficiencia de la producción de enzimas mediante T. emersonii IMI393751. La producción de termozimas particulares reflejo la composición del substrato de inducción y la variación (Tabla 35).

Tabla 35: Cantidades relativas de enzimas de hidrolización de celulosa y hemicelulosa MGBG 2, derivado de cultivod de 108 horas de T. emersonii y crecieron en una mezcla 1:1 de hojas de té gastado/platos de papel, MGBG 3, derivado de cultivo de 120 horas T. emersonii crecieron en una mezcla 1:1 de sorgo/pulpa de betabel; MGBG 4, derivado de cultivo de 120 horas de T. emersonii crecieron en una mezcla 1:1 salvado de trigo /pulpa de betabel; MGBG 5, derivado de cultivo de 120 horas T. emersonii crecieron en una mezcla 1:1 de platos de papel /pulpa de betabel; MGBG 6, derivado de cultivo de 120 horas T. emersonii crecieron en una mezcla (2:1:1) de papel café/platos de papel /pulpa de betabel; MGBG 7, derivado de cultivo de 120 horas T. emersonii crecieron en una mezcla 1:1 de hojuelas de centeno/salvado de trigo; MGBG 8, derivado de cultivo de 120 horas T. emersonii crecieron en una mezcla 1:1 de pulpa de betabel/hojas de té gastadas.

La celulosa en los cocktails de termozimas fueron más activas en un pH de alrededor de 4.0 (figura 11A) y a unas temperaturas de entre 70°C y 80°C (figura 12). El componente(s) de celulasa en cada preparación enzimática son activas con respecto a un amplio rango de ph (<pH 2.6->pH 6.5). La actividad de xilanasa presente en los mismos cocktails fue más activas en el pH 4.0-5.0 (figura 11B) y a una temperatura entre 75-85°C (figura 13). Sin embargo la actividad de xilanasa en los cocktails fue activa con un respecto a un amplio rango de pH (<pH-2.6 a >pH 7.0), aunque se observaron niveles de actividad similares a las temperaturas de 90°C y 50°C. La estabilidad térmica de varios de los cocktails MGBG (descritos en la Tabla 35) fue reflejada en los valores de vida media largos a temperaturas de 50°C y 70°C, es decir hubo efectivamente nada o una pérdida mínima de actividad de endoxilanasa o endocelulasa a una temperatura de 50°C después de la incubación únicamente en amortiguador (pH 5.0). Todos los cocktails fueron preparaciones de enzimas crudas y no se agregaron estabilizadores o aumentadores. La actividad de Xilanasa presente en los cocktails 2, 5, 6 y 8 fue particularmente estable a una temperatura de 70°C (únicamente ~<2-20% de pérdida de actividad de xilanasa después 25 horas). Por ejemplo, el valor t½ del cocktail 2 a una temperatura de 70°C fue de >6 días. Las estabilidades a temperaturas de 70°C de los cocktails 3 y 4, y hasta un grado menor el cocktail 7, fueron menores debido a la presencia de altos niveles de proteasa de ecolisin (valores t½ de 2 horas, 12 horas y 25 horas). En la presencia del substrato (es decir desecho crudo), la estabilidad de esto cocktails fue marcadamente mayor (es decir (valores de t½ de 22 horas, 46 horas y 72 horas). Del desempeño general de los cocktails MGBG en substrato de celulosa y hemicelulosa fue muy alto (Tabla 36). El nivel de hidrólisis incrementó significativamente conforme incrementó la temperatura de reacción de 50°C a 70°C (Tabla 37). En las temperaturas de reacción superiores (por ejemplo, 70°C), el % de hidrólisis se logró en 18 horas y fue similar a, en algunos casos mayor a, el % de hidrólisis obtenido después de 24 horas a una temperatura de 50°C (Tabla 37). Este descubrimiento señala la ventaja de las termozimas comparadas con enzimas de organismos mesofílicos, los cuales pueden ser activos en temperaturas menores. Tabla 36: % de hidrólisis de materiales con alto contenido de Celulosa Substrato Cócteles 2 % de hidrólisis 3 4 5 6 7 8 Tejido de lavatorio 37.9 85.6 9.8 9.7 47.4 22.4 22.6 Platos de papel 17.6 20.0 16.1 27.5 34.2 16.3 26.2 Papel filtro 18.3 23.7 7.2 17.4 18.8 0.0 20.7 ß-glucan de cebada 72.6 90.1 60.2 83.3 80.4 78.7 61.9 Tabla 37: % de hidrólisis de papel de tejido con alto contenido de Celulopsa Los productos de la hidrólisis en el transcurso del tiempo de celulosa y hemicelulosa, los cuales se analizaron mediante TLC, han confirmado la eficiencia de conversión de alto nivel de las termozimas MGBG. Los substratos de polisacárido fueron degradados inicialmente a oligosacáridos y finalmente a glucosa, lo cual fue casi el único producto de la hidrólisis, aunque la celulosa presente en los desechos con alto contenido de celulosa, es decir papel de tejido fueron similarmente hidrolizados casi completamente a glucosa. Las implicaciones de estos resultados para la industria a base de bioetanol, son significativos e indican el potencial de los sistemas de termozimas T. emersonii. Ejemplo 16: Biocon versión de Pulpa de Betabel a hidrolisados con alto contenido de azúcar para producción de Bioetanol Se seleccionaron ocho cocktails de termozima de un rango inicial de 20 cocktails. El perfil de actividades de enzimas endohidrolasa y exoglucosidasa en cada uno de los 8 cocktails de termozima, derivados de la cepa 393751, fueron determinados (Tuohy & Coughlan, 1992, Tuohy y asociados, 1993, 1994, 2002; Murray y asociados, 2001, 2004). Las preparaciones de enzimas fueron combinadas en diferentes concentraciones o dosis con lotes de 1 g de fracciones de betabel de azúcar, preparadas utilizando diferentes métodos de fracción. Las fracciones son como se indica a continuación: A. Partes superiores y tallos de betabel de azúcar (1 g de peso seco/10 volumen total) B. Pulpa de betabel de azúcar (1 g de peso seco /10 mi volumen total) C. Fruta de betabel de azúcar (1 g de peso seco) D. Cáscara de betabel de azúcar (1 g de peso seco) Fracciones de betabel de azúcar A-D fueron homogeinizadas en el mezclador Waring (ráfagas de 2 x 30 segundos). Las alícuotas de enzimas, es decir 2 mi y 5 mi de soluciones de enzimas (1-8) fueron agregadas a un volumen de reacción total final de 10 mi (con agua de grifo, pH 7.2) e incubadas inicialmente a una temperatura de 63°C: Se llevaron a cabo experimentos adicionales para optimizarla temperatura de reacción (75°C), pH (pH 4.0) y para reducir el tiempo de incubación (16 horas). Las muestras se tomaron en intervalos programados durante la incubación de 16 a 48 horas, se centrifugaron y la acción enzimática terminó hirviendo a una temperatura de 100°C durante 10 minutos. La fracción del sobrenadante se analizó con respecto a azúcares de reducción liberados. El análisis cuantitativo de los tipos de azúcares liberados fue analizado mediante TLC, y se determinó mediante HPLC en análisis cuantitativo de los azúcares producidos. Se evaluaron las materias primas con alto contenido de azúcar para producción de bioetanol (Tuohy y asociados, 1993, 1994, 2002; Murray y asociados, 2001, 2004; Gilleran, 2004; Braet, 2005). Resultados: Las condiciones de reacción óptima fueron 75°C y pH 4.0. La tabla 38 presenta los azúcares de reducción liberados después de 16 horas bajo condiciones óptimas. El incremento de incubación a 48 horas incrementó el % de hidrólisis en el caso de fracciones de cáscara y fruta. La optimización de las condiciones de carga de enzimas permitió que el tiempo de incubación fuera disminuido a la mitad (es decir, 24 horas), mostrándose los rendimiento en la Tabla 39. Tabla 38: % de hidrólisis de carbohidratos presentes después de 16 horas a una temperatura de 75°C Cocktails % de hidrólisis (75°C) después de 16 horas Substrato 2 3 4 5 6 7 8 Pulpa 35.5 91.1 48.8 38.5 59.8 37.4 48.6 Cáscara 12.8 32.7 5.8 14.8 7.8 9.8 20.0 Fruta 13.8 6.4 3.0 26.0 11.5 3.0 28.7 Tabla 39: % de hidrólisis del carbohidrato presente después de 24 horas a una temperatura de 75°C con cargas de enzimas optimizadas Se emprendió el desarrollo de optimización del cocktail de enzimas para efectuar la hidrólisis, utilizando una combinación de genómicos y proteómicos funcionales (con base en la información de los 8 cocktails utilizados en los experimentos iniciales). Se produjeron 2 cocktails, marcados como MGBG SB#1 y MGBG SB#2. La hidrólisis de la planta de betabel de azúcar total y el compuesto de fruta total a través de los dos cocktails optimizados se comparó con los cocktails 3 y 5 de los experimentos previos. Las reacciones se llevaron a cabo en las condiciones óptimas para los dos cocktails novedosos, es decir 71°C y pH 4.5. La tabla 40 proporciona los niveles relativos de la enzima incluida en cada reacción por g de substrato (es decir planta de betabel de azúcar total o el componente de fruta total). Las tablas 41 y 42 resumen los resultados obtenidos de la hidrólisis.

Tabla 40: Cargas de enzimas por g de substrato de betabel de azúcar Las principales diferencias entre los cocktails optimizados y los cocktails 3 y 5 se estuvieron en las cantidades relativas de agilidades clave, especialmente exo-glicosidasas Tabla 41: % de hidrólisis con base en azúcares de reducción liberados (71°C, pH 4.59 después de 24 horas Tabla 42: % de azúcar total liberada que corresponde a glucosa Ambos cocktails novedosos liberaron altos niveles de azúcar de reducción del homogenado de planta total. De los azúcares de reducción liberados, aproximadamente del 88 al 90% fue monosacárido del cual aproximadamente del 43 al 67% fue glucosa Fermentación a bioetanol Se llevaron a cabo estudios para investigar la producción de bioetanol de hidrolisados de planta total y betabel. Más del 90% de la glucosa presente en el hidrolisado de planta total se convirtió a bioetanol mediante S. cerevisiae (de 40 g/L azúcar fermentable, aproximadamente 9.0 g/L de etanol se obtuvieron). Se investigaron otras especies de levadura para producción de bioetanol (condiciones aeróbicas), por ejemplo. Pachysolen tannophilus. La última levadura utilizó azúcares de glucosa y pentosa liberados (xilosa y arabinosa) en fermentaciones repetidas (>92-95% metabolismo). Sin embargo, las producciones de etanol fueron ligeramente menores que con S. cerevisiae ((de 40 g/L azúcar fermentable, aproximadamente 6.7 g/L de etanol fueron obtenidos). Propiedades bioquímicas seleccionadas de los cocktails novedosos Temperatura óptima: 75-80°C, con >75-87% de actividad permaneciendo a una temperatura de 85°C, dependiendo del coctel . Termoestabilidad: No hubo pérdida real de actividad después 24 horas a una temperatura de 50°C y hubo <10% de pérdida después de 3 semanas a una temperatura 50°C. A una temperatura de 71°C, ~4-9% hubo de pérdida de actividad en las primeras 24 horas, con menos del 5-7% de pérdida adicional durante 5 días. pH Optimo y estabilidades: Aunque ambos cocktails fueron más activos en un pH 4.5, se observó una actividad >55% en un pH <2.6 y >50-60% en un pH 6.8; ambas enzimas desplegaron actividad significativa (>48-58%) en un pH 7.0. La preparación de enzimas fue más estables en pH entre pH 3.5-6.0 (4-50°C, durante 1 mes). Ejemplo 17: Identificación y propiedades seleccionadas de una xilanasa bi-funcional novedosa producida mediante Talaromyces emersonii EMI393751 Talaromyces emersonii secreta entre 14-20 distintos componentes de endoxilanasa cuando se crece en la fuente de carbono adecuado. Trece de estas endoxilanasas han sido purificadas para homogeneidad y caracterizadas con respecto a las propiedades catalíticas. Los pesos moleculares de las endoxilanasas purificadas varían ntre 30-130 kDa. La expresión de xilanasa y glucanasa no es equivalente entre 10 cepas T. emersonii crecidas bajo condiciones idénticas en el mismo medio nutriente e inductores de carbono. Se ha identificado una nueva xilanasa de bajo peso molecular, Xyn XII (17.5 kDa) de la cepa T. emersonii IMI393751 del sistema que degrada - xilan. La secreción de xilanasas con valores Mr menores o iguales a 20 kDa ha sido reportada para un número de otras especies de bacterias y hongos, pero no para T. emersonii antes de esto. Purificación y caracterización de enzimas Se creció T. emersonii IMI393751 en una mezcla 1:1 de salvado de trigo y pulpa de betabel durante 120 horas a una humedad de 45°C, 210 rpm (o alternativamente durante 11 días en fermentación sólida (estática), 33% substrato:67% humedad; 45°C). Se analizaron los contenidos de xilanasa y proteína de muestras de enzimas crudas y fraccionadas tal como se describió anteriormente (Tuohy & Coughlan, 1992; Tuohy y asociados, 1993,1994; Murray y asociados, 2001). El extracto de enzimas crudas fue recolectado tal como se describió previamente (Tuohy & Coughlan, 1992). La ultrafiltración utilizando un sistema Amicon DC2, equipado con un dializador de fibra-hueca HIP 10-43 fue utilizado para separar la xilanasa novedosa (fracción permeada) de las xilanasas de mayor peso molecular (retención). Xyn XII se purificó para homogenidad utilizando una combinación de técnicas de fraccionado, incluyendo "extracción de sal" o precipitación con (NH4)2S04 (0-90% de corte), cromatografía de permeabilidad de gel (GPC) en Sephacryl S-200 SF (100 mM amortiguador NaOAc, pH 5.0 como eluente), cromatografía de intercambio de iones (IEC) en Whatman DE-52 (equilibrado con amortiguador 30 mM NaOAc, pH 5.0; la xilanasa se eluyó mediante aplicación de un gradiente NaCI 0.0-0.3 M amortiguado lineal), seguido de cromatografía por interacción hidrofóbica (HIC) en Fenil Sepharosa CL-4B (equilibrada con 15% (NKU)2S04 en 30 mM NaOc, pH5.0). Antes de HIC, la muestra de xilanasa fue "adicionada con sal" con (NH4)2S04 a una concentración final de % (p/v). Las sales de amortiguación y (NH4)2S04 fueron eliminadas mediante aplicación de la muestra a Sephadex G-25 (aquí no se muestra). Finalmente, las fracciones con alto contenido de xilanasa fueron fraccionadas mediante la aplicación adicional a una segunda columna de intercambio de aniones DE-52, en pH 7.0, seguido de cromatografía de permeabilidad de gel sobre Sephacryl S-100 HR (100 mM amortiguador NaOAc, pH 5.0 utilizado como amortiguador de equilibrio e irrigación) y un paso de fraccionado final en DEAE-Sepharosa, equilibrado previamente con 50 mM amortiguador NH4OAc, pH 5.5 (0.0-0.2 M gradiente NaCI para eluir xilanasa). A la enzima recolectada se le extrajo la sal mediante la aplicación a Sephadex G-25 o BioGel P-6 y se liofilizó antes del análisis electroforético. Propiedades seleccionadas de la nueva xilanasa bif uncional Propiedades físico-químicas seleccionadas La pureza de la nueva enzima fue confirmada mediante electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida en geles al 15% (acrilamida/bis-acrilamida) de acuerdo con el método Laemmli. SDS-PAGE reveló una bada de proteína simple en manchado con placa que corresponde a un Mr estimado de 17.5 kDa. Además, se obtuvo una sola banda de proteína en |EF que corresponde a un valor pl de pH 5.0 para Xyn XII. La temperatura óptima para la degradación catalizada por Xyn XII de OSX fue determinada para ser de 75°C, y el pH óptimo para la actividad fue de 4.0 - 4.5. Sin embargo, a diferencia de Xyn I - XI, la cual perdió entre 25-81% de las actividades originales respectivas durante un período de incubación de 10 minutos en pH 3.0, Xyn XII fue remarcadamente estable al ácido y retuvo aproximadamente el 91% de su actividad original en un pH 3.0 incluso en una incubación prologada. Propiedades catalíticas seleccionadas Se incubaron alícuotas diluidas en forma adecuada de Xyn XII con un rango de polisacáridos, incluyendo varios xilanos, ß-glucanos, polímeros pecticos y fructan (todos a una concentración de 1.0% (p/v)). Los azúcares de reducción liberados durante un periodo de incubación prologado de 30 minutos se cuantificaron tal como se describió anteriormente. La actividad contra aril-glucósidos (1.0 mM) se determinó utilizando método de microensayo (Murray y asociados, 2001). Los estudios preliminares para determinar las constantes cinéticas se llevaron a cabo variando [substrato], xilan, entre 0.2 - 25 mg/ml, bajo condiciones de ensayo normales. Los resultados presentados en la figura 14 ilustran la reactividad relativa de la nueva xilanasa (Xyn XII) contra diferentes xilanos. Esta enzima es más activa en un enlace mezclado xilan no sustituido, (1 ,3;1 ,4-3-D-xilan) conocido como rodimenan de la Palmaria palmata de alga roja. En contraste con las dos arabinoxilanos de cereal, es decir. OSX y WSX, la enzima mostró la mayor actividad contra el WSX más sustituido. El patrón general de reactividad fue de: RM>WSX>LWX>OSX>BWX. Tal como lo demuestran las figuras 15A a 15G, las preferencias de substrato de un número de otras xilanasas (Xyn IV a Xyn XI) son muy distintas a Xyn XII. Con Xyn IV, OSX>R >WSX>LWX»>BWX (figura 15A). El orden de reactividad con Xyn VI es de OSX>LWX>RM=BWX>WSX(figura 15B), aunque el desplegado por Xyn III es RM>LWX>WSX=BWX>>OSX (figura 15C). La reactividad de Xyn VIII fue R >BWX>WSX»LWX>OSX (figura 15D), y de Xyn IX fue de RM>LWX>BWX=OSX>WSX (figura 15E). Finalmente, Xyn X desplegó las siguientes preferencias RM»BWX~WSX>OSX»>LWX (figura 15F) y Xyn XI RM=LWX>WSX>BWX=OSX (figura 15G). Además, a diferencia de Xyn l-XI que fueron estrictamente activas únicamente contra xilans, la nueva xilanasa funcional (Xyn XII) desplegó actividad substancial contra ß-glucan enlazada-mezclada de cebada (1 ,3; 1 ,4-3-D-glucan), por ejemplo, en 55% de actividad relativa a la observada con OSX, el substrato en ensayo normal (figura 16). En contraste con Xyn I - X I , la nueva xilanasa bifuncional desplegó actividad contra las 4-nitrofenil ß-D-xilosida de aril^-xilosidas (4NPX) y cloronitrofenil3-D-xilosida (CNPX), con mayor actividad contra el último substrato (figura 17). Este descubrimiento puede reflejar el efecto de extracción de electrones de la porción de cloro, haciendo al grupo cloronitrofenilo un mejor "grupo de partida". Sin embargo, otras endoxilanasas novedosas de la cepa CBS814.70 de T. emersonii (Tuohy y asociados, 1993; también se producieron a través de la cepa I M 1393751 , aunque se expresaron de manera diferente) son significativamente activas contra CNPX y despliegan poca o nada de actividad contra 4NPX. Este fenómeno reflejó características de exo-actuación parcial de estas enzimas, y también puede reflejar una característica similar para Xyn XII. Además, la baja actividad se observó contra ß-glucosida y CNP-p-celobiosa, la cual no se esperó ya que Xyn XII es activa contra 1,3;1,4-ß-?-glucan y si posee ciertas propiedades de exo-actuación, tal como se observa con las ß-xilosidas de arilo, puede esperarse que tenga una actividad correspondiente contra las ß-glucosidas de arilo. No se observó reactividad contra cualesquiera otros glucósidos de arilo enlazados-a o ß. Por lo tanto, "in vivo", esta xilanasa bifuncional nueva puede jugar un papel muy importante para T. emersonii, IMI393751 para proporcionar acceso a hemicelulosa de pared de célula de planta, por ejemplo, degradando los glucanos enlazados-mezclados en cereales de otras plantas, residuos de plantas y desechos. Ejemplo 18: Expresión de hidrolasas clave y otras enzimas accesorias mediante cepas T. emersonii La expresión de enzimas clave en la misma fuente de carbono es diferente Número, tipo y abundancia relativa de xilanasa(s) producida mediante T. emersonii IMI393751 y otras cepas, es diferente. Tal como se mostró anteriormente, los niveles de enzimas en filtrados de cultivo son marcadamente diferentes y sugiere que las cepas T. emersonii ya sea producen diferentes niveles de las mismas xilanasas, o expresan diferentes isoformas. Para ilustrar este punto, se llevó a cabo manchado de zinograma después de la electroforesis SDS-PAGE de gel (renaturalizado como se describe en la publicación de Tuohy & Coughlan (1992) y IEF con los filtrados del cultivo de la cepa IMI393751 y CBS549.92. Estos estudios confirmaron que (i) expresaron diferentes xilanasas y (ii) el número de isoformas de xilanasa expresadas son marcadamente diferentes. Los resultados obtenidos para la expresión de xilanasa en carob se resumen como se indica a continuación: Las isoformas xilanasa detectadas (ver la publicación de Tuohy y asociados, (1994) para referencia a las isoformas - p I y Mr IMI393751. Xyn IV, Xyn V, Xyn VI, Xyn IX y Xyn XI, Xyll (ß-xilosidasa) y Xyl II CBSS49.92: Xyn II, Xyn VII (nota: Xyn VII es idéntica a la secuencia publicada en una patente anterior (Número de Acceso GenBank AX403831) y muy bajas cantidades de Xyl I (ß-xilosidasa). Además, IMI393751 es la única cepa que produce Xyn XII durante el crecimiento en hojas de té/platos de papel (y únicamente en hojas de té).

El patrón de expresión en fuentes de carbono diferentes, es diferente El patrón de la expresión de xilanasa en diferentes fuentes de carbono no es equivalente, por ejemplo IMI393751: Glucosa como la fuente de carbono: Xyn I, Xyn VIII, una cantidad menor de Xyn XI y sin ß-xilosidasa Carob: Xyn IV, Xyn V, Xyn VI, Xyn IX y Xyn XI, Xyl I (ß-xylosidasa) y Xyl II TL/PPL: Xyn III, Xyn V, Xyn IX, Xyn X, Xyn XII, Xyl I y Xyl II CBS549.92: Glucosa: bajos niveles de un componente que puede ser equivalente a Xyn IV y no a ß-xilosidasa Carob: Xyn II, Xyn VII y muy bajas cantidades de Xyl I (ß-xilosidasa). TL/PPL: proteínas similares a Xyn I, Xyn VII y Xyn IX, algunos Xyl I. Además, otros ejemplos de diferencias claras en expresión fueron observados, por ejemplo expresión Xyl I, no Xyl I es expresada por IMI393751, CBS549.92, CBS180.68, CBS393.64, CBS394.64 OR CBS397.64, durante el crecimiento en glucosa. En contraste, bajo condiciones idénticas, Xyl I es expresado por CBS355.92, CBS395.64, CBS472.92 y CBS759.71. En forma similar a Carob, Xyl I se expresa en todas las cepas, aunque niveles marcadamente diferentes, con la excepción de CBS394.64. Xyl I también se expresa en todas las cepas, excepto CBS 180.68 y CBS394.64 durante el crecimiento en TL/PPL. En OSX, como la fuente de carbono, Xyl I no fue expresado por CBS 180.68 y CBS394.64, aunque se expresó mediante CBS393.64 (bajos niveles) y todas las otras cepas. Se observaron diferencias generales marcadas en los niveles de expresión Xyl I y el patrón de expresión (es decir las cepas que expresan las mayores o menores cantidades de Xyl I) entre todos los substratos de inducción. Diferencias en actividad específica de homólogos producidos mediante cepas diferentes Se compararon cepas diferentes con respecto a la expresión de xilanasas clave tal como se describió anteriormente. Sin embargo, además las xilanasas presentes en los cultivos inducidos de IMI393751 y CBS549.92 fueron fraccionadas y la actividad específica de los componentes de xilanasa purificada fueron comparados. En el primer caso, únicamente IMI393751 parece producir Xyn XII. Además, cuando se comparan actividades específicas (resultados para OSX como substratos de ensayo se presentan más adelante), se observaron claramente algunas diferencias en la actividad específica de enzimas individuales (figura 18). Producción de componentes novedosos mediante T. emersonii IMI393751 durante crecimiento en diferentes fuentes de carbono Se cultivó T. emersonii IMI393751 en un rango de fuentes de carbono y se perfiló renaturalizando SDS-PAGE y IEF, después del manchado con zimograma, tal como se describió anteriormente. Lo siguiente es una muestra de alguno de los resultados obtenidos: (i) Hojas de té como inductor: Xyn III, Xyn V, Xyn IX, algunas Xyn X y Xyn XII; Xyl I y Xyl II (ii) Carob: Xyn IV, Xyn V, Xyn VI, Xyn IX y Xyn XI, Xyl I (ß-xilosidasa) y Xyl II (iii) Hojuelas de centeno: Xyn IV, Xyn V, Xyn VI, Xyn IX, con un componente extra de "xilanasa" novedosa de pl 6.5; Xyl I (ß-xilosidasa) y Xyl II (iv) Harina de menudeo: Xyn III, Xyn VI, Xyn VIII, Xyn IX, Xyn X, Xyl I (ß-xilosidasa) y Xyl II, con un componente adicional de "xilanasa" novedosa de pl 5.8 (v) Sorgo: Xyn I, Xyn VIII, Xyn IX, Xyn X, Xyn XI, parte de Xyl I (ß-xilosidasa) y Xyl II (vi) Xilosa: Xyn I y Xyn VIII, Xyl I (vii) Glucosa: Xyn I, Xyn VIII, una pequeña cantidad de Xyn XI y sin ßß-xilosidasa Ejemplo 19: Expresión diferencial de otras enzimas no esencial mediante cepas T. emersonii Peroxidasa de glutationa Se corrieron muestras de filtrado de cultivo (muestras no concentradas y concentradas) en geles PAGE nativos al 7.5% y se enjuagaron en glutationa reducida a una temperatura de 50°C seguido de incubación con 0.002% H202. Posteriormente el gel fue manchado con cloruro férrico al 1 %/ferricianuro de potasio al 1%. También se complementó el manchado de zimograma mediante ensayos de enzima infiltrados de cultivo. IMI393751 produce peroxidasa de glutationa extracelular (Mr~45 kDa), con la expresión diferencial observada en un número de inductores de carbón (los números 1 a 18 representan diferentes inductores). En contraste no se observó actividad extracelular para cualesquiera de las cepas T. emersonii, incluso en las muestras concentradas. La cepa IMI393751 también produce niveles significativos de peroxidasa de glutationa extracelular durante el crecimiento en TL/PPL. Catalasa Se corrieron muestras de filtrado de cultivo (muestras no concentradas y concentradas) en geles PAGE nativos al 7.5%, seguido de incubación con 3% H202. Posterior el gel se manchó con cloruro férrico al 1 %/ferricianuro de potasio al 1% (las bandas de catalasa aparecen como bandas color amarillo intenso). El manchado con zimograma también fue complementado por ensayos de enzima en los filtrados de cultivo, utilizando el método estándar publicado. IMI393751 produce catalasa extracelular (Mr~230 kDa), con la expresión diferencial siendo observada en un número de inductores de carbono (los números 1 a 18 representan inductores diferentes). En contraste con la no actividad extracelular observada para cualesquiera de cepas T. emersonii, incluso en las muestras concentradas. La presencia de estas actividades de enzimas en los filtrados de cultivo de IMI393751 pueden ser potencialmente importantes para afectar la estructura del substrato, aunque también para eliminar cualesquiera compuestos que puedan oxidar las actividades de hidrolasa clave, por ejemplo xilanasa o glucanasa. Ejemplo 20: Comparación del fenotipo de 10 cepas T. emersonii en diferentes medios sólidos (agar) B. Medio de agar 1. Agar de dextrosa Sabouraud (Oxoid Ltd., UK) 2. Agar de maltosa de papa (Oxoid Ltd., UK) 3. Czapek Dox (Oxoid Ltd., UK; pH no ajustado) 4. Agar Cornmeal (Oxoid Ltd., UK) 5. Agar de extracto de malta (Oxoid Ltd., UK) 6. Agar nutriente (Difco Ltd., UK) 7. Agar de Emerson (almidón soluble de potasio de levadura; YpSs) Se agregaron los siguientes ingredientes a 1 L de H20 destilado: 15.0 g de almidón soluble (Sigma-Aldrich, Dublin, Irlanda) 4.0 g de extracto de levadura (Oxoid Ltd., UK) 1.0 g de Fosfato de di-hidrógeno de potasio (KH2P04) 0.5 g de Heptahidrato de sulfato de magnesio (MgS047H20) 20.0 g de Agar número 1 (Oxoid Ltd., UK) 8. Agar de glucosa de levadura (YGA) Se agregaron los siguientes ingredientes a 1L de H20 destilado: 20.0 g Glucosa (Sigma-Aldrich, Dublin, Irlanda) 10.0 g de Extracto de Levadura (Oxoid Ltd., UK) 15.0 g de Agar número 1 (Oxoid Ltd., UK) Se inocularon placas de agar (cada tipo de agar) con las 10 diferentes cepas T. emersonii. Se incubó un lote de placas a una temperatura de 45°C y el segundo a una temperatura de 55°C (contenido de humedad de aire fue de -20-30%). Los cultivos se revisaron diariamente, y se registraron los siguientes resultados: (a) medida de diámetro de cultivo (utilizando calibradores) (b) registro fotográfico utilizando una cámara digital de 7.0 M (c) registro de cambios/diferencias fenotípicas visibles (d) indicación de formación de esporas (análisis microscópico) o de otra forma Resultados: El cultivo de cepas T. emersonii en los diferentes medios de agar reveló diferencias claras entre la cepa 393751 y las otras 9 cepas con respecto a lo siguiente: Tablas 43 y 44 Resumen del rango y grado de crecimiento en 45°C, medidas de diámetro de cultivo tomadas el día 2 y el día 5 Tabla 45: Rango de crecimiento a una temperatura de 55°C -medidas de diámetro de cultivo tomadas el día 5 Tabla 46: Resumen de cambios fenotípicos visibles y evidencia de formación de esporas Observación importante 1: Muchas de las cepas IMI/CBS produjeron cultivos con colores múltiples. Sin embargo, la pureza de estos cultivos fue verificada. Los colores/pigmentos producidos y el patrón de producción es típico de muchas especies de Penicillium , por ejemplo P. pinophilum . Observación importante: Tal como se indica en la tabla 20, existen diferencias claras entre la cepa 393751 y las otras, en términos de formación de esporas.

Tabla 43: Rango y grado de crecimiento a una temperatura de 45°C - medidas de diámetro de cultivo tomadas el día 5 SDA, Agar de Dextrosa Sabouraud; CMA, Agar con miel; PMA, Agar de Maltosa de Papa; MEA, Agar de Extracto de Malta; YpSs, Almidón Soluble de Potasio de levadura; YG, Agar de Glucosa de Levadura; NA, Agar Nutriente; OMA; Agar de Avena. Diámetros de cultivo: Placa completa, ++++++; 65-80 mm, +++++; 50-65 mm, ++++; 35-50 mm, +++; 20-35 mm, ++; y <20 mm, +.

M OI O OI OI Tabla 44: Rango y grado de crecimiento a una temperatura de 45°C - medidas de diámetro de cultivo tomadas el día 2 SDA, Agar de Dextrosa Sabouraud; CMA, Agar con miel; PMA, Agar de Maltosa de Papa; MEA, Agar de Extracto de Malta; YpSs, Almidón Soluble de Potasio de levadura; YG, Agar de Glucosa de Levadura; NA, Agar Nutriente; OMA; Agar de Avena. Diámetros de cultivo: Placa completa, ++++++; 65-80 mm, +++++; 50-65 mm, ++++; 35-50 mm, +++; 20-35 mm, ++; y <20 mm, +; no hubo evidencia de crecimiento, -.

N> en o a? Ol Tabla 45: Rango y grado de crecimiento a una temperatura de 55°C - medidas de diámetro de cultivo tomadas el día 5 SDA, Agar de Dextrosa Sabouraud; CMA, Agar con miel; PMA, Agar de Maltosa de Papa; MEA, Agar de Extracto de Malta; YpSs, Almidón Soluble de Potasio de levadura; YG, Agar de Glucosa de Levadura; NA, Agar Nutriente; OMA; Agar de Avena. Diámetros de cultivo: Placa completa, ++++++; 65-80 mm, +++++; 50-65 mm, ++++; 35-50 mm, +++; 20-35 mm, ++; y <20 mm, +; no hubo evidencia de crecimiento, -. r a? o n en Tabla 46: Resumen de cambios fenotípicos visibles y evidencia de formación de esporas (cultivos con 5 días de antigüedad, temperatura 45°C) SDA, Agar de Dextrosa Sabouraud; CMA, Agar con miel; PMA, Agar de Maltosa de Papa; MEA, Agar de Extracto de Malta; YpSs, Almidón Soluble de Potasio de levadura; YG, Agar de Glucosa de Levadura; NA, Agar Nutriente; OMA; Agar de Avena.

Tabla 46 continuación: Resumen de cambios fenotípicos visibles y evidencia de formación de esporas (cultivos con 5 días de antigüedad, temperatura 45°C) SDA, Agar de Dextrosa Sabouraud; CMA, Agar con miel; PMA, Agar de Maltosa de Papa; MEA, Agar de Extracto de Malta; YpSs, Almidón Soluble de Potasio de levadura; YG, Agar de Glucosa de Levadura; NA, Agar Nutriente; OMA; Agar de Avena.

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Claims (30)

1. REIVINDICACIONES 1. Una cepa termofílica de Talaromyces emersonii, la cual tiene un rango de temperatura de crecimiento de 30 a 90°C y la cual secreta en forma activa enzimas a temperaturas superiores a 55°C.
2. 2. Una cepa de Talaromyces emersonii tal como se describe en la reivindicación 1, con el depósito número IMI393751 o un muíante del mismo codificando también enzimas termoestables.
3. 3. Una composición de enzimas que comprende un filtrado de cultivo extracelular derivado de una cepa tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque retiene la actividad enzimática a temperaturas superiores a 55°C.
4. 4. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, para la bioconversion de plantas o materiales derivados de plantas o corrientes de desecho que incluyen desecho de hospitales.
5. 5. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, en la producción de materias primas con alto contenido de monosacáridos procedentes de residuos de plantas.
6. 6. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, en el procesamiento y reciclado de madera, productos de papel, papel y textiles.
7. 7. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, en la sacarificación de desechos de papel.
8. 8. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, en control antifúngico, de biocontrol y de limo.
9. 9. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, para aplicaciones hortícolas.
10. 10. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, en la producción de alimento para animales para aumentar la capacidad de digestión de alimento para ganado a base de cereales.
11. 11. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, en la producción de alimento para ganado a base de cereales que contiene bajo contenido de pentosa para animales monogástricos con capacidad de digestión mejorada y bajos contenidos de beta-glucan no celulósico.
12. 12. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, en la producción de alimentos para ganado funcionales con potencial bioactivo para utilizarse en el cuidado de la salud veterinaria.
13. 13. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, en la producción de productos lácteos o de dieta especializados, por ejemplo productos alimenticios y formulaciones de bebidas para cuidado de la salud geriátrico e infantil.
14. 14. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, en los sectores de panadería y confitería, y en la formulación de productos de panadería novedosos para el cuidado de la salud.
15. 15. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, en la generación de compuestos precursores de sabor, aroma y sensoriales en la industria alimenticia.
16. 16. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, para la generación de alimentos funcionales.
17. 17. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, para la producción de bebidas alcohólicas y sin alcohol de diseñador novedosas, jugos de frutas y bebidas saludables.
18. 18. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, en la producción de biofarmacéuticos, tales como oligosacáridos bioactivos (incluyendo 1,3(4) y 1 ,3(6)-glucooligosacáridos de ligadura mezcladas, xiloglucooligosacáridos de galactooligosacáridos, oligosacáridos pécticos, xilooligosacáridos ramificados y lineales (galacto)glucomanooligosacáridos), glicopéptidos y glucósido flavonoides de plantas terrestres y marinas, residuos de plantas, hongos y corrientes de desecho o subproductos con alto contenido de azúcares simples.
19. 19. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 6 2, para incrementar la biodisponibilidad de biomoléculas con actividad antibacteriana y antiviral natural, incluyendo glucósidos flavonoides y cianogénicos, saponinas, oligosacáridos y fenólicos (incluyendo ácidos ferúlico y p-cumárico, epicatequina, catequiza, ácido pirogálico y similares).
20. 20. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal cómo se describe en la reivindicación 1 ó 2, para incrementar la biodisponibilidad de biomoléculas antioxidantes naturales, por ejemplo carotenoides, licopenos, xantofilos, antocianinas, fenólicos y glucósidos de todos los materiales de plantas, residuos, desechos incluyendo varias frutas y fresas.
21. 21. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, para la generación de materias primas de materiales de plantas sin procesar, residuos de plantas y desechos para utilizar en la producción microbiana de antibióticos mediante hongos y bacterias incluyendo Penicillium sp. y Streptomyces sp..
22. 22. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, para la generación de materias primas de materiales de plantas sin procesar, residuos de plantas y desechos para utilizarse en la producción microbiana de ácido cítrico.
23. 23. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, para la producción de oligosacáridos de polisacáridos de algas (por ejemplo laminaran y fucoidan) y aditivos derivados de extractos de planta, considerados generalmente como procesos seguros, en la formulación de cosméticos.
24. 24. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, para la producción de oligosacáridos y glicopéptidos para utilizarse como reactivos de investigación, en producción de biosensores y como herramientas en glicómicos funcionales para probar interacciones de receptor-ligando y en la producción de bibliotecas de substrato para perfilar la especificidad de enzima-substrato.
25. 25. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, para la producción de celulosa modificada y ß-glucanos, cellooligosacáridos, almidones modificados y maltooligosacáridos, lactulosa y polioles (por ejemplo manitol, glucitol o dulcitol, xilitol, arabitol).
26. 26. Una xilanasa que tiene un peso molecular de 17.5 kDa, un pH óptimo de 4-4.5, que retienen 91% de actividad en pH 3.0, y que tiene actividad degradante contra tanto D-xilanos de enlace mezclado como D-glucanos de enlace mezclado.
27. 27. Una xilanasa tal como se describe en la reivindicación 26, que tiene actividad contra aril-P-xilosidas.
28. 28. Una xilanasa tal como se describe en la reivindicación 26 ó 27 derivada de la cepa Talaromyces emersonii con el depósito número IMI 393751, o una cepa substancialmente similar a la misma o un mutante de la misma.
29. 29. El uso de una composición de enzimas tal como se describe en la reivindicación 3 o una cepa de microorganismo tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, en un método para alterar el valor calorífico de una corriente de desecho.
30. 30. El uso tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 25 ó 29, caracterizado porque comprende además una o ambas de las cepas Chaetomium thermophile y Thermoascus aurantiacus.