MX2008009199A - Variante d3n de glicosilacion de la hormona estimulante del foliculo novedosa - Google Patents

Abstract

Se describe el mutante de la FSH con glicosilación aumentada y vida media más larga;también se describe el uso de este mutante de la FSH para inducir la folículo-génesis en pacientes humanos.

Description

VARIANTE D3N DE GLICOSILACION DE LA HORMONA ESTIMULANTE DEL FOLÍCULO NOVEDOSA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la reproducción humana. Más específicamente, la presente invención se refiere a las terapias de fecundación.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA a. Gonadotrofinas La hormona estimulante del folículo (FSH) es un miembro de la familia de gonadotrofinas que juega los papeles claves en la fecundidad humana. Las gonadotrofinas, que incluyen también la hormona de luteinizante (LH) y la gonadotrofina coriónica (CG), son heterodímeros, que consisten cada uno en una subunidad-a (92 aminoácidos) y una única subunidad-ß comunes (111 aminoácidos en FSH). Las secuencias del aminoácido de las formas maduras de las subunidades a y ß de la FSH se muestran en la SEC ID NO: 1 y la SEC ID NO: 2, respectivamente. La FSH humana ha sido aislado de las glándulas pituitarias y de la orina post-menopausia (EP 322.438) y ha sido producida de forma recombinante en las células mamarias (Patente de los Estados Unidos de Norte América No. 5.639.640; Patente de los Estados Unidos de Norte América No. 5.156.957; Patente de los Estados Unidos de Norte América No. 4.923.805; Patente de los Estados Unidos de Norte América No. 4.840.896; Patente de los Estados Unidos de Norte América No. 5.767.251 ; Patente EP 211.894; y patente EP 521.586. Las últimas referencias también revelan un gen humano modificado de la subunidad-ß de la FSH. La patente de los Estados Unidos de Norte América No. 5.405.945 revela un gen humano modificado de la subunidad-a de la FSH que comprende solo un intrón. Liu y colaboradores, Biol J Chem 1993.15; 268 (2): 21613-7, Grossmann y colaboradores, Mol Endocrinol 1996 10 (6) : 769-79, Roth y Dias (Mol Cell Endocrinol 1995 1 ; 109 (2): 143-9, Valove y colaboradores, la Endocrinología 1994; 135 (6): 2657-61.1 Yoo y colaboradores, JBiol Chem 1993 25; 268 (18): 13034-42), la patente de los Estados Unidos de Norte América No. 5.508.261 y Chappel y colaboradores, 1998, Human Reproduction, 13 (3): 1835 revelan varios estudios de la relación de la estructura-función e identifican residuos de los aminoácidos implicados en la unión del receptor y la activación y en la dimerización de la FSH. b. El uso de Gonadotrofinas en las Técnicas de Reproducción Asistida. Las gonadotrofinas juegan roles cruciales en el ciclo reproductor, y en su uso en terapias exógenas es esencial para las técnicas de reproducción asistida (ART), tal como la fecundación in vitro (IVF), IVF en conjunto con la inyección de esperma intracitoplasmático (IVF/ICSI) y la transferencia de embrión (ET), así como para la inducción de la ovulación (Ol) en los pacientes anovulatorios que experimentan la fecundación in vivo tanto naturalmente o por medio de la inseminación intrauterina (IUI). La patente de los Estados Unidos de Norte América No. 4.589.402 y la patente de los Estados Unidos de Norte América No. 4.845.077 revelan la FSH humana purificada la cual está libre de LH y el uso de las mismas para la fecundación in vitro. La patente EP 322.438 revela una proteína con al menos 6200 U/mg de actividad FSH la que está substancialmente libre de actividad de LH, y en donde la subunidad-a y la subunidad-ß de la FSH, respectivamente, pueden ser de tipo salvaje o formas truncadas específicas de las mismas. La terapia prolongada es necesaria para lograr un efecto terapéutico, típicamente de 8-10 días consecutivos y a veces hasta 21 días para estimular la foliculo-génesis en las mujeres, y hasta los 18 meses en los varones hipogonadotróficos para inducir la espermatogénesis. La hFSH recombinante es administrada típicamente como una inyección i.m. o s.c. diaria, con la consecuente molestia y el potencial para la reacción del sitio de la inyección local. Disminuir la frecuencia de la administración facilitaría la terapia y suministraría una administración de gonadotrofina más adecuada, más tolerable y más a gusto del paciente. c. Glicosilación de la FSH Las gonadotrofinas son glicoproteínas, que tienen las cadenas laterales de otigosacárido (N-enlance) unidas a la asparagina que son importantes para la actividad y la función in vivo. La adición del carbohidrato (glicosilación) a los polipéptidos es un acontecimiento post- translacional que resulta en la adición de cadenas de azúcar a la asparagina específica (enlace-N) o los aminoácidos de serina/treonina (enlace-O). En contraste con la secuencia invariable del aminoácido de la porción de la proteína de las glicoproteínas, las estructuras del carbohidrato son variables, una característica referida como micro-heterogeneidad. Por ejemplo, los sitios de glicosilación-N en la misma proteína pueden contener estructuras diferentes del carbohidrato. Además, aún en el mismo sitio de glicosilación en una glicoproteína dada, se pueden encontrar estructuras de carbohidrato diferentes. Esta heterogeneidad es una consecuencia de la síntesis no-dirigida de plantilla de los carbohidratos. La glicosilación N de las proteínas ocurre específicamente en el patrón de consenso Asn-Xaa/Ser/Thr, y en menor grado en el patrón de consenso Asn-Xaa-Cys, donde Xaa puede ser cualquier residuo de aminoácido. Sin embargo, la presencia de un tripéptido de consenso no es suficiente para asegurar que un residuo de asparagina sea glicosilado. Por ejemplo, la glicosilación-N de la secuencia Asn-Pro-Ser/Thr ocurre a una tasa 50 veces más baja que los otros patrones de consenso de Asn-Xaa-Ser/Thr. La FSH humana contiene cuatro sitios de glicosilación: dos en la subunidad-a comunes en las posiciones 52 y 78 y dos en la subunidad-ß en las posiciones 7 y 24. Los carbohidratos adjuntos a la subunidad-a de la FSH son críticos para el ensamblado del dímero, para la integridad, para la transducción de secreción y señal, mientras que los carbohidratos de la subunidad-ß son importantes para el ensamblado del dímero, para la secreción y el despeje del heterodímero de la circulación. Galway y colaboradores, Endocrinología 1990; 127 (1 ): 93-100 demuestra que las variantes de la FSH producidas en una línea de célula CHO de transferasa-l N-acetilglucosamina o una línea de célula de CHO defectuosa en el transporte del ácido siálico, es tan activa como la FSH secretada por las células de tipo salvaje o la FSH pituitaria purificada in vitro, pero carece de actividad in vivo, presumiblemente debido al despeje rápido de las variantes inadecuadamente glicosiladas en el suero. D'Antonio y colaboradores, Reprod. Humana 1999; 14 (5): 1160-7 describen varios isoformos de la FSH que circulan en la corriente sanguínea. Los isoformos tienen secuencias idénticas de aminoácido, pero difieren en la extensión de la modificación post-translacional. Se descubrió que los grupos menos ácidos de isoformos tuvieron un más rápido despeje in vivo, comparado con el grupo de isoformo acido, posiblemente debido a diferencias en el contenido del ácido siálico entre los isoformos. Además, Bishop y colaboradores, Endocrinología 1995; 136 (6): 2635-40 concluye que la vida media circulatoria parece como que es el determinante primario de la actividad in vivo. Estas observaciones llevaron a la hipótesis de que la vida media de la FSH podría ser aumentada mediante la introducción de sitios adicionales de glicosilación para aumentar el contenido del ácido siálico del polipéptido. d. Variantes de la FSH. Se han desarrollado agonistas de la FSH con una vida media aumentada mediante la fusión del péptido de carboxiterminal de hCG (CTP) a la FSH recombinante nativa humana (rhFSH). La fracción CTP consiste de los aminoácidos 112-118 a 145 con cuatro sitios de glicosilación de enlace O-localizados en las posiciones 121 , 127, 132 y 138. La patente de los Estados Unidos de Norte América No. 5.338.835 y la patente de los Estados Unidos de Norte América No. 5.585.345 revelan una subunidad-ß modificada de la FSH extendida a la Terminal-C Glu con la fracción de CTP de hCG. El análogo modificado resultante se indica que tiene la actividad biológica de la FSH nativa, pero una vida media de circulación prolongada. La patente de los Estados Unidos de Norte América No. 5.405.945 revela que la porción terminal del carboxi de la subunidad-ß hCG o una variante de la misma, tiene efectos significativos en el despeje de CG, de la FSH, y de LH. La patente de los Estados Unidos de Norte América No. 5.883.073 revela las proteínas de cadena-simple que comprenden dos subunidades-a con una actividad de agonista o antagonista para CG, TSH, LH y FSH. La patente de los Estados Unidos de Norte América No. 5.508.261 revela los polipéptidos heterodimérico s que tienen afinidad de unión a LH y receptores de la FSH que comprenden una subunidad-a de la hormona de glicoproteína y un polipéptido de la subunidad-ß que ocurre no-naturalmente, en donde el polipéptido de subunidad-ß es una cadena de aminoácidos que comprende cuatro sub-secuencias unidas, cada una de las cuales es escogida de una lista de secuencias específicas. Klein y colaboradores (2003) revelan un análogo de cadena simple de la FSH con un incremento de la vida media, en donde las subunidades-a y -ß son enlazadas por un oligopéptido que contiene dos sitios de glicosilación de enlaces -N. La patente WO 01/58493 revela 77 mutaciones que pueden ser hechas en la subunidad-a de la FSH y 51 mutaciones que pueden ser hechas en la subunidad-ß de la FSH en una tentativa para mejorar la vida media in vivo de la FSH. Además, la patente WO 01/58493 revela que uno o más sitios de glicosilación pueden ser añadidos a la Terminal N- de la FSH para mejorar su vida media o ser insertados en varios sitios dentro del polipéptido FSH. La patente WO 01/58493, mientras que describe que los sitios de glicosilación pueden ser insertados en el polipéptido de la FSH, no proporcionan una guia como el sitio específico (los sitios), donde uno podría insertar un sitio de glicosilación y mantener la actividad de la FSH. La patente WO 01/58493 además revela que las subunidades-a y ß mutantes pueden ser usadas individualmente: (1 sitio adicional de glicosilación) o en una combinación (2 sitios adicionales de glicosilación). Los 128 mutantes candidatos fueron identificados usando 50 modelos de estructura 3D de la FSH que fueron generados basados únicamente en la estructura de hCG y una alineación de secuencia de la FSH y hCG a pesar del sólo 32 por ciento de identidad entre las subunidades-ß de hCG y FSH. La patente WO 01/58493 no revela la producción o la prueba de cualquiera de la subunidades-a o ß de la FSH donde un sitio de glicosilación se introdujo por mutagénesis dirigida de sitio. La patente WO 05/020934 revela GM1 , con las mutaciones en las subunidades-a y -ß de la FSH, inclusive una mutación doble en ß E55N/V57T, es decir, el residuo E en la posición del aminoácido 55 mutado a N y el residuo V en la posición del aminoácido 57 mutado a T. La secuencia del aminoácido de ß E55N/V57T se muestra en la SEC ID NO: 3. Existe una necesidad clínica de un producto que proporcione parte o todos los efectos terapéuticamente relevantes de la FSH, y que puedan ser administrados con menos intervalos de frecuencia en comparación con los productos de la FSH actualmente disponibles, y que proporcionen preferiblemente un nivel más estable de la actividad circulante de la FSH en comparación con que los que se pueden conseguir por los tratamientos corrientes. La presente invención se dirige a tales productos así como también a los medios para fabricar tales productos.- BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a las moléculas de la FSH mutante, en donde la subunidad-a de la FSH comprende la SEC ID NO: 4 y en donde la subunidad-ß de la FSH comprende la SEC ID NO: 3. La FSH puede ser N-glicosilada en 0, 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos de la asparagina de dicha FSH mutante. En una modalidad N3 de la subunidad-a mutante de la SEC ID NO: 4 puede ser glicosilada. La invención presente se refiere también a las moléculas de ADN aisladas que codifican un mutante de la subunidad-a de la FSH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 4. La invención presente se refiere también a un ADN aislado que codifican una subunidad-ß de la FSH que comprende la secuencia de SEC ID NO: 3. La invención presente se refiere también a un vector que comprende un ADN que codifica un mutante de la subunidad-a de la FSH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 4. El vector puede ser un vector de expresión. La presente invención se refiere también a un vector que comprende un ADN que codifica un mutante de la subunidad-ß de la FSH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 3. El vector puede ser un vector de expresión. La presente invención se refiere también a un vector que comprende un primer ADN y un segundo ADN en el que el primer ADN codifica un mutante de la subunidad-a de la FSH de la secuencia de la SEC ID NO: 4 y en donde el segundo ADN codifica un mutante de la subunidad-ß de la FSH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 3. El vector puede ser un vector de expresión. La presente invención se refiere también a una célula que comprende un vector que comprende la codificación del ADN de un mutante de la subunidad-a de la FSH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 4. El vector puede ser un vector de expresión. La célula puede ser una célula de mamífero, por ejemplo, una célula CHO. La presente invención se refiere también a una célula que comprende un vector que comprende un ADN que codifica un mutante de la subunidad-ß de la FSH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 3. El vector puede ser un vector de expresión. La célula puede ser una célula de mamífero, por ejemplo, una célula CHO. La presente invención se refiere también a una célula que comprende un vector que comprende un primer ADN y un segundo ADN, en donde el primer ADN codifica una mutante de la subunidad-a de la FSH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 4 y en donde el segundo ADN codifica un mutante de la subunidad-ß de la FSH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 3. El vector puede ser un vector de expresión. La célula puede ser una célula de mamifero, por ejemplo, una célula CHO. La invención presente se refiere también a una célula que comprende un primer y un segundo vector, en donde el primer vector comprende un ADN que codifica un mutante de la subunidad-a de la FSH que consiste en la SEC ID NO: 4 y el segundo vector comprende un ADN que codifica un mutante de la subunidad-ß de la FSH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 3. El vector (vectores) puede ser un vector de expresión. La célula puede ser una célula de mamifero, por ejemplo, una célula CHO. La presente invención se refiere también a un método para producir un mutante de la FSH que comprende el cultivo de células mamíferas con capacidad de glicosilar proteínas, en donde dichas células comprenden un primer vector de expresión que comprende un ADN que codifica un mutante de la subunidad-a de la FSH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 4 y un segundo vector de expresión que comprende un ADN que codifica un mutante de la subunidad-ß de la FSH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 3. En otra modalidad de la invención presente dichas células comprenden un solo vector que comprende un ADN que codifica un mutante de la subunidad-a de la FSH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 4 y comprende además un ADN que codifica un mutante de la subunidad-ß de la FSH que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 3. La presente invención se refiere también a una composición que comprende un mutante de la FSH y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la subunidad-a de la FSH comprende de la secuencia de la SEC ID NO: 4 y en donde la subunidad-ß de la FSH comprende la SEC ID NO: 3. La presente invención se refiere también a un método para tratar un mamífero infértil, que comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo, una cantidad efectiva de un mutante de la FSH mutante, en la que la subunidad-a de la FSH comprende la secuencia de la SEC ID NO: 4 y en donde la subunidad-ß de la FSH comprende la SEC ID NO: 3. La presente invención se refiere también a un método estimulante de la folículo-génesis en un mamifero, que comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo, una cantidad efectiva de una FSH mutante, en donde la subunidad-a de la FSH comprende la secuencia de la SEC ID NO: 4 y en donde la subunidad-ß de la FSH comprende la SEC ID NO: 3. La presente invención se refiere también a un método para inducir la hiper-estimulación ovárica en un mamífero, que comprende administrar al mamífero en necesidad del mismo una cantidad efectiva de una FSH mutante, en donde la subunidad-a de la FSH comprende la secuencia de la SEC ID NO: 4 y en donde la subunidad-ß de la FSH comprende la SEC ID NO: 3.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra una alineación de los mutantes de la subunidad-a D3N (SEC ID NO: 4) a la subunidad-a humana de la FSH (SEC ID NO: 1 ). Los números de residuos se refieren a la subunidad-a humana de la FSH (SEC ID NO: 1 ) siendo el 1 el primer aminoácido del polipéptido maduro. Las exposiciones de la figura 2 muestran una curva de respuesta a la dosis para la FSH mutante, que comprende una subunidad-a mutante D3N y una subunidad-ß GM-1 que comprende la SEC ID NO: 3, en comparación con una curva de respuesta a la dosis de la FSH de tipo salvaje. La curva de respuesta a la dosis indica la actividad de la FSH en varias diluciones de ambas, la FSH mutante y la de tipo salvaje. El Clon 15C se refiere al mutante D3N. El Clon 14C es un mutante no relacionado de la FSH.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Mientras que se ha mostrado que aumentar el contenido del carbohidrato de la FSH puede conducir al aumento de la vida media in vivo, la mejora de la vida media de la FSH es más complicada que agregar simplemente sitios adicionales de glicosilación. Mientras una secuencia del consenso de glicosilación es necesaria para la adición del carbohidrato, no es suficiente para asegurar que un sitio de adición del carbohidrato se haya utilizado. Otros factores, tal como el plegado y la conformación de la proteína local durante la biosíntesis, determina si un oligosacárido está adjunto a un sitio dado de la secuencia del consenso. Además, en función de una glicosilación adicional que conduzca a un aumento de la vida media in vivo, la secuencia de consenso debe estar en una posición tal que la glicosilación del sitio no interfiera con la unión del receptor, ni que comprometa el plegado, la conformación ni la estabilidad de la glicoproteína. A este punto, los análogos de la FSH con vidas medias aumentadas han sido limitados principalmente a las proteínas de fusión en donde las porciones fusionadas del polipéptido incluyeron sitios adicionales de glicosilación. 1. FSH mutante Se proporciona un mutante de la FSH con la condición de que se haya modificado para crear sitios de reconocimiento de glicosilación adicional. La subunidad-a del mutante de la FSH puede tener una de las mutaciones siguientes, comparado con la subunidad-a de tipo salvaje: D3N y Q5T. Una FSH mutante puede comprender la subunidad-a mutante de más arriba en combinación con la subunidad-ß mutante, es decir ß GM1 conteniendo la mutación siguiente: E55NA/57T. Uno o más de los sitios adicionales de glicosilación de la FSH recombinante pueden ser glicosilados. Uno o más sitios adicionales de glicosilación de la FSH mutante pueden ser glicosilados in vitro o in vivo. El mutante de la FSH puede ser producido por algún método adecuado conocido en el arte. Estos métodos incluyen la construcción de las secuencias de nucleótido que codifican los mutantes respectivos de la FSH y expresar la secuencia de aminoácido en un huésped transfectado adecuado. El mutante de la FSH puede ser producido también por la síntesis química o por una combinación de la síntesis química y la tecnología de ADN recombinante.

La FSH mutante puede comprender las subunidades-a y ß- de la FSH en forma de dos cadenas separadas de polipéptido, donde las dos cadenas se dimerizan in vivo para formar un polipéptido dimérico, o puede comprender un constructo de cadena único que comprende las dos subunidades ligadas covalentemente por una unión de péptido o un conectador de péptido. Los residuos del aminoácido del péptido enlazador pueden exhibir propiedades que no interfieren apreciablemente con la actividad del mutante de la FSH. El mutante de la FSH puede tener una vida media aumentada comparado con la FSH de tipo salvaje. El mutante de la FSH puede también tener una estabilidad comparada con la FSH de tipo salvaje. El mutante de la FSH puede comprender los oligosacáridos a 0, 1 , 2, 3, 4, 5 o 6 de los sitios de glicosilación unidos N. Una población de los mutantes de la FSH también se proporcionan, los que pueden comprender uno o más isoformos mutantes de la FSH, donde cada isoformo comprende los oligosacáridos a 0, 1 , 2, 3, 4, 5 o 6 de los sitios de glicosilacion unidos a N. La secuencia del nucleótido que codifica las subunidad-a- o ß del mutante de la FSH puede ser construida aislando o sintetizando una secuencia de nucleótido que codifica la subunidad madre de la FSH, tal como la hFSH-alfa o la hFSH-beta con las secuencias de aminoácido mostradas en la SEC ID Nos.: 1 y 2, respectivamente. La secuencia del nucleótido entonces puede ser cambiada para realizar la reinserción o la sustitución de los residuos relevantes de aminoácido. La secuencia del nucleótido puede ser modificada por el sitio de mutagénesis dirigido. En la alternativa, la secuencia de nucleótido puede ser preparada por la síntesis química, en donde los oligonucleotidos están diseñados basados en la secuencia del aminoácido específico del mutante de la FSH. La secuencia del nucleótido que codifica el polipéptido puede ser insertada en un vector recombinante y operablemente ser unida a una secuencia de control necesaria para la expresión del polipéptido en la célula huésped transfectada deseada. Las secuencias de control pueden ser cualquier componente que sea necesario o ventajoso para la expresión de un polipéptido. Los ejemplos de las secuencias de control adecuadas para dirigir la transcripción en las células de los mamíferos incluyen los promotores tempranos y tardías de SV40 y el adenovirus, por ejemplo el promotor tardío principal del adenovirus 2, el promotor MT -1 (gen de metalotioneina) y el promotor del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV). Una persona experta en la técnica puede realizar una selección entre estos vectores, las secuencias del control de la expresión y los huéspedes sin la experimentación no debida. El vector recombinante puede ser un vector replicante autónomo, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosomática, la réplica de la cual es independiente de la réplicación cromosomática, por ejemplo un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando es introducido en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y replica junto con el cromosoma (los cromosomas) en que ha sido integrada.

El vector puede ser un vector de expresión en el cual la secuencia del nucleótido que codifica el polipéptido de la invención está operablemente unido a los segmentos adicionales requeridos para la transcripción de la secuencia nucleótida. El vector puede ser derivado de un ADN de plásmido o viral. Un número de vectores de expresión para la expresión en las células huésped mencionado en la presente se encuentran comercialmente disponibles o descriptos en la literatura. El vector recombinante puede además comprender una secuencia de ADN que habilita al vector a replicar en la célula huésped en cuestión. Un ejemplo de tal secuencia (cuando la célula huésped es una célula de mamífero) es el origen SV40 de la replicación. El vector puede también comprender un marcador seleccionable, por ejemplo un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped, tal como la codificación del gen para la reductasa de dihidrofolato (DHFR) o una que confiere resistencia a una droga, por ejemplo, ampicilina, canamicina, cloramfenicol de tetraciclina, la neomicina, higromicina o metotrexato. El vector puede también comprender un gen amplificable, tal como DHFR, de manera que las células que tengan múltiples copias del gene amplificable y las secuencias que flanquean, inclusive el ADN de la FSH mutante, pueden ser escogidas para un medio apropiado. También proporcionado se encuentra un ADN que codifica una subunidad-a del mutante de la FSH. La secuencia del nucleótido que codifica las subunidades de alfa beta del mutante de la FSH, preparadas por mutagénesis de sitio-dirigido, síntesis, PCR u otros métodos, opcionalmente pueden incluir también una secuencia de nucleótido que codifica un péptido de señal. El péptido de señal puede estar presente cuando el polipéptido es para ser secretado por las células en las que se expresa. Tal péptido de señal, si está presente, puede ser uno reconocido por la célula escogida para la expresión del polipéptido. El péptido de señal puede ser homólogo (por ejemplo), que sea el que normalmente está asociado con una subunidad de hFSH) o puede ser heterólogos (es decir que se origina en otra fuente que la hFSH) al polipéptido o puede ser homólogo o heterólogo a la célula huésped, es decir, es un péptido de señal normalmente expresado de la célula huésped o de uno que no es expresado normalmente de la célula huésped. Cualquier huésped adecuado puede ser usado para producir los polipéptidos, incluyendo las bacterias, los hongos (incluyendo las levaduras), plantas, insectos, mamíferos, u otras células de animal apropiadas o líneas de célula, tanto como los animales transgénicos o plantas. Los ejemplos de las células huésped de mamífero incluyen las líneas de células CHO del ovario del hámster Chino, por ejemplo, CHO-KL; ATCC CCL-61 ), las líneas de célula del Mono Verdes (Green Monkey), (COS) (por ejemplo, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651 )); las células de ratón (por ejemplo NSIO), líneas de célula (BI-EK) de Riñon del Hámster Bebé (Baby Hámster Kidney), (por ejemplo ATCC CRL-1632 o ATCC CCL-10), y las células humanas (por ejemplo BEK 293 (ATCC CRL-1573)), así como células de planta en los cultivos del tejido. Las líneas de célula adecuadas adicionales son conocidas en la técnica y están disponibles de los depositarios públicos tales como la Recolección del Cultivo Tipo Americano, (American Type Cultura Collection) Estados Unidos De Norte América. Los métodos para introducir ADN exógenos en las células huésped de mamíferos incluyen la transfección de fosfato-mediado de calcio, electroporación, transfección mediada por dextran, transfección mediada por liposoma y los vectores vírales. Las células pueden ser cultivadas en un medio nutriente adecuado para la producción del polipéptido utilizando los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada mediante el cultivo en un frasco de agitación, fermentación o gran escala o pequeña escala (incluyendo las fermentaciones continuas, de lote de alimentación o estado sólido) en laboratorio o en fermentadores industriales llevados a cabo en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales orgánicas, usando los procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles desde los proveedores comerciales o pueden ser preparados de acuerdo con las composiciones publicadas (por ejemplo en el Catálogo de la Colección de Cultivos Tipo Americano). Si el polipéptido es secretado en el medio de nutriente, puede ser recuperado directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado, puede ser recuperado de los usados de la célula. Un método de producción de alto rendimiento de los mutantes de la FSH de la invención es por amplificación mediante el uso de reductasa dihidrofolato (DHFR) en las células CHO deficientes-DHFR, mediante el uso de los niveles de aumento sucesivos de metotrexato tal como se describe en la patente de los Estados Unidos de Norte América No. 4.889.803. El polipéptido de la FSH mutante resultante puede estar cubierto por los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede estar recubierto del medio nutriente por procedimientos convencionales que incluyen, pero no están limitados a, la centrifugación, la filtración, la extracción, el secado por pulverización, la evaporación o la precipitación. Los polipéptidos de la FSH mutante pueden estar purificados por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no están limitados a, la cromatografía (por ejemplo, el intercambio de iones, afinidad, hidrofóbica, cromato-enfoque, y exclusión de tamaño), los procedimientos electroforéticos (por ejemplo, el enfoque isoeléctrico preparativo), la solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación del sulfato de amonio), la SDS-PAGE, o la extracción. También provistos se encuentra una composición farmacéutica que comprende la FSH mutante. Tal composición farmacéutica puede ser usada para estimular la folículo-génesis, por ejemplo, en conjunto con las técnicas de inducción por ovulación o reproductivas asistidas (ART). Debido a que el mutante de la FSH de la presente invención puede ser efectivo para inducir a que los folículos múltiples se desarrollen y maduren, puede ser particularmente adecuado para usar en ART, en la cual se desea recolectar los oocitos múltiples. El mutante de la FSH puede ser usado para inducir la mono- folículo-génesis para Ol, o la paucifolículo-génesis (hasta aproximadamente tres folículos) para IUI, para la fecundación in vivo. La mono-folículogenesis puede ser alcanzada también con una dosis reducida del mutante de la FSH, o dosificación menos frecuente comparado con las preparaciones convencionales de la FSH. Por ejemplo, en Ol una preparación de la FSH de la invención puede ser administrada a 225-400 IU cada tres días, o dosis más bajas, dependiendo de la respuesta del paciente. La respuesta del paciente puede ser seguida por sonografía. El mutante de la FSH de la invención puede ser usado en un régimen de hiper-estimulación controlada COH. Los regímenes estándar para CHO incluyen una fase de regulación descendente en la que la hormona endógena luteinizante (LH) es regulada hacia abajo mediante la administración de una hormona agonista liberadora de la gonadotrofina (GnRH) seguido por una fase de estimulación en la que el desarrollo folicular (folículo-génesis) es inducido por la administración diaria de la hormona estimulante del folículo (FSH), generalmente a aproximadamente 150-225 lU/día. Alternativamente la estimulación puede ser iniciada con la FSH después de una menstruación espontánea o inducida, seguido por la administración de un Gnrh-Antagonista (empezando típicamente alrededor del día seis de la fase de estimulación). Cuándo hay por lo menos 3 folículos >16 Mm (uno de 18 Mm), se puede administrar un bolo alimenticio único de hCG (IU 5-10.000) para imitar la oleada natural de LH e inducir la ovulación. La recuperación del oocito puede ser cronometrada durante 36-38 horas después de la inyección de hCG. El mutante de la FSH de la invención también puede ser usado para 01 o para IUI, la estimulación FSH puede iniciarse después de la menstruación ya sea espontánea o inducida a una dosis diaria de 75-150 IU. Cuándo 1 o 3 folículos han alcanzado un diámetro de, por lo menos, 16 Mm, se puede administrar un bolo alimenticio hCG único para inducir la ovulación. La inseminación puede ser realizada in vivo, mediante una relación sexual regular o por IUI. Debido a que el mutante de la FSH puede tener un aumento de la vida media con respecto a las preparaciones de la FSH de tipo salvaje, regímenes como el descripto más arriba pueden emplear menores dosis de IU de la FSH, y/o pueden ser modificados mediante la disminución del período de estimulación de la FSH, mientras que se logra la misma o una mejor respuesta en términos de cantidad y viabilidad de folículos. Por ejemplo, una adecuada folículo-génesis puede ser lograda con dosis diarias de aproximadamente 50-150, 50-100 o 50-75 IU de la FSH. La dosificación de la FSH puede ser en una base diaria o semi-diaria. El período de dosificación puede ser menos que o aproximadamente 14, 12, 11 o 10 días. Para Ol, la preparación del mutante de la FSH puede ser administrada en dosis de 25-150 o 50-125 IU de FSH/día. Para el tratamiento de la esterilidad masculina, la preparación del mutante de la FSH puede ser administrada a 3 X 150 hasta 300 lU/semana hasta que la espermatogénesis alcance los niveles adecuados para la inseminación, ya sea por técnicas de relación sexual regulares o por ART. Debido a la vida media más larga de la FSH mutante, puede administrarse como una preparación de acción prolongada, que puede ser administrada con menos frecuencia que cada dos días. La FSH convencional puede ser administrada en o a aproximadamente 300 IU en cada día por medio, mientras que se logran resultados semejantes a la administración cada dia en o a aproximadamente 150 IU. La FSH mutante puede ser administrado cada 3, 4, 5, 6 o 7 días, al lograr resultados semejantes o mejores que la administración diaria de la FSH convencional. El mutante de la FSH puede ser usada para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades, condiciones o desórdenes. En otro aspecto el polipéptido de la composición farmacéutica de acuerdo a la invención se usa en un método para tratar a un mamifero, en particular un humano, que comprende administrarle al mamífero que lo necesite un polipéptido o una composición farmacéutica. Es evidente para aquellas personas expertas en la técnica que una cantidad efectiva de un polipéptido, preparación o composición depende, inter alia, de la enfermedad, de la dosis, del programa de administración, si el polipéptido o la preparación o la composición son administrados solos o en conjunto con otros agentes terapéuticos, de la vida media del suero de las composiciones, y de la salud general del paciente. Típicamente, una dosis efectiva de la preparación o la composición es suficiente para asegurar un efecto terapéutico.

El mutante de la FSH puede ser administrado en una composición que incluye uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un vehículo o excipiente que no causa ningún efecto adverso en los pacientes a quienes se les administra. Tales vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica y el polipéptido puede ser formulado en las composiciones farmacéuticas por métodos bien conocidos (ver por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 18, edición decimoctava, A. R. Gennaro, Ed. Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer y L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000); y Handbook of Pharmaceutical Excipients, A. Kibbe, Pharmaceutical Press (2000)). Los excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden ser usados en las composiciones que comprende el polipéptido incluye, por ejemplo, los agentes de amortiguación, los agentes estabilizadores, los conservantes, los iso-tonificadores, los surfactantes no-iónicos o los detergentes "agentes humectantes"), los antioxidantes, los agentes engrosantes o los rellenadores, los agentes quelantes y los co-solventes. Las composiciones farmacéuticas que comprenden el mutante de la FSH pueden ser formuladas de una variedad de formas, incluyendo los líquidos, por ejemplo soluciones o suspensiones listas para usar, geles, liofilizados, o a cualquier otra forma adecuada, por ejemplo, polvos o cristales adecuados para preparar una solución. La forma de la composición puede depender de la indicación particular que está siendo tratada y será evidente para una persona con habilidad en la técnica. Las composiciones farmacéuticas que comprenden el mutante de la FSH pueden ser administradas de forma intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, sublingual, bucal, intranasal, transdérmica, por inhalación o de cualesquier otra manera aceptable, por ejemplo, usando tecnología PowderJect o ProLease o un sistema de inyección de pluma. El modo de la administración puede depender de la indicación particular a ser tratada y será evidente para una persona de habilidad en la técnica. La composición puede ser administrada subcutáneamente, lo que puede permitir que el paciente realice una auto-administración. Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas en conjunto con otros agentes terapéuticos. Estos agentes pueden ser incorporados como parte de la misma composición farmacéutica o pueden administrarse separadamente desde los polipéptidos, tanto concurrentemente como de acuerdo con cualquier otro programa de tratamiento aceptable.

Adicionalmente el polipéptido, la preparación o la composición farmacéutica pueden ser utilizados como un adjunto a otras terapias. La presente invención tiene múltiples aspectos, ilustrados por los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 Mutantes de la FSH La estructura del cristal 3D de la FSH humana fue usada para identificar los sitios de glicosilación candidatos en la subunidad-a de la FSH o en las regiones de la molécula de la FSH donde un sitio de glicosilación candidato puede insertarse. Las dos moléculas de la FSH (4 subunidades) están presentes en cada unidad asimétrica de la estructura de cristal. Las dos moléculas de la FSH se super-impusieron y compararon, siendo cada residuo visualmente inspeccionado para identificar los sitios de la glicosilación N potencial. La estructura cristalográfica de la FSH fue combinada con el conocimiento de la interacción de receptor de la FSH/FSHR para ayudar, además, en la selección de sitios potenciales de N-glicosilación. Los criterios principales del diseño fueron la interrupción mínima de la estructura 3D, la interrupción mínima de sitios predichos de unión y de activación, y de la estructura 3D pronosticada compatible con la glicosilación. Basados en los criterios de más arriba, se identificó el mutante siguiente para la secuencia del aminoácido de la subunidad-a de la FSH: EJEMPLO 2 Análisis morfológico de los mutantes de la FSH Las alícuotas de los supemacientes de cultivo concentrados de la expresión transitoria del mutante de la subunidad-a de la FSH fueron analizadas por SDS-PAGE bajo las condiciones de no-reducción que permite la resolución de los heterodímeros intactos de la FSH de las sub-unidades-a y -ß libres. Comparando los pesos moleculares aparentes de cada heterodímero mutante a aquel de la FSH de tipo salvajes se puede determinar si la FSH mutante es hiperglicosilada en relación a la FSH de tipo salvaje. Brevemente, después de la electroforesis, las proteínas fueron electroforética mente transferidas a PVDF y se visualizó usando anticuerpo de Serono 9-14 dirigida contra la subunidad-a de la FSH. Como un control, la FSH humana de tipo salvaje, el mutante GM1 , la FSH-CTP y Gonal F fueron analizadas también. El cuadro 1 muestra el peso molecular aparente del heterodímero formado por el mutante de la subunidad-a y la subunidad-ß tipo salvaje como se calculó basado en los estándares del peso molecular.

CUADRO 1 Como se muestra en el cuadro I, el mutante de la FSH, es decir mutación D3, mostró la glicosilación aumentada evidenciada por una conmutación de la distribución del peso molecular aparente del heterodímero comparado con la FSH humana tipo salvaje.

EJEMPLO 3 Función In Vitro de los mutantes de la FSH Para determinar la actividad de los mutantes de la FSH, el mutante se probó por su capacidad para estimular la producción cAMP en una línea de células CHO que expresa en forma recombinante el receptor humano de la FSH. Las células CHO-FSHR se mantuvieron en el medio de crecimiento de la FSHR [MEM a(-) (Gibco, cat#12561 -056) + 10 por ciento de FBS dializado (Gibco, cat#26300-020) + 600 µg/ml de Geneticin (Gibco, cat#10131-035) + 0.02µMTX M]. Las células CHO-FSHR fueron sembradas en 2x10" células/fuente en 100 µl/fuente (2 x 106 células/10 mi = 1 placa) y se incubaron a 37°C durante 24 horas antes del ensayo. Las células fueron usadas para el ensayo si por lo menos el 70 por ciento confluente. Se realizó una dilución 1 :3 serial de punto 12 comenzando con el 67.5 nM para todas las muestras y el estándar interno (Gonal F se utilizó como un estándar interno). Todas las diluciones se realizaron en el medio del ensayo [DMEM/F12 (libre de fenol, Gibco, cat #1 1039-021 ) + 1 mg/ml BSA (Sigma, A-6003) + 0.1 mM IBMX (inhibidor 3-isobutil-1-metilxantona fosfod ¡este rasa, Sigma, cat#l-7018)]. Se quitaron los medios de crecimiento de la placa del ensayo, se agregó 25µl de medios de ensayo (suministrados con un equipo MA6000 cAMP MSD - Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD), se recuperaron e incubaron las placas a 37°C durante 15 minutos. Las fuentes luego se dosificaron con 25 µl/fuente de la muestra de prueba, se mezclaron, las placas se recubrieron e incubaron durante 1 hora a 37°C. Luego de 1 hora de incubación, se quitaron las muestras y los medios de las fuentes. Se agregaron luego 25 µl de amortiguador de lisis estándar (suministrado con un conjunto de MA 6000 Meso Scale Discovery) para cada fuente, las placas se cubrieron con sellador de placa (Packard, cat#60O5185) y se agitaron durante 5 minutos. Después de 5-minutos de incubación de lisis, se transfirieron 25 µl del material de la célula lisado a la placa cAMP Meso Scale Discovery (suministrada con un equipo MA6000 MSD) y se incubó con un mezclado suave a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se agregaron 25 µl de conjugado cAMP-AP a cada fuente y se mezcló. Luego se agregaron 25 µl de anti-cuerpo cAMP a cada fuente, las placas se cubrieron con sellador de placa y se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron luego seis veces con 350 µl/fuente de amortiguador de lavado en una lavadora de placa automática. Se agregaron luego 100 µl de mejorador de sustrato Sapphire II RTU (Listo para usar) a cada fuente, las placas se cubrieron con sellador de placa y se incubó durante 30 minutos en la oscuridad a 25°C. Se leyeron las placas en un segundo por fuente con niveles bajos de cAMP mostrando una señal alta y niveles altos de cAMP mostrando una señal baja. La curva de dosis respuesta del mutante de la FSH se muestra en la Figura 2. Los valores EC50 se calcularon y mostraron en el cuadro2. Como se muestra en la Figura 2 y en el cuadro 2, el mutante de la FSH tiene una actividad in vitro comparable a aquella de la FSH de tipo salvaje.

CUADRO 2 EJEMPLO 4 Vida media in vivo de los mutantes de la FSH Se analizaron dos diferentes lotes de mutante D3N en estudios farmacoquineticos separados (PK). Los dos estudios fueron del mismo diseño: 33 ratas hembras inmaduras SD de 21 días de edad (aprox. 40 g de peso corporal; Charles River Laboratories, Wilmington, MA) se las dividió en forma aleatoria en 5 grupos de tratamiento (n=6) y un grupo de línea base (n=3). La elección de las ratas hembras inmaduras se basó en el uso de esta edad y sexo para las valoraciones biológicas in vivo de la actividad de la FSH. Los animales en los grupos de tratamiento recibieron inyecciones subcutáneas (s.c.) de 4 ug de GM1 (control), mutante D3N o 8 µg de Gonal- F rhFSH (control). La sangre se recolectó del seno retro-orbital a las 0 horas del grupo de línea base y a las 1 , 2, 4, 6, 10, 24, 48 y 72 horas de los animales en los grupos de tratamiento (n=3/punto de tiempo; se alternaron las ratas como para que no sean desangradas en 2 puntos de muestreo subsecuentes). Aproximadamente 0.1 mi de la sangre se recolectó de cada rata en cada sangrado y el plasma fue cultivado y almacenado a -80°C hasta que se analizó por ELISA. El ensayo utilizado para medir las proteínas de la FSH en el suero de ambos estudios fue de fuente revestida ELISA de la FSH de DSL (Diagnostics Systems Laboratories, Webster, TX). Se analizaron cada una de las muestras de suero por triplicado. Las vidas medias del mutante D3N fue significativamente más larga que de la FSH tipo salvaje.

EJEMPLO 5 Actividad Biológica in vivo El modelo in vivo usado para valorar la actividad biológica del mutante D3N es el ensayo ovárico del aumento de peso en las ratas. El tratamiento de las ratas hembras inmaduras de 21 días con la FSH o las moléculas con la actividad tipo de la FSH, por ejemplo el mutante D3N, provoca el crecimiento de los folículos y la producción ovárica de los oocitos. Este crecimiento es fácilmente detectado por la medida del peso ovárico a fines del período del tratamiento. En el modelo, la sustancia a ser probada es dada por inyección durante tres días y los ovarios son recolectados y son pesados después de la última dosis. Este ensayo fue usado por varias décadas como la base para asignar la potencia de la FSH a los productos clínicos para propósitos de etiqueta. Mide la acción fisiológica pertinente de la FSH y tiene una correlación clara para el desempeño de los productos en la clínica. La actividad in vivo del mutante D3N fue comparada con aquella de la FSH de tipo salvaje. Todas las dosis fueron definidas basadas en la equivalencia predicha de la FSH, teniendo en cuenta la potencia in vitro y la vida media en las ratas. Se descubrió que el mutante D3N posee actividad de la FSH potente con una magnitud semejante a aquella de la FSH de tipo salvaje.

Claims (17)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un ácido nucleico que codifica una subunidad-a mutante de la FSH en donde la subunidad-a comprende la secuencia de SEC ID No.: 4.

2.- Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1.

3.- El vector de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el vector es un vector de expresión.

4.- El vector de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el vector comprende además un ácido nucleico que codifica la secuencia de SEC ID NO: 3.

5.- Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 2.

6.- La célula huésped de conformidad con la reivindicación 5, caractepzada además porque la célula es una célula de un mamífero.

7.- Una FSH mutante, en donde la subunidad-ß comprende la ID NO: 3, y en donde la subunidad-a comprende una secuencia codificada por el ácido nucleico de la reivindicación 1.

8.- La FSH mutante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque cualquiera de los residuos de 0 a 6 de la asparagina son glicosilados.

9.- La FSH mutante de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la subunidad-a comprende la secuencia de SEC ID NO: 4 y en donde N3 es glicosilada.

10.- Un método para producir un mutante de la FSH que comprende: a) proporcionar una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1 y un segundo ácido nucleico que codifica la SEC ID NO: 3; b) cultivar la célula bajo las condiciones que permiten la expresión de los primeros y segundos ácidos nucleicos.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caractepzado además porque la célula es apta para glicosilar una proteína.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la célula comprende un solo vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1 y un ácido nucleico que codifica la SEC ID NO: 3.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la célula comprende un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1 y comprende además un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica la SEC ID NO: 3.

14.- Una composición farmacéutica que comprende la FSH mutante de la reivindicación 1 y opcionalmente un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

15.- El uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 14, para la fabricación de un medicamento útil para tratar un mamífero infértil.

16.- El uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 14, para la fabricación de un medicamento útil para la estimulación de la folículo-génesis en un mamífero.

17.- El uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 14, para la fabricación de un medicamento útil para inducir la hiper-estimulación ovárica en un mamífero.