MX2008008925A

MX2008008925A - Polipeptidos que tienen actividad de lipasa y polinucleotidos que codifican para los mismos

Info

Publication number: MX2008008925A
Application number: MX/A/2008/008925A
Authority: MX
Inventors: Vind Jesper; Borch Kim; Mikkelsen Mikael; Carsten Franz Knotzel Jurgen
Original assignee: Borch Kim; Mikkelsen Mikael; Novozymes A/S; Novozymes North America Inc; Vind Jesper
Priority date: 2006-01-23
Filing date: 2008-07-10
Publication date: 2008-09-26

Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de lipasa y que además tienen un RP de la menos 0.8 y un BR de menos de 1.1 a las condiciones de prueba dadas en la especificación.

Description

POLIPEPTIDOS QUE TIENEN ACTIVIDAD DE LIPASA Y POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN PARA LOS MISMOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de lipasa y a polinucleótidos que codifican para los mismos.

Antecedentes de la Invención Las lipasas son útiles, por ejemplo, como enzimas detergentes para remover manchas de lipidos o grasas de ropas y otros textiles, como aditivos a la masa para pan y otros productos horneados. De esta manera, una lipasa derivada de Thermomyces lenuginosus (sinónimo Hurnicola lanuginosa, EP 258 068 y EP 305 215) se vende para uso detergente bajo la marca comercial Lipolase" (producto de Novo Nordisk A/S) . La WO 0060063 describe variantes de la lipasa de T. lanuginosus con un desempeño particularmente bueno en el primer lavado en una solución detergente. Las WO 9704079, WO 9707202 y WO 0032758 también describen variantes de la lipasa de T. lanuginosus. La WO 02062973 describe lipasa de T. lanuginosus con una extensión C-terminal con tendencia reducida a formar color.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a polipéptidos REF. : 194442 aislados que tienen actividad de lipasa seleccionados del grupo que consiste de lipasas que tienen un Desempeño Relativo Promedio (RP) de al menos 0.8 y un Beneficio-Riesgo (BR) de al menos 1.1 en las condiciones de prueba dadas en la especificación. La presente invención también se refiere a variantes de lipasa con potencial reducido para generación de olor y a un método para preparar las mismas. Se refiere de manera particular a variantes de la lipasa de Thermomyces lanuginosus que tiene una preferencia para cadenas largas de ácidos grasos en tanto que al mismo tiempo tienen un buen desempeño relativo . En un aspecto adicional, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido, una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido, un vector de expresión recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico y una célula hospedera recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico. La presente invención también se refiere a un método para producir las lipasas de la invención.

Breve Descripción de la Figura La figura 1 muestra el listado de secuencias siguiente: Listado de Secuencias SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de ADN que codifica para la lipasa de Thermomyces lanoginosus . SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de una lipasa de Thermomyces lanoginosus . SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 16 muestra secuencias para alineación en la Figura 1. SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 muestran secuencias usadas para el ejemplo de alineación.

Descripción Detallada de la Invención Definiciones Actividad de lipasa: El término "actividad de lipasa" se define en la presente como una actividad de éster carboxilico-hidrolasas que cataliza la hidrólisis de triacilglicerol bajo la formación de diacilglicerol y un carboxilato. Para los propósitos de la presente invención, la actividad de lipasa se determina de acuerdo al procedimiento descrito en "Actividad de lipasa" en "Materiales y Métodos". Una unidad de actividad de lipasa se define como la cantidad de enzima capaz de liberar 1.0 micro mol de ácido butírico por minuto a 30°C, pH 7. Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos 70 %, tal como al menos 75 % u 80 % u 85 % ó 90 %, de manera más preferente al menos 95 %, de manera aún más preferente 96 % o 97 %, de manear más preferente 98 % o 99 %, y de manera aún más preferente al menos 100 % de la actividad de lipasa medida como desempeño relativo del polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada como el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, con las sustituciones T231R + N233R. Polipéptido aislado: El término polipéptido aislado como se usa en la presente se refiere a un polipéptido que es al menos 20 % puro, de manera preferente al menos 40 % puro, de manera más preferente al menos 60 % puro, de manera aún más preferente al menos 80 % puro, de manera más preferente al menos 90 % puro, y de manera aún más preferente al menos 95 % puro, como se determina por SDS-PAGE. Polipéptido sustancialmente puro: El término "polipéptido sustancialmente puro" denota en la presente una preparación de polipéptido que contiene a lo mucho 10 %, de manera preferente a lo mucho 8 %, de manera más preferente a lo mucho 6 %, de manera más preferente a lo mucho 5 %, de manera más preferente a lo mucho 4 %, a lo mucho 3 %, de manera aún más preferente a lo mucho 2 %, de manera más preferente a lo mucho 1 % y de manera aún más preferente a lo mucho 0.5 % en peso de otro material de polipéptido con el cual esta asociado de manera nativa. Por lo tanto, se prefiere que el polipéptido sustancialmente puro sea al menos 92 % puro, de manera preferente al menos 94 % puro, de manera más preferente al menos 95 % puro, de manera más preferente al menos 96 % puro, de manera más preferente al menos 96 % puro, de manera más preferente al menos 97 % puro, de manera más preferente al menos 98 % puro, de manera aún más preferente al menos 99 %, de manera más preferente al menos 99.5 % puro, y de manera aún más preferente 100 % puro en peso del material de polipéptido total presente en la preparación. Los polipéptidos de la presente invención están preferentemente en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polipéptidos estén en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación de polipéptidos este esencialmente libre de otro material de polipéptido con el cual esta asociado de manera nativa. Esto se puede lograr, por ejemplo, al preparar el polipéptido por medio de métodos recombinantes bien conocidos o por métodos clásicos de purificación. En la presente, el término "polipéptido sustancialmente puro" es sinónimo con los términos "polipéptido aislado" y "polipéptido en forma aislada". Identidad: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad". Para los propósitos de la presente invención, la alineación de dos secuencias de aminoácidos se determina al usar el programa Needle del paquete EMBOSS (http://emboss.org) versión 2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo de alineación global descrito en Needleman, S. B. y Wunsch. C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. La sustitución usada es BLOSUM62, penalidad de abertura de separación es 10 y penalidad de extensión de separación es 0.5. El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos de la presente invención ("Secuencia de la invención"; por ejemplo, aminoácidos 1 a 269 de SEQ ID NO: 2) y una secuencia diferente de aminoácidos ("secuencia extraña") se calcula como el número de correspondencias exactas en una alineación de las dos secuencias, dividido por la longitud de la "secuencia de la invención" o la longitud de la "secuencia extraña", cualquiera que sea la más corta. El resultado se expresa en por ciento de identidad. Se presenta una correspondencia exacta cuando la "secuencia de la invención" y la "secuencia extraña" tienen residuos idénticos de aminoácidos en las mismas posiciones del traslape (en el ejemplo de alineación más adelante que se representa por "I") . La longitud de una secuencia es el número de residuos de aminoácido en la secuencia (por ejemplo en la longitud de SEQ ID NO: 2 es 269) . En el ejemplo de alineación posterior, el traslape es la secuencia de aminoácidos "HTWGER-NL" de la Secuencia A; o la secuencia de aminoácidos "HGWGEDANL" de la Secuencia B. En el ejemplo, una separación se indica por un "-".

Ejemplo de Alineación Secuencia A: ACMSHTWGER-NL I I I I II Secuencia B: HGWGEDANLAMNPS Fragmento de Polipéptido: El término "fragmento de polipéptido" se define en la presente como un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos suprimidos del término amino y/o carboxilo de SEQ ID NO: 2 o una secuencia homologa de la misma, en donde el fragmento tiene actividad de lipasa. Subsecuencia: El término "subsecuencia" se define en la presente como una secuencia de nucleótidos que tiene uno o más nucleótidos suprimidos del extremo 5' y/o 3' de SEQ ID NO: 1 o una secuencia homologa de la misma, en donde la subsecuencia codifica para un fragmento de polipéptido que tiene actividad de lipasa. Variante alélica. El término "variante alélica" denota en la presente cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de manera natural a través de la mutación, y puede dar por resultado polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser imperceptibles (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar para polipéptidos que tienen secuencias alteradas de aminoácidos. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen. Polinucleótido sustancialmente puro: El término "polinucleótido sustancialmente puro" como se usa en la presente se refiere a una preparación de polinucleótido libre de otros nucleótidos extraños o indeseados y en una forma adecuada para el uso con sistemas de producción de proteina, genéticamente manejados. De esta manera, un polinucleótido sustancialmente puro contiene a lo mucho 10 %, de manera preferente a lo mucho 8 %, de manera más preferente a lo mucho 6 %, de manera más preferente a lo mucho 5 %, de manera más preferente a lo mucho 4 %, de manera más preferente a lo mucho 3 %, de manera aún más preferente a lo mucho 2 %, de manera más preferente a lo mucho 1 %, y de manera aún más preferente a lo mucho 0.5 % en peso de otro material de polinucleótido con el cual esta asociado de manera nativa. Sin embargo, un polinucleótido sustancialmente puro puede incluir regiones no traducidas 5' y 3' que se presentan de manera natural, tal como por motores y terminadores. Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro sea al menos 90 % puro, de manera preferente al menos 92 % puro, de manera más preferente al menos 94 % puro, de manera más preferente al menos 95 % puro, de manera más preferente al menos 96 % puro, de manera más preferente al menos 97 % puro, de manera aún más preferente al menos 98 % puro, de manera más preferente al menos 99 % y de manera aún más preferente al menos 99.5 % puro en peso. Los polinucleótidos de la presente invención están preferentemente en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polinucleótidos descritos en la presente estén en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación de polinucleótidos este esencialmente libre de otro material de polinucleótido con el cual estén asociados de manera nativa. En la presente, el término "polinucleótido sustancialmente puro" es sinónimo con los términos "polinucleótido aislado" y "polinucleótido de forma aislada". Los polinucleótidos pueden ser de origen genómico, de ADNc, de ARN, semisintéticos, sintéticos o cualquier combinación de los mismos . ADNc: El término "ADNc" se define en la presente como una molécula de ADN que se puede preparar por transcripción inversa de una molécula madura, empalmada de ARNm obtenida de una célula eucariótica. El ADNc carece de secuencias intrón que usualmente están presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcripto de ARN, primario, inicial es un precursor a ARNm que se procesa a través de una serie de pasos antes de que aparezca como ARNm empalmado, maduro. Estos pasos incluyen la remoción de secuencias intrón por un proceso llamado empalme. El ADNc derivado de ARNm carece, por lo tanto, de cualquier secuencia intrón. Construcción de ácido nucleico: El término "construcción de ácido nucleico" como se usa en la presente se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea de hebra individual o de doble hebra, que se aisla de un gen que se presenta de manera natural o que se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de otro modo no existiría en la naturaleza. El término construcción de ácido nucleico es sinónimo con el término "cásete de expresión" cuando la construcción de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención. Secuencia de control: El término "secuencias de control" se define en la presente para que incluya todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña a la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido. Estas secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, una secuencia guia, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, una secuencia promotora, secuencia de péptido de señal, y secuencia terminadora de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de detención transcripcional y transduccional . Las secuencias de control se pueden proporcionar con ligadores para el propósito de introducir sitios específicos de restricción que facilitan la ligación de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido. Operablemente enlazado: El término "operablemente enlazado" denota en la presente una configuración en la cual se coloca una secuencia de control en una posición apropiada con relación a la secuencia codificante de la secuencia de polinucleótido tal que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante de un polipéptido. Secuencia codificante: Cuando se usa en la presente el término "secuencia codificante" significa una secuencia de nucleótidos, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de subproducto proteico. Los limites de la secuencia codificante se determinan en general por un cuadro de lectura abierto, que usualmente empieza con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tal como GTG y TTG. La secuencia codificante puede ser una secuencia de ADN, de ADNc o de nucleótidos recombinante. Expresión: El término "expresión" incluye cualquier paso comprendido en la producción del polipéptido que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación post-transcripcional, traducción, modificación post-transduccional, y secreción. Vector de expresión: El término "vector de expresión" se define en la presente como una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la invención, y que esta operablemente enlazado a nucleótidos adicionales que proporcionan su expresión. Célula hospedera: El término "célula hospedera", como se usa en la presente incluye cualquier tipo celular que sea susceptible a transformación, transfección, trasducción, y similar con una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la presente invención. Modificación: El término "modificación" significa en la presente cualquier modificación química del polipéptido que consiste del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 asi como manipulación genética del ADN que codifica para ese polipéptido. Las modificaciones pueden ser sustituciones, supresiones y/o inserciones de los aminoácidos asi como reemplazos de cadenas laterales de aminoácidos. Variante artificial: Cuando se usa en la presente, el término "variante artificial" significa un polipéptido que tiene actividad de lipasa producido por un organismo que expresa una secuencia modificada de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. La secuencia modificada de nucleótidos se obtiene a través de intervención humana por modificación de la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 1. Desempeño relativo (RP) : El término desempeño relativo refleja el desempeño de la variante enzimática en comparación a una enzima de referencia cuando se mide como el brillo del color de las muestras textiles lavadas con esa variante enzimática especifica. Factor de beneficio-riesgo (BR) : El factor de Beneficio-Riesgo describe el desempeño de lavado en comparación al riesgo de olor cuando se remueve el sustrato.

Convenciones para Designación de Variantes: Al describir las variantes de lipasa de acuerdo a la invención, se usa la siguiente nomenclatura para facilidad de referencia: Aminoácidos originales: posiciones: aminoácidos sustituidos . De acuerdo a esta nomenclatura, por ejemplo, la sustitución de ácido glutámico por lisina en la posición 195 se muestra como G195E. Una supresión de glicina en la misma posición se muestra como G195*, y la inserción de un residuo de aminoácido adicional tal como lisina se muestra como G195GK. Cuando una lipasa especifica contiene una "supresión" en comparación con otras lipasas y se hace una inserción en esta posición que se indica como *36D para inserción de un ácido aspártico en la posición 36. Se separan múltiples mutaciones por impulsos, es decir, R170Y+G195E, que representan mutaciones en las posiciones 170 y 195 que sustituyen tirosina y ácido glutámico por arginina y glicina, respectivamente. X231 indica el aminoácido en un polipéptido de origen que corresponde a la posición 231, cuando aplica el procedimiento de alineación descrito. X231R indica que el aminoácido se reemplaza con R. Para SEQ ID NO: 2 X es T, y T231R indica de esta manera una sustitución de T en la posición 231 con R. Donde el aminoácido en una posición (por ejemplo 231) se puede sustituir por otro aminoácido seleccionado de un grupo de aminoácidos, por ejemplo, el grupo que consiste de R y P e Y, esto se indicará por X231R/P/Y. En todos los casos, se emplea la abreviación de aminoácido de letra única o de tres letras de la IUPAC, aceptada .

Polipéptidos que Tienen Actividad de Lipasa La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de lipasa seleccionados del grupo que consiste de lipasas que tienen un RP de al menos 0.8 y un BR de al menos 1.1 en las condiciones de prueba dadas en la especificación. En una modalidad preferida, la lipasa tiene un RP de al menos 0.9, tal como 1.0 ó 1.1, en una modalidad aún más preferida la lipasa tiene un RP de al menos 1.2, tal como 1.3, o aún 1.4. En otra modalidad preferida, la lipasa tiene un BR de al menos 1.2, tal como 1.3 o aún 1.4. En una modalidad aún más preferida, la lipasa tiene un BR de al menos 1.5, tal como 1.6 ó 1.7. En un aspecto adicional, la lipasa de la presente invención tiene además una LU/A280 relativa menor de 1, tal como menos de 0.95 en las condiciones de prueba dadas en la especificación. En una modalidad preferida, la LU/A280 relativa es menos de 0.90, tal como menos de 0.85 o aún menos de 0.80. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una secuencia de aminoácidos que está comprendida por o comprende SEQ ID NO: 2, o una variante alélica de la misma, y que además tiene un BR de al menos 1.1 y un RP de al menos 0.8. En otro aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una secuencia de aminoácidos que esta comprendida o comprende la parte madura de SEQ ID NO: 2, o una variante alélica de la misma, y que tiene además un BR de al menos 1.1 y un RP de al menos 0.8. En un aspecto aún adicional, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (es decir, el polipéptido maduro) de al menos 80 % tal como al menos 85 % o 90 % o al menos 95 % de manera preferente al menos 97 %, de manera más preferente al menos 98 %, de manera aún más preferente al menos 99 %, que tiene actividad de lipasa (más adelante "polipéptidos homólogos") . En un aspecto preferido, los polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos que difiere por diez aminoácidos, por nueve aminoácidos, por ocho aminoácidos, por siete aminoácidos, por seis aminoácidos, de manera preferente por cinco aminoácidos, de manera más preferente por cuatro aminoácidos, de manera aún más preferente por tres aminoácidos, de manera más preferente por dos aminoácidos, y de manera aún más preferente por un aminoácido del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de lipasa que se codifican por polipéptidos que hibridizan bajo condiciones de muy baja severidad, de manera preferente condiciones de baja severidad, de manera más preferente condiciones de severidad media, de manera más preferente condiciones de severidad media-alta, de manera aún más preferente condiciones de alta severidad, y de manera mucho más preferente condiciones de muy alta severidad con (i) nucleótidos 644 a 732 de SEQ ID NO: 1 (ii) la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 644 a 732 de SEQ ID NO: 1, (iii) una subsecuencia de (i) ó (ii) ó (iv) una hebra complementaria de (i), (ii), ó (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch y T Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Labora tory Manual , 2d edition, Cold Spring Harbor, New Yorg) . Una subsecuencia de SEQ ID NO: 1 contiene al menos 100 nucleótidos contiguos o de manera preferente al menos 200 nucleótidos contiguos. Además, la subsecuencia puede codificar para un fragmento de polipéptido que tiene actividad de lipasa. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una subsecuencia de la misma, asi como la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma, se puede usar para diseñar una sonda de ácido nucleico para identificar y clonar ADN que codifique para polipéptidos que tienen actividad de lipasa de cepas de diferentes géneros o especies de acuerdo a métodos bien conocidos en la técnica. En particular, estas sondas se pueden usar para hibridación con el ADN genómico o ADNc del género o especie de interés, después de procedimientos normales de transferencia Southern, a fin de identificar y aislar el gen correspondiente en el mismo. Estas sondas pueden ser considerablemente más cortas de la secuencia completa, pero deben ser al menos 14, de manera preferente al menos 25, de manera más preferente al menos 35, y de manera más preferente al menos 70 nucleótidos de longitud. Sin embargo, se prefiere que la sonda de ácido nucleico sea de al menos 100 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico puede ser de al menos 200 nucleótidos, de manera preferente de al menos 300 nucleótidos, de manera más preferente de al menos 400 nucleótidos, de manera más preferente de al menos 500 nucleótidos de longitud. Se pueden usar sondas aún más largas, por ejemplo, sondas de ácido nucleico que son de al menos 600 nucleótidos, de manera al menos preferente de al menos 700 nucleótidos, de manera más preferente de al menos 800 nucleótidos de longitud. Se pueden usar sondas de tanto ADN como ARN. Las sondas se marcan típicamente para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina) . Estas sondas se abarcan por la presente invención. Una biblioteca de ADN genómico o ADNc preparada de estos organismos diferentes por lo tanto se puede detectar por el ADN que hibridiza con las sondas descritas anteriormente y que codifica para un polipéptido que tiene actividad de lipasa. El ADN genómico u otro de estos otros organismos se puede separar por electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, u otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas del ADN separado se puede transferir a e inmovilizar en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. A fin de identificar un clon o ADN que es homólogo con SEQ ID NO: 1 o una subsecuencia de la misma, el material portador se usa en un Southern Blot. Para los propósitos de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de nucleótidos hibridiza a una sonda marcada de ácido nucleico que corresponde a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, su hebra complementaria, o una subsecuencia de la misma, bajo condiciones de severidad muy baja o muy alta. Las moléculas a las cuales hibridiza la sonda de ácido nucleico bajo estas condiciones se puede detectar usando película de rayos X. En aún un aspecto adicional, la presente invención se refiere a variantes artificiales que comprenden una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de la misma, estas variantes que tienen un BR de al menos 1.1 y un RP de al menos 0.8. De manera preferente, los cambios de aminoácido son de una naturaleza menor, es decir sustituciones o inserciones conservadoras de aminoácidos que no afectan de manera significativa el plegado y/o la actividad de la proteina; pequeñas supresiones, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos. Pequeñas extensiones amino- o carboxi-terminales, tal como un residuo de metionina amino-terminal; o un pequeño péptido ligador de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función, tal como un tracto de poli-histidina, un epitopo antigénico o un dominio de unión. Los ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) aminoácidos hidrófobos (leuciona, isoleucina y valina) , aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano y tirosina), y aminoácidos pequeños (lisina, alanina, serina, trionina y metionina) . Las sustituciones de aminoácidos que no alteran en general la actividad especifica se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, In , The Proteins, Academic Press, New York. Los intercambios que se presentan más comúnmente son Ala/Ser, Val/lie, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lie, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly. Además de los 20 aminoácidos normales, se pueden sustituir aminoácidos no normales (tal como 4-hidroxipropila, 6-N-metil-lisina, ácido 2-aminoisobutirico, isovalina y alfa-metil-serina) por residuos de aminoácidos de un polipéptido tipo silvestre. Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no se codifican por el código genético, y aminoácidos no naturales se pueden sustituir por residuos de aminoácido. Los "aminoácidos no naturales" se han modificado después de la síntesis de proteina, y/o tienen una estructura química en sus cadenas laterales diferente de aquella de los aminoácidos normales. Se pueden sintetizar de manera química aminoácidos no naturales, y de manera preferente, están comercialmente disponibles, e incluyen ácido pipecólico, ácido tiazolidina-carboxilico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, y 3, 3-dimetilprolina . De manera alternativa, los cambios de aminoácidos son de una naturaleza tal que se alteren las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos. Por ejemplo, los cambios de aminoácidos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad del sustrato, cambiar el pH óptimo y similar. Los aminoácidos esenciales en el polipéptido de origen se pueden identificar de acuerdo a procedimientos conocidos en la técnica, tal como a mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones individuales de alanina en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se prueban para actividad biológica (es decir, actividad de lipasa) para identificar residuos de aminoácido que son críticos a la actividad de la molécula. Ver también, Hilton et al . , 1996, J. Biol . Chem . 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar por análisis físico de la estructura, como se determina por técnicas tal como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica, o marcación por fotoafinidad, en unión con la mutación de aminoácidos de sitio de contacto putativo. Ver, por ejemplo, de Vos et al . , 1992, Science 255: 306-312: Smith et al . , 1992, J. Mol . Biol . 224; 899-904; Wlodaver et al . , 1992, FEBS Lett . 309:59-64. Las identidades de los aminoácidos esenciales también se puede inferir de análisis de identidades con polipéptidos que se relacionan a un polipéptido de acuerdo a la invención. Se pueden hacer y probar sustituciones individuales o múltiples de aminoácidos usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o transposición, seguido por un procedimiento pertinente de detección, tal como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc . Na ti Acad. Sci . USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden usar incluyen PCR propensa a error, visualización en fagos (por ejemplo Lowman et al . , 1991, Biochem . 30:10832-10837; Patente de los Estados Unidos No. 5,223,409; WO 92/06204), y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al . , 1986, Gene 46: 145; Ner et al . , 1988, DNA 7:127). Los métodos de mutagénesis/transposición se pueden combinar con métodos de detección, automatizados, de alto rendimiento para detectar actividad de polipéptidos mutagenizados, clonados expresados por células hospederas. (Moléculas de ADN mutagenizadas que codifican para polipéptidos activos se pueden recuperar de células hospederas y secuenciar rápidamente usando métodos normales en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida. El número total de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 291 de SEQ ID NO: 2 es 10, de manera preferente 9, de manera más preferente 8, de manera más preferente 7, de manera más preferente a lo mucho 6, de manera más preferente a lo mucho 5, de manera más preferente 4, de manera aún más preferente 3, de manera mucho más preferente 2, y de manera mucho más preferente 1.

Identificación de Regiones y Sustituciones Las sustituciones cubiertas por la presente solicitud se pueden identificar como descritas en estas secciones. Las posiciones referidas en la Región I hasta Región IV posteriores son las posiciones de los residuos de aminoácido en SEQ ID NO. 2. Para encontrar las posiciones correspondientes (u homologas) en un lipasa diferente, se usa el procedimiento descrito en "Homología y alineación" Sustituciones en Región I La Región I consiste de residuos de aminoácido que se circundan el residuo El N-terminal. En esta región, se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa de origen con un aminoácido más positivo. Los residuos de aminoácido que corresponden a las siguientes posiciones están comprendidos por la Región I: 2 a 11 y 223-239. Las siguientes posiciones son de interés particular: 4, 8, 11, 223, 229, 231, 233, 234, 236. En particular, se han identificado las siguientes sustituciones: X4V, X231 y X233R. En una modalidad preferida, la lipasa variante tiene al menos 80 %, tal como 85 % ó 90 %, tal como al menos 95 % ó 98 % ó 99 % de identidad a SEQ ID No. 2.

Sustituciones en Región II La Región II consiste de residuos de aminoácido en contacto con el sustrato en un lado de la cadena de asilo y un lado de la parte de alcohol. En esta región, se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa de origen con un aminoácido más positivo o con un aminoácido menos hidrófobo. Los residuos de aminoácido que corresponden a las siguientes posiciones están comprendidos por la Región II: de 202 a 211 y de 249 a 269. Son de interés particular las siguientes posiciones: 202, 210, 211, 253, 254, 255, 255 256. En particular, se han identificado las siguientes sustituciones: X202G, X255Y/V y X256K/R. En una modalidad preferida, la lipasa variante tiene al menos 80 %, tal como 85 % ó 90%, tal como al menos 95 % ó 98 % ó 99 % de identidad a SEQ ID No. 2.

Sustituciones en Región III La Región III consiste de residuos de aminoácido que forman una estructura flexible de esta manera permiten que el sustrato entre en el sitio activo. En esta región, se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa de origen con un aminoácido más positivo o un aminoácido menos hidrófobo. Los residuos de aminoácido que corresponden a las siguientes posiciones están comprendidos por la Región III: de 82 a 102. Son de interés particular las siguientes posiciones: 86, 87, 90, 91, 95, 96, 99. En particular, se ha identificados las siguientes sustituciones: X86V y X90A/R. En una modalidad preferida, la lipasa variante tiene al menos 80 %, tal como 85 % ó 90 % tal como al menos 95 % ó 98 % ó 99 % de identidad a SEQ ID No. 2.

Sustituciones en Región IV La Región IV consiste de residuos de aminoácido que se unen de manera electrostática a una superficie. En esta región, se prefiere sustituir un aminoácido de la lipasa de origen con un aminoácido más positivo. Los residuos de aminoácido que corresponden a las siguientes posiciones están comprendidos por la Región IV: 27 y 54 a 62. Las siguientes posiciones son de interés particular: 27, 56, 57, 58, 60. En particular, se han identificado las siguientes sustituciones: X27R, X58N/AG/T/P y X60V/S/G/N/R/K/A/L. En una modalidad preferida, la lipasa variante tiene al menos 80 %, tal como 85 % ó 90 %, tal como al menos 95 % ó 98 % ó 99% de identidad SEQ ID No. 2.

Aminoácidos en Otras Posiciones. La lipasa de origen puede comprender opcionalmente sustitución de otros aminoácidos, particularmente menos de 10 o menos de 5 de estas sustituciones. Los ejemplos son sustituciones que corresponden a una o más de las posiciones 24, 46, 74, 81, 83, 127, 131, 137, 147, 150, 203, 206, 211, 263, 264, 265, 267, y269 de SEQ ID No. 2. En una modalidad particular, hay una sustitución en al menos una de las posiciones que corresponden a la posición 81, 147, 150, 227 y 249. En una modalidad preferida, por lo menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste de X81Q/E, X147M/Y, X150G, X227G y X249R/I/L. Las sustituciones adicionales se pueden hacer, por ejemplo, de acuerdo a los principios conocidos en la técnica por ejemplo sustituciones descritas en WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202.

Homología y Alineación Para los propósitos de la presente invención, el grado de homología se puede determinar de manera adecuada por medio de programas de computadora conocidos en la técnica, tal como GAP proporcionado en paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, Agosto 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45), usando GAP con los siguientes ajustes para comparación de secuencia de polipéptidos. Penalidad de creación de GAP de 3.0 y penalidad de extensión de GAP de 0.1. En la presente invención, las posiciones correspondientes (u homologas) en la secuencia de lipasa de Absidia reflexa , Absidia corymbefera , Rhizmucor miehei , Rhizopus de lema r , Aspergillus niger, Aspergillus Fusarium oxysporum, Fusarium heterosporum, Aspergillus oryzea , Penicilium camembertii , Aspergillus foetidus , Aspergillus niger, Thermomyces lanoginosus (sinónimo : Hurnicola lanuginose) y Landerina penisapora se definen por la alineación mostrada en la Figura 1. Para encontrar las posiciones homologas en las secuencias de lipasa no mostradas en la alineación, la secuencia de interés se alinea a las secuencias mostradas en la Figura 1. La nueva secuencia se alinea a la presente alineación en la Figura 1 al usar la alineación de GAP a la secuencia más homologa encontrada por el programa GAP. Se proporciona GAP en el paquete de programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, Agosto 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, D.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45). Se usan los siguientes ajustes para comparación de secuencias de polipéptidos: penalidad de creación de GAP de 3.0 y penalidad de extensión de GAP de 0.1. Se puede usar cualquier lipasa de origen adecuado.

En una modalidad preferida, la lipasa de origen tiene una homología de al menos 50 % con la lipasa de T. lanuginosus (SEQ ID No. 2), particularmente al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 75 %, al menos 85 %, al menos 90 %, más de 95 %, 96 %, 97 % ó más de 98 % ó 99 %. En una modalidad particular, la lipasa de origen es idéntica a la lipasa de T. lanuginosus (SEQ ID No. 2) .

Fuentes de Polipéptidos que Tienen Actividad de Lipasa. Un polipéptido de la presente invención se puede obtener de microorganismos de cualquier género. Para propósitos de la presente invención, el término "obtenido de" como se usa en la presente unión con una fuente dada debe significar que el polipéptido codificado por una secuencia en nucleótidos se produce por la fuente o por una sepa en la cual se ha insertado la secuencia de nucleótidos de la fuente. En un aspecto preferido, el polipéptido obtenido de una fuente dada se segrega de manera extracelular. Un polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido de bacteria gran-positivas tal como un polipéptido de Ba cillus, por ejemplo, un polipéptido de Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans , Bacillus coagulans , Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus lichenformis , Bacillus mega terium, Bacillus stearothermophilus , Bacillus subtilis , o un polipéptido de Ba cillus thuringiensis; o un polipéptido de Streptomyces, por ejemplo, un polipéptido de Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; o un polipéptido de bacteria gram-negativas, por ejemplo, un polipéptido E. coli o Pseudomonas sp. Un polipéptido de la presente invención también puede ser un polipéptido fúngico, y de manera más preferente un polipéptido de levadura tal como un polipéptido de Candida , Kluyveromyces , Pichia , Saccharomyces , Schizosaccharomyces , o Yarrowia ; o de manera más preferente un polipéptido de hongos filamentosos tal como un polipéptido de Acremonium, Aspergillus , Aureobasidium, Cryptococcus , Filobasidium, Fusarium, Humicola , Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora , Neocallimastix, Neurospora , Paecilomyces , Penicillium, Piromyces , Schizophyllum, Talaromyces , Thermoascus , Thielavia , Tolypocladium o Trichoderma. En un aspecto preferido, el polipéptido es un polipéptido de Saccharomyces carisbergensis , Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces diastaticus , Saccharomyces douglasíi , Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis que tiene actividad de lipasa. En otro aspecto preferido, el polipéptido es un polipéptido de Aspergíllus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus , Aspergillus japonicus , Aspergillus nidulans , Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis , Fusarium bactridioídes , Fusarium cerealís , Fusarium crookwellense , Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides , Fusarium venenatum, Humicola insolens , Thermomyces lanoginosus, (sinónimo: Humicola lanuginose) , Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma vi r ide. En otro aspecto preferido, el polipéptido es un polipéptido de Thermomyces . En un aspecto más preferido, el polipéptido es un polipéptido de Thermomyces lanuginosus, por ejemplo, el polipéptido de SEQ ID No. 2 con mutaciones como se describe en la presente solicitud. Se entenderá que para las especies mencionadas anteriormente, la invención abarca tanto los estados perfectos como imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anaformas, a pesar del nombre de especie con el cual se conozcan. Aquéllos expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados. Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles al público en varias colecciones de cultivo, tal como American Type Culture Collection (ATCC) , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Cetraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) , y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) . Adicionalmente, estos polipéptido se pueden identificar y obtener de otras fuentes que incluyen organismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, suelo, composta, agua, etc.) usando las sondas mencionadas anteriormente. También conocidas las técnicas para aislar microorganismos de habitat naturales. El polinucleótido entonces se puede obtener al detectar de manera similar una biblioteca de ADN genómico o ADNc de otro microorganismo. Una vez que se ha detectado con las sondas una secuencia de polinucleótidos que codifique para un polipéptido, el polinucleótido se puede aislar o clonar al utilizar técnicas que son bien conocidas por aquéllos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al . , 1989, supra ) . Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de función escindióle en los cuales se fusiona otro polipéptido en el N-término o el C-término del polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado se produce al fusionar una secuencia de nucleótidos (o una porción de la misma) que codifica para otro polipéptido a una secuencia de nucleótidos (o una porción de la misma) de la presente invención. Se conocen las técnicas para producir polipéptidos de fusión, e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican para los polipéptidos de modo que estén en cuadro y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo el control de los mismos promotores y terminadores .

Polinucleótidos La presente 'invención también se refiere a polinucleótidos aislados que tiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de la presente invención. La presente invención también abarca secuencias de nucleótidos que codifican para un polipéptido que es una variante de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2 o el polipéptido maduro de la misma, que difieren del polinucleótido codificante por virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se refiere a subsecuencias de SEQ ID No. 1 que codifican para fragmentos de SEQ ID No. 2 que tienen actividad de lipasa, estos fragmentos que tienen un BR de al menos 1.1 y un RP de al menos 0.8. Las técnicas usadas para aislar o clonar un polinucleótido que codifica para un polipéptido se conocen en la técnica e incluyen aislamiento del ADN genómico, preparación de ADNc o una combinación de las mismas. La clonación de los polinucleótidos de la presente invención de este ADN genómico se puede efectuar, por ejemplo, al usar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), bien conocida, o detección de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Ver, por ejemplo Innis et al . , 1990, PCR : A Guide to Methods and Applica tion , Academia Press, New York. Se pueden usar otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico tal como la reacción en cadena de la lipasa (LCR) , la trascripción activada por ligasa (LAT) y la amplificación basada en secuencia de nucleótidos (NASBA) . Los polinucleótidos se pueden clonar de una sepa de Thermomyces, u otro organismo relacionado, y de esta manera, por ejemplo, puede ser una variante alélica o de especie de la región codificante del polipéptido de la secuencia de nucleótidos. La presente invención también se refiere a polinucleótidos que tienen secuencias de nucleótidos que tienen un grado de identidad a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID No. 1 de al menos 60 %, de manera preferente al menos 65 %, de manera más preferente al menos 70 %, de manera más preferente al menos 75 %, de manera más preferente al menos 80 %, de manera más preferente al menos 85 %, de manera más preferente al menos 90 %, de manera aún más preferente al menos 95 %, y de manera muy preferente al menos 97 %, 98 % ó 99 % de identidad, que codifican para el polipéptido activo que tiene actividad de lipasa y un BR de al menos 1.1 y un RP de al menos 0.8. La modificación de una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas que no se presentan de manera natural el polipéptido. Estos polipéptidos puede diferir de alguna manera manejada del polipéptido aislado de su fuente inactiva, por ejemplo, variantes artificiales que difieren en actividad especifica, termoestabilidad, pH óptimo, o similar. La secuencia variante se puede construir en base a la secuencia de nucleótidos presentada como la región codificante del polipéptido de SEQ ID No. 1, por ejemplo, una subsecuencia de la misma, y/o por introducción de sustituciones de nucleótidos que no dan otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos, pero que corresponden al uso de codones del organismo hospedero propuesto para la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una diferente secuencia de aminoácidos. Para una descripción general de la sustitución de nucleótido, ver, por ejemplo, Ford et al . , 1991, Protein Expression y Purifica tion 2: 95-107. Será evidente para aquéllos expertos en la técnica que estas sustituciones se pueden hacer fuera de las regiones criticas a la función de la molécula y aún dar por resultado un polipéptido activo. Los residuos de aminoácidos esenciales a la actividad del polipéptido codificado por un polinucleótido aislado de la invención, por lo tanto no sometidos preferentemente a sustitución, se pueden identificar de acuerdo a procedimientos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de exploración de alanita (ver, por ejemplo, Cunningham y Wells, 1989. Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, las mutaciones introducen en cada residuo positivamente cargado en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se prueban para la actividad de lipasa para identificar residuos de aminoácido que son críticos a la actividad de la molécula. Los sitios de interacción sustrato-enzima también se pueden determinar por análisis de la estructura tridimensional como se determina por técnicas tal como análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcación por fotoafinidad (ver, por ejemplo, de Vos et al . , 1992, Science 255; 306-312; Smith et al . , 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al . , 1992, FEBS Let ters 309: 59-64). La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican para un polipéptido de la presente invención, que hibridizan bajo condiciones de muy baja severidad, de manera preferente condiciones de baja severidad, de manera más preferente condiciones de severidad media, de manera más preferente condiciones severidad media-alta, de manera aún más preferente condiciones de alta severidad, y de manera mucho más preferente condiciones de muy alta severidad con (i) de SEQ ID No. 1, (ii) la secuencia de ADNc contenida en SEQ ID No. 1, o (iii) una hebra complementaria de (i) o (ii); o variantes alélicas y subsecuencias de la misma (Sambrook et al . , 1989, supra ) como se definen en la presente. La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados obtenidos al (a) hibridizar una población de ADN bajo condiciones de severidad muy baja, baja, media, media-alta, alta, muy alta con (i) los nucleótidos de SEQ ID No. 1; (ii) la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos de SEQ ID No. 1 o (iii) una hebra complementaria de (i) o (ii) ; y (b) aislar el polinucleótido hibridizante, que codifica para un polipéptido que tiene actividad de lipasa.

Construcciones de Ácido Nucleico La presente invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido aislado de la presente invención operablemente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedera adecuada bajo condiciones compatibles con la secuencia de control . Un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido de la presente invención se puede manipular en una variedad de maneras para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Son bien conocidas las técnicas para modificar las secuencias de polinucleótido utilizando métodos de ADN recombinante. La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de nucleótidos que se reconoce por una célula hospedera para la expresión de un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente invención. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcional que media la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestra actividad transcripcional en la célula hospedero de elección incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y se puede obtener de genes que codifiquen para polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sea homólogos o heterólogos a la célula hospedera. Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la trascripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención, especialmente una célula hospedera bacteriana, son los promotores obtenidos del operón lac célula de E . coli , el gen de agarasa ( dagA) de Streptomyces coelicolor, el gen de levansucrasa ( sa cB) de Ba cill us subtilis, el gen de alfa-amilasa ( amyL) de Ba cillus licheniformis, el gen de amilasa ( amyM) de Bacill us stearothermophilus, el gen de alfa-amilasa ( amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, el gen de penicilasa (penP) de Bacill us licheniformis , los genes xylA y xylB de Bacill us subtilis , y el gen de beta-lactamasa procariótico (Villa-Kamaroff et al . , 1978, Proceedings of the Na tional Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al . , 1983, Proceedings of the Na tional Academy of Sciences USA 80: 21-25). Describen promotores adicionales en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scien tific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et al . , 1989, supra . Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la trascripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedera fúngica filamentosas son promotores obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhi zomucor miehei , alfa-amilasa neutral de Aspergill us niger, alfa-amilasa estables ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa ( glaA) de Aspergíll us niger o Aspergillus awamori , lipasa de Rhizomucor miehei , proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa-fosfato-isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans , amiloglucosidasa de Fusari um venena tum (WO 00/56900), Daria de Fusari um venena tum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venena tum (WO 00/56900), proteasa tipo tripsina de Fusarium ixysporum (WO 96/00787), beta-glucosidasa de Trichoderma reesei , celobiohidralasa I de Trichoderma reeseí , enduglucanasa I de Trichoderma reesei , endoglucanasa II de Trichoderma reesei , endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei , endoglucanasa V de Trichoderma reesei , xilanasa I de Trichoderma reesei , xilanasa I de Trichoderma reesei , beta-xilosidasa de Tri choderma reesei , así como el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para alfa-milasa neutral de Aspergillus niger y triosa-fosfato-isomerasa de Aspergillus oryzae) ; y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos . En un hospedero de levadura, se obtienen promotores útiles de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae ' (ENO-1), galactosinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1) , alcohol-deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa de Sa ccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP) , triosa-fosfato- isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotionina (CUP1) de Sa ccharomyces cerevisiae, y ter-fosfoglicerato- sinasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros promotores útiles para las células de levadura se describen por Romanos et al . , 1992, Yeast 8: 423-488. La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de trascripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula hospedera para terminar la trascripción. La secuencia terminadora está enlazada de manera operable al término 3' de la secuencia en nucleótidos que codifica para el polipéptido. Se puede usar, en la presente invención, cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedera de elección. Los terminadores preferidos para células hospedero fongoideas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA- amilasa de Aspergill us oryzae, glucoamilasa de Aspergill us niger, antranilato-sintasa de Aspergillus nidulans, alfa- glucosidad de Aspergill us niger, proteasa tipo trisina de Fusari um oxysporum . Los terminadores preferidos para células hospederas de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Sa ccharomyces cerevisiae, y gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa de Saccharomuces cerevisiae . Otros terminadores útiles para células hospederas de levadura se describen por Romanos et al . , 1992, supra . La secuencia de control también puede ser una secuencia guía adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para traducción por las células hospederas. La secuencia guía está enlazada de manera operable al término 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido. En la presente invención se puede usar cualquier secuencia guía que sea funcional en la célula hospedera de elección . Las guías preferidas para células hospederas fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA-amilasa de Aspergill us oryzae y triosa-fosfato-isomerasa de Aspergill us nidulans . Las guías adecuadas para células hospederas de levadura se obtienen de los genes para enolasa (ENO-1) de Sa ccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato-sinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Sa ccharomyces cerevisiae y alcohol-deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato- deshidrogenasa de Sa ccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP) . La secuencia de control también ser la secuencia de poliadenilación, una secuencia operablemente enlazada al término 3' de la secuencia en nucleótidos y que cuando se trascribe, se reconoce por la célula hospedera como una señal para adicionar residuos de poliadenosina al ARNm. En la presente invención se puede usar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedera de elección. Las secuencias, de poliadenilación preferidas para células hospederas fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA-amilasa de Aspergill us oryzae, glucoamilasa de Aspergill us niger, antranilato-sintasa de Aspergill us nidulans, proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum, y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger. Las secuencias de poliadenilación útiles para células hospederas de levadura se describen por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cell ular Biology 15: 5983-5990. La secuencia de control también puede ser una' región codificante de péptido de señal que codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada al término amino de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado en la ruta secretoria de la célula. El esquema 5' de la secuencia codificante de la secuencia en nucleótidos puede contener inherentemente una región codificante de péptido de señal enlazada de manera natural en el cuadro de lectura de traducción con el segmento de la región codificante que codifica para el polipéptido segregado. De manera alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante de péptido de señal que es extraña a la secuencia codificante. La región codificante de péptido de señal, extraña, se puede requerir donde la secuencia no contenga de manera natural una región codificante de péptido de señal. De manera alternativa, la región codificante de péptido de señal extraña puede reemplazar simplemente la región codificante de péptido de señal, natural a fin de mejorar la secreción del polipéptido. Sin embargo, cualquier región codificante de péptido de señal que dirija al polipéptido expresado en la ruta secretoria de una célula hospedera de elección se puede usar en la presente invención. Las regiones codificantes de péptido de señal, efectivas, para células hospederas bacterianas son las regiones codificantes de péptido de señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica NCIB 11837 de Bacill us, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophil us, subtilisina de Ba cillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, proteasas neutrales ( nprT, nprS, nprM) de Bacill us stearothermophil us, y prsA de Bacill us subtilis . Se describen péptidos de señal adicionales por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviewa 57: 109-137.

Las regiones codificantes de péptido de señal efectivas para células hospederas fúngicas filamentosas son las regiones codificantes de péptido de señal obtenidas de los genes para TAKA-amilasa de Aspergi llus oryzae, amilasa neutral de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergill us niger, proteínas aspártica de Rhizomucor miehei , celulasa de Humicola insolens, y lipasa de Humicola lanuginosa . Los péptidos de señal útiles para células hospederas de levadura se obtienen de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones codificantes de péptidos de señal útiles se describen por Romanos et al . , 1992, supra . La secuencia de control también puede ser una región codificante de propéptido que codifique para una secuencia de aminoácidos colocada en el término amino de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una pro-enzima o pro-polipéptido (o un zimógeno en algunos casos) . En general, un pro-polipéptido inactivo se puede convertir a un polipéptido activo maduro por escisión catalítica o autocatalítica del pro-péptido del pro-polipéptido. La región codificante de propéptido se puede obtener de los genes para proteasa alcalina ( aprE) de Bacill us subtilis, proteasa neutral ( nprT) de Ba cillus subtilis, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) .

Donde están presentes regiones tanto de péptido como de propéptido de señal en el término amino de un polipéptido, la región de propéptido está colocada al término amino de un polipéptido y la región de péptido está colocada cerca del término amino de la región de propéptido. También puede ser deseable adicionar secuencias reguladoras para permitir la regulación de la expresión del polipéptido con relación al crecimiento de la célula hospedera. Los ejemplos de sistemas reguladores son aquéllos que provocan que se active o desactive la expresión del gen en respuesta a un estímulo químico o físico incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas de los operadores lac, tac, y trp. En levadura, se puede usar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, el promotor de TAKA-alfa-amilasa, el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, y el promotor de glucoamilasa de Aspergill us oryzae se pueden usar como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquéllos que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos, estos incluyen el gen de hidrofoliato-reductasa que se amplifica en la presencia de metrotexato, y los genes de metalotioneina que se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia en nucleótidos que codifica para el polipéptido se enlazará de manera operable con la secuencia reguladora .

Vectores de Expresión La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor, y señales de detención trascripcional y transduccional . Los varios ácidos nucleicos y secuencias de control descritas anteriormente se pueden unir de manera conjunta para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios convenientes de restricción para permitir la inserción o sustitución de la secuencia en nucleótidos que codifica para el polipéptido en estos sitios. De manera alternativa, se puede expresar una secuencia en nucleótidos de la presente invención al insertar la secuencia de nucleótidos a una construcción de ácido nucleico que comprenda la secuencia en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante está localizada en el vector de modo que la secuencia codificante se enlaza de manera operable con las secuencias de control apropiadas para la expresión. El vector de expresión , recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plasmido o virus) que se pueda someter de manera conveniente a procedimientos de ADN recombinantes y se de lugar a la expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula hospedera en la cual se va a introducir el vector. Los vectores pueden ser plasmados circulares lineales o cerrados. El vector puede ser un vector que se replica de manera autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la auto-replicación. De manera alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedera, se integra en el genoma y se replica conjuntamente con los cromosomas en las cuales se ha integrado. Además, se puede usar un vector o plásmido individual o dos o más vectores o plásmidos que conjuntamente contienen el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula hospedera. Los vectores de la presente invención contienen de manera preferente uno o más marcadores seleccionables que permiten la fácil selección de las células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen, el producto del cual proporciona resistencia viral o biocida, resistencia a metales pesados, o prototropía a auxótrofos, y similares. Un gen condicionalmente esencial para funcionar como un marcador seleccionable no de antibiótico. Los ejemplos no limitantes de marcadores seleccionables no de antibióticos condicionalmente esenciales, bacterianos son los genes de dal de Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis, u otros Bacilli, que sólo son esenciales cuando la bacteria se cultiva en ausencia de D-alanina. También, los genes que codifican para enzimas comprendidas en la producción de UDP-galactosa pueden funcionar como marcadores condicionalmente esenciales en una célula cuando la célula se cultiva en la presencia de galactosa o se cultiva en un medio que da lugar a la presencia de galactosa. Los ejemplos no limitantes de estos genes son aquéllos de B . subtilis o B . licheniformis que codifican para fosforilasa dependiente de UTP (EC 2.7.7.10), uridililtransferasa dependiente de UDP-glucosa (EC 2.7.7.12), o UDP-galactosa-epimerasa (EC 5.1.3.2). También se puede usar un gen de xilosa-isomerasa tal como xylA, de Bacilli como marcadores seleccionables en células cultivadas en medio mínimo con xilosa como única fuente de carbono. Los genes necesarios para utilizar gluconato, gn tK y gntP también se pueden usar como marcadores seleccionables en células cultivadas en medio mínimo con gluconato como la única fuente de carbono. Se conocen en la técnica otros ejemplos de genes condicionalmente esenciales. Los marcadores seleccionables de antibiótico confieren resistencia a los antibióticos tal como ampicilina, kanamicina, cloramfenicol, eritromicina, tetracilicina, neomicina, hidromicina o metotrexato. Los marcadores adecuados para células hospederas de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Los marcadores seleccionables para el uso en una célula hospedera fúngica filamentosa incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidazas) , argB (ornitina-carbamoiltrasferasa) , bar ( fosfinotricin-acetiltransferasa) , hph (higromicina-fosfotransferasa) , niaD (nitrato-reducatasa) , pyrG (oritidina-5' -fosfato-descarboxilasa) , sC (sulfato-adeniltransferasa) , y trpC (antranilato-sintasa) , así como equivalentes de los mismos. Preferidos para el uso en una célula de Aspergillus son los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus . Los vectores de la presente invención contienen de manera preferente un elemento que permite la integración del vector en el genoma de la célula hospedera para replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma. Para la integración en el genoma en la célula hospedera, el vector puede depender de la secuencia de polinucleótido que codifica para el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma por recombinación homologa o no homologa. De manera alternativa, el vector puede contener secuencias adicionales de nucleótidos para dirigir la integración por recombinación homologa en el genoma de la célula hospedera en un sitio preciso en el cromosoma. Para incrementar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deben contener de manera preferente un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10,000 pares de base, de manera preferente 400 a 10,000 pares de base, y de manera más preferente 800 a 10,000 pares de base, que tienen un alto grado de identidad con la secuencia objetivo correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con la secuencia objetivo en el genoma de la célula hospedera. Además, los elementos de integración pueden ser secuencias de nucleótidos codificantes o no codificantes. Por otra parte, el vector' se puede integrar en el genoma de la célula hospedera por recombinación homologa. Para replicación autónoma, el vector puede comprenden además un origen de replicación que permita que el vector se replique de manera autónoma en la célula hospedera en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que medie la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" se define en la presente como una secuencia de nucleótidos que permite que un plásmido de vector se replique in vivo . Los ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E . coli , y pUBllO, pE194, pTA1060, y pAMßl, que permiten la replicación en Bacillus . Los ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula hospedera de levadura son el origen de 2 micrones de replicación ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación ARS4 y CEN6. Los ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMAl y ANSÍ (Gems et al . , 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al . , 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). Se puede elaborar el aislamiento del gen AMAl y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen de acuerdo a los métodos descritos en WO 00/24883. Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en la célula hospedera para incrementar la producción del producto génico. Un incremento en el número de copia del polipéptido se puede obtener al integrar al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedera o al incluir un gen marcador seleccionable amplificable con el polipéptido donde se puedan seleccionar células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y de este modo copias adicionales del polipéptido, por cultivo de las células en la presencia del gen seleccionable apropiados. Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinante de la presente invención son bien conocidos por aquéllos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al . , 1989, supra ) .

Células Hospederas La presente invención también se refiere a células hospederas recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención, que se usa de manera ventajosa en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula hospedera de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extra-cromosómico auto-replicante como se describe anteriormente. El término "célula hospedera" abarca cualquier progenie de una célula de origen que no sea idéntico a la célula de origen debido a mutaciones que se presentan durante la replicación. La elección de una célula hospedera dependerá en un gran grado del gen que codifica para el polipéptido y su fuente. La célula hospedera puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo, una procariota, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo, una eucariota. Los microorganismos unicelulares útiles son células bacterianas tal como bacterias gram-positivas que incluyen, pero no se limitan a, una célula de Bacill us, por ejemplo, una célula de Bacillus Alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans , Bacillus clausii, Bacillus coagulans , Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis , Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus , Bacillus subtilis, y Bacillus thunngiensis; o una célula de Streptomyces, por ejemplo, Streptomyces lividans y Streptomyces murinus, o una bacteria gram-negativa tal como E.coli y Pseudomonas sp. En un aspecto preferido, la célula hospedera bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis , Bacillus stearothermophilus , o Bacillus subtilis. En otro aspecto preferido, la célula de Bacillus es un Bacillus alcalofilo. La introducción de un vector en una célula hospedera bacteriana se puede efectuar, por ejemplo, por transformación con protoplastos (ver, por ejemplo Chang y Cohén, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (ver, por ejemplo, Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (ver, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (ver, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278) . La célula hospedera también puede ser una eucariota, tal como una célula mamífera, de insecto, vegetal o fúngica.

En un aspecto preferido, la célula hospedera es una célula fúngica. "Hongo" como se usa en la presente incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (como se define por Hawksworth et al . , In , Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungi , 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU) así como el Oomycota (como se cita en Hawksworth et al . , 1995, supra , página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al . , 1995, supra ) . En un aspecto más preferido, la célula hospedera fúngica es una célula de levadura. "Levadura" como se usa en la presente incluye levadura ascosporogenosa (Endomycetales) , levadura basidiosporogenosa, y levadura que corresponde a los Hongos imperfectos (Blastomycetes) . Puesto que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los propósitos de esta invención, levadura se debe definir como se describe en Biology and Activi ties of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds, Soc. App . Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980) . En un aspecto aun más preferido, la célula hospedera de levadura es una célula de Candida , Hansenula , Kl uyveromyces , Pichia , Saccharomyces , Schizosaccharomyces , o Yarrowia . En un aspecto más preferido, la célula hospedera de levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis , Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diasta ticus , Saccharomyces douglasii , Sa ccharomyces kl uyveri , Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis . En otro aspecto más preferido, la célula hospedera de levadura es una célula de Kl uyveromyces oviformis . En otro aspecto más preferido, la célula hospedera de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica . En otro aspecto más preferido, la célula hospedera fúngica es una célula fúngica filamentosa. "Hongos filamentosos" incluye en todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al . , 1995, supra ) . Los hongos filamentosos se caracterizan en general por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosan, mannano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es obligadamente aeróbico. En contraste, el crecimiento vegetativo por levaduras tal como Sa ccharomyces cerevisiae es por germinación de un tallo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo. En un aspecto aún más preferido, la célula hospedera fúngica filamentosa es una célula de Acremonium , Aspergill us , Aureobasidium , Bj erkandera , Ceriporiopsis , Coprinus , Coriol us , Cryptococcus , Filobasidi um, Fusari um , Humícola , Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora , Neocallimastix, Neurospora , Paecilomyces , Penícilli um , Phanerochaete, Phlebia , Piromyces, Pleurotus , Schizophyllum, Talaromyces , Thermoascus , Thielavia , Tolypocladium, Trametes , o Trichoderma . En un aspecto más preferido, la célula hospedera fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus , awamori , Aspergillis fumiga tus , Aspergillus foetidus , Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae . En otro aspecto más preferido, la célula hospedera fúngica filamentosa es una célula de Fusari um bactridioides , Fusarium cerealis , Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum , Fusarium reticula tum, Fusarium roseum, Fusarium sembucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides , o Fusarium venena tum . En otro aspecto más preferido, la célula hospedera fúngica filamentosa es una célula de Bj erkandera adusta , Ceriporiopsis aneirina , Ceriporiopsis aneirina , Ceriporiopsis caregiea , Ceriporiopsis gilvescens , Ceriporiopsis pannocinta , Ceriporiopsis rivulosa , Ceriporiopsis subrufa , o Ceriporiopsis subvernispora , Coprinus cinereus , Coriolus hirsutus , Humicola insolens , Humicola lanuginosa , Mucor miehei , Myceliophthora thermophila , Neurospora crassa , Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phiebia radia ta , Pleurotus eryngii , Thielavia terrestris, Trametes villosa , Trametes versicolor, Trichoderma harzianum , Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachia tum , Trichoderma reesei , o Trichoderma viride . Se pueden transformar células fúngicas por un proceso que comprende formación de protoplastos, transformación de los protoplastos, y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se . Los procedimientos adecuados para transformación de células hospederas de Aspergillus y Trichoderma se describen en EP 238 023 y Yelton et al . , 1984, Proceedings of the Na tional Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Se describen métodos adecuados para transformar especies de Fusarium por Malardier et al . , 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. Se puede transformar levadura usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, In Abelson. J.N. and Simón, M.I., editors, Guide to Yeast Geneti cs and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187. Academic Press. Inc., New York; Ito et al . , 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al . , 1978, Proceedings of the Na tional Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de Producción La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende (a) cultivar una célula, que en su forma tipo silvestre es capaz de producir el polipéptido, bajo condiciones conductoras para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. De manera preferente, la célula es del género Aspergill us, y de manera más preferente Aspergillus Oryzae. La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprenden (a) cultivar una célula hospedera bajo condiciones conductoras para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprende (a) cultivar una célula hospedera bajo condiciones conductoras para la producción del polipéptido, en donde la célula hospedera comprende una secuencia mutante de nucleótidos que tiene al menos una mutación en la región codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia mutante de nucleótidos codifica para un polipéptido que es una lipasa comprendida por o que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 2, y (b) recuperar el polipéptido. En una modalidad preferida, la secuencia de nucleótidos comprende un polipéptido que es una lipasa comprendida por o que comprende la parte madura del polipéptido de SEQ ID NO: 2, y (b) recuperar el polipéptido. En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutriente, adecuado para la producción del polipéptido usando métodos bien conocidos en la técnica, Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz agitado, y fermentación a gran escala y pequeña escala (incluyendo fermentaciones continuas por lotes, por lotes con alimentación o en estado sólido) en termentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan que el polipéptido se exprese y/o se aisle. El cultivo toma lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales y se pueden preparar de acuerdo a composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection) . Si el polipéptido se segrega en el medio nutriente, el polipéptido se puede recuperar directamente desde el medio. Si no se segrega el polipéptido, se puede recuperar de los usados celulares. Los polipéptidos se pueden detectar usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir uso de anticuerpos específicos, formación de un producto enzimático, o desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede usar un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido como se describe en la presente. El polipéptido resultante se puede recuperar usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido se puede recuperar del medio nutriente por procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación o precipitación. Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrófoba, de cromatoenfoque, y por exclusión de tamaño) , procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio) , SDS-PAGE, o extracción (ver, por ejemplo, Protein Purifica tion, J.-C. Janson y Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) .

Composiciones La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención. De manera preferente, las composiciones se enriquecen en este polipéptido. El término "enriquecido" indica que la actividad de lipasa de la composición se ha incrementado, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de 1.1. La composición puede comprender un polipéptido de la presente invención como el componente enzimático principal, por ejemplo, una composición de mono-componente. De manera alternativa, la composición puede comprender múltiples actividades enzimáticas, tal como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina-glicosiltransferasa, desoxiribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, laccasa, lipasa, mannosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa. Las enzimas adicionales se pueden producir, por ejemplo, por un microorganismo que corresponde al género Aspergill us, de manera preferente Aspergillus aculea tus , Aspergill us awamori , Aspergillus fumiga tus , Aspergillus foetidus , Aspergill us japonicus , Aspergill us nidulans, Aspergillus niger, o Aspergill us oryzae; Fusari um, de manera preferente Fusarium bactridioides , Fusari um cerealis , Fusarium crookwellense , Fusarium culmorum , Fusarium graminearum , Fusarium graminum , Fusarium heterosporum , Fusarium negundi , Fusari um oxysporum , Fusarium reticula tum , Fusarium roseum , Fusari um sambucinum , Fusari um sarcochroum , Fusari um sulphureum , Fusarium toruloseum , Fusari um trichothecioides , o Fusarium venena tum; Humicola , de manera preferente Humicola insolens o Humicola lenuginosa ; o Trichoderma , de manera preferente Tri choderma harzianum , Tri choderma koningii , Trichoderma longibrachia tum , Tri choderma reesei , o Tri choderma vi r ide . Las composiciones de polipéptidos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y pueden estar en la forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede estar en la forma de un granulado o un microgranulado. El polipéptido que se va a incluir en la composición se puede estabilizar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Se dan más adelante ejemplos de usos preferidos de las composiciones de polipéptido de la invención. Las dosis de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones bajo las cuales se usa la composición se pueden determinar en base a métodos conocidos en la técnica.

Aplicaciones de Detergentes La enzima de la invención se puede adicionar a, y de esta manera llegar hacer un componente de una composición de detergente. La composición de detergente de la invención se pueden formular, por ejemplo, como una composición detergente de lavado a máquina o a mano que incluye una composición de aditivo de lavandería adecuada para pre-tratamiento de tejidos manchados y una composición de suavizante de tela adicionado en enjuague, o se formula como una composición de detergente para el uso en operaciones generales de limpieza de superficies duras caceras, o se formula para operaciones de lavavajillas a máquina o lavado a mano de trastes.

Enzimas En un aspecto específico, la invención proporciona un aditivo detergente que comprende la enzima de la invención. El aditivo detergente así como la composición de detergente pueden comprender una o más enzimas diferentes tal como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mannanasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo una laccasa, y/o una peroxidasa. En general, las propiedades de las enzimas elegidas deben ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y las enzimas deben estar presentes en cantidades efectivas.

Proteasas : Las proteasas adecuadas que incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefiere de origen microbiano. Se incluyen mutantes químicamente modificados o manejados con proteínas. La proteasa puede ser una serina- proteasa o una metalo-proteasa, de manera preferente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa tipo tripsina. Los ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, incluyendo aquellos derivadas de Bacillus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en la WO 89/06279). Los ejemplos de proteasas tipo tripsina son tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusari um descrita en la WO 89/06270 y WO 94/25583. Los ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en la WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 68', 76, 57, 97, 101, 104, 106, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235, 245, 252 y 274, y entre otras variantes con las siguientes mutaciones: (K27R, V104Y, N123S, T124A) , (N76D, S103A, V1041), ó (S101G, S103A, V1041, G159D, A232V, Q236H, Q245R, N248D, N252K) . Las enzimas de proteasa preferidas comercialmente disponibles incluyen AlcalasaMR, SavinasaMR, PrimasaMR, DuralasaMR, EsperasaMR, CoronasaMR, PolarzymeMR y KannasaMR (Novozymes A/S) , MaxatasaMR, MaxacalMR, MaxapemMR, ProperasaMR, PurafectMR, Purafect PrimeMR, Purafect OxPMR, FN2, FN3 y FN4 (Genencor International Inc.).

Lipasas : Las lipasas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Incluyen mutantes químicamente modificados o manejados con proteína. Los ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo de Thermomyces), por ejemplo, de H. lanuginosa (sinónimo T. lanuginosus) como se describe en EP 258 068 y EP 305 216 o de H. Insolens como se describe en la WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo, de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO) 96/12012), una lipasa de Bacillus, por ejemplo, de B. subtilis (Dartois et al., (1993), Biochemica et Biophysica Acta. 1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422) . Otros ejemplos son variantes de lipasa tal como aquellas descritas en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202. Otras enzimas de lipasa comercialmente disponibles incluyen LipolasaMR, Lipolasa UltraMR y LipexMR (Novozymes A/S) . Las lipasas preferidas son lipasas de la presente invención.

Amilasas : Las amilasas adecuadas (a y/o ß) incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes químicamente modificados o manejados con proteína. Las amilasas incluyen, por ejemplo, a-amilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de B. licheniformis, descrita en más detalle en GB 1,296,839. Los ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en la WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 y WO 97/43424, especialmente las variantes con substituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 y 444. Las amilasas comercialmente disponibles son DuramylMR, TermamylMR, StainzymeMR, Stainzyme UltraMR, FungamylMR y BANMR (novozymes A/S) , RapidaseMR y PurastarMR (de Genencor International Inc.).

Celulasas : Las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes químicamente modificados o manejados con proteína. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora, thermophila y Fusarium oxysporum descritas en US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259. Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutrales que tienen beneficios de cuidado de color. Los ejemplos de estas celulasas son celulasas descritas en EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tal como aquellas descritas en WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00200. Las celulasas comercialmente disponibles incluyen RenozymeMR CelluzymeMR, y CarezymeMR (Novozymes A/S) , ClazinasaMR y Puradax HAMR (Genencor International Inc.), y KAC-500(B)MR (Kao Corporation).

Peroxidasas/Oxidasas : Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes químicamente modificados o manejados con proteína. Los ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo de C. cinereus, y variantes del mismo como aquellas descritas en WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257.

Las peroxidasas comercialmente disponibles incluyen GuardzymeMR (Novozymes A/S) .

Detergentes 'Las enzimas detergentes se pueden incluir en una composición detergente al adicionar aditivos separados que contienen una o más enzimas, o al adicionar un aditivo combinado que comprende todas estas enzimas. Un aditivo o detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, se puede formular, por ejemplo como un granulado, un líquido, o una suspensión espesa, etc. Las formulaciones aditivas detergentes preferidas son granulados, en particular granulados no espolvorientos, líquidos, en particular líquidos estabilizados, o suspensiones espesas. Se pueden producir granulados no espolvorientos, por ejemplo, como se describe en US 4,106,991 y 4,661,452 y se pueden revestir opcionalmente por métodos conocidos en la técnica. Los ejemplos de materiales de revestimiento ceroso son productos de poli (etileno-óxido) , (polietilen-glicol, PEG) con pesos molares promedio de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en el cual hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di- y tri-glicéridos de ácidos grasos. Los ejemplos de materiales de revestimiento formadores de película adecuados para aplicación por técnicas de lecho fluido se dan en GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas se pueden estabilizar, por ejemplo, al adicionar un poliol tal como propilenglicol, una azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico de acuerdo a los métodos establecidos. Se pueden preparar enzimas protegidas de acuerdo al método descrito en la EP 238,216. La composición detergente de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una barra, una tableta, un polvo, un granulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, típicamente que contiene hasta 70 % de agua y 0-30 % de solvente orgánico, o no acuoso. La composición detergente comprende uno o más agentes tensioactivos, que pueden ser no iónicos que incluyen semi-polares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitterionico . Los agentes tensioactivos se presentan típicamente a un nivel de 0 % a 60 % en peso. Cuando se incluye en la presente, el detergente contendrá usualmente de aproximadamente 0 % a aproximadamente 40 % de un agente tensioactivo aniónico tal como alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, éster metílico de ácido alfa-sulfo-graso, ácido alquil- o alquenil-succínico o jabón.

Cuando se incluye en la presente, el detergente contendrá usualmente de aproximadamente 0 % a aproximadamente 40 % de un agente tensioactivo no iónico tal como etoxilato de alcohol, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicósido, alquildimetilaminaóxido, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, amida de ácido graso de polihidroxi-alquilo, o derivados de N-acilo-N-alquilo de glucosamina ("glucamidas") . El detergente puede contener 0-65 % de un aditivo detergente o agente formador de complejo tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilendiamina tetracético, ácido dietilentriaminapentaacético, ácido alquil- ó alquenil-succínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (por ejemplo, SKS-6 de Hoechst). El detergente puede comprender uno o más polímeros. Los ejemplos son carboximetilcelulosa, poli (vinilpirrolidona) , poli (etilen-glicol) , poli (alcohol vinílico), poli (vinilpiridina-N-óxido) , poli (vinilimidazol) , policarboxilatos tal como poliacrilatos, o polímeros de ácido maleico/ácido acrílico y copolímeros de lauril-metacrilato/ácido acrílico. El detergente puede contener un sistema blanqueador que puede comprender una fuente de H202 tal como perborato o percarbonato que se puede combinar con un activador blanqueador formador de perácido tal como tetraacetiletilendiamina o nonanoiloxibencenosulfonato. De manera alternativa, el sistema blanqueador puede comprender peroxiácidos de por ejemplo el tipo amida, imida o sulfona. Las enzimas de la composición detergente de la invención se pueden estabilizar usando agentes estabilizadores convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático, o derivado de ácido fenilborónico tal como ácido 4-formilfenil-borónico, y la composición se puede formular como se describe por ejemplo en WO 92/19709 y WO 92/19708. El detergente también puede contener otros ingredientes de detergentes convencionales tal como por ejemplo acondicionadores de tela tal como arcillas, reforzadores de espuma, supresores de espumas de jabón, agentes anti-corrosión, agentes de suspensión de suciedad, agentes anti-redepósitos de suciedad, tintes, bactericidas, abrillantadores ópticos, hidrotropos, inhibidores de deslustre, o perfumes. En la presente se contempla que en las composiciones detergentes se puede adicionar una enzima, en particular la enzima de la invención, en una cantidad que corresponde a 0.001-100 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado, tal como 0.01-50 mg ó 0.03-30 mg, de manera preferente 0.05-5 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado, en particular 0.1-1 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado. La enzima de la invención se puede incorporar adicionalmente en las formulaciones detergentes descritas en WO 97/07202, WO 04/041979 WO 04/074419, que se incorporan de este modo como referencia.

Usos La presente invención también se refiere a métodos para usar los polipéptidos que tienen actividad de lipasa. Las variantes de la invención se pueden usar en aplicaciones conocidas de enzimas lipolíticas por analogía con la técnica anterior, por ejemplo; Una variante con actividad de lipasa se puede usar en la industria de pulpa y papel, para remover la brea depositable o para remover tinta de papel usado. WO 9213130, WO 9207138, JP 2160984 A, EP 374700. Una variante con actividad de fosfolipasa y/o galactolipasa se puede usar en la preparación de masa, pan y biscochos, por ejemplo, para incrementar la estabilidad de la masa y las propiedades de manejo de la masa, o para mejorar la elasticidad del pan o biscocho. WO 94/04035, WO 00/32758. Se puede usar una variante con actividad de fosfolipasa en un proceso para reducir el contenido de fosfolípido en un aceite comestible. US 5,264,367 (Metallgesellschaft, Rohm); K. Dahlke & H. Buchold, INFORM, 6 (12), 1264-91 (1995); H. Buchold, Fat Sci. Technol., 95 (8), 300-304 (1993); JP-A-2-153997 (Showa Sangyo) ; o EP 654,527 (Metallgesellschaft, Rohm) . Se puede usar una variante con actividad de lisofosfolipasa para mejorar la capacidad de filtración de una solución acuosa o suspensión espesa de origen de carbohidrato, por ejemplo, hidrolisado de almidón, especialmente un hidrolizado de almidón de trigo. EP 219,269. Se puede usar una variante con actividad de fosfolipasa para la preparación de liso-fosfolípido, por ejemplo, liso-lecitina (EP 870840, JP-A 10-42884, JP-A 4-135456 ó JP-A 2-49593) o para la producción de mayonesa (EP 628256, EP 398666 ó EP 319064). Se puede usar también una variante con actividad de fosfolipasa en el procesamiento de productos de leche y otros productos alimenticios, por ejemplo como se describe en EP 567,662 (Nestlé) , EP 426,211 (Unilever), EP 166,284 (Nestlé) , JP-A 57 189638 (Yakult) ó US 4,119,564 (Unile-ver) . Se puede usar una variante con actividad de fosfolipasa en la industria del cuero GB 2233665, EP 505920. Se puede usar una variante con actividad de lipasa para remover materia grasa que contiene esteres hidrófobos (por ejemplo, triglicéridos) durante el acabado de textiles. WO 03/13256. La presente invención se describe además por los siguientes ejemplos que no se deben considerar como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos Los productos químicos usados como amortiguadores y sustratos fueron productos comerciales de al menos grado reactivo.

Medios y Soluciones Producto Marca comercial LAS: Surfac PS Zeolita A Wessalith P Materiales Producto Proveedores EMPA221 EMPA St. Gallen, Lerchfeldstrasse 5, CH-9014 St. Gallen. Suiza Ejemplo 1 Producción de Enzima Se construye un plásmido que contiene gen que codifica para la lipasa, y se transforma en una célula hospedera adecuada usando métodos normales de la técnica. Se lleva a cabo la fermentación como una fermentación por lote de alimentación usando una temperatura constante del medio de 34 °C y un volumen de inicio de 1.2 litros. El pH inicial del medio se ajusta a 6.5. Una vez que el pH se ha incrementado a 7.0 este valor se mantiene a través de la adición de H3P04 al 10 %. El nivel de oxígeno disuelto en el medio se controla al variar la velocidad de agitación y al usar una velocidad fija de aireación de 1.5 litro de aire por litro de medio por minuto. La velocidad de adición de alimentación se mantiene a un nivel constante durante la fase completa del lote de alimentación. El medio de lote contiene jarabe de maltosa como fuente de carbono, urea y extracto de almidón como fuente de nitrógeno y una mezcla de metales trasa y sales. La alimentación adicionada continuamente durante la fase de lote de alimentación contiene jarabe de maltosa como fuente de carbono en tanto que se adiciona extracto de levadura y urea a fin de asegurar un suministro suficiente de nitrógeno. La purificación de la lipasa se puede hacer por el uso de métodos normales conocidos en la técnica, por ejemplo, al filtrar el sobrenadante de fermentación y la cromatografía hidrófoba subsiguiente y la cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo como se describe en EP 0 851 913, Ejemplo 3.

Ejemplo 2 AMSA - Ensayo de Esfuerzo Mecánico Automatizado - para cálculo de RP Las variantes enzimáticas de la presente solicitud se prueban usando el Ensayo de Esfuerzo Mecánico Automático (AMSA) . Con la prueba de AMSA, se puede examinar el desempeño de lavado de una gran cantidad de soluciones de detergente con enzima de volumen pequeño. La placa de AMSA tiene varias ranuras para soluciones de prueba y una tapa que aprieta firmemente la muestra textil que se va a lavar contra todas las aberturas de las ranuras. Durante el tiempo de lavado, la placa, las soluciones de prueba, el textil y la tapa se agitan vigorosamente para poner a la solución de prueba en contacto con el textil y aplicar esfuerzo mecánico. Para descripción adicional ver la WO 02/42740 especialmente en el párrafo "Modalidades de método especiales" en la página 23-24. Los recipientes, que contienen la solución de prueba detergente, consisten de agujeros cilindricos (6 mm de diámetro y 10 mm de profundidad) en una placa metálica. La tela manchada (material de prueba) está en la parte superior de las placas metálicas y se usa como una tapa y sello en los recipientes. Otra placa metálica esta en la parte superior de la tela manchada para evitar cualquier derrame de cada recipiente. Las dos placas metálicas conjuntamente con la tela manchada se hacen vibrar hacia arriba y hacia abajo a una frecuencia de 30 Hz con una amplitud de 2 mm. El ensayo se lleva a cabo bajo las condiciones experimentales especificadas a continuación: Tabla 1 Se prepararon muestras de crema-curcuma al mezclar 5 g de cúrcuma (Santa María, Dinamarca) con 100 g de crema (38 % de grasa, Arla, Dinamarca) a 50°C, la mezcla se deja a esta temperatura durante aproximadamente 20 minutos y se filtra (50°C) para remover cualquier partícula no disuelta. La mezcla se enfría a 20°C y las muestras de algodón tejidas, EMPA221, se sumergen en la mezcla de crema-curcuma y posteriormente se dejan secar a temperatura ambiente durante la noche y se congelan hasta el uso. En la Patente WO 2006/125437 se describe la preparación de muestras de crema-curcuma. El desempeño de la variante de enzima ' se mide como el brillo del color de las muestras textiles lavadas con esta variante ezimática específica. También se puede expresar el brillo como la intensidad de la luz reflejada de la muestra textil cuando se ilumina con luz blanca. Cuando el textil se tiñe la intensidad de la luz reflejada es baja, que aquellas de un textil limpio. Por lo tanto, la intensidad de la luz reflejada se puede usar para medir el desempeño de lavado de una variante enzimática. Se hacen mediciones de color con un escáner de cama plana profesional (PFU DL2400pro) que se usa para capturar una imagen de las muestras textiles lavadas. Las exploraciones se hacen con una resolución de 200 puntos por pulgada y con una profanidad de color de salida de 24 bits. A fin de obtener resultados exactos, el escáner se calibra frecuentemente con un objetivo reflexivo IT8 Kodak. Para extraer un valor para la intensidad de la luz de las imágenes exploradas, se usa una aplicación de software especial, diseñado (Novozymes Color Vector Analyzer) . El programa recupera los valores en pixeles de 24 bits de la imagen y los convierte en valores para rojo, verde y azul (RGB). El valor de intensidad (Int) se calcula al adicionar los valores de RGB conjuntamente como vectores y luego al tomar la longitud del vector resultante: Int= \| r2+g2+b2 El desempeño del lavado (P) de las variantes se calcula de acuerdo con la fórmula a continuación: P = Int (v) - Int (r) Donde Int(v) es el valor de la intensidad de la luz de la superficie textil lavado con la enzima, y Int(r) es el valor de la intensidad de la luz de la superficie textil lavada sin enzima. Se da una puntuación de desempeño relativa como el resultado del lavado de AMSA de acuerdo con la definición: Las puntuaciones de desempeño relativo (RP) se suman hasta los desempeños (P) de las variantes enzimáticas probadas contra enzima de referencia: RP = P (enzima de prueba) /P (enzima de referencia). RPavg indica el desempeño relativo promedio en comparación a la enzima de referencia a las tres concentraciones enzimáticas (0.125, 0.25, 0.5, 1.0 mg ep/1). RPavg = avg (RP (0.125) , RP(0.25) RP(0.5), RP(1.0)) Una variante se considera que exhibe desempeño mejorado del lavado, si se desempeña mejor que la referencia. En el contexto de la presente invención, la enzima de referencia es la parte madura de SEQ ID NO. 2 con las sustituciones T231R + N233R.

Ejemplo 3 GC-Cromatografía de gases, para cálculo de factor de riesgo La liberación de ácido butílico de las muestras lavadas con lipasas se midió por cromatografía de gas con micro-extracción de fase sólida (SPME-GC) usando el siguiente método: Cuatro piezas textiles (de 5 mm de diámetro), lavadas en la solución especificada en la Tabla 1 que contiene 1 mg/L de lipasa, se transfirieron a un frasco de cromatógrafo de gases (GC) . Las muestras se analizaron en un Varían 3800 GC equipado con una columna Stabilwax-DA w/Integra-Guard (30m, 0.32 mm de ID y 0.25 micro-m df) y una fibra Carboxen PDMS SPME (75 micro-m) . Cada muestra se pre-incubo durante 10 minutos a 40°C seguido por muestreo de 20 minutos con la fibra de SPME en el espacio superior sobre las piezas textiles. La muestra se inyectó subsiguientemente en la columna (temperatura de inyector = 250°C) . Flujo de columna = 2 ml de Helio/min. Gradiente de temperatura de horno en columna: 0 min = 40°C, 2 min = 40°C, 22 min = 240°C, 32 min = 240°C. El ácido butírico se detectó por detección de FID y se calculó la cantidad de ácido butírico en base a la curva normal de ácido butírico. El olor de desempeño de riesgo, R, de una variante de lipasa es la relación entre la cantidad de ácido butírico liberado de la muestra lavada con variante de lipasa es la cantidad de ácido butírico liberado de una muestra lavada con la parte madura de la lipasa de SEQ ID NO. 2, después de que ambos valores se han corregido para la cantidad de ácido butírico liberado de una muestra lavada sin lipasa. El riesgo (R) de las variantes se calcula de acuerdo con la fórmula a continuación: Olor = medido en micro g de ácido butírico desarrollado a 1 mg de proteína de enzima/1 corregido para blanco.

Al i aenzlma de prueba - 010 renzlma ?je prueba — D13HCO . Al l aenzlma de referencia = 01 ?renz?ma de referencia — b l anCO . — "J- I 3enzlma de prueba / A t aenz?ma de referencia * Se considera que una variante exhibe olor reducido en comparación de la referencia, si el factor R es inferior que 1.

Ejemplo 4 Actividad (LU) con relación a la absorbancia 280nm La actividad de una lipasa con relación a la absorbancia 280 nm se determina por el siguiente ensayo: LU/A280: Un sustrato para lipasa se prepara al emulsionar tributirin (glicerin-tributirato) usando goma arábiga como emulsionador . La hidrólisis de tributirin a 30°C a pH 7 o 9 se permite en un experimento de titulación con pH. Una unidad de actividad de lipasa (1LU) es igual a la cantidad de enzima capaz de liberar 1 micro mol de ácido butírico/min a pH7. La absorbancia de la lipasa purificada a 280 nm se mide (A280) y se calcula la relación LU/A280. La LU/A280 relativa se calcula como la LU/A280 de la variante divida por la LU/A280 y una enzima de referencia. En el contexto de la presente invención, la enzima de referencia es la parte madura de SEQ ID NO. 2 con las mutaciones T231R y N233R.

Ejemplo 5 BR.- Beneficio de un riesgo. El factor beneficio-riesgo se describe el desempeño en comparación al riesgo reducido para olor olido se define de esta manera: BR = RPavg / R Una variante se considera que exhibe desempeño mejorada del lavado y olor reducido, si el factor de BR es mayor que 1. Aplicando los métodos anteriores, se obtuvieron los siguientes resultados: Tabla 2 La lipasa de referencia y las variantes 7 y 8 en la Tabla 2 se describen en la WO 2000/060063. La invención descrita y reivindicada en la presente no se limita en el alcance por los aspectos preferidos descritos en la presente, puesto que estos aspectos se proponen como ilustraciones de varios aspectos de la invención. Se propone cualquier aspecto equivalente que esté dentro del alcance de esta invención. En realidad, varias modificaciones de la invención además de aquéllas mostradas y descritas en la presente llegarán a ser evidentes para aquéllos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Estas modificaciones también se proponen que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En el caso de conflicto, controlará la presente descripción incluyendo definiciones . Se citan en la presente varias referencias, las descripciones de las cuales se incorporan como referencia en sus totalidades. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Polipéptido, caracterizado porque tiene actividad de lipasa y que además tiene un desempeño relativo promedio (RPavg) de al menos 0.8 y un factor de beneficio-riesgo (BR) de al menos 1.1 a las condiciones de prueba tratadas en la especificación
2. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene además una LU/A280 relativa menor de 1.00 a las condiciones de prueba tratadas en la especificación.
3. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un polipéptido bacteriano.
4. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es polipéptido fúngico.
5. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque es un polipéptido de Thermomyces.
6. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque es un polipéptido de Thermomyces lanuginosus .
7. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es una variante de una lipasa comprendida por el polipéptido de SEQ ID NO. 2.
8. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es una variante de una lipasa comprendida por la parte madura del polipéptido de SEQ ID NO. 2.
9. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es una variante de una lipasa que comprende el polipéptido de SEQ ID NO. 2.
10. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es una variante de una lipasa que comprende la parte madura del polipéptido de SEQ ID NO. 2.
11. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se codifica por un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones de severidad al menos alta con los nucleótidos 644 a 732 de SEQ ID NO. 1 o una hebra complementaria a esto.
12. Polinucleótido asilado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
13. Construcción de ácido nucleico, caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 12, operablemente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un hospedero de expresión.
14. Vector expresión recombinante, caracterizado porque comprende la construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13.
15. Célula hospedera recombinante, caracterizada porque comprende la construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14.
16. Método para producir el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una célula, que en su forma tipo silvestre es capaz de producir el polipéptido, bajo condiciones conductoras para producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.
17. Método para producir el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una célula hospedera que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido bajo condiciones conductoras para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.