MX2008008739A - Uso de un extracto insaponificable de pulpa vegetal en el tratamiento del envejecimiento cutaneo - Google Patents

Abstract

El uso de un extracto insaponificable de pulpa vegetal en el tratamiento del envejecimiento cutáneo,. El dominio de la presente invención se refiere a la utilización de un extracto insaponificable de pulpa vegetal para la preparación de un producto cosmético, farmacéutico o nutracéutico destinado a tratar y/o prevenir los desórdenes cutáneos asociados con el envejecimiento.

Description

USO DE UN EXTRACTO INSAPONIFICABLE DE PULPA VEGETAL EN EL TRATAMIENTO DEL ENVEJECIMIENTO CUTÁNEO CAMPO DE LA INVENCIÓN El dominio de la presente invención se refiere a la utilización de un extracto insaponificable de pulpa vegetal para la preparación de un producto cosmético, farmacéutico o nutracéutico destinado a tratar y/o prevenir los desórdenes cutáneos asociados al envejecimiento. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El envejecimiento es un problema inevitable, lentamente evolutivo e irreversible que incluye modificaciones anatómicas e histológicas responsables de anomalías funcionales de los órganos. Los primeros signos se manifiestan al nivel del tejido cutáneo por las alteraciones de la textura, del color, de la transparencia y por la parición de arrugas. Estas manifestaciones se pueden potencializar por los factores extrínsecos como el sol, el tabaco, etc. La importancia de los radicales libres oxigenados (RLO) en los proceso implicados en el envejecimiento se considera como una de las principales teorías. Al nivel cutáneo, los RLO descritos como los mediadores precoces de las patologías inflamatorias y de envejecimiento (Kress M, et al. Pain 1995; 62:87-94). En el transcurso del envejecimiento, todas las estructuras de la piel se modifican. Pero las alteraciones fundamentales predominantemente en la dermis y estos son los fibroblastos y la matriz extracelular que son los principales objetivos y los principales actores. Los fibroblastos son capaces de entrar en senescencia. En consecuencia, su número disminuye, su función se ralentiza y su fenotipo de modifica. Participan entonces activamente en la degradación de la matriz extracelular dérmica. Además, luego de la senescencia, los fibroblastos pierden su reactividad y ven modulada su regulación. En efecto, se admite que el envejecimiento está asociado a una reducción de una parte de la respuesta a la tensión ambiental, y de esta forma, a una aparición de las enfermedades infecciosas, auto-inmunes y de cánceres (Gardner I.D. Rev. Infect . Dis . 1980; 2: 801-10). La aparición de arrugas es uno de los signos más precoces del envejecimiento. La misma constituye, para ciertas personas, un verdadero problema en sus relaciones con el exterior. Así en el presente, numerosos productos cosméticos que apuntan al tratamiento del envejecimiento cutáneo están puestos a la disposición del público. Principalmente, sus especialidades son a base de extractos vegetales. El arganier, conocido en la nomenclatura botánica internacional bajo el nombre de Argania spinosa (L.) S ells, ha sido balizado especialmente por la industria cosmética, y más particularmente la almendra del grano. El arganier es un árbol achaparrado de 6 a 10 metros de alto, donde el aspecto recuerda aquél del olivo. El aspecto de la corona foliar es poco variable, puede estar enderezado o ser llorón. Las ramas, muy espinosas tienen hojas pequeñas lanceoladas, alternas, estrechas, cortas (alrededor de 2 cm) , a menudo reagrupadas en fascículos. El follaje del arganier es generalmente persistente, pero sucede que en periodo de gran sequedad, se vuelve caduco. Las flores, de color amarillo verdoso, hermafroditas (estambres y pistilos en la misma flor) y pentámeros (5 pétalos, 5 sépalos..), se reagrupan en inflorescencias del tipo glomérulo. Ellas se abren de mayo a junio. El arganier fructifica a la edad de 5 años. El fruto es una baya amarilla sésil y ovalada de 4 a 5 cm de longitud. La misma está formada de un pericarpio carnoso (también llamada pulpa) , encerrando una suerte de "hueso falso" muy duro de color marrón. Este elemento está constituido en realidad de 2 a 3 granos aplastados soldados entre ellos y que encierran cada uno una almendra oleaginosa. Las aplicaciones más valiosas tienen como origen la almendra del grano. Esta suministra un aceite después, en un segundo tiempo un residuo sólido.

El aceite extraído de los granos es el objeto de varias patentes de invención: la obtención del aceite por solvente (FR 2 553 788) , el aceite de argan enriquecido e insaponificable (FR 2 724 663) . Las sustancias diferentes del aceite ha sido también patentadas. Esta es el caso de los péptidos expedidos del borujo de los granos obtenidos después de la extracción del aceite: asociación del aceite y de los péptidos de borujos o residuos sólidos para el tratamiento de los problemas ligados al envejecimiento cutáneo (FR 2 756 183) . La hoja de arganier, las proteínas y las saponinas de los residuos sólidos son igualmente el objeto de las patentes de invención: EP 1 213 025 concerniente a los extractos de hojas, EP 1 213 024 reducido de las proteínas de residuos sólidos y EP 1 430 900 de las saponinas de residuos sólidos. Las pulpas de las frutas del arganier son el objeto más reciente de la solicitud de patente O2005/039610. El fruto del arganier es una falsa drupa. Está constituida entonces de un pericarpio carnoso llamado pulpa (55 a 75% de fruta) y de un hueso provisto de una coquilla muy dura que contiene una a tres almendras. De éstas últimas se extrae el aceite. La pulpa de la fruta es el objeto de estudios químicos. Esta constituida de glúcidos donde la celulosa, la glucosa, fructosa y sacarosa (Charrouf Z. Guillaume D., Ethnoeconomical , ethnomedical and phytochemical study of Argania spinosa (L.) Skeels., Journal of Ethnopharmacology, 1999, 67, 1, 7-14 - Sandret F.G., Etudes p'reliminaires des glucides et du látex de la pulpe du fruit d'Argen (Argania spinosa) : variation au cours de la maturation, Bulletin de la Societé de Chimie Biologique, 1957, 39, 5-6, 619-631) . Los lípidos están igualmente presentes. Su contenido es de 6%. En la fracción insaponificable de estos lípidos han sido identificados 5 alcoholes triterpénicos = eritrodiol, lupeol a y ß-amirina, betulinaldehído y 2 esteróles = espinosterol y schottenol (Charrouf Z., Fkih-Tetouani S., Charrouf M. Mouchel B., Triterpenos et stérols extraits de la pulpe d'Argania spinosa, Plantes Medicinales et Phytothérapie, 1991, 25, 2-3. 112-117) . La solicitud de patente WO2005/039610 trata, de manera general, la utilización de la composición a base de pulpas de frutas de arganier para la preparación de productos cosméticos. El extracto de pulpas de frutas ha sido más o menos purificado. Así, es preferencialmente la utilización de un extracto de pulpas de frutas contenido en seguida de una extracción con hexano que se describe (página 15) . Seguido de una clásica etapa de saponificación conocida por el experto en la técnica, los autores han probado la fracción insaponificable así recibida. Finalmente, los autores han visualizado una etapa de fraccionamiento del insaponificable por cromatografía teniendo cuidado de desviar el compuesto triterpénico de eritrodiol . Este razonamiento ha sido guiado verdaderamente por los resultados obtenidos especialmente por el hecho que el eritrodiol solo está presente como tóxico (ejemplo 1) a una dosis más débil que la fracción triterpénica tal como se define en el documento: fracción A desprovista del eritrodiol (página 38) . Además, el eritrodiol solo no presenta sino un beneficio mediocre frente a los UVA y UVB (ejemplos 3 y 4) , con respecto a dicha fracción triterpénica. La enseñanza general de este documento parte entonces de la utilización de la fracción triterpénica de un extracto de pulpa de frutas de arganier para la preparación de productos cosméticos y preferentemente en el tratamiento de pieles dañadas pore los UVA y UVB vía la estimulación del metabolismo de los fibroblastos. Más específicamente, este documento enseña que dicha fracción triterpénica tal como se ha divulgado en O2005/039610 será por tanto más activa que la cantidad de eritrodiol será débil. De manera sorprendentemente inesperada, los autores de la presente invención han puesto en evidencia un efecto de inhibición de la senescencia de la fibroblastos de pieles maduras con un extracto insaponificable de pulpas de frutas de alganier rica en eritrodiol; dicho extracto es susceptible de ser obtenido por una extracción con acetona seguido de una etapa clásica de saponificación. Sin embargo, se puede considerar razonablemente que los beneficios de la presente invención pueden ser entendidos con cualquier extracto insaponificable de pulpa vegetal que presenta una fracción triterpénica donde la composición en sus compuestos principales está próxima de aquella salida de las pulpas de frutas de arganier. La presente invención se refiere a la utilización de un extracto insaponificable de pulpa vegetal que comprende una fracción triterpénica, caracterizada en que dicha fracción triterpénica comprende el eritrodiol, la -amirina y el lupeol, para la preparación de un producto cosmético, farmacéutico o nutracéutico destinado a prevenir y/o tratar los desórdenes cutáneos asociados al envejecimiento cutáneo. De manera preferente, dicho extracto se obtiene por una extracción acetónica seguida de una etapa clásica de saponificación. Este extracto insaponificable, aún llamado insaponificable inicial, puede estar solubilizado en un excipiente para facilitar su formulación.

Preferentemente dicho extracto se obtiene a partir de un vegetal elegido de la familia Sapotacae o sapotáceas; y aún más preferentemente dicho extracto se obtiene a partir de pulpas de frutas de arganier. La ventaja de la extracción acetónica reside en el hecho que se puede liberar del látex, que representa la más grande mayoría de la fracción lipídica, y así está más concentrada de sustancia insaponificables en la fracción lipídica. La composición del insaponificable según la presente invención se diferencia a la vez cualitativamente y cuantitativamente de aquella descrita preferentemente en la solicitud de patente O2005/039610. Los extractos de la presente invención están caracterizados por su contenido de sustancias triterpénicas . Estas últimas pueden ser analizadas por cromatografía en fase gaseosa según un método apropiado clásico que permite identificar la ß-amirina, el eritrodiol. Por el contrario, la a-amirina y el lupeol no se separan por este método, estas moléculas pueden entonces estar dosificadas comúnmente. Ventajosamente, la fracción triterpénica de dicho extracto está compuesto de eritrodiol donde la fracción másica está comprendida entre alrededor del 7% y alrededor del 40% del insaponificable inicial, la ß-amirina donde la fracción másica está comprendida entre alrededor del 5% y alrededor del % del insaponificable inicial, la a-amirina y el lupeol donde la suma de estas dos fracciones másicas está comprendida de entre alrededor del 10% y alrededor del 50% del insaponificable inicial. De manera ventajosa, dicha fracción másica de eritrodiol está comprendida entre aproximadamente 10% y aproximadamente 20% del insaponificable inicial; y de manera aún más ventajosa es igual a aproximadamente 15% del insaponificable inicial. De manera ventajosa, dicha fracción másica de ß-amirina está comprendida entre aproximadamente 7% y aproximadamente 20% del insaponificable inciial; y de manera aún más ventajosa es igual a aproximadamente 10% del insaponificable inicial. De manera ventajosa, la suma de dichas fracciones másicas de a-amirina y de lupeol está comprendida entre aproximadamente 15% y aproximadamente 30% del insaponificable inicial; y de manera aún más ventajosa es igual a aproximadamente el 20% del insaponificable inicial. Los contenidos de estas diferentes moléculas dependen de las condiciones de extracción. Estos valores serán menos importantes en el producto cosmético, farmacéutico o nutracéutico en función del o de los excipientes que serán agregados al insaponificable inicial. Un punto remarcable de la presente invención es la contribución importante del eritrodiol en las propiedades anti -envejecimiento del extracto insaponificable según la presente invención. El RLO juega un papel importante en el proceso de envejecimiento cutáneo, el efecto antiradical (anto-RLO) del eritrodiol a sido evaluado en comparación con el insaponificable de las pulpas de frutas de arganier según la presente invención. Los Los dominios creados por los RLO en el seno de las células se traducen por la alteración de los compuestos lipidíeos de la membrana plasmática (lipoperoxidación) , las proteínas (desnaturalización y degradación) y del material genético o ADN (mutaciones) . Los ensayos realizados in vitro han llevado a la determinación: - de la eficacia de protección por el eritrodiol y por el extracto insaponificable contra la oxidación de lípidos membranarios (ejemplo 3) ,- - y del poder protector del eritrodiol y de otras moléculas triterpénicas (lupeol a y ß-amirina) frente a la alteración del ADN genómico (ejemplo 4) . Estos ensayos han permitido poner en evidencia que el eritrodiol es una molécula que posee un potencial anti-oxidante importante . En un modo particular de realización de la presente invención, la extracción se puede realizar como sigue: las pulpas de la fruta de arganier secas se trituran luego se extraen con acetona. Se puede igualmente utilizar una mezcla de acetona-agua. La extracción se realiza bajo la agitación o de manera estática, en una proporción planta/solvente que puede variar de 1/2 a 1/20, a temperaturas que varías de la temperatura ambiente a la temperatura de ebullición del solvente y sobre una duración que puede ir de 30 minutos a 24 horas . Una vez extraído, el residuo sólido de la planta se separa de la solución extractiva por filtración o centrifugación. La solución puede estar más o menos concentrada hasta la obtención de un extracto seco. En el último caso, la materia seca puede ser solubilizada en un alcohol para permitir la saponificación. A la solución, se agrega un hidróxido metálico, en particular sosa o potasa a concentraciones que varían de 0.1 a 10 N. La saponificación se conduce a temperaturas que varían de la temperatura ambiente a la de ebullición, bajo agitación y por una duración que varia de 15 minutos a 48 horas según la temperatura . La purificación se conduce por una extracción líquido/líquido. Se añade entonces al medio de hidrólisis un solvente no miscible que puede ser agua saturada o no con sales [NaCl, (NH4)2S04] y agregada a pH que varía de 3 a 9. Este solvente puede ser un óxido de éter, un éster, un alcano, un hidrocarburo halogenado, o una mezcla de estos solventes. Uno, dos o tres extracciones líquidas/líquidas sucesivas se realizan. Las fases orgánicas se reúnen luego se lavan con agua saturada o no con sales y a pH variante de 3 a 9. Esta fase de lavado se puede repetir varias veces. Después de la purificación, las fases orgánicas se tratan a manera de eliminar el solvente. Este tratamiento se puede efectuar por evaporación controlando la presión. La etapa de evaporación se puede conducir a un producto de consistencia lípida más o menos ceroso, el insaponificable inicial. Se puede agregar un excipiente que puede ser una cera animal (de abeja por ejemplo) o vegetal (cera de carnauba, de candelilla o de jojoba) un aceite vegetal (maíz, cártamo, ajonjolí, argan..) glicerina, los productos de origen sintético como el aceite de vaselina, los polioles (como el propilenglicol, el butilenglicol , el glicerol...) los triglicéridos esterificados (como el migliol 812, el miritol 318, el neobee MJ) los polímeros oxipropíleñados de la fórmula H(OCH2-CHCH3)nOH o los políomeros oxietilenados de la fórmula H(OCH2-CH2)nOH, los diésteres de alcohol graso de longitud variable de Ci a C40. Las proporciones del insaponificable inicial de las pulpas de frutas de arganier y del excipiente pueden variar de 1/99 a 99/1.

De manera ventajosa, la presente invención permite una valorización de las pulpas de frutas es el tratamiento antienvejecimiento, a un costo de retorno razonable. El extracto insaponificable se utiliza sin etapa de purificación complementaria, que s es muy costosa. La composición según la presente invención se puede obtener entonces con la ayuda de un procedimiento que hace intervenir las etapas clásicas de extracción y de saponificación conocidas del experto en la materia . La utilización de un extracto insaponificable de pulpa vegetal según la presente invención permite obtener y/o tratar los desórdenes cutáneos que se manifiestan por las alteraciones de textura, de color, de transparencia de la piel y por la aparición de arrugas. En un modo de realización particular de la invención, los desórdenes cutáneos son consecutivos a una reducción o una pérdida de respuesta a la tensión ambiental, especialmente causada por el sol o el tabaco. En otro modo de realización particular de la invención, los desórdenes cutáneos son consecutivos a una reducción io una pérdida de inductibilidad de proteínas HSP72. Las proteínas HSP para "proteína de choque por calor" se expresa constitutivamente en numerosas células y poseen las funciones indispensables en mantener las proteínas, de donde su nombre de proteínas "de compañía" . En efecto, ellas inhiben la agregación de las proteínas desnaturalizadas, evitan las asociaciones no apropiadas de proteínas y no están implicadas en el transporte intracelular y en el mantenimiento bajo la forma inactiva de ciertas proteínas (Morris S.D. Clin . Exp . Dermatol . 2002; 27:220-224). Las HSPs juegan igualmente un papel esencial en la respuesta a la tensión o estrés y especialmente en los procesos de protección celulares que ponen en juego la respuesta adaptativa (Maytin E.V. J". Invest . Dermatol . 1995; 104:448-55). De manera inesperada, la utilización de un extracto según la presente invención permite restaurar la inducción de las proteínas HSP72 en los fibroblastos senescentes. En el marco de la presente invención, el producto cosmético, farmacéutico o nutracéutico, encierran un extracto según la invención, se administra por vía oral o por vía tópica, preferentemente por vía tópica. Para una administración por vía tópica, la forma galénica se elige del grupo que comprende las cremas, los geles, las pomadas y los aerosoles. Ventajosamente, la forma oral se elige entre el grupo que comprende los comprimidos, las cápsulas o los polvos para suspensiones bebibles.

De manera ventajosa, la cantidad de dicho extracto en el producto cosmético final está comprendida entre aproximadamente 0.001% y aproximadamente 50%, preferentemente entre aproximadamente 0.01% y aproximadamente 10%, y aún más preferentemente entre aproximadamente 0.1% y aproximadamente 2% en peso respecto al peso total de la preparación. La preparación puede además contener otros activos bien conocidos por el experto en la materia, para el tratamiento y/o la prevención de desórdenes cutáneos asociados al envejecimiento cutáneo. Ventajosamente, dicha preparación contiene otras sustancias que sales del arganier conocidas por su acción "anti -edad" tales como el aceite obtenido a partir de la almendra del grano y los péptidos de los borujos por ejemplo. El ejemplo aquí debajo de una composición de la invención está dado a título indicativo y no limitativo. Los porcentajes están dados en peso con respecto al peso total de la composición. Ejemplo 1: Cuidado anti-relajamiento de la cara - Extracto insaponificable de pulpa de Frutas de arganier 0.1 a 2% - Aceite de argan enriquecido 1 a 5% - Péptidos de argan 0.1 a 1% - Derivados de vitamina E 0.1 a 0.5% - Éster glicérico de vitamina E 0.1 a 0.5% - Palmitato de vitamina A 0.1 a 1% - Estearato de metil glucosa 1 a 5% - Triglicéridos cáprico caprílico 2 a 8% - Parafina líquida 5 a 12% - Perfume es - Agua purificada csp lOOg Los ejemplos siguientes ilustran la presente invención sin limitar en cualquier manera el alcance. Ejemplo 2: Procedimiento de obtención de un extracto insaponificable de pulpas de frutas de arganier. Una tonelada de pulpas de frutas de arganier secas se trituran después se estraen de un reactor de 5 toneladas de acetona. La extracción se conduce bajo agitación durante una hora a reflujo. Una vez re-enfriada, la solución se recupera por filtración luego se concentra bajo vacío hasta la obtención de un extracto oleoso de disolvente. Este residuo se retoma en 500 1 de etanol a 95% v/v. Se agregan 100 1 de lejía de sosa ION y se lleva a reflujo bajo agitación dura te una hora. Después del enfriamiento, la solución hidrolizada se coloca en un decantador, se agregan 500 1 de heptano y 300 1 de agua. La extracción líquido/líquido se conduce con precaución. Después de la decantación, se recuperan la fase orgánica. Se repite 2 extracciones nuevas con 500 1 de heptano. Las 3 fases heptánicas se reagrupan y lavan 3 veces con 500 1 de agua cada vez. A las fases orgánicas lavadas se elimina el solvente. Se recupera así una pasta cerosa. Este extracto, que corresponde al insaponificable inicial, está dosificado para su contenido en sustancias triterpénicas . Contiene 10% de ß amirina, 15% de eriteodiol y 20% de mezcla de lupeol -a amirina. Ejemplo 3: Análisis del efecto anti-radical del eritrodiol - análisis de la peroxidación lipídica. 1) Introducción La membrana plasmática constituye el principal y el primer blanco del RLO y, estando enriquecido en líquido, es el sitio de una peroxidación aumentada (Girotti A.W. J. Free Radie. Biol . Med 1985; 1:87-95). Los peróxidos generados en el curso de esta oxidación lipídica son también muy reactivos y capaces de degradas el material proteico genómico. Para evaluar la alteración de la membrana, los autores de la invención han medido la peroxidación lipídica por una dosificación in vitro de complejos entre ñlos productos de oxidación lipidíeos y el ácido tiobarbitúrico. Estos complejos se llaman TBARS (por sustancias reactivas de ácido tiobarbitúrico) y el dan el nombre a la prueba: Prueba de TBARS . Después de imitar una tensión oxidativa química, se ha tratado la línea de fibroblastos L929, por un complejo compuesto de peróxido de hidrógeno (H202) y fierro (Fe2+/Fe3+) reconstituyendo así la reacción de Fenton, fuente de RLO y más particularmente del radical hidroxilo (0H°) (Vessey D.A. et al J. Invest. Dermatol . 1992 ; 99 : 859-63) : H2?2 + Fe"+ ? 0H° + OH" + Fe ,3+ . 2 ) Metodología Productos probados : Los productos han sido evaluados sobre la línea de fibroblastos murinos L929. Las células se pretratan con las diferentes concentraciones de productos (Tabla I) durante 16 horas y se estimulan enseguida con el complejo H202-Fe2+/Fe3+ durante 1 hora. El lote LK0304 de extracto insaponificable de pulpas de frutas de arganier se ha preparado según el ejemplo 2. Tabla 1: Presentación de las soluciones probadas (*Molécula de referencia anti-radical) La peroxidación de los lípidos membranarios se analiza midiendo los TBARS (según Morliére P. et al. Biochim. Biophys . Acta 1991;1084:261-268). Principio de la prueba: En medio ácido, a 95°C se forman los complejos, notados TBARS para sustancia reactiva del ácido tiobarbitúrico, entre los productos de oxidación lipidíeos (malondialdehído o MDA) y el ácido tiobarbitúrico (TBA) que puede ser dosificados en fluorescencia con respecto a una gama patrón con el MDA. La dosificación de TBARS se indica en pmol/µg de proteínas. Las proteínas y TBARS se dosifican en el medio intracelular. Cálculo del porcentaje de protección de las membranas celulares : A partir del cálculo de TBARS en pmol/µg proteínas, la eficiencia protectora de diferentes productos contra la oxidación de lípidos membranarios se calcula como sigue: [TBARS control] - [TBARS (+productos) ] % de protección = [TABRS control] 3) Resultados - discusión Después de un tratamiento de 16 horas con los diversos productos a probarse, el modelo de tensión de radicales utilizado en este experimento (reacción de Fenton) induce una peroxidación lipídica importante en los fibroblastos L929.

Esta descarga masiva del radical hidroxilo OH° genera entonces una tensión oxidativa al nivel celular y especialmente al nivel de las membranas. Sin embargo, en este tipo de reacción oxidativa, los productos generados de la peroxidación lipídica se internalizan en las células y los TBARS se dosifican entonces en el medio intracelular. Los resultados obtenidos se presentan en la tabla II a continuación Tabla II: Análisis de la peroxidación lipídica La vitamina E, que constituye la molécula de referencia anti-radical, disminuye la peroxidación lipídica inducida por el complejo H20 -Fe2+/Fe3+, y protege muy eficientemente las membranas celulares (aproximadamente 56%) . El extracto insaponificable de pulpas de frutas de arganier preparado según el ejemplo 2 presenta una actividad anti-radicales a las concentraciones de 1 y 3 µg/ml (30 y 37% de protección de las membranas lipídicas, respectivamente) . El eritrodiol, molécula contenida en la fracción triterpénica del extracto insaponificable, presenta una buena actividad anti -oxidante con un efecto dependiente de la dosis. El eritrodiol es activo desde 0.3 µg/ml (33% de protección). El efecto anti-radical del eritrodiol s 3µg/ml es muy importante y comparable a la vitamina E. 4) Conclusión El modelo in vitro presentado en este estudio refleja las consecuencias debidas a una tensión oxidativa mayor sobre el principal objetivo celular que es la membrana plásmica. Así la dosis de la peroxidación lipídica constituye un buen marcador de la tensión oxidativa y permite la evaluación de la acción antioxidante, frente al radical hidroxilo, de los principios activos al nivel de la membrana celular. La vitamina E, molécula anti-oxidante, permite la validación de este modelo. En las condiciones experimentales, se observa que el extracto según la presente invención contiene el eritrodiol así como el eritrodiol mismo que posee un potencial antioxidante importante. Ejemplo 4: Análisis del efecto anti-radical del eritrodiol - análisis del daño genómico 1) Introducción El ADN es un objetivo del RLO que induce la modificación de la base (oxidación, nitración, desaminación: Guetens G. et al Cli. Lab. Sci . 2002; 39: 331-457), la formación de rupturas de hebra (sitios no básicos o ß-eliminación) y de puentes ADN-proteínas o ADN-hidroperóxidos . La alteración del material genómico induce una cascada de reacciones celulares (bloqueo de bifurcación de replicación, activación de las proteínas claves, detención en el ciclo celular) que termina en la inducción de mecanismos de reparación. Las bases modificadas por una tensión o estrés oxidativo se toman así a cargo mayoritariamente por el sistema de reparación de las bases o VER por reparación de escisión de bases (Friedberg E.C. et al DNA repair and mutagenesis, ASMPress; Washington DC 1995). Este sistema actúa rápida y eficazmente según tres etapas claves : 1. Reconocimiento de la base alterada; 2. Incisión y escisión de la lesión 3. Re-síntesis de la brecha Los RLO pueden ser producidos en cantidad tal que los sistemas de defensa y la reparación celular puedan ser saturados. Si los efectores de la apoptosis son activados, las células dañadas mueren. Pero en el caso donde las lesiones en el ADN son mal reparadas, puede tener generación de mutaciones deletéreas que estén entonces implicadas en la etapa de iniciación de la carcenogénesis . Es por eso que la incidencia biológica de una tensión o estrés oxidativo (mortalidad o mutagénesis) condiciona los acontecimientos a más largo plazo como el envejecimiento y el cáncer. Numerosos estudios han demostrado la fuerte correlación entre el envejecimiento y la acumulación progresiva e irreversible de los dominios oxidativos al nivel de las macromoléculas celulares. Muchos grupos de investigación han demostrado en el roedor, que las tasas de 8-0xoGuanina, medida en diferentes tejidos tales como la piel, aumentan con la edad (Tahara S. et al Mech . Ageiging Dev. 2001; 122:145-426). Los trabajos de Meccocci P. et al (Free Radie . Biol . Med. 1999; 26: 303-8) sobre el músculo esquelético en el hombre, muestran que las lesiones oxidantes en el ADN so en los lípidos se acumulan con la edad. El mismo equipo ha demostrado igualmente que en los sujetos aquejados de la enfermedad de Alzheimer, la tasa de bases oxidadas en el ADN de linfocitos y la tasa de antioxidantes en el plasma son significativamente más altos y más bajos respectivamente, que en los sujetos sanos (Meccocci P. et al Arch Neurol . 2002; 59: 794-8). 2) Objetivo Continuando con el ejemplo 3 y con el fin de controlar la actividad anti-radical del eritrodiol sobre otro modelo, los autores de la invención han analizado su poder protector frente a la alteración del ADN genómico inducido por una tensión oxidante, en comparación con el extracto insaponificable de las pulpas de frutas de arganier y de otras moléculas triterpénicas contenidas igualmente en dicho extracto . Se han elegido generar las lesiones de ADN por una tensión de H202 y de analizar indirectamente los daños así formados analizando la reacción de reparación. Para esto, se ha utilizado un equipo llamado prueba 3D por Detección del Daño del DNA (Salles B. et al Anal . Biochem . 1995; 232: 37-42 y Salles B. et al Biochemi e 1999; 81: 53-58) . La prueba 3D tiene por base la reparación de lesiones del ADN al medio de extractos celulares humanos purificados. En el transcurso de la etapa de reparación, un marcador se incorpora al ADN y esta incorporación, refleja cuantitativamente el número de lesiones reparadas, se revela enseguida por la quimioluminiscencia. 3) Metodología Productos probados : Los productos han sido evaluados sobre la línea de fibroblastos murinos L929. Las células se pre-tratan con los productos (Tabla III) durante 16 horas y enseguida son estimulados con H202 (peróxido de hidrógeno al 3&% - Ref. GIFRER - Laboratorire Gifrer Barbezat) a lOOµM durante 30 minutos . Tabla III: Presentación de soluciones probadas Prueba 3D: El principio es el siguiente: después del daño del ADN genómico (tratamiento oxidativo) , las células se lisan. El usado se deposita sobre una microplaca revestida con polilisina : 1. Adsorción de ADN 2. Incubación del ADN con un extracto proteico enriquecido con enzimas de reparación) y un conjunto de nucleótidos donde un nucleótido se marcó con la biotina (dUTP- Biotina) - Reparación de lesiones e incorporación en el ADN de nucleótidos marcados "dUTP-Biotina" 3. Incubación con un complejo enzimático "avidina- peroxidasa" - reconcimiento por la avidina de la dUTP- Biotina incorporada. 4. Adición de un sustrato de la peroxidasa luminiscente y cuantificación de la señal emitida proporcional al nombre de lesiones reparadas. El protocolo de realización de la prueba se sigue según las instrucciones del proveedor del equipo o kit (Prueba 3D Solycel - Ref: SFRIDN013 - AES Laboratoire) . Al final de la reacción, la placa se lee en un luminómetro (MITHRAS LB940 - BERTHOLD) . Cálculo del porcentaje de protección del ADN El rendimiento en seguida permite calcular, para cada concentración del producto probado, el % de protección contra la inducción de lesiones sobre el ADN por una tensión oxidativa (la intensidad de luminiscencia - o IL - explica la cantidad de lesiones del ADN) IL (H202) - IL (producto) % de protección del ADN = x 100 IL(H202) - IL (testigo) 4) Resultados y conclusión Los resultados obtenidos en el ejemplo 3 han mostrado que el eritrodiol presenta la actividad anti-radical más fuerte a 3µg/ml (6.78µM) . Esto es debido a que los autores ha elegido probar todos los triterpenos (lupeol, a-amirina, ß-amirina y eritrodiol) y el extracto insaponificable de pulpas de frutas de arganier a 3 µg/ml en la prueba 3D "Detección del Daño de ADN" . Dicho extracto insaponificable ha sido obtenido siguiendo el procedimiento del ejemplo 2. Los resultados obtenidos se presentan en la tabla IV abajo. Los valores indicados en esta tabla son los porcentajes de inhibición (o % de protección) de las lesiones en el ADN en consecuencia de un a tensión oxidativa exógena, con respecto a las células "testigo base" (100%) y a las células "tensionada por H202" (0%) .

Tabla IV: Protección del ADN por eritrodiol El tratamiento del H202 induce una fuerte proporción de oxidación al nivel de la guanina con formación en particular de la d-oxo-7, 8-dihidro-desoxiguanosina (8-OxoGuanina) (Dizdaroglu M. et al Arch . Biochem Biophys . 1991; 285: 388-390) . La prueba 3D muestra un fuerte aumento de luminiscencia después del tratamiento con H202, reflejan una fuerte actividad de reparación y como consecuencia una tasa importante de bases dañada en el ADN. El extracto insaponificable de pulpas de frutas de arganier protege eficazmente el ADNB frente a la tensión oxidativa .

El eritrodiol, la molécula contenida en dicho extracto insaponificable, a 3µg/ml presenta una muy buena actividad anti -oxidante con 99% de protección del ADN frente a la formación de lesiones oxidativas. Comparando las moléculas triterpénicas con concentración molar equivalente (aproximadamente 7µM) , es el eritrodiol que es el más activo. Ejemplo 5: Modelo de estudio in vitro del efecto de extracto insaponificable según la invención sobre la inducción de proteínas HSP72. 1) Bibliografía Diferentes trabajos han mostrado la pérdida de inductibilidad de las proteínas HSP72 luego del envejecimiento. En los pacientes maduros, la inducción de la proteína HSP72 por el calor se reduce de manera importante al nivel cutáneo (Muramatsu T. et al . Br. J". Dermatol . 1996; 134: 1035-1038). Por otra parte, Gustmann-Conrad A. et al. (Exp . Cell Res . 1998; 241:404-413) han mostrado que la inducción de la proteína HSP72 por una tensión térmica, disminuye significativamente en los fribroblastos que salen de la "piel de los sujetos maduros con respecto a aquellas que salen de los sujetos jóvenes. En este mismo estudio, se ha demostrado que el nivel de inducción de HSP72 se reduce igualmente en los fibroblastos (que salen de la piel joven) o en las líneas de fibroblastos (IMP-90) se vuelven senescentes en el curso de las divisiones celulares. Una primera tensión moderada sufre una inducción in vitro de las proteínas HSPs a fin que protejan la célula frente a las nuevas tensiones (Morris S.D. et al. J". Clin . Invest . 1996; 97: 706-12). El HSP72 es una proteína principal de la familia del HSP72, expresada en los queratinocitos y los fibroblastos cutáneos e inducibles por numerosos agentes tensionantes (calor, UV.. ) (Trauntinger F. et al. J. Invest . Dermatol . 1993; 101:334-38; Charveron M. et al. Cell . Biol . Toxicol . 1995; 11:161-65). 2) Protocolo experimental Los autores de la presente invención han elegido analizar el nivel de inducción, por una tensión térmica, de las proteínas HSP72 en los fibroblastos IMR-90 (línea fibroblástica) luego de la senescencia, y esto a fin de evaluar las propiedades "anti-edad" de un extracto de pulpas de fruta de arganier preparado según el ejemplo 2, ya sea conteniendo 10% de ß-amirina, 15% de eritrodiol y 20% de la mezcla de lupeol -a amirina. En un primer tiempo, los autores han puesto en su lugar y validado un modelo de envejecimiento celular que induce la senescencia de los fibroblastos por una tensión oxidativa. - Modelo de senescencia inducida: Los fibroblastos se dividen hasta un estado crítico que se llama la senescencia replicativa y que se asimila a un envejecimiento celular. Pero la senescencia puede igualmente ser inducida especialmente por una tensión oxidativa, si se trata de la "Senescencia Prematura Inducida por tensión o SIPS" (Dumont et al Free Radie . Biol . Med 2000; 28:361-373). Modelo utilizado: La inducción de la senescencia en la línea de fibroblastos IMR-90 jóvenes a sido puesta en evidencia al tratar las células 2h con el H202. 72 horas después de esta tensión, las células IMR-90 son senescentes. En un segundo tiempo, han mostrado la disminución de un nivel de inducción del HSP72 seguido por una tensión térmica, en los fibroblastos senescentes comparados con los fibroblastos jóvenes. Finalmente, se han evaluado las propiedades de un extracto de pulpas de fruta de arganier preparado según el ejemplo 2, sea conteniendo 10% de ß amirina, 15% de eritrodiol y 20% de mezcla de lupeol-a amirina sobre este modelo de senescencia. 3) Resultados La invención se comprenderá mejor y los objetivos, ventajas y características de esta aparecerán más claramente de la descripción que sigue y que se hace en referencia a los dibujos anexos en los cuales: - La figura 1 presenta el análisis de la tasa de inducción del HSP72 en los fibroblastos IMR-90 al nivel transcripcional y traduccional . - La figura 2 presenta el análisis por manchado Western de la tasa de proteínas HSP72 en las células IMR-90 tratadas con diferentes concentraciones del extracto de pulpas de fruta de arganier según la invención. - La figura 3 presenta el análisis semi-cuantitativo de la tasa de inducción de las proteínas HSP72 (normalizada por el nivel de expresión de la ß-actina) en los fibroblastos IMR-90 senescentes pre-tratados con diferentes concentraciones del extracto de pulpas de fruta de arganier según la invención. -Análisis de la inducción del HSP72 por una tensión o estrés térmico en el transcurso de la senescencia de los fibroblastos IMR-90: Las células cultivadas a 37°C se incuban 1 hora a 45°C y enseguida se incuban a 37 °C durante 2 horas (análisis de ARNm) o durante 4h (análisis de las proteínas) : - Expresión de la proteína (Manchado Western) Las proteínas intracelulares, extraídas de los fibroblastos, se analizaron por la técnica del manchado Western, utilizando un anticuerpo anti-HSP72 (anticuerpo monoclonal, CHEMICON y un sistema de revelación indirecta en luminiscencia. La membrana se analiza y la intensidad de las bandas se cuantifica por densitometría (Logiciel ImageMaster TotalLab AMERCHAM) . El nivel de expresión de HSP72 se normaliza por aquella de una proteína expresada de manera constitutiva, la ß-actina. La figura ÍA presenta el análisis semi-cuantitativo por manchado Western de la tasas de inducción de las proteínas HSP72 en los IMR-90 jóvenes (B) e IMR-90 senescentes (U) (senescencia inducida por H202) . Así, la figura ÍA muestra claramente que la tasa de proteínas HSP72 es inducida por una tensión térmica en los fibroblastos IMR-90 jóvenes. Esta inducción de HSP72 disminuye en los fibroblastos IMR-90 senescentes . • Expresión del ARNm (PCR en tiempo real) Los autores han analizado la expresión HSP72 al nivel transcripcional cuantificando los ARNm por la técnica de PCR en tiempo real. El nivel de expresión del gen de interés HSP72 se calcula en las muestras tratadas por una tensión térmica y las muestras testigo. El nivel de expresión del gen HSP72 se normaliza enseguida utilizando tres genes de referencia [ß-actina, GAPDH (deshidrogenasa de gliceraldehido-3-fosfato humana) y YWHAZ (polipéptido zeta de la proteína de activación de tirosina-3-monooxigenasa, triptófano-5-monooxigenasa) ] , donde la expresión es constitutiva. Finalmente, fijando el nivel de expresión en las muestras testigo en 1, entonces es posible determinar el factor de inducción del gen HSP72. La figura IB presenta el análisis por PCR en tiempo real de la tasa de inducción del ARNm HSP72 en el IMR-90 jóvenes (B) e IMR-90 senescentes (B) (senescencia inducida por H202) . La figura IB muestra claramente que la inducción del ARNm HSP72 es igualmente muy disminuida luego de la senescencia inducida de los fibroblastos IMR-90. - Análisis de la eficacia del extracto de las pulpas de frutas de arganier: Los autores de la invención han utilizado el modelo de senescencia inducida o SIPS (Senescencia prematura inducida por tensión o estrés) con la línea fibroblástica IMR-90 para evaluar el extracto de pulpas de fruta de arganier preparada según el ejemplo 2. Las células se han incubado con el extracto de pulpas de frutas de arganier a las concentraciones de 1 y 3 µg/ml durante 24 horas. Luego se les sube la tensión oxidativa induciendo la senescencia. Todos los tratamientos han sido comparados con un lote de células IMR90 "jóvenes" y un lote de células "senescentes" (senescencia inducida) no pre-tratadas por el extracto de pulpas de frutas de arganier. Tres días (72h) después de la tensión o estrés oxidativo, los HSP72 han sido inducidos por el calor. Finalmente, el ARN y las proteínas HSP72 se han analizado por PCR en tiempo real y manchado Western, respectivamente. La figura 2 presenta el análisis por manchado Western de las tasas de proteínas HSP72 en la células IMR-90 tratados con las diferentes concentraciones del extracto insaponificable preparado según el ejemplo 2. Las menciones "T" y "ST" significa respectivamente "Testigo" y "Tensión térmica o estrés térmico" . Los análisis A, B, C y D se refieren respectivamente a los fibroblastos IMR-90 jóvenes, los fibroblastos IMR-90 senescentes (senescencia inducida por H202) , los fibroblastos IMR-90 senescentes incubados con el extracto insaponificable a 1 µg/ml y finalmente los fibroblastos IMR-90 senescentes incubados con el extracto insaponificable a 3 µg/ml. La figura 3 presenta el análisis semi-cuantitativo de la tasa de inducción de las proteínas HSP72 (normalizado por el nivel de expresión de la ß-actina) en los fibroblastos IMR-90 senescentes pre-tratados con el extracto insaponificable a lµg/ml (C) y a 3µg/ml (D) . Se representan igualmente las tasas de inducción de proteínas HSP72 en los fibroblastos IMR-90 jóvenes (A) y en los fibroblastos IMR-90 senescentes (B) (senescencia inducida por H202) . Las figuras 2 y 3 muestran que no hay más inducción de las proteínas HSP72 en los fibroblastos IMR-90 que se vuelven senescentes, pero que el extracto de pulpas de frutas de arganier, a las concentraciones de 1 y 3 µg/ml, restaura la inducción del HSP72 por la tensión térmica. Finalmente, la tabla V siguiente da el factor de inducción (después de la normalización) del ARNm HSP72 en los fibroblastos senescentes pre-tratados con diferentes concentraciones del extracto de pulpas de frutas de arganier.

Tabla V: Factor de inducción Esta tabla confirma los resultados obtenidos al nivel transcripcional y muestra la restauración casi -total de la inducción del ARNm HSP72 por el extracto de pulpas de fruta de arganier. Esta es la concentración de 3µg/ml que este extracto es el más activo. 4) Conclusión Las proteínas HSP72 son las proteínas inducibles por numerosas tensiones (calor...) y están fuertemente implicadas en los procesos de respuesta adaptativa. Se reconoce que la inductibilidad de las proteínas HSP72, al nivel cutáneo y en otros tejidos, disminuye con la edad y especialmente luego de la senescencia celular. Además, se admite que el envejecimiento está asociado a una reducción de la respuesta en la tensión ambiental que genera las patologías ligadas a la edad. A partir de un modelo de senescencia inducida en los fibroblastos en cultivo, los autores han evaluado la capacidad del extracto de pulpas de fruta de arganier para modular la disminución de inducción del HSP72 por el calor. El conjunto de los resultados confirma por un lado que hay una fuerte disminución de la inducción de HSP72 (por una tensión térmica) en los fibroblastos senescentes en comparación con los fibroblastos jóvenes. Por otro lado, estos trabajos muestran que el extracto de pulpas de fruta de arganier, restaura la inducción de las proteínas HSP72 en los fibroblastos senescentes. En este modelo de estudio in vitro, el extracto de pulpas de frutas de arganier limita las consecuencias biológicas de la senescencia celular y entonces presenta las propiedades anti-envejecimiento.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES 1. El uso de un extracto insaponificable de pulpa vegetal que comprende una fracción triterpénica, caracterizado en que dicha fracción triterpénica comprende el eritrodiol, la a-amirina, la ß-amirina y el lupeol, para la preparación de un producto cosmético, farmacéutico o nutracéutico destinado a prevenir y/o tratar los desórdenes cutáneos asociados al envejecimiento cutáneo, la cantidad de eritrodiol esta comprendida entre 7 y 40% en peso del extracto insaponificable.
2. 2. El uso según la reivindicación 1, caracterizado en que la fracción másica de ß-amirina está comprendida entre 5% y 30% del extracto insaponificable.
3. 3. El uso según la reivindicación 1, caracterizado en que la suma de fracciones másicas de a-amirina y de lupeol está comprendida entre 10% y 50% del extracto insaponificable.
4. 4. El uso según la reivindicación 1, caracterizado en que la cantidad de dicho extracto en el producto cosmético final está comprendida entre 0.001% y 50%, preferentemente entre 0.01% y 10%, y aún más preferentemente entre 0.1 y 2% en peso del peso total de la preparación.
5. 5. El uso según la reivindicación 1, caracterizado en que dicho extracto se obtiene a partir de un vegetal elegido de la familia botánica de Sapotaceae o sapotáceas.
6. 6. El uso según la reivindicación 1, caracterizado en que dicho extracto se obtiene a partir de pulpas de frutas de arganier.
7. 7. El uso según la reivindicación 1, caracterizado en que los desórdenes cutáneos se manifiestan por las alteraciones de textura, de color, de transparencia de la piel y por la aparición de arrugas.
8. 8. El uso según la reivindicación 1, caracterizado en que los desórdenes cutáneos son consecutivos a una reducción o una parte de respuesta a la tensión o estrés ambiental .
9. 9. El uso según la reivindicación 8, caracterizado en que la tensión ambiental es causada por el sol, el tabaco.
10. 10. El uso según la reivindicación 1, caracterizado en que los desórdenes cutáneos son consecutivos a una reducción o una parte de inductibilidad de proteínas HSP72.
11. 11. El uso según la reivindicación 1, caracterizado en que el producto cosmético, farmacéutico o nutracéutico está bajo la forma oral o tópica, preferentemente bajo la forma tópica.
12. 12. El uso según la reivindicación 11, caracterizado en que la forma tópica se elige entre el grupo que comprende cremas, geles, pomadas y aerosoles.
13. 13. El uso según la reivindicación 11, caracterizado en que la forma oral se elige entre el grupo que comprende los comprimidos, cápsulas y polvos para suspensiones bebibles.