MX2008008237A

MX2008008237A - Metodos y reactivos para genotipificar hcv.

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Publication number: MX2008008237A
Application number: MX2008008237A
Authority: MX
Inventors: James Hnatyszyn; Marcellinus Gualbertus Hubertus Maria Beld; Toumy Guettouche; Remko Gouw; Carola Beatrijs Maria Van Der Meer
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics
Priority date: 2005-12-23
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2008-11-06
Also published as: WO2007076493A8; KR20080082662A; WO2007076493A2; US20070259339A1; WO2007076493A3; JP2009521235A; US8735063B2; AU2006330464A1; EP1963493B1; EP1963493A2; US20100196876A1; CA2638903A1; CN101341247A; BRPI0620445A2; NO20083233L; EP1963493A4

Abstract

La presente invención se dirige hacia métodos y reactivos para determinar el genotipo de una especie de virus de hepatitis C (HCV) presente en una muestra de prueba. La invención más particularmente concierne a mezclas de cebadores para amplificación y formación de secuencias, y a métodos de usar dichos cebadores, que son complementarios a una pluralidad de especies de HCV, y son capaces de generar información de secuencias de nucleótidos para una región de NS5b de HCV esto es, para cada especie, indicadora del tipo y/o sub-tipo, de la especie presente en la muestra.

Description

METODOS Y REACTIVOS PARA GENOTIPIFICAR HCV CAMPO DE LA INVENCION La presente invención generalmente se dirige a métodos y a materiales para renotificar una especie del virus de hepatitis C (HCV) , encontrada en una muestra de prueba .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Se estima que el virus de la hepatitis C (HCV) , infecta a aproximadamente 170 millones de personas en el mundo, y es responsable de enfermedades hepáticas crónicas y del riesgo creciente de cirrosis y de carcinoma hepatocelular . El tratamiento de HCV se limita principalmente a regímenes anti-virales , cuya eficiencia es grandemente influida por varios parámetros biológicos, tales como el genotipo del virus. Por consiguiente, la genotipificación del HCV ha sido usada ampliamente para predecir la respuesta a la terapia anti-viral y para optimizar la duración del tratamiento. También, la renotificación de HCV se ha convertido en una herramienta esencial para estudios epidemiológicos y para rastrear fuentes de contaminación por HCV. El genoma de ARN del HCV de múltiples hebras es de aproximadamente 9600 nucleótidos de extensión y codifica a al menos un macro de lectura abierto con aproximadamente 3010 aminoácidos. En células infectadas, esta lipoproteina es fragmentada en múltiples sitios por proteasas virales y celulares para producir proteínas estructurales y no estructurales (NS, Non-Structural) . Los HCV aislados se caracterizan por un alto grado de variabilidad genética debido a la falta de fidelidad de el ARN polimerasa dependiente del ARN del HCV, los cuales son codificados por el gen no estructural 5B (NS5B) . Además, como un resultado de la mutación o infección endógena por una pluralidad de especies, también da origen a especies quasi variables genéticamente de HCV en un paciente individual. Se han descrito seis genotipos de HCV, y más de cien sub-tipos. La variabilidad genética de HCV complica el proceso de, amplificación, formación de secuencias y de genotipificación . Estos proceso típicamente dependen del uso de cebadores y sondas de oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores para amplificación por PCR, cebadores para formación de secuencias, y sondas para sitio puntual) que son complementarias a y son capaces de hibridizar a las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes del genoma de HCV. Como un resultado del alto grado de variabilidad del genoma de HCV, los cebadores y las sondas de oligonucleótidos complementarios a una especie de HCV pueden no ser complementarios a otras especies. Por consiguiente, dichos cebadores y sondas deben de ser diseñados para especificidad a regiones muy conservadas.

Alternativamente, los ensayos deben de usar mezclas de cebadores y sondas degeneradas que sean complementarias a todas las especies. Algunos métodos de genotipificación se han enfocado sobre la región 5? No codificadora (5'NC). La región 5' no codificadora (NC) de HCV es muy conservada, aún contiene polimorfismos de tipo especifico que pueden ser utilizados para distinguir entre genotipos. A la fecha, la mayoría de los ensayos de genotipificación de la región 5'NC disponibles comercialmente se han basado en amplificación por PCR y en el análisis de fragmentos por RFLP o hibridización a sondas de oligonucleótidos . Estos tipos de ensayo son rápidos pero no tan seguros como los ensayos basados en la formación de secuencias. Por esta razón, se han propuesto regiones genómicas alternativas para uso en la genotipificación de HCV, incluyendo la región NS5B. La mayoría de los métodos directos y seguros de genotipificar HCV es secuenciar el genoma del virus en la región que sea suficientemente divergente entre varis especies para distinguir entre tipos y sub-tipos de virus. De manera igualmente importante, las bases de datos para análisis filogenético deben de estar fácilmente disponibles para analizar las secuencias generadas a partir de estas regiones. Ensayos de genotipificación de HCV basados en la formación de secuencias disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, el Equipo de Genotipificación TRUGENE HCV 5'NC (Bayer HealthCare) , el cual es un ensayo rápido basado en la formación de secuencias que utiliza la región 5'NC de HCV. Los datos de secuencias generadas por medio de este ensayo son directamente analizados utilizando una base de datos de la región 5'NC filogenética (programa de cómputo TRUGENE HCV 5'NC módulo v3.1.1). Previamente, las bases de datos de 5'NC han incluido secuencias de varias fuentes que nunca han sido completamente validadas y, en algunos casos, la asignación de sub-tipos para cepas particulares han sido discordantes cuando se analizaron secuencias de 5'NC o de NS5B. Hay una necesidad continua para mejorar los ensayos de HCV basados en la formación de secuencias, para mejorar la identificación de tipos y subtipos de HCV para propósitos de análisis clínicos e intervenciones terapéuticas .

SUMARIO DE LA INVENCION Generalmente, la presente invención está dirigida hacia métodos y reactivos para genotipificar una especie de virus de hepatitis C (HCV) encontradas en una muestra de prueba. Más particularmente, la presente invención se dirige hacia un método mejorado de amplificar y de secuenciar porciones de la región NS5B de una especie de HCV en una muestra y determinar su genotipo. Un aspecto de la invención concierne a un método para determinar el genotipo de una especie de virus de hepatitis C (HCV) en una muestra de prueba por formación de secuencias de al menos una porción de la región NS5B de HCV que, para cada una de la pluralidad de especies de HCV, es indicador del tipo y/o del subtipo de esa especie . En una modalidad, el método comprende (a) determinar la secuencia de nucleótidos de al menos una poción de la región NS5b de HCV indicadora del genotipo de dicha especie de HCV en la muestra de prueba, en donde la secuencia de nucleótidos correspondiente de una pluralidad de especies de HCV, es indicadora de un genotipo diferentes del de la especie de HCV; y (b) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región de NS5B determinada en (a) con el genotipo de dicha pluralidad de especies de HCV.

En otra modalidad, el método comprende (a) determinar la secuencia de nucleótido de al menos una porción de la región NS5B de HCV indicadora del genotipo de dicha especie de HCV presente en la muestra de prueba, en donde la secuencia de nucleótidos correspondientes de cada una de la pluralidad de especies de HCV que tengan 1, 2, 3, 4, 5, y 6 genotipos de HCV son indicadores de un genotipo diferente de esa especie de HCV; y (b) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región de NS5B determinada en (a) con uno de dichos 1, 2, 3, 4, 5, y 6 genotipos de HCV. En aún otra modalidad, el método comprende (a) determinar la secuencia de nucleótidos de al menos una porción de la región NS5B de HCV indicadora del genotipo o del subtipo de dicha especie de HCV presentes en la muestra de prueba, en donde la secuencia de nucleótidos correspondiente de cada especie de HCV que tengan 1, 2, 3, 4, 5, y 6 genotipos de HCV y cada uno de los sub-tipos de HCV expuestos en la Tabla 1, e sindicador de un genotipo y sub-tipos diferentes de la especie de HCV; y (b) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dichas porciones de la región NS5B determinada en (a) con uno de dichos 1, 2, 3, 4, 5, y 6 genotipos de HCV y uno de dichos sub-tipos de HCV expuestos en la Tabla 1.

En una modalidad particular de los métodos anteriores la porción de la región NS5B del HCV consiste prácticamente de la región desde aproximadamente la posición del nucleótido 8344 al aproximadamente 8547 de la SEC ID NO: 1. En otra modalidad particular de los métodos anteriores, la porción de la región NS5B de HCV consiste prácticamente de la región de la posición del nucleótido 8344 al 8547 de la SEC ID NO: 1. En otra modalidad, el método de la presente invención comprende (a) proporcionar una mezcla de cebadores de formación de secuencias de oligonucleótidos degenerados capaces de generar secuencias de nucleótidos de al menos una porción de la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV presentes en una muestra de prueba, en donde la secuencia de nucleótidos correspondiente de cada uno de dicha pluralidad de especies de HCV es indicador de un genotipo diferente de especies de HCV; (b) determinar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b indicadora del genotipo de dicha especies de HCV presente en la muestra de prueba; y (c) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b de dicha especie de HCV determinada en (b) con un genotipo de una de dicha pluralidad de especies de HCV.

En aún otra modalidad, el método comprende (a) proporcionar una mezcla de cebadores para formación de secuencias oligonucleótidos degenerados capaces de generar secuencia de oligonucleótidos de al menos una porción de la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV, en donde la secuencia de oligonucleótidos correspondiente de cada una de ducha pluralidad de especies de HCV es indicadora de uno de los 1, 2, 3, 4, 5 y 6 genotipos; (b) determinar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b indicadora del genotipo de dicha especie de HCV presente en la muestra de prueba; y (c) correlacionar la secuencia de nucleótido de dicha porción de la región NS5b de dicha especie de HCV determinada en (b) con uno de los 1, 2, 3, 4, 5 y 6 genotipos . En aún otra modalidad, el método comprende (a) proporcionar una mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótidos degenerados capaces de generar la secuencia de nucleótidos de al menos una porción de la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV, en donde la secuencia de nucleótidos correspondiente a cada uno de dicha pluralidad de especies de HCV es indicadora de uno de los 1, 2, 3, 4, 5. y 6 genotipos y uno de los sub-tipos expuestos en la Tabla 1; (b) determinar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b indicadora del genotipo y sub-tipo de dichas especies de HCV presentes en la muestra de prueba; y (c) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b de dichas especies de HCV determinadas en (b) con un genotipo y sub-tipo de HCV (por ejemplo, uno de los 1, 2, 3, 4, 5, y 6 genotipos de HCV y uno de los sub-tipos expuestos en la Tabla 1) . En una modalidad particular, la mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótidos degenerados comprenden las secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde aproximadamente el nucléotido 8256 a aproximadamente el 8278 [cebador para formación de secuencias -NS5b-Cy5.5 de CLIP], o su complemento, y las secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde aproximadamente el nucleótido 8611 a aproximadamente el 8633 (por ejemplo, cebador para formación de secuencias M-NS5b-Cys de CLIP) de la SEC UD NO: 1, o su complemento. En otra modalidad particular, la mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótidos degenerados comprende las secuencias de oligonucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleótido 8256 al 8278 (por ejemplo, el cebador para formación de secuencias M-NS5b-Cys5.5 de CLIP), o su complemento, y las secuencias de nucleotidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleotidos 8611 al 8633 (por ejemplo; el cebador para formación de secuencias M-NS5b-Cys) de CLIP) de la SEC ID NO: 1, o su complemento. En aún otra modalidad, la mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótidos degenerada comprende las secuencias de oligonucleótidos degeneradas definidas por una o más de las siguientes fórmulas, o complementos de las mismas: SEC I D NO: 1 : 5'-TAT GAY ACC CGC TGY TTY GAY TC-3'; y SEC I D NO: 2: 5'-VGT CAT RGC 1TC YGT RAA GGC TC-3'.

Otro aspecto de la invención concierne a un método para determinar el genotipo de una especie del virus de la hepatitis C (HCV) presente en una muestra de prueba por amplificación de al menos una porción de la región NS5b de HCV que, para cada una de la pluralidad de especies de HCV, es indicador del tipo y/o sub-tipo de esa especie. En una modalidad, el método comprende (a) proporcionar una mezcla de cebadores para PCR de oligonucleótidos degenerada que comprende las secuencias de oligonucleótidos degeneradas de la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde aproximadamente el oligonucleótido 8245 a aproximadamente el nucleótido 8269 (por ejemplo, cebadores en sentido directo FF1 y/o FF2) , o su complemento; y las secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde aproximadamente el nucleótido 8616 a aproximadamente el 8641 (por ejemplo cebadores en sentido contrario RR1), de la SEC ID NO: 1, o su complemento; y (b) amplificar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b. En una modalidad particular, la mezcla de cebadores para PCR de oligonucleótidos degenerada comprende las secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleótido 8256 al 8278 (por ejemplo, cebadores para formación de secuencias -NS5b-Cys5.5 de CLIP), o su complemento, y secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleótidos 8611 al 8633 (por ejemplo, cebadores para formación de secuencias M-NS-5b-Cys de CLIP) de la SEC ID NO: 1, o su complemento. En otra modalidad particular, la mezcla de cebadores para PCR de oligonucleótidos degenerada comprende las secuencias de oligonucleótidos degenerada definida por una o más de las fórmulas siguientes, o complementos de las mismas: SEC I D NO: 6: 5'- TGG SBT TYK CNT AYG AYA CYM GNT G - 3' SEC I D NO: 5: 5'- GAR TAY CTV GTC ATR GCI TCY GTR AA - 3' En aún otra modalidad particular, la mezcla de cebadores para PCR de oligonucleótidos degenerada comprende las secuencias de oligonucleótidos degeneradas definidas por una o más de las siguientes fórmulas, o complementos de las mismas: SEC ID NO: 3: 5 - TGG GGT TCK CGT ATG AYA CCC GC G - 3' SEC I D NO : 4 : 5'- TGG GGT TCK CTT ATG AYA CYM GIT G - 3 ' SEC ID NO: S: 5 - GAR TAY CTV GTC ATR GCI TCY GTR AA - 3' BREVE DESCIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1, es un diagrama esquemático que muestra el dominio NS5b de HCV y las regiones relevantes utilizadas en modalidades particulares de la invención. La Figura 2, muestra la secuencia de nucleótidos del dominio NS5b de HCV, como se expone en el No. de Acceso a GenBank M67463. Las regiones de cebadores son resaltadas y designadas en los márgenes. La Figura 2, corresponde a la SEC ID NO: 12.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones Aunque la terminología usada en esta solicitud es estándar en el arte, se proporcionan las siguientes definiciones de ciertos términos para confirmar la claridad. Unidades, prefijos, y símbolos pueden ser denotados en su forma aceptada SI. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos son escritos de izquierda a derecha en orientación 5' a 3' . Los intervalos numéricos citados en la presente son inclusive de los números que definen el intervalo e incluyen y son soporte de cada entero en el intervalo definido. Los aminoácidos pueden ser mencionados en la presente ya se por sus símbolos de tres letras conocidos comúnmente o por los símbolos de una letra recomendado por la Comisión de Nomenclatura IUPAC-IUBMB. Asimismo, los nucleótidos pueden ser mencionados por su código de una sola letra aceptado comúnmente. A menos que se indique de otra manera, los términos "un, una" se construyeron para querer decir "al menos uno de". La sección de encabezados usados en la presente es para propósitos organizacionales solamente y no se construyeron como limitantes del asunto descrito. Todos los documentos, o porciones de documentos, citados en esta solicitud, incluyendo pero no limitándose a patentes, solicitudes de patentes, artículos, libros, y tratados, son incorporados íntegra y expresamente como referencia para cualquier propósito. En el caso de cualquier discrepancia en las secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos en la solicitud, las figuras controlan . Como se usa en la presente, el término "amplificación" significa el proceso de aumentar la abundancia relativa de uno o más genes o fragmentos de genes específicos en una mezcla de reacción con respecto a otros genes. El término "que consiste esencialmente de" significa, cuando se usa en la presente con referencia a secuencias de nucleótidos específicas, la secuencia específica y cualquier secuencia adicional que no afecte materialmente la complementaridad de la secuencia y la habilidad de la secuencia para hibridizar a una pluralidad de tipos y subtipos de HCV. Como se usa en la presente, una "muestra" se refiere a cualquier sustancia que contenga o sospechosa de contener un ácido nucleico, tal como ARN o ADN, e incluye muestras de tejido o de fluido aislados de un individuo o individuos, incluyendo pero no limitándose a, por ejemplo, piel, plasma, suero, fluido espinal, fluido linfático, fluido sinovial, orina, lágrimas, células sanguíneas, órganos, tumores, y también a muestras de constituyentes de cultivo celular in vitro (incluyendo pero no limitándose a medio acondicionado que resulta del crecimiento de células en medio de cultivo, células recombinantes y componentes celulares). El término "nucleótido" significa los nucleótidos adenosina, citosina, guanina, y timina, son representados por sus códigos de una letra A, C. G, y T respectivamente. En representación de cebadores degenerados, el símbolo R, se refiere ya sea a G o a A, el símbolo Y se refiere ya sea a T/U o C, el símbolo M se refiere ya sea a A o a C, el símbolo K se refiere ya sea a G o a T/U, el símbolo S se refiere a G o C, el símbolo W se refiere ya sea a A o a T/U , el símbolo B se refiere a "diferente de A", el símbolo D se refiere a "diferente de C", el símbolo H se refiere a "diferente de G", el símbolo V se refiere a "diferente de T/U" y el símbolo N se refiere a cualquier nucleótido. El símbolo I representa inosina, la cual es una base neutra que generalmente emparejará con cualquiera de C, T, o A. En la especificación y reivindicaciones de esta solicitud, un cebador degenerado, se refiere a cualquiera de todas las combinaciones de bases seleccionadas y a ya sea secuencia de ADN o de ARN correspondiente (es decir, con T reemplazada por U) . Por consiguiente, un cebador degenerado puede representar una especie individual, o una mezcla de dos especies que caigan en las selecciones, o una mezcla de tres selecciones que caigan en las selecciones, y asi sucesivamente hasta una mezcla que contenga todas las combinaciones posibles. Los términos "acido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido", se refiere a cebadores, sondas, fragmentos oligoméricos a ser detectados, controles oligoméricos y oligómeros bloqueadores sin marcar y serán genéricos a polidesoxiribonucleótidos (que contengan 2-desoxi- D- ribosa) , a poliribonucleótidos (que contengan D- ribosa) , y a cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N- glicósido de una purina o pirimidina base, o purina o pirimidina bases modificadas. No se pretende distinguir entre el términi "acido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido", y estos términos serán usados indistintamente. Estos términos se refieren solamente a cualquiera de las estructuras primarias de la molécula. Por consiguiente, estos términos incluyen ADN de una o de doble hebra, asi como también ARN de una o de doble hebra. El oligonucleótido consiste de una secuencia de aproximadamente al menos 6 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 10 - 12 nucleótidos, y más preferiblemente al menos aproximadamente 15 - 25 nucleótidos correspondientes a una región de la secuencia de nucleótidos designada. El término "correspondiente a", como se usa en la presente para definir una secuencia de ácido nucleico en términos de una secuencia de nucleótidos de referencia, significa secuencias de nucleótidos que emparejan con toda o parte de la secuencia de referencia y secuencias de nucleótidos que son el complemento de toda o parte de la secuencia de referencia . El oligonucleótido no es necesariamente derivado físicamente de cualquier secuencia natural o existente pero puede ser generado en cualquier manera, incluyendo síntesis química, replicación de ADN transcripción en sentido contrario o una combinación de las mismas. Los términos "oligonucleótido" o "acido nucleico" están previstos para un polinucleótido de ADN o ARN, cADN genómicos, de origen sintético o semi-sintético los cuales en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o una porción del polinucleótido con el cual está asociado en la naturaleza; y/o (2) está ligado a un polinucleótido diferente de aquel del cual está ligado en la naturaleza; y (3) no se encuentra en la naturaleza . Porque los mononucleótidos son hechos reaccionar para hacer oligonucleótidos en una manera tal que el fosfato en 5' de un anillo mononucleótido pentosa está fijado al oxígeno en 3' de su vecino en una dirección vía una ligadura fosfodiéster, un extremo de un oligonucleótido es mencionado como el "extremo 5' " si su fosfato en 5' no está ligado al oxigeno en 3' de una anillo mononucleótido pentosa y como el "extremo 3'" si su oxigeno en 3' no está ligado en su fosfato en 5' de un anillo mononucleótido pentosa subsecuente. Como se usa en la presente, una secuencia de ácido nucleico, aún si es interna a un oligonucleótido más grande, también puede decirse que tiene extremos 5' y 3' . Cuando dos oligonucleótidos diferentes o no sobrepuestos fortalecen a diferentes regiones de la misma secuencia de ácido nucleico complementaria lineal, y el extremo 3' de unos puntos del oligonucleótido hacia el extremo 5' del otro, éste último puede ser llamado el oligonucleótido "desde el extremo 5' hacia el extremo 3' en el sentido de la hebra de ADN dupleto" y éste último el oligonucleótido "desde el extremo 3' hacia el extremo 5' en el sentido de la hebra de ADN dupleto". El término "cebador" puede referirse a más de un cebador y se refiere a un oligonucleótido, si se encuentra naturalmente, como en una digestión de restricción purificada, o producido sintéticamente, el cual es capaz de actuar como un punto de iniciación de síntesis a lo largo de una hebra complementaria cuando se coloca bajo condiciones en las cuales la síntesis de un producto de extensión del cebador el cual es complementario a una hebra de ácido nucleico es catalizado. Dichas condiciones incluyen la presencia de cuatro trifosfatos de desoxiribonucleósido diferentes y un agente de inducción de polimerización tal como ADN polimerasa o trasncriptasa en sentido contrario, en un regulador apropiado ("regulador" incluye sustituyentes que son co-factores, o que afectan al pH, fuerza iónica, etc.), y a una temperatura adecuada. El cebador es preferiblemente de una sola hebra para máxima eficiencia en amplificación, pero alternativamente puede ser de doble hebra, Si es de doble hebra, el cebador es tratado primero para separar sus hebras antes de ser usado para preparar los productos de extensión. Preferiblemente, el cebador es un oligodesoxiribonucleósido . El cebador debe de ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en la presencia del agente para polimerización. La longitud exacta de los cebadores dependerá de muchos factores, incluyendo temperatura y fuente del cebador y uso del método. Por ejemplo, dependiendo de la complejidad de la secuencia objetivo, el cebador oligonucleótido contiene 15 a 24 nucleótidos, aunque puede contener más o menos nucleótidos. Generalmente, moléculas de cebadores cortas requieren temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con el modelo. El término "cebador de extensión" significa una secuencia de polinucleótido que es complementaria a una secuencia modelo, y que es capaz de hibridizar y que extiende una secuencia bajo condiciones de la reacción en cadena de polimerasa. El término "complemento" y sus formas "complementarias" adjetivas relacionadas, cuando se usan con referencia a dos secuencias de ácido nucleico, significa que cuando dos secuencias de ácidos nucleicos son alineadas en asociación anti-paralela (con el extremo 5' de una secuencia emparejada con el extremo 3' de la otra secuencia) los nucleótidos bases de G y C de las secuencias son emparejadas, y los nucleótidos bases A y T correspondientes son emparejados. Ciertas bases no comúnmente encontradas en ácidos nucleicos naturales pueden ser incluidos en los ácidos nucleicos de la presente invención, e incluir, por ejemplo, inosina y 7-desasaguanina . El término "localización" o "posición" de un nucleótido en un locus genético significa el número asignado al nucleótido en el gen, generalmente tomado desde la secuencia de cADN de la secuencia genómica de un gen .

El término "cebador oligonucleótido" significa una molécula que consiste de más de tres desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos . La longitud exacta dependerá de muchos factores que se relacionan a la función y uso final del cebador oligonucleótido, incluyendo temperatura de la reacción de fortalecimiento, y la fuente y composición del cebador. Cebadores de amplificación deben de ser suficientemente largos para cebar la síntesis de productos de extensión en la presencia del agente para polimerización. El cebador oligonucleótido es capaz de actuar como un punto de iniciación para síntesis cuando es colocado bajo condiciones que inducen síntesis de un producto de extensión de cebador complementario a una hebra de ácido nucleico. Las condiciones pueden incluir la presencia de nucleótidos y un agente de inducción tal como una ADN polimerasa a una temperatura y pH adecuados. En modalidades preferidas, el cebador es un oligodesoxiribonucleótido de suficiente longitud para cebar la síntesis de un producto de extensión desde una secuencia específica en la presencia de un agente de inducción. En un aspecto de la presente invención, los cebadores oligonucleótidos son desde aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de largo, aunque un cebador puede contener más o menos nucleótidos. Los cebadores oligonucleótidos son preferiblemente de al menos 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos de largo. Más preferiblemente, los cebadores contendrán alrededor de 20 a 25 nucleótidos. La sensibilidad y la especificidad de los cebadores oligonucleótidos son determinadas por la extensión del cebador y la unicidad de secuencia en una muestra dada de ácido nucleico modelo. Los cebadores que son demasiado cortos, por ejemplo, pueden mostrar enlace no especifico a una amplia variedad de secuencias. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, técnicas de ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos que están en la experiencia en el arte. Dichas técnicas se explican a fondo en la literatura. Reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se efectúan de acuerdo a las especificaciones del fabricante o como se lograron comúnmente en el arte o como se describen en la presente. Las técnicas y procedimientos anteriormente mencionados se efectúan generalmente de conformidad con los métodos convencionales bien conocidos en el arte y como se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten en el transcurso de la presente especificación. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Olignonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. , 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, 1984); y una serie, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), cuyos contenidos se incorporan a la presente como referencia. El término "transcripción en sentido contrario" significa el proceso de generar un complemento de ADN en una molécula de ARN, y generalmente se logra con el uso de una enzima transcripatasa en sentido contrario. Un cebador puede ser usado para iniciar la polimerización; este cebador puede ser uno de un par cebador usado después para amplificación por PCR. La molécula de ARN es entonces separada del ADN copiado ("cADN") o degradada por una actividad ARNasa H de una enzima que permite asi que la segunda hebra de cADN sea generada por una ADN polimerasa dependiente del modelo. Este método se describe en las Unidades 3.7 y 15.4 de Current Protocols in Molecular Cloning, Eds. Ausubel, F. M. y colaboradores (John Wiley & Sons; 1995) , cuyos contenidos se incorporan a la presente como referencia.

El término "formación de secuencias" significa la determinación del orden de nucleótidos en al menos una parte de un gen. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, técnicas de ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos, las cuales están en la experiencia del arte. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se efectúan de acuerdo a las especificaciones del fabricante o como se lograron comúnmente en el arte o como se describen en la presente. Las técnicas y procedimientos anteriormente mencionados se efectúan generalmente de conformidad con los métodos convencionales bien conocidos en el arte y como se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten en el transcurso de la presente espcificación . Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a. Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Olignonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds . , 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, 1984); y una serie, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), cuyos contenidos sé incorporan a la presente como referencia. Fuente de ADN En un aspecto de la invención, el método comprende primero obtener del paciente una muestra un modelo de polinucleótido de doble hebra que abarca la mutación de interés. El modelo de polinucleótido de doble hebra puede comprender ADN genómico, un fragmento de ADN genómico o cADN transcrito en sentido contrario a partir de ARN. El modelo abarcará no solamente la mutación de interés, sino puede también abarcar la región que contenga el polimorfismo de extensión que da origen a quasi-especies múltiples . Un modelo de polinucleótido de doble hebra se preparará típicamente a partir de una muestra del paciente por tratamiento de una muestra del paciente que contenga ADN para elaborar todo o una porción del ADN en la muestra accesible para hibridización con cebador oligonucleótido, por ejemplo por lisis, centrifugación para remover los desechos celulares y digestión proteolítica para exponer el ADN. El modelo de ADN puede contener, por consiguiente, solamente ADN nuclear, solamente ADN mitocóndrico o alguna sub-fracción de ADN nuclear o mitocóndrico obtenido por aislamiento de una muestra de tejido. El modelo de ADN puede también ser preparado por conversión, por ejemplo, por transcripción en sentido contrario de una preparación de mARN total o el genoma de un ARN virus a cADN; ADN aislado a partir de una colonia bacteriana individual que se desarrolla solamente sobre una placa o desde un cultivo bacteriano enriquecido; y una preparación de ADN viral donde sustancialmente es aislado el genoma viral completo. El ADN puede ser preparado desde muestras de fluido, por ejemplo, sangre u orina o muestras de tejido por cualquiera de numerosas técnicas, incluyendo lisis, centrifugación para remover los desechos celulares y digestión proteolitica para exponer el ADN; precipitación de sal o extracción con K-fenol de la proteinasa en SDS estándar. Las muestras pueden ser preparadas usando equipos, por ejemplo, el Equipo para Aislamiento de ADN de Puré Gene (Gentra) . Amplificación de Acidos Nucleicos La presente invención incluye métodos y reactivos para amplificación de ADN para proporcionar una fuente abundante de ADN para formación de secuencias subsecuentemente . Típicamente, antes de formación de secuencias, se prepara un modelo de formación de secuencias primero por amplificación de una región de ADN que abarca la región objetivo a ser secuenciada. No es necesario que la secuencia a ser amplificada esté presente inicialmente en una forma pura; puede ser una fracción mínima de una mezcla compleja o una porción de secuencia de ácido nucleico. El ácido nucleico inicial puede contener más de una secuencia de ácido nucleico específico deseado, las cuales pueden ser iguales o diferentes. Por consiguiente, el proceso de la presente es útil no solamente para producir grandes cantidades de una secuencia de ácido nucleico específico, sino también para amplificar simultáneamente más de una secuencia de ácido nucleico específico diferente localizada sobre la misma o diferentes moléculas de ácido nucleico si están presentes más de una de las variaciones de pares base en la secuencia . La presente invención está dirigida a métodos y a reactivos, incluyendo cebadores de amplificación y para formación de secuencias, usados para genotipificar HCV. La presente invención utiliza métodos bien conocidos para amplificar secuencias de ácidos nucleicos específicos usando la técnica de la reacción en cadena de polimerasa (o PCR) o alguna otra metodología basada en extensión de cebadores. Los métodos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) son muy ampliamente conocidos en el arte. Dichos métodos se describen, por ejemplo, en las Patentes U.S. Nos. 4,683,195, 4,683,202, y 4,800,159; K.

Mullís, Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol., 51:263-273 (1986) ; y C. R. Newton & A. Graham, Introduction to Biotechniques : PCR, 2.Suo.nd. Ed. Springen-Verlag (new York: 1997), cuya descripción se incorpora a la presente como referencia. La PCR involucra el uso de pares de cebadores, uno para cada hebra complementaria del ADN dupleto (en donde la hebra codificadora es mencionada como la "hebra en el sentido" y su hebra complementaria es mencionada como la "hebra en anti-sentido" ) , que hibridizará en sitios localizados sobre uno u otro lado de una región de interés en un gen . La polimerización por extensión de cadena es entonces llevada a cabo en ciclos repetitivos para incrementar el número de copias de la región de interés exponencialmente . Para resumir brevemente, en la primera etapa de la reacción de PCR, las moléculas de ácidos nucleicos de la muestra son temporalmente calentadas, y luego enfriadas, a fin de desnaturalizar moléculas de doble hebra. Cebadores en sentido directo y en sentido contrario están presentes en la mezcla de reacción de amplificación a una concentración en exceso en relación a la muestra objetivo. Cuando la muestra es incubada bajo condiciones conducentes a hibridización y polimerización, los cebadores hibridizan a la hebra complementaria de la molécula de ácido nucleico en una posición 3' a la secuencia de la región que se desea amplificar que es el complemento de la secuencia cuya amplificación se desea. A partir de la hibridización, los extremos 3' de los cebadores son extendidos por la polimerasa. La extensión del cebador da como resultado la síntesis de una molécula de ADN que tiene la secuencia exacta del complemento de la muestra objetivo del ácido nucleico deseado. La reacción de PCR es capaz de amplificar exponencialmente las secuencias de ácidos nucleicos deseadas, con un con una duplicación cerca del número de moléculas que tengan la secuencia deseada en cada ciclo. Por consiguiente, al permitir los ciclos de hibridización, polimerización, desnaturalización, puede lograrse un incremento exponencial en la concentración de la molécula de ácido nucleico deseada. Puede usarse el polinucleótido amplificado como el modelo para una reacción de formación de secuencias. Gelfand y colaboradores han descrito una enzima termoestable, "Taq polimerasa", derivada del organismo Thermus acuaticus, el cual es útil en este proceso de amplificación (ver las Patentes U.S. Nos. 4,889,818; 5,352,600; y 5,079,352 las cuales se incorporan a la presente como referencia) . Se conocen y están disponibles para los expertos en la materia técnicas de amplificación alternativas, tales como NASBA, 3SR, Qb Replicasa, y Amplificación en Cadena Ramificada. El término "RT-PCR" se refiere generalmente a la amplificación que incluye una etapa de transcripción en sentido contrario para permitir la amplificación de secuencias de ARN. Preparación de Patrones de Amplificación de Polinucleótidos La presente invención concierne a la amplificación y formación de secuencias de HCV y en formas variables. El método de la presente invención puede emplear, por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo ARN mensajero, dichos ADN o ARN pueden ser de una sola hebra o de doble hebra. Además, puede utilizarse un híbrido de ARN-ADN que contiene una hebra de cada uno. Pueden emplearse también una mezcla de estos ácidos nucleicos, o pueden así emplearse los ácidos nucleicos producidos a partir de una reacción de amplificación previa en la presente usando cebadores iguales o diferentes. La secuencia de ácido nucleico específico a ser amplificada puede ser solamente una fracción de una molécula más grande o puede estar presente inicialmente como una molécula discreta, de modo que la secuencia específica constituya el ácido nucleico completo. No es necesario que la secuencia a ser amplificada esté presente inicialmente en una forma pura; puede estar en una fracción mínima de una mezcla compleja o una porción de secuencia de ácido nucleico. El ácido nucleico inicial puede contener más de una secuencia de ácidos nucleicos específicos que pueden ser iguale so diferentes. Por consiguiente, el proceso de la presente es útil no solamente para producir grandes cantidades de una secuencia de ácidos nucleicos específicos, sino también para amplificar simultáneamente más de una secuencia de ácidos nucleicos específicos localizados en moléculas iguales o diferentes si más de una de las variaciones de pares base está presente en la secuencia.

Los ácidos nucleicos patrón pueden obtenerse a partir de cualquier fuente, por ejemplo, a partir de plásmidos tales como pBR322, a partir de ARN o ADN clonados, o a partir de ARN o ADN naturales de cualquier fuente. El ADN y el ARN pueden ser extraídos de sangre, material de tejidos o células amnióticas por medio de una variedad de técnicas tales como las descritas por Maniatis y colaboradores, Molecular Cloning (1983), 280-281. Las células pueden ser usadas directamente sin purificación del ácido nucleico si están suspendidas en regulador hipotónico y calentadas a aproximadamente 90 -100 °C, hasta que tenga lugar la lisis celular y dispersión de los componentes intracelulares , generalmente aproximadamente 1 a 15 minutos. Después de la etapa de calentamiento los reactivos de amplificación pueden ser añadidos directamente a las células lisadas. El método de detección de células directo puede ser usado sobre linfocitos de sangre periférica y amniocitos. El ácido nucleico objetivo contenido en la muestra estará inicialmente en la forma de ARN, y es preferiblemente transcrito en sentido contrario en cADN, y luego es desnaturalizado, usando cualquier método de desnaturalización adecuado incluyendo medios físicos, químicos, o enzimáticos, los cuales son conocidos por el experto en la materia. Un medio físico preferido para separación de hebras involucra calentar el ácido nucleico hasta su desnaturalización completa (> 99 %) . La desnaturalización térmica típica involucra variar la temperatura desde aproximadamente 80 °C a aproximadamente 105 °C, por variación de los tiempos desde unos cuantos segundos a minutos. Como una alternativa a la desnaturalización, el ácido nucleico objetivo puede existir en una forma de una sola hebra en la muestra, tal como, por ejemplo, ADN o ARN virales de una sola hebra. Las hebras de ácidos nucleicos desnaturalizados son entonces incubadas con cebadores oligonucleótidos pre-seleccionados , y, opcionalmente, un oligonucleótidos marcado (mencionado en la presente como una "sonda") para propósitos de detectar la secuencia amplificada) bajo condiciones que facilitan el enlace de los cebadores y sondas a las hebras de ácidos nucleicos individuales. Como es sabido en el arte, los cebadores son seleccionados de modo que su posición relativa a lo largo de una secuencia dupleto es tal que un producto de extensión sintetizado a partir de un cebador, cuando el producto de extensión es separado de su patrón (complemento) , sirve como un patrón para la extensión del otro cebador para producir una cadena replicada de extensión definida. Amplificación de HCV Un aspecto de la presente invención concierne a un método para determinar el genotipo de una especie de virus de hepatitis C (HCV) presente en una muestra de prueba por amplificación de al menos una porción de la región NS5b de HCV que, para cada una de una pluralidad de especies de HCV, es indicador del tipo y/o del subtipo de esa especie. En una modalidad, el método comprende (a) proporcionar una mezcla de cebadores de PC oligonucleótidos degenerados que comprenda secuencias de nucleótidos degenerados complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde aproximadamente el nucleótido 8245 al aproximadamente 8269 a aproximadamente 8269 (por ejemplo, cebadores FF1 y/o FF2 en sentido directo) , o su complemento, y secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde aproximadamente el nucleótido 8616 a aproximadamente 8641 (por ejemplo, cebadores RR1 en sentido contrario) de la SEC ID NO: 1, o de su complemento; y (b) amplificar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b. En una modalidad particular, la mezcla de cebadores para PCR oligonucleótidos degenerados comprende secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleótido 8256 a 8278 (por ejemplo, cebadores para formación de secuencia CLIP M-NS-5b-Cys) o su complemento; y secuencias de nucleótidos degenerados complementaria a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleótido 8611 al 8633 (por ejemplo, cebadores para formación de secuencias -NS5b-Cys5) CLIP de la SEC ID NO: 1, o su complemento. En otra modalidad particular, la mezcla de cebadores para PCR de oligonucleótidos degenerados comprende secuencias de oligonucleótidos degenerados definidos por una o más de las siguientes fórmulas, o complementos de las mismas: SEC ID NO: 6:·: 5'-TGG SBT TY C T AYG AYA CYM GNT ü — 3' SEC ID NO: 5: : 5'- GAR TAY CTV GTC AT GCI TCY GTR AA - 3' En aún otra modalidad particular, la mezcla de cebadores para PCR de oligonucleótidos degenerados comprende secuencias de oligonucleótidos degenerados definidas por una o más de las fórmulas siguientes, o complementos de las mismas: SEQ ID TM0:3: 5'- TGG GGT TC CGT ATG AYA CCC GCT G - 3' SEQ ID N0:4: 5r- TGG GGT TCK CIT ATG AYA CY GIT G ~ 3' SEQ ID N0:5: 5'- GAR TAY CTV GTC ATR GCI TCY GTR AA ~ 3' Formación de secuencias de ácidos nucleicos La amplificación de ADN como se describió anteriormente dará como resultado una fuente abundante de ADN para formación de secuencias. Los patrones de polinucleótidos preparados como se describió anteriormente son secuenciados usando cualquiera de los numerosos métodos disponibles y conocidos por los expertos en el arte de formación de secuencias de nucleótidos . Numerosos métodos se conocen y están disponibles para los expertos en el arte para formación de secuencias de nucleótidos, cualquiera de los cuales puede ser usado en el método de la presente invención. Un método bien conocido de formar secuencias es el método de "terminación de cadena" primero descrito por Sanger y colaboradores, PNAS (U.S.A.) 74 (12): 5468-5467 (1977) y se detalla en la literatura del producto Sequenase® 2.0 (Amersham Life Science, Cleveland) y más recientemente elaborado en la Patente Europea EP-B1-655506, cuyos contenidos se incorporan todos a la presente como referencia. En este proceso, el ADN a ser secuenciado es aislado, convertido en de una sola hebra, y colocado en cuatro recipientes. En cada recipiente están los componentes necesarios para replicar la hebra de ADN, los cuales incluyen una ADN polimerasa dependiente del patrón, una molécula de cebador corto complementario al sitio de iniciación de formación de secuencias de ADN a ser secuenciado y trifosfatos de desoxiribonucleótidos para cada una de las bases A, C, C y T, en un regulador conducente a hibridización entre el cebador y el ADN a ser secuenciado y la extensión de cadena del cebador hibridizado. Además, cada recipiente contiene una pequeña cantidad de un tipo de trifosfato de didesoxiguanosina ("ddG"), trifosfato de didesoxicitosina ("ddC") , trifosfato de didesoxitimidina ("ddT". En cada recipiente, cada pieza del ADN aislado es hibridizado con un cebador. Los cebadores son entonces extendidos, una base a la vez para formar un nuevo polímero de ácido nucleico complementario al ADN patrón. Cuando un didesoxinucleótido es incorporado en el polímero de extensión, se previene al polímero de extensión adicional. Por consiguiente, en cada recipiente, un grupo de polímeros extendidos de longitud específica se formó, lo cual es indicador de las posiciones del nucleótido correspondiente al didesoxinucleótido en ese recipiente. Estos grupos de polímeros son entonces evaluados usando electroforesis sobre gel para determinar la secuencia. La formación de secuencias de polinucleótidos puede efectuarse usando ADN ya sea de una sola hebra o de doble hebra. El uso de polimerasa para extensión de cebadores requiere un ADN patrón de una sola hebra. En modalidades preferidas, el método de la presente invención usa ADN de doble hebra a fin de obtener la confirmación de la hebra opuesta confirmadora de los resultados de secuenciación . ADN patrones de doble hebra puede ser secuenciado usando desnaturalización ya sea alcalina o térmica para separar los dos ADN patrones complementarios en hebras individuales. Durante la polimerización, cada molécula del ADN patrón es copiado una vez como la hebra extendida del cebador complementario. El uso de ADN polimerasa termoestable (por ejemplo, Taq, Bst, Tth o Vent ADN polimerasa) facilita la ciclización repetida de ADN patrones de doble hebra en la reacción de secuenciación a través de períodos alternos de desnaturalización térmica, fortalecimiento de cebador, extensión y terminación didesoxi. Este proceso de ciclización efectivamente amplifica pequeñas cantidades de ADN patrón alimentados para generar suficiente patrón para secuenciar.

La formación de secuencias puede efectuarse también directamente en productos de reacción de amplificación por PCR. Aunque la clonación de ADN amplificado es relativa, totalmente secuenciada en sentido directo de productos de PCR facilita y acelera la adquisición de información de secuencias. Mientras que la reacción de PCR produce un producto amplificado discreto, será responsable de dirigir la formación de secuencias. En contraste a métodos donde el producto de PCR es clonado y un solo clón es secuenciado, el procedimiento el cual la secuencia de productos de PCR es analizado directamente generalmente no es afectado por el alto coeficiente de error comparativamente de taq ADN polimerasa. Los errores probablemente se distribuyen estocásticamente en toda la molécula. Por consiguiente, la mayoría del excedente del producto amplificado consistirá de la secuencia correcta. La secuenciación directa de productos de PCR tiene la ventaja sobre la secuenciación de los productos de PCR clonados en que (1) es fácilmente estandarizado porque es proceso enzimático simple que no depende del uso de células vivientes, y (2) solamente una secuencia individual necesita ser determinada para cada muestra. Los métodos de amplificación usados en la presente invención pueden también ser usados simultáneamente conjuntamente con la formación de secuencias. Los métodos para amplificación simultánea y formación de secuencias son ampliamente conocidos en el arte, e incluyen amplificación y secuencia acopladas (CAS) (descrita por Ruano y Kidd, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 88 (7): 2815-2819 (1991), y en la Patente U.S. No. 5,427, 911, la cual se incorpora a la presente como referencia) , y la secuenciación y amplificación por CLIP (descritas en la patente U.S. No. 6,007,983, y en J. Clin. Microbiology 41(4), 1586-1593 (Abril de 2003) la cual se incorpora a la presente como referencia. Los fragmentos de amplificación por PCR sometidos a secuenciación por CLIP previamente generados para amplificación por PCR simultánea y secuenciación directa. En secuenciación CAS, se trata una muestra en una primera etapa de reacción con dos cebadores y es amplificada por numerosos ciclos para lograr la amplificación de 10,000 a 100, 000. Se añade entonces ddNTP durante la fase exponencial de la reacción de amplificación, y la reacción es procesada por ciclos térmicos adicionales para producir fragmentos de secuenciación terminados en cadena. El proceso CAS requiere una adición intermedia de reactivos (los reactivos de ddNTO) , los cuales introducen la oportunidad de error o de contaminación e incrementa la complejidad de cualquier aparato que pudiera ser usado para automatización. La metodología CAS es por consiguiente preferiblemente combinada con la formación de secuencias por CLIP, la cual somete fragmentos de amplificación por PCR a amplificación por PCR simultánea y formación de secuencias directa. La amplificación y formación de secuencias simultáneas usando el método CLIP® puede lograrse, por ejemplo, usando los reactivos descritos en la presente, bajo condiciones similares a las descritas en equipos disponibles comercialmente, tales como el equipo para genotipificación de HCV de TRUGENE® (Bayer HealthCare LLC) . En aspectos particulares, la presente invención concierne a la secuenciación de HCV. El ADN patrón de doble hebra usado en el método de la presente invención puede derivarse de, por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo ARN mensajero, el cual puede ser de una hebra o de doble hebra. Además, el ADN patrón puede estar en al forma de un híbrido de ADN-ARN que contiene una hebra de ADN y una hebra de ARN. Puede emplearse también una mezcla de cualquiera de estos ácidos nucleicos, o pueden utilizarse los ácidos nucleicos producidos a partir de una reacción de amplificación previa en la presente usando cebadores iguales o diferentes. La secuencia de ácidos nucleicos específica a ser amplificada puede ser solamente una fracción de una molécula más grande o puede estar presente inicialmente como una molécula discreta, de modo que la secuencia especifica constituye el ácido nucleico completo . Genotipificación de HCV La presente invención incluye un nuevo método y reactivos para genotipificar HCV en una muestra sospechosa de contener o que se sabe que contiene HCV. La presente invención se dirige hacia el problema anteriormente mencionado, proporcionando cebadores que abarcan una región de HCV. Los cebadores de formación de secuencias de la presente invención consisten de oligonucleótidos específicos para la región HS5b de HCV, los cuales pueden ser usados para amplificar y secuenciar una porción de HCV. De conformidad con métodos conocidos por los expertos en la materia, se usa una muestra obtenida de un individuo sospechoso de estar infectado con HCV para recuperar ARN viral, ya sea en la forma de ARN o de ADN de HCV viral obtenido de la muestra es transcrita en sentido contrario a cADN. El cADN patrón es entonces amplificado, usando la Reacción en Cadena de la Polimerasa o algún otro método basado en extensión de cebador. El fragmento amplificado resultante es entonces secuenciado inicialmente con un grupo de cebadores que abarcan la región NS5b deseada de HCV usando métodos de formación de secuencias por ciclo o la formación de secuencias bi-direccional de CLIP®. Un aspecto particular de la presente invención es un método para amplificar y genotipificar una porción de la región NS5b de HCV en una muestra sospechosa de contener HCV. Formación de Secuencias de HCV Generalmente, la presente invención se dirige a métodos y reactivos mejorados para genotipificar una especie de virus de hepatitis C (HCV) encontrada en una muestra de prueba. En ciertos aspectos de la invención, la invención concierne a un método de secuenciar una porción de la región HS5b de una especie de HCV en una muestra y de determinar su genotipo. Generalmente, la invención concierne a un método para determinar el genotipo de una especie del virus de hepatitis C (HCV) presente en una muestra de prueba por medio de la formación de secuencias de al menos' una porción de la región HS5b de HCV que, para cada una de la pluralidad de especies de HCV, es indicadora del tipo y/o sub-tipo de esa especie. La presente invención también incluye un método y cebadores para determinar la secuencia de la región NS5b de HCV, o una porción de las mismas. Los cebadores de formación de secuencias de la presente invención incluyen ambos cebadores en sentido directo y en sentido contrario, los cuales pueden ser marcados con una marca detectable. Para la mayoría de los instrumentos para formación de secuencias comunes, es deseable una marca fluorescente, aunque podría también emplearse otros tipos de marcas incluyen coloreada, cromogénica, fluorogénica (incluyendo quimioluminiscente ) y radiomarcas. La combinación de cebadores puede incluir otros reactivos apropiados para transcripción en sentido contrario, amplificación o formación de secuencias, y puede, por supuesto incluir material genético de HCV para análisis.

Aunque los cebadores de formación de secuencias de la presente invención descritos posteriormente son seleccionados preferiblemente de entre cebadores que tengan la misma secuencia que se describe posteriormente, se contempló que la presente invención incluye secuencias degeneradas que tengan la especificidad y función equivalentes, las cuales pueden ser diseñadas y construidas de conformidad con la experiencia en el arte. Específicamente los cebadores de formación de secuencias incluyen fragmentos de los cebadores anteriores de 15 o más nucleótidos. Los cebadores de formación de secuencias pueden también incluir fragmentos de los cebadores anteriores que tengan 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos. El diseño y construcción de dichas secuencias degeneradas son bien conocidos por los expertos en el arte. Porque los cebadores de formación de secuencias, opuestamente a cebadores de amplificación, no pueden mezclarse juntos si no tienen la misma localización para la base 3' , solamente se ilustran posteriormente posiciones de bases degeneradas especificas, aunque es para comprender que la localización 3' puede también ser modificada. Por ejemplo, la extensión 5' puede ser cambiada para incluir regiones de conservación de secuencias mayores o para modificar la temperatura de fusión y la severidad del enlace. Se prefiere un grupo de cebadores no degenerados si el coeficiente de éxito se encuentra suficiente con los cebadores primarios. Las condiciones de reacción pueden también afectar significativamente los resultados. Las modificaciones potenciales de cebadores de formación de secuencias se ilustran en las secciones y ejemplos siguientes.

En una modalidad, el método de la invención incluye primero determinar la secuencia de nucleótidos de al menos una porción de la región NS5b de HCV indicadora del genotipo de dicha especie de HCV. La porción de la región NS5b de HCV que es indicadora de su genotipo será la misma región que corresponde a la secuencia de nucleótidos de una pluralidad de especies de HCV que es indicador del genotipo de cada una de las especies de HCV. Por consiguiente, un aspecto de la invención es la identificación de una región que es común entre las especies de HCV que es indicadora del tipo y/o sub-tipo de la especie de HCV particular. La formación de secuencias de esta región de cualquier especie de HCV facilita asi la determinación del tipo y sub-tipo de esa especie correlacionando la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b determinada en la etapa anterior con el genotipo de una de una pluralidad de especies de HCV de genotipo/secuencia conocidos. En otra modalidad, el método comprende (a) determinar la secuencia de nucleótidos de al menos una porción de la región NS5b de HCV indicadora del genotipo de dicha especie de HCV, en donde la secuencia de nucleótidos correspondiente de cada especie de HCV que tengan 1, 2, 3, 4, 5 y 6 genotipos es indicador del genotipo de dicha especie; y (b) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b determinada en (a) con uno de los 1, 2, 3, 4, 5 y 6 genotipos . En aún otra modalidad, el método comprende (a) determinar la secuencia de nucleótidos de al menos una porción de la región NS5b de HCV indicadora del genotipo y sub-tipo de dicha especie de HCV, en donde la secuencia de nucleótidos correspondiente de cada especie de HCV que tenga 1, 2, 3, 4, 5 y 6 genotipos, y cada uno de los subtipos expuestos en la Tabla 1, es indicadora del genotipo y sub-tipo de dicha especie; y (b) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b determinada en (a) con uno de los 1, 2, 3, 4, 5, y 6 genotipos de HCV y uno de los sub-tipos expuestos en la Tabla 1. En una modalidad particular del método anterior, la porción de la región NS5b de HCV consiste esencialmente de la región desde aproximadamente la posición del nucleótido 8344 a aproximadamente 8547 de la SEC ID NO: 1. En otra modalidad particular de los métodos anteriores, la porción de la región NS5b de HCV consiste de la región de la posición del nucleótido 8344 a 8547 de la SEC ID NO: 1. En otra modalidad, el método de la presente invención comprende (a) proporcionar una mezcla de cebadores de formación de secuencias de oligonucleótidos degenerados capaces de generar la secuencia de nucleótidos de al menos una porción de la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV, y en donde la secuencia de nucleótidos correspondiente de cada una de dicha pluralidad de especies de HCV es indicador del genotipo de dicha especie; (b) determinar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b indicadora del genotipo de dicha especie; y (c) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b de dicha especie de HCV determinada en (b) con un genotipo de una de dicha pluralidad de especies de HCV. En aún otra modalidad, el método comprende (a) proporcionar una mezcla de cebadores de formación de secuencias de oligonucleótidos degeneradas capaces de generar la secuencia de nucleótidos de al menos una porción de la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV, en donde la secuencia de nucleótidos correspondiente de cada una de la pluralidad de especies de HCV es indicador de uno de los 1, 2, 3, 4, 5 y 6 genotipos de HCV; y (b) determinar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b indicadora del genotipo de dicha especie; y (c) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b de dicha especie de HCV determinada en (b) con uno de los 1, 2, 3, 4, 5, y 6 genotipos de HCV. En aún otra modalidad, el método comprende (a) proporcionar una mezcla de cebadores de formación de secuencias de oligonucleótidos degenerados capaces de generar la secuencia de oligonucleótidos de al menos una porción de la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV, en donde la secuencia de nucleótidos correspondiente de cada una de dicha pluralidad de especies de HCV es indicador de uno de los 1, 2, 3, 4, 5 y 6 genotipos de HCV y uno de los subtipos expuestos en la Tabla 1; (b) determinar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b indicadora del genotipo de dicha especie; y (c) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b de dicha especie de HCV determinada en (b) con el genotipo y el sub-tipo de HCV (por ejemplo, uno de los 1, 2, 3, 4, 5, y 6 genotipos y uno de los sub-tipos expuestos en la Tabla 1) · En una modalidad particular, la mezcla de cebadores de formación de secuencias de oligonucleótidos degenerados comprende secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde aproximadamente el nucleótido 8256 a aproximadamente el 8278 (por ejemplo, el cebador de formación de secuencias por CLIP -NS5b-Cy5.5), o su complemento, y secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde aproximadamente el nucleótido 8611 a aproximadamente el 8633 (por ejemplo, cebador de formación de secuencias por CLIP M-NS5b-Cy5) de la SEC ID NO: 1, o su complemento.

En otra modalidad particular, la mezcla de cebadores de formación de secuencias de oligonucleótidos degeneradas comprende secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleótido 8256 al 8278 (por ejemplo, el cebador de formación de secuencias por CLIP M-NS5b-Cy5.5) , o su complemento, y secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleótido 8611 al 8633 (por ejemplo, el cebador de formación de secuencias por CLIP -NS5b-Cy5 ) de la SEC ID NO: 1, o su complemento . En aún otra modalidad particular, la mezcla de cebadores de formación de secuencias de oligonucleótidos degenerados comprende las secuencias de oligonucleótidos degenerados definida por una o más de las fórmulas siguientes, o complementos de las mismas.

SEC ID NO: 1 : S'-TAT GAY ACC CGC TGY TTY GAY TC-3'; y SEC ID NO: 2: 5'-VGT CAT RGC UC YGT RAA GGC TC-3'.

Pueden utilizarse otras variaciones de las secuencias anteriores para permitir la detección de otras variantes de HCV.

Ejemplo 1 - Genotificación de NS5b de HCV por Formación de Secuencias El siguiente ejemplo describe un protocolo de laboratorio para producir la secuencia bi-direccional de un fragmento de 204 pares de bases en la región NS5b del virus de la hepatitis C para el propósito de determinar el genotipo y el sub-tipo. Generalmente, el ARN del HCV viral es extraído de la muestra de plasma usando un Mini Equipo para ARN Viral Qiagen QIAmp como describe el fabricante. Resumiendo, los especímenes de ARN extraído son transcritos en sentido contrario usando hexámeros aleatorios . Después de la síntesis de cADN, 10 µ? del patrón de cADN son amplificados usando cebadores específicos para generar un amplicón de 398 pares de bases. Después de amplificación por PCR se efectuó una reacción de formación de secuencias por CLIP con el cebador teñido. Ambas hebras de las secuencias de la reacción por CLIP del ADN simultáneamente usando cebadores en sentido directo (en el sentido) y en sentido contrario (anti-sentido) cada uno marcado con diferentes colorantes fluorescentes (Cy 5.5, Cy 5; reactivos de extensión en cadena, y uno de cuatro trifosfatos didesoxinucleótido terminadores de cadena (ddNTPs) : trifosfatos de didesoxiadenosina (ddATP) , didesoxicitidina (ddCTP) , didesoxiguanosina (ddGTP) , o didesoxitimidina (ddTTP) . La reacción es iniciada con la adición de la muestra y un ADN polimerasa termoestable con una alta afinidad por ddNTPs. Como la mezcla de reacción es ciclizada térmicamente, los cebadores hibridizan a ADN patrón y son extendidos, luego usualmente terminados en alguna parte a lo largo de la secuencia de ADN objetivo. Cuatro reacciones por CLIP produjeron ambas secuencias en sentido directo y en sentido contrario del objetivo entre los dos cebadores de CLIP. La reacción procedió hasta 40 ciclos generando altos niveles de productos de reacción terminados en cadena a partir de cada cebador. Después de la terminación del programa de ciclización, se añadió solución Colorante de Carga de Detención a cada tubo de reacción y la reacción se calentó para separar los fragmentos de ADN de doble hebra. Una fracción de cada reacción es entonces cargada sobre la parte superior de un cartucho icroCel™ 500 que contenia un gel de poliacrilamida polimerizada vertical en capa fina que tenia una matriz formada de tamaño de poro especifico. El gel de poliacrilamida contiene una alta concentración de urea para mantener los fragmentos de ADN en un estado desnaturalizado de una sola hebra. Una solución regulada mantiene contacto con ambas partes superior y fondo del gel ultra fino. Se aplicó un campo eléctrico de alto voltaje, forzando los fragmentos de ADN cargados negativamente a migrar a través del gel hacia el ánodo. La velocidad de migración de los fragmentos de ADN está relacionada con el tamaño de los poros formados por la matriz de poliacrilamida y el tamaño del fragmento de ADN, con los fragmentos más pequeños que migran más rápido. Cerca del fondo del gel de poliacrilamida, un haz de rayos láser excita al colorante fluorescente ligado a los fragmentos de ADN que se mueven al pasar el láser, y los detectores miden la cantidad de luz y la longitud de onda producida por el colorante fluorescente. Esta medición luminosa es entonces colectada por el secuenciador y transmitida a una estación de trabajo que almacena los datos. Cada reacción de secuenciación requiere cuatro bandas, una por cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos terminadores de cadena (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) . Las secuencias de CLIP en sentido directo y en sentido contrario se combinaron y compararon a la secuencia de una secuencia de referencia "mejor emparejada" (W) . Los operadores revisaron la alineación a la posición marcada y editaron las bases que fueron necesarias. El programa de cómputo prepara un reporte de NS5b de HCV por cada muestra.

Transcripción en sentido contrario (síntesis de cADN) El cADN es sintetizado a partir de ARN genómico derivado de la muestra de conformidad con el protocolo siguiente . Los reactivos de RT descritos posteriormente (excepto el inhibidor ARNasa y SuperScript) son sometidos a vórtice y microcentrifugado para recuperar volumen. Se preparó la Mezcla Maestra para RT de NS5b de HCV, usando volúmenes calculados de conformidad con la fórmula siguiente : Mezcla Maestra para RT de NS5b de HCV Reactivo para RT Conc . Volumen/ Final muestra (µ?) Agua libre de nucleasa 3.9 Regulador II para para PCR (10X) IX 2.5 Solución de gC12 (25 mM) 5 mM 5.0 dNTO' s (100 mM) 8 mM 2.0 Hexámeros aleatorios 60 pg/µ? 1.0 Inhibidor de ARNasa (20 U/pl) 0.4 U/µ? 0.50 Transcriptasa en sentido contrario 0.8 U/µ? 0.10 SuperScript III Reactivo para RT total 15.00 Los reactivos para RT (15 µ?) se alicuotaron en cada tubo para PCR marcado. Los tubos son transferidos a la campana de aire con anhídrido carbónico del área postamplificación. Los extractos de ARN control y de muestra se retiraron del congelador para descongelar a temperatura ambiente. El extracto de ARN descongelado (10 µ?) es añadido al tubo apropiado que contenía el reactivo para RT. El reactivo y el ARN se mezclaron por bandeja por ligeros golpes. Los tubos se colocaron en un termociclizador programado para efectuar la etapa siguiente Programa para RT de NS5b de HCV Las muestras para RT se retiraron del termociclizador y se almacenaron a 4 °C. Amplificación por PCR Se efectuó la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como sigue. Se prepararon los tubos para PCR y se marcaron para muestras. Los reactivos para PCR descritos posteriormente (excepto la enzima AmpliTaq Gold) se sometieron a vórtice y se microcentrifugaron para recuperar volumen. Se prepararon las mezclas de cebadores degeneradas, los cuales son diseñados para amplificación múltiple de especies de HCV relevantes clínicamente, que tengan las siguientes secuencias de nucleótidos: Cebador para PCR en sentido directo (FF-1) : 5'- TGG GGT TCK CGT ATG AYA CCC GCT G-3' (SEC ID NO: 7) Cebador para PCR en sentido directo (FF-2): 5'- TGG GGT TCK CIT ATG AYA CYM GIT G-3' (SEC ID NO: 8) Cebador para PCR en sentido contrario (RR1) : 5?- GAR TAY CTV GTC ATR GCI TCY GTR AA-3' (SEC ID NO: 9) Se preparó una Mezcla Maestra para PCR usando la hoja de trabajo para volúmenes de reactivos. Los volúmenes se calcularon de conformidad con la fórmula siguiente : Mezcla Maestra para PCR de NS5b de HCV Agua libre de nucleasa 23.25 Regulador II para PCR (10X) 0.8X 4.00 Solución de MgC12 (25 mM) 1 mM 2.00 µ? -NS5B-FF1 (10 mM) 0.3 µ? 1.50 (Continuación) La Mezcla Maestra para PCR (40 µ?) es alicuotada en cada uno de los tubos para PCR marcados. Se añadió cADN de RT (10 µ?) a tubos marcados apropiadamente que contenían el reactivo para PCR, y los tubos se colocaron en un termociclizador programado para efectuar las siguientes etapas: Programa para PCR de NS5b de HCV No . de Tiempo Temp. Proceso ciclos °C 1 10 min. 95 Activación por AmpliTaq 45 30 seg 94 Desnaturalización 45 30 seg 48 Fortalecimiento 45 1 min. 68 Extensión 1 10 min 68 Extensión final 1 Todo el 4 Retención ciclo Se retiraron las muestras para PCR del termociclizador, y pueden ser almacenadas a 4 °C por hasta dos semanas o sometidas a formación de secuencias por CLIP, como se describió posteriormente. Formación de Secuencias por CLIP Se prepararon mezclas de cebadores de formación de secuencias degeneradas, los cuales son diseñados para multi-secuenciar especies de HCV relevantes clínicamente, que tengan las siguientes secuencias de nucleótidos: Cebador por CLIP en sentido directo: 5'- Cy5.5 TAT GAY ACC CGC TGY TTY GAY TC-3' (SEC ID NO: 10) Cebador por CLIP en sentido contrario: Cy5- 5'- VGT CAT RGC ITC YGT RAA GGC TC- 3' (SEC ID NO: 11). El número necesario de tubos con tira de PCR y tapas se conjuntaron en una bandeja y se colocaron en un bloque frió. Un tubo de 0.5 mi es marcado para cada muestra y control y se colocaron en bloque frío. Los reactivos para CLIP (excepto la enzima Thermo Sequenase) se retiraron del congelador, y se descongelaron a temperatura ambiente. Cada componente (excepto la enzima Thermo Sequenase) es sometido a vórtice y centrifugado rápidamente para recuperar volumen. Usando una pipeta ajustable de 10 µ?, se transfirieron directamente 3 µ? de la mezcla terminadora de CLIP apropiada al fondo de la columna de pocilios respectiva en cada uno de los tubos para PCR.

Se hizo una dilución 1:10 de la enzima Thermo Sequenase en Regulador de Dilución para Thermo Sequenase. Se preparó la Mezcla Maestra por CLIP usando volúmenes de reactivo calculados de conformidad con la fórmula siguiente : Mezcla Maestra por CLIP para NS5b de HCV Reactivo para CLIP Conc . Volume Final n/ muestr a (µ?) Agua libre de nucleasa 6.5 Equipo para formación de Secuencias Cebador IX 2.50 Colorante 7-desaza-dGTP Cy5Cy5.5 (100 pruebas) Regulador para Dilución Thermo Sequenasa (520 mi) Enzima Thermo Sequenasa (57 mi) Regulador para formación de secuencias (320 µ?) Mezcla de Terminación A (375 µ?) Mezcla de Terminación C (375 µ?) Mezcla de Terminación G (375 µ?) Mezcla de Terminación T (375 µ?) Colorante para Carga de Detención (2750 µ?) Cebador de CLIP en sentido directo M-NS5B 0.4 µ? 2.50 Cebador de CLIP en dirección contraria, M-NS5B 0.1 µ? 2.50 DMSO 8 % 2.00 Enzima Thermo Sequenasa (dilución 1:10) U/0.512 µ? 4.00 Reactivo para CLIP total 20.00 Se alicuotaron 20 µ? de Mezcla Maestra de CLIP en cada tubo marcado y se transfirieron a tubos que contenían reactivos para CLIP. El amplicón de PCR (2 µ?) es añadido a los tubos apropiados que contenían la Mezcla Maestra de CLIP, se sometió a vórtice brevemente y se microcentrifugó para colectar el volumen en el fondo del tubo. La mezcla de CLIP (5 µ?) es añadida a cada uno de los 4 tubos terminadores en el bloque frío. Se efectuó la reacción de formación de secuencias/amplificación por CLIP en un termociclizador de conformidad con el protocolo siguiente: CLIP para NS5b de HCV Se retiraron los tubos del termociclizador y se añadió Colorante de Carga de Detención (6 µ?) a cada tubo, y se sometió a vórtice para mezclar. Los tubos se regresaron al termociclizador y se sometieron a condiciones de desnaturalización, como sigue: Desnaturalización de NS5b de HCV Se retiraron los tubos del termociclizador y se almacenaron o sometieron a electroforesis sobre gel, como se describe posteriormente. Se efectuó la electroforesis sobre gel usando un Secuenciador de Torre de Lectura Prolongada, como se describe por el fabricante, usando los ajustes de control del secuenciador: Temperatura de Gel (°C) 60 °C Voltage del gel (V) 1800 V Energía Láser (%) 50 % Cronómetro (Intervalo de Muestreo) 0.5 seg. Cronómetro (Duración de la corrida) 50 min Se asignaron ensayos con información de muestra y control .

Ejemplo 2 - Evaluación de las Características de Funcionamiento de la genotipificación por Formación de Secuencias de NS5b de HCV. Las características del funcionamiento del ensayo de genotipificación fueron evaluadas, con base en ensayos de genotipificación sustancialmente como se describieron anteriormente en el Ejemplo 1, usando los reactivos siguientes . Reactivos Específicos para NS5b de HCV Descripción # de Lote -NS5b-FFl 10/27/04 M-NS5b-FF2 12/27/04 -NS5b-RRl 10/27/04 -NS5bSes-Cy5.5 10/27/04 M-NS5bSeq-Cys 10/27/04 Propósito General de los Reactivos Descripción # de Lote Regulador II para PCR E10896 25 m de gC12 E10900 100 mM de dNTP 36227107050 Hexámeros aleatorios F06662 Inhibidor de ARNasa F07872 SuperScript III para RT 1232439 (Continuación) Se usaron las muestras siguientes: Muestras A B C D E F 1 Acrometrix 1 Acrometrix 2b Acrometrix 2 Acrometrix 3a Acrometrix 3 Acrometrix 4a Acrometrix 4 Acrometrix Muestras (Continuación) A B C D E F 5a Acrometrix 5 Acrometrix 6a Acrometrix 6 Acrometrix lala 1 MP1 Millenium lala la MP2 Millenium lala la MP3 Millenium lala la MP4 Millenium lala la MP5 Millenium lblb Ib MP6 Millenium lblb Ib MP7 Millenium lblb Ib MP8 Millenium lblb 1 MP9 Millenium lblb Ib P10 Millenium 2 2b 2 2b MP11 Millenium 2 2b 2 2b MP12 Millenium 2 2b 2 2b MP13 Millenium 2 2b 2 2b P14 Millenium 2 2b 2 2b MP15 Millenium 3a3a 3a MP16 Millenium 3a3a 3a MP17 Millenium 3a3a 3d MP18 Millenium lala la MP19 Millenium (Continuación) A B C D E F 4 4 4a MP20 Millenium 4c/4d/ 4a MP21 Millenium 4c/4d 3a3a 3a MP22 Millenium 4h 4 4a MP23 Millenium 5a5a 5a MP24 Millenium 5a5a 5a MP25 Millenium 1A GP1A-C2 10, 000 B.C.A.

IB GP1B-A2 10, 000 B.C.A. 2A 9810067 2,292, 000 B.C.A. 2A GP2A-A2 10, 000 B.C.A. 2A GP2A-B2 10, 000 B.C.A. 2A GP2A-C2 10, 000 B.C.A. 2B GP2B-A2 10, 000 B.C.A. 3A 3A 3-3A 30, 049, 850 B.C.A. 4A GP4A-A2 10, 000 B.C.A. 4A GP4a-B2 10, 000 B.C.A- (Continuación) B C D E F 4A GP4A-C2 10, 000 B.C.A. 5A (S) 1-5A 9, 745, 338 B.C.A. A GP6A-A2 10, 000 B.C.A. A GP6A-A3 5,000 B.C.A. A 2-6A 11, 168, 451 B.C.A. (24485) 6A(S) GP6A-C2 10, 000 B.C.A. 6A(S) GP6A-C3 5, 000 B.C.A. 4A 14682 1, 326, 000 Teragenix A 15038 2, 522, 000 Teragenix A 20759 8, 112, 000 Teragenix 7C HCVGTP- 17, 628, 000 Teragenix 004c#l 9B HCVGTP- 10, 660, 000 Teragenix 004c#2 8C HCVGTP- 45,240, 000 Teragenix 004c#3 6B HCVGTP- 1, 237, 000 Teragenix 004c#4 7C HCVGTP- 31,824,000 Teragenix 004c#5 (Continuación) B.C.A. = Bayer Clinical Affair S = Sequetech d.n. = diluyente negativo c.n. = Control negativo A = Genotipo de HCV (LiPA TMA LiPA) B = Genotipo de HCV (5'NC de TRUGENE) C = Genotipo de HCV (NS5b) D = Identificación del Espécimen E = Carga viral (c/ml) F = Proveedor Análisis de Precisión Analítica A fin de determinar la precisión analítica de los métodos y reactivos de la invención, se efectuó un análisis usando un grupo de 25 elementos que comprenda los genotipos 1 a 5, un grupo de 6 elementos que comprenda los genotipos 1 a 6, un grupo de 12 elementos que comprenda los genotipos 4 a 10, y 15 muestras clínicas adicionales que comprendan los genotipos 1 a 6 y los resultados se compararon al genotipo previo. Se genotipificaron muestras usando la metodología descrita en el Ejemplo 1, anterior, y se compararon con el genotipo de muestras iguales, como se caracterizaron previamente ya sea por LiPA o el genotipificador de 5'NC de TruGene u otro método para NS5b como se detalló en la sección de muestras, para determinar la precisión analítica. Los resultados de este análisis se resumen en la tabla siguiente: Datos de Precisión Analítica Identificación Genotipo esperado Genotipo de de la Muestra (nomenclatura nueva) NS5b de BRTL MP1 la la MP2 Ia la MP3 la la MP4 la Ia MP5 Ib Ib MP7 Ib Ib MP8 Ib Ib MP9 Ib Ia P10 Ib Ib MP11 2b 2b MP12 2b 2b MP13 2b 2b MP14 2b 2b MP15 2b 2b MP16 3a 3a MP17 3a UG rpt 3a MP18 3a 3a MP19 la la MP20 4a 4a MP21 4a 4a (Continuación) Identificación Genotipo esperado Genotipo de de la Muestra (nomenclatura NS5b de BRTL nueva) MP22 3a UG(hets)rpt 3a MP23 4a 4a MP24 5a 5a MP25 5a 5a Acrometrix 1 Ib Ia Acrometrix 2 2b 2b Acrometrix 3 3a 3a Acrometrix 4 4 4a Acrometrix 5 5a 5a Acrometrix 6 6a UG HCVGTP-004c#l 7c(6f) UG HCVGTP-004c#2 9b(6i) 6i HCVGTP-004c#3 8c (6n) 6n HCVGTP-004c#4 6b 6b HCVGTP-004c#5 7c (6f) UG HCVGTP-004a#l 10a/3k) 3k HCVGTP-004a#2 8c (6n) 6n HCVGTP-004a#3 10a (3k) 3k HCVGTP-004a#4 9b(6i) 6i (Continuación) Identificación de la Genotipo Genotipo Muestra esperado de NS5b (nomenclatura de BRTL nueva) 14682 4a 4a 15038 5a 5a 20759 6a UG GP1A-C2 (10,000 c/ml) la Ia GP1B-A2 (10,000 c/ml) Ib Ia rpt la 9810067 (2,292,000 c/ml) 2a 2a GP2A-A2 (10,000 c/ml) 2a 2a rpt 2a GP2A-B2 (10,000 c/ml) 2a 2a rpt 2a GP2A-C2 (10,000 c/ml) 2a 2a GP2B-A2 (10,000 c/ml) 2b 2b rpt 2b 3-3A (30,043,850 c/ml) 3a 3a GP4A-A2 (10,000 c/ml) 4a 4a GP4A-B2 (10,000 c/ml) 4a 4a 2-6A (24485) (11,168,451 6a UG c/ml) GP4A-C2 (10, 000 c/ml) 4a 4a l-5a (9, 745, 338 c/ml) 5a 5a GP6A-A2 (10,000 c/ml) 6a UG GP6A-C2 (10,000 c/ml) 6a UG Un total de 58 muestras para precisión analizadas produjeron 51 resultados de genotipos de NS5b. 51 de 51 o 100 % de muestras genotipificables con NS5b produjeron un genotipo concordante con el genotipo previamente determinado a nivel de tipo. 48 de 51 muestras fueron concordantes a nivel de ambos tipo y sub-tipo, y 3 de 51 muestras fueron concordantes al nivel de tipo solamente (las tres fueron Ib por LiPA y la por NS5b) . 7 muestras (5 genotipos 6a y 2 genotipos 7c) fallaron la amplificación y fueron incapaces de ser genotipificados por NS5b. Los datos anteriores demuestran que la precisión del ensayo de genotipificación de la invención es superior a otros ensayos disponibles comercialmente . El ensayo mostró 100 % de concordancia con resultados de genotipificación previos al nivel del tipo para 51 muestras que fueron genotipificables con NS5b. Siete muestras que no fueron genotipificables con NS5b fueron excluidas de esta fase de la evaluación. 7 muestras no genotipificables se repitieron en la Fase 2 de la evaluación . Un grupo alterno de cebadores para RT - PCR está en desarrollo para amplificar el genotipo 6a y 7c, fue subsecuentemente diseñado y analizado, como se describe posteriormente en conexión con el análisis en la Fase 2.

Análisis de Reproductibilidad A fin de determinar la reproductibilidad del ensayo de genotipificación de NS5b de HCV y reactivos de la invención, un total de 22 muestras que comprenden los genotipos 1 a 10 fueron analizadas por dos operadores en dos corridas separadas y se compararon los resultados por concordancia al nivel del tipo y del sub-tipo. Los resultados de controles positivos sobre cada una de las ocho corridas se compararon también. Datos de Reproductibilidad de Operador a Operador Identificación Genotipo de NS5b Genotipo de NS5b de la muestra del Operador 1 del Operador 2 HCVGTP-004c#l UG UG HCVGTP-004c#2 6a 6a HCVGTP-004c#3 6a 6a HCVGTP-004c#4 6b 6b HCVGTP-004c#5 UG UG HCVGTP-004a#l 3k 3k HCVGTP-004a#2 6n 6n HCVGTP-004a#3 3k 3k HCVGTP-004a#4 6i 6i 14682 4a 4a 15038 5a 5a (Continuación) Datos de Reproductibilidad de Corrida a Corrida Identificación de la muestra Genotipo Genotipo de esperado NS5b de BRTL Corrida de Control Positivo 1 Ib Ib Corrida de Control Positivo 2 Ib Ib Corrida de Control Positivo 3 Ib Ib Corrida de Control Positivo 4 Ib Ib (Continuación) Se analizaron separadamente 22 muestras por dos operadores, que produjeron 16 genotipos de NS5b. Los datos anteriores demuestran que el ensayo de genotipificación de NS5b dio como resultado 16/16 o 100 % de concordancia de genotipos de NS5b tanto al nivel del tipo como del sub-tipo entre dos operadores, asi como también entre dos corridas. Seis muestras (4 genotipos 6a y 2 genotipos 7c) fueron incapaces de ser amplificados o genotipificados por ambos operadores. La reproductibilidad de Corrida a Corrida: 100 % de concordancia entre 16/16 o 100 % de conformidad con los genotipos de NS5b a ambos niveles de tipo y de sub-tipo entre dos operadores, asi como también entre dos corridas. 6 muestras (4 genotipos 6a y dos genotipos 7c fueron incapaces de ser amplificados o genotipificados por ambos operadores. Reproductibilidad Corrida a Corrida: 100 % de concordancia entre 8 réplicas de control positivo a partir de 8 corridas. Análisis de Sensibilidad A fin de determinar el nivel de sensibilidad del ensayo de genotipificación, se preparó también un grupo de diluciones de los genotipos 1-10 como se detalla a continuación . Grupo de Diluciones para Sensibilidad de NS5b de HCV Genotipo c/ml # de # de réplicas Nominal réplicas genotipificables probadas la 5, 000 3 3/3 la 1, 000 6 3/6 la 500 6 0/6 2b 5, 000 3 3/3** 2b 1,000 6 6/6** 2b 500 6 4/6 3 1, 000 3 3/3 4 1, 000 3 0/3 5 1, 000 3 0/3 6 1, 000 3 0/3 6b(004c#4 2, 423* 3 0/3 7c004c#l 258* 3 0/3 (Continuación) *Las diluciones del grupo de sensibilidad elaboradas con base en valores del Certificado de Análisis suministrado por el proveedor. Cargas virales subsecuentes determinadas por cADN fueron usadas para recalcular el valor nominal para estos elementos del grupo de sensibilidad. **Esta muestra es confirmada como un 2b por LiPA y genotipificación de 5'NC de HCV de TruGene y genotipos como Ib con genotipificación de NS5b. Se enviará a laboratorio de referencia para pruebas adicionales para resolver la discrepancia de genotipo. Los datos anteriores indican que el ensayo de genotipificación para NS5b de HCV satisface los criterios para sensibilidad aceptable para los genotipos 1 a 5, cucando muestras de los genotipos 1 a 5 de HCV fueron genotipificados reproducible y precisamente a 1,000 c/ml (129 Ul/ml) . El ensayo de genotipificación para NS5b de HCV sin embargo, no funcionó consistentemente para muestras del genotipo para el genotipo 6 de HCV. Muestras del genotipo 6 de HCV no fueron genotipificables consistentemente a 1, 000 c/ml (192 Ul/ml) . Por consiguiente, debido a las consecuencias al preparar las diluciones de sensibilidad para los genotipos 6 a 10, la sensibilidad a 1, 000 c/ml no puede ser determinado a partir de estos datos. El ensayo de genotipificación de NS5b es por consiguiente preciso a 1,000 c/ml para los genotipos 1 a 5 con consistencia variable. Ejemplo 3 - Evaluación de las Características de Funcionamiento de la genotipificación para NS5b de HCV por Formación de Secuencias. Análisis de Precisión Analítica Un sub-grupo de las muestras para validación de la precisión de la Fase 1 que consiste de un grupo de 6 elementos que comprenden los genotipos 1 a 6, un grupo de 12 elementos que comprende los genotipos 4 a 10, 4 muestras clínicas adicionales que comprenden los genotipos 4, 5, y 6 serán analizadas y los resultados serán comparados al genotipo previo. Las muestras fueron previamente caracterizadas ya sea por LiPA o bien por genotipificación de 5'NC de TruGene u otro método de NS5b como se detalla en la sección de muestras. Datos de Precisión Analítica Identificación Genotipo Genotipo de NS5b de la Muestra esperado de BRTL HCVGTP-004c#l 7C (6f ) 6f HCVGTP-004c#2 9B(6i) 6i HCVGTP-004c#3 8C (6n) 6n HCVGTP-004c#4 6B 6b HCVGTP-004c#5 7C (6f ) 6f HCVGTP-004a#l 10a (3k) 3k HCVGTP-004a#2 8C (6n) 6n HCVGTP-004a#3 10A(3k) 3k HCVGTP-004a#4 9B(6i) 6i 14682 4A 4a 15038 5A 5a 20759 6A 6a (Continuación) Los datos anteriores indican que la precisión del ensayo de genotipificación de NS5b de HCV es 100 % concordante con el nivel tipo para todas las muestras, incluyendo dos muestras 7c y cuatro muestras 6a que fallaron previamente. Análisis de reproductibilidad Los resultados de controles positivos de cada una de las cuatro corridas se compararon, como sigue: Datos de Reproductibilidad Los datos anteriores muestran 100 % de concordancia entre 4 réplicas de control positivo de 4 corridas. Análisis de Sensibilidad Se preparó un grupo de diluciones de los genotipos 1 a 6 como se detalla a continuación: Datos de Sensibilidad Identificación c/ml # de # de réplicas del Genotipo Nominal réplicas genotipificables probadas la (5,000) 5, 000 3 3/3 la (1,000) 1, 000 3 1/3 2b (5,000) 5, 000 3 3/3* 2b (1,000) 1, 000 3 2/3* 3 (1,000) 1, 000 3 3/3 (Continuación) *Está confirmada esta muestra como una 2b por LiPA y genotipificación de 5'NC de HCV de TruGene y genotipos como el Ib con NS5b. Se envió una muestra de referencia a al laboratorio para pruebas adicionales para resolver la discrepancia del genotipo. Este ensayo dio como resultado genotipos reproducibles y precisos a 1,000 c/ml (192 UI/ral) para los genotipos 1 a 5, asi como también genotipos reproducibles y precisos a 5,000 c/ml (962 Ul/ml) para el genotipo 6.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.- Un método para determinar el genotipo de especies del virus de la hepatitis C (HCV) presentes en una muestra de prueba, caracterizado porque comprende: (a) determinar la secuencia de nucleótidos de al menos una porción de la región NS5b de HCV indicadora del genotipo de dicha especie de HCV presente en la muestra de prueba, en donde la secuencia de nucleótidos correspondiente de una pluralidad de especies de HCV, es indicadora de un genotipo diferente del de la especie de HCV; (b) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b determinada en (a) con el genotipo de una de dicha pluralidad de especies de HCV. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la porción de la región NS5b de HCV consiste prácticamente de aproximadamente la posición del nucleótidos 8344 a aproximadamente 8547 de la SEC ID NO: 1.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la porción de la región NS5b de HCV consiste prácticamente de la región de aproximadamente la posición del nucleótido 8344 al 8547 de la SEC ID NO: 1.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la porción de la región NS5b de HCV consiste prácticamente de la región de la posición del nucleótido 8344 al 8547 de la SEC ID NO: 1.

4. - Un método para determinar el genotipo de una especie de virus de la hepatitis C (HCV) presente en la muestra de prueba, caracterizado porque comprende: (a) determinar la secuencia de nucleótidos de al menos una porción de la región NS5b de HCV indicadora del genotipo de dicha especie de HCV presente en la muestra de prueba, en donde la secuencia de nucleótidos correspondiente de una pluralidad de especies de HCV que tenga los genotipos 1, 2, 3, 4, 5 y 6, es indicadora de un genotipo diferente al de la especie de HCV; (b) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b determinada en (a) con uno de dichos genotipos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 de HCV.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la porción de la región NS5b de HCV consiste prácticamente de la región desde aproximadamente la posición del nucleótido 8344 a aproximadamente el 8547 de la SEC ID NO: 1.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la porción de la región NS5b de HCV consiste prácticamente de la región desde la posición del nucleótido 8344 a 8547 de la SEC ID NO: 1.

7. - Un método para determinar el genotipo y el subtipo de una especie del virus de la hepatitis C (HCV) presente en una muestra de prueba, caracterizado porque comprende: (a) determinar la secuencia de nucleótidos de al menos una porción de la región NS5b de HCV indicadora del genotipo y del sub-tipo de dicha especie de HCV presente en la muestra de prueba, en donde la secuencia de nucleótidos correspondiente de cada una de una pluralidad de especies de HCV que tenga los genotipos 1, 2, 3, 4, 5 y 6, de HCV, y cada uno de los sub-tipos de HCV expuestos en la Tabla 1, es indicadora de un genotipo y sub-tipo diferentes al de la especie de HCV; (b) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b determinada en (a) con uno de dichos genotipos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 de HCV y uno de dichos sub-tipos expuestos en la Tabla 1.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la porción de la región NS5b de HCV consiste prácticamente de la región desde aproximadamente la posición del nucleótido 8344 a aproximadamente el 8547 de la SEC ID NO: 1

9. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la porción de la región NS5b de HCV consiste prácticamente de la región desde la posición del nucleótido 8344 al 8547 de la SEC ID NO: 1.

10. - Un método para determinar el genotipo de una especie de virus de la hepatitis C (HCV) presente en una muestra de prueba, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótidos degeneradas capaces de generar secuencias de nucleótidos de al menos una porción de la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV, en donde la secuencia del nucleótido correspondiente de cada una de dicha pluralidad de especies de HCV es indicador de un genotipo distinto de esa especie de HCV; (b) determinar la secuencia de nucleótidos de al menos una porción de la porción de la región NS5b de HCV indicadora del genotipo de dicha especie de HCV presente en la muestra de prueba; y (c) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b de dicha especie de HCV determinada en (b) con un genotipo de uno de dicha pluralidad de especies de HCV.

11. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótido degeneradas comprende degenerar la secuencia de nucleótidos generada, complementaria a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde aproximadamente el nucleótido 8256 a aproximadamente el nucleótido 8278, o su complemento, dichas secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la mezcla de cebadores para formación de secuencias del oligonucleótido degenerada complementaria a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleótido 8256 al 8278, o su complemento, y secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleótido 8611 al 8633 de la SEC ID NO: 1.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótido degeneradas comprende las secuencias de oligonucleotidos degeneradas definida por las fórmulas siguientes, o complementos de las mismas.

14. -Un método para determinar el genotipo de una especie de virus de la hepatitis C (HCV) presente en una muestra de prueba, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótidos degeneradas capaces de generar la secuencia de nucleótidos de al menos una porción de la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV, en donde la secuencia de nucleótidos correspondiente de cada una de dicha pluralidad de especies de HCV es indicadora de uno los genotipos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 de HCV: (b) determinar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b indicadora del genotipo de dicha especie de HCV presente en la muestra de prueba; y (c) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b de dicha especie de HCV determinada en (b) con uno de los genotipos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 de HCV.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótidos degeneradas comprende las secuencias de oligonucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde aproximadamente el nucleótido 8256 a aproximadamente el 8278, o su complemento, y secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde aproximadamente el nucleótido 8611 a aproximadamente el 8633 de la SEC ID NO: 1, o su complemento.

16. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótidos degeneradas comprende secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleótido 8256 al 8278, o su complemento, y secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleótido 8611 al 8633 de la SEC ID NO: 1, o su complemento.

17. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótidos degeneradas comprende secuencias de oligonucleótidos definidas por las fórmulas siguientes, o complemento de las mismas: SEC ID NO: 1 : 5'-TAT GAY ACC CGC TGY TTY GAY TC-3'; y SEC I D NO: 2: 5'-VGT CAT RGC ITC YGT RAA GGC TC-3'.

18. - Un método para determinar el genotipo de una especie de virus de la hepatitis C (HCV) presente en una muestra de prueba, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótidos degeneradas capaces de generar la secuencia de nucleótidos de al menos una porción de la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV, en donde la secuencia de nucleótidos correspondiente de cada una de dicha pluralidad de especies de HCV es indicadora de uno los genotipos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 y de uno de los sub-tipos de HCV: (b) determinar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b indicadora del genotipo y del sub-tipo de dicha especie de HCV presente en la muestra de prueba; y (c) correlacionar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b de dicha especie de HCV determinada en (b) con un genotipo y sub-tipo de HCV.

19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótidos degeneradas comprende las secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde aproximadamente el nucleótido 8256 a aproximadamente el 8278, o su complemento, y secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde aproximadamente el nucleótido 8611 a aproximadamente el 8633 de la SEC ID NO: 1, o su complemento.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótidos degeneradas comprende secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleótido 8256 al 8278, o su complemento, y secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleótido 8611 al 8633 de la SEC ID NO: 1, o su complemento.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótidos degeneradas comprende secuencias de oligonucleótidos degeneradas definidas por las fórmulas siguientes, o complemento de las mismas: SEC I D NO: 1 : 5'-TAT GAY ACC CGC TGY TTY GAY TC-3'; y SEC ID NO: 2: 5'-VGT CAT RGC ITC YGT RAA GGC TC-3'.

22.- Un método para amplificar una porción de la región NS5b de una especie del virus de la hepatitis C (HCV) presente en una muestra de prueba, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una mezcla de cebadores para PCR de oligonucleótidos degenerados que comprenda: secuencias de nucleótidos degenerados complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde aproximadamente el nucleótido 8245 a aproximadamente el 8269, o su complemento; y secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde aproximadamente el nucleótido 8616 a aproximadamente el 8641 de la SEC ID NO: 1 o su complemento; y (b) amplificar la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la región NS5b.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la mezcla de cebadores para PCR de oligonucleótidos degenerados comprende: secuencias de nucleótidos degeneradas complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleótido 8256 al 8278, o su complemento; y secuencias de nucleótidos degenerados complementarias a la región NS5b de una pluralidad de especies de HCV desde el nucleótido 8611 al 8633 de la SEC ID NO: 1, o su complemento.

24. - El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la mezcla de cebadores para PCR de oligonucleótidos degenerados comprende las secuencias de oligonucleótidos degenerados definida por las fórmulas siguientes, o complementos de las mismas: SEC ID NO: 6: 5'- TGG SBT TY CNT AYG AYA CYM GNT G - 3' SEC I D NO: 5: 5'- GAR TAY CTV GTC ATR GCI TCY GTR AA - 3'

25. - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la mezcla de cebadores para PCR de oligonucleótidos degenerados comprende las secuencias de oligonucleótidos degeneradas definidas por las siguientes fórmulas, o complementos de las mismas: SEC ID NO: 3: 5'- TGG GGT TCK CGT ATG AYA CCC GCT G - 3' SEC ID NO: 4 : 5'- TGG GGT TCK CIT ATG AYA CYM GIT G - 3' SEC ID NO: 5>: 5'- GAR TAY CTV GTC ATR GCI TCY GTR AA - 3'

26.- Una mezcla de cebadores para PCR de oligonucleótidos degenerados caracterizada porque la mezcla comprende una pluralidad de cebadores para PCR de oligonucleótidos definidas por una o más de las siguientes fórmulas: SEC I D NO: 3: 5'- TGG GGT TCK CGT ATG AYA CCC GCT G - 3' SEC I D NO: 4 : 5'- TGG GGT TCKCU ATG AYA CYM GIT G - 3' SEC ID NO: 5: 5'- GAR TAY CTV GTC ATR GCI TCY GTR AA - 3'

27. - La mezcla de cebadores para PCR de oligonucleótidos degenerados de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la mezcla comprende una pluralidad de cebadores para PCR de 5 oligonucleótidos definida por la siguiente fórmula: SEC ID NO: 3: 5'-TGG GGT TCK CGT ATG AYA CCC GC G - 3'

28. - La mezcla de cebadores para PCR de oligonucleótidos degenerados de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la mezcla 0 comprende una pluralidad de cebadores para PCR de oligonucleótidos definida por la siguiente fórmula: SEC ID NO: 4 : 5'- TGG GGT TCK C1T ATG AYA CYM GIT G - 3'

29. - La mezcla de cebadores para PCR de oligonucleótidos degenerados de conformidad con la 5 reivindicación 26, caracterizada porque la mezcla comprende una pluralidad de cebadores para PCR de oligonucleótidos definida por la siguiente fórmula: SEC ID NO: 5: 5 - GAR TAY CTV GTC AT GCI TCY GTR AA - 3'

30. - Una mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótidos degenerados caracterizada porque la mezcla comprende una pluralidad de cebadores para formación de secuencias de oligonucleótidos definida por una o más de las fórmulas siguientes: SEC I D NO: 1 : 5'-TAT GAY ACC CGC TGY TTY GAY TC-3'; y c SEC I D NO: 2: 5'-VGT CAT RGC TTC YGT RAA GGC TC-3'.

31. - La mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleotidos degenerados de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la mezcla comprende una pluralidad de cebadores para formación de secuencias de oligonucleotidos definida por la fórmula siguiente : SEC ID NO: 1 : 5'-TAT GAY ACC CGC TGY TTY GAY TC-3';

32. - La mezcla de cebadores para formación de secuencias de oligonucleotidos degenerados de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la mezcla comprende una pluralidad de cebadores para formación de secuencias de oligonucleotidos definida por la fórmula siguiente : SEC ID NO: 2: 5'-VGT CAT RGC ITC YGT RAA GGC TC-3'.