MX2008008291A - Peptidos antimicrobianos ciclicos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a péptidos catiónicos cíclicos y a su uso en el tratamiento de infecciones microbianas.

Description

PEPTIDOS ANTIMICROBIANOS CICLICOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a péptidos catiónicos cíclicos, y a su uso en el tratamiento de infecciones microbianas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los péptidos antimicrobianos (AMP) forman la piedra angular de la inmunidad de los organismos eucarioticos, y proveen una primera línea de defensa contra el rompimiento de las superficies de mucosas y de la piel por microorganismos. Ejemplos de AMP naturales, incluyen las familias de péptidos defensina y catelicidina. Estos AMP son heterogéneos en longitud, secuencia y estructura, pero comunes para la mayoría es su tamaño pequeño, carga catiónica neta y estructura antipática. Pequeños péptidos antimicrobianos catiónicos se han aislado también de muchas bacterias, hongos, plantas, invertebrados y vertebrados, y parecería por lo tanto también que desempeñan una función en las defensas de los organismos procarióticos. Los AMP naturales exhiben actividad de amplio espectro contra bacterias Gram positivas y Gram negativas, levaduras, hongos y virus con cubierta. Los patógenos microbianos no parecen adquirir resistencia a estos péptidos catiónicos y, como tales, los AMP se han conservado como moléculas de defensa del hospedero inmunes innatas vitales a través de milenios de evolución. No es sorprendente por lo tanto que los AMP hayan sido implicados como objetivos potenciales para la terapéutica de una amplia gama de infecciones. Sin embargo, el hecho de que sean técnicamente desafiantes y costosos de producir en sistemas recombinantes, y tengan funciones biológicas inflamatorias y quimiotácticas potentes, excluye las formas de AMP naturales como terapéutica. En la solicitud copendiente de los presentes inventores, se ha mostrado que péptidos lineales ricos en ciertos residuos básicos tales como lisina o arginina poseen actividad antimicrobiana y, en particular, actividad antimicótica. Sin embargo, existe la necesidad de más agentes que puedan usarse en el tratamiento o la prevención de infecciones microbianas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION De conformidad con un primer aspecto de la invención, se provee un péptido que comprende de 2 a aproximadamente 200 D y/o L aminoácidos, que pueden ser iguales o diferentes, en donde los aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de aminoácidos hidrofóbicos y/o aminoácidos catiónicos, y en donde el péptido es cíclico. El péptido cíclico puede comprender de 3 a aproximadamente 100 D y/o L aminoácidos, por ejemplo, de 3 a 50 D y/o L aminoácidos, incluyendo de 4 a aproximadamente 50 D y/o L aminoácidos. Los péptidos de la invención son útiles en el tratamiento o la prevención de infecciones microbianas. Los péptidos cíclicos de la invención son deseables como una terapéutica, ya que son altamente efectivos, proteolíticamente estables, sustancialmente insensibles a las sales, no hepatotoxicos, no hemolíticos y fáciles de sintetizar. Se cree que la carga catiónica de los péptidos de la invención facilita la asociación del péptido con los grupos de cabeza polar de las membranas microbianas. Se cree que la estabilización de los grupos cargados en una conformación más densa por ciclización intensifica su atracción, incrementando de esta manera la potencia antimicrobiana de los péptidos. En otro aspecto de la invención, se provee un péptido que comprende aminoácidos de conformidad con la fórmula I: en donde I y m son enteros de 0 a 10, de modo que I y m no son 0; n es un entero de 1 a 10; X y Y, los cuales pueden ser iguales o diferentes, son un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos hidrofóbicos y/o aminoácidos catiónicos, y en donde el péptido es cíclico, para su uso como una formulación farmacéutica. El péptido puede comprender de 2 a 50 aminoácidos, por ejemplo, 3, 4, 5, 6 ó 7 hasta 50 aminoácidos, incluyendo 3, 4, 5, 6 ó 7 hasta 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 aminoácidos.

En un aspecto preferido de la invención, el péptido comprende de 2 a 15 aminoácidos, por ejemplo, de 3 a 15 aminoácidos. De preferencia, el péptido comprende de 5 a 13 aminoácidos. Aún más preferidos, son los péptidos que comprenden de 3 a 7 aminoácidos, por ejemplo, 7 aminoácidos. Como es sabido por los expertos en la técnica, los aminoácidos pueden agruparse en diferentes clases, dependiendo principalmente de las propiedades químicas y físicas de la cadena lateral de aminoácidos. Por ejemplo, se considera en general que algunos aminoácidos son aminoácidos hidrof ílicos o polares, y se considera que otros son aminoácidos hidrofobicos o no polares. Los aminoácidos hidrofobicos pueden seleccionarse del grupo de aminoácidos hidrofobicos que consisten de glicina, leucina, fenilalanina, prolina, alanina, triptófano, valina, isoleucina, metionina, tirosina y treonina; aminoácidos catiónicos pueden seleccionarse del grupo que consiste de ornitina, histidina, arginina y lisina. Como se usa en la presente, los términos "hidrofóbico" y "catiónico" pueden referirse a aminoácidos que tienen una hidrofobicidad que es mayor que o igual a -1 .10, y/o una carga neta que es mayor que o igual a 0, como se describe en Fauchere y Pliska Eur. J. Med Chem. 10:39 (1983). Un aminoácido hidrofóbico o no polar puede referirse también a un aminoácido que tiene una cadena lateral que no está cargada a pH fisiológico, no es polar y que es repelida generalmente por una solución acuosa. Los aminoácidos pueden ser de ocurrencia natural, o sintéticos. En un aspecto preferido de la invención, X y/o Y son aminoácidos catiónicos seleccionados del grupo que consiste de histidina, omitiría, arginina y lisina. De preferencia, X y/o Y son arginina o lisina. X y/o Y pueden ser isómeros ópticos de un aminoácido hidrofóbico o catiónico, como se define en la presente, por ejemplo, D o L-aminoácidos. De preferencia, X y/o Y son D-aminoácidos. En un aspecto preferido de la invención, el péptido de fórmula (I) consiste de por lo menos 90%, por ejemplo, por lo menos 95%, tal como 97-99% o incluso 100%, de D-aminoácidos. En un aspecto preferido de la invención, el péptido de fórmula (I) consiste de por lo menos 90%, por ejemplo, por lo menos 95%, tal como 97-99% o incluso 100%, de L-aminoácidos. La invención incluye también isómeros conocidos (estructurales, estereoisómeros, conformacionales y configuracionales), peptidomiméticos, análogos estructurales de los aminoácidos anteriores, y aquellos modificados ya sea en forma natural (por ejemplo, modificación post-traducción) o químicamente incluyendo, pero no exclusivamente, fosforilación, glicosilacion, sulfonilación y/o hidroxilación. En general, el péptido de la invención no incluye los aminoácidos ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina o serina, pero ciertos péptidos de la invención pueden tener actividad aún cuando estos aminoácidos estén presentes. En otro aspecto preferido, X y Y son iguales. De preferencia, X y Y son iguales, y son lisina o arginina. En el péptido de fórmula (I), I y m pueden ser 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, y n puede ser 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. En el péptido de fórmula (I), I puede ser I, n puede ser I y m puede estar entre 4 y 9, por ejemplo, m puede ser 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9. En el péptido de fórmula (I), I, n y/o m pueden estar entre 1 y 5, por ejemplo, 1 , 2, 3, 4 ó 5. En el péptido de fórmula (I), I y m pueden ser un entero entre 0 y 7, y n puede ser un entero entre 1 y 10. En el péptido de fórmula (I), I y m pueden ser 0, 1 ó 2, y n puede ser un entero entre 1 y 10. En el péptido de fórmula (I), X y Y pueden ser iguales, I puede ser 0, m puede ser 1 , y n puede ser 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. En el péptido de fórmula (I), X y Y pueden ser iguales, I y m pueden ser 1 , y n puede ser 2, 3, 4 ó 5. En el péptido de fórmula (I), X y Y pueden ser iguales, I puede ser 1 , m puede ser 2, y n puede ser 1 , 2, 3 ó 4. En el péptido de fórmula (I), X y Y pueden ser iguales, I y m pueden ser 2, y n puede ser 1 , 2, 3 ó 4. En otro aspecto de la invención, se provee un péptido cíclico que comprende aminoácidos de conformidad con la fórmula II: (X)n (II) en donde X y n son como se describen en la presente. De preferencia, X es lisina, arginina u ornitina. De preferencia, n es un entero entre 3 y 15.

En una modalidad de la invención, X es arginina. En una modalidad alternativa de la invención, X es lisina. En otra modalidad alternativa de la invención, X es ornitina. Los péptidos de la invención pueden comprender uno o más residuos de cisteína, por ejemplo, hasta 6 residuos de cisteína, tal como 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos de cisteína. Además, la secuencia de aminoácidos del péptido puede ser modificada para resultar en una variante de péptido que incluye la sustitución de por lo menos un residuo de aminoácido en el péptido por otro residuo de aminoácido, incluyendo sustituciones que usan la forma D más que la forma L. Uno o más de los residuos del péptido pueden ser intercambiados por otro para alterar, intensificar o preservar la actividad biológica del péptido. Dicha variante puede tener, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 10% de la actividad biológica del péptido no variante correspondiente. Se usan con frecuencia aminoácidos conservativos, es decir, sustituciones de aminoácidos con propiedades químicas y físicas similares como se describió anteriormente. Por ende, por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos conservativos pueden implicar el intercambio de lisina por arginina, ornitina o histidina; o el intercambio de arginina por lisina o isoleucina, ornitina por histidina; o el intercambio de un aminoácido hidrofóbico por otro. Después de que se introducen las sustituciones, las variantes se identifican para actividad biológica. El término "péptido", como se usa en la presente significa, en términos generales, una pluralidad de residuos de aminoácido unidos entre sí por enlaces peptídicos. Se usa recíprocamente, y significa lo mismo que polipéptido y proteína. En una modalidad de la invención, el péptido cíclico se selecciona del grupo que consiste de: K-K-K-K-K-K-K R-R-R-R-R-R-R Los péptidos de la invención son generalmente péptidos sintéticos. Los péptidos pueden ser péptidos aislados o purificados, o variantes de los mismos, los cuales pueden sintetizarse in vitro, por ejemplo, mediante un método de síntesis de péptidos de fase sólida, mediante síntesis de péptidos catalizada por enzimas, o con la ayuda de la tecnología de ADN recombinante. En otro aspecto de la invención, se provee un procedimiento para la preparación de un péptido de conformidad con la invención, el procedimiento comprendiendo ciclizar un péptido de fórmula (I) o (II) por reacción del péptido con un agente de acoplamiento. El agente de acoplamiento puede ser cualquier agente capaz de formar un enlace peptídico entre los dos residuos de aminoácido terminales (C y N terminales) del péptido cuando está en su forma lineal, por ejemplo, entre estructuras de base o cadenas laterales de dos aminoácidos. La elección del agente de acoplamiento puede influenciar la eficiencia de acoplamiento, y por ende el rendimiento del péptido cíclico. Ejemplos de agentes de acoplamiento útiles en el procedimiento de la invención se muestran en el cuadro 1 , aunque el experto en la técnica estará al tanto de otros agentes de acoplamiento conocidos que son también útiles en la invención. De preferencia, el agente de acoplamiento es HATU - hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1 -il)-?,?,?',?'-tetrametiluronio. De preferencia, la reacción entre el péplido y el agente de acoplamiento ocurre en presencia de una base. La base puede incluir, pero no está limitada a, n-metilmorfolina (NMM) o diisopropil-etilamina (DIEA). De preferencia, la reacción ocurre a pH alcalino, por ejemplo, entre pH 8.5 a 9. El péptido puede ser modificado para incluir un grupo protector antes de su reacción con el agente de acoplamiento. Grupos protectores pueden incluir Pbf (2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofuran-5-sulfonilo), tBu (éter t-butílico), tr (metoxitrimetilbencensulfonilo), Pmc (cloruro de 2,2,5,7, 8-pentametil-croman-6-sulfonilo), Mbh (hidruro de 4,4-dimetiloxibencilo), Tmob (2,4,6-trimetoxibencilo), Aloe (aliloxicarbonilo), Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) y Boc (t-butiloxicarbonilo). Después de reacción con el agente de acoplamiento, el grupo protector puede removerse por separación del grupo protector bajo condiciones ácidas ligeras, por ejemplo, en presencia de una solución de ácido trifluoroacético (TFA). Durante la ciclización de la estructura de base del péptido, el péptido en el extremo C-terminal del péptido lineal es expuesto a un grupo de activación del agente de acoplamiento, y conforme la reacción procede, se produce un intermediario ceto-enol en el carbono alfa de este aminoácido. El intermediario enol (o alquenol) puede llevar por lo tanto a la producción de dos enantiomeros cuando el grupo de activación es removido del carbono adyacente y se forma un enlace peptídico. Esta racemización, es decir, la formación de los enantiomeros respectivos del aminoácido individual (por ejemplo, formas dextrorrotatorias y levorrotatorias (es decir, isómeros d y /, respectivamente)) y la producción de diastereómeros del péptido como un todo, pueden ocurrir en el sitio de ciclizacion tras la activación por el agente de acoplamiento usado. Puesto que es deseable que los péptidos de la invención sean enantioméricamente puros, la producción de diastereómeros no deseables debe reducirse o prevenirse. Para reducir o prevenir esta producción de diastereómeros, y producir un péptido diastereoméricamente puro, el péptido de la invención puede modificarse para incluir una porción aquiral que prevenga la racemización del péptido durante la ciclizacion. De esta manera, en otro aspecto preferido de la invención, el péptido de la invención, o el péptido definido en el procedimiento de la invención, es modificado para incluir una porción que prevenga la formación de diastereómeros del péptido durante la ciclizacion. Como se usa en la presente, un "péptido racémico" es uno que contiene cantidades (típicamente cantidades iguales) de los isómeros ópticos respectivos, por ejemplo, formas dextrorrotatorias y levorrotatorias (es decir, isómeros d y /, respectivamente), del aminoácido en el extremo C-terminal del péptido antes de la ciclizacion del péptido. La porción introducida en el péptido es generalmente un aminoácido aquiral, el cual puede ser un aminoácido de ocurrencia natural o un análogo de aminoácido. El aminoácido aquiral puede seleccionarse del grupo que consiste de glicina, ß-alanina, ácido 3-aminopropanoico, ácido 4-aminobutírico, ácido 5-aminopentanoico y ácido 6-aminohexanoico. En una modalidad de la invención, el péptido es modificado en el extremo C-terminal para incluir un aminoácido aquiral, por ejemplo, glicina. Así como la modificación del péptido de la invención incluye una porción, como se define en la presente, en el extremo C-terminal, la relación de los dos enantiómeros formados durante la ciclización del péptido depende de varios factores, tales como el solvente usado, el tiempo de incubación y la temperatura durante la ciclización (es decir, reacción con el agente de acoplamiento), y el grupo de activación usado para facilitar la ciclización. La presente invención se refiere además a péptidos ciclizados obtenibles mediante el procedimiento de la invención. En una modalidad de la invención, el péptido cíclico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: K-K-K-K-K-K-K R-R-R-R-R-R-R O-O-O-O-O-O-O D -D "DR_D "D "DR"DR Para identificar péptidos activos que tienen poca o ninguna toxicidad no deseada para células de mamífero, pueden obtenerse péptidos individuales, o colecciones de péptidos, y los péptidos individuales o péptidos de esas colecciones pueden identificarse para toxicidad y actividad antimicrobiana que incluye, pero no está limitada a, toxicidad y actividad antimicótica, antibacteriana, antiviral, antiprotozoaria y antiparasitaria. Los péptidos de la invención pueden existir en diferentes formas tales como, por ejemplo, ácidos libres, bases libres, ésteres y otros profármacos, sales y tautómeros, y la invención incluye todas las formas variantes de los compuestos. De esta manera, la invención abarca la sal o profármaco de un péptido o variante de péptido de la invención. El péptido de la invención puede administrarse en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden sintetizarse a partir del péptido precursor que contenga una porción básica o ácida, mediante métodos químicos convencionales. En general, dichas sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas de base o ácido libre del péptido con una cantidad estequiométrica de la base o ácido adecuado en agua o en un solvente orgánico, o en una mezcla de los dos; en general, se prefieren medios no acuosos tales como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Listas de sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoséptima edición, Mack Publishing Company, Easton, Pa., US, 1985, p. 1418, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia; véase también Stahl et al., eds., "Handbook of Pharmaceutical Salts Properties Selection and Use", Verlag Helvética Chimica Acta, y Wiley-VCH, 2002. La invención incluye de esta manera sales farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención, en donde el compuesto precursor es modificado obteniendo sales ácidas o básicas del mismo, por ejemplo, las sales no tóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario que se forman, por ejemplo, de bases o ácidos orgánicos o inorgánicos. Ejemplos de dichas sales ácidas de adición incluyen acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencensulfonato, bisulfato, butirato, citrato, alcanforato, alcanforsulfonato, ciclopentanpropionato, digluconato, dodecilsulfato, etansulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietansulfonato, lactato, maleato, malonato, metansulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Sales básicas incluyen sales de amonio, sales de metal alcalino tales como sales de sodio y potasio, sales de metal alcalinotérreo tales como sales de calcio y magnesio, sales con bases orgánicas tales como sales de diciclohexilamina, N-metil-D-glutamina, y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina, etc. Asimismo, los grupos que contengan nitrógeno básico pueden ser cuaternizados con agentes tales como halogenuros de alquilo inferior, tales como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; dialquilsulfatos tales como dimetil, dietil, dibutil y diamil sulfatos, halogenuros de cadena larga tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo, halogenuros de aralquilo tales como bromuros de bencilo y fenetilo, y otros. Sales de grupos carboxilo de un péptido o vanante de péptido de la invención pueden prepararse en la manera usual, poniendo en contacto el péptido con uno o más equivalentes de una base deseada tal como, por ejemplo, una base de hidróxido metálico, por ejemplo, hidróxido de sodio; un carbonato o bicarbonato de metal tal como, por ejemplo, carbonato o bicarbonato de sodio; o una base de amina tal como, por ejemplo, trietilamina, trietanolamina, y similares. La invención incluye profármacos para la especie farmacéutica activa del péptido descrito, por ejemplo, en la cual uno o más grupos funcionales son protegidos o derivatizados, pero pueden ser convertidos in vivo hasta el grupo funcional, como en el caso de ésteres de ácidos carboxílicos convertibles in vivo hasta el ácido libre, o en el caso de aminas protegidas, hasta el grupo amino libre. El término "profármaco", como se usa en la presente, representa en particular estructuras que son rápidamente transformadas in vivo hasta la estructura precursora, por ejemplo, por hidrólisis en la sangre. Otro aspecto de la invención provee una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un péptido de la invención, o dos o más péptidos diferentes de la invención. La composición incluye también un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. La frase "farmacéuticamente aceptable" se usa en la presente para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del juicio médico profundo, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos o, según pueda ser el caso, un animal sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación excesivo, en proporción con una relación razonable de beneficio/riesgo. El péptido de la invención es útil, entre otras cosas, como un péptido antimicrobiano, por ejemplo, contra bacterias, hongos, levaduras, parásitos, protozoarios y virus. El término "péptido antimicrobiano" puede usarse en la presente para definir cualquier péptido que tenga actividad microbiocida y/o microbiostática y abarque, no exclusivamente, cualquier péptido descrito que tenga propiedades antibacterianas, antimicóticas, antiparasitarias, antiprotozoarias, antivirales, antiinfecciosas y/o germicidas, algicidas, amebicidas, microbiocidas, bacteriocidas, fungicidas, parasiticidas y contra protozoarios. En un aspecto preferido, la invención provee el uso de un péptido de conformidad con la invención, en la fabricación de un medicamento para tratar una infección microbiana. Por el termino "infección microbiana", se entiende una infección causada por una bacteria, parásito, protozoario, virus u hongo, incluyendo levaduras. Un "patógeno" se define en general como cualquier organismo que cause enfermedad.

Un patógeno bacteriano puede derivarse de una especie de bacteria seleccionada del grupo, pero no exclusivamente el grupo, que consiste de: Staphylococcus spp., por ejemplo, Staphylococcus aureus (por ejemplo, Staphylococcus aureus NCTC 10442), Staphylococcus epidermidis; Chlamydia spp., por ejemplo, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci; Enterococcus spp., por ejemplo, Enterococcus faecalis; Streptococcus pyogenes; Liste ría spp.; Pseudomonas spp.; Mycobacteríum spp., por ejemplo, Mycobacteríum tuberculosis; Enterobacter spp.; Campylobacter spp.; Salmonella spp.; Streptococcus spp., por ejemplo, Streptococcus grupo A o B, Streptoccocus pneumoniae; Helicobacter spp., por ejemplo, Helicobacter pylori; Neisseria spp., por ejemplo, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis; Borrelia burgdorferi; Shigella spp., por ejemplo, Shigella flexneri; Escherichia coli (E.coli O157:H7 NCTC 1 2900); Haemophilus spp., por ejemplo, Haemophilus influenzae; Francisella tularensis; Bacillus spp., por ejemplo, Bacillus anthracis; Clostridium spp., por ejemplo, Clostridium botulinum; Yersinia spp., por ejemplo, Yersinia pestis; Treponema spp.; Burkholderia spp., por ejemplo, Burkholderia cepacia, B. mallei y B pseudomallei. En un uso preferido de conformidad con la invención, el patógeno bacteriano es Staphyloccus aureus o E. coli. Un patógeno viral puede derivarse de un virus seleccionado de, pero no limitado a, el grupo que consiste de: virus de la inmunodeficiencia humana (VIH 1 y 2); virus de la leucemia de células T humanas (HTLV 1 y 2); virus Ebola; virus del papiloma humano (por ejemplo, HPV-2, HPV-5, HPV-8, HPV-16, HPV-18, HPV-31 , HPV-33, HPV-52, HPV-54 y HPV-56); papovavirus; rinovirus; poliovirus; virus del herpes; adenovirus; virus de Epstein Barr; virus de la influenza, virus de la hepatitis B y C, virus de la viruela, rotavirus o coronavirus del SARS. Un patógeno parásito puede derivarse de un parásito seleccionado de, pero no limitado a, el grupo que consiste de Trypanosoma spp. (Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei), Leishmania spp., Giardia spp., Trichomonas spp., Entamoeba spp., Naegleria spp., Acanthamoeba spp., Schistosoma spp., Plasmodium spp., Criptosporidium spp., Isospora spp., Balantidium spp., Loa loa, Ascaris lumbricoides, Dirof Haría ¡mmitis y Toxoplasma ssp., por ejemplo, Toxoplasma gondii. En un uso preferido de conformidad con la invención, la infección microbiana es una infección por hongos. Un hongo patógeno puede derivarse de un hongo (incluyendo levaduras) seleccionado de, pero no limitado a, los géneros Candida spp. (por ejemplo, C. albicans), Epidermophyton spp., Exophiala spp., Microsporum spp., Trichophyton spp. (por ejemplo, T. rubrum y T. interdigitale), Tinea spp., Aspergillus spp., Blastomyces spp., Blastoschizomyces spp., Coccidioides spp., Cryptococcus spp. (toor ejemplo, Cryptococcus neoformans), Histoplasma spp., Paracoccidiomyces spp., Sporotrix spp., Absidia spp., Cladophialophora spp., Fonsecaea spp., Phialophora spp., Lacazia spp., Arthrographis spp., Acremonium spp., Actinomadura spp., Apophysomyces spp., Emmonsia spp., Basidiobolus spp., Beauveria spp., Chrysosporium spp., Conidiobolus spp., Cunninghamella spp., Fusarium spp., Geotrichum spp., Graphium spp., Leptosphaeria spp., Malassezia spp. (por ejemplo, Malassezia fúrfur), Mucor spp., Neotestudina spp., Nocardia spp., Nocardiopsis spp., Paecilomyces spp., Phoma spp., Piedraia spp., Pneumocystis spp., Pseudallescheria spp., Pyrenochaeta spp., Rhizomucor spp., Rhizopus spp., Rhodotorula spp., Saccharomyces spp., Scedosporium spp., Scopularíopsis spp., Sporobolomyces spp., Syncephalasfrum spp., Trichoderma spp., Trichosporon spp., Ulocladium spp., Ustilago spp., Verticillium spp. y Wangiella spp. En un uso preferido de conformidad con la invención, el hongo patógeno es de los géneros Trichophyton spp. o Cryptococcus spp. Por ejemplo, el hongo patógeno puede ser Trichophyton rubrum, Trichophyton interdigitale o Cryptococcus neoformans. La infección por hongos puede ser una infección sistémica, tópica, subcutánea, cutánea o de mucosas. Infecciones tópicas de las uñas y la piel causadas por hongos son causadas generalmente por dermatófitos, aunque algunos no dermatófitos tales como las levaduras, pueden causar también infecciones de la piel. La infección por dermatófitos puede incluir una infección por Tinea (tiña), por ejemplo, Tinea barbae (barba), Tinea capitis (cabeza), Tinea corporís (cuerpo), Tinea cruris (ingle), Tinea faciei (cara), Tinea manuum (mano), Tinea pedis (pie), Tinea unguium (uña), Tinea (pitiriasis) versicolor, Tinea incógnita o Tinea nigra. La infección puede derivarse de hongos de los géneros Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton spp. (por ejemplo, T. rubrum y T. interdigitale). La infección dermatofítica puede ser una infección de la piel, lámina, estrato córneo, uñas (uñas de los dedos de la mano y uñas de los dedos del pie) o el cabello. De mención particular, son infecciones dermatofíticas causadas por un dermatófito de los géneros Trichophyton, Epidermophyton o Microsporum. Ejemplos de dermatófitos incluyen Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, Microsporum audouinii, Microsporum gypseum, Microsporum nanum, Microsporum ferrugineum, Microsporum distortum, Microsporum fulvum, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale, Trichophyton mentagrophytes var. nodulare, Trichophyton tonsurans, Trichophyton soudanese, Trichophyton violaceum, Trichophyton megnini, Trichophyton schoenlenii, Trichophyton gallinae, Trichophyton krajdenii, Trichophyton yaoundei, Trichophyton equinum, Trichophyton erinacei y Trichophyton verrucosum. En una modalidad particular de la invención, la infección dermatofítica es onicomicosis. El término "onicomicosis" incluye, pero no está limitado a, tipos de onicomicosis subungular lateral distal, blanca superficial, subungular blanca proximal, distrófíca secundaria, distrófica primaria, endonix, candidial (por ejemplo, onicólísis y enfermedad mucocutánea crónica), y Tinea ungium. Hongos no dermatofíticos asociados con onicomicosis incluyen Aspergillus spp., Cephalosporum spp., Fusarium oxysporum, Scopularis brevicaulis y Scytalidium spp. Los péptidos de la invención son péptidos antimicrobianos potentes para una amplia variedad de organismos patogénicos. Sin embargo, los péptidos de la invención pueden ser también útiles en el tratamiento de otras condiciones que incluyen, pero no están limitadas a, condiciones asociadas con infecciones de mucosas, por ejemplo, fibrosis quística o infecciones gastrointestinales, urogenitales, urinarias (por ejemplo, infección del riñon o cistitis) o respiratorias. Los péptidos de la invención pueden ser también útiles en el tratamiento o la prevención de infecciones asociadas, típicamente con la piel que incluyen, entre otras, heridas, úlceras y lesiones, por ejemplo, lesiones cutáneas tales como cortaduras o quemaduras, y condiciones asociadas con las mismas. En un aspecto preferido de la invención, los péptidos son útiles en el tratamiento de infecciones bacterianas de la piel o "piodermas". El término "tratamiento" se refiere a los efectos de los péptidos descritos en la presente, que imparten un beneficio a los pacientes afectados con una enfermedad (infecciosa), que incluye una mejora en la condición del paciente o demora en la progresión de la enfermedad. Como se usa en la presente, el "tratamiento de una herida" puede incluir curación de la herida y condiciones asociadas y terapia que promuevan, aumenten o aceleren la curación de tejidos, e incluye cicatrización post-operatoria, quemaduras, úlceras, psoriasis, aceleración de la reconstrucción de tejidos, por ejemplo, post-cirugía cosmética y trasplante de órganos. De esta manera, en otro aspecto de la invención, se provee un substrato al cual un péptido de la invención es aplicado o unido. De preferencia, el substrato es adecuado para la aplicación a heridas o el suministro hacia sitios de la herida. De preferencia, el substrato permite la transferencia de los péptidos de la invención, del substrato al lecho de una herida, para lograr su efecto antibiótico. El substrato puede ser un aposito, por ejemplo, aposito para heridas. El aposito puede comprender un material de tela, o puede ser un material tipo colágena. Los péptidos de la invención pueden encontrar también aplicación como/en un desinfectante. En este contexto, el péptido o las composiciones farmacéuticas de la invención pueden aplicarse, ya sea solos o en combinación con otros agentes desinfectantes, a una superficie que se va a tratar. Como se usa en la presente, el término "una superficie que se va a tratar" puede ser un substrato como se define en la presente, o un dispositivo médico. En otro aspecto, la invención provee un método para tratar o prevenir una infección microbiana en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido de conformidad con la invención. En un método preferido de la invención, la infección microbiana es una infección por hongos. En el método de la invención, el péptido se aplica tópicamente a la piel o las uñas de dicho sujeto. Mamíferos, aves y otros animales pueden tratarse mediante los péptidos, composiciones o métodos descritos en la presente. Dichos animales y aves incluyen humanos, perros, gatos y ganado, tales como caballos, ganado vacuno, ovejas, cabras, pollos y pavos, y similares. Además, pueden tratarse también plantas mediante los péptidos, composiciones o métodos de la invención. En donde el sujeto es un animal, el método de la invención puede aplicarse en rasgos tipo uña que incluyen, pero no son exclusivos de, pezuñas, garras y trotadores. El método de la invención puede incluir, además del tratamiento con péptidos, tratamientos que pueden intensificar la permeación del péptido en las uñas. Esto podría facilitarse mediante medios químicos o f ísicos. Tratamientos físicos tales como grabado de las uñas por ataque químico o relleno de la capa dorsal de la uña, pueden intensificar la permeabilidad de los péptidos de la invención. La intensificación química de la permeabilidad de las uñas a los péptidos de la invención, puede lograrse rompiendo enlaces físicos o químicos dentro de la queratina de la placa de la uña. Agentes ablandadores de uñas que incluyen, pero no son exclusivos de urea y ácido salicílico, incrementan la hidratación de la uña para disminuir la densidad de la uña y, por lo tanto, pueden incrementar la permeabilidad hacia los péptidos de la invención. Compuestos que contengan grupos sulfhidrilo separarán los enlaces disulfuro en la queratina de la uña, y pueden llevar a desestabilización y permeabilidad incrementada de fármacos. En otro aspecto, la invención provee un método para tratar una herida en un sujeto, que comprende aplicar a la herida una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido, o un substrato, de conformidad con la invención. Para lograr los efectos deseados, el péptido, o variante del mismo o una combinación del mismo, puede administrarse como dosificaciones individuales o divididas, por ejemplo, de por lo menos aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 500 a 750 mg/kg, de por lo menos aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 300 a 500 mg/kg, por lo menos aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 100 a 300 mg/kg, o por lo menos aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 50 a 100 mg/kg de peso corporal, o por lo menos aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, aunque otras dosificaciones pueden proveer resultados benéficos. La cantidad administrada variará, dependiendo de varios factores que incluyen, pero no están limitados a, el péptido elegido y sus efectos clínicos, la enfermedad, el peso, la condición física, la salud, la edad del mamífero, si se va a lograr prevención o tratamiento, y si el péptido es químicamente modificado. La administración de los agentes terapéuticos de conformidad con la invención puede ser en una dosis individual, en dosis múltiples, en una manera continua o intermitente dependiendo, por ejemplo, de la condición fisiológica del receptor, si el propósito de la administración es terapéutica o profiláctica, y otros factores conocidos por los expertos en la técnica. La administración de los péptidos de la invención puede ser esencialmente continua durante un período preseleccionado, o puede ser en una serie de dosis espaciadas. Se contempla la administración tanto local como sistémica. Para preparar la composición, los péptidos son sintetizados o de otra manera obtenidos, purificados según sea necesario o se desee, y entonces liofilizados y estabilizados. El péptido puede ser ajustado entonces a la concentración adecuada, y opcionalmente combinado con otros agentes. El peso absoluto de un péptido determinado incluido en una dosis unitaria puede variar ampliamente. Por ejemplo, puede administrarse de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 2 g, o de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 500 mg de por lo menos un péptido de la invención, o una pluralidad de péptidos específicos para un tipo de célula particular. En forma alternativa, la dosificación unitaria puede variar de aproximadamente 0.01 g a aproximadamente 50 g, de aproximadamente 0.01 g a aproximadamente 35 g, de aproximadamente 0.1 g a aproximadamente 25 g, de aproximadamente 0.5 g a aproximadamente 12 g, de aproximadamente 0.5 g a aproximadamente 8 g, de aproximadamente 0.5 g a aproximadamente 4 g, o de aproximadamente 0.5 g a aproximadamente 2 g. De esta manera, una o más formas de dosificación unitaria adecuadas que comprenden los péptidos terapéuticos de la invención, pueden administrarse mediante una variedad de vías que incluyen las vías oral, parenteral (incluyendo subcutánea, intravenosa, intramuscular e intraperitoneal), rectal, dérmica, transdérmica, intratorácica, intrapulmonar e intranasal (respiratoria). Los péptidos terapéuticos pueden formularse también en una formulación de lípidos o para liberación sostenida (por ejemplo, usando microencapsulación; véase el documento WO 94/07529 y la patente de E.U.A. No. 4,962,091 ). En donde sea adecuado, las formulaciones pueden presentarse convenientemente en formas de dosificación unitaria discretas, y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en las técnicas farmacéuticas. Dichos métodos pueden incluir el paso de mezclar el agente terapéutico con vehículos líquidos, matrices sólidas, vehículos semisólidos, vehículos sólidos finamente divididos, o combinaciones de los mismos, y entonces, si es necesario, introduciendo o configurando el producto en el sistema de suministro deseado. Cuando los péptidos terapéuticos de la invención se preparan para administración oral, se combinan en general con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para formar una formulación farmacéutica, o forma de dosificación unitaria. Para administración oral, los péptidos pueden estar presentes como un polvo, una formulación granular, una solución, una suspensión, una emulsión o en una resina o polímero natural o sintético para ingestión de los ingredientes activos a partir de una goma de mascar. Los péptidos activos pueden presentarse también como un bolo, electuario o pasta. Péptidos terapéuticos oralmente administrados de la invención pueden formularse también para liberación sostenida, por ejemplo, los péptidos pueden ser recubiertos, microencapsulados o de otra manera puestos dentro de un dispositivo de suministro sostenido. Los ingredientes activos totales en dichas formulaciones comprenden de 0.1 a 99.9% en peso de la formulación. Formulaciones farmacéuticas que contienen a los péptidos terapéuticos de la invención, pueden prepararse mediante procedimientos conocidos en la técnica usando ingredientes bien conocidos y fácilmente disponibles. Por ejemplo, el péptido puede formularse con excipientes, diluyentes o vehículos comunes, y puede formarse en tabletas, cápsulas, soluciones, suspensiones, polvos, aerosoles, y similares. Ejemplos de excipientes, diluyentes y vehículos que son adecuados para dichas formulaciones, incluyen reguladores de pH, así como llenadores y diluyentes tales como almidón, celulosa, azúcares, manitol y derivados de ácido silícico. Agentes aglutinantes pueden incluirse también, tales como carboximetilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y otros derivados de celulosa, alginatos, gelatina y polivinilpirrolidona. Pueden incluirse agentes humectantes tales como glicerol, así como agentes de desintegración tales como carbonato de calcio y bicarbonato de sodio. Pueden incluirse también agentes para retardar la disolución, tales como parafina. Pueden incluirse también catalizadores de resorción, tales como compuestos de amonio cuaternario. Pueden incluirse agentes tensoactivos tales como alcohol cetílico y monoestearato de glicerol. Pueden añadirse vehículos de adsorción tales como caolín y bentonita. Pueden incluirse también lubricantes tales como talco, estearato de calcio y magnesio y polietilenglicoles sólidos. Pueden añadirse también conservadores. Las composiciones de la invención pueden contener también agentes espesantes tales como celulosa y/o derivados de celulosa. Pueden contener también gomas tales como goma de xantano, goma guar o goma carbo o goma arábiga, o en forma alternativa polietilenglicoles, bentonitas y montmorilonitas, y similares. Por ejemplo, tabletas o capletas que contengan a los péptidos de la invención pueden incluir agentes reguladores de pH tales como carbonato de calcio, óxido de magnesio y carbonato de magnesio. Agentes reguladores de pH adecuados pueden incluir también ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal. Capletas y tabletas pueden incluir también ingredientes inactivos tales como celulosa, almidón pregelatinizado, dióxido de silicio, hidroxipropilmetilcelulosa, estearato de magnesio, celulosa microcristalina, almidón, talco, dióxido de titanio, ácido benzoico, ácido cítrico, almidón de maíz, aceite mineral, polipropilenglicol, fosfato de sodio, estearato de zinc, y similares. Cápsulas de gelatina duras o blandas que contengan por lo menos un péptido de la invención pueden contener ingredientes inactivos tales como gelatina, celulosa microcristalina, lauril sulfato de sodio, almidón, talco y dióxido de titanio, y similares, así como vehículos líquidos tales como polietilenglicoles (PEGs) y aceite vegetal. Además, capletas o tabletas con recubrimiento entérico que contengan uno o más péptidos de la invención están diseñadas para resistir a la desintegración en el estómago y disolverse en el ambiente más neutro o alcalino del duodeno. Los péptidos terapéuticos de la invención pueden formularse también como elíxires o soluciones para administración oral conveniente, o como soluciones adecuadas para administración parenteral, por ejemplo, mediante las vías intramuscular, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa. Las formulaciones farmacéuticas de los péptidos terapéuticos de la invención pueden tomar también la forma de una dispersión o solución acuosa o anhidra, o en forma alternativa la forma de una emulsión o suspensión o ungüento. De esta manera, los péptidos terapéuticos pueden formularse para administración parenteral (por ejemplo, mediante inyección, por ejemplo, inyección de bolo o infusión continua), y pueden presentarse en forma de dosis unitaria en ampolletas, jeringas prellenadas, contenedores de infusión de volumen pequeño o en contenedores de dosis múltiples. Los péptidos activos y otros ingredientes pueden formar suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. En forma alternativa, los péptidos activos y otros ingredientes pueden estar en forma de polvo, obtenidos mediante aislamiento aséptico de sólido estéril o mediante liofilización de solución para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril y libre de pirógenos, antes de su uso. Estas formulaciones pueden contener portadores, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables que son bien conocidos en la técnica. Es posible, por ejemplo, preparar soluciones usando uno o más solventes orgánicos que sean aceptables desde el punto de vista fisiológico elegidos, además de agua, de solventes tales como acetona, ácido acético, etanol, alcohol isopropílico, sulfóxido de dimetilo, éteres de glicol tales como los productos vendidos bajo el nombre "Dowanol", poliglicoles y polietilenglicoles, ésteres de alquilo de C1 -C4 de ácidos de cadena corta, lactato de etilo o isopropilo, triglicéridos de ácido graso tales como los productos vendidos bajo el nombre "Miglyol", miristato de isopropilo, aceites animales, minerales y vegetales, y polisiloxanos. Solventes o diluyentes que comprendan los péptidos de la invención pueden incluir soluciones ácidas, dimetilsulfona, N-(2-mercaptopropionil) glicina, 2-n-nonil-1 ,3-dioxolano y alcohol etílico. De preferencia, el solvente/diluyente es un solvente ácido, por ejemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido bórico, ácido láctico, ácido propiónico, ácido fosfórico, ácido benzoico, ácido butírico, ácido málico, ácido malónico, ácido oxálico, ácido succínico o ácido tartárico. Contemplados también son productos de combinación que incluyen uno o más péptidos de la presente invención y uno o más de otros agentes antimicrobianos o antimicóticos, por ejemplo, polienos tales como anfotericina B, complejo de lípidos-anfotericina B (ABCD), anfotericina liposomal (L-AMB) y nistatina liposomal, azoles y triazoles tales como voriconazol, fluconazol, ketoconazol, itraconazol, pozaconazol, y similares; inhibidores de glucano sintasa tales como caspofungina, micafungina (FK463) y V-equinocandina (LY303366); griseofulvina; alilaminas tales como terbinafina; flucitosina u otros agentes antimicóticos, incluyendo aquellos descritos en la presente. Además, se contempla que los péptidos podrían combinarse con agentes antimicóticos tópicos tales como ciclopirox olamina, haloprogina, tolnaftato, undecilenato, nistatina tópica, amorolfina, butenaíina, naftiíina, terbinafina, y otros agentes tópicos. Además, los péptidos pueden formularse como formas de dosificación de liberación sostenida, y similares. Las formulaciones pueden constituirse también de modo que liberen el péptido activo, por ejemplo, en un sitio particular del tracto intestinal o respiratorio, posiblemente durante un cierto período. Recubrimientos, cubiertas y matrices protectoras pueden hacerse, por ejemplo, de sustancias poliméricas tales como polilactida-glicolatos, liposomas, microemulsiones, micropartículas, nanopartículas o ceras. Estos recubrimientos, cubiertas y matrices protectoras son útiles para recubrir dispositivos residentes, por ejemplo, stents, catéteres, equipos de diálisis peritoneal, dispositivos de drenaje, y similares. Para administración tópica, los agentes activos pueden formularse como es sabido en la técnica para aplicación directa a un área objetivo. Formas acondicionadas principalmente para aplicación tópica toman la forma, por ejemplo, de cremas, leches, geles, polvos, dispersión o microemulsiones, lociones espesadas a un mayor o menor grado, almohadillas impregnadas, ungüentos o barras, formulaciones en aerosol (por ejemplo, rocíos o espumas), jabones, detergentes, lociones o barras de jabón.

Otras formas convencionales para este propósito incluyen apositos para heridas, vendajes recubiertos u otras cubiertas de polímero, ungüentos, cremas, lociones, pastas, jaleas, rocíos y aerosoles. De esta manera, los péptidos terapéuticos de la invención pueden suministrarse por medio de parches o vendajes para administración dérmica. En forma alternativa, el péptido puede formularse para ser parte de un polímero adhesivo, tal como poliacrilato o copolímero de acrilato/acetato de vinilo. Para aplicaciones a largo plazo, podría ser deseable usar materiales laminados de refuerzo microporosos y/o respirables, de modo que la hidratación o maceración de la piel pueda ser reducida al mínimo. La capa de refuerzo puede ser de cualquier espesor adecuado que provea las funciones de protección y soporte deseadas. Un espesor adecuado será en general de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mieras. La administración tópica puede estar en la forma de una laca o recubrimiento para uñas. Por ejemplo, los péptidos antimicóticos pueden formularse en una solución para administración tópica que contenga acetato de etilo (NF), alcohol isopropílico (USP) y monoéster butílico de poli[éter vinilmetílico/ácido maleico] en alcohol isopropílico. Las formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden comprender, por ejemplo, una solución salina regulada en su pH fisiológicamente aceptable, que contenga entre aproximadamente 0.001 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml, por ejemplo, entre 0.1 mg/ml y 10 mg/ml, de uno o más de los péptidos de la presente invención específicos para la indicación o enfermedad que se va a tratar. Los ungüentos y cremas pueden formularse, por ejemplo, con una base acuosa u oleosa con la adición de agentes gelificantes y/o espesantes adecuados. Pueden formularse lociones con una base acuosa u oleosa, y contendrán también en general uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizadores, agentes de dispersión, agentes de suspensión, agentes espesantes o agentes colorantes. Los péptidos activos pueden suministrarse también por medio de iontoforesis, por ejemplo, como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 4,140,122; 4,383,529; o 4,051 ,842. El porcentaje en peso de un agente terapéutico de la invención presente en una formulación tópica dependerá de varios factores, pero será en general de 0.01 % a 95% del peso total de la formulación, y típicamente de 0.1 a 85% en peso. Gotas, tales como gotas oculares o gotas nasales, pueden formularse con uno o más de los péptidos terapéuticos en una base acuosa o no acuosa que comprenda también uno o más agentes de dispersión, agentes de solubilización o agentes de suspensión. Pueden bombearse rocíos líquidos, o pueden suministrarse convenientemente de empaques presurizados. Pueden suministrarse gotas por medio de un frasco gotero simple, por medio de un frasco de plástico adaptado para suministrar contenido líquido gota a gota, o por medio de una tapa especialmente configurada. El péptido terapéutico puede formularse además para administración tópica en la boca o garganta. Por ejemplo, los ingredientes activos pueden formularse como una pastilla que comprenda además una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprendan la composición en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprendan la composición de la presente invención en un vehículo líquido adecuado. Ejemplos no limitativos específicos de los vehículos y/o diluyentes que son útiles en las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, incluyen agua y soluciones salinas reguladas en su pH fisiológicamente aceptables, tales como soluciones salinas reguladas en su pH con fosfato de pH 7.0 a 8.0. Los péptidos de la invención pueden ser administrados también hacia el tracto respiratorio. Para administración por inhalación o insuflación, la composición puede tomar la forma de un polvo seco, por ejemplo, una mezcla de polvo del agente terapéutico y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Los péptidos terapéuticos de la presente invención pueden administrarse también en una solución acuosa cuando se administren en un aerosol o forma inhalada. De esta manera, otras formulaciones farmacéuticas en aerosol pueden comprender, por ejemplo, una solución salina regulada en su pH con fosfato fisiológicamente aceptable que contenga entre aproximadamente 0.001 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml, por ejemplo, entre 0.1 y 100 mg/ml, tal como 0.5-50 mg/ml, 0.5-20 mg/ml, 0.5-10 mg/ml, 0.5-5 mg/ml o 1 -5 mg/ml, de uno o más de los péptidos de la presente invención específicos para la indicación o enfermedad que se va a tratar. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones de esta especificación, los términos "comprende" y "contiene" y variaciones de los mismos, por ejemplo, "que comprende" y "comprende", significan "incluyendo, pero no limitado a", y no se pretende que (y no) excluyan otras porciones, aditivos, componentes, enteros o pasos. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones de esta especificación, el singular abarca el plural, a menos que el contexto lo requiera de otra manera. En particular, en donde se use el artículo indefinido, se entenderá que la especificación contempla la pluralidad, así como la singularidad, a menos que el contexto lo requiera de otra manera. Se entenderá que rasgos, enteros, características, compuestos, porciones químicas o grupos descritos en conjunto con un aspecto, modalidad o ejemplo particular de la invención, son aplicables a cualquier otro aspecto, modalidad o ejemplo descrito en la presente, a menos que sea incompatible con la misma.

EJEMPLOS Materiales y métodos EJEMPLO 1 Se realizó ciclización de un péptido de polilisina de 7 aminoácidos, disolviendo 1 equivalente de péptido protegido con 1 equivalente (equivalente = volumen equivalente) de HATU en D F (dimetilformamida) a 100 mg/ml. Para incrementar el pH, se añadieron 2.5 equivalentes de DIEA (diisopropiletilamina), y se siguió el progreso de la región mediante CLAR. Cuando concluyó, el péptido se precipitó en agua y se lavó en más agua. El péptido se secó entonces y se desprotegió con ácido fluorhídrico, para dar el péptido cíclico final. Se usó entonces cromatografía de intercambio iónico para reemplazar el solvente de ácido fluorhídrico con ácido acético antes de la liofilización.

EJEMPLO 2 Se realizó ciclización de un péptido de poliarginina de 7 aminoácidos, combinando 1 equivalente de péptido protegido con 5 equivalentes de NaHCO3 (bicarbonato de sodio) y 2 equivalentes de PyBOP disueltos en DMF a 28.5 mg/ml. La reacción se siguió mediante TLC, y cuando concluyó, el péptido se precipitó en agua y se lavó en más agua. El péptido se secó entonces y se desprotegido con ácido fluorhídrico, para dar el péptido cíclico final. Se usó entonces cromatografía de intercambio iónico para reemplazar el solvente de ácido fluorhídrico con ácido acético antes de la liofilización.

EJEMPLO 3 Ciclización de un péptido de poliarginina de 7 aminoácidos Solución 1 : Se disolvieron 57 mg de HBTU (peso molecular = 379.3, 0.15 mmoles) o 57 mg of HATU (M = 380.3, 0.15 mmoles) y 60 µ? de 0.92 mg/ml de NMM (N-metilmorfolina, peso molecular = 101 .2, 0.55 mmoles) en 2.86 mi de DMF. Solución 2: Se disolvieron 288 mg de H-[Arg(Pbf)]7-OH (peso molecular = 2877.6, 0.1 mmoles) (péptido de poliarginina de 7 aminoácidos) en 0.71 mi de DMF. Se añadió gota a gota la solución 2 a la solución 1 durante 30 minutos. El pH se verificó mediante papel pH húmedo, y debía ser de 8.5 a 9. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche (el acoplamiento usando HATU concluyó después de 5 horas. La cantidad de NMM depende del exceso de TFA en H-[Arg(Pbf)]7-OH). La mezcla se concentró bajo vacío. Se añadió una solución de NaHCO3 (5%). El precipitado del ciclopéptido protegido se filtró y se lavó con agua. Se obtuvieron de 150 a 200 mg. La separación de los grupos de Pbf se realizó en TFA/agua (95/5, v/v) (10 mi para 1 g de ciclopéptido protegido). La mezcla se concentró y se añadió IPE para precipitar el producto crudo. Se obtuvieron de 100 a 1 10 mg de cicloArg cruda. Los péptidos cíclicos se sintetizan para que sean por lo menos 95% enantioméricamente puros, y tienden a variar entre 97 y 99%. Son por lo menos 95% enantioméricamente puros, cuando se sintetizan mediante este método.

Prueba de susceptibilidad antimicótica en dilución de caldo La sensibilidad de cepas de hongos relevantes para los péptidos ciclizados, se determinó usando estándares aprobados por el Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI; antes NCCLS). La susceptibilidad de los hongos se puso a prueba usando "Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi; estándar aprobado M38-F", y la susceptibilidad de las levaduras se puso a prueba usando "Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; estándar aprobado - segunda edición M27-A".

Prueba de susceptibilidad antibacteriana en dilución de caldo La sensibilidad de cepas de bacterias relevantes a los péptidos ciclizados, se determinó usando estándares aprobados por el Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI; antes NCCLS). La susceptibilidad bacteriana se puso a prueba usando "Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Anaerobically; estándar aprobado - séptima edición M7-A7".

Pruebas de hemolisis El péptido bajo estudio se distribuyó en alícuotas a la concentración deseada por triplicado en placas Nunc de 96 cavidades, y se obtuvieron diluciones en serie 1 :1 (100 pl). Se añadieron 100 pl de glóbulos rojos (RBCs) humanos agrupados (3 lavados de 50 mi de HBSS) lavados (1 x108 RBC/ml) a las cavidades de prueba, y se incubaron a 37°C por 3 horas. Después de incubación, se añadieron otros 100 pl de HBSS a todas las cavidades, y la placa se incubó a 4°C durante la noche. Se removieron 100 pl de sobrenadante, y se pusieron en una placa de microtítulo nueva que se leyó en un lector de placa Sunrise (Tascam) a 450/620 nm. Se incluyeron también cavidades control (por cuadruplicado) de regulador de pH solo, regulador de pH y RBCs, y H2O y RBCs. Los datos se graficaron, y se analizaron estadísticamente usando Graph Pad (software Prism).

Resultados Secuencia de los péptidos ciclizados La secuencia de los péptidos analizados, es como sigue: Péptido 1 : Cíclico-K-K-K-K-K-K-K Péptido 2: Cíclico-R-R-R-R-R-R-R Péptido 3: Cíclico-K-K-K-K-K-K-K-G Péptido 4: Cíclico-R-R-R-R-R-R-R-G Péptido 5: Cíclico-O-O-O-O-O-O-O-G Péptido 6: CÍCI¡CO-DR-DR-DR-DR-DR-DR-DR-G Péptido 7: CÍCI¡CO-DO-DO-DO-DO-DO-DO-DO-G Péptido 8: Cíclico-DK-DK-DK-DK-DK-DK-DK-G El prefijo "-D" indica un isómero ? del aminoácido que se usó en la síntesis de péptido. "O" representa el aminoácido no natural ornitina. Se han sintetizado péptidos cíclicos que consisten de 3, 5, 9, 1 1 , 13 ó 15 aminoácidos de arginina o lisina, y se ha determinado su actividad (datos no mostrados).

Actividad antibacteriana de los péptidos ciclizados Se expusieron cultivos de E. coli y Staphylococcus aureus al péptido 1 , y la MIC después de crecimiento durante las siguientes 16 horas a 37°C fue de 1 mM para ambos organismos (cuadro 2). El péptido 1 inhibe en total el crecimiento de E. coli Staphylococcus aureus a esta concentración. Este experimento se repitió con el péptido 2. La MIC para el péptido 2 contra E. coli fue de 0.1 mM; la MIC para el péptido 2 contra S. aureus fue de 1 .0 mM. Esto indica un impacto significativo de los péptidos ciclizados sobre la actividad bacteriana. Péptidos lineales que corresponden en tamaño a los péptidos 1 y 2, demostraron actividad significativamente menor que los péptidos 1 y 2, respectivamente.

Actividad antimicótica de los péptidos ciclizados contra Trichophyton rubrum Se puso a prueba la susceptibilidad de 7. rubrum a los péptidos 1 a 8. El péptido 1 demostró una MIC de 0.1 mM contra los cultivos de 7 rubrum (cuadro 2). El péptido 2 demostró una MIC de 0.25 mM contra los cultivos de 7. rubrum. Péptidos lineales que corresponden en tamaño a los péptidos 1 y 2, demostraron actividad significativamente menor que los péptidos 1 y 2, respectivamente. Los péptidos 3 a 8 tuvieron un residuo de glicina individual introducido en el anillo del péptido cíclico. De esta manera, los péptidos 3 a 8 tienen 8 aminoácidos de longitud, en comparación con 7 aminoácidos para los péptidos 1 y 2. Los péptidos 3 a 6 demostraron actividad antimicótica contra 7. rubrum (MIC (mM) de 4.0, 2.0, 4.0, 1.0, respectivamente). Los péptidos 7 y 8 no demostraron actividad antimicótica contra 7. rubrum a la concentración máxima puesta a prueba (4 mM). Los péptidos 3 a 6 demuestran actividad antimicótica, pero la introducción del aminoácido no catiónico glicina reduce significativamente la actividad antimicótica. Por ejemplo, esto puede verse en la actividad del péptido 2 (sin glicina; MIC = 0.2 mM) en comparación con el péptido 4 (glicina añadida; MIC = 2.0 mM) (cuadro 2). Estos datos muestran que la actividad antimicótica está presente en los péptidos cíclicos de 7 y 8 aminoácidos de longitud, pero que los péptidos de cationicidad reducida son menos antimicóticos contra T. rubrum.

Inhibición de Tríchophyton interdigitale por los péptidos ciclizados Se puso a prueba la susceptibilidad de T. interdigitale a los péptidos 2 a 8. La actividad antimicótica de los péptidos 2 a 8 contra T. interdigitale se muestra en el cuadro 2. Los péptidos 2, 4 y 6 son activos hacia T. interdigitale.

Inhibición de Cryptococcus neoformans por los péptidos ciclizados La susceptibilidad de C. neoformans a los péptidos 4 y 6 a 8 se puso a prueba usando "Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing oí Yeasts; estándar aprobado - segunda edición M27-A". El cuadro 2 demuestra que los péptidos cíclicos catiónicos 4 y 6 a 8 son antimicóticos contra la levadura patogénica C. neoformans (MICs = 1 .0 mM, 0.5 mM, 2.0 mM y 0.5 mM, respectivamente).

Actividad antimicrobiana del péptido 2 contra patógenos microbianos seleccionados La actividad antimicrobiana del péptido 2 contra 60 patógenos microbianos seleccionados, se demuestra en el cuadro 3. Como puede verse, la actividad antimicrobiana más grande (es decir, MICs más baja) se observa consistentemente contra hongos, especialmente dermatófitos, Scopulariopsis brevicaulis, Malassezia fúrfur, Candida spp. no albicans, y la bacteria E. coli.

Efecto del uso de aminoácidos enantioméricos en los péptidos ciclizados La comparación del efecto inhibidor de péptidos catiónicos cíclicos todo L y todo D, se demuestra en el cuadro 2. Los péptidos 4 y 6 son péptidos catiónicos cíclicos equivalentes todo L y todo D que contienen los aminoácidos arginina (7 aa) y glicina (1 aa). La actividad antimicotica contra 7" rubrum es mayor para la versión todo D que la versión todo L (MIC = 1 .0 y 2.0 mM, respectivamente). La actividad antimicotica contra 7. interdigitale es mayor para la versión todo D que la versión todo L (MIC = 0.25 y 0.5 mM, respectivamente). La actividad antimicotica contra la levadura C. neoformans es mayor para la versión todo D que la versión todo L (MIC = 0.5 y 1 .0 mM, respectivamente). Esto indica que la versión todo D de este péptido es más activa que la versión todo L. Los péptidos 3 y 8 son péptidos catiónicos cíclicos equivalentes todo L y todo D que contienen los aminoácidos lisina (7 aa) y glicina (1 aa). La actividad antimicótica contra T. rubrum es mayor para la versión todo L que la versión todo D (MIC = 4.0 y >4.0 mM, respectivamente). Ningún péptido demuestra actividad antimicótica contra T. interdigitale (MIC >4.0 mM para ambos péptidos).

Actividad hemolítica de los péptidos ciclizados Las actividades hemolíticas de los péptidos catiónicos cíclicos (cuadro 4) son despreciables a concentraciones mayores que las que demuestran actividad antimicótica.

Hepatotoxicidad de los péptidos ciclizados Los péptidos 2, 9 y 10 no muestran hepatotoxicidad a concentraciones similares a las que demuestran actividad antimicótica.

CUADRO 1 Agentes de acoplamiento DCC DIPCDI DPPA TFFH CIP FDPP (O-Forma) (O-Forma) (W-Forma) Sales de uronto/ amonio Sales (Ilegible) Sales de Fosfonlo HBTU: R' = R! = CH3; X = CH (estructura torma N) BOMI: R' = R2 = CH3, R3 = H; X = CH (estructura forma N) BOP: R' = R* = CH3; X = CH HBPyU: R1, R!= (CH,).; X = CH (desconocido) BD P: R1, R3 = (CH2)3, RJ = CH3; X = CH (estructura forma N) PyBOP: R', R? = (CH,).; X = CH HATU: R' = ' = CH3; X = N = (estructura forma N) DPMP: R' = R' = (CH,),. R5 = Pb; X = CH (desconocido) AOP: R' = ?' = CH3; X = N HAPyU: R\ R! = (CH,).;X = N (estructura torma N) AOMP: R', R3 = (CH,)3, R* = CH3: X = N (desconocido) DyAOP. R! = (CHj).: X = N CUADRO 2 Actividad antimicrobiana (MIC; mM) de péptidos cíclizados contra patógenos microbianos seleccionados CUADRO 3 Actividad antimicrobiana (MIC; mM) del péptido 2 contra patógenos microbianos seleccionados CUADRO 3 (CONTINUACION) 1 MRSA (S. aureus resistente a meticilina) 2Números de referencia: DM2006 517; DM2006 902; DM2006 932; M2006 953; DM2006 1008; DM2006 1093; DM2006 1377 3MSSA (S. aureus sensible a meticilina) Números de referencia: 97.2935.K; 98.1695.K; 97.2637.D; 98.2028.X; .5240.R; 00.9523.R; 03.8996.T; 98.1515.F; 00.5472.R; 00.1O39.P; .6225.E; 03.3200.J; 01 .7995.S; 03.8951 . G; 00.9521 .M; 97.1636.D.

CUADRO 4 Actividad hemolítica de péptidos seleccionados contra glóbulos rojos

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 . - Un péptido cíclico, o variante del mismo, que comprende aminoácidos de conformidad con la fórmula I: ((X)i(Y)m)n (I), en donde I y m son enteros de 0 a 10, de modo que I y m no son 0; n es un entero de 1 a 10; X y Y, los cuales pueden ser iguales o diferentes, son un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos catiónicos, para su uso como un medicamento.

2. - El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el péptido comprende de 2 a 50 aminoácidos.

3. - El péptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el péptido comprende de 3 a 15 aminoácidos.

4. - El péptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el péptido comprende de 5 a 13 aminoácidos.

5. - El péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque X y/o Y son arginina, lisina u ornitina.

6. - El péptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque X y Y son iguales, y son arginina o lisina.

7. - El péptido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque X y Y son iguales, y son arginina.

8. - El péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque X y/o Y son D-aminoácidos.

9. - El péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque X y/o Y son L-aminoácidos.

10. - El péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque I y m son un entero entre 0 y 7, y n es un entero entre 1 y 10. 1 1 . - El péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el péptido es R-R-R-R-R-R-R. 12. - Un procedimiento para la preparación de un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el procedimiento comprendiendo ciclizar un péptido de fórmula (I) por reacción del péptido con un agente de acoplamiento capaz de formar un enlace peptídico entre dos residuos de aminoácido terminales del péptido. 13. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el agente de acoplamiento es HATU -hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1 -il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio. 14. - Un péptido ciclizado obtenible mediante el procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 12 ó 13. 15. - Una composición que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. 16. - El uso de un péptido cíclico, o variante del mismo, que comprende aminoácidos de conformidad con la fórmula I: ((X)i(Y)m)n (I), en donde I y m son enteros de 0 a 10, de modo que I y m no son 0; n es un entero de 1 a 10; X y Y, los cuales pueden ser iguales o diferentes, son un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos catiónicos, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección microbiana. 17. - El uso como se reclama en la reivindicación 16, en donde la infección es una infección por hongos. 18. - El uso como se reclama en la reivindicación 17, en donde la infección por hongos es causada por un hongo patógeno derivado de un hongo del género Candida spp., Epidermophyton spp., Exophiala spp., Microsporum spp., Trichophyton spp., Tinea spp., Aspergillus spp., Blastomyces spp., Blastoschizomyces spp., Coccidioides spp., Cryptococcus spp., Histoplasma spp., Paracoccidiomyces spp., Sporotríx spp., Absidia spp., Cladophialophora spp., Fonsecaea spp., Phialophora spp., Lacazia spp., Arthrographis spp., Acremonium spp., Actinomadura spp., Apophysomyces spp., Emmonsia spp., Basidiobolus spp., Beauveria spp., Chrysosporium spp., Conidiobolus spp., Cunninghamella spp., Fusarium spp., Geotrichum spp., Graphium spp., Leptosphaeria spp., Malassezia spp., Mucor spp., Neotestudina spp., Nocardia spp., Nocardiopsis spp., Paecilomyces spp., Phoma spp., Piedraia spp., Pneumocystis spp., Pseudallescheria spp., Pyrenochaeta spp., Rhizomucor spp., Rhizopus spp., Rhodotorula spp., Saccharomyces spp., Scedosporium spp., Scopulariopsis spp., Sporobolomyces spp., Syncephalastrum spp., Trichoderma spp., Trichosporon spp., Ulocladium spp., Ustilago spp., Verticillium spp. y Wangiella spp. 19. - El uso como se reclama en la reivindicación 17, en donde la infección por hongos es una infección por dermatófitos. 20. - El uso como se reclama en la reivindicación 19, en donde la infección por dermatófitos es una infección por Tinea. 21 . - El uso como se reclama en la reivindicación 19, en donde la infección por dermatófitos es causada por un dermatófito de los géneros Trichophyton, Epidermophyton o Microsporum. 22. - El uso como se reclama en la reivindicación 21 , en donde el dermatófito es Trichophyton spp. 23. - El uso como se reclama en la reivindicación 22, en donde el dermatófito es Trichophyton interdigitale. 24. - El uso como se reclama en la reivindicación 22, en donde el dermatófito es Trichophyton rubrum. 25. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, en donde la infección por hongos es onicomicosis. 26. - El uso de un péptido cíclico, o variante del mismo, que comprende aminoácidos de conformidad con la fórmula I: ((X)i(Y)m)n (0. en donde I y m son enteros de 0 a 10, de modo que I y m no son 0; n es un entero de 1 a 10; X y Y, los cuales pueden ser iguales o diferentes, son un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos catiónicos, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una herida. 27. - Un método para tratar o prevenir una infección microbiana en un sujeto, el método comprendiendo administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido cíclico, o variante del mismo, que comprende aminoácidos de conformidad con la fórmula I: ((X),(Y)m)n (I), en donde I y m son enteros de 0 a 10, de modo que I y m no son 0; n es un entero de 1 a 10; X y Y, los cuales pueden ser iguales o diferentes, son un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de aminoácidos catiónicos. 28. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque la infección microbiana es una infección por hongos. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 27 ó 28, caracterizado además porque la cantidad terapéuticamente efectiva del péptido o variante del mismo se administra tópicamente. 30. - El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la cantidad terapéuticamente efectiva del péptido o variante del mismo se administra tópicamente a la piel o las uñas del sujeto.