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MX2008007682A - Anticuerpo anti-ilt7. - Google Patents

Anticuerpo anti-ilt7.

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Publication number
MX2008007682A
MX2008007682A MX2008007682A MX2008007682A MX2008007682A MX 2008007682 A MX2008007682 A MX 2008007682A MX 2008007682 A MX2008007682 A MX 2008007682A MX 2008007682 A MX2008007682 A MX 2008007682A MX 2008007682 A MX2008007682 A MX 2008007682A
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MX
Mexico
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ilt7
cell
antibody
seq
cells
Prior art date
Application number
MX2008007682A
Other languages
English (en)
Inventor
Yumiko Kamagawa
Naoko Arai
Koji Ishida
Minkwon Cho
Original Assignee
Sbi Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sbi Biotech Co Ltd filed Critical Sbi Biotech Co Ltd
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Abstract

Se obtuvo un anticuerpo que enlaza a IPC utilizando una célula animal en la cual la proteína de membrana celular que se puede asociar con ILT7 se expresó en conjunto en la forma de un inmunogeno. El anticuerpo de la presente invención tiene alta especificidad que permite la distinción inmunológica entre otras moléculas de la familia ILT y ILT7. El anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención se enlazó a IPC e inhibió la actividad de la misma. Con el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención, la actividad IPC puede ser inhibida y se puede tratar o prevenir una enfermedad relacionada con interferón. Se mantiene la expresión ILT7 incluso en IPC en la presencia de IFN(. Por consiguiente, se puede esperar una acción inhibidora de la actividad IPC a través del anticuerpo ILT7, incluso en un paciente con enfermedad autoinmune con una producción incrementada de IFN(.

Description

ANTICUERPO ANTI-ILT7 Campo de la Invención La presente invención se refiere a un anticuerpo que enlaza a ILT7 humano. Antecedentes de la invención El interferón (IFNa: en lo sucesivo, "interferón" se abrevia como IFN) y el interferón ß (IFNp) son conocidos como IFNs tipo 1 que poseen la actividad anti-viral o actividad anti-tumor. Por otra parte, también se ha revelado que IFNa está relacionado con una enfermedad auto-inmune, por ejemplo, la producción anormal de IFNa ha sido reportada en pacientes con las enfermedades autoinmunes que se encuentran más adelante. También se ha sugerido que los síntomas de enfermedad autoinmune se pueden reducir neutralizando IFNa.
Lupus eritematoso sistémico (Shiozawa y asociados, Arthr. & Rheum. 35, 412, 1992). Reumatismo crónico (Hopkins y asociados, Clin. Exp. Immunol. 73, 88, 1988). Se reportaron casos en los cuales los síntomas de enfermedades autoinmunes han sido manifestados o empeorados a través de la administración de IFNa2 o IFN recombinante (Wada y asociados, Am. J. Gastrowenterol, 90, 136, 1995; Pérez y asociados, Am. J. Hematol. 49, 365, 1995; Wilson LE y asociados, Semin Artritis. Rheum. 32, 163-173, 2002). Además, también se ha revelado que IFNa induce diferenciación de células dendríticas. La célula dendrítica es también una célula que presenta antígenos. Por consiguiente, se considera que la inducción a diferenciación de las células dendríticas consiste en un mecanismo importante de enfermedades autoinmunes. Se ha sugerido que existe una profunda asociación entre la inducción de diferenciación de células dendríticas de IFNa y el desencadenamiento de grupos eritematoso sistémico (Blanco y asociados, Science, 16:294, 1540-1543, 2001 ). Por lo tanto, se ha señalado que IFNa está relacionado en forma cercana con actividad anti-tumor, así como enfermedades autoínmune. Además, IFNa está implicado profundamente en el desencadenamiento de psoriasis (Nestle FO y asociados, J. Exp. Med. 202, 135-143, 2005). Se identificaron células que producen interferón (IPCs) como células que producen IFN tipo 1 en grandes cantidades asociadas con infección de virus. Algunos IPCs se presentaron en la sangre. Se considera que los linfocitos de sangre periférica abarcan el 1% o menos de los IPCs. Sin embargo, los IPCs tienen una capacidad muy superior de producir IFN. La capacidad de producir IFN que tiene IPCs, alcanza por ejemplo, 300 pg/ml/104 células. Esto es, se puede decir que la mayor parte de IFNa o I F N ß en la sangre, que se produce en infección viral, resulta de IPCs, aunque existen pocas células.
Por otra parte, los IPCs son células dendríticas linfoides no diferenciadas que se consideran como células precursoras de las células dendríticas. IPCs pueden ser referidas como células dendríticas plasmacitoides. Las IPCs se diferenciaron en células dendríticas mediante estímulo de virus e inducen la producción de IFNy o IL-10 a través de células T. Los IPCs también son diferenciados en células dendríticas mediante estímulo IL-3. Las células dendríticas diferenciadas mediante estímulo IL-3 inducen a la producción de citocina Th2 (IL-4, IL-5, y IL-10) a través de células T. Por lo tanto, IPCs tienen propiedades que les permiten ser diferenciadas en distintas células dendríticas mediante estimulo diferente. Por consiguiente, las IPCs tienen dos perfiles. Células que producen IFN y células precursoras de células dendríticas. Ambas células juegan un papel importante en el sistema inmune. En otras palabras IPC es una de las células importantes que soportan el sistema inmune en varios aspectos.
Documento de no patente 1: Shiozawa y asociados, Arthur. & Rheum. 35, 412, 1992. Documento de no patente 2: Hopkins y asociados, Clin.
Exp. Immunl. 73, 88, 1988. Documento de no patente 3: Wada y asociados, Am. J. Gastroenterol. 90, 136, 1995. Documento de no patente 4: Pérez y asociados, Am. J. Hematol. 49, 365, 1995.
Documento de no patente 5: Bianco y asociados, Science, 16:294, 1540-1543, 2001. Documento de no patente 6: Ju y asociados, Gene. 28 de abril del 2004; 331 :159-64. Documento de no patente 7: Colonna M y asociados, Seminars in Immunology 12:121-127, 2000. Documento de no patente 8: Nakajima H y asociados, J. Immunology 162: 5-8, 1999. Documento de no patente 9: Wilson LE y asociados, Semin Arthritis. Rheum. 32, 163-173, 2002. Documento de patente 1: WO03/12061 (Solicitud de Patente Norteamericana Publicada No. 2003-148316). Breve Descripción de la Invención Problemas que serán resueltos a través de la presente invención. Un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo que enlaza a tra nscripción-7 tipo inmunoglobulina (ILT7), y detectar, identificar o aislar las IPCs. Otro objeto de la presente invención es regular la actividad de las IPCs. Medios para resolver los problemas Con el objeto de regular la actividad de un factor humoral tal como IFN, es efectiva la administración de anticuerpos, que reconocen el factor. Por ejemplo, el intento de tratar enfermedades autoinmune mediante anticuerpos contra interleucina ( I L ) - o IL-4 han sido realizados (Guler y asociados, Arthritis Rheum., 44. S307, 2001 ). Además, se asume que los anticuerpos de neutralización pueden servir como agentes terapéuticos de enfermedades autoinmune, como con ¡nterferón (Stewart, TA, Citokine Growth Factor Rev. 14; 139-154, 2003). Se puede anticipar que el mismo método al descrito anteriormente es efectivo en el IFN producido por las IPCs. Sin embargo, dicho método está basado en la inhibición del efecto del factor humoral después de la producción del factor. Si la producción del factor humoral deseado puede ser controlado directamente, se pueden lograr más efectos terapéuticos sustanciales. Los anticuerpos, los cuales reconocen IPC humana han sido reportados. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-BDCA-2 es un anticuerpo monoclonal específ ico-l PC humano (Dzionek A. y asociados, J. Immunol. 165:6037-6046, 2000). Se descubrió que el anticuerpo monoclonal anti-BDCA-2 es efectivo en inhibir la producción de IFN mediante IPCs humana (J. Exp. Med. 194:1823-1834, 2001 ). Además, también se ha reportado que los anticuerpos nnonoclonales, que reconocen las células que producen ¡nterferón en ratones, inhiben la producción de ¡nterferón (Blood 1 de junio de 2004; 103/11: 4201-4206. Epub diciembre del 2003). Se reportó que el número reducido de células dendríticas se debió a anticuerpos nnonoclonales contra células dendríticas plasmacitoides en ratones (J. Immunol. 2003, 171 :6466-6477).
En forma similar, sería útil proporcionar anticuerpos que reconocen las IPCs humanas y pueden regular la actividad. Por ejemplo, los inventores de la presente invención han demostrado que un anticuerpo, el cual reconoce Ly49Q, enlaza específicamente a IPCs de ratón. Sin embargo, el anticuerpo contra Ly49Q, no interfirió con la actividad de los IPCs de ratón (Blood, 1 de abril del 2005; Vol. 105, No. 7 y pp. 2787-2792; WO2004/13325). Por otra parte, ILT7 es conocida como una molécula cuya expresión especifica se observa en células dendríticas plasmacitoides (Ju XS y asociados y Gene., 28 de abril del 2004; 331: 159-64; WO03/ 206 ). Sin embargo, no se han obtenido anticuerpos contra ILT7. Por consiguiente, los efectos de los anticuerpos en IPCs también es desconocido. ILT7 es una proteína de membrana que contiene un motivo tipo inmunoglobulina. Se ha reportado como una de las moléculas expresadas en células del sistema mieloide o sistema linfático (Colonna M y asociados, Seminars in Immunology 12:121-127, 2000). Una pluralidad de moléculas con las estructuras análogas a ILT7 se refiere como la familia ILT. La familia ILT también es estructuraimente similar a los receptores de inhibición de células exterminadoras (KIR). ILT7 tiene cuatro dominios tipo inmunoglobulina tipo C como con otras moléculas de la familia ILT. Se consideró que ILT7 envía las señales de activación a las células como con ILT1, proteína tipo ILT1, ILT8, y LIR6a. Se ha confirmado que una molécula que pertenece a la familia ILT se expresa en células del sistema de hematocitos (Young y asociados, Immunogenetics 53: 270-278, 2001; "The KIR Gene Cluster. "Carrington, Mary y Norman, Paul. Bethesda (MD): Nacional Library of Medicine (US), NCBI; 2003). Posteriormente, se detectó una alta expresión de ILT7 en células dendríticas Plasmacitoides (PDC) y se detectó una baja expresión de ILT7 en células dendríticas derivadas de monocito (MDDC) aunque una hibridación menor. Se expresaron ILT2 y ILT3 no únicamente en PDC sino también DC, obtenido de células positivas MDDC o CD34. Sin embargo, ya que mARN en ILT7 fue expresada específicamente en PDC, se descubrió que el mARN puede servir como un marcador de PDC. Además, se descubrió que en dicho momento, se redujo la expresión de ILT7 mediante estímulo de CpG (Ju XS y asociados, Gene. 28 de abril 2004; 331: 159-64; WO03/12061 ). Los inventores de la presente invención confirmaron que la expresión de ILT7 en IPC fue facilitada a través del estudio en IPC humanas. Posteriormente, los inventores de la presente invención intentaron producir anticuerpos de ILT7 y elucidar los efectos. Por ejemplo, las moléculas que constituyen las familias ILT, tales como ILT2 y ILT3, tienen alto nivel de conservación, particularmente en secuencias de aminoácidos de dominios extracelulares (figura 9). Estas familias ILT exhiben perfiles de expresión características en varias células de la sangre, respectivamente. Por consiguiente, es muy importante obtener un anticuerpo que pueda distinguirse en forma inmunológica entre otras moléculas de la familia ILT y ILT7. Sin embargo, de hecho, fue difícil producir un anticuerpo que enlace específicamente a las IPCs humanas utilizando ILT7 como un inmunogen, debido a los obstáculos que se describirán más adelante. Generalmente, se utiliza una proteína producida mediante tecnología de recombinación genética como un inmunogen con el objeto de obtener un anticuerpo que reconoce una cantidad de trazo de proteínas derivadas de organismos vivos. Los inventores de la presente invención tratarán de expresar ILT7 humano sobre las bases de la información de una secuencia base de cADN de ILT7 humano, en la cual ya había sido descubierta, y las secuencias de aminoácido codificada por la secuencia base (Acceso GenBank No. NM 012276). Sin embargo, los inventores de la presente invención pueden no producir ILT7 humano como un recombinante bajo condiciones normales. Las secuencias de aminoácido parciales de proteínas naturales con frecuencia se tratan de utilizar como un inmunogen, con el objeto de obtener un anticuerpo de proteína. Sin embargo, existen pocas secuencias de aminoácidos específicas de ILT7 humano en proteínas, ya que la homología con las secuencias de aminoácido es extremadamente alta en la familia ILT. Además, es necesario seleccionar la región constituida de la parte que es reconocida como un epítope mediaate anticuerpos en la superficie de las células con el propósito de permitir que los anticuerpos reconozcan moléculas en la superficie de las células. Por consiguiente, se ha considerado que la formación de un anticuerpo que es específico de ILT7, utilizando un fragmento de secuencia de aminoácido como un inmunogen, no es realista. Los inventores de la presente invención mostraron que un anticuerpo, el cual enlaza IPCs puede ser obtenido utilizando un inmunogen especial bajo dichas condiciones. Además, los inventores de la presente invención descubrieron que el anticuerpo obtenido de esta forma, reconoció en forma específica las IPCs humanas y además tubo un efecto en la regulación de la actividad y por lo tanto tuvo éxito en completar la presente invención. Esto es, la presente invención se refiere al siguiente anticuerpo anti-ILT7, método de producción del mismo, y uso del mismo. Efectos de la presente invención La presente invención proporciona un inmunogen útil para producir anticuerpo que reconoce ILT7 humano y un método de producción del anticuerpo ILT7 anti-humano utilizando el inmunogen. ILT7 es una proteína de membrana que pertenece a la familia ILT. Particularmente, la secuencia de aminoácido de la región extracelular es altamente conservada entre las familias ILT. Por consiguiente, es extremadamente difícil producir un anticuerpo que se distingue entre las familias ILT mediante métodos de inmunización generales. Los inventores de la presente invención mostraron que el anticuerpo, el cual reconoce ILT7 humano puede obtenerse fácilmente utilizando células animales en donde ILT7 se expresa en conjunto con la proteína de membrana celular. El anticuerpo anti-ILT7, el cual se puede obtener a través de la presente invención, tiene una alta especificidad que distingue las células que expresan otras familias ILT de las que expresan IPCs humanas. En una modalidad preferida, el anticuerpo ILT7 antihumano proporcionado por la presente invención, enlaza a las IPCs humanas. Además, el anticuerpo de la presente invención reconoce en forma específica las IPCs humanas. Por consiguiente es útil en detección, y aislamiento de IPCs. IPC es una célula que produce la mayor parte del interferón tipo 1. Por consiguiente, la detección y aislamiento son importantes en diagnóstico y estudio de enfermedades que implican las IPCs, tal como enfermedades autoinmune. Particularmente, de acuerdo con los requerimientos de la presente invención, la expresión de ILT7 en IPCs no se reduce bajo la presencia de IFNa. La expresión de IFN con frecuencia es facilitada en pacientes con enfermedades autoinmune. Esto significa que un anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención puede ser utilizado para la detección y aislamiento de IPCs, tal como los pacientes con enfermedades autoinmune en los cuales se facilita la expresión de IFNa. El anticuerpo anti-ILT7 proporcionado por la presente invención, tiene un efecto que regula la actividad de IPCs humana en una modalidad preferida. Por consiguiente, el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención puede ser utilizado para inhibir la actividad de IPCs. Tal como se describió previamente, la expresión de ILT7 en IPCs no es reducida bajo la presencia de IFNa. Por consiguiente, si la inhibición de la actividad de IPCs a través del anticuerpo de la presente invención es utilizada, se puede esperar un efecto terapéutico en los pacientes con enfermedades autoinmunes en los cuales se facilita la expresión de IFNa. Las IPCs scant producen una gran cantidad de IFN. Los anticuerpos, tal como muchas de las moléculas IFN, son necesarios para la neutralización de IFN. Sin embargo, el producir la activación de la célula se inhibe directamente en la presente invención. Como resultado, se puede esperar un fuerte efecto inhibidor en IFN, incluso si se utiliza una cantidad menor de anticuerpos en comparación con la neutralización a través del anticuerpo anti-IFN. Además, en el caso en donde IFN se produce en forma continua, se anticipa que la neutralización mediante anticuerpos IFN es una inhibición temporal. En la presente invención, ya que se inhibe la actividad de las IPCs se puede esperar un efecto de inhibición de producción de IFN durante un largo periodo de tiempo. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1a, es una fotografía en la cual se revisa la expresión de mARN del gen ILT7 mediante el método RT-PCR. Es un resultado de la expresión analizada de mARN del gen ILT7 en inmunocitos humanos. La figura 1b, es un diagrama en el cual se compara la expresión del mARN del gen ILT7 en varios tejidos y células humanas, y se revisa utilizando el método PCR cuantitativo. El eje horizontal muestra los tejidos revisados y las células, y el eje vertical muestra el nivel de expresión de ILT7, el cual es estandarizado de acuerdo con el nivel de expresión del gen GAPDH. La figura 2, es un diagrama que muestra las estructuras de la proteína ILT7, en donde la figura 2(a) muestra una secuencia de aminoácido de la proteína ILT7 y muestra además la secuencia de señal de secreción estimada y el dominio de transmembrana en los dibujos, y la figura 2(b) muestra un diagrama esquemático de proteínas ILT7 que son codificadas mediante vectores de expresión construidos. La figura 3, es un diagrama que muestra un resultado de que se introdujeron en las células el vector de expresión ILT7 y el vector de expresión FcRy, y se revisó mediante FCM la expresión de superficie celular de las moléculas ILT7. El eje horizontal muestra la intensidad de fluorescencia detectada en el anticuerpo anti-FLAG, es decir, la intensidad de la expresión de superficie celular de las moléculas ILT7 a las cuales se puede adherir la etiqueta FLAG y el eje vertical muestra el número de células. La figura 4, muestra fotografías en las cuales se introdujeron el vector de expresión ILT7 y el vector de expresión FcRy, en las células y la asociación de las moléculas fue analizada mediante inmuno-precipitación y manchado Western. Los diagramas de lado izquierdo muestran resultados de que la molécula ILT7 fue manchada con el anticuerpo anti-FLAG después de la inmuno-precipitación de la molécula FcRy con el anticuerpo anti-myc (el dibujo de arriba) y la molécula de FcRy fue manchada con anticuerpo anti-myc (el dibujo de abajo). En forma similar, los diagramas de lado derecho muestran resultados de que la molécula ILT7 fue manchada con anticuerpo anti-FLAG después de la imnuno-precipitación de la molécula FcRy con el anticuerpo anti-FLAG (arriba) y la molécula FcRy fue manchada con el anticuerpo anti-myc (abajo). La figura 5, es una fotografía en la cual la glucolisación de la molécula ILT7 fue revisada mediante la introducción del vector de expresión ILT7 y el vector de expresión FcRy en la célula y tratamiento de N -g I u cosi d a sa . El lado izquierdo de la fotografía muestra el tamaño de ILT7 en el caso en donde ILT7 no fue tratada con N-glucosidasa y el lado derecho de la fotografía, muestra el tamaño de ILT7 en el caso en donde se llevó a cabo el tratamiento con N-glucosidasa. La figura 6a, es un diagrama en el cual se revisó la capacidad de respuesta del anticuerpo monoclonal anti-ILT7 producido, mediante análisis FCM. (a) muestra el resultado del enlace del anticuerpo anti-ILT7 a la fracción IPC del BDCA-2 positivo, se analizó utilizando linfocitos de sangre periférica humanos y manchado doble con el anticuerpo anti-ILT7 del anticuerpo anti-BDCA-2. El eje vertical muestra la capacidad de respuesta del anticuerpo BDCA-2 y el eje horizontal muestra la capacidad de respuesta de cada uno de los anticuerpos anti-ILT7 producidos. La figura 6b, es un diagrama en el cual la capacidad de respuesta de los anticuerpos monoclonales anti-ILT7 producidos fue revisado mediante análisis FCM. (b) muestra un resultado en el cual se revisó el enlace del anticuerpo anti-ILT7 a la molécula ILT7 utilizando células 293T en donde se habían introducido vectores de expresión ILT7 y FcRy. El eje vertical muestra la capacidad de respuesta del anticuerpo anti-FLAG, es decir, la intensidad de expresión de las moléculas ILT7 a las cuales se adhirió la etiqueta FLAG y el eje horizontal muestra la capacidad de respuesta de los anticuerpos anti-ILT7, respectivos. La figura 7, es un diagrama en el cual entre los anticuerpos monoclonales anti-ILT7 producidos, se revisó la capacidad de respuesta de dos clones para linfocitos de sangre periférica humana, mediante análisis FCM. Las tres gráficas a la izquierda muestran los resultados del #11, y las tres gráficas a la derecha muestran el resultado del #17. Los diagramas del lado izquierdo, cada eje con la marca de ILT7, muestran la capacidad de respuesta de I LT7# 11. En forma similar, los diagramas de lado derecho, cada eje con la marca de ILT7 muestran la capacidad de respuesta de ILT7#17. La figura 8, es un resultado en el cual se comparó la actividad de enlace de los anticuerpos monoclonales anti-ILT7 producidos I LT 7# 11 y ILT7#17, con linfocitos humanos, con el del anticuerpo anti-BDCA-2 y se sometió a revisión. El eje vertical muestra la capacidad de respuesta del anticuerpo anti-CD123 y el eje horizontal muestra la capacidad de respuesta de cada anticuerpo. Esto es, cada anticuerpo enlaza a una parte de una célula positiva CD123. Esto es un diagrama que muestra los resultados en los cuales la capacidad de respuesta fue analizada cuando se estimularon células de linfocito a través de dos tipos de CPPS y IFNa. La figura 9a, es un diagrama que muestra las secuencias de aminoácido de las moléculas de la familia con homología de alto nivel con las moléculas ILT7. Cada secuencia de aminoácido de la región extracelular se muestra principalmente como una alineación; la figura 9b es una continuación de la figura 9a; y la figura 9c es una continuación de la figura 9b.
La figura 10, es un resultado en el cual se revisó la capacidad de respuesta de los anticuerpos monoclonales anti-!LT7 I LT7#11 y ILT7#17 producidos con las moléculas ILT1, ILT2 y ILT3, utilizando células en las cuales se introdujeron sus vectores de expresión. El diagrama superior muestra los resultados en donde se reafirmó la capacidad de respuesta a células en las cuales las moléculas ILT7 con la etiqueta FLAG habían sido expresadas en conjunto con FcRy. El diagrama inferior muestra los resultados de capacidad de respuesta de las células en donde se introdujeron ILT3, y FcRy (diagrama izquierdo: I LT7# 11 , diagrama derecho: ILT7#17). El eje horizontal muestra la capacidad de respuesta de cada anticuerpo anti-ILT7. La figura 11 , es un diagrama que muestra el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-ILT7 producidos I LT7# 11 y ILT7#17 en la capacidad interferogénica de los linfocitos humanos. En el diagrama, el eje horizontal muestra la concentración IFNa en un sobrenadante de cultivo cuando los linfocitos humanos fueron estimulados mediante virus de influenza y el eje vertical muestra los anticuerpos tratados. El término "sin infecciones" indica los resultados de las células las cuales no fueron estimuladas por el virus influeza. La figura 12, es un diagrama que muestra la actividad anti-ILT7 de los anticuerpos monoclonales producidos ILT7#37, ILT7#28 y ILT7#33. Incluso cuando se utilizaron anticuerpos monoclonales anti-ILT7 obtenidos de cualquier hibridoma, se exhibió el 80% o más de actividad CDC en la concentración de anticuerpos de 0.1 µ9/??? o mayor. En el caso de anticuerpos además del anticuerpo monoclonal anti-ILT7, no se observó actividad CDC de las células objetivo. La figura 13, es un diagrama que muestra la internalización de las células objetivos de los anticuerpos monoclonales anti-ILT7 producidos ILT7#17, ILT7#26, ILT7#37, ILT7#28, y ILT7#33. La intensidad de fluorescencia de APC es un indicador de la cantidad de complejo inmune del anticuerpo ILT7-anti-ILT7 el cual estuvo presente en la superficie de las células antes de la incubación, y se detectó sin importar si el complejo inmune del anticuerpo I LT7-anti-l LT7 está presente en la superficie de la célula objetivo, o si se incorpora en la célula después de la incubación. Por otra parte, la intensidad de fluorescencia de FITC es un indicador de la cantidad de complejo inmune de anticuerpo I LT71 -anti-l LT7 que permanece en la superficie de las células después de la incubación. Esto es, la intensidad de fluorescencia FITC se disminuye mediante internalización. Mejor modo de llevar a cabo la invención. Se ha reportado que ILT7 humano (transcri pción-7 tipo inmunoglobulina) es una molécula que se expresa específicamente en células dendríticas Plasmacitoides (Gene. 28 de abril del 2004; 331:1 59-64; WO03/12061 ). Como alternativa, también se ha sabido que ILT7 humano puede utilizarse como un indicador predictivo para pronósticos de linfoma (WO2005/24043). Sin embargo, aún no se ha establecido un método para producir un anticuerpo con la capacidad de reconocer ILT7 humano. ILT7 humano consiste en 499 residuos de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 2 y es una proteína de transmembrana tipo 1 que comprende cuatro dominios tipo inmunoglobulina en la estructura y una región de transmembrana (44-466; de 429 a 450 en SEQ ID NO: 2). Entre los 444 residuos de aminoácido incluyendo N-terminal, 16 residuos de aminoácido (de 15 a -1, en SEQ ID NO: 2) son secuencias de señal y de 17 a 44 residuos de aminoácidos (del 1 al 428, en SEQ ID NO:2) constituyen un dominio extracelular. Por otra parte, la región C-terminal es un dominio intracelular. La mayoría de las partes del ILT7 humanos son dominios extracelulares y los 33 residuos de aminoácidos constituyen un dominio intracelular (de 467 a 499; de 451 a 483; en SEQ ID NO: 2). No se anticipó que un motivo, el cual está implicado en la señalización, se encuentre en un dominio intracelular. En la SEQ ID NO: 2 se muestra una secuencia de aminoácido de longitud total de ILT7 humano, y la secuencia base del cADN que codifica la secuencia de aminoácido se muestra en SEQ ID NO: 1. Aquí, las regiones de codificación del péptido maduro (72)..(1520), mostrados en SEQ ID NO: 1, no comprenden los codones de término e inicio. Esto es, la secuencia que codifican la proteína que comprenden los codones de terminación e inicio en SEQ ID NO: 1 son de 24 a 1523. Se considera que la señal de ligando se transmite a las células mediante asociación del ILT7 humano con una molécula de transducción de señal. Por ejemplo, la mayor parte de las cadenas-? del receptor Fe se encuentran en las células. Además, el dominio intracelular contiene un motivo de activación a base de tirosina inmunoreceptora (ITAM) la cual está implicada en señalización. ITAM es una parte de la secuencia de aminoácido, la cual comúnmente se observa en moléculas de adaptación que están . asociadas con inmunoreceptores, tales como receptores Fe. Un motivo tal como YxxL (SEQ ID NO: 76), el cual es un objetivo de la fosforilación de tirosina, está comprendido en ITAM y la señal es transmitida mediante fosforilación. Los ejemplos conocidos de la molécula de transducción de señal, la cual comprende ITAM en un dominio intracelular, incluyen CD3 y DAP12 además de la cadena-? del receptor Fe. Entre estas moléculas de transducción de señal, la molécula asociada con ILT7 humano se anticipa que será la cadena-? del receptor Fe. Actualmente no se ha descubierto un ligando, el cual enlace a ILT7 humana. Los inventores de la presente invención, confirmaron que ILT7 se expresó específicamente en IPCs humanas mediante análisis de expresión genética. Los inventores de la presente invención consideraron que puede ser útil en el estudio de IPCs, que se pudiera obtener en forma inmunológica un anticuerpo con la capacidad de distinguir ILT7 humana de otras moléculas. Sin embargo, existen muchas moléculas con estructuras similares en la familia ILT, incluyendo ILT7. Las moléculas tales como ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6 o ILR-8 comprenden secuencias de aminoácido altamente homologas, particularmente en sus dominios extracelulares. Por consiguiente, los inventores de la presente invención consideraron que fue difícil obtener un anticuerpo con la capacidad de distinguir entres estas moléculas utilizando un péptido de dominio que comprende una secuencia de aminoácido parcial que constituye un dominio extraceluiar en la forma de un inmunogen. Posteriormente, los inventores de la presente invención han tratado de producir un anticuerpo contra ILT7 humano utilizando las células que expresan ILT7 humano como inmunogens. Sin embargo, el uso de vectores de expresión general no originó la expresión del cADN de ILT7 humano en células de animal. Se ha reportado que la molécula ILT1 que tiene una estructura muy similar a ILT7 se asocia con la cadena-? del receptor Fe. Esto es, cuando las células en las cuales se expresó la cadena-? del receptor Fe, tal como RBL (leucemia basofílica de rata), las células y las células P815 (mastocitoma de ratón) fueron utilizadas como células huésped, se observó la expresión de ILT1 en la superficie celular. Sin embargo, si ILT1 se forzó para expresarse en células 293 en donde no se expresó originalmente la cadena-? de receptor Fe, no se observó la expresión de la superficie celular. Por otra parte, se mostró que la expresión de la superficie celular de ILT1 puede confirmarse cuando ILT1 se expresa en conjunto con la cadena-? del receptor Fe (Nakajima H. y asociados, J. Immunology 162:5-8, 1999). Sin embargo, no existe información con respecto a un inmunogen para producir los anticuerpos ILT7. Por ejemplo, en el reporte, las células RBL en las cuales se introduce el gen ILT1, se utilizan como inmunogens para producir los anticuerpos ILT1. Los inventores de la presente invención trataron de producir anticuerpos ILT7 utilizando la combinación de células RBL con el gen ILT7 en la misma forma a la descrita. Sin embargo, incluso si ILT7 se forza para ser expresado en células RBL (P815), no se observó la expresión de superficie celular de ILT7 y por consiguiente, no se puede utilizar como un inmunogen. Los inventores de la presente invención han llevado a cabo una investigación dedicada con el objeto de obtener el anticuerpo con la capacidad de reconocer ILT7 humano. Como resultado, ios inventores de la presente invención descubrieron que el anticuerpo deseado puede ser producido utilizando una célula transformada específica en la forma de un inmunogen y se completó la presente invención. Esto es, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que enlaza al dominio extracelular de ILT7 humano, y se relaciona con un fragmento que comprende su región de enlace de antígenos. En la presente invención, se puede definir ILT7 humano como una molécula natural que se expresa en IPGs humano o una molécula que es inmunologicamente equivalente a ILT7, la cual se expresa en IPCs humano. En la presente invención, se puede confirmar el enlace de anticuerpos a ILT7 humana, por ejemplo, tal como se indica a continuación. - Confirmación a base de respuesta a células humanas: De acuerdo con los descubrimientos de los inventores de la presente invención, se observó la expresión específica de ILT7 humano en IPCs humanas. Originalmente, se aisló ILT7 humano como un gen cuya expresión se aprecia en células dendríticas Plasmacitoides (Blood. 2002 100; 3295-3303, Gene, 28 de abril del 2004; 331:159-64). Además, se sabe que se puede utilizar como un marcador de células dendríticas Plasmacitoides (WO03/12061). Se asume que las células dendríticas Plasmacitoides y IPCs son las poblaciones de células casi idénticas o sus partes grandes son comunes. Por consiguiente, no hay contradicción entre estos reportes y los descubrimientos de los inventores de la presente invención. Considerando el perfil de expresión de ILT7 humano, primero, la actividad de enlace de IPCs o células dendríticas Plasmacitoides al menos a un cierto subgrupo, es una de las características importantes del anticuerpo que enlaza a ILT humano en la presente invención. Los marcadores de superficie celulares específicos de poblaciones de células respectivas se pueden utilizar para determinar si una cierta célula es IPC o una célula dendrítica Plasmacitoide. Por ejemplo, el enlace a las células deseadas puede confirmarse mediante manchado doble con el anticuerpo que enlaza a los marcadores de superficie celular del anticuerpo cuya actividad de enlace debe ser revisada. Esto es, las IPCs en la presente invención comprenden, por ejemplo, células que expresan BDCA2. - Confirmación a base de capacidad de respuesta a células transformadas que expresan el gen ILT7 humano: Los inventores de la presente invención descubrieron que se reconstruyó una característica inmunológica de ILT7 expresada en IPCs cuando se llevó a cabo la expresión del gen ILT7 humano bajo una condición específica. Por consiguiente, la capacidad de respuesta de ILT7 humano también puede confirmarse con base en la capacidad de respuesta de anticuerpos a células en las cuales se introduce artificialmente un gen que codifica a ILT7. Es decir, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que comprende la secuencia de aminoácidos que constituye un dominio extracelular como el dominio extracelular y enlaza a una molécula expresada en conjunto con la molécula de transducción de señal o se relaciona con un fragmento que comprende su región de enlace de antígenos. Aquí, el dominio extracelular está compuesto de una secuencia de aminoácidos que corresponde a la posición 17 a 444 de las secuencia de aminoácido N-terminal mostrada en SEQ ID NO: 2 (de 1 a 428 en SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, las características inmunológicas de ILT7 expresado en IPCs humana se mantiene en células transfectadas en conjunto con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica el ILT7 humano y un vector de expresión que comprende el ADN que codifica la molécula de transducción de señal. Por consiguiente, se prefiere una célula transformada que expresa ILT7 humano y la molécula de transducción de señal, para confirmar la afinidad de enlace de anticuerpo al dominio extracelular de ILT7 humano en la presente invención. En la presente invención, es deseable utilizar una célula, la cual no se transforme como controles, cuando la capacidad expuesta de los anticuerpos, se contiene utilizando la célula transformada. Además, también es importante confirmar que el enlace de los anticuerpos no se detecta utilizando la mima célula huésped que expresa únicamente la molécula de transducción de señal como un control . En la presente invención, una molécula, que induce la expresión de ILT7 humano y la superficie celular, se puede utilizar como la molécula de transducción de señal para la expresión conjunta. La molécula de transducción de señal de la presente invención, también puede definirse como una molécula que puede impartir las características inmunológicas de ILT7 humano natural para al menos el dominio extracelular de la molécula ILT7 en una célula que expresa ILT7. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "característica inmunológica" de ILT7 humano natural, significa el reconocimiento mediante un anticuerpo que enlaza a las IPCs humanas. En forma especifica, es preferible utilizar la cadena-? del receptor Fe o DAP12 como una molécula de transducción de señal. En la presente invención, la cadena-? del receptor Fe es particularmente preferida como la molécula de transducción de señal. La cadena-? del receptor Fe es una molécula que consiste en una secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 16. La molécula de transducción de señal puede ser un fragmento tan largo como el ILT7 humano, que será expresado en conjunto, que se localiza en la superficie celular. Siempre que ILT7 humano será expresado en conjunto, se localiza en la superficie celular, la mutación o adición de la secuencia de aminoácido es permitida en la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 16. Esto es, la presente invención proporciona métodos para producir células que producen un anticuerpo monoclonal que enlaza al dominio extracelular del ILT7 humano, que comprende los siguientes pasos: (1) administrar a animales inmunes, una célula que expresa en forma exógena una proteína que comprende el dominio extracelular de ILT7 humano y una molécula que comprende las secuencias de aminoácido descritas en SEQ ID NO: 16; y (2) seleccionar un anticuerpo que produce células que producen el anticuerpo que enlaza a ILT7 humano de células que producen anticuerpos de animales inmunes. En forma subsecuente, como el anticuerpo que enlaza a ILT7 humano en la presente invención, es preferible utilizar un anticuerpo en el cual no se observe un cruce con poblaciones de células que son conocidas por expresar familias ILT diferentes además de ILT7. En forma específica, como el anticuerpo que enlaza ILT7 humano en la presente invención, se prefiere utilizar un anticuerpo en el cual el enlace a las poblaciones celulares que son conocidas por expresar las familias ILT además de ILT7, no pueden observarse bajo la misma condición, que la condición en la cual se confirmó el enlace a IPCs. Tal como se describió anteriormente, por ejemplo, ILT2 y ILT3 se expresan no únicamente en PDC, sino también en DC obtenidos de células positivas MDDC o CD34 (Gene. 28 de abril del 2004; 331:159-64). Por otra parte, no se puede detectar la expresión de ILT7 debido a la diferenciación de IPCs en células dendríticas. Por consiguiente, el anticuerpo que no puede detectar el enlace a DCs obtenido de células positivas MDDC o CD34 bajo la condición en la cual se puede confirmar el enlace a IPCs, está comprendido al anticuerpo que enlaza a ILT7 humano en la presente invención. Se han reportado los siguientes patrones de expresión como las otras moléculas de la familia ILT ("The KI Gene Cluster" Carrington, Mary y Norman, Paul. Bethesda (MD): Nacional Library of Medicine (US), NCBI; 2003, Gene. 28 de abril del 2004; 331:159-64). Por consiguiente, un anticuerpo que enlaza a IPCs o PDCs humanas y cuyo enlace a las células que se describen a continuación no puede ser confirmado, se incluye en un anticuerpo que tiene especificidad para ILT7: ILT1; células de linaje mieloide (monocitos, DCs derivados de monocitos, macrófagos); ILT2; IPCs, células B, células positivas CD34, DCs derivadas de células positivas CD34, y DCs derivadas de monocitos; ILT3; IPCs y DCs; ILT5; monocitos, DCs derivados de células positivas CD34 y DCs derivadas de monocitos; y ILT8; células de linaje de monocitos. Esto es, el anticuerpo monoclonal, el cual enlaza al dominio extracelular de ILT7 humano en la presente invención, comprende preferentemente un anticuerpo monoclonal el cual tiene las siguientes características inmunológicas: a) el anticuerpo monoclonal se enlaza a IPCs humano; y b) el enlace del anticuerpo monoclonal a una o más células seleccionando el grupo que consiste monocitos, macrófagos, células B, células positivas CD34 y células dendríticas derivadas de estas no pueden ser confirmadas bajo la condición de enlace a IPCs humanas. Como el anticuerpo monoclonal de la presente invención, se prefiere utilizar un anticuerpo en el cual el enlace a monocitos, macrófagos, células B, células positivas CD34 y células dendríticas derivadas de estas células no pueda ser confirmada bajo la condición de enlace, particularmente a IPCs humanas. Como alternativa, el anticuerpo monoclonal, el cual enlaza el dominio extracelular de ILT7 humana en la presente invención, comprende preferentemente un anticuerpo monoclonal el cual tiene las siguientes características inmunológicas: c) el anticuerpo enlaza a la célula transformada que es transfectada en conjunto con un vector de expresión que transporta el forma expresa el ADN que codifica el ILT7 humano, y un vector de expresión que trasporta en forma expresa el ADN que codifica la molécula de transducción de señal ; d) el enlace a la célula huésped antes de la transformación no puede ser confirmado bajo la condición para enlazar a las células transfectadas en conjunto tal como se describe en c); o El anticuerpo monoclonal de la presente invención comprende un anticuerpo monoclonal el cual tiene las siguientes características inmunológicas: e) el enlace a la célula huésped que expresa únicamente la molécula de transduccion de señal no puede ser confirmado bajo la condición de enlace a las células transfectadas en conjunto tal como en c). En la presente invención, el hecho de que ei anticuerpo monoclonal anti-ILT7 no intercepte con la familia ILT de otras moléculas, puede confirmarse utilizando células en las cuales cada familia ILT fue forzada a ser expresada. Esto es, para expresión forzada, el cADN que codifica cada familia ILT de la secuencias de aminoácido se introduce en una célula huésped adecuada. El anticuerpo monoclonal anti-ILT7 cuyo cruce debe ser confirmado, se pone en contacto con la célula transformada obtenida. Posteriormente, se puede confirmar que si el enlace del anticuerpo a la célula, que expresa a las moléculas de la familia ILT además de ILT7, no se observa, el anticuerpo tiene la capacidad de distinguir en forma inmunológica entre ILT7 y otras moléculas de la familia ILT. Por ejemplo, en ejemplos que se describen más adelante, el hecho de que el anticuerpo monoclonal anti-ILT7 obtenido a través de la presente invención no intercepte con ILT1, ILT2 y ILT3 se puede confirmar. Por consiguiente, un ejemplo preferido del anticuerpo monoclonal en la presente invención, es el anticuerpo monoclonal que enlaza a ILT7 en donde el enlace a ILT1, ILT2 y ILT3 no puede ser detectado bajo la misma condición. Particularmente, ILT2 y ILT3 son genes cuya expresión en IPCs ha sido confirmada (Ju y asociados, Gene. 331:159-64, 2004). Sin embargo, estas moléculas pueden mostrar perfiles de expresión únicos para cada tipo celular dependiendo de los niveles de diferenciación respectivos en IPCs o condiciones tales como el estímulo con viruses u otras citocinas. El uso de un anticuerpo, el cual tiene ia capacidad de distinguir inmunológicamente estas moléculas de la familia ILT de ILT7, permite detección específica de los cambios en la expresión de ILT7. El enlace de un anticuerpo monoclonal cuya actividad de enlace debe ser confirmada para varios tipos de células, se puede confirmar, por ejemplo, con base en el principio de citometría de flujo. Con el objeto de confirmar la capacidad de respuesta de anticuerpos con base en el principio de citometría de flujo, es conveniente etiquetar anticuerpos con una molécula o grupo atómico que produzca una señal detectable por adelantado. Generalmente, se utilizan etiquetas fluorescentes o luminiscentes. Se puede utilizar un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) para analizar el enlace de los anticuerpos etiquetados fluorescentes a células con base en el principio de citometría de flujo. El uso de FACS permite confirmar de manera eficiente el enlace de una pluralidad de anticuerpos a una pluralidad de células. En forma especifica, por ejemplo, el anticuerpo A el cual se ha descubierto previamente que tiene la capacidad de identificar IPCs y el anticuerpo B cuyas características de enlace a IPCs deben ser analizadas, se hacen reaccionar con poblaciones de células que comprenden IPCs al mismo tiempo. El anticuerpo A y el anticuerpo B se etiquetan con una señal fluorescente en la cual se distinguen mutuamente a través de estos anticuerpos por adelantado. En el caso en donde ambas señales son detectadas de las mimas poblaciones celulares, el enlace de dichos anticuerpos a las mismas poblaciones de células puede ser confirmado. En otras palabras, se ha descubierto que ambos de los anticuerpos A y B tienen las mismas características de enlace. En el caso en donde enlazan a diferentes poblaciones celulares, queda claro que ambos anticuerpos tienen distintas características de enlace. Un ejemplo preferido del anticuerpo monoclonal en la presente invención, puede comprender un anticuerpo monoclonal que se ha producido por el hibridoma ILT7#11 y ILT7#17. El hibridoma I LT7# 11 y el hibridoma ILT7#17 han sido depositados con el National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Internacional Patent Organism Depositary (Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Consignación del Organismo de Patente Internacional) Bajo los Números de Accesos FERM BP-1074 y FERM BP-1075 el 21 de octubre del 2005. El contenido de depósito especificado es como se indica a continuación: (a) Apelación y dirección de la institución de depósito Apelación: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, (Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Consignación del Organismo de Patente Internacional) Dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón (código zip 305-8566). (b) Fecha de depósito: 21 de octubre del 2005 (c) Número de Acceso: FERM BP-1074 (hibridoma ILT7#11) (c) Número de Acceso: FERM BP-1075 (hibridoma ILT7#17). El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede ser un fragmento que comprende su región de enlace de antígeno. Por ejemplo, se puede utilizar un fragmento de anticuerpo que comprende la región de enlace de antígeno que se obtiene mediante digestión enzimática de IgG como el anticuerpo en la presente invención. En forma especifica, los fragmentos de anticuerpos tales como Fab y F(ab')2 pueden ser obtenidos mediante digestión con papaína o pepsina. Es bien sabido que estos fragmentos de anticuerpo pueden ser utilizados como moléculas de anticuerpo que tienen afinidad para anticuerpos. Como alternativa, los anticuerpos construidos mediante recombinación genética también pueden ser utilizados siempre que se mantenga una actividad satisfactoria de eniace-antígeno. Los ejemplos de los anticuerpos construidos mediante recombinación genética, comprenden anticuerpos quiméricos, anticuerpos transplantados-CD R , Fvs de cadena simple, diacuerpos, anticuerpos lineales y anticuerpos poli-específicos formados de fragmentos de anticuerpo. Es un conocimiento, que estos anticuerpos puedan ser proporcionados utilizando anticuerpos monoclonales por células que producen anticuerpos que producen los anticuerpos. El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede ser obtenido utilizando una célula transformada específica en la forma de un inmunogen. Esto es, la presente invención se refiere a un método para producir células que producen un anticuerpo monoclonal que enlazan al domino extracelular de ILT7 humano, que comprende los pasos de: (1) administrar a animales inmune, una célula que expresa una proteína exógena que comprende un dominio extracelular de ILT7 humano y una molécula exógena que está asociada con ILT7 humano; y (2) seleccionar una célula que produce anticuerpos que produce el anticuerpo que enlaza a ILT7 humano, de las células que producen anticuerpos de animales inmunes. Las células que producen anticuerpos obtenidas de esta forma, las células que producen anticuerpos inmortalizadas son cultivadas y se puede recuperar los anticuerpos monoclonales deseados de los cultivos. Con referencia al método para inmortalizar células que producen anticuerpos, se conocen varios métodos. En el método para producir el anticuerpo monoclonal de la presente invención, los ejemplos utilizables de la molécula, que está asociada con ILT7 humano para producir una célula transformada que será utilizada como un inmunogen comprenden proteínas de membrana celular. Entre ellas, .una molécula de transduccion de señal, la cual se localiza en las membranas celulares, se utiliza preferentemente como una proteína de membrana celular en la presente invención. El término "molécula de transduccion de señal" significa una molécula que está asociada con proteínas y células que tienen estructuras de receptor en el dominio extracelular y transmite el estímulo del enlace de ligandos a receptores en las células. Los ejemplos de la molécula de transduccion de señal comprenden la cadena-? de receptor Fe, DAP12 o similares. Por ejemplo, se utiliza preferentemente la cadena-? de receptor Fe como una proteína de membrana celular en !a presente invención. Las secuencias de aminoácido de DAP12 humano y la cadena-? de receptor Fe, así como una secuencia de base de cADN, que codifica las secuencias, son conocidas públicamente. Una secuencia base de la cadena-? de receptor Fe humano y una secuencia de aminoácido que se codifica a través de la secuencia base, se muestran en las figuras 15 y 16, respectivamente. En la presente invención, una célula transformada que será utilizada como un inmunogen puede ser obtenida, preparando, por ejemplo, una célula que transporta en forma expresa los siguientes (a) y (b): (a) un polinucleótido exógeno que codifica una secuencia de aminoácido que comprende un dominio extracelular de ILT7 h u m a no ; y (b) un polinucleótido exógeno que codifica cadena-y de receptor Fe. En la presente invención, un polinucleótido exógeno significa un polinucleótido el cual se introduce artificialmente en la célula huésped. Cuando se utilizan células humanas como células, se introducen genes humanos en las células humanas. En dicha combinación, un polinucleótido introducido artificialmente, significa el polinucleótido exógeno. Por consiguiente, la expresión ectópica de ILT7 humano o la cadena-? de receptor Fe humana, está comprendida en la expresión de polinucleótido exógeno. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "dominio extracelular de ILT7 humano" significa la secuencia de aminoácido de la posición 17 a 444 de la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO: 2 al dominio extracelular de I secuencia de aminoácido (de 1 a 428 en SEQ ID NO: 2). Como una secuencia de aminoácido que comprende el dominio extracelular de ILT7 humano en la presente invención, es preferible utilizar la secuencia de aminoácido que comprende cada región, por ejemplo, comenzando del N-terminal, en el siguiente orden: [Secuencia de señal + dominio extracelular + dominio de transmembrana + región intracelular] Como alternativa, una secuencia de aminoácido, la cual carece particularmente de una región intracelular tal como se describirá mas adelante, está incluida en la secuencia de aminoácido que comprende el dominio extracelular de ILT7 humano en la presente invención. [Secuencia de señal + dominio extracelular + dominio de transmembrana + una parte de la región intracelular] Además, una estructura, la cual carece de una región intracelular, tal como se mencionará más adelante, está incluida en la secuencia de aminoácido que comprende el dominio extracelular el ILT7 humano en la presente invención. [Secuencia de señal + dominio extracelular + dominio de transmembrana] En la estructura, las regiones además del dominio extracelular pueden ser secuencias de aminoácido que son seleccionadas de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO:2, o pueden combinarse con otras secuencias de aminoácido que tienen homología con las regiones. Por ejemplo, la secuencia de aminoácido que constituye una secuencia de señal, un dominio de transmembrana, y una región intracelular puede ser una secuencia de aminoácido de las moléculas de la familia de ILT además de ILT7. O, se puede combinar con la secuencia de aminoácido de la familia de ILT en especies además de la humana. Además, la secuencia de aminoácido, que constituye regiones además del dominio extracelular, puede comprender una mutación dentro del rango con la capacidad de mantener la función de cada región. Como alternativa otras regiones pueden intervenir entre cada región. Por ejemplo, también se puede insertar una etiqueta de epítope tal como FLAG, entre las secuencias de señal y el dominio extracelular. Particularmente, la secuencia de señal es eliminada mediante procesamiento durante su transferencia a la superficie de membrana celular después de ser traducida en la proteína. Por consiguiente, la secuencia de aminoácido arbitraria que induce el tránsito de la proteína traducida a la membrana celular, se puede utilizar como la secuencia de señal. Más específicamente, es preferible utilizar la secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 2) de ILT7 humano como la secuencia de aminoácido que comprende el dominio extracelular de ILT7 humano.
Por consiguiente, la presente invención, una secuencia de base arbitraria que codifica la secuencia de aminoácido que constituye la estructura antes mencionada [Secuencia de señal + dominio extracelular + dominio de transmembrana + región intracelular] se puede utilizar, el polinucleótido que constituye el polinucleótido exógeno descrito en (a). Por ejemplo, la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2 es codificada por la secuencia base descrita en SEQ ID NO: 1. En la presente invención, un vector de expresión que transporta en forma expresa los polinucleótidos antes mencionados (a) y (b), se pueden introducir en una célula huésped adecuada con el objeto de obtener una célula transformada que será utilizada como un ¡nmunogen. Los polinucleótidos (a) y (b) pueden llevarse en un vector o en diferentes vectores. Cuando cada polinucleótido es llevado en diferentes vectores, las células huésped son transfectadas en conjunto con dos tipos de vectores. Los ejemplos preferidos de la célula huésped en la presente invención, comprenden células de mamífero. Los ejemplos específicos de la célula huésped comprenden células derivadas de humano, monos, ratones o ratas. Particularmente, las células derivadas de humanos se utilizan preferentemente como células huésped. Por ejemplo, es preferible utilizar células 293T derivadas de humano como la célula huésped en la presente invención. Las células 293T pueden ser obtenidas como ATCC CEL-11268. Además, las células derivadas de animales inmunes también pueden ser utilizadas como células huésped. Cuando las células derivadas de animales inmunes se utilizan como inmunogens, se proporciona un poco respuesta inmunológica a las células huésped. Por dicha razón, se puede obtener de manera eficiente un anticuerpo contra el dominio extracelular del ILT7 expresado en forma exógena. Por consiguiente, por ejemplo, cuando se utilizan ratones como animales inmune, las células derivadas de ratones también se pueden utilizar como células huésped. Los polinucleótidos antes mencionados pueden ser transportados en células, transportándolos en un vector con la capacidad de inducir la expresión en células huésped. Los vectores comercialmente disponibles, los cuales pueden inducir la expresión en células de mamífero, pueden ser utilizados. Los vectores de expresión tales como el Vector pCM V-Script (R), Vector PGS5 (fabricado por Stratagene), pcADN3.1 (fabricado por Invitrogen) se pueden utilizar en la presente invención. Las células transformadas obtenidas de esta forma se administran a animales inmune junto con componentes adicionales tales como adyuvantes, si es necesario. Los ejemplos utilizables de adyuvantes incluyen adyuvante completo de Freund y similares. En caso de utilizar ratones como animales inmune, las células transformadas pueden ser administradas dentro del rango de 104 a 109 células, más específicamente 104 a 106 células. Generalmente, se proporcionan múltiples dosis de inmunogen en intervalos regulares hasta que se eleva el titulador de anticuerpo. Por ejemplo, en el caso de una inmunización a corto plazo, las células transformadas son administradas en intervalos de 2 a 4 días, más específicamente en intervalos de 3 días. Después de administrar dos veces o tres veces, se puede recuperar las células que producen anticuerpos. Como alternativa, se administran una vez a la semana y las células que producen anticuerpos también se pueden recuperar después de administrarse cinco o seis veces. En la presente invención, las células que producen anticuerpos recuperadas, son clonadas para proporcionar anticuerpos monoclonales. Es preferible que las células que producen anticuerpos sean inmortalizadas para clonación. Por ejemplo, el método de fusión celular, tal como se tipifica a través del método de hibridoma o la transformación mediante virus de Epstein-Barr (EBV), se puede utilizar como el método de inmortalizacion de células que producen anticuerpos. Como para células que producen anticuerpos, una célula produce un tipo de anticuerpos. Por consiguiente el establecimiento de poblaciones de células derivadas de una célula (por ejemplo clonación), permite producir anticuerpos monoclonales. El método de hibridoma implica el proceso en el cual las células que producen anticuerpos son fusionadas con una línea celular adecuada, la cual es inmortalizadas y posteriormente sometida a clonación. Las células que producen anticuerpos inmortalizadas, pueden ser clonadas mediante una técnica tal como método de dilución limitante. Se sabe que existen lotes de líneas celulares útiles para el método de hibridoma. Estas líneas celulares son excelentes en la eficiencia de inmortalízación de células linfocíticas y tienen varios marcadores genéticos que son necesarios para seleccionar las células fusionadas con éxito. Además, cuando se pretende la producción de células que producen anticuerpos, también se puede utilizar una línea celular que carece de la capacidad de producir anticuerpos. Por ejemplo, los mielomas de ratón P3x63Ag8.653 (ATCC CRL-1580) y P3x63Ag8U.1 (ATCCCRL-1597) se utilizan ampliamente como líneas celulares útiles para el método de fusión celular para ratones o ratas. En general, se produce un hibridoma a través de la fusión de células homogéneas, en tanto que también se puede obtener un anticuerpo monoclonal de hibridoma hetero de una diferente especie entre especies relacionadas en forma cercana. Se conocen públicamente protocolos específicos de la fusión celular. Esto es, las células que producen anticuerpos de animales inmunes se mezclaron con partes de fusión adecuadas para llevar a cabo la fusión celular. Los ejemplos utilizables de la célula que produce anticuerpos incluyen células esplénicas, células de linfocitos recolectadas de nodo linfático y células B de sangre periférica. Como partes de fusión, se pueden utilizar varias líneas celulares descritas previamente. El método de polietilenglicol y el método de fusión eléctrica se pueden utilizar para la fusión celular. Posteriormente, sobre las bases de marcadores selectivos de células fusionadas, se seleccionan células fusionadas en forma exitosa. Por ejemplo, cuando se utiliza una línea celular sensible a HAT para la fusión celular, las células fusionadas con éxito, son seleccionadas, seleccionando células que crecen en un medio HAT. Además, se confirma que los anticuerpos producidos por las células seleccionadas tienen la capacidad de respuesta deseada. Cada hibridoma es clasificado con base en la capacidad de respuesta de los anticuerpos. Esto es, los anticuerpos que producen hibridomas que enlazan a ILT7 son seleccionados a través del método que se describe anteriormente. Preferentemente, cuando el hibridoma seleccionado subclonado y posteriormente se confirma finalmente la producción del anticuerpo deseado, el anticuerpo confirmado es seleccionado como un anticuerpo monoclonal que produce hibridomas de la presente invención. Específicamente, el hibridoma deseado puede ser seleccionado con base en la capacidad de respuesta a células humanas con la capacidad de respuesta a la célula transformada que expresa el gen ILT7 humano. Los anticuerpos que enlazan a células, pueden ser detectados con base en el principio de inmunoensayo. Por ejemplo ELISA, el cual utiliza células como antígenos puede ser utilizado para detección del anticuerpo deseado. En forma específica, se pone en contacto un sobrenadante de cultivo del hibridoma con un soporte en el cual la IPC humana o la célula trasformada se utiliza como un inmunogen. En el caso en donde el sobrenadante de cultivo comprende el anticuerpo deseado, el anticuerpo es atrapado en la célula inmovilizada en el soporte. Posteriormente, se separa la fase sólida del sobrenadante de cultivo, el cual si es necesario, se lava. Posteriormente, el anticuerpo atrapado en la fase sólida puede ser detectado. Un anticuerpo, que reconoce un anticuerpo, puede ser fusionado para la detección de anticuerpos. Por ejemplo, un anticuerpo de ratón puede ser detectado a través de un anticuerpo de inmunoglobulina antiratón. La detección es fácil si el anticuerpo, el cual reconoce un anticuerpo, es etiquetado. Los ejemplos utilizables de la etiqueta incluyen enzimas, tintas fluorescentes, tintas luminiscentes y similares. Por otra parte, las partículas de una pared interna de una placa de microtitulacion pueden ser utilizadas como el soporte en el cual se inmovilizan las células. Las células pueden ser inmovilizadas en partículas elaboradas de plástico o la superficie de un contenedor mediante absorción física. Los ejemplos utilizables del soporte para inmovilizar células incluyen gránulos elaborados de poliestireno y envases de reacción . En la selección de hibridomas, no se puede anticipar la producción del anticuerpo contra ILT7, sino la célula huésped de la célula transformada utilizada como un inmunogen. Por ejemplo, tal como se ¡lustra en los ejemplos, en el caso en donde se utiliza la célula humana como un inmunogen y se utiliza un ratón como un animal inmune, la célula humana es reconocida como una sustancia extraña. Por lo tanto, la producción de un anticuerpo, que enlaza a la sustancia extraña es anticipada. En la presente invención, se pretende obtener un anticuerpo con la capacidad de reconocer ILT7 humano. Por consiguiente, no es necesario obtener un anticuerpo que reconozca antígenos de célula humana además de ILT7 humano. Con el objeto de eliminar hibridomas, que producen dicho anticuerpo en la clasificación, se pueden absorber anticuerpos no deseados, antes de la confirmación de la respuesta del anticuerpo. Los anticuerpos no deseados pueden ser absorbidos por un antígeno con el cual se presume que enlaza a un anticuerpo. En forma especifica, por ejemplo, se puede absorber un anticuerpo contra antígenos de célula humana además del ILT7 humano, a través de una célula que no puede detectar la expresión de ILT7 humano. En la presente invención, es preferible utilizar la célula huésped utilizada para el inmunogen como un antígeno para absorber los anticuerpos no deseados. En forma alternativa, una célula que no expresa el dominio extracelular de ILT7 humano, sino que expresa la molécula que se asocia con ILT7, puede utilizarse como el antígeno para absorber los anticuerpos. Como con el anticuerpo monoclonal, cuya actividad enlaza al antígeno se confirma, se confirma su efecto real en la actividad IPC, si es necesario. El efecto en IPC puede ser confirmado a través de métodos tales como los métodos que se describen más adelante. Como para el anticuerpo monoclonal de la presente invención, un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal es cultivado del anticuerpo monoclonal de la presente invención, y es recuperado del cultivo resultante. El hibridoma puede ser cultivado in vitro o in vivo. En el caso de in vitro, el hibridoma puede ser cultivado utilizando un medio de cultivo conocido, tal como RPMI1640. La inmunogiobulina secretada por el hibridoma, se acumula en el sobrenadante de cultivo. Por consiguiente, el anticuerpo monoclonal de la presente invención puede obtenerse recolectando el sobrenadante de cultivo y purificándolo, si es necesario. Es más fácil purificar la inmunogiobulina cuando no se agrega suero al medio de cultivo. Sin embargo, con el propósito de una proliferación más rápida del hibridoma y la facilidad de la producción del anticuerpo, también se puede agregar al medio de cultivo suero de bovino fetal al 10%. El hibridoma puede ser cultivado in vivo. En forma especifica, el cultivo ¡ntraperitoneal del hibridoma puede elaborarse inoculando el hibridoma en la cavidad abdominal de ratones desprotegidos. Los anticuerpos monoclonales se acumulan en los ascitos. Por consiguiente, si los ascitos con obtenidos y purificados según se necesite, se puede producir el anticuerpo monoclonal requerido. Los anticuerpos monoclonales obtenidos pueden ser modificados o procesados en forma adecuada de acuerdo con el uso proyectado. El anticuerpo monoclonal de la presente invención, puede ser expresado obteniendo el cADN que codifica la región de enlace de antígeno dej anticuerpo del hibridoma e insertándolo en un vector de expresión adecuado. La técnica, en la cual el cADNA que codifica una región variable de un anticuerpo se obtiene y posteriormente se expresa en una célula huésped adecuada, es bien conocida. Además, también se conocen un método en el cual un anticuerpo quimérico se elabora ligando una región variable que comprende la región de enlace de antígenos en una región constante. Los ejemplos preferidos del anticuerpo monoclonal de la presente invención comprenden anticuerpos monoclonales producidos mediante el hibridoma #11 (Número de Acceso: FERM BP-10704), hibridoma #17 (Número de Acceso: FERM BP- 10705), o hibridoma #37. Las secuencias de aminoácidos que construyen las regiones variables de estos anticuerpos monoclonales, así como las secuencias base de cADN que codifica los mismos se describirá más adelante. Por consiguiente, por ejemplo los anticuerpos quiméricos que serán obtenidos conjugando estas regiones variables a los genes constantes de otras inmunoglobulinas, son preferidos en la presente invención. En secuencias de aminoácido descritas en el listado de secuencias, la secuencia de aminoácido de 1 al C término, constituye una proteína madura. Esto es, la secuencia de aminoácido consecutiva de 1 al C término de cada secuencia de aminoácido, es una secuencia madura de cada secuencia de aminoácido. Por otra parte, la secuencia de aminoácido representada por un valor numérico de N término a -1 es una secuencia de señal.
Región variable de cadena pesada Región variable de cadena ligera #11 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 40 (secuencia base) (secuencia base) SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 41 (secuencia de aminoácido) (secuencia de aminoácido) #17 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 44 (secuencia base) (secuencia base) SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 45 (secuencia de aminoácido) (secuencia de aminoácido) #37 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 48 (secuencia base) (secuencia base) SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 49 (secuencia de aminoácido) (secuencia de aminoácido) Por ejemplo, un anticuerpo quimérico de ratón (región variable)-humano (región constante), puede elaborarse ligando estos genes de región variable en una región constante de cadena pesada I g G 1 humana y un gen que codifica la región constante de cadena ligera kappa Ig humana, respectivamente.
Las secuencias de aminoácido de dicho anticuerpo quimérico y las secuencias bases que codifican los mismos se describen respectivamente más adelante. Los anticuerpos quiméricos especificados por estas secuencias muestran la construcción de una modalidad preferida de un anticuerpo monoclonal anti-ILT7 en la presente invención. En las siguientes secuencias de aminoácidos de anticuerpos quimérico. La secuencia del N término a -1, corresponde a la secuencia de señal, y la secuencia de aminoácido del 1 a C término corresponden a la proteína madura. Esto es, un anticuerpo quimérico que comprenden de cadena ligeras y pesadas, que consisten en la secuencia de aminoácido de 1 al C término para cada secuencia de aminoácido, se prefiere en la presente invención. Cadena pesada Cadena ligera #11 SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 52 (secuencia base) (secuencia base) SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 53 (secuencia de aminoácido) (secuencia de aminoácido) #17 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 56 (secuencia base) (secuencia base) SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 57 (secuencia de aminoácido) (secuencia de aminoácido) Además, la actividad de enlace de antígenos del anticuerpo monoclonal también puede ser injertada a otras inmunoglobulinas. La región variable de inmunoglobulina está comprendida de una región de determinación de complementariedad (CDR) y una región de estructura. La propiedad de enlace de antígeno de cada de inmunoglobulina se determina mediante CDR y la estructura mantiene la estructura de la región de enlace de antígeno. La secuencia de aminoácido de CDR es extremadamente rica en diversidad, en tanto que la secuencia de aminoácido de la parte de la estructura es altamente conservada. Se sabe que la secuencia de aminoácido que constituye CDR se incorpora en la región de estructura de las otras moléculas de inmunoglobulina, que permiten el injerto de la actividad del enlace de antígenos. Se ha establecido el método en el cual se injerta la propiedad de enlace de antígenos de diferentes inmunoglobulinas, a inmunoglobulina humana utilizando este proceso. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "región de enlace de antígeno" puede comprender la CDR que se injerta a la estructura. Por consiguiente, el término "fragmento que comprende la región de enlace" de un cierto "anticuerpo monoclonal", comprende un fragmento de inmunoglobulina humana que comprende la región variable a la cual se injerta la CDR del anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, cada una de las secuencias de aminoácido de las regiones variables antes mencionadas, comprenden las siguientes secuencias de aminoácido (SEQ ID Nos) en la forma de CDRs.
CDR1 CDR2 CDR3 #11 cadena pesada SDYAWN YISYSGSTSYNPSLKSR SPPYYAMDY (58) (59) (60) #11 cadena ligera KASQDVGTAVA WASTRHT QQYSSYPLT (61) (62) (63) #17 cadena pesada SYWIH RIYPGTGSTYYNEKFKG YPTYDWYFDV (64) (65) (66) #17 cadena ligera RASQSISNYLH YASQSIS QQSNSWPLT (67) (68) (69) #37 cadena pesada SDYAWN YISYSGSTSYNPSLKSR ALPLPWFAY (70) (71) (72) #37 cadena ligera KASQDVGTAVA WASTRHT QQYSSYPYT (73) (74) (75) Con base en la información de la secuencia de base que codifica las secuencias de aminoácido antes mencionadas y la información de la secuencia de base que codifica la estructura de la inmunoglobulina (FR), se puede diseñar un sebador y se puede amplificar un cADN que tenga una secuencia de base obtenida conjugando ambas de las secuencias base. La operación se repite para cada estructura y se puede construir una región variable en la cual CDR1, CDR2, y CDR3 de los ratones se conectan mediante FR humano. Además, cuando la secuencia de base, que codifica una región constante de inmunoglobulina humana, se conjuga según lo necesario, se puede obtener un anticuerpo humanizado con la región constante. En la forma del anticuerpo quimérico que comprende las regiones variables antes mencionadas o el anticuerpo humanizado al cual se injerta la CDR que constituye una región variable, un anticuerpo con una región constante derivada de IgG o IgM está comprendido en un anticuerpo preferible en la presente invención. Los inventores de la presente invención confirmaron que el anticuerpo monoclonal contra ILT7 mostró una acción CDC en células que expresan ILT7. Por consiguiente, el anticuerpo que tiene una región constante derivada de IgG o IgM, exhibe citotoxicidad contra células que expresan ILT7, debido al efecto CDC. Dichos anticuerpos son útiles para inhibir el número de células que expresan ILT7, tales como I PCs. El anticuerpo quimérico con la capacidad de reconocer ILT7 o un anticuerpo humanizado, que se proporciona a través de la presente invención, se puede producir mediante ingeniería genética utilizando polinucleótidos que codifican estos anticuerpos. Por ejemplo, un polinucleótido que es la secuencia base descrita en las siguientes SEQ ID NOs: y que codifica la secuencia de aminoácido, constituye una proteína madura de cada secuencia de aminoácido que puede ser utilizada como un polinucleótido que codifica la región variable de #11 o #17. La secuencia de aminoácido consecutiva de 1 al C término de cada secuencia de aminoácido corresponde a una proteína madura. En el caso en donde cada proteína madura es expresada como una proteína separada, es preferible colocar la señal de secreción en el N-término de cada secuencia de aminoácido. Por ejemplo, en la secuencia de aminoácido mostrada en estas SEQ ID NOs:, la secuencia del N término -1 puede ser utilizada como una secuencia de señal, cuando dichas proteínas son expresadas en células animales. Como alternativa, estas regiones variables pueden ser secretadas como proteína maduras utilizando una secuencia de señal arbitraria que permite la secreción de inmunoglobulina. #11 SEQ ID NO: 50 (secuencia base) SEQ ID NO: 52 (secuencia base) #17 SEQ ID NO: 54 (secuencia base) SEQ ID NO: 56 (secuencia base) En la misma forma que se describió anteriormente, como para el polinucleótido que codifica el anticuerpo humanizado, se puede elaborar un polinucleótido que expresa el anticuerpo humanizado, utilizando la secuencia base que codifica una proteína que tiene la secuencia de señal que será agregada al N-término. Cuando las cadenas pesadas y ligeras son llevadas en regiones separados, ambos vectores son transfectados en conjunto en la misma célula huésped. Las cadenas pesadas y ligeras expresadas de cada vector, son utilizadas para construir una molécula de inmunoglobulina con ambas cadenas. O, también se puede llevar en el mismo vector un polinucleótido que codifica una cadena pesada y un polinucleótido que codifica una cadena ligera. La célula huésped en la cual se transfecta en conjunto que lleva ambos polinucleótidos, expresa cadenas pesadas y ligeras y produce una inmunoglobulina que tiene ambas cadenas. Estos polinucleótidos pueden ser expresados como anticuerpos utilizando un sistema de huésped-vector con la capacidad de expresar un gen de anticuerpos. Además, en el caso en donde se expresan como una molécula de proteína simple, conectando una región variable de cadena pesada con una región variable de cadena ligera, se puede colocar una secuencia de señal en el N término de la molécula de la proteína. Un ejemplo conocido de dicha molécula de anticuerpo, incluye una molécula scFv en la cual se conectan a través de un enlazador una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera. Cada uno de los anticuerpos monoclonales producidos de esta forma está comprendido en el anticuerpo monoclonal de la presente invención. En otras palabras, un anticuerpo monoclonal, que consiste en una ¡nmunoglobulina que comprende la región de enlace de antígenos codificada por un polinucleótido derivado del cADN que codifica la región de enlace del antígeno de los anticuerpos monoclonales antes mencionados, está comprendida en el anticuerpo monoclonal, en la presente invención. Tal como se describió anteriormente, las células RBL en las cuales el gen ILT1 fue forzado para ser expresado, se puede utilizar como un inmunogen para obtener anticuerpos ILT1. Sin embargo, la expresión de ILT7 en la superficie de las células RBL (P815) puede no ser confirmado y por lo tanto puede no utilizarse como un Inmunogen. Los inventores de la presente invención descubrieron que la expresión de ILT7 humano en la superficie celular puede ser inducida mediante la expresión conjunta del ILT7 humano y las otras proteínas en membrana celular que se asocian con ILT7 humano. Posteriormente, los inventores de la presente invención descubrieron que el anticuerpo, el cual enlaza a IPCs humanas, puede ser obtenido utilizando la célula transformada cuya expresión es inducida de esta forma como un inmunogen y se completó la presente invención. Esto es, la presente invención proporciona el inmunogen para producir el anticuerpo que enlaza al dominio extracelular de ILT7 humano, y comprende células de animales en las cuales (a) un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácido comprende el dominio extracelular de ILT7 humano; y (b) un polinucleótido que codifica la cadena-? de receptor Fe mantenida para ser expresada en forma exógena o fracciones de membrana celular del mismo. Ya han transcurrido seis años o más, desde que la estructura de ILT7 humana fue descubierta en el año de 1998. Sin embargo, el anticuerpo con la capacidad de reconocer en forma específica ILT7 aún no ha sido obtenido. El anticuerpo con la capacidad de reconocer ILT7 humano fue proporcionado utilizando el inmunogen de la presente invención por primera vez. Esto es, la presente invención proporciona el anticuerpo con la capacidad de reconocer ILT7 humano que se puede obtener a través de los siguientes pasos: (1) administras a animales inmunes una célula que expresa en forma exógeno a una proteína que comprende un dominio extracelular de ILT7 humano y una molécula que está asociada con ILT7 humano. (2) seleccionar el anticuerpo que produce células que producen el anticuerpo que enlaza a ILT7 humano, de células que producen anticuerpos de animales inmune; y (3) cultivar las células que producen anticuerpos seleccionadas a través del paso (2) y recuperar un anticuerpo con la capacidad de reconocer ILT7 humano de los cultivos. Se descubrió que el ILT7 humano se expresó en forma específica en IPC humano. En el análisis de la expresión genética mediante SAGE que se llevó a cabo por parte de los inventores de la presente invención, la expresión específica de ILT7 humana en IPC humana también fue confirmada. Sin embargo, en los reportes anteriores, los niveles de expresión de ILT7 de ambos casos fueron analizados con base en mARN. Ya que el anticuerpo con la capacidad de detectar ILT7 humano no fue proporciona, el estado de expresión de la proteína no se analizó de manera convencional. El análisis de la proteína ILT7 humana fue realizado mediante la provisión del anticuerpo que enlaza al dominio extracelular de ILT7 humano en la presente invención. Los inventores de la presente invención realmente confirmaron que el anticuerpo monoclonal que enlaza al dominio extracelular del ILT7 humano con base en la presente invención, detecta en forma específica las IPCs humanas. Esto es, la presente invención se refiere a un método para detectar células que producen interferón en donde el método comprende los pasos de: contactar un anticuerpo monoclonal que enlaza al dominio extracelular del ILT7 humano o un fragmento que comprende la región de enlace de antígenos con una célula de prueba; y detectar el anticuerpo monoclonal el cual enlaza a células o un fragmento que comprende su región de enlace de antígenos. La detección de ILT7 humano con base en la presente invención, permite determinar si una cierta célula es IPC. Esto es, la presente invención proporciona un método para identificar IPCs utilizando ILT7 humano como un indicador. O, las IPCs humanas pueden ser separadas separando las células en las cuales ILT7 humano se detecto con base en la presente invención. Esto es, la presente invención proporciona un método para separar IPCs utilizando ILT7 humano como un indicador. Con base en el análisis mediante el anticuerpo ILT7 humano, se confirmó que el nivel de expresión de ILT7 en IPCs, cuya diferenciación fue inducida por CpG, similar, fue reducido. Esto es, la IPCs antes de que se induzca su diferenciación, pueden ser detectadas en forma específica utilizando ILT7 como un indicador. En otras palabras, el anticuerpo monoclonal de la presente invención es útil, particularmente para detectar IPCs antes de su diferenciación en células dendríticas. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "IPCs antes de su diferenciación" se puede definir como poblaciones celulares que mantienen la capacidad de producir ¡nterferón. En la presente invención, el anticuerpo monoclonal que enlaza al domino extracelular de ILT7 humano o al fragmento que comprende su región de enlace de antígenos, se puede etiquetar por adelantado. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser detectados fácilmente etiquetando con tintas luminiscentes o tintas fluorescentes. Más específicamente, el anticuerpo etiquetado con tinta fluorescente se pone en contacto con una población celular que puede comprender IPCs, y posteriormente células a las cuales el anticuerpo de la presente invención enlazado puede ser detectado utilizando la tinta fluorescente como un indicador. Además, las IPCs pueden ser separadas separando las células en las cuales se detecta la tinta fluorescente. Se puede llevar a cabo fácilmente una serie de pasos con base en el principio de FACS. Como alternativa, el anticuerpo de la presente invención puede ser enlazado por anticipado a un soporte de fase sólida, tal como partículas magnéticas. El anticuerpo enlazado al soporte de fase sólida reconoce ILT7 humano y posteriormente las IPCs se atrapan en el soporte de fase sólida. Como resultado, las IPCs pueden ser detectadas o separadas. El anticuerpo necesario para el método para detectar IPCs con base en la presente invención, se puede proporcionar como un reactivo para detectar IPCs. Esto es, la presente invención proporciona un reactivo para detectar células que producen interferón, en donde el reactivo comprende el anticuerpo monoclonal que enlaza al dominio extracelular de ILT7 humano o al fragmento que comprende su región de enlace de antígeno. El reactivo para detectar IPCs de la presente invención, se puede utilizar en combinación con un control positivo o un control negativo además de los anticuerpos. Por ejemplo, las células transformadas que expresan el dominio extracelular de ILT7 humano se utilizan para el ¡nmunogen, así como las IPCs obtenidas de humanos pueden ser utilizadas como controles positivos. Normalmente, únicamente se pueden obtener unas cuantas IPCs humanas de la sangre periférica. Por consiguiente, es preferible utilizar, particularmente una célula transformada como el control positivo en el reactivo de la presente invención. Por otra parte, se puede utilizar como el control negativo una célula arbitraria, la cual no expresa ILT7 humano. Esto es, la presente invención proporciona un equipo para detectar IPCs humanas que comprende: (a) el anticuerpo monoclonal que enlaza al dominio extracelular de ILT7 humano o al fragmento que comprende su región de enlace de antígenos; y (b) la célula que expresa una proteína exógena que comprende el dominio extracelular del ILT7 humano, y una molécula exógena que está asociada con ILT7 humano. Los inventores de la presente invención analizaron el efecto del anticuerpo que enlaza al dominio extracelular del ILT7 humano en IPCs. Como resultado, se confirma que el anticuerpo, el cual enlaza al dominio extracelular de ILT7 humano, inhibe la actividad de IPCs. Esto es, la presente invención se refiere a un método para inhibir la actividad de células que producen interferón, comprendiendo un paso para contactar cualesquiera de los siguientes componentes con células que producen interferón: (a) un anticuerpo monocional que enlaza a ILT7 humano e inhibe la actividad de células que producen interferón o un fragmento que comprende su región de enlace de antígenos; y (b) una inmunoglobulina a la cual se injerta una región de determinación de complementariedad del anticuerpo monocional descrito en (a) o un fragmento que comprende su región de enlace de antígenos. O, la presente invención se refiere a un método para inhibir la actividad de células que producen interferón en donde el método comprende el paso de administrar cualesquiera de los siguientes componentes a los organismos vivos: (a) el anticuerpo monocional que enlaza a ILT7 humano inhibe la actividad de células que producen interferón o un fragmento que comprende su región de enlace de antígeno; (b) un fragmento que comprende la inmunoglobulina a la cual una región de determinación de complementariedad del anticuerpo monoclonal descrito en (a) se injerta o un fragmento que comprende su región de enlace de antígenos; y (c) un polinucleótido que codifica los componentes descritos en (a) o (b). Tal como se utiliza en la presente invención, el término "células que producen interferón (IPCs)", significa células que tienen la capacidad de producir IFN y expresan ILT7 en la superficie celular. En lo sucesivo a menos que se observe lo contrario, el término "IPCs" comprende no únicamente células que son células precursoras de células dendríticas, sino también células que tienen la capacidad de producir IFN y expresar ILT7 en la superficie celular. Los métodos para identificar dichas IPCs son comúnmente conocidos. IPCs se puede distinguir de otras células sanguíneas utilizando algunos marcadores de superficie celular como indicadores. En forma específica, un perfil de marcadores de superficie celular de IPCs humanas, se describe a continuación (Shortman, K. y Liu, YJ. Nature Reviews 2:151-161, 2002). En años recientes, un cierto reporte ha sugerido que las células positivas BDCA-2 son definidas como IPC (Dzíonek, A, y asociados, J. Immunol. 165:6037-6046, 2000). [Perfil de antígeno de superficie celular de IPCs humanas] CD4 positiva, CD123 positiva, Linaje (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56) negativo, y CD112c negativo. Por consiguiente, también se dice que las IPCs son células que tienen el perfil de expresión de estos marcadores conocidos y tienen la capacidad de producir IFN. Además, las células en organismos vivos con la capacidad de producir IFN, están comprendidas en IPCs, incluso si las células son una población celular con perfiles diferentes al patrón de expresión del perfil de expresión de estos marcadores. Además, los ejemplos de las características, las cuales comúnmente se observan en IPCs humanas, son como se indica a continuación: [Característica morfológica de las células] - Similar a células de plasma - Células redondas con una superficie celular suave - El núcleo es relativamente grande [Característica funcional de las células] Durante infección por virus, se produce una gran cantidad de interferones Tipo-1 en un período de tiempo corto. Diferenciadas en células dendríticas después de infección por virus. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "inhibición de la actividad de IPCs", significa la inhibición de al menos una de las funciones de IPCs. Los ejemplos de la función de IPCs, incluyen la producción de IFN y la supervivencia celular. La supervivencia celular también puede ser traducida en el número de células. Por consiguiente, en el caso de inhibir ambas o cualquiera de estas funciones, se dice que la actividad IPCs es inhibida. Se descubrió que el IFN tipo 1 producido por las IPCs conduce a varias enfermedades. Por consiguiente, la inhibición del número de IPCs y producción IFN, es útil para una estrategia de tratamiento médico de dichas enfermedades. Por ejemplo, la relación entre la condición patológica de enfermedades autoinmune IFNa ha sido señalada de manera especial. La mayor parte del IFNa es producido por IPCs. Por consiguiente, las condiciones patológicas originadas por IFNa pueden ser aliviadas inhibiendo la producción de IFNa. Como se utiliza en la presente invención, el término "inhibición de producción IFN mediante IPCs" significa la inhibición de la producción de al menos una de las IFN producidas por IPCs. Preferentemente IFN en la presente invención, es IFN tipo 1. Entre ellas, IFNa es importante. Esto es, la presente invención se refiere a un inhibidor de la producción de IFN que comprende un anticuerpo que enlaza al dominio extracelular de ILT7 como un ingrediente activo. La presente invención proporciona un método para inhibir la producción de IFN, en donde el método comprende el paso de administrar el anticuerpo que enlaza al dominio extracelular de ILT7. Además, la presente invención se refiere al uso del anticuerpo que enlaza al dominio extracelular de ILT7 en la producción de una composición medicinal para inhibir la producción de IFN. Las células en las cuales se produce una gran cantidad de IFN a través de un pequeño número de células, están incluidas en IFNa. Por ejemplo, las células precursoras de células dendríticas estimuladas por viruses y similares producen la mayor parte del IFN producido por el cuerpo ivo. La inhibición del número de IPCs que producen un lote de IFN, da como resultado la supresión de la producción de IFN. Por consiguiente, se pueden reducir las condiciones patológicas originadas por IFNa, inhibiendo el número de IPCs. Se confirmó que el anticuerpo monoclonal anti-ILT7 a células que expresan ILT7, y posteriormente el efecto de citotoxicidad, fue determinado por la Citotoxicidad Dependiente de Complemento (CDC) en una modalidad preferida de la presente invención. El efecto CDC es uno de los mecanismos importantes del fármaco de anticuerpo. El anticuerpo monoclonal anti-ILT7 de la presente invención también tiene potente citotoxicidad contra células que expresan ILT7, tal como IPCs, debido al efecto CDC del mismo. Esto es, como para el anticuerpo monoclonal anti-ILT7, el efecto de inhibición de producción de IFN puede esperarse a través de la citotoxicidad contra IPCs, además del mecanismo de inhibición de la producción IFN en una modalidad preferida. El anticuerpo, el cual reconoce el dominio extracelular de ILT7 humano que será utilizado para !a presente invención, puede ser obtenido con base en el método descrito previamente. El anticuerpo de la presente invención puede ser de cualquier clase. Las especies de organismos de las cuales se deriva el anticuerpo, no están limitadas. Además, se puede utilizar como un anticuerpo, un fragmento que comprende la región de enlace de antígeno del anticuerpo. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo que comprende la región de enlace de antígeno que se obtiene mediante digestión enzimática de IgG, se puede utilizar como el anticuerpo en la presente invención. En forma específica, los fragmentos de anticuerpo tales como Fab y F(ab') pueden ser obtenidos mediante digestión con papaína o pepsina. Es bien sabido que estos fragmentos de anticuerpos pueden ser utilizados como moléculas de anticuerpos que tiene afinidad para anticuerpos. En forma alternativa, también se pueden utilizar anticuerpos construidos mediante recombinación genética, siempre que se mantenga una actividad de enlace de antígenos satisfactorio. Los ejemplos de los anticuerpos «construidos mediante recombinación genética incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos transplantados con CDR, Fvs de cadena simple, diacuerpos, anticuerpos lineales y anticuerpos poliespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. Es un conocimiento común que estos anticuerpos puedan ser proporcionados utilizando anticuerpos monoclonal. En la presente invención, los anticuerpos pueden ser modificados, si es necesario. De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo, el cual reconoce el dominio extracelular de ILT7 humano, tiene un efecto de inhibición de la actividad de IPCs. Esto es, se contempla que el propio anticuerpo tenga citotoxicid ad contra IPCs. Se conocen subclases de anticuerpos que exhiben potente actividad efectora. Como alternativa, se puede aumentar de manera adicional el efecto de inhibición en la actividad IPC, modificando anticuerpos con un agente citotóxico. Los ejemplos de agentes citotóxicos se describen más adelante. Toxinas: endotoxina Pseudomonas (PE), toxina de difteria, ri ci n a . Radioisótopos: Tc99m, Sr89, I131, Y90 Agentes anti-cáncer calicamicin, mitomixin, paclitaxel. Las toxinas que consisten en proteínas pueden ser conjugadas para anticuerpos o sus fragmentos con un reactivo bifuncional. Como alternativa, se conecta un gen que codificas una toxina con un gen que codifica un anticuerpo y se pueden obtener proteínas de fusión de ambos genes. El método para conjugar anticuerpos con radioisótopos también es conocido. Por ejemplo, se conoce el método para etiquetar anticuerpos con radioisótopos utilizando un agente de quelación. Además, los anticuerpos anti-cáncer pueden ser conjugados a anticuerpos utilizando cadenas de azúcar o el reactivo bifuncional.
Los inventores de la presente invención han confirmado un fenómeno en el cual un anticuerpo monoclonal que enlaza a ILT7 expresado en una membrana celular se incorpora en células después del enlace (¡nternalización). Por consiguiente, los agentes citotóxicos pueden ser suministrados en células contactando los anticuerpos conjugados con estos agentes citotóxicos de la presente invención con células que expresan ILT7. Esto es, la presente invención proporciona un inhibidor activo de células que expresan ILT7, que comprende un anticuerpo monoclonal anti-ILT7 al cual se conjuga el agente citotóxico como un ingrediente activo. O, la presente invención se-refiere al uso de un anticuerpo monoclonal anti-ILT7 al cual se conjuga el agente citotóxico en la producción del inhibidor activo de células que expresan ILT7. Además, la presente invención proporciona el método para inhibir la actividad de células que expresan ILT7, en donde el método comprende el paso de administrar un anticuerpo monoclonal anti-ILT7 al cual se conjuga el agente citotóxico. En la presente invención, un anticuerpo cuya estructura es modificada artificialmente atmósfera puede ser utilizado como un ingrediente activo. Por ejemplo, los diversos métodos de codificación son conocidos con el objeto de mejorar la citotoxicidad y estabilidad de los anticuerpos. En forma especifica, se conoce una ¡nmunoglobulina en la cual se modifican las cadenas de azúcar de las cadenas pesadas (Shinkawa, T y asociados, J. Biol. Chem. 278:3466-3473, 2003). Se mejora la actividad de Citotoxicidad Trasmitida por Célula Dependientes de Anticuerpos (ADCC) de la inmunoglobulina mediante la modificación de cadenas de azúcar. O, también se conoce una inmunoglobulina en la cual se modifica la secuencia de aminoácido de la región Fe. Esto es, se aumenta la actividad ADCC mediante el incremento artificial de la actividad de enlace de inmunoglobulina al receptor Fe (Shield, RL. y asociados, J. Biol. Chem. 276; 6591-6604, 2001). IgG, la cual enlaza al receptor Fe que incorpora en las células una vez. Posteriormente, IgG se enlaza al receptor Fe el cual se expresa en endosomas y se libera nuevamente en la sangre. Este fenómeno ha sido revelado. IgG con una alta actividad de enlace con el receptor Fe, tiene una mejor oportunidad de liberarse en la sangre nuevamente después de su incorporación en las células. Como resultado, el tiempo de retención de IgG en la sangre se prolonga (Hinton, PR, y asociados, J Biol Chem. 279:6213-6216, 2004). Además de esto, se dice que la modificación de la secuencia de aminoácido de la región de Fe se origina un cambio de la actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Estos anticuerpos modificados pueden ser utilizados como el anticuerpo en la presente invención. Cuando el anticuerpo, el cual enlaza al domino extracelular de ILT7 humano, se contacta con IPCs, se inhibe la actividad de IPCs. Por consiguiente, estos anticuerpos pueden ser utilizados para un inhibidor o método para inhibir la actividad de IPCs. Esto es, la presente invención proporciona un inhibidor activo de IPCs que comprende al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en los siguientes, (a) a (c) como un ingrediente activo. O, la presente invención se refiere a un método para inhibir la actividad de IPCs, en donde el método comprende el paso de administrar al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c). Además, la presente invención se refiere al uso de al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c), en la producción de un inhibidor activo de IPCs: (a) el anticuerpo monoclonal que enlaza a ILT7 humano o un fragmento que comprende su región de enlace a antígeno; (b) la inmunoglobulina a la cual se injerta la región de determinación de complementariedad del anticuerpo descrito en (a), o un fragmento que comprende su región de enlace de antigenos; y (c) un polinucleótido que codifica componentes descritos en (a) o (b) En la presente invención, el anticuerpo monoclonal, el cual reconoce el dominio extracelular de ILT7 humano, se puede utilizar como el anticuerpo monoclonal que inhibe la actividad de IPCs. En la presente invención, se pueden utilizar uno o más anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, se combinan uno o más anticuerpos monoclonales, los cuales reconocen el dominio extracelular de ILT7, para utilizarse en la presente invención. Se puede confirmar que los anticuerpos tienen un efecto de inhibición en la producción IFN a través de IPCs, en la forma que se describe más adelante. IPCs produce una cantidad de IFN debido a la estimulación de virus. Los anticuerpos se proporcionan antes a IPCs, después, al mismo tiempo que el estímulo de IPCs con virus. La capacidad de producir IFN para cada una de las IPCs resultantes, se compara con la de cada control al cual no se proporcionan los anticuerpos. La capacidad de producir IFN puede ser evaluada midiendo IFNa o ???ß contenido en sobrenadante de cultivo de IPCs. Como resultado de la comparación, se puede confirmar que los anticuerpos probados son efectivos para inhibir la capacidad de producir IFN, cuando la cantidad de IFN en el sobrenadante es disminuida significativamente a través de la adición de anticuerpos. Estos métodos para medir IFN son conocidos. IPCs produce la mayor parte de IFN en el cuerpo vivo. Por consiguiente, el estado que produce IFN en el cuerpo vivo, puede ser regulado inhibiendo la capacidad de producir IFN de IPCs.
En la presente invención, la actividad de IPCs comprende el mantenimiento del número de copias. Por consiguiente, la inhibición de la actividad de IPCs en la presente invención comprende la inhibición del número de IPCs. Cuando se confirma que el número de copias se inhibe bajo la presencia de anticuerpos, se puede encontrar que los anticuerpos están inhibiendo la actividad de IPCs. Como con la producción IFN, se puede utilizar como un control comparativo, una inmunoglobulina inerte derivada de la misma especie animal que la del anticuerpo, cuya actividad debe ser confirmada. El número de IPCs puede compararse en forma cuantitativa mediante conteo celular. Los números de IPCs pueden contarse con FACS o un microscopio. Además, se dice que IPCs se diferencian en las células que inducen Th2 referido como a la célula dendrítica 2 (DC2), como un resultado de la infección con virus o similares. Si la producción IFN de IPCs a través de estímulo de virus puede ser inhibida, también se puede inhibir su diferenciación en Th2. Por consiguiente, se puede esperar que el anticuerpo monoclonal de la presente invención, que inhibe la producción IFN, también pueda tener un efecto terapéutico en varias enfermedades alérgicas. Cuando el anticuerpo, el cual reconoce el dominio extracelular de ILT7 humano, se administra a un huésped diferente a la especie del organismo del cual se derivó el anticuerpo, es recomendable procesar el anticuerpo en una forma que sea difícil de ser reconocido como una sustancia externa por parte del huésped. Por ejemplo, la inmunoglobulina no puede ser reconocida fácilmente como la sustancia externa, mediante el procesamiento del anticuerpo en las siguientes moléculas. La técnica para procesar moléculas de inmunoglobulina tal como se describe más adelante, es bien conocida. El fragmento que comprende la región de enlace de inmunoglobulina, que carece de una región constante (Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, tercera edición, Academic Press Limited. 1995; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996). Anticuerpo quimérico compuesto de la región de enlace de antígenos del anticuerpo monoclonal y la región constante de inmunoglobulina del huésped ("Gene Expression Experimental Manual", Isao Ishida, Tamie Ando, eds., Kodansha, 1994). -Anticuerpo substituido con CDR en donde se sustituye la región de determinación de complementariedad (CDR) de la inmunoglobulina del huésped por la CDR del anticuerpo monoclonal ("Gene Expression Experiment Manual", Isao Ishida, Tamie Ando, eds., Kodansha, 1994). Como alternativa, se puede obtener un anticuerpo humano utilizando animales no humanos en los cuales se incorpora un gen de anticuerpo humano como animales inmune, aunque se utilizan animales no humanos. Por ejemplo, los ratones transgénicos con genes de anticuerpo humano, han sido puestos para el uso práctico con el objeto de producir anticuerpos humanos en la forma de animales inmunes (Ishida y asociados, Cloning and Stem Cells, 4: 85-95, 2002). El uso de dichos animales permite obtener el anticuerpo humano el cual reconoce ILT7 utilizando inmunogens tal como se describió previamente. Es preferible administrar el anticuerpo humano a humanos. Como alternativa, también se puede obtener el gen de región variable de inmunoglobulina humana a través de un método de despliegue de fagos (McCafferty J. y asociados, Nature 348: 552-554, 1990; Kretzschmar T y asociados, Curr Opin Biotechnol. Diciembre 2002; 13(6): 598-602). En el método de despliegue de fagos, e incorpora en un gen de fago un gen que codifica la región variable de inmunoglobulina humana. También se puede producir una biblioteca de fagos utilizando varios genes de inmunoglobulina en la forma de compotas. Un fago expresa una región variable en la forma de una proteína de fusión de la proteína compuesta del fago. La región variable expresada por el fago en la superficie del fago, mantiene la actividad de enlace con un antígeno. Por consiguiente, los fagos, los cuales enlazan antígenos a células en los cuales se expresan los antígenos, son seleccionados permitiendo de esta forma clasificar un fago en el cual se expresa a partir de la librería de fago, una región variable que tiene la actividad de enlace deseada. Además, se retiene un gen que codifica una región variable, el cual tiene la actividad de enlace deseada, en las partículas de fago seleccionadas de esta manera. Esto es, en el método de despliegue de fagos, un gen que codifica la región variable con la actividad de enlace deseada, puede ser obtenida utilizando la actividad de enlace de la región variable como un indicador. En el inhibidor activo de IPCs o el método para inhibir la actividad de IPCs en la presente invención, el anticuerpo que reconoce el dominio extracelular de ILT7 humano o el fragmento de anticuerpo que comprende al menos una región de enlace de antígenos del anticuerpo puede ser administrada como una proteína o un polinucleótido que codifica la proteína. En la administración de polinucleótidos, es recomendable utilizar un vector en el cual se coloque un polinucleótido que codifica la proteína deseada bajo el control de un promotor adecuado, de modo que exprese la proteína deseada. También se puede colocar un aumentador y un terminador en el vector. Se conoce un vector que lleva un gen de cadenas pesadas y ligeras que constituye una inmunoglobulina y tiene la capacidad de expresar una molécula de inmunoglobulina. El vector con la capacidad de expresar la inmunoglobulina puede administrarse introduciéndolo en células. En la administración a organismos vivos, un vector, el cual puede ser infectado mediante la administración a los organismos vivos, puede ser administrado directamente. Una vez que los linfocitos son separados de los organismos vivos, posteriormente se introduce el vector en los linfocitos, el cual puede ser regresado nuevamente a los organismos vivos (ex vivo). El inhibidor activo de IPCs o el método para inhibir la actividad de IPCs basado en la presente invención, como para la cantidad de anticuerpo monoclonal que será administrada a los organismos vivos, la inmunoglobulina se administra normalmente dentro del rango de 0.5 mg a 100 mg, por ejemplo, 1 mg a 50 mg, preferentemente 2 mg a 10 mg por kg de peso corporal. Los intervalos de administración del anticuerpo a los organismos vivos pueden ser ajustados en forma adecuada para mantener de esta forma una concentración efectiva de inmunoglobulina en los organismos vivos durante el período de tratamiento. Específicamente, por ejemplo, el anticuerpo puede ser administrado en intervalos de 1 a 2 semanas. La ruta de administración es opcional. Los expertos en la técnica pueden seleccionar en forma adecuada una ruta de administración efectiva en los tratamientos. Los ejemplos específicos de los mismos incluyen administración oral o parenteral. Los anticuerpos se administran en forma sistémica o tópica, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, o similar. Los ejemplos de una formulación adecuada para administración parenteral en la presente invención incluyen soluciones inyectables, supositorios y rocíos. Cuando el anticuerpo se proporciona a las células, se agrega inmunoglobulina al medio de cultivo normalmente dentro del rango de 1 pg/ML, preferentemente 10 pg/ML, más preferentemente 50 pg/ML, incluso más preferentemente 0.5 mg/ML. En el inhibidor activo de IPCs o el método para inhibir la actividad de IPCs de la presente invención, se puede administrar el anticuerpo monoclonal a los organismos vivos a través de métodos opcionales. Normalmente, el anticuerpo monoclonal se combina con un soporte farmacéuticamente aceptable. Si es necesario, el anticuerpo monoclonal puede ser combinado con agentes aditivos tales como endulzadores, estabilizadores, conservadores y solubilizadores. Los ejemplos de dicho soporte o agente aditivo incluyen lactosa, ácido cítrico, ácido esteárico, estearato de magnesio, sacarosa, almidón, talco, gelatina, agar, aceite vegetal y etilenglicol . El término "farmacéuticamente aceptable" significa que está aprobado por una agencia reguladora en cada gobierno o está descrita en la Farmacopea de cada país u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, en mamíferos, y más particularmente, en humanos. El inhibidor activo de IPCs de la presente invención también puede ser proporcionado en la forma de dosis simples o múltiples de polvos liofilizados o tabletas. Además, los polvos liofilizados o tabletas se pueden utilizar en combinación con agua esterilizada para inyección, una solución de sal fisiológica o solución amortiguadora para disolver las composiciones para que tengan una concentración deseada antes de la administración. Además, cuando el anticuerpo monoclonal se administra en la forma de un vector, el cual expresa inmunoglobulina, las cadenas pesadas y ligeras son cotransfectadas a otro plásmido, y cada plásmido puede ser administrado dentro del rango de 0.1 a 10 mg, por ejemplo, 1 a 5 mg por kg de peso corporal. Con el objeto de introducir los plásmidos en células in vitro, el contenido de los vectores para utilizarse es de 1 a 5 pg/106 células. Más adelante, la presente invención se descri irá de manera específica con referencia a los ejemplos. Todos los documentos de la técnica anterior aquí mencionados están incorporados en su totalidad a la presente invención como referencia. EJEMPLOS Ejemplo 1 A. Análisis de expresión de ILT7 A-1) Análisis utilizando biblioteca SAGE Se comparó la expresión de genes en monocitos humanos, IPCs, y IPCs tratadas con HSV y se analizó a través del método de Análisis en Serie de Expresión Genética (nombre comercial; SAGE). El método de análisis es tal como se indica a continuación. Se separaron monocitos en la forma de células positivas BDCA-4 y se separaron IPCs en la forma de células positivas CD14 de sangre periférica humana utilizando un clasificador celular. Además, las IPCs se cultivaron durante 12 horas bajo la presencia de Virus de Herpes Simple (HSV) y posteriormente se prepararon las IPCs diferenciadas. Los ARNs se obtuvieron de células respectivas, seguido de la producción de una biblioteca SAGE utilizando un equipo l-SAGE (nombre comercial) (fabricado por Invitrogen). Los datos en la secuencia de base obtenida de etiquetas de aproximadamente 100,000, se analizaron utilizando el software de análisis SAGE (fabricado por Invitrogen). Como resultado, se encontró un gen cuyo valor de marcación de monocito/l PC/I PC + HSV es de 0/16/0, es decir, ILT7 (Gen Bank Acc#N M_012276 ) conocido como un ge, el cual muestra expresión específica de IPC. ILT7 es una proteína de membrana con dominios tipos inmunoglobulina codificados por una secuencia base mostrada en SEQ ID NO: 1 (figura 2 (a)). Se ha reportado que el mARN de ILT7 se expresa en IPCs (Blood 100, 3295-3303 (2002)). A-2) RT-PCR La expresión de ILT7 en células de hemocito se revisó con mayor detalle. Cada célula fue aislada en forma preparativa de sangre periférica humana a través del clasificador celular. Los ARNs fueron extraídos de cada una de las poblaciones celulares, de las cuales se sintetizó el cADN. El PCR cuantitativo se llevó a cabo de acuerdo con un método ordinario utilizando el cADN resultante como una plantilla y se analizó el nivel de expresión de mARN de ILT7. Las condiciones utilizadas para las secuencias base de los cebadores y PCR son como se indica a continuación: Cebador delantero: 5' CTC CAA CCC CTA CCT GCT GTC 3' (SEQ ID NO: 3) Cebador de avance: 5' TTC CCA AGG CTC CAC CAC TCT 3' (SEQ ID NO: 4) 1 ciclo de PCR (a una temperatura de 94°C durante 3 minutos) 25 ciclos de PCR [a una temperatura de 94°C durante 30 segundos, una temperatura de 58°C durante 30 segundos, y a una temperatura de 72°C durante 1 minuto]. 1 ciclo de PCR (a una temperatura de 72°C durante 6 minutos) Cuando las IPCs estimuladas por monocitos, células positivas IPCs, HSVs y CD19 (es decir células B), las células positivas CD3 (es decir células T), células T estimuladas por PMAs y células positivas CD56 (es decir células NK) fueron revisadas, y se descubrió que ILT7 se expresó específicamente en IPCs (figura 1 (a)). A-3) RT-PCR cuantitativo Además, la expresión en otros órganos y tejidos se revisó mediante PCR cuantitativo utilizando ABI PRISM 7000 (fabricado por Applied Biosystems). Como el panel de cADN, se utilizaron panel de cADN de tejido múltiple BD (nombre comercial) (Humano I; Cat. No. 636742, inmune humano; Cat. No. 636748, fracciones de sangre humana; Cat. No. 636750; todas ellas son fabricadas por Becton Dickinson) y el mismo cADN derivado de las células de hemocitos tal como se describe en 2). Las secuencias base utilizadas de los cebadores son como se indica a continuación: Cebador de avance para ILT7: 5' CCT CAA TCC AGC ACA AAA GAA TAA 3' (SEQ ID NO: 5) Cebador inverso para ILT7: 5' CGG ATG AGA TTC TCC ACT GTG TAA 3' (SEQ ID NO: 6) Cebador de avance para GAPDH: 5' CCA CCC ATG GCA AAT TCC 3' (SEQ ID NO: 7) Cebador inverso para GAPDH: 5' TGG GAT TTC CAT TGA TGA CAA G 3' (SEQ ID NO: 8) Se llevó a cabo PCR utilizando ABI PRISM 7000 (fabricado por Applied Biosystem) y equipo de mezcla master PCR verde SYBR (fabricados por la misma compañía). Se utilizó el Software de Sistema de Detección de Secuencia (fabricado por la misma compañía) para el análisis. Las condiciones de reacción son como se indican a continuación: Paso 1: ciclo 1 de PCR (a una temperatura de 50°C durante 2 minutos) Paso 2: 1 ciclo de PCR (a una temperatura de 95°C durante 10 minutos) Paso 3: 40 ciclos de PCR (a una temperatura de 95°C durante 15 segundos, a una temperatura de 60°C durante 1 minuto) La expresión de gen ILT7 se comparó entre cada tejido, estandarizando en el nivel de expresión del gen de deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (GAPH) el cual es conocido por ser expresado en forma constitutiva. Como resultado, se observó que ILT7 no se expresó en cualesquiera órganos además de los tejidos linfoides y se expresó específicamente en IPCs. B. Producción de vectores de expresión ILT7 y FcRy En forma subsecuente, se llevó a cabo la clonación de genes y la producción de vectores de expresión, con el objeto de expresar proteínas ILT7. B-1) Clonación de genes ILT7 Se extrajo poly (A) +ARN de sangre periférica humana de IPCs, de los cuales se sintetizó el cADN utilizando el oligo cebador dT y el Super Script Choice System del equipo de cADN Synthesis. El adaptador EcoRI se ligó en el cADN sintetizado, el cual se ligó en el vector pME18S disociado mediante EcoRI, dando como resultado la producción de la biblioteca de cADN IPC humana. El gen ILT7 se amplificó mediante método PCR utilizando la biblioteca cADN producida como una plantilla, así como utilizando cebadores con las siguientes secuencias base. Se utilizó para la reacción PCR, una unidad de polimerasa de ADN KOD (fabricada por TOYOBO CO., LTD.). Las condiciones de reacción se ajustaron a 25 ciclos de PCR [a una temperatura de 94°C durante 15 segundos, a una temperatura de 55°C durante 30 segundos, y a una temperatura de 68°C durante 2 minutos] después de 1 ciclo de PCR a una temperatura de 94°C durante 2 minutos. Cebador de avance: 5' CAG GGC CAG GAG GAG GAG ATG 3' (SEQ ID NO: 9) Cebador inverso: 5' TCA GCA GAC ACT TCC CCA ACT 3' (SEQ ID NO: 10) El fragmento de cADN 2-kb ILT7 amplificado fue separado y recuperado mediante electroforesis utilizando gel de agarosa al 1%, el cual se clonó para el vector de plásmido pCR4 Blunt-TOPO (fabricado por Invitrogen) utilizando equipo de clonación PCR Zero Blunt TOPO (fabricado por Invitrogen). Las secuencias base de los genes obtenidos fueron analizadas, y se descubrió que se obtuvo el gen ILT7 deseado mostrado en SEQ ID NO: 1. B-2) Producción de vectores de expresión ILT7 etiquetados con FLAG Se construyó un plásmido que expresa una proteína en la cual se fusionaron etiquetas ILT7 al N y C término de ILT7, respectivamente. ILT7 se fusionó con una etiqueta, la cual permitió confirmar la expresión de la proteína ILT7 mediante la detección de la etiqueta. La secuencia deseada fue amplificada a través de método PCR utilizando el gen ILT7 producido tal como se describe en 1), en la forma de una plantilla, así como utilizando cebadores con las siguientes secuencias base. Se utilizó para la reacción PCR, 1 unidad de polimerasa de ADN KOD Plus (fabricado por TOYOBO CO., LTD.). Las condiciones de reacción se ajustaron a 25 ciclos de PCR [a una temperatura de 94°C durante 15 segundos, a una temperatura de 55°C durante 30 segundos, y a una temperatura de 68°C durante 2 minutos] después de 1 ciclo de PCR a una temperatura de 94°C durante 2 minutos. . Para N-FLAG ILT7 Cebador de avance (SEQ ID NO: 11): 5' CCG ctc gag ATG ACC CTC ATT CTC ACA AGC CTG CTC TTC TTT GGG CTG AGC CTG GGC ÍG AT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG1 CCC AGG ACC CGG GTG CAG GCA GAA 3' Cebador inverso: (SEQ ID NO: 12): 5' C TAG act agt TCA GAT CTG TTC CCA AGG CTC 3' Para C-FLAGILT7 Cebador avance (SEQ ID NO: 13): 5' CCG ctc gag ATG ACC CTC ATT CTC ACA AGC 3' Cebador inverso (SEQ ID NO: 14): 5' C TAG act agt TCA fCTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC1 GAT CTG TTC CCA AGG CTC 3' En las secuenciase base antes mencionadas, cada parte subrayada en el paréntesis muestra una secuencia base que codifica la etiqueta FLAG adherida, y cada letra minúscula muestra el sitio de disociación para la enzima de restricción Xhol o Spel. Los fragmentos de ADN amplificados mediante PCR, fueron disociados mediante Xhol y Spel, los cuales posteriormente son separados mediante electroforesis de gel. Se recuperaron fragmentos de ADN de 2 kb, los cuales fueron ligados en el vector pME18X disociado por Xhol y Spel en la misma forma que se describió anteriormente. Posteriormente, se construyeron dos tipos de plásmidos con la capacidad de expresar la proteína de fusión deseada, es decir pME18X-N-FLAG ILT7 y pM E 18X-C-FLAG ILT7. B-3) Clonación de genes FCRY Se consideró la proteína FcRy como una proteína con la capacidad de asociarse con la proteína ILT7. La molécula de la presente invención es un gen con secuencias base y secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 15 y 16 (Genbank Acc#NM 004106, J. Biol. Chem. 265, 6448-6452 (1990)). La molécula es una molécula (cadena gamma) que constituye Fe e Rl, es decir un receptor IgE de alta afinidad. Aunque también se nombra como Fe e Rl ?, será referida en lo sucesivo como FcRy. A este respecto, la molécula de la presente invención también ha sido conocida como un componente de FcRy o FcaR. El gen de la presente invención fue clonado mediante método PCR tal como se muestra más adelante para producir vectores de expresión. El gen FcRy fue amplificado mediante método PCR utilizando la biblioteca deseada cADN IPC humana producida tal como se describe en 1), como una plantilla, así como utilizando cebadores con las siguientes secuencias bases: se utilizó para reacción PCR una unidad de polimerasa de ADN KOD Plus (fabricada por TOYOBO CO., LTD.). Las condiciones de reacción se ajustaron a 25 ciclos de PCR [a una temperatura de 94°C durante 15 segundos, temperatura de 55°C durante 30 segundos, y a una temperatura de 68°C durante 1 minuto] después de 1 ciclo de PCR a una temperatura de 94°C durante 2 minutos. Cebador de avance: 5' CCC AAG ATG ATT CCA GCA GTG 3' (SEQ ID NO: 17) Cebador inverso: 5' GGA AGA ACC AGA AGC CAA AGA 3' (SEQ ID NO: 18) El fragmento 0.3-kb FcRycADN amplificado fue separado y recuperado mediante electrof oresis utilizando gel de agarosa al 2% el cual se clonó para un vector de plásmido pCR4 Blunt-TOPO (fabricado por Invitrogen) utilizando el equipo de clonación Zero Blunt TOPO PCR (fabricado por Invitrogen). Las secuencias base de los genes obtenidos fueron analizadas, y se confirmó que el ge FcRy deseado mostrado en SEQ ID NO: 15, fue clonado. B-4) Producción de vectores de expresión FcRy etiquetados con Myc Se construyó un plásmido que expresa una proteína en la cual se adhirió la etiqueta Myc al C término, de modo que se pudiera confirmar la expresión de la proteína FcRy. La secuencia deseada fue amplificada a través de método PCR, utilizando el gen FcRy producido tal como se describe en 3) como una plantilla, así como utilizando cebadores con las siguientes secuencias base. Se utilizó 1 unidad de polimerasa de ADN KOD Plus (fabricada por TOYOBO CO., LTD.) para reacción PCR. Las condiciones se ajustaron a 25 ciclos de PCR [a una temperatura de 94°C durante 15 segundos, temperatura de 55°C durante 30 segundos, y a temperatura de 68°C durante 1 minuto] después de 1 ciclo de PCR a una temperatura de 94°C durante 2 minutos. Cebador de avance (SEQ ID NO: 19): 5' CCG ctc gag ATG ATT CCA GCA GTG GTC TTG 3' Cebador inverso (SEQ ID NO: 20): 5' CTA Gac tag tCT A [CA GAT CCT CTT CAG AGA TGA GTT TCT GCT Cl CT GTG GTG GTT TCT CAT G 3' De las secuencias de cebador antes mencionadas, la parte subrayada en el paréntesis muestra una secuencia base que codifica la etiqueta Myc adherida, y cada letra minúscula muestra el sitio de disociación de la enzima de restricción Xhol o Spel. Los fragmentos de ADN amplificados mediante PCR fueron disociados a través de Xho y Spel, los cuales posteriormente se separaron mediante electroforesis de Gel. Se recuperaron fragmentos de ADN de aproximadamente 0.3-kb, los cuales se ligaron en el vector pME18X disociado mediante Xhol y Spel en la misma forma que se describió anteriormente.
Posteriormente, se construyó un plásmido con la capacidad de expresar la proteína de función deseada, por ejemplo pM E 18X-Myc-FcRy. C. Expresión de ILT7 en células de animal Se revisó la expresión de ILT7 en células de animal utilizando vectores de expresión producidos tal como se describió anteriormente. C-1) Expresión de células 293T Se introdujeron ADNs que consisten en las siguientes cinco combinaciones en células 293T (7 x 105 células) utilizando equipo de transfección de effecteno (fabricado por Qiagen). Dos días después de la introducción, se llevó a cabo el análisis de citometría de flujo (análisis FCM). (1) pME1 8X- N -FLAG ILT7 2 pg (2) pME1 8X- C -FLAG ILT7 2 pg (3) pME1 8X- N -FLAG ILT7 1 pg + pME18X- Myc- FcRy 1 pg (4) pME1 8X- C -FLAG ILT7 1 pg + pME18X- Myc- FcRy 1 pg (5) pME18X-Myc-FcRy 2 pg Se llevó a cabo el método de análisis FCM en la misma forma que se describe en A-4 del ejemplo 2 que se encuentra más adelante. El anticuerpo anti-Flag conjugado con Cy3 (fabricado por Sigma) fue utilizado para la reacción y se utilizó FACScan (fabricado por Becton Dickinson) para el análisis. Como un resultado, se descubrió que únicamente se expresa un poco de ILT7 en la superficie celular cuando se hace reaccionar solo, aunque se expresó ILT7 en forma extracelular y robusta cuando existe en conjunto con FcRy (figura 3). Se sabe que FcRy tiene alta homología con FcRy humano. Sin embargo, cuando se utilizan células p815 (mastocitoma de ratón) que expresan FcRy de ratón en la forma de huéspedes, no se puede observar la expresión de ILT7. C-2) Análisis de método de inmunoprecipitación y manchado weste r n Se expresó ILT7 con FcRy acompañante en la superficie celular, lo cual se confirmó como se indica a continuación. Después de inmunoprecipitación, se expresaron en conjunto varios anticuerpos para cada célula 293T con ambos genes en combinaciones respectivas descritas en (1) a (5). Los ADNs fueron introducidos en células 293T (7 x 105 células) de las cuales se recuperaron células 293T dos días después de la introducción en la misma forma que se describe en 1). Se disolvieron fracciones celulares en amortiguador de lisis (0.5% Tritón, 150 mM Nací), lo cual se dejó sobre hielo durante 20 minutos. Posteriormente, se repitió el aspirado utilizando una hoja (27G) varias veces, seguido de centrifugación en 15 Krpm durante 20 minutos. Se agregó anticuerpo antí-myc (2 g, fabricado por Santa Cruz biotechnology) o anticuerpo anti-Flag (2 pg, fabricado por Sigma) a 200 pg de Usados de los productos resultantes, lo cual se agitó en forma adicional mediante rotación a una temperatura de 4°C durante 4 horas. Posteriormente, se agregó una mezcla de flujo Protein A/G Sepharose 4 Fast Flow (fabricada por Amershambioscience), la cual se agitó mediante rotación a una temperatura de 4°C durante 1 hora. Posteriormente, las fracciones precipitadas resultantes se lavaron tres veces con amortiguador de lisis con la siguiente composición: Amortiguador de lisis: 0.5% TritonX-100, . 50 mM HEPES (pH 7.6) 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0% gl ice rol, 1 mM DTT, 2 mM PMSF, 1 pg/ml Aproptinin, 1 pg/ml Pepstatin A, 0.1 pg/ml Chymostatin, 1 mM Na3V04, 0.1 mM ß-glicerofosfato Se agregó un amortiguador de muestra para SDS-PAGE a los precipitados lavados, los cuales se hirvieron durante 5 minutos y se centrifugaron, seguido de actuación de electroforesis con gel SDS al 10%. Las muestras se transfirieron de los geles después de electroforesis a la membrana PVDF (membrana de transferencia-I mmobilon-p-transfer: fabricada por Millipore) de acuerdo con un método ordinario. Se llevó a cabo manchado con anticuerpo anti-Flag y anticuerpo anti-myc. Se confirmó que ILT7 asociado con F c R ? estuvo en las células 293T, debido a que se observó su presencia en cada precipitado inmune (figura 4). C-3) Análisis de cadena de azúcar Ya que se observaron varias bandas de ILT7 en el análisis Western, se revisó la posibilidad de que se glucosilara ILT7. Se ¡nmunoprecipitaron 200 pg de lisado de células 293T que expresan N-FLAG ILT7 y Myc-FcRy, con anticuerpo anti-Flag en la forma descrita en los incisos 1) y 2). Posteriormente, las fracciones precipitadas fueron suspendidas en 60 µ?_ de amortiguador de N-glucosidasa con la siguiente composición y 30 µ?_ de cada solución resultante fue alicuotada en dos tubos.
Amortiguador de N-glucosidasa: 10 mm EDTA 0.2% SDS, 0.5% TritonX100, 1% 2-mercaptoetanol en PBS (amortiguador de fosfato) Posteriormente, se agregaron a un tubo 3 unidades de 3 pL de N-glucosidasa (#1365177, fabricado por Roche) la cual se hizo reaccionar a una temperatura de 37°C durante 15 horas. Además, se agregaron 7 µ?_ de amortiguador de muestra, el cual se calentó a una temperatura de 100°C durante 5 minutos, seguido de llevar a cabo la electroforesis con gel de SDS al 10%. Después de la electroforesis, se transfirió el gel a una membrana PVDF, a la cual se le agregaron 1 g de anticuerpo-policlonal ILT7 tal como se describe en 4) y se hizo reaccionar a una temperatura de 4°C durante la noche. El producto resultante se lavó con amortiguador TBS-T y se hizo reaccionar con anticuerpo anti-conejo etiquetado-HRP diluido a 100,000 veces (fabricado por Jackson) a temperatura ambiente. Posteriormente, se coloreó con un sistema de detección de manchado Western ECL (fabricado por Amersham bioscience). Como resultado, se disminuyó el peso molecular aparente llevando a cabo el tratamiento con N-glicosidasa. Por lo tanto, se espera que las cadenas de azúcar se agreguen a ILT7 (figura 5). C-4) Producción de anticuerpo policlonai anti-ILT7 El anticuerpo policlonai anti-ILT7 tal como se describe en 3) fue producido como se indica a continuación. Se sintetizó en forma química el péptido de 23 aminoácidos que corresponden al C-termino ILT7 (CSQEANSRKDNAPFRVVEPWEQI ; SEQ ID NO: 21) y se enlazó a proteína KLH la cual es una carrera y el producto resultante se utilizó como un inmunogen. Los conejos fueron inmunizados en forma intradérmica con inmunogen mezclado con adyuvante completo de Freund. Después de seis inmunizaciones en todos (una por semana), se confirmó el titulador de anticuerpo incrementado en suero, y posteriormente se recolectó la sangre completa. Posteriormente, parte de suero fue purificado por afinidad utilizando la columna péptido de la misma secuencia. El producto resultante se determinó como anticuerpo policlonal anti-ILT7. Ejemplo 2 A. Producción de anticuerpo monoclonal anti-ILT7 A-1) Producción de inmunogen Las células que serán utilizadas como inmunogens fueron preparadas introduciendo genes a células 293T tal como se describe más adelante. Se agregaron 46.4 pg de transgeno (pME18 X-C-FLAG ILT7 23.2 pg y pM E 18X-Myc-FcRy 23.2 pg) a la parte del fondo de un Plato 100 mm/Collagen Coated Dish (IWAKI) recubierto con 3 mL de opti-MEM (GIBCO) y se mezcló. En forma subsecuente, además de la solución de transgeno, se diluyeron 58 pL de Lipofectamina (nombre comercial) 2000 (Invitrogen) con 3 mL de opti-MEM, el cual se dejó asentar a temperatura ambiente durante 5 minutos y se preparó una solución de Lipofectamine. Posteriormente, la solución de Lipofectamine se agregó suavemente al plato que contiene la solución de transgeno y se mezcló. Después de permanecer a temperatura ambiente durante 20 minutos, se agregaron suavemente al plato 10 mL de células 293T diluidas en 1 x 106 células/ML utilizando medio de cultivo DMEM (SIGMA) que contiene 10% FBS (suero de bovino fetal). E! medio resultante fue sometido a cultivo estático en una incubadora a una temperatura de 37°C bajo C02 durante 48 horas, del cual se recuperaron células mediante pipeteado. Las células obtenidas fueron utilizadas como transfectantes para inmunogens. A-2) Producción de hibridomas Un día antes de que las células fueran inmunizadas, se inyectaron 50 pL de emulsión obtenida mezclando 200 pL de PBS con 200 pL de adyuvante completo (FREUND) (RM606-1, manufacturado por Mitsubishi Kagaku latron, Inc.) a las partes del fondo de ambas patas de cuatro ratones hembra Balb/c (cuatro semanas de edad) para inmunización. Al siguiente día, se inmunizaron 50 pL de 2 x 107 células en 400 pL de PBS. La segunda y terceras inmunizaciones se llevaron a cabo cada cuatro días. Tres días después de la tercer inmunización, se llevó a cabo la fusión celular, tal como se indica a continuación. Las células fueron recolectadas de nodos linfáticos de patas de ratones inmunizados. Se mezclaron células de mieloma de ratón P3-X63-Ag8-U 1 cultivadas en medio de cultivo RPMI1640 (SIGMA) que contiene 10% FBS, con las células derivadas de nodos linfáticos y mieloma de modo que la proporción de células de mieloma de ratón a las células derivadas de nodos linfáticos y el mieloma debe ser de 2:1 a 10:1 , de las cuales se recuperaron células mediante centrifugación. Se agregó PEG400 (MERCK) diluido en forma equivalente con medio de cultivo RPMI1640 a las fracciones de células obtenidas, lo cual se sometió a fusión celular. Después del lavado de las células, el producto resultante fue suspendido en 1.60 ml_ de un medio-FBS-HAT que contiene un suplemento y posteriormente se inocularon dieciséis placas de 96 depósitos en 200 pL/depósito. El medio de cultivo fue intercambiado después de tres días. Una a dos semanas después de la observación de la formación de colonias, se llevó a cabo una clasificación primaria. A-3) Clasificación de hibridoma mediante método ELISA Cell El hibridoma, que produce el anticuerpo objetivo, fue clasificado a través del siguiente ensayo Cell ELISA. Las células producidas tal como se describe en 1 ), fueron utilizadas en 1 x 107 células por placa de 96 depósitos, las cuales se suspendieron en 0.5% BSA/2 mM EDTA/PBS y posteriormente se alicuotaron a una placa de Cell ELISA (NUNC 249570 96V NW PS) en 100 pL/depósito. Se llevó a cabo la centrifugación en 2,000 rpm a una temperatura de 4°C y posteriormente se desechó el sobrenadante. Se agregó sobrenadante de cultivo muestreado en 50 pL/depósito, lo cual se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La operación de lavado que implica agregar 0.5% BSA/2 mM y EDTA/PBS a cada depósito, centrifugar 2,000 rpm a una temperatura de 4°C durante 2 minutos, y posteriormente desechar el sobrenadante, se llevó a cabo dos veces. Se agregaron 50 pL/depósito de anticuerpo IgG anti-ratón de cabra etiquetado con peroxidasa düuido a 10,000 veces (IM0819; cultivador Beckman) a cada depósito después de lavado, el cual se hizo reaccionar durante 30 minutos. La operación del lavado utilizando 0.5% BSA/2 mM-EDTA/PBS se llevó a cabo dos veces, seguido de la adición de una solución colorante. La solución de anticuerpo preparada fue sustituida con PBS (-) mediante membrana de diálisis (10,000 cortes fabricado por PIERCE) para proporcionar anticuerpos quiméricos anti-ILT7 purificados. A-4) Revisión de capacidad de respuesta de anticuerpos mediante análisis de citometría de flujo (FCM) Se analizó el sobrenadante de cultivo de hibridoma mediante análisis de citometría de flujo (FCM). Las células producidas tal como se describen 1), fueron suspendidas en 0.5% BSA/2 mM EDTA/PBS, lo cual se transfirió a un tubo de centrifugación en 1 x 105 por una muestra, seguido de adición de 40 pL de cada cultivo y haciendo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La operación de lavado que implica agregar 1 mi de 0.5% BSA/2 mM y EDTA/PBS a cada tubo, centrifugando a 1200 rpm a una temperatura de 4°C durante 3 minutos, y desechando el sobrenadante se llevó a cabo dos veces. Se agregaron 40 pL de anticuerpo IgG antiratón de cabra etiquetado-FITC diluido 100 veces (IM0819; cultivador Beckman) a cada depósito después del lavado, el cual se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La operación de lavado utilizando 0.5% BSA/2 mM-EDTA/PBS se llevó a cabo dos veces, seguido de análisis utilizando citometría de flujo FC500 (cultivador Beckman). Se seleccionó un hibridoma que produce un anticuerpo el cual no responde únicamente a una célula huésped y responde específicamente a !a célula en donde el gen ha sido introducido. El hibridoma seleccionado se clonó mediante método de dilución limitante y se obtuvieron los hibridomas #11 y #17, los cuales producen anticuerpos monoclonal. B. Revisión de respuesta del anticuerpo anti-ILT7 Se expresó en conjunto ILT7 en donde la etiqueta FLAG se adhirió al N término, con la molécula FcRy en células 293T en la misma forma se describe en C-1) del ejemplo 1. Posteriormente, se confirmó la respuesta del anticuerpo obtenido en el ejemplo 2 mediante análisis FCM utilizando FACScan (Becton Dickinson). Como resultado, se confirmó que todos los anticuerpos producidos por hibridomas #11 y #17, los cuales se obtuvieron tal como se describe en A responden a las células en donde el gen ILT7 fue introducido y el cual expresa ILT7 (figura 6 (b)). Además, los linfocitos se separaron de la sangre periférica humana utilizando Ficoll y posteriormente se llevó a cabo el manchado con el anticuerpo anti-ILT7 producido y el anticuerpo anti-BDCA-2 etiquetado-PE (Miltenyi). Posteriormente, la respuesta a los linfocitos fue revisada. Como resultado, el enlace del anticuerpo monoclonal producido mediante hibridomas #11 y #17 a células positivas BDCA-2, fue detectado. Esto es, se confirmó que ambos anticuerpos monoclonales reconocieron moléculas ILT7 expresadas en IPCs humanas (figura 6 (a)). Estos anticuerpos monoclonales fueron designados como anticuerpo anti-ILT7 #11 y anticuerpo anti-ILT7 #17, respectivamente. Se llevó a cabo un análisis más detallado. Se llevó a cabo un análisis de manchado múltiple para Mnfocitos de sangre periférica humana utilizando el anticuerpo anti-ILT7 producido, el anticuerpo anti-Lineage (anticuerpos anti-CD3, CD14, CD16, CD19, CD56; Becton Dickinson), el anticuerpo ant¡-CD123 (Becton Dickinson) y el anticuerpo anti-BDCA-2 (Miltenyi). Como para las fracciones positivas-anticuerpo ILT7, el marcador Lineage Marker fue negativo, CD123 fue positivo, y BDCA-2 fue positivo. A partir de los resultados, se confirmó que IPCs fueron manchadas únicamente mediante ILT7#11 y ILT7#17 (figura 7). Además, la expresión de varias moléculas fue revisada mediante análisis FCM, cuando se estimularon linfocitos de sangre periférica humana mediante CpG y IFNa durante 24 horas. Se utilizó CpGODN2216 como CpGA, lo cual induce la producción de IFN de IPCs y CpGODN2006, se utilizó como CpGB que facilita la maduración de células dendríticas (Moseman y asociados J. Immunology. 173, 4433-4442, 2004). Se estableció una salida para la fracción negativa de Lineage Marker. Cuando la respuesta del anticuerpo anti-BDCA-2 y el anticuerpo anti-ILT7 a la población de células positivas CD123 fue analizada, la mayor parte de las fracciones positivas ILT7 desaparecieron incluso después de estímulo CpG durante 24 horas. Por otra parte, algunas células de BDCA-2 mostraron ser positivas después de 24 horas de estimulo CpG (figura 8). Se ha considerado que IPCs se diferencian en diferentes células inmediatamente después del estímulo. Se indicó que el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención fue útil como un anticuerpo especifico de la etapa para IPCs. Además, se confirmó que IPCs en los linfocitos de sangre periférica no fueron diferenciados bajo la presencia de IFNa, en este caso cuando la proporción de supervivencia fue alta, la expresión de ILT7 se mantuvo en IPCs, además estuvo presente en forma estable en ILT7 en enfermedades autoinmunes con la posibilidad de que el IFN en suero estuviera en un nivel alto. C. Revisión de especificidad de anticuerpo anti-ILT7 ILT7 pertenece a la familia ILT/LIR y existe una pluralidad de moléculas con alta homología, particularmente con alta homología en la región extracelular (figura 9). Se ha reportado que las mRNAs de las moléculas, especialmente tal como ILT2 y ILT3 se expresaron en IPCs (Ju y asociados, Gene 331, 159-164, 2004). Por consiguiente, la respuesta de estas moléculas fue confirmada utilizando células transgénicas. C-1) Clonación de molécula ILT1 y producción de vectores de expresión El cADN fue sintetizado a partir de ARN derivado de tonsil humano utilizando oligo cebador de T y el sistema SuperScript Choice System del equipo Synthesis. Posteriormente, se ligó un adaptador Notl en el vector pME18S disociado por Notl, dando como resultado la producción de biblioteca de cADN de tonsil humano. Se amplificó el gen ILT1 con una etiqueta FLAG en el C término a través de método PCR utilizando la biblioteca de cADN producida como una plantilla, así como utilizando cebadores con las siguientes secuencias base. Se utilizó 1 unidad de polimerasa de ADN KOD Plus (fabricado por TOYOBO CO., LTD.) para reacción PCR. Las funciones de reacción se establecieron en 25 ciclos de PCR [a una temperatura de 94°C durante 15 segundos, a una temperatura de 55°C durante 30 segundos, y a una temperatura de 68°C durante 2 minutos] después de 1 ciclo de PCR a una temperatura de 94°C durante 2 minutos. Cebador de avance (SEQ ID NO: 22): 5' CCG ctc gag ATG ACC CCC ATC CTC ACG GTC C 3' Cebador inverso (SEQ ID NO: 23): 5' CTA Gac tag tTC A [CT TAT CGT CGT CAT CCT TGT AAT Cl CC TCC CGG CTG CAT CTT G 3' En la secuencias cebadoras antes mencionadas, la parte subrayada en paréntesis muestra una secuencia base que codifica la etiqueta lowercase adherida y cada letra lowercase muestra el sitio de disociación de la enzima de restricción Xhol o Spel. Los fragmentos de ADN amplificados mediante PCR fueron disociados mediante Xhol y Spel, los cuales posteriormente se separaron mediante electroforesis de Gel. Se recuperaron fragmentos de ADN de aproximadamente 2-kb, los cuales se ligaron en vector pME18X disociado mediante Xhol y Spel en la misma forma que se describió anteriormente. Posteriormente, se construyó un plásmido con la capacidad de expresar la proteína de fusión deseada, es decir pME18X-C-FLAGILT1. La secuencia base y ¡a secuencia de aminoácido se muestran en SEQ ID NO: s: 24 y 25. C-2) Producción de células de expresión y revisión de respuesta de anticuerpo Como para ILT2 (SEQ ID NO: 26) y ILT3 (SEQ ID NO: 28), se utilizaron vectores de expresión en los cuales los genes respectivos fueron clonados para sitios Xbal o Xhol de pcADN4.1 (fabricados por Invitrogen). Los ADNs de las siguientes combinaciones fueron introducidos en células 293T (7 x 105 células) en la misma forma descrita en C-1). Dos días después de la introducción, se llevó a cabo el análisis FCM y posteriormente se analizó el anticuerpo anti-ILT7. (1) pM E 18X-N-FLAG ILT7 1 pg + p M E 18X- My c- F cRy 1 pg (2) pME18X-C-FLAG ILT7 0.5 pg + pME 18X-Myc-FcRy 0.5 pg + pcADN4.1-ILT2 0.5 pg + pcADN4. -I LT3 0.5 pg Como resultado, no todos los anticuerpos respondieron a las células en las cuales se expresó ILT1. Por esta razón, se sugirió que estos anticuerpos anti-ILT7 reconocen en forma específica moléculas ILT7 en iPCs (figura 10). Ejemplo 3 Efecto de anticuerpo anti-ILT7 en capacidad de producir IFN humano Se inocularon linfocitos de sangre periférica humana en una placa de 96 depósitos en 2 x 105 células/depósito las cuales se hicieron reaccionar con 5 pg/mL de varios anticuerpos a una temperatura de 37°C. Después de cultivo durante 1 hora, se agregó virus de influenza PR8. Después de cultivo de 24 horas, se midió el IFNa en el sobrenadante de cultivo mediante equipo ELISA (Bender Med System). Como resultado, se inhibió la producción de IFN mediante la adición de anticuerpo anti-ILT7 (figura 11). A saber, se descubrió que la producción IFN mediante IPCs fue afectada por el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención. Ejemplo 4 Actividad CDC del anticuerpo anti-lLT7 A. Producción de anticuerpo monoclonal anti-ILT7 Se obtuvo un clon que produce un anticuerpo monoclonal en la misma forma que se describe en A-1) a A-4) del ejemplo 2. La respuesta fue revisada en la misma forma que se describe en B del ejemplo 2, y se revisó la especificidad en la misma forma que se describe en C del ejemplo 2. Como resultado, los hibridomas #37, #28 y #33 que produjeron anticuerpos monoclonales anti-ILT7 con buena respuesta y especificidad, fueron los obtenidos. Se midió la actividad CDC tal como se describe más adelante utilizando el anticuerpo monoclonal anti-ILT7 en el cual se produjeron tres tipos de estos hibridomas. B. Determinación de actividad CDC B-1) El día anterior de la producción objetivo de la línea celular objetivo (línea celular ILT7-CHO) se introdujo el siguiente ADN en las células CHO-k1, las cuales fueron inoculadas para ser 6 x 105 células por un plato (6 cm p) utilizando el reactivo Effectene Transfection Reagent (fabricado por QLAGEN) y posteriormente se seleccionaron las cepas resistentes utilizando 800 pg/ml de Zeocin (fabricado por Invitrogen). ADN introducido: pcADN 3.1 -C-FLAG ILT7 1 pg + pME18X-Myc FcRy 2 pg Posteriormente, se obtuvo una línea celular, la cual expresa altamente ILT7 utilizando el plastificador celular (BD FACSAria, fabricado por Becton Dikinson). Se confirmó que la línea celular seleccionada expresó altamente ILT7 mediante análisis FCM. Se llevó a cabo la operación de análisis FCM de acuerdo con el método tal como se describe en A-4) del ejemplo 2, excepto que se utilizó FACSCaliber (fabricado por BD) para FCM. Se utilizaron los siguientes anticuerpos para un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario, respectivamente. Anticuerpo primario: anticuerpo anti-ILT7 de ratón 5 g/ml (#37), Anticuerpo secundario: anticuerpo policlonal específico de i nmunoglobulina anti-ratón de cabra conjugado-(R-PE) R-ficoeritrina (BD). B-2) Respuesta de células obietivo a anticuerpos anti-ILT7 Se recuperaron células objetivo obtenidas tal como se describe en B-1) (célula ILT7) utilizando 5 mM de solución EDTA/PBS, las cuales se suspendieron en medio CDC con la siguiente composición para tener una concentración de 4 x 105 células/ml. La suspensión fue alicuotada en cada placa de 96 depósitos en 50 pl/depósito. Medio CDC: RPMI1640 0.1% BSA 100 unidades/ml Penicilina 100 pg/ml Estreptomicina 10 mM Hepes (pH 7.6) 2 mM L-Glutamina Se agregaron 50 g de una solución de anticuerpo anti-!LT7 preparada a través de medio CDC a cada depósito y se mezclaron a la concentración final de anticuerpos que debe ser de 0.1 pg/ml, 0.5 g/ml, 1 pg/ml y 5 pg/ml. Además, se agregaron 50 µ? de medio CDC que contiene un complemento con la siguiente composición, y se mezcló de modo que la concentración de complemento final deba ser de 6%, seguido de cultivo a una temperatura de 37°C durante 2 horas. Medio CDC que contiene complemento: 1 mi de complemento de ratón joven (catálogo número: CL3441 , fabricado por CEDARLANE) Medio CDC (vide supra) Posteriormente, la suspensión se centrifugó (condición centrífuga: en 250 G durante 4 minutos) y el sobrenadante se recuperó en tanto se puso atención a no contaminarse con las células. LDH en el sobrenadante se midió a través de un método ordinario, el cual se determinó como "la cantidad de LDH filtrada de la célula objetivo mediante actividad de complemento" (Muestra Experimental) También se prepararon los siguientes parámetros con el objeto de determinar la actividad CDC. -Liberación LDH espontánea de célula objetivo: únicamente se cultivaron células objetivo en el mismo volumen que la muestra, y se prepararon. -Liberación LDH máxima de célula objetivo: únicamente se cultivaron células objetivo en el mismo volumen que la muestra, y posteriormente la solución TritonX-100 incluida con el equipo se agregó a la misma 60 minutos antes de la recuperación del sobrenadante, de modo que la concentración final deba ser de 0.8% y se preparó. -Control de corrección de volumen: se agregó la misma cantidad de TritonX-100 a la que se agregó cuando se preparó la liberación LDH máxima de célula objetivo al medio de cultivo del mismo volumen que la muestra. -Fondo del medio de cultivo: el medio de cultivo del mismo volumen que la muestra y la solución a la cual se agregó el medio CDC que contiene complemento, fue agregado al medio de cultivo para tener el mismo volumen que la mezcla preparada. Se sustrajo el mismo volumen de medio de cultivo al de la muestra, de la absorbancia del Máxima Objetivo y Espontáneo Objetivo. Se sustrajo la solución a la cual se agregó el medio CDC que contiene complemento al medio de cultivo, para tener el mismo volumen que la muestra y se extrajo de la absorbancia de la muestra de experimento y fue corregida. Se calculó la actividad CDC a través de la siguiente ecuación. Los resultados se muestran en la tabla 1 y en la figura 12. Incluso en el caso en donde se utilizaron anticuerpo monoclonales anti-ILT7 obtenidos de cualquier hibridoma, se exhibió el 80% o más de actividad CDC cuando la concentración del anticuerpo fue de 0.5 µ/ml o más. Muestra Experimental - Espontáneo Objetivo Actividad CDC (%) x 100 Máximo Objetivo - Control de Volumen - Espontáneo Objetivo Tabla 1 Ejemplo comparativo 1 Se llevó a cabo exactamente la misma operación en la misma forma que se describe en B y C del ejemplo 4, excepto que el lgG2a de ratón se utilizó en lugar del anticuerpo anti-ILT7. Los resultados se muestran en el ejemplo 4, así como en la tabla 5 y en la figura. No se observó actividad CDC de las células objetivo en anticuerpos diferentes al anticuerpo monoclonal anti-ILT7. Ejemplo 5 Internalización de anticuerpo anti-ILT7 a células objetivo A. Anticuerpo monoclonal anti-ILT7 Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales anti-ILT7. Anticuerpos monoclonales anti-ILT7: #17, #26, #37, #28 y #33. B. Observación de internalización B-1) Producción de línea de célula objetivo (línea de célula ILT7-CHO) Se produjo la línea de célula objetivo (línea de célula ILT7-CHO) en la misma forma que se describe en B-1 del ejemplo 4. B.2. Respuesta de células objetivo al anticuerpo anti-ILT7 Se suspendieron las células ILT7-CHO recuperadas en un amortiguador enfriado con hielo (T(-) + 10% FBS) con la siguiente composición en 1 x 106 células/mL utilizando 5 mM de una solución EDTA/PBS. Medio T (-): RP I1640 100 unidades/mL Penicilina 100 g/ml Estreptomicina 10 mM Hepes (pH 7.6) 2 mM L-Glutamina 1 mM piruvato de sodio 50 µ? 2-mercaptoetanol Suero de bovino fetal desactivado con calor al 10% Se colocaron 1 mL de la suspensión que se describió anteriormente en un tubo centrífugo, el cual se centrifugó (condición centrífuga: en 1200 rpm, a una temperatura de 4°C durante 5 minutos) y posteriormente se desechó el sobrenadante. Se agregaron 200 µ?_ de una suspensión de anticuerpo monoclonal ant¡-ILT7 de (10 g/mL) a los pelets celulares, lo cual se mezcló e incubó a una temperatura de 4°C durante 30 minutos, seguido de lavado dos veces con un medio T(-) enfriado con hielo (la cantidad del medio utilizado: 10 ml_ por lavado, condición centrífuga: en 1200 rpm, a una temperatura de 4°C durante 5 minutos). B.3) Modificación del complejo inmune de anticuerpo ILT7-anti-ILT7 presente en la superficie de las células objetivo En forma subsecuente, se modificó el complejo inmune de anticuerpo I LT7-a nti-l LT7 que se encuentra en la superficie de las células con un anticuerpo secundaria, el cual se etiquetó con fluorescencia para detección. El método especifico se describe más adelante. Se agregó anticuerpo policlonal IgG anti-ratón de cabra etiquetado con APC (número de catálogo: 550826BD, fabricado por Biosciences) que contiene medio T(-) enfriado con hielo, a los pelets celulares obtenidos tal como se describe en B-2), el cual se incubó con sombreado a una temperatura de 4°C durante 20 minutos, seguido de lavado dos veces con medio T(-) enfriado con hielo (la cantidad del medio utilizado: 10 ml_ por lavado, condición centrífuga: en 1200 rpm a una temperatura de 4°C durante 5 minutos). Posteriormente, el medio T(-) enfriado con hielo se agregó al mismo, lo cual se utilizó en la forma de 1 x 106 células/mL de suspensión.
B-4) Introducción de internalización mediante incubación a una temperatura de 37°C La suspensión obtenida tal como se describe en B-3, se dividió en forma igual en dos tubos (es decir los tubos (a) y (b)). Los tubos (a) y (b) se incubaron a una temperatura de 37 y 4°C, respectivamente bajo condición de sombreado durante 60 minutos. Después de la incubación, se agregó 1 % FBS/PBS (enfriado con hielo) con el objeto de detener la internalización. La solución resultante se centrifugó (condición centrífuga: en 1200 rpm, a una temperatura de 4°C durante 5 minutos) y posteriormente el sobrenadante fue desechado, seguido de lavado dos veces con 1% de FBS/PBS (enfriado con hielo) (cantidad de la solución: 10 mL por lavado, condición centrífuga: en 1200 rpm a una temperatura de 4°C durante 5 minutos). B-5) Modificación de complejo inmune de anticuerpo ILT7-anti-ILT7 que permaneció en la superficie de las células objetivo después de la incubación Se modificó el complejo inmune de anticuerpo ILT7-anti-ILT7 que permaneció en la superficie de la célula después de la incubación, con un anticuerpo terciario con el objeto de detección, mediante fluorescencia. Dicho método se describirá más adelante. 20 pL de una suspensión que contiene anticuerpos terciarios (anticuerpo IgG anticabra de mono etiquetado-FITC) (número de catálogo: sc-2024, fabricado por Santa Cruz biotechnology)) se agregó a los pelets celulares obtenidos tai como se describe en B-4), lo cual se mezcló y dejó asentar a una temperatura de 4°C durante 15 minutos bajo condiciones de sombreado. La solución resultante se lavó (cantidad de solución: 10 ml_ por lavado, condición centrífuga: en 1200 rpm a una temperatura de 4°C durante 5 minutos). B-6) Análisis de anticuerpo anti-ILT7 presente en células objetivo En forma subsecuente, se agregaron 150 µ?_ de 1% FBS/PBS a los pelets celulares obtenidos tal como se describe en B-5), lo cual se suspendió y recolectó en un tubo de microtitulación de 1.2 mi, seguido del desempeño del análisis FCM. En análisis, se analizó la intensidad de fluorescencia promedio (MPI) de cada célula por separado en FITC y APC. Además, se calculó la proporción de intensidad de fluorescencia (%) a través de la siguiente ecuación. Intensidad de fluorescencia promedio de células incubadas a Proporción de una temperatura de 37°C durante 60 minutos intensidad de (%)= x 100 intensidad de fluorescencia promedio de células incubadas a fluorescencia una temperatura de 4°C durante 60 minutos Los resultados se muestran en la tabla 2, tabla 3 y figura Tabia 2 Tabla 3 La intensidad de fluorescencia de FITC es un indicador de la cantidad de complejo inmune de anticuerpo I LT7-anti-l LT7 en la superficie celular después de la incubación. La intensidad de fluorescencia promedio de FITC para las células incubadas a una temperatura de 37°C durante 60 minutos, cayó hasta aproximadamente el 50% en comparación con las células incubadas a una temperatura de 4°C. Por otra parte, la intensidad de fluorescencia APC es un indicador de la cantidad de complejo inmune del anticuerpo I LT7-anti-l LT7 presentado en la superficie celular antes de la incubación. El complejo inmune del anticuerpo ILT7-anti-ILT7 se detecta sin importar si está presente en la superficie celular o si se incorpora en las células después de la incubación. En el ejemplo 5, la intensidad de fluorescencia APC después de la incubación en el caso de incubación a una temperatura de 37°C fue equivalente a la del caso de la incubación a una temperatura de 4°C. Se muestra que el complejo inmune del anticuerpo I LT7-anti-l LT7 puede encontrarse en cualquier sitio de las células objetivo incluso cuando la incubación se lleva a cabo a cualquier temperatura. Tal como se mencionó anteriormente, se descubrió que el anticuerpo monoclonal anti-ILT7 evocó la internalización de ILT7 a través de la incubación a una temperatura de 37°C. Ejemplo comparativo 2 Se llevó a cabo exactamente la misma operación en la misma forma a la descrita en el ejemplo 5, excepto que se utilizó lgG2 de ratón en lugar de anticuerpo anti-ILT7. Los resultados se muestran en el ejemplo 5, así como la tabla 2, tabla 3 y figura 13. En el caso en donde el IgGa de ratón se utilizó, no se observaron cambios algunos en la intensidad de fluorescencia de FITC y APC, de esta forma se descubrió que lgG2a de ratón no evoca la internalización de 1LT7. Ejemplo 6 Relacionado con la estructura del anticuerpo monoclonal ILT7 anti-humano de ratón [Secuencias de regiones variables] A. La clonación de la región variable que codifica el cADN del anticuerpo anti-ILT7 de ratón A-1) Con respecto a hibridomas que producen anticuerpos anti-ILT7 de ratón Los siguientes hibridomas fueron utilizados como hibridomas que producen anticuerpos anti-ILT7 de ratón. Hibridoma #11 (número de acceso: FERM BP-10704) Hibridoma #17 (número de acceso: FERM BP-10705) A-2) Aislamiento de los ARNs totales Los ARNs totales fueron aislados de hibridomas descritos en A-1) utilizando un equipo comercialmente disponible "RNeasy Mini kit" (número de catálogo: 74106, fabricado por Qiagen), de acuerdo con la instrucción anexa en el equipo. En ambos casos, se obtuvieron aproximadamente 200 pg de los ARNs totales de 1 x 107 hibridomas. A-3) Amplificación y fragmentación de cADN que codifica una región variable de cadena pesada de ratón El cADN que codifica una región variable de cadena pesada fue amplificado mediante método 5' RACE utilizando 5 pg de los ARNs totales aislados tal como se describió en A-2. Como para amplificación, el equipo comercialmente disponible "5' RACE System for Rapid Amplificaron of cDNA ENDS, Versión 2.0 Kit" (catálogo número: 18374-058. fabricado por Invitrogen) fue el utilizado. A continuación se describirá de manera específica. Primero, se sintetizó un primer cADN de hebra a partir de los ARNs totales obtenidos tal como se describió en A-2) mediante transcriptasa inversa. Las secuencias base de los cebadores antisentido (GSP1 ) utilizados al mismo tiempo se muestran en la tabla 4. Tabla 4 Cebadores utilizados para amplificación de un gen que codifica una región variable de cadena pesada de ratón En forma subsecuente, se degradaron los ARNs totales mediante RNaseH y el primer cADN de hebra que permaneció como una hebra simple, fue purificado mediante método de agarosa de bajo punto de fusión (1.5%). Además, se agregó dC (es decir homopolímero de nucleótido) al 3'-término del primer cADN de cadena utilizando la transferasa de desoxinucleotidilo terminal (TdT). El cADN se amplificó mediante método PCR utilizando cebadores ancla (SEQ ID NO: 34) que tienen un polímero de nucleótido complementario para dC (secuencia amplia) en el 3'-término y los cebadores antisentido (GSP2) mostrados en la tabla 4. Además, se utilizaron los productos PCR obtenidos como plantillas. El cADN fue amplificado mediante método PCR Anidado utilizando un cebador AUAP (SEQ ID NO: 35) y los cebadores antisentido (GSP2) mostrados en la tabla 4. Además, los productos PCR fueron purificados mediante método de agarosa de bajo punto de fusión (1.5%). Cebador de ancla para 5' RACE (SEQ ID NO: 34) 5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG Gil GGG IIG-3' (36 mer) AUAP primer gor 5' RACE (SEQ ID NO: 35) 5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3' (20-mer) A-4) Amplificación y fragmentación de cADN que codifica la región variable de cadena ligera de ratón El cADN que codifica una región variable de cadena ligera de ratón fue amplificado a partir de los ARNs totales aislados tal como se describe en A-2), en la forma misma forma que se describe en A-3). Las secuencias base de los cebadores utilizados en el momento se muestra en la tabla 5. Los productos PCR obtenidos fueron purificados mediante método de agarosa de bajo punto de fusión (1.5%). Tabla 5 Cebadores utilizados para amplificación de un gen que codifica una región variable de cadena ligera de ratón Confirmación de secuencia base de cADN y determinación de región CDR Una región variable de cadena pesada obtenida tal como se describe en A-3) y un fragmento de cADN de una región variable de cadena ligera obtenida tal como se describe en A-4), fueron clonadas ai vector pCR4 Blunt-TOPO utilizando un equipo comercialmente disponible "ZeroBluntTOPOCIoningKit" (número de catálogo: 1325137, fabricado por Invitrogen) de acuerdo con la instrucción adherida al equipo, la cual posteriormente se introduce en las células competentes Escherichia coli para producir el transformador Escherichia coli. Se obtuvo el plásmido antes mencionado del transformante, posteriormente se confirmó la secuencia base de cADN en el plásmido utilizando un secuenciador de ADN automático "PCR-based ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer" (fabricado por Applied Biosystems). Se extractaron secuencias correctas mediante la exclusión de transcripciones obtenidas de un ARN inactivo debido al desplazamiento de la estructura y las mutaciones sin sentido alrededor de la región de determinación de complementariedad (en lo sucesivo referido como "región CDR"). Además, la homología de la secuencia base de cADN comprendida en el plásmido fue comparada con la base de datos Kabat y las secuencias de la región CDR y se determinó la región variable en las regiones variables respectivas. Asimismo, como parte el hibridoma #37 producido en el ejemplo 4, se determinaron las secuencias de la región CDR y la región variable en las regiones variables y en el mismo procedimiento que se describe en A-1) a A-5) del ejemplo 6, utilizando el hibridoma #17. Las secuencias base de cADN de las regiones variables de cadena pesada y las regiones variables de cadena ligera de los anticuerpos monoclonales anti-ILT7 producidas mediante cada hibridoma y las secuencias de aminoácido codificadas por las secuencias, se muestran en las siguientes SEQ ID NOs.
Variable de cadena pesada Región variable de cadena ligera #11 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 40 (secuencia base) (secuencia base) SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 41 (secuencia de aminoácido) (secuencia de aminoácido) #17 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 44 (secuencia base) (secuencia base) SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 45 (secuencia de aminoácido) (secuencia de aminoácido) #37 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 48 (secuencia base) (secuencia base) SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 49 (secuencia de aminoácido) (secuencia de aminoácido) Confirmación de isotipo de región constante Como para el sobrenadante de cultivo de hibridoma, el isotipo de la región constante del anticuerpo monoclonal producido fue confirmado utilizando un equipo de isotipificación de anticuerpo monoclonal de ratón comercialmente disponible (número de catálogo: MMT1, fabricado por SerotecProduct). La región constante de cadena pesada del anticuerpo ILT7 anti-humano de ratón #11 fue I gy 3 , y la región constante de cadena ligera fue I g ? . Además, cada una de las regiones constantes de cadena pesada del anticuerpo ILT7 anti-humano de ratón #17 y el anticuerpo ILT7 anti-humano de ratón #37 fue Igy2a, y cada una de las regiones constantes de cadena ligera fue IgK. Ejemplo 7 Producción de anticuerpos quiméricos A. Clonación de cADN que codifica región constante IgG humana La región constante de cadena pesada lgG1 de humano y la región constante de cadena ligera kappa Ig de humano se seleccionaron de la biblioteca de cADN de IPCs humanas. Posteriormente, las regiones seleccionadas fueron clonadas para el vector pCR4 Blunt-TOPO utilizando un equipo comercialmente disponible "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit" (número de catálogo: 1325137, fabricado por Invitrogen) de acuerdo con la instrucción adherida en el equipo, lo cual posteriormente se introdujo en células competentes Escherichia coli para producir el transformador Escherichia coli. Se obtuvo el plásmido antes mencionado del transformador, posteriormente se confirmó la secuencia de base de cADN en el plásmido utilizando un secuenciador de ADN automático "PCR-based ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer" (fabricado por Applied Biosystems). B. Ligadura de región variable con región constante y clonación El cADN que codifica la región constante pesada obtenida como se describe en A, y el cADN que codifica la región variable de cadena pesada obtenida tal como se describe en A-5 del ejemplo 6 fueron utilizadas, respectivamente. Ambos ADNs tienen una región en la cual se traslapa una secuencia base del ADN. Posteriormente, se obtuvo el ADN de hebra doble a través del método de extensión de traslape utilizando la región. El proceso específico es como se indica a continuación. C-1) Preparación de cADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo ILT7 quimérico Se digirió el "plásmido con cADN que codifica las regiones variables de cadena pesada de #11 y #17", el cual se obtuvo tal como se describe en A-5) con enzimas de restricción Notl y Xbal, el cual se purificó a través del método de gel de agarosa (1.5%). Los productos resultantes se disolvieron en cada amortiguador TE, con la siguiente composición para ser de 100 pmol/pL para preparar una solución de fragmento de ADN que codifica la región variable de cadena pesada. Amortiguador TE: 10 mM Tris-HCI 1 mM EDTA pH 7.5 a 8.0 Además, el "plásmido de cADN que codifica la región constante de cadena pesada" obtenido como se describe en B, se trató de la misma forma que se describe anteriormente para preparar 100 pmol/pL de solución. En forma subsecuente, ambas soluciones fueron mezcladas, y posteriormente ambas regiones de traslape fueron hibridadas manteniéndolas primero a una temperatura 70°C durante 10 minutos y posteriormente manteniéndolas a una temperatura de 37°C durante 5 minutos. Posteriormente, el cADN fue amplificado mediante el método PCR y el cADN obtenido fue digerido con enzimas de restricción Notl y Xbal, las cuales fueron purificadas mediante método de gel de agarosa de bajo punto de fusión (1.5%). C-2) Preparación de cADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo ILT7 quimérico. El cADN que codifica la región constante de cadena ligera obtenida como se describe en A y el cADN que codifica la región variable de cadena ligera obtenida tal como se describe en A-5 del Ejemplo 6, fueron utilizados respectivamente. Se obtuvo el cADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo ILT7 quimérico, en la misma forma que se describe en C-1) utilizando estos cADNs. C-3) Clonación El cADN obtenido tal como se describe en C-1) fue clonado para el vector de plásmido pcAD N 3.1 -Zeoci na (fabricado por Invitrogen) utilizando Notl y Xbal tal como los sitios de clonación para producir un vector de expresión de cadena pesada del anticuerpo ILT7 quimérico. Además, el cADN obtenido tal como se describe en C-2) fue clonado al vector de plásmido pcADN3.1 -hidromicina (fabricado por Introgen) utilizando Notl y Xbal como sitios de clonación para producir un vector de expresión de cadena ligera de anticuerpo ILT7 quimérico. Los nombres de cada vector se muestran en la Tabla 6. Tabla 6 Nombre de vectores de plásmido D. Expresión de anticuerpo ILT7 quimérico. D-1) Transformación Temporal 1 µ9 de un vector de expresión de cadena pesada de anticuerpo ILT7 quimérico y 1 de un vector de expresión de cadena ligera de anticuerpo quimérico ILT7, los cuales se obtuvieron tal como se describe en C-3), se transfectaron en conjunto para células 293T utilizando un equipo de transfección de efectine (Catálogo número: 301427, fabricado por Qiagen). Posteriormente, los productos resultantes fueron cultivados a una temperatura de 37°C utilizando medio de cultivo DMEM adicionado con FBS IgG Bajo al 2% con la siguiente composición. Medio de cultivo DMEM adicionado con FBS IgG Bajo al 2 % : Medio de cultivo DMEM (Catálogo número: D5796, fabricado por Sigma) FBS IgG Bajo al 2% (Catálogo número: SH30151.03, fabricado por HyClone) 2 mM L-Glutamina 100 U/ml Penicilina 100 pg/ml estreptomicina pH 7.2 a pH 7.4 Después de la introducción de los vectores, se cultivo el medio resultante durante 96 horas y se recolectó el sobrenadante de cultivo. Posteriormente, los fragmentos celulares se eliminaron mediante centrifugación para producir la solución del anticuerpo crudo. D-2) Transformación por Homeostasis Se obtuvieron 1 pg del vector de expresión de cadena pesada del anticuerpo ILT7 quimérico y 1 pg del vector de expresión de cadena ligera del anticuerpo ILT7 quimérico, tal como se describe en C-3), se transfectaron en conjunto para células YB 2/0 (células derivadas de mieloma de rata, ATCC#CRL-1622) utilizando un equipo de transfeccion efectine (Catálogo número: 301427, fabricado por Qiagen). Entre los vectores de plásmido, el vector para la expresión de cadena pesada es un marcador para la resistencia de Zeocin y el vector para la expresión de cadena ligera es un marcador para la resistencia por higromicina. Posteriormente, se introdujeron células en las cuales ambos vectores pueden ser crecidos en un medio de cultivo al cual se agregan Zeocin e hygromycin al mismo tiempo. Posteriormente, las células fueron cultivadas en un medio de cultivo RPMI al cual se le agregaron Zeocin e hygromycin y se seleccionó ¡a cepa existente. Medio de cultivo RPMI adicionado con Zeocin-hygromycin: Medio de cultivo RPMI 1640 (Catálogo número: R8758, fabricado por Sigma) 10% FBS 0.01 M HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico) 1 mM Piruvato de sodio 2 mM L-Glutamina 100 U/ml Penicilina 100 pg/ml Estreptomicina 55 µ? 2-mercaptoetanol 0.5 mg/ml Zeocin 0.5 mg/ml Hygromycin pH 7.2 a pH 7.4 Tres días después de esto, se determinó la cantidad de producción de anticuerpo en el sobrenadante de cultivo a través del método ELISA. Se seleccionó la línea celular que produce el anticuerpo quimérico ILT7 con un alto nivel de expresión y se incrementaron las células de manera suficiente. Además, se llevó a cabo una clonación simple de las lineas celulares seleccionadas a través del método de clasificador celular para obtener las siguientes líneas celulares. Línea celular que produce anticuerpo-quimérico ILT7 #11: Línea celular #11-5 y línea celular #11-16. Línea celular que produce anticuerpo-quimérico ILT7 #17: Línea celular #17-24. Las líneas celulares antes mencionadas (Línea celular #11-5, línea celular #11-16, y línea celular #17-24) se cultivaron respectivamente en un medio de cultivo RPMI adicionado con FBS al 5% con la siguiente composición. La temperatura de incubación y el tiempo de incubación se ajustaron a una temperatura de 37°C y a 96 horas, respectivamente. Medio de cultivo RPMI adicionado con FBS al 5%: Medio de cultivo RPMI1640 (Catálogo número: R8758S, fabricado por Sigma). 5% FBS 0.01 M HEPES 1 mM Piruvato de sodio 2 mM L-Glutamina 100 U/ml Penicilina 100 µ g / m I Estreptomicina 55 µ? 2-mercaptoetanol pH 7.2 a pH 7.4. El sobrenadante de cultivo se recolectó y posteriormente se eliminaron los fragmentos celulares mediante centrifugación para proporcionar una solución de anticuerpo crudo. E. Purificación de anticuerpos Cada una de las soluciones de anticuerpo crudo obtenido tal como se describió en D-1 y D-2 fue purificada mediante columna de afinidad de proteína A (rProtein A Sepharose FF, Catálogo número 17-1279-01 , fabricado por Amershram Pharmacia). Las condiciones de purificación son como se indica a continuación. Se llevó a cabo purificación de afinidad utilizando el amortiguador PBS (-) con la siguiente composición como un amortiguador de absorción y un amortiguador de citrato de sodio 0.1 M (pH 3) como un amortiguador de elución de acuerdo con el manual de instrucciones anexo. Se agregaron 1 M Tris-HCI (pH 8.0) a las fracciones eluidas para ajustar el pH alrededor de 7.2. Los ODs en 450 a 620 nm fueron medidos y posteriormente se seleccionaron los depósitos que muestran reacción positiva. Con referencia a la concentración de anticuerpos purificados, se determinó la absorbancia de 280 nm se cálculo con base en 1.38 OD/mg/ml. Se obtuvieron las relaciones entre anticuerpos ILT7 quiméricos, se derivaron los hibridomas de los cuales el gen de región variable fue derivado, y se resumieron las células huésped en la Tabla 7. Amortiguador PBS (-): 0.2 g/L Fosfato dihidrógeno de monopotasio 0.2 g/L Cloruro de potasio 8 g/L Cloruro de sodio 1.15g/L anhidro fosfato de monohidrógeno disódico. Tabla 7 Anticuerpos quiméricos producidos A continuación se muestran las secuencias base y de aminoácido de cADN de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos quiméricos producidos, respectivamente. En cada secuencia de aminoácido, la secuencia del aminoácido del N-término a -1 es una secuencia de señal y la secuencia de aminoácido de 1 al C término es una secuencia de aminoácido de una proteína madura. Esto es, las cadenas pesadas y ligeras, las cuales constituyen estos anticuerpos quiméricos, consisten en la secuencia de aminoácido de 1 al C término cada una de las siguientes secuencias de aminoácido. Cadena pesada Cadena ligera #11 SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 52 (secuencia base) (secuencia base) SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 53 (secuencia de aminoácido) (secuencia de aminoácido) #17 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 56 (secuencia base) (secuencia base) SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 57 (secuencia de aminoácido) (secuencia de aminoácido) Aplicabilidad Industrial La presente invención proporciona el ¡nmunogeno útil para producir el anticuerpo que reconoce en forma específica el ILT7 humano, y el método para producir el anticuerpo anti-ILT7 utilizando el inmunogeno. El anticuerpo que reconoce en forma específica el ILT7 humano de la presente invención, reconoce en forma específica ILT7 bajo la presencia de la familia ILT. Por consiguiente, el anticuerpo de la presente invención puede ser utilizado para la detección y aislamiento de ILT7 humano. Por ejemplo, la localización de ILT7 puede analizarse utilizando el anticuerpo de la presente invención. Se considera que ILT7 es una molécula relacionada en forma cercana con la diferenciación y función de IPCs o células dendríticas. Por consiguiente, el anticuerpo, el cual reconoce ILT7 con alta especificidad, es útil para el análisis de función de IPCs o células dendríticas. Las células de cáncer tipo IPC (que tienen la característica en la cual se expresa BDCA-2) son conocidas (Chaper of L y asociados., Eur. J. Immunol. 34; 418-426, 2004, Maeda T y asociados., Int. J. Hematol. 81; 148-154, 2005). La confirmación de la expresión de ILT7 en estas células puede permitir el diagnóstico de cáncer y un agente terapéutico. En el caso de enfermedades autoinmunes, se señala por ejemplo, la relación profunda entre IFNa producido por IPCs y el desarrollo de psoriasis, la cual es una enfermedad de la piel (Nestle FO y asociados., J. Exp. Med. 202, 135-143, 2005). Por consiguiente, la severidad de psoriasis puede ser revisada identificando IPCs en el tejido de la piel de pacientes con psoriasis, es decir, en muestras de biopsia que utilizan el anticuerpo anti-ILT7. Se sabe que el desarrollo de SIDA en pacientes infectados con VIH está correlacionado con el número de IPCs. Es decir, se han observado lotes de IPCs en pacientes que no muestran síntomas y se ha observado la reducción de IPCs en e¡ desencadenamiento (Soumells V. y asociados., Blood 98; 906-912, 2001 ). Por consiguiente, es efectivo en la anticipación del pronóstico de infección de virus, tal como VIH. Por ejemplo, ILT7 es una molécula que se expresa en forma específica en IPCs humanas. Por consiguiente, el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención puede ser utilizado para detectar, identificar o aislar IPCs. IPCs son células que producen la mayor parte del ¡nterferón tipo 1. Por consiguiente, la detección, identificación o aislamiento es un objetivo importante en el diagnóstico y estudio de enfermedades que implican interferón tipo 1. Como dichas enfermedades, se pueden ilustrar varias enfermedades autoinmune e infecciones en las que está implicado el interferón en la formación de la condición patológica. Además, el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención tiene el efecto inhibidor en la actividad de IPCs. Por consiguiente, la actividad de IPCs puede inhibirse utilizando el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención. Además, las enfermedades que implican interferón tipo 1 pueden tratarse inhibiendo la actividad de IPCs. En forma específica, el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención es útil para varias enfermedades autoinmune e infecciones en las que el interferón está implicado en la formación de la condición patológica. Particularmente, ya que el anticuerpo anti-ILT7 tiene alta especificidad, puede eliminar en forma eficiente IPCs.

Claims (31)

  1. REIVINDICACIO ES 1. Un anticuerpo monoclonal que enlaza a un dominio extracelular de ILT7 humano o un fragmento que comprende su región de enlace de antígeno. 2. El anticuerpo monoclonal o el fragmento que comprende su región de enlace de antígeno es tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal enlaza a células que producen interferón humano. 3. Un anticuerpo monoclonal que es producido a través de un hibridoma I LT7# 11 depositado bajo el Número de Acceso FERM BP- 0704 o un hibridoma ILT7#17 depositado bajo el Número de Acceso FERM BP-10705, o un fragmento que comprende su región de enlace de antígeno. 4. El anticuerpo monoclonal o el fragmento que comprende su región de enlace de antígeno tal como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo monoclonal comprende secuencias de aminoácido de acuerdo con cualesquiera de los incisos i) a iii), tal como CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera: i) CDR1 de una región variable de cadena pesada: SDYAWN (SEQ ID NO: 58); CDR2 de una región variable de cadena pesada: YISYSGSTSYNPSLKSR (SEQ ID NO: 59); y
  2. CDR3 de una región variable de cadena pesada: SPPYYAMDY (SEQ ID NO: 60); CDR1 de una región variable de cadena ligera: KASQDVGTAVA (SEQ ID NO; 61); CDR2 de una región variable de cadena ligera: WASTRHT
  3. (SEQ ID ÑO: 62); y CDR3 de una región variable de cadena ligera: QQYSSYPLT (SEQ ID NO: 63); ii) CDR1 de una región variable de cadena pesada: SYWIH (SEQ ID NO: 64); CDR2 de una región variable de cadena pesada: RIYPGTGSTYYNEKFKG (SEQ ID NO: 65); y CDR3 de una región variable de cadena pesada: YPTYDWYFDV (SEQ ID NO: 66); CDR1 de una región variable de cadena ligera:
  4. RASQSISNYLH (SEQ ID NO; 67); CDR2 de una región variable de cadena ligera: YASQSIS (SEQ ID NO: 68); CDR3 de una región variable de cadena ligera: QQSNSWPLT (SEQ ID NO: 69); iii) CDR1 de una región variable de cadena pesada: SDYAWN (SEQ ID NO: 70); CDR2 de una región variable de cadena pesada: YISYSGSTSYNPSLKSR (SEQ ID NO: 71); CDR3 de una región variable de cadena pesada:
  5. ALPLPWFAY (SEQ ID NO: 72); CDR1 de una región variable de cadena ligera: KASQDVGTAVA (SEQ ID NO; 73); CDR2 de una región variable de cadena ligera: WASTRHT (SEQ ID NO: 74); y CDR3 de una región variable de cadena ligera: QQYSSYPLT (SEQ ID NO: 75). 5. El anticuerpo monoclonal o el fragmento que comprende su región de enlace de antígeno tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal comprende una secuencia madura de una secuencia de aminoácido seleccionada de cualesquiera de las siguientes combinaciones (a) a (c) como la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera: a) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 41 b) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 45 ; y c) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 47 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 49
  6. 6. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo monoclonal o el fragmento que comprende su región de enlace de antígeno tal como se describe en las reivindicaciones 4 ó 5.
  7. 7. Un vector que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo monoclonal o el fragmento que comprende su región de enlace de antígeno tal como se describe en las reivindicaciones 4 ó 5.
  8. 8. Una célula transformada que retiene el vector tal como se describe en la reivindicación 7 en una forma que se puede expresar.
  9. 9. Un método para producir el anticuerpo monoclonal o el fragmento que comprende su región de enlace de antígeno tal como se describe en la reivindicación 4 ó 5, que comprende los pasos de: cultivar la célula transformada tal como se describe en la reivindicación 8; y recuperar el anticuerpo monoclonal o el fragmento que comprende su región de enlace de antígeno del cultivo.
  10. 10. Un hibridoma que produce cualesquiera de los anticuerpos monoclonales tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2.
  11. 11. Un hibridoma ILT7#11 depositado bajo el Número de Acceso FERM BP-10704 o un hibridoma ILT7#17 depositado bajo el Número de Acceso FERM BP-10705.
  12. 12. Un método para producir un anticuerpo monoclonal, que comprende los pasos de: cultivar el hibridoma tal como se describe en la reivindicación 11; y recolectar el anticuerpo monoclonal del cultivo.
  13. 13. Un método para producir una célula que produce un anticuerpo monoclonal que enlaza a un dominio extracelular del ILT7 humano, caracterizado porque comprende los pasos de: (1 ) administrar a un animal inmune una célula que expresa una proteína exógena que comprende un dominio extracelular del ILT7 humano, y una molécula exógena que se asocia con el ILT7 humano; y (2) seleccionar un anticuerpo que produce células que producen un anticuerpo que enlaza el ILT7 humano de la célula que produce anticuerpos del animal inmune.
  14. 14. El método tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque la molécula que se asocia con ILT7 humano es una proteína de membrana celular.
  15. 15. El método tal como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque la proteína de membrana celular es una cadena-? del receptor Fe.
  16. 16. El método tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizado porque la célula que expresa el ILT7 humano y la molécula que se asocia con ILT7 humano, es una célula que retiene los siguientes (a) y (b) en una forma que se puede expresar: (a) un polinucleótido exógeno que codifica una secuencia de aminoácido que comprende un dominio extracelular del ILT7 humano; y (b) un polinucleótido exógeno que codifica la cadena-? del receptor Fe.
  17. 17. El método tal como se describe en la reivindicación 16, caracterizado porque la célula es una célula animal.
  18. 18. El método tal como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque la célula es una célula derivada de humano.
  19. 19. El método tal como se describe en la reivindicación 18, caracterizado porque la célula derivada de humano es una célula 293T.
  20. 20. El método tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque comprende además el paso de clonar la célula que produce anticuerpos obtenida a través del método de acuerdo con la reivindicación 13.
  21. 21. Un método para producir un anticuerpo monoclonal que enlaza a un dominio extracelular de ILT7 humano, caracterizado porque comprende los pasos de: cultivar la célula que produce anticuerpos a través del método de acuerdo con la reivindicación 8; y recuperar el anticuerpo monoclonal del cultivo.
  22. 22. Un anticuerpo monoclonal con la capacidad de reconocer ILT7 humano o un fragmento que comprende su región de enlace de antígeno que puede obtenerse a través de los siguientes pasos: (1 ) administrar a un animal inmune una célula que expresa en forma exógena una proteína que comprende el dominio extracelular de un ILT7 humano y una molécula que se asocia con el 1LT7 humano. (2) seleccionar una célula que produce anticuerpos que produce el anticuerpo que enlaza a ILT7 humano de la célula que produce anticuerpos del animal inmune; y (3) cultivar la célula que produce anticuerpos seleccionada a través del paso (2) y recuperar un anticuerpo con la capacidad de reconocer ILT7 humano del cultivo.
  23. 23. Un inmunogeno para producir un anticuerpo que enlaza a un dominio extracelular de ILT7 humano, que comprende una célula animal en la cual (a) un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácido que comprende un dominio extracelular de ILT7 humano, y (b) un polinucleótido que codifica la cadena-? del receptor Fe se retienen en una forma exógenamente expresable; o una fracción de membrana celular del mismo.
  24. 24. El inmunogeno tal como se describe en la reivindicación 23, caracterizado porque la célula animal es una célula derivada de humano.
  25. 25. Un método para detectar una célula que produce interferón, caracterizado porque comprende los pasos de: contactar un anticuerpo monoclonal que enlaza a un dominio extracelular de ILT7 humano o un fragmento que comprende su región de enlace de antígeno con una célula de prueba; y detectar el anticuerpo monoclonal o el fragmento que comprende su región de enlace de antígenos que se enlaza a la célula.
  26. 26. Un reactivo para detectar una célula que produce interferón, que comprende un anticuerpo monoclonal que enlaza a un dominio extracelular de ILT7 humano o un fragmento que comprende su región de enlace de antígenos.
  27. 27. Un método para inhibir la actividad de una célula que produce interferón, caracterizado porque comprende el paso de contactar cualesquiera de los siguientes componentes en una célula que produce interferón: (a) un anticuerpo monoclonal que enlaza a ILT7 humano y que inhibe la actividad en la célula que produce interferón o un fragmento que comprende su región de enlace de antígeno; y (b) una inmunoglobulina en la cual se introduce una región de determinación de complementariedad del anticuerpo monoclonal descrito en (a), o un fragmento que comprende su región de enlace de antígenos.
  28. 28. Un método para inhibir la actividad de una célula que produce interferón en un organismo vivo, que comprende el paso de administrar cualesquiera de los siguientes componentes a un organismo vivo: (a) un anticuerpo monoclonal que enlaza a ILT7 humano y que inhibe la actividad de una célula que produce interferón o un fragmento que comprende su región de enlace de antígenos; (b) una inmunoglobulina en la cual se introduce una región de determinación de complementariedad del anticuerpo monocional descrito en (a) o el fragmento que comprende su región de enlace de antígenos; y (c) un polinucleótido que codifica cualesquiera de los componentes que se describen en (a) ó (b).
  29. 29. El método tal como se describe en la reivindicación 27 ó 28, caracterizado porque la actividad de la célula que produce interferon se debe ya sea a la actividad que produce interferon o a la supervivencia de la célula que produce interferon, o ambas de ellas.
  30. 30. Un inhibidor para la actividad de una célula que produce interferon, que comprende cualesquiera de los siguientes componentes en la forma de un ingrediente activo: (a) un anticuerpo monoclonal que enlaza a ILT7 humano e inhibe la actividad de una célula que produce interferon o un fragmento que comprende su región de enlace de antígenos; (b) una inmunoglobulina en la cual se introduce una región de determinación de complementariedad del anticuerpo monoclonal que se describe en (a), o un fragmento que comprende su región de enlace de antígenos; y (c) un polinucleótido que codifica cualesquiera de los componentes descritos en (a) ó (b).
  31. 31. El inhibidor de la actividad de una célula que produce interferon tal como se describe en la reivindicación 30, caracterizada porque la actividad de la célula que produce interferon se debe a ya sea a la actividad que produce interferon o a la supervivencia de la célula que produce interferón, o ambas de ellas.
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