MX2008007281A - Terapia de estrogeno contra cancer - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de un conjugado que comprende un polímero de poli(aminoácido) para un fármaco para el tratamiento del cáncer en un paciente, en donde el cáncer estácaracterizado por la presencia de células cancerígenas que llevan receptor de estrógeno o en donde el cáncer es originado en un tejido uórgano que contiene células que llevan receptor de estrógeno, y en donde se identifica al paciente por tener un nivel de estrógeno de hasta en el rango de aproximadamente 30 hasta aproximadamente 1,000 picogramos por mililitro de suero o plasma. Del mismo modo, la presente invención se refiere al uso de un conjugado que comprende un polímero de poli(aminoácido) conjugado para un fármaco contra el cáncer para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un paciente, en donde el cáncer estácaracterizado por la presencia de células cancerígenas que llevan receptor de estrógeno, o en donde el cáncer se origina en un tejido uórgano que contiene células que llevan receptor de estrógeno, y en donde el paciente es identificado por tener un nivel de estrógeno por debajo de 30 picogramos por mililitro de suero o plasma.

Description

TERAPIA DE ESTRQGENQ CONTRA CÁNCER REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la fecha de presentación de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos de Norteamérica No. 60/742,725, presentada el 6 de diciembre de 2005 y la Solicitud Provisional de los Estados Unidos de Norteamérica No. 60/814,221 , presentada el 16 de junio de 2006 las descripciones de las cuales están incorporadas en la presente mediante referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los conjugados de paclitaxel soluble en agua, los métodos para elaborarlos y métodos para utilizarlos para tratar enfermedades sensibles a taxano, están descritos en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica 5,977,163 y 6,262,107. Según se reporta en ellas, se encontró de manera sorpresiva que las composiciones que contienen I las formas conjugadas de los fármacos fueron sorprendentemente efectivas con agentes anti-tumorales contra modelos de tumor ilustrativos, y se espera que por lo menos sean tan efectivos como paclitaxel o docetaxel contra cualquiera de las enfermedades o condiciones para las cuales se sabe que son efectivos los taxanos o taxoides. También proporcionaron ventajas en términos de facilidad de formulación (al superar las desventajas asociadas con la insolubilidad de los fármacos mismos), liberación controlada y menores efectos colaterales (debido por lo menos en parte a la eliminación de la necesidad de solventes que están asociados con los efectos colaterales observados con las composiciones de paclitaxel anteriores). BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un primer aspecto de la presente invención está dirigido a un método para tratar pacientes identificadas por tener un nivel de estrógeno premenopáusico, y a quienes se les diagnostico cáncer, que comprende suministrar a una mujer que necesita del mismo, un conjugado que comprende un polímero de poli (amino ácido) conjugado para un fármaco anti-cáncerígeno (referido en la presente como el fármaco conjugado o conjugado de fármaco), en donde el cáncer está caracterizado por la presencia de células cancerosas que llevan receptor de estrógeno o células normales (no enfermas) que llevan receptor de estrógeno del órgano o tejido en el cual se origina el cáncer.

Un segundo aspecto de la presente invención está dirigido a un método para tratar pacientes identificadas por tener un nivel de estrógeno postmenopáusico, y a quienes se les diagnosticó cáncer, en donde el cáncer está caracterizado por la presencia de células cancerígenas que llevan receptor de estrógeno o células normales (no enfermas) que llevan receptor de estrógeno del órgano o tejido en el cual se origina el cáncer, y en donde el tratamiento comprende suministrar a la paciente el fármaco conjugado y terapia con estrógeno.

En varias modalidades de la presente invención, el polímero de poli)amino ácido) es ácido poli(glutámico) o poli (lisina); el fármaco anti-cancerígeno es un taxano; en otras modalidades, el fármaco anti-cancerígeno es paclitaxel. En otra modalidad, el fármaco anti-cancerígeno es paclitaxel y el polímero comprende ácido poli (glutámico). En otra modalidad, la terapia con estrógeno comprende la administración de 17-ß-estradiol. En otra modalidad, el cáncer es cáncer pulmonar, en una modalidad adicional, el cáncer es cáncer pulmonar de célula no-pequeña.

Un aspecto adicional de la presente invención está dirigido a un método para seleccionar un régimen de tratamiento del cáncer en base a los niveles de estrógeno en sangre o en suero.

En tanto que no pretende enlazarse a ninguna teoría de operación particular, el solicitante considera que la presencia de estrógeno (es decir, terapia con estrógeno suministrada endógena o exógenamente) mejora la eficacia de los fármacos conjugados al incrementar la cantidad de fármaco suministrada al tejido canceroso (por ejemplo, tumor). El estrógeno puede ocasionar también la sobre-regulación de catespina B, una enzima asociada con la separación del fármaco activo desde la estructura de base del vehículo polimérico, dando como resultado cantidades incrementadas de fármaco anticancerígeno no conjugado (o libre) en el tejido canceroso.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica lineal que indica sobrevivencia, en días, para mujeres con niveles de estrógeno en plasma sanguíneo postmenopáusicos (es decir, bajos) tratadas con paclitaxel conjugado + carboplatina (CT-2103 + Carbo (es decir, carboplatina); línea sólida con círculos abiertos) o paclitaxel no conjugado + carboplatina (Paclitaxel + Carbo (es decir, carboplatina); línea punteada con cuadrados abiertos).

La Figura 2 es una gráfica lineal que indica sobrevivencia, en días, para mujeres con niveles de estrógeno en plasma sanguíneo premenopáusicos (es decir, elevados) tratadas con paclitaxel conjugado + carboplatina (CT-2103 + Carbo; línea sólida con círculos abiertos) o paclitaxel no conjugado + carboplatina (Paclitaxel + Carbo; línea punteada con cuadrados abiertos).

La Figura 3 es una gráfica lineal que muestra la sobrevivencia general (OS) en mujeres de menos 55 años de edad, tratadas con paclitaxel poliglumex (PPX) contra control.

La Figura 4 es una gráfica lineal que muestra OS en mujeres de más de 55 años de edad, tratadas con PPX contra control.

La Figura 5 es una gráfica lineal que muestra OS en mujeres premenopáusicas, tratadas con PPX contra control.

La Figura 6 es una tinción Western que muestra expresión Era y ERß en líneas de célula de tumor humanas y los modelos de tumor HT-29 y H460.

La Figura 7 es un conjunto de gráficas lineales que muestra el efecto del estrógeno sobre el peso del tumor y la actividad de catepsina B en el modelo de tumor HT-29.

La Figura 8 es un conjunto de gráficas que muestra el efecto del estrógeno sobre el peso del tumor y la actividad de catepsina B en el modelo de tumor H460.

La Figura 9 es una tinción Western que muestra el efecto del estradiol sobre la expresión de receptor ß de estrógeno (ERß) en el modelo de tumor HT-29.

La Figura 10 es una tinción Western que muestra el efecto del estradiol sobre la expresión ERß en el modelo de tumor H460.

La Figura 11 es un diagrama que ilustra un análisis RT-PCR sobre el gen corriente abajo de E-Caderina de la trayectoria de señalización del receptor de estrógeno.

La Figura 12 es un diagrama que muestra un análisis RT-PCR en el gen corriente abajo (ld-2) de la trayectoria de señalización del receptor de estrógeno.

La Figura 13 es un conjunto de gráficas lineales que indica los niveles de paclitaxel no conjugado o total, en ng de fármaco/g del tejido, ya sea en el hígado, pulmón o médula ósea de hombres (A), mujeres (B) o ratas hembra ooforectomizadas (C); en donde: (A) (línea sólida negra con cuadros abiertos); (B) (línea sólida azul con cuadrados abiertos); y (C) (línea sólida roja con cuadrados abiertos).

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención está dirigida a un tratamiento contra el cáncer. Como se utiliza en la presente, el término "cáncer que lleva receptor de estrógeno" se refiere a cualquier cáncer, formación de tumor o de otro tipo (por ejemplo, cánceres hematopoyéticos tales como leucemia), caracterizados por la presencia de células cancerígenas que llevan receptores de estrógeno, o un cáncer que se origina en un órgano o tejido que contiene células normales (no-enfermas) que llevan receptores de estrógeno. El receptor de estrógeno puede ser expresado de manera transitoria y/o las células que llevan receptor de estrógeno pueden representar una fracción de la población total de células (células cancerígenas o células no enfermas). Establecido de una manera un poco diferente, no todas las células asociadas con un cáncer particular o las células en el tejido de origen, tienen necesariamente receptores de estrógeno. Las células cancerígenas no siempre expresan los receptores de estrógeno durante el curso del avance de la enfermedad. Las células normales en el tejido de origen no necesariamente expresan los receptores de estrógeno durante todo su lapso de vida).

Hay dos formas de receptores de estrógeno, a saber receptores a- y ß-. La prevalencia de cualquier receptor en las células cancerígenas puede estar relacionada con el tipo particular de cáncer y/o una etapa particular de la progresión del cáncer. Por lo tanto, las células cancerígenas pueden expresar cada forma en diferentes momentos durante la progresión de la enfermedad. Véase Leav et al., Am. J. Path. 255:79-92 (2001). Los cánceres que llevan el receptor ß de estrógeno incluyen, aunque no se limitan a, cáncer pulmonar de célula no-pequeña (NSCLC), cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer epitelial uterino y sarcomas, cáncer de colon, glioma, cáncer de próstata, cánceres testiculares, y melanoma. Para esta solicitud, los receptores ß de estrógeno son de particular interés ya que son los únicos receptores funcionales expresados en los tejidos pulmonares y en NSCLC. See Patrone et al., Mol. Cell. Blo. 23:8542-8552 (2003).

Como se describe en la presente, dependiendo de la población de pacientes seleccionada, los métodos de la invención pueden comprender también la administración de terapia de estrógeno. En algunas modalidades de la invención, la población de paciente seleccionada constituye mujeres con niveles premenopáusicos (o elevados) de estrógeno endógeno. Las mujeres con "niveles premenopáusicos de estrógeno endógeno" como se utiliza la frase en la presente, tienen de manera típica un nivel de estrógeno en suero o plasma sanguíneo (medido comúnmente en términos de la hormona estradiol bioactiva (estradiol-17ß, o E2, utilizando, por ejemplo, equipos del ensayo con inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) comercialmente disponible como aquellos de la división RDI de Fitzgerald Industries International (Concord, MA)) desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 1000 picogramos/mililitro (pg/ml), por ejemplo aproximadamente 30 hasta aproximadamente 300 pg/ml de suero o plasma. Los niveles premenopáusicos de estrógeno endógeno se encuentran de manera común en mujeres quienes son pos-pubescentes, que no han experimentado la menopausia, y no tienen otros factores mitigantes de salud que cambiarían drásticamente los niveles de estrógeno. Esta población incluye de manera común mujeres con edades desde 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, hasta aproximadamente 54, y cualquier rango de subconjunto en las mismas. Además, aunque es raro, los hombres en ocasiones tienen niveles de estrógeno en suero sanguíneo o plasma similares a las mujeres premenopáusicas. Por lo tanto, el término "premenopáusico" como se emplea en la presente, en relación con los niveles de estrógeno en suero sanguíneo o plasma, abarca también a los hombres.

En otras modalidades de la invención, la población de pacientes seleccionada constituye pacientes con bajos niveles de estrógeno, por lo general hombres y mujeres postmenopáusicas. En estas modalidades, los pacientes son tratados con terapia combinada que permite el suministro o administración del conjugado de fármaco y terapia con estrógeno. Estos pacientes tienen de forma común niveles de estrógeno en suero o plasma sanguíneo menores a aquellos de la cuantificación, por lo general menores a 30 pg/ml, por ejemplo, aproximadamente 20 hasta justo por debajo de 30 pg/ml. En tanto que se reconoce que los hombres no experimentan la "menopausia", como se utiliza en la presente, en relación con los niveles de estrógeno en suero sanguíneo o plasma, el término "postmenopáusico" abarca también a los hombres. Las mujeres postmenopáusicas comúnmente son de más de 55 años de edad. Sin embargo, en ciertos casos individuales, mujeres menores a los 55 años de edad pueden tener niveles de estrógeno postmenopáusicos. Estos casos incluyen mujeres que han tenido ooforectomías quirúrgicas, o perdieron la función de los ovarios debido a la administración de quimioterapia citotóxica para cáncer u otros fármacos que afectan la función de los ovarios o la pituitaria, o tienen falla ovárica primaria. Este grupo puede incluir mujeres más jóvenes con edades de 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, o 54.

Los polímeros útiles en la presente invención comprenden amino ácidos. Los ejemplos de dichos polímeros se describen en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica 5,977,163 y 6,262,107. El término "polímero de poli (amino ácido)", como se emplea en la presente, se refiere a copolímeros y homopolímeros que constan de amino ácidos de existencia natural o sintéticos. Los aminoácidos no necesitan ser polimerizados a través de enlaces de péptido aunque pueden ser enlazados de cualquier modo que permita que los monómeros de amino ácido sean enlazados de forma secuencial.

Los polímeros que pueden ser útiles en la presente invención incluyen aunque no se limitan a ácido poli(1 -glutámico), ácido poli(d-glutámico), ácido poli(d1 -glutámico), ácido poli(l-aspártico), ácido poli(d-aspártico), ácido poli(d1 -aspártico), poli(l-lisina), poli(d-lisina), poli(d1 -lisina), poli(1 -serina), poli(d-serina), poli(d1 -serina), poli(l-gliacina), poli(d-glicina), poli(d1 -glicina), poli(l-alanina), poli(d-alanina), poli(dl-alanina), poli(1 -tirosina), poli(d-tirosina), poli(dl-tirosina), poli(1 -treonina), poli(d-treonina), poli(d1 -treonina), poli(d-cisteina), poli(l-cisteina), y poli(dl-cisteina). En otras modalidades, los polímeros son copolímeros, tales como copolímeros de bloque, injerto o aleatorios, de los poli (amino ácidos) antes listados con polímeros sin amino ácido tales como polietilen glicol, policaprolactona, ácido poliglicólico y ácido poliláctico, así como poli(2-hidroxietil 1-glutamina), quitosán, carboximetil dextrano, ácido hialurónico, albúmina de suero humano y ácido algínico. Son particularmente preferidos el (los) ácido(s) poli-glutámico(s) y la(s) poli-lisina(s). La referencia a cualquier poli (amino ácido), por ejemplo, ácido poli(glutámico) no es limitante con respecto a isomerismo, y comprende por lo tanto todas las formas isoméricas, incluyendo formas d, 1 y d1.

En ciertas modalidades, se usan "un poliamino ácido soluble en agua", "poliamino ácidos solubles en agua" o "polímero de amino ácidos soluble en agua". A través de estos términos, se da a entender que los polímeros incluyen cadenas de amino ácido que comprenden combinaciones de ácido glutámico y/o ácido aspártico y/o lisina, de cualquier conformación isomérica d y/o 1. En ciertas modalidades, dicho "poliamino ácido soluble en agua" contiene uno o más residuos de ácido glutámico, ácido aspártico y/o lisina. En las modalidades preferidas, el polímero es un polímero de poli(amino ácido aniónico). Los ejemplos de polímeros de poli (amino ácido aniónico) incluyen ácido poli-glutámico, ácido poli-aspártico, y otros polímeros de homo- o hetero-amino ácido que tiene una carga negativa neta en pH 7.

En otras modalidades, los polímeros son copolímeros tales como copolímeros de bloque, de injerto o aleatorios, que contienen ácido glutámico. Por lo tanto, se incluyen los copolímeros de ácido glutámico con por lo menos otro monómero (de preferencia biodegradable), oligómero o polímero. Estos incluyen, por ejemplo, copolímeros que contienen por lo menos otro amino ácido, tal como ácido aspártico, serina, tirosina, glicina, etilen glicol, óxido de etileno, (o un oligómero o polímero de cualquiera de éstos) o alcohol polivinílico. Los residuos de ácido glutámico pueden transportar uno o más sustituyentes y los polímeros incluyen aquellos en los cuales una proporción o todos los monómeros de ácido glutámico son sustituidos. Los grupos sustituyentes incluyen, por ejemplo, alquilo, hidroxi alquilo, arilo y arilalquilo, comúnmente hasta con 18 átomos de carbono por grupo, o polietilen glicol unido por medio de enlaces de éster. La expresión "ácido poli(glutámico)" y expresiones de cognado en la presente serán interpretadas para cubrir cualquiera de las posibilidades antes mencionadas a menos que el contexto indique lo contrario.

Varias sustituciones de amino ácidos de existencia natural, inusuales o químicamente modificados pueden comprender la composición de amino ácido del polímero de poli(amino ácido).

Los amino ácidos de existencia natural para uso en la presente invención como amino ácidos o sustituciones de un poli (amino ácido) son alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, citrulina, cisteína, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, omitina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofan, tirosina, valina, hidroxiprolina, e-carboxiglutamato, fenilglicina, o O-fosfoserina.

Los amino ácidos de existencia natural para uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, ß-alanina, ácido a-amino butírico, ácido ?-amino butírico, ácido ?-(aminofenil) butírico, ácido a-amino isobutírico, citrulina, ácido e-amino capróico, ácido 7-amino heptanóico, ácido ß-aspártico, ácido aminobenzóico, ácido aminofenil acético, ácido aminofenil butírico, ácido ?-glutámico, e-lisina, metionin sulfona, norleucina, norvalina, ornitina, d-ornitina, p-nitro-fenilalanina, hidroxi prolina, ácido 1 ,2,3,4,-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico y tioprolina.

Las sustituciones de amino ácido se basan por lo general en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de amino ácido, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Un análisis del tamaño, forma y tipo de los sustituyentes de cadena lateral de amino ácido revela que la arginina, lisina e histidina son todos residuos con carga positiva; que la alanina, glicina y serina son todas de tamaño similar; y que la fenilalanina, triptófano y tirosina tienen una forma generalmente similar. Por lo tanto, en base a estas consideraciones, la arginina, lisina e histidina; alanina, glicina y serina; y fenilalanina, triptófano y tirosina; están definidas en la presente como equivalentes biológicamente funcionales.

Los pseudo-poli (aminoácidos) también pueden ser utilizados en la presente invención. Los pseudo-poli (amino ácidos) difieren de los poli (amino ácidos) descritos con anterioridad en que los monómeros de dipéptido son enlazados de manera covalente a través de enlaces diferentes a los péptido normal. Los pseudo-poli (amino ácidos) adecuados para uso de acuerdo con la presente invención son aquellos, por ejemplo en Kohn et al., Amer. Chem. Soc, 109:917 (1987) y Pulapura et al., J. Polímero Preprints,. 31 :23 (1990), cada una de las cuales está incorporada aquí mediante referencia. Los pseudo-poli (amino ácidos) pueden ser utilizados solos o en combinación con las mezclas de poli (amino ácidos) clásicos y pseudo-poli (amino ácidos) de acuerdo con la invención.

Un poli (amino ácido) puede, en el extremo inferior del rango de sustitución de amino ácido, tener 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25 o residuos de ácido glutámico, ácido aspártico, serina, tirosina o glicina, respectivamente, sustituidos por cualquiera de los amino ácidos de existencia natural, modificados o inusuales descritos en la presente.

En otros aspectos de la invención, un homopolímero de poli (amino ácido) tal como ácido poli-glutámico, ácido poli-aspártico, poli-serina, poli-tirosina, poli-glicina, o un copolímero de poli (amino ácido) que comprende una mezcla de algunos o de todos estos cinco amino ácidos puede, en el extremo inferior, tener aproximadamente 1 %, aproximadamente 2%, aproximadamente 3%, aproximadamente 4%, aproximadamente 5%, aproximadamente 6%, aproximadamente 7%, aproximadamente 8%, aproximadamente 9%, aproximadamente 10%, aproximadamente 11 %, aproximadamente 12%, aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%, aproximadamente 20%, aproximadamente 21 %, aproximadamente 22%, aproximadamente 23%, aproximadamente 24%, hasta aproximadamente 25% de residuos de ácido glutámico, ácido aspártico, serina, tirosina o glicina, de manera respectiva, (% en peso o por residuo) y/o sustituido por cualquiera de los amino ácidos de existencia natural, modificados, o inusuales descritos en la presente.

Un homopolímero de poli (amino ácido) tal como ácido poli-glutámico, ácido poli-aspártico, poli-serina, poli-tirosina, o poli-glicina puede, en el extremo superior del rango de sustitución de amino ácido, tener menos de 25%, menos de 26%, menos de 27%, menos de 28%, menos de 29%, menos de 30%, menos de 31 %, menos de 32%, menos de 33%, menos de 34%, menos de 35%, menos de 36%, menos de 37%, menos de 38%, menos de 39%, menos de 40%, menos de 41 %, menos de 42%, menos de 43%, menos de 44%, menos de 45%, menos de 46%, menos de 47%, menos de 48%, menos de 49%, hasta menos de 50% más o menos de los residuos de ácido glutámico, ácido aspártico, serina, tirosina, o glicina (% en peso o por residuo), respectivamente, sustituido por cualquiera de los aminoácidos de existencia natural, modificados o inusuales descritos en la presente. De manera preferible, la mayoría de los residuos comprende ácido glutámico y/o ácido aspártico y/o serina y/o tirosina y/o glicina.

Los polímeros de la presente invención tienen pesos moleculares que por lo general varían desde aproximadamente 1 ,000 daltons hasta menos de 10,000,000 daltons. Los polímeros de la presente invención, en ciertas modalidades, tienen un peso molecular de aproximadamente 10 daltons hasta aproximadamente 5,000 daltons, incluyendo todos los valores enteros dentro de este rango, que incluye, por ejemplo, 100, 200, 300, 500, 1 ,000, 1 ,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, y 4,500 daltons, y en otras ciertas modalidades tienen un peso molecular de aproximadamente 600 daltons, aproximadamente 32,000 daltons o aproximadamente 33,000 daltons.

Los polímeros de poli(amino ácido) pueden ser sintetizados de acuerdo con varios tipos de técnicas estándar, que incluyen procesos químicos y recombinantes. Por ejemplo, un homopolímero de ácido glutámico puede ser preparado en un proceso de dos etapas, en el cual (i) el ácido glutámico es tratado con fosgeno o un reactivo equivalente, por ejemplo, difosgeno, a una temperatura desde 15°C hasta 70°C para formar un N-carboxianhídrido (NCA), y (ii) se efectúa la polimerización de anillo abierto del N-carboxianhídrido con una base para producir ácido poli-(glutámico). Las bases adecuadas incluyen alcóxidos, por ejemplo, alcóxidos de metal alcalino tales como metóxido de sodio, compuestos organometálicos y aminas primarias, secundarias o terciarias, por ejemplo butilamina o trietilamina. Véase la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,470,510. Existen muchos otros métodos para sintetizar químicamente poli (aminoácidos).

Los polímeros de amino ácido de la presente invención pueden ser producidos de manera recombinante por ejemplo, a través de la utilización de E. coli transformado. La producción bacteriana limitada de ácido poli(glutámico) se describe, por ejemplo en EP-A-410, 638. Los procesos recombinantes conducidos usando bacteria producirán comúnmente ácido poli(1 -glutámico), aunque se sabe que la bacteria proporcionará la forma d.

En ciertas modalidades, el fármaco anti-cancerígeno conjugado para el polímero es un taxano. Los taxanos incluyen paclitaxel, docetaxel y otros productos químicos que tienen la estructura del taxano. Véase Cortes et al., J. Clin. Oncol. 13:2643-2655 (1995).

Los ejemplos de compuestos de taxano y los métodos para su preparación se establecen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,942,184.

En las modalidades preferidas, el paclitaxel es conjugado para ácido polifiglutámico). Los fármacos conjugados de la invención son múltiples moléculas de estructura de taxano en tanto que el fármaco no conjugado (por ejemplo, paclitaxel tradicional) es una molécula de estructura de taxano individual. A fin de proporcionar por lo menos una comparación significativa entre los fármacos conjugado y no conjugado, cada molécula de estructura de taxano en el fármaco conjugada es calculada como un equivalente de paclitaxel (es decir, paclitaxel no conjugado). En una modalidad, el conjugado de fármaco, es decir, un conjugado de poliglutamato paclitaxel, es una molécula de estructura de taxano múltiple con el nombre químico 5-beta, 20-epoxi-1 ,2-alfa, 4,7-beta, 10-beta, 13-alfa-hexahidroxi-tax-ll-en-9-ona 4, 10-diacetato 2-benzoato 13-éster con (2R, 3S)-N-benzoil-3-fenil-isoserina) 2', gama carboxilato éster de un ácido a-poli-1 -glutámico.

Un ejemplo de un conjugado de poliglutamato paclitaxel útil incluye paclitaxel poliglumex (PPX; el nombre no propietario adoptado por el United States Approved Ñame (USAN) Council (nombre comercial Xyotax™)). PPX tiene un MW promedio en el rango de aproximadamente 35,000 hasta aproximadamente 40,000 Da, aunque no excede de 75,000 Da, con aproximadamente 35% hasta aproximadamente 37% peso/peso (p/p) de carga de paclitaxel.

En otras modalidades, el fármaco o agente anti-cancerígeno es camptotecina, o un análogo, derivado, o profármaco de la misma. Los compuestos de camptotecina (CPT) incluyen varios 20(S)-camptotecinas, análogos de 20(S)-camptotecina, y derivados de 20(S)-camptotecina. Camptotecina, cuando se utiliza en el contexto de esta invención, incluye el alcaloide vegetal 20(S)-camptotecina, tanto camptotecinas substituidas como no substituidas, y análogos de las mismas. Los ejemplos de derivados de camptotecina incluyen, aunque no se limitan a, 9-nitro-20(S)-camptotecina, 9-amino-20(S)-camptotecina, 9-metil-camptotecina, 9-clorocamptotecina, 9-fluoro-camptotecina, 7-etil camptotecina, 10-metilcamptotecina, 10-cloro-camptotecina, 10-bromo-camptotecina, 10-fluoro-camptotecina, 9-metoxi-camptotecina, 11-fluoro-camptotecina, 7-etil-10-hidroxi camptotecina, 10,11-metilendioxi camptotecina, y 10,1 1 -etilendioxi camptotecina, y 7-(4-metilpiperazinometilen)-10,11 -metilenedioxí camptotecina. Los profármacos de camptotecina incluyen, aunque no se limitan a, derivados de camptotecina esterificados como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,731 ,316, tal como camptotecina 20-O-propionato, camptotecina 20-O-butirato, camptotecina 20-O-valerato, camptotecina 20-O-heptanoato, camptotecina 20-O-nonanoato, camptotecina 20-0-crotonato, camptotecina 20-O-2',3'-epoxi-butirato, nitrocamptotecina 20-O-acetato, nitrocamptotecina 20-O-propionato, y nitrocamptotecina 20-O-butirato. Ejemplos particulares de 20(S)-camptotecinas incluyen 9-nitrocamptotecina, 9-aminocamptotecina, 10,11-metilendioxi-20(S)-camptotecina, topotecan, irinotecan, 7-etil-10-hidrox¡ camptotecina, u otra camptotecina sustituida que es sustituida por lo menos en una de las posiciones 7, 9, 10, 11 , o 12. Estas camptotecinas pueden estar opcionalmente sustituidas.

Las sustituciones se pueden hacer un andamio de camptotecina en tanto que retenga su actividad. En ciertas modalidades, el andamio de camptotecina es substituido en las posiciones 7, 9, 10, 11 , y/o 12 positions. Dichas sustituciones pueden server para proporcionar actividades diferenciales sobre el compuesto de camptotecina no sustituido. Los ejemplos de camptotecinas sustituidas incluyen 9-nitrocamptothecin, 9-aminocamptotecina, 10,11-metilendioxi-20(S)-camptotecina, topotecan, irinotecan, 7-etil-10-hidroxi camptotecina, u otra camptotecina sustituida que es sustituida por lo menos en una de las posiciones 7, 9, 10, 11 , o 12.

La camptotecina nativa, no substituida, se puede obtener por medio de purificación del extracto natural, o se puede obtener a partir de Stehlin Foundation for Cáncer Research (Houston, Tx).

Las camptotecinas sustituidas se pueden obtener utilizando métodos conocidos en la literatura, o se pueden obtener a partir de distribuidores comerciales. Por ejemplo, 9-nitrocamptotecina se puede obtener con SuperGen, Inc. (San Ramón, CA), y 9-aminocamptotecina se puede conseguir con Idee Pharmaceuticals (San Diego, CA). La camptotecina y varios análogos se pueden obtener también a través de establecimientos de suministro de productos químcos finos estándar, tal como Sigma Chemicals (St. Louis, MO).

Aparte de los taxanos y las camptotecinas, otros fármacos anti-cancerígenos que pueden ser útiles en las composiciones y métodos de la presente invención incluyen etopsida, teniposida, fludarabina, doxorubicina, daunomicina, emodin, 5-fluorouracil, FUDR, estradiol, camptotecina, ácidos retinóicos, verapamil, epotilonas y ciclosporina. De modo más general, es posible emplear los fármacos anti-cancerígenos con un grupo hidroxilo libre que pueden proporcionar un sitio se conjugación.

La invención contempla el uso de un solo polímero así como dos o más polímeros diferentes. Los diversos polímeros incluyen, por ejemplo, polímeros similares de diferentes longitudes, así como polímeros sustancialmente diferentes. La invención incluye el uso de un fármaco conjugado para un polímero individual y un fármaco conjugado para múltiples polímeros diferentes. De manera similar, la invención incluye el uso de dos o más fármacos, cada uno conjugado para el mismo tipo de polímero, así como mezclas de dos o más fármacos, cada uno conjugado para un polímero diferente. En ciertas modalidades, dos o más porciones de fármaco diferentes pueden ser conjugadas para un solo polímero. La invención contempla también la administración de otros fármacos contra el cáncer (por ejemplo, carboplatina) además del conjugado de fármaco y/o terapia con estrógeno.

La naturaleza del enlace o asociación entre el fármaco y el polímero no es crítica.

Por ejemplo, una interacción de fármaco conjugado-polímero es a través de un enlace covalente, en tanto que una asociación puede ser a través de interacciones carga-carga, fuerzas de Van der Waal, y similares. Los enlaces covalentes pueden ser generados de manera sintética o a través de fusión genética para producir una proteína de fusión polímero-fármaco recombinante. Los métodos ilustrativos de conjugación de un polímero para fármaco se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica 5,977,163, 6,262,107 y 6,441 ,025, y en las Publicaciones de Patente Internacional WO 99/49901 , WO 97/33552, WO 01/26693, y WO 01/70275. El polímero y el fármaco pueden ser conjugados o asociados directamente o a través de una molécula secundaria tal como un enlazador o un separador (véase, por ejemplo, WO 01/70275, la tecnología descrita en la cual puede ser aplicada a cualquier conjugado de fármaco, de manera particular conjugados de poliamino ácido). Los enlazadores preferidos incluyen a aquellos que son relativamente estables a la hidrólisis en la circulación. Los enlazadores ilustrativos incluyen amino ácidos, hidroxiácidos, dioles, aminotioles, hidroxitioles, aminoalcoholes, beta alaninas, glicol y combinaciones de los mismos. Además, el fármaco puede requerir de modificación antes de la conjugación, tal como la introducción de un nuevo grupo funcional, la modificación de un grupo funcional pre-existente o la unión de una molécula separadora.

El acoplamiento químico se puede lograr utilizando compuestos de entrelazamiento homo- o hetero-bifuncionales comercialmente disponibles, de acuerdo con métodos conocidos y disponibles en la técnica, como aquellos descritos, por ejemplo, en Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, Inc., 1995, y Wong, Chemistry de Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, 1991.

Ejemplos adicionales de métodos para enlazar polímeros a fármacos u otras moléculas se describen en Hoffman et al., Biol. Chem. 370:575-582 (1989); Wiesmuller et al., Vaccine 7:29-33 (1989); Wiesmuller et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40:255-260 (1992); Defourt et al., Proc Nati. Acad. Sci. 83:3879-3883 (1992); Tohokuni et al., J. Am. Chem. Soc. 116:395-396 (1994); Rachel, Chem. Common. 2087-2088 (1997); Kamitakahara, Angew. Chem. Int. Ed. 37:1524-1528 (1998); y Dullenkopf et al., Chem. Etc. J. 5:2432-2438 (1999).

En ciertas modalidades, un polímero es conjugado para un fármaco por medio de conjugación química, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,977,163. En este método, se preparan conjugados de ácido poliglutámico como una sal de sodio, dializada para remover los contaminantes de bajo peso molecular y las sales en exceso, y después liofilizada. Otros métodos de conjugación química se describen en WO 01/26693 A2. De acuerdo con este método, un polímero de ácido poliglutámico es enlazado de manera covalente a un fármaco a través de un enlace directo entre un residuo de ácido carboxílico del ácido poliglutámico y un grupo funcional del fármaco, o por medio de un enlace indirecto a través de uno o más grupos bifuncionales. Otros métodos se describen en March, Advanced Organic Chemistry, Wiley Interscience, 4th ed., 1992.

En una modalidad, un vehículo de poliglutamato es acoplado a un fármaco de acuerdo con un método como sigue: (a) proporcionar una forma protonada de un polímero de ácido poliglutámico y un fármaco para conjugación del mismo; (b) enlazar de manera covalente dicho fármaco al polímero de ácido poliglutámico en un solvente orgánico inerte para formar un conjugado de ácido poliglutámico-fármaco; (c) precipitar el conjugado de ácido poliglutámico-fármaco desde la solución por medio de la adición de un volumen en exceso de solución salina acuosa; y (d) recolectar dicho conjugado como un sólido protonado.

La forma protonada del polímero de ácido poliglutámico en la etapa (a) se obtiene por medio de la acidificación de una solución que contiene la sal del ácido poliglutámico que se va a utilizar como un material de partida y convertir la sal a su forma acida. Después de separar el sólido por medio de centrifugado, el sólido es lavado con agua, el ácido poliglutámico es secado posteriormente, de preferencia mediante liofilización y de preferencia hasta un peso constante que comprende entre aproximadamente 2% hasta aproximadamente 21 % de agua, entre aproximadamente 7% hasta aproximadamente 21 % de agua, o entre 7% y 21 % de agua, antes de la conjugación para un fármaco deseado (b).

Los conjugados pueden ser producidos en su totalidad, o en parte, utilizando tecnología de ADN recombinante. Por ejemplo, un polímero o fármaco, o ambos, pueden ser producidos a través de medios recombinantes y posteriormente asociados o conjugados. De manera alternativa, un polipéptido individual, por ejemplo, que comprende tanto el polímero como el fármaco puede ser producido como una proteína de fusión. Los métodos de construcción de vectores de expresión recombinantes son conocidos en la técnica, como lo son los métodos de expresión de polipéptidos recombinantes en una variedad de organismos, tales como bacterias y levadura.

La cantidad de fármaco conjugado en comparación con el polímero es variable. En el extremo inferior, el conjugado fármaco polímero puede comprender desde aproximadamente 1 %, aproximadamente 2%, aproximadamente 3%, aproximadamente 4%, aproximadamente 5%, aproximadamente 6%, aproximadamente 7%, aproximadamente 8%, aproximadamente 9%, aproximadamente 10%, aproximadamente 11 %, aproximadamente 12%, aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%, aproximadamente 20%, aproximadamente 21 %, aproximadamente 22%, aproximadamente 23%, aproximadamente 24%, hasta aproximadamente 25% (p/p) de fármaco con relación a la masa del conjugado. En el extremo superior, el conjugado fármaco-polímero puede comprender desde aproximadamente 26%, aproximadamente 27%, aproximadamente 28%, aproximadamente 29%, aproximadamente 30%, aproximadamente 31 % aproximadamente 32%, aproximadamente 33%, aproximadamente 34%, aproximadamente 35%, aproximadamente 36%, aproximadamente 37%, aproximadamente 38%, aproximadamente 39%, aproximadamente 40%, hasta aproximadamente 50% o más (p/p) de fármaco con relación a la masa del conjugado.

De manera similar, puede variar el número de moléculas de fármaco conjugado por molécula de polímero. En el extremo inferior, el conjugado fármaco-polímero puede comprender desde aproximadamente 1 , aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 1 1 , aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, hasta aproximadamente 20 o más moléculas de el fármaco por molécula de polímero. En el extremo superior, el conjugado fármaco-polímero puede comprender desde aproximadamente 21 , aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31 , aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 41 , aproximadamente 42, aproximadamente 43, aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47, aproximadamente 48, aproximadamente 49, aproximadamente 50, aproximadamente 51 , aproximadamente 52, aproximadamente 53, aproximadamente 54, aproximadamente 55, aproximadamente 56, aproximadamente 57, aproximadamente 58,- aproximadamente 59, aproximadamente 60 aproximadamente 61 , aproximadamente 62, aproximadamente 63, aproximadamente 64, aproximadamente 65, aproximadamente 66, aproximadamente 67, aproximadamente 68, aproximadamente 69, aproximadamente 70, aproximadamente 71 , aproximadamente 72, aproximadamente 73, aproximadamente 74, hasta aproximadamente 75 o más moléculas o más de fármaco por molécula de polímero.

Un polímero puede estar asociado con uno o más sitios discretos o traslapantes en una molécula de fármaco. De manera inversa, en ciertas modalidades, una molécula de fármaco puede estar asociada con uno o más sitios discretos en un polímero. En consecuencia, en ciertas modalidades, las composiciones de la invención incluyen polímeros asociados con fármacos a través de diferentes sitios en el fármaco, así como fármacos asociados con un polímero a través de diferentes sitios en el polímero. Se pueden usar diferentes enlazadores para asociación directa a través de diferentes sitios, o se puede emplear un enlazador individual, dependiendo de los grupos funcionales particulares presentes en cada sitio. En ciertas modalidades, la invención incluye una composición que comprende una composición que comprende una mezcla de uno o más polímeros asociados con uno o más fármacos a través de uno o más sitios traslapantes o diferentes en cada fármaco o polímero.

Los conjugados de fármaco de la presente invención pueden ser suministrados o administrados por medio de cualesquiera medios terapéuticamente adecuados. Por ejemplo, la administración puede ser parenteral u oral. En modalidades preferidas la administración es intravenosa (i.v.).

Las composiciones incluyen el conjugado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente, vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen solventes (por ejemplo, medio acuoso regulado en su pH), medio de dispersión, recubrimientos, agentes antibacteriales y antifungales, agentes de isotonicidad (por ejemplo, glucosa) y similares. Las composiciones farmacéuticas que contienen los conjugados adecuados para uso intravenoso incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles, así como polvos estériles que pueden ser reconstituidos después en una solución acuosa. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, un poliol, mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. Las soluciones inyectables adecuadas pueden ser preparadas mediante la incorporación de una cantidad adecuada del conjugado en un solvente apropiado, de manera opcional con muchos otros ingredientes como se listaron antes. Las soluciones pueden ser esterilizadas mediante filtración. Las dispersiones pueden ser preparadas mediante la incorporación del conjugado en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión y cualesquiera otros ingredientes a partir de aquellos listados con anterioridad. Los polvos estériles pueden ser preparados mediante técnicas de secado al vacío y secado por congelación, produciendo un polvo del conjugado y cualesquiera ingredientes adicionales a partir de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser suministradas o administradas en una dosis apropiada y para una duración y frecuencia adecuadas. La dosis y duración de la administración son determinadas típicamente por factores tales como la condición del paciente, el tipo y severidad de la enfermedad de la enfermedad del paciente, la forma particular del ingrediente activo y el método de administración. La dosis y regímenes de tratamiento adecuados están designados para lograr un beneficio terapéutico (por ejemplo, un resultado clínico mejorado, tal como las remisiones completas o parciales más frecuentes, o mayor período sin enfermedad y/u OS). Los ejemplos de diferentes rangos de dosis y programas de administración se proporcionan en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,670,537 (que describe dosis y programas de administración para taxol).

En ciertas modalidades de la invención, los pacientes que necesitan dicho tratamiento reciben un conjugado de fármaco tal como PPX, en un horario dos veces por semana u otros clínicamente útil, en los niveles de dosis utilizados comúnmente para el conjugado particular involucrado. A fin de proporcionar una comparación significativa entre terapias de estructura múltiple de taxano y otras terapias de molécula de estructura individual de taxano, la dosificación de los conjugados de taxano puede, ser expresada como "equivalentes de paclitaxel". Por ejemplo, para fines de dosificación, cada estructura de taxano en una molécula de conjugado de taxano es calculada como un equivalente de paclitaxel. Por lo general el nivel de dosis varía desde aproximadamente 175 hasta aproximadamente 250 miligramos/metro cuadrado (mg/m2) de equivalentes de paclitaxel. En modalidades preferidas, los pacientes son tratados con PPX en una cantidad de aproximadamente 200 hasta aproximadamente 250 mg/m2 equivalentes de paclitaxel cada 21 días o aproximadamente una vez cada 3 semanas. En la modalidad más preferida los pacientes son tratados con PPX en una cantidad de aproximadamente 175 mg/m2 equivalente de paclitaxel cada 21 días o aproximadamente una vez cada 3 semanas. En otras modalidades, los pacientes son tratados con un conjugado de taxano, tal como PPX, en una cantidad que excede de aproximadamente 250 mg/m2 equivalentes de paclitaxel cada 21 días o incluso en exceso de aproximadamente 275 mg/m2 equivalentes de paclitaxel cada 21 días.

La infusión intravenosa puede ser para cualquier período adecuado, el cual es fácilmente determinable por alguien con experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, las infusiones pueden durar aproximadamente una hasta aproximadamente 24 horas, aunque tiempos de infusión más breves o más prolongados también quedan dentro del alcance de la invención.

Algunas modalidades de la invención contemplan el uso de terapia con estrógeno en combinación con el conjugado de fármaco. La terapia con estrógeno, como se usa en la presente, se refiere a la administración de una sustancia estrogénica que incrementará los niveles de estrógeno en el paciente o resulta en una mayor acumulación del fármaco anti-cancerígeno en los tejidos cancerosos, por ejemplo, pulmonar, en comparación con tejido non-canceroso (el cual en el caso del cáncer pulmonar, incluye hueso e hígado). Por lo tanto, como se usa en la presente, "estrógeno" incluye, aunque no se limita a, cualquiera de los estrógenos de mamífero de existencia natural y congéneres de los mismos, por ejemplo, estradiol y sus esteres orgánicos (por ejemplo, benzoato de estradiol, cipionato de estradiol y valerato de estradiol), estrona, dietilestilbestrol, estrona sulfato de piperazina, etinil estradiol, mestranol, fosfato de poliestradiol, estriol, hemisuccinato de estriol, quinestrol, estropipato, pinestrol, estrona potasio sulfato, y tibolona, metabolitos de estrógeno, por ejemplo, 17-ß-estradiol, análogos de estrógeno, compuestos naturales con actividad estrogénica, por ejemplo, fitoestrógenos, tales como genesteina o isoflavona, agonistas de estrógeno, por ejemplo, moduladores selectivos de receptor de estrógeno con alguna actividad agonística (por ejemplo, tamoxifen), y otras sustancias susceptibles a interacción con receptores de estrógeno de superficie de célula. Estos estrógenos y sustancias estrogénicas pueden ser naturales o sintéticas.

El estrógeno o las sustancias estrogénicas pueden ser formulados a través de cualesquiera medios compatibles con la fisiología de los mamíferos y la ruta de suministro seleccionada. Estos métodos son bien conocidos en la técnica. Véase U.S. Pharmacopeia National Formulary, United States Pharmacopeal Convention, Inc., pp. 530-541 (1990).

La terapia con estrógeno puede ser administrada a través de cualquier ruta adecuada tal como local, oral, sistémica, intravenosa, intramuscular, mucosa, o transdérmica (por ejemplo, un parche). La terapia con estrógeno puede ser administrada en una base regular (por ejemplo, diaria/semanal), y puede ser intermitente o sustancialmente continua con respecto a la terapia fármaco-conjugado. Los rangos de dosis típicos dependen del compuesto y las características del paciente. La dosis diaria del estrógeno se basa comúnmente en la cantidad de una preparación determinada necesaria para mantener los niveles de estrógeno en suero o plasma iguales o mayores a 30 pg/ml cuando se utilizan el estrógeno o sus metabolitos.

Los regímenes de tratamiento incluyen, aunque no se limitan a, terapia de reemplazo hormonal, tales como terapia de estrógeno/progesterona a 0.3 mg/l-5mg, 0.45 mg/1.5mg, 0.625 mg/2.5 mg, o 0.625 mg/5.0 mg diariamente. En otra modalidad, la terapia puede comprender terapia con estrógeno a 0.15 mg, 0.3 mg, 0.625 mg o 1.25 mg una o dos veces al día. En una modalidad preferida, la terapia comprende 10 mg de estrógeno tres veces al día. Un ejemplo de estrógeno es Premarin® (Wyeth Pharmaceuticals, Inc., PA). En ciertas modalidades, la combinación estrógeno/progesterona se logra a través de la administración de Prempro® (Wyeth Pharmaceuticals, Inc., PA). Las terapias alternas incluyen tamoxifen administrado a 20 hasta 40 mg por día en dosis de 10 mg varias veces al día o 20 mg diariamente en una sola dosis.

Los métodos de la invención no requieren que cada componente de la terapia de combinación sea suministrado por la misma ruta o incluso al mismo tiempo. Sin embargo, en ciertas modalidades de la invención, el conjugado de fármaco y la terapia con estrógeno son suministrados al mismo tiempo por la misma ruta de administración. En una modalidad más preferida, la terapia con estrógeno es administrada transdérmicamente (por ejemplo, mediante un parche) o vía oral (por ejemplo, tableta, cápsula o pildora diariamente) para que sea sustancialmente continua a través de la duración del curso de tratamiento del conjugado de fármaco.

La presente invención también está dirigida a un método para seleccionar o escoger un tratamiento contra el cáncer en base a los niveles de estrógeno en suero sanguíneo o plasma. Es más probable que las pacientes con niveles de estrógeno premenopáusicos respondan de manera favorable al tratamiento con una forma conjugada del fármaco anti-cancerígeno, por ejemplo, PPX, en tanto que aquellas pacientes con bajos niveles de estrógeno (por ejemplo, postmenopáusicos), pueden ser tratadas con PPX u otra terapia contra el cáncer tal como paclitaxel no conjugado (véanse los ejemplos 1 y 2, especialmente las Figuras 3 y 4).

El método para escoger o seleccionar un tratamiento contra el cáncer lleva consigo la medición del nivel de estrógeno en el suero o plasma de una muestra sanguínea obtenida a partir de una paciente con cáncer, y la correlación del nivel de estrógeno con una opción de tratamiento. Los niveles de estrógeno premenopáusicos están correlacionados con un tratamiento contra cáncer que comprende la administración de PPX. Los niveles de estrógeno postmenopáusicos están correlacionados con un tratamiento contra cáncer que puede incluir ya sea PPX o paclitaxel. El método es particularmente útil en relación con cánceres que llevan receptor de estrógeno los cuales como se describió con anterioridad, incluyen cualquier cáncer caracterizado por la presencia de células cancerígenas que llevan receptores de estrógeno, o un cáncer que se origina en un órgano o tejido que contiene células normales (no enfermas) que llevan receptores de estrógeno, en donde el receptor de estrógeno puede ser expresado de manera transitoria y/o las células que llevan receptor de estrógeno representan una fracción de la población total de las células.

A fin de ilustrar de manera completa la presente invención y las ventajas de la misma, se proporcionan los siguientes ejemplos específicos, comprendiéndose que los mismos están destinados a ser únicamente ilustrativos y no limitantes.

Ejemplo 1 Los experimentos y resultados presentados en el ejemplo 1 describen la correlación entre los niveles de estrógeno y el tratamiento con CT-2103 contra paclitaxel, como se midió a través de la supervivencia general (OS). Los datos mostrados en las Figuras 1 y 2 se derivaron a partir de un estudio de etiqueta abierto, multinacional, de fase III. Inicialmente, 400 pacientes con NSCLC fueron aleatorizados igualmente a 1 de 2 equipos de tratamiento: 199 pacientes en Equipo 1 (CT-2103, es decir, PPX) en una dosis de 210 mg/m2 en combinación con carboplatina (AUC 6); 201 pacientes en Equipo 2 (Paclitaxel no conjugado) en una dosis 225 mg/m2 en combinación con carboplatina (AUC 6). La aleatorización fue estratificada para reducir al mínimo los desequilibrios potenciales entre los 2 tratamientos. Después de que fueron seleccionados para el estudio, los pacientes fueron estratificados por etapa de la enfermedad (IV vs otra), género, ubicación geográfica (EUA vs. Europa Occidental y Canadá vs. resto del mundo), e historial de metástasis cerebrales (si vs. no).

A partir del conjunto muestra inicial, se analizó a un subconjunto que consta de mujeres con alto o bajo estrógeno. A partir del Equipo 1 , se estudió a 29 mujeres con estrógeno elevado y 15 mujeres con estrógeno reducido y para el Equipo 2, se estudió a 25 mujeres con estrógeno elevado y a 17 mujeres con estrógeno reducido. Los niveles de estrógeno en las mujeres fueron determinados por medio de un inmunoensayo competitivo (por ejemplo, Analizador DPC IMMULITE 2000, NY; Analizador DPC IMMULITE, Irlanda). Se efectuaron comparaciones entre los Equipos 1 y 2 para el grupo bajo en estrógeno (Figura 1) y entre los Equipos 1 y 2 para el grupo con estrógeno elevado (Figura 2).

Los criterios de inclusión constaron de: 1. un diagnóstico de NSCLC histológicamente o citológicamente confirmado; 2. cumplir con por lo menos uno de los siguientes criterios de estatus de desuso a. enfermedad localmente avanzada o recurrente previamente tratada con radiación y/o cirugía, b. pacientes de etapa IIIB que no fueron candidatos para la terapia de modalidad combinada, o c. pacientes con enfermedad en etapa IV; 3. un registro de desempeño ECOG de 2; y 4. adecuada función de medula ósea, renal, y hepática. Además, los pacientes con metástasis cerebrales conocidos deben haber recibido tratamiento antitumoral estándar (ninguna quimioterapia sistémica combinada con radiación); pacientes deben haberse recuperado adecuadamente de la terapia y exhibieron función neurológica estable durante 2 semanas antes de la aleatorización.

Los pacientes recibieron CT-2103/carboplatina o paclitaxel/carboplatina, mediante infusión intravenosa, en el día 1 de cada ciclo 21 días para un total de 6 ciclos. Se evaluaron las toxicidades en cada visita del paciente. Se evaluaron los parámetros de hematología, química clínica y de coagulación antes y durante el período de estudio. Un tumor agudo fue evaluado de acuerdo con los Criterios de Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST); los síntomas relacionados con la enfermedad fueron medidos por medio de la terapia de cáncer de determinación funcional-clasificación de cáncer de pulmón (FACT-LCS), y las exploraciones de tomografía computarizada (CT) fueron evaluadas en intervalos regulares. Los pacientes fueron retirados por progresión de la enfermedad, toxicidad intolerable, retiro con consentimiento del paciente, o decisión del investigador para retirar al paciente. Se tomó una determinación de terminación de tratamiento a los 22-26 días después del tratamiento de estudio final; también se contactó a los pacientes en intervalos de 8 semanas después de la visita de terminación del tratamiento para obtener información adicional de sobrevivencia y estatus de la enfermedad. Los resultados de eficacia y seguridad este estudio fueron monitoreados por un Comité de Monitoreo de Datos independiente (DMC).

La eficacia de los tratamientos fue determinada mediante la evaluación de carga tumoral de acuerdo con RECIST. Además, se realizaron exploraciones CT en la línea de base y en 3ra semana de cada ciclo con numeración impar. Los síntomas relacionados con la enfermedad fueron medidos por medio de la terapia de cáncer de determinación funcional-clasificación de cáncer de pulmón (FACT-LCS) 3 días antes de cada tratamiento de estudio.

Se llevo a cabo un análisis estadístico de rango de registro para comparar Grupo 1 y Grupo 2 en las mujeres con estrógeno elevado y el Grupo 1 y Grupo 2 en las mujeres con estrógeno reducido.

Los resultados del estudio anterior indicaron que no hay diferencia estadística significativa en el OS de mujeres postmenopáusicas (es decir, estrógeno reducido) diagnosticadas con NSCLC y tratadas con CT-2103 + carboplatina o paclitaxel + carboplatina (Figura 1). En estricto contraste, hubo un incremento estadísticamente significativo en la sobrevivencia cuando CT- 2103 + carboplatina fue administrado a mujeres pos-pubescentes, pre-menopáusicas con NSCLC (es decir, estrógeno elevado) contra, paclitaxel + carboplatina (Figura 2). La diferencia estadísticamente significativa para los resultados ¡lustrados en la Figura 2 fue incluso más sorprendente dado el pequeño tamaño de la muestra.

Estos resultados sugieren que las mujeres diagnosticadas con NSCLC, y que poseen niveles de estrógeno premenopáusicos, se beneficiarían a partir del tratamiento contra el cáncer que incluyó CT-2103 (es decir, PPX), en tanto que las mujeres con niveles de estrógeno postmenopáusicos pueden ser tratadas ya sea con CT-2103 o con paclitaxel.

Ejemplo 2 Los experimentos y resultados presentados en el ejemplo 2 describen la correlación entre niveles de estrógeno, género (es decir, sexo), y tratamiento con PPX contra paclitaxel, como se midió a través de la sobrevivencia general (OS). Se condujeron dos estudios de fase III, que comprenden a un total de 781 pacientes con NSCLC y un estatus de desempeño escaso (PS2). En un estudio (STELLAR 3), pacientes fueron divididos en dos grupos de tratamiento, el grupo experimental recibió PPX (210 mg/m2 más carboplatina AUC 6, cada 3 semanas) y el grupo de control recibió paclitaxel (225 mg/m2 más carboplatina AUC 6, cada 3 semanas). En el otro estudio (STELLAR 4), el grupo experimental recibió PPX (175 mg/m2, cada 3 semanas) y el grupo de control recibió gemcitabina (1000 mg/m2 en días 1 , 8, y 15, cada 4 semanas) o vinorelbina (30 mg/m2 en los días 1 , 8, y 15, cada 3 semanas). Para estudiar el efecto del sexo y el estrógeno en la sobrevivencia entre los diferentes grupos de tratamiento, los resultados a partir de las pruebas clínicas de fase III fueron combinados y se ejecutó un análisis compuesto.

Los resultados del efecto del sexo en la sobrevivencia se presentan en el Cuadro 1 a continuación. Estos resultados indicaron que un número estadísticamente mayor de mujeres tratadas con PPX alcanzó el punto de sobrevivencia en comparación las mujeres en el grupo de control. Por otra parte, no hay tal diferencia en la sobrevivencia a un año para los hombres en el grupo PPX vs. los hombres en el grupo de control.

Cuadro 1 aN el número de pacientes en un grupo determinado Para evaluar el efecto del estrógeno sobre la sobrevivencia en mujeres tratadas con PPX, los datos fueron analizados de manera retrospectiva a través de estatus menopáusico. El estatus menopáusico funcional se asignó en base a edad y niveles de estradiol previos al tratamiento, cuando estuvieron disponibles. El estudio fue un compuesto de resultados a partir de ambos estudios clínicos. En mujeres menores de 55 años de edad, la OS fue prolongada para pacientes que reciben PPX en comparación con aquellas del grupo de control (Figura 3). En las mujeres de más de 55 años de edad, la OS fue similar entre los grupos de tratamiento (Figura 4).

En STELLAR 3, los niveles de estrógeno estuvieron disponibles para algunas mujeres. Las mujeres con niveles de estrógeno premenopáusicos tuvieron un resultado mejorado cuando fueron tratadas con PPX en comparación con el control (Figura 5). En contraste, el grupo de tratamiento no tuvo efecto evidente en la sobrevivencia en las pacientes con niveles de estrógeno postmenopáusicos (datos no mostrados).

Ejemplo 3 Los experimentos y resultados presentados en el ejemplo 3 describen los mecanismos mediante los cuales PPX es llevado dentro de las células. Se estudió el consumo celular (admisión, ingesta, entrada celular ¿?) de PPX, in vitro, en dos líneas celulares obtenidas a partir de la American Type Culture Collection (ATCC), NCI-H460 carcinoma de pulmón humano (H460; ATCC HTB-177) y EIAW 264.7 monocito/macrófago de ratón (RAW; ATCC TIB-71), las cuales fueron cultivadas y tratadas de manera independiente, con PPX.

En un conjunto de experimentos, se midió el consumo de PPX utilizando PPX radioetiquetado, el cual se elaboró como sigue: se elaboró PPX Radioetiquetado mediante la conjugación de una preparación estándar de ácido poli-L glutámico con paclitaxel que fue uniformemente etiquetada con 14C en el anillo 2-benzoilo (14C-PPX; Sigma-Aldrich, 1.762 microcuries (µCi)/mg actividad específica). Las células fueron tratadas con 0.01 -10 µM 4C-PPX durante 2 minutos o 3-4 horas. La radioactividad fue cuantificada después en el medio mediante conteo de cintilación. Las células cultivadas fueron extraídas en acetato de etilo y se contaron la fase orgánica superior (que contiene paclitaxel no conjugado y metabolitos de bajo peso molecular [es decir, mono & diglutamil paclitaxel]) y la fase acuosa inferior (que contiene metabolitos de glutamil-paclitaxel y PPX intacto).

Para estudiar la distribución de PPX, se trataron células RAW con 1 µM o 10 µM de PPX radioetiquetado (14C-PPX). Se tomaron muestras a los 2 minutos, y a las 3 o 4 horas. Se cuantificó la radioactividad como se describió de manera previa. Los resultados, a partir de las 3 muestras, se expresaron como desintegraciones por minuto (DPM) ± la desviación estándar.

Los resultados presentados en el Cuadro 2 (a continuación) indican un incremento estadísticamente significativo (p < 0.001) de PPX intacto en células tratadas durante 3 horas con 10 µM de 4C-PPX.

CUADRO 2 [1 C-PPX] TµM 10 µM Tiempo de 2 minutos 4 horas 2 minutos 3 horas Incubación Muestras DPMs +/- Des viación Estándar, 1* <J=3 (% control) Medio de 252989 ± 4366 252989 ± 4366 2490999 ± 2490999 Partida 16716 ±16716 Extracto de 196 ± 11 1980 ± 197 454 ± 66 2554 ± 90 capa (0.077%) (0.783%) (0.018%) (0.103) celular acuosa Extracto de 323 ± 360 693 ± 410 207 ± 29 275 ± 50 capa (0.128%) (0.273) (0.008%) (0.011 %) celular orgánica En otro experimento, dos cohortes o grupos, de células RAW o H460, fueron tratados con 14C-PPX durante 2 minutos, o 3 horas. Uno de los dos cohortes fue tratado de manera adicional con un inhibidor de endocitosis dependiente de energía (20 µM de citocalasina D (Cyto D, EMD Biosciences) o 1 µM Óxido de Fenil Arsina {POA, Sigma}). La radioactividad fue cuantificada como se describió con anterioridad. Se calcularon DPMs mediante sustracción de los DPMs en la incubación de 2 minutos desde DPMs en la incubación de 3 horas en la fase acuosa del compartimiento de capa celular extraída con acetato de etilo.

Los resultados, presentados en el Cuadro 3 (a continuación), indican que el pre-tratamiento de las células con un inhibidor de endocitosis resulta en una disminución estadísticamente importante en 4C-PPX como se midió en la fase acuosa (PPX intacto).

CUADRO 3 [14C-PPX] 1 µM 10 µM +/-lnhibidor - + - + Tipo de DPMs +/- Desviación Estándar, N=3 Inhibidor/ Célula Células Cyto 1784 ± 197 808 ± 106 2100 ± 1 12 1318 ± 57 D/RAW Células 73 ± 15 54 ± 6 217 ± 6 128 ± 11 PAO/H460 a DPMs se calcularon mediante la sustracción de DPMs en la incubación de 2 minutos a partir de DPMs en la incubación de 3 horas en la fase acuosa del compartimiento de capa celular extraída con acetato de etilo.

Los resultados a partir de los estudios del consumo de 14C-PPX indicaron que el PPX intacto fue incluido dentro del compartimiento celular de los macrófagos RAW cultivados y las células de tumor H460 por medio de endocitosis dependiente de energía, en una forma dependiente de dosis- y tiempo.

En otro conjunto de experimentos, se estudió el consumo de PPX mediante inmunfluorescencia indirecta. Se prepare un anticuerpo monoclonal anti-PPX (MAb) como sigue: El Plasmodium falciparum (P. falciparum) péptido (GGG GGA GLL GNV STV LLG GV; Generaed Synthesis, Inc.) fue conjugado para PPX (CTl; lote# 1116-91) a través de una reacción de diisopropil carbodiimida a fin de hacer inmunogénica a la molécula PPX. El P. falciparum péptido-PPX antigen fue utilizado para producir un MAb a través del procedimiento de inmunización Rapid Prime® propietario (IramunoPrecise Antibodies Ltd.). se seleccionaron clones de hibridoma positivos utilizando una fase sólida ELISA con P. falciparum péptido-PPX antígeno inmovilizado. Un clon de hibridoma, CT-2D5, fue expandido mediante inyección intraperitoneal (i.p.) en ratones BALB/c. se purificó CT-2D5 a partir de fluido de ascitos mediante cromatografía de Proteína G. se determinó la afinidad de enlace mediante metodología ELISA de fase sólida. Los isótopos MAb fueron determinados para ser lgG-2b con un equipo Instant ChekTM-ISOTYPE (EY Laboratories Ltd.). El epítope de enlace de CT-2D5 fue mapeado utilizando una metodología ELISA competitiva.

Después de que las capas celulares confluentes fueron incubadas con 10 nM hasta 10 µM de PPX durante 4 horas, las células fueron fijadas y procesadas para inmunofluorescencia por medio del siguiente método: Las células fijadas fueron teñidas con CT-2D5, el 1 ° anticuerpo (Ab), y una dilución 1 :5000 de F(ab')2 2o Ab de anti-ratón de cabra marcado con AlexaFluor488 (Molecular Probes). Se obtuvieron las imágenes con un microscopio fluorescente Nikon Diaphot y cámara CoolSnap HQ. Se utilizó el software de procesamiento de imagen Metamorph (Metamorph v.6.2 r6) para procesar y almacenar las imágenes.

Las capas de célula RAW fueron procesadas como se describió y después fueron co-teñidas con un antígeno-1 Ab endosómico anti-anterior(EEA-l, Santa Cruz Biotechnology). Las capas de células H460 fueron procesadas como se describió. Un cohorte adicional de capas de células H46O fue co-teñido con tinte nuclear Hoechst y anti-a-tubulina Ab.

Los resultados a partir de los estudios inmunofluorescentes indirectos indicaron que la inmunotinción PPX se co-localizó con un marcador endosómico (datos no mostrados). Los endosomas se fusionaron con lisosomas, exponiendo PPX a enzimas lisosómicas que metabolizan el fármaco, principalmente catepsina B.

Ejemplo 4 Los experimentos y resultados presentados en el ejemplo 4 describen el movimiento de PPX in vivo. Por tanto, la distribución de PPX fue estudiada en ratones hembra sin pelo, tratados con PPX, portando tumor. A los ratones hembra sin pelo se les implantaron subcutáneamente (s.c.) fragmentos de tumor humano H460 en el flanco izquierdo. Cuando la masa tumoral alcanzó un tamaño de 100-150 mm3, los ratones fueron tratados con una dosis intravenosa individual de PPX (90 mg/kg como equivalente de PTX). Los ratones fueron sacrificados a las 24 horas después del tratamiento. Se recolectaron muestras de pulmón, hígado, bazo y tumor, fijadas en formalina regulada en su pH al 10% y parafina embebida. Las secciones de tejido (4 micrómetros (µm)) fueron teñidas con varios anticuerpos: CT-2D5 (previamente descritos en el ejemplo 3), anti-ratón de rata CD45 (BD Pharmingen, Cat No: 55039, Clon: 30-F1 1), anti-ratón de rata F4/80 (Novus Biologicals, Cat NB 600-404 Clon CLA3-), Ab HLA-DR a-cadena monoclonal antihumana de ratón MHCII (HLA)' (Dako Cytomation, Clone TAL.1 B5, REF: M 0746, LOT: 00006515), lisozima policlonal de conejo anti-humana (Dako Cytomation, EC 3.2.1.17, Code A 0099), y mieloperoxidasa (MPO) policlonal de conejo anti-humana (Dako Cytomation, Code NP082).

Se realizó la tinción CT-2D5 utilizando un equipo de ratón-sobre-ratón Dako-ARK.

Se ejecutaron tinción CD45 y F4/80 utilizando equipo Vectestain ABC-Alkaline-Phosphatase. Se ejecutaron tinción MHCII, Lisozima y MPO usando equipo Vectestain ABC-Peroxidase. Para detectar la tinción no específica, se prepararon secciones de control negativo fueron preparados como sigue. Durante la inmunotinción con secciones de control negativo CT-2D5, CD45, F4/80 y MHCII fueron incubadas con suero de bloqueo normal como el Ab primario. Durante la inmunotinción con Lisozima y MPO, se incubaron secciones de control negativo con Ab primario policlonal de conejo extraño.

Se realizaron revisiones histológicas empleando un microscopio óptico con una cámara digital fijada. Las revisiones microscópicas se ejecutaron de modo ciego. Se registró la intensidad de la inmuno reacción positive siguiendo una escala arbitraria (de mínimo a marcado). La evaluación semi-cuantitativa de índice de positividad IHC se realizó mediante conteo de células positivas en ampliación elevada (40Ox) en 10 campos seleccionados de manera aleatoria. Los campos representativos a 100x fueron capturados para ilustrar la distribución de positividad en el tejido.

Se encontró fuerte tinción intra-citoplásmica en órganos del sistema reticuloendotelial 24 horas después del tratamiento con PPX; en el hígado, aproximadamente 20 células por campo (cpf) con morfología compatible con las células de Kupffer fueron altamente positivas; los hepatocitos fueron negativos; en el bazo, las células con morfología de macrófago fueron positivas (» 10-15 cpf) en tanto que los folículos linfoides fueron negativos; en el pulmón, las células positivas (<lcpf) fueron morfológicamente compatibles con neumocitos tipo II.

En el tejido de tumor, se encontró una fuerte tinción intracitoplásmica en cápsula de tumor (=» 2 cpf); la morfología de las células positivas fue consistente con aquella de los macrófagos de infiltración. El margen entre las células viables y la necrosis estuvo caracterizado por tinción granular, extracelular, y ocasionalmente intracelular (intracitoplásmica e intranuclear) moderada a fuerte. La arquitectura de tejido en esta área estuvo severamente comprometida por los procesos necróticos, por lo que no fue posible una identificación confiable a través de análisis morfológico de las células positivas CT-2D5.

En el bazo, casi cada célula en la pulpa roja mostró una fuerte positividad intracitoplásmica para CD45 y se encontró positividad ligera a moderada también en la pulpa blanca; tinción intracitoplásmica moderada para F4/80 en la pulpa roja en un menor número de células (=» 10-15 cpf). En el hígado, se observó tinción intracitoplásmica ligera a moderada tanto para CD45 como F4/80 (<= 20 cpf). En el pulmón, se observó una tinción ¡ntracitoplásmica de moderada a intense para CD45 (<= 2-5 cpf); se observó tinción intracitoplásmica ligera para F4/80 en unas cuantas células (<1 cpf). La morfología y patrón de distribución de las células positivas F4/80 en el hígado, bazo y pulmón fueron consistentes con aquellos de las células positivas CT-2D5 en los mismos tejidos.

En el tumor, se observe fuerte tinción intracitoplásmica tanto para CD45 como F4/80 (= 6 y 4 cpf, respectivamente) en la cápsula de tumor. Raras células positivas CD45 y F4/80 fueron localizadas dentro del tejido de tumor viable tumor. El límite entre las células de tumor viable y la necrosis estuvo caracterizado por una tinción granular extracelular de moderada a intensa y ocasionalmente intracelular, para CD45. La morfología de estas células fue consistente con aquella de los granulocitos cariolíticos-cariorrécticos. El área necrótica estuvo caracterizada por marcada positividad para CD45. Las áreas peri-necrótica y necrótica fueron negativas para F4/80.

La inmunoreactividad específica (» 10 cpf) para MHCII fue localizada en la cápsula externa del. Se encontraron células positivas raras (= 1 cpf) y esparcidas en las porciones viables del tumor. El análisis morfológico de las células inmunoreactivas indica que fueron de origen histiocítico. No se encontró tinción positive en el área necrótica.

La inmunoreactividad positiva para Lisozima fue localizada en la cápsula externa del tumor (=» 10 cpf). Se encontró tinción positive intensa (desecho granular fino) en las áreas necróticas del tumor.

Se observaron numerosas células inmunoreactivas MPO morfológicamente consistentes con los granulocitos cariolíticos-cariorrécticos en las áreas necróticas del tumor.

Los resultados de este estudio confirman que 24 horas después de la inyección, el consumo y acumulación de PPX se pueden detectar en diferentes órganos y en tejido del tumor.

La evaluación morfológica, apoyada por la co-localización de CD45 (antígeno de leucocito común) y señal F4/80 (antígeno macrófago de murino específico), demostraron que todas las células positivas CT-2D5 fueron de origen mielo-histocítico en el hígado, bazo, pulmón y cápsula de tumor. Esto confirma que PPX fue recibido en gran medida por los macrófagos tejido-asociados en el sistema reticuloendotelial sin distribución significativa hacia los hepatocitos, células de revestimiento alveolar en el pulmón o la pulpa blanca del bazo.

La evaluación de positividad CT-2D5 en el área perinecrótica y necrótica fue complicada por el número limitado de células viables. No obstante, la positividad CD45, MPO y de lisozima y la revisión morfológica sugieren que la acumulación de PPX en estas áreas de tumores está asociada con infiltración de leucocitos polimorfonucleares (PMN) y el PPX ¡ntracelular se debe a su actividad fagocítica en esa área.

La falta de acumulación de macrófagos en la porción central de este modelo de tumor impide la determinación de la interacción potencial de PPX con macrófagos asociados con tumor (TAMs) tanto como una fuente potencialmente importante de metabolismo de PPX intratumoral como los efectos potenciales de concentraciones elevadas y prolongadas de paclitaxel libre intracelular PPX sobre la función de TAM.

La acumulación de PPX detectada en el área perinecrótica de tejido tumoral de xenoinjerto de tumor H460 es compatible con la distribución mejorada de PPX a través de la permeabilidad mejorada y el efecto de retención (EPR) de la vasculatura del tumor.

La presencia de altos niveles de PPX en la cápsula de tumor de xenoinjertos H460 es consistente con los estudios de biodistribución previos y confirma la acumulación de PPX de tumor preferencial.

La localización intracelular de PPX es observada principalmente en las células fagocíticas, es decir, macrófagos tejido-asociados (hígado, bazo) o macrófagos de infiltración de tumor.

En el tejido de tumor, el PPX intra- y extra-celular se co-localiza con un marcador para actividad lisosomal.

En conjunto, estas observaciones son consistentes con un modelo en el cual PPX se acumula de manera preferencial en el tejido de tumor seguido por la liberación de paclitaxel a través de la actividad proteolítica de enzimas lisosomales.

Ejemplo 5 Se realizó un estudio para examinar el efecto del estrógeno sobre la actividad de catepsina B y PPX en xenoinjertos de tumor humano. Para estudiar este efecto, células de cáncer colorectal humano HT-29 (CRC) y cáncer pulmonar de célula no-pequeña humano H460 (NSLCL) (ambas de ATCC) fueron trasplantadas s.c. en ratones hembra CD nu/nu. Placebo o 0.17, 0.36, 0.72 mg/60días de pellas de 17ß Estradiol (E2) de liberación controlada (IRA) fueron implantadas s.c. en el día 0 y después de 5 días se trasplantaron fragmentos de tumor humano. En el día 5, 21 , 28 y 35 posterior al implante de pella, se recolectaron sangre y tumores (5 ratones/punto de tiempo).

Los efectos del tratamiento con estrógeno sobre la actividad antitumoral de PPX y paclitaxel en el modelo de tumor de xenoinjerto CRC humano HT-29 fueron analizados a través del siguiente método: cuando los tumores fueron de 120-150 mg (es decir, tumores avanzados), se administraron PPX (i.v./qdl 90 mg/kilogramo (kg) equivalentes de PTX) y PTX (i.v./qdl 90 mg/kg, Sigma Aldrich), al tumor y placebo (P) o ratones que llevan pella E2. Un día (24 horas) y 7 días (168 horas) después del tratamiento con fármaco, se recolectaron los tumores y fueron sometidos a congelación rápida en nitrógeno líquido inmediatamente después de la disección.

Los parámetros de actividad antitumoral fueron determinados como sigue: 1. % de inhibición de peso de tumor (TWI%) igual a 100 menos (TW del tratado dividido entre TW de control) 100 veces, que fue evaluado en el día 60 a partir del implante de pella. 2. Retraso de crecimiento de tumor (TGD): TGD igual a TG Tratado menos TG de Control, en donde TG es el tiempo medio, en días, para que el tumor alcance un peso de 1 gramo (g). 3. El registro de destrucción de célula (LCK) fue calculado a través de la fórmula: LCK igual a ((TGD 1 g) dividido entre 3.32) veces DT, en donde DT es el tiempo (días) necesario para que el tumor duplique su volumen, en los grupos de control y experimental.

Se realizaron los análisis estadísticos utilizando una prueba posterior de una dirección de ANOVA Bonferroni.

Se determinaron los niveles de estrógeno en plasma por medio de un RadiolmmunoAssay KIT (DiaSorin).

Se determinaron el análisis de paclitaxel no conjugado y total en tejidos de tumor a través del siguiente método: después de la adecuada homogenización de los tejidos, se determinaron las concentraciones de paclitaxel no conjugado a través de la extracción líquido/líquido con éter de metil-terbutilo (MTBE). El paclitaxel total fue medido después de la reacción de metanolisis de PPX seguida por extracción MTBE del paclitaxel liberado. El contenido de paclitaxel en las muestras procesadas fue probado por medio de LC/MS/MS bajo condiciones optimizadas en el monitoreo de reacción seleccionado.

ERa, ERß, E-Cadherin y la expresión de gen ld-2 fueron determinados a través de RT-PCR, relacionando su expresión de ARN con aquella del gen GAPDH. El ARN total extraído desde los tumores fue transcrito de manera inversa por medio de Thermoscript RT-PCR System (INVITROGEN). El ADNc generado fue utilizado como plantilla para PCR con iniciadores específicos para ERa y ß, E-Caderina e ld-2.

Se efectuó el análisis de tinción Western como sigue: se extrajeron las proteínas por medio de homogenización en regulador RIPA y se determinó su contenido mediante Bio-Rad Protein Assay. Las alícuotas de proteína fueron separadas por tamaño en 10% SDS-PAGE y transferidas a membrana de nitrocelulosa. Se realizó la ¡nmunodetección utilizando: anti-ERa Policlonal Ab (HC-20, Santa Cruz Biotechnologies), anti-ER-ß Policlonal Ab (06-629, Upstate Biotechnologies)r anti-a-Actin (Sigma), y anti-a-Tubulina (Santa CruzBiotechnologies).

Se efectuó la prueba de actividad de Catepsina B como sigue: las proteínas fueron extraídas mediante homogenización en regulador de catepsina B en relación de 1 mi de regulador por 100 mg de tejido. La prueba utilizó la capacidad de la catepsina B para digerir el sustrato sintético Z-Arg-Arg-AMC. Se determine el AMC liberado de manera fluorométrica en la longitud de onda de excitación 390 ni y la longitud de onda de emisión 460 ni. La actividad de catepsina B fue cuantificada contra una curva estándar AMC.

La expresión ERa y ERß en líneas celulares de tumor humano y el modelo de tumor de xenoinjerto humano HT-29 y H460 fueron demostrados a través del análisis de tinción Western (Figura 6).

El efecto de los niveles de estrógeno circulante sobre el crecimiento del tumor y la actividad de catepsina B fueron demostrados en el modelo de tumor de xenoinjerto CRC humano HT-29. Los resultados indicaron que los niveles incrementados de estrógeno (17ß estradiol) dieron como resultado incrementos tanto en el peso del tumor como en la actividad de catepsina B (Figura 7). Se observe un efecto similar en el modelo de tumor de xenoinjerto NSCLC humano H460 (Figura 8).

El efecto del estradiol sobre la expresión de ERß en CRC humano HT-29 y NSCLC humano H460 fue analizado a través de tinción Western (Figura 9 y 10, respectivamente).

El efecto del estradiol en la activación ERß en células CRC humano HT-29 y NSCLC humano H460 fue analizado por medio de RT-PCR, en donde la expresión incrementada del gen E-Caderina (en células HT-29) y la expresión incrementada del gen ld-2 (en células H460) es indicativa de la activación ERß (Figura 11 y 12, respectivamente).

El efecto del tratamiento con estrógeno sobre el metabolismo de PPX fue demostrado utilizando el modelo de tumor de xenoinjerto CRC HT-29. Los resultados se presentan en el Cuadro 4 (a continuación). (+(E2): ratones con tumor administrados con 0.72 mg 17ß Estradiol; -(P): ratones con tumor no administrados. Los datos a partir del. grupo de 3 tumores). Se observaron mayores concentraciones de paclitaxel no conjugado en el tumor después de la administración de PPX en comparación con aquellas logradas cuando se administró paclitaxel no conjugado como tal.

Cuadro 4 En general, los resultados presentados en el ejemplo 5 indican que la señalización estrógeno-mediada es predominantemente dependiente de ERß, los complementos E2 inducen la activación y/o expresión ERß, y que la actividad de catepsina B incrementada esté asociada con actividad antitumoral de PPX mejorada en las células HT-29.

Ejemplo 6 Los experimentos y resultados presentados en el ejemplo 6 describen el paclitaxel libre y total en varios tejidos, en presencia o ausencia de estrógeno, utilizando un modelo de rata. Para estos estudios las ratas fueron divididas en tres grupos: 1) machos, 2) hembras substituías operadas (es decir, intactas), y 3) hembras ooforectomizadas. Se suministro a las ratas 1 C-CT2103 (paclitaxel conjugado 14C etiquetado, es decir, PPX 4C etiquetado) como una inyección intravenosa individual de 25 mg/Kg.

En varios puntos de tiempo posteriores a la inyección, se sacrificaron tres ratas por grupo y fueron probadas para paclitaxel no conjugado y total en varios tejidos (por ejemplo, pulmón, hígado y médula ósea).

Los resultados a partir de este estudio indicaron que tanto el paclitaxel no conjugado como el paclitaxel total acumulados para niveles estadísticamente superiores en el tejido del pulmón de ratas hembra substituías operadas vs. aquellos niveles en ratas macho o hembra ooforeclomizada. En conlrasle, no hubo diferencia esladíslica en la acumulación de fármaco enlre ralas macho, hembra subslilula operada o hembra ooforeclomizada en hígado o médula ósea (Figura 13). De forma colecíiva, estos datos establecen que el paclitaxel se acumula hasla niveles esladíslicameníe superiores en el tejido pulmonar en presencia de eslrógeno.

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Uso de un conjugado que comprende un polímero de poli(amino ácido) para un fármaco para el Iralamienlo del cáncer en un pacienle, en donde el cáncer eslá caraclerizado por la presencia de células cancerígenas que llevan receptor de estrógeno, o en donde el cáncer es originado en un tejido u órgano que coníiene células que llevan receplor de estrógeno, y en donde se identifica al paciente por íener un nivel de eslrógeno en el rango de aproximadamenle 30 hasta aproximadamente 1 ,000 picogramos por mililitro de suero o plasma.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1 , caraclerizado porque la paciente es una mujer.

3. El uso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la mujer es menor de 55 años de edad.

4. El uso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la paciente es una mujer postmenopáusica con una lerapia de reemplazo hormonal.

5. El uso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el paciente es un hombre con una terapia de reemplazo hormonal.

6. El uso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el paciente es un hombre con una terapia anti-adrógeno.

7. Uso de un conjugado que comprende un polímero de poli(amino ácido) conjugado para un fármaco contra el cáncer para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un paciente, en donde el cáncer está caracterizado por la presencia de células cancerígenas que llevan receptor de estrógeno, o en donde el cáncer se origina en un tejido u órgano que contiene células que llevan receptor de estrógeno, y en donde el paciente es identificado por tener un nivel de estrógeno por debajo de 30 picogramos por mililitro de suero o plasma.

8. El uso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el tratamiento comprende además terapia de estrógeno.

9. El uso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el paciente es hombre.

10. El uso de conformidad con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, caracterizado porque la paciente es mujer.

1 1. El uso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la mujer tiene por lo menos 55 años de edad.

12. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 , caracterizado porque el polímero de poli(amino ácido) es ácido poli(glutámico).

13. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque el fármaco contra el cáncer es un taxano.

14. El uso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el fármaco contra el cáncer es paclitaxel.

15. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 , caracterizado porque el fármaco contra el cáncer es paclitaxel y el polímero comprende ácido (poliglutámico).

16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el conjugado comprende PPX.

17. El uso de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el conjugado está en una cantidad de aproximadamente 175 hasta aproximadamente 250 mg/m2 equivalentes de paclitaxel.

18. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el medicamento es para suministro intravenoso.

19. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el cáncer es cáncer pulmonar.

20. El uso de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el cáncer pulmonar es cáncer pulmonar de célula no pequeña.

21. Un método para seleccionar un régimen de tratamiento del cáncer en base a niveles de estrógeno, que comprende: determinar si el nivel de estrógeno en una muestra de suero o plasma obtenida de un paciente con cáncer está en el rango de aproximadamente 30 hasta aproximadamente 1 ,000 picogramos por mililitro de suero o plasma, o por debajo de aproximadamente 30 picogramos por mililitro de suero o plasma , en donde un nivel de estrógeno en el rango de aproximadamente 30 hasta aproximadamente 1 ,000 picogramos por mililitro indica que el tratamiento con paclitaxel conjugado para poliglutamato será más efectivo que el paclitaxel no conjugado, y en donde un nivel de estrógeno por debajo de aproximadamente 30 picogramos por mililitro indica que el tratamiento con paclitaxel conjugado para poliglutamato no será más efectivo que el paclitaxel no conjugado.