MX2008007118A

MX2008007118A - Moleculas de anticuerpo que tienen especificidad para il-6 humana

Info

Publication number: MX2008007118A
Application number: MXMX/A/2008/007118A
Authority: MX
Inventors: George Popplewell Andrew; Evan Gelinas Richard; Choudhury Singhal Mitra; Zhang Yi; Adams Ralph
Original assignee: Adams Ralph; Evan Gelinas Richard; George Popplewell Andrew; Choudhury Singhal Mitra; Ucb Sa; Zhang Yi
Priority date: 2005-12-09
Filing date: 2008-06-03
Publication date: 2008-09-02

Abstract

La presente invención se refiere a moléculas de anticuerpos que tienen especificidad para determinantes antigénicos de IL-6, usos terapéuticos de las moléculas de anticuerpos y métodos para producir las moléculas de anticuerpo.

Description

MOLÉCULAS DE ANTICUERPO QUE TIENEN ESPECIFICIDAD PARA IL-6 HUMANA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a moléculas de anticuerpo que tienen especificidad para determinantes antigénicos de IL-6. La presente invención también se refiere a usos terapéuticos de las moléculas de anticuerpo y métodos para producir las moléculas de anticuerpo. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La IL-6 es una citocina multi-funcional pleyotrópica producida por una variedad de tipos de células. Originalmente se identificó como un factor de diferenciación de célula B (BSF-2) que indujo la maduración final de células B en células que producen anticuerpo (Hirano et al., 1986 Nature 324, 73-76) . Se ha mostrado que la IL-6 juega un papel central en la regulación inmune, inflamación, hematopoyesis y oncogénesis. Dentro del sistema inmune, la IL-6 induce la producción de anticuerpo de célula B incrementando la cantidad de inmunoglobulina policlonal. También induce la expresión del receptor de interleucina-2 (IL-2) en células T (Nomo et al., 1987, Immunol. Letters, 15, 3, 249-253) y promueve la producción de IL-2 en células T activadas induciendo tanto el crecimiento como la diferenciación de células T citotóxicas (Okada et al., 1988 J Immunol, 141, 5, Ref. 193196 1543-1549). También se conoce que la IL-6 determina la diferenciación de monocitos en macrófagos (Chomarat P et al., 2000 Nature Immunol, 6, 510-514). La función de IL-6 no se restringe a la respuesta inmune cuando actúa en hematopoyesis, trombopoyesis, formación de osteoclasto, producción de respuesta de fase aguda hepática resultando en la elevación de la proteína C-reactiva (CRP) y proteína amiloide A de suero (SAA) . Se conoce que es un factor de crecimiento para queratinocitos epidérmicos, células mesangiales renales, células de mieloma y plasmacitoma (Grossman et al., 1989 Prot Nati Acad Sci., 86, (16) 6367-6371; Horii et al., 1989, J Immunol, 143, 12, 3949-3955; Kawano et al., 1988, Nature 332, 6159, 83-85). La IL-6 se produce por un amplio intervalo de tipos de célula incluyendo monocitos/macrófagos, fibroblastos, queratinocitos epidérmicos, células endoteliales vasculares, células mesangiales renales, células guales, condrocitos, células T y B y algunas células cancerígenas (Akira et al., 1990, FASEB J. , 4, 11, 2860-2867). Excepto para las células cancerígenas que constitutivamente producen IL-6, las células normales no expresan IL-6 a menos que sea apropiadamente estimulada. La IL-6 es una glicoproteína, una molécula de 184 aminoácidos con un peso molecular de 21 a 28 kD dependiendo de las modificaciones post-traduccionales . Las variantes de empalme alternas se encuentran en algunos tipos de células (Kishimoto et al., 1995, Blood, 86, 4, 1243-1254). El complejo de receptor de IL-6 (IL-6R) está comprendido de dos proteínas de membrana funcionalmente diferentes, una cadena de enlace específico de IL-6 de 80kD (gp80) y una cadena de transducción de señal de 130 kD (gpl30) . Aunque la IL-6 no puede enlazar directamente la gpl30, puede enlazar a IL-6R para generar un complejo ternario de alta afinidad de IL-6/IL-6R/gp 130. El IL-6R enlaza a IL-6 con baja afinidad, sin embargo, el IL-6R no tiene un dominio de transducción de señal intracelular por lo tanto esta ligación sola no conduce a la activación celular. De manera similar, la expresión de superficie celular de IL-6R no significa que la célula sea sensible a la estimulación de IL-6. La escisión proteolitica conduce a la liberación de IL-6R soluble (sIL-6R; sgp80) el cual puede enlazar IL-6 circulante e incrementar la semivida de IL-6. Para la activación celular, la IL-6 primero enlaza a cualquier IL-6R unido a célula o SIL-6R; el complejo IL-6/IL-6R heterodimérico luego se asocia con la glicoproteína de superficie celular gpl30. El heterocomplejo tripartita resultante enlaza a otro IL-6/IL-6R/gpl30 y de transducción de señal resultante (Bravo and Heath 2000, EMBO J. , 19, (11), 2399-2411; Boulanger et al., 2003, Science, 300, 5628, 2101-2104), por lo tanto el IL-6R unido a célula como soluble contribuyen a la activación celular. La señalización de IL-6 a través del IL-6R unido a célula se ha llamado señalización cis mientras que la activación celular vía IL-6R soluble se ha descrito como señalización trans. Las células que expresan gpl30 pero no IL-6R se pueden estimular por IL-6 a través de SIL-6R. Los anticuerpos murinos neutralizantes para IL-6 humana se conoce que son capaces de interferir con el enlace de IL-6 humana al IL-6R (sitio 1) o a gpl30 (sitios 2 y 3) (Kalai et al., 1997, Eur. J. Biochem. 249, 690-700; Brakenhoff et al., 1990, Journal of Immunology, 145, 561-568; endling et al., 1993, Journal of Rhematology, 29, 259-262). La patente de Estados Unidos 5,856,135 describe anticuerpos humanos reconformados para IL-6 humana los cuales bloquean la IL-6 que enlaza al IL-6R. Estos anticuerpos se dividieron de un anticuerpo monoclonal de ratón SK2 en el cual las regiones determinantes de complementariedad (CDR's) de la región variable del anticuerpo de ratón SK2 se transplantan en las regiones variables de un anticuerpo humano . También se conocen auto-anticuerpos humanos neutralizantes para IL-6 (Hansen et al, Eur. J. Immunol, 1995, 25, 348-354) . Un anticuerpo anti-IL-6 murino/humano quimérico de sitio I se describió en O2004039826 para el uso en terapia. Un anticuerpo monoclonal del receptor IL-6 anti-humano humanizado está en los ensayos clínicos fase II para el tratamiento de artritis reumatoide (Kishimoto, 2005, Annu Rev Immunol. 23:1-21) . También se ha reportado que el mismo anticuerpo es eficaz en un estudio de fase II de enfermedad de Crohn. La eficacia también se ha demostrado con anticuerpos tanto anti-IL-6 como anti-IL-6R en enfermedad tipo lupus en ratones NZB/ Fi (Fink et al., 1994 J. Clin. Invest. 94, 585; Mihara et al., 998, Clin. Exp. Immunol. 112, 397) . Un anticuerpo neutralizante para el receptor de IL-6 murina suprime la colitis en un modelo de enfermedad de transferencia adoptiva (Yamamoto et al., 2000 Journal of I munology, 164, 4878; Atreya et al., 2000 Nature Med 6, 583). El último estudio también demostró eficacia con un anticuerpo anti-receptor en el modelo de colitis de ratón agónico de IL-10 y en el modelo de inflamación de gota de TNBS. Ahora se ha identificado un anticuerpo anti-IL-6 neutralizante de alta afinidad que es particularmente eficaz in vivo, por ejemplo en el modelo in vivo descrito en la presente . Los residuos en los dominios variables de anticuerpo son convencionalmente numerados de acuerdo con un sistema contemplado por Kabat et al. Este sistema se describe en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (después "Kabat et al. ( supra ) " ) . Este sistema de numeración se usa en la presente especificación excepto donde se indique de otra forma. Las designaciones de residuo Kabat no siempre corresponden directamente con la numeración lineal de los residuos aminoácido. La secuencia de aminoácido lineal actual puede contener pocos o adicionales aminoácidos que en la numeración de Kabat estricta correspondiente a un acortamiento de, o inserción en, un componente estructural, si es la estructura o región determinante de complementariedad (CDR) , de la estructura de dominio variable básica. La numeración de Kabat correcta de residuos se puede determinar para un anticuerpo dado por alineación de residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar". Las CDR del dominio variable de cadena pesada se ubican en residuos 31-35 (CDR-H1), residuos 50-65 (CDR-H2) y residuos 95-102 (CDR-H3) de acuerdo con el sistema de numeración Kabat. Sin embargo, de acuerdo con Chothia (Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), el equivalente de bucle a CDR-H1 se extiende desde el residuo 26 al residuo 32. Por consiguiente 'CDR-H1', como se usa en la presente, comprende residuos 26 a 35, como se describe por una combinación del sistema de numeración Kabat y definición de bucle topológico de Chothia. Las CDR del dominio variable de cadena ligera se ubican en los residuos 24-34 (CDR-L1), residuos 50-56 (CDR-L2) y residuos 89-97 (CDR-L3) de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Como se usa en la presente, el término 'anticuerpo neutralizante' describe un anticuerpo que es capaz de neutralizar la actividad de señalización biológica de IL-6, por ejemplo bloqueando el enlace de sitio 3 de IL-6 al receptor de gp 130. Los anticuerpos para el uso en la presente invención se pueden obtener usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. El polipéptido de IL-6 o células que expresan el polipéptido se pueden usar para producir anticuerpos los cuales específicamente reconocen la IL-6. El polipéptido de IL-6 puede ser el polipéptido 'maduro' o un fragmento biológicamente activo o derivados de los mismos. Preferiblemente, el polipéptido de IL-6 es el polipéptido maduro. Los polipéptidos de IL-6 se pueden preparar por procesos bien conocidos en la técnica a partir de células hospederas genéticamente modificadas que comprenden sistemas de expresión o se pueden recuperar de fuentes biológicas naturales. En la presente solicitud, el término "polipéptidos" incluye péptidos, polipéptidos y proteínas. Esto se usan intercambiablemente a menos que se especifique de otra forma. El polipéptido de IL-6 puede, en algunos casos, ser parte de una proteína grande tal como una proteína de fusión, por ejemplo, fusionada a una marca de afinidad. Los anticuerpos generados contra el polipéptido de IL-6 se pueden obtener, donde la inmunización de un animal es necesaria, administrando los polipéptidos a un animal, preferiblemente un animal no humano, usando protocolos bien conocidos y de rutina, véase por ejemplo Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol. 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986) . Muchos animales de sangre caliente, tales como conejos, ratones, ratas, ovejas, vacas o cerdos se pueden inmunizar. Sin embargo, ratones, conejos, cerdos y ratas son generalmente preferidos . Los anticuerpos para el uso en la presente invención incluyen anticuerpos completos y fragmentos funcionalmente activos o derivados de los mismos y pueden ser, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, humanizados, completamente humanos o quiméricos. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar por cualquier método conocido en la técnica tal como la técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) y la técnica de EBV-hibridoma (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, pp 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985). Los anticuerpos para el uso en la invención también se pueden generar usando métodos de anticuerpo de linfocito único mediante clonación y expresión de ADNc de región variable de inmunoglobulina generados de linfocitos únicos seleccionados para la producción de anticuerpos específicos mediante, por ejemplo, los métodos descritos por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93 ( 15) : 7843-78481 ; WO92/02551; O2004/051268 y Solicitud de Patente Internacional número WO2004/106377. Los anticuerpos humanizados (los cuales incluyen anticuerpos con CDR injertada) son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las especies no humanas y una región de estructura de una molécula de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo US 5,585,089; WO91/09967) . Se apreciará que solamente puede ser necesario transferir los residuos determinantes de especificidad de las CDR antes que la CDR completa (véase, por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Los anticuerpos humanizados opcionalmente pueden comprender adicionalmente uno o más residuos de estructura derivados de las especies no humanas de las cuales las CDR se derivaron. Los anticuerpos quiméricos son aquellos anticuerpos codificados por genes de inmunoglobulina que se han modificado genéticamente de modo que los genes de cadena ligera y pesada están compuestos de segmentos de gen de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies. Los anticuerpos para el uso en la presente invención también se pueden generar usando varios métodos de exhibición de fagos conocidos en la técnica e incluyen aquellos descritos por Brinkman et al. (en J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol . Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Im unol . 1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) y WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5, 969,108. Los anticuerpos completamente humanos son aquellos anticuerpos en los cuales las regiones variables y las regiones constantes (donde están presentes) de cadenas tanto pesadas como ligeras son todas de origen humano, o sustancialmente idénticas a las secuencias de origen humano, no necesariamente del mismo anticuerpo. Los ejemplos de anticuerpos completamente humanos pueden incluir anticuerpos producidos por ejemplo, por los métodos de exhibición de fagos descritos anteriormente y anticuerpos producidos por ratones en los cuales la variable de inmunoglobulina murina y genes de parte constante se han reemplazado por sus contrapartes humanas, por ejemplo, como se describe en términos generales en EP0546073 Bl, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661,016, US 5,770,429, EP 0438474 Bl y EP0463151 Bl . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana, que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 5 para CDR-Hl, una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 6 para CDR-H2 y una CDR que tiene la secuencia dada en SEC ID NO: 7 para CDR-H3. En otra modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana, que comprende una cadena pesada, en donde al menos dos de CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3 del dominio variable de la cadena pesada se seleccionan de lo siguiente: la secuencia dada en la SEC ID NO: 5 para CDR-Hl, la secuencia dada en la SEC ID NO: 6 para CDR-H2 y la secuencia dada en la SEC ID NO: 7 para CDR-H3. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender una cadena pesada en donde CDR-Hl tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 5 y CDR-H2 tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 6. Alternativamente, el anticuerpo puede comprender una cadena pesada en donde CDR-Hl tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 5 y CDR-H3 tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 7, o el anticuerpo puede comprender una cadena pesada en donde CDR-H2 tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 6 y CDR-H3 tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 7. Para evitar duda, se entiende que todas las permutaciones están incluidas . En otra modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana, que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 5 para CDR-Hl, la secuencia dada en la SEC ID NO: 6 para CDR-H2 y la secuencia dada en la SEC ID NO: 7 para CDR-H3. En una modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-humana, que comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 9 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 10 para CDR-L3. En otra modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana, que comprende una cadena ligera, en donde al menos dos de CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3 del dominio variable de la cadena ligera se seleccionan de lo siguiente: la secuencia dada en la SEC ID NO : 8 para CDR-Ll, la secuencia dada en la SEC ID NO: 9 para CDR-L2 y la secuencia dada en la SEC ID NO: 10 para CDR-L3. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender una cadena ligera en donde CDR-Ll tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 8 y CDR-L2 tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 9. Alternativamente, el anticuerpo puede comprender una cadena ligera en donde la CDR-Ll tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 8 y CDR-L3 tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 10, o el anticuerpo puede comprender una cadena ligera en donde la CDR-L2 tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 9 y la CDR-L3 tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 10. Para evitar duda, se entiende que todas las permutaciones están incluidas. En otra modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana, que comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, la secuencia dada en la SEC ID NO: 9 para CDR-L2 y la secuencia dada en la SEC ID NO: 10 para CDR-L3. Se apreciará que una o más sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácido se pueden hacer a las CDR proporcionadas por la presente invención sin alterar significativamente la capacidad del anticuerpo para enlazar IL-6 y neutralizar la actividad de IL-6. El efecto de cualquiera de las sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácido se puede probar fácilmente por un experto en la técnica, por ejemplo usando los métodos descritos en los Ejemplos para determinar la neutralización y enlace de IL-6. Por consiguiente, en un ejemplo la presente invención proporciona un anticuerpo que tiene especificidad para IL-6 humana que comprende una o más CDR seleccionadas de CDRH-1 (SEC ID N0:5), CDRH-2 (SEC ID N0:6), CDRH-3 (SEC ID N0:7), CDRL-1 (SEC ID NO : 8 ) , CDRL-2 (SEC ID N0:9) y CDRL-3 (SEC ID NO: 10) en las cuales uno o más aminoácidos en una o más de las CDR se han sustituido con otro aminoácido. Las moléculas de anticuerpo de la presente invención preferiblemente comprenden una cadena ligera de complementariedad o una cadena pesada de complementariedad, respectivamente. Por lo tanto en una modalidad, un anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 5 para CDR-Hl, la secuencia dada en la SEC ID NO: 6 para CDR-H2 y la secuencia dada en la SEC ID NO: 7 para CDR-H3 y una cadena ligera en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, la secuencia dada en la SEC ID NO: 9 para CDR-L2 y la secuencia dada en la SEC ID NO:10 para CDR-L3.

En un ejemplo la presente invención proporciona un anticuerpo que tiene especificidad para IL-6 humana, que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 5 para CDR-Hl, la secuencia dada en la SEC ID NO: 6 para CDRH-2 y la secuencia dada en la SEC ID NO : 7 para CDRH-3 y una cadena ligera en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, la secuencia dada en la SEC ID NO : 9 para CDR-L2 y la secuencia dada en la SEC ID NO: 10 para CDR-L3 en la cual uno o más aminoácidos en una o más de las CDR se han sustituido con otro aminoácido. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEC ID NO:2. En otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud a la secuencia dada en la SEC ID NO: 2. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95%, o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEC ID NO: 2.

"Identidad", como se usa en la presente, indica que en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo aminoácido es idéntico entre las secuencias. "Similitud", como se usa en la presente, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Por ejemplo, la leucina se puede sustituir por isoleucina o valina. Otros aminoácidos los cuales frecuentemente se pueden sustituir por otro incluyen pero no se limitan a: - fenilalanina, tirosina y triptofan (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas); - aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales acidas); - asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida); y cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre). Los grados de identidad y similitud se pueden calcular fácilmente (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds., M Stockton Press, New York, 1991) . En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEC ID N0:4. En otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud a la secuencia dada en la SEC ID NO: . En una modalidad el anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95%, o 98% de identidad o similitud a la secuencia dada en la SEC ID NO: 4. En una modalidad un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de rata, en el cual el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 2, y el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEC ID NO : 4. Este anticuerpo de rata es referido en la presente como '132E09' o como el anticuerpo "donante". Las secuencias de nucleótido y aminoácido completas del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo de rata 132E09 se proporcionan en las SEC ID NOS: 1 y 2 respectivamente. Las secuencias de nucleótido y aminoácido completas del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo de rata 132E09 se proporcionan en las SEC ID NOS: 3 y 4 respectivamente. Las CDR dadas en las SEC ID NOS: 5, 6, 7, 8, 9 y 10 se derivan del anticuerpo de rata 132E09. En una modalidad un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo con CDR injertada. Como se usa en la presente, el término 'anticuerpo con CDR injertada' se refiere a un anticuerpo en donde la cadena pesada y/o ligera contiene una o más CDR (incluyendo, si se desea, una o más CDR modificadas) de un anticuerpo donante (por ejemplo, un anticuerpo de rata) injertado en una estructura de región variable de cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo aceptor (por ejemplo un anticuerpo humano) . Para una revisión, véase Vaughan et al, Nature Biotechnology, 1_6, 535-539, 1998.

Preferiblemente una o más de las CDR se ha obtenido del anticuerpo de rata 132E09 (SEC ID NOS:5, 6, 7, 8, 9 y 10). En una modalidad antes que la CDR completa sea transferida, solamente uno o más residuos determinantes de especificidad de cualquiera de las CDR descrita en la presente anteriormente son transferidos a la estructura de anticuerpo humano (véase por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). En una modalidad solamente los residuos determinantes de especificidad de una o más de las CDR descritas en la presente anteriormente se transfieren a la estructura de anticuerpo humano. En otra modalidad solamente los residuos determinantes de especificidad de cada una de las CDR descritas en la presente anteriormente son transferidos a la estructura de anticuerpo humano. Mientras que las CDR o residuos determinantes de especificidad son injertados, se puede usar cualquier estructura de región variable aceptora apropiada habiendo considerado la clase/tipo del anticuerpo donante del cual las CDR se derivan, incluyendo regiones de estructura de rata, ratón, primate y humana. Preferiblemente, el anticuerpo con CDR injertada de la presente invención tiene al menos un dominio variable que comprende regiones de estructura aceptoras humano así como una o más de las CDR derivadas del anticuerpo donante como se refirió anteriormente. Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo con CDR injertada neutralizante en donde el dominio variable comprende regiones de estructura aceptoras humanas y CDR donante no humana, preferiblemente rata. Los ejemplos de estructuras humanas las cuales se pueden usar en la presente invención son KOL, NEWM, REÍ, EU, TUR, TEI, LAY Y POM (Kabat et al, supra) . Por ejemplo, KOL y NEWM se pueden usar para la cadena pesada, REÍ se puede usar para la cadena ligera y EU, LAY y POM se pueden usar tanto para cadena pesada como cadena ligera. Alternativamente, las secuencias de línea germinal humanas se pueden usar; las secuencias de estas están disponibles en: http: //vbase.mrc-cpe . cam. ac . uk/ . En un anticuerpo con CDR injertada de la presente invención, las cadenas pesada y ligera aceptoras no necesariamente necesitan ser derivadas del mismo anticuerpo y, si se desea, pueden comprender cadenas compuestas que tienen regiones de estructura derivadas de diferentes cadenas. La región de estructura preferida para la cadena pesada del anticuerpo con CDR injertada de la presente invención se deriva de la secuencia VH3 de sub-grupo humano 1-4 3-72 conjuntamente con JH4 (mostrado en la figura 2; SEC ID NOS: 10 y 20) . Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo con CDR injertada neutralizante que comprende al menos una CDR donante no humana en donde la región de estructura de cadena pesada se deriva de la secuencia de subgrupo humano 1-4 3-72 conjuntamente con JH4. La secuencia de JH4 humana es como sigue: (YFDY) WGQGTLVTVSS (SEC ID NO:20). El motivo YFDY es parte de la CDR-H3 y no es parte de la estructura 4 (Ravetch, JV. et al, 1981, Cell, 27, 583-591) . La secuencia donante es la secuencia 132E09 VH (SEC ID NO:2) mostrada en la figura 2 y las CDR donantes (SEC ID NOs: 5, 6 y 7) son subrayadas.

La región de estructura preferida para la cadena ligera del anticuerpo con CDR injertada de la presente invención se deriva de la secuencia VK1 de sub-grupo de línea germinal humana 2-1- (1) 012 conjuntamente con JK2 mostrado en la figura 2 (SEC ID NO: 21 y 22) . Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo con CDR injertada neutralizante que comprende al menos una CDR donante no humana en donde la región de estructura de cadena ligera se deriva de la secuencia de sub-grupo humano VK1 2-1- (1) 012 conjuntamente con JK2. La secuencia de JK2 es como sigue: (YT) FGQGTKLEIKR (SEC ID N0:22). El motivo YT es parte de la CDR-L3 y no es parte de la estructura 4 (Hieter, PA. , et al, 1982, J. Biol. Chem., 257, 1516-1522). La secuencia donante es la secuencia 132E09 VL (SEC ID NO : 4 ) mostrada en la figura 2 y las CDR donantes (SEC ID NOs: 8, 9 y 10) son subrayadas. Además, en un anticuerpo con CDR injertada de la presente invención, las regiones de estructura no necesitan tener exactamente la misma secuencia como aquellas del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, los residuos inusuales se pueden cambiar a residuos más frecuentemente presentes para esta clase o tipo de cadena aceptora. Alternativamente, los residuos seleccionados en las regiones de estructura aceptoras se pueden cambiar de modo que corresponden al residuo encontrado en la misma posición en el anticuerpo donante (véase Reichmann et al, 1998, Nature, 332, 323-324).

Tales cambios se deberán mantener al mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donante. Un protocolo para seleccionar residuos en las regiones de estructuras aceptoras las cuales pueden necesitar ser cambiadas se describe en WO 91/09967. Preferiblemente, en una molécula de anticuerpo con CDR injertada de la presente invención, si la cadena pesada aceptora tiene la secuencia VH3 humana 1-4 3-72 conjuntamente con JH4, entonces las regiones de estructura aceptoras de la cadena pesada comprenden, además de una o más CDR donantes, un residuo donante en al menos la posición 49 (de acuerdo con Kabat et al., (supra)). Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo con CDR injertada, en donde al menos el residuo en la posición 49 del dominio variable de la cadena pesada es un residuo donante. Preferiblemente, en una molécula de anticuerpo con CDR injertada de acuerdo con la presente invención, si la cadena ligera aceptora tiene la secuencia VK1 de sub-grupo humano 2-1- (1) 012 conjuntamente con JK2, entonces no se usan residuos donantees en las regiones de estructura aceptoras de la cadena ligera y solamente una o más CDR donantes se transfieren . Los residuos donantees son residuos del anticuerpo donante, es decir, el anticuerpo del cual las CDR se derivaron originalmente, el cual en este caso de la presente invención es el anticuerpo de rata 132E09. Por consiguiente, la presente invención proporciona un anticuerpo en el cual la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de gH13 (figura 2; SEC ID NO: 11). En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud a la secuencia dada en la SEC ID NO: 11. Preferiblemente, el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEC ID NO: 11. Además, la presente invención proporciona un anticuerpo en el cual la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de gLIO (figura 2; SEC ID NO: 13) . En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud a la secuencia dada en la SEC ID NO: 13. Preferiblemente, el anticuerpo comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEC ID NO: 13.

Preferiblemente un anticuerpo con CDR injertada de acuerdo con la presente invención comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de gH13 (SEC ID NO: 11) y una cadena ligera que comprende la secuencia de gLIO (SEC ID N0:13) . En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEC ID NO: 11 y el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEC ID NO: 13. Preferiblemente, el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEC ID NO: 11 y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEC ID NO: 13. Las moléculas de anticuerpo de la presente invención pueden comprender una molécula de anticuerpo completa que tiene cadenas ligera y pesada de longitud completa o un fragmento de las mismas y puede ser, pero no se limita a Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio único, scFv, anticuerpos bi, tri o tetravalentes, Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos de enlace de epítope de cualquiera de los anteriores (véase por ejemplo Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23 (9) : 1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews Online 2(3), 209-217). Los métodos para crear y manufacturar estos fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181) . Otros fragmentos de anticuerpo para el uso en la presente invención incluyen los fragmentos Fab y Fab' descritos en las solicitudes de patente internacionales WO2005/003169, WO2005/003170 y WO2005/003171. Los anticuerpos multi-valentes pueden comprender múltiples especificidades o pueden ser monoespecíficas (véase por ejemplo WO 92/22853 y WO05/113605) . Los dominios de región constante de la molécula de anticuerpo de la presente invención, si están presentes, se pueden seleccionar habiendo considerado la función propuesta de la molécula de anticuerpo, y en particular las funciones efectoras las cuales se pueden requerir. Por ejemplo, los dominios de región constante pueden ser dominios de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humana. En particular se pueden usar dominios de región constante de IgG humana, especialmente de los isotipos de IgGl e IgG3 cuando la molécula de anticuerpo se propone para usos terapéuticos y las funciones efectoras de anticuerpo son requeridas. Alternativamente, los isotipos de IgG2 e IgG4 se pueden usar cuando la molécula de anticuerpo se propone para propósitos terapéuticos y las funciones efectoras de anticuerpo no se requieren, por ejemplo para simplemente bloquear la actividad de IL-6. Se apreciará que las variantes de secuencia de estos dominios de región constante también se pueden usar. Por ejemplo, se pueden usar moléculas de IgG en las cuales la serina en la posición 241 se ha cambiado a prolina como se describe en Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30(1), 105-108. Es particularmente preferido el dominio constante de IgG4 que comprende este cambio. También se entenderá por un experto en la técnica que los anticuerpos pueden sufrir una variedad de modificaciones post-traduccionales . El tipo y grado de estas modificaciones frecuentemente depende de la línea de célula hospedera usada para expresar el anticuerpo así como las condiciones de cultura. Tales modificaciones pueden incluir variaciones de glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperizina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un residuo básico carboxi-terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chroma tography 705:129-134, 1995). Por consiguiente, la lisina C-terminal de la cadena pesada de anticuerpo de la SEC ID NO: 16 puede estar ausente. En una modalidad preferida el anticuerpo proporcionado por la presente invención es un anticuerpo neutralizantes que tiene especificidad para IL-6 humana en el cual la región constante de cadena pesada comprende la región constante de IgG4 humana en la cual la serina en la posición 241 se ha sustituido por prolina como se describe en Angal et al , supra . Por consiguiente, la presente invención proporciona un anticuerpo en el cual la cadena pesada comprende o consiste de la secuencia dada en la SEC ID NO: 16. Preferiblemente la región constante de cadena ligera es cKappa . En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo en el cual la cadena pesada comprende o consiste de la secuencia dada en la SEC ID NO: 16 y la cadena ligera comprende o consiste de la secuencia dada en la SEC ID NO: 18. En una modalidad de la invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEC ID NO: 16. Preferiblemente, el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEC ID NO: 16. En una modalidad de la invención, el anticuerpo comprende una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEC ID NO: 18. Preferiblemente, el anticuerpo comprende una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEC ID NO: 18. En una modalidad de la invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEC ID NO: 16 y la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEC ID NO: 18. Preferiblemente, el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEC ID NO: 16 y una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEC ID NO:18. También por la presente invención se proporciona una región específica o epítope de IL-humana el cual se puede unir por un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, en particular un anticuerpo que comprende cualquiera de CDR-Hl (SEC ID N0:5), CDR-H2 (SEC ID N0:6), CDR-H3 (SEC ID N0:7), CDR-Ll (SEC ID NO: 8), CDR-L2 (SEC ID NO: 9) o CDR-L3 (SEC ID NO: 10), por ejemplo, anticuerpo 132E09 o anticuerpos que comprenden la secuencia de región variable de cadena pesada gH13 (SEC ID NO: 11) y/o la secuencia de región variable de cadena ligera gLIO (SEC ID NO: 13) . Esta región específica o epítope del polipéptido de IL-6 humana se puede identificar por cualquier método de mapeo de epítope adecuado conocido en la técnica en combinación con cualquiera de los anticuerpos proporcionados por la presente invención. Los ejemplos de tales métodos incluyen péptidos de tamizado de longitudes variadas derivados de IL-6 para enlazar al anticuerpo de la presente invención con el fragmento más pequeño que puede específicamente enlazar al anticuerpo que contiene la secuencia del epítope reconocido por el anticuerpo. Los péptidos de IL-6 se pueden producir sintéticamente o por digestión proteolítica del polipéptido de IL-6. Los péptidos que enlazan el anticuerpo se pueden identificar, por ejemplo, por análisis espectrométrico de masa. En otro ejemplo, la espectroscopia de RMN se puede usar para identificar el epítope unido por un anticuerpo de la presente invención, como se describe en los ejemplos en la presente. Una vez identificado, se puede usar el fragmento epitópico el cual enlaza un anticuerpo de la presente invención, si se requiere, como un inmunógeno para obtener anticuerpos neutralizantes adicionales los cuales enlazan el mismo epítope . En un ejemplo, el epítope de IL-6 humana unido por un anticuerpo de la presente invención comprende al menos los residuos de aminoácido S47, C50, E93, R104, F105, E106, T149, K150, A153, Q156, Q159 y S169 de IL-6 humana (numeración de residuos de acuerdo con Boulanger et al., Science, 300, 2101-2104) . En un ejemplo, el epítope de IL-6 humana unido por un anticuerpo de la presente invención comprende los residuos de aminoácido S47, C50, E93, R104, F105, E106, T149, K150, A153, Q156, Q159 y S169 y uno o más residuos seleccionados de C44, S53, A58, V96, Q152, Q154, N155, W157, T163, L165, y E172. En un ejemplo, el epítope de IL-6 humana unido por un anticuerpo de la presente invención comprende los residuos de aminoácido C44, S47, C50, S53, A58, E93, V96, R104, F105, E106, T149, K150, Q152, A153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, T163, L165, S169 y E172. En una modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-humana el cual enlaza un epítope de IL-humana madura el cual comprende los residuos de aminoácido S47, C50, E93, R104, F105, E106, T149, K150, A153, Q156, Q159 y S169. En una modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-humana el cual enlaza un epítope de IL-6 humana madura el cual comprende los residuos de aminoácido S47, C50, E93, R104, F105, E106, T149, K150, A153, Q156, Q159 y S169 y uno o más residuos seleccionados de C44, S53, A58, V96, Q152, Q154, N155, W157, T163, L165, y E172. En una modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-humana el cual comprende los residuos de aminoácido C44, S47, C50, S53, A58, E93, V96, R104, F105, E106, T149, K150, Q152, A153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, T163, L165, S169 y E172. Se apreciará que los residuos nombrados anteriormente también se pueden numerar basado en la numeración de aminoácido del precursor no procesado de IL-6 (número de acceso Swiss Prot P05231). Usando esta numeración los residuos numerados anteriormente de acuerdo con Boulanger et al., supra como C44, S47, C50, S53, A58, E93, V96, R104, F105, E106, T149, K150, Q152, A153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, T163, L165, S169 y E172 llegan a ser C72, S75, C78, S81, A86, E121, V124, R132, F133, E134, T177, K178, Q180, A181, Q182, N183, Q184, W185, Q187, T191, L193, S197 y E200 respectivamente . Preferiblemente un anticuerpo de la presente invención bloquea el enlace de receptor gpl30 al sitio 3 de IL-6 humana. Los anticuerpos los cuales bloquean cruzado el enlace de los anticuerpos de la presente invención a IL-6 pueden ser útiles de manera similar en la actividad de IL-6 neutralizante. Por consiguiente, la presente invención también proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana, el cual bloquea de manera cruzada el enlace de cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente para IL-6 humana y/o es bloqueado de manera cruzada del enlace de IL-6 por cualquiera de aquellos anticuerpos. En una modalidad, tal anticuerpo enlaza al mismo epítope como un anticuerpo descrito en la presente anteriormente. En otra modalidad el anticuerpo neutralizante de bloqueo cruzado enlaza un epítope el cual se rodea y/o se superpone con el epítope enlazado por un anticuerpo descrito en la presente anteriormente. En otra modalidad el anticuerpo neutralizante de bloqueo cruzado de este aspecto de la invención no enlaza al mismo epítope como un anticuerpo de la presente invención o un epítope que rodea y/o se superpone con el epítope. Los anticuerpos de bloqueo cruzado se pueden identificar usando cualquier método adecuado en la técnica, por ejemplo usando BIAcore o ELISA de competición donde el enlace del anticuerpo de bloqueo cruzado a IL-6 humana previene el enlace de un anticuerpo de la presente invención o viceversa. En una modalidad se proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana, el cual bloquea de manera cruzada el enlace del anticuerpo 132E09 o un anticuerpo cuya cadena pesada comprende la secuencia gH13 (SEC ID NO: 11) o un anticuerpo cuya cadena ligera comprende la secuencia gLIO (SEC ID NO: 13) o un anticuerpo que comprende cualquiera de CDR-Hl (SEC ID NO: 5), CDR-H2 (SEC ID NO: 6), CDR-H3 (SEC ID NO: 7), CDR-Ll (SEC ID NO:8), CDR-L2 (SEC ID NO:9) o CDR-L3 (SEC ID NO:10) a IL-6 humana. En una modalidad los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención inhiben el enlace de 132E09 o un anticuerpo cuya cadena pesada comprende la secuencia gH13 (SEC ID NO: 11) o un anticuerpo cuya cadena ligera comprende la secuencia gLIO (SEC ID NO: 13) o un anticuerpo que comprende cualquiera de CDR-Hl (SEC ID NO: 5), CDR-H2 (SEC ID NO: 6), CDR-H3 (SEC ID NO : 7 ) , CDR-Ll (SEC ID NO:8), CDR-L2 (SEC ID NO:9) o CDR-L3 (SEC ID NO:10) a IL-6 humana por 80% o mayor, por 85% o mayor, por 90% o mayor, o por 95% o mayor. Alternativamente o además, los anticuerpos neutralizantes de acuerdo con este aspecto de la invención pueden ser bloqueados de manera cruzada del enlace a IL-6 humana por cualquiera de los anticuerpos de la presente invención. Por lo tanto también se proporciona una molécula de anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-humana la cual es bloqueada cruzada del enlace de IL-6 humana por el anticuerpo 132E09 o un anticuerpo cuya cadena pesada comprende la secuencia gH13 (SEC ID NO: 11) o un anticuerpo cuya cadena ligera comprende la secuencia gLIO (SEC ID NO: 13) o un anticuerpo que comprende cualquiera de CDR-Hl (SEC ID N0:5), CDR-H2 (SEC ID N0:6), CDR-H3 (SEC ID NO : 7 ) , CDR-Ll (SEC ID NO:8), CDR-L2 (SEC ID N0:9) o CDR-L3 (SEC ID NO:10). En una modalidad los anticuerpos neutralizantes proporcionados por este aspecto de la invención son inhibidos del enlace de IL-6 humana por 132E09 o un anticuerpo cuya cadena pesada comprende la secuencia gH13 (SEC ID NO: 11) o un anticuerpo cuya cadena ligera comprende la secuencia gLIO (SEC ID NO: 13) o un anticuerpo que comprende cualquiera de CDR-Hl (SEC ID NO: 5), CDR-H2 (SEC ID NO: 6), CDR-H3 (SEC ID NO:7), CDR-Ll (SEC ID NO:8), CDR-L2 (SEC ID NO:9) o CDR-L3 (SEC ID NO: 10) por 80% o mayor, por 85% o mayor, por 90% o mayor, o por 95% o mayor. Las moléculas de anticuerpo de la presente invención preferiblemente tienen una alta afinidad de enlace para IL-6 humana, preferiblemente picomolar. La afinidad se puede medir usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo BIAcore como se describe en los ejemplos en la presente. Preferiblemente la afinidad se mida usando IL-6 humana recombinante como se describe en los ejemplos en la presente. Preferiblemente una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención tiene una afinidad de enlace para IL-6 humana de menos de 500 pM. Preferiblemente una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención tiene una afinidad de enlace para IL-6 humana de menos de 50 pM. Por consiguiente, en una modalidad una molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de enlace de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 500 pM. En una modalidad la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de enlace de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 pM . Preferiblemente la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de enlace para IL-6 humana de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 pM. En una modalidad el anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de enlace para IL-6 humana de entre 8 y 12 pM. Se apreciará que la afinidad de anticuerpos proporcionados por la presente invención se puede alterar usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. La presente invención, por lo tanto, también se refiere a variantes de las moléculas de anticuerpo de la presente invención, las cuales tienen una afinidad mejorada para IL-6 humana. Tales variantes se pueden obtener por un número de protocolos de maduración de afinidad incluyendo mutación de las CDR (Yang et al, J. Mol. Biol, 254, 392-403, 1995), inversión de cadena (Marks et al, Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas mutagénicas de E. coli (Low et al, J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), inversión de ADN (Patten et al, Curr. Opin. Biotechnol., 8_, 724-733, 1997), exhibición de fagos (Thompson et al, J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y PCR sexual (Cramep et al, Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al ( supra ) discute estos métodos de maduración de afinidad. Las moléculas de anticuerpo de la presente invención preferiblemente neutralizan la actividad de IL-6, por ejemplo en los ensayos m vi tro e m vivo descritos en los ejemplos. En una modalidad estos anticuerpos enlazan al sitio 3 de IL-6 humana. En una modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana el cual es capaz de inhibir la actividad de IL-6 humana 0.038 nM por 50% a una concentración de menos de 100 pM, la actividad inhibidora se mide en la profileración inducida por IL-6 de células T1165. En una modalidad la concentración del anticuerpo el cual inhibe IL-6 por 50% es menos de 50 pM, más preferiblemente menos de 20 pM. Preferiblemente la IL-6 humana usada en el ensayo es IL-6 recombinante humana. En una modalidad el anticuerpo neutralizante es un anticuerpo humanizado o completamente humano.

En otra modalidad la presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana el cual es capaz de inhibir la actividad de IL-6 humana 3.84 nM por 50% a una concentración de menos de 1 nM, la actividad inhibidora se mide en la producción de MCP-1 por HUVECs en respuesta a sIL-6R e IL-6 humana. Preferiblemente la IL-6 humana usada en el ensayo es IL-6 recombinante humana. En una modalidad el anticuerpo neutralizante es un anticuerpo humanizado o completamente humano. Si se desea un anticuerpo de acuerdo con la presente invención se puede conjugar a una o más moléculas efectoras. Se apreciará que en una modalidad la molécula efectora puede comprender una molécula efectora única o dos o más moléculas así enlazadas para formar una porción única que se puede unir a los anticuerpos de la presente invención. Donde se desee obtener un fragmento de anticuerpo enlazado a una molécula efectora, este se puede preparar por procedimientos de ADN recombinante o químico estándar en los cuales el fragmento de anticuerpo se enlaza ya sea directamente o vía un agente de acoplamiento a la molécula efectora. Las técnicas para conjugar tales moléculas efectoras a anticuerpos son bien conocidas en la técnica (véase, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 y WO03031581. Alternativamente, donde la molécula efectora es una proteína o polipéptido el enlace se puede lograr usando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo como se describe en WO 86/01533 y EP0392745. El término molécula efectora como se usa en la presente incluye, por ejemplo, agentes anti-neoplásicos, fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, otro anticuerpo o fragmentos de anticuerpo, polímeros sintéticos o que se presentan naturalmente, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, por ejemplo, ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionúclidos, particularmente radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos reporteros tales como compuestos fluorescentes o compuestos los cuales se pueden detectar por espectroscopia ESR o RMN. Los ejemplos de moléculas efectoras pueden incluir citotoxinas o agentes citotóxicos incluyendo cualquier agente que es nocivo a (por ejemplo, mata) células. Los ejemplos incluyen combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maytansinoides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Las moléculas efectoras también incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina) , agentes alquilantes (por ejemplo, mecloroetamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol , estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamin platino (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por ejemplo daunorrubicina (principalmente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (principalmente actinomicina) , bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC) , caliqueamicinas o duocarmicinas) , y agentes anti-mitóticos (por ejemplo vincristina y vinblastina) . Otras moléculas efectoras pueden incluir radionúclidos quelados tales como ulIn y 90Y, Lu177, Bismuto213, Californio252, Iridio192 y Tungsteno188/Renio188; o fármacos tales como pero no limitados a, alquilfosfocolinas, inhibidores I de topoisomerasa, taxoides y suramin.

Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen, pero no se limitan a, enzimas proteolíticas, hidrolasas, liasas, isomerasas, transferasas . Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulinas, toxinas tales como abrina, ricina A, exotoxina pseudomonas, o toxina difteria, una proteína tal como insulina, factor de necrosis cancerígena, a-interferón, ß-interferón, factor de crecimiento de nervios, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador de plasminógeno de tejido, un agente trombótico o un agente anti-angiogénico, por ejemplo angioestatina o endostatina, o, un modificador de respuesta biológica tal como una linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), factor estimulante de colonia de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) , factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF) , factor de crecimiento de nervios (NGF) u otro factor de crecimiento e inmunoglobulinas. Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles, por ejemplo, en diagnóstico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, núclidos radioactivos, metales emisores de positrones (para el uso en tomografía de emisión de positrones), y iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. Véase generalmente Patente de Estados Unidos No. 4,741,900 para iones metálicos los cuales se pueden conjugar a anticuerpos para uso como diagnósticos. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamin fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina; y los núclidos radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, ?nIn y 99Tc. En otro ejemplo las moléculas efectoras pueden incrementar la semivida del anticuerpo in vivo, y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o mejorar el suministro de un anticuerpo a través de una barrera epitelial al sistema inmune. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de enlace de albúmina o compuestos de enlace de albúmina tales como aquellos descritos en WO05/117984 (publicada el 15.12.05). Donde la molécula efectora es un polímero, en general, puede ser un polímero sintético o que se presenta naturalmente, por ejemplo un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituidos o un polisacárido ramificado o no ramificado, por ejemplo un homo- o hetero-polisacárido . Los sustituyentes opcionales particulares los cuales pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados anteriormente incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi. Los ejemplos particulares de polímeros sintéticos incluyen poli (etilenglicol ) , poli (propilenglicol ) , poli ( vinilalcohol) de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituidos o derivados de los mismos, especialmente poli (etilenglicol) opcionalmente sustituido tal como metoxipoli (etilenglicol) o derivados del mismo. Los polímeros que se presentan naturalmente particulares incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glicogen o derivados de los mismos. "Derivados" como se usa en la presente se propone para incluir derivados reactivos, por ejemplo grupos reactivos tiol selectivos tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo se puede enlazar directamente o a través de un segmento de enlazante al polímero. Se apreciará que el residuo de tal grupo, en algunos casos, formará parte del producto como el grupo enlazante entre el fragmento de anticuerpo y el polímero.

El tamaño del polímero se puede variar como se desee, pero generalmente estará en un intervalo de peso molecular promedio desde 500 Da a 50000 Da, preferiblemente desde 5000 a 40000 Da y más preferiblemente desde 20000 a 40000 Da. El tamaño de polímero, en particular, se puede seleccionar sobre la base del uso propuesto del producto, por ejemplo, capacidad para localizar ciertos tejidos tales como tumores o extender la semivida de circulación (para revisión véase Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Por consiguiente, por ejemplo, donde el producto se propone dejar la circulación y penetrar el tejido, por ejemplo para uso en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso usar un polímero de peso molecular menor, por ejemplo con un peso molecular de alrededor de 500 Da. Para aplicaciones donde el producto permanece en la circulación, puede ser ventajoso usar un polímero de peso molecular mayor, por ejemplo que tiene un peso molecular en el intervalo desde 2000 Da a 40000 Da. Los polímeros particularmente preferidos incluyen un polímero de polialquileno, tal como un poli (etilenglicol) o, especialmente, un metoxipoli (etilenglicol ) o un derivado del mismo, y especialmente con un peso molecular en el intervalo desde aproximadamente 15000 Da a aproximadamente 40000 Da. En un ejemplo los anticuerpos para el uso en la presente invención se unen a porciones de poli (etilenglicol) (PEG). En un ejemplo particular el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y las moléculas de PEG se pueden unir a través de cualquier grupo funcional aminoácido terminal o de cadena lateral de aminoácido disponible ubicado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo cualquier grupo amino libre, imino, tiol hidroxilo o carboxilo. Tales aminoácidos pueden presentarse naturalmente en el fragmento de anticuerpo o se pueden modificar en el fragmento usando métodos de ADN recombinantes (véase por ejemplo US 5,219,996; US 5,667,425; W098/2571). En un ejemplo la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento Fab modificado en donde la modificación es la adición al extremo C-terminal de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora. Preferiblemente, los aminoácidos adicionales forman una región de articulación modificada que contiene uno o más residuos de cisteína a los cuales la molécula efectora se puede unir. Se pueden usar múltiples sitios para unir dos o más moléculas de PEG. Preferiblemente las moléculas de PEG son covalentemente enlazadas a través de un grupo tiol de al menos un residuo cisteína ubicado en el fragmento de anticuerpo. Cada molécula de polímero unida al fragmento de anticuerpo modificado se puede enlazar covalentemente al átomo de azufre de un residuo cisteína ubicado en el fragmento. El enlace covalente generalmente será un enlace de disulfuro o, en particular, un enlace de azufre-carbono. Donde un grupo tiol se usa como el punto de unión, se pueden usar moléculas efectoras apropiadamente activadas, por ejemplo derivados de tiol selectivos tales como maleimidas y derivados de cisteína. Se puede usar un polímero activado como el material de partida en la preparación de fragmentos de anticuerpo modificados con polímero como se describió anteriormente. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contiene un grupo reactivo tiol tal como un éster o ácido a-halocarboxílico, por ejemplo yodoacetamida, una imida, por ejemplo maleimida, una vinil sulfona o un disulfuro. Tales materiales de partida se pueden obtener comercialmente (por ejemplo de Nektar, antes Shearwater Polymers Inc., Huntsville, Al, USA) o se pueden preparar de materiales de partida comercialmente disponibles usando procedimientos químicos convencionales. Las moléculas de PEG particulares incluyen 20K metoxi-PEG-amina (obtenible de Nektar, antes Shearwater, Rapp Polymere; and SunBio) y M-PEG-SPA (obtenible de Nektar, antes Shearwater) . En una modalidad, el anticuerpo es un fragmento Fab modificado o diFab el cual es PEGilado, es decir tiene PEG (poli (etilenglicol ) ) covalentemente unido a este, por ejemplo de acuerdo con los métodos descritos en EP 0948544 o EP1090037 [véase también "Poly (ethyleneglycol ) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed) , Plenum Press, New York, "Poly (ethyleneglycol ) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. En un ejemplo el PEG se une a un grupo maleimida covalentemente enlazada a un grupo tiol único en una región de articulación modificada. Un residuo lisina puede ser enlazada covalentemente al grupo maleimida y a cada uno de los grupos amina en el residuo lisina se puede unir un polímero metoxipoli (etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 Da. El peso molecular total del PEG unido al fragmento Fab, por lo tanto, puede ser aproximadamente 40,000 Da. En una modalidad, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana, la cual es un fragmento Fab modificado que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 11 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 13 y que tiene en el extremo C-terminal de su cadena pesada una región de articulación modificada que contiene al menos un residuo cisteína al cual una molécula efectora se une. Preferiblemente la molécula efectora es PEG y se une usando los métodos descritos en (W098/25971 y WO2004072116) por los cuales un grupo lisil-maleimida se une al residuo cisteína en el extremo C-terminal de la cadena pesada, y cada grupo amino del residuo lisil tiene covalentemente enlazado un residuo metoxipoli (etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 Da. El peso molecular total del PEG unido al anticuerpo, por lo tanto es aproximadamente 40,000 Da. En otro ejemplo las moléculas efectoras se pueden unir a fragmentos de anticuerpo usando los métodos descritos en las solicitudes de patente Internacionales WO2005/003169, WO2005/003170 y WO2005/003171. La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislado que codifica las cadena pesada y/o ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. Preferiblemente, la secuencia de ADN codifica la cadena pesada o ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender ADN sintético, por ejemplo producido por procesamiento químico, ADN genómico o cualquier combinación de los mismos. Las secuencias de ADN las cuales codifican una molécula de anticuerpo de la presente invención se pueden obtener por métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, secuencias de ADN que codifican parte o todas las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo se pueden sintetizar como se desee a partir de las secuencias de ADN determinadas o sobre la base de secuencias de aminoácido correspondientes . El ADN que codifica secuencias de estructura aceptoras está ampliamente disponible por aquellos expertos en la técnica y se puede sinterizar fácilmente sobre la base de sus secuencias de aminoácido conocidas. Las técnicas estándar de biología molecular se pueden usar para preparar secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Las secuencias de ADN deseadas se pueden sintetizar completamente o en parte usando técnicas de síntesis de oligonucleótido.

Las técnicas de reacción de cadena de polimerasa (PCR) y mutagénesis dirigida al sitio se pueden usar como apropiadas. Los ejemplos de secuencias de ADN adecuadas se proporcionan en SEC ID NO:l, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 12, SEC ID NO:14, SEC ID NO:15 y SEC ID NO:17. Los nucleótidos 1-57 en la SEC ID NO: 15 y 1-60 en SEC ID NO: 17 codifican la secuencia de péptido señal de anticuerpo de ratón B72.3 (Whittle et al., 1987, Protein Eng. 1(6) 499-505) la cual es escindida para producir una molécula de anticuerpo neutralizante de la presente invención. Por consiguiente, la presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislado que codifica la cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención la cual comprende nucleótidos 58-2008 de la SEC ID NO: 15. La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislado que codifica la cadena ligera de un anticuerpo de la presente invención la cual comprende nucleótidos 61-705 de la SEC ID NO:17. La presente invención también se refiere a un vector de clonación o expresión que comprende una o más secuencias de ADN de la presente invención. Por consiguiente, se proporciona un vector de clonación o expresión que comprende una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invención. Preferiblemente, el vector de clonación o expresión comprende dos secuencias de ADN, que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de la molécula de anticuerpo de la presente invención, respectivamente. Preferiblemente, un vector de acuerdo con la presente invención comprende las secuencias dadas en las SEC ID NOS:15 y 17. Los nucleótidos 1-57 en la SEC ID NO:15 y 1-60 en la SEC ID NO: 17 codifican la secuencia de péptido señal del anticuerpo de ratón B72.3 la cual es más preferiblemente escindida para producir una molécula de anticuerpo neutralizante de la presente invención. Los métodos generales por los cuales los vectores se pueden construir, métodos de transfección y métodos de cultivo son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. A este respecto, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed) , Wiley Interscience, New York y el Maniatis Manual producido por Cold Spring Harbor Publishing. También se proporciona una célula hospedera que comprende uno o más vectores de expresión o clonación que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invención. Cualquier sistema de vector/célula hospedera se puede usar para la expresión de las secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli, y otros microbianos se pueden usar o sistemas de expresión de célula hospedera eucariótica, por ejemplo mamífero, también se pueden usar, véase Verma et al, 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181. Las células hospederas de mamífero adecuadas incluyen células CHO, NSO, mieloma o hibridoma. Los ejemplos de sistemas de expresión adecuados incluyen el sistema de expresión de glutamina sintasa descrio en WO87/04462. La presente invención también proporciona un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención que comprende cultivar una célula hospedera que contiene un vector de la presente invención bajo condiciones adecuadas para conducir a la expresión de proteína de ADN que codifica la molécula de anticuerpo de la presente invención, y aislar la molécula de anticuerpo . La molécula de anticuerpo puede comprender solamente un polipétido de cadena pesada o ligera; en este caso solamente un polipéptido de cadena pesada o cadena ligera que codifica la secuencia necesita ser usado para transfectar las células hospederas. Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, la linea celular se puede transfectar con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Alternativamente, se puede usar un vector único, el vector incluye secuencias que codifican los polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada. Como los anticuerpos de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o profilaxis de una condición patológica, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende una molécula de anticuerpo de la presente invención en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, se proporciona el uso de un anticuerpo de la invención para la manufactura de un medicamento. La composición usualmente será suministrada como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente un adyuvante farmacéuticamente aceptable. La presente invención también proporciona un proceso para la preparación de una composición de diagnóstico o farmacéutica que comprende agregar y mezcla la molécula de anticuerpo de la presente invención conjuntamente con un o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. La molécula de anticuerpo puede ser el ingrediente activo solo en la composición farmacéutica o de diagnóstico o puede estar acompañada por otros ingredientes activos incluyendo otros ingredientes de anticuerpo, por ejemplo anticuerpos anti-TNF, anti-IL-lß, anti-célula T, anti-IFN? o anti-LPS, o ingredientes de no anticuerpo tales como xantinas . Las composiciones farmacéuticas preferiblemente comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la invención. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa en la presente se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, aliviar o prevenir una condición o enfermedad de objetivo, o para exhibir un efecto preventivo o terapéutico detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente ya sea en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, usualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal también se puede usar para determinar el intervalo de concentración apropiado y la ruta de administración. Tal información luego se puede usar para determinar las dosis y rutas útiles para administración en humanos . La cantidad terapéuticamente efectiva precisa para un sujeto humano dependerá de la severidad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, peso y género del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinaciones de fármaco, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad se puede determinar por experimentación de rutina y está dentro del juicio del médico clínico. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva será desde 0.01 mg/kg a 50 mg/kg, preferiblemente 0.1 mg/kg a 20 mg/kg. Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención por dosis. Las composiciones se pueden administrar individualmente a un paciente o se pueden administrar en combinación (por ejemplo, simultáneamente, consecutivamente o separadamente) con otros agentes, fármacos u hormonas. La dosis a la cual la molécula de anticuerpo de la presente invención se administra depende de la naturaleza de la condición a ser tratada, el grado de inflamación presente y de si la molécula de anticuerpo está siendo usada profilácticamente o para tratar una condición existente. La frecuencia de dosis dependerá de la semivida de la molécula de anticuerpo y la duración de su efecto. Si la molécula de anticuerpo tiene una semivida corta (por ejemplo 2 a 10 horas) puede ser necesario dar una o más dosis por día. Alternativamente, si la molécula de anticuerpo tiene una semivida larga (por ejemplo 2 a 15 días o 2 a 30 días) solamente puede ser necesario dar una dosificación una vez por día, una vez por semana o aún una vez cada 1 ó 2 meses. El portador farmacéuticamente aceptable no deberá inducir por si mismo la producción de anticuerpos nocivos al individuo que recibe la composición y no deberá ser tóxico. Los portadores adecuados pueden ser macromoléculas lentamente metabolizadas, grandes tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido y partículas de virus inactivo. Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácido mineral, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfato y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos . Los portadores farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas adicionalmente pueden contener líquidos tal como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias de amortiguamiento de pH, pueden estar presentes en tales composiciones. Tales portadores hacen posible que las composiciones farmacéuticas sean formuladas como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas aguadas y suspensiones, para ingestión por el paciente. Las formas preferidas de administración incluyen formas adecuadas para administración parenteral, por ejemplo inyección o infusión, por ejemplo por inyección de bolo o infusión continua. Donde el producto es para inyección o infusión, puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo acuoso o aceitoso y puede contener agentes formuladores, tales como agentes de suspensión, conservadores, de estabilización y/o dispersión. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca, para reconstitución antes del uso con un líquido estéril apropiado. Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos a ser tratados pueden ser animales. Sin embargo, es preferido que las composiciones sean adaptadas para administración a sujetos humanos. Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar por cualquier número de rutas incluyendo, pero no limitadas a, rutas oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular , intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase WO 98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. Los hipopulverizadores también se pueden usar para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar como inyectables, ya sea. como soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos previo a la inyección . El suministro directo de las composiciones generalmente será realizado por inyección, subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente o intramuscularmente, o se suministra al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en una lesión. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples. Se apreciará que el ingrediente activo en la composición será una molécula de anticuerpo. Como tal, será susceptible a la degradación en el tracto gastrointestinal. Por consiguiente, si la composición será administrada por una ruta usando el tracto gastrointestinal, la composición necesitará contener agentes los cuales protegen el anticuerpo de la degradación pero los cuales liberan el anticuerpo una vez que se ha absorbido del tracto gastrointestinal. Una discusión completa de portadores farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991). También se contempla que el anticuerpo de la presente invención se puede administrar mediante el uso de terapia con genes. Para lograr esto, las secuencias de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera de la molécula de anticuerpo bajo el control de los componentes de ADN apropiados son introducidas en un paciente de modo que las cadenas de anticuerpo se expresan de las secuencias de ADN y se ensamblan in si tu . La presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo para el uso en el control de enfermedades inflamatorias. Preferiblemente, la molécula de anticuerpo se puede usar para reducir el proceso inflamatorio o para prevenir el proceso inflamatorio. También se proporciona una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención para el uso en el tratamiento y/o profilaxis de un trastorno patológico que es mediado por IL-6 o asociado con un nivel incrementado de IL-6. La presente invención adicionalmente proporciona el uso de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención en la manufactura de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de un trastorno patológico que es mediado por IL-6 o asociado con un nivel incrementado de IL-6. Preferiblemente, la condición patológica se selecciona del grupo que consiste de infecciones (virales, bacterianas, fúngicas y parasíticas), choque endotóxico asociado con infección, artritis, artritis reumatoide, artritis psoriática, artritis idiopática juvenil de comienzo sistémico JIA) , lupus eritematoso sistémico (SLE), asma, enfermedad pélvica inflamatoria, Enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome de intestino irritable, enfermedad de Castleman, espondilitis anquilosante, dermatomiositis, uveítis, Enfermedad de Peyronie, adhesiones quirúrgicas, apoplejía, Diabetes Tipo I, artritis de lyme, meningoencefalitis, trastornos inflamatorios inmunomediados del sistema nervioso central y periférico tal como esclerosis múltiple y síndrome de Guillain-Barr , otros trastornos autoinmunes, pancreatitis, trauma (cirugía), enfermedad de injerto contra hospedero, rechazo de transplante, cáncer (tanto tumores sólidos tales como melanomas, hepatoblastomas, sarcomas, carcinomas de célula escamosa, cánceres de célula transicional, cánceres de ovarios como malignidades hematológicas y en particular leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, cáncer gástrico y cáncer de colon) , enfermedad del corazón incluyendo enfermedades isquémicas tal como infarto al miocardio así como ateroesclerosis, coagulación intravascular, resorción ósea, pacientes quemados, osteoporosis, periodontitis e hipocloridia . Preferiblemente el trastorno patológico es artritis reumatoide o lupus eritematoso sistémico (SLE). La presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención para el uso en el tratamiento o profilaxis de dolor. La presente invención adicionalmente proporciona el uso de una molécula de anticuerpo de conformidad con la presente invención en la manufactura de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de dolor. Una molécula de anticuerpo de la presente invención se puede utilizar en cualquier terapia donde se desee reducir los efectos de IL-6 en el cuerpo humano o animal. La IL-6 se puede hacer circular en el cuerpo o puede estar presente en un nivel indeseablemente alto localizado en un sitio particular en el cuerpo, por ejemplo un sitio de inflamación. Una molécula de anticuerpo de la presente invención preferiblemente se usa para el control de enfermedad inflamatoria . La presente invención también proporciona un método para tratar sujetos humanos o animales que sufren o están en riesgo de un trastorno mediado por IL-6, el método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de la molécula de anticuerpo de la presente invención. La molécula de anticuerpo de la presente invención también se puede usar en el diagnóstico, por ejemplo en el diagnóstico in vivo y formación de imagen de estados de enfermedad que involucran IL-6. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención adicionalmente se describe por vía de ilustración solamente en los siguientes ejemplos, los cuales se refieren a las figuras acompañantes, en las cuales: Las figuras la-Ib muestran el diseño de injerto para las secuencias de cadena pesada (figura 2a, SEC ID NO:ll) y cadena ligera (figura 2b; SEC ID NO:13) 240. gl. El símbolo ( | ) realza las diferencias entre las secuencias de estructura de donante : aceptor : inj ertada . Las CDR son subrayadas únicas. Existen como se define por kabat, excepto para CDR-Hl la cual abarca tanto definiciones de Kabat como Chothia. Las secuencias subrayadas doble son residuos de estructura de donante retenidos en los injertos. La figura 2a muestra la secuencia traducida de cadena pesada de IgG4 240. gl, que muestra los límites de intrón/exón . La figura 2b muestra la secuencia traducida de cadena ligera 240. gl, que muestra los límites de intrón/exón. La figura 3a muestra la inhibición de proliferación inducida por IL-6 recombinante humana, derivada de mamífero humano, rhesus, cinomolga y de ratón de células T1165 por el anticuerpo 240. gl. La figura 3b muestra la inhibición de la producción de MCP-1 inducida por sIL-6R e IL-6 recombinante humana en HUVECs por el anticuerpo 240. gl. La figura 3c muestra la inhibición de la producción de MCP-1 inducida por sIL-6R e IL-6 endógena inducida por IL- 17 en HUVECs por el anticuerpo 240. gl. La figura 4. Neutralización in vivo de SAA inducida por hIL-6 en ratones mediante la administración de CA030_240.gl (anticuerpo sitio 3) n=7-8/grupo, excepto PBS n=6. El análisis estadístico por ANOVA con prueba posterior Bonferroni, ** P<0.01 comparado con IL-6 sola. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Métodos generales y manipula ciones de ADN La cepa E . coli INVaF (Invitrogen) se utilizó para transformación y crecimiento de cultivo de rutina. Las enzimas de modificación y restricción de ADN se obtuvieron de Roche Diagnostics Ltd. y New England Biolabs. Las preparaciones de plásmido se realizaron usando kits de purificación de Maxi Plasmid (QIAGEN, catálogo No. 12165). Las reacciones de secuencias de ADN se realizaron usando el kit de secuenciación por terminador ABI Prism Big Dye (catálogo No. 4304149) y se portaron en un secuenciador automatizado ABI 3100 (Applied Biosystems). Los datos se analizaron usando el programa AutoAssembler (Applied Biosystems). Los oligonucleótidos se obtuvieron de INVITROGEN. Los genes sintéticos se construyeron en Entelechon. La concentración de Fab e IgG se determinó usando montaje ELISA.

Ejemplo 1: Aislamiento de 132E09 Se inmunizaron ratas por inyección cutánea de IL-6 humana recombinante (Peprotech) a tres intervalos semanales, inicialmente con Adyuvante Completo de Freund y posteriormente con Adyuvante Incompleto de Freund. Se recolectaron los bazos dos semanas después de la última inmunización, y se prepararon las suspensiones de célula única. Se cultivaron los linfocitos de rata inmune en la presencia de células EL4 de timoma de ratón irradiadas y medios acondicionados con célula T de conejo por una semana en placas de microtitulación de 96 cavidades. Los sobrenadantes se tamizaron para la presencia de anticuerpos específicos para IL-6 humana en ELISA. Los positivos se tamizaron adicionalmente para la capacidad de neutralizar los efectos biológicos de IL-6 humana en un ensayo de línea celular DSl (Bock et al., 1993, Cytokine, 5, 480-489). Las células B individuales que secretan anticuerpo con características de enlaza apropiadas se aislaron de cavidades de microtitulación positivas de acuerdo con el Método de Anticuerpo y Linfocito Seleccionado (Babcook et al., 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93, 7843-7848; WO92/02551); y los genes de región variable de cadena pesada y ligera se clonaron vía PCR de transcripción inversa de células B de rata únicas. Las regiones variables se expresaron en formato de IgG recombinante para confirmar el enlace, y el anticuerpo 132E09 se seleccionó para humanización y estudio adicional. La secuencia de región variable de rata se registró como CA030_00240. Las secuencias de región V se muestran en las SEC ID NOS: 1 a 4.

Ejemplo 2: Injerto de CDR de 132E09 Se diseñaron una serie de regiones VL y VH humanizadas en las cuales las regiones hipervariables CDR más un número variado de residuos de estructura de 132E09 se injertaron sobre estructuras aceptoras de región V humana. Diez regiones VL injertadas (gLl-10) se diseñaron y los genes se construyeron por montaje de oligonucleótido y mutagénesis de PCR. Un total de 13 regiones VH injertadas también se construyeron (gHl-13) usando dos regiones de estructura diferentes, VH3 1-4 3-72 y VH3 1-3 3-21. La secuencias injertadas de cadena ligera se sub-clonaron en el vector de expresión de cadena ligera humana pkHlO.l el cual contiene el ADN que codifica la región constante C-Kappa humana (alotipo Km3 ) . Las secuencias injertadas de cadena pesada se sub-clonaron en el vector de expresión gamma-4 humano p Vhg4P FL, el cual contiene el ADN que codifica la región constante gamma-4 humana que contiene la mutación de estabilización de articulación S241P (Angal et al., supra). Los plásmidos se co-transfectaron en células CHO y los anticuerpos producidos se tamizaron para actividad en ensayos in vivo y enlace de IL-6. Las transfecciones de células CHO se realizaron usando el procedimiento Lipofectamine™ 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (InVitrogen, catálogo No. 11668) . De los 13 injertos de cadena pesada producidos, dos contuvieron solamente un residuo donante de estructura única (Ala) en la posición 49 y estos se produjeron usando las dos diferentes estructuras de cadena pesada. El injerto VH3 1-3 3-21 se expresó pobremente en células CHO y mostró una afinidad reducida para IL-6. En contraste, el injerto usando la estructura VH3 1-4 3-72 se expresó bien y retuvo la afinidad del anticuerpo donante. Este injerto de cadena pesada, que comprende solamente un residuo de estructura donante único, se seleccionó en combinación con el injerto de cadena ligera gLIO en el cual solamente las CDR fueron transferidas . Las figuras la-Ib muestran una alineación entre la secuencia de rata donante 132E09 y las estructuras humanas aceptoras. La estructura aceptora de cadena pesada es la secuencia de línea germinal humana VH3 1-3 3-72, con la estructura 4 llegando a ser de esta porción de la línea germinal de región JH humana JH4. La estructura aceptora de cadena ligera es la secuencia de línea germinal humana VK1 2-1-(1) 012, con la estructura 4 llegando a ser de esta porción de la línea germinal de región JK humana JK2. Las secuencias de injerto para gH13 y gLIO se muestran en las figuras la-Ib (SEC ID NOS: 11, 12, 13 y 14). Este anticuerpo injertado se llamó CA030_00240. gl . Este se produjo como una IgG4 completa que comprende la sustitución de serina a prolina en la posición 241 como se describió anteriormente. Las secuencias de cadena pesada y ligera traducidas completas se muestran en las figuras 2a y 2b respectivamente. La secuencia de aminoácido completa de la cadena pesada se proporciona en la SEC ID NO: 16 y la cadena ligera en la SEC ID NO: 18. Las secuencias de ADN que codifican la cadena pesada y ligera se proporcionan en las SEC ID NOs: 15 y 17 respectivamente. Los nucleótidos 1-57 en la SEC ID NO: 15 y en la figura 2a codifican las secuencias de péptido señal de anticuerpo de ratón B72.3 VH y los nucleótidos 1-60 en la SEC ID NO: 17 y en la figura 2b codifican las secuencias de péptido señal de anticuerpo de ratón B72.3 VL . El anticuerpo de ratón B72.3 se describe en Whittle et al., 1987, Protein Eng. 1(6) 499-505.

Ejemplo 3: Afinidad de enlace Medi ciones de afinidad de enlace de CA030_00240. gl La tecnología BIAcore monitoreó el enlace entre las biomoléculas en tiempo real y sin el requerimiento de etiquetado. Uno de los interactores, llamado el ligando, es ya sea inmovilizado directamente o capturado en la superficie inmovilizada mientras el otro, llamado el analito, fluye en solución sobre la superficie capturada. El sensor detecta el cambio de masa en la superficie del sensor cuando el analito enlaza el ligando para formar un complejo en la superficie. Esto corresponde al proceso de asociación. El proceso de disociación se monitoreó cuando el analito se reemplazó por amortiguador. En el ensayo de afinidad BIAcore, el ligando es IgG completa de CA030_00240. gl y el analito es IL-6 humana.

Instrumento Biacore® 3000, Biacore AB, Uppsala, Suecia.

Chip de sensor CM5 (grado investigación) Número de Catálogo: BR-1001-14, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Los chips se almacenaron a 4°C.

Solución de BIAnormalización 70% (p/p) Glicerol. Parte de Kit de BIAmantenimiento Número de Catálogo: BR-1002-51, Biacore AB, Uppsala, Suecia. El kit de BIAmantenimiento se almacenó a 4°C.

Kit de Acopamiento de Amina Número de Catálogo: BR-1000-50, Biacore AB, Uppsala, Suecia.

Clorhidrato de etil-3- ( 3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) . Elaborado hasta 75 mg/ml en agua destilada y almacenado en alícuotas de 200 µl a -70°C.

N-Hidroxisuccinimida (NHS). Elaborada hasta 11.5 mg/ml en agua destilada y almacenada en alícuotas de 200 µl a -70°C.

Clorhidrato de etanolamina 1M - NaOH pH 8.5. Almacenado en alícuotas de 200 µl a -70°C.

Amortiguadores Amortiguador de corrida: HBS-EP (siendo HEPES 0.01 M pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, 0.005% Tensioactivo P20). Número de catálogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Amortiguador almacenado a 4°C.

Amortiguador de inmovilización: Acetato 5.0 (siendo acetato de sodio 10 mM pH 5.0). Número de catálogo: BR-1003-51, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Amortiguador almacenado a 4°C.

Captura de ligando IL-6 humana recombinante (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxon. Número de catálogo 206-IL-050, Número de lote A131402A) almacenada a -70CC y disuelta una vez para cada ensayo.

La IL-6 de mono cinomóloga recombinante e IL-6 de mono Rhesus recombinante se produjeron por transfección temporal de células CHO. El material se utilizó como sobrenadante de cultivo celular no purificado y no cuantificado.

Solución de Regeneración Se preparó HCl 40 mM por dilución con agua destilada de una solución madre 11.6 M (BDH, Poole, Inglaterra. Número de catálogo: 101254H) . Se preparó NaOH 5 mM por dilución con agua destilada de una solución madre 50 m . Número de catálogo: BR-1003-58; Biacore AB, Uppsala, Suecia.

Método de Ensayo Se realizó BIA (Análisis de Interacción Biomolecular) usando BIAcore 3000 (BIAcore AB) . IgG anti-humana de cabra de Fragmento F(ab')2 Affinipure, específico de fragmento Fe (Jackson ImmunoResearch) se inmovilizó en un Chip de Sensor CM5 vía química de acoplamiento de amina a un nivel de captura de «5000 unidades de respuesta (RUs) .

Amortiguador HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, 0.005% Tensioactivo P20, BIAcore AB) se utilizó como el amortiguador de corrida con una velocidad de flujo de 10 µl/min. Una inyección de 10 µl de CA030_240.gl a 4 µg/ml se utilizó para captura por la IgG-Fc anti-humana inmovilizada.

La IL-6 humana se tituló sobre el CA030_240.gl capturado a varias concentraciones a una velocidad de flujo de 30 µl/min.

La superficie se regeneró por una inyección de 10 µl de HCl 40 mM, seguida por una inyección de 5 µl de NaOH 5 mM a una velocidad de flujo de 10 µl/min. Las curvas de enlace de sustracción antecedente se analizaron usando el software de BIAevaluación (versión 3.2) siguiendo procedimientos estándar. Los parámetros cinéticos se determinaron del algoritmo de ajuste. Un lote de CA030_240.gl se utilizó en este estudio.

La afinidad se midió a concentraciones de IL-6 humana a o por debajo de 20 nM. El valor de afinidad determinado para CA030_240.gl estuvo en el intervalo de 9.02-10.50 pM con un promedio ± s.e.m. de 9.76 ± 0.74 pM (Tabla 1.1). No fue posible medir la afinidad con la IL-6 humana inmovilizada en el chip BIAcore cuando la inmovilización de la IL-6 resultó en una pérdida de conformación nativa. Debido a que no fue posible cuantificar la IL-6 de mono Cinomólogo o mono Rhesus también no fue posible determinar los parámetros cinéticos verdaderos para su interacción con CA030_00240. gl . Sin embargo, la inspección visual de los sensogramas de enlace indica que el CA030_00240. gl enlaza estas IL-6 primates no humanas con una afinidad similar a aquella para IL-6 humana.

TABLA 1.1: Afinidad de CA030_240.gl para IL-6 humana Ejemplo 5: Ensayos de neutralización in vitro La potencia del anticuerpo CA030 00240. gl, de aquí en adelante abreviado 240. gl, se determinó usando dos diferentes ensayos. El primer ensayo empleó una línea celular dependiente de IL-6 de ratón, llamada T1165, que prolifera en respuesta a la IL-6 de ratón, rhesus, cinómolga y humana.

Esta señalización directa de IL-6 al receptor IL-6 de superficie celular, en conjunto con una sub-unidad 'de receptor de señalización llamada gpl30, se llamó cis-señalización . El segundo ensayo utilizó células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) estimuladas con IL-6 más receptor de IL-6 soluble (IL-6) con la lectura siendo la producción de proteína-1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1) . En este ensayo la IL-6 ya sea se agregó exógenamente o podrá ser producida mediante estimulación de HUVECs con la citocina interleucina-17 (IL-17) . Estas dos variantes de ensayo se llamaron trans-señalización cuando HUVECs no expresan IL-6R y solamente pueden responde, es decir, producen MCP-1 cuando IL-6 e IL-6R soluble son ambos agregados exógenamente. Usando estos diversos ensayos fue posible generar valores ND50 (50% de dosis de neutralización) para 240. gl contra IL-6 humana (recombinante y natural), rhesus, cinómolga y de ratón.

Ma teriales Medio de cultivo Medio de cultivo T1165 - RPM11640, suplementado con suero bovino fetal 10%, penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (50 µg/ml), glutamina (2 mM) e IL-6 recombinante humana, R&D systems, UK.

Medio de cultivo HUVEC - medio basal de célula de endotelio de recipiente grande (LVECBM) TCS Cellworks, UK, suplemento de crecimiento de célula endotelial de recipiente grande TCS Cellworks, UK y suplemento antibiótico TCS Cellworks, UK. CA 030 00240. gl producido internamente a una concentración de 6.83 mg/ml en PBS. IL-6 humana R&D systems, UK, IL-6 derivada de mamífero humano (derivada internamente de transfección de CHO con IL-6 humana 10017108/67), IL-6 rhesus (derivada internamente de transfección de CHO con IL-6 rhesus 10017108/67), IL-6 cinómolga (derivada internamente de transfección de CHO con IL-6 cinómolga 10017108/67), IL-6 de ratón R&D systems, UK. Anticuerpo de captura de MCP-1 antihumano (555055) y anticuerpo de detección de MCP-1 antihumano (554664) y MCP-1 recombinante humano (890225), BD Biosciences, CA. Estreptavidina-HRP (AMDEX) Amersham bioscience, UK. Trombina Merck Biosciences, Darmstadt, Alemania. sIL-6R R&D systems, UK. IL-17 humana R&D systems, UK.

Ensayo de T1165 - CellTiter 96® AQueous Promega, CA.

TM Blue (Serologicals, GA) Medición de la actividad de 240. gl usando la proliferación dependiente de IL-6 de células T1165. Las células T1165 se descongelaron 4 días previo al uso y se cultivaron en RPMI1640 suplementado con FCS al 10%, antibióticos, glutamina y 10 ng/ml de IL-6 humana. La viabilidad de célula se monitoreó usando exclusión de azul de tripano, solamente se utilizaron las células que parecieron ser al menos 90% viables. Previo al uso las células se lavaron, dos veces, en RPMI1640 en la ausencia de IL-6 humana. Las células luego se contaron y distribuyeron en placas de fondo plano de 96 cavidades a una densidad de 5xl?Vcélula por cavidad. En placas separadas una dilución en serie de 240. gl se incubó en la presencia ya sea de IL-6 recombinante humana, derivada de mamífero humano (también referida como IL-6 de CHO humana), rhesus, cinómolga o de ratón a una concentración fija de 1 ng/ml (0.038 nM) . El complejo pre-mezclado de 240. gl e IL-6 luego se transfirió a cavidades que contienen células T1165 las cuales fueron incubadas por 48 horas a 37°C en una atmósfera de C02 al 5% humidificada. Durante las últimas seis horas de incubación se agregaron 20 ml de Celltiter 96® AQueous para determinar el número de células de proliferación. La inhibición de la proliferación dependiente de IL-6 de células T1165 por 240. gl se expresó como un porcentaje de inhibición de cavidades tratadas con IL-6 sola menos cavidades de control que contuvieron células pero no IL-6. La actividad de 240. gl contra IL-6 recombinante humana, derivada de mamífero humano, rhesus, cinómolga y de ratón que indujo la proliferación de la línea celular T1165 se puede ver en la figura 3a. 240. gl potencialmente inhibió la actividad de IL-6 recombinante humana, derivada de mamífero humano, rhesus, cinómolga pero no de ratón. El ND50 para IL-6 recombinante humana fue 1.1 ± 0.5 ng/ml (7.26 ± 3.3 pM) . El ND50 para IL-6 derivada de mamífero humano de fue 3.6 ± 2.4 ng/ml (23.76 ± 15.84 pM) . El ND50 para IL-6 rhesus fue 2.2 ± 1.1 ng/ml (14.52 ± 7.26 pM) . El ND50 para IL-6 cinómolga fue 5.4 ± 1.1 ng/ml (35.64 ± 7.26 pM) .

Medición de actividad de 2401. gl usando producción de MCP-1 inducida por receptor IL-6 soluble e IL-6 en HUVECs . HUVECs (TCS Cellworks, UK) crecieron en medio basal de células de endotelio de recipiente grande (LVECBM) y se hicieron pasar en cultivo no más de cinco veces. Las células crecieron hasta 75% de confluencia antes del uso. Las células se separaron usando tripsina/EDTA, se volvieron a suspender y se lavaron una vez en LVECBM fresco. Las células luego se contaron y se distribuyeron en placas de fondo plano de 96 cavidades a una densidad de 2xl04/células por cavidad. Las células luego se cultivaron durante la noche a 37°C en una atmósfera de C02 al 5% humidificada. Al siguiente día las células se lavaron en medio fresco complementado con trombina biotinilada (3U/ml), y se pusieron a un lado. En placas separadas se incubó una dilución en serie de 240. gl en la presencia de IL-6 recombinante humana (50 ng/ml; 3.84nM) y SIL-6R a una concentración fija de 500 ng/ml (10.15 nM) . Además 240. gl también se incubó con IL-17 recombinante humana (25 ng/ml; 1.18 nM) , lo cual estimula HUVECs para producir IL-6, y sIL-6R a una concentración fija de 500 ng/ml (10.15 nM) . El complejo pre-mezclado de 240. gl e IL-6/sIL-6R o IL-17/sIL-6R luego se transfirió a cavidades que contienen HUVECs los cuales se incubaron por 24 horas a 37 °C en una atmósfera de C02 al 5% humidificada. Después del periodo de incubación el sobrenadante libre de células se colectó y los niveles de MCP-1 humano se determinaron por ELISA intercalada (protocolo dado posteriormente). La inhibición de la producción de MCP-1 inducida por IL-6/sIL-6R o IL-17/sIL-6R por 240. gl se expresó como un porcentaje de inhibición de cavidades tratadas con IL-6/sIL-6R o IL-17/sIL-6R menos cavidades de control que contienen células pero sin estímulo. Además los controles se adicionaron para indicar la respuesta de las células a la adición de IL-6 humana en la ausencia de SIL-6R.

ELISA de MCP-1 Las placas Nunc Maxisorp se revistieron con anticuerpo de captura anti-MCP-1 a una concentración de 2 µg/ml. Las placas se incubaron a +4°C durante la noche luego se lavaron dos veces en PBS más 0.1% de tween20 (amortiguador de lavado) . Las placas se bloquearon por 1 hora en PBS más 5% de albúmina de suero bovino. Las placas luego se lavaron cuatro veces con amortiguador de lavado y estándares y muestras adicionadas. Las placas se incubaron por dos horas a temperatura ambiente. Las placas luego se lavaron y el anticuerpo anti-MCP-1 biotinilado se adicionó a una concentración de 1 mg/ml. Las placas se incubaron por unas 2 horas adicionales luego se lavaron cuatro veces. Una dilución de 1:5000 de estreptavidina-HRP luego se adicionó y las placas se incubaron por 30 minutos. Las placas se lavaron cuatro veces al final y se adicionó sustrato de TMB . Las lecturas colorimétricas se tomaron a 630nm y las lecturas de fondo a 492nm. Las concentraciones de MCP-1 se derivaron, de una curva estándar usando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros, en software Génesis II. La actividad de 240. gl contra trans-señalización inducido por SIL-6R e IL-6 recombinante humana en HUVECs se puede ver en la Figura 3b. 240. gl potencialmente inhibió la producción de MCP-1 inducida por sIL-6R e IL-6 recombinante humana por HUVECs. El ND50 fue 64 ± 62 ng/ml (422 ± 409 pM) . La actividad de 240. gl contra trans-señalización inducida por SIL-6R e IL-6 endógena inducida por IL-17 en HUVECs se puede ver en la Figura 3c. 240. gl potencialmente inhibió la producción de MCP-1 inducida por SIL-6R e IL-6 endógena inducida por IL-17 por HUVECs. El ND50 fue 93 ± 70 ng/ml (614 ± 462 pM) .

Conclusión 240. gl es capaz de neutralizar la bioactividad de IL-6, recombinante humana, derivada de mamífero humano, rhesus y cinómolga pero no de ratón en un ensayo de cis-señalización de IL-6. Además 240. gl puede neutralizar la trans-señalización de IL-6 inducida ya sea por IL-6 recombinante o endógena.

Ejemplo 6: En actividad in vivo La IL-6 es conocida por inducir proteínas de fase aguda. En ratones la proteína de fase aguda más prominente es amiloide A de suero (SAA) . La IL-6 humana es capaz de actuar sobre el receptor de ratón de modo que es posible inyectar IL-6 humana en ratones y medir la producción de SAA en el suero . Ratones Balb/c se inyectaron s.c. con anticuerpo anti-hIL-6 específico de sitio 3, IgG4 completa de CA030_240. gl . 24 horas más tarde, los ratones se inyectaron i.p. con hIL-6 a 30 µg/kg (Peprotech, número de catálogo 200-06, número de lote 0203B16) . Después de 20 horas la sangre se tomó por punción cardiaca y se colectó suero para la valoración de amiloide A de suero (SAA) por ELISA (Tridelta, número de lote 22KT022). Como se señaló en la Figura 4, la inducción de SAA por hIL-6 se inhibió por CA030_240.gl con reducción estadísticamente significante de SAA que se nota a dosis de 0.3, 0.1 y 0.03 mg/kg. n = 7-8/grupo, excepto PBS n=6. Análisis estadístico por ANOVA con prueba posterior de Bonferroni,** P<0.01 comparado con IL-6 sola. 2 experimentos adicionales confirmaron la inhibición significativa de SAA inducida por IL-6 (30 ug/kg) por CA030_240.gl a dosis de 0.3 y 0.1 mg/kg.

Ejemplo 7: Mapeo de Epitope CA030 00240.gl El epítope en IL-6 humana que CA030_00240. gl reconoce se mapeó usando tecnología de RMN usando 240. gl como un fragmento Fab' . Esto requirió que la IL-6 humana fuera expresada en E. coli y se etiquetó uniformemente con isótopos estables 15N/13C/2H. Las asignaciones de resonancia de estructura específica de secuencia completa se obtuvieron para IL-6 libre y los cambios en la posición de estas señales inducidas por el enlace del fragmento Fab' de CA030_00240. gl se detectaron usando un espectro 3D TROSY HNCO.

Expresión y purifi ca ción de IL- 6 humana recombinan te : La IL-6 humana se preparó a partir de un vector de expresión E. coli (pET3d) que contiene la secuencia de codificación de la forma madura de la proteína. La proteína se expresó en células Tuner (DE3) pLysS, resultando en altos rendimientos de un producto insoluble. Las muestras etiquetadas con 15N, 15N/13C y 15N/13C/2H de IL-6 fueron preparadas a partir de células crecidas en medios ricos apropiadamente etiquetados (Celtone). La IL-6 se purificó a partir de células E. coli transformadas usando procedimientos bien establecidos. Inícialmente, las células recolectadas a partir de 1 1 de medios de cultivo se volvieron a suspender en 40 ml de amortiguador A [KCl 100 mM, DTT 2 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8.5, 25% (p/v) sucrosa, tableta de inhibidor de proteasa disuelta (Boehringer) ] . 10 ml de amortiguador B [Tris-HCl 300 mM pH 8.5, EDTA 100 mM, 4 mg/ml lisozima] se adicionaron y la suspensión se incubó en hielo por 10-30 minutos con turbulencia ocasional. 50 ml de amortiguador C [LiCl 1 M, EDTA 20 mM, 0.5% (v/v) NP-40] luego se adicionaron y la suspensión se realizó a través de la Prensa Francesa dos veces a 20,000 psi. El homogeneizado luego se centrifugó a 16,000 g rpm por 15 minutos a 4°C y la pelotilla se retuvo. La pelotilla se volvió a suspender en 40 ml de amortiguador D [Tris-HCl 10 mM pH 8.5, EDTA 0.1 mM, LiCl 0.5 M, 0.5% (v/v) NP-40, DTT 1 mM, tableta de proteasa disuelta] y se realizó en la Prensa Francesa y se centrifugó como anteriormente. Esta etapa se repitió. La pelotilla luego se volvió a suspender en 40 ml de amortiguador E [Tris-HCl 10 mM pH 8.5, EDTA 0.1 mM, 0.5% (v/v) NP-40, DTT 1 mM, tableta de proteasa disuelta] y se realizó en Prensa Francesa y se centrifugó como antes. Esta etapa se repitió. La pelotilla final se disolvió en 6 ml GuHCl 6M, Tris-HCl 50 mM pH 8.0 y se clarificó por centrifugación a 48,000 g por 30 minutos a 4°C. El sobrenadante se retuvo y la IL-6 solubilizada se cuantificó espectrofotométricamente . La IL-6 solubilizada se diluyó a 2.5 mg/ml en GuHCl 5M, NaCl 50mM, Tris-HCl 50 mM, GSH 2 mM, GSSG 0.2 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0 y se incubó a 25°C por 1 hora. Luego, las muestras se diluyeron adicionalmente, en una manera de goteo a 250 µg/ml en NaCl 50 mM, Tris-HCl 50 mM, GSH 2 mM, GSSG 0.2 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0 y se incubaron a 25°C por 3 horas. Cualquier precipitado formado en esta etapa se removió por centrifugación a 30,000 g por 30 minutos a 4°C. El material clarificado se dializó contra Tris-HCl 50 mM, 10% (v/v) glicerol, pH 9.0 por un mínimo de 16 horas a 4°C con dos cambios de amortiguador. Después de la diálisis la solución se clarificó por centrifugación a 30,000 g por 30 minutos a 4°C. El sobrenadante se retuvo y se cargó en una columna de intercambio iónico monoQ (Amersham Biosciences) de 8 ml y se eluyó con un gradiente lineal de cloruro de sodio (0-1.0 M) . Las fracciones que contienen la IL-6 replegada se identificaron por SDS-PAGE y luego se agruparon y se diafiltraron en fosfato de sodio 25 mM, NaCl 100 mM, 0.01% (p/v) NaN3, pH 6.5. El fragmento Fab' de CA030_00240. gl se generó, se purificó y se formuló en fosfato de sodio 25 mM, NaCl 100 mM, 0.01% (p/v) NaN3, pH 6.5. Los complejos 1:1 entre IL-6 y el fragmento Fab' de CA030_00240. gl se preparó por análisis de RMN mezclando cantidades equimolares de las proteínas a una concentración de aproximadamente 0.2 - 0.6 mM.

Espectroscopia de RMN: Los experimentos por RMN se realizaron en muestras de 0.35 ml de las proteínas y complejos en un fosfato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 100 mM y 0.01% (p/v) de amortiguador de azida de sodio a pH 6.5 (95% H20 y 5% de D20) . EL complejo 1:1 entre IL-6 etiquetada con 15N/13C/2H y el fragmento Fab' no etiquetado de CA030_00240. gl se preparó por análisis de RMN mezclando cantidades equimolares de las proteínas para lograr una concentración final de 0.1 mM. Los datos de RMN se adquirieron a 25°C por IL-6 libre y para el fragmento IL-6:Fab' de complejo CA030_00240. gl en un espectrómetro Bruker Avance de 800 MHz equipado con una criosonda de triple resonancia (15N/13C/H). Los espectros de HNCACB, CBCA(C0)NH y HNCO estándar (Wittekind, M., and Mueller, L. (1993) J Magn Reson , Series B 101(2), 201; Grzesiek, S., and Bax, A. (1993) J Biomol NMR 3 (2) , 185-204; Muhandiram, D.R. and Kay, L. E. (1994) J Magn Reson , Series B 103(3), 203; Grzesiek, S., and Bax, A. (1992) J Magn Reson 96(2), 432) se usaron para hacer asignaciones de resonancia de esqueleto de secuencia específica completas (15N, 13C y XH) para IL-6 libre usando una muestra uniformemente etiquetada con 15N/13C 0.9 mM. Los cambios en las posiciones de señales de esqueleto de IL-6 inducidas por fragmento Fab' de enlace de CA030_00240.gl se detectaron usando un espectro 3D TROSY HNCO (Salzmann, M. et al., (1998) Proc Na ti Acad Sci USA 95(23), 13585-13590) . Los parámetros de adquisición típicos para todos los experimentos de RMN 3D se proporcionan en la tabla 1. Todos los espectros se procesaron usando NMRPipe (Delaglio, F. et al., (1995) J Biomol NMR 6(3), 277-293), con predicción lineal usada para extender el tiempo de adquisición efectivo en la dimensión 15N de datos 3D a aproximadamente 30 ms . El mejoramiento de resolución media se aplicó en todas las dimensiones usando una función de seno cuadrado desplazado. El análisis de los espectros se realizó usando Sparky (Goddard, T.D., and Kneller, D.G. SPARKY 3. In., Universidad de California, San Francisco).

Análisis de da tos de enlace de Fab : El procedimiento de desplazamiento mínimo (Farmer, B.T. et al., (1996) Na t Struct Mol Biol 3(12), 995; Muskett, F.W. et al (1998) J Bi ol Chem 273(34), 21736-21743) se utilizó para determinar los cambios en las posiciones de señales de RMN de IL-6 resultantes del fragmento Fab' de enlace de CA030_00240. gl . Inicialmente, todos los picos en el espectro HNCO 3D de IL-6 libre y espectro TROSY"HNCO 3D de IL-6 unida a gl32E09 Fab se escogieron en sus centros. Los valores de desplazamiento químicos de 15N y 1H de resonancias de esqueleto se corrigieron para la diferencia de temperatura entre espectros del complejo y proteína libre (-0.8 ppm para 15N y -0.05 ppm para 1ti) (Baxter, N. J. , and Williamson, M. P. (1997) J Biomol NMR 9(4), 359-369). El cambio mínimo en posición para picos entre IL-6 enlazada a Fab y libre se obtuvo usando Microsoft Excel para calcular la diferencia de desplazamiento químico combinado en 15N, 13C y 1ti para cada pico asignado en el espectro HNCO de la proteína libre comparada con todos los picos observados en el espectro TROSY-HNCO de complejo Fab. Las diferencias de desplazamiento químico combinadas de protón de amida, nitrógeno y carbono (?d) se definieron de acuerdo con la siguiente ecuación (Ecuación 1), donde ?dHN ?dN y ?dc corresponden a las diferencias de desplazamientos de 1 , 15N y 13C entre pares de picos de HNCO comparados y aN y ac son factores de escala de 0.2 y 0.33 requeridos para contar diferencias en el intervalo de desplazamientos químicos de protón de amida, nitrógeno de amida y carbono. Para cada pico de HNCO individual, el desplazamiento mínimo inducido por enlace Fab se tomó como el valor de desplazamiento (?d) combinado más bajo posible. ?<S = iAd + ÍAdN-a + {Adccccf < Ec - x > Para identificar los sitios de enlace de Fab (epítopes) en IL-6, un histograma de desplazamiento mínimo combinado contra secuencia de proteína se utilizó para revelar las regiones de IL-6 que contienen señales significativamente perturbadas. Si el tamaño del cambio de desplazamiento químico combinado para aminoácidos individuales excedió un valor de umbral del promedio del cambio de desplazamiento químico combinado para todos los aminoácidos más una desviación estándar de este promedio, estos residuos se seleccionaron para evaluación adicional como posibles residuos de contacto en el sitio de enlace de Fab. Las ubicaciones de los residuos de sitio de enlace candidatos se examinaron finalmente en la estructura de alta resolución de IL-6 (Xu, G. Y. et al, (1997) J Mol Biol 268(2), 468-481) y solamente los residuos posicionados en la superficie celular se consideraron que están disponibles para enlace de Fab. Se aplicaron dos diferentes umbrales para identificar los residuos unidos por el Fab, el desplazamiento mínimo promedio + 1SD (0.143) y el desplazamiento mínimo promedio + 2SD (0.213). El sitio de enlace del anticuerpo se encontró que abarca el residuo de marca de sitio 3 crítico de Trp 157 (Boulanger et al, 2003, Science, 300, 2101-2104) . Usando la numeración de aminoácido usada en Boulanger et al., s upra se encontró que el anticuerpo 240g.l enlaza al menos los siguientes residuos (promedio +2SD (0.213)) S47, C50, E93, R104, F105, E106, T149, K150, A153, Q156, Q159 y S169. El anticuerpo puede enlazar todos los siguientes residuos (promedio +1SD (0.143)) C44, S47, C50, S53, A58, E93, V96, R104, F105, E106, T149, K150, Q152, A153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, T163, L165, S169 y E172. Se apreciará que los mismos residuos también se pueden numerar basado en la numeración de aminoácido del precursor no procesado de IL-6 (número de acceso Swiss Prot P05231) . Usando esta numeración el anticuerpo 240g.l enlaza al menos los siguientes residuos S75, C78, E121, R132, F133, E134, T177, K178, A181, Q182, Q187 y S197. El anticuerpo puede enlazar todos los siguientes residuos C72, S75, C78, S81, A86, E121, V124, R132, F133, E134, T177, K178, Q180, A181, Q182, N183, Q184, W185, Q187, T191, L193, S197 y E200.

Tabla 1: Parámetros básicos de experimentos de RMN, La dimensión 1H directa (F3 o F2) se adquirió con una anchura de barrido de 14 ppm y tiempo de adquisición de 85 ms. Desde luego se entenderá que la presente invención se ha descrito por vía de ejemplo solamente, en ninguna forma significa que es limitativo, y que la modificación de detalles se pueden hacer dentro del alcance de las reivindicaciones después. Las características preferidas de cada modalidad de la invención son para cada una de las otras modalidades mutatis mutandis. Todas las publicaciones, incluyendo pero no limitadas a patentes y solicitudes de patente, citadas en esta especificación se incorporan en la presente para referencia como si cada publicación individual fuera específicamente e individualmente indicada para ser incorporada para referencia en la presente como si se describiera completamente. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana que comprende una cadena pesada, caracterizado porque el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 5 para CDR-Hl, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 6 para CDR-H2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO : 7 para CDR-H3.

2. Anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 5 para CDR-Hl, la secuencia dada en la SEC ID NO: 6 para CDR-H2 y la secuencia dada en la SEC ID NO: 7 para CDR-H3.

3. Anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana que comprende una cadena ligera, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 9 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 10 para CDR-L3.

4. Anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque adicionalmente comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 9 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEC ID NO: 10 para CDR-L3.

5. Anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 3 o reivindicación 4, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 8 para CDR-Ll, la secuencia dada en la SEC ID NO: 9 para CDR-L2 y la secuencia dada en la SEC ID NO: 10 para CDR-L3.

6. Anticuerpo neutralizante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la cadena pesada comprende la secuencia gH13 (SEC ID NO:ll) .

7. Anticuerpo neutralizante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la cadena ligera comprende la secuencia gLIO (SEC ID NO:13) .

8. Anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana, caracterizado porque tiene una cadena pesada que comprende la secuencia gH13 (SEC ID NO: 11) y una cadena ligera que comprende la secuencia gLIO (SEC ID NO: 13) .

9. Anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana, caracterizado porque el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo de la reivindicación 8 y en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad o similitud con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8.

10. Anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana, caracterizado porque tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 2 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEC ID NO : 4.

11. Anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana, caracterizado porque tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 16 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEC ID NO:18.

12. Anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana, caracterizado porque las cadenas pesada y ligera son al menos 60% idénticas o similares a las cadenas pesada y ligera correspondienes del anticuerpo de al reivindicación 11.

13. Anticuerpo neutralizante humanizado o completamente humano, caracterizado porque tiene una afinidad de enlace para IL-6 humana de 500 pM o mejor.

14. Anticuerpo neutralizante humanizado, completamente humano o quimérico, caracterizado porque tiene una afinidad de enlace para IL-6 humana de 50 pM o mejor.

15. Epítope en IL-6 humana, caracterizado porque se une por el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8.

16. Epítope de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende los residuos aminoácido S47, C50, E93, R104, F105, E106, T149, K150, A153, Q16, Q159 y S169 de IL-6 humana.

17. Epítope de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende los residuos aminoácido S47, C50, E93, R104, F105, E106, T149, K150, A153, Q16, Q159 y S169 y uno o más residuos seleccionados de C44, S53, A58, V96, Q152, Q154, N155, W157, T163, L165, y E172.

18. Anticuerpo neutralizante humanizado, completamente humano o quimérico, caracterizado porque tiene especificidad para IL-6 humana, el cual enlaza al epítope de conformidad con la reivindicación 15, reivindicación 16 o reivindicación 17.

19. Anticuerpo neutralizante humanizado, completamente humano o quimérico, caracterizado porque tiene especificidad para IL-6 humana el cual bloquea de manera cruzada el enlace del anticuerpo de la reivindicación 8 a IL- 6 humana o es bloqueado de manera cruzada del enlace de IL-humana por el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8.

20. Anticuerpo neutralizante que tiene especificada para IL-6 humana, caracterizado porque es capaz de inhibir la actividad de IL-6 humana 0.038 nM por 50% a una concentración de menos de 100 pM, la actividad inhibidora se mide en la proliferación inducida por IL-6 de las células T1165.

21. Anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-6 humana, caracterizado porque es capaz de inhibir la actividad de IL-6 humana 3.84 nM por 50% a una concentración de menos de 1 nM, la actividad inhibidora se mide en la producción de MCP-1 por HUVECs en respuesta a SIL-6R e IL-6 humana.

22. Anticuerpo neutralizante de conformidad con la reivindicación 20 o reivindicación 21, caracterizado porque bloquea de manera cruzada el enlace del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8 a IL-6 humana.

23. Anticuerpo neutralizante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-22, caracterizado porque tiene una afinidad de enlace para IL-6 humana de 50 pM o mejor.

24. Secuencia de ADN aislado, caracterizada porque codifica las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 ó 18-23.

25. Secuencia de ADN aislado de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 12 o SEC ID NO: 15 o nucleótidos 58-2008 de la SEC ID NO: 15.

26. Secuencia de ADN aislado de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la secuencia de ADN que codifica la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 17 o nucleótidos 61-705 de la SEC ID NO: 17.

27. Vector de clonación o expresión, caracterizado porque comprende una o más secuencias de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-26.

28. Vector de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende la secuencia dada en la SEC ID NO: 15 y la secuencia dada en la SEC ID NO: 17.

29. Célula hospedera, caracterizada porque comprende uno o más vectores de clonación o expresión de conformidad con la reivindicación 27 o reivindicación 28.

30. Proceso para la producción de un anticuerpo que tiene especificidad de enlace para IL-6 humana, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 29 y aislar el anticuerpo.

31. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 ó 18-23, en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable .

32. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque adicionalmente comprende otros ingredientes activos.

33. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 ó 18-23 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31 o reivindicación 32, caracterizado porque es para el uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno patológico que es mediado por IL-6, o que está asociado con un nivel incrementado de IL-6.

34. Uso de un anticuerpo neutralizante humanizado o completamente humano con una afinidad de enlace para IL-6 humana de 500 pM o mejor en la manufactura de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de un trastorno patológico que es mediado por IL-6, o que está asociado con un nivel incrementado de IL-6.