MX2008006792A

MX2008006792A - Anticuerpos monoclonales humanos para proteina tirosina kinasa 7 (ptk 7) y su uso

Info

Publication number: MX2008006792A
Application number: MXMX/A/2008/006792A
Authority: MX
Inventors: Pan Chin; LiShenglu; Alexander Terrett Jonathan
Original assignee: Lu Lisheng; Medarex Inc; Pan Chin; Alexander Terrett Jonathan
Priority date: 2005-12-08
Filing date: 2008-05-27
Publication date: 2008-09-26

Abstract

La presente invención provee anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se unen específicamente a PTK7 con alta afinidad. También se provee moléculas deácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención, vectores de expresión, células huésped y métodos para expresar los anticuerpos de la invención. También se provee inmunoconjugados, moléculas bioespecíficas y composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos de la invención. La invención también provee métodos para detectar PTK7, asícomo métodos para tratar varias enfermedades, incluyendo cáncer y enfermedades infecciosas, usando anticuerpos anti-PTK7.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS PARA PROTEÍNA TI ROSINA KINASA 7 (PTK 7) Y SU USO SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad a la solicitud provisional de E. U .A. No. : 60/748,373, presentada el 8 de diciembre de 2005, que se incorpora a la presente por referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los receptores tirosina kinasas (RTKs) son proteínas de señalización de transmembrana que transmiten señales biológicas desde el am biente extracelular al interior de la célula. La regulación de señales de RTK ez importante para la reculación de crecimiento celular, diferenciación , crecimiento de ax?n, crecimiento de epitelio, desarrollo, adhesión , migración, y apoptosis (Prenzel y otros (2001 ) Endocr. Relat. Cáncer 8: 1 1 -31 ; Hubbard y Xi II (2000) Annu. Rev. Biochem. 69: 373-98). Los RTKs son conocidos por involucrarse en el desarrollo y progresión de varias formas de cáncer. En la mayoría de los cánceres relacionados con RTK, ha habido una amplificación del receptor proteína en vez de una mutación del gen (Kobus y Fleming (2005) Biochemistry 44: 1464-70). La proteína tírosina kinasa 7 (PTK7), un miembro de la familia de receptor prote ina tirosina kinasa, primero se aisló de melanocitos humanos normales y se clonó por PCR a temperatura ambiente (Lee y otros, ( 1993) Oncogene 8: 3403- 10; Park y otros, ( 1996) J. Biochem 1 19:235-9). Por separado, el gen se clonó de líneas celulares derivadas de carcinoma de colon humano y se llamó kinasa 4 de carcinoma de colon (CCK4) (Mossie y otros (1995) Oncogene U_: 2179-84). PTK7 pertenece a un subconjunto de RTKs que carecen de actividad de tirosina kinasa catalítica detectable pero retienen actividad de transducción de señal y se cree que posiblemente funcionan como una molécula de adhesión celular. El mARN para PTK7 se descubrió ser variablemente expresado en l íneas celulares derivadas de carcinoma de colon pero no expresado en tejidos de colon de adulto humano (Mossie y otros, supra). La expresión de PTK7 también se observó en algunas l íneas celulares de melanoma y biopsias de melanoma (Easty, y otros ( 1 997) Int. J. Cáncer 71_: 1061 -5). U na forma alternativa de empalme se descubrió expresada en hematomas y células de cáncer de colon (J ung y otros (2002) Biochim Biophys Acta 1 579: 153-63) . Además, se descubrió que PTK7 estaba altamente sobreexpresada en muestras de leucemia mieloide aguda (Muller-Tidow y otros, (2004) Clin. Cáncer Res. 10: 1241 -9). Por inmunohistoquímica , se observó manchado específico de tumor de PTK7 en cánceres de mama, colon , pulmón , páncreas, riñon y vejiga , como se describió en la publicación de PCT WO 04/17992. Por consiguiente, se desean agentes que reconozcan PTK7, y métodos de usar dichos agentes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se enlazan a PTK7 y que exhiben numerosas propiedades deseables. Estas propiedades incluyen unión de alta afinidad a PTK7 humana y unión a células de tumor de Wilms. También se proveen métodos para tratar una variedad de enfermedades mediadas con PTK7 usando los anticuerpos y composiciones de la invención. En un aspecto, la invención pertenece a un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo: (a) se enlaza específicamente a PTK7 humana; y (b) se enlaza a una línea celular de tumor de Wilms (ATCC No. de cuenta CRL-1441). Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo humano, aunque en modalidades alternativas el anticuerpo puede ser un anticuerpo de ratón, un anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado. En modalidades más preferidas, el anticuerpo se enlaza a células de tumor de Wilms con un EC50 de 4.0 nM o menos o se enlaza a células de tumor de Wilms con un EC50 de 3.5 nM o menos.

En otra modalidad, el anticuerpo se enlaza a una linea celular de cáncer seleccionada a partir del grupo que consiste de líneas celulares de A-431 (ATCC No. de cuenta CRL-1555), Saos-2 (ATCC No. de cuenta HTB-85), SKOV-3 (ATCC No. de cuenta HTB-77), PC3 (ATCC No. de cuenta CRL-1435), DMS 114 (ATCC No. de cuenta CRL-2006), ACHN (ATCC No. de cuenta CRL-1611), LNCaP (ATCC No. de cuenta CRL-1740), DU 145 (ATCC No. de cuenta HTB-81), LoVo (ATCC No. de cuenta CCL-229) y MÍA PaCa-2 (ATCC No. de cuenta CRL-1420). En otra modalidad, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o porción enlazadora a antígeno del mismo, en donde el antlgeno compite por enlazarse a PTK7 con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia: (a) se enlaza específicamente a PTK7 humana; y (b) se enlaza a una línea celular de tumor de Wilms (ATCC No. de cuenta CRL-1441). En varias modalidades, el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10. En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen VH 3-30.3 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a PTK7. La invención también provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen VH DP44 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a PTK7. La invención también provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva de un gen VH 3-33 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a PTK7. La invención provee además un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen V? L 15 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a PTK7. La invención provee además un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del m ismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen V? A10 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a PTK7. La invención provee además un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del m ismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen V? A27 humano, en donde el » anticuerpo se une específicamente a PTK7. La invención provee además un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o se deriva de un gen V? L6 hujnano, en donde el anticuerpo se une específicamente a PTK7. Una combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:11; (b)una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:15; (c)una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:19; (d)una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:23; (e)una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:29; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:35. Otra combinación preferida comprende: (a)una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:11; (b)una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:15; (c)una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:19; (d)una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:24; (e)una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:30; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:36. Otra combinación preferida comprende: (a)una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:12; (b)una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:16; (c)una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:20; (d)una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:25; (e)una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:31; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:37. Otra combinación preferida comprende: (a)una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:13; (b)una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:17; (c)una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:21; (d)una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:26; (e)una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:32; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:38.

Otra combinación preferida comprende: (a)una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:13; (b)una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:17; (c)una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:21; (d)una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:27; (e)una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:33; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:39. Otra combinación preferida comprende: (a)una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:14; (b)una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:18; (c)una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:22; (d)una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:28; (e)una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:34; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:40. Otros anticuerpos preferidos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos comprenden: (a)una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1, y (b)una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:5. Otra combinación preferida comprende: (a)una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1, y (b)una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:6. Otra combinación preferida comprende: (a)una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2, y (b)unav región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:7. Otra-combinación preferida comprende: (a)una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3, y (b)una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:8. Otra combinación preferida comprende: (a)una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3, y (b)una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9. Otra combinación preferida comprende: (a)una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC I D NO:4, y (b)una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de S EC I D NO: 10. Los anticuerpos de la invención pueden ser, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, de un isotipo lgG 1 o lgG4. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos de Fab o Fab'2 , o anticuerpos de cadena individual. La invención también provee un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invención , o porción de unión a antígeno del mismo, ligado a un agente terapéutico, tal como una citotoxi na o un isótopo radioactivo. La invención también provee una molécula biespecífica que comprende un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la invención , ligada a una segunda porción funcional teniendo una especificidad de unión diferente que dicho anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo. También se proveen composiciones que comprenden un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, o inmunoconjugado o molécula biespecífica y un portador farmacéuticamente aceptable. La invención también abarca moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, así como vectores de expresión que comprenden dichos ácidos nucleicos y células huésped que comprenden dichos vectores de expresión. Además, la invención provee un ratón transgénico que comprende transgenes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana, en donde el ratón expresa un anticuerpo de la invención, así como hibridomas preparadas a partir de dicho ratón, en donde el hibridoma produce el anticuerpo de la invención. Todavía en otro aspecto, la invención provee un método de tratar o prevenir una enfermedad caracterizado por células de tumor expresando PTK7, de las mismas, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la invención en una cantidad efectiva para tratar o prevenir la enfermedad . La enfermedad puede ser, por ejemplo, cáncer, por ejemplo, cáncer de colon (incluyendo cáncer del intestino delgado), cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer pancreático, melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastático) , leucemia mieloide aguda, cáncer de riñon, cáncer de vejiga, cáncer de ovario y cáncer de próstata. En una modalidad preferida , la invención provee un método de tratar cáncer in vivo usando un anticuerpo anti-PTK7. El anticuerpo anti-PTK7 puede ser anticuerpo de ratón, quimérico, humanizado o humano. Ejemplos de otros cánceres que se pueden tratar usando los métodos de la invención incluyen cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de célula renal) , glioblastoma , tumores cerebrales, leucemias crónicas o agudas incluyendo leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia de célula T adulta (T-ALL), leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfomas (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y de no Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma de CNS primario, linfoma de célula T, linfoma de Burkitt, linfomas de célula grande anaplástica (ALCL) , linfomas de célula T cutánea, linfomas de célula cortada pequeña nodular, linfomas de célula T periférica, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticas, linfomas/leucemia de célula T (ATLL), cánceres de linfomas foliculares entroblásticos/centrocíticos (cb/cc) , linfomas de célula grande difusa de linaje B, linfoma de célula T de tipo de linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) y linfomas a base de cavidad corporal asociada con VI H), carcinomas embrionales, carcinomas sin diferencia de la rino-faringe (por ejemplo, tumor de Schmicke), enfermedad de Castleman , sarcoma de Kaposi, mieloma m últiple, macroglobulínemia de Waldenstrom y otros linfomas de célula B, carcinomas de nasofaringe, cáncer de hueso, cáncer de piel , cáncer de la cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de recto, cáncer de la región anal , cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cerviz, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer del pene, tumores sólidos de niñez, cáncer de la vejiga, cáncer del riñon o uretra, carcinoma de la pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central (CNS), angiogénesis de tumor, tumor de eje espinal, glioma del tronco cerebral, adenoma pituitaria, cáncer epidermoide, cáncer de célula escamosa, cánceres ambientalmente inducidos incluyendo aquellos inducidos por asbesto, por ejemplo, mesotelioma y combinaciones de dichos cánceres. Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada que no se debe considerar como limitante. Los contenidos de todas las referencias, entidades del Genbank, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de esta solicitud se incorporan expresamente a la presente por referencia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1A muestra la secuencia de nucleótido (SEC ID NO:41) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NÓ:1) de la región variable de cadena pesada de los anticuerpos monoclonales humanos 3G8 y 3G8a. Las regiones CDR1 (SEC ID NO:11), CDR2 (SEC ID NO:15) y CDR3 (SEC ID NO:19) se delinean y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J. La figura 1B muestra la secuencia de nucleótido (SEC ID NO:45) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO:5) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 3G8. Las regiones CDR1 (SEC ID NO:23), CDR2 (SEC ID NO:29) y CDR3 (SEC ID NO:35) se delinean y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La figura 1C muestra la secuencia de nucleótido (SEC ID NO:46) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO:6) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 3G8a.

Las regiones CDR1 (SEC ID NO:24), CDR2 (SEC ID NO:30) y CDR3 (SEC ID NO:36) se delinean y se indican derivaciones de la línea germinal V y J. La figura 2A muestra la secuencia de nucleótido (SEC ID NO:42) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO:2) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo .monoclonal humano 4D5.

Las regiones CDR1 (SEC ID NO:12), CDR2 (SEC ID NO:16) y CDR3 (SEC ID NO:20) se delinean y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J. La figura 2B muest a la secuencia de nucleótido (SEC ID NO:47) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO:7) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 4D5.

Las regiones CDR1 (SEC ID NO:25), CDR2 (SEC ID NO:31) y CDR3 (SEC ID NO:37) se delinean y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La figura 3A muestra la secuencia de nucleótido (SEC ID NO:43) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO:3) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 12C6.

Las regiones CDR1 (SEC ID NO:13), CDR2 (SEC ID NO:17) y CDR3 (SEC ID NO:21) se delinean y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J. La figura 3B muestra la secuencia de nucleótido (SEC ID NO:48) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO:8) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 12C6. Las regiones CDR1 (SEC ID NO:26), CDR2 (SEC ID NO:32) y CDR3 (SEC ID NO:38) se delinean y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La figura 3C muestra la secuencia de nucleótido (SEC ID NO:49) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO:9) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 12C6a.

Las regiones CDR1 (SEC ID NO:27), CDR2 (SEC ID NO:33) y CDR3 (SEC ID NO:39) se delinean y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La figura 4A muestra la secuencia de nucleótido (SEC ID NO:44) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO:4) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 7C8.

Las regiones CDR1 (SEC ID NO:14), CDR2 (SEC ID NO:18) y CDR3 (SEC ID NO.22) se delinean y se indican las derivaciones de la linea germinal V, D y J. La figura 4B muestra la secuencia de nucleótido (SEC ID NO:50) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO:10) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 7C8.

Las regiones CDR1 (SEC ID NO:28), CDR2 (SEC ID NO:34) y CDR3 (SEC ID NO:40) se delinean y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.

La figura 5 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de 3G8 (SEC ID NO: 1) y 3G8a (SEC ID NO: 1) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal VH 3-30.2 humana (SEC ID NO:51) (línea germinal JH4b descrita como SEC ID NO: 59). La figura 6 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 4D5 (SEC ID NO: 2) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal VH 3- 30.2 humana (SEC ID NO:51) (línea germinal JH4b descrita como SEC ID NO: 60). La figura 7 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de 12C6 (SEC ID NO: 3) y 12C6a (SEC ID NO: 2) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal VH DP44 humana (SEC ID NO:52) (líneas germinales 3-7, 3-23 y JH4b descrita como SEC ID NOS: 61-63, respectivamente). La figura 8 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 7C8 (SEC ID NO: 4) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal VH 3-33 humana (SEC ID NO:53) (línea germinal JH6b descrita como SEC ID NO: 64). La figura 9 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera de 3G8 (SEC ID NO: 5) y 3G8a (SEC ID NO: 6) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal V? L15 humana (SEC ID NO:54) (línea germinal JK1 descrita como SEC ID NO: 65). La figura 10 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 4D5 (SEC ID NO: 7) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal V? A10 humana (SEC ID NO:55) (línea germinal JK5 descrita como SEC ID NO: 66). La figura 11 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 12C6 (SEC ID NO: 8) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal V? A27 humana (SEC ID NO.56) (línea germinal JK2 descrita como SEC ID NO: 67). La figura 12 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 12C6a (SEC ID NO: 9) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal V? L15 humana (SEC ID NO:54) (línea germinal JK2 descrita como SEC ID NO: 68). La figura 13 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 7C8 (SEC ID NO: 10) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal V? L6 humana (SEC ID NO:57) (línea germinal JK3 descrita como SEC ID NO: 69). La figura 14 muestra los resultados de experimentos de citometría de flujo que demuestran que el anticuerpo monoclonal humano 7C8, dirigido contra PTK7 humano, une la superficie celular de células HEK3 transfectadas con PTK7 humana de longitud completa. La figura 15 muestra los resultados de experimentos ELISA que demuestran que anticuerpos monoclonales humanos contra PTK7 humana une específicamente a PTK7. La figura 16 muestra los resultados de experimentos de citometría de flujo que demuestran que anticuerpos dirigidos contra PTK7 humana une la superficie celular de células de tumor de Wilms. La figura 17 muestra los resultados de experimentos de citometría de flujo que demuestran que anticuerpos dirigidos contra PTK7 humana une la superficie celular de una variedad de líneas de célula cancerosa. La figura 18 muestra los resultados de experimentos de citometría de flujo que demuestran que anticuerpos dirigidos contra PTK7 humana une la superficie celular de células dendríticas. La figura 19 muestra los resultados de experimentos de citometría de flujo que demuestran que anticuerpos dirigidos contra PTK7 humana une a linfocitos T CD4+ y CD8 + , pero no a linfocítos B.

La figura 20 muestra los resultados de experimentos de internalización Hum-Zap que demuestran que anticuerpos monoclonales humanos contra PTK7 humana pueden internalizarse en células PTK7 + . (A) Internalización de los anticuerpos humanos 3G8, 4D5 y 7C8 en células de tumor de Wilms. (B) Internalización del anticuerpo humano 12C6 en células de tumor de Wilms. (C) Internalización de los anticuerpos humanos 7C8 y 12C6 en células de tumor A-431. (D) Internalización de los anticuerpos humanos 7C8 y 12C6 en células de tumor PC3. La figura 21 muestra los resultados de un ensayo de proliferación celular que demuestra que anticuerpos anti-PTK7 monoclonales humanos conjugados con toxina matan líneas celulares de cáncer de riñon humano. La figura 22 muestra los resultados de un ensayo de proliferación celular que demuestra que anticuerpos anti-PTK7 monoclonales humanos conjugados con toxina matan l íneas celulares que expresan niveles bajos a altos de expresión de PTK7. La figura 23 muestra los resultados de un ensayo de invasión que demuestra anticuerpos anti-PTK7 inhiben la movilidad de invasión de células que expresan PTK7 en la superficie celular. La figura 24 muestra los resultados de un estudio de injerto heterólogo de tumor in vivo que demuestran que anticuerpos anti-PTK7 conjugaron a una progresión de crecimiento de tumor más despacio de toxina en cáncer pancreático. La figura 25 m uestra los resultados de un estudio de injerto heterólogo de tumor in vivo que demuestran que anticuerpos anti-PTK7 conjugaron a una progresión de crecimiento de tumor más despacio de toxina en cáncer de mama.

BREVE DESC RIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se unen específicamente a PTK7. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención exhiben una o más propiedades funcionales deseables, tales como unión con alta afinidad a PTK7 y/o la habilidad de inhibir el crecimiento de células de tumor in vivo o in vitro. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se derivan de secuencias de línea germinal de cadena pesada y ligera particulares y/o comprenden características estructurales particulares tales como regiones CDR que comprenden secuencias de am inoácidos particulares. La invención provee anticuerpos aislados, métodos de hacer dichos anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas biespecíficas. que comprenden dichos anticuerpos y composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos, inmunoconjugados o moléculas biespecífícas de la invención . La invención también se refiere a métodos de usar los anticuerpos, tal como para tratar enfermedades tal como cáncer. A fin de que la presente invención se pueda entender mejor, primero se definen ciertos términos. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada. Los términos "PTK7" y "CCK4" se usan de manera intercam biable e incluyen variantes, isoformas y especies homologas de PTK7 hum ana . Por consiguiente, los anticuerpos humanos de la invención , en ciertos casos, pueden reaccionar con PTK7 de especies diferentes de las humanas. En ciertas modalidades, los anticuerpos pueden ser completamente específicos para una o más PTK7 humana y quizá no exh iba n especies u otros tipos de reactividad cruzada no humana. La secuencia de aminoácidos completa de una PTK7 humana ejemplar tiene el número de acceso al Genbank NM_002821 (SEC ID NO:58). El término "respuesta inmune" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentando antígeno, células fagocíticas, granulocitos, y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citokinas, y complemento) que resulta en daño selectivo a, destrucción de, o eliminación del cuerpo humano de invadir patógenos, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas, o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales. Una "vía de trunsducción de señal" se refiere a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señal que juegan un papel en la transmisión de una señal desd^ una porción de una célula a otra porción de una célula . Como se usa en la presente, la frase " receptor de superficie celular" incluye, por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y la transmisión de dicha señal sobre la membrana de plasma de una célula. Un ejemplo de un "receptor de superficie celular" de la presente invención es el receptor de PTK7. El térm ino "anticuerpo" como se refiere en la' presente incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o cadenas individuales de los mismos. Un "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) ínter-conectadas por uniones de disulfuro, o una porción de unión a antígeno del mismo. Cada cadena pesada está compuesta de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta de tres dominios, CH 1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera . La región constante de cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hiperdisponibilidad, denominadas regiones que determinan complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de estructura (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde terminal amino a terminal carboxi en el siguiente orden: FR 1 , C DR 1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las reg iones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inm unoglobu lina para hospedar tej idos o factores, incluyendo varias célu las del sistema inm une (por ejemplo, células ¡nductoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo") , como se usa en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la habilidad de unir específicamente a un antígeno (por ejemplo, PTK7). Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios V , VH, C y CH 1 ; (¡i) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente de disulfuro en la región de gozne; (iii) un fragmento Fab' , que es esencialmente un Fab con parte de la región de gozne (ver, FUN DAMENTAL I MMUNOLOGY (Paule d. , 3 sup. rd ed. 1993); (iv) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH 1 ; (v) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (vi) un fragmento dAb (Ward y otros, ( 1989) Nature 341: 544-546) , que consiste de un dominio VH; (vii) una región determ inante de com plementariedad aislada (CDR); y (viii) un nanocuerpo , una reg ión variable de cadena pesada que contiene un solo dom inio variable y dos dominios constantes. Además, annque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, se pueden juntar, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite hacerse como una sola cadena de proteína en donde las regiones VL y VH se unifican para formar moléculas monovalentes (conocidas como cadena individual Fv (scFv) ; ver, por ejemplo, Bird y otros ( 1988) Science 242:423-426: y H uston y otros ( 1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883).

Dichos anticuerpos de cadena individual también deben abarcarse dentro del término "porción de unión a antígenoB de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas a aquellos expertos en la técnica , y los fragmentos se filtran para utilidad en la misma manera como son anticuerpos intactos. Un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente, se debe referir a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que une específicamente a PTK7 está sustancialmente libre de anticuerpos que unen específicamente a antígenos diferentes de PTK7). Un anticuerpo aislado que une específicamente a PTK7, no obstante, puede tener reactividad cruzada a otros antígenos, tales como moléculas de PTK7 de otras especies. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o qu ímicos. Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se usan en la presente se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular individual. Una composición de anticuerpo monoclonal exhibe una sola especificidad de unión y afinidad para un epítope particular. El término "anticuerpo humano" , como se usa en la presente, debe incluir anticuerpos que tienen regiones variables en donde tanto las regiones de estructura como CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de l ínea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o de sitio específico in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, no debe incluir anticuerpos en donde secuencias de CDR derivadas de la línea germ inal de otras especies de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias de estructura humana. El término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que exhiben una sola especificidad de unión que tienen reg iones variables en donde ambas regiones de estructura y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de l ínea germinal humana . En una modalidad , los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, teniendo un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humano y un tra nsgén de cadena ligera fusionado en una célula inmortalizada. El término "anticuerpo humano recombinante", como se usa en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan , crean o a islan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado de los mismos (descrito más adelante), (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpo humano combinatorio, recombinante, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involucre empalmar secuencias de gen de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en donde las regiones de estructura y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. No obstante, en ciertas modalidades, dichos anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagénesis in vitro (o, cuando un animal transgénico para secuencias Ig humanas se usa, mutagénesis somática in vivo) y así las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes que, aunque se derivan de y relacionan a secuencias VH y VL de línea germinal humana, quizá no existan de forma natural dentro de repertorio de línea germinal de anticuerpo humano in vivo. Como se usa en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o I g Gl) que se codifica por los genes de región constante de cadena pesada. Las frases "un anticuerpo reconociendo un antígeno" y "un anticuerpo especifico para un antígeno" se usan de manera intercambiable en la presente con el término "un anticuerpo que une específicamente a un antígeno". El término "derivados de anticuerpo humano" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo. El término "anticuerpo humanizado" se debe referir a anticuerpos en donde secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mam ífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias de estructura humana. Se pueden hacer modificaciones de región de estructura adicionales dentro de las secuencias de estructura humana. El término "anticuerpo quimérico" se debe referir a anticuerpos en donde las secuencias de reg ión variable se derivan de otra especie y las secuencias de región constante se derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en donde las secuencias de región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de región constante se derivan de un anticuerpo humano. Como se usa en la presente, un anticuerpo que "une específicamente a PTK7 humana" se debe referir a un anticuerpo que u ne a PTK7 humana con un KD de 1 x 10" 7 M o menos, más preferible x 10"8 M o menos, más preferible 1 x 10"8 M o menos, más preferible 5 x 1 0' 9 M o menos. El térm ino " no se une sustanclalmente" a una proteína o células, como se usa en la presente, sig nifica que no une o no se une con una alta afinidad a la proteína o células, es decir, une a la proteína o células con un KD de 1 x 10"6 M o más, más preferible 1 x 10'5 M o más, más preferible 1 x 10"4 M o más, más preferible 1 x 10' 3 M o más, incluso más preferible 1 x 10"2 M o más. El término "KaSoc° o "Ks", como se usa en la presente, se debe referir a la velocidad de asociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular, mientras que el término "Kd¡s° o "Kd" , como se usa en la presente, se debe referir a la velocidad de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular. El término "KD" , como se usa en la presente, se debe referir al constante de disociación, que se obtiene de la relación de Kd a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores KD para anticuerpos se pueden determ inar usando métodos bien establecidos en la técnica. Un método preferido para determinar el KD de un anticuerpo es al usar resonancia de plasma de superficie, preferiblemente usando un sistema biosensor tal como un sistema Biacore®. Como se usa en la presente, el término "alta afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene un K0 de 10"8 M o menos, m ás preferible 1 0"9 M o menos e incluso más preferible 10" 10 M o menos para un antígeno objetivo. Sin embargo, unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, unión de "alta afinidad" para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene un KD de 10"7 M o menos, más preferible 10"8 M o menos, incluso más preferible 1 0"9 M o menos.

Como se usa en la presente, el término "sujeto" incluye cualquier humano o animal no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Varios aspectos de la invención se describen en más detalle en las siguientes subsecciones.

Anticuerpos anti-PTK7 Los anticuerpos de la invención se caracterizan por características funcionales particulares o propiedades de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se unen específicamente a PTK7. Preferiblemente, un anticuerpo de la invención se une a PTK7 con alta afinidad, por ejemplo con un KD de 1 x 10"7 M o menos. Los anticuerpos anti-PTK7 de la invención exhiben preferiblemente una o más de las siguientes características: (a) une específicamente a PTK7 humana; o (b) une a una línea celular de tumor de Wilms (ATCC No. CRL-1441). Preferiblemente, el anticuerpo se une a PTK7 humana con un KD de 5 x 10"8 M o menos, se une a PTK7 humana con un KD de 1 x 10'8 M o menos, se une a PTK7 humana con un KD de 5 x 10"9 M o menos, o se une a PTK7 humana con un K0 de entre 1 10"8 M y 1 x 10'10 M o menos. Preferiblemente, el anticuerpo se une a células de tumor de Wilms con un EC50 de 4.0 nM o menos, o se une a células de tumor de Wilms con un EC50 de 3.5 nM o menos. Ensayos estándar para evaluar la habilidad de unión de los anticuerpos hacia PTK7 son conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ELISAs, blots Western y RIAs. La cinética de unión (por ejemplo, afinidad de unión) de los anticuerpos también se pueden evaluar por ensayos estándar conocidos en la técnica, tal como por ELISA, análisis de Scatchard y Biacore. Como otro ejemplo, los anticuerpos de la presente invención se pueden unir a una línea celular de tumor de carcinoma de riñon, por ejemplo, la línea celular de tumor de Wilms. Ensayos adecuados para evaluar cualquiera de las características antes descritas se describen en detalle en los ejemplos.

Anticuerpos monoclonales 3G8. 3G8a . 4D5. 12C6. 12C6a v 7C8 Los anticuerpos preferidos de la invención son los anticuerpos monoclonales humanos 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8, aislados y caracterizados estructuralmente oomo se describe en los ejemplos 1 y 2. Aquellos expertos en la técnica deberán apreciar que los anticuerpos 3G8 y 3G8a , así como los anticuerpos 12C6 y 12C6a tienen la misma secuencia de cadena pesada, aunque difieren en sus secuencias de cadena ligera. Las secuencias de aminoácidos VH de 3G8, 3G8a , 4D5, 12C6, 1 2C6a y 7C8 se m uestran en SEC I D NOs: 1 (3G8 y 3G8a), 2 (4D5) , 3 ( 12C6 y 12C6a) y 4 (7C8) . Las secuencias de aminoácidos VL de 3G8, 3G9a , 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en SEC I D NOs: 5, 6, 7, 8, 9 y 10, respectivamente. Dado que cada unos de estos anticuerpos se puede unir a PTK7, las secuencias VH y VL se pueden "mezclar y acoplar" para crear otras moléculas de unión anti-PTK7 de la invención. La unión de PTK7 de dichos anticuerpos "mixtos y acoplados" se puede probar usando los ensayos de unión descritos antes y en los ejemplos (por ejemplo, ELISAs). Preferiblemente, cuando se mezclan y acoplan cadenas VH y VL, una secuencia VH de un par de VH/VL particular es reemplazada con una secuencia VH estructuralmente similar. Asimismo, preferiblemente una secuencia VL de un par de VH/VL particular es reemplazada con una secuencia VL estructuralmente similar. Por consiguiente, en un aspecto, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC I D NOs: 1 , 2, 3 y 4; y (b) una región variable de cadena ligera que com prende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC I D NOs: 5, 6, 7, 8, 9 y 10; en donde el anticuerpo se une específicamente a PTK7, preferiblemente PTK7 humana. Las com binaciones preferidas de cadena pesada y ligera incluyen: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC I D NO: 1 ; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:5; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:6; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:7; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:8; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:10. En otro aspecto, la invención provee anticuerpos que comprenden las CDR1s, CDR2s y CDR3s de cadena pesada y cadena ligera de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8, o combinaciones de los mismos. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1s de VH de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en SEC ID NOs: 11 (3G8 y 3G8a), 12 (4D5), 13 (12C6 y 12C6a) y 14 (7C8). Las secuencias de aminoácidos de las CDR2s de VH de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en SEC ID NOs: 15 (3G8 y 3G8a), 16 (4D5), 17 (12C6 y 12C6a) y 18 (7C8). Las secuencias de aminoácidos de las CDR3s de VH de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en SEC ID NOs: 19 (3G8 y 3G8a), 20 (4D5), 21 (12C6 y 12C6a) y 22 (7C8). Las secuencias de aminoácidos de las CDR1s de V? de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en SEC ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 y 28, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2s de V? de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en SEC ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33 y 34, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3s de V? de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en SEC ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39 y 40, respectivamente. Las regiones CDR se delinean usando el sistema Kabat (Kabat, E. A., y otros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH No. de publicación 91-3242). Dado que cada uno de estos anticuerpos se puede unir a PTK7 y que la especificidad de unión a antígeno es provista primariamente por las regiones CDR1, CDR2 y CDR3, las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de V? se pueden "mezclar y acoplar" (es decir, CDRs de anticuerpos diferentes se pueden mezclar y acoplar, aunque cada anticuerpo debe contener una CDR 1 , CDR2 y CDR3 de VH y una CDR 1 , CDR2 y CDR3 de V«) para crear otras moléculas de unión anti-PTK7 de la invención. La unión de PTK7 de dichos anticuerpos "mezclados y acoplados" se puede probar usando los ensayos de unión descritos antes y en los ejemplos (por ejemplo, ELISAs, análisis de Biacore). Preferiblemente, cuando se mezclan y acoplan secuencias de CDR de VH, la secuencia de CDR 1 , CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de VH particular se reemplaza con una secuencia(s) de CDR estructuralmente similar. Asimismo, cuando se mezclan y acoplan secuencias de CDR de V?, la secuencia de CDR 1 , CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de V? particular se reemplaza preferiblemente con una secuencia(s) de CDR estructuralmente similar. Será evidente al experto en la técnica que las secuencias de VH y V novedosas se pueden crear al sustituir una o más secuencias de región CDR de VH y/o VL con secuencias estructuralmente similares de las secuencias de CDR descritas en la presente para anticuerpos monoclonales 3G8, 3G8a, 4D5, 1 2C6, 1 2C6a y 7C8. Por consig uiente, en otro aspecto, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo que comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDR 1 que comprende una secuencia de am inoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC I D NOs: 1 1 , 12, 13 y 14; (b) una reg ión variable de cadena pesada CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 15, 16, 17 y 18; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 19, 20, 21 y 22; (d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 y 28; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33 y 34; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39 y 40; en donde el anticuerpo se une específicamente a PTK7, preferiblemente PTK7 humana. En una modalidad preferida, el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:11; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:15; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO.19; (d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:23; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:29; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:35. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:11; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:15; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:19; (d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:24; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:30; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comorende SEC ID NO:36. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:12; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:16; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO.20; (d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:25; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:31; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:37. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:13; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:17; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:21; (d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:26; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:32; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:38. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:13; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:17; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:21; (d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:27; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:33; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:39. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:14; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:18; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:22; (d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:28; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:34; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:40. Es bien conocido en la técnica que el dominio de CDR3, independientemente del dominio(s) de CDR1 y/o CDR2, solo puede determinar la especificidad de unión de un anticuerpo para un antígeno cognado y que múltiples anticuerpos se pueden generar de forma predecible teniendo la misma especificidad de unión con base en una secuencia de CDR3 común. Ver, por ejemplo, Klimka y otros, British J. of Cáncer 83(2):252-260 (2000) (describiendo la producción de un anticuerpo anti-CD30 humanizado usando solamente la CDR3 de dominio variable de cadena pesada de anticuerpo Ki-4 anti-CD30 de ratón); Beiboer y otros, J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000) (describiendo anticuerpos de glicoproteína 2 (EGP-2) epitelial recombinante usando solamente la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo anti-EGP-2 MOC-31 de ratón parental); Rader y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 95:8910-8915 (1998) (describiendo un panel de anticuerpos anti-integrina avß3 humanizado usando un dominio de CDR3 variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo LM609 anti-integrina avß3 de ratón en donde cada anticuerpo miembro comprende una secuencia distinta fuera del dominio de CDR3 y capaz de unir el mismo epítope como el anticuerpo de ratón origen con afinidades tan altas o mayores que el anticuerpo de ratón origen); Barbas y otros, J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (describiendo que el dominio de CDR3 provee la contribución más significativa a unión de antígeno); Barbas y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.. 92:2529-2533 (1995) (describiendo el injerto de secuencias de CDR3 de cadena pesada y tres Fabs (SI- 1 , SI-40 y SI-32) contra ADN de placenta humana en la cadena pesada de un Fab toroide anti-tétano así reemplazando la CDR3 de cadena pesada existente y demostrando que el dominio de CDR3 solo confirió especificidad de unión); y Ditzel y otros, J. Immunol. 157:739-749 (1996) (describiendo estudios de injerto en donde la transferencia de solamente la CDR3 de cadena pesada de un LNA 3 Fab poliespecífico origen a una. cadena pesada de un anticuerpo Fab p313 de unión a IgG de tétano toroide monoespecífico fue suficiente para retener especificidad de unión del Fab origen). Cada una de estas referencias se incorpora a la presente por referencia en su totalidad. Por consiguiente, la presente invención provee anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios de CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo derivado de un animal humano o no humano, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unir específicamente a PTK7. Dentro de ciertos aspectos, la presente invención provee anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios de CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo de ratón o rata, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unir específicamente a PTK7. Dentro de algunas modalidades, dichos anticuerpos inventivos que comprenden uno o más dominios de CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo no humano (a) son capaces de competir por unirse; (b) retener las características funcionales; (c) unirse al mismo epítope; y/o (d) tener una afinidad de unión similar como el anticuerpo no humano parenteral correspondiente. Dentro de otros aspectos, la presente invención provee anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios de CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no h umano, en donde el anticuerpo humano es capaz de unirse específicamente a PTK7. Dentro de otros aspectos, la presente invención^ provee anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios de CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un primer anticuerpo humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no humano, en donde el primer anticuerpo humano es capaz de unirse específicamente a PTK7 y en donde el dominio de CDR3 del primer anticuerpo humano reemplaza un dom inio de CDR3 en un anticuerpo humano que carece de especificidad de unión para PTK7 para generar un segundo anticuerpo humano que sea capaz de unirse específicamente a PTK7. Dentro de algunas modalidades, dichos anticuerpos inventivos que comprenden uno o más dom inios de CDR3 de cadena pesada y/o ligera del primer anticuerpo humano (a) son capaces de competir por unirse; (b) retener las características funcionales; (c) unir al mismo epítope; y/o (d) tener una afinidad de unión similar como el primer anticuerpo humano parental correspondiente. En modalidades preferidas, el primer anticuerpo humano es 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a o 7C8.

Anticuerpos ten iendo secuencias de línea germinal particular En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada de uq gen de inm unoglobulina de cadena pesada de l ínea germinal particular y/o una región variable de cadena ligera de un gen de inmunoglobulina de cadena ligera de l ínea germinal particular.

Por ejemplo, en una modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen VH 3-30.3 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a PTK7, preferiblemente PTK7 humana. En otra modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen VH DP44 humano, en donde el anticuerpo une específicamente PTK7 , preferiblemente PTK7 humana. En otra modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen VH 3-33, en donde el anticuerpo une específicamente a PTK7 , preferiblemente PTK7 humana . Todavía en otra modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una reg ión variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen V? L 15, en , donde el anticuerpo une específicamente a PTK7, preferiblemente PTK7 humana. Todavía en otra modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que com prende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen V? A10, en donde el anticuerpo une específicamente a PTK7 , preferiblemente PTK7 humana. Todavía en otra modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen V« A27, en donde el anticuerpo une específicamente a PTK7, preferiblemente PTK7 humana. Todavía en otra modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen V? L6, en donde el anticuerpo une específicamente a PTK7, preferiblemente PTK7 humana. Todavía en otra modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo: (a) comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen VH 3-30.3, DP44 o 3-33 (el cual gen codifica la secuencia de am inoácidos establecida en SEC I D NOs: 51 , 52 ó 53, respectivamente); (b) comprende una región de cadena ligera q ue es el producto de o derivado de un gen V? L 1 5, A10, A27 o L6 (el cual gen codifica la secuencia de aminoácidos establecida en SEC I D NOs: 54, 55, 56 ó 57 , respectivamente) ; y (c) une específicamente a PTK7. Ejemplos de anticuerpos teniendo VH y V? de VH 3-30.3 y V? L 15, respectivamente, son 3G8 y 3G8a . Un ejemplo de un anticuerpo teniendo VH y V? de VH 3-30.3 y V? A 1 0, respectivamente, es 4D5. Un ejemplo de un anticuerpo teniendo VH y V? de VH DP44 y V? A27, respectivamente, es 12C6. Un ejemplo de un anticuerpo teniendo VH y V? DP44 y V? L15, respectivamente, es 12C6a. Un ejemplo de un anticuerpo teniendo VH y V? de VH 3-33 y V? L6, respectivamente, es 7C8. Como se usa en la presente, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de línea germinal particular si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa genes de inmunoglobulina de línea germinal humana. Dichos sistemas incluyen inmunizar un ratón transg.énico portando genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o filtrar una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana exhibida en fago con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana se puede identificar como tal al comparar la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano a las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulinas de línea germinal humana y seleccionar la secuencia de inmunoglobulina de linea germinal humana que está más cercana en secuencia (es decir, mayor % de identidad) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana particular puede contener diferencias de aminoácido en comparación con la secuencia de línea germinal, debido a, por ejemplo, mutaciones somáticas que ocurren de manera natural o introducción intencional de mutación de sitio dirigido. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado típicamente es al menos 90% idéntico en secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de línea germinal humana y contiene residuos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano como siendo humano al compararse con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de línea germinal de otras especies (por ejem plo, secuencias de línea germinal de ratón) . En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos 95% , o incluso al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntico en secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inm unoglobulina de l ínea germ inal . Típicamente, un anticuerpo humano derivado d s una secuencia de línea germinal humana particular exhibirá no más de 10 diferencias de aminoácido de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germ ina l humana . E n ciertos casos, el anticuerpo humano puede exhibir no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 ó 1 diferencia de aminoácido de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de l ínea germ inal .

Anticuerpos homólogos Todavía en otra modalidad , un anticuerpo de la invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos q ue son homologas a las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos preferidos descritos en. la presente, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-PTK7 de la invención. Por ejemplo, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde: (a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 1, 2, 3 y 4; (b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 5, 6, 7, 8, 9 y 10; y (c) el anticuerpo une a PTK7 humana con un KD de 1 x 10"7 M o menos; (d) el anticuerpo une a la línea celular de tumor de Wilms. En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos de VH y/o VL pueden ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homologas a las secuencias establecidas antes. Un anticuerpo que tiene regiones de VH y VL teniendo alta homología (es decir, 80% o más) a las regiones de VH y VL de las secuencias establecidas antes, se puede obtener por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis mediada por PCR o de sitio dirigido) de moléculas de ácido nucleico codificando SEC ID NOs: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, seguido por probar el anticuerpo alterado codificado para función retenida (es decir, las funciones establecidas en (c) y (d) anteriores) usando los ensayos funcionales descritos en la presente. Como se usa en la presente, el porcentaje de homolog ía entre las dos secuencias de aminoácidos es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homolog ía = # de posiciones idénticas/total # de posiciones x 100) , tomando en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se necesitan introducir para alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación de porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden lograr usando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes más adelante. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de E . Meyers y W. Miller ( Comput. Appl. Biosci. , 4: 1 1 -17 ( 1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuo de peso PAM 1 20, una penalidad de longitud de hueco de 12 y una penalidad de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en www. gcg . com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6. Adicional o alternativamente, las secuencias de proteina de la presente invención se pueden usar además como una "secuencia de búsqueda" para realizar una búsqueda contra bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden realizar usando el programa XBLAST (versión 2.0) de Altschul, y otros ( 1990) J. Mol. Biol. 21 5:403- 10. Se pueden realizar búsquedas de proteína BLAST con el programa XBLAST, calificación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de anticuerpo de la invención. Para obtener alineaciones con hueco para propósitos de comparación , se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul y otros ( 1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Al utilizar los programas BLAST y Gapped BLAST, los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y N BLAST) se pueden usar. (Ver wv/w. n cbi . nlm . nih . gov).

Anticuerpos con modificaciones conservadoras En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR 1 , CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera q ue com prende secuencias de CDR 1 , CDR2 y CDR3, en donde una o más de estas secuencias de CDR comprenden secuencias de aminoácidos específicas con base en los anticuerpos preferidos descritos en la presente (por ejemplo, 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a o 7C8), o modificaciones conservadoras de los mismos, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-PTK7 de la invención. Por consiguiente, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, en donde: (a) la secuencia de CDR3 de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEC ID NOs: 19, 20, 21 y 22, y modificaciones conservadoras de las mismas; (b) la secuencia de CDR3 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencia de aminoácidos de SEC ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39 y 40, y modificaciones conservadoras de las mismas; y el anticuerpo exhibe una o más de las siguientes propiedades: (c) une específicamente a PTK7 humana; y (d) une a una línea celular de tumor de Wilms (ATCC No. Cuenta CRL-1441). En una modalidad preferida, la secuencia de CDR2 de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEC ID NOs: 15, 16, 17 y 18, y modificaciones conservadoras de las mismas; y la secuencia de CDR2 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEC I D NOs: 29, 30, 31 , 32, 33 y 34, y modificaciones conservadoras de las mismas. En otra modalidad preferida, la secuencia de CDR 1 de reg ión variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencias de SEC ID NOs: 1 1 , 12, 1 3 y 14, y modificaciones conservadoras de las mismas; y la secuencia de CDR 1 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEC ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 y 28, y modificaciones conservadoras de las mismas. Como se usa en la presente, el térm ino "modificaciones de secuencia conservadoras" debe referirse a modificaciones de am inoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de am inoácidos . Dichas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y omisiones de aminoácidos. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de la invención por técnicas estándar conocidas en la técnica, tal como mutagénesis de sitio dirigido y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son unas en donde el residuo de aminoácidos se reemplaza con un residuo de aminoácidos teniendo una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos teniendo cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De esta manera, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invención se puede reemplazar con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadena lateral y el anticuerpo alterado se puede probar para función retenida (es decir, las funciones establecidas en (c) y (d) anteriores) usando los ensayos funcionales descritos en la presente.

Anticuerpos gue unen al mismo epítope como anticuerpos anti-PTK7 de la invención En otra modalidad, la invención provee anticuerpos que unen al mismo epítope en PTK7 humana como cualquiera de los anticuerpos monoclonales de PTK7 de la invención (es decir, anticuerpos que tienen la habilidad de competir por unión a PTK7 con cualquiera de los anticuerpos monoclonales de la invención). En modalidades preferidas, el anticuerpo de referencia para estudios de competencia cruzada puede ser el anticuerpo monoclonal 3G8 (teniendo secuencias de VH y VL como se muestra en SEC ID NOs: 1 y 5, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 3G8a (teniendo secuencias de VH y VL como se muestra en SEC I D NOs: 1 y 6, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 4D5 (teniendo secuencias de VH y VL como se muestra en SEC I D NOs: 2 y 7, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 1 2C6 (teniendo secuencias de VH y VL como se muestra en SEC I D NOs: 3 y 8, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 12C6a (teniendo secuencias de VH y VL como se muestra en SEC I D NOs: 3 y 9, respectivamente) , o el anticuerpo monoclonal 7C8 (teniendo secuencias de VH y VL como se muestra en SEC ID NOs: 4 y 10, respectivamente). Dichos anticuerpos de competencia cruzada se pueden identificar con base en su habilidad de competir con 3G8, 3G9a , 4D5, 1 2C6, 1 2Coa o 7C8 en ensayos de unión de PTK7 estándar. Por ejemplo, se pueden usar análisis BIAcore, ensayos de ELI SA o citometría de flujo para demostrar competencia cruzada con los anticuerpos de la presente invención. La habilidad de un anticuerpo de prueba de inhibir la unión de, por ejemplo, 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a o 7C8, a PTK7 humana demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a o 7C8 para u nión a PTK7 humana y así une al mismo epítope en PTK7 humana com o 3G8, 3G8a , 4D5, 12C6, 12C6a o 7C8. En una modalidad preferida, el anticuerpo que une al mismo epítope en PTK7 humana como 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a o 7C8 es un anticuerpo monoclonal. Dichos anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar y aislar como se describe en los ejemplos.

Anticuerpos diseñados y modificados Un anticuerpo de la invención se puede preparar además usando un anticuerpo que tiene una o más secuencias de VH y/o V descritas en la presente como material de partida para diseñar un anticuerpo modificado, el cual anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas a partir del anticuerpo de partida. Un anticuerpo se puede diseñar al modificar uno o más residuos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones de estructura . Adicional o alternativamente, un anticuerpo se puede diseñar al modificar residuos dentro de la región(es) constante, por ejemplo para alterar la función(es) efectora del anticuerpo. Un tipo de diseño de región variable que se puede realizar es injerto de CDR. Anticuerpos interactúan con antígenos objetivo predominantemente a través de residuos de aminoácidos que se ubican en las seis regiones determ inantes de complementariedad de cadena pesada y ligera (CDRs). Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de CDRs son más diversas entre anticuerpos individuales que secuencias fuera de C DRs. Ya que las secuencias de C DR son responsables por la mayoría de las interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de anticuerpos específicos que ocurren de manera natural al construir vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR del anticuerpo específico que ocurre de manera natural injertado en secuencias de estructura a partir de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (ver, por ejemplo, Riechmann, L. y otros (1997) Nat?re 332:323-327: Jones, P. y otros (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. y otros (1989) Proc. Nati. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; patente de E.Ü.A. No. 5.225,539 a Winter, y patentes de E.U.A. Nos. 5,530,101; 5,585,089, 5,693,762 y 6,180,370 a Queen y otros). Por consiguiente, otra modalidad de la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 11, 12, 13 y 14, SEC ID NOs: 15, 16, 17 y 18 y SEC ID NOs: 29, 20, 21 y 22, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 y 28, SEC ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33 y 34 y SEC ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39 y 40, respectivamente. De esta manera, dichos anticuerpos contienen las secuencias de VH y VL de anticuerpo monoclonales 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a o 7C8 no obstante pueden contener diferentes secuencias de estructura a partir de estos anticuerpos. Dichas secuencias de estructura se pueden obtener de bases de datos de ADN públicas o referencias publicadas que incluyen secuencias de gen de anticuerpo de línea germinal . Por ejemplo, secuencias de ADN de línea germinal para genes de región variable de cadena pesada y ligera humana se pueden encontrar en la base de datos de secuencia de línea germinal humana "VBase" (disponible en Internet en www. mrc-cpe. cam . ac. uk/vbase) , así como en Kabat, E. A. , y otros ( 1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U . S. Department of Health and Human Services, N I H No. de publicación 91 -3242; Tomlinson, I . M . , y otros ( 1992) "The Repertoire of H uman Germ line VH Sequences Reveáis about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227: 776-798: y Cox, J . P. L. y otros ( 1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveáis a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24_: 827-836; los contenidos de cada uno de los cuales se incorporan expresamente a la presente por referencia. Como otro ejemplo, las secuencias de ADN de línea germinal para genes de región variable de cadena pesada y ligera se pueden encontrar en la base de datos de Genbank. Por ejemplo, las siguientes secuencias de línea germ inal de cadena pesada encontradas en el ratón HCo7 HuMAb están disponibles en los números de acceso del Genbank acompañantes: 1 -69 (NG_0010109, NT_024637 y BC070333) , 3-33 (NG_0010109 y NT_024637) y 3-7 (NG_001 01 09 y NT_024637) . Como otro ejemplo, las siguientes secuencias de línea germinal de cadena pesada encontradas en el ratón HCo12 HuMAb están disponibles en los números de acceso del Genbank acompañantes: 1 -69 (NG_00101 09, NT_024637 y BC070333), 5-51 (NG_001 0109 y NT_024637), 4-34 (NG_0010109 y NT_024637), 3-30.3 (?) y 3-23 (AJ406678). Se comparan secuencias de proteína de anticuerpo contra una base de datos de secuencia de proteína compilada usando uno de los métodos de búsqueda de similitud de secuencia llamado el Gapped BLAST (Altschul y otros ( 1997) Nucleic Acids Research 25: 3389-3402) , que es bien conocido a aquellos expertos en la técnica. BLAST es un algoritmo heurístico en cuanto a una alineación estad ísticamente significativa entre la secuencia de anticuerpo y la secuencia de base de datos probablemente contenga pares de segmento de calificación alta (HSP) de palabras alineadas. Los pares de segmento cuyas calificaciones no se pueden mejorar por extensión o recorte se llama un hit. Brevemente, las secuencias de nucleótido de origen VBASE (http://vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase 1/list2.php) se traducen y se retiene la región entre e incluyendo región de estructura de FR1 a FR3. Las secuencias de base de datos tienen una longitud promedio de 98 residuo s. Se eliminan secuencias duplicadas que son equivalentes exactos sobre la longitud entera de la proteína. Una búsqueda de BLAST para proteínas usando el programa blastp con parámetros estándar, predeterm inados excepto el filtro de baja complejidad, que se apaga , y la matriz de sustitución de BLOSU M62, filtra para 5 primeros hits dando equivalentes de secuencia. Las secuencias de nucleótido se traducen en todos los seis marcos y el marco con ningún codón de paro en el segmento de equivalencia de la secuencia de base de datos se considera el hit potencial. Esto, a su vez, es confirmado usando el programa tblastx de BLAST, que traduce la secuencia de anticuerpo en todos los seis marcos y compara aquellas traducciones a las secuencias de nucleótido VBASE traducidas dinámicamente en todos los seis marcos. Las identidades son equivalentes de aminoácidos exactos entre la secuencia de anticuerpo y ia base de datos de proteína sobre la longitud entera de la secuencia. Los positivos (identidades + equivalente de sustitución) no son idénticos sino sustituciones de aminoácidos guiadas por la matriz de sustitución BLOSU M62. Si la secuencia de anticuerpo ¡g uala dos de las secuencias de base de datos con la misma identidad, el hit con más positivos se decidiría ser el hit de secuencia equivalente. Las secuencias de estructura preferidas para usarse en los a nticuerpos de la invención son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias de estructura usadas por anticuerpos seleccionados de la invención, por ejem plo, similares a las secuencias de estructura de VH 3-30.3 (SEC I D NO: 51 ) y/o las secuencias de estructura de VH DP44 (SEC I D NO: 52) y/o las secuencias de estructura de VH 3-33 (SEC I D NO:53) y/o las secuencias de estructura de V? L 1 5 (SEC I D NO: 54) y/o las secuencias de estructura de V? A1 0 (S EC I D NO: 55) y/o las secuencias de estructura de V? L 15 (SEC I D NO: 54) y/o las secuencias de estructura de V« A27 (SEC ID NO:56) y/o las secuencias de estructura de V? L15 (SEC ID NO: 54) y/o las secuencias de estructura de V? L6 (SEC ID NO: 57) usadas por anticuerpos monoclonales preferidos de la invención. Las secuencias de CDR1 , CDR2 y CDR3 de VH, y las secuencias de CDR1 , CDR2 y CDR3 de V?, se pueden injertar en regiones de estructura que tienen la secuencia idéntica como aquella encontrada en el gen de inmunoglobulina de l ínea germ inal de la cual se deriva la secuencia de estructura, o las secuencias de CDR se pueden injertar en regiones de estructura que contienen una o más mutaciones en comparación con las secuencias de línea germ inal . Por ejemplo se ha descubierto que en ciertos casos es benéfico mutar residuos dentro de las regiones de estructura para mantener o realzar la habilidad de unión a antígeno del anticuerpo (ver, por ejemplo, patentes de E. U.A. Nos. 5, 530, 101 ; 5, 585, 089; 5, 693, 762 y 6, 1 80, 370 a Queen y otros) .

Otro tipo de modificación de región variable es mutar residuos de am inoácidos dentro de las reg iones CDR1 , CDR2 y/o CDR3 de VH y/o VK para así mejorar una o más propiedades de unión (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés. Se puede realizar mutagénesis de sitio dirig ido o mutagénesis mediada por PCR para introd ucir la mutación(es) y el efecto en unión de anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, se puede evaluar en ensayos in vitro o in vivo como se describe en la presente y se provee en los ejemplos. Preferiblemente , se introducen modificaciones conservadoras (como se discutió antes). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones u omisiones de aminoácidos, pero son preferiblemente sustituciones. Además, típicamente se altera no más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región CDR. Por consiguiente, en otra modalidad, la invención provee anticuerpos monoclonales anti-PTK7 aislados, o porciones de unión a antígeno de los mismos, comprendiendo una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región CDR1 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 11, 12, 13 y 14, o una secuencia de aminoácidos teniendo una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, omisiones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEC ID NOs: 11, 12, 13 y 14; (b) una región CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs:, 15, 16, 17 y 18, o una secuencia de aminoácidos teniendo una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, omisiones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEC ID NOs: 15, 16, 17 y 18, (c) una región CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 19, 20, 21 y 22, o una secuencia de aminoácidos teniendo una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, omisiones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEC ID NOs: 19, 20, 21 y 22; (d) una región CDR1 de V? que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 y 28, o una secuencia de aminoácidos teniendo una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, omisiones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEC ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 y 28; (e) una región CDR2 de V? que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC I D NOs: 29, 30, 31 , 32, 33 y 34, o una secuencia de aminoácidos teniendo una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, omisiones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEC I D NOs: 29, 30, 31 , 32, 33 y 34; y (f) una región CDR3 de V que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC I D NOs: 35, 36, 37, 38, 39 y 40, o una secuencia de aminoácidos teniendo una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, omisiones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEC I D NOs: 35, 36, 37, 38, 39 y 40. Los anticuerpos diseñados de la invención incluyen aquellos en donde se han hecho modificaciones a los residuos de estructura dentro de VH y/o V?, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo . Típicamente dichas modificaciones de estructura se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, una propuesta es "mutar de vuelta" uno o más residuos de estructura a la secuencia de l ínea germ inal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo q ue ha pasado por mutación somática puede contener residuos de estructura que difieren de la secuencia de l ínea germinal de la cual se deriva el anticuerpo. Dichos residuos se pueden identificar al com parar las secuencias de estructura de anticuerpo a las secuencias de l ínea germ inal de las cuales se deriva el anticuerpo. Por ejemplo, para 3G8 (y 3G8a), residuo de aminoácidos #28 (dentro de FR1 ) de VH es una isoleucina mientras que este residuo en la secuencia de línea germinal de VH 3-30.3 correspondiente es una treonina. Para regresar las secuencias de región de estructura a su configuración de línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden "mutar de vuelta" a la secuencia de línea germinal, por ejemplo, por mutagénesis de sitio dirigido o mutagénesis mediada por PCR (por ejemplo, residuo #28 de FR 1 de VH de 3G8 (y 3G8a) se puede "mutar de vuelta" de isoleucina a treonina) . Como otro ejemplo, para 12C6 (y 12C6a), el residuo de am inoácidos #44 (dentro de FR2) de VH es una treonina mientras que este residuo en la secuencia de l ínea germinal de VH DP44 es una glicina. Para regresar las secuencias de región de estructura a su configuración de línea germinal, por ejemplo, #44 (residuo #9 de FR2) de VH de 12C6 (y 1 2C6a) se puede "mutar de vuelta" de treonina a glicina . Dichos anticuerpos "m utados de vuelta" también deben estar abarcados por la invención . Otro tipo de modificación de estructura involucra mutar uno o más residuos dentro de la reg ión de estructura , o incluso dentro de una o más regiones CDR, para elim inar epítopes de célula T para así reducir la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Esta propuesta también es referida como "desinmunización" y se describe en más detalle en la publicación de patente de E. U.A. No. 200301 53043 por Carr y otros .

Adicional o alternativamente a las modificaciones hechas dentro de las regiones de estructura o CDR, se pueden diseñar anticuerpos de la invención para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tal como media vida de suero, fijación de complemento, unión de receptor Fc, y/o citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la invención se puede modificar qu ímicamente (por ejemplo, una o más porciones químicas se pueden fijar al anticuerpo) o modificar para alterar su glicosilación, una vez más para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas modalidades se describe en mayor detalle más adelante. La numeración de residuos en la región Fc es aquella del índice EU de Kabat. En una modalidad, la reg ión de gozne de CH 1 es modificada de modo que el número de residuos de cisteína en la región de gozne se altera, por ejemplo, aumentada o disminuida. Esta propuesta se describe más en la patente de E. U.A. No. 5,677,425 por Bodmer y otros . El número de residuos de cisteína en la región de gozne de CH 1 se altera para , por ejemplo, facilitar el ensamble de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticue rpo. E n otra modalidad, la región de gozne Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, una o más mutaciones de aminoácidos se introducen en la región de interfaz de dominio CH2-CH3 del fragmento de gozne Fc de modo que el anticuerpo tiene unión de proteína A de Staphylococcyl (SpA) impedida relativa a unión de SpA de dominio de gozne Fc nativa. Esta propuesta se describe en mayor detalle en la patente de E.U.A. No. 6,165,745 por Ward y otros. En otra modalidad, el anticuerpo se modifica para aumentar su vida media biológica. Son posibles varias propuestas. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de E.U.A. No. 6,277,375 a Ward. Alternativamente, para aumentar la vida media biológica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la región CH1 o CL para contener un epítope de unión receptor de salvamento tomado de dos circuitos de un dominio CH2 de una región Fc de un IgG, como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 5,869,046 y 6,121,022 por Presta y otros. Todavía en otras modalidades, la región Fc se altera al reemplazar por lo menos un residuo de aminoácidos con un residuo de aminoácidos diferente para alterar la función(es) efectora del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados a partir de residuos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 se puede reemplazar con un residuo de aminoácidos diferente de modo que el anticuerpo tiene una afinidad alterada para un ligando efector pero retiene la habilidad de unión a antigeno del anticuerpo origen. El ligando efector al cual se altera afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 de complemento. Esta propuesta se describe en mayor detalle en las patentes de E. U.A. Nos. 5,624, 821 y 5, 648, 260, ambas por Winter y otros. En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de residuos de aminoácidos 329, 331 y 322 se pueden reemplazar con un residuo de aminoácidos diferente de modo que él anticuerpo tiene unión C 1 q alterada y/o citotoxicidad dependiente de complemento reducido o abolida (CDC). Esta propuesta se describe en mayor detalle en las patentes de E. U.A. Nos. 6, 194, 551 por Idusogie y otros. En otro ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las posiciones de aminoácidos 231 y 239 se alteran para así alterar la habilidad del anticuerpo de fijar complemento. Esta propuesta se describe más en la publicación de PCT WO 94/29351 por Bodmer y otros. Todavía en otro ejemplo, la región Fc ee modifica para aumentar la habilidad del anticuerpo de mediar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo para un receptor Fcy al modificar uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267 , 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292 , 293, 294, 295, 296, 298, 301 , 303, 305, 307, 309, 312 , 315, 320, 322 , 324, 326, 327 , 329, 330, 331 , 333, 334, 335, 337 , 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419 , 430, 434, 435, 437 , 438 ó 439. Esta propuesta se describe más en la publicación de PCT WO 00/42072 por Presta . Además, los sitios de unión en lgG 1 humano para Fc?R 1 , FcyRI l , FcyRI I I y FcRn se han trazado y variantes con unión mejorada se han descrito (ver Shields, R. L. y otros (2001 ) J. Biol. Chem. 276:6591 -6604). Se mostraron mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 para mejorar la unión a Fc?RI I I . Adicionalmente, los siguientes mutantes de combinación se mostraron para mejorar unión de FcyRI I I : T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A. Todavía en otra modalidad , se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede hacer un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por antígeno. Dichas modificaciones de carboh idrato se pueden lograr, por ejemplo, al alterar uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia de anticuerpo. Por ejemplo, una o más sustituciones de am inoácidos se puede hacer que resultan en el im inación de uno o más sitios de glicosilación de estructura de reg ión variable para así eliminar g licosilación en ese sitio. Dicha aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por antígeno. Dicha propuesta se describe en mayor detalle en las patentes de E . U .A. Nos. 5, 714, 350 y 6, 350, 861 por Co y otros. Adicional o alternativamente, se puede hacer un anticuerpo que tiene un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado teniendo cantidades reducidas de residuos de fucósilo o un anticuerpo teniendo estructuras GIcNac bisegmentadas aumentadas. Dichos patrones de glicosilación alterados han sido demostrados para aumentar la habilidad ADCC de anticuerpos. Dichas modificaciones de carbohidrato se pueden lograr, por ejemplo, al expresar el anticuerpo en una célula huésped con maquinaria de g licosilación alterada. Se han descrito células con maquinaria de glicosilación alterada en la técnica y se pueden usar como células huésped en donde expresar anticuerpos recombinantes de la invención para así producir un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejem plo, las l íneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen del gen de fucosiltransferasa en las l íneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen fucosa en sus carbohidratos. Las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 FUT8"'" se crearon por la disrupción objetivo del gen FUT8 en células CHO/DG44 usando dos vectores de reemplazo (ver publicación de patente de E. U .A. No. 200401 1 0704 por Yamane y otros y Yamane-Ohnuki y otros (2004) Biotechnol Bioeng 87: 614-22). Como otro ejemplo, EP 1 , 176, 195 por Hanai y otros describe una l ínea celular con un gen FUT9 de funcionalidad interrumpida , que codifica una transferasa de fucosilo, de modo que los anticuerpos expresados en dicha línea celular exhiben hipofucosilación al reducir o elim inar la enzima relacionada con enlace a lfa 1 , 6. Hanai y otros tam bién describen l ineas celulares que tienen una actividad de enzima baja para agregar fucosa a la N-acetilglucosamina que une a la reg ión Fc del anticuerpo o no tiene la actividad enzimática, por ejemplo, la línea celular de m ieloma de rata YB2/0 (ATCC C RL 1662) . La publicación de PCT WO 03/035835 por Presta describe una línea celular CHO variante, células Lec13, con habilidad reducida de fijar fucosa a carbohidratos ligados a Asn(297), también resultando en hipofucosilación de anticuerpos expresados en que las células huésped (ver también Shields, R.L. y otros (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La publicación de PCT WO 99/54342 por Umana y otros describe líneas celulares diseñadas para expresar glicosil transferasas modificadoras de glicoproteína (por ejemplo, beta(1 ,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares diseñadas exhiben estructuras GIcNac bisegmentadas aumentadas lo que resulta en actividad de ADCC aumentada de los anticuerpos (ver también Umana y otros (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Alternativamente, los residuos de fucosa del anticuerpo se pueden cortar . usando una enzima fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa alfa-L-fucosidaea quita residuos de fucosilo de anticuerpos (Tarentino, A.L. y otros (1975) Biochem. 14:5516-23). Otra modificación de los anticuerpos en la presente que se contempla por la invención es pegilación. Un anticuerpo se puede pegilar, por ejemplo, para aumentar la vida media biológica (por ejemplo, suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, típicamente se hace reaccionar con glicol de polietileno (PEG), tal como un éster reactivo o aldehido derivado de PEG, bajo condiciones en donde uno o más grupos de PEG se fijan al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo vía una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Como se usa en la presente, el término "glicol de polietileno" debe abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivar otras proteínas, tal como mono (C 1 -C 10) glicol alcoxi- o ariloxi-polietileno o glicol-maleimida de polietileno. En ciertas modalidades, el anticuerpo a pegilarse es un anticuerpo aglicosilado. Métodos para pegilar proteínas son conocidos en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Ver, por ejemplo, EP 0 1 54 316 por Nishimura y otros y EP 0 401 384 por Ishikawa y otros.

Propiedades físicas del anticuerpo Los anticuerpos de la presente invención se pueden caracterizar además por las varias propiedades físicas de los a nticuerpos anti-PTK7. Se pueden usar varios ensayos para detectar y/o diferenciar clases diferentes de anticuerpos con base en estas propiedades físicas. En algunas modalidades, los anticuerpos de la presente invención pueden contener uno o más sitios de glicosilación en la reg ión variable de cadena ligera o pesada. La presencia de uno o más si tios de gl icosilación en la región variable puede resultar en inmunogenicidad aumentada del anticuerpo o una alteración del pK del anticuerpo debido a unión a antígeno alterada (Marshall y otros ( 1972) Annu Rev Biochem 4J_: 673-702; Gala FA y Morrison SL (2004) J Immunol 1 72 : 5489-94: Wallick y otros ( 1988) J Exp Med 168: 1099- 109; Spiro RG (2002) Glycobiology 1_2:43R-56R; Parekh y otros (1985) Nature 316:452-7: Mimura y otros (2000) Mol Imm?nol 37:697-706). La glicosilación ha sido conocida por ocurrir en motivos que contienen una secuencia N-X-S/T. La glicosilación de región variable se puede probar usando un ensayo Glycoblot, que corta el anticuerpo para producir un Fab, y después prueba la glicosilación usando un ensayo que mide oxidación de periodato y formación de base Schiff. Alternativamente, se puede probar la glicosilación de región variable usando cromatografía de luz Díonex (Dionex-LC), que corta sacáridos de un Fab en monosacáridos y analiza el contenido de sacárido individual. En algunas instancias, se prefiere tener un anticuerpo anti-PTK7 que no contiene glicosilación de región variable. Esto se puede lograr al seleccionar anticuerpos que no contienen el motivo de glicosilación en la región variable o al mutar residuos dentro del motivo de glicosilación usando técnicas estándar bien conocidas en la técnica. En una modalidad preferida, los anticuerpos de la presente invención no contienen sitios de isomerismo de asparagina. Una desamidací?n o efecto de ácido isoaspártico puede ocurrir en secuencias N-G o D-G, respectivamente. La desamidación o efecto de ácido isoaspártico resulta en la creación de ácido isoaspártico que disminuye la estabilidad de un anticuerpo al crear una estructura retorcida de una terminal de carboxi de cadena lateral en vez de la cadena principal. La creación de ácido isoaspártico se puede medir usando un ensayo iso-cuanto, el cual usa una HPLC de fase en reversa para probar ácido isoaspártico. Cada anticuerpo tendrá un punto isoeléctrico único (pl), pero por lo general caerán anticuerpos en el rango de pH de entre 6 y 9.5. El pl para un anticuerpo lgG1 típicamente cae dentro del rango de pH de 7-9.5 y el pl para un anticuerpo lgG4 típicamente cae dentro del rango de pH de 6-8. Los anticuerpos pueden tener un pl que está fuera de este rango. Aunque los efectos por lo general son desconocidos, hay especulación que los anticuerpos con un pl fuera del rango normal pueden tener algún desdoble e inestabilidad bajo condiciones in vivo. El punto isoeléctrico se puede probar usando un ensayo de enfoque isoeléctrico capilar, el cual crea un gradiente de pH y puede utilizar enfoque con láser para precisión aumentada (Janini y otros (2002) Electrophoresis 23.: 1605-11 ; Ma y otros (2001) Chromatographia 53_:S75-89; Hunt y otros (1998) J Chromatogr A 800:355-67). En algunas instancias, se prefiere tener un anticuerpo^ anti-PTK7 que contiene un valor pl que cae en el rango normal. Esto se puede lograr ya sea al seleccionar anticuerpos con un pl en el rango normal, o al mutar residuos de superficie cargados usando técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Cada anticuerpo tendrá un punto de fundición que es indicativo de estabilidad térmica (Krishnamurthy R y Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Una estabilidad térmica más alta indica mayor estabilidad global in vivo. El punto de fundición de un anticuerpo se puede medir usando técnicas tales como calorimetría de exploración diferencial (Chen y otros (2003) Pharm Res 20:1952- 60; Ghirlando y otros ( 1999) Immunol Lett 68_:47-52). TM? indica la temperatura del desdoble inicial del anticuerpo. TM2 indica la temperatura de desdoble completo del anticuerpo. Por lo general, se prefiere que el TM 1 de un anticuerpo de la presente invención sea mayor de 60°C, preferiblemente mayor de 65°C, incluso más preferible mayor de 70°C. Alternativamente, la estabilidad térmica de un anticuerpo se puede medir usando dicroísmo circular (Murray y otros (2002) J. Chromatoar Sci 40: 343-9). En una modalidad preferida , se seleccionan anticuerpos que no se degradan rápidamente. La fragmentación de un. anticuerpo anti- PTK7 se puede medir usando electroforesis capilar (CE) y MALDI- MS , como es bien entendido en la técnica (Alexander AJ y Hughes DE ( 1995) Anal Chem 67 : 3626-32). En otra modalidad preferida, se seleccionan anticuerpos que - tienen efectos de agregación mínimos. La agregación puede conducir al desencadenamiento de una respuesta inmune no deseada y/o propiedades farmacocinéticas alteradas o desfavorables . Por lo general, son aceptables anticuerpos con agregación de 25% o menos, preferiblemente 20% o menos, incluso más preferible 15% o menos, incluso más preferible 10% o menos e incluso más preferible 5% o menos. La agregación se puede medir por varias técnicas bien conocidas en la técnica , incluyendo cromatografía líquida, de alto rendimiento (H PLC) de columna de exclusión de tamaño (SEC), y d iseminación de luz para identificar monómeros , dímeros, trímeros o m u ltímeros.

Métodos de diseñar anticuerpos Como se discutió antes, los anticuerpos anti-PTK7 teniendo secuencias de VH y VK descritos en la presente se pueden usar para crear anticuerpos anti-PTK7 nuevos al modificar las secuencias de VH y/o VK, o la región(es) constante fijadas a las m ismas. De esta manera, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de un anticuerpo anti-PTK7 de la invención, por ejemplo, 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a o 7C8, se usan para crear anticuerpos anti-PTK7 estructuralmente relacionados que retienen por lo menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención , tal como unión a PTK7 humana. Por ejemplo, una o más regiones CDR de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 1 2C6a o 7C8, o mutaciones de las mismas , se puede combinar de manera recombinante con regiones de estructura conocidas y/u otras CDRs para crear anticuerpos ant'.-PTK7 adicionales, diseñados recombinantemente, de la invención, como se discutió antes. Otros tipos de modificaciones i ncluyen aquellas descritas en la sección previa. El material de partida para el método de diseño es una o más de las secuencias de VH y/o VK provistas en la presente, una o más regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo diseñado, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo teniendo una o más secuencias de VH y/o VK provistas en la presente, o una o más regiones CDR de las mismas. En vez, la información contenida en la secuencia(s) se usa como el material de partida para crear una secuencia(s) de "segunda generación" derivada de la secuencia(s) original y entonces la secuencia(s) de "segunda generación" se prepara y expresa como una proteína. Por consiguiente, en otra modalidad, la invención provee un método para preparar un anticuerpo anti-PTK7 que comprende: (a) proveer: (i) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de CDR1 seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 11, 12, 13 y 14, una secuencia de CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 15, 16, 17 y 18, y/o una secuencia de CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 19, 20, 21 y 22; y/o (ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de CDR1 seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 y 28, una secuencia de CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 29, 30, 31, 32, 3_3 y 34 y/o una secuencia de CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39 y 40; (b) alterar al menos un residuo de aminoácidos dentro de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera para crear por lo menos una secuencia de anticuerpo alterada; y (c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína. Se pueden usar técnicas de biológica molecular estándar para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada.

Preferiblemente, el anticuerpo codificado por la secuencia(s) de anticuerpo alterado es uno que retiene una, algunas o todas de las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-PTK7 descritos en la presente, las cuales propiedades funcionales incluyen, pero no se limitan a: (a) el anticuerpo une a PTK7 humana con un KD de 1 x 10-7 M o menos; (b) el anticuerpo une a la línea celular de tumor de Wilms. Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados se pueden evaluar usando ensayos estándar disponibles en la técnica y/o descritos en la presente, tales como aquellos establecidos en los ejemplos (por ejemplo, citometría de flujo, ensayos de unión). En ciertas modalidades de los métodos de diseñar anticuerpos de la invención, se pueden introducir mutaciones aleatoria o selectivamente ju nto con todo o parte de una secuencia codificadora de anticuerpo anti-PTK7 y los anticuerpos anti-PTK7 modificados resultantes se pueden filtrar para actividad de unión y/u otras propiedades como se describe en la presente. Se han descrito métodos de mutación en la técnica . Por ejemplo, la publicación de PCT WO 02/092780 por Short describe métodos para crear y filtrar mutaciones de anticuerpo usando mutagénesis de saturación, ensamble de ligación sintética , o una combinación de los mismos. Alternativamente, la publicación de PCT WO 03/074679 por Lazar y otros describe métodos de usar métodos de , filtración computacional para optimizar propiedades fisioqu ímicas de anticuerpos.

Moléculas de ácido nucleico codificando anticuerpos de la invención Otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se "aisla" o "hace sustancialmente puro" cuando se purifica lejos de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, por técnicas estándar, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, agrupación de CsCI, cromatografía de columna, electroforesis de gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica. Ver, F. Ausubel y otros, ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscíence, Nueva York. Un ácido nucleico de la invención puede ser, por ejemplo, ADN o ARN, y quizá contenga o no secuencias intrónicas. En una modalidad preferida, el ácido nucleico es una molécula de cADN. Se pueden obtener ácidos nucleicos de la invención usando técnicas de biología molecular estándar. Para anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados a partir de ratones transgénicos portando genes de inmunoglobulina humana como se describe más adelante), cADNs codificando las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo hecho por el hibridoma se pueden obtener por amplificación de PCR estándar o técnicas de clonación de cADN. Para anticuerpos obtenidos de una genoteca de inmunoglobulina (por ejemplo, usando técnicas de exhibición de fago), se puede recuperar ácido nucleico codificando el anticuerpo de la biblioteca. Las moléculas de ácido nucleico preferidas de la invención son aquellas que codifican las secuencias de VH y VL de los anticuerpos monoclonales de 3G8, 3G8a , 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias de VH de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6. 12C6a y 7C8 se muestran en SEC I D NOs: 41 (3G8 y 3G8a) . 42 (4D5). 43 ( 12C6 y 12C6a) y 44 (7C8). Las secuencias de ADN que codifican las secuencias de VL de 3G8, 3G8a , 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en SEC I D NOs: 45, 46, 47, 48, 49 y 50, respectivamente. Una vez q ue se obtienen fragmentos de ADN codificando secuencias de VH y VL, estos fragmentos de ADN se pueden manipular más por técnicas de ADN recombinante estándar, por ejemplo, para convertir los genes de región variable a genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, a genes de fragmento Fab o a un gen scFv. ?rt esas mani pulaciones, un fragmento de ADN codificando VL o VH se liga operativamente a otro fragmento de ADN codificando otra proteína , tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El término "ligado operativamente" , como se usa en este contexto, debe significar que los dos fragmentos de ADN se juntan de modo que las secuencias de aminoácidos codificadas por los fragmentos de ADN permanecen en marco. El ADN aislado que codifica la reg ión de VH se puede convertir en un gen de cadena pesada de longitud completa al ligar operativamente el ADN codificando VH a otra molécula de ADN codificando regiones constantes de cadena pesada (CH 1 , CH2 y CH3). Las secuencias de genes de región constante de cadena pesada humana son conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Kabat, E . A. , y otros (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, N I H No. de publicación 91 -3242) y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener por amplificación de PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de lgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE , IgM o IgD, pero muy preferible es una región constante de lgG 1 o lgG4. Para un gen de cadena pesada de fragmento Fab, el ADN codificando VH se puede ligar operativamente a otra molécula de ADN codificando solamente la región constante CH 1 de cadena pesada. El ADN aislado codificando la región de VL se puede convertir en un gen de cadena ligera de long itud completa (así como un gen de cadena ligera Fab) al ligar operativamente el ADN codificando VL a otra molécula de ADN codificando la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de región constante de cadena ligera humana se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Kabat, E. A. y otros ( 1 991 ) Sequences of Proteins of lmmunological? lnierest, quinta edición, U .S. Department of Health and Human Services, N I H no. de publicación 91 -3242) y fragmentos de ADN abarcando éstas reg iones se pueden obtener por amplificación de PC R estándar. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero muy preferible es una región constante kappa.

Para crear un gen scFv, los fragmentos codificando VH y VL se ligan operativamente a otro fragmento codificando un enlazador flexible, por ejemplo, codificando la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de modo que las secuencias de VH y VL se pueden expresar como una proteína de cadena individual contigua, con las regiones de VH y VL unidas por el enlazador flexible (ver, por ejemplo, Bird y otros ( 1988) Science 242 :423-426: Huston y otros ( 1 988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty y otros ( 1990) Nature 348: 552-554).

Producción de anticuerpos monoclonales de la invención Se pueden producir anticuerpos monoclonales (mAbs) de la presente invención por una variedad de técnicas, incluyendo metodolog ía de anticuerpo monoclonal convencional, por ejemplo, la técnica de hibridación celular somática estándar de Kohler y Milstein ( 1 975) Nature 256:495. Aunque se prefieren procedim ientos de hibridación celular somática, en principio, se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpo monoclonal, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B. El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema de ratón . La producción de hibridpma en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión son bien conocidos en la técnica. También se conocen parejas de fusión (por ejemplo, células de mieloma de ratón) y procedimientos de fusión. Se pueden preparar anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención con base en la secuencia de un anticuerpo monoclonal de ratón preparado como se describió antes. Se puede obtener ADN codificando las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera del hibridoma de ratón de interés y se puede diseñar para contener secuencias de inmunoglobulina no de ratón (por ejemplo, humano) usando técnicas de biología molecular estándar. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables de ratón se pueden ligar a regiones constantes humanas usando métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,816,567 a Cabilly y otros). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR de ratón se pueden insertar en una estructura humana usando métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, patente de E U.A No. 5,225,539 a Winter, y patentes de E.U.A. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 a Queen y otros). En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Dichos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra PTK7 se pueden generar usando ratones transgénicos o transcromosómicos portando partes del sistema inmune humano en vez del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromos?micos incluyen ratones referidos en la presente como ratones HuMAb y ratones KM mice™, respectivamente, y se refieren colectivamente en la presente como "ratones Ig humanos". El ratón HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) contiene miniloci de gen de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada humana no reacomodada (µ y y) y cadena ligera K, junto con mutaciones objetivo que inactivan los loci de cadena µ y K endógenos (ver, por ejemplo, Lonberg, y otros (1994) Nature 368(6474):856-859). Por consiguiente, los ratones exhiben expresión reducida de IgM o K de ratón, y en respuesta a inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humanos introducidos pasan por cambio de clase y mutación somática para generar monoclonal lgG? humano de alta afinidad (Lonberg, N. y otros (1994), supra; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101 ; y Harding, F. y Lonberg, N (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y uso de ratones HuMab, y las modificaciones genómicas portadas por dichos ratones, se describe además en Taylor, L.; y otros (1992) Nucleic Acids Research 20.:6287-6295; Chen, J. y otros (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon y otros (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi y otros (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. y otros (1993) EMBOs J. 1_2:821-830; Tuaillon y otros (1994) J. Immunol. 1_52_:2912-2920; Taylor, L. y otros (1994) International Immunology 6:579-591; y Fishwild, D. y otros (1996) Nature Biotechnology 14:845-851, los contenidos de las cuales se incorporan específicamente a la presente por referencia en su totalidad. Ver además, patentes de E.U.A. Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; todas a Lonberg y Kay; patente de E.U.A. No. 5,545,807 a Surani y otros; publicaciones de PCT Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas a Lonberg y Kay; y publicación de PCT No. WO 01/14424 a Korman y otros. En otra modalidad, se pueden elevar anticuerpos humanos de la invención usando un ratón que porta secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que porta un transgén de cadena pesada humano y un transcromosoma de cadena ligera humana. Dichos ratones, referidos en la presente como "KM mice™", se describen en detalle en la publicación de PCT WO 02/43478 a Ishida y otros. Todavía más, sistemas de animal transgénico alternativos expresando genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se pueden usar para elevar anticuerpos anti-PTK7 de la invención. Por ejemplo, se puede usar un sistema transgénico alternativo referido como el Xenoratón (Abgenix, Inc.); dichos ratones se describen en, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 y 6,162,963 a Kucherlapati y otros. Además, sistemas de animal transcromosómico alternativos expresando genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la. técnica y se pueden usar para elevar anticuerpos anti-PTK7 de la invención. Por ejemplo, se pueden usar ratones portando tanto un transcromosoma de cadena pesada humana como un transcromosoma de cadena ligera humana, referidos como "TC mice"; dichos ratones se describen en Tomizuka y otros (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 9_7:722-727. Además, se han descrito vacas portando transcromosomas de cadena pesada y ligera humanas en la técnica (Kuroiwa y otros (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) y se pueden usar para elevar anticuerpos anti-PTK7 de la invención. También se pueden preparar anticuerpos monoclonales humanos de la invención usando métodos de exhibición para filtrar bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Dichos métodos de exhibición de fago para aislar anticuerpos humanos se establecen en la técnica. Ver, por ejemplo: patentes de E.U.A. Nos. 5,225,409; 5,403,484; y 5,571,698 a Ladner y otros; patentes de E.U.A. Nos. 5,427,908 y 5,580,717 a Dower y otros; patentes de E.U.A. Nos. 5,969,108 y 6,172,197 a McCafferty y otros; y patentes de E.U.A. Nos. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,582,915 y 6,593,081 a Griffiths y otros. También se pueden preparar anticuerpos monoclonales humanos de la invención usando ratones SCID en donde se han reconstituido células inmunes humanas de modo que se puede generar una respuesta a anticuerpo humano al inmunizar. Dichos ratones se describen en, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,476,996 y 5,698,767 a Wilson y otros.

Inmunización de ratones Ig humanos Cuando se usan ratones Ig humanos para elevar anticuerpos humanos de la invención, dichos ratones se pueden inmunizar con una preparación purificada o enriquecida de antígeno de PTK7 y/o PTK7 recombinante, o una proteína de fusión de PTK7, como se describe por Lonberg, N . y otros ( 1994) Nature 368_(6474):856-859; Fishwild, D. y otros ( 1996) Nature Biotechnology 14:845-851 ; y publicación de PCT WO 98/24884 y WO 01 /14424. Preferiblemente, los ratones tendrán 6-16 semanas de edad en la primera infusión. Por ejemplo, se puede usar una preparación purificada o recombinante (5-50 µg) de antígeno de PTK7 para inmunizar los ratones Ig humanos intraperitonealmente. Procedimientos detallados para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos a PTK7 se describen en el ejemplo 1 más adelante. La experiencia cumulativa con varios antígenos ha mostrado que los ratones transgénicos responden cuando son inmunizados al inicio intreperitonealmente (I P) con antígeno en adyuvante de Freund completo, seguido por inmunizaciones I P cada otra semana (hasta un total de 6) con antígeno en adyuvante de Freund incompleto. Además, células enteras en ausencia de adyuvante se descubre son altamente inmunogénicas. La respuesta inmune se puede monitorear .sobre el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma siendo obtenidas por hemorragias retroorbitales. El plasma se puede filtrar por ELI SA (como se describe más adelante) , y ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-PTK7 se puede usar para fusiones. Los ratones pueden ser estimulados intravenosamente con antígeno 3 días antes del sacrificio y eliminación del bazo. Se espera que se necesite realizar 2-3 fusiones por cada inmunización. Entre 6 y 24 ratones típicamente son inmunizados por cada antigeno. Usualmente se usan ambas variedades HCo7 y HCo12. Además, se pueden criar tanto el transgén HCo12 como HC012 juntos en un ratón individual teniendo dos diferentes transgenes de cadena pesada humana (HCo7/HCo12). Alternativa o adicionalmente, la variedad de KM mouse™ se puede usar, como se describe en el ejemplo 1.

Generación de hibridomas produciendo anticuerpos monoclonales humanos de la invención Para generar hibridomas produciendo anticue-pos monoclonales humanos de la invención, se pueden aislar y fusionar esplenocitos y/o células de nodo linfático de ratones inmunizados a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se pueden filtrar para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, se pueden fusionar suspensiones celulares individuales de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados a un sexto el número de células de mieloma de ratón no secretor de P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con 50% de PEG. Se laminan células a aproximadamente 2 x 10s en placa de microtítulo de fondo plano, seguido por una incubación de dos semanas en medio selectivo conteniendo 20% de suero de clon fetal, 18% de medio acondicionado "653", 5% de origen (IGEN), 4 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 5mM de HEPES, 0.055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y 1X de HAT (Sigma; el HAT se agrega 24 horas después de la fusión). Después de aproximadamente dos semanas, se pueden cultivar células en medio en donde se reemplaza HAT con HT. Entonces se pueden filtrar pozos individuales por ELISA para anticuerpos de IgM e IgC monoclonales humanos. Una vez ocurrido el crecimiento de hibridoma extensivo, se puede observar el medio usualmente después de 10-14 días. Se pueden volver a laminar los hibridomas secretando anticuerpo, una vez más filtrar, y si siguen positivos para IgG humano, los anticuerpos monoclonales se pueden subclonar por lo menos dos veces por dilución limitante. Los subclones establer entonces se pueden cultivar in vivo para generar cantidades pequeñas de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para caracterización. Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, se pueden hacer crecer hibridomas seleccionados en frascos centrifugadores de dos litros para purificación de anticuerpo monoclonal. Se pueden filtrar y concentrar sobrenadantes antes de cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Se puede verificar el IgG extraído por electroforesis de gel y cromatografía líquida de alto rendimiento para asegurar pureza. La solución reguladora se puede intercambiar en PBS, y la concentración se puede determinar por OD2ßo usando 1 .43 coeficiente de extinción. Los anticuerpos monoclonales se pueden alicuotar y almacenar a -80°C.

Generación de transfectomas produciendo anticuerpos monoclonales de la invención También se pueden producir anticuerpos de la invención en un transfectoma de célula huésped usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección de genes como es bien conocido en la técnica (por ejemplo, Morrison, S . (1985) Science 229: 1202). Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de los mismos , ADNs codificando cadenas ligeras y pesadas de longitud parcial o completa, se pueden obtener por técnicas de biología molecular estándar (por ejem plo, amplificación de PC R o clonación de cADN usando un hibridoma que expresa el anticuerpo de i nterés) y los ADNs se pueden insertar en vectores de expresión de modo que los genes se ligan operativamente a secuencias de control de transcripción y traducción . En este contex :o, el térm ino "ligado operativamente" debe significar que un gen de anticuerpo se liga en un vector de modo que las secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector sirven su función destinada de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y secuencias de control de expresión se eligen para ser compatibles con la célula huésped de expresión usada. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo se pueden insertar en un vector separado o, más típicamente, ambos genes se pueden insertar en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión por métodos estándar (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento de gen de anticuerpo y vector, o ligación de punta desafilada si no hay sitios de restricción). Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente se pueden usar para crear genes de anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo al insertarlos en vectores de expresión ya codificando regiones constantes de cadena pesada y regiones constantes de cadena ligera del isotipo deseado, de modo que el segmento de VH se liga operativamente al segmento(s) de CH dentro del vector y el segmento de V? se liga operativamente al segmento de C dentro del vector. Adicional o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula huésped. El gen de cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector, de modo que el péptido de señal se liga en marco a la terminal amino del gen de cadena anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heteróloga (es decir, un péptido de señal de una proteína no de inmunoglobulina). Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula huésped. El término "secuencia reguladora" debe incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 1 85, Academic Press, San Diego, CA ( 1990)). Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de dichos factores como la elección de la célula huésped a ser transformada, el nivel de expresión de proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresión de célula huésped de mam ífero incluyen elementos virales que dirigen niveles altos de expresión de proteína en células de mam ífero, tales como promotores y/o potenc»adores derivados de citomegalovirus (CMV), Sim ian Virus 40 (SV40) , adenovirus (por ejemplo, el promotor posterior principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Alternativamente, se pueden usar secuencias reguladoras no virales, tal como el promotor de ubiquitina o promotor de ß-globina. Todavía más, los elementos reguladores compuestos de secuencias de fuentes diferentes, tal como el sistema promotor SRa, que contiene secuencias del primer promotor SV40 y la repetición terminal larga de virus de leucemia de célula T humana tipo 1 (Takebe, Y. y otros ( 1 988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472). Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, ios vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como las secuencias que regulan la réplica del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de réplica) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en donde se ha introducido el vector (ver, por ejemplo, patentes de E . U .A. Nos. 4, 399,216, 4,634,665 y 5, 179, 017, todas por Axel y otros) . Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en donde se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DH FR) (para usarse en células huésped de dhfr con selección/amplificación de metotrexato) y el gen de neo (para selección de G41 8). Para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas, el vector(es) de expresión codificando las cadenas pesadas y ligeras se transfecta en una célula huésped por técnicas estándar. Las varias formas del término "transfección" deben abarcar una variedad amplia de técnicas usadas comúnmente para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariótica o eucariójica, por ejemplo, electroporación, precipitación de calcio-fosfato, transfección de DEAE-dextrina y similares, aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en células huésped procarióticas o eucarióticas, la expresión de anticuerpos en células eucarióticas, y muy preferible células huésped de mam ífero, es la más preferida porque dichas células eucarióticas, y en particular células de mam ífero, tienen más probabilidad que las células procarióticas de ensamblar y secretar un anticuerpo propiamente doblado e inmunológicamente activo. La expresión procariótica de genes de anticuerpo ha sido registrada como inefectiva para la producción de altos rendimientos de anticuerpo activo (Boss, M . A. y Wood , C. R. ( 1 985) Immunology Today 6: 12- 13) . Las células huésped de mam ífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (células de CHO) (incluyendo células de CHO de dhfr, descritas en U riaub y Chasin , (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 7_7:421 6-4220, usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J . Kaufman y P. A. Sharp ( 1982) Mol. Biol. 1 59: 601 -621 ) . células de mieloma de NSO, células de COS y células de S P2. En particular, para usarse con células de mieloma de NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión de gen GS descrito en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338, 841 . Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes codificando genes de anticuerpo en células huésped de mam ífero, los anticuerpos se producen al cultivar las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para perm itir la expresión del anticuerpo en las células huésped o , más preferible, secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en donde se hacen crecer las células huésped .

Se pueden recuperar anticuerpos del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteína estándar.

Caracterización de unión de anticuerpo a antígeno Se pueden probar los anticuerpos de la invención para unión a PTK7, por ejemplo, por ELISA estándar. Brevemente, se revisten placas de microtítulo con PTK7 purificada a 0.25 µg/ml en PBS, y después se bloquean con 5% de albúmina de suero bovino en PBS. Se agregan diluciones de anticuerpo (por ejemplo, diluciones de plasma de ratones inmunizados con PTK7) a cada pozo y se incuban durante 1-2 horas a 37°C. Las placas se lavan con PBS/Tween y después se incuban con reactivo secundario (por ejemplo, para anticuerpos humanos, un reactivo policlonal específico de IgG Fc de cabra anti-humano) conjugadas a fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37°C. Después de lavar, las placas se desarrollan con sustrato de pNPP (1 mg/ml), y se analizan a OD de 405-650. Preferiblemente, los ratones que desarrollan los títulos más altos se usarán para fusiones. Un ensayo ELISA como se describió antes también se puede usar para filtrar hibridomas que muestren reactividad positiva con inmunogen de PTK7. Los hibridomas que unen con avidez a PTK7 se subclonan y caracterizan más. Un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células origen (por ELISA), se puede elegir para hacer un banco celular de 5-10 frascos almacenado a -140°C, y para purificación de anticuerpo.

Para purificar anticuerpos anti-PTK7, se pueden hacer crecer hibridomas seleccionados en frascos centrifugadores de dos litros para purificación de anticuerpo monoclonal. Se pueden filtrar sobrenadantes y concentrar antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ). Se puede verificar IgG extraído por electroforesis de gel y cromatografía líquida de alto rendimiento para asegurar pureza. La solución reguladora se puede intercambiar en PBS, y la concentración se puede determinar por OD280 usando 1.43 coeficiente de extinción. Los anticuerpos monoclonales se pueden alicuotar y almacenar a -80°C. Para determinar si los anticuerpos monoclonales de anti-PTK7 seleccionados unen a epítopes únicos, cada anticuerpo se puede biotinilar usando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Rockford, IL? Estudios de competencia usando anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpo monoclonales biotinilados se pueden realizar usando placas de ELISA revestidas con PTK7 como se describió antes. Se puede detectar la unión a mAb biotinilada con una sonda de strep-avidina-fosfatasa alcalina. Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, se puede realizar ELISAs de isotipo usando reactivos específicos para anticuerpos de un isotipo particular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, se pueden revestir pozos de placas de microtítulo con 1 µg/ml de inmunoglobulina anti-humano durante la noche a 4°C. Después de bloquear con 1% de BSA, las placas se hacen reaccionar con 1 µg/ml o menos de anticuerpos monoclonales de prueba o controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente durante una a dos horas. Los pozos entonces se pueden hacer reaccionar con sondas conjugadas con fosfatasa alcalina específicas de IgM humano o lgG 1 humano. Se desarrollan y analizan placas como se describió antes. Se pueden probar además IgGs humanos anti-PTK7 para reactividad con antígeno de PTK7 por Western blotting . Brevemente, se puede preparar PTK7 y someter a electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecilo sulfato sódico. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa , bloqueadas con 1 0% de suero de cabra fetal, y en sonda con los anticuerpos monoclonales a ser probados. La unión de IgG humano se puede detectar usando fosfatasa alcalina de IgG anti-humano y desarrollar con tablet as de sustrato de BCI P/NBT (Sigma Chem . Co. , St. Louis, Mo) .

I nm unoconiugados En otro aspecto, la presente invención muestra un anticuerpo anti-PTK7, o un fragmento del m ismo, conjugado a una porción terapéutica, tal como una citotoxina , un fármaco (por ejemplo, un inm unosupresor) o una radiotoxina. Dichos conjugados son referidos en la presente como "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas son referidos como "inmunotoxinas". U na citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea dañino a (por ejemplo, mate) células. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, coquicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracita diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazína), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloroetamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (antes daunomicina) y doxorubicina), antibióticos , (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapéuticas que se pueden conjugar a un anticuerpo de la invención incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas y auristatinas y derivados de los mismos. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpo de caliqueamicina está comercialmente disponible (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst). Ejemplos de citotoxinas terapéuticas se pueden encontrar, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 6548530 y 6281 354 y publicación de patente de E. U.A. Nos. : US 2003/0064984, US 2003/0073852 y US 2003/0050331 . Se pueden conjugar citotoxinas a anticuerpos de la invención usando tecnología enlazadora disponible en la técnica. Ejemplos de tipos de enlazador que se han usado para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioéteres, esteres, disulfuros y enlazadores que contienen péptido. Un enlazador se puede elegir, es decir, por ejemplo, susceptible a corte por pH bajo dentro del compartimento lisosomal o susceptible a corte por proteasas, tales como proteasas expresadas de preferencia en tejido de tumor tales como catepsinas (por ejemplo, catepsinas B, C, D) . Para más discusión sobre tipos de citotoxinas, enlazadores y métodos para conjugar agentes terapéuticos a anticuerpos, ver también Satio, G. y otros (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail , P .A. y otros (2003) Cáncer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne, G. (2003) Cáncer Cell 3: 207-21 2; Alien, T. M. (2002) Nat. Rev.

Cáncer 2:750-763; Pastan , I . y Kreitman, R.J . (2002) Curr. Opin.

Investig. Dr?gs 3: 1089-1091 ; Senter, P. D. y Springer, C.J. (2001 ) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264. Los anticuerpos de la presente invención también se pueden conjugar a un isótopo radioactivo para generar radiofarmacéuticos citotóxicos, también referidos como radioinmunoconjugados.

Ejemplos de isótopos radioactivos que se pueden conjugar a anticuerpos para usarse diagnóstica o terapéuticamente incluyen , pero no se limitan a, yodo131, indio111, itrio90 y lutecio177. Se establecen métodos para preparar radioinmunoconjugados en la técnica. Ejemplos de radioinmunoconjugados están comercialmente disponibles, incluyendo Zevalín™ (IDEC Pharmaceuticals) y Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), y métodos similares se pueden usar para preparar radioinmunoconjugados usando los anticuerpos de la invención. Los conjugados de anticuerpo de la invención se pueden usar para modificar una respuesta biológica dada, y la porción de fármaco no se debe considerar como limitada a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido poseyendo una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, pseudomonas exotoxinas, o difteria toxina; una proteína tal como factor de necrosis de tumor o interferón-?; o modificadores de respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfoquinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulador de colonia de macrófago de granulocito ("GM-CSF"), factor estimulador de colonia de granulocito ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento. Las técnicas para conjugar dicha porción terapéutica a anticuerpos son bien conocidas, ver, por ejemplo, Arnon y otros, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs in Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld y otros (eds. ), pp. 243-56 (Alan R. Liss, I nc. 1985); Hellstrom y otros , "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a edición), Robinson y otros (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents I n Cáncer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y otros (eds.), pp. 475-5Ó6 ( 1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy" , en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin y otros (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe y otros, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates" , Immunol. Rev. , 62: 1 1 9-58 ( 1982) .

Moléculas biespecíficas En otro aspecto, la presente invención muestra moléculas biespecíficas que comprenden un anticuerpo anti-PTK7 , o un fragmento del mismo, de la invención . Un anticuerpo de la invención, o porciones de unión a antígeno del mismo, se pueden derivar o ligar a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica q ue une al menos dos sitios de unión diferentes o moléculas objetivo. El anticuerpo de la invención de hecho se puede derivar o ligar a más de dos sitios de unión diferentes y/o moléculas objetivo: dichas moléculas multiespecíficas también deben estar abarcadas por el término "molécula biespecífica" como se usa en la presente. Para crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención se puede ligar funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética , asociación no covalente o de lo contrario) a una o más otras moléculas de unión, tal como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimética de unión, de modo que resulta una molécula biespecífica. Por consiguiente, la presente invención incluye moléculas biespecíficas que comprenden por lo menos una primera especificidad de unión para PTK7 y una segunda especificidad de unión para un segundo epítope objetivo. En una modalidad particular de la invención , el segundo epítope objetivo es un receptor Fc, por ejemplo, FcyRI humano (CD64) o u n receptor Fca humano (CD89) . Por lo tanto, ia invención incluye moléculas biespecíficas capaces de unir tanto a células efectoras expresando FcyR o FcaR (por ejemplo, monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMNs)) , y a células objetivo expresa ndo PTK7. Estas moléculas biespecíficas buscan células expresando PTK7 a célula efectora y provocar actividades de célula efectora mediada por receptor Fc, tales como fagocitosis de una PTK7 expresando células, citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) , liberación de citoquina, o generación de anión de superóxido. En una modalidad de la invención en donde la molécula biespecífica es multiespecífica , la molécula puede incluir además una tercera especificidad de unión, además de una especificidad de unión anti-Fc y una especificidad de unión anti-PTK7. En una modalidad, la tercera especificidad de unión es una porción de factor anti-mejora (EF), por ejemplo, una molécula que une a una proteína de superficie involucrada en actividad citotóxica y así aumenta la respuesta inmune contra la célula objetivo. La "porción de factor anti-mejora" puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que une a una molécula dada, por ejemplo, un antígeno o un receptor, y así resulta en una mejora del efecto de los determinantes de unión para el receptor Fc o antígeno de célula objetivo. La "porción de factor anti-mejora" puede unir un receptor Fc o un antígeno de célula objetivo. La "porción de factor anti-mejora" puede unir un factor Fc o un antígeno de célula objetivo. Alternativamente, la porción de factor anti-mejora puede unir una entidad que es diferente de la entidad a la que se unen las primeras y segundas especificidades de unión. Por ejemplo, la porción de factor anti-mejora puede unir una célula T citotóxica (por ejemplo, vía CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra célula inmune que resulta en respuesta inmune aumentada contra la célula objetivo). En una modalidad, las moléculas biespecíficas de la invención comprenden como una especificidad de unión por lo menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de las mismas, incluyendo, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o un Fv de cadena individual. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv. o una construcción de cadena individual como se describe en Ladner y otros, patente de E. U.A. No. 4,946,778, los contenidos de la cual se incorporan a la presente por referencia. En una modalidad , la especificidad de unión para un receptor FCY se provee por un anticuerpo monoclonal, la unión del cual no está bloqueada por inmunoglobulina humana G (IgG). Como se usa en la presente, el término "receptor IgG" se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena Y ubicados en el cromosoma 1 . Estos genes codifican un total de doce isoformas de transmem brana o receptor soluble que se agrupan en tres clases de receptor FCY : Fc?RI (CD64), Fc?RI I (CD32), y Fc?RI I I (CD 16). En una modalidad preferida , el receptor FCY es un Fc?RI humano de alta afinidad. El Fc?RI humano es una molécula de 72 kDa, que muestra alta afinidad para IgG monomérica ( 108 - 109 M" 1 ). La producción y caracterización de ciertos anticuerpcs monoclonales anti-Fc? preferidos se describen por Fanger y otros en la publicación de PCT WO 88/00052 y en la patente de E. U .A. No. 4, 954,617, las enseñanzas de las cuales se incorporan por completo a la presente por referencia . Estos anticuerpos se unen a un epítope de Fc?RI , Rc?RI I o FcyRI I I en un sitio que es distinto del sitio de unión Fcy del receptor y, de esta manera , su unión no está bloqueada sustancialmente por niveles fisiológicos de IgG. Los anticuerpos anti-Fc?RI específicos en esta invención son mAb 22, mAb 32 , mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El hibridoma produciendo mAb 32 está disponible de la American Type Culture Collection (Colección de Cultivo Tipo Americano), ATCC número de acceso HB9469. En otras modalidades, el anticuerpo receptor anti-Fc? es una forma humanizada de anticuerpo monoclonal 22 (H22). La producción y caracterización del anticuerpo H22 se describe en Graziano, R. F. y otros ( 1995) J. Immunol 1_55_(10):4996-5002 y publicación de PCT WO 94/10332. La l ínea celular produciendo anticuerpo H22 fue depositada en la American Type Culture Collection bajo la designación HA022CL 1 y tiene el número de acceso CRL 1 1 177. Todavía en otras modalidades preferidas, la especificidad de unión para un receptor Fc se provee por un anticuerpo que une a un receptor IgA humano, por ejemplo, un receptor Fc-alfa (FcaRI (CD89)) , la unión del cual preferiblemente no es bloqueada por inmunoglobulina humana A (IgA) . El térm ino "receptor IgA" debe incluir el producto de gen de un a-gen (FcaRI) ubicado en el cromosoma 19. Este gen es conocido por codificar varias isoformas de transmembrana alternativamente divididas de 55 a 1 10 kDa. FcaRI (CD89) se expresa constitutivamente en monocitos/macrófagos, granulocitos eosinofílicos y neutrofílicos, pero no en poblaciones celulares no efectoras. FcaRI tiene afinidad media (=5 x 107 M' 1) para lgA1 e lgA2 , que se aumenta al exponer a citoquinas tales como G-CSF o GM-CSF (Morton , H . C . y otros ( 1996) Critical Reviews in Immunology 1_6:423-440) . Cuatro anticuerpos monoclonalejs FcaRI-específícos, identificados como A3, A59, A62 y A77, que unen a FcaFI fuera del dom inio de unión de ligando, se han descrito (Monteiro , R. C . y otros ( 1 992) J. Immunol. 148: 1764) .

FcaRI y Fc?RI son receptores provocadores preferidos para usarse en las moléculas biespecíficas de la invención ya que ( 1 ) se expresan primariamente en células efectoras inmunes, por ejemplo, monocitos, PMNs, macrófagos y células dendríticas; (2) se expresan a niveles altos (por ejemplo, 5,000-100,000 por célula); (3) mediadores de actividades citotóxicas (por ejemplo, ADCC, fagocitos); (4) median la presentación de antígeno mejorada de antígenos, incluyendo auto-antígenos, apuntados a ellos. Aunque se prefieren anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que se pueden emplear en las moléculas biespecíficas de la invención son anticuerpos monoclonales de ratón, quiméricos y humanizados. Las moléculas biespecíficas de la presente invención se pueden preparar al conjugar las especificidades de unión constituyentes; por ejem plo , las especificidades de unión anti-FcR y anti-PTK7, usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica se puede generar por separado y después conjugar entre sí . Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se puede usar una variedad de agentes de acoplamiento o entrelazamiento para conj ugación covalente. Ejemplos de agentes de entrelazamiento incluyen prote ina A, carbodiimida , N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5, 5'-ditiobi(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) , o-fenilendimaleim ida (oPDM) , N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) , y sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohaxano- 1 - carboxilato (sulfo-SMCC) (ver, por ejemplo, Karpovsky y otros ( 1984) J. Exp. Med. 160: 1686: Liu, MA y otros (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 8_2: 8648). Otros métodos incluyen aquellos descritos en Paulus (1985) Behring I ns. Mitt. No. 78, 1 18-132; Brennan y otros (1985) Science 229: 81 -83) . y Gennie y otros ( 1987) J. Immunol. 1 39:2367-2375). Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, I L). Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, se pueden conjugar vía unión de sulfhidrilo de las regiones de gozne de terminal C de las dos cadenas pesadas. En una modalidad particularmente preferida, la región de gozne se modifica para contener un número non de residuos de sulfhidrilo, preferiblemente uno, antes de la conj ugación . Alternativamente, ambas especificidades de unión se pueden codificar en el mismo vector y expresar y ensamblar en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil en donde la molécula biespecífica es un mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab proteína de fusión . Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de cadena individual que comprende un anticuerpo de cadena individual y un determinante de unión , o una molécula biespecífica de cadena individual que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender por lo menos dos moléculas de cadena individual. Se describen métodos para preparar moléculas biespecíficas por ejemplo en la patente de E. U.A. No. 5, 260,203; patente de E. U.A. No. 5,455,030; patente de E. U.A. No. 4, 881 , 1 75; patente de E. U .A. No. 5, 132,405; patente de E. U.A. No. 5, 091 ,513; patente de E. U .A. No. 5,476,786; patente de E. U .A. No. 5,013,653; patente de E. U .A. No. 5,258,498; y patente de E. U .A. No. 5,482, 858. La unión de las moléculas biespecíficas a sus objetivos específicos se puede confirmar, por ejemplo, por prueba inmunoabsorbente ligada a enzima (ELISA), radioinmunoprueba (RÍA) , análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición de crecimiento), o prueba Western blot. Cada uno de estos ensayos detecta por lo general la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de interés particular al emplear un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos de FcR-anticuerpo se pueden detectar usando, por ejemplo, un anticuerpo ligado a enzima o fragmento de anticuerpo que reconoce y une específicamente a los complejos de anticuerpo-FcR. Alternativamente, los complejos se pueden detectar usando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar radioactivamente y usar en un radioinmunoensayo (RÍA) (ver, por ejemplo, Weintraub, B. , Principies of Radioimmunoassays , Seventh Training Course on Radiol gand Assay Techniques, The Endocrine Society, Marzo, 1986, que se incorpora a la presente por referencia) . El isótopo radioactivo se puede detectar por dichos medios como el uso de un contador Y O por autorradiografía .

Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención provee una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales, o porción(es) de unión a antígeno del mismo, de la presente invención, formulada junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden incluir uno o una combinación de anticuerpos (por ejemplo, dos o más diferentes), o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o biespecíficos) que unen a epítopes diferentes en el antígeno objetivo o que tienen actividades complementarias. También se pueden administrar composiciones farmacéuticas de la invención en terapia de combinación , es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede inclu:r un anticuerpo anti-PTK7 de la presente invención combinado con al menos otro agente anti-inflamatopo o inm unosupresor. Ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en terapia de combinación se describen en mayor detalle más adelante en la sección de usos de los anticuerpos de la invención . Como se usa en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacteriales y antifúngicos, agentes retardadores isotónico y de absorción, y similares que sean fisiológ icamente com patibles . Preferi blemente, el portador es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, inmunoconjugado, o molécula biespecífica, sé puede revestir en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar al compuesto. Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una sal "farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada dei compuesto origen y no imparte ningún efecto toxicológico no deseado (ver, por ejemplo, Berge, S.M., y otros (1977) J. Pharm. Sci. 66_:1-19). Ejemplos de dichas sales incluyen sales acidas de adición y sales básicas de adición. Las sales acidas de adición incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, hidroyódico, fósforo y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos aiifáticos mono- y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos fenilo sustituidos, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales básicas de adición incluyen aquellas derivadas de metales alcalino térreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, asi como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendíamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etiendiamina, procaína y similares. Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: ( 1 ) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como ascorbilo palmitato, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propilo galato, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes metálicos, tales como ácido cítrico, ácido tetaacético de etilendiamina (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares. Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua , etanol, polioles (tales como glicerol, propileno glicol , polietileno glicol, y similares) , y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de oliva , y esteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo. Se puede mantener fluidez propia , por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestim iento, tal como lecitina , por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y por el uso de agentes tensioactivos. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservadores, agentes humidificadores, agentes emulsionantes y agentes dispersantes . Se puede asegurar prevención de presencia de microorganismos tanto por procedimientos de esterilización, supra, como por la inclusión de varios agentes antibacteriales y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico, y similares. También se puede desear incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, se puede dar lugar a absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable por la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en cuanto a cualquier medio convencional o agente sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones. Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármaco. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión conteniendo, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propileno glicol y polietileno glicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez propia, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de agentes tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Se puede causar absorción prolongada de las composiciones inyectables al incluir en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Se pueden preparar soluciones inyectables estériles al incorporar el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enum erados antes, según se requiera, seguido por microfíltración por esterilización . Por lo general, se preparan dispersiones al incorporar el compuesto activo en u n vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados antes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado congelado (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada previamente esterilizada del mismo. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosificación individual variará dependiendo del sujeto siendo tratado, y el modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosificación individual por lo general será aquella cantidad de la composición un efecto terapéutico. En general, de cien por ciento, esta cantidad variará de alrededor de 0.01 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, preferiblemente de alrededor de 0.1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, muy preferible de alrededor de 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento de ingrediente activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Se ajustan regímenes de dosificación para proveer la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, se puede administrar una pildora individual, se pueden adm inistrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. Forma de dosis unitaria como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de com puesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosis unitarias de la invención son dictadas por y directamente dependientes de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograrse, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de preparar compuestos tal como un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos. Para administración del anticuerpo, las dosificaciones varían de alrededor de 0.0001 a 1 00 mg/kg , y más usualmente 0.01 a 5 mg/kg , de peso corporal huésped. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser 0.3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal. 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del rango de 1 -10 mg/kg . Un régimen de tratam iento ejemplar abarca la adm inistración una vez por semana , una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosificación preferidos para un anticuerpo anti-PTK7 de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal vía administración intravenosa , con el anticuerpo siendo dado usando uno de los siguientes horarios de dosificación : (i) cada cuatro semanas para seis dosificaciones, después cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas. En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión se administran simultáneamente, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado cae dentro de los rangos indicados. El anticuerpo usualmente se administra en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica al medir niveles de sangre de anticuerpo al antígeno objetivo en el paciente. En algunos métodos, se ajusta la dosificación para lograr una concentración de anticuerpo de plasma de aproximadamente 1 -1000 µg/ml y en algunos métodos aproximadamente 25-300 µg/ml. Alternativamente, se puede administrar el anticuerpo como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia pueden variar en la vida media del anticuerpo en el paciente. En general , los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguido por anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. La dosificación y frecuencia de administración puede variar dependiendo si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes sobre un periodo largo de tiempo. Alg unos pacientes siguen recibiendo tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, una dosificación relativamente alta a intervalos relativamente cortos a veces se requiere hasta reducir o terminar el progreso de la enfermedad , y preferiblemente hasta que el paciente muestra mejora parcial o com pleta de síntomas de la enfermedad. Después, el paciente puede ser administrado un régimen profiláctico. Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar para así obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectivo para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición, y modo de administración, sin ser tóxica al paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleados, o el éster, sal o amida de los mismos, la vía de administración , el tiempo de administración , la velocidad de excreción del compuesto particular siendo empleado, la duración del tratam iento, otros fár macos, com puestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo , peso, condición , salud general e historial médico previo del paciente siendo tratado , y factores similares bien conocidos en la técnica de la medicina. Una "dosificación terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo anti-PTK7 de la invención resulta de preferencia en una disminución en severidad de síntomas de la enfermedad, un aumento en frecuencia y duración de periodos libres de síntomajs de la enfermedad, o una prevención de daño o incapacidad debido a la aflicción de la enfermedad . Por ejemplo, para el tratamiento de tumores, una "dosificación terapéuticamente efectiva" inhibe de preferencia el crecimiento celular o crecimiento de tumor por al menos aproximadamente 20%, más preferiblemente por al menos aproximadamente 40%, incluso más preferible por al menos aproximadamente 60%, y todavía más preferible por al menos 80% relativo a sujetos no tratados. La habilidad de un compuesto de inhibir el crecimiento de tumor se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición se puede evaluar al examinar la habilidad del compuesto de inhibir, dicha inhibición in vitro por ensayos conocidos al experto en la técnica. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, o de lo contrario mejorar los síntomas en un sujeto. Un experto en la técnica podría determinar dichas cantidades con base en dichos factores cómo el tamaño del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto, y la composición particular o vía de administración seleccionada. Una composición de la presente invención se puede administrar vía una o más vías de administración usando uno o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como se apreciará por el experto en la técnica, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración preferidas para anticuerpos de la invención incluyen intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenterales, por ejemplo, por inyección o infusión. La frase "administración parenteral" como se usa en la presente significa modos de administración diferentes de la administración del intestino y tópica, usualmente por inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, infraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intraesternal. Alternativamente, un anticuerpo de la invención se puede administrar por una vía no parenteral , tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópicamente. Los compuestos activos se pueden preparar con portadores que protegerán el compuesto contra liberación rápida , tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo, implantes, parches transdérmicos, y sistenas de surtido microencapsulado. Se pueden usar pol ímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno vinilo acetato, polianh ídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliacético. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o por lo general son conocidos a aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J . R. Robinson , ed. , Marcel Dekker, I nc. , Nueva York, 1978. Se pueden administrar composiciones terapéuticas con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad preferida , una com posición terapéutica de la invención se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmico sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las patentes de E. U .A. Nos. 5,399, 163; 5, 383,851 ; 5,312,335; 5, 064,413; 4,941 ,880; 4,790,824; o 4,596, 556. Ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: patente de E. U.A. No. 4,487,603, que describe una bomba de micro-infusión implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada; patente de E. U .A. No. 4,486, 194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de ta piel; patente de E. U .A. No. 4,447,233, que describe una bomba de infusión de medicación para surtir medicamento a una velocidad de infusión precisa; patente de E. U .A. No. 4,447,224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para surtido de fármaco continuo; patente de E. U .A. No. 4,439, 196, que describe un sistema de surtido de fármaco osmótico que tiene compartimentos de múltiple cámara; y patente de E. U .A. No. 4,475, 196, que describe un sistema de surtido de fármaco osmótico. Estas patentes se incorporan a la presente por referencia . Muchos otros dichos implantes, sistemas de surtido, y módulos son conocidos a aquellos expertos en la técnica . E n ciertas modalidades , los anticuerpos monoclonales humanos de la invención se pueden formular para asegurar distribución propia in vivo. Por ejemplo, la barrera de sangre-cerebro (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para asegurar que los com puestos tera péuticos de la invención crucen la BBB (sí se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricar liposomas, ver, por ejemplo, patentes de E.U.A. 4,522,811; 5,374,548 y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o más porciones que se transportan selectivamente en células u órganos específicos, así realzan el surtido de fármaco buscado (ver, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Las porciones objetivo ejemplares incluyen folato o biotina (ver, por ejemplo, patente de E.U.A. 5,416,016 a Low y otros); manosidas (Umezawa y otros (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038): anticuerpos (P.G. Bloeman y otros (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais y otros (1995) Antimicrob. Agents Chemother 39_:180); receptor de proteína A de agente tensioactivo (Briscoe y otros (1995) Am. J. Physiol. 1233:134): p120 (Schreier y otros (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); ver también K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123: J.J. Killion; I.J. Fidlar (1994) Immunomethods 4:273.

Usos y métodos de la invención Los anticuerpos, composiciones de anticuerpo y métodos de la presente invención tienen numerosas utilidades diagnósticas y terapéuticas in vitro e in vivo involucrando el diagnóstico y tratamiento de trastornos mediados con PTK7. En una modalidad preferida, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos humanos, por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a células en cultivo, in vivo o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de trastornos. Como se usa en la presente, el término "sujeto" debe incluir animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios, y reptiles. Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que tienen trastornos mediados por actividad de PTK7. Los métodos son particularmente adecuados para tratar pacientes humanos con un trastorno asociado con expresión de PTK7 aberrante. Cuando se administran anticuerpos a PTK7 junto con otro agente, los dos se pueden administrar en cualquier orden o simultáneamente. Dada la unión específica de los anticuerpos de la invención para PTK7, los anticuerpos de la invención se pueden usar para detectar específicamente expresión de PTK7 en la superficie de células y, además, se pueden usar para purificar PTK7 vía purificación por inmunoafinidad. La invención provee además métodos para detectar la presencia de antígeno de PTK7 humana en una muestra, o medir la cantidad de antígeno de PTK7 humana, que comprende contactar la muestra, y una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, que une específicamente a PTK7 humana, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o porción del mismo y PTK7 humana La formación de un complejo entonces se detecta, en donde una formación de complejo de diferencia entre la muestra comparada a la muestra de control es indicativa de la presencia de antígeno de PTK7 humana en la muestra. PTK7 se expresa en líneas celulares derivadas de carcinoma de colon pero no encontradas como expresadas en tejidos de colon de adulto humano (Mossie y otros ( 1995) Oncogene 11:2179-84) . También se observó expresión de PTK7 en algunas líneas celulares de melanoma y biopsias de melanoma (Easty, y otros (1997) Int. J. Cáncer 71_: 1061 -5) . Además, se descubrió que PTK7 está altamente sobreexpresada en muestras de leucemia mieloide aguda (Muller-Tidow y otros (2004) Clin. Cáncer Res. 10: 1241 -9). Un anticuerpo anti-PTK7 se puede usar solo para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. Alternativamente, un anticuerpo anti-PTK7 se puede usar en conjunto con otros agentes inmunogénicos, tratamientos de cáncer estándar u otros anticuerpos, como se describe más adelante.

Los cánceres preferidos cuyo crecim iento se puede inhibir usando los anticuerpos de la invención incluyen cánceres típicamente responsivos a inmunoterapia. Ejemplos no limitantes de cánceres preferidos para tratamiento incluyen cáncer de colon (incluyendo cáncer de intestino delgado) , cáncer de pulmón, cáncer de mama , cáncer pa ncreático, melanoma (por ejemplo, melanoma malig no metastático) , leucemia mieloide aguda, cáncer eje riñon, cáncer de vejiga, cáncer de ovario y cáncer de próstata. Ejemplos de otros cánceres que se pueden tratar usando los métodos de la invención incluyen cáncer renal (por ejemplo, carcinoma celular renal), glioblastoma, tumores cerebrales, leucemias crónicas o agudas incluyendo leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia de célula T adulto (T-ALL), leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfomas (por ejemplo, línfoma de Hodgkin y no de Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma de CNS primario, linfoma de célula T, linfoma de Burkitt, linfomas de célula grande anaplástica (ALCL), linfomas de célula T cutánea, linfomas de célula cortada pequeña nodular, linfomas de célula T periférica, linfomas de Lennert, línfomas inmunoblásticas, leucemía/linfomas de célula T (ATLL), cánceres de linfomas foliculares entroblásticos/centrocíticos (cb/cc), linfomas de célula grande difusa de linaje B, linfoma de célula T de tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) y linfomas basados en cavidad corporal asociados con VIH), carcinomas embrionales, carcinomas no diferenciados de la rino-faringe (por ejemplo, tumor de Schmincke), enfermedad de Castleman, Sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y otros linfomas de célula B, carcinomas nasofaringes, cáncer de huesos, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cerviz, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, tumores sólidos de infancia, cáncer de la vejiga, cáncer del riñon o uretra, carcinoma de la pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central (CNS), angiogé?esis de tumor, tumor de eje espinal, glioma de tronco cerebral, adenoma pituitaria, cáncer epidermoide, cáncer de célula escamosa, cánceres ambientálmente inducidos incluyendo aquellos inducidos por asbesto, por ejemplo, mesotelioma y combinaciones de dichos cánceres. Además, dada la expresión de PTK7 en varias células de tumor, los anticuerpos humanos, composiciones de anticuerpo y métodos de la presente invención se pueden usar para tratar un sujeto con un trastorno tumorigénico, por ejemplo, un trastorno caracterizado por la presencia de células de tumor expresando PTK7 incluyendo, por ejemplo, cáncer de colon (incluyendo cáncer del intestino delgado), melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastático), leucemia mieloide aguda, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de ovario y cáncer de próstata. Ejemplos de otros sujetos con un trastorno tumorigénico incluyen sujetos teniendo cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de célula renal), glioblastoma, tumores cerebrales, leucemias crónicas o agudas incluyendo leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia de célula T adulto (T-ALL), leucemia mieloíde aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfomas (por ejemplo, linfoma de Hodgkín y no de Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma de CNS primario, linfoma de célula T, linfoma de Burkitt, linfomas de célula grande anaplástica (ALCL), linfomas de célula T cutánea, linfomas de célula cortada pequeña nodular, linfomas de célula T periférica , linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticas, leucemia/linfomas de célula T (ATLL) , cánceres de linfomas foliculares entroblásticos/centrocíticos (cb/cc), linfomas de célula grande difusa de linaje B, linfoma de célula T de tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) y linfomas basados en cavidad corporal asociados con VI H) , carcinomas embrionales, carcinomas no diferenciados de la rino-faringe (por ejemplo, tumor de Schmincke) , enfermedad de Castleman , Sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y otros linfomas de célula B, carcinomas nasofaringes, cáncer de huesos, cáncer de piel , cáncer de la cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer rectal , cáncer de la región anal , cáncer de estómago, cáncer testícular, cáncer uterino, carcinoma de las trom pas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cerviz, carcinoma de la vagina , carcinom a de la vulva , cáncer del esófago, cáncer del i ntestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la g lándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la g lándu la adrenal , sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncei del pene, tumores sólidos de infancia, cáncer de la vejiga , cáncer del riñon o uretra , carcinoma de la pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central (CNS) , angiogénesis de tumor, tumor de eje espinal , g lioma de tronco cerebral, adenoma pituitaria , cáncer epidermoide , cáncer de célula escamosa, cánceres ambientalmente inducidos incluyendo aquellos inducidos por asbesto, por ejemplo, mesotelioma y combinaciones de dichos cánceres. Por consiguiente, en una modalidad, la invención provee un método de inhibir el crecimiento de células de tumor en un sujeto, comprendiendo administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-PTK7 o porción de unión a antígeno del mismo. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo anti-PTK7 humano (tal como cualquiera de los anticuerpos anti-PTK7 humanos descritos en la presente). Adicional o alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-PTK7 quimérico o humanizado. En una modalidad, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas y composiciones) de la invención se pueden usar para detectar niveles de PTK7 o niveles de células que contienen PTK7 en su superficie de membrana, los cuales niveles después se pueden ligar a ciertos síntomas de enfermedad. Alternativamente, los anticuerpos se pueden usar para inhibir o bloquear función de PTK7 que, a su vez, se puede ligar a la prevención o mejora de ciertos síntomas de enfermedad, así implicando PTK7 como un , mediador de la enfermedad. Esto se puede lograr al contactar una muestra experimental y una muestra de control con el anticuerpo anti-PTK7 bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y PTK7. Cualquier complejo formado entre el anticuerpo y PTK7 se detecta y compara en la muestra experimental y el control. En otra modalidad, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas y composiciones) de la invención se pueden probar al inicio para actividad de unión asociada con uso terapéutico o diagnóstico in vitro. Por ejemplo, las composiciones de la invención se pueden probar usando los ensayos citométricos de flujo descritos en los ejemplos más adelante. Los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas, inmunoconjugados y composiciones) de la invención tienen utilidad adicional en terapia y diagnóstico de enfermedades relacionadas con PTK7. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos, las moléculas multiespecíficas y biespecíficas y los inmunoconjugados se pueden usar para provocar in vivo o in vitro una o más de las siguientes actividades biológicas: inhibir el crecimiento de y/o matar una célula expresando PTK7; mediar fagocitosis o ADCC de una célula expresando PTK7 en presencia de células efectoras humanas; o bloquear unión de ligando de PTK7 a PTK7. En una modalidad particular, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas y composiciones) se usan in vivo para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de enfermedades relacionadas con PTK7. Ejemplos de enfermedades relacionadas con PTK7 incluyen, entre otros, cáncer de colon (incluyendo cáncer de intestino delgado), melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastático), leucemia mieloide aguda, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de ovario y cáncer de próstata. Vías adecuadas de administrar las composiciones de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la invención in vivo e in vitro son bien conocidas en la técnica y se pueden seleccionar por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpo se pueden administrar por inyección (por ejemplo, intravenosa o subcutánea). Las dosificaciones adecuadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y peso del sujeto y la concentración y/o form ulación de la composición de anticuerpo. Como se describió previamente, se pueden co-administrar anticuerpos anti-PTK7 humanos de la invención con uno o más agentes terapéuticos , por ejem plo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor. Ei anticuerpos se puede ligar al agente (como un ¡nm unocomplejo) o se puede administrar separado del agente . En el último caso (adm inistración separada), el a nticuerpo se puede adm inistrar antes, después o concurrentemente con el agente o se puede co-adm in istrar con otras terapias conocidas , por ejemplo, una terapia anti-cáncer, por ejemplo, radiación . Dichos agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes anti-neoplásticos tales como doxorubicina (adriamicina) , cisplatina bleomicina sulfato, carm ustina , clorambucil y ciclofosfamida hidroxiurea que, por sí mismos, solamente son efectivos a niveles que son tóxicos o subtóxicos a un paciente. Cisplatina se administra intravenosamente como una dosis de 1 00 mg una vez cada cuatro semanas y adriamicina se administra intravenosamente como una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La co-administración de los anticuerpos anti-PTK7 humanos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención con agentes quimioterapéuticos provee dos agentes anti-cáncer que operan vía mecanismos diferentes que producen un efecto citotóxico a células de tumor humanas. Dicha co-administración puede resolver problemas debido al desarrollo de resistencia a fármacos o un cambio en la antigenicidad de las células de tumor que los harían no reactivos con el anticuerpo. En una modalidad, se pueden usar inmunoconjugados de la invención para encontrar compuestos (por ejemplo, agentes terapéuticos, marcas, citotoxinas, radiotoxinas, inmunosupresores, etc.) a células que tienen receptores de superficie celular de PTK7 al enlazar dichos compuestos al anticuerpc. Por ejemplo, un anticuerpo anti-PTK7 se puede conjugar a cualquiera de los compuestos de toxina descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 6,281,354 y 6,548,530, publicación de patente de E.U.A. Nos. 20030050331, 20030064984, 20030073852 y 20040087497 o publicada en WO 03/022806, que se incorporan a la presente por referencia en sus totalidades. De esta manera, la invención provee también métodos para localizar células ex vivo o in vivo expresando PTK7 (por ejemplo, con una etiqueta detectable, tal como un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor de enzima). Alternativamente, los inmunoconjugados se pueden usar para matar células que tienen receptores de superficie celular de PTK7 al encontrar citotoxinas o radiotoxinas a PTK7. Células efectoras específicas de objetivo, por ejemplo, células efectoras ligadas a composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también se pueden usar como agentes terapéuticos. Células efectoras para objetivo pueden ser leucocitos humanos tales como macrófagos, neutrófilos o monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células asesinas naturales y otras células con receptor de IgG o IgA. Si se desea, se pueden obtener células efectoras del sujeto a ser tratado. Las células efectoras específicas de objetivo se pueden administrar como una suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administrado puede ser en el orden de 108-109 pero variará dependiendo del propósito terapéutico. En general, la cantidad será suficiente para obtener localización en la célula objetivo, por ejemplo, una célula de tumor expresando PTK7 y para matar célula de efecto, por ejemplo, mediante fagocitosis. También pueden variar las vías de administración. Se puede realizar terapia con células efectoras específicas de objetivo en conjunto con otras técnicas para eliminación de células de objetivo. Por ejemplo, la terapia anti-tumor usando las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención y/o células efectoras armadas con estas composiciones se pueden usar en conjunto con quimioterapia. Adicionalmente, se puede usar inmunoterapia de combinación para dirigir dos poblaciones efectoras citotóxicas distintas hacia rechazo de célula de tumor. Por ejemplo, anticuerpos anti-PTK7 ligados a Rl anti-Fc-gamma o anti-CD3 se pueden usar en conjunto con agentes de unión específicos receptores de IgG o IgA. También se pueden usar moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención para modular niveles de Fo?R o FcyR en células efectoras, tal como al tapar y eliminar receptores en la superficie celular. También se pueden usar mezclas de receptores anti-Fc para este propósito. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la invención que tienen sitios de unión de complemento, tales como porciones de lgG1, -2 o -3 o IgM que unen complemento, también se pueden usar en presencia de complemento. En una modalidad, tratamiento ex vivo de una población de células comprendiendo células objetivo con un agente de unión de la invención y células efectoras apropiadas se pueden suplementar por la adición de complemento o suero conteniendo complemento. Fagocitosis de células objetivo revestidas con un agente de unión de la invención se puede mejorar al unir proteínas de complemento. En otra modalidad, las células objetivo revestidas con las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también se pueden Usar por complemento. Todavía en otra modalidad, las composiciones de la invención no activan complemento. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la invención también se pueden administrar juntas con complemento. Por consiguiente, dentro del alcance de ia invención hay composiciones que comprenden anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas y suero o complemento. Estas composiciones son ventajosas en cuanto a que el complemento está ubicado en proximidad cercana a los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas. Alternativamente, los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas o biespecíficas de la invención y el complemento o suero se pueden administrar por separado. Por consiguiente, los pacientes tratados con composiciones de anticuerpo de la invención pueden ser administrados adicionalmente (antes de, simultáneamente con o después de la administración de un anticuerpo humano de la invención) con otro agente terapéutico, tal como un agente citotóxico o radiotóxico, que realza o aumenta el efecto terapéutico de los anticuerpos humanos. En otras modalidades, el sujeto puede ser tratado adicionalmente con un agente que modula, por ejemplo, realza o inhibe, la expresión o actividad de FCY O receptores de FCY, por ejemplo, al tratar al sujeto con una citoquina. Las citoquinas preferidas para la administración durante el tratamiento con la molécula multiespecífíca incluyen factor estimulante de colonia de granulocito (G-CSF), factor estimulante de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF), interferón-? (IFN-?) y factor de necrosis de tumor (TNF). Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también se pueden usar para apuntar células expresando FcyR o PTK7, por ejemplo, para marcar dichas células. Para dicho uso, el agente de unión se puede ligar a una molécula que se puede detectar. De esta manera, la invención provee métodos para localizar células ex vivo o in vitro expresando factores Fc, tales como Fo?R o PTK7. La etiqueta detectable puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor de enzima. También dentro del alcance de la presente invención hay equipos que comprenden las composiciones de anticuerpo de la invención (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas biespecíficas o multiespecíficas, o inmunoconjugados) e instrucciones de uso. El equipo puede contener además uno o más reactivos adicionales, tal como un reactivo inmunosupresor, un agente citotóxico o un agente radiotóxico o uno o más anticuerpos humanos adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo humano teniendo una actividad complementaria que une a un epítope en el antígeno de PTK7 distinto del primer anticuerpo humano). Los equipos típicamente incluyen una etiqueta indicando el uso destinado de los contenidos del equipo. El término etiqueta incluye cualquier escritura, o material grabado provisto en o con el equipo, o que de lo contrario acompaña al equipo. La presente invención se ilustra más mediante los siguientes ejemplos que no se deben considerar como limitantes. Los contenidos de todas las figuras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de esta solicitud se incorporan expresamente a la presente por referencia.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales humanos contra PTK7 Antígeno Los protocolos de inmunización utilizados como antígeno (i) una proteína de fusión recombinante que comprende la porción extracelular de PTK7 con un myc y su etiqueta y (ii) PTK7 de longitud completa de membrana unida. Ambos antígenos fueron generados por métodos de transfección recombinante en una línea celular CHO.

Ratones transgénicos HuMab y KM mice™ Los anticuerpos monoclonales completamente humanos a PTK7 fueron preparados usando las variedades de HCo7 y HCo12 de ratones transgénicos HuMab y la variedad de KM de ratones transcromosómicos transgénicos, cada uno de los cuales expresa genes de anticuerpo humano. En cada una de estas variedades de ratón, el gen de cadena ligera de ratón endógeno kappa ha sido homocigosamente interrumpido como se describe en Chen y otros (1993) EMBO J. 12:811-820 y el gen de cadena pesada de ratón endógeno ha sido homocigosamente interrumpido como se describe en el ejemplo 1 de la publicación de PCT WO 01/09187. Cada una de estas variedades de ratón porta un transgén de cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwild y otros (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. La variedad HCo7 porta el transgén de cadena pesada humana de HCo7 como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 5,770,429; 5,545,806; 5,625,825; y 5,545,807. La variedad de HCo12 porta el transgén de cadena pesada humana de HCo12 cornos e describe en el ejemplo 2 de WO 01/09187 o el ejemplo 2 de WO 01/4424. La variedad de KM contiene el transcromosoma SC20 como se describe en la publicación de PCT WO 02/43478.

Inmunizaciones de HuMab v KM: Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos a PTK7, se inmunizaron ratones HuMab y KM mice™ con proteína de fusión de PTK7 recombinante purificada y células CHO transfectadas con PTK7 como antígeno. Los esquemas de inmunización generales para ratones HuMab se describen en Lonberg, N. y otros (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwilde, D. y otros (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 y publicación de PCT WO 98/24884. Los ratones tenían 6-16 semanas de edad en su primer infusión de antígeno. Una preparación recombinante purificada (5-50 µg) de antígeno de proteína de fusión de PTK7 y células de 5 - 10x106 se usaron para inmunizar los ratones HuMab y KM mice™ intraperitonealmente, subcutáneamente (Sc) o vía inyección en el bandolero. Los ratones transgénicos fueron inmunizados dos veces con antígeno en adyuvante de Freund completo o adyuvante IP de Ribi, seguido por 3-21 días IP (hasta un total de 11 inmunizaciones) con el antígeno en adyuvante de Freund o Ribi incompleto. La respuesta inmune fue monitoreada por hemorragias retroorbitales. Se filtró el plasma mediante ELISA (como se describe más adelante), y se usaron ratones con suficientes títulos de ¡nmunoglobulina humana anti-PTK7 para fusiones. Los ratones fueron estimulados intravenosamente con antígeno 3 días antes de sacrificio y eliminación del bazo. Típicamente, se realizaron 10-35 infusiones para cada antígeno. Varias docenas de ratones fueron inmunizadas para cada antígeno.

Selección de HuMab o KM Mice™ produciendo anticuerpo anti-PTK7: Para seleccionar HuMab o KM mice™ produciendo anticuerpos que unen PTK7, se probó el suero de ratones inmunizados por ELISA como se describe por Fishwild, D. y otros (1996). Brevemente, se revistieron placas de microtítulo con proteína de fusión de PTK7 recombinante purificada de células de CHO transfectadas a 1-2 µg/ml en PBS, 100 µl/pozos incubados 4°C durante la noche, después bloqueados con 200 µl/pozo de 5% de suero bovino fetal en PBS/Tween (0.05%). Se agregaron diluciones de suero de ratones inmunizados con PTK7 a cada pozo y se incubaron durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas con PBS/Tween y después incubadas con un anticuerpo policlonal IgG de cabra-antihumano conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar, las placas se desarrollaron con sustrato de ABTS (Sigma, A-1888, 0.22 mg/ml) y analizaron por espectrofotómetro a OD 415-495. Los ratones que desarrollaron los títulos más altos de anticuerpos anti-PTK7 se usaron para fusiones. Se realizaron fusiones como se describe más adelante y se probaron sobrenadantes de hibridoma para actividad anti-PTK7 por ELISA.

Generación de hibridomas produciendo anticuerpos monoclonales humanos a PTK7: Los esplenocitos de ratón, aislados de los ratones HuMab, se fusionaron con PEG a una línea celular de mieloma de ratón con base en protocolos estándar. Los hibridomas resultantes entonces se filtraron para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Las suspensiones de célula individual de esplenocitos de ratones inmunizados se fusionaron a un cuarto el número de SP2/0 células de mieloma de ratón no secretor (ATCC, CRL 1581) con 50% de PEG (Sigma). Se chaparon células a aproximadamente 1x105/pozo en placa de microtítulo de fondo plano, seguido por aproximadamente dos semanas de incubación en medio selectivo conteniendo 10% de suero bovino fetal, 10% de P388D1 (ATCC, CRL TIB-63) medio condicionado, 3-5% origen (IGEN) en DMEM (Mediatech, CRL 10013, con glucosa alta, L-glutamina y piruvato de sodio) más 5 mM de HEPES, 0.055 mM de 2-mercarptoetanol, 50 mg/ml de gentamicina y 1 x HAT (Sigma, CRL P-7185). Después de 1-2 semanas, se cultivaron células en medio en donde el HAT fue reemplazado con HT. Entonces se filtraron pozos individuales por ELISA (descritos antes) para anticuerpos IgG monoclonales anti-PTK7 humanos. Una vez ocurrido el crecimiento de hibridoma extensivo, se monitoreó el medio usualmente después de 10-14 días. Se volvieron a chapar hibridomas secretores de anticuerpo, se filtraron una vez más y, de seguir positivos para anticuerpos monoclonales anti-PTK7 de IgG humano se subclonarcn al menos dos veces por dilución limitada. Los subclones estables entonces fueron cultivados in vitro para generar cantidades pequeñas de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para caracterización adicional. Se seleccionaron clones de hibridoma 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 para más análisis.

Ejemplo 2: Caracterización estructural de anticuerpos monoclonales humanos 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 Las secuencias de cADN codificando regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 fueron obtenidos de los hibridomas de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8, respectivamente, usando técnicas de PCR estándar y se secuenciaron usando técnicas de secuenciación de ADN estándar. Las secuencias de nucleótido y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 3G8 se muestran en la figura 1A y en SEC ID NO:41 y 1, respectivamente. Las secuencias de nucleótido y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 3G8 se muestran en la figura 1B y en SEC ID NO:45 y 5, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 3G8 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana demostró que la cadena pesada de 3G8 utiliza un segmento de VH de la línea germinal VH 3-30.3, un segmento D no determinado, y un segmento JH de línea germinal humana JH 4b. La alineación de la secuencia de VH de 3G8 a la secuencia de VH 3-30.3 de línea germinal se muestra en la figura 5. Análisis adicional de la secuencia de VH de 3G8 usando el sistema Kabat de la determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las figuras 1A y 5, y en SEC ID NOs: 11, 15 y 19, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 3G8 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal humana demostró que la cadena ligera de 3G8 utiliza un segmento de VL de la línea germinal VK L15 y un segmento JK de línea germinal humana JK 1. La alineación de la secuencia de VL de 3G8 a la secuencia de VK L15 de línea germinal se muestra en la figura 9. Análisis adicional de la secuencia de VL de 3G8 usando el sistema Kabat de la determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las figuras 1B y 9, y en SEC ID NOs: 23, 29 y 35, respectivamente. Las secuencias de nucleótido y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 3G8a se muestran en la figura 1A y en SEC ID NO:41 y 1, respectivamente. Las secuencias de nucleótido y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 3G8a se muestran en la figura 1C y en SEC ID NO:46 y 6, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 3G8a con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana demostró que la cadena pesada de 3G8a utiliza un segmento de VH de la línea germinal VH 3-30.3, un segmento D no determinado, y un segmento JH de línea germinal humana JH 4b. La alineación de la secuencia de VH de 3G8a a la secuencia de VH 3-30.3 de línea germinal se muestra en la figura 5. Análisis adicional de la secuencia de VH de 3G8a usando el sistema Kabat de la determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las figuras 1A y 5, y en SEC ID NOs: 11, 15 y 19, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 3G8a con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal humana demostró que la cadena ligera de 3G8a utiliza un segmento de VL de la línea germinal VK L15 y un segmento JK de línea germinal humana JK 1. La alineación de la secuencia de VL de 3G8a a la secuencia de VK L15 de línea germinal se muestra en la figura 9. Análisis adicional de la secuencia de VL de 3G8a usando el sistema Kabat de la determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las figuras 1C y 9, y en SEC ID NOs: 24, 30 y 36, respectivamente. Las secuencias de nucleótido y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 4D5 se muestran en la figura 2A y en SEC ID NO:42 y 2, respectivamente. Las secuencias de nucleótido y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 4D5 se muestran en la figura 2B y SEC ID NO:47 y 7, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 4D5 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana demostró que la cadena pesada de 4D5 utiliza un segmento de VH de la línea germinal VH 3-30.3, un segmento D no determinado, y un segmento JH de línea germinal humana JH 4b. La alineación de la secuencia de VH de 4D5 a la secuencia de VH 3-30.3 de línea germinal se muestra en la figura 6. Análisis adicional de la secuencia de VH de 4D5 usando el sistema Kabat de la determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las figuras 2A y 6, y en SEC ID NOs: 12, 16 y 20, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 4D5 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de ¡ínea germinal humana demostró que la cadena ligera de 4D5 utiliza un segmento de VL de la línea germinal VK L15 y un segmento JK de línea germinal humana JK 1. La alineación de la secuencia de VL de 4D5 a la secuencia de VK L15 de línea germinal se muestra en la figura 10. Análisis adicional de la secuencia de VL de 4D5 usando el sistema Kabat de la determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las figuras 2B y 10, y en SEC ID NOs: 25, 31 y 37, respectivamente. Las secuencias de nucleótido y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 12C6 se muestran en la figura 3A y en SEC ID NO:43 y 3, respectivamente. Las secuencias de nucleótido y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 12C6 se muestran en la figura 3B y en SEC ID NO:48 y 8, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 12C6 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana demostró que la cadena pesada de 12C6 utiliza un segmento de VH de la línea germinal VH DP44, un segmento D no determinado, y un segmento JH de línea germinal humana JH 4b. La alineación de la secuencia de VH de 12C6 a la secuencia de VH DP44 de línea germinal se muestra en la figura 7. Análisis adicional de la secuencia de VH de 12C6 usando el sistema Kabat de la determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las figuras 3A y 7, y en SEC ID NOs: 13, 17 y 21, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 12C6 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal humana demostró que la cadena ligera de 12C6 utiliza un segmento de VL de la línea germinal VK A27 y un segmento JK de línea germinal humana JK 2. La alineación de la secuencia de VL de 12C6 a la secuencia de VK A27 de línea germinal se muestra en la figura 11. Análisis adicional de la secuencia de VL de 12C6 usando el sistema Kabat de la determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las figuras 3B y 11, y en SEC ID NOs: 26, 32 y 38, respectivamente.

Las secuencias de nucleótido y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 12C6a se muestran en la figura 3A y SEC ID NO:43 y 3, respectivamente. Las secuencias de nucleótido y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 12C6a se muestran en la figura 3C y en SEC ID NO:49 y 9, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 12C6a con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana demostró que la cadena pesada de 12C6a utiliza un segmento de VH de la línea germinal VH DP44, un segmento D no determinado, y un segmento JH de línea germinal humana JH 4b. La alineación de la secuencia de VH de 12C6a a la secuencia de VH DP44 de línea germinal se muestra en la figura 7. Análisis adicional de la secuencia de VH de 12C6a usando el sistema Kabat de la determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las figuras 3A y 7, y en SEC ID NOs: 13, 17 y 21, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 12C6a con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal humana demostró que la cadena ligera de 12C6a utiliza un segmento de VL de la línea germinal VK L15 y un segmento JK de línea germinal humana JK 2. La alineación de la secuencia de VL de 12C6a a la secuencia de VK L15 de línea germinal se muestra en la figura 12. Análisis adicional de la secuencia de VL de 12C6a usando el sistema Kabat de la determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las figuras 3C y 12, y en SEC ID NOs 27, 33 y 39, respectivamente.

Las secuencias de nucleótido y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 7C8 se muestran en la figura 4A y en SEC ID NO:44 y 4, respectivamente. Las secuencias de nucleótido y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 7C8 se muestran en la figura 4B y en SEC ID NO:50 y 10, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 7C8 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana demostró que la cadena pesada de 7C8 utiliza un segmento de VH de la línea germinal VH 3-33, un segmento D no determinado, y un segmento JH de línea germinal humana JH 6b. La alineación de la secuencia de VH de 7C8 a la secuencia de VH 3-33 de linea germinal se muestra en la figura 8. Análisis adicional de la secuencia de VH de 7C8 usando el sistema Kabat de la determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las figuras 4A y 8, y en SEC ID NOs: 14, 18 y 22, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 7C8 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de linea germinal humana demostró que la cadena ligera de 7C8 utiliza un segmento de VL de la línea germinal VK L6 y un segmento JK de línea germinal humana JK 3. La alineación de la secuencia de VL de 7C8 a la secuencia de VK L6 de línea germinal se muestra en la figura 13. Análisis adicional de la secuencia de VL de 7C8 usando el sistema Kabat de la determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las figuras 4B y 13, y en SEC ID NOs: 28, 34 y 40, respectivamente.

Ejemplo 3: Mutación de mAb 12C6 y uso de línea germinal alternativo Como se discutió en el ejemplo 2 anterior, los anticuerpos monoclonales 12C6 y 12C6 utilizan una región variable de cadena pesada derivada de una secuencia de línea germinal DP44 humana presente en el transgén HCo7 de la variedad HuMab Mouse®. Ya que DP-44 no es una secuencia de línea germinal que se utilice en el repertorio de inmunoglobulina humana nativa, puede ser ventajoso mutar la secuencia de VH de 12C6 y 12C6a para reducir inmunogenicidad potencial. Preferiblemente, uno o más residuos de estructura de la secuencia de VH de 12C6 o 12C6a se mutan a un residuo(s) presente en la estructura de una secuencia de línea germinal de VH estr ucturalmente relacionada que se utiliza en el repertorio de inmunoglobulina humana nativa. Por ejemplo, la figura 7 muestra la alineación de la secuencia de VH de 12C6 y 12C6a con la secuencia de línea germinal de DP44 y también a dos secuencias de línea germinal humana estructuralmente relacionadas, VH 3-23 y VH 3-7. Dada la relación de estas secuencias, uno puede predecir que uno puede seleccionar un anticuerpo humano que une específicamente a PKT7 humana y que utiliza lina región de VH derivada de una secuencia de línea germinal de VH 3-23 o VH 3-7. Además, uno puede mutar uno o más residuos dentro de la secuencia de VH de 12C6 o 12C6a que difieren del residuo(s) en la posición comparable en la secuencia de VH 3-23 o VH 3-7 con el residuo(s) que está presente en VH 3-23 o VH 3-7, o con una sustitución de aminoácido conservadora de los mismos.

Ejemplo 4: Caracterización de especificidad de unión y cinética de unión de anticuerpos monoclonales anti-PTK7 En este ejemplo, se examinaron afinidad de nión y cinética de unión de anticuerpos anti-PTK7 por análisis Biacore. Se examinaron especificidad de unión y competencia cruzada por citometría de flujo.

Especificidad de unión por citometría de flujo Las líneas celulares que expresan PTK7 humana recombinante en la superficie celular se desarrollaron y usaron para determinar la especificidad de anticuerpos monoclonales humanos de PTK7 por citometría de flujo. Se transfectaron células HEK3 con plásmidos de expresión conteniendo formas de transmembrana codificadoras de cADN de longitud completa de PTK7. La unión del anticuerpo monoclonal humano anti-PTK7 de 7C8 fue evaluada al incubar las células transfectadas con el anticuerpo monoclonal humano anti-PTK7 a una concentración de 10 µg/ml. Las células fueron lavadas y se detectó unión con un Ab de IgG anti-humano marcado con FITC.

Se realizaron análisis citométricos de flujo usando una citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Los resultados se ilustran en la figura 14. El 7C8 de anticuerpo monoclonal anti-PTK7 se unió a las células HEK3 transfectadas con PTK7 pero no a células HEK3 que no fueron transfectadas con PKT7 humana. Estos datos demuestran la especificidad de anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 para PTK7.

Especificidad de unión por ELISA La unión de anticuerpos anti-PTK7 también fue evaluada por ELISA estándar para examinas la especificidad de unión para PTK7.

Se probó el dominio extracelular recombinante de PTK7 para unión contra los anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 y 12C6a a concentraciones diferentes. Se realizaron procedimientos de ELISA estándar. Los anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 se agregaron a una concentración individual de 10 µg/ml y se diluyeron en serie a una dilución de 1:2. Se usó anticuerpo policlonal de IgG (específico de cadena kappa) de cabra-anti-humano conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) como anticuerpo secundario. Los resultados se muestran en la figura 15. Cada uno de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 y 12C6a se unió a PTK7. Estos datos demuestran la especificidad de anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 para PTK7.

Mapeo de epítope de anticuerpos anti-PTK7 Se usó citometría de flujo para determinar agrupación de epítope de HuMAbs anti-PTK7. Se transfectaron células G-401 de tumor de Wilms (ATCC No. de cuenta CRL-1441) con plásmidos de expresión conteniendo formas de transmembrana codificadoras de cADN de longitud completa de PTK7. La unión de epítope de cada anticuerpo monoclonal humano anti-PTK7 fue evaluada al incubar 1 x 105 células transfectadas con 10 µg/ml de anticuerpo monoclonal humano anti-PTK7 frío, lavada, y seguida por la adición de 10 µg/ml de un anticuerpo monoclonal humano anti-PTK7 conjugado con fluorescencia. La unión fue detectada con un Ab de IgG anti-humano marcado con FITC. Se realizaron análisis citométricos de flujo usando una citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Al analizar los datos, los anticuerpos anti-PTK7 han sido categorizados en 3 grupos de epítope - grupo A, que incluye 7D11, grupo B, que incluye 3G8 y 3G8a y grupo C, que ¡ncluye 7C8, 12C6 y 12C6a.

Ejemplo 5: Caracterización de unión de anticuerpo anti-PTK7 a PTK7 expresada en la superficie de células cancerosas humanas La línea celular de tumor de Wilms de neuroblastoma G-401 (ATCC No. de cuenta CRL-1441) fue probada para unión de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 de HuMAb 12C6 y 7C8 a concentraciones diferentes. Se evaluó la unión de anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 al incubar 1x105 células con anticuerpo a una concentración de inicio de 30 µg/ml y diluyendo en serie el anticuerpo a una dilución de 1:10. Las células se lavaron y se detectó unión con un Ab de IgG anti humano marcado con PE. Se realizaron análisis citométricos de flujo usando citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Los resultados se muestran en la figura 16. Los anticuerpos monoclonales anti-PTK7 12C6 y 7C8 se unieron a la línea celular de tumor de Wilms de neuroblastoma en una manera dependiente de concentración, como se midió por la intensidad fluorescente media (MFI) de manchado. Los valores EC50 para los anticuerpos monoclonales anti-PTK7 12C6 y 7C8 fue 4.035 nM y 3428 nM, respectivamente. Estos datos demuestran que los HuMAbs anti-PTK7 unen a líneas celulares de cáncer de riñon.

Ejemplo 6: Unión de anticuerpo anti-PTK7 humano a líneas celulares de cáncer Se probaron anticuerpos anti-PTK7 para unión a una variedad de líneas celulares de cáncer por citometría de flujo. La unión de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 de 3G8, 12C6a, 4D5 y 12C6 a un panel de líneas celulares de cáncer fue evaluada al incubar líneas celulares de cáncer con anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 a una concentración de 10 µg/ml. Las líneas celulares de cáncer que fueron probadas fueron A-431 (ATCC No. de cuenta CRL-1555), células de tumor de Wilms G-401 (ATCC No. de cuenta CRL-1441), Saos-2 (ATCC No. de cuenta HTB-85), SKOV-3 (ATCC No. de cuenta HTB-77), PC3 (ATCC No. de cuenta CRL-1435), DMS 114 (ATCC No. de cuenta CRL-2066), ACHN (ATCC No. de cuenta CRL-1611), LNCaP (ATCC No. de cuenta CRL-1740), DU 145 (ATCC No. de cuenta HTB-81), LoVo (ATCC No. de cuenta CCL-229) y MÍA PaCa-2 (ATCC No. de cuenta CRL-1420). Se usó un anticuerpo de control de isotipo como un control negativo. Las células fueron lavadas y la unión fue detectada con un Ab de IgG anti-humano marcado con FITC. Se realizaron análisis citométricos de flujo usando una citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Los resultados se muestran en la figura 17. Los anticuerpos monoclonales anti-PTK7 3G8, 12C6a, 4D5 y 12C6 se unieron a las líneas celulares de cáncer A-431, células de tumor de Wilms G-401, Saos-2, SKOV-3, PC3, DMS 114, ACHN, LNCaP, DU 145, LoVo y MÍA PaCa-2, como se midió por la intensidad fluorescente media (MFI) de manchado. Estos datos demuestran que los HuMAbs anti-PTK7 unen a un rango de células de cáncer que expresan PTK7 de superficie celular.

Ejemplo 7: Unión de anti-PTK7 a células T, B y dendríticas humanas Se probaron anticuerpos anti-PTK7 para unión a células T de CD4 + , CD8 + , B de CD19+ y células dendríticas mieloides de sangre humanas expresando PTK7 en su superficie celular por citometría de flujo. Se activaron células T humanas por anticuerpo anti-CD3 para inducir expresión de PKT7 en células T antes de unir con un anticuerpo monoclonal anti-PTK7 humano. Se evaluó la unión del anticuerpo monoclonal humano anti-PTK7 de 7c8 al incubar las células con anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 a una concentración de 10 µg/ml. En algunos experimentos, un anticuerpo conocido que une un marcador específico de célula T y B se usó como un control positivo. Las células se lavaron y se detectó unión con un Ab de IgG anti-humano marcado con FITC. Se realizaron análisis citométricos de flujo usando una citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Los resultados se muestran en la figura 18 (células T y células B humanas activadas) y 19 (células dendríticas). El anticuerpo monoclonal anti-PTK7 7C9 unió a células T de CD4+ y CD8+ humanas activadas y células dendríticas, pero no a células B, como se midió por la intensidad fluorescente media (MFI) de manchado. Estos datos demuestran que HuMAbs anti-PTK7 unen a células T humanas y células dendríticas.

Ejemplo 8: Internalización de anticuerpo monoclonal anti-PTK7 Se probaron HuMAbs anti-PTK7 para la habilidad de internalizar en líneas celulares expresando PTK7 usando un ensayo de internalización de Hum-Zap. El ensayo de Hum-Zap prueba la internalización de un anticuerpo humano primario a través de unión de un anticuerpo secundario con afinidad para IgG humano conjugado a la saporina tóxica. Las líneas celulares de cáncer expresando PTK7, tumor de Wilms G-401 (ATCC No. de cuenta CRL- 1441 ), A-431 (ATCC No. de cuenta CRL- 1555) y PC3 (ATCC No. de cuenta CRL- 1435) se sembraron en 1 x 104 células/pozo en pozos de 100 µl directamente. Los anticuerpos de HuMAb anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 o 7C8 se agregaron a los pozos a una concentración de inicio de 30 nM y se titularon a diluciones en serie de 1 : 3. Se usó un anticuerpo de control de isotipo que es no específico para PKT7 como un control negativo. Se agregó el Hum-Zap (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, IT-22-25) a una concentración de 1 1 nM y se dejaron i ncubar placas durante 72 horas. Las placas entonces fueron pulsadas con 1 .0 µCi de 3H-timidina durante 24 horas, cultivadas y le ídas en un contador Top Count Scintillation Counter (Packard I nstruments , Meriden, CT) . Los resultados se muestran en las figuras 20A-D. Los anticuerpos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 y 7C8 mostraron una disminución dependiente de concentración de anticuerpo en incorporación de 3H-timidina en la l ínea celular de cáncer de tumor de Wilms expresando PTK-7 A-431 y PC3. El valor EC50 para anticuerpos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 y 7C8 en células de tumor de Wilms fue 0.6437 nM, 0.2516 nM , 0.2053 nM y 0.1788 nM, respectivamente . El valor EC50 para los anticuerpos anti-PTK7 12C6 y 7C8 en células A-431 fue 0. 1657 nM y 0. 1 826 nM , respectivamente.

El valor EC50 para los anticuerpos anti-PTK7 12C6 y 7C8 en células de tumor PC3 fue 0.3175 nM y 0.2648 nM, respectivamente. Estos datos demuestran que los anticuerpos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 y 7C8 internalizan en células de cáncer.

Ejemplo 9: Evaluación de matanza celular de un anticuerpo anti-PTK7 conjugado con toxina en líneas celulares de cáncer humano En este ejemplo, se probaron anticuerpo monoclonales anti-PTK7 conjugados a una toxina para la habilidad de matar líneas celulares de cáncer humano PTK7+ en un ensayo de proliferación celular. El anticuerpo de HuMAb anti-PTK7 12C6a se conjugó a una toxina vía un enlazador, tal como un enlazador de peptidilo, hidrazina o disulfuro. Ejemplos de compuestos de toxina que se pueden conjugar a los anticuerpos de la presente invención se describen en la solicitud presentada con Número de expediente No. 04280/100M629US3, presentada el 26 de septiembre de 2005. La línea celular G-401 de cáncer de riñon humano de tumor de Wílms expresando PTK7 (ATCC No. de cuenta CRL-1441) se sembró a 104 células/pozo en pozos de 100 µl durante 3 horas. Se agregó un conjugado de anticuerpo anti-PTK7 toxina a los pozos a una concentración de inicio de 100 nM y se titularon a diluciones en serie de 1:3. Las placas se dejaron incubar durante 48 horas. Las placas entonces se pulsaron con 1 µCi de 3H-timidina durante 24 horas antes de terminar el cultivo, se cultivaron y leyeron en un contador Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments). La figura 21 muestra los efectos del conjugado 12C6a en las células de tumor de Wilms. El anticuerpo anti-PTK7 12C6a mostró una disminución dependiente de concentración de anticuerpo-toxina en incorporación de 3H-timidina en línea celular de cáncer de riñon humano de tumor de Wilms expresando PTK7. Estos datos demuestran que los anticuerpos anti-PTK7 conjugados a toxina muestran citotoxicidad específica a células de cáncer de riñon humano.

Ejemplo 10: Evaluación de matanza celular de un anticuerpo anti-PTK7 conjugado con toxina en líneas celulares de tumor humano En este ejemplo, se probaron anticuerpos monoclonales antí- PTK7 conjugados a una toxina para la habilidad de matar líneas celulares de tumor humano PTK7+ teniendo expresión de superficie celular baja, intermedia o alta de PTK7 en un ensayo de proliferación celular. El anticuerpo de HuMAb anti-PTK7 12C6a se conjugó a una toxina vía un enlazador, tal como un enlazador de peptidilo, hidrazina o disulfuro. Ejemplos de compuestos de toxina que se pueden conjugar a los anticuerpos de la presente invención se describen en la solicitud presentada con Número de expediente No. 04280/100M629US3, presentada el 26 de septiembre de 2005. Las líneas celulares A-431 de cáncer de tumor humano expresando PTK7, SKOV3 y LoVo se sembraron a 104 células/pozo en pozos de 100 µl. Las líneas celulares fueron previamente probadas para expresión de superficie celular de PTK7 en un ensayo FACS estándar. La línea celular A-431 expresó el nivel más alto de expresión de superficie celular de PKT7 y la línea celular de LoVo expresó el nivel más bajo de expresión de superficie celular de PTK7. Se agregó un conjugado de anticuerpo anti-PTK7 toxina a los pozos a una concentración de inicio de 20 nM y se titularon a diluciones en serie de 1:2. Se usó un anticuerpo de control de isotipo como un control negativo. Se dejaron incubar placas durante 3 horas y se lavaron los conjugados de anticuerpo-toxina (libre) no unidos. Las placas siguieron incubándose durante 96 horas y la actividad de matanza (FU, unidad fluorescente) se midió por viabilidad celular en ensayo luminiscente CelITiter-Glo® al protocolo (Promega, Wl, EUA, boletín técnico No. 288) usando un lector BIO-TEK (Bio-Tek Instruments, Inc, VT, EUA). Los resultados se muestran en la figura 22 El conjugado de anti-PTK7-toxina mostró una disminución dependiente de la concentración de anticuerpo-toxina en el ensayo de proliferación en A431alta, SKOV3'nter, y LoVoba?a expresando PTK7. Estos datos demuestran que los anticuerpos anti-PTK7 conjugados a toxina muestran citotoxicidad específica a varías células de cáncer humanas.

Ejemplo 11 : Inmunohistoquímica con 3G8, 12C6a, 2E11 La habilidad de los HuMAbs anti-PTK7 3G8, 12C6a y 2E11 por reconocer PTK7 por inmunohistoquímica se examinó usando biopsias clínicas de cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de intestino delgado & cáncer de próstata. Para inmunohistoquímica, se usaron secciones congeladas de 5 µm (Ardáis, Inc, EUA). Después de secar durante 30 minutos, se fijaron secciones con acetona (a temperatura ambiente durante 10 minutos) y se secaron al aire durante 5 minutos. Se enjuagaron los portaobjetos en PBS y después de pre-incubaron con 10% de suero de cabra normal en PBS durante 20 minutos y posteriormente se incubaron con 10 µg/ml de anticuerpo fitcilado en PBS con 10% de suero de cabra normal durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después, se lavaron los portaobjetos tres veces con PBS y se incubaron durante 30 minutos con anti-FITC de ratón (10 µg/ml de DAKO) a temperatura ambiente. Se lavaron una vez más los portaobjetos con PBS y se incubaron con conjugado anti-ratón de HRP de cabra (DAKO) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Una vez más se lavaron portaobjetos tres veces con PBS. Se usó diaminobenzidina (Sigma) como sustrato, resultando en manchado café. Después de lavar con agua destilada, los portaobjetos fueron contra-manchados con hematoxilina durante 1 minuto. Posteriormente, se lavaron los portaobjetos durante 10 segundos en agua destilada corriendo y se montaron en glicergel (DAKO). El manchado inmunohistoquímico de biopsia clínica exhibió manchado positivo en secciones de cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de intestino delgado & cáncer de próstata. El tejido normal siempre fue negativo para manchado de PTK7 mientras que dentro del tejido maligno, se observaron fibroblastos activados con cáncer y células epiteliales cancerosas como positivas para manchado de PTK7. La identidad de los fibroblastos activados con cáncer se confirmó en secciones de cáncer de vejiga y cáncer de mama por manchado con anticuerpo Fibroblast Activation Protein (FAP, Alexis Biochemicals, San Diego, EUA). FAP es un marcador conocido de fibroblastos activados de cáncer (Hofheinz y otros (2003) Oncologie 26:44-48).

Ejemplo 12: Ensayo de invasión En este ejemplo, se probaron anticuerpos dirigidos contra PKT7 para la habilidad de afectar la invasión celular en una línea celular CHO transfectada con PTK7. El ensayo se realizó usando un sistema HTS 96-Multiwell Insert System (Cat# 351162, BD Biosciences, CA) de acuerdo con el protocolo. Ya sea una línea celular origen?de CHO, células de CHO transfectadas con PTK7 de longitud completa o una línea celular de HEK293 de control se mezclaron con un banco de HuMAbs anti-PTK7 o un anticuerpo de control de isotipo antes de la adición de las células en los insertos. La mezcla (banco de células+Ab) se agregó en un pozo de inserto en la placa de invasión. Después de la incubación a 37°C con 5% de CO2 durante 24 horas, las células fueron marcadas con un colorante fluorescente y células que invadieron el fondo de la membrana se cuantificaron usando un lector de placa de fluorescencia. Los resultados se muestran en la figura 23. Estos datos demuestran que los anticuerpos anti-PTK7 inhiben la movilidad de invasión de células expresando PTK7 en la superficie celular.

Ejemplo 13: Tratamiento de modelo de xenotransplante celular de cáncer pancreático in vivo usando anticuerpos anti-PTK7 desnudos y conjugados con citotoxina Este ejemplo describe el tratamiento in vivo de ratones implantados con un tumor de carcinoma celular pancreático con anticuerpos anti-PTK7 conjugados con toxina para examinar el efecto in vivo de los anticuerpos en crecimiento de tumor. HPAC (adenocarcinoma pancreático humano, ATCC Número de acceso CRL-2119) u otras células de cáncer pancreático adecuadas se expandieron in vitro usando procedimientos de laboratorio estándar. Se implantaron ratones desnudos atímicos Ncr macho (Taconic, Hudson, NY) entre 6-8 semanas de edad subcutáneamente en el flanco derecho con 2.5 x 106 células HPAC en 2.0 ml de PBS/Matrigel (1:1) por ratón. Los ratones fueron pesados y medidos para tumores tridimensionalmente usando un calibre electrónico dos veces por semana después de la implantación. Se calcularon los volúmenes del tumor como altura x ancho x longitud/2. Los ratones con tumores de HPAC promediando 90 mm3 fueron aleatorízados en grupos de tratamiento. Los ratones fueron administrados una sola dosis intravenosa con veh ículo de PBS, anticuerpo anti-PTK7 desnudo o HuMAb anti-PTK7 conjugado con toxina en el día 0 a la dosis indicada (µmol/kg). Ejemplos de compuestos de toxina que se pueden conjugar a los anticuerpos de la presente invención se describieron en la solicitud de patente de E. U .A. No. de serie 1 1 /134, 826 y la solicitud de patente de E. U.A. No. pendiente designada MEDX-0034US4. Los ratones fueron monitoreados para crecimiento de tumor durante 61 d ías después de la dosificación . Los ratones fueron eutanizados cuando los tumores alcanzaron el punto final del tumor (2000 mm3) o se ulceraron. Los anticuerpos anti-PTK7 conjugados a una toxina alentaron el progreso de crecimiento del tumor. Los resultados se muestran en la figura 24. El efecto antí-tumor del conjugado anti-PTK7 fue dependiente de dosis, con el efecto mayor observado a una dosis de 0.3 µmol/kg . Se toleró bien el tratamiento con conjugado de toxina anti-PTK7 , con sujetos nunca experimentando más del 5% de pérdida de peso corporal promedio (datos no mostrados). De esta manera, el tratamiento con un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-toxina tiene un efecto inhibidor in vivo directo en crecim iento de tumor de cáncer pancreático.

Ejemplo 14: Tratamiento de modelo de xenotransplante celular de cáncer de mama in vivo usando anticuerpos anti-PTK7 desnudos y conjugados con toxina Este ejemplo describe el tratamiento in vivo de ratones implantados con un tumor de carcinoma de mama con resistencia a adriamicina con anticuerpos anti-PTK7 conjugados con toxina para examinar el efecto /'/) vivo de los anticuerpos en crecimiento de tumor. MCF7-adr (línea celular de cáncer de mama humano resistente a adriamicina) se expandieron in vivo usando procedimientos de laboratorio estándar. Ratones CB17.SCID hembra (Taconic, Hudson, NY) entre 6-8 semanas de edad fueron implantados subcutáneamente con pildoras de estrógeno de liberación de 90 días de 1.7 mg, 3.0 mm de tamaño (Innovative Research of America, Sarasota, FL) en la región del cuello un día antes de ser implantados subcutáneamente en el flanco derecho con 10 x 106 MCF7-Adr células en 0.2 ml de PBS/Matrigel (1:1) por ratón. Los ratones fueron pesados y medidos para tumores tridimensionalmente usando un calibre electrónico dos veces por semana después de la implantación. Se calcularon volúmenes del tumor como altura x ancho x longitud/2. Los ratones con tumores de MCF7-adr promediando 160 mm3 fueron aleatorizados en grupos de tratamiento. Los ratones fueron administrados una sola dosis intravenosa a 0.1 µmol/kg con vehículo de PBS, anticuerpo anti-PTK7 desnudo o HuMAb anti-PTK7 conjugado con toxina en el día 0. Ejem plos de compuestos de toxina que se pueden conjugar a los anticuerpos de la presente invención se describieron en la solicitud de patente de E. U .A. No. de serie 1 1 /134,826 y la solicitud de patente de E. U .A. No. pendiente designada MEDX-0034US4. Los ratones fueron monitoreados para crecimiento de tumor durante 63 días después de la dosificación. Los ratones fueron eutanizados cuando los tumores se ulceraron. Los resultados se muestran en la figura 25. Los conjugados de anticuerpo anti-PTK7 de toxina alentaron el progreso de crecimiento del tumor. De esta manera , el tratamiento con un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-toxina tiene un efecto inhibidor in vivo directo en crecimiento de tumor de cáncer de mama .

Claims

REIVINDICACIONES 1.- Un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo: a) une específicamente a PTK7 humana; y b) une a una línea celular de tumor de Wilms (ATCC No. de cuenta CRL-1441). 2.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que es un anticuerpo de longitud completa de un isotipo lgG1 o lgG4. 3.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de cadena individual. 4.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo une a células de tumor de Wilms con un EC50 de 4.0 nM o menos. 5.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo une a células de tumor de Wilms con un EC50 de 3.5 nM o menos. 6.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo une además a una línea celular de cáncer seleccionada a partir del grupo que consiste de las líneas celulares A-431 (ATCC No. de cuenta CRL-1555), Saos-2 (ATCC No. de cuenta HTB-85), SKOV-3 (ATCC No. de cuenta HTB 77), PC3 (ATCC No. de cuenta CRL-1435), DMS 114 (ATCC No. de cuenta CRL-2066), ACHN (ATCC No. de cuenta CRL-1611), LNCaP (ATCC No. de cuenta CRL-1740), DU 145 (ATCC No. de cuenta HTB-81), LoVo (ATCC No. de cuenta CCL-229) y MÍA PaCa-2 (ATCC No. de cuenta CRL-1420). 7.- Un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo compite por unir a PTK7 con un anticuerpo de referencia que comprende: a) una región variable de cadena pesada humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs: 1, 2, 3, y 4; y b) una región variable de cadena ligera humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NOs. 5, 6, 7, 8, 9 y 10. 8.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, en donde la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:5. 9.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, en donde la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO-6 10.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, en donde la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:7. 11.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, en donde la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:8. 12.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, en donde la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9. 13.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, en donde la región variable de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:4 y la región variable de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:10. 14.- Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen VH 3-30.3 humano, gen VH DP44 o gen VH 3-33 en donde el anticuerpo une específicamente a PTK7. 15.- Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen V? L15 humano, gen V? A10, gen V? A27 o gen V? L6 en donde el anticuerpo une específicamente a PTK7. 16.- El anticuerpo monoclonal aislado o una porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 18 que comprende además una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen VH 3-30.3 humano, gen VH DP44 o un gen VH 3-33 humano. 17.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que comprende: a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:11; b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:15; c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:19; d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:23; e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:29; y f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:35. 18.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que comprende: a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:11; b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:15; c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:19; d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:24; e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:30; y f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:36. 19.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que comprende: a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:12; b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:16; c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:20; d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:25; e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:31; y f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:37. 20.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que comprende: a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:13; b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:17; c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:21; d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:26; e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:32; y f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:38. 21.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que comprende: a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:13; b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:17; c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:21; d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO.27; e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:33; y f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO 39. 22.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que comprende: a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende SEC ID NO:14; b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO:18; c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO:22; d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende SEC ID NO:28; e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO:34; y f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO:40. 23.- Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión a antígeno del mismo que comprende: a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1; y b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:5. 24.- Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión a antígeno del mismo que comprende: a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1; y b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:6. 25.- Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión antígeno del mismo que comprende: a) una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2; y b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:7. 26 - Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión antígeno del mismo que comprende: a) una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3; y b) una región variable de cadena ligera que comprende secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:8. 27.- Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión antígeno del mismo que comprende: a) una región variable de cadena pesada que comprende secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3; y b) una región variable de cadena ligera que comprende secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9. 28.- Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión antígeno del mismo que comprende: a) una región variable de cadena pesada que comp ende secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:4; y b) una región variable de cadena ligera que comprende secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:10. 29.- Una composición que comprende el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, de conformidad con la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable. 30.- Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo o porción de unión a antigeno del mismo, de conformidad con la reivindicación 1 , ligado a un agente terapéutico. 31 . - Una composición que comprende el inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 30 y un portador farmacéuticamente aceptable. 32.- El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 30, en donde el agente terapéutico es una citotoxina. 33.- Una composición que comprende el inmunoconj ugado de conformidad con la reivindicación 32 y un portador farmacéuticamente aceptable . 34.- El inmu noconjugado de conform idad con la reivindicación 30 , en donde el agente terapéutico es un isótopo radiactivo . 35. - U na composición q ue comprende el inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 34 y un portador farmacéuticamente aceptable . 36. - Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, de conformidad con la reivindicación 1 . 37. - Un vector de expresión q ue comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 36. 38. - U na célula h uésped que comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 37. 39. - Un método para preparar un anticuerpo anti-PTK7 que comprende expresar el anticuerpo en la célula huésped de conformidad con la reivindicación 38 y aislar el anticuerpo de la célula huésped. 40.- Un método de tratar o prevenir una enfermedad caracterizada por el crecimiento de células de tumor expresando PTK7, que comprende administrar a un sujeto el anticuerpo o porción de unión a antígeno del m ismo, de conform idad con la reivindicación 1 en una cantidad efectiva para tratar o prevenir la enfermedad . 41 .- El método de conformidad con la reivindicación 40, en donde la enfermedad es cáncer. 42.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , en donde el cá ncer se selecciona a partir del grupo que consiste de cáncer de colon , cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer pancreático, melanoma , leucemia mieloide aguda , cáncer de riñon, cáncer de vej iga , cánce de ovario y cáncer de próstata. 43. - El método de conformidad con la reivindicación 42 , en donde el cáncer es cáncer pancreático. 44.- El método de conformidad con la reivindicación 42, en donde el cáncer es cáncer de mama . RESUME N DE LA INVENCIÓN La presente invención provee anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se unen específicamente a PTK7 con alta afinidad . También se provee moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención , vectores de expresión , células huésped y métodos para expresar los anticuerpos de la invención . También se provee inm unoconjugados, moléculas bioespecíficas y com posiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos de la invención. La invención también provee métodos para detectar PTK7, así como métodos para tratar varias enfermedades, incluyendo cáncer y enfermedades infecciosas, usando anticuerpos anti-PTK7.