MX2008004901A - Agentes para suprimir el daño a islotes trasplantados despues del trasplante del islote. - Google Patents

Abstract

Se revisa un anticuerpo de receptor anti-IL-6 con respecto a su efecto inhibidor contra disfunción de isleto transplantado producido después de transplante de isleto. Como resultado, se descubrió que el anticuerpo del receptor anti-IL-6 puede reducir la disfunción de isleto transplantado, mejorar la supervivencia del isleto transplantado, y también mejorar el estado hiperglucémico de un receptor. También se descubrió que la administración del anticuerpo del receptor anti-IL-6 permite evitar la producción de una citocina inflamatoria en una célula de identificación después del transplante. Por lo tanto, se descubrió que la disfunción de isleto transplantado producido después del transplante de isleto, puede prevenirse utilizando el anticuerpo del receptor anti-IL-6.

Description

INHIBIDOR DE LA D1SFUNCION DEL ISLOTE TRASPLANTADO EN TRASPLANTE DEL ISLOTE Campo de la Invención La presente invención se refiere a agentes para suprimir el daño a los islotes trasplantados después del trasplante de islotes, que comprenden inhibidores de IL-6 como ingredientes activos, y a sus usos Antecedentes de la Invención La insulina es una hormona hipoglucémica. La diabetes insulinodependiente es provocada por la destrucción selectiva de las células productoras de insulina (células ß de los islotes) por mecanismos inmunológicos, y se conoce que su inicio resulta en la hiperglucemia, lo que provoca diversos trastornos. En la terapia convencional, se administran preparaciones de insulina (inyectada), que normalmente es escasa, para compensar la falta de insulina y corregir la hiperglucemia. Sin embargo, el control estricto del azúcar en sangre es difícil en las terapias basadas en insulina, lo que puede conducir a una administración excesiva y puede provocar una hipoglucemia fatal. Después del inicio de la diabetes se observa el progreso de complicaciones vasculares (tales como retinopatía, nefropatía y neuropatía). Los métodos terapéuticos convencionales, tales como las inyecciones de insulina, no pueden detener este progreso, lo que conduce a problemas terapéuticos serios. Bajo condiciones fisiológicas, el azúcar en sangre es controlado principalmente por el mecanismo regulador de las células ß de los islotes; sin embargo, en la diabetes insulinodependiente, la eliminación de estos islotes resulta en ascensos y descensos violentos del nivel de azúcar en sangre, lo que provoca los síntomas clínicos descriptos con anterioridad. En los años recientes, en Europa y Estados Unidos se ha comenzado con la aplicación clínica de trasplantes de islotes, donde se transplantan islotes pancreáticos de Langerhaus (islotes) como un medio para tratar la diabetes. De este modo se intenta efectuar un tratamiento que no comprende la administración -de insulina, sino la implantación de células productoras de insulina. El procedimiento práctico del trasplante clínico de islotes es como se indica a continuación: se efectúa una cateterización transpulmonar percutánea de la vena porta guiada por ultrasonido, bajo anestesia local; y luego se transplantan islotes del donante al hígado a través del catéter. Los islotes injertados sobreviven al final de la vena porta, y controlan el nivel de azúcar al secretar insulina. Cuando resulta exitoso, el trasplante de islotes restaura el nivel normal de azúcar en sangre en los receptores diabéticos, de modo que resulta innecesario un tratamiento con insulina. Sin embargo, hasta la fecha, los casos exitosos de trasplante de islotes son limitados. Además, el trasplante a un único receptor requiere el aislamiento de islotes a partir del páncreas de dos o tres donantes.

Específicamente, como los trastornos de la función de los islotes que aparecen inmediatamente después del trasplante reducen la viabilidad del injerto, el trasplante de islotes de un único donante a un único receptor es insuficiente, por lo que se realiza el trasplante desde dos o tres donantes a un único receptor. En algunos informes se sugiere que solamente entre 20% y 30% de los injertos trasplantados sobreviven. Los detalles de estos trastornos funcionales aún no están claros, pero representan un problema extremadamente serio en términos del mejoramiento del trasplante clínico de islotes. Normalmente, el trasplante de islotes se realiza usando islotes aislados de los páncreas de donantes con muerte cerebral » o donantes con paro cardiaco. En los informes recientes también se describen casos exitosos de trasplante de islotes a partir de donantes vivos, donde los islotes se aislan y purifican a partir de una porción de páncreas extraída de donantes saludables y transplantada a pacientes diabéticos. Este trasplante de islotes a partir de donantes vivos es invasivo y resulta una carga para los donantes. Por consiguiente, es preferible concebir tratamientos que supriman el daño a los islotes trasplantados justamente después del trasplante, y en los que se usen menos islotes del donante. IL-6 es una citocina denominada factor de estimulación de células B 2 (BSF2) o interferón ß2. IL-6 fue descubierta como un factor de diferenciación que participaba en la activación de las células linfocíticas B (Documento No Patentable 1), y luego se reveló que era una citocina multiftuncional que influía en la función de diversas células (Documento No Patentable 2). Se ha informado que IL-6 induce la maduración de las células linfocíticas T (Documento No Patentable 3). IL-6 transmite su actividad biológica a través de dos tipos de proteínas en la célula. Una de las proteínas es el receptor IL-6, que es una proteína de unión a ligando con la cual se une IL-6, y tiene un peso molecular de aproximadamente 80 kDa (Documentos No Patentables 4 y 5). Además de una forma unida a membrana que penetra y se expresa en la membrana celular, el receptor de IL-6 está presente como un receptor de IL-6 soluble, que principalmente consiste en la región extracelular de la forma unida a membrana. La otra es la proteína de membrana gp130, que tiene un peso molecular de aproximadamente 130 kDa y participa en la transducción de señales de unión no relacionada con ligandos. La actividad biológica de IL-6 se transmite a las células mediante la formación del complejo de IL-6/receptor de IL-6 por IL-6 y el receptor de IL-6, y la unión posterior del complejo con gp130 (Documento No Patentable 6). Los inhibidores de IL-6 son sustancias que inhiben la transmisión de la actividad biológica de IL-6. Hasta el momento se conocían anticuerpos contra IL-6 (anticuerpos anti-IL-6), los anticuerpos contra receptores de IL-6 (anticuerpos anti-receptor de IL-6), anticuerpos contra gp130 (anticuerpos anti-gp130), variantes de IL-6, péptidos parciales de IL-6 o receptores de IL-6, y semejantes. Hay diversas fuentes en las que se describen los anticuerpos anti-receptor de IL-6 (Documentos No Patentables 7 y 8, Documentos Patentables 1-3). Se conoce un anticuerpo humanizado PM-1, que se obtuvo a través del trasplante de la región de terminación de la complementanedad (CAR) del anticuerpo PM-1 de ratón (Documento No Patentable 9), que es uno de los anticuerpos anti-receptor de IL-6 (Documento Patentable 4). La información en los documentos de la técnica anterior de relacionada a la presente invención se describe a continuación: [Documento No Patentable 1] Hirano, T. y col., Nature (1986) 324, 73-76 [Documento No Patentable 2] Akira, S. y col., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78 [Documento No Patentable 3] Lotz, M. y col., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258 [Documento No Patentable 4] Taga, T. y col., J. Exp. Med. (1987) 166,967-981 [Documento No Patentable 5] Yamasaki, K. y col., Science (1988) 241 ,825-828 [Documento No Patentable 6] Taga, T. y col., Cell (1989) 58, 573-581 [Documento No Patentable 7] Novick, D. y col., Hybridoma (1991) 10, 137-146 [Documento No Patentable 8] Huang, Y. W. y col., Hybridoma (1993) 12,621-630 [Documento No Patentable 9] Hirata, Y. y col., J. Immunol. (1989) 143,2900-2906 [Documento Patentable 1] Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 95/09873 [Documento Patentable 2] Solicitud de Patente Francesa No. FR 2694767 [Documento Patentable 3] Patente Norteamericana No. 5216128 [Documento Patentable 4] WO 92/19759 Descripción de la invención Problemas que resolver mediante la invención En el trasplante de islotes para el tratamiento de la diabetes, es importante mejorar la viabilidad de los islotes al suprimir el daño a los islotes trasplantados en el momento del trasplante. Sin embargo, hasta la fecha no hay métodos efectivos. Además, con anterioridad no se ha evaluado si el anticuerpo anti-receptor de IL-6, que es un inhibidor de IL-6, presenta el efecto de suprimir el daño en los islotes trasplantados después del trasplante de islotes. La presente invención se concibió teniendo en cuenta ios antecedentes mencionados, y tiene por objeto proporcionar agentes para suprimir el daño a los islotes trasplantados, que comprenden inhibidores de IL-6 como ingredientes- activos, los cuales se usan en el trasplante de islotes. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para suprimir el daño a los islotes trasplantados a sujetos, donde los métodos comprenden la etapa de administrar inhibidores de IL-6 a los sujetos. Medios para resolver los problemas Para alcanzar los objetivos descriptos previamente, los presentes inventores evaluaron si los anticuerpos anti-receptor de IL-6 ejercían el efecto de suprimir el daño a los islotes trasplantados después del trasplante de islotes. En primer lugar, los presentes inventores prepararon ratones diabéticos como receptores administrando estreptozotocina a ratones C57BL/6 macho por vía intravenosa. Luego, los ratones diabéticos receptores recibieron un trasplante de islotes aislados a partir de páncreas de dos ratones (400 islotes) o de un único ratón (200 islotes). Los resultados indican que el trasplante de islotes a partir de páncreas de dos ratones restauró los niveles normales de azúcar en sangre, por lo que presentó un efecto terapéutico sobre la diabetes, mientras que el trasplante a partir de un único ratón no restauró los niveles normales de azúcar en sangre, por lo que se mantuvo el estado de hiperglucemia (Figuras 2 y 3). Mientras tanto, cuando se administraron 500 pg de un anticuerpo anti-receptor de IL-6 (M16-1) por vía intraperitoneal tres veces después de un trasplante de islotes a partir de un único ratón (200 islotes), se restauraron niveles normales de azúcar en sangre en todos los receptores después del trasplante (Fig. 4). Como alternativa, cuando se administró una dosis igual de un anticuerpo anti-receptor de IL-6 en una ocasión, se restauraron niveles normales de azúcar en sangre en tres cuartos de los receptores (figura 5). Cuando se administraron 200 g de anticuerpo anti-receptor de IL-6 en una ocasión, se restauraron niveles normales de azúcar en sangre en un tercio de los receptores (figura 6). También se descubrió que la administración de los anticuerpos anti-receptor de IL-6 de la presente invención suprimía la producción de citocinas inflamatorias en las células en infiltración después del trasplante. Los descubrimientos anteriores sugieren que los anticuerpos anti-receptor de IL-6 reducen el daño a los islotes trasplantados, mejoran la viabilidad de los islotes y corrigen la hiperglucemia en los receptores. Específicamente, los presentes inventores descubrieron por primera vez que podría suprimirse el daño a los islotes trasplantados después del trasplante de islotes usando anticuerpos anti-receptor de IL-6 de acuerdo con la presente invención, y por lo que completaron la presente invención. Más específicamente, en la presente invención se proveen los siguientes artículos [1] a [23]: [1]. Un agente para suprimir el daño a los islotes trasplantados después del trasplante de islotes, que comprende un inhibidor de IL-6 como ingrediente activo. [2]. El agente para suprimir el daño a los islotes trasplantados de [1], donde el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce una IL-6. [3]. El agente para suprimir el daño a los islotes trasplantados de [1], donde el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce un receptor de IL-6. [4]. El agente para suprimir el daño a los a islotes trasplantados de [2] o [3], donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. [5]. El agente para suprimir el daño a los islotes trasplantados de cualquiera de [2] a [4], donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-IL-6 humano o un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano. [6]. El agente para suprimir el daño a los a islote trasplantados de cualquiera de [2] a [5], donde el anticuerpo es un anticuerpo recombinante. [7]. El agente para suprimir el daño a los a islotes trasplantados de [6], donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico humanizado o humano. [8]. El agente para suprimir el daño a los islotes trasplantados de cualquiera de [1] a [7], que se usa para tratar la diabetes. [9]. Un método para suprimir el daño a los islotes trasplantados en un sujeto sometido a un trasplante de islotes, que comprende la etapa de administrarle un inhibidor de IL-6 al sujeto; [10]. Un método para mejorar la viabilidad de un trasplante de islotes en un sujeto, que comprende la etapa de administrarle un inhibidor de IL-6 al sujeto; [11]. El método de [9] o [10], donde el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce una IL-6; [12]. El método de [9] o [10], donde el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce un receptor de IL-6; [13]. El método de [11] o [12], donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; [14]. El método de cualquiera de [11] a [13], donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-IL-6 humano o un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano; [15]. El método de cualquiera de [11] a [14], donde el anticuerpo es un anticuerpo recombinante; [16]. El método de [15], donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano; [17]. El uso de un inhibidor de IL-6 para producir agentes para suprimir el daño a los islotes trasplantados después del trasplante de islotes; [18]. El uso de [17], donde el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce una IL-6; [19]. El uso de [17], donde el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce un receptor de IL-6; [20]. El uso de [18] o [19], donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; [21]. El uso de cualquiera de [18] a [20], donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-IL-6 humano o un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano; [22]. El uso de cualquiera de [18] a [21], donde el anticuerpo es un anticuerpo recombinante; y [23]. El uso de [22], donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una gráfica en el que se ilustran los cambios en los niveles de azúcar en sangre en ratones diabéticos receptores que no fueron sometidos a un trasplante de islotes. La Figura 2 es una gráfica en el que se ilustran los cambios en los niveles de azúcar en sangre en ratones diabéticos receptores que recibieron un trasplante de islotes isogénicos a partir de páncreas de dos ratones (400 islotes). La Figura 3 es una gráfica en el que se ilustran los cambios en los niveles de azúcar en sangre en ratones diabéticos receptores que recibieron un trasplante de islotes isogénicos a partir de un páncreas de un único ratón (200 islotes). La Figura 4 es una gráfica en el que se ilustran los cambios en los niveles de azúcar en sangre en ratones diabéticos receptores que recibieron un trasplante de islotes isogénicos a partir de un páncreas de un único ratón (200 islotes), y que recibieron tres administraciones intraperitoneales de 500 pg de anticuerpo anti-receptor de IL-6 después del trasplante. La Figura 5 es una gráfica en el que se ilustran los cambios en los niveles de azúcar en sangre en ratones diabéticos receptores que recibieron un trasplante de islotes isogénicos a partir de un páncreas de un único ratón (200 islotes), y que recibieron una única administración intraperitoneal de 500 pg de anticuerpo anti-receptor de IL-6 después del trasplante. La Figura 6 es una gráfica en el que se ilustran los cambios en los niveles de azúcar en sangre en ratones diabéticos receptores que recibieron un trasplante de islotes isogénicos a partir de un páncreas de un único ratón (200 islotes), y que recibieron una única administración intraperitoneal de 200 pg de anticuerpo anti-receptor de IL-6 después del trasplante. La Figura 7 es una gráfica en el que se ilustra que la administración del anticuerpo anti-receptor de IL-6 suprime la producción post-trasplante de citocinas inflamatorias por las células en infiltración. La Figura 8 es una gráfica en el que se ¡lustran los cambios en los niveles de azúcar en sangre en ratones diabéticos receptores que recibieron un trasplante de islotes alogénicos a partir de un páncreas de un único ratón (200 islotes), y que recibieron tres administraciones intraperitoneales de 200 pg de IgG de rata después del trasplante. La Figura 9 es una gráfica en el que se ilustran los cambios en los niveles de azúcar en sangre en ratones diabéticos receptores que recibieron un trasplante de islotes alogénicos a partir de un páncreas de un único ratón (200 islotes), y que recibieron una única administración intraperitoneal de 200 pg de anticuerpo anti-CD4 después del trasplante. La Figura 10 es una gráfica en el que se ilustran los cambios en los niveles de azúcar en sangre en ratones diabéticos receptores que recibieron un trasplante de islotes alogénicos a partir de un páncreas de un único ratón (200 islotes), y que recibieron tres administraciones intraperitoneales de 500 pg de anticuerpo anti-receptor de IL-6, y una administración de 200 pg de anticuerpo anti-CD4 después del trasplante. Mejor Modo de Realización de la Invención Los presentes inventores descubrieron que el anticuerpo anti-receptor de IL-6 puede suprimir el daño a los islotes trasplantados después del trasplante de islotes. La presente invención se basa en estos descubrimientos. La presente invención se relaciona con agentes para suprimir el daño a los islotes trasplantados después del trasplante de islotes, que comprenden un inhibidor de IL-6 como ingrediente activo. En la presente documentación, un "inhibidor de IL-6" es una sustancia que bloquea la transd ucción de señales mediada por IL-6 e inhibe la actividad biológica de IL-6. Preferiblemente, el inhibidor de IL-6 es una sustancia que tiene una función inhibidora contra la unión de IL-6, el receptor de IL-6, o gp130. Los inhibidores de IL-6 de la presente invención incluyen, sin limitaciones, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-6, anticuerpos anti-receptor de IL-6, anticuerpos anti-gp130, variantes de IL-6, variantes solubles del receptor de IL-6 y péptidos parciales de IL-6 o del receptor de IL-6, y compuestos de bajo peso molecular que presentan actividades similares. Los inhibidores de IL-6 preferidos de la presente invención incluyen anticuerpos que reconocen receptores de IL-6. En la presente invención no se restringe particularmente la fuente del anticuerpo; sin embargo, el anticuerpo preferiblemente deriva de mamíferos, y más preferiblemente deriva de seres humanos. El anticuerpo anti-IL-6 usado en la presente invención puede obtenerse como un anticuerpo policlonal o monoclonal a través de medios conocidos. En particular, se prefieren los anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos como el anticuerpo anti-IL-6 usado en la presente invención. Los anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos incluyen aquellos producidos a partir de hibridomas y aquellos producidos a partir de huéspedes transformados con un vector de expresión que comprende un gen de anticuerpo, de acuerdo con métodos de ingeniería genética. Al unirse a IL-6, el anticuerpo inhibe la unión de IL-6 a un receptor de IL-6, y bloquea la transmisión de la actividad biológica de IL-6 en la célula. Estos anticuerpos incluyen MH166 (Matsuda, T. y col., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956), el anticuerpo SK2 (Sato, K. y col., transacción de la 21a Reunión de la Sociedad Japonesa de Inmunología (1991) 21, 166), y semejantes. Básicamente, es posible preparar hibridomas que producen el anticuerpo anti-IL-6 usando técnicas conocidas, como se indica a continuación. Específicamente, estos hibridomas pueden prepararse usando IL-6 como antígeno sensibilizador para realizar la inmunización, de acuerdo con un método de inmunización convencional, fusionando las células inmunes obtenidas con células progenitoras conocidas, de acuerdo con un método de fusión celular convencional, y buscando células productoras de anticuerpos monoclonales con un método de análisis convencional. Más específicamente, es posible producir anticuerpos anti-IL-6 como se indica a continuación. Por ejemplo, es posible obtener IL-6 humana, usada como antígeno sensibilizador para obtener anticuerpos, usando el gen y/o la secuencia de aminoácidos de IL-6 descripta en Bur. J. Biochem. (1987) 168, 543-550; J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541; y/o Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2698. Después de transformar una célula huésped apropiada con un sistema de vectores de expresión conocido con una secuencia genética de IL-6 insertada, se purifica la proteína IL-6 deseada con un método conocido, a partir del interior de una célula huésped o a partir del sobrenadante de cultivo. Esta proteína IL-6 purificada puede usarse como antígeno sensibilizador. Como alternativa, puede usarse una proteína de fusión de la proteína IL-6 y otra proteína como antígeno sensibilizador. Los anticuerpos anti-receptor de IL-6 usados en la presente invención pueden obtenerse como anticuerpos policlonales o monoclonales de acuerdo con métodos conocidos. En particular, los anticuerpos anti-receptor de IL-6 usados en la presente invención son preferiblemente anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos. Los anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos incluyen aquellos producidos a partir de hibridomas y aquellos producidos a partir de huéspedes transformados con un vector de expresión que comprende el gen del anticuerpo, de acuerdo con métodos de ingeniería genética. Al unirse a un receptor de IL-6, el anticuerpo inhibe la unión de IL-6 al receptor de IL-6 y bloquea la transmisión de la actividad biológica de IL-6 en la célula. Estos anticuerpos incluyen el anticuerpo MR16-1 (Tamura, T. y col., Proc, Nati. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), el anticuerpo PM-1 (Hirata, Y y col., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), el anticuerpo AUK12-20, el anticuerpo AUK64-7 y el anticuerpo AUK146-15 (SVO 92/19759), y semejantes. Entre ellos, puede mencionarse el anticuerpo PM-1 como un ejemplo de un anticuerpo monoclonal preferido contra el receptor de IL-6 humano, y puede mencionarse el anticuerpo R16-1 como un anticuerpo monoclonal preferido contra el receptor de IL-6 de ratón. Básicamente, es posible preparar hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal anti-receptor de IL-6 usando técnicas conocidas, como se indica a continuación. Específicamente, estos hibridomas pueden prepararse usando IL-6 como antígeno sensibilizador para realizar la inmunización, de acuerdo con un método de inmunización convencional, fusionando las células inmunes obtenidas con células progenitoras conocidas, de acuerdo con un método de fusión celular convencional, y buscando células productoras de anticuerpos monoclonales con un método de análisis convencional. More específicamente, es posible producir anticuerpos anti-IL-6 como se indica a continuación. Por ejemplo, es posible obtener un receptor de IL-6 humano o un receptor de IL-6 de ratón, usado como antígeno sensibilizador para obtener anticuerpos, usando los genes y/o las secuencias de aminoácidos de receptores de IL-6 descriptas en la Publicación de Patente Europea No. LP 325474 y la Publicación de Solicitud de Patente Japonesa Kokai No. (JP-A) H03-155795 (sin examinar, Solicitud de Patente Publicada), respectivamente. Hay dos tipos de proteínas receptoras de IL-6, es decir, las proteínas que se expresan en la membrana celular y las proteínas separadas de la membrana celular (receptor de IL-6 soluble) (Yasukawa, K. y col., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). El receptor de IL-6 soluble consiste esencialmente en la región extracelular del receptor de IL-6 unido a membrana, y difiere del receptor de IL-6 unido a membrana porque carece de la región transmembrana, o porque carece de la regiones transmembrana e intracelular. Es posible emplear cualquier receptor de IL-6 como proteína receptora de IL-6, siempre que pueda usárselo como antígeno sensibilizador para producir el anticuerpo anti-receptor de IL-6 utilizado en la presente invención. Después de transformar una célula huésped apropiada con un sistema de vectores de expresión con una secuencia genética de receptor de IL-6 insertada, se purifica la proteína receptora de IL-6 deseada con un método conocido, a partir del interior de una célula huésped o a partir del sobrenadante de cultivo. Esta proteína receptora de IL-6 purificada puede usarse como antígeno sensibilizador. Como alternativa, puede usarse una célula que expresa el receptor de IL-6, o una proteína de fusión de la proteína receptora de IL-6 y otra proteína como antígeno sensibilizador. Los anticuerpos ariti-gp130 usados en la presente invención pueden obtenerse como anticuerpos policlonales o monoclonales de acuerdo con métodos conocidos. En particular, los anticuerpos anti-gp130 usados en la presente invención son preferiblemente anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos. Los anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos incluyen aquellos producidos a partir de hibridomas y aquellos producidos a partir de huéspedes transformados con un vector de expresión que comprende el gen del anticuerpo, de acuerdo con métodos de ingeniería genética. Al unirse a gp130, el anticuerpo inhibe la unión de gp130 al complejo de I L-6/receptor de IL-6, y bloquea la transmisión de la actividad biológica de IL-6 en la célula. Estos anticuerpos incluyen el anticuerpo AM64 (JP-Á (Kokai) H03-219894), el anticuerpo 4B11 y el anticuerpo 2H4 (US 5571513), el anticuerpo B-S12 y el anticuerpo B-P8 (JP-A (Kokai) H08-291199), y semejantes. Básicamente, es posible preparar hibridomas que producen el anticuerpo anti-gp130 usando técnicas conocidas, como se indica a continuación. Específicamente, estos hibridomas pueden prepararse usando gp130 como antígeno sensibilizador para realizar la inmunización, de acuerdo con un método de inmunización convencional, fusionando las células inmunes obtenidas con células progenitoras conocidas, de acuerdo con un método de fusión celular convencional, y buscando células productoras de anticuerpos monoclonales con un método de análisis convencional. Más específicamente, el anticuerpo monoclonal puede producirse como se indica a continuación. Por ejemplo, es posible obtener gp130, usado como antígeno sensibilizador para obtener anticuerpos, usando el gen y/o la secuencia de aminoácidos de gp130 descripta en la Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 411946. Después de transformar una célula huésped apropiada con un sistema de vectores de expresión conocido con una secuencia genética de gp130 insertada, se purifica la proteína gp130 deseada con un método conocido, a partir del interior de una célula huésped o a partir del sobrenadante de cultivo. Esta proteína gp130 purificada puede usarse como antígeno sensibilizador. Como alternativa, puede usarse una célula que expresa gp130, o una proteína de fusión de la proteína gp130 y otra proteína como antígeno sensibilizador. Los mamíferos que pueden inmunizarse con un antígeno sensibilizador no están particularmente limitados, pero preferiblemente se seleccionan teniendo en cuenta la compatibilidad con la célula progenitora usada para la fusión celular. En general se usan roedores, tales como ratones, ratas y hámsteres. La inmunización de los animales con 1 un antígeno sensibilizador se realiza de acuerdo con métodos conocidos. Por ejemplo, como método general, se la lleva a cabo inyectando el antígeno sensibilizador por vía intraperitoneal o subcutánea en mamíferos. Específicamente, el antígeno sensibilizador se diluye o suspende preferiblemente en una cantidad apropiada de solución salina amortiguada con fosfato (PBS), solución salina fisiológica o semejantes, se mezcla con una cantidad apropiada de un coadyuvante general (por ejemplo, coadyuvante completo de Freund), se emulsifica y luego se lo administra varias veces cada 4 a 21 días a un mamífero. Además, es posible usar un vehículo apropiado para la inmunización con un antígeno sensibilizador. Después de esta inmunización, se confirma un nivel incrementado del anticuerpo deseado en suero, y luego se obtienen células inmunes del mamífero para efectuar la fusión celular. Las células inmunes preferidas para la fusión celular incluyen, en particular, células de bazo. Para usar células de mieloma de mamíferos como células progenitores, es decir, para poder fusionar una célula progenitora con las células inmunes anteriores, se usan apropiadamente diversas cepas de células, por ejemplo, P3X63Ag8.653 (Keamey, J. F. y col., J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81,1-7), NS-1 (Kohler, Cz y Nilstein, C, Eur. J. unol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, A, H. y col., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. y col., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. E y col., J. Immunol. Methods (1980) 35,1-21), 5194 (Trowbrídge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Ufre, G y col., Nature (1979) 277, 131-133), y semejantes. Básicamente, es posible realizar la fusión celular de las células inmunes y las células de mieloma mencionadas previamente usando métodos conocidos, por ejemplo, el método de Nilstein y col. (Kohler, G. y Nilstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46), y semejantes. Más específicamente, la fusión celular mencionada previamente se efectúa generalmente en un medio de cultivo con nutrientes, en presencia de un agente que favorece la fusión celular. Por ejemplo, se usa polietilenglicol (PEG), virus Sendai (HVJ) y similares como agentes que favorecen la fusión celular. Además para mejorar la eficiencia de la fusión, pueden agregarse agentes auxiliares, tales como dimetil sulfóxido, para usarlos según se los necesite. La relación entre las células inmunes y células de mieloma usadas preferiblemente es, por ejemplo, de entre 1 y 10 células inmunes por cada célula de mieloma. El medio de cultivo usado para la fusión celular mencionada previamente es, por ejemplo, el medio de cultivo RPMI1640 o MEM, que es apropiado para la proliferación de las células de mieloma mencionadas previamente. También puede usarse un medio de cultivo general usado para cultivar este tipo de células. Además, pueden usarse suplementos de suero en combinación, tales como suero fetal de ternero (FCS). Para la fusión celular, las células de fusión (hibridomas) de interés se forman mezclando apropiadamente cantidades predeterminadas de las células inmunes y las células de miéloma mencionadas previamente en el medio de cultivo mencionado con anterioridad, y luego agregando y mezclando una concentración de entre 30 y 60% (p/v) de solución de PEG (por ejemplo, una solución de PEG con un peso molecular promedio de entre aproximadamente 1000 y 6000) precalentada a aproximadamente 37°C. Posteriormente, es posible eliminar los agentes de fusión celular y similares, que no son apropiados para el crecimiento del hibridoma, repitiendo los pasos de adición sucesiva de un medio de cultivo apropiado y remoción del sobrenadante por centrifugación . Los hibridomas anteriores se seleccionan cultivando las células en un medio de cultivo de selección general, por ejemplo, medio de cultivo HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo en el medio de cultivo HAT se continúa por un período de tiempo suficiente, generalmente por entre varios días y varias semanas, para matar las células distintas de los hibridomas de interés (células no fusionadas). Luego se pone en práctica un método de dilución limitada convencional para separar y clonar los hibridomas que producen el anticuerpo de interés. Además del método para inmunizar un animal no humano con un antígeno para obtener los hibridomas mencionados previamente, es posible obtener un anticuerpo humano deseado, que tiene actividad de unión a un antígeno o una célula que expresa un antígeno deseado, sensibilizando un linfocito humano con una proteína antigénica deseada o una célula que expresa un antígeno in vitro, y fusionando el linfocito B sensibilizado con una célula de mieloma humano (por ejemplo, U266) (véase la Publicación de Solicitud de Patente Japonesa Kokoku No. (JP-B) H01-59878 (solicitud de patente japonesa examinada y aprobada, publicada para oposición)). Más aún, es posible obtener un anticuerpo humano deseado administrándole el antígeno o la célula que expresa el antígeno a un animal transgénico que tiene un repertorio de genes de anticuerpos humanos, y luego poniendo en práctica el método mencionado previamente (véanse las Publicaciones de Solicitudes de Patentes Internacionales No. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO 96/33735). Los hibridomas preparados de este modo, que producen anticuerpos monoclonales, pueden subcultivarse en un medio de cultivo convencional y almacenarse en nitrógeno líquido por un período prolongado. Para obtener anticuerpos monoclonales a partir de los hibridomas mencionados previamente pueden emplearse los siguientes métodos: (1) un método en el que se cultivan los hibridomas de acuerdo con métodos convencionales y se obtienen los anticuerpos como sobrenadante de cultivo; (2) un método en el que los hibridomas se hacen proliferar administrándoselos a un mamífero compatible, y obteniendo los anticuerpos como ascites; y semejantes. El primer método se emplea para obtener anticuerpos con una pureza elevada, y el segundo método es más apropiado para la producción de anticuerpos a gran escala. Por ejemplo, la preparación de hibridomas productores de anticuerpos anti-receptor de IL-6 puede efectuarse de acuerdo con el método descripto en JP-A (Kokai) H03-139293. La preparación puede efectuarse de acuerdo con un método que comprende inyectar un hibridoma productor de anticuerpo PM-1 en la cavidad abdominal de un ratón BALB/c, obtener ascites, y luego purificar el anticuerpo PM-1 a partir de los ascites, o el método que comprende cultivar el hibridoma en un medio apropiado (por ejemplo, un medio RPMI1640 que contiene 10% de suero fetal bovino y 5% de BM-Condimed H1 (Boehringer Mannheim); medio para hibridomas SFM (GIBCO-BRL); medio PFHM-II (GIBCO-BRL), etcétera), y luego puede obtenerse el anticuerpo PM-1 a partir del sobrenadante de cultivo. Un anticuerpo recombinante puede usarse como un anticuerpo monoclonal de la presente invención, donde el anticuerpo se produce mediante técnicas de recombinación genética, mediante la clonación de un gen de anticuerpo a partir de un hibridoma, la inserción del gen en un vector apropiado, y la introducción posterior del vector en un huésped (véase, por ejemplo, Borrebaerck, C. A. K. y Larrick, J. W, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANDTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD., 1990). Más específicamente, se aisla ARNm que codifica la región variable (V) del anticuerpo a partir de una célula que produce el anticuerpo de interés, tal como un hibridoma. El aislamiento del ARNm puede efectuarse preparando ARN total de acuerdo con métodos conocidos, tal como el método de ultracentrifugación de guanidina (Chirgwin, J. M. y col., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) y el método de AGPC (Chomczynski, P y col., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), y la preparación del ARNm puede efectuarse con un conjunto de elementos para purificar ARNm (Pharmacia), y semejantes. Como alternativa, el ARNm puede prepararse directamente usando el conjunto de elementos para purificar ARNm QuickPrep (Pharmacia). El ADNc de la región V del anticuerpo se sintetiza a partir del ARNm obtenido usando transcriptasa inversa. La síntesis del ADNc puede efectuarse usando el conjunto de elementos de síntesis de ADNc con transcriptasa inversa de primera cadena, y semejantes. Además, para sintetizar y amplificar el ADNc, puede emplearse el método de 5'-RACE (Frohman, M. A. y col., Proc. Nati. Acad. Sei. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. y col., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932), usando el conjunto de elementos 5'-AmpliFINDER RACE (Clontech) y PCR. El fragmento de ADN de interés se purifica a partir de los productos de PCR obtenidos, y luego se une con un ADN vector. Luego se prepara un vector recombinante usando el ADN anterior, y se lo introduce en Escherichia coli o semejantes, y sus colonias se seleccionan para preparar el vector recombinante deseado. La secuencia de nucleótidos del ADN de interés se confirma, por ejemplo, con el método de dideoxi. Cuando se obtiene un ADN que codifica la región V de un anticuerpo de interés, el ADN se une con un ADN que codifica una región constante de anticuerpo deseada (región C) y se inserta en un vector de expresión. Como alternativa, el ADN que codifica la región V del anticuerpo puede insertarse en un vector de expresión que comprende el ADN de una región C de anticuerpo.

Para producir un anticuerpo que puede usarse en la presente invención, como se describirá más adelante, se inserta el gen del anticuerpo en un vector de expresión, de modo que se exprese bajo el control de la región reguladora de la expresión, por ejemplo, un potenciador y un promotor. Luego puede expresarse el anticuerpo transformando una célula huésped con este vector de expresión. En la presente invención, para disminuir la heteroantigenicidad contra seres humanos y semejantes, pueden usarse anticuerpos recombinantes modificados genéticamente de forma artificial, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Estos anticuerpos modificados pueden prepararse usando métodos conocidos. Es posible obtener un anticuerpo quimérico uniendo el ADN que codifica la región V del anticuerpo, descripto con anterioridad, con un ADN que codifica una región C de un anticuerpo humano, insertando el ADN en un vector de expresión e introduciéndolo en un huésped para producirlo (véase la Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 125023; la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 92/19759). Este método conocido puede usarse para obtener anticuerpos quiméricos útiles para la presente invención. Los anticuerpos humanizados también se conocen como anticuerpos humanos reformados, y son anticuerpos en los que las regiones de determinación de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo de un mamífero distinto del ser humano (por ejemplo, un anticuerpo de ratón) se transfieren a las CDR de un anticuerpo humano. También se conocen métodos generales para esta recombinación genética (véanse la Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 125023 y la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 92/19759). Más específicamente, se sintetiza por PCR una secuencia de ADN, diseñada de modo que las CDR de un anticuerpo de ratón estén unidas a las regiones de marco de trabajo (FR) de un anticuerpo humano, a partir de varios oligonucleótidos que han sido producidos de modo que contengan porciones superpuestas en sus extremos. El ADN obtenido se une con un ADN que codifica una región C de un anticuerpo humano, y luego se inserta en un vector de expresión. El vector de expresión se introduce en un huésped para producir el anticuerpo humanizado (véanse la Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 239400 y la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 92/19759).

Las FR de los anticuerpos humanos que se desea unir a través de las CDR se seleccionan de modo que las CDR formen un sitio de unión a antígéno apropiado. El o los aminoácidos dentro de las FR de las regiones variables de los anticuerpos pueden sustituirse según sea necesario, de modo que todas las CDR del anticuerpo humano reformado formen un sitio de unión a antígeno apropiado (Sato, K, y col., Cáncer Res. (1993) 53, 851-856). Las regiones C del anticuerpo humano se usan para los anticuerpos quiméricos y humanizados, e incluyen Cy. Por ejemplo, puede usarse Cy1, Cy2, Cy3 o Cy4. Además, para mejorar la estabilidad del anticuerpo o su producción, es posible modificar las regiones C del anticuerpo humano. Los anticuerpos quiméricos consisten en la región variable de un anticuerpo derivado de mamíferos no humanos y una región C derivada de un anticuerpo humano; y los anticuerpos humanizados consisten en las CDR de un anticuerpo derivado de mamíferos no humanos y regiones de marco de trabajo y regiones C derivadas de un anticuerpo humano. Ambos presentan una antigenicidad reducida en el cuerpo humano, por lo que son útiles como anticuerpos para usar en la presente invención. Los ejemplos específicos preferidos de anticuerpos humanizados usados en la presente invención incluyen un anticuerpo humanizado PM-1 anticuerpo (véase la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 92/19759). Adicionalmente, además del método para obtener un anticuerpo humano mencionado con anterioridad, también se conocen técnicas para obtener anticuerpos humanos que comprenden el uso de una biblioteca de anticuerpos humanos. Por ejemplo, es posible expresar las regiones variables de anticuerpos humanos en la superficie de fagos como anticuerpos de cadena simple (scFv) con el método de presentación de fagos, y luego seleccionar los fagos que se unen a antígenos. Al analizar los genes de los fagos seleccionados, es posible determinar las secuencias de ADN que codifican las regiones variables de los anticuerpos humanos que se unen al antígeno. Una vez que se han revelado la secuencia de ADN de un scFV que se une al antígeno, puede construirse un vector de expresión apropiado que comprende la secuencia, con el fin de obtener un anticuerpo humano. Estos métodos son conocidos, y es posible usar las publicaciones de WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 y WO 95/15388 como referencia. El gen de anticuerpo construido con anterioridad puede expresarse de acuerdo con métodos convencionales. Cuando se usa una célula de mamífero, el gen de anticuerpo puede expresarse usando un ADN en el que el gen de anticuerpo que se desea expresar está unido funcionalmente a un promotor útil de uso común, y a una señal de poli A río abajo del gen de anticuerpo, o un vector que comprende el ADN. Los ejemplos de a un promotor/potenciador incluyen el promotor/potenciador temprano del citomegalovirus humano. Además, otros promotores/potenciadores que pueden utilizarse para expresar el anticuerpo que se usará en la presente invención incluyen los promotores/potenciadores de retrovirus, virus de polioma, adenovirus, virus de simio 40 (SV40) y semejantes; y los promotores/potenciadores derivados de células de mamíferos, tales como el factor de elongación 1a humano (HEF1 a). Por ejemplo, cuando se usa el promotor/potenciador SV40, la expresión puede realizarse fácilmente de acuerdo con el método de Mulligan y col. (Mulligan, R C. y col., Nature (1979) 277, 108-114). Como alternativa, en el caso de un promotor/potenciador HEF1a, puede usarse el método de Mizushima y col. (Mizushima, S. y Nagata S., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322). Cuando se usa E. coli, es posible expresar el gen del anticuerpo uniendo funcionalmente un promotor útil convencional, una secuencia señal para secretar el anticuerpo y el gen del anticuerpo que se desea expresar. Los ejemplos de promotores incluyen el promotor lacZ, el promotor araB y semejantes. Cuando se usa el promotor lacZ, la expresión puede efectuarse de acuerdo con el método de Ward y col. (Ward, E. S. y col., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. y col., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427); y el promotor araB puede usarse de acuerdo con el método de Betten y col. (Better, M, y col., Science (1988) 240, 1041- 1043). Cuando se produce el anticuerpo en el periplasma de E. coli, puede usarse la secuencia señal peí B (Lei, S. P. y col., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) como secuencia señal para secretar el anticuerpo. El anticuerpo producido en el periplasma se aisla y luego se usa después de plegar apropiadamente la estructura del anticuerpo (véase, por ejemplo, WO 96/30394). Como orígenes de replicación pueden usarse aquellos derivados de SV40, el virus de polioma, adenovirus, el virus de papilloma bovino (BPV) y semejantes. Además, para mejorar la cantidad de copias del gen en el sistema de la célula huésped, el vector de expresión puede comprender el gen de aminoglicósido fosfotransferasa (APH), el gen de timidina quinasa (TK), el gen de xantina-guanina fosforribosiltramferasa de E. coli (Ecogpt), el gen de dihidrofolato reductasa (dhfr), o un gen semejante, como marcador de selección. Puede usarse cualquier sistema de producción para preparar los anticuerpos que se usarán en la presente invención. Los sistemas de producción para preparar los anticuerpos incluyen los sistemas de producción in vitro e in vivo. Los sistemas de producción in vitro incluyen aquellos en los que se utilizan células eucariotas o células procariotas. Los sistemas de producción en los que se usan células eucariotas incluyen aquellos en los que se utilizan células animales, células vegetales o células fúngicas. Las células animales incluyen (1) células de mamíferos, por ejemplo, CHO, COS, células de mieloma, células de riñon de hámster neonato (BHK), HeLa, Vero y semejantes, (2) células de anfibios, por ejemplo, oocitos de Xenopus; y (3) células de insectos, por ejemplo, sf9, sf21, Tn5 y semejantes. Las células vegetales conocidas incluyen células derivadas de Nicotiana tabacum, que pueden cultivarse como callos. Las células fúngicas conocidas incluyen levaduras, tales como Sacchcromyces (por ejemplo, S. cerevisiae) , hongos de moho, tales como Aspergíllus (por ejemplo, A. niger), y semejantes. Los sistemas de producción en los que se usan células procariotas incluyen aquellos en los que se utilizan células bacterianas. Las células bacterianas conocidas incluyen E. coli y Bacillus subtilis. Los anticuerpos pueden obtenerse introduciendo un gen de un anticuerpo de interés en estas células por transformación, y cultivando las células transformadas in vitro. El cultivo se realiza de acuerdo con métodos conocidos. Por ejemplo, puede usarse DMEM, ME , RPMI1640, IMDM como medio de cultivo, y es posible usar suplementos de suero, tales como FCS, en combinación. Además, una célula en la que se ha introducido un gen de anticuerpo puede transferirse a la cavidad abdominal, o a una parte semejante de un animal, para producir un anticuerpo in vivo. Por otro lado, los sistemas de producción in vivo incluyen aquellos en los que se utilizan animales o plantas. Los sistemas de producción en los que se usan animales incluyen aquellos en los que se utilizan mamíferos o insectos. Los mamíferos que pueden usarse incluyen cabras, cerdos, ovejas, ratones, bovinos y semejantes (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applieations, 1993). Además, los insectos que pueden usarse incluyen gusanos de seda. Cuando se usan plantas, por ejemplo, puede usarse tabaco. En estos animales o plantas se introduce un gen de anticuerpo, se produce un anticuerpo en el cuerpo de los animales o las plantas, y luego se lo recupera. Por ejemplo, el gen de anticuerpo se prepara como un gen de fusión insertando el gen en el medio de un gen que codifica una proteína, tal como la caseína ß de cabra, que se produce únicamente en la leche. Se inyecta un fragmento de ADN que comprende la fusión insertada del gen de anticuerpo en un embrión de cabra, y este embrión se introduce en una cabra hembra. El anticuerpo deseado se obtiene a partir de la leche producida por el animal transgénico que nace a partir de la cabra que ha recibido el embrión, o es producido por la progenie de este animal. Para incrementar la cantidad de leche que contiene el anticuerpo deseado producido por la cabra transgénica, pueden usarse apropiadamente hormonas en la cabra transgénica (Ebers, K. M. y col., Bio/Technology (1994) 12, 699-702). Además, cuando se usa un gusano de seda, se lo infecta Con baculovirus en los que se ha insertado el gen de anticuerpo deseado, y el anticuerpo deseado se obtiene a partir del fluido corporal de este gusano de seda (Maeda. S. y col., Nature (1985) 315, 592-594). Más aún, cuando se usa tabaco, el gen de anticuerpo deseado se inserta en un vector de expresión en plantas (por ejemplo, pMON530), y este vector se introduce en bacterias tales como Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria se usa para infectar tabaco (por ejemplo, Nicotiana tabacum) , con el fin de obtener el anticuerpo deseado a partir de las hojas de este tabaco (Julián, K.-C. Ma y col., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138). Cuando se produce un anticuerpo en sistemas de producción in vitro o in vivo como se describió previamente, pueden insertarse ADN que codifican la cadena pesada (cadena H) y la cadena liviana (cadena L) del anticuerpo en vectores de expresión separados, y luego se co-transforma un huésped con los vectores. Como alternativa, los ADN pueden insertarse en un único vector de expresión para transformar un huésped (véase la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/11523). Los anticuerpos usados en la presente invención pueden ser fragmentos de anticuerpos o productos modificados basados en éstos, siempre que puedan usarse apropiadamente en la presente invención. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, F(ab')2, Fv y Fv de cadena simple (scFv), donde se unen Fv de las cadenas H y L a través de un conector apropiado.

Específicamente, los fragmentos de anticuerpos se producen tratando un anticuerpo con una enzima, por ejemplo, papaína o pepsina, o como alternativa, se construyen genes que codifican estos fragmentos, se los introduce en vectores de expresión y se los expresa en células huésped apropiadas (véanse, por ejemplo, Co, M. S. y col., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Bete M. & Horwitz, A. H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. y col., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-666; Bird, R. E. y col., TIBTECH (1991) 9, 132-137). Es posible obtener un scFv uniendo la región V de la cadena H y la región V de la cadena L de un anticuerpo. En el scFv, la región V de la cadena H y la región V de la cadena L están unidas por un conector, preferiblemente a través de un conector peptídico (Huston, J. S. y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). Las regiones V de las cadenas H y L en un scFv pueden derivar de cualquiera de los anticuerpos descriptos previamente. Los conectores peptídicos para unir las regiones V incluyen, por ejemplo, una única cadena peptídica arbitraria que consiste en entre 12 y 19 residuos de aminoácidos. Es posible obtener un ADN que codifica un scFv usando como molde el ADN que codifica la cadena H, o su región V, y el ADN que codifica la cadena L, o su región V, de los anticuerpos mencionados previamente, realizando la amplificación por PCR de la porción de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos deseada en la secuencia molde, usando cebadores que definen los extremos de la porción, y luego amplificando adicionalmente la porción de ADN amplificada con un ADN que codifica una porción de conector peptídico, con un par de cebadores que une ambos extremos del conector con la cadena H y la cadena L. Además, una vez que se ha obtenido un ADN que codifica un scFv, puede obtenerse un vector de expresión que comprende el ADN y un huésped transformado con el vector de acuerdo con métodos convencionales. Además, el scFv puede obtenerse de acuerdo con métodos convencionales usando el huésped. De forma similar a lo descripto con anterioridad, es posible producir estos fragmentos de anticuerpos a partir del huésped obteniendo y expresando sus genes. En la presente documentación, un "anticuerpo" incluye estos fragmentos de anticuerpos. Como anticuerpo modificado también puede usarse un anticuerpo unido a diversas moléculas, tales como polietilenglicol (PEG). En la presente documentación, un "anticuerpo" abarca estos anticuerpos modificados. Estos anticuerpos modificados pueden obtenerse modificando los anticuerpos obtenidos por medios químicos. Estos métodos ya están establecidos en la técnica. Los anticuerpos producidos y expresados como se describió con anterioridad pueden aislarse a partir del interior o el exterior de la célula o el huésped, y pueden purificarse hasta que estén homogéneos. El aislamiento y/o la purificación de los anticuerpos usados en la presente invención puede realizarse por cromatografía de afinidad. Las columnas que pueden usarse para la cromatografía de afinidad incluyen, por ejemplo, la columna de proteína A y la columna de proteína G. Los vehículos usados para la columna de proteína A incluyen, por ejemplo, HiperD, POROS, SepharoseF.F. y semejantes. Además de los anteriores, pueden usarse otros métodos para aislar y/o purificar proteínas comunes, y éstos no están limitados de modo alguno. Por ejemplo, los anticuerpos usados en la presente invención pueden aislarse' y/o purificarse seleccionando y combinando apropiadamente cromatografías, más allá de la cromatografía de afinidad, filtros, ultrafiltración , desalado, diálisis y semejantes. Las cromatografías incluyen, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, filtración en gel y semejantes. Estas cromatografías pueden aplicarse a una cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC). Como alternativa, puede usarse HPLC de fase inversa. La concentración de los anticuerpos obtenidos como se describió con anterioridad puede determinarse con mediciones de absorbancia, ELISA o semejantes. Específicamente, la absorbancia se determina diluyendo apropiadamente la solución de anticuerpo con PBS(-), midiendo la absorbancia a 280 nm y calculando la concentración (1,35 OD = 1 mg/ml). Como alternativa, cuando se usa un ELISA, la medición puede realizarse como se indica a continuación. Específicamente, se agregan 100 µ? de IgG de cabra anti-humano (TAG), diluida hasta 1 pg/mi con amortiguador de bicarbonato 0,1 M (pH 9,6), a una placa de 96 cavidades (Nunc), y se incuba durante la noche a 4°C para inmovilizar el anticuerpo. Después de bloquear, se agregan 100 µ? de un anticuerpo de la presente invención diluido apropiadamente, o una muestra que comprende el anticuerpo diluida apropiadamente, y IgG humana (CAPPEL) como referencia, y se incuba una hora a temperatura ambiente. Después de lavar, se agregan 100 µ? de IgG anti-humano marcada con fosfatasa alcalina (BIO SOURCE), diluida 5000 x, y se incuba una hora a temperatura ambiente. Después de realizar otro lavado, se agrega la solución de sustrato y se incuba, y se mide la absorbancia a 405 nm usando el lector de microplacas modelo 3550 (Bio-Rad), para calcular la concentración del anticuerpo de interés. Las variantes de IL-6 usadas en la presente invención son sustancias que presentan actividad de unión a un receptor de IL-6, y que no transmiten la actividad biológica de IL-6. Es decir, las variantes de IL-6 compiten con IL-6 por la unión a los receptores de IL-6, pero no pueden transmitir la actividad biológica de IL-6, por lo que bloquean la transducción de señales mediada por IL-6. Las variantes de IL-6 se producen introduciendo una o más mutaciones, mediante la sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de IL-6. El origen de la IL-6 usada como base de las variantes de IL-6 no es limitado; sin embargo, preferiblemente es IL-6 humana, cuando se considera su antigenicidad, y factores semejantes. Más específicamente, la sustitución de aminoácidos se realiza prediciendo la estructura secundaria de la secuencia de aminoácidos de IL-6 con programas de modelado molecular conocidos (por ejemplo,7 WHATIF; Vriend y col., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56), y evaluando adicionalmente la influencia de los uno o más residuos de aminoácidos sustituidos en la molécula completa. Una vez determinado el residuo de aminoácido apropiado que se desea sustituir, comúnmente se ponen en práctica métodos de PCR, usando la secuencia de nucleótidos que codifica el gen de IL-6 humano como molde para introducir mutaciones, con el fin de sustituir los aminoácidos, con lo que se obtiene un gen que codifica una variante de IL-6. De ser necesario, este gen se inserta en un vector de expresión apropiado, y la variante de IL-6 puede obtenerse aplicando los métodos mencionados previamente para expresar, producir y purificar los anticuerpos recombinantes. Se describen ejemplos específicos de las variantes de IL-6 en Brakenhoff y col., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, Savino y col., EMBO J. (1994) 13,1357-1367, WO 96/18648 y WO 96/17869. Los péptidos parciales de IL-6 y los péptidos parciales de receptores de IL-6 que se usarán en la presente invención son sustancias que presentan actividad de unión a receptores de IL-6 e IL-6, respectivamente, y que no transmiten la actividad biológica de IL-6. A conocer, al unirse y capturar un receptor de IL-6 o una IL-6, el péptido parcial de IL-6 o el péptido parcial del receptor de IL-6 inhibe específicamente la unión de IL-6 con el receptor de IL-6. como resultado, la actividad biológica de IL-6 no se transmite, por lo que se bloquea la transducción de señales mediada por IL-6. Los péptidos parciales de IL-6 o del receptor de IL-6 son péptidos que comprenden una parte o la totalidad de la secuencia de aminoácidos de la región de la secuencia de aminoácidos de la IL-6 o el receptor de IL-6 que participa en la unión de la IL-6 y el receptor de IL-6. Estos péptidos comúnmente comprenden entre 10 y 80, preferiblemente entre 20 y 50, más preferiblemente entre 20 y 40 residuos de aminoácidos. Los péptidos parciales de IL-6 o los péptidos parciales del receptor de IL-6 pueden producirse de acuerdo con métodos generalmente conocidos, por ejemplo, técnicas de ingeniería genética o métodos de síntesis de péptidos, especificando la región de la secuencia de aminoácidos de la IL-6 o el receptor de IL-6 que participa en la unión de la IL-6 y el receptor de IL-6, y usando una porción o la totalidad de la secuencia de aminoácidos de la región especificada. Cuando se prepara un péptido parcial de IL-6 o un péptido parcial de un receptor de IL-6 con un método de ingeniería genética, se inserta una secuencia de ADN que codifica el péptido deseado en un vector de expresión, y luego puede obtenerse el péptido aplicando los métodos mencionados previamente para expresar, producir y purificar anticuerpos recombinantes. Para producir un péptido parcial de IL-6 o un péptido parcial de un receptor de IL-6 a través de métodos de síntesis de péptidos, pueden usarse métodos de síntesis de péptidos de uso general, por ejemplo, métodos de síntesis en fase sólida o métodos de síntesis en fase líquida. Específicamente, la síntesis puede realizarse de acuerdo con el método descripto en "Continuation of Development of Pharmaceuticals, Vol. 14, Peptide Synthesis (en japonés) (editado por. Hauakí Yajima, 1991, Hirokawa Shoten)". Como método de síntesis en fase sólida, por ejemplo, puede emplearse el siguiente método: el aminoácido que corresponde el extremo C del péptido que se desea sintetizar se une a un soporte que es insoluble en solventes orgánicos, luego se elonga la cadena peptídica repitiendo (1) la reacción de condensación de los aminoácidos cuyos grupos a-amino y sus grupos de cadenas de ramificación funcionales están protegidos con grupos protectores apropiados, uno por vez, en una dirección desde el extremo C hasta el extremo N; y (2) la reacción de remoción de los grupos protectores de los grupos a-amino del aminoácido o el péptido unido a la resina. La síntesis del péptido en fase sólida se clasifica ampliamente en el método Boc y el método Fmoc, sobre la base del tipo de grupo protector usado. Una vez sintetizada la proteína de interés como se describió previamente, se efectúa la reacción de desprotección y la reacción para separar la cadena peptídica del soporte. Para la reacción de separación de la cadena peptídica, en general se usa fluoruro de hidrógeno o ácido trifluorometan sulfónico para el método Boc, y TFA para el método Fmoc. De acuerdo con el método Boc, por ejemplo, la resina con el péptido protegido mencionada previamente se trata en fluoruro de hidrógeno en presencia de anisol. Luego se recupera el péptido eliminando el grupo protector y separando el péptido del soporte. Al secar por congelamiento el péptido recuperado, puede obtenerse un péptido en bruto. Por otro lado, en el método Fmoc, por ejemplo, es posible llevar a cabo la reacción de desprotección y la reacción para separar la cadena peptídica del soporte en TFA, de acuerdo con un método similar al descripto previamente. El péptido en bruto obtenido puede separarse y/o purificarse efectuando una HPLC. La elución puede efectuarse bajo condiciones óptimas, usando un sistema de solventes de agua-acetonitrilo, que generalmente se usa para purificar proteínas. Las fracciones que corresponden a los picos del perfil cromatográfico obtenido se recolectan y se secan por congelamiento. Por consiguiente, se identifican fracciones de péptidos purificados a través de análisis de peso molecular, análisis de espectro de masa, análisis de composición de aminoácidos, análisis de secuencias de aminoácidos, o semejantes. Se describen ejemplos específicos de péptidos parciales de IL-6 y péptidos parciales de receptores de IL-6 en JP-A (Kokai) H02-188600, JP-A (Kokai) H07-324097, JP-A (Kokai) H08-311098, y en la Publicación de Patente Norteamericana No. US 5210075. Los anticuerpos usados en la presente invención también pueden ser anticuerpos conjugados, que están unidos a diversas moléculas, tales como polietilenglicol (PEG), sustancias radiactivas y toxinas. Estos anticuerpos conjugados pueden obtenerse modificando químicamente los anticuerpos obtenidos. Los métodos para modificar los anticuerpos ya están establecidos en la técnica. Los "anticuerpos" de la presente invención abarcan estos anticuerpos conjugados. Los agentes de la presente invención para suprimir el daño a los - islotes trasplantados después del trasplante de islotes pueden usarse para tratar la diabetes. La diabetes incluye la diabetes tipo 1, la diabetes tipo 2, la diabetes pancreática, la diabetes gestacional, y semejantes. Los tipos de diabetes descriptos previamente también incluyen las diabetes secundarias causadas por pancreatitis o inducidas por el uso de drogas esteroidales, y las diabetes debidas a causas específicas, tales como las diabetes causadas por anormalidades en genes particulares.

Los agentes de la presente invención para suprimir el daño a los islotes trasplantados pueden usarse en el trasplante de islotes. El trasplante de islotes incluye el trasplante de islotes a partir de donantes con muerte cerebral, a partir de donantes con paro cardiaco y a partir de donantes vivos. El trasplante de islotes de acuerdo con la presente invención puede incluye isoinjertos y aloinjertos. Los isoinjertos son trasplantes entre animales de un sistema homogéneo, que en seres humanos son trasplantes entre gemelos idénticos. Los aloinjertos son trasplantes entre individuos de la misma especie que presenta diferencias genéticas, que en seres humanos son trasplantes entre individuos sin relación alguna o entre mellizos diovulares. En la presente invención, la actividad de los inhibidores de IL-6 en la inhibición de la transducción de la señal de IL-6 puede evaluarse con métodos convencionales. Específicamente, se agrega IL-6 a cultivos de líneas de células de mieloma humano dependiente de IL-6 (S6B45 y KPMM2), la línea de células T de linforma de Lennert humano KT3 o la línea de células dependientes de IL-6 MH60.BSF2; y se mide la asimilación de 3H-timidina por las células dependientes de IL-6 en presencia de un inhibidor de IL-6. Como alternativa, se cultivan células U266 que expresan el receptor de IL-6, se agrega IL-6 marcada con 25l y un inhibidor de IL-6 al cultivo al mismo tiempo; y luego se cuantifica la IL-6 marcada con 125l unida a las células que expresan el receptor de IL-6. Además del grupo del inhibidor de IL-6, se incluye un control negativo que no contiene el inhibidor de IL-6 en el sistema de ensayo descripto previamente. La actividad del inhibidor de IL-6 en la inhibición de IL-6 puede evaluarse comparando los resultados de ambos grupos. Como se indicará más adelante en los Ejemplos, se descubrió que la administración de un anticuerpo anti-receptor de IL-6 suprimía el daño a los islotes trasplantados después del trasplante de islotes. Este descubrimiento sugiere que los inhibidores de IL-6, tales como los anticuerpos anti-receptor de IL-6, son útiles como agentes para suprimir el daño a los islotes trasplantados después del trasplante de islotes. Los sujetos que recibirán la administración de los agentes de la presente invención para suprimir el daño a los islotes trasplantados son mamíferos. Preferiblemente, los mamíferos son seres humanos. Los agentes de la presente invención para suprimir el daño a los islotes trasplantados pueden administrarse como sustancias farmacéuticas, y pueden administrarse por vía sistémica o local, mediante una administración oral o parenteral. Por ejemplo, puede seleccionarse una inyección intravenosa, tal como una infusión por goteo, una inyección intramuscular, una inyección ¡ntraperitoneal, una inyección subcutánea, un supositorio, un enema, tabletas entéricas orales o semejantes. Es posible seleccionar un método de administración apropiado dependiendo de la edad y los síntomas del paciente. La dosis efectiva por administración se selecciona entre el rango de entre 0,01 y 100 mg/kg de peso corporal. Como alternativa, la dosis puede seleccionarse dentro del rango de entre 1 y 1000 mg/paciente, preferiblemente dentro del rango de entre 5 y 50 mg/paciente. Una dosis y un método de administración preferido son como se indica a continuación: por ejemplo, cuando se usa un anticuerpo anti-receptor de IL-6, la dosis efectiva es una cantidad tal que el anticuerpo libe está presente en la sangre. Específicamente, se administra una dosis de entre 0,5 y 40 mg/kg de peso corporal/mes (cuatro semanas), preferiblemente entre 1 y 20 mg/kg de peso corporal/mes por inyección intravenosa, tal como una infusión por goteo, una inyección subcutánea o semejantes, entre una y varias veces por mes, por ejemplo, dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada dos semanas o una vez cada cuatro semanas. El cronograma de administración puede ajustarse, por ejemplo, extendiendo el intervalo de administración desde dos veces por semana o una vez por semana hasta una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas, mientras se monitorea la condición después del trasplante y los cambios en los valores de la prueba en sangre. En la presente invención, los agentes para suprimir el daño a los islotes trasplantados pueden contener vehículos aceptables para el uso farmacéutico, tales como preservantes y estabilizadores. Los "vehículos aceptables para el uso farmacéutico" hacen referencia a materiales que pueden co- administrarse con un agente descripto con anterioridad, y ellos mismos pueden producir o no el efecto descripto previamente de supresión del daño a los islotes trasplantados. Como alternativa, los vehículos pueden ser materiales que no tengan el efecto de suprimir el daño a los islotes trasplantados, sino que produzcan un efecto de estabilización aditivo o sinérgico cuando se los use en combinación con un inhibidor de IL-6. Estos materiales aceptables para el uso farmacéutico incluyen, por ejemplo, agua estéril, solución salina fisiológica, estabilizadores, excipientes, amortiguadores, preservantes, detergentes, agentes quelantes (EDTA y semejantes) y aglutinantes. En la presente invención, los detergentes incluyen detergentes no iónicos, y los ejemplos típicos de éstos incluyen ésteres de sorbitan de ácidos grasos, tales como monocaprilato de sorbitan, monolaurato de sorbitan y monopalmitato de sorbitan; ésteres de glicerina de ácidos grasos, tales como monocaprilato de glicerina, monomiristato de glicerina y monoestearato de glicerina; ésteres de poliglicerina de ácidos, tales como monoestearato de decaglicerilo, diestearato de decaglicerilo y monolinoleato de decaglicerilo; ésteres de polioxietilen sorbitan de ácidos grasos, tales como monolaurato de polioxietilen sorbitan, monooleato de polioxietilen sorbitan, monoestearato de polioxietilen sorbitan, monopalmitato de polioxietilen sorbitan, trioleato de polioxietilen sorbitan y diestearato de polioxietilen sorbitan; ésteres de polioxietilen sorbit de ácidos grasos, tales como tetraestearato de polioxietilen sorbit y tetraoleato de polioxietilen sorbit; ésteres de polioxietilen glicerina de ácidos grasos, tales como monoestearato de polioxietilen glicerilo; ésteres de polietilen glicol de ácidos grasos, tales como diestearato de polietilen glicol; ésteres de polioxietilen alquilo, tales como éter de polioxietilen laurilo; ésteres de polioxietilen polioxipropilen alquilo, tales como polioxietilen polioxipropilen glicol, éter de polioxietilen polioxipropilen propilo y éter de polioxietilen polioxipropilen cetilo; ésteres de polioxietilen alquil fenilo, tales como éter de polioxietilen nonilfenilo; aceites de castor endurecidos con polioxietileno, tales como polioxietilen aceite de castor y aceite de castor endurecido con polioxietileno (aceite de castor endurecido con polioxietileno); derivados de polioxietilen cera de abeja, tales como polioxietilen sorbit cera de abeja; derivados de polioxietilen lanolina, tales como polioxietilen lanolina; y polioxietilen amidas de ácidos grasos y semejantes, con un valor de HLB de entre 6 y 18, tales como polioxietilen amida de ácido esteárico. Los detergentes también incluyen detergentes aniónicos, y los ejemplos típicos de éstos incluyen, por ejemplo, los alquilsulfatos que tienen un grupo alquilo con entre 10 y 18 átomos de carbono, tales como cetilsulfato de sodio, laurilsulfato de sodio y oleilsulfato de sodio; los sulfatos de éteres de polioxietilen alquilo, en los que el grupo alquilo tiene entre 10 y 18 átomos de carbono, y donde la cantidad molar promedio de óxido de etileno es de entre 2 y 4, tales como polioxietilen lauril sulfato de sodio; las sales de ésteres de sufosuccinato de alquilo que tienen un grupo alquilo con entre 8 y 18 átomos de carbono, tales como el éster de lauril sulfosuccinato de sodio; los detergentes naturales, por ejemplo, lecitina; los glicerofosfolípidos; los esfingo-fosfolípidos, tales como la esfingomielina; y los ésteres de sacarosa y ácidos grasos, en los que los ácidos grasos tienen entre 12 y 18 átomos de carbono. Puede combinarse uno, dos o más de los detergentes descriptos previamente, y puede agregárselos a los agentes de la presente invención. Los detergentes que se usan preferiblemente en las preparaciones de la presente invención incluyen los ésteres de ácidos grasos de polioxietilen sorbitan, tales como los polisorbatos 20, 40, 60 y 80. Los polisorbatos 20 y 80 son particularmente preferidos. También se prefieren los polioxietilen polioxipropilenglicoles, tales como el poloxámero (Pluronic F-68® y semejantes). La cantidad de detergente agregado varía dependiendo del tipo de detergente usado. Cuando se usa polisorbato 20 u 80, la cantidad en general está en el rango de entre 0,001 y 100 mg/ml, preferiblemente en el rango de entre 0,003 y 50 mg/ml, más preferiblemente, en el rango de entre 0,005 y 2 mg/ml. En la presente invención, los amortiguadores incluyen fosfato, amortiguador de citrato, ácido acético, ácido málico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido láctico, fosfato de potasio, ácido glucónico, ácido cáprico, ácido desoxicólico, ácido salicílico, trietanolamina, ácido fumárico y otros ácidos orgánicos, y amortiguador de ácido carbónico, amortiguador Tris, amortiguador de histidina y amortiguador de imidazol. Las preparaciones líquidas pueden formularse disolviendo los agentes en amortiguadores acuosos conocidos en el campo de las preparaciones líquidas. La concentración del amortiguador en general está en el rango de entre 1 y 500 mM, preferiblemente en el rango de entre 5 y 100 mM, más preferiblemente en el rango de entre 10 y 20 mm. Los agentes de la presente invención también pueden comprender otros polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina e inmunoglobulina; aminoácidos; azúcares e hidratos de carbono, tales como polisacáridos y monosacáridos, alcoholes de azúcares y semejantes. En la presente documentación, los aminoácidos incluyen aminoácidos básicos, por ejemplo, arginina, lisina, histidina y ornitina, y sales inorgánicas de estos aminoácidos (preferiblemente sales de clorhidrato y sales de fosfato, a conocer, aminoácidos de fosfato). Cuando se usan aminoácidos libres, el pH se ajusta hasta un valor preferido agregando sustancias amortiguadoras apropiadas para el uso fisiológico, por ejemplo, ácidos inorgánicos, en particular, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido acético y ácido fórmico, y sales de éstos. En este caso, el uso de fosfato es particularmente beneficioso, una que proporciona productos bastante estables al secarlos por congelamiento. El fosfato es particularmente ventajoso cuando se realizan preparaciones que sustancialmente no contienen ácidos orgánicos, tales como ácido málico, ácido tártarico, ácido cítrico, ácido succínico y ácido fumárico, o que no contienen los aniones correspondientes (ión malato, ión tartrato, ión citrato, ión succinato, ión fumarato y semejantes). Los aminoácidos preferidos son la arginina, la Usina, la histidina y la ornitina. Además, es posible usar aminoácidos ácidos, por ejemplo, ácido glutámico y ácido aspártico, y sales de éstos (preferiblemente sales de aminoácidos); aminoácidos neutros, por ejemplo, isoleucina, leucina, glicina, serina, treonina, valina, metionina, cisteina y alanina; y aminoácidos aromáticos, por ejemplo, fenilalanina, tirosina, triptofano y su derivado, N-acetil triptofano. En la presente documentación, los azúcares y los hidratos de carbono, tales como los polisacáridos y los monosacáridos, incluyen, por ejemplo, destrosa, glucosa, fructosa, lactosa, xilosa, mañosa, maltosa, sacarosa, trehalosa y rafinosa. En la presente documentación, los alcoholes de azúcares incluyen, por ejemplo, manitol, sorbitol e inositol. Cuando los agentes de la presente invención se preparan como soluciones acuosas para inyección, los agentes pueden mezclarse, por ejemplo, con solución salina fisiológica y/o con una solución ¡sotónica que contiene glucosa u otros agentes auxiliares (tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio). Las soluciones acuosas pueden usarse en combinación con agentes solubilizantes apropiados, tales como alcoholes (etanol y semejantes), polialcoholes (propilenglicol, PEG y semejantes), o detergentes no iónicos (polisorbato 80 y HCO-50).

Además, de ser necesario, los agentes pueden comprender diluyentes, solubilizantes, sustancias para ajustar el pH, agentes suavizantes, agentes reductores que contienen azufre, antioxidantes y semejantes. En la presente documentación, los agentes reductores que contienen azufre incluyen, por ejemplo, compuestos que comprenden grupos sulfhidrilo, tales como N-acetilcisteina, N-acetilhomocisteina, ácido tióctico, tiodiglicol, tioetanolamina , tioglicerol, tiosorbitol, ácido tioglicólico y sales de éste, tiosulfato de sodio, glutatión, y ácidos tioalcanoicos que tienen entre 1 y 7 átomos de carbono. Más aún, los antioxidantes en la presente invención incluyen, por ejemplo, ácido eritórbico, dibutilhidroxi toluenp, butilhidroxi anisol, a-tocoferol, acetato de tocoferol, ácido L-ascórbico y sales de éste, palmitato de ácido L-ascórbico, estearato de ácido L-ascórbico, bisulfito de sodio, sulfito de sodio, galato de tiamilo, galato de propilo, y agentes quelantes, tales como tetraacetato de etilenediámina disódico (EDTA), pirofosfato de sodio y metafosfato de sodio. De ser necesario, los agentes pueden encapsularse en microcápsulas (microcápsulas de hidroximetilcelulosa, gelatina, poli[ácido metilmetacrílico] o semejantes), o pueden prepararse como sistemas de administración de drogas coloidales (liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, nanocápsulas y semejantes) (véase Remington's Pharmaceutical Science", 16a edición, editado por Oslo, 1980, y semejantes). Además, también se conocen métodos para preparar los agentes como agentes de liberación sostenida, y puede aplicárselos a la presente invención (Langer y col., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem Tech. 1992, 12: 98-105; Patente Norteamericana No. 3773919; Solicitud de Patente Europea No. (EP) 58481; Sidman y col., Biopolimers 1983, 22: 547-556; y EP 133988). Los vehículos aceptables para el uso farmacéutico usados se seleccionan apropiadamente entre aquellos descriptos previamente, o se combinan dependiendo del tipo de forma de dosificación, pero no se limitan a aquellos. La presente invención se relaciona con métodos para suprimir el daño a los islotes trasplantados, que comprenden ja etapa de administrar un inhibidor de IL-6 a sujetos que han recibido un trasplante de islotes. Además, la presente invención se relaciona con métodos para mejorar la supervivencia de los islotes trasplantados en el sujeto, que comprenden la etapa de administrarle un inhibidor de IL-6 a los sujetos que han recibido un trasplante de islotes.

En la presente documentación, el "sujeto" hace referencia a organismos, partes corporales de los organismos, o una parte separada o proporcionada de los organismos en la que se desea administrar un agente de la presente invención para suprimir el daño a los islotes trasplantados. Los organismos incluyen animales (por ejemplo, seres humanos, especies de animales domésticos y animales salvajes), pero no están particularmente limitados. Las "partes corporales de los organismos" no están particularmente limitadas, pero preferiblemente incluyen órganos en los que se desea transplantar los islotes, omentum mayor, cápsula subrenal y mesenterio. En la presente invención, los órganos en los que se desea transplantar los islotes incluyen el hígado, y más específicamente, los vasos sanguíneos del hígado.

En la presente documentación, la "administración" incluye administraciones orales y parenterales. La administración oral incluye, por ejemplo, la administración de agentes orales. Estos agentes orales incluyen, por ejemplo, gránulos, polvos, tabletas, cápsulas, soluciones, emulsiones y suspensiones. La administración parenteral incluye, por ejemplo, la administración de inyecciones. Estas inyecciones incluyen, por ejemplo, inyecciones subcutáneas, inyecciones intramusculares e inyecciones intraperitoneales. Mientras tanto, los efectos de los métodos de la presente invención pueden alcanzarse introduciendo genes que comprenden los oligonucleótidos que se desea administrar en los cuerpos vivos, usando técnicas de terapia génica. Como alternativa, los agentes de la presente invención pueden administrarse en forma local en las áreas de tratamiento deseadas. Por ejemplo, los agentes pueden administrarse a través de una inyección local durante la cirugía, usando catéteres, o recurriendo a una administración directa de genes con ADN que codifica un péptido de la presente invención. Los agentes supresores de la presente invención pueden administrarse a los sujetos antes del trasplante de órganos, en el momento en que ocurre el trasplante de órganos o después del trasplante de órganos. Además, los agentes supresores pueden administrarse una única vez o en forma repetida. Como alternativa, cuando se los administra a una parte separada o proporcionada de un organismo, los agentes supresores de la presente invención pueden "ponerse en contacto" con la parte del organismo. En la presente invención, la "puesta en contacto" se realiza de acuerdo con la condición del organismo. Los ejemplos incluyen, sin limitaciones, el rocío de los agentes supresores de la presente invención sobre las partes del organismo, y la adición de los agentes supresores de la presente invención a partes del organismo comprimidas. Cuando la parte del organismo está compuesta por células cultivadas, el "contacto" mencionado previamente puede alcanzarse agregando los agentes supresores de la presente invención al medio de cultivo de estas células, o introduciendo ADN que comprenden los oligonuclcotides de la presente invención en las células que constituyen la parte del organismo. Cuando se ponen en práctica los métodos de la presente invención, los agentes supresores de la presente invención pueden administrarse como partes de composiciones farmacéuticas, en combinación con al menos un agente quimioterapéutico conocido. Como alternativa, los agentes supresores de la presente invención pueden administrarse de forma simultánea con al menos un inmunosupresor conocido. En una realización, los agentes q uimioterapéuticos conocidos y los agentes supresores de la presente invención pueden administrarse de una forma virtualmente simultánea. Los agentes supresores de la presente invención pueden administrarse en los sitios en que se ha realizado el trasplante de islotes, una vez que los islotes han sido trasplantados, o pueden administrarse en los blancos al mismo tiempo que los islotes. Como alternativa, los agentes pueden agregarse a los islotes in vitro, antes del trasplante. En la presente documentación, la frase "supresión del daño a los islotes trasplantados" denota que se suprime el daño a los islotes trasplantados y se mejora la viabilidad. La frase "supresión del daño a los islotes trasplantados" también comprende la supresión de las respuestas inmunes naturales que acompañan el trasplante.

La supresión del daño a los islotes trasplantados puede confirmarse midiendo los niveles de azúcar en sangre en los cuerpos vivos, de acuerdo con los métodos que se describen en los Ejemplos. Los niveles de azúcar en sangre pueden medirse, por ejemplo, recolectando sangre del seno orbital, y determinando los niveles de azúcar en sangre con un analizador de glucosa Beckman después de separar el plasma. Cuando la administración de los agentes de la presente invención para suprimir el daño a los islotes trasplantados provoca una disminución sostenida del nivel de azúcar en sangre, se considera que el daño a los islotes trasplantados ha sido suprimido. Como alternativa, cuando la supervivencia de los islotes mejora como resultado de esta administración, también es posible concluir que los agentes "suprimen el daño a los islotes trasplantados" después del trasplante de islotes. La supervivencia de los islotes puede evaluarse determinando si se restauran o no los niveles normales de azúcar en sangre después de un trasplante en receptores diabéticos. Por ejemplo, cuando se transplantan 200 islotes, que pueden aislarse a partir de un único donante, al grupo control descripto en los Ejemplos de la presente documentación, se mantiene el estado hiperglucémico, por lo que la viabilidad puede considerarse como 0%. Sin embargo, cuando la misma cantidad de islotes usada para el grupo control se transplanta al grupo que ha recibido la administración de anticuerpos anti-receptor de IL-6 descripto en los Ejemplos de la presente documentación, se restauran los niveles normales de azúcar en sangre en todos los receptores, por lo que se considera que la viabilidad es de 100%. Todos los documentos de la técnica previa citados en la presente documentación se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. Ejemplos A continuación, la presente invención se describirá específicamente con referencia a los Ejemplos, pero no debe interpretarse que se limita a éstos. Ejemplo 1 Investigación de la supresión del daño a los islotes trasplantados después del trasplante de islotes isogénicos, donde el efecto se debe a la administración de anticuerpos anti-receptor de IL-6 Se prepararon ratones diabéticos receptores administrando estreptozotocina (180 mg/kg) a ratones C57BL/6 macho por vía intravenosa. La estreptozotocina es un agente que destruye selectivamente los islotes de Langerhans en el páncreas. Una única administración de estreptozotocina elimina la mayoría de las células B, por lo que induce diabetes tipo 1. Sin el trasplante de islotes, en todos los ratones subsistió un estado de hiperglucemia (Figura 1). Entre tres y cinco días después de la administración de estreptozotocina, se transplantaron islotes isogénicos aislados de ratón a los hígados de los ratones diabéticos a través de la vena porta. Los islotes se aislaron a partir de donantes de islotes usando métodos basados en colagenasa. A partir del páncreas de un único ratón pueden aislarse 200 islotes. En el caso del trasplante de 400 islotes provenientes de dos ratones donantes, se restauraron los niveles normales de azúcar en sangre después de un transplanta a receptores diabéticos, y fue posible tratar la diabetes (Figura 2). En este Ejemplo, se recolectó sangre del seno orbital y se determinaron los niveles de azúcar en sangre usando un analizador de glucosa Beckman después de separar el plasma. Sin embargo, el trasplante de 200 islotes de un ratón no restauró los niveles normales de azúcar en sangre, y en los receptores subsistió un estado de hiperglucemia (Figura 3). Cuando se realizaron tres administraciones de 500 pg de anticuerpo anti-receptor de IL-6 (R16-1) por vía intraperitoneal después del trasplante de 200 islotes (días 0, 2, y 4), se restauraron los niveles normales de azúcar en sangre en todos los receptores después del trasplante (Figura 4). Cuando se realizó una única administración de una dosis igual de anticuerpo anti-receptor de IL-6, se restauraron los niveles normales de azúcar en sangre en tres cuartos de los receptores (Figura 5). Como alternativa, cuando se realizó una única administración de 200 g de anticuerpo anti-receptor de IL-6, se restauraron los niveles normales de azúcar en sangre en un tercio de los receptores (Figura 6). Los resultados anteriores demuestran que los anticuerpos anti-receptor de IL-6 redujeron el daño a los islotes trasplantados, mejoraron la supervivencia de los islotes y corrigieron la hiperglucemia en los receptores. Específicamente, se descubrió que los anticuerpos anti-receptor de IL-6 pueden usarse como agentes para suprimir el daño a los islotes trasplantados después de un trasplante de islotes isogénicos (isoinjerto). Ejemplo 2 Investigación de la supresión de la producción de citocinas inflamatorias, donde el efecto se debe a la administración de anticuerpos anti-receptor de IL-6 Se usaron métodos de citometría de flujo para investigar si la administración de los anticuerpos anti-receptor de IL-6 de la presente invención suprimía la producción post-trasplante de citocinas inflamatorias por parte de las células en infiltración. Se transplantaron 200 islotes isogénicos a los hígados de ratones con diabetes provocada por estreptozotocina, y estos animales se sacrificaron seis horas después, se extrajeron sus hígados y sus células mononucleares hepáticas se aislaron y se analizaron por citometría de flujo (Figura 7). No se observó producción de IFN-? y TNF-a en las células mononucleares hepáticas de los ratones sin tratar (vírgenes). La producción de IFN-? y TNF-a se vio incrementada en las células mononucleares hepáticas del grupo control, en el que no se había administrado anticuerpos anti-receptor de IL-6. No se observó la producción de IFN-? y TNF-a en las células mononucleares hepáticas de los ratones a los que se les había efectuado una única administración de anticuerpos anti-receptor de IL-6 (ip; 200 g/inyección/ratón) de forma simultánea con el trasplante. Estos descubrimientos sugieren que la administración de los anticuerpos anti-receptor de IL-6 previene el daño a los islotes trasplantados al suprimir la producción de citocinas inflamatorias. Ejemplo 3 Investigación de la supresión del daño a los islotes trasplantados en un trasplante de islotes alogénicos, donde el efecto se debe a la administración de anticuerpos antireceptor de IL-6 Se prepararon ratones diabéticos receptores administrando estreptozotocina (180 mg/kg) a ratones C57BL/6 macho por vía intravenosa. Entre tres y cinco días después de la administración de estreptozotocina, se transplantaron islotes alogénicos de ratón a los hígados de los ratones diabéticos (BALB/c) a través de la vena porta. Los islotes se aislaron a partir de páncreas de donantes usando métodos basados en colagenasa. Los niveles de azúcar en sangre se determinaron con el mismo método descripto en el Ejemplo 1. Después de transplantar 200 islotes, se realizaron tres administraciones de 500 pg de un anticuerpo anti-receptor de IL-6 (MR16-1) por vía intraperitoneal (días 0, 2 y 4), y una única administración de 200 pg de anticuerpo anti-CD4 por vía intraperitoneal, de forma simultánea con la primera administración del anticuerpo anti-receptor de IL-6, y se restauraron los niveles normales de azúcar en sangre en todos los receptores después del trasplante (FiguralO). Por otro lado, cuando se realizó la misma cantidad de administraciones de 500 pg de un anticuerpo control (IgG de rata) (Figura 8) o 200 de anticuerpo anti-CD4 solo (Figura 9), en todos los ratones prevaleció el estado de hiperglucemia. Los resultados anteriores demuestran que en los receptores que reciben aloinjertos, los anticuerpos anti-receptor de IL-6 también redujeron el daño a los islotes trasplantados, mejoraron la supervivencia de los islotes y corrigieron la hiperglucemia. Específicamente, se descubrió que los anticuerpos anti-receptor de IL-6 pueden usarse como agentes para suprimir el daño a los islotes trasplantados después de un trasplante de islotes alogénicos. Aplicabilidad Industrial Los métodos y los agentes de la presente invención para suprimir el daño a los islotes trasplantados mejoran la supervivencia de los islotes después del trasplante de islotes, y se espera que permitan efectuar un tratamiento eficiente de la diabetes usando menos donantes de islotes. Previamente, cuando se transplantaban islotes aislados a partir de páncreas de donantes con muerte cerebral o donantes con paro cardiaco, un único receptor requería islotes aislados a partir de páncreas de dos o tres donantes, ya que se inducía la falla funcional de los islotes, que reducía la viabilidad de los injertos. Al usar los agentes de la presente invención para suprimir daño a los islotes trasplantados, se reduce la cantidad de islotes requeridos para un único receptor, y como resultado, se espera que más receptores puedan recibir trasplantes de islotes.

En los informes recientes se describen casos exitosos de trasplantes de islotes a partir de donantes vivos, en los que se aislaron y purificaron islotes a partir de una porción de páncreas extraída a partir de donantes saludables y transplantada a pacientes diabéticos; sin embargo, se cree que el uso use de los agentes de la presente invención para suprimir daño a los islotes permite establecer métodos terapéuticos que sean menos invasivos para los donantes.

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Un agente para suprimir el daño a los islotes trasplantados después del trasplante de islotes, que comprende un inhibidor de IL-6 como ingrediente activo.

2. El agente para suprimir el daño a los islotes trasplantados de la reivindicación 1, en donde el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce una IL-6.

3. El agente para suprimir el daño a los islotes trasplantados de la reivindicación 1, en donde el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce un receptor de IL-6.

4. ?? agente para suprimir el daño a los islotes trasplantados de la reivindicación 2 ó 3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

5. El agente para suprimir el daño a los islotes trasplantados de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-IL-6 humano o un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano.

6. El agente para suprimir el daño a los islotes trasplantados de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde el anticuerpo es un anticuerpo recombinante.

7. El agente para suprimir el daño a los islotes trasplantados de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.

8. El agente para suprimir el daño a los islotes trasplantados de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que se usa para tratar la diabetes.

9. Un método para suprimir el daño a los islotes trasplantados en un sujeto sometido a un trasplante de islotes, que comprende la etapa de administrarle un inhibidor de IL-6 al sujeto.

10. Un método para mejorar la viabilidad de un trasplante de islotes en un sujeto, que comprende la etapa de administrarle un inhibidor de IL-6 al sujeto.

11. El método de la reivindicación 9 ó 10, en donde el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce una IL-6.

12. El método de la reivindicación 9 ó 10, en donde el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce un receptor de IL-6.

13. El método de la reivindicación 11 ó 12, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-IL-6 humano o un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde el anticuerpo es un anticuerpo recombinante.

16. El método de la reivindicación 15, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.

17. El uso de un inhibidor de IL-6 para producir agentes para suprimir el daño a los islotes trasplantados después del trasplante de islotes.

18. El uso de la reivindicación 17, en donde el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce una IL-6.

19. El uso de la reivindicación 17, en donde el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce un receptor de IL-6.

20. El uso de la reivindicación 18 ó 19, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

21. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-IL-6 humano o un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano.

22. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en donde el anticuerpo es un anticuerpo recombinante.

23. El uso de la reivindicación 22, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.