MX2008003389A

MX2008003389A - Plantas que tienen rendimiento incrementado y un metodo para efectuar las mismas.

Info

Publication number: MX2008003389A
Application number: MX2008003389A
Authority: MX
Inventors: Ana Isabel Sanz Molinero
Original assignee: Cropdesign Nv
Priority date: 2005-09-15
Filing date: 2006-09-15
Publication date: 2008-03-27
Also published as: EP2573179A1; AU2006290677B2; WO2007031581A2; CA2621489A1; US8071840B2; BRPI0615941A2; CN101268193A; AU2006290677A1; EP1931788A2; AR055439A1; ZA200803268B; US20090193543A1; WO2007031581A3

Abstract

La presente invencion se relaciona a un metodo para incrementar el rendimiento de plantas modulando la expresion en una planta de un acido nucleico que codifica un polipeptido de OsLEA3a o un homologo del mismo. Tal metodo comprende introducir en una planta un acido nucleico de OsLEA3a o variante del mismo. La invencion se relaciona tambien a plantas transgenicas que tienen introducidas en la misma un acido nucleico de O5LEA3a o variante del mismo, cuyas plantas tienen rendimiento incrementado y perfil metabolico alterado, con relacion a las plantas control. La presente invencion tambien se relaciona a construcciones utiles en los metodos de la invencion.

Description

PLANTAS QUE TIENEN RENDIMIENTO INCREMENTADO Y UN MÉTODO PARA EFECTUAR LAS MISMAS La presente invención se relaciona en general al campo de la biología molecular y tiene que ver con un método para incrementar el rendimiento de plantas con relación a plantas control. Más específicamente, la presente invención tiene que ver con un método para incrementar el rendimiento de plantas que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de OsLEA3a o un homólogo del mismo. La invención además se relaciona a un cambio composicional en metabolitos unidos al incremento del rendimiento. La presente invención también se relaciona a plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de OsLEA3a o un homólogo del mismo, cuyas plantas tienen rendimiento incrementado con relación a las plantas control. La invención también proporciona construcciones útiles en los métodos de la invención. La población mundial cada vez mayor y el abastecimiento decreciente de tierra de cultivo para la búsqueda de combustibles agrícolas realizan una investigación para mejorar la eficiencia de la agricultura. Medios convencionales de cultivo y mejoras hortícolas utilizan técnicas de reproducción selectiva para identificar plantas que tienen características deseables. Sin embargo, tales técnicas de reproducción selectivas tienen varias desventajas, es decir que estas técnicas normalmente requieren mucha mano de obra y resultan en plantas que a menudo contienen componentes genéticos heterogéneos que pueden no siempre resultar en el atributo deseable que se transmite de las plantas progenitoras. Avances en biología molecular han permitido a la humanidad modificar el material genético de animales y plantas. La ingeniería genética de las plantas implica el aislamiento y la manipulación de material genético (normalmente en la forma de ADN o ARN) y la introducción subsecuente de ese material genético en la planta. Tal tecnología tiene la capacidad para presentar cultivos o plantas que tienen varios atributos económico, agronómico u hortícolas mejorados. Un atributo de interés económico particular es el rendimiento, relacionada necesariamente a un cultivo específico, área y/o periodo de tiempo. El rendimiento se define normalmente como la producción medible del valor económico de un cultivo. Esto puede definirse en términos de cantidad y/o calidad. El rendimiento es dependiente directamente de varios factores, por ejemplo, el número y el tamaño de los órganos, arquitectura de la planta (por ejemplo, el número de ramas), producción de semillas y más. El desarrollo de raíces, incorporación de nutrientes y tolerancia a la tensión pueden ser también factores importantes para determinar el rendimiento. Optimizar uno de los factores antes mencionados puede por lo tanto contribuir a incrementar el rendimiento del cultivo. La biomasa de la planta es el rendimiento para cultivos forrajeros como alfalfa, maíz ensilado y heno. Muchos sustitutos han sido utilizados para rendimiento en cultivos forrajeros. Lo más importante entre éstos es la estimación del tamaño de la planta. El tamaño de la planta puede medirse de muchas formas, dependiendo de la especie y la etapa de desarrollo, pero incluye el peso seco total de la planta, el peso seco molido anterior, el peso fresco molido anterior, el área de la hoja, el volumen del tallo, la altura de la planta, el diámetro del florón, la longitud de la hoja, la longitud de la raíz, la masa de la raíz, el número de retoños y el número de hojas. Muchas especies mantienen una relación conservadora entre el tamaño de diferentes partes de la planta en una etapa de desarrollo dada. Estas relaciones alométricas se utilizan para extrapolar desde una de estas mediciones de tamaño a otra (por ejemplo, Tittonell et al 2005 Agrie Ecosy & Environ 105:213). El tamaño de la planta en cualquier etapa de desarrollo temprana se correlacionará normalmente con el tamaño subsecuente de la planta en desarrollo. Una planta más grande con un área de hojas mayor puede absorber normalmente más luz y dióxido de carbono que una planta más pequeña y por lo tanto ganará probablemente un mayor peso durante el mismo periodo (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50:39). Esto es además de la continuación potencial de la ventaja microambiental o genética que la planta tuvo para conseguir el tamaño más grande inicialmente. Existe un fuerte componente genético para el tamaño de la planta y la velocidad de crecimiento (por ejemplo, ter Steege et al 2005 Plant Physiology 139:1078), y de esta manera para un intervalo del tamaño de planta de diversos genotipos bajo una condición ambiental que probablemente se correlaciona con el tamaño bajo otro (Hittalmani et al 2003 Theoretical Applied Genetics 107:679). De esta manera, el ambiente estándar se utiliza como un sustituto para ambientes diversos y dinámicos encontrados en diferentes ubicaciones y tiempos por cultivos en el campo. El índice de cosecha, la relación del rendimiento de semillas al peso seco molido anterior, es relativamente estable bajo muchas condiciones ambientales y de esta manera una fuerte correlación entre el tamaño de la planta y el rendimiento del grano con frecuencia pueden obtenerse (por ejemplo, Rebetzke et al 2002 Crop Science 42:739). Estos procesos se enlazan intrínsecamente debido a que la mayoría de biomasa del grano es dependiente de la productividad fotosintético actual o almacenada por las hojas y el tallo de la planta (Gardener et al 1985 Physiology of Crop Plant. Iowa State University Press, pp 68-73) . Por lo tanto, la selección del tamaño de la planta, incluso en etapas tempranas de desarrollo, se ha utilizado como un indicador para rendimiento potencial futuro (por ejemplo, Tittonell et al 2005 Agrie Ecosys & Environ 105: 213) . Cuando se prueba el impacto de diferencias genéticas en la tolerancia a la tensión, la capacidad para estandarizar propiedades de suelo, temperatura, agua y capacidad de nutrientes e intensidad de luz es una ventaja intrínseca del invernadero o de los ambientes de la cámara de crecimiento de la planta comparados al campo. Sin embargo, limitaciones artificiales en el rendimiento debido a deficiente polinización se deben a la ausencia de aire o insectos, o insuficiente espacio para el crecimiento de raíces maduras o dosel, pueden restringir el uso de estos ambientes controlados para probar las diferencias de rendimiento. Por lo tanto, las mediciones del tamaño de la planta en el desarrollo temprano, bajo condiciones estandarizadas en una cámara o invernadero de crecimiento, son prácticas estándares para proporcionar indicación de ventajas de rendimiento genético potenciales. El rendimiento de semillas es un atributo particularmente importante, ya gue las semillas de muchas plantas son importantes para nutrición humana y animal. Cultivos tales como maíz, arroz, trigo, cañóla y soya representan más de la mitad de la ración calórica, ya sea a través del consumo directo de las semillas mismas o a través del consumo de productos cárnicos producidos en semillas procesadas. Estos son también fuentes de azúcares, aceites y muchas clases de metabolitos utilizados en los procesos industriales. Las semillas contienen un embrión (la fuente de nuevos brotes y raíces) y un endosperma (la fuente de nutrientes para el crecimiento del embrión durante la germinación y durante el crecimiento temprano de plántulas) . El desarrollo de semillas implica muchos genes, y requiere la transferencia de metabolitos a partir de las raíces, hojas y tallos en la semilla que está creciendo. El endosperma, en particular, asimila los precursores metabólicos de carbohidratos, aceites y proteínas y los sintetiza en macromoléculas en almacenamiento para completar el grano. La capacidad para incrementar el rendimiento de la planta podría tener muchas aplicaciones en áreas tales como la agricultura, incluyendo en la producción de plantas ornamentales, arboricultura, horticultura y silvicultura. Incrementar el rendimiento puede también encontrar uso en la producción de algas para uso en bio-reactores (para la producción biotecnológica de sustancias tales como farmacéuticos, anticuerpos o vacunas, o para la bio-conversión de residuos orgánicos) y otras áreas. La OsLEA3a es una proteína de arroz que puede clasificarse como una proteína del Lea del Grupo 3a (Wise & Tunnacliffe, Trends Plant Sci. 9, 13-17, 2004). Las proteínas LEA (proteínas Abundantes de Embriogénesis Tardía) se expresan en diferentes etapas de la embriogénesis tardía en embriones de semillas de plantas superiores y bajo condiciones de estrés por deshidratación. Pueden inducirse por ácido abscísico. A menudo, la función de estas proteínas es desconocida. Una clasificación reciente discrimina 7 grupos dentro de las proteínas LEA; varios de estos grupos se caracterizan por un motivo de secuencia típico y un análisis computacional permite una predicción de la función (Wise & Tunnacliffe, 2004) . Las proteínas Lea del grupo 3 comprenden las superfa ilias 2 y 5 LEA y se caracterizan por la presencia de motivos de aminoácido 11-mer que pueden definirse ampliamente como sigue: en las posiciones 1, 2, 5 y 9 un residuo hidrofóbico, en las posiciones 3, 7 y 11 un residuo negativo o amida, en las posiciones 6 y 8 un residuo positivo y en las posiciones 4 y 10 cualquier aminoácido puede presentarse (Wise & Tunnacliffe, 2004, Dure III, L., Protein and Peptide Letters 8, 115-122, 2001) . Las proteínas LEA del grupo 3 se postulan para funcionar como una chaperona molecular y puede jugar un papel en la tolerancia por desecación (Goyal et al., Biochem. J. 388, 151-157, 2005). Debido a que las proteínas LEA se inducen en plantas bajo condiciones de estrés acuoso, se hipotetizó que las proteínas LEA pueden ser útiles para efectuar plantas más resistentes a la sal y a la sequía. Xu et al. (Plant Physiol. 110, 249-257, 1996) demostró que el arroz transformado con cebada LEA3a fue más tolerante para déficit de agua y estrés salina, Rohila et al. (Plant Sci. 163, 525-532, 2002) describe arroz Basmati transgénico con expresión constitutiva o inducida por estrés de cebada LEA3a que muestra tolerancia incrementada contra la sequía y alta salinidad. Similarmente, el trigo transformado con cebada LEA3a bajo control de un promotor constitutivo fue más resistente a la sequía que las plantas control (Bahieldin et al., Physiol. Plant. 123, 421-427, 2005) . Sin embargo, estos estudios también mostraron que no hubo incremento de rendimiento comparado a las plantas control cuando las plantas se cultivaron bajo condiciones sin estrés. La WO 97/13843 describe el uso de cebada HVAl para incrementar la resistencia a la sequía y estrés salino, sin embargo, no se demostró que las plantas que expresan cebada HVAl hubieron mejorado las propiedades de crecimiento bajo condiciones sin estrés . Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica el polipéptido LEA3a a partir de arroz (OsLEA3a) o un homólogo del mismo da plantas que tienen rendimiento incrementado con relación a las plantas control. Este incremento del rendimiento se observó sorprendentemente cuando las plantas se cultivaron bajo condiciones sin estrés (condiciones sin estrés). De preferencia, el homólogo de 0sLEA3a es de origen vegetal, más preferiblemente, el homólogo 0sLEA3a se origina de una planta monocotiledónea, siempre y cuando el homólogo 0sLEA3a no sea la SEQ ID NO: 22 (Hordeum vulgare) . Más preferiblemente, el homólogo se origina de Oryza sativa . De acuerdo con una modalidad de la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de la planta, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de OsLEA3a o un homólogo del mismo. Ventajosamente, el desempeño de los métodos de acuerdo con la presente invención resulta en plantas que tienen rendimiento incrementado, particularmente el rendimiento de semillas, con relación a las plantas control. La elección de plantas control es una parte rutinaria de una configuración experimental y puede incluir plantas de tipo silvestre correspondientes o plantas correspondientes sin el gen de interés. La planta control puede es normalmente de la misma especie de plantas o incluso de la misma variedad como la planta que se compara. La planta control puede ser también un nulicigoto de la planta que se compara. Los nulicigotos son individuos que pierden el transgen por segregación. Una "planta control" como se utiliza en la presente no sólo se refiere a plantas completas, sino también a partes de la planta, incluyendo semillas y partes de la semilla. Una "referencia", "planta de referencia", "control", "planta control", "tipo silvestre" o "planta de tipo silvestre" es en particular una célula, un tejido, un órgano, una planta, o una parte de la misma, la cual no se produjo de acuerdo al método de la invención. Por consiguiente, los términos "tipo silvestre" "control" o "referencia" son intercambiables y pueden ser una célula o una parte de la planta tal como un organelo o tejido, o una planta, la cual puede no modificarse o tratarse de acuerdo al método descrito en la presente de acuerdo con la invención. Por consiguiente, la célula o parte de la planta tal como un organelo o una planta utilizada como tipo silvestre, control o referencia corresponde a la célula, planta o parte de la misma o tanto como sea posible y está en cualquier otra propiedad, pero en el resultado del proceso de la invención es tan idéntica a la materia objeto de la invención como es posible. De este modo, el tipo silvestre, control o referencia se trata de manera idéntica o tan idéntica como sea posible, es decir que sólo condiciones o propiedades podrían ser diferentes las cuales no influencian la calidad de la propiedad probada. Eso significa en otras palabras que el tipo silvestre denota (1) una planta, la cual porta la forma inalterada o no modulada de un gen o alelo o (2) el material/planta de partida de la cual se derivan las plantas producidas por el proceso o método de la invención. De preferencia, cualquier comparación entre las plantas de tipo silvestre y las plantas producidas por el método de la invención se lleva a cabo bajo condiciones análogas. El término "condiciones análogas" significa que todas las condiciones tales como, por ejemplo, condiciones de cultivo o crecimiento, condiciones de prueba (tales como composición de tamponación, temperatura, sustratos, cepa de patógenos, concentraciones y similares) se mantienen idénticas entre los experimentos que se comparan. La "referencia", "control" o "tipo silvestre" es de preferencia un objeto, por ejemplo, un organelo, una célula, un tejido, una planta, la cual no se moduló, modificó o trató de acuerdo con el proceso descrito en la presente de la invención y está en cualquier otra propiedad tan similar a la materia objeto de la invención como sea posible. La referencia, control o tipo silvestre está en su genoma, transcriptoma, proteoma o metaboloma tan similar como sea posible al objeto de la presente invención. De preferencia, el término organelo, célula, tejido o planta de "referencia", "control" o "tipo silvestre" se relaciona a un organelo, célula, tejido o planta, la cual es casi genéticamente idéntica al organelo, célula, tejido o planta de la presente invención o una parte de la misma, de preferencia 95%, de mayor preferencia son 98%, incluso de mayor preferencia son 99.00%, en particular 99.10%, 99.30%, 99.50%, 99.70%, 99.90%, 99.99%, 99.999% o más. Más preferiblemente, la "referencia", "control" o "tipo silvestre" es un objeto, por ejemplo, un organelo, una célula, un tejido, una planta, la cual es genéticamente idéntica a la planta, organelo de célula, utilizado de acuerdo con el método de la invención excepto que las moléculas de ácido nucleico o el producto genético codificado por éstas se cambian, modulan o modifican de acuerdo con el método inventivo. El término "expresión" o "expresión genética" significan la aparición de un atributo fenotípico como una consecuencia de la transcripción de un gen específico o genes específicos. El término "expresión" o "expresión genética" en particular significa la transcripción de un gen o genes en el ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con traducción subsecuente del último en una proteína. El proceso incluye la transcripción de AD?, procesamiento del producto de ARNm resultante y su traducción en una proteína activa. El término "modulación" significa en relación a la expresión o expresión genética, un proceso en el cual el nivel de expresión se cambia por la expresión genética en comparación a la planta control, de preferencia se incrementa el nivel de expresión. La expresión no modulada original, puede ser de cualquier clase de expresión de un ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con traducción subsecuente. El término "que modula la actividad" significará cualquier cambio de la expresión de las secuencias de ácido nucleico o proteínas codificadas inventivas, lo cual conduce al rendimiento incrementado y/o crecimiento incrementado de las plantas . El término "rendimiento" en general significa un producto medible de valor económico, relacionado necesariamente a un cultivo específico, a un área y a un periodo de tiempo. Partes individuales de la planta contribuyen directamente al rendimiento basado en su número, tamaño y/o peso. Mientras que el rendimiento actual es el rendimiento por acre para un cultivo y año, el cual se determina al dividir la producción total (incluye tanto la producción cosechada como estimada) por acres plantados. Los términos "incremento", "mejora" o "mejorar" son intercambiables y significarán en el sentido de la aplicación al menos un 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ó 10%, de preferencia al menos 15% ó 20%, más preferiblemente 25%, 30%, 35% ó 40% de más rendimiento y/o crecimiento en comparación a la planta de tipo silvestre como se define en la presente. El incremento se refiere a la actividad de las cantidades de polipéptido en una célula, un tejido, un organelo, un órgano o un organismo o una parte de la misma de preferencia es al menos 5%, de preferencia al menos 10%, o al menos 15%, especialmente, de preferencia al menos 20%, 25%, 30% o más, muy especialmente de preferencia son al menos 40%, 50% ó 60%, más preferiblemente son al menos 70% o más en comparación al control, referencia o tipo silvestre. El término "rendimiento incrementado" como se define en la presente es para considerar un incremento en la biomasa (peso) de una o más partes de una planta, la cual puede incluir partes (cosechables) sobre la tierra y/o partes (cosechables) debajo de la tierra. En particular, tales partes cosechables son semillas, y el desempeño de los métodos de la invención resulta en plantas que tienen rendimiento incrementado con relación al rendimiento de semillas de plantas control. El rendimiento incrementado de semillas puede manifestarse como uno o más de lo siguiente: a) un incremento en la biomasa de las semillas (peso total de semillas) el cual puede estar en una base individual de semillas y/o por planta y/o por hectárea o por acre; b) número incrementado de flores por plantas; c) número incrementado de semillas (llenas); d) tasa incrementada de llenado de semillas (la cual se expresa como la relación entre el número de semillas llenas divididas por el número total de semillas; e) índice incrementado de cosecha, el cual se expresa como la relación del rendimiento de partes cosechables, tales como semillas, dividido por la biomasa total; y f) peso en miles de granos (TKW) incrementado, el cual se extrapola desde el número de semillas llenas contadas y su peso total. Un TKW incrementado puede resultar a partir de un tamaño incrementado de semillas y/o el peso de semillas, y puede resultar a partir de un incremento en el tamaño del embrión y/o en el endosperma. Un incremento en el rendimiento de semillas puede también manifestarse como un incremento en el tamaño de las semillas y/o volumen de semillas, el cual puede influenciar también la composición de semillas (incluyendo contenido total de aceite, proteína y carbohidratos y la composición) . Además, un incremento en el rendimiento de semillas puede también manifestarse en un área de semillas y/o longitud de semillas y/o ancho de semillas y/o perímetro de semillas. El rendimiento incrementado puede también resultar en arquitectura modificada, o puede ocurrir debido a la arquitectura modificada. Tomando maíz como un ejemplo, un incremento en el rendimiento puede manifestarse como uno o más de lo siguiente: el incremento en el número de plantas por hectárea o por acre, un incremento en el número de espigas por planta, un incremento en el número de hileras, número de semillas por hilera, peso de la semilla, peso en miles de semillas, longitud/diámetro de la espiga, incremento en tasa de llenado de semillas (la cual es el número de semillas llenas divididas por el número total de semillas y multiplicado por 100), entre otros. Tomando arroz como un ejemplo, un incremento en el rendimiento puede manifestarse mediante un incremento en uno o más de lo siguiente: número de plantas por hectárea o por acre, número de panículas por planta, número de espiguillas por panícula, número de flores (flósculo) por panícula, (la cual se expresa como una relación del número de llenado de semillas sobre el número de panículas primarias) incremento en la tasa de llenado de semillas (la cual es el número de semillas llenas divididas por el número total de semillas y multiplicado- por 100), incremento en el peso en miles de granos, entre otros. Un incremento en el rendimiento puede también resultar en arquitectura modificada, o puede ocurrir como un resultado de la arquitectura modificada. De acuerdo con una característica preferida, el desempeño de los métodos de la invención resulta en plantas que tienen rendimiento incrementado, particularmente rendimiento de semillas. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de plantas, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de OsLEA3a o un homólogo del mismo. Puesto que las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención tienen rendimiento incrementado, es probable que estas plantas exhiban una tasa de crecimiento incrementada (durante al menos parte de su ciclo de vida) , con relación a la tasa de crecimiento de las plantas control en una etapa correspondiente en su ciclo de vida. Las plantas que tienen una tasa de crecimiento incrementada, pueden tener un ciclo de vida más corto. El ciclo de vida de una planta puede considerar que significa el tiempo necesario para crecer a partir de una semilla madura seca hasta la etapa en donde la planta ha producido semillas maduras secas, similar al material de partida. El ciclo de vida puede influenciarse por factores tales como vigor temprano, tasa de crecimiento, tiempo de florecimiento y velocidad de maduración de las semillas. El incremento en la tasa de crecimiento puede tener lugar en una o más etapas en el ciclo de vida de una planta o durante sustancialmente el ciclo de vida completo de la planta. La tasa de crecimiento incrementada durante las etapas tempranas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar el vigor mejorado. El incremento en la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta permitiendo a las plantas sembrarse después y/o cosecharse más pronto de lo que podría ser posible (un efecto similar puede obtenerse con el tiempo de florecimiento temprano) . Si la tasa de crecimiento se incrementa en forma suficiente, puede permitir la siembra adicional de semillas de la misma especie de planta (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de arroz seguida por siembra y cosecha de plantas de arroz adicionales todas dentro de un período de crecimiento convencional). Similarmente, si la tasa de crecimiento se incrementa en forma suficiente, puede permitir la siembra adicional de semillas de diferentes especies de plantas (por ejemplo, la siembra y cosecha de plantas de arroz seguida por, por ejemplo, la siembra y cosecha opcional de soya, papa o cualquier otra planta) . Los tiempos adicionales de cosecha del mismo rizoma en el caso de algunas plantas de cultivo también pueden ser posibles. Alterar el ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un incremento en la producción de biomasa anual por acre (debido a un incremento en el número de veces (digamos en un año) que alguna planta particular puede cultivarse y cosecharse) . Un incremento en la tasa de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que sus contrapartes de tipo silvestre, ya que las limitaciones territoriales para hacer crecer un cultivo con frecuencia se determinan por las condiciones ambientales adversas ya sea en el tiempo de la plantación (temporada temprana) o en el tiempo de la cosecha (temporada tardía). Tales condiciones adversas pueden evitarse si el ciclo de cosecha se acorta. La tasa de crecimiento puede determinarse al derivar diversos parámetros a partir de curvas de crecimiento, tales parámetros pueden ser: T-Mid (el tiempo tomado por las plantas para alcanzar 50% de su tamaño máximo) y T-90 (tiempo tomado por las plantas para alcanzar 90% de su tamaño máximo) entre otros . Las plantas con una tasa de crecimiento incrementada exhiben en una o más partes de esa planta, un metabolismo alterado, reflejado como niveles alterados de metabolitos. Los niveles de metabolito alterado se unen a la presencia del transgén. Por lo tanto, el perfil metabólico puede utilizarse como una herramienta de diagnóstico para caracterizar o identificar plantas que tienen rendimiento incrementado, para predecir nuevas proteínas que están implicadas en el incremento del rendimiento, o para identificar las trayectorias que están implicadas en el incremento del rendimiento. El término "metabolitos" se refiere a sustancias intermedias, de preferencia de peso molecular bajo, el cual ocurre durante el anabolismo y catabolismo en una planta o una célula vegetal, en otras palabras, una sustancia producida o consumida durante el metabolismo, tal como aminoácidos. El término "composición mejorada" de metabolitos se refiere a cambios deseados en la concentración de estos metabolitos. Dependiendo del tipo de metabolito, el cambio puede ser un incremento o disminución en la concentración. De preferencia, el cambio en la concentración/nivel de metabolito se mide con relación a plantas control adecuadas.

Metabolitos preferidos en la presente invención comprende metabolitos de por ejemplo, metabolismo de aminoácido, metabolismo de carotenoide, metabolismo de co-factor, metabolismo de ácido graso, metabolismo de ácido orgánico, metabolismo de fenólicos, metabolismo de fitohormona, metabolismo de fitosterol, metabolismo de azúcar, metabolismo compuesto relacionado y tocoferol, metabolismo de compuesto ceroso, metabolismo de lípidos. Los niveles de diversos metabolitos normalmente varían dentro de ciertos límites (véase por ejemplo los datos en el Ejemplo 6) y los cambios en los niveles de uno o más metabolitos puede utilizarse para definir un perfil metabólico. Tal perfil metabólico puede comprender datos para niveles alterados de metabolitos específicos y/o clases de metabolitos (tales como metabolismo de aminoácido, metabolismo de carotenoide, metabolismo de cofactor, metabolismo de ácido graso, metabolismo de ácido orgánico, metabolismo de fenólicos, metabolismo de fitohormona, metabolismo de fitosterol, metabolismo de azúcar, metabolismo de compuesto relacionado y tocoferol, metabolismo de compuesto ceroso, metabolismo de lípidos). Los niveles de metabolitos pueden alterarse sustancialmente en toda la planta completa o en ciertas partes de la planta, órganos, tejidos o células, debido a la expresión modulada del gen de interés, in casu LEA3a. En una modalidad preferida, los niveles del metabolito se alteran en las semillas . De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el desempeño de los métodos de la invención da plantas que tienen una tasa de crecimiento incrementada o rendimiento incrementado en comparación a las plantas control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento y/o la tasa de crecimiento en plantas, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de OsLEA3a o un homólogo del mismo. Un incremento en el rendimiento y/o tasa de crecimiento ocurre si la planta está bajo condiciones sin tensión o si la planta se expone a varias tensiones comparadas a las plantas control. El incremento en el rendimiento y/o la tasa de crecimiento se observa particularmente cuando la planta está bajo condiciones sin estrés) . Las plantas normalmente responden a la exposición a tensión por crecimiento más lentamente. En condiciones de tensión severa, la planta puede incluso detener el crecimiento por completo. La tensión moderada por otro lado se define en la presente como siendo cualquier tensión a la cual una planta se expone lo cual no resulta en que la planta deje de crecer por completo sin la capacidad de reactivar el crecimiento. La tensión moderada en el sentido de la invención conduce a una reducción en el crecimiento de las plantas tensas de menos de 40%, 35% ó 30%, de preferencia menos de 25%, 20% ó 15%, más preferiblemente menos de 14%, 13%, 12%, 11% ó 10% o menos en comparación a la planta control bajo condiciones sin tensión. Debido a los avances en prácticas agrícolas (tratamientos con irrigación, fertilización, pesticidas) no se encuentran a menudo tensiones severas en plantas forrajeras cultivadas. Como una consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por tensión moderada es a menudo una característica indeseable para la agricultura. Las tensiones moderadas son las tensiones típicas a las cuales puede exponerse una planta.

Estas tensiones pueden ser tensiones bióticas y/o abióticas (ambiental) cada día a la cual se expone una planta. Las tensiones abióticas o ambientales típicas incluyen tensiones por temperatura provocadas por calor atípico o temperaturas frías/de congelamiento; tensión salina; tensión acuosa (sequía o agua en exceso) . Los químicos pueden provocar también tensiones abióticas. Las tensiones bióticas son típicamente aquellas tensiones provocadas por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos e insectos. En particular, los métodos de la presente invención pueden realizarse bajo condiciones sin estrés para dar plantas que tienen rendimiento incrementado con relación a las plantas control. Como se reporta en Wang et al. (Planta (2003) 218:1-14), el estrés abiótico conduce a una serie de cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que afectan adversamente el crecimiento y la productividad de la planta. La sequía, la salinidad, temperaturas extremas y la tensión oxidativa se conocen para ser interconectadas y pueden inducir el crecimiento y daño celular mediante mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) describe un grado particularmente elevado de "interferencia" entre la sequía por estrés y alta salinidad por estrés. Por ejemplo, la sequía y/o salinización se manifiestan principalmente como estrés osmótico, resultando en la interrupción de homeostasis y distribución iónica en la célula. El estrés oxidativo, el cual acompaña frecuentemente salinidad o sequía por estrés, de temperatura alta o baja, puede provocar desnaturalización de proteínas funcionales y estructurales. Como una consecuencia, estos diversos estreses ambientales a menudo activan trayectorias de señalización de célula similares y respuestas celulares, tales como la producción de proteínas de estrés, sobre-regulación de anti-oxidación, acumulación de solutos compatibles y detención de crecimiento. El término condiciones "sin estrés" como se utiliza en la presente son aquellas condiciones ambientales que no imponen estrés, tales como los estreses descritos anteriormente en las plantas . Personas experimentadas en la técnica están al tanto de las condiciones normales del suelo y las condiciones climáticas para una ubicación dada. Las características de crecimiento antes mencionadas pueden modificarse ventajosamente en cualquier planta . El término "planta" como se utiliza en la presente abarca plantas completas, ancestros y progenie de las plantas, células vegetales y partes de la planta, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluyendo tubérculos), flores y tejidos y órganos, en donde cada uno de los antes mencionados comprenden el gen/ácido nucleico de interés. El término "planta" también abarca la suspensión de cultivos, callos, tejidos, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas, de nuevo en donde cada uno de los antes mencionados comprende el gen/ácido nucleico de interés. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agropyron spp., Allium spp., Amaranthus spp., Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arabidopsis thaliana , Arachis spp., Artocarpus spp., Asparagus officinal is, Avena sa tiva, Averrhoa carambola, Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp., Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crateegus spp., Crocus sativus, Cucúrbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodiu spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Eleusine coracana, Eriobotrya japónica, Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp., Gossypium hirsutum, Helianthus spp., Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp., Ipomoca batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Omithopus spp., Oryza spp., Panicum miliaceum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Persea spp., Petroselinum crispum, Phaseolus spp., Phoenix spp., Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisu spp., Poa spp., Popul us spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Púnica grana tum, Pyrus communis , Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Rubus spp., Saccharum spp., Sambucus spp., Sécale cereale, Sesa um spp., Sinapis s . , Solanum spp., Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Tri folium spp., Tri ticosecale rimpaui , Tri ticum spp., Tropaeolum minus, Tropaeol um majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vi tis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otras. Otras plantas ventajosas se seleccionan del grupo que consiste de Asteraceae tal como el género Helianthus , Tagetes , por ejemplo, la especie Helianthus annuus [girasol], Tagetes lucida , Tagetes erecta o Tagetes tenuifolia [Caléndula] . Brassicaceae tal como el género Brassica , Arabidopsis, por ejemplo, la especie Brassica napus , Brassica rapa ssp. [cañóla, colza oleaginosa, nabo] o Arabidopsis thaliana . Fabaceae tal como el género Glycine por ejemplo, la especie Glycine max, Soja hispida o Soja max [soya] . Linaceae tal como el género Linum, por ejemplo, la especie Linum usi ta tissimum, [lino, linaza]; Poaceae tal como el género Hordeum, Sécale, Avena , Sorghum, Oryza, Zea , Tri ticum, por ejemplo, la especie Hordeum vulgare [cebada]; Sécale cereale [avena] , Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fa tua var. Sativa, Avena hybrida [avena], Sorghum bicolor [Sorgo, mijo], Oryza sativa , Oryza la ti folia [arroz], Zea mays [elote, maíz], Tri ticum aestivum, Tri ticum durum, Tri ticum turgidum, Tri ticum hybernum, Tri ticum macha, Tri ti cum sa tivum o Tri ticum vulgare [trigo, trigo blando, trigo común] ; Solanaceae tal como el género Solanum, Lycopersicon , por ejemplo, la especie Solanum tuberosu [papa] , Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum . , Lycopersicon pyri forme, Solanum integrifoli um o Solanum lycopersicum [tomate]. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, la planta es una planta forrajera. Ejemplos de plantas forrajeras incluyen soya, girasol, cañóla, alfalfa, semilla de colza, algodón, tomate, papa y tabaco. Además de preferencia, la planta es una planta monocotiledónea. Ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen caña de azúcar. Más preferiblemente la planta es un cereal. Ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, sorgo y avenas. El término "polipéptido de OsLEA3a o un homólogo del mismo" como se define en la presente se refiere a un polipéptido LEA3a de arroz tal como aquel representado en la SEQ ID NO: 2 y a las proteínas que pertenecen al Grupo 3 de las proteínas LEA, que tienen los dominios de proteína 2 LEA_4 que corresponden al acceso PF02987 Pfma o el acceso IPR004238 InterPro y que comprende el motivo de secuencia de aminoácido 11-mer definido en general como sigue: en las posiciones 1, 2, 5 y 9 un residuo hidrofóbico, en las posiciones 3, 7 y 11 un residuo negativo o amida, en las posiciones 6 y 8 un residuo positivo y en las posiciones 4 y 10 cualquier aminoácido puede presentarse; dentro de este motivo puede ocurrir una incompatibilidad (Dure III, L., Protein and Peptide Letters 8, 115-122, 2001) . El grupo de residuos de aminoácido hidrofóbico consiste de A, C, F, G, I, L, M, T, V, W, S e Y. Los aminoácidos negativos son D o E y los residuos amida son Q y N. Los aminoácidos positivos son H, K y R. La conservación de la secuencia en este motivo no es absoluta y una o dos incompatibilidades pueden ocurrir (Figura 3 ) . De preferencia, el motivo de secuencia de aminoácido 11-mer (más adelante nombrada identificación consenso) corresponde a la secuencia) T(S/T/A/K) (Q/E/D)A(A/T) (R/K) (D/Q/E) (K/R) A (A/G/Y) (E/G) (SEQ ID NO: 3) , además de preferencia la secuencia de identificación consenso corresponde a la secuencia T(S/T/A/K) (Q/E/D)A(A/T) (R/K) (D/Q/E) (K/R) A (A/G/Y) E más preferiblemente, la identificación consenso corresponde a la secuencia T(S/A/K) (Q/D)A(A/T) (R/K) (D/E) KA (A/Y) E, más preferiblemente la identificación consenso es T ( S/A) QAARDKAAE . El término "dominio" se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones específicas a lo largo de una alineación de secuencias de proteínas evolutivamente relacionadas. Mientras que los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre homólogos, los aminoácidos que son altamente conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que son esenciales en la estructura, la estabilidad o la actividad de una proteína. Identificados por su alto grado de conservación en secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteínas, pueden usarse como identificadores para determinar si cualquier polipéptido en cuestión pertenece a una familia de polipéptidos previamente identificada (en este caso la familia de las proteínas LEA3 ) . El término "motivo" o "secuencia consenso" o "identificación" se refiere a una región conservada corta en una secuencia de proteínas. Los motivos son frecuentemente partes altamente conservadas de dominios, pero pueden también incluir solamente parte del dominio, o estar ubicados fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo caen fuera de un dominio definido) . Bases de datos especiales existen para la identificación de los dominios. El domino LEA_4 en una proteína LEA3 puede identificarse utilizando, por ejemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244; InterPro (Mulder et al., (2003) Nucí. Acids. Res. 31, 315-318; Prosite (Bucher and Bairoch (1994). Una sintaxis de perfil generalizado para motivos de secuencia biomolecular y su función en interpretación de secuencia automática. (In) ISMB-94; Proceedings 2a International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R. , Brutlag D. , Karp P., Lathrop R. , Searls D. , Eds., pp53-61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al., Nucí. Acids. Res. 32: D134-D137, (2004)) o Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002)). Un conjunto de herramientas para análisis in silico de las secuencias de proteína está disponible en el servidor de proteómica ExPASY (presentado por el Instituto Suizo de Bioinformática (Gasteiger et al., ExPASy; el servidor de proteómicos para conocimiento y análisis de proteína profunda, Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003)). La secuencia de la proteína OsLEA3a se analizó con la herramienta SMART (versión 4.1; Schultz et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244) y se utilizó para seleccionar el Pfam (Versión 17.0, Marzo 2005; Bateman et al. (2004) Nucí. Acids Res. 32, D138-141) y la base de datos InterPro (Reléase 11.0, 26 de Julio de 2005; Mulder et al. (2005) Nucí. Acids. Res. 33, D201-205). El primer dominio LEA_4 en la secuencia de la SEQ ID NO: 2 inicia en G28 y finaliza en D97, el Segundo inicia en G101 a D163. Alinear otras secuencias de proteína con la SEQ ID NO: 2, la secuencia de identificación consenso correspondiente, el dominio LEA_4 u otros motivos de secuencia pueden fácilmente identificarse. De este modo, los polipéptidos LEA3 u homólogos de los mismos (que abarcan ortólogos y parálogos) pueden identificarse fácilmente, utilizando técnicas de rutina bien conocidas en la técnica, tales como por alineación de secuencia. Los métodos para la alineación de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica, tales métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de huecos. El algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215:403-10) calcula la identidad de secuencias en porcentajes y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar análisis BLAST se encuentra públicamente disponible a través del Centro Nacional para la Información en Biotecnología. Los homólogos pueden identificarse fácilmente utilizando, por ejemplo, el algoritmo de alineación de secuencia múltiple ClustalW (versión 1.83) con los parámetros de alineación de que forma pares determinada, y un método de clasificación en el porcentaje. Los porcentajes globales de similaridad e identidad pueden también determinarse utilizando uno de los métodos disponibles en el paquete de software MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics , 2003 Jui 10; 4: 29. MatGAT: una aplicación que genera matrices de similaridad/identidad utilizando la proteína o secuencias de ADN) . La corrección manual menor puede realizarse para optimizar la alineación entre motivos conservados, como sería aparente por una persona experta en la técnica. Además, en lugar de utilizar secuencias de longitud completa para la identificación de homólogos, dominios específicos (tales como el dominio LEA_4 ) pueden utilizarse también. Los valores de identidad de secuencia, los cuales se indican posteriormente como un porcentaje se determinaron sobre el dominio conservado completo o ácido nucleico o secuencia de aminoácido utilizando los programas mencionados anteriormente utilizando los parámetros predeterminados. Ejemplos de proteínas OsLEA3a u homólogos de los mismos incluyen las secuencias representadas por SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36. Se entenderá que las secuencias que caen bajo la definición del "polipéptido de OsLEA3a u homólogo del mismo" no son para limitarse a las secuencias representadas por la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, pero que cualquier polipéptido que comprende la secuencia de identificación consenso de la SEQ ID NO: 3, y de preferencia que tiene también al menos 42% de identidad de secuencia (utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch con una penalización de abertura Gap de 11 y una penalización de extensión Gap de 1 ) a la SEQ ID NO: 2, puede ser adecuada para uso en los métodos de la invención. Sin embargo, el término "polipéptido de OsLEA3 u homólogo del mismo" como se utiliza en la presente no abarca la SEQ ID NO: 22 (LEA3a de Hordeum vulgare) . De preferencia, el polipéptido es un polipéptido de arroz. Abarcados por el término "homólogos" son secuencias ortólogas y secuencias parálogas, dos formas especiales de homología las cuales abarcan conceptos evolutivos utilizados para describir relaciones ancestrales de genes . Los parálogos son genes dentro de la misma especie que se han originado mediante la duplicación de un gen ancestral y ortólogos son genes de diferentes organismos que se han originado mediante especificación . Los ortólogos y parálogos pueden encontrarse al realizar una búsqueda denominada blast recíproca. Esto puede hacerse por una primera BLAST que involucra BLASTing una secuencia de interrogación (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2) contra cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos NCBI públicamente disponible. BLASTN o TBLASTX (usando valores predeterminados estándar) pueden usarse cuando se inicia a partir de un nucleótido y BLASTP o TBLASTN (usando valores predeterminados estándar) pueden utilizarse cuando inician a partir de una proteína de secuencia. Los resultados de BLAST pueden filtrarse opcionalmente. Las secuencias de longitud total, ya sea de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados se someten nuevamente a BLASTed (segunda BLAST) contra secuencias del organismo del cual se deriva la secuencia de interrogación (donde la secuencia de interrogación es la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, la segunda BLAST estaría por lo tanto contra secuencias de arroz) . Los resultados de la primera y segunda BLAST se comparan entonces . Un parálogo se identifica si una consulta de alto nivel de la segunda BLAST es de la misma especie a partir de la cual se deriva la secuencia de interrogación, un ortólogo se identifica si una consulta de alto nivel no es de la misma especie como desde cualquier secuencia de interrogación se deriva; un ortólogo se identifica si una consulta de alto nivel no es de la misma especie a partir de la cual se deriva la secuencia de interrogación. Ortólogos preferidos son ortólogos de la SEQ ID NO: l o SEQ ID NO: 2. Las consultas de alto nivel son aquellas que tienen un valor E bajo. Entre más bajo el valor E, más notable la clasificación (o en otras palabras entre más baja la oportunidad de que la consulta se encuentre por la oportunidad) . La computación del valor E es bien conocida en la técnica. Además de los valores E, las comparaciones se clasifican también por identidad de porcentaje. La identidad de porcentaje se refiere al número de nucleótidos idénticos (o aminoácidos) entre las dos secuencias de ácido nucleico comparadas (o polipéptido) sobre una longitud particular. De preferencia, la clasificación es mayor de 50, más preferiblemente mayor de 100; y de preferencia el valor E es menor de e-5, más preferiblemente menor de e-6. En el caso de grandes familias, ClustalW puede utilizarse, seguido por la generación de un árbol de asociación de vecinos, para ayudar a visualizar la agrupación de genes relacionados y para identificar ortólogos y parálogos. Ejemplos de ortólogos de secuencia a la SEQ ID NO: 2 incluyen la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 32 y la SEQ ID NO: 22. Ejemplos de parálogos de la SEQ ID NO: 2 incluyen la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 12. De preferencia, los dominios LEA_4 de proteínas LEA3 útiles en los métodos de la presente invención tienen, en orden creciente de preferencia, al menos una secuencia de identidad de 40%, 42%, 45%, 49%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% a la proteína OsLEA3 de la SEQ ID NO: 2. La matriz mostrada en la Figura 4 muestra similaridades e identidades (en negrita) sobre la longitud total de la proteína. En el caso en que solamente se comparan dominios específicos, la identidad o similaridad puede ser más elevada entre las diferentes proteínas. Puede llevarse a cabo un análisis para determinar la actividad de OsLEA3a. Para determinar la actividad de la proteína LEA3 , análisis están disponibles y se conocen en la técnica, por ejemplo, un ensayo por estrés térmico y por estrés acuoso se describen por Goyal et al. (Biochem. J. 388, 151-157, 2005) . Además, la expresión de la proteína OsLEA3a o de un homólogo de la misma en plantas, y en particular en arroz, tiene el efecto para incrementar el rendimiento de la planta transgénica cuando se compara a plantas control, en donde el rendimiento incrementado comprende al menos uno de: el peso total de semillas, el número total de semillas y el número de semillas llenas. Un polipéptido de OsLEA3a u homólogo del mismo se codifica por un ácido nucleico/gen OsLEA3a . Por lo tanto, el término "ácido nucleico/gen de OsLEA3a" como se define en la presente es cualquier ácido nucleico/gen que codifica un polipéptido de OsLEA3a o un homólogo del mismo como se define anteriormente.

Ejemplos de ácidos nucleicos 0sLEA3a incluyen, pero no se limitan a aquellos representados por cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 33. Los ácidos nucleicos/gen OsLEA3a y variantes de los mismos pueden ser adecuados para practicar los métodos de la invención. El término "ácido nucleico/gen OsLEA3a o variantes de los mismos" como se define en la presente no abarcan ácidos nucleicos que codifican la SEQ ID NO: 22 (LEA3a de Hordeum vulgare) . De preferencia, las variantes de un gen OsLEA3a originado de arroz. Ácidos nucleicos/genes OsLEA3a variantes incluyen porciones de un ácido nucleico/gen OsLEA3a , variantes de empalme, variantes alélicas y/o ácidos nucleicos capaces de hibridizar con un ácido nucleico/gen OsLEA3a . Con referencia en la presente a una "secuencia de ácido nucleico" se considera que significa una forma polimérica de un desoxiribonucleótido o un polímero ribonucleótido de cualquier longitud, ya sea de hebra doble o sencilla, o análogos de los mismos, que tiene la característica esencial de ribonucleótido natural en que puede hibridizar a las secuencias de ácido nucleico en una manera similar para nucleótidos de origen natural.

El término porción como se define en la presente se refiere a una pieza de ADN que codifica un polípéptido que comprende dos dominios LEA4 que corresponden al acceso Pfam PÍ02987 o el acceso IPR004238 InterPro y la secuencia de identificación consenso (SEQ ID NO: 3) . Una porción puede prepararse, por ejemplo, realizando una o más eliminaciones al ácido nucleico 0sLEA3a . Las porciones pueden utilizarse en forma aislada o pueden combinarse a otras secuencias de codificación (o sin codificación) con el fin de, por ejemplo producir una proteína que combina varias actividades. Cuando se combina a otras secuencias de codificación, el polipéptido resultante producido en la traducción puede ser más grande que aquel previsto para el fragmento OsLEA3a. La porción es normalmente al menos 100, 150 ó 200 nucleótidos de longitud, de preferencia al menos 250, 300 ó 350 nucleótidos de longitud, más preferiblemente al menos 400, 450 ó 500 nucleótidos de longitud y más preferiblemente al menos 550 ó 600 nucleótidos de longitud. De preferencia, la porción es una porción de un ácido nucleico como se representa por cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 33. Más preferiblemente, la porción de un ácido nucleico OsLEA3a es como se representa por la SEQ ID NO: 1.

Los términos "fragmento", "fragmento de una secuencia" o "parte de una secuencia", "porción" o "porción de la misma" significan una secuencia truncada de la secuencia original indicada. La secuencia truncada (secuencia de ácido nucleico o de proteína) puede variar ampliamente en longitud; el tamaño mínimo es una secuencia de tamaño suficiente para proporcionar una secuencia con al menos una función comparable y/o la actividad de la secuencia original indicada o que hibridiza con la molécula de ácido nucleico de la invención o se utiliza en el proceso de la invención bajo condiciones severas, mientras el tamaño máximo no es crítico. En algunas aplicaciones, el tamaño máximo usualmente no es sustancialmente mayor que aquel requerido para proporcionar la actividad deseada y/o función o funciones de la secuencia original. Una función comparable significa al menos 40%, 45% ó 50%, de preferencia al menos 60%, 70%, 80% ó 90% o más de la función de la secuencia original. Otra variante de un ácido nucleico/gen OsLEA3a es un ácido nucleico capaz de hibridizar bajo condiciones de severidad reducida, de preferencia bajo condiciones severas, con un ácido nucleico/gen OsLEA3a como se define anteriormente o con una porción como se define anteriormente, cuya secuencia de hibridación codifica de preferencia un polipéptido que comprende dos dominios LEA4 que corresponden al acceso PF02987 Pfam o el acceso IPR004238 InterPro y la secuencia de identificación consenso OsLEA3a de la (SEQ ID NO: 3) . La secuencia de hibridación es normalmente al menos 300 nucleótidos de longitud, de preferencia al menos 400 nucleótidos de longitud, más preferiblemente al menos 500 nucleótidos de longitud y más preferiblemente al menos 600 nucleótidos de longitud. De preferencia, la secuencia de hibridación es aquella que es capaz de hibridizar a un ácido nucleico como se representa por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 o a una porción de cualquiera de las secuencias antes mencionadas, una porción que se define como en lo anterior. Más preferiblemente, la secuencia de hibridación es capaz de hibridizar a la SEQ ID NO: 1, o a porciones (o sondas) de la misma. Los métodos para diseñar sondas se conocen bien en la técnica. Las sondas son en general menores de 1000 pb, 900 pb, 800 pb, 700 pb, 600 pb de longitud, de preferencia menores de 500 pb, 400 pb, 300 pb, 200 pb ó 100 pb de longitud. Comúnmente, las longitudes de sonda para hibridaciones de ADN-ADN tales como transferencia Southern, varía entre 100 y 500 pb, mientras que la región de hibridación en sondas para hibridaciones de ADN-ADN tales como en amplificación de PCR generalmente son más cortas de 50, pero más largas de 10 nucleótidos, de preferencia son 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 pb de longitud. El término "hibridación" como se define en la presente es un proceso en donde las secuencias de nucleótido complementarias sustancialmente homologas se recocen entre sí. El proceso de hibridación puede ocurrir completamente en solución, es decir, ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. El proceso de hibridación puede ocurrir también con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados a una matriz tal como perlas magnéticas, perlas de Sepharose o cualquier otra resina. El proceso de hibridación puede ocurrir también con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados a un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa o nylon o inmovilizados por ejemplo, por fotolitografía a por ejemplo, un soporte de vidrio silíceo (el último conocido como disposiciones o microdisposiciones de ácido nucleico o como fragmentos de ácido nucleico) . Con el fin de permitir que la hibridación ocurra, las moléculas de ácido nucleico se desnaturalizan en general térmica o químicamente para fundir una doble hebra en dos hebras sencillas y/o para remover horquillas u otras estructuras secundarias a partir de ácidos nucleicos de una sola hebra. El término "severidad" se refiere a las condiciones bajo las cuales una hibridación tiene lugar. La severidad de hibridación se influencia por condiciones tales como temperatura, concentración salina, resistencia iónica y composición de tampón por hibridación. Generalmente, las condiciones de baja severidad se seleccionan para ser de aproximadamente 30°C más bajo que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica en una resistencia iónica definida y el pH. Condiciones de severidad media son cuando la temperatura está 20°C debajo de la Tm, y las condiciones de severidad elevada son cuando la temperatura es 10°C debajo de Tm. Condiciones de hibridación de severidad alta se utilizan típicamente para aislar secuencias de hibridación que tienen similaridad de secuencia alta a la secuencia de ácido nucleico objetivo. Sin embargo, ácidos nucleicos pueden desviarse en secuencia y codifican aún un polipéptido sustancialmente idéntico, debido a la degradación del código genético. Por lo tanto, condiciones de hibridación de severidad media puede algunas veces ser necesaria para identificar tales como moléculas de ácido nucleico. La Tm es la temperatura bajo resistencia iónica definida y pH, en la cual 50% de la secuencia objetivo hibridiza a una sonda perfectamente acoplada. La Tm es dependiente de las condiciones de solución y la composición base y la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas hibridizan específicamente a temperaturas más elevadas. La tasa máxima de hibridación se obtiene de aproximadamente 16°C hasta 32°C debajo de la Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electrostática entre las dos hebras de ácido nucleico por lo que se promueve la formación de híbridos; este efecto es visible para concentraciones de sodio de hasta 0.4M (para concentraciones más elevadas, este efecto puede ignorarse) . La formamida reduce la temperatura de fusión de duplos de ADN-ADN y de ADN-ARN con 0.6 a 0.7°C para cada porcentaje de formamida, y además el 50% de formamida permite la hibridación que se realice de a 30 a 45°C, aunque la tasa de hibridación se disminuirá. Los desacoplamientos de pares de bases reducen la tasa de hibridación y la estabilidad térmica de los duplos. En promedio y para grandes sondas, la Tm disminuye aproximadamente 1°C por % de desacoplamiento base. La Tm puede calcularse utilizando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de híbridos: 1. Híbridos de ADN-ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984): Tm = 81.5°C + 16.6xlog?o [Na+] a + 0.41x% [G/Cb] -SOOxtL0]""1 - 0.61x% de formamida 2. Híbridos de ADN-ARN o ARN-ARN: Tm = 79.8 + 18.5 ( logio [Na+] a) + 0.58 (%G/Cb) + 11.8 (%G/Cb)2 -820/Lc 3. Híbridos de oligo-ADN u oligo-ARNd: Para <20 nucleótidos: Tm = 2 (ln) Para 20-35 nucleótidos: Tm = 22 + 1.46 (ln) a o para otro catión monovalente, pero sólo exacto en el intervalo 0.01-0.4 M. b sólo exacto para % de GC en el intervalo de 30% a 75%. c L = longitud de duplos en pares de bases. d Oligo, oligonucleótido; 1„, longitud efectiva del cebador = 2x(no. de G/C) -(no. de A/T) El enlace no específico puede controlarse utilizando cualquiera de un número de técnicas conocidas tales como por ejemplo, bloqueando la membrana con soluciones que contienen proteínas, adiciones de ARN heterólogos, ADN y SDS al tampón de hibridación, y tratamiento con RNasa . Por sondas no homologas, una serie de hibridaciones pueden realizarse variando uno de (i) disminuyendo progresivamente la temperatura de fijación (por ejemplo de 68°C a 42°C) o (ii) disminuyendo progresivamente la concentración de formamida (por ejemplo de 50% a 0%). El técnico experimentado tiene conocimiento de varios parámetros los cuales pueden alterarse durante la hibridación y los cuales mantienen ya sea o cambia las condiciones de severidad. Además de las condiciones de hibridación, la especificidad de hibridación depende normalmente también de la función de lavados post-hibridación. Para remover peculiaridades que resultan de hibridación no específica, se lavan muestras con soluciones salinas diluidas. Factores críticos de tales lavados incluyen la resistencia iónica y la temperatura de la solución de lavado final; entre más baja la concentración salina y más alta la temperatura de lavado, más elevada la severidad del lavado. Las condiciones de lavado se realizan normalmente en o debajo de la severidad de hibridación. Una hibridación positiva da una señal que es al menos dos veces aquella de la peculiaridad. Generalmente, las condiciones de severidad adecuadas para ensayos de hibridación de ácido nucleico o procedimientos de detección de amplificación genética como se establece anteriormente. Condiciones más o menos severas pueden seleccionarse también. El técnico experimentado tiene conocimiento de varios parámetros los cuales pueden alterarse durante el lavado y los cuales mantendrán o cambiarán ya sea las condiciones de severidad. Por ejemplo, condiciones de hibridación de severidad elevada típicas para híbridos de ADN más largos de 50 nucleótidos abarcan la hibridación a 65°C en lx SSC o a 42°C en lx SSC y 50% de formamida, seguido por lavado a 65°C en 0.3x de SSC. Ejemplos de condiciones de severidad media para híbridos de ADN más largos de 50 nucleótidos abarcan hibridación a 50°C en 4x SSC o a 40°C en 6x SSC y 50% de formamida, seguida por lavado a 50°C en 2x SSC. La longitud del híbrido es la longitud anticipada para el ácido nucleico de hibridación. Cuando los ácidos nucleicos de secuencia conocida se hibridizan, la longitud híbrida puede determinarse alineando las secuencias e identificando las regiones conservadas descritas en la presente. lxSSC es 0.15M de NaCl y 15 mM de citrato de sodio; las hibridaciones y lavados pueden incluir adicionalmente 5 x de reactivo Denhardt 's, 0.5-1.0% de SDS, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado, 0.5% de pirofosfato de sodio . Para los propósitos de definir el nivel de severidad, puede hacerse referencia a Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 y actualizaciones anuales). También útiles en los métodos de la invención son ácidos nucleicos que codifican homólogos a la secuencia de aminoácido representadas por la SEQ ID NO: 2. "Homólogos" de una proteína abarca péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tienen actividad biológica y funcional similar como la proteína no modificada a partir de la cual se derivan. Un homólogo puede estar en la forma de una "variante sustitucional" de una proteína, es decir, en donde al menos un residuo en una secuencia de aminoácido se ha removido y un diferente residuo se inserta en su lugar. Las sustituciones de aminoácido son normalmente de residuos sencillos, pero pueden agruparse dependiendo de las restricciones funcionales colocadas en el polipéptido; las inserciones son usualmente del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácidos. De preferencia, las sustituciones de aminoácido comprenden sustituciones de aminoácido conservadoras. Para producir tales homólogos, los aminoácidos de la proteína pueden reemplazarse por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tales como carácter hidrofóbico, carácter hidrofílico, antigenicidad, propensión similar para formar o dividir estructuras a-helicoidales o estructuras de ß-hoja) . Las tablas de sustitución conservadora se conocen bien en la técnica (véase por ejemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company y la Tabla 1 posteriormente) .

Tabla 1: Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservados Un homólogo también puede estar en la forma de una "variante insercional" de una proteína, es decir donde uno o más residuos de aminoácido se introducen en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones N-terminal y/o C-terminal así como también inserciones intrasecuencia de aminoácidos sencillos o múltiples. Generalmente, las inserciones dentro de las secuencias de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones N- o C-terminal, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de proteínas o péptidos de fusión N- o C-terminal incluyen el dominio de unión o dominio de activación de un activador transcripcional tal como se usa en el sistema de dos híbridos en levadura, proteínas de cubierta de fago, etiqueta de 6- (histidina) , etiqueta de glutatión S-transferasa, proteína A, proteína de unión a maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo Tag 100, epítopo c-myc, epítopo FLAG®, lacZ, CMP (péptido de unión a calmodulina), epítopo HA, epítopo de proteína C y epítopo VSV. Los homólogos en la forma de "variantes por eliminación" de una proteína se caracterizan por la remoción de uno o más aminoácidos de una proteína. Las variantes de aminoácidos de una proteína (variantes de sustitución, eliminación y/o inserción) pueden elaborarse fácilmente usando técnicas sintéticas de péptidos bien conocidas en la técnica, tal como síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por manipulaciones de ADN recombinante. Los métodos para la manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de una proteína por sustitución, inserción o eliminación se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, las técnicas para elaborar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en el ADN se conocen bien para aquellos experimentados en la técnica e incluyen mutagénesis con M13, mutagénesis in vi tro T7-Gen (USB, Cleveland, OH) , mutagénesis QuickChange Site-Directed (Stratagene, San Diego, CA) , mutagénesis sitio-dirigida mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis sitio- dirigida . También útiles en los métodos de la invención son derivados que codifican ácidos nucleicos del polipéptido representado por la SEQ ID NO: 2 u ortólogos o parálogos de los mismos. "Derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, los cuales pueden compararse a la secuencia de aminoácidos de la forma de origen natural de la proteína, tales como aquel presentado por la SEQ ID NO: 2, comprender sustituciones de aminoácidos con residuos de aminoácidos de origen no natural o adiciones de residuos de aminoácidos de origen no natural. "Derivados" de una proteína también abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos los cuales comprenden residuos de aminoácidos alterados de origen natural (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados , sulfatados, etc.) o residuos de aminoácido alterado no naturales comparados a la secuencia de aminoácido de una forma de origen natural del polipéptido. Un derivado puede comprender también uno o más sustituyentes o adiciones sin aminoácido comparadas a la secuencia de aminoácido a partir de la cual se deriva, por ejemplo, una molécula reportera u otro ligando, covalente o no volante enlazada a la secuencia de aminoácido, tal como una molécula reportera la cual se enlaza para facilitar su detección y residuos de aminoácido de origen no natural con relación a la secuencia de aminoácido de una proteína de origen natural.

Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la presente invención es una variante de empalme que codifica un polipéptido de 0sLEA3a como se define anteriormente. El término "variante de empalme" como se usa en la presente, abarca variantes de una secuencia de ácido nucleico en la cual los intrones y/o exones seleccionados se han escindido, reemplazado, desplazado o agregado, o en la cual los intrones se han acortado o alargado. Tales variantes serán aquellas en las cuales la actividad biológica de la proteína se retiene en forma sustancial, esto puede lograrse al retener en forma selectiva los segmentos funcionales de la proteína. Tales variantes de empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden hacerse por el hombre. Los métodos para elaborar tales variantes de empalme se conocen en la técnica. Variantes de empalme preferidas son variantes de empalme del ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de identificación consenso OsLEA3a (SEQ ID NO: 3). De preferencia, el polipéptido de OsLEA3a o el homólogo del mismo tiene al menos 42%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 2. Preferidas además son variantes de empalme representada por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO : 31 y la SEQ ID NO: 33. Más preferida es la variante de empalme representada por la SEQ ID NO: 1. Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la presente invención es la variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de 0sLEA3a como se define anteriormente. De preferencia, la variante alélica es un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de identificación consenso 0sLEA3a (SEQ ID NO: 3) y que tiene al menos 42%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 2. De preferencia, el polipéptido codificado por la variante alélica se representa por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 33. Más preferiblemente, la variante alélica que codifica el polipéptido de OsLEA3a se representa por la SEQ ID NO: 1. Las variantes alélicas existen en la naturaleza, y abarcado dentro de los métodos de la presente invención es el uso de estos alelos naturales. Variantes alélicas abarcan Polimorfismos de Nucleótido Sencillo (SNPs) así como Polimorfismos de Inserción/Eliminación Pequeños (INDELs) . El tamaño de los INDELs es usualmente menor de 100 pb. Los SNPS e INDELs forman el conjunto más grande de variantes de secuencia en cepas polimórficas de origen natural de la mayoría de los organismos . Una variante de ácido nucleico adicional útil en los métodos de la invención es una variante de ácido nucleico obtenido por desordenamiento genético. El desordenamiento genético o evolución dirigida puede utilizarse también para generar variantes de ácidos nucleicos 0sLEA3 . Esto consiste de iteraciones de desordenamiento de ADN seguido por detección y/o selección apropiada para generar variantes de ácidos nucleicos 0sLEA3 o porciones de los mismos que tienen una actividad biológica modificada (Castle et al . , (2004) Science 304(5674): 1151-4; Patentes Norteamericanas 5,811,238 y 6,395,547) . Además, la mutagénesis sitio-dirigida puede utilizarse para generar variantes de ácidos nucleicos OsLEA3 . Varios métodos están disponibles para lograr mutagénesis sitio-dirigida; la más común es métodos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Eds.). El ácido nucleico de OsLEA3a o variante del mismo pueden derivarse de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico/gen o variante del mismo puede aislarse de una fuente microbiana, tal como levadura u hongo, o de una fuente vegetal, alga o animal (incluyendo ser humano) . Este ácido nucleico puede modificarse desde su forma nativa en composición y/o ambiente genómico a través de manipulación humana deliberada. El ácido nucleico es de preferencia de origen vegetal, ya sea de la misma especie de planta (por ejemplo, a aquella en la cual va a introducirse) o ya sea desde una diferente especie de planta. El ácido nucleico puede aislarse desde una especie de monocotiledónea, de preferencia de la familia Poaceae, más preferiblemente de Oryza sativa . Más preferiblemente, el ácido nucleico de 0sLEA3a se representa por la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácido de 0sLEA3a es como se representa por la SEQ ID NO: 2. Cualquier referencia en la presente a un polipéptido de OsLEA3a se considera por lo tanto que significa una proteína de OsLEA3a como se define anteriormente. Cualquier ácido nucleico que codifica tal proteína OsLEA3a es adecuado para uso en los métodos de la invención. De acuerdo con un aspecto preferido de la presente invención, la expresión modulada, de preferencia incrementada del ácido nucleico de OsLEA3a o variante del mismo se visualiza. Métodos para incrementar la expresión de genes o productos genéticos se documentan bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión conducida por promotores apropiados, el uso de mejoradores de transcripción o mejoradores de traducción. Los ácidos nucleicos aislados los cuales sirven como elementos promotores o mejoradores pueden introducirse en una posición apropiada (normalmente corriente arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido de manera que sobre-regula la expresión de un ácido nucleico de 0sLEA3a o variante del mismo. Por ejemplo, promotores endógenos pueden alterarse in vivo por mutación, eliminación y/o sustitución (véase K iec, Patente Norteamericana No. 5,565,350; Zarling et al., PCT/US93 /03868 ) , o promotores aislados pueden introducirse dentro de una célula vegetal en la orientación y distancia apropiada a partir de un gen de la presente invención de manera que controlan la expresión del gen. Los métodos para reducir la expresión de genes o productos genéticos se documentan bien en la técnica. La expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de OsLEA3a o un homólogo del mismo puede modularse introduciendo una modificación genética (de preferencia en el lugar de un gen OsLEA3a ) . El lugar de un gen como se define en la presente se considera que significa una región genómica, la cual incluye el gen de interés y 10 kb corriente abajo o arriba de la región de codificación. La modificación genética puede introducirse, por ejemplo, por cualquiera (o más) de los siguientes métodos: activación de ADN-T, TILLING, mutagénesis sitio-dirigida, evolución dirigida y recombinación homologa o introduciendo y expresando en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de OsLEA3a o un homólogo del mismo. Después de la introducción de la modificación genética, sigue una etapa para seleccionar la expresión modificada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de 0sLEA3a o un homólogo del mismo, cuya modificación en expresión da plantas que tienen rendimiento incrementado. El etiquetado de activación de ADN-T (Hayashi et al . Science (1992) 1350-1353) implica la inserción de ADN-T que usualmente contiene un promotor (también puede ser un mejorador de traducción o un intrón) , en la región genómica del gen de interés o 10 kb corriente arriba o abajo de la región de codificación de un gen en una configuración tal que el promotor dirija la expresión del gen objetivo. Típicamente, la regulación de la expresión del gen objetivo por su promotor natural se interrumpe y el gen cae bajo el control del promotor recientemente introducido. El promotor se incrusta típicamente en un ADN-T. Este ADN-T se inserta al azar dentro del genoma de la planta, por ejemplo, a través de infección por Agrobacterium y conduce a sobreexpresión de los genes cercanos al ADN-T insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la sobreexpresión de los genes cercanos al promotor introducido. El promotor que se introduce puede ser cualquier promotor capaz de dirigir la expresión de un gen en el organismo deseado, en este caso una planta. Por ejemplo, los promotores constitutivos, preferidos de tejido, preferidos del tipo de célula e inducibles son todos adecuados para su uso en la activación de ADN-T. Una modificación genética puede introducirse también en el lugar de un gen 0sLEA3a utilizando la técnica de TILLING (Lesiones Locales Inducidas Objetivo en Genomas) . Ésta es una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar, y para aislar eventualmente variantes mutagenizadas de un ácido nucleico de 0sLEA3a con expresión y/o actividad modulada. TILLING también permite la selección de plantas portando tales variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden exhibir expresión modificada, ya sea en resistencia o en ubicación o en sincronización (si las mutaciones afectan el promotor por ejemplo) . Estas variantes mutantes pueden incluso exhibir actividad de OsLEA3a más elevada que aquella exhibida por el gen en su forma natural. TILLING combina mutagénesis de alta densidad con métodos de selección de rendimiento elevado. Las etapas seguidas típicamente en TILLING son: (a) mutagénesis de EMS (Redei GP and Koncz C (1992) En Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, pp . 16-82; Feldmann et al . , (1994) En Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J and Caspar T (1998) En J Martinez-Zapater , J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91-104); (b) preparación de ADN y agrupación de individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización y fijación para permitir la formación de heteroduplos; (e) DHPLC, en donde la presencia de un heteroduplo en un grupo se detecta como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación del individuo mutante; y (g) secuenciación del producto de PCR mutante. Los métodos para TILLING se conocen bien en la técnica (McCallum et al . , (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50). La mutagénesis sitio-dirigida puede utilizarse para generar variantes de ácidos nucleicos de OsLEA3a . Varios métodos están disponibles para lograr mutagénesis sitio dirigida; la más común es métodos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Eds. www.4ulr . com/products/currentprocols/index. html) . La evolución dirigida puede también utilizarse para generar variantes de ácidos nucleicos de OsLEA3a . Esto consiste de iteraciones de desordenamiento de ADN seguido por detección y/o selección apropiada para generar variantes de ácidos nucleicos de OsLEA3a o porciones de los mismos que codifican polipéptidos de OsLEA3a u homólogos o porciones de los mismos que tienen una actividad biológica modificada (Castle et al . , (2004) Science 304(5674): 1151-4; Patentes Norteamericanas 5,811,238 y 6,395,547).

La activación de ADN-T, TILLING, mutagénesis sitio-dirigida y evolución dirigida son ejemplos de tecnologías que permiten la generación de alelos novedosos y variantes de 0sLEA3a . Los efectos de la invención pueden producirse también utilizando recombinación homologa, la cual permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homologa es una tecnología estándar utilizada rutinariamente en ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levaduras o el musgo Physcomi trella . Los métodos para realizar recombinación homologa en plantas se han descrito no únicamente para plantas modelo (Offringa et al . (1990) EMBO J 9(10): 3077-84), sino también para plantas forrajeras, por ejemplo, arroz (Terada et al . (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; lida y Terada (2004) Curr Opin Biotech 15 (2 ) : 132-8 ) . Un método preferido para introducir una modificación genética (la cual en este caso no necesita estar en el lugar de un gen OsLEA3a ) es para introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de OsLEA3a o un homólogo del mismo, como se define anteriormente. El ácido nucleico que va a introducirse en una planta puede ser un ácido nucleico de longitud total o puede ser una porción de una secuencia de hibridación como se define anteriormente.

La invención también proporciona construcciones y vectores genéticos para facilitar la introducción y/o expresión de las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de acuerdo con la invención. Por lo tanto, se proporciona una construcción génica que comprende: (i) un ácido nucleico OsLEA3a o variante del mismo, como se define anteriormente; (ii) una o más secuencias de control capaces de conducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i) , siempre y cuando el ácido nucleico de OsLEA3a o una variante no codifique la SEQ ID NO: 22 (proteína LEA3a de Hordeum vulgare) . Las construcciones útiles en los métodos de acuerdo con la presente invención pueden construirse usando tecnología de ADN recombinante bien conocida para personas experimentadas en la técnica. Las construcciones génicas pueden insertarse en vectores, los cuales pueden encontrarse comercialmente disponibles, adecuados para transformar en plantas y adecuados para la expresión del gen de interés en las células transformadas. La invención además proporciona el uso de una construcción génica como se define anteriormente en los métodos de la invención. Las plantas se transforman con un vector que comprende la secuencia de interés (es decir, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de 0sLEA3a o un homólogo del mismo) . El técnico experimentado está al tanto de los elementos genéticos que deben presentarse en el vector con el fin de transformar, seleccionar y propagar exitosamente células huéspedes que contienen la secuencia de interés. La secuencia de interés se une operablemente a una o más secuencias control (al menos a un promotor) . Los términos "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" se usan en su totalidad en forma intercambiable en la presente y deben tomarse en un contexto amplio para referirse a secuencias reguladoras de ácidos nucleicos capaces de efectuar la expresión de las secuencias a las cuales se ligan. El término "promotor" normalmente se refiere a una secuencia control de ácido nucleico ubicada corriente arriba desde el inicio de transcripción de un gen y el cual está implicado en el reconocimiento y enlace de polimerasa de ARN y otras proteínas, por lo que dirige la transcripción de un ácido nucleico operablemente unido. Abarcados por los términos antes mencionados son secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen de genoma eucariótico clásico (incluyendo la caja TATA la cual se requiere para la iniciación precisa de la transcripción, con o sin una secuencia de caja CCAAT) y los elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras corriente arriba, intensificadores y silenciadores) los cuales alteran la expresión génica en respuesta al estímulo del desarrollo y/o externo, o de una manera específica de tejido. También se incluye dentro del término una secuencia reguladora transcripcional de un gen procariótico clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras transcripcionales de caja -10. El término "elemento regulador" también abarca una molécula de fusión sintética o derivado que confiere, activa o intensifica la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. El término "enlazado en forma operable" como se usa en la presente, se refiere a un enlazamiento funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de modo que la secuencia promotora sea capaz de iniciar la transcripción del gen de interés. Venta osamente, cualquier tipo de promotor puede usarse para conducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor inducible, es decir que tiene una iniciación de la transcripción inducida o incrementada en respuesta a un estímulo químico, ambiental o físico. Un ejemplo de un promotor inducible es un promotor inducible por estrés, es decir un promotor activado cuando una planta se expone a diversas condiciones de estrés, o a un promotor inducido por patógeno. Adicional o alternativamente, el promotor puede ser un promotor específico de tejido, es decir uno que es capaz de iniciar la transcripción en forma preferencial en ciertos tejidos, tales como las hojas, raíces, tejido de la semilla, etc; o puede ser un promotor ubicuo, el cual es activo en sustancialmente todos los tejidos o células de un organismo, o el promotor puede regularse evolutivamente, por lo que es activo durante ciertas etapas de desarrollo o en partes de la planta que experimentan cambios de desarrollo. Los promotores capaces de iniciar la transcripción en ciertos tejidos se refieren únicamente en la presente como "específicos de tejido", similarmente, promotores capaces de iniciar la transcripción en ciertas células se refieren únicamente en la presente como "específicos de células". Promotores adecuados, los cuales son funcionales en plantas, se conocen en general. Estos pueden tener la forma de promotores constitutivos o inducibles. Los promotores adecuados pueden permitir la expresión específica del desarrollo y/o del tejido en eucariotes multicelulares; de esta manera, promotores específicos de hojas, raíces, flores, semillas, estoma, tubérculos o frutos pueden utilizarse ventajosamente en las plantas. Diferentes promotores vegetales que pueden usarse en plantas son promotores tales como, por ejemplo, el promotor USP, el LegB4-, el DC3 o el promotor de ubiquitina de perej il .

Un promotor "vegetal" comprende elementos reguladores, los cuales median la expresión de un segmento de secuencia codificante en células vegetales. Por consiguiente, un promotor de planta no necesita ser de origen vegetal, pero puede originarse de virus o microorganismos, en particular por ejemplo de virus los cuales atacan células vegetales. El promotor "vegetal" puede originarse también de una célula vegetal, por ejemplo, de la planta, la cual se transforma con la secuencia de ácido nucleico que debe expresarse en el proceso inventivo y se describe en la presente. Esto también se aplica a otras señales reguladoras "vegetales" por ejemplo, en terminadores "vegetales". Para su expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico, como se describe anteriormente, debe enlazarse en forma operable a, o comprender, un promotor adecuado el cual expresa el gen en el punto exacto en el tiempo y en una manera específica de célula o tejido. Los promotores que pueden usarse son promotores constitutivos (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), tales como aquellos que se originan de virus vegetales, tales como 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980 285-294), 19S CaMV (véase también US 5352605 y WO 84/02913), 34S FMV (Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443), o promotores vegetales tales como el promotor de ubiquitina de perejil, el promotor de la subunidad pequeña de Rubisco descrito en US 4,962,028 o los promotores vegetales PRP1 [Ward et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, PGEL1, OCS [Leisner (1988) Proc Nati Acad SCi USA 85 (5) :2553-2557] , lib4, usp, mas [Comai (1990) Plant Mol Biol 15(3) :373-381] , STLS1, ScBV (Schenk (1999) Plant Mol Biol 39 (6) : 1221-1230) , B33, SADl , SAD2 (promotores de lino, Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696-1701) o nos [Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12 (20 ): 7831-7846] . Ejemplos adicionales de promotores vegetales constitutivos son los promotores de V-ATPasa de remolacha azucarera (WO 01/14572). Ejemplos de promotores constitutivos sintéticos son el Super promotor (WO 95/14098) y promotores derivados de cajas G (WO 94/12015). Si es apropiado, promotores inducibles por químicos pueden también utilizarse adicionalmente, compárese EP-A 388186, EP-A 335528, WO 97/06268. La expresión constitutiva estable de las proteínas de acuerdo con la invención en una planta puede ser ventajosa. Sin embargo, la expresión inducible del polipéptido de la invención es ventajosa, si, por ejemplo una expresión tardía antes de la cosecha es de ventaja, ya que la manipulación metabólica puede conducir al retardo en el crecimiento de la planta. La expresión de genes vegetales también puede facilitarse mediante un promotor químicamente inducible (para una revisión véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Los promotores químicamente inducibles son particularmente adecuados cuando se desea expresar el gen en una manera específica en el tiempo. Ejemplos de tales promotores son un promotor inducible por ácido salicílico (WO 95/19443), y el promotor inducible por ácido abscísico (EP 335 528), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404), un promotor inducible por ciciohexanol o etanol (WO 93/21334) u otros como se describe en la presente. Otros promotores adecuados son aquellos que reaccionan a condiciones de estrés biótico o abiótico, por ejemplo, el promotor génico PRP1 inducido por patógenos (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), el promotor hsp80 de tomate inducible por calor (US 5,187,267) el promotor de alfa-amilasa de papa inducible por frío (WO 96/12814) o el promotor pinll inducible por heridas (EP-A-0 375 091) u otros como se describe en la presente. Los promotores preferidos son en particular aquellos que aportan expresión génica en tejidos y órganos, en células de semillas, tales como células del endospermo y células del embrión en desarrollo. Los promotores adecuados son el promotor de gen napina de semilla de colza (US 5,608,152), el promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., Mol. Ben Genet, 1991, 225(3): 459-67), el promotor de oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), el promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980), el promotor arc5 de frijol, el promotor DcG3 de zanahoria, o el promotor B4 de Leguminosa (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal 2 (2):233-9), y promotores los cuales producen la expresión específica en semillas en plantas monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz y similares. Promotores ventajosos específicos de semillas son el promotor de la proteína de unión a sacarosa (WO 00/26388), el promotor de faseolina y el promotor de napina. Promotores adecuados los cuales deben considerarse son el promotor del gen Ipt2 ó Ipt2 de cebada (WO 95/15389 y WO 95/23230), y los promotores descritos en WO 99/16890 (promotores del gen de hordeína de cebada, el gen de glutelina de arroz, el gen de orizina de arroz, el gen de prolamina de arroz, el gen de gliadina de trigo, el gen de glutelina de trigo, el gen de zeína de maíz, el gen de glutelina de avena, el gen de kasirina de sorgo y el gen de secalina de centeno) . Promotores adecuados adicionales son Amy32b, Amy 6-6 y Aleuraína [US 5,677,474] Bce4 (semilla de colza) [US 5,530,149], glicina (soya [EP 571 741], fosfoenolpiruvato carboxilasa (soya) [JP 06/62870], ADR12-2 (soya) [WO 98/08962], isocitrato liasa (semilla de colza) [US, 5,689,040] o a-amilasa (cebada) [EP 781 849]. Otros promotores los cuales están disponibles para la expresión de genes en plantas son promotores específicos de hojas tales como aquellos descritos en DE-A 19644478 o promotores regulados por luz tales como, por ejemplo, el promotor petE de chícharo. Promotores vegetales adecuados adicionales son el promotor FBPase citosólico o el promotor ST-LSI de papa (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445) el promotor de fosforibosilpirofosfato amidotransferasa de Glycine max (No. de Registro GenBank U87999) o el promotor específico de nodo descrito en EP-A 0 249 676. De preferencia, el ácido nucleico de 0sLEA3a o variante del mismo se une operablemente a un promotor constitutivo. Un promotor constitutivo es transcripcionalmente activo durante la mayoría, pero no necesariamente todas las fases de su crecimiento y desarrollo y bajo la mayoría de las condiciones ambientales en al menos una célula, tejido u órgano. Un promotor constitutivo preferido es un promotor constitutivo que se expresa también sustancialmente en forma ubicua. Además de preferencia, el promotor constitutivo se deriva de una planta, más preferiblemente de una planta monocotiledónea. El más preferido es el uso de un promotor GOS2 (de arroz, como se representa por la SEQ ID NO: 6) . Debe ser claro que la aplicabilidad de la presente invención no se restringe al ácido nucleico de OsLEA3a representado por la SEQ ID NO: 1, ni es la aplicabilidad de la invención restringida a la expresión de un ácido nucleico OsLEA3a cuando se conduce por un promotor GOS2. Ejemplos de otros promotores constitutivos los cuales pueden también utilizarse para conducir la expresión de un ácido nucleico de 0sLEA3a se muestran en la Tabla 2 posteriormente.

Tabla 2: Ejemplos de promotores constitutivos Opcionalmente, una o más secuencias terminadoras (también una secuencia control) puede utilizarse en la construcción introducida en una planta. El término "terminador" abarca una secuencia control la cual es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional la cual señala el procesamiento y la poliadenilación 3 ' de un transcrito primario y la terminación de la transcripción. El terminador puede derivarse del gen natural, desde una variedad de otros genes de plantas, o de ADN-T. El terminador que se agrega puede derivarse de por ejemplo, los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o alternativamente de otro gen de planta, o menos preferiblemente de cualquier otro gen eucariótico. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir intensificadores transcripcionales así como también traduccionales . Aquellos experimentados en la técnica se percatarán de las secuencias terminadoras e intensificadoras que pueden ser adecuadas para su uso al realizar la invención. Tales secuencias pueden conocerse o pueden obtenerse fácilmente por una persona experimentada en la técnica . Una secuencia intrón puede agregarse también a la región 5' no traducida (UTR) o en la secuencia de codificación para incrementar la cantidad de mensaje maduro que acumula en el citosol. La inclusión de un intrón emplazable en la unidad de transcripción tanto en las construcciones de expresión de planta como animal se ha mostrado que incrementa la expresión genética en los niveles de ARNm y proteínas hasta 1000 veces (Buchman and Berg, Mol. Cell biol. 8:4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200 (1987). Tal intensificación intrónica de la expresión génica es típicamente mayor cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad transcripcional. El uso de intrones de maíz Adh-l-S intrón 1, 2 y 6, el intrón Bronze-1 se conocen en la técnica. Véase en general, The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994) . Otras secuencias control (además de las secuencias promotoras, mejoradoras, silenciadoras , intrón, regiones 3 'UTR y/o 5 'UTR) pueden ser elementos de estabilización de proteína y/o ARN. Tales secuencias pueden conocerse o pueden obtenerse fácilmente por una persona experimentada en la técnica . Las construcciones genéticas de la invención además pueden incluir una secuencia de origen de replicación que se requiere para el mantenimiento y/o replicación en un tipo celular específico. Un ejemplo es cuando una construcción genética se requiere mantener en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (por ejemplo, molécula de plásmido o cósmido) . Los orígenes de replicación preferidos incluyen, pero no se limitan a, el fl-ori y colEl . Para la detección y/o selección de la transferencia exitosa de las secuencias de ácido nucleico como se representan en el protocolo de secuencias y se usan en el proceso de la invención, es favorable usar genes marcadores (= genes reporteros). Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia exitosa de las moléculas de ácido nucleico mediante una serie de diferentes principios, por ejemplo, mediante identificación visual con la ayuda de fluorescencia, luminiscencia o en el intervalo de longitud de onda de la luz la cual es discernible para el ojo humano, por una resistencia a herbicidas o antibióticos, mediante lo que se conoce como marcadores nutritivos (marcadores de auxotrofía) o marcadores antinutritivos, a través de ensayos enzimáticos o a través de fitohormonas. Ejemplos de tales marcadores los cuales pueden mencionarse son GFP (= proteína fluorescente verde) ; el sistema de luciferina/luciferasa, la ß-galactosidasa con sus sustratos coloreados, por ejemplo, X-Gal, las resistencias a herbicida a por ejemplo, imidazolinona, glifosato, fosfinotricina o sulfonilurea, las resistencias a antibióticos para por ejemplo, bleomicina, higromicina, estreptomicina, kanamicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina, por mencionar sólo algunos, marcadores nutritivos tal como la utilización de mañosa o xilosa, o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a 2-desoxiglucosa . Esta lista representa solamente un número pequeño de posibles marcadores. El trabajador experto se familiariza mucho con tales marcadores. Se prefieren diferentes marcadores, dependiendo del organismo y el método de selección. Por lo tanto, la construcción genética puede comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como se usa en la presente, el término "marcador seleccionable o gen marcador seleccionable" incluye cualquier gen que confiere un fenotipo en una célula en la cual se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células que se transfectan o transforman con una construcción de ácidos nucleicos de la invención. Los marcadores adecuados pueden seleccionarse de marcadores que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas, que introducen un nuevo atributo metabólico o que permiten selección visual. Ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptll que fosforila neomicina y kanamicina, o hpt , que fosforila higromicina) , a herbicidas (por ejemplo bar el cual proporciona resistencia a Basta; aroA o gox que proporcionan resistencia contra glifosato), o genes que proporcionan un atributo metabólico (tal como manA que permite a las plantas usar mañosa como única fuente de carbono) . La expresión de los genes marcadores visuales resulta en la formación de color (por ejemplo ß-glucuronidasa, GUS), luminiscencia (tal como luciferasa) o fluorescencia (Proteína Verde Fluorescente, GFP, y derivados de la misma) . Se sabe acerca de la integración estable o transitoria de ácidos nucleicos en células vegetales que sólo una minoría de las células acepta el ADN extraño y, si lo desea, lo integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión utilizado y la técnica de transfección utilizada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (como se describe en lo anterior, por ejemplo, resistencia a antibióticos) se introduce usualmente en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos en plantas comprenden aquellos que confieren resistencia a un herbicida tal como glifosato o glufosinato. Otros marcadores adecuados son, por ejemplo, marcadores, los cuales codifican genes implicados en rutas biosintéticas de, por ejemplo, azúcares o aminoácidos, tales como ß-galactosidasa, ura3 o ilv2. Los marcadores, que codifican genes tales como luciferasa, gfp u otros genes de fluorescencia, son así mismo adecuados. Estos y los marcadores antes mencionados pueden utilizarse en mutantes en quienes estos genes no son funcionales ya que, por ejemplo, se han eliminado por métodos convencionales. Además, moléculas de ácido nucleico, las cuales codifican un marcador seleccionable, pueden introducirse en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o se utilizan en el proceso o incluso en un vector separado. Las células las cuales se han transfectado establemente con el ácido nucleico introducido pueden identificarse por ejemplo por selección (por ejemplo, las células que han integrado el marcador seleccionable sobreviven mientras que las otras células mueren) . Ya que los genes marcadores, particularmente genes para resistencia a antibióticos y herbicidas, ya no se requieren más o son indeseados en la célula huésped transgénica una vez que los ácidos nucleicos se han introducido exitosamente, el proceso de acuerdo con la invención para introducir los ácidos nucleicos emplea ventajosamente técnicas las cuales permiten la remoción, o escisión, de estos genes marcadores. Un método tal es lo que se conoce como cotransformación. El método de cotransformación emplea dos vectores simultáneamente para la transformación, un vector que porta el ácido nucleico de acuerdo con la invención y un segundo que porta el o los genes marcadores. Una gran proporción de transformantes recibe o, en el caso de plantas, comprende (hasta 40% de los transformantes y más), ambos vectores. En el caso de la transformación con Agrobacterias, los transformantes usualmente reciben sólo una parte del vector, la secuencia flanqueada por el ADN-T, la cual usualmente representa el cásete de expresión. Los genes marcadores pueden removerse subsecuentemente de la planta transformada al realizar cruzas. En otro método, los genes marcadores integrados en un transposón se utilizan para la transformación junto con el ácido nucleico deseado (conocido como la tecnología Ac/Ds). Los transformantes pueden cruzarse con un recurso de transposasa o los transformantes se transforman con una construcción de ácido nucleico que confiere expresión de una transposasa, transitoriamente o estable. En algunos casos (aproximadamente 10%), el transposón salta del genoma de la célula huésped una vez que la transformación ha tenido lugar exitosamente y se pierde. En un número adicional de casos, el transposón salta a una ubicación diferente. En estos casos, el gen marcador debe eliminarse al realizar cruzas. En microbiología, se desarrollaron técnicas las cuales hacen posible, o facilitan, la detección de tales eventos. Un método ventajoso adicional depende de lo que se conoce como sistemas de recombinación; cuya ventaja se puede prescindirse de la eliminación por cruzas. El sistema mejor conocido de este tipo es el que se conoce como el sistema Cre/lox. Creí es una recombinasa, la cual remueve las secuencias ubicadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias loxP, éste se remueve, una vez que la transformación ha tenido lugar exitosamente, por la expresión de la recombinasa. Sistemas de recombinación adicionales son el sistema HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem. 275, 2000:22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000:553-566). Es posible una integración específica de sitio en el genoma de la planta de las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Naturalmente, estos métodos pueden aplicarse también a microorganismos tales como levaduras, hongos o bacterias. La presente invención también abarca plantas, partes de la planta o células vegetales obtenibles por los métodos de acuerdo con la presente invención. La presente invención por lo tanto proporciona plantas obtenibles por el método de acuerdo con la presente invención, cuyas plantas han introducido en la presente un ácido nucleico de OsLEA3a o variante del mismo como se define anteriormente. La invención también proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen rendimiento incrementado, que comprenden la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico de OsLEA3a o una variante del mismo como se define anteriormente. Para los propósitos de la invención, "transgénica", "transgen" o "recombinante" significa, con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico, un cásete de expresión (= construcción genética) o un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico o un organismo transformado con las secuencias de ácido nucleico, casetes de expresión o vectores de acuerdo con la invención, todas aquellas construcciones efectuadas por los métodos recombinantes en los cuales, ya sea a) las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención, o b) secuencias de control genético las cuales se enlazan en forma operable con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención, por ejemplo, un promotor, o c) a) y b) no se localizan en su ambiente genético natural o se han modificado por métodos recombinantes, es posible para la modificación tomar la forma de, por ejemplo una sustitución, adición, eliminación, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótido. Se entiende que el ambiente genético natural significa el lugar genómico o cromosomal natural en la planta original o la presencia de una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácido nucleico se retiene de preferencia, al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, de preferencia al menos 500 pb, especialmente de preferencia al menos 1000 pb, más preferiblemente al menos 5000 pb. Un cásete de expresión de origen natural - por ejemplo, la combinación de origen natural del promotor natural de las secuencias de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico correspondiente que codifica un polipéptido que tiene dominios de LEA_4 o un homólogo de tal polipéptido - se vuelve un cásete de expresión transgénica cuando este cásete de expresión se modifica por métodos sintéticos no naturales ("artificiales") tales como por ejemplo, tratamiento mutagénico. Métodos adecuados se describen por ejemplo, en la US 5,565,350 o WO 00/15815. Una planta transgénica para los propósitos de la invención se entiende por lo tanto como significando, como en lo anterior, que los ácidos nucleicos utilizados en el método de la invención no están en su sitio natural en el genoma de la planta, siendo posible para los ácidos nucleicos que se expresan homologa o heterólogamente. Sin embargo, como se menciona, transgénica también significa que, mientras los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o utilizados en el método inventivo están en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia se ha modificado con respecto a la secuencia natural, y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales se han modificado. Se entiende transgénica de preferencia como significando la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en un lugar no natural en el genoma, es decir, homólogo, o de preferencia, expresión heteróloga de los ácidos nucleicos que tiene lugar. Las plantas transgénicas preferidas se mencionan en la presente. Plantas huéspedes para los ácidos nucleicos o el vector utilizado en el método de acuerdo con la invención, el cásete de expresión o construcción o vector son, en principio, ventajosamente todas las plantas, las cuales son capaces de sintetizar los polipéptidos utilizados en el método inventivo. Más específicamente, la presente invención proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen rendimiento incrementado, con el método que comprende : (i) introducir y expresar en una planta o célula vegetal un ácido nucleico OsLEA3a o variante del mismo; y (ii) cultivar la célula vegetal bajo condiciones que promueven el crecimiento y desarrollo de la planta. El ácido nucleico puede introducirse directamente en una célula vegetal o en la planta misma (incluyendo introducción en un tejido, órgano o cualquier otra parte de una planta) . De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico de preferencia se introduce en una planta por transformación. El término "introducción" o "transformación" como se refiere en la presente, abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, sin importar el método usado para la transferencia. El tejido vegetal capaz de propagación clonal subsecuente, ya sea por organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con una construcción genética de la presente invención y regenerarse una planta completa a partir del mismo. El tejido particular elegido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles para, y mejor adaptados a, la especie particular que se transforma. Los objetivos de tejido ejemplares incluyen discos de hoja, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, brotes axilares, y meristemos radicales), y tejido de meristemo inducido (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo de hipocotilo) . El polinucleótido puede introducirse en forma transitoria o estable en una célula huésped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede integrarse en el genoma huésped. La célula vegetal transformada resultante puede entonces usarse para regenerar una planta transformada en una manera conocida para las personas experimentadas en la técnica. La transferencia de genes extraños en el genoma de una planta se llama transformación. Al hacer esto, los métodos descritos para la transformación y regeneración de plantas a partir de tejidos vegetales o células vegetales se utilizan para transformación transitoria o estable. Un método de transformación ventajoso es la transformación in planta. Para este fin es posible, por ejemplo, permitir a las agrobacterias actuar sobre las semillas de las plantas o inocular el meristemo de la planta con agrobacterias. Ha demostrado ser particularmente conveniente de acuerdo con la invención permitir a una suspensión de agrobacterias transformadas actuar sobre la planta intacta o al menos la primera etapa de la flor. La planta se cultiva subsecuentemente hasta que las semillas de la planta tratada se obtienen (Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743) . Para seleccionar plantas transformadas, el material vegetal obtenido en la transformación, como regla general, se somete a condiciones selectivas de manera que las plantas transformadas puedan distinguirse de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas en la manera descrita en lo anterior pueden plantarse y, después de un periodo de crecimiento inicial, someterse a una selección adecuada por aspersión. Una posibilidad adicional consiste en cultivar las semillas, si es apropiado después de la esterilización, en placas de agar utilizando un agente de selección adecuado de manera que sólo las semillas transformadas puedan crecer en las plantas. Métodos de transformación ventajosos adicionales, en particular para plantas, se conocen por el trabajador experto y se describen en la presente en lo siguiente. La transformación de especies vegetales es actualmente una técnica bastante rutinaria. En forma favorable, cualquiera de varios métodos de transformación puede usarse para introducir el gen de interés en una célula predecesora adecuada. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, químicos que incrementan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, bombardeo de partículas, transformación usando virus o polen y microproyección. Los métodos pueden seleccionarse del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8:363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol 3, 1099-1102); micro inyección en material vegetal (Crossway A. et al., (1986) Mol. Gen Genet 202, 179-185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein T.M. et al., (1987), Nature 327, 70) infección con virus (no integrativos) y similares.

Las plantas de arroz transgénico se producen de preferencia mediante transformación mediada por Agrobacterium usando cualquiera de los métodos bien conocidos para transformación de arroz o maíz, tal como se describe en cualquiera de los siguientes: solicitud de patente Europea publicada EP 1198985 Al, Aldemita and Hodges (Planta, 199, 612-617, 1996); Chan et al . (Plant Mol Biol 22 (3) 491-506, 1993), Hiei et al . (Plant J. 6 (2) 271-282, 1994), cuyas descripciones se incorporan para referencia en la presente como si se establecieran por completo. En el caso de la transformación de maíz, el método preferido es como se describe ya sea en Ishida et al . (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o Frame et al . (Plant Physiol. 129(1): 13-22, 2002), cuyas descripciones se incorporan para referencia en la presente como si se establecieran por completo. Tales métodos se describen además a manera de ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants. Vol. 1, Engineering and Utilization, eds., S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Los ácidos nucleicos o la construcción que se expresa se clona de preferencia en un vector, el cual es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens , por ejemplo, pBinl9 (Bevan et al., Nucí. Acids Res. 12(1984) 8711). Las agrobacterias transformadas por tal vector pueden entonces utilizarse en una manera conocida para la transformación de las plantas, en particular plantas de cultivo tales como, a modo de ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo, al bañar hojas lesionadas u hojas cortadas en trozos en una solución de agrobacterias y luego cultivarlas en un medio adecuado. La transformación de plantas por medio de Agrobacterium tumefaciens se describe, por ejemplo, por Hdfgen and Willmitzer en Nucí. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce inter alia de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38. Generalmente, después de la transformación, las células vegetales o agrupaciones de células se seleccionan por la presencia de uno o más marcadores los cuales se codifican por genes que pueden expresarse en plantas cotransferidos con el gen de interés, después de lo cual el material transformado se regenera en una planta completa. Como se mencionó, las agrobacterias transformadas con un vector de expresión de acuerdo con la invención pueden utilizarse también en la manera conocida per se para la transformación de plantas tales como plantas experimentales como Arabidopsis o plantas de cultivo, tales como, cereales, maíz, avenas, centeno, cebada, trigo, soya, arroz, algodón, remolacha azucarera, ca óla, girasol, lino, cáñamo, papa, tabaco, tomate, zanahoria, pimiento dulce, semilla de colza, tapioca, yuca, arrurruz, caléndula, alfalfa, lechuga y diversas especies de árboles, nuez y vid, en particular plantas de cultivo que contienen aceite tales como soya, cacahuate, planta de aceite de ricino, girasol, maíz, algodón, lino, semilla de colza, coco, palma de aceite, cártamo ( Carthamus tinctorius) o granos de cacao, por ejemplo, al bañar hojas escarificadas o segmentos de hojas en una solución de agrobacterias y subsecuentemente cultivándolas en un medio adecuado. Además de la transformación de células somáticas, las cuales tienen entonces que regenerarse en plantas intactas, es posible también transformar las células de meristemos de plantas y en particular aquellas células las cuales se desarrollan en los gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando lugar a plantas transgénicas. De este modo, por ejemplo, semillas de Arabidopsis se tratan con agrobacterias y se obtienen semillas a partir de las plantas en desarrollo de las cuales una cierta proporción se transforma y de esta manera son transgénicas [Feldman, KA y Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chua y J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp . 274-289]. Métodos alternativos se basan en la remoción repetida de las inflorescencias y la incubación del sitio de escisión en el centro del florón con agrobacterias transformadas, por lo que semillas transformadas pueden así mismo obtenerse en un punto más tarde en el tiempo (Chang (1994). Plan J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245:363-370). Sin embargo, un método especialmente efectivo es el método de infiltración por vacío con sus modificaciones tales como el método de "inmersión floral". En el caso de infiltración por vacío de Arabidopsis, plantas intactas bajo presión reducida se tratan con una suspensión de agrobacterias [Bechthold, N (1993) . C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194-1199], mientras en el caso del método de "inmersión floral" el tejido floral en desarrollo se incuba brevemente con una suspensión de agrobacterias tratada con tensioactivo [Clough, SJ und Bent, AF (1998). The Plant J. 16, 735-743]. Una cierta proporción de semillas transgénicas se cosechan en ambos casos, y estas semillas pueden distinguirse de las semillas no transgénicas al cultivarlas bajo las condiciones selectivas descritas anteriormente. Además la transformación estable de las plástidas es ventajosa debido a que las plástidas se heredan de forma maternal en la mayoría de los cultivos reduciendo o eliminó el riesgo de flujo transgénico a través del polen. La transformación del genoma de cloroplasto se consigue generalmente por un proceso el cual se ha desplegado esquemáticamente en Klaus et al., 2004, [Nature Biotechnology 22(2), 225-229]. Brevemente, las secuencias que se transforman se clonan junto con un gen marcador seleccionable entre secuencias flanqueantes homologas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias flanqueantes homologas dirigen la integración específica de sitio en el plastoma. La transformación plastidal se ha descrito para muchas especies vegetales diferentes y una visión general puede tomarse de Bock et al. (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology, J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3 ): 425-38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Bíotechnol. 21, 20-28. Progreso biotecnológico adicional se ha reportado recientemente en forma de transformantes de plástidas libres de marcador, las cuales pueden producirse por un gen marcador cointegrado transitorio (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22 (2) , 225-229). Las células vegetales genéticamente modificadas pueden regenerarse mediante todos los métodos con los cuales el obrero calificado está familiarizado. Métodos adecuados pueden encontrarse en las publicaciones antes mencionadas por S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o Hófgen y Willmitzer. Después de la transferencia y regeneración de ADN, las plantas putativamente transformadas pueden evaluarse, por ejemplo usando análisis Southern, por la presencia del gen de interés, número de copias y/u organización genómica. Alternativa o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN recientemente introducido pueden monitorearse usando análisis Northern y/o Western, tales técnicas se conocen bien para las personas que tienen experiencia ordinaria en el arte . Las plantas transformadas generadas pueden propagarse por una variedad de medios, tal como por propagación clonal o técnicas clásicas de reproducción. Por ejemplo, una planta transformada de primera generación (o Tl) puede autofecundarse para dar transformantes de segunda generación (o T2 ) homocigóticas, y las plantas T2 propagarse además a través de técnicas clásicas de reproducción. Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clónales (por ejemplo, todas las células se transforman para contener el cásete de expresión) ; injertos de tejido transformado y sin transformar (por ejemplo, en plantas, un patrón radical transformado injertado en un retoño sin transformar) . La presente invención claramente se extiende a cualquier célula vegetal o planta producida por cualquiera de los métodos descritos en la presente, y a todas las partes de la planta y propágulos de la misma. La presente invención se extiende además para abarcar la progenie de una célula, tejido, órgano o planta completa primaria transformada o transfectada que se ha producido por cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, siendo el único requerimiento que la progenie exhiba la o las mismas características genotípicas y/o fenotípicas que aquellas producidas en el progenitor por los métodos de acuerdo con la invención. La invención también incluye células huésped que contienen un ácido nucleico de OsLEA3a aislado o variante del mismo. Las células huésped preferidas de acuerdo con la invención son células vegetales. La invención también se extiende a partes cosechables de una planta tales como, pero no limitadas a, semillas, hojas, frutos, flores, tallos, cultivos de tallo, rizomas, tubérculos y bulbos. La invención además se relaciona con productos derivados directamente de una parte cosechable de tal planta, tales como granulos o polvos secos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas. Estos productos también abarcan los metabolitos que se presentan en niveles incrementados y que tienen un valor económico. La presente invención también abarca el uso de ácidos nucleicos de OsLEA3a o variantes de los mismos y el uso de polipéptidos de OsLEA3a u homólogos de los mismos. Tal uso se relaciona para mejorar las características de crecimiento de las plantas, en particular al mejorar el rendimiento, especialmente el rendimiento de semillas. El rendimiento de semillas puede incluir uno o más de lo siguiente: peso total incrementado de semillas, número incrementado de semillas llenas y número total incrementado de semillas. Los ácidos nucleicos de 0sLEA3a o variantes de los mismos, o polipéptidos de 0sLEA3a u homólogos de los mismos pueden encontrar uso en programas de reproducción en los cuales un marcador de ADN se identifica, el cual puede unirse genéticamente a un gen de 0sLEA3a o variante del mismo. Los ácidos nucleicos/genes de 0sLEA3a o variantes de los mismos, o polipéptidos de OsLEA3a u homólogos de los mismos pueden utilizarse para definir un marcador molecular. Este marcador de ADN o de proteína puede utilizarse entonces en programas de reproducción para seleccionar plantas que tienen rendimiento incrementado. El gen de OsLEA3a o variante del mismo puede, por ejemplo ser un ácido nucleico como se representa por cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 33. Las variantes alélicas de un ácido nucleico/gen de OsLEA3a pueden también encontrar uso en programas de reproducción asistidos por marcadores. Tales programas de reproducción algunas veces requieren la introducción de variación alélica por tratamiento mutagénico de las plantas, usando por ejemplo mutagénesis EMS; alternativamente, el programa puede iniciar con una colección de variantes alélicas de origen denominado "natural" provocadas de manera no intencionadas. La identificación de variante alélicas tiene lugar entonces por, por ejemplo, PCR. Esto se sigue por una etapa de selección para la selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y las cuales dan características de crecimiento mejoradas en una planta. La selección se lleva a cabo típicamente al monitorear el desempeño en el crecimiento de plantas que contienen diferentes variante alélicas de la secuencia en cuestión, por ejemplo, diferentes variantes alélicas de cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 33. El desempeño del crecimiento puede monitorearse en un invernadero o en el campo. Etapas opcionales posteriores incluyen cruzar las plantas, en las cuales la variante alélica superior se identificó, con otra planta. Esto puede usarse, por ejemplo, para elaborar una combinación de características fenotípicas interesantes. Un ácido nucleico de OsLEA3a o variante de los mismos también puede usarse como sonda para mapear genética y físicamente los genes de los que son parte, y como marcadores de atributos enlazados a esos genes. Tal información puede ser útil en la reproducción vegetal a fin de desarrollar líneas con fenotipos deseados. Tal uso de los ácidos nucleicos de 0sLEA3a o variantes de los mismos requieren sólo una secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos 15 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos de 0sLEA3a o variantes de los mismos pueden usarse por marcadores de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) . Análisis Southern (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) de ADN genómico de planta de digestión restringida puede examinarse con los ácidos nucleicos de OsLEA3a o variantes de los mismos. Los patrones de bandas resultantes pueden entonces someterse a análisis genético usando programas de computación tal como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1:174-181) a fin de construir un mapa genético. Además, los ácidos nucleicos pueden usarse para examinar un análisis de Southern que contiene los ADN genómicos tratados con endonucleasas de restricción de un conjunto de individuos que representan progenitores y progenie de una cruza genética definida. La segregación de los polimorfismos de ADN se observa y usa para calcular la posición del ácido nucleico 0sLEA3a o de una variante del mismo en el mapa genético obtenido anteriormente usando esta población (Botstein et al. (1980) A . J. Hum. Genet. 32:314-331). La producción y uso de sondas derivadas de genes vegetales para su uso en mapeo genético se describe en Bernatzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Repórter 4:37-41. Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clones de ADNc específicos usando la metodología establecido en lo anterior o variaciones de la misma. Por ejemplo, poblaciones de entrecruzamiento F2 , poblaciones de hibridación, poblaciones apareadas al azar, líneas isogénicas cercanas y otros conjuntos de individuos pueden usarse para el mapeo. Tales metodologías se conocen bien para aquellos con experiencia en la técnica. Las sondas de ácidos nucleicos también pueden usarse para mapeo físico (es decir, colocación de secuencias en mapa físico, véase Hoheisel et al. En: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp . 319-346, y referencias citadas en el mismo) . En otra modalidad, las sondas de ácido nucleico pueden usarse en mapeo por hibridación in situ con fluorescencia directa (FISH) mapeo (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). Aunque los métodos actuales del mapeo FISH favorecen el uso de grandes clones (varios kb a varios miles de kb; véase Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20), las mejoras en la sensibilidad pueden permitir la realización de mapeo por FISH usando sondas más cortas. Una variedad de métodos basados en amplificación de ácidos nucleicos para mapeo genético y físico puede llevarse a cabo usando los ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen amplificación específica de alelos (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332), ligación específica de alelos (Landegren et al. (1988) Science 241:1077-1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), Mapeo de Híbridos por Radiación (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) y Mapeo Happy (Dear y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Para estos métodos, la secuencia de un ácido nucleico se usa para diseñar y producir pares de cebadores para su uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión de cebador. El diseño de tales cebadores se conoce bien por aquellos con experiencia en la técnica. En los métodos que emplean mapeo genético basado en PCR, puede ser necesario identificar diferencias en secuencias de ADN entre los progenitores de la cruza de mapeo en la región correspondiente a la secuencia de ácidos nucleicos inmediata. Esto, sin embargo, generalmente no es necesario para los métodos de mapeo. Los métodos de acuerdo con la presente invención resultan en plantas que tienen rendimiento incrementado y perfiles metabólicos alterados, como se describe en la presente. Estas características de crecimiento favorable también pueden combinarse con otros atributos económicamente favorables, tales como atributos adicionales que intensifican el rendimiento, tolerancia a diversos factores de estrés, atributos que modifican diversas características arquitectónicas y/o bioquímicas y/o características fisiológicas. El perfil metabólico alterado puede encontrar uso como una forma alternativa para caracterizar plantas que tienen rendimiento incrementado, cuyas plantas se producen por los métodos de la presente invención. El perfil metabólico alterado puede también utilizarse como una herramienta de diagnóstico o como un biomarcador.

Descripción de las figuras La presente invención se describirá ahora con referencia a las siguientes figuras, en las cuales: La Figura 1 muestra la estructura de dominio típico de polipéptidos de OsLEA3a. La proteína codificada por la SEQ ID NO: 2 comprende dos dominios LEA_4 (en negritas) ; los motivos de aminoácido 11-mer se subrayan. La mayoría del dominio C-terminal (en cursiva) es una región de complejidad baja. La Figura 2 muestra un vector binario p070, para expresión en Oryza sativa de una secuencia que codifica OsLEA3a de Arabidopsis thaliana bajo el control de un promotor GOS2 (referencia interna PRO0129). La Figura 3 detalla ejemplos de secuencias útiles en realizar los métodos de acuerdo con la presente invención. Las SEQ ID NO: 1 y 2 representan la secuencia de codificación de 0sLEA3a y la secuencia de proteína deducida. Las SEQ ID NO: 7 a 20 representan secuencias de otras proteínas LEA3a de arroz y secuencias de codificación, las SEQ ID NO: 21 y 22 son secuencias de cebada HVAl. Las SEQ ID NO: 4 y 5 son las secuencias cebadoras utilizadas para clonar OsLEA3a . Las SEQ ID NO: 23 a 34 representan secuencias de codificación y secuencias de proteínas de homólogos LEA3 a partir de especies sin arroz. La SEQ ID NO: 35 y la SEQ ID NO: 36 son variantes de la SEQ ID NO: 14 y la SEQ ID NO: 34, respectivamente. La SEQ ID NO: 3 representa la secuencia de identificación consenso. La Figura 4 representa una tabla de identidad/similaridad de secuencia producida con MATGAT (matriz BLOSUM62, penalización 11 de abertura gap, penalización 1 de extensión gap) . Las identidades de secuencia se dan en negrita antes de la diagonal, las similaridades de secuencia se dan posteriormente a la diagonal. Se utilizaron secuencias de proteína de longitud total .

EJEMPLOS La presente invención se describirá con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales son a modo de ilustración únicamente. Manipulación ADN: al menos que se establezca de otra manera, las técnicas de ADN recombinantes se realizan de acuerdo a los protocolos estándar tal como aquellos descritos en Sambrook (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3er Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, 2001) or in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols (www .4ulr . com/products/currentprotocols/ index . html ) . Materiales estándar y métodos para el trabajo molecular de planta se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D Croy, publicados por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications (UK) .

Ejemplo 1 : Clonación Genética de OsLEA3a El gen que codifica OsLEA3a de Oryza sa tiva se amplificó por PCR utilizando como plantilla una biblioteca de ADNc de plántula de Oryza sa tiva japónica cv Nipponbare (Invitrogen, Paisley, UK) . Después de la transcripción inversa de APN extraído de las plántulas, los AD?c se clonaron en pCNV Sport 6.0. El tamaño de inserto promedio del banco fue 1.5 kb y el número original de clones fue del orden de 1.59xl07 cfu. La concentración original se determinó para ser 9.6xl05 cfu/ml, y después de una primera amplificación de 6x1o11 cfu/ml. Después de la extracción del plásmido, se utilizó 200 ng de la plantilla en una mezcla de PCR de 50 µl . Los cebadores prm06120 (sentido, sitio AttBl en cursivas, codón de inicio en negras: 5' ggggacaagtt gtacaaaaaagcaggcfctaaacaatggcttcccaccagga-3 ' ) (SEQ ID NO: 4) y prm06121 (inversa, complementaria, sitio AttB2 en cursivas, codón de detención en negritas: 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaaatcattcacggcgtctagt-3 ' ) (SEQ ID NO: 5), la cual incluye los sitios AttB para recombinación Gateway, se utilizaron para amplificación de PCR. Se realizó la PCR utilizando Hifi Taq ADN polimerasa en condiciones estándares. Un fragmento de PCR del tamaño esperado se amplificó y purificó también utilizando métodos estándares. La primera etapa del procedimiento de Gateway, la reacción de BP, se realizó entonces, durante la cual el fragmento de PCR recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada", p06. El plásmido pDONR201 se adquirió de Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

Ejemplo 2: Construcción de Vector El clon p06 de entrada se utilizó subsecuentemente en una reacción LR con p00640, un vector de destinación utilizado para transformación de Oryza sativa . Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los bordes de ADN-T: un marcador seleccionable de planta; un cásete de expresión de marcador visual; y un cásete Gateway pretendido para recombinación in vivo de LR con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor GOS2 de arroz (SEQ ID NO: 6) para expresión constitutiva (PRO0129) se localizó corriente arriba de este cásete Gateway. Después de la etapa de recombinación LR, el vector de expresión resultante p07 (Figura 1) se transformó en la cepa LBA4044 de Agrobacterium utilizando protocolos de choque térmico o electroporación. Las colonias transformadas se cultivaron en un medio YEP y se seleccionaron por antibióticos respectivos durante dos días a 28°C. Estos cultivos de Agrobacterium se utilizaron para la transformación de la planta descrita en el Ejemplo 3. Otras cepas de Agrobacterium tumefaciens pueden utilizarse para la transformación de la planta y se conocen bien en la técnica. Ejemplos de tales cepas son C58C1 o EHA105.

Ejemplo 3 : Transformación de la Planta Transformación de Arroz La Agrobacterium que contiene el vector de expresión se utilizó para transformar plantas Oryza sativa .

Semillas secas maduras del cultivo de rice japónica Nipponbare se descascararon. La esterilización se llevó a cabo incubando durante un minuto en 70% de etanol, seguido por 30 minutos en 0.2% de HgCl2, seguido por un lavado de 15 minutos 6 veces con agua destilada estéril. Las semillas estériles se germinaron entonces en un medio que contiene 2,4-D (medio de inducción de callos) . Después de la incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, se extirparon callos derivados de escutelo embriogénico y se propagaron en el mismo medio. Después de dos semanas, los callos se multiplicaron o propagaron por subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. Las piezas de callos embriogénicos se subcultivaron en un medio reciente 3 días antes del co-cultivo (para fomentar la actividad de división celular) . La cepa LBA4404 de Agrobacteri um que contiene el vector de expresión se utilizó para co-cultivo. La Agrobacterium se inoculó en un medio AB con los antibióticos apropiados y se cultivó durante 3 días a 28°C. Las bacterias se recolectaron y suspendieron en un medio de co-cultivo líquido a una densidad (OD600) de aproximadamente 1. La suspensión se transfirió entonces a una placa de Petri y el callo se sumergió en la suspensión durante 15 minutos. Los tejidos callosos se secaron por tinción en un papel filtro y se transfirieron para solidificar, en un medio de co-cultivo y se incubaron durante 3 días en la oscuridad a 25°C. Los callos co-cultivados se cultivaron en un medio que contiene 2,4-D durante 4 semanas en la oscuridad a 28°C en la presencia de un agente de selección. Durante este periodo, se desarrollaron rápidamente islas de callos resistentes a crecimiento. Después de la transferencia de este material a un medio de regeneración y la incubación en la luz, el potencial embriogénico se liberó y . los brotes se desarrollaron en las siguientes cuatro a cinco semanas. Los brotes se extirparon desde el callo y se incubaron durante 2 a 3 semanas en un medio que contiene auxina, a partir del cual se transfirieron al suelo. Los brotes endurecidos se cultivaron bajo alta humedad y días cortos en un invernadero. Aproximadamente 35 transformantes de arr-oz TO independientes se generaron para una construcción. Las transformantes primarias se transfirieron a partir de una cámara de cultivo de tejido a un invernadero. Después de un análisis de PCR cuantitativo para verificar el número de copias del inserto de ADN-T, solamente plantas transgénicas de-' copia sencilla que exhiben tolerancia al agente de selección se mantuvieron para la cosecha de la semilla Tl . Las semillas se cosecharon tres a cinco meses después del transplante. El método produjo transformantes de lugar sencillo en una tasa de más de 50% (Aldemita y Hodges 1996, Chan et al . 1993, Hiei et al . 1994).

Transformación del maíz La transformación del maíz ( Zea mays) se realiza con una modificación del método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 ( 6 ) : 745-50. La transformación es dependiente de. genotipo en maíz y únicamente genotipos específicos son sensibles a la transformación y regeneración. La línea A188 congénita (Universidad de Minnesota) o híbridos con A188 como un progenitor son buenas fuentes de material donador para transformación, pero otros genotipos pueden utilizarse exitosamente también. Las espigas se cosechan de la planta de maíz aproximadamente 11 días después de la polinización (DAP) cuando la longitud del embrión inmaduro es aproximadamente 1 a 1.2 mm. Los embriones inmaduros se co-cultivan con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión, y las plantas transgénicas se recuperan mediante organogénesis. Los embriones extirpados se cultivan en un medio de inducción de callos, luego el medio de regeneración de maíz, que contiene el agente de selección (por ejemplo, imidazolinona, aunque varios marcadores de selección pueden utilizarse) . Las placas de Petri se incuban en la luz a 25°C durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollen los brotes. Los brotes verdes se transfieren de cada embrión al medio de enraizado del maíz y se incuban a 25°C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollen los brotes. Los brotes enraizados se transplantan al suelo en el invernadero. Las semillas Tl se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una copia sencilla del inserto de ADN-T.

Transformación del trigo La transformación del trigo se realiza con el método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6) :745-50. El cultivo Bobwhite (disponible de CIMMYT, México) es comúnmente utilizado en la transformación. Los embriones inmaduros se co-cultivan con Agrobacterium tumefacíens que contiene el vector de expresión, y las plantas transgénicas se recuperan medíante organogénesis . Después de la incubación con Agrobacterium, los embriones se cultivan in Vi tro en un medio de inducción de callos, luego en un medio de regeneración, que contiene el agente de selección (por ejemplo, imidazolinona, aunque varios marcadores de selección pueden utilizarse) . Las placas de Petri se incuban en la luz a 25°C durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollen los brotes. Los brotes verdes se transfieren de cada embrión a un medio de enraizado y se incuban a 25°C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollen los brotes. Los brotes enraizados se transplantan al suelo en el invernadero. Las semillas Tl se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una copia sencilla del inserto de ADN-T.

Transformación de Soya La soya se transforma de acuerdo con una modificación del método descrito en la patente Norteamericana 5,164,310 de Texas A&M. Varias variedades de soya comercial son sensibles a transformación por este método. El cultivo Jack (disponible de the Illinois Seed foundation) es comúnmente utilizado para la transformación. Las semillas de soya se esterilizan para sembrado in Vi tro . El hipocótilo, el radículo y una cotiledónea se extirpan a partir de las plántulas de siete días. El epicótilo y el cotiledón restantes se cultivan además para desarrollar nodos axilares. Estos nodos axilares se extirpan e incuban con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión. Después del tratamiento de co-cultivo, las explantas se lavan y se transfieren a un medio de selección. Los brotes regenerados se extirpan y colocan en un medio de alargamiento de brote. Los brotes que no son más largos de 1 cm se colocan en el medio de enraizado hasta que se desarrollan los brotes. Los brotes enraizados se transplantan al suelo en el invernadero. Las semillas Tl se producen de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una copia sencilla del inserto de ADN-T.

Transformación de semilla de colza/ cañóla Los pecíolos e hipocótilos de cotiledóneas de plántulas de 5-6 días se utilizan como explantas para cultivo de tejido y se transforman de acuerdo con Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). El cultivo comercial Westar (Agricultura de Canadá) es la variedad estándar utilizada para transformación, aunque otras variedades pueden utilizarse. Las semillas de cañóla son de superficie esterilizada por sembrado in vi tro . Las explantas de pecíolos de cotiledóneas con la cotiledónea unida se extirpan de las plántulas in vi tro, y se inoculan con Agrobacterium (que contiene el vector de expresión) sumergiendo el extremo de corte de la explanta de pecíolo en la suspensión bacterial. Las explantas se cultivan entonces durante 2 días en un medio MSPAB-3 que contiene 3 mg/l de BAP, 3% de sacarosa, 0.7% de Phytagar a 23°C, 16 horas de luz. Después de dos días de co-cultivo con Agrobacterium, las explantas de pecíolo se transfieren a un medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, cefotaxima, carbenicilina o timentina (300 mg/l) durante 7 días y luego se cultivan en un medio MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o timentina y el agente de selección hasta la regeneración del brote. Cuando los brotes están 5-10 mm de largo, se cortan y se transfieren al medio de alargamiento de brote (MSBAP-0.5, que contiene 0.5 mg/l de BAP). Los brotes de aproximadamente 2 cm de largo se transfieren al medio de enraizado (MS0) para inducción de raíces. Los brotes enraizados se transplantan al suelo en el invernadero. Las semillas Tl se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una copia sencilla del inserto de ADN-T.

Transformación de alfalfa Un clon de regeneración de alfalfa (Medicago sativa ) se transforma utilizando el método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119:839-847). La regeneración y transformación de la alfalfa es dependiente de genotipo y por lo tanto una planta de regeneración se requiere. Los métodos para obtener plantas de regeneración se han descrito. Por ejemplo, estos pueden seleccionarse del cultivo Rangelander (Agricultura de Canadá) o cualquier otra variedad de alfalfa comercial como se describe por Brown DCW y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112). Alternativamente, la variedad RA3 (Universidad de Wisconsin) se ha seleccionado para el uso en cultivo de tejidos (Walker et al., 1978 Am J Bot 65:654-659). Las explantas de pecíolos se co-cultivan con un cultivo durante la noche de Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) o LBA4404 que contiene el vector de expresión. Las explantas se co-cultivan durante 3 días en la oscuridad en un medio de inducción SH que contiene 288 mg/l de Pro, 53 mg/L de tioprolina, 4.35 g/1 de K2S04, y 100 µm de acetosiringinona. Las explantas se lavan en un medio Murashige-Skoog de media resistencia (Murashige and Skoog, 1962) y se colocan en placas en el mismo medio de inducción SH sin acetosiringinona, pero con un agente de selección adecuado y antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium . Después de varias semanas, los embriones somáticos se transfieren al medio de desarrollo BOÍ2Y que no contiene reguladores de crecimiento, ni antibióticos, y 50 g/1 de sacarosa. Los embriones somáticos se germinan subsecuentemente en un medio Murashige-Skoog de media resistencia. Las plántulas enraizadas se transplantan en macetas y se cultivan en el invernadero. Las semillas Tl se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una copia sencilla del inserto de ADN-T.

Ejemplo 4 : Evaluación y resultados de expresión de OsLEA3a en arroz bajo el control del promotor GOS2 de arroz Se generaron aproximadamente 15 a 20 transformantes de arroz TO independientes. Se transfirieron las transformantes primarias a partir de una cámara de cultivo de tejido a un invernadero para el crecimiento y la cosecha de semillas Tl . Cuatro a cinco casos, de los cuales la progenie Tl segregó 3:1 para presencia/ausencia del transgen, se retuvieron. Para cada uno de estos casos aproximadamente 10 plántulas Tl que contienen el transgen (hetero y homocigotos) y aproximadamente 10 plántulas Tl que carecen del transgen (nulicigotos ) , se seleccionaron al verificar la expresión de marcador visual. Las plantas Tl seleccionadas se transfirieron a un invernadero. Cada planta recibió una etiqueta de código de barras única para unir sin ambigüedades los datos de fenotipos a la planta correspondiente. Las plantas Tl seleccionadas se cultivaron en el suelo en macetas de 10 cm de diámetro bajo los siguientes parámetros ambientales: fotoperiodo = 11.5 horas, intensidad de luz de día = 30,000 lux o más, temperatura diurna = 28°C, temperatura nocturna = 22°C, humedad relativa = 60-70%. Las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes se cultivaron lado por lado a posiciones aleatorias. Se tuvo cuidado de que las plantas no se sometieran a ningún estrés. A partir de la etapa de sembrado hasta la etapa de madurez las plantas se pasaron varias veces a través de una cabina de digitalización de imágenes. En cada punto de tiempo las imágenes digitales (2048x1536 pixeles, 16 millones de colores) se tomaron de cada planta por al menos 6 diferentes ángulos. Se determinó el área superficial (que corresponde a la biomasa de las hojas) al contar el número total de pixeles de las partes de la planta superficial discriminada desde el fondo. Este valor se promedió para las pinturas tomadas en el mismo punto de tiempo desde los diferentes ángulos y se convirtió a un valor superficial físico expresado en mm cuadrado por calibración. Los experimentos muestran que el área de planta de fondo medidas de este modo se correlaciona con la biomasa de las partes superficiales de la planta. Las panículas primarias maduras se cosecharon, se embolsaron, y se etiquetaron con código de barras y luego se secaron durante tres días en un horno a 37 °C. Las panículas se trillaron entonces y todas las semillas se recolectaron. Las cascaras llenas se separaron a partir de las vacías utilizando un dispositivo de sopladura de aire. Después de la separación, ambos lotes de semillas se contaron entonces utilizando una máquina contadora comercialmente disponible. Las cascaras vacías se desecharon. Las cascaras llenas se pesaron en una balanza analítica y el área de sección transversal de las semillas se midió utilizando imágenes digitales. Este procedimiento resulta en el conjunto de los siguientes parámetros relacionados con las semillas: El número de semillas llenas se determinaron contando el número de cascaras llenas que permaneció después de la etapa de separación. Se midió el rendimiento de semilla total (peso total de semillas) pesando todas las cascaras llenas cosechadas de una planta. Se midió el número de semilla total por planta contando el número de las cascaras cosechadas de una planta. Se extrapoló el Peso en Miles de Granos (TKW) desde el número de semillas llenas contadas y su peso total. El índice de cosecha se definió como la relación del rendimiento total de semillas y el área superficial (mm2) multiplicada por un factor 106. Estos parámetros se derivaron en una forma automatizada a partir de las imágenes digitales utilizando software de análisis de imágenes y se analizaron estadísticamente. Los parámetros de semillas individuales (incluyendo ancho, longitud, área, peso) se midieron utilizando un dispositivo hecho a la medida que consiste de dos componentes principales, un dispositivo de peso y representación de imágenes, acoplado al software para análisis de imágenes. Un factor doble ANOVA (análisis de varianza) corregido para el diseño desequilibrado se utilizó como un modelo estadístico para la evaluación global de características fenotípicas de la planta. Se llevó a cabo una prueba F en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los casos transformados con el gen de la presente invención. Se llevó a cabo la prueba F para verificar un efecto del gen sobre todos los casos de transformación y para verificar un efecto total del gen, también llamado en la presente "efecto genético global". Si el valor de la prueba F muestra que los datos son notables, que se concluye que existe un efecto "genético", significando que no únicamente la presencia o la posición del gen está causando el efecto. El umbral para importancia para un efecto genético global real se establece a 5% del nivel de probabilidad para la prueba F . Para verificar un efecto de los genes dentro de un evento, es decir, para efecto específico de línea, una prueba t se realizó dentro de cada evento utilizando datos establecidos a partir de las plantas transgénicas y las plantas nulas correspondientes. "Plantas nulas" o "segregantes nulos" o "nulicigotos" son las plantas tratadas en el mismo modo como la planta transgénica, pero a partir de las cual se ha segregado el transgen. Plantas nulas pueden describirse también como las plantas transformadas negativas homocigotas . El umbral para importancia para la prueba t se establece en 10% del nivel de probabilidad. Los resultados para algunos eventos pueden estar sobre o debajo de este umbral. Esto se basa en la hipótesis de que un gen podría únicamente tener un efecto en ciertas posiciones en el genoma, y que la aparición de este efecto dependiente de posición no es común. Esta clase de efecto genético se llama también en la presente un "efecto de línea del gen" . El valor p se obtiene al comparar el valor t a la distribución t o alternativamente, comparando el valor F a la distribución F. El valor p da entonces la probabilidad de que la hipótesis nula (es decir, que no existe efecto del transgen) es correcta . Los datos obtenidos por OsLEA3a en el primer experimento se confirmaron en un segundo experimento con plantas T2. Cuatro líneas que tuvieron el patrón de expresión correcto se seleccionaron para análisis adicional. Lotes de semillas de las plantas positivas (tanto hetero como homocigotos) en Tl , se seleccionaron monitoreando la expresión del marcador. Para cada evento elegido, los lotes de semillas heterocigotas se retuvieron entonces para evaluación de T2. Dentro de cada lote de semillas un número igual de plantas positivas y negativas se cultivaron en el invernadero para evaluación. Un número total de 120 plantas transformadas OsLEA3a se evaluaron en la generación de T2 , que es 30 plantas por evento de las cuales 15 son positivas para el transgen y 15 son negativas. Debido a que dos experimentos con eventos traslapantes habían sido llevados a cabo, se realizó un análisis combinado. Esto es útil para verificar la consistencia de los efectos sobre los dos experimentos, y si éste es el caso, para acumular evidencia desde ambos experimentos con el fin de incrementar confidencia en la conclusión. El método utilizado fue un procedimiento de modelo mezclado que tiene en cuenta la estructura de multinivel de los datos (es decir, experimento - evento -segregantes) . Los valores p se obtienen al comparar la prueba de relación de probabilidad a distribuciones chi-cuadrado.

Ejemplo 5: Evaluación de transformantes OsLEA3a: medición de parámetros relacionados con el rendimiento En el análisis de las semillas como se describe anteriormente, los inventores encontraron que las plantas transformadas con la construcción genética 0sLEA3a tuvo un rendimiento de semillas más elevado, expresado como el número total de semillas (incremento del 11%), número de semillas llenas (incremento del 21%) y un peso total de semillas (incremento del 25%) comparado a plantas que carecen del transgen OsLEA3a . Los resultados obtenidos por las plantas en la generación de Tl se resumen en la Tabla 3 : Tabla 3: Estos resultados positivos se obtuvieron de nuevo en la generación de T2. Los datos de T2 se volvieron a evaluar en un análisis combinado con los resultados de la generación de Tl , y los valores p obtenidos mostraron que los efectos observados fueron notablemente significativos.

Ejemplo 6: Análisis metabólico de plantas transformadas Las plantas transformadas con OsLEA3a (como se describe en el Ejemplo 1) se cultivaron en el invernadero como se describe en el Ejemplo 4. La composición modificada de acuerdo con la invención, con respecto a diversos metabolitos, se determinó por el siguiente procedimiento. a) Homogenización de las muestras Se transfirieron de diez a treinta granos de arroz en tubos de plástico (Eppendorf, Safe-Lock, 2 mL) y se homogenizaron con una bola de acero inoxidable en un molino de bolas (Retsch) bajo enfriamiento con nitrógeno líquido. b) Liofilización Durante el experimento, se tuvo cuidado de que las muestras permanecieran ya sea en un estado de congelación profunda (debajo de -40°C) o se liberaran de agua por liofilización del material homogenizado hasta el primer contacto con los solventes. Las muestras se transfirieron en un secador por .congelación pre-enfriado (-40°C). La temperatura inicial durante la fase de secado principal fue -35°C y la presión fue 0.120 mbar. Durante el proceso de secado, los parámetros se alteraron, siguiendo un programa de presión y de temperatura. La temperatura final después de 12 horas fue +30°C y la presión final fue 0.001 a 0.004 mbar. En la desconexión de la bomba de vacío y la máquina refrigerante, el sistema se limpió con aire (secado a través de un tubo de secado) o argón.

Extracción Inmediatamente después que el aparato de liofilización se hubo limpiado, los tubos con el material de planta liofilizada se sellaron herméticamente para proteger el material de humedad aérea. Para la extracción, una porción de 50 mg de material de planta homogenizado seco se pesó en dedales de extracción de fibra de vidrio y se transfirió en cartuchos de extracción de 5 ml del dispositivo ASE (Extractor de Solvente Acelerado ASE 200 con el Controlador de Solvente y software AutoASE (DIONEX) ) . Las 24 posiciones de muestra de un dispositivo ASE (Extractor de Solvente Acelerado 200 con el Controlador de Solvente y el software AutoASE (DIONEX) ) se llenaron con muestras de planta, incluyendo algunas muestras para prueba de control de calidad. Se extrajeron sustancias polares con aproximadamente 10 ml de metanol/agua (80/20, v/v) a 70°C y una presión de 140 bares, 5 minutos de fase de aumento de calor, 1 minutos de extracción estática. Las sustancias más lipofílicas se extrajeron con aproximadamente 10 ml de metanol/diclorometano (40/60, v/v) a 70°C y una presión de 140 bares, 5 minutos de fase de aumento de calor, 1 minuto de extracción estática. Las dos mezclas de solventes se agruparon en los mismos tubos de vidrio (tubos de centrífuga, 50 ml equipados con tapa de rosca y septo perforable para el ASE (DIONEX) ) . La solución se suplemento con estándares internos comercialmente disponibles tales como ribitol, L-glicina-2 , 2-d2, L alanina-2 , 3 , 3 , 3-d , metionina-d3 , Arginina_(13C) , Triptofano-d5, metilnonadecanoato de a-metilglucopiranosida, undecanoato de metilo, tridecanoato de metilo, pentadecanoato de metilo y nonacosanoato de metilo. El extracto total se mezcló con 8 ml de agua. El residuo sólido de la muestra vegetal y el manguito de extracción se desecharon. El extracto se agitó y luego se centrifugó durante 5 a 10 minutos en forma mínima 1400 g con el fin de acelerar la separación de fase. Se removió 1 ml de la fase de metanol/agua sobrenadante ("fase polar", incolora) por análisis cromatográfico de gas (GC) y se removió 1 ml para análisis cromatográfico líquido (LC) . El resto de la fase de metanol/agua se desechó. En forma similar, se removió 0.75 ml de la fase orgánica ("fase lípido" verde oscuro) para el análisis de GC adicional y se removió 0.75 ml para el análisis de LC . Todas estas muestras se evaporaron hasta sequedad utilizando el evaporador de vacío infrarrojo IR Dancer (Hettich) . La temperatura máxima durante el proceso de evaporación no excedió 40°C. La presión en el aparato fue 10 mbares o menor. d) Procesamiento de lípido y fase polar para análisis de LC/Ms o LC/MS/MS E extracto de lípido y el extracto polar, el cual se había evaporado a sequedad, se tomaron en la fase móvil para análisis de LC . e) Análisis de LC-MS La parte de LC se llevó a cabo en un sistema de LC/MS comercialmente disponible de Agilent Technologies, USA. A partir de los extractos polares, se inyectaron 10 µl en el sistema en una tasa de flujo de 200 µl/minuto. La columna de separación (Fase Inversa C18) se mantuvo a 15°C durante cromatografía. Para extractos de lípidos, se inyectaron 5 µl en el sistema en una tasa de flujo de 200 µl/minuto. La columna de separación (Fase Inversa C18) se mantuvo a 30°C. Se realizó la HPLC con elución de gradiente. El análisis de espectrometría de masa se realizó en un instrumento triple-cuádruple Applied Biosystems API 4000 con una fuente de rocío de ion turbo. Para extractos polares, el instrumentó se midió en modo de ion negativo en modo de barrido completo de 100-1000 amu; mientras que para los extractos de lípidos el instrumento se midió en modo de ion positivo en modo de barri.do completo de 100-1000 amu. f) Derivación de la fase de lípido para el análisis de GC/MS Se agregó una mezcla de 140 µl de cloroformo, 37 µl de ácido clorhídrico (37% en peso de HCl en agua) , 320 µl de metanol y 20 µl de tolueno al extracto evaporado para la transmetanólisis . El recipiente se selló herméticamente y se calentó durante 2 horas a 100°C, mientras se agitaba. La solución se evaporó subsecuentemente hasta que el residuo se secó completamente. La metoximación de los grupos carbonilo se llevó a cabo por reacción con clorhidrato de metoxiamina (5 mg/ml en piridina, 100 ml durante 1.5 horas a 60°C) en un recipiente herméticamente sellado. Se agregaron 20 µl de una solución de ácidos grasos de cadena lineal, numerados por nones (solución de cada uno 0.3 mg/mL de ácidos grasos de 7 a 25 átomos de carbono y cada uno 0.6 mg/mL de ácidos grasos con 27, 29 y 31 átomos de carbono en 3/7 (v/v) piridina/tolueno) como estándares de tiempo. Finalmente, la derivación con 100 µl de N-metil-N- (trimetilsilil) -2 , 2 , 2-trifluoroacetamida (MSTFA) se llevó a cabo durante 30 minutos a 60°C, de nuevo en el recipiente herméticamente sellado. El volumen final antes de la inyección en el GC fue 220 µl . g) Derivación de la fase polar para el análisis de GC/MS La metoximación de los grupos carbonilo se llevó a cabo por la reacción con clorhidrato de metoxiamína (5 mg/ml en piridina, 50 ml durante 1.5 horas a 60°C) en un recipiente herméticamente sellado. Se agregaron 10 µl de una solución de ácidos grasos de cadena lineal numerados por nones (solución de cada uno 0.3 mg/ml de ácidos grasos de 7 a 25 átomos de carbono y cada uno 0.6 mg/mL de ácidos grasos con 27, 29 y 31 átomos de carbono en 3/7 (v/v) piridina/tolueno) como estándares de tiempo. Finalmente, la derivación con 50 µl de N-metil-N- (trimetilsilil) -2, 2, 2-trifluoroacetamida (MSTFA9 se llevó a cabo durante 30 minutos a 60°C, de nuevo en el recipiente herméticamente sellado. El volumen final antes de la inyección en el GC fue 110 µl . h) Análisis de GC-MS El sistema de GC-MS consiste de un GC Agilent 6890 acoplado a un Agilent 5973 MSD. Los auto-muestrarios fueron CompiPal o GCPal de CTC. Para el análisis, se utilizaron columnas de separación capilar comercialmente disponibles (30m x 0.25 mm x 0.25 µm) con diferentes fases estacionarias de poli-metil-siloxano que contienen 0% hasta 35% de porciones aromáticas, dependiendo del material de muestra y las fracciones a partir de la etapa de separación de fase que se analiza (por ejemplo: Agilent Technologies DB-lms, HP-5ms, DB-XLB, DB-35ms,). Se inyectó hasta 1 µL del volumen final sin dividirse y con un gradiente de temperatura de horno de 70°C a 340°C con diferentes tasas de calentamiento dependiendo del material de muestra y la fracción de la etapa de separación de fase, con el fin de lograr una separación cromatográfica suficiente y un número de barridos dentro de cada pico de analito. Condiciones estándares de GC-MS usuales, por ejemplo, se utilizaron flujo constante con 1 a 1.7 ml/min nominal, y helio como el gas de fase móvil. La ionización se hizo por impacto por electrón con 70 eV, barriendo dentro de un intervalo de m/z de 15 a 600 con velocidades de barrido de 2.5 a 3 barridos/seg y condiciones de tonada estándar i) Análisis de las diversas muestras de plantas Las muestras se midieron en series individuales de 20 muestras de plantas cada una. En los experimentos cada serie contuvo al menos 3 replicados por línea transgénica más al menos 3 plantas de la línea nula-segregante respectiva como controles. Las áreas pico para cada analito se ajustaron para el peso seco establecido para la planta (área normalizada) . Los valores de relación se calcularon por normalización adicional al control. En los experimentos, los valores de relación se calcularon dividiendo el área de normalización por el promedio de los datos correspondientes del grupo control en la misma serie. Los valores obtenidos se refieren como relación_ por_ control. Son comparables entre series e indican cuánta concentración de analito en la planta transgénica difiere del grupo control, las cuales son las plantas de las líneas nulas-segregantes respectivas en una serie dada. Controles apropiados se hacen previos para confirmar que el vector y el procedimiento de transformación mismo no tuvieron influencia notable en la composición metabólica de las plantas.

Los resultados de los diferentes análisis de las plantas puede observarse a partir de la siguiente tabla 4: Tabla 4: Resultados del análisis de semillas a partir de transformantes OsLEA3a, la relación_min y la relación_max son relativas a las plantas control .

La columna 2 muestra el metabolito analizado, la columna 1 da la clase metabólica a la cual pertenece el metabolito. Las columnas 3 y 4 muestran la relación mínima y máxima, a partir de la cual el intervalo de incremento o disminución del metabolito analizado como se encuentra en experimentos independientes entre las plantas transgénicas y sus líneas control nulas-segregantes respectivos de tipo silvestre pueden derivarse. La columna 4 indica el método analítico (Cromatografía de Gas o Cromatografía Líquida) . La tabla muestra que los valores de relación_por_control dentro del grupo de aminoácidos pueden variar entre 0.7 y 7.7; dentro del grupo de carotenoides entre 1.8 y 19.3; dentro del grupo de co-factores entre 1.3 y 1.5; dentro del grupo de ácidos grasos y etabolitos relacionados entre 0.3 y 0.9; dentro del grupo de ácidos orgánicos entre 1.4 y 20.0; dentro del grupo de fenólicos entre 1.4 y 8.5; dentro del grupo de fitohormonas y fitoesteroles entre 1.0 y 10.9; dentro del grupo de metabolitos de azúcar entre 0.5 y 7.1, dentro del grupo de tocoferol y metabolitos relacionados entre 0.3 y 4.2.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para incrementar el rendimiento de plantas con relación a las plantas control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de 0sLEA3a o un homólogo del mismo, y opcional ente seleccionar para plantas que tienen rendimiento incrementado, siempre que el polapéptido de 0sLEA3a u homólogo del mismo no sea la SEQ ID NO- 22 ( Hordeum vulgare) .
2. El método de acuerdo con ] a rei indicación 1, en donde la expresión modulada se efectúa al introducir una modificación genética de preferencia en el lugar de un gen que codifica un polipéptido de OsLEA3a o un homólogo del mismo .
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la modificación genética se efectúa por uno de: activación de ADN-T, TILLING, mutagénesis sitio-dirigida o evolución dirigida.
4. Un método para incrementar el rendimiento de plantas con relación a plantas control, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico de OsLEA3a o una variante del mismo, siempre que el ácido nucleico de OsLEA3a o variante del mismo no codifique la SEQ ID NO: 22 (Hordeum vulgare LEA3a) .
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico codifica un homólogo de la proteína 0sLEA3a de la SEQ ID NO: 2, de preferencia el ácido nucleico codifica un parálogo de la proteína 0sLEA3a de la SEQ ID NO: 2.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la variante es una porción del ácido nucleico de 0sLEA3a o una secuencia capaz de hibridizar a un ácido nucleico de 0sLEA3a , cuya porción o secuencia de hibridación codifica un polipéptido que comprende 2 dominios LEA_4 y la secuencia de identificación consenso de OsLEA3a de la SEQ ID NO: 3.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en donde el ácido nucleico de OsLEA3a o variante del mismo se sobreexpresa en una planta.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde el ácido nucleico de OsLEA3a o variante del mismo es de origen vegetal, de preferencia de una planta onocotiledónea, más preferiblemente de la familia Poaceae, más preferiblemente el ácido nucleico es de Oryza sa ti va .
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde el ácido nucleico de OsLEA3a o variante del mismo se une operablemente a un promotor constitutivo .
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el promotor constitutivo es un promotor G0S2.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el rendimiento incrementado es el rendimiento incrementado de semillas.
12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el rendimiento incrementado se selecciona de: el peso total incrementado de semillas, el número incrementado de semillas llenas o el índice incrementado de la cosecha.
13. La planta obtenible por un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Una construcción, que comprende: (i) un ácido nucleico de 0sLEA3a o una variante del mismo ; (n) una o más secuencias control operablemente unidas a la secuencia de ácido nucleico de (a) , siempre que el ácido nucleico de OsLEA3a o una variante del mismo no codifique la SEQ ID NO: 22 (Hordeumn vulgare LEA3a) .
15. La construcción de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la secuencia control es un promotor constitutivo.
16. La construcción de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el promotor constitutivo es un promotor G0S2.
17. La construcción de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el promotor GOS2 es como se representa por la SEQ ID NO: 6.
18. La planta transformada con una construcción de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17.
19. Un método para la producción de una planta transgénica que tiene rendimiento incrementado comparado a las plantas control, cuyo método comprende: (i) introducir y expresar en una planta o célula vegetal un ácido nucleico de OsLEA3a o variante del mismo; (n) cultivar la célula vegetal bajo condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta, siempre que el ácido nucleico de OsLEA3a o variante del mismo no codifique la SEQ ID NO- 22 (Hordeum vulgare LEA3a) .
20. Una planta transgénica que tiene rendimiento incrementado cuando se cultiva ba o condiciones sin estrés, resultando a partir de un ácido nucleico de OsLEA3a o una variante del mismo introducida en la planta.
21. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 13, 18 ó 20, en donde la planta es una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar o en donde la planta es un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, avenas o sorgo.
22. Las partes cosechables de una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13, 18, 20, o 21.
23. Las partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 22, en donde las partes cosechables son semillas .
24. Los productos directamente derivados de una planta de acuerdo con la reivindicación 21, y/o de las partes cosechables de una planta de acuerdo con las reivindicaciones 22 ó 23.
25. El uso de un ácido nucleico/gen de OsLEA3a o variante del mismo, o uso de un polipéptido de OsLEA3a o un homólogo del mismo, para mejorar el rendimiento, especialmente el rendimiento de semillas, de plantas cultivadas bajo condiciones sin estrés y con relación a plantas control .
26. El uso de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el rendimiento de semillas es uno o más de: el peso total incrementado de semillas, el número incrementado de semillas llenas y el índice incrementado de la cosecha.
27. El uso de un ácido nucleico/gen de OsLEA3a o variante del mismo, o el uso de un polipéptido de 0sLEA3a o un homólogo del mismo, como un marcador molecular.
28. La semilla de plantas que tiene niveles de metabolito alterados en donde la relación de los niveles de metabolito en la semilla de plantas comparados a aquellos de las semillas de plantas control varía dentro del grupo de aminoácidos entre 0.7 y 7.7; dentro del grupo de carotenoides entre 1.8 y 19.3; dentro del grupo de co- factores entre 1.3 y 1.5; dentro del grupo de ácidos grasos y metabolitos relacionados entre 0.3 y 0.9; dentro del grupo de ácidos orgánicos entre 1.4 y 20.0; dentro del grupo de fenólicos entre 1.4 y 8.5; dentro del grupo de fitohormonas y fitosteroles entre 1.0 y 10.9; dentro del grupo de metabolitos de azúcar entre 0.5 y 7.1, dentro del grupo de tocoferol y metabolitos relacionados entre 0.3 y 4.2; cuya planta tiene expresión modulada de un ácido nucleico que codifica una proteína de 0sLEA3 o un homólogo del mismo.