MX2008003054A - Lineas de celulas hospederas para la produccion de la region constante de anticuerpos, con fusion efectora mejorada. - Google Patents

Abstract

Lineas de celulas hospederas para la produccion biofarmaceutica de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o proteinas de fusion derivadas de anticuerpos, se seleccionan porque tienen la capacidad de inducir funciones efectoras celulares mejoradas, por ejemplo, funciones efectoras mediadas por Fc; las celulas hospederas se derivan de la linea de celulas YB2/0 de mieloma de rata, y estan adaptadas para crecer en medio quimicamente definido.

Description

LINEAS DE CÉLULAS HOSPEDERAS PARA LA PRODUCCIÓN DE LA REGIÓN CONSTANTE DE ANTICUERPOS, CON FUNCIÓN EFECTORA MEJORADA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a células, líneas de células y cultivos de células útiles en tecnologías de ADN recombinante, y para la producción de proteínas en cultivo de células. Más específicamente, la presente invención está dirigida a líneas de células de mieloma clónales capaces de crecer en medios químicamente definidos, que proveen función efectora mejorada de anticuerpos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos son referidos con frecuencia como moléculas adaptadoras que enlazan mecanismos inmunes humorales y celulares: las respuestas humorales siendo atribuidas principalmente a anticuerpos circulantes secretados maduros capaces de alta afinidad de unión a un antígeno objetivo conferida por la especificidad inherente de los dominios variables. Las respuestas celulares son atribuidas a las consecuencias de la activación celular por unión de complejos de anticuerpo-antígeno (ab-ag) y por secuelas corriente abajo, causadas por la liberación de mediadores celulares como resultado de la unión del complejo ab-ag a células efectoras. Estas respuestas celulares incluyen neutralización del objetivo, opsonización y sensibilización (si el antígeno es exhibido sobre la superficie en una célula), sensibilización de células cebadas y activación del complemento. Para objetivos celulares, es decir, antígenos de la superficie de la célula, estas funciones efectoras llevan a lo que se conoce comúnmente como citotoxicidad celular dirigida por el anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad mediada por el complemento (CDC). Son las denominadas regiones variables y los dominios hipervariables del anticuerpo, que son responsables del reconocimiento antigénico especifico, y las denominadas regiones constantes de la porción de la cadena pesada del heterodímero, la porción Fc, que interactúan con estos receptores de Fc presentes en varias células usualmente altamente móviles, capaces de estimular a esas células para afectar ciertas funciones que incluyen la captación del anticuerpo y mecanismos citotóxicos o ADCC, CDC, y que afectan también la unión del anticuerpo a varios receptores que incluyen la unión a la proteína C1q. Estos receptores se conocen como receptores de Fc. Entre los isotipos de los anticuerpos (por ejemplo, IgA, IgE, IgD, IgG e IgM), las IgGs son las más abundantes, exhibiendo las subclases de lgG1 el grado y la disposición más significativos de las funciones efectoras. Los anticuerpos tipo lgG1 son los anticuerpos usados más comúnmente en la inmunoterapia del cáncer. Estructuralmente, la región de gozne y los dominios CH2 de la IgG desempeñan una función importante en las funciones efectoras de los anticuerpos. Los oligosacáridos N-enlazados presentes en la región Fc (formada por la dimerización del gozne y los dominios CH2 y CH3) afectan las funciones efectoras (figura 1). La porción Fc de todos los anticuerpos de ocurrencia natural está decorada además en posiciones conservadas en la cadena pesada con cadenas de carbohidratos. En los isotipos de IgG, el sitio de glucosilación N-enlazado está en Asn297 que está en cada dominio CH2. Puesto que las regiones constantes varían con el isotipo, cada isotipo posee una disposición distinta de estructuras de carbohidratos N-enlazados que afectan variablemente el ensamble, la secreción o la actividad funcional de las proteínas (Wright, A. y Morrison, S. L., Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)). La estructura del carbohidrato N-enlazado unido varia considerablemente, dependiendo del grado de procesamiento, y puede incluir oligosacáridos de alto contenido de mañosa, altamente ramificados, y oligosacáridos de complejo biantenario y residuos de ácido siálico (ácido N-acetil neuramínico o NANA), fucosa, galactosa y GIcNAc (N-acetil glucosamina) como azúcares terminales mostrados en el cuadro A. Se ha reconocido el impacto sobre las funciones efectoras de la célula hospedera y el contenido de oligosacáridos de los anticuerpos (Lifely, M. R., et al., 1995 Glycobiology 5: 813-822; Jefferis, R., eí al., 1998 Immunol Rev. 163: 59-76; Wright, A. y Morrison, S. L, citado anteriormente; Presta L. 2003. Curr Opin Struct Biol. 13(4): 519-25). Además, respecto a una cadena de azúcar en un anticuerpo, se reporta que la adición o modificación de fucosa en la N-acetilglucosamina proximal en el extremo reductor en la cadena de azúcar enlazada por N-glucósidos de un anticuerpo, cambia significativamente la actividad de ADCC del anticuerpo (véase documento WO 00/61739). Además, la producción de proteínas terapéuticas recombinantes usando células hospederas establemente diseñadas, ha entrañado tradicionalmente el uso de medios de cultivo complementados con componentes derivados de animales químicamente no definidos, tales como suero o extractos orgánicos. Más allá del problema de la variabilidad de lote a lote, la necesidad de purificar productos lejos de estos contaminantes y la posibilidad de transmisión de un patógeno humano, se eleva cuando se usan estos componentes. Esta sensibilidad ha llegado a ser más aguda en años recientes con el descubrimiento de que la encefalopatía espongiforme bovina (BSE), una enfermedad neurodegenerativa del ganado conocida también como enfermedad de las vacas locas, es indistinguible del virus de Creutzfeld-Jacob (vCJD), que se cree es el patógeno de la enfermedad que afecta a los humanos (Bruce, et al., Nature 389: 498-501 , 1997). De esta manera, muchas agencias reguladoras recomiendan fuertemente el uso discontinuo o limitado de materiales derivados de animales en medios de cultivo de células. Por consiguiente, están ahora disponibles medios químicamente definidos ("CD") para el crecimiento y mantenimiento de células de mamífero que están libres de suero (SF) y/o libres de proteínas derivadas de animales (APF). El inconveniente de los medios CD, es que la mayoría de las líneas de células de producción no se adaptan al crecimiento en los mismos, o crecen lentamente y su producción es muy reducida. Por consiguiente, la línea de células de producción ideal para la fabricación de una proteina terapéutica de glucosilación optimizada, será también capaz de producir proteínas recombinantes con capacidad comercial a gran escala, mientras crecen en medios CD. De esta manera, en la producción industrial de proteínas recombinantes terapéuticas, existe la necesidad de una línea de células capaz de afectar un patrón optimizado de carbohidratos sobre las proteínas expresadas y procesadas desarrolladas en medios libres de suero y/o libres de proteínas, que mejore la eficacia de la proteina y evite la necesidad de procesamiento post-cosecha, por ejemplo, mediante medios enzimáticos, para lograr patrones de glucosilación optimizados (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 6,399,336).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a células, líneas de células y cultivos de células capaces de crecer en medio libre de proteínas animales quimicamente definido, y de producir proteínas terapéuticas derivadas de inmunoglobulina óptimamente glucosiladas. En una modalidad preferida, la linea de células es una línea de células derivada de mieloma de rata YB2/0 adaptada para crecer en medio CD. En una modalidad preferida, las células, líneas de células y cultivos de células de la presente invención producen proteínas recombinantes a aproximadamente 10 mg/L a aproximadamente 10,000 mg/L de medio de cultivo. En otra modalidad, las células, líneas de células y cultivos de células de la presente invención producen proteínas recombinantes a un nivel de aproximadamente 0J pg/célula/día a aproximadamente 100 ng/célula/día. La presente invención provee además métodos para producir por lo menos una proteína, por ejemplo, un anticuerpo o proteína que contiene Fc, de una célula hospedera cultivada de la invención. En una modalidad preferida, las células de la presente invención que expresan por lo menos una proteína deseada se cultivan en un medio químicamente definido, y las proteínas se aislan del medio químicamente definido o de las células mismas. Otra modalidad de la invención comprende un anticuerpo o proteína terapéutica que contiene Fc producido por una línea de células de la invención. El anticuerpo o proteína terapéutica que contiene Fc de la invención puede incluir, o puede derivarse de, cualquier mamífero tal como, pero no limitado a, un humano, un ratón, un conejo, una rata, un roedor, un primate, o cualquier combinación de los mismos, e incluye anticuerpos aislados de humano, primate, roedor, mamífero, quiméricos, humanizados y/o injertados con CDR, así como inmunoglobulinas, productos de digestión y otras porciones especificadas y variantes de los mismos. En un aspecto de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo anti-integrina, un anticuerpo anti-factor tisular, u otro anticuerpo capaz de mostrar unión a un antígeno exhibido en la superficie de una célula dentro de un sujeto, por el cual la reducción o prevención del crecimiento de dichas células in vivo es deseable, y cuya actividad es conferida o mejorada por la producción del anticuerpo en la línea de células de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un esquema que describe un anticuerpo de mamífero subclase de IgG típico, dominios y puntos de glucosilación. Las figuras 2A y 2B muestran una comparación del crecimiento y la viabilidad de líneas de células APF/YB2/0 (C1083B) cultivadas en medios que contienen suero y libres de suero durante generaciones múltiples. Se cultivó C1083B en DMEM + FBS a 5% y en medio CD-Hyb complementado con glutamina 6mM. Las células se hicieron pasar tres veces por semana usando una densidad de siembra de 2-3x105 células/ml: (figura 2A) curva de crecimiento, y (figura 2B) viabilidad. La figura 3 muestra las propiedades de crecimiento relativas de cuatro líneas de células APF-YB2/0 derivadas de C1083B. Se aislaron clones adaptados a medio CD-Hyb mediante dos métodos, es decir, separación (C1083B-1 y C1083B-12) y selección directa (C1083-H18 y C1083-H21). Se cultivaron células en medio CD-Hyb complementado con glutamina 6 mM. Las células se hicieron pasar tres veces por semana usando una densidad de siembra de 2-3x105 células/ml.

La figura 4 es una gráfica que demuestra la toxicidad de la lectina LCA para C1083B después de 5 días. Las figuras 5A y 5B muestran: (figura 5A) la secuencia de nucleótidos del ARN mensajero de futd de rata (GenBank, NM_001002289), con la localización de las series de iniciador y sonda y la expresión del ARN mensajero de futd en variantes de CD1083B marcadas (iniciadores (subrayados) y sondas (en cursivas) diseñadas usando el software 'Primer Express' (Applied Biosystems)), y (figura 5B) análisis por QPCR de ocho líneas de células resistentes a lectina derivadas de C1083B. Cada línea de células se cultivó en DMEM + FBS a 5%, y 1x107 células se cosecharon a la fase exponencial. El nivel de ARN mensajero de futd en cada clon se analizó mediante QPCRP. Las figuras 6A y 6B muestran gráficas de (figura 6A) la densidad de células viables, y (figura 6B) la viabilidad de clones agotados en fucosa derivados de C1083B. Las líneas de células se cultivaron en medios CD-Hyb complementados con glutamina 6 mM. Las figuras 7A y 7B son una representación esquemática de los vectores de expresión de CNTO d60 usados para la generación de las líneas de células: (figura 7A) p2401 es el vector de expresión de la cadena pesada, y (figura 7B) p2402 es el vector de expresión de la cadena ligera. Las figuras 8A y 8B son gráficas que muestran la estabilidad de C1261A, una línea de células que expresa CNTO d60, un anticuerpo antifactor tisular, diseñado a partir de C10d3B con el tiempo. Se sembraron células del pasaje once (a 2x105/ml) por duplicado en medio CD-Hyb (Gibco) en cultivos de matraz de agitación. El crecimiento y los títulos de los anticuerpos se monitorearon en ausencia y presencia de 1x lípido (Gibco). Las figuras 9A y 9B son: (figura 9A) una gráfica de barras que muestra la lisis de células específica de anticuerpos dependiente de la dosis inducida por CNTO 859 y CNTO 860 generados en la línea de mieloma de ratón C463 y la línea de células hospederas YB2/0 C1083B. (figura 9B) Una gráfica de barras que muestra las diferencias de ADCC entre CNTO 860 de C463 en comparación con C10d3B y la línea de células YB2/0 agotada en futd C1083C (A4-3). Las figuras 10A-10C muestran el trazo del registro del análisis de MALDI-TOF-MS de CNTO 660 producido por varias líneas de células; (figura 10A) en C463A, línea de células hospederas YB2/0 de mieloma de rata adaptada APF, (figura 10B) C10d3B, y (figura 10C) línea de células hospederas YB2/0 deficiente en futd, C1063C. Las figuras 11A-11C muestran el trazo del registro del análisis de MALDI-TOF-MS de CNTO 148 producido por varias líneas de células; (figura 11A) en C463A, línea de células hospederas YB2/0 de mieloma de rata adaptada APF, (figura 11 B) C1083B, y (figura 11C) línea de células hospederas YB2/0 deficiente en futd, C1033C. La figura 12 es una gráfica que muestra la dependencia de la concentración y la actividad de ADCC relativa (medida mediante lisis específica de células objetivo) para varios lotes del Mab anti-FNTalfa, CNTO 148 expresado en diferentes células hospederas. La figura 13 muestra el trazo del registro del análisis de MALDI-TOF-MS del Mab anti-CD3 2C11 producido por la línea de células hospederas YB2/0, C10d3A. La figura 14 es una gráfica que muestra la activación de células T medida mediante marcadores de esplenocitos en esplenocitos cosechados de ratones que habían sido dosificados con las varias preparaciones de anticuerpos indicadas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Abreviaturas Ab(s) = anticuerpo(s), policlonal(es) o monoclonal(es); APF = libre de proteínas animales; CD = químicamente definido; CDR = región determinante de complementariedad; Ig = inmunoglobulina; IgG = inmunoglobulina G; Mab = anticuerpo monoclonal; TF = factor tisular. Para los residuos de azúcar: Fue = fucosilo; Gal = galactosilo; Glc = glucosilo; GIcNAc = N-acetilglucosaminilo; Man = manosilo; y NANA = sialil (N-acetilneuraminilo, pero también puede abarcar ácido 5-N-acetilneuramínico (NeuAc) o ácido 5-N-glucolilneuramínico (NeuGc, NGNA) como "ácido siálico"; Mab = anticuerpo monoclonal; MALDI-TOF-MS = ionización por desorción con láser asistida por matriz - tiempo de vuelo - espectrometría de masa.

Definiciones El término "actividad de ADCC" representa citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo, y significa el fenómeno de destrucción de células objetivo mediada por anticuerpos, por células efectoras no sensibilizadas. La identidad de la célula objetivo varia, pero debe tener unida inmunoglobulina G de superficie que tenga un dominio de Fc o porción del dominio de Fc capaz de mostrar activación del receptor de Fc. La célula efectora es una célula "asesina" que posee receptores de Fc. Puede ser, por ejemplo, un linfocito que carece de marcadores de células B o T convencionales, o un monocito, macrófago o leucocito polinuclear, dependiendo de la identidad de la célula objetivo. La reacción es independiente del complemento. La actividad de ADCC de un anticuerpo u otra proteína que contiene Fc de la presente invención es "mejorada", si su capacidad para demostrar destrucción de células mediada por ADCC sobrepasa la capacidad de un anticuerpo o proteína de secuencia sustancialmente similar y dominio de Fc producido por una célula hospedera alternativa. La actividad de ADCC puede determinarse en una prueba in vivo o in vitro estándar de destrucción de células, tal como las pruebas discutidas en la presente. De preferencia, el anticuerpo de la invención que tenga actividad de ADCC mejorada, logra el mismo efecto (prevención o inhibición del crecimiento de células tumorales) a una menor dosis y/o en un tiempo más corto, que un anticuerpo de referencia producido en una célula hospedera alterna. De preferencia, la diferencia entre la potencia de un anticuerpo dentro del alcance de la presente invención y un anticuerpo de referencia, es de por lo menos aproximadamente 1.5 veces, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 2 veces, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 3 veces, muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 5 veces según se determina, por ejemplo, mediante comparación codo a codo en una prueba de ADCC de liberación de cromo estándar seleccionada. Se pretende que el término "anticuerpo" incluya moléculas de anticuerpo enteras, fragmentos de anticuerpo, o proteínas de fusión que incluyan una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina. Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, en general, el dominio variable o de unión al antígeno del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; cuerpos completos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. Dichos fragmentos de anticuerpo pueden ser fusionados a regiones del dominio de Fc de anticuerpos de la misma especie o especies diferentes, o a dominios de Fc modificados o dominios CH2 de anticuerpos (la figura 1 muestra la estructura básica de dichos anticuerpos). El término "línea de células clonadas", "línea de células clonalmente derivadas" o "linea de células clónales", como se usa en la presente, significa una población propagable de células genéticamente idénticas de una linea de células específica que se derivan de una célula progenitora individual. Para las células hospederas derivadas de YB2/0, la linea de células progenitora es una línea de células de mieloma de rata descrita en la patente de E.U.A. No. 4,472,500 y depositada como ATCC CRL 1662. El término "funciones efectoras" de anticuerpos o análogos de anticuerpos, como se usa en la presente, son procesos por los cuales patógenos o células anormales, por ejemplo, células tumorales, son destruidos y removidos del cuerpo. Las respuestas inmunes innata y adaptativa usan la mayoría de los mismos mecanismos efectores para eliminar patógenos, incluyendo ADCC, CA (activación del complemento), unión a C1q, y opsinización. El término "Fc", "proteína que contiene Fc" o "molécula que contiene Fc", como se usa en la presente, se refiere a una proteína dimérica o heterodimérica que tiene por lo menos un dominio CH2 de inmunoglobulina.

Los dominios CH2 pueden formar por lo menos una parte de la región dimérica de la proteína/molécula (por ejemplo, anticuerpo). El término fucosil transferasa o "futd" o "fudasa" se refiere al gen conocido como futd, y el producto génico que tiene actividad de alfa-1 , 6-fucosiltransferasa. Se pretende que el término "proteína terapéutica que contiene Fc", signifique una proteína dimérica o heterodimérica que tiene un dominio de unión al antígeno, una región Fc, o que comprende por lo menos un dominio CH2 de inmunoglobulina, cuyo Fc o porción que comprende CH2 del anticuerpo contiene un residuo de asparagina capaz de ser glucosilado. Como se usa en la presente, el término "célula hospedera" abarca cualquier tipo de sistema celular que puede ser diseñado para generar proteinas, fragmentos de proteína o péptidos de interés, incluyendo anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. Las células hospederas incluyen, sin limitación, células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero derivadas de roedores (ratas, ratones, conejillos de Indias o hámsteres), tales como CHO, BHK, NSO, SP2/0, YB2/0; o tejidos humanos o células de hibridoma, células de levadura y células de insecto, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico o tejido cultivado. El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" o "Mab", como se usa en la presente, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular sustancialmente singular. Una composición de anticuerpo monoclonal exhibe una especificidad y afinidad de unión singular por un epitope particular. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un sitio antigénico singular. Además, en contraste a las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un determinante singular en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, siendo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no se considerará que requiere la producción del anticuerpo mediante algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán de conformidad con la presente invención pueden obtenerse mediante el método de hibridomas descrito primero por Kohier et al., Nature 256: 495 (1975), o pueden obtenerse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,616,567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden aislarse también de colecciones de anticuerpos de fagos usando, por ejemplo, las técnicas descritas en Clarkson ef al., Nature 352: 624-62d (199 1) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 561-597 (1991). Los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente en la presente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la cadena es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, asi como fragmentos de dichos anticuerpos, en tanto exhiban la actividad biológica deseada (véase la patente de E.U.A. No. 4,816,567, y Morrison ef al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81 : 6851-6d55 (1984)). Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino) son anticuerpos quiméricos que tienen porciones de secuencia sustancialmente reemplazadas que se derivaron de inmunoglobulinas no humanas. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpos del receptor) en las cuales los residuos de la región hipervariable (los cuales se conocen también como las regiones determinantes de complementariedad o CDR) del receptor son reemplazados por residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpos del donador), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo del receptor o en al anticuerpo del donador. Estas modificaciones se hacen para refinar además el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos un dominio variable, y típicamente dos dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana, y todos o sustancialmente todos los residuos de la FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de una inmunoglobulina G humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature 321 : 522-525 (1966); Reichmann ef al., Nature 332: 323-329 (19dd); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Como se usa en la presente, el término "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene regiones variables y/o constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana. Un anticuerpo humano se "deriva de" una secuencia de línea germinal particular, si el anticuerpo se obtiene de un sistema que usa secuencias de inmunoglobulina humana, por ejemplo, inmunizando a un ratón transgénico que posea genes de inmunoglobulina humana, o identificando una colección de genes de inmunoglobulina humana, y en donde el anticuerpo humano seleccionado es por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, aun más preferiblemente por lo menos 96%, 97%, 9d% o 99% idéntico en secuencia de aminoácidos, a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro, o mediante mutación somática in vivo) y, en lo que respecta a las secuencias hipervariables o secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR), son determinantes únicos de la especificidad del anticuerpo y no codificados en la línea germinal, y estas regiones deben excluirse del análisis de identidad de secuencia. El término "anticuerpo recombinante", como se usa en la presente, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aislan mediante medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que sea transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado de los mismos (descrito más adelante), (b) anticuerpos aislados de una célula hospedera transformada que expresa el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una colección combinatoria recombinante de anticuerpos humanos, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana u otras secuencias de ADN. Los anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Sin embargo, en ciertas modalidades, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de inmunoglobulina humana, a mutagénesis somática in vivo), y de esta manera las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, mientras que se derivan de, y se relacionan con, secuencias de VH y VL de línea germinal humana, pueden no existir en forma natural in vivo dentro del repertorio de anticuerpos de la línea germinal humana. Se pretende que el término "anticuerpo aislado", como se usa en la presente, se refiera a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente al factor tisular, está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos menos el factor tisular). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítope, isoforma o variante del factor tisular humano puede mostrar, sin embargo, reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otra especie (por ejemplo, homólogos de especie del factor tisular). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos. En una modalidad de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" que tienen diferentes especificidades, se combina en una composición bien definida. Se pretende que el término "molécula biespecífica" incluya cualquier agente, por ejemplo, una proteina, péptido o complejo de proteína o péptido, que tiene dos diferentes especificidades de unión. Por ejemplo, la molécula puede unirse a, o puede interactuar con, (a) un antígeno de la superficie de la célula, y (b) un receptor de Fc en la superficie de una célula efectora. Se pretende que el término "molécula multiespecífica" o "molécula heteroespecífica" incluya cualquier agente, por ejemplo, una proteína, péptido o complejo de proteína o péptido, que tenga más de dos diferentes especificidades de unión. Por ejemplo, la molécula puede unirse a, o puede interactuar con, (a) un antígeno de la superficie de la célula, (b) un receptor de Fc en la superficie de una célula efectora, y (c) por lo menos algún otro componente. Por consiguiente, la ¡nvención incluye, pero no está limitada a, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecificas y otras moléculas multiespecificas que son dirigidas hacia una proteína objetivo que puede ser un receptor de la superficie de la célula o un ligando para dicho receptor, y hacia otros objetivos, tales como receptores de Fc en células efectoras. Como se usa en la presente, el término "heteroanticuerpos" se refiere a dos o más anticuerpos, fragmentos de unión a anticuerpo (por ejemplo, Fab), derivados de los mismos, o regiones de unión a antígeno enlazadas, por lo menos dos de los cuales tienen diferentes esepecificidades. Estas diferentes especificidades incluyen una especificidad de unión por un receptor de Fc en una célula efectora, y una especificidad de unión por un antígeno o epítope en una célula objetivo, por ejemplo, una célula tumoral. Una proteína terapéutica derivada de inmunoglobulina óptimamente glucosilada comprende proteinas recombinantes que comprenden una región CH2 humana o región CH2 derivada de humano que tiene sitios de glucosilación N-enlazados, cuyos sitios son ocupados por un glucano que confiere capacidad alterada (relativamente intensificada o disminuida) de dicha proteina terapéutica para inducir mecanismos inmunes celulares in vivo conocidos en conjunto como funciones efectoras. Para obtener productos biofarmacéuticos, se requiere una línea de células de producción capaz de mostrar expresión eficiente y reproducible de un polipéptido recombinante. La línea de células es estable y puede depositarse en un banco. La línea de células es capaz de crecer a alta densidad, es decir, a concentraciones mayores de 500,000 (5 X 105) células por ml, de preferencia mayores de 1 millón (1 X 106) de células por ml o más de cultivo. Una variedad de líneas de células hospederas puede usarse para este propósito. Puesto que el entendimiento de las complejidades de cómo la maquinaria celular influye sobre la cantidad final y composición de un producto bioterapéutico, la selección de una línea de células hospederas que impartirá los atributos necesarios para la producción y la composición del producto, llega a ser más evidente. La patente de E.U.A. No. 4,472,500 describe una linea de células de mieloma de rata útil como un miembro de fusión de hibridoma y con estabilidad y capacidad de producción superiores. La última línea de células ha sido designada diversamente como YO, YB2 AgO, célula YB2/3HL.P2.G11 J6Ag.20, o YB2/0 (ATCC CRL 1662), y en lo sucesivo será referida como YB2/0. Lifely ef al. (1995 Glycobiology 5: 813-d22) compararon la composición de la cadena de azúcar unida a CAMPATH-1 H, un anticuerpo de lgG1 humana injertada con CDR, producido por una línea de células CHO, célula NSO o células YO (YB2/0) de mieloma de rata. Además, se evaluó la actividad de ADCC. Se reportó que CAMPATH-1H producido por células YO mostró la actividad de ADCC más alta y tuvo el contenido más alto de N-acetilglucosamina (GIcNAc) en la posición de bisección en los oligosacáridos N-enlazados (cuadro A). Esto es porque la glucosil transferasa que añade una GIcNAc de bisección a varios tipos de oligosacáridos N-enlazados, GIcNAc-transferasa lll (GnT lll), no está presente normalmente en células CHO (Stanley y Campell, 19d4, J. Biol. Chem. 261 : 13370-13376). Otros esfuerzos por incrementar las capacidades de ADCC de anticuerpos terapéuticos, tales como C2Bd, rituximab, se han enfocado en el diseño de líneas de células hospederas con niveles optimizados de enzimas GnT (Umana et al., documento US6602684). Los últimos inventores descubrieron además que la sobreexpresión de GnT lll a altos niveles llevó a la inhibición del crecimiento, y fue tóxica para las células, como fue la sobreexpresión de GnT V, una glucosil transferasa distinta. De esta manera, la viabilidad y productividad reducidas de las células puede ser una característica general de la sobreexpresión de la glucosiltransferasa que modifica las glucoproteínas. El cuadro A muestra las estructuras de oligosacáridos biantenarios dominantes asociadas con anticuerpos recombinantes derivados de células de mamífero o naturales. Se han identificado las siguientes estructuras de azúcar abreviadas: Fue = fucosa; Gal = galactosa; Glc = glucosa; GIcNAc = N-acetilglucosamina; Man = mañosa; y NANA* = ácido sialil (N-acetilneuraminico).

CUADRO A Man Man GlcNAc GlcNAc 1 Man Gl NAc Man Man GlcNAc GlcNAc 2 GlcNAc Man JILNAC Man Gal Man GlcNAc GlcNAc 3 GlcNAc Man Gal UJUN/?c ivian Man GlcNAc GlcNAc 4 Gal " GlcNAc Man Ga) UICIM C ivjan Gal Man GlcNAc GlcNAc 5 G l - GlcNAc Man Gal Gal UICJ ?C jvjan Man GlcNAc Glc Ac 6 Gal Gal GlcNAc Man Gal IC1 AC ivian Sia Man GlcNAc GlcNAc 7 Gal - GlcNAc Man Sia Gal UICIM?C ivjan Man GlcNAc GIcNAc 8 Sia Gal GIcNAc Man Gl NAc ' Man GlcNA Man (JlcNAc GlcNAc 9 GlcNAc Man JJCNAC " Man Gal GlcNAc Man GlcNAc GlcNAc 10 GlcNAc Man Gal UJCJNAC iviají GlcNAc Man GIcNAc GlcNAc 1 1 Gal - GlcNAc Man - Gal UICJ AC JVjail Gal - GlcNAc Man GlcNAc GlcNAc 12 • Gal • GlcNAc Man Gal Gal UICJSAC iviaii GlcNAc Man GlcNAc GlcNAc 13 Gal Gal GlcNAc Man Gal UICÍNAC ivjaii Sia Gl NA Man GlcNAc GlcNAc 14 Gal • GlcNAc Man Sia Gal UICINAC ivjan GlcNAc Man GlcNAc GlcNAc 15 Sia Gal - GlcNAc Man Man Fue Man GlcNAc GlcNAc 16 Man GlcNAc Man Fue Man GlcNAc GlcNAc 17 GlcNAc Man Fue r GlcNAc Man Gal Man GlcNAc GlcNAc 18 *- GlcNAc Man Gal GlcNAc Man Fue Man GlcNAc GlcNAc 19 Gal GlcNAc Man Gal GlcNAc Man Fue Gal Man GlcNAc GlcNAc 20 Gal GlcNAc Man Gal Gal GlcNAc Man Fue Man GlcNAc GlcNAc 21 Gal Gal GlcNAc Man r Gal GlcNAc Man Fue Sia i Man GlcNAc GlcN I Ac 22 Gal GlcNAc Man Sia Gal GlcNAc Man Fue Man GlcNAc GlcNAc 23 Sia Gal GlcNAc Man GlcNAc Man Fue GlcNAc • Man GlcNAc GlcNAc 24 GlcNAc Man Fue r GlcNAc Man Gal GlcNAc • Man GlcNAc GlcNAc 25 GlcNAc Man Gal- GlcNAc Man Fue GlcNAc " Man Glc Ac GlcNAc 26 Gal" GlcNAc Man Gal" GlcNAc — Man Fue Gal GlcNAc ' Man GlcNAc GlcNAc 27 Gal- GlcNAc — Man Gal" Gal- GlcNAc Man Fue GlcNAc " Man GlcNAc GlcNAc 28 Gal- Gal- GlcNAc Man Gal" GIcNAc — Man Fue Sia GlcNAc Man GlcNAc GlcNAc 29 Gal' GlcNAc — Man Sia Gal- GlcNAc — Man Fue GlcNAc Man GlcNAc GlcNAc 30 Sia Gal" GlcNAc — Man Man Man Man GlcNAc GlcNAc 31 Man Man Man Man Man GlcNAc GlcNAc 32 Man Man Man Man Man GlcNAc GlcNAc 33 Man Man Man Man Man Man GlcNAc GlcNAc 34 Man - Man Man Man Man Man Man Man GlcNAc GlcNAc 35 Man " Man Man Man Man Man Man Man Man GlcNAc ' GlcNAc 36 Man ' Man Man Una segunda observación acerca de la composición de oligosacáridos de un Mab producido por las varias células hospederas (véase Lifely, citado anteriormente), fue que los Mabs producidos por células CHO y NSO tuvieron oligosacáridos predominantemente fucosilados (cuadro A, estructuras 16-30), mientras que los Mabs producidos por YB2/0 tuvieron un patrón más complejo que incluyó más estructuras no fucosiladas (cuadro A; estructuras 1-15 y 31-36).

Después de esta observación, se ha mostrado que la enzima responsable de la fucosilación de las estructuras de oligosacáridos N-enlazados, la alfa-1 , 6-fucosil transferasa, el producto génico de futß y referida también como "fudasa", fue menor en células YB2/0 que en las líneas de células CHO o NSO. De esta manera, el gen futd puede ser manipulado en líneas de células hospederas con efecto similar (Shinkawa, ef al., 2003 J. Biol. Chem., 27d: 3466-3473; documento EP1176195A1). Además, las contribuciones relativas de la galactosilación de los oligosacáridos biantenarios, la presencia de GIcNac de bisección, y la fucosilación, indican que los Mabs no fucosilados exhiben una mayor capacidad para intensificar la ADCC medida in vitro e in vivo que otras modificaciones a las estructuras de oligosacáridos biantenarios N-enlazados (Shields, ef al., 2002. J Biol Chem. 277: 26733-40; Ninwa, et al., 2004. Cáncer Res. 64: 2127-2133).

Desarrollo de lineas de células con propósito dirigido El desarrollo de líneas de células de producción implica típicamente la transfección de genes de anticuerpos en líneas de células hospederas (tales como el mieloma de ratón Sp2/0, Sp2/0 adaptado con CD (C463) y NS/0), y el aislamiento de transfectomas que expresan altos niveles del anticuerpo deseado. En algunos casos, por ejemplo, el anticuerpo cA2, en donde el anticuerpo terapéutico actúa para neutralizar la molécula biológica objetivo, el anticuerpo funciona uniéndose y después agotando el FNT-a circulante. En otros casos, el anticuerpo funciona eligiendo como objetivo células cancerosas que sobreexpresan un antígeno particular, por ejemplo, el factor tisular. Mientras que la unión del anticuerpo al factor tisular neutraliza la actividad del factor tisular, las células cancerosas son destruidas mediante vías de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) activadas por el reconocimiento del Fc unido. La ADCC, un ataque lítico en células elegidas como objetivo por anticuerpos, es desencadenada tras la unión de los receptores linfocíticos, Fc?Rs, a la región constante (Fc) de los anticuerpos.

Composiciones de la invención La presente invención se refiere a lineas de células de mieloma clónales que tienen la capacidad de crecer continuamente en medios CD. En una modalidad, la línea de células de mieloma clónales es un mutante espontáneo clonado de un banco de células YB2/0, retirando gradualmente el cultivo de medios CD-Hyb complementados con FBS (CD-Hibridoma, Gibco) durante seis pasajes. En esta modalidad, la linea de células de mieloma clónales es designada como C10d3B. La caracterización de C1063B reveló que la línea de células tiene muchas características de crecimiento únicas no asociadas con las células YB2/0 progenitoras. Por ejemplo, la línea de células C1063B puede congelarse y descongelarse en ausencia de suero, un agente de criopreservación necesario para las líneas de células progenitoras YB2/0. Además, a diferencia de las líneas progenitoras, C1063B puede crecer a alta densidad de células en medios CD. Una mayor caracterización demostró que la línea de células C1083B desarrollada en medios CD, exhibe parámetros de crecimiento que incluyen densidad de células viables y tiempo de duplicación que son similares o superiores a los observados cuando las células se mantienen en medio de crecimiento complementado con suero. Un segundo subclon de C1083A, designado como C10d3E, se seleccionó por expansión de un cultivo de células C1063A directamente en medio CD-Hyb complementado sólo con glutamina 6 mM por tres semanas. En otra modalidad, la línea de células de mieloma clónales se deriva de un banco de células C10d3B mediante selección con medio CD complementado con lectina. La lectina usada en este caso es aglutinina de Lens culinaris (LCA); sin embargo, cualquiera de las dos lectinas específicas de fucosa puede usarse para la selección. En esta modalidad, las líneas de células de mieloma clónales se designan como C10d3C y C10d3D. La caracterización del crecimiento de C10d3C y C10d3D demostró que son comparables a C10d3B en medio CD-Hyb. Por lo tanto, las células C10d3B y sus derivados son capaces de mostrar mantenimiento, crecimiento y proliferación in vitro indefinidos. Las células C1063B proliferan, pueden ser subcultivadas (es decir, pueden hacerse pasar repetidamente en nuevos recipientes de cultivo), y pueden ser criopreservadas con el tiempo (por ejemplo, almacenadas en la fase de vapor de nitrógeno líquido con un crioconservador, tal como sulfóxido de dímetilo a 10% o glicerol). Las células C10d3B pueden mantenerse en cultivo a largo plazo como una línea de células.

En su mayor parte, las células de la invención se desarrollan en cualquier recipiente, matraz, placa de cultivo de tejidos o dispositivo usado para el cultivo de células, que provea un ambiente adecuadamente estéril capaz de mostrar intercambio de gases. Típicamente, un cultivo fundador usado en la invención, es uno en el cual las células se remueven de una existencia de células C10d3B progenitora existente, se ponen en un recipiente de cultivo en una mezcla de medio que contenga suero y medio libre de suero, y después se hace pasar a un estado libre de suero como se describe en detalle en la presente. En una modalidad preferida, las células, lineas de células y cultivos de células de la presente invención, pueden producir una inmunoglobulina o fragmento de la misma derivado de un roedor o un primate. Más específicamente, la inmunoglobulina o fragmento de la misma puede derivarse de un ratón o un humano. En forma alternativa, la inmunoglobulina o fragmento de la misma puede ser quimérica o diseñada. Por supuesto, la presente invención contempla además células, líneas de células y cultivos de células que producen una inmunoglobulina o fragmento de la misma que es inmunizado, injertado con CDR, exhibido por fagos, producido por ratones transgénicos, optimizado, mutagenizado, distribuido al azar o recombinado. La clase o el isotipo de anticuerpos (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) son conferidos por las regiones constantes que son codificadas por genes de la región constante de la cadena pesada. Entre la clase de IgG humana, existen cuatro subclases o subtipos: lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4 nombrados en orden de su abundancia natural en el suero, partiendo de más alta a más baja. Los anticuerpos de IgA se encuentran como dos subclases, lgA1 e lgA2. Como se usa en la presente, el término "cambio de isotipo" se refiere también a un cambio entre subclases o subtipos de IgG. Las células, líneas de células y cultivos de células de la presente invención pueden producir una inmunoglobulina o fragmento de la misma que incluye, pero no está limitado a, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 , lgA2, slgA, IgD, IgE, y cualquier análogo estructural o funcional de las mismas. En una modalidad específica, la inmunoglobulina expresada en las células, líneas de células y cultivos de células de la presente invención es CNTO d60 (dominio variable de cCLBd fusionado a dominios constantes derivados de hulgGI de humano). La presente invención provee además células, líneas de células y cultivos de células que expresan una inmunoglobulina o fragmento de la misma capaz de mostrar glucosilación en un dominio CH2 que se une a un antigeno, una citocina, una integrina, un anticuerpo, un factor de crecimiento, una proteina del ciclo celular, una hormona, un neurotransmisor, un receptor o proteína de fusión del mismo, una proteína sanguínea, cualquier fragmento de la misma, y cualquier análogo estructural o funcional de cualquiera de los anteriores. En una modalidad preferida, la inmunoglobulina, fragmento o derivado de la misma, se une a un antígeno en la superficie de una célula objetivo. En una modalidad particularmente preferida, la célula objetivo es una célula tumoral, una célula de la vasculatura del tumor, o una célula inmune. En una modalidad específica, la inmunoglobulina, fragmento o derivado de la misma, se une al factor tisular. Un ejemplo del anticuerpo anti-factor tisular de la invención es CNTO 860 producido por la linea de células designada como C1261. En otra modalidad, las células, líneas de células y cultivos de células de la presente invención pueden expresar detectablemente una proteína de fusión que comprenda una hormona o factor de crecimiento. Ejemplos de los factores de crecimiento contemplados por la presente invención incluyen, pero no están limitados a, un factor de crecimiento humano, un factor de crecimiento derivado de plaquetas, un factor de crecimiento epidérmico, un factor de crecimiento de fibroblastos, un factor de crecimiento nervioso, una gonadotropina coriónica humana, una eritropoyetina, una trombopoyetina, una proteína morfogénica ósea, un factor de crecimiento transformante, un factor de crecimiento tipo insulina o un péptido tipo glucagon, y cualquier análogo estructural o funcional de los mismos. Los anticuerpos aislados de la invención incluyen aquellos que tienen isotipos de anticuerpo con actividad de ADCC, especialmente lgG1 humana (por ejemplo, lgG1? e IgGl?), y menos preferidos son lgG2 e lgG3, o isotipos híbridos que contienen residuos alterados en residuos específicos en los dominios de Fc, son sus contrapartes de otra especie. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de longitud completa (por ejemplo, lgG1), o pueden incluir sólo una porción de unión a antígeno y una porción Fc o dominio capaz de inducir funciones efectoras que incluyen ADCC, activación de complemento y unión a C1q. Además, el fragmento de inmunoglobulina producido por las células, lineas de células y cultivos de células de la presente invención puede incluir, pero no está limitado a, Fc u otro dominio CH2 que contenga estructuras y cualquier análogo estructural o funcional del mismo. En una modalidad, el fragmento de inmunoglobulina es un polipéptido de fusión de dominio del receptor dimérico. En una modalidad específica, el polipéptido de fusión de dominio del receptor dimérico es etanercept. Etanercept es una molécula receptora de FNTa soluble recombinante que se administra subcutáneamente y se une al FNTa en el suero del paciente, haciéndolo biológicamente inactivo. Etanercept es una proteína de fusión dimérica que consiste de la porción de unión a ligando extracelular del receptor del factor de necrosis tumoral (FNTR) de 75 kilodaltons (p75) de humano enlazada a la porción Fc de la lgG1 humana. El componente Fc de etanercept contiene el dominio CH2, el dominio CH3 y la región de gozne, pero no el dominio CH1 de la lgd . Otros productos sujetos a fabricación usando líneas de células de la invención, incluyen proteínas terapéuticas o profilácticas fabricadas comúnmente por otros tipos de líneas de células animales, y que tienen un dominio CH2 capaz de ser glucosilado. Particularmente preferidas son aquellas proteínas terapéuticas glucosiladas que contienen al dominio CH2 que se unen a antígenos objetivo sobre la superficie de una célula, cuyo tipo de célula es deseable que se incapacite o se elimine del cuerpo. Muchos de dichos anticuerpos terapéuticos son diseñados para que contengan la lgG1 humana, especialmente la cadena pesada de la lgG1 kappa, que comprende un dominio CH1, CH2 y CH3 humano. Dichas proteinas terapéuticas incluyen, pero no están limitadas a: Infliximab, vendida ahora como REMICADE®. Infliximab es un anticuerpo monoclonal de lgG1? quimérico con un peso molecular aproximado de 149,100 daltons. Se compone de las regiones variable de murino y constante de humano. Infliximab se une específicamente al factor de necrosis tumoral alfa (FNT(alfa)) humano, con una constante de asociación de 1010M"1. Infliximab neutraliza la actividad biológica del FNT(alfa) por unión con alta afinidad a las formas soluble y de transmembrana del FNT(alfa), e inhibe la unión del FNT(alfa) con sus receptores. Las células que expresan al FNT(alfa) de transmembrana unido por infliximab, pueden ser lisadas in vitro o in vivo. Infliximab se indica para el tratamiento de artritis reumatoide, enfermedad de Crohn y espondilitis anquilosante. Infliximab se administra a dosis de 3 a 5 mg/kg dadas como una infusión intravenosa seguida de dosis similares adicionales a 2, 6 y/u d semanas después y a intervalos de cada d semanas, dependiendo de la enfermedad que se va a tratar. Daclizumab (vendido como ZENAPAX® es un anticuerpo monoclonal de lgG1 humanizado inmunosupresor producido mediante tecnología de ADN recombinante, que se une específicamente a la subunidad alfa (subunidad p55 alfa, CD25 o Tac) del receptor de interleucina-2 (IL-2) de alta afinidad de humano que es expresado sobre la superficie de linfocitos activados. Daclizumab es un anticuerpo quimérico de ratón-humano injertado con regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las secuencias humanas se derivaron de los dominios constantes de lgG1 humana y las regiones de estructura variables del anticuerpo de mieloma Eu. Las secuencias de murino se derivaron de las CDRs de un anticuerpo anti-Tac de murino. Daclizumab se indica para la profilaxis del rechazo agudo de órganos en pacientes que reciben trasplantes renales, y se usa generalmente como parte de un régimen inmunosupresor que incluye ciclosporina y corticosteroides. Basiliximab (vendido como SIMULECT®) es un anticuerpo monoclonal quimérico (de murino/humano) producido mediante tecnología de ADN recombinante, que funciona como un agente inmunosupresor, uniéndose específicamente a, y bloqueando, la cadena alfa del receptor de interleucina-2 (IL-2R(alfa), conocido también como antigeno CD25) sobre la superficie de linfocitos T activados. Con base en la secuencia de aminoácidos, el peso molecular calculado de la proteina es de 144 kilodaltons. Es una glucoproteína obtenida de la fermentación de una linea de células de mieloma de ratón estabilizada diseñada genéticamente que expresa plásmidos que contienen los genes de la región constante de la cadena ligera y pesada humana (lgG1) y los genes de la región variable de la cadena ligera y pesada de ratón que codifican para el anticuerpo RFT5 que se une selectivamente a la IL-2R(alfa). Basiliximab se indica para la profilaxis del rechazo agudo de órganos en pacientes que reciben trasplante renal cuando se usa como parte de un régimen inmunosupresor que incluye ciclosporina y costicosteroides. Adalimumab (vendido como HUMIRA®) es un anticuerpo monoclonal de lgG1 de humano recombinante específico para el factor de necrosis tumoral (FNT) humano. Adalimumab se creó usando tecnología de exhibición de fagos que resulta en un anticuerpo con regiones variables de la cadena ligera y pesada derivadas de humano y regiones constantes de lgG1 kappa humana. HUMIRA® se indica para reducir signos y síntomas e inhibir la progresión de daño estructural en pacientes adultos con artritis reumatoide moderadamente a severamente activa que han tenido una respuesta inadecuada a uno o más DMARDs. HUMIRA® puede usarse solo o en combinación con MTX u otros DMARDs. Rituximab (vendido como RITUXAN®) es un anticuerpo monoclonal de humano/murino quimérico diseñado genéticamente, dirigido contra el antígeno CD20 presente sobre la superficie de linfocitos B normales y malignos. El anticuerpo es una inmunoglobulina de lgG1 kappa que contiene secuencias de la región variable de la cadena ligera y pesada de murino y secuencias de la región constante de humano. Rituximab tiene una afinidad de unión por el antígeno CD20 de aproximadamente 8.0 nM. Rituximab se indica para el tratamiento de pacientes con linfoma no de Hodgkin de células B positivo para CD20, recurrente o refractario, de bajo grado o folicular. RITUXAN® se administra en infusión IV de 375 mg/m 2 una vez por semana por 4 u d dosis.

Trastuzumab (vendido como HERCEPTIN®) es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se une selectivamente con alta afinidad en una prueba basada en células (Ka = 5 nM), al dominio extracelular de la proteína del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano, HER2. El anticuerpo es una lgG1 kappa que contiene regiones de estructura humanas con las regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo de murino (4D5) que se une a HER2. HERCEPTIN se indica como terapia con agente individual para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico cuyos tumores sobreexpresan la proteína HER2, y quienes han recibido uno o más regimenes de quimioterapia para su enfermedad metastásica. HERCEPTIN® en combinación con paclitaxel se indica para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico cuyos tumores sobreexpresan la proteína HER2, y quienes no han recibido quimioterapia para su enfermedad metastásica. La dosificación recomendada es una dosis de carga inicial de 4 mg/kg de trastuzumab administrados como una infusión por 90 minutos y una dosis de mantenimiento semanal de 2 mg/kg de trastuzumab que puede administrarse como una infusión por 30 minutos si la dosis de carga inicial fue bien tolerada. Alemtuzumab (vendido como CAMPATH®) es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante (Campath-1 H) que es dirigido contra la glucoproteína de superficie de la célula de 21 a 28 kD, CD52. Alemtuzumab se une a CD52, un antígeno no modulador que está presente sobre la superficie de esencialmente todos los linfocitos B y T, una mayoría de monocitos, macrófagos y células NK, una subpoblación de granulocitos, y tejidos del sistema reproductor masculino. El anticuerpo Campath-1 H es una lgG1 kappa con regiones constantes y de estructura variables de humano, y regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo monoclonal de murino (rata) (Campath-1 G). Campath se indica para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL) en pacientes que han sido tratados con agentes alquilantes, y en quienes ha fallado la terapia con fludarabina. La determinación de la eficacia de Campath se basa en regímenes de respuesta generales. Campath se administra inicialmente a 3 mg administrados diariamente como una infusión IV por 2 horas; una vez tolerada, la dosis diaria debe aumentarse a 10 mg, y debe continuarse hasta que sea tolerada. Una vez que se tolera este nivel de dosis, la dosis de mantenimiento de 30 mg de Campath puede iniciarse y administrarse tres veces por semana por hasta 12 semanas. En la mayoría de los pacientes, el aumento a 30 mg puede lograrse en 3 a 7 días. Omalizumab (vendido como XOLAIR®) es un anticuerpo monoclonal de lgG1 (kappa) humanizado recombinante que se une selectivamente a la inmunoglobulina E (IgE) humana. Omalizumab inhibe la unión de la IgE al receptor de IgE de alta afinidad (Fc(épsilon)RI) sobre la superficie de células cebadas y basófilos. La reducción en la IgE unida a la superficie en células que poseen Fc(épsilon)RI, limita el grado de liberación de mediadores de la respuesta alérgica. El tratamiento con omalizumab, reduce también el número de receptores de Fc(épsilon)RI en los basófilos de pacientes atópicos. Omalizumab se indica para adultos y adolescentes (de 12 años de edad y mayores) con asma persistente de moderado a severo, quienes tengan una prueba de piel positiva o reactividad in vitro a un aeroalérgeno perenne, y cuyos síntomas son controlados inadecuadamente con corticosteroides inhalados. Omalizumab se administra subcutáneamente cada 2 ó 4 semanas a una dosis de 150 a 375 mg. Efalizumab (RAPTIVA®) es un anticuerpo monoclonal de isotipo de lgG1 kappa humanizado recombinante inmunosupresor que se une a CD11a de humano. Efalizumab se une a CD11a, la subunidad (alfa) del antígeno 1 de función en leucocitos (LFA-1) que es expresado en todos los leucocitos, y disminuye la expresión de CD11a en la superficie de la célula. Efalizumab inhibe la unión de LFA-1 a la molécula 1 de adhesión intercelular (ICAM-1), inhibiendo de esta manera la adhesión de los leucocitos a otros tipos de células. La interacción entre LFA-1 e ICAM-1 contribuye al inicio y el mantenimiento de procesos múltiples, que incluyen activación de linfocitos T, adhesión de linfocitos T a células endoteliales, y migración de linfocitos T hacia sitios de inflamación que incluyen piel psoriática. La activación y el tráfico de linfocitos hacia la piel, desempeña una función en la fisiopatología de la psoriasis crónica en placa. En la piel psoriática, la expresión de ICAM-1 en la superficie de la célula es sobrerregulada en el endotelio y los queratinocitos. CD11a es también expresada sobre la superficie de linfocitos B, monocitos, neutrófilos, células asesinas naturales y otros leucocitos. Por lo tanto, existe el potencial para que efalizumab afecte la activación, adhesión, migración y el número de células menos linfocitos T. La dosis recomendada de RAPTIVA® es una dosis de acondicionamiento SC de 0.7 mg/kg individual seguida de dosis SC semanales de 1 mg/kg (la dosis individual máxima no excede un total de 200 mg). En otra modalidad, una línea de células de la invención es establemente transfectada o de otra manera diseñada para expresar un polipéptido no derivado de inmunoglobulina. En otra modalidad, las células, líneas de células y cultivos de células de la presente invención pueden expresar detectablemente una proteína sanguínea recombinante u otra proteína de tejido conectivo. Dichas proteínas recombinantes incluyen, pero no están limitadas a, una eritropoyetina, una trombopoyetina, un activador de plasminógeno tisular, un fibrinógeno, una hemoglobina, una transferrina, una albúmina, una proteína C, colágena, y cualquier análogo estructural o funcional de los mismos. En una modalidad específica, las células, líneas de células y cultivos de células de la presente invención expresan activador de plasminógeno tisular. Los ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos y las proteínas de esta invención pueden derivarse de varias formas bien conocidas en la técnica. En un aspecto, los anticuerpos se obtienen convencionalmente de hibridomas preparados inmunizando un ratón con los péptidos de la invención. Los anticuerpos pueden obtenerse de esta manera usando cualquiera de las técnicas de hibridoma bien conocidas en la materia; véase, por ejemplo, Ausubel, ef al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1967-2001); Sambrook, ef al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow y Lañe, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (19d9); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan ef al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001), cada una de estas citas siendo incorporada en la presente como referencia. En otro método conveniente para derivar la porción de unión al objetivo del anticuerpo, tipicamente los dominios de la cadena pesada variable y/o la cadena ligera variable de un anticuerpo, estas porciones se seleccionan de una colección de dichos dominios de unión creados, por ejemplo, en una colección de fagos. Puede crearse una colección de fagos insertando una colección de oligonucleótidos al azar o una colección de polinucleótidos que contengan secuencias de interés, tales como de células B de un animal o humano inmunizado (Smith, G. P. 1965. Science 22d: 1315-1317). Las colecciones de fagos y anticuerpos contienen pares de la región variable de la cadena pesada (H) y de la cadena ligera (L) en un fago que permite la expresión de fragmentos Fv de cadena sencilla o fragmentos Fab (Hoogenboom, ef al., 2000, Immunol. Today, 21(d): 371-8). La diversidad de una colección de fagémidos puede manipularse para incrementar y/o alterar las inmunoespecificidades de los anticuerpos monoclonales de la colección para producir y después identificar anticuerpos monoclonales humanos deseables adicionales. Por ejemplo, los genes que codifican para moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada (H) y cadena ligera (L) pueden mezclarse al azar (pueden ser entremezclados) para crear nuevos pares de HL en una molécula de inmunoglobulina ensamblada. Además, los genes que codifican para la cadena H y L, o cualquiera de las mismas, pueden ser mutagenizados en una región determinante de complementariedad (CDR) de la región variable del polipéptido de inmunoglobulina, y después pueden seleccionarse para capacidades deseables de neutralización y afinidad. Pueden crearse también sintéticamente colecciones de anticuerpos seleccionando una o más secuencias de estructura humanas, e introduciendo colecciones de cassettes de CDR derivados de repertorios de anticuerpos humanos o a través de variación diseñada (Kretzschmar y von Ruden 2000, Current Opinión in Biotechnology, 13: 598-602). Las posiciones de diversidad no se limitan a CDRs, y pueden incluir también los segmentos de estructura de las regiones variables, o pueden incluir menos que regiones variables de anticuerpos, tales como péptidos. Otras colecciones de componentes de unión al objetivo que pueden incluir menos que regiones variables de anticuerpo, son las exhibiciones de ribosomas, exhibiciones de levaduras y exhibiciones de bacterias. La exhibición de ribosomas es un método para traducir moléculas de ARN mensajero en sus proteínas cognadas, mientras se mantiene la proteína unida al ARN. El ácido nucleico que codifica para la secuencia se recupera mediante RT-PCR (Mattheakis, L. C. et al., 1994. Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 91 , 9022). La exhibición de levaduras se basa en la construcción de proteínas de fusión del receptor de adhesión de levaduras de alfa-aglutinina asociado con la membrana, agal y aga2, una parte del sistema tipo apareamiento (Broder, ef al., 1997. Nature Biotechnology, 15: 553-7). La exhibición de bacterias se basa en la fusión del objetivo a proteinas bacterianas exportadas que se asocian con la membrana celular o la pared celular (Chen y Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79: 496-503). En comparación con la tecnología de hibridomas, los métodos de exhibición de fagos y otros métodos de exhibición de anticuerpos brindan la oportunidad de manipular la selección contra el antígeno objetivo in vitro, y sin la limitación de la posibilidad de que el hospedero afecte al antigeno, o viceversa.

Procedimiento de producción Una vez establecida como establemente transfectada, la línea de células YB2/0 de la invención puede criopreservarse y recuperarse para empezar un ciclo de producción. Típicamente, la linea de células se deposita en un banco a 1x107 células por vial en medio CD-Hibridoma complementado con DMSO a 10%. Al inicio de un ciclo de producción, un vial de células es descongelado, el contenido transferido a un matraz que contenga 10 ml de medios CD-Hibridoma, y el matraz incubado a 37°C/C02 a 5%. Después, el cultivo se expande en un recipiente más grande, el cual a su vez es transferido a un biorreactor de perfusión de capacidad deseada (Deo et al., 1996. Biotechol. Prog. 12: 57-64). Por ejemplo, las líneas de células de mieloma clónales de la presente invención puede manipularse para producir proteínas recombinantes a un nivel de aproximadamente 0.01 mg/L a aproximadamente 10,000 mg/L de medio de cultivo. En otra modalidad, las líneas de células de mieloma clónales de la presente invención pueden manipularse para producir proteínas recombinantes a un nivel de aproximadamente 0J pg/célula/día a aproximadamente 100 ng/célula/día. Los medios de cultivo o medios de crecimiento útiles en la presente invención que sustentan la expansión y el mantenimiento de células C1083B-E de la invención, incluyen medio libre de suero (SFM), medios libres de proteínas (PF), medios libres de componentes derivados de animales (ADCF) y formulaciones químicamente definidas (CD). Los medios CD, como se usan en la presente invención, comprenden medios de crecimiento que carecen de cualquier componente de origen animal, incluyendo suero, proteínas del suero, hidrolizados o compuestos de composición desconocida. Todos los componentes de los medios CD tienen una estructura química conocida, que resulta en la eliminación de la variabilidad de lote a lote discutida anteriormente. Los medios CD usados en la presente invención pueden incluir, pero no están limitados a, medio CD-Hibridoma, un medio CD producido por Invitrogen Corp., Carlsbad, Calif. (No. de catálogo 11279). El medio CD- Hibridoma, es un medio libre de proteínas químicamente definido optimizado para el crecimiento de una variedad de hibridomas y mielomas, y la producción de anticuerpos monoclonales en sistemas de suspensión estacionarios o agitados. El medio CD-Hibridoma no contiene proteínas originadas de animales, plantas o por síntesis. Tampoco existen lisados o hidrolizados no definidos en la formulación. El medio CD-Hibridoma se formula sin L-glutamina para estabilidad incrementada. Puede añadirse glutamina como 40 ml de L-glutamina 200 mM o 40 ml de complemento GlutaMAX™-! (disponible también de Invitrogen) por 1 ,000 ml de medio antes de su uso. Un archivo maestro de medio de hibridomas se ha presentado a la FDA. El medio CD-Hibridoma no está optimizado para cultivos dependientes de lípidos o dependientes de colesterol, tales como líneas derivadas de NSO. Para perfiles de crecimiento, el medio CD-Hibridoma fue complementado con 1 g/L de NaHC03 y L-glutamina a una concentración final de 6 mM. La presente invención contempla también el uso de los medios químicamente definidos, que incluyen "medio CDM", descrito en la publicación del PCT No. WO 02/066603, titulada "Chemically Defined Médium For Cultured Mammalian Cells", la cual se incorpora expresamente en la presente como referencia.

Métodos para evaluar la función efectora La función de la glucosilación de anticuerpos en la depuración, y por lo tanto la farmacocinética de proteínas terapéuticas que contienen Fc, es incierta: la unión al receptor de Fc neonatal (FcRn), aunque responsable de la remoción de IgG de la circulación, parece no ser perturbada por la falta de oligosacáridos N-enlazados en la porción Fc de un anticuerpo. Los receptores de Fc de la IgG (FcR) que enlazan respuestas inmunes mediadas por anticuerpos de IgG con funciones efectoras celulares, incluyen los receptores de Fc-gamma: FcRI (CD64), FcRIl (CD32) y FcRIII (CD16). Los tres se encuentran exhibidos en monocitos. Sin embargo, la elaboración de estos receptores en varias células objetivo parece ocurrir diferencialmente y en respuesta a otros factores. Por lo tanto, la medición de la afinidad de bioterapéuticas que contienen Fc modificada por glucosilación para receptores de Fc-gamma, es una medición adecuada para producir funciones efectoras mejoradas. Se ha reportado que Abs de lgG1 de humano con bajos niveles de fucosa en los glucanos de su Fc, tienen mayor afinidad por FcR CD16 de humano, y actividad in vitro dramáticamente mejorada en pruebas de ADCC usando células efectoras de PBMC humanas (Shinkawa ef al., J Biol Chem 278(5): 3466-3473, 2003; Shields et al., J Biol Chem 277(30): 26733-26740, 2002; Umana ef al., Nat Biotech 17: 176-160,1999). Sin embargo, después de los reportes de que la afinidad de dichos Abs por FcRs CD16 y CD32 de ratón no fue mayor que la de Abs de alto contenido de fucosa (Shields ef al., 2002), hubo menos incentivo para estudiar Abs de bajo contenido de fucosa en ratones. Sin embargo, cuando se comparó la actividad antitumoral de una versión de alto contenido de fucosa y una versión de bajo contenido de fucosa de un Ab de lgG1 humano quimérico contra el receptor 4 de quimiocina CC, no se observó diferencia alguna en su actividad de ADCC in vitro (usando células efectoras de ratón); sin embargo, el Ab de bajo contenido de fucosa mostró eficacia más potente in vivo. No se proveyeron células efectoras humanas, y los ratones retienen células NK endógenas (Niwa ef al., Cáncer Res 64: 2127-2133, 2004). Puesto que el receptor CD16 en células NK humanas ha demostrado sensibilidad mejorada a los niveles de fucosa de Abs de lgG1 , estos datos sugieren que un mecanismo distinto del que se ha estudiado en células efectoras humanas, está operando en ratones. Una posibilidad es el receptor CD16-2 de ratón descubierto más recientemente (Mechetina et al., Immunogen 54: 463-468, 2002). El dominio extracelular de CD16-2 de ratón tiene identidad de secuencia significativamente mayor con CD16A de humano (65%) que con el receptor CD16 de ratón mejor conocido, sugiriendo que puede ser más sensible a los niveles de fucosa de IgGs que lo unen que CD16 de ratón. Su expresión reportada en células J774 tipo macrófago de ratón, es consistente con la posibilidad de que macrófagos de ratón que expresan CD16-2 pueden ser responsables de la mayor actividad antitumoral por el Ab de bajo contenido de fucosa descrito por Niwa ef al. (2004). De esta manera, el estudio de la unión al receptor de Fc por proteínas que contienen Fc tipo lgG1 humana, a células efectoras de murino, no es profético. Otro método para evaluar las funciones efectoras, es usando una prueba de ADCC in vitro en una forma cuantitativa. De esta manera, puede diseñarse una prueba in vitro que mida la capacidad del anticuerpo unido para causar la destrucción de la célula que exhibe su ligando cognado, mediante la selección correcta de líneas de células objetivo y efectoras, y evaluando la "destrucción" de las células por la incapacidad de las células para continuar dividiéndose, o por la liberación de contenidos internos, por ejemplo, liberación de 51cromo. La célula objetivo puede ser una línea de células que exprese normalmente un ligando objetivo para el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión de la invención, o puede diseñarse para expresar y retener la proteína objetivo sobre su superficie. Un ejemplo de dicha línea de células diseñada, es la célula K2, una línea de células de mieloma de ratón Sp2/0 que expresa establemente sobre su superficie FNT humano recombinante que permanece como una forma de transmembrana debido a la introducción de una deleción de los aminoácidos 1 a 12 de la citocina madura (Pérez ef al., Cell 63: 251-258, 1990). Esta linea de células es útil para evaluar alteraciones en la actividad de ADCC de anticuerpos anti-FNT, fragmentos de anticuerpo o proteínas de fusión diseñadas que eligen como objetivo anti-FNTalfa, que tienen dominios de Fc o actividad de dominio de Fc. Las células efectoras para la prueba de actividad de ADCC in vitro pueden ser PBMCs (células monocíticas de sangre periférica) originadas de humano u otro mamífero. Las células efectoras PBMCs pueden ser recién aisladas después de la colecta de sangre de donadores mediante métodos aprobados. Otras células monocíticas o macrófagos que pueden usarse, son los derivados de fluidos de efusión tales como exudados peritoneales.

Mientras que se ha descrito la invención en términos generales, las modalidades de la invención se describirán mejor en los siguientes ejemplos.

EJEMPL0 1 Adaptación y clonación de la línea de células APF-YB2/0 La línea de células de hibridoma de rata, YB2/0 (C1083A), cultivada en DMEM complementado con FBS a 5% (DMEM+FBS a 5%), fue adaptada para crecer en un medio CD-Hyb APF, CD-Hibridoma (Gibco), mediante dos métodos diferentes: Método 1. Las células fueron retiradas lentamente del medio que contenía FBS, haciéndolas pasar repetidamente 1 :1 en medio CD-Hyb complementado con glutamina 6 mM. Después de 6 pasajes, las células fueron capaces de crecer en medio APF. Esta línea de células fue designada como C10d3B (cuadro 1). Las características de crecimiento de C10d3B en medio CD-Hyb y DMEM+FBS a 5%, fueron comparables (figuras 2A y 2B). Se aislaron clones individuales de C1083B mediante el método de dilución limitativa usando DMEM+FBS a 5%. Se transfirieron veinticuatro clones para aumento en proporción, y ocho clones de este experimento se seleccionaron para más estudio. Los criterios para la selección de estos ocho clones incluyeron tiempo de duplicación medio (MDT), capacidad para alcanzar alta densidad de células en cultivos de matraz de agitación, y estabilidad durante pasajes múltiples.

CUADRO 1 Método 2. Se sembraron 200, 500, 1000 ó 5000 células C1083A por cavidad de placas de 96 cavidades (5 placas por cada categoria) en medio CD-Hyb complementado con glutamina 6 mM. Después de tres semanas de incubación, sólo las placas con 5000 células/cavidad tuvieron colonias en aproximadamente 10 cavidades/placa. Veinticuatro clones fueron transferidos a una placa de 24 cavidades para expansión. Se seleccionaron cuatro clones para mayor estudio, con base en el tiempo de duplicación medio, capacidad para alcanzar alta densidad de células en cultivos de matraz de agitación, y estabilidad durante pasajes múltiples. Doce clones, ocho generados mediante el método 1 y cuatro generados mediante el método 2, se compararon para características de crecimiento en medio CD-Hyb, es decir, tiempo de duplicación medio, capacidad para alcanzar alta densidad de células en cultivos de matraz de agitación, y estabilidad durante pasajes múltiples. Se seleccionaron cuatro clones (C1083B-1, C1083B-12, C1063-H18 y C1083-H21) de este experimento para más estudio. Los cuatro tuvieron características de crecimiento comparables. Su tiempo de duplicación medio fue de aproximadamente 22 horas, y fueron capaces de alcanzar alta densidad de células (> 2x106/ml) en cultivos de matraz de agitación (figura 3). Tres de las cuatro líneas de células (C10d3B-1 , C1063B-12 y C1083-H21) se pusieron a prueba entonces para determinar su eficiencia de transfección usando el instrumento de electroporación AMAXA y valores previamente optimizados para transfecciones de líneas de células de mieloma. Se seleccionó la línea de células C10d3B-12 de este estudio como la línea de células APF-YB2/0 con las características deseadas, y servirá como la línea de células hospederas de transfección alterna además de C1083B. Se designó como C10d3E.

EJEMPLO 2 Aislamiento de clones de YB2/0 resistentes a lectinas específicas de fucosa Pueden usarse lectinas para seleccionar lineas de células que expresan un tipo específico de oligosacárido (Ripka y Stanley, 1966. Somatic Cell Mol Gen 12: 51-62). De las dos lectinas especificas de fucosa disponibles, se seleccionó la aglutinina de Lens culinaris (LCA) para generar una curva de destrucción (en forma de gráfica de barras) usando C1083B (figura 4). Se sembraron células C1083B (cultivadas en DMEM+FBS a 5%) a 5000 células/cavidad en placas de 96 cavidades en presencia de varias concentraciones de lectinas de LCA. Después de 5 días, la viabilidad se determinó mediante la prueba de azul Alamar (equipo de prueba metabólico de células Vybrant, Molecular Probes, Inc.). Se seleccionaron variantes naturales raras de C10d3B que expresaban niveles reducidos de ARN mensajero de futd (SEQ ID NO: 1), sembrando 5 células/cavidad en placas de 96 cavidades en presencia de 50 µg/ml de LCA. Después de tres semanas, se identificaron 17 clones resistentes (de 2x104 células sembradas). Estas se aumentaron en proporción, y se hicieron pasar veces múltiples en medio CD-Hyb. Se seleccionaron ocho de los 17 clones con base en crecimiento vigoroso, capacidad para alcanzar alta densidad de células en cultivos de matraz de agitación, y estabilidad del cultivo durante pasajes múltiples. Se aisló ARN total de estos clones. Se realizaron experimentos de PCR cuantitativa usando dos series de sondas Taqman (subrayadas) e iniciadores (en cursivas) (SEQ ID NOS: 2-7, figura 5A) de futd específicos de rata. Estos análisis demostraron que un clon (A4) tuvo 6 veces menos ARN mensajero de futd, mientras que otros dos clones (Ad y A9) tuvieron aproximadamente 2 veces menos ARN mensajero de futd (figura 5B). El clon A4 fue designado como C10d3C, y el clon A9 fue designado como C10d3D. Los datos de las figuras 6A y 6B demuestran que las características de crecimiento de C1033C y C10d3D en medio CD-Hyb, son comparables a las de la línea progenitora, C1083B, con base en células viables por volumen de medio de cultivo (figura 6A) y en la viabilidad total de células (figura 6B).

EJEMPLO 3 Transfección de células C1083B con ADN de anticuerpos anti-factor tisular Se seleccionó a CNTO 860, un anticuerpo anti-factor tisular humano, debido a su eficacia para reducir o prevenir el crecimiento de tumores, ya que según se puso a prueba en modelos de cáncer de xenoinjertos humanos en ratones, depende de la actividad de ADCC. Vectores de expresión (p2401 y p2402) que codifican para las cadenas ligera y pesada de CNTO 860, como se muestra en las figuras 7A y 7B, se describen además en el documento WO/04110363 y en la solicitud de patente de E.U.A. No. de serie 11/010,797), y fueron co-transfectados con pSV2DHFR (Promega), y se analizaron clones resistentes al marcador de selección MHX (ácido micofenólico, hipoxantina y xantina) para la expresión de anticuerpos mediante ELISA. Una línea de células de alta expresión, C1261A, se seleccionó para más estudio. Produjo 45-50 mg/L en medio CD-Hyb en cultivos de matraz de agitación, y demostró estabilidad en expresión durante pasajes múltiples (figuras 8A y dB). El crecimiento y los títulos de los anticuerpos se monitorearon en ausencia y presencia de 1x lípido (Gibco).

EJEMPLO 4 Determinación de la actividad de ADCC de anticuerpos anti-factor tisular derivados de C1083B Se usó una serie de pruebas de citotoxicidad de liberación de 51Cr in vitro, para demostrar la mejora de la actividad de ADCC de varios anticuerpos anti-factor tisular: CNTO 659, que contiene un Fc de lgG4 de humano (descrito en el documento EP833911 B1); CNTO 860, que tiene la misma región de unión a antígeno que CTNO 859, pero ha sido clonado en una estructura de lgG1 humana, y de esta manera produce un anticuerpo humanizado que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 8 para la cadena pesada, y SEQ ID NO: 9 para la cadena ligera (como se describe en la solicitud de E.U.A. No. de serie 11/010797, presentada en diciembre 13 de 2004); y una variante de glucosilación como resultado de la producción del anticuerpo CNTO 860 en la línea de células YB2/0 adaptada a medio CD-Hyb o variantes deficientes en futd. Las células de carcinoma de colon humano, HCT 116, que expresan el factor tisular, se usaron como células objetivo. Las células se mantuvieron en medio 5A de McCoy complementado con FBS a 10% inactivado con calor y LNN a 1% (M5A-10). En el día de la prueba, las células fueron tripsinizadas, cosechadas y marcadas a 10x106 células por 200 µCi de Na251Cr04 (Perkin-Elmer Life Science, Boston, MA) en 1 mL de M5A-10 por 2 horas a 37°C. Las células marcadas se lavaron dos veces con 50 mL de PBS sin calcio o magnesio (PBS ), y se resuspendieron hasta 4x105 células/mL de M5A-10. Se aislaron PBMCs de donadores sanos. Se colectó sangre venosa en jeringas heparinizadas, y se diluyó con un volumen igual de PBS en un tubo cónico de 50 mL (20mL: 20mL). Esta solución de sangre fue cubierta con 13 mL de Ficoll-Paque (Amersham, Uppsala, Suecia) y centrifugada a 2200 rpm por 30 minutos a temperatura ambiente. La capa de plasma superior fue aspirada, y la interfaz (cubierta amarilla) que contenía PBMCs fue cosechada. Las células efectoras se lavaron tres veces en PBS , y entonces se resuspendieron en M5A-10 a 5x106 células/mL. Una relación de efector a objetivo de 25:1 se usó para todos los experimentos. En el primer experimento, la actividad de ADCC de los anticuerpos monoclonales contra el factor tisular, a saber, CNTO d59, CNTO d60 y CNTO 660, se caracterizó usando PBMCs de dos diferentes donadores (figura 9A). Se determinó la lisis específica después de 4 horas, y cada barra es representativa de la media de triplicados de ambos donadores. Muestras control de liberación máxima y espontánea fueron tratadas con medio solo en presencia de 2 µg/mL de anticuerpo, pero sin células efectoras, o tratadas con Tritón X-100 a 0.5%, respectivamente. El porcentaje de lisis específica en cada muestra se calculó con base en los cpm liberados por Tritón X-100 (liberación máxima) corregida mediante los cpm espontáneamente liberados. CNTO 859, el subtipo de lgG4, posee actividad de ADCC minima en comparación con CNTO 860, el subtipo de lgG1 producido por una línea de células hospederas de mieloma de ratón, C463. En contraste, CNTO 860 derivado de la línea de células hospederas YB2/0 C1083B, fue aproximadamente 20 a 60 veces más potente que el derivado de C463 (figura 9A) cuando se comparó su EC50 y los valores máximos de lisis. CNTO 860 derivado de YB2/0, fue 40% fucosilado en comparación con CNTO d60 derivado de C463, que fue 99% fucosilado. En un segundo experimento, se comparó CNTO 660 derivado de 3 líneas de células para su potencia de ADCC relativa, a saber, C463: la línea de células YB2/0 adaptada libre de proteínas animales, C1083B, y la línea de células YB2/0 agotada en futd, C10d3C. Se determinó la lisis especifica después de 4 horas, y las barras representan la media de triplicados de un sólo donador. CNTO d60 derivado de la línea de células C10d3B fue aproximadamente 10 veces más potente que el derivado de la línea de células de mieloma de ratón, C463 (figura 9B). No se observó diferencia alguna en la actividad de ADCC entre CNTO 860 derivado de la línea de células derivada de YB2/0 progenitora, C1083B, y el clon A4-2 agotado en fut8, C10d3C. Estos resultados indican que un incremento adicional en la actividad de ADCC reduciendo el nivel de fucosa, no fue además mensurable usando el método de prueba in vitro.

EJEMPLO 5 Análisis de la lucosilación de anticuerpos Se realizó el análisis de MALDI-TOF-MS, de CNTO d60 generado en C463 y varias líneas de células hospederas de transfección. CNTO d60 generado en C463A (figura 10A), la línea de células hospederas YB2/0 de mieloma de rata adaptada APF, C1063B (figura 10B), y la línea de células hospederas YB2/0 agotada en futd, C10d3C (figura 10C), fueron sometidos a análisis MALDI-TOF-MS según protocolos publicados (Papac ef al., 1996; Papac ef al., 1998; Raju ef al., 2000). Se analizaron estructuralmente Abs de prueba mediante diferentes métodos. Para realizar el análisis MALDI-TOF-MS de Abs de IgG intactos, muestras de IgG se pusieron en regulador de pH de Tris-HCl 10 mM, pH 7.0, y concentración ajustada a aproximadamente 1 mg/mL de regulador de pH. Aproximadamente 2 µl de solución de IgG se mezclaron con 2 µl de solución matriz (la solución matriz se preparó disolviendo 10 mg de ácido sinapínico en 1.0 ml de acetonitrilo a 50% en agua que contenía ácido trifluoroacético a 0.1%), y 2 ml de esta solución se cargaron en el objetivo y se dejó que se secaran al aire. Se adquirió MALDI-TOF-MS usando un instrumento Voyager DE de Applied BioSystems (Foster City, CA). Para realizar el análisis MALDI-TOF-MS de glucanos de Fc liberados, muestras de IgG (~50 µg) fueron digeridas con PNGase F en regulador de pH de Tris-HCl 10 mM (50 µl), pH 7.0, por 4 horas a 37°C. La digestión se interrumpió acidificando la mezcla de reacción con ácido acético a 50% (~ 5 µl), y entonces se hizo pasar a través de una columna de resina de intercambio catiónico como se describió previamente (Papac ef al., 1996; Papac ef al., 1998; Raju et al., 2000). Estas muestras que contenían una mezcla de oligosacáridos ácidos y neutros, se analizaron mediante MALDI-TOF-MS en los modos de ion positivo y negativo, como se describió en otra parte (Papac ef al., 1996; Papac ef al., 1998; Raju ef al., 2000), usando un instrumento Voyager DE de Applied BioSystems (Foster City, CA). Los análisis MALDI-TOF-MS de los glucanos liberados de muestras de anticuerpos producidas en diferentes células YB2/0 se muestran en las figuras 10A-10C, y la estructura de los oligosacáridos se ilustra en el cuadro A. Los oligosacáridos se enumeran en secuencia con base en la presencia de fucosa en el centro, GIcNAc de bisección, presencia o ausencia de azúcares terminales tales como ácido siálico, galactosa, etc. Los datos del análisis de MALDI-TOF-MS sugieren que las muestras de anticuerpos producidas en células YB2/0 contienen cantidades incrementadas de oligosacáridos no fucosilados (cuadro A, estructuras 1-15). Las cantidades de oligosacáridos no fucosilados varian de 50% a 95% para ciertas muestras de anticuerpos. Además, un incremento en oligosacáridos no fucosilados que contienen GIcNAc de bisección, se observó también en las muestras de anticuerpos derivadas de YB2/0. Además, las muestras de anticuerpos derivadas de células YB2/0 contienen homogeneidad incrementada y/o más estructuras homogéneas debido a la presencia de oligosacáridos no fucosilados y que contienen GIcNAc de bisección. Por el contrario, las muestras de anticuerpos producidas en otros tipos de células tienden a contener una estructura más homogénea de oligosacáridos (cuadro A, estructuras 1-36), indicando el valor de las células YB2/0 para producir muestras de anticuerpos terapéuticos con actividad incrementada debido a la presencia de estructuras de oligosacáridos más definidas y homogéneas. Además, las muestras de anticuerpos producidas en células YB2/0 tienden a contener un menor porcentaje de estructuras con alto contenido de mañosa (cuadro A, estructuras 31-36), en comparación con las muestras de anticuerpos producidas en otras líneas de células tales como HEK o NS/0.

EJEMPLO 6 Expresión de Mab anti-FNTalfa en C 1083 B/C El examen de los niveles de expresión de CNTO 860 en varias líneas de células hospederas de mieloma (Sp2/0, NSO y YB2/0), reveló niveles relativamente bajos de producción de anticuerpos en comparación con otros anticuerpos producidos en estas lineas de células. Por lo tanto, se seleccionó un anticuerpo alternativo para expresión en las líneas de células hospederas derivadas de YB2/0 de la invención. Células YB2/0 C1083B y células YB2/0 C1083C fueron transfectadas con plásmidos (plásmidos p1783 y p1776, respectivamente) que codifican para la cadena pesada (la región variable de ésta es SEQ ID NO: 10) y la cadena ligera (la región variable de ésta es SEQ ID NO: 11) que codifican para un Mab anti-FNT alfa humano designado como CNTO 148 (Golimumab) mediante electroporación, según se describe (Knight ef al., Mol Immunol 30: 1443-1453, 1993; documento WO02/012502). Colonias resistentes a ácido micofenólico de las células derivadas de YB2/0 transfectadas, se pusieron a prueba para la presencia de CNTO 148 en sus sobrenadantes de cultivo mediante ELISA para IgG humana, según se describe (Knight et ai, 1993). Los transfectantes (transfectante #14 C1083B y transfectante #1 C10d3C), fueron aumentados en proporción en IMDM, FBS a 5%, glutamina a 1%, 1X marcador de selección MHX (0.5 µg/ml de ácido micofenólico; 2.5 µg/ml de hipoxantina, 50 µg/ml de xantina) hasta un volumen de 1 litro, y se dejó que los cultivos crecieran en exceso hasta que la viabilidad de las células fuese menor de 20%. Se usó cromatografía estándar de proteína A para purificar las dos muestras de CNTO 14d. Las purificaciones dieron 1.3 mg de CNTO 146 de las células transfectadas con C10d3B, y 3.2 mg de CNTO 14d de las células transfectadas con C1083C. C1083B-148-14 y otro clon, C1083B-148-33, fueron sometidos a subclonación Halo. Se seleccionaron 21 halos de la subclonación Halo de la primera ronda del clon 33, de la cual un subclon, C1083B-148-33-19, expresó -89 µg/mL en un matraz de agitación. Después de expansión y una segunda ronda de Halo, el subclon C10d3B-148-33-19-42 exhibió títulos de -105 µg/mL en un matraz de agitación. Este clon está siendo adaptado para medio APF.

Caracterizaciones bioanaliticas de CNTO 148 derivado de YB2/0 El análisis MALDI-TOF-MS del oligosacárido liberado por PNGase F (figuras 11A-11C), indicó que más de 80% de los oligosacáridos de las células hospederas derivadas de YB2/0, C1083B y C1083B, fueron no fucosilados. Inesperadamente, se encontró que el contenido de fucosa de CNTO 148 derivado de C1083C no es menor que el de CNTO 148 derivado de C1083B (figuras 11 B y 11C). Los oligosacáridos de estas muestras de anticuerpos contienen también cantidades incrementadas de GIcNAc de bisección, sin que la fucosa parezca ser más homogénea que los oligosacáridos del anticuerpo producido en las células hospederas NS/0 (figura 11 A).

Prueba de ADCC in vitro con CNTO 148 derivado de YB2/0. Las células objetivo designadas como células K2 o C480A, son una línea de células de mieloma de ratón Sp2/0 que expresa establemente sobre su superficie FNT humano recombinante que permanece como una forma de transmembrana debido a la introducción de una deleción de los aminoácidos 1 a 12 de la citocina madura (Pérez ef al., 1990, citado anteriormente). Se cultivaron células K2 en medio de Iscove que contenía FBS inactivado con calor, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales OJ mM y 1X de marcador de selección MHX. Las células K2 se hicieron pasar 1 :5 cada 2 a 3 dias. En el día de la prueba, las células K2 se centrifugaron y se lavaron una vez con PBS. Las células se ajustaron a aproximadamente 1 x 106 células/ml con el medio de cultivo, y se añadieron 15 microlitros de reactivo de marcación fluorescente BATDA (en equipo de reactivo de citotoxicidad Delfia EuTDA, Perkin-Elmer Life Sciences) a 5 ml de las células (Blomberg ef al., J Immunol Methods 193: 199-206, 1996). Las células se incubaron por 30 minutos a 37°C, y entonces se lavaron dos veces con PBS a 1000 rpm, por 5 minutos. Inmediatamente antes del mezclado con células efectoras PBMC, las células objetivo se centrifugaron y se resuspendieron a 2 x 105 células/ml en medios de Iscove que contenían BSA a 1%. Se aislaron células efectoras PBMC de donadores sanos después de la colecta de sangre en vacutainers heparinizados, y dilución dos veces con PBS. Se pusieron treinta (30) ml de sangre diluida sobre 15 ml de Ficoll-Paque (Amersham, Uppsala, Suecia) en un tubo cónico de 50 ml, y se centrifugaron a 1500 rpm, por 30 minutos a temperatura ambiente. La interfaz (cubierta amarilla) que contenía PBMCs se colectó y se lavó dos veces con PBS, y se centrifugó a 1200 rpm, por 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se resuspendieron en medios de Iscove que contenían FBS a 5% inactivado con calor, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM y aminoácidos no esenciales 0J mM. Se activaron PBMCs por aproximadamente 4 horas a 37°C, C02 a 5%, por incubación en placas de cultivo de tejidos de 100 mm que habían sido recubiertas con OKT3 (10 µg/ml en PBS, Ortho Pharmaceutical) durante la noche a 4°C, y enjuagadas con PBS. Se colectaron PBMCs, se lavaron una vez con medios de Iscove que contenían BSA a 1 %, se hizo el conteo de las mismas, y se resuspendieron hasta aproximadamente 1 x 107 células/ml. Muestras de prueba de CNTO 146 se diluyeron en serie en medio de Iscove con BSA a 1%. Cincuenta microlitros de células objetivo (-10,000) y 100 microlitros de anticuerpo se añadieron a una placa de 96 cavidades de fondo redondo. Cincuenta microlitros de células efectoras (-500,000 células) se añadieron a la mezcla, y la placa se centrifugó a 1000 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente. La relación de células efectoras a células objetivo (E:T) fue de 50:1. Para medir la fluorescencia de fondo, las cavidades se incubaron con una mezcla de células efectoras y células objetivo en medio, sin anticuerpos. Para establecer la fluorescencia máxima, se añadieron 10 microlitos de solución de lisis (del equipo de citotoxicidad Delfia EuTDA) a las cavidades de fondo. Para la prueba de ADCC, las células se incubaron a 37°C, C02 a 5%, por aproximadamente 2 horas. Veinte microlitros de sobrenadante se transfirieron a una placa de fondo plano de 96 cavidades. Se añadieron 200 microlitros de solución de europio (equipo de citotoxicidad Delfia EuTDA), y la placa se puso en un agitador de plancha por 10 minutos, a temperatura ambiente. Se midió la fluorescencia en el fluorómetro de resolución temporal, instrumento En Vision (Perkin-Elmer Life Sciences). El porcentaje de lisis específica en cada muestra se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: % de liberación específica = ([liberación experimental - liberación espontánea] + [liberación máxima - liberación espontánea]) X 100. Los resultados de las pruebas de ADCC mostraron que CNTO 14d derivado de C10d3B fue aproximadamente 70 veces más potente que el material de referencia, CNTO 148 de las células de mieloma de ratón (figura 12). CNTO 148 derivado de C1083C mostró esencialmente la misma potencia que CNTO 148 derivado de C1083B, consistente con los datos bioanalíticos que mostraron que tenían niveles de fucosa muy similares. Como resultado de la similitud inesperada en los niveles de fucosa, estos lotes de Ab no ofrecieron un medio para poner a prueba si bajos niveles extra de fucosa (10-20%) se tradujeron en no más mejora de la actividad de ADCC, en comparación con tener niveles moderados de fucosa (40-50%), como se había observado con CNTO d60 in vitro (y 2C11 in vivo). No obstante, estos resultados proveen otro ejemplo de un Ab expresado en C10d3B o C10d3C que muestra actividad de ADCC notablemente mejorada respecto al mismo Ab expresado en una célula hospedera alterna.

EJEMPLO 7 Actividad agonista in vivo de un Ab anti-CD3 expresado en células HEK 293E, células C1083A y células C1083C Con base en reportes previos que muestran que la activación de células T por Abs monoclonales anti-CD3 depende de la capacidad de esos Abs para unirse a receptores de Fc? (Fc?Rs), se usó un sistema modelo simple para poner a prueba si ratones mostrarían diferentes grados de una respuesta dependiente de Fc a un Ab de lgG1 humano con diferentes niveles de fucosa en su glucano de Fc. Para estos estudios, se usó Ab de cadena épsilon recombinante anti-CD3 de ratón de hámster, 145-2C11 (2C11 ). Un plásmido que codifica para un Fv de cadena sencilla versión 2C11 , fue provisto amablemente por el Dr. Jeffrey Bluestone (Universidad de California, San Francisco). La región variable (V) de cadena ligera y pesada que codifica para secuencias en este plásmido, fue amplificada previamente por PCR, y los fragmentos de ADN amplificados fueron clonados primero en vectores genómicos de la región variable de cadena ligera y pesada, y entonces en vectores de expresión de la región constante genómica para las cadenas kappa y de lgG2a de ratón, respectivamente. Para preparar variantes de lgG1 humanas de 2C11 , ADN que codifica para la región variable de cadena pesada fue amplificado a partir de uno de los plásmidos preparados previamente, p2213, y clonado en dos vectores de expresión diferentes que contenían la secuencia codificante de la región constante G1 humana. Esto resultó en la generación de los plásmidos de expresión p264d, en el cual la transcripción del gen de Ab fue dirigida por un promotor del CMV, y p2694, en el cual la transcripción fue dirigida por un promotor de inmunoglobulina de ratón. La región variable de cadena ligera 2C11 fue amplificada del plásmido p220d, y clonada en vectores de expresión que contenían regiones constantes kappa de humano, dirigidas por un promotor del CMV o un promotor de inmunoglobulina. Esto resultó en la generación de los plásmidos de expresión p2623, en el cual la transcripción del gen de Ab fue dirigida por el promotor del CMV, y p2629, en el cual la transcripción fue dirigida por el promotor de inmunoglobulina. Los plásmidos que contenían al promotor del CMV fueron expresados transitoriamente en células HEK 293E. Aproximadamente 3.5 x 108 células fueron desarrolladas en una pila de células de 10 niveles (Corning) en medios de crecimiento (DMEM con FBS a 10%), durante la noche a 37°C en C02 a 5%. Un coctel de transfección preparado mezclando 1.4 ml de Lipofectamine 2000 con 300 µg de cada uno de los plásmidos p2648 o p2622 y p2623, en 40 ml de Optimem (Invitrogen, Inc.), se añadió a la pila de células, y se incubó durante la noche a 37°C. Al día siguiente, los medios con el coctel de transfección se reemplazaron con 1 litro de 293 SFMII (Invitrogen, Inc.) + butirato de sodio 4 mM, y las células se incubaron por 4 días a 37°C. Los sobrenadantes que contenían al anticuerpo expresado se cosecharon, y se depuraron mediante centrifugación y filtración a 0.8 mieras. El anticuerpo expresado se purificó mediante cromatografía de afinidad de proteína A estándar. Los plásmidos que contenían al promotor de inmunoglobulina se introdujeron en células YB2/0 C1083A y C10d3 por medio de transfecciones estables. Aproximadamente 2 X 107 células YB2/0 fueron transfectadas por electroporación con 10 µg de cada uno de los plásmidos p2694 y p2669, y sembradas en placas de cultivo de células de 96 cavidades en medios de crecimiento que contenían MEM alfa complementado con FBS a 10%, NEAA, L-glutamina y piruvato de sodio. Se seleccionaron células para integración estable de plásmidos con ácido micofenólico. Clones resistentes a ácido micofenólico que secretaban anticuerpos, se seleccionaron mediante ELISA de anti-lgG humana. Los clones estables de alta expresión fueron aumentados en proporción en medio de cultivo que contenía FBS a 5%. El anticuerpo expresado se purificó mediante cromatografia de afinidad de proteina A estándar. El Ab de huG1 2C11 preparado que había sido expresado en células YB2/0 C1083A, se sometió a análisis MALDI-TOF-MS como se describió en los ejemplos 5 y 6 anteriores (figura 13). Este análisis demostró que la línea de células, aunque cultivada en presencia de suero, continuó produciendo Ab producto glucosilado en el cual la especie dominante es no fucosilada (estructura 2 como en el cuadro A). La preparación de 2C1 1 fue desglucosilada enzimáticamente para preparar un Ab control que carecía de capacidad de unión al Fc?R. La desglucosilación se hizo tratando el Ab con 1000 unidades de PNGase F a 37°C por 24 horas (~ 10 mg de Ab en 1.0 mL de regulador de pH). Se añadió otra alícuota de la enzima, y la incubación se continuó por otras 24 horas. Las muestras de IgG desglucosiladas se purificaron usando una columna de proteina A HiTrap y se formularon en solución salina regulada en su pH con fosfato, pH 7.0. Se mostró mediante análisis MALDI-TOF-MS que la glucoforma resultante, denominada 2C11 Gno, había sido completamente desglucosilada (datos no mostrados). Las concentraciones de cada muestra de Ab se determinaron midiendo la D028o por espectrofotometría, así como tinción de un gel de SDS- poliacrilamida. Se realizaron pruebas de LAL en todos los Abs de prueba para determinar los niveles de endotoxina contaminantes. Los análisis MALDI-TOF-MS y CLAR realizados como se describió anteriormente, mostraron que el glucano de Fc en el Ab derivado de HEK 293E (huG1 2C11 , HEK), el Ab derivado de C1083A (huG1 2C11 , C1063A) y el Ab derivado de C1083C (huG1 2C11 , C1083C), fue aproximadamente 95%, 40% y 15% fucosilado, respectivamente. Los análisis de unión cuantitativos a CD3 en esplenocitos de ratón recién aislados, no revelaron diferencias detectables en la afinidad del antígeno por las tres diferentes preparaciones de Ab (datos no mostrados). Para evaluar cómo se compararon entre sí los tres Abs con respecto a sus propiedades de activación de células T in vivo, se administraron a ratones Balb/c hembras normales (Charles River Laboratories), inyecciones intraperitoneales individuales de cantidades variables de Ab de prueba. Aproximadamente 24 horas después de la inyección de Ab de prueba, todos los ratones fueron sometidos a eutanasia mediante asfixia con C02, se colectaron muestras de sangre terminales mediante punción cardiaca, y los bazos se cosecharon y se pusieron en tubos que contenían medio de cosecha frío (RPMl 1640, suero de bovino fetal a 5% inactivado con calor, L-glutamina a 1%). Se prepararon suspensiones de células individuales de los esplenocitos prensando poco a poco los bazos a través de un tamiz malla de nylon de 100 µm, y lavando una vez con medio del RPMI-1640. La suspensión de células individuales fue agotada entonces de eritrocitos enucleados usando solución de lisis hipotónica de NH4CI, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmingen). Los esplenocitos se lavaron dos veces y se resuspendieron en PBS, BSA a 0.5% con azida de sodio a 0.2%. Los esplenocitos fueron inmunoteñidos usando CD4 PE+/CD25 APC+/CD d y colorante de viabilidad 7-AAD, y analizados mediante citometría de flujo. Toda la tinción se hizo en presencia del mAb anti-CD16/CD32, 2.4G2, que bloquea la tinción mediada por la unión al receptor de Fc. Los resultados revelaron mayor activación de células T en ratones dosificados con la variante de contenido moderado de fucosa en comparación con la variante de alto contenido de fucosa, necesitando ser dosificada la variante de alto contenido de fucosa con aproximadamente 4 veces más Ab para lograr el mismo grado de activación de células T (figura 14). Sin embargo, la variante de bajo contenido de fucosa no fue más activa que la variante de contenido moderado de fucosa, sugiriendo que la ausencia completa de fucosa no es necesaria para lograr la función de Fc máximamente mejorada de las variantes de bajo contenido de fucosa en ratones. Dado que uno de los FcyRs humanos de baja afinidad, Rc?RIIIA, es sensible a los niveles de fucosa de la porción Fc, estos hallazgos sugieren que los ratones pueden imitar más estrechamente las respuestas dependientes de Fc por células humanas, de lo que se pensaba previamente. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la presente se incorporan en la presente como referencia con el propósito de describir y de revelar, por ejemplo, las construcciones y metodologías que se describen en las publicaciones que podrían usarse con relación a la invención actualmente descrita. Las publicaciones discutidas anteriormente y en todo el texto se proveen solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente se considerará como una admisión de que los inventores no tienen derecho a adelantar dicha descripción en virtud de la invención previa.

Claims (1)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 - Una línea de células aislada derivada de una linea de células de mieloma de rata YB2/0 (ATCC 1662) útil para la producción de un anticuerpo, dicha línea de células produciendo polipéptidos glucosilados caracterizados porque tienen un contenido sustancialmente reducido de fucosa en comparación con polipéptidos producidos usando YB2/0 (ATCC 1662). 2.- La linea de células de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la línea de células se desarrolla de la línea de células de hibridoma de rata YB2/0 (C10d3A) adaptando la linea de células a crecer en medio libre de proteínas animales, CD-Hibridoma (CD-Hyb), y se designa como C1063B. 3.- La línea de células de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la línea de células es un subclon de C1063B seleccionado con base en por lo menos uno de alta eficiencia de transfección, tiempo de duplicación medio corto y capacidad para alcanzar alta densidad de células en medio CD-Hyb, y en donde la línea de células se designa como C1063E. 4.- La línea de células de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque los niveles de ARN mensajero de futd son menores que los niveles de la línea de células YB2/0 de tipo silvestre. 5.- La línea de células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque la línea de células se selecciona para resistencia a lectina. 6.- La línea de células de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque los péptidos glucosilados de la línea de células tienen contenido sustancialmente reducido de fucosa en comparación con péptidos producidos por líneas de células de mieloma de tipo silvestre y líneas de células CHO. 7.- Un anticuerpo producido por una línea de células hospederas transfectada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la molécula se caracteriza porque tiene grupos de oligosacáridos N-enlazados predominantemente no fucosilados. 8.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el anticuerpo tiene actividad de ADCC incrementada en comparación con un anticuerpo anti-factor tisular producido en una línea de células YB2/0 de tipo silvestre. 9.- Una composición biofarmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 7, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. 10.- Un método para producir un anticuerpo, que comprende: transfectar una secuencia de polinucleótidos que codifica para el anticuerpo en la línea de células de la reivindicación 1 ; y expresar el anticuerpo en cantidades detectables o recuperables. 11.- El método para producir un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el anticuerpo codificado por la secuencia de polinucleótidos es un anticuerpo humano. 12.- El método para producir un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el anticuerpo codificado por la secuencia de polinucleótidos es un anticuerpo humanizado. 13.- El método para producir un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, caracterizado además porque el anticuerpo codificado por la secuencia de polinucleótidos se une a una región de un polipéptido humano que puede ser unido a la superficie de una célula. 14.- Un anticuerpo producido mediante el método de la reivindicación 10, en donde el anticuerpo recuperado codificado por la secuencia de polinucleótidos se caracteriza porque tiene grupos de oligosacáridos N-enlazados predominantemente no fucosilados. 15.- Un anticuerpo producido mediante el método de la reivindicación 10, que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SEQ ID NO: 8. 16.- Un anticuerpo producido mediante el método de la reivindicación 10, que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 10. 17.- El uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, para preparar un medicamento útil para tratar una enfermedad o condición en un sujeto, célula o tejido. 18.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en donde la enfermedad o condición es una enfermedad neoplásica o un trastorno mediado por la respuesta inmune, en donde se desea la destrucción de una célula que exhibe un polipéptido al cual el anticuerpo es capaz de unirse. 19.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 18, en donde el polipéptido al cual el anticuerpo es capaz de unirse, es el factor tisular humano o el FNTalfa humano. 20.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 18, en donde la enfermedad o condición se caracteriza por angiogénesis anormal seleccionada del grupo que consiste de artritis reumatoide, degeneración macular, psoriasis y retinopatía diabética. 21.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 19, en donde la enfermedad o condición se caracteriza por la liberación de dicho polipéptido de dicha célula.