MX2008001978A - Vacunacion contra infeccion por el virus del dengue - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a métodos y kits para uso en vacunación contra infección por virus del dengue.

Description

VACUNACIÓN CONTRA INFECCIÓN POR EL VIRUS DEL DENGUE Antecedentes de la Invención Esta invención se refiere a vacunación contra infección por el virus del dengue. El dengue, una enfermedad ocasionada por cuatro especies distintas del virus del dengue (llamadas serotipos 1-4) , es la enfermedad portada por vector mas importante de la humanidad. Aproximadamente 100 millones de personas son afectadas por virus del dengue anualmente en regiones tropicales y subtropicales del mundo (Halstead, "Epidemiology of Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever", CABI Publ . , Nueva York, pp . 23-44, 1997; Gubler, "Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever", CABI Publ., Nueva York, p . 1-22, 1997) . Una forma severa y potencialmente letal de enfermedad ocasionada por infección del virus del dengue, fiebre hemorrágica del dengue (DHF) , está incrementando en distribución geográfica e incidencia. Estos hechos han propiciado esfuerzos intensos para construir vacunas seguras y efectivas contra el dengue pero, a pesar de muchos esfuerzos, abarcando mas de 50 años, no se ha desarrollado ninguna vacuna comercialmente disponible contra el dengue. El desarrollo de una vacuna contra el dengue es así considerado una alta prioridad por la Organización Mundial de la Salud (Chambers y colaboradores, Vaccine 15:1494-1502, 1997).

La patogénesis de DHF impulsa el diseño de vacunas del dengue. DHF es una enfermedad inmunopatológica, la cual ocurre principalmente en individuos que han sostenido una infección previa con un serotipo de dengue y luego se exponen a un segundo serotipo diferente (heterólogo) . Infección con cualquiera uno de los cuatro serotipos del dengue proporciona inmunidad durable contra ese serotipo homólogo, con base en anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, inmunidad contra otros serotipos heterólogos del dengue después de infección con un serotipo del dengue es de corta duración, si ocurre del todo (Sabin, Am. J. Trop . Med . Hyg. 1:30-50, 1952) . Típicamente, después de unas cuantas semanas o meses, anticuerpos solamente de ligadura y no neutralizantes a serotipos heterólogos están presentes. Estos anticuerpos de ligadura pero no neutralizantes pueden acrecentar infección subsecuente con un serotipo heterólogo del virus del dengue, incrementando el riesgo de enfermedad severa (Rothman y colaboradores, Virology 257 : 1-6, 1999). Dada la inmunopatogénesis de DHF, una vacuna exitosa contra el dengue debe ser segura e inducir respuestas de anticuerpo de larga duración, de neutralización cruzada, contra todos los 4 serotipos del virus del dengue simultáneamente, tal que títulos no caigan a niveles que dejen a un sujeto no protegido contra infección futura. Históricamente, esfuerzos empíricos para desarrollar candidatos a vacuna vivos, atenuados, han demostrado que es difícil lograr un balance entre suficiente atenuación (seguridad) e inmunogenicidad de virus de vacuna candidatos. También ha sido difícil combinar cepas de vacuna representando todos los cuatro serotipos en una mezcla tetravalente efectiva y un programa de dosis múltiples fue necesario para alcanzar seroconversión contra todos los serotipos, con el efecto no deseable de proporcionar espacios en el programa de inmunización donde sujetos pudieron sensibilizarse con eventos inmunopatológicos . De hecho, intentos para inmunizar con mezclas de vacunas del dengue vivas, monovalentes, demostraron interac-ciones significativas entre las cuatro cepas de virus y han resultado en efectos de interferencia viral (revisado en Saluzzo, Adv. Virus Res . 61:420-444, 2003). Vacunas a base de flavivirus quiméricos diseñadas genéticamente contra virus del dengue han sido desarrolladas, en las cuales dos secuencias (es decir, secuencias que codifican las proteínas de pre-membrana (prM) y de cápsula (E) ) de serotipos del dengue 1, 2, 3, o 4 se insertan en un clon infeccioso de longitud completa de virus de fiebre amarilla 17D, en lugar de las secuencias que codifican las proteínas de virus de fiebre amarilla correspondientes (ver, v.gr., Guirakhoo y colaboradores, J. Virol . 75:7290-7304, 2001; Guirakhoo y colaboradores , Virology 298:146-159, 2002) . Estos virus son altamente efectivos para inducir respuestas inmunes cuando se inyectan en monos. Sin embargo, datos preliminares también mostraron algunos efectos de interferencia viral en seres humanos, los cuales pueden limitar la inmunización contra todos los cuatro serotipos después de una dosis de vacuna del dengue. Los presentes inventores han encontrado un método nuevo y seguro de inmunización contra enfermedades del dengue, el cual permite inducción de respuesta de anticuerpo de larga duración, de neutralización cruzada contra serotipos del dengue 1-4, mientras que evita la necesidad de un programa de vacunación contra el dengue de dosis múltiples y el riesgo potencial asociado con una respuesta inmune primaria no balanceada. El método de la presente invención, el cual usa un régimen de inmunización comprendiendo la administración de una primera vacuna de fiebre amarilla seguida por la administración de una vacuna del dengue a base de flavivirus quimérico, permite la inducción de una respuesta inmune de neutralización cruzada contra los virus del dengue, lo cual presenta las ventajas de aparecer pronto (dentro de 30 días) después de la administración de la vacuna del dengue, ser de larga duración, y ser de reacción cruzada contra los cuatro serotipos. Mas aun, el método de la presente invención presenta el beneficio adicional de inducir una respuesta inmune protectora contra fiebre amarilla. Price y colaboradores (Am. J". Epid . 88:392-397, 1968) previamente describe un método para inmunización de flavivirus secuencial comprendiendo una serie de tres inmunizaciones con dengue tipo 2 y dos virus heterólogos (fiebre amarilla y encefalitis japonesa) . Mas aun, a diferencia de la presente invención, la secuencia de fiebre amarilla seguida por dengue 2, sin la adición de inmunización de encefalitis japonesa, falló en conferir inmunidad de protección cruzada. Scott y colaboradores (J. Infecí . Dis . 148:1055-1060, 1983), mostró que sujetos que se inmunizaron previamente con fiebre amarilla y subsecuentemente inoculados con una vacuna del dengue tipo 2 viva, atenuada, tiene respuestas inmunes mejoradas contra dengue tipo 2, las cuales son también mas durables (durando 3 años) que en sujetos sin inmunidad de fiebre amarilla previa. La respuesta mejorada puede haber sido debido a anticuerpos acrecentadores (de ligadura, no neutralizantes) producidos al virus del dengue tipo 2 por la vacunación de fiebre amarilla precedente (Eckels y colaboradores , J". Immunol . 135 (6) : 4201-4203 , 1985) . Sin embargo, Scott y colaboradores no mostraron que vacunas de fiebre amarilla seguida por dengue 2 produjeron una respuesta inmune de largo plazo a los otros tres serotipos del dengue (tipos 1, 3, o 4) . A diferencia de la presente invención, la secuencia de fiebre amarilla seguida por dengue tipo 2 no se mostró produciendo una respuesta amplia por la prueba de neutralización, la cual es la única prueba que predice inmunidad protectora . En un artículo reciente, Kanesa-thasan y colaboradores (Am. J. Trop . Med . Hyg. 69(Suppl. 6):32-38, 2003) descubrió respuestas heterólogas impulsadas y títulos de anticuerpo anti-dengue en sujetos remotamente vacunados con fiebre amarilla siguiendo vacunación con vacunas del dengue atenuadas. Estas respuestas de anticuerpo de corto plazo (al día 30) se demostraron con ensayos de anticuerpo incluyendo neutralización, pero los autores concluyeron que evidencia para protección contra infección del dengue subsecuente fue no concluyente. A diferencia de la presente invención, los autores no pudieron demostrar de manera concluyente el tiempo o recepción previos de vacunación de fiebre amarilla, respuestas de anticuerpo de neutralización amplia de largo plazo, o proporcionan evidencia para respuestas de células T de reacción cruzada al dengue. Los presentes inventores demuestran por primera vez que inducción de inmunidad de neutralización cruzada contra serotipos del dengue múltiples en humanos pueden de hecho conferirse por administración secuencial de virus quiméricos de fiebre amarilla y dengue. Compendio de la Invención La presente invención proporciona un método para inducir una respuesta inmune de largo plazo, de neutralización cruzada, al virus del dengue en un paciente, comprendiendo administrar al paciente: (i) una dosis de una vacuna de virus de fiebre amarilla, y (ii) una dosis de vacuna de flavivirus quimérico comprendiendo por lo menos un flavivirus quimérico comprendiendo un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual la secuencia que codifica proteína de sobre del virus de fiebre amarilla ha sido reemplazada con una secuencia que codifica la proteína de sobre de un virus de dengue, donde la vacuna de flavivirus quimérico se administra por lo menos 30 días y hasta a 10 años después de la administración de la vacuna de fiebre amarilla. En un ejemplo, la secuencia de cápsula de dengue es una secuencia revuelta . De acuerdo con una forma de realización, el flavivirus quimérico comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y de cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con secuencias que codifican las proteínas de membrana y de cápsula de un virus del dengue. En un ejemplo, cualquiera o ambas de estas secuencias de dengue son secuencias revueltas. De acuerdo con una forma de realización particular, la vacuna de flavivirus quimérico se administra al paciente 30, 60, o 90 días después de administración de la vacuna de fiebre amarilla . De acuerdo con una forma de realización particular, el flavivirus quimérico usado en la vacuna del dengue de la invención se compone de un esqueleto de virus de fiebre amarilla 17D (YF17D) . De acuerdo con otra forma de realización, la vacuna de virus de fiebre amarilla usada en el método de la invención comprende una cepa YF17D.

De acuerdo con otra forma de realización, la vacuna de flavivirus quimérico usada en el método de la presente invención comprende un flavivirus quimérico comprendiendo un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y de cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un virus de serotipo 1 del dengue . De acuerdo con otra forma de realización, la vacuna de flavivirus quimérico usada en el método de la invención comprende un flavivirus quimérico comprendiendo un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y de cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un virus de serotipo 2 del dengue. De acuerdo con otra forma de realización, la vacuna de flavivirus quimérico usada en el método de la invención comprende un flavivirus quimérico que comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con secuencias que codifican las proteínas se membrana y cápsula de un virus de serotipo 3 del dengue. De acuerdo con otra forma de realización, la vacuna de flavivirus quimérico usada en el método de la invención comprende un flavivirus quimérico que comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con secuencias que codifican las proteínas se membrana y cápsula de un virus de serotipo 4 del dengue. De acuerdo con una forma de realización particular, la vacuna de flavivirus quimérico usada en el método de la presente invención es una vacuna monovalente o una vacuna tetravalente. De acuerdo con otra forma de realización, el método de la invención además comprende la administración de una dosis de refuerzo de la vacuna de flavivirus quimérico anteriormente definida, 6 meses a 10 años después de la primera dosis de la vacuna de flavivirus quimérico. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende: (i) una vacuna de virus de fiebre amarilla, y (ii) una vacuna de flavivirus quimérico que comprende por lo menos un flavivirus quimérico que comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual la secuencia que codifica la proteína de cápsula del virus de fiebre amarilla ha sido reemplazada con la secuencia que codifica la proteína de cápsula de un virus del dengue. En un ejemplo, la secuencia de cápsula del dengue es una secuencia revuelta. De acuerdo con una forma de realización, el flavivirus quimérico comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y de cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un virus del dengue. En un ejemplo, cualquiera una o ambas de estas secuencias del dengue son secuencias revueltas. De acuerdo con una forma de realización del kit de la invención, la vacuna de virus de fiebre amarilla comprende una cepa YF17D, donde YF17D comprende un número de sub-cepas usadas para vacunación contra fiebre amarilla (incluyendo 17D-204, 17D-213 y 17DD) . De acuerdo con otra forma de realización, el flavivirus quimérico se compone de un esqueleto de virus YF17D. De acuerdo con otra forma de realización del kit de la invención, la vacuna de flavivirus quimérico comprende un flavivirus quimérico que comprende un esqueleto de virus YF17D en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y de cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un virus de serotipo 1 del dengue. De acuerdo con otra forma de realización del kit de la invención, la vacuna de flavivirus quimérico comprende un flavivirus quimérico que comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y de cápsula del virus YF17D han sido reemplazadas con secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un virus de serotipo 2 del dengue.

De acuerdo con otra forma de realización del kit de la invención, la vacuna de flavivirus quimérico comprende un flavivirus quimérico que comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y de cápsula del virus YF17D han sido reemplazadas con secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un virus de serotipo 3 del dengue. De acuerdo con otra forma de realización del kit de la invención, la vacuna de flavivirus quimérico comprende un flavivirus quimérico que comprende un esqueleto de virus YF17D en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y de cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un virus de serotipo 4 del dengue. De acuerdo con otra forma de realización el kit como se define anteriormente además comprende por lo menos una dosis de refuerzo de una vacuna de flavivirus quimérico como se define anteriormente . De acuerdo con otra forma de realización, la invención se refiere al uso de los virus mencionados anteriormente y en otros puntos en la presente en la prevención y tratamiento de infección de virus del dengue, así como el uso de estos virus en la preparación de medicamentos para este propósito. Definiciones Por "respuesta inmune de neutralización cruzada" se entiende una respuesta inmune específica que comprende anticuerpos de neutralización contra múltiples serotipos del dengue diferentes (hasta 4) . Inducción de una respuesta inmune de neutralización cruzada puede determinarse fácilmente por un ensayo de neutralización de placas de referencia (PRNT50) . Por ejemplo, inducción de una respuesta inmune de neutralización cruzada se puede determinar por uno de los ensayos PRNT50 como se describe en el ejemplo 1. Una muestra de suero se considera positiva para la presencia de anticuerpos de neutralización cruzada cuando el título de anticuerpo neutralizante así determinado es por lo menos superior o igual a 1:10 en por lo menos uno de estos ensayos. Por "respuesta inmune de largo plazo" se entiende una respuesta inmune de neutralización cruzada positiva como se define anteriormente, la cual se puede detectar en suero humano por lo menos 6 meses, ventajosamente, por lo menos 12 meses después de la administración de una vacuna de flavivirus quimérico como se define mas adelante. Por "paciente" se entiende individuos susceptibles a fiebre amarilla incluyendo adultos y niños. Por individuos "susceptibles a fiebre amarilla" se entiende individuos sin vacunación documentada contra fiebre amarilla por mas de 10 años y/o sin infección de virus de fiebre amarilla certificada por mas de 10 años. Por "individuos inmunes a fiebre amarilla" se entiende, dentro del marco de la presente invención, individuos con una vacunación documentada contra fiebre amarilla y/o con una infección de virus de fiebre amarilla certificada que ha ocurrido 10 años atrás o menos, v.gr., 5 años o menos, v.gr., 4, 3, 2, o 1 año atrás, o aun 6, 5, 4, 3, o 2 meses atrás, y en algún caso mas de 30 días atrás. Por "flavivirus quimérico" se entiende un flavivirus quimérico compuesto de un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual la secuencia que codifica la proteína de cápsula del virus de fiebre amarilla ha sido reemplazada con la secuencia que codifica la proteína de cápsula de un virus del dengue. Ventajosamente, un flavivirus quimérico se compone de un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un virus del dengue. El esqueleto de fiebre amarilla puede ventajosamente ser de una cepa de vacuna, tal como YF17D o YF17DD. Estos flavivirus quiméricos se definen en mas detalle mas adelante y son nombrados YF/dengue-N, con N identificando el serotipo de dengue. Por "vacuna de flavivirus quimérico" se entiende una composición inmunógena comprendiendo una cantidad inmunoefectiva de por lo menos un flavivirus quimérico como se define anteriormente y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La vacuna de flavivirus quimérico se dice que es "monovalente" cuando la vacuna comprende flavivirus quimérico que expresa proteína de un serotipo de dengue. Ejemplos de vacunas monovalentes son vacunas comprendiendo YF/dengue-1, YF/dengue-2, YF/dengue-3, o YF/dengue-4, ventajosamente YF/dengue-2. La vacuna de flavivirus quimérico se dice que es "bivalente" cuando la vacuna comprende flavivirus quiméricos que expresan proteínas de dos serotipos de dengue diferentes. Ejemplos de vacunas bivalentes son vacunas que comprenden YF/dengue-2 y YF/dengue-4, o YF/dengue-2 y YF/dengue-3, o YF/dengue-2 y YF/dengue-1. La vacuna de flavivirus quimérico se dice que es "trivalente" cuando la vacuna comprende flavivirus quiméricos que expresan proteínas de tres serotipos de dengue diferentes. Ejemplos de vacunas trivalentes son vacunas que comprenden YF/dengue-2, YF/dengue-1, y YF/dengue-4, o YF/dengue-2, YF/dengue-3, y YF/dengue-4. La vacuna de flavivirus quimérico se dice que es "tetravalente" cuando la vacuna comprende flavivirus quiméricos que expresan proteínas de cuatro serotipos de dengue diferentes. Un ejemplo de una vacuna tetravalente es una vacuna que incluye YF/dengue-1, YF/dengue-2, YF/dengue-3, y YF/dengue-4. Por "cantidad inmunoefectiva de un flavivirus quimérico" se entiende una cantidad de un flavivirus quimérico capaz de inducir, después de administración en un individuo inmune a fiebre amarilla, una respuesta inmune de neutralización cruzada como se define anteriormente. Típicamente, una cantidad inmunoe-fectiva de un flavivirus quimérico se compone entre 102 y 107, v.gr., entre 103 y 106, tal como una cantidad de 104, 105, o 106, unidades infecciosas (v.gr., unidades formadoras de placas o dosis infecciosas en cultivo de tejido) por serotipo, por dosis. Una ventaja central del método de la presente invención es la habilidad para inducir anticuerpos neutralizantes contra todos los cuatro serotipos de dengue rápidamente y simultáneamente, con ello protegiendo contra fiebre de dengue y así evitando los riesgos potenciales asociados de desarrollar fiebre hemorrágica del dengue en exposición natural subsecuente a infección del dengue. Anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la proteína de cápsula del dengue se consideran el mediador principal de inmunidad protectora contra infección, por lo tanto la demostra-ción de anticuerpos neutralizantes se considera como un sustituto relevante de una inmunidad neutralizante en pacientes. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada, las reivindicaciones, y los dibujos. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es una gráfica que muestra respuestas de IFN? a vacuna (Día 31 de estudio menos Día 1) . Las dos dosis de ChimeriVax-Den2 dieron respuestas de células T equivalentes. La respuesta no se inhibió en sujetos previamente vacunados con una vacuna de virus de fiebre amarilla.

Descripción Detallada La invención proporciona un método para inducir en un paciente inmunidad de largo plazo, de neutralización cruzada, para todos los cuatro serotipos del dengue (1-4) usando un procedimiento simple de dos pasos. La población apuntada está así compuesta especialmente de los siguientes pacientes en riesgo de infección del dengue: viajeros al extranjero, expatriados y personal militar, así como habitantes de regiones en las cuales el dengue es endémico. En este método, un paciente es inmunizado primero con una dosis (de preferencia una dosis, pero posiblemente mas de una dosis (v.gr., 2 o 3 dosis)) de una vacuna de virus de fiebre amarilla (v.gr., una vacuna atenuada viva, comercialmente disponible, ver mas adelante) . Después de un intervalo de tiempo apropiado de por lo menos 30 días, el cual permite en particular para el estado en reposo de la respuesta inmune innata inducida por la vacuna del virus de fiebre amarilla, el segundo paso en el método se lleva a cabo, el cual involucra la administración de una dosis de una vacuna de flavivirus quimérico comprendiendo uno o mas virus quiméricos atenuados vivos, cada uno comprendiendo un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual una o mas secuencias que codifican proteínas estructurales (v.gr., proteínas de pre-membrana y cápsula) han sido reemplazadas con las secuencias que codifican a las proteínas correspondientes de un virus de dengue (v.gr., dengue 1, 2, 3, o 4) . Los presentes inventores han mostrado que esta secuencia de inmuniza- ción produce títulos de anticuerpos neutralizantes altos contra todos los cuatro serotipos de dengue. Estos anticuerpos persisten en altos niveles sobre 6 meses y aun sobre 12 meses después de la administración de vacuna contra el dengue, indicando que inmunidad contra dengue amplia fue de largo plazo. Dado que el agente inmunizante/primario inicial (vacuna de fiebre amarilla) es incapaz de sensibilizar al sujeto a DHF, no hay peligro que la inoculación primaria, primera, deje al sujeto vulnerable a esta enfermedad si la segunda inyección se retrasa o no se lleva a cabo. Estos resultados fueron inesperados, como aun infección secuencial con dos serotipos del virus del dengue, los cuales están relacionados de manera mucho mas cercana entre sí con base en la secuencia de genoma y relaciones antigénicas que lo que la fiebre amarilla se relaciona al dengue, no inducen protección sólida o respuestas de anticuerpo de neutralización cruzada amplia contra infección con los dos serotipos del dengue restantes. Demostración adicional de la naturaleza inesperada del método de vacunación secuencial de la invención se proporcionó por una examinación de respuesta del anticuerpo de fiebre amarilla siguiendo al segundo paso (inoculación del virus del dengue quimérico) . El método de la invención se describe adicionalmente, como sigue. Vacunas del Virus de Fiebre Amarilla Como se menciona anteriormente, el primer paso del método de la invención involucra administración a un paciente de una dosis de una vacuna del virus de fiebre amarilla. Ejemplos de tales vacunas que se pueden usar en la invención incluyen vacunas atenuadas vivas, tales como aquellas derivadas de la cepa YF17D, la cual se obtuvo originalmente por atenuación de la cepa Asibi de tipo salvaje (Smithburn y colaboradores, "Yellow Fever Vaccination" , World Health Organization, p. 238, 1956; Freestone, en Plotkin y colaboradores (editores), Vaccines, 2da. edición, W. B. Saunders, Filadelfia, Estados Unidos, 1995) . Un ejemplo de una cepa YF17D a partir de la cual vacunas que se pueden usar en la invención se puede derivar es YF17D-204 (YF-VAX, Sanofi-Pasteur, Swiftwater, Pennsylvania, Estados Unidos; Stamaril, Sanofi-Pasteur, Marcy-L' Etoile, Francia; ARILVAX, Chiron, Speke, Liverpool, Reino Unido; FLAVIMUN, Berna Biotech, Berna, Suiza; YF17D-204 France (X15067, X15062); YF17D-204, 234 US (Rice y colaboradores, Science 229:726-733, 1985)), mientras que otros ejemplos de tales cepas que se pueden usar están relacionados de manera cercana con la cepa YF17DD (Número de Acceso GenBank No. 17066), YF17D-213 (Número de Acceso GenBank No. U17067) , y cepas 17DD del virus de fiebre amarilla descritas por Galler y colaboradores, Vaccines 16(9/10) : 1024-1028, 1998. Además de estas cepas, cualquier otra cepa de vacuna del virus de fiebre amarilla encontrada como siendo atenuada aceptablemente en humanos, tales como pacientes humanos, se puede usar en la invención. Las vacunas del virus de fiebre amarilla usadas en la invención se pueden obtener a partir de fuentes comerciales (ver anteriormente) o pueden prepararse usando métodos que son bien conocidos en la materia. En un ejemplo de tales métodos, embriones de pollos son inoculados con virus en un nivel de paso fijo, y luego virus aislado de sobrenadantes de homogeneizado centrifugado se seca por congelación. En otros métodos, la cepa de fiebre amarilla se hace crecer en fibroblastos de embrión de pollo cultivados (ver, v.gr, Freiré y colaboradores, Vaccine 23(19) =2501-2512, 2005) u otras células cultivadas para fabricación de vacunas virales tales como células Vero. Las vacunas del virus de fiebre amarilla generalmente se almacenan en forma liofilizada previo al uso. Cuando se necesitan para administración, las vacunas son reconstituidas en una solución acuosa (típicamente, alrededor de 0.5 mL) , tal como una solución de cloruro de sodio al 0.4%, y luego se administran por inyección subcutánea en, v.gr., el músculo deltoide. Otros modos de administración determinados como siendo apropiados por los técnicos en la materia (v.gr., inyección intramuscular o intradérmica, o administración percutánea usando métodos que entregan virus a las capas superficiales de la piel) también se pueden usar. La vacuna se puede administrar en dosis variando de, por ejemplo, 2-5 (v.gr., 3 o 4) log10 unidades formadoras de placa (UFP) por dosis. Todas las vacunas comercializadas se usan de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En una forma de realización, el primer paso del método de la invención consiste de la administración de una dosis de Stamaril o de una dosis de YF-VAX. El método de la presente invención también se puede adaptar para usarse con pacientes inmunes a fiebre amarilla. En tal un caso, el método solamente comprende el segundo paso involucrando la administración de una dosis de una vacuna de flavivirus quimérico como se define mas adelante. El dicho método también se incluye dentro del alcance de la presente invención. Vacunas de Flavivirus Quimérico El segundo paso del método de inmunización de acuerdo con la invención comprende administración de una dosis de una vacuna de flavivirus quimérico como se define anteriormente. Por motivos de claridad, en la siguiente descripción, la invención es solamente definida en relación con el uso de flavivirus quiméricos en los cuales el flavivirus quimérico se compone de un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y de cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con las secuencias que codifican las proteínas de membrana y de cápsula de un virus del dengue. La invención también incluye el uso de otras quimeras, tales como quimeras en las cuales solamente una proteína (v.gr., la proteína de cápsula) de una cepa de vacuna de fiebre amarilla ha sido reemplazada, o quimeras en las cuales todas las tres proteínas estructurales han sido reemplazadas. Virus quiméricos que se pueden usar en la presente invención incluyen aquellos con base en la cepa de vacuna de fiebre amarilla humana, YF17D (v.gr., YF17D-204, YF17D-213, o YF17DD) , como se describe anteriormente. En estos virus, las proteínas de pre-membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla se reemplazan con las proteínas de pre-membrana y cápsula de un virus del dengue (serotipo 1, 2, 3, o 4) . En una forma de realización de la presente invención, los virus quiméricos se componen de un esqueleto YF17D-204 en el cual las secuencias que codifican las proteínas de pre-membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla se reemplazan con las secuencias que codifican las proteínas de pre-membrana y cápsula de serotipos 1, 2, 3, y/o 4 del dengue de tipo salvaje, v.gr., con las secuencias que codifican las proteínas de pre-membrana y cápsula de virus del dengue 1 PUO-359, virus del dengue 2 PUO-218, virus del dengue 3 PaH-881/88, o virus del dengue 4 1228. Detalles de la construc-ción de estas construcciones de virus quiméricos y relacionadas se proporciona, por ejemplo, en las siguientes publicaciones: WO 98/37911; WO 01/39802; Chambers y colaboradores, J. Virol . 73:3095-3101, 1999; WO 03/103571; WO 2004/045529; patente US 6,696,281; patente US 6,184,024; patente US 6,676,936; patente US 6,497,884; Guirakhoo y colaboradores, J. Virology 75:7290-7304, 2001; Guirakhoo y colaboradores, Virology 298:146-159, 2002; y Caufour y colaboradores, Virus Res . 79(1-2) :1- 14, 2001. Como un ejemplo específico de un flavivirus quimérico que se puede usar en la invención, se hace nota del siguiente flavivirus quimérico, el cual se depositó en la Colección de Cultivos de Tipo Americana (American Type Culture Collection, ATCC) en Manassas, Virginia, Estados Unidos, bajo los términos del Tratado de Budapest y otorgado una fecha de depósito del 6 de enero de 1998: Virus de Fiebre Amarilla 17D/Dengue Tipo 2 Quimérico (YF/DEN-2; número de acceso ATCC VR-2593) . Los flavivirus quiméricos usados en los métodos de la invención pueden, opcionalmente, incluir mutaciones atenuantes en secuencias de virus del dengue. Por ejemplo, las secuencias del dengue pueden incluir una supresión o sustitución de aminoácido de cápsula 204 (serotipos de dengue 1, 2, y 4) o 202 (serotipo de dengue 3) , el cual es lisina en los virus de tipo salvaje. En un ejemplo de tal una sustitución, la lisina en esta posición se reemplaza con arginina. En otros ejemplos, uno o mas otros aminoácidos en la región de aminoácidos 200-208 (o combinaciones de estos aminoácidos) es mutada, con ejemplos específicos incluyendo los siguientes: posición 202 (K) de dengue 1; posición 202 (E) de dengue 2; posición 200 de dengue 3 (K) ; y posiciones 200 (K) , 202 (K) , y 203 (K) de dengue 4. Estos residuos se pueden sustituir con, por ejemplo, arginina. Estas mutaciones se describen en detalle en WO 03/103471, el contenido de las cuales se incorpora en la presente por referencia. Además de las quimeras descritas anteriormente, otras quimeras que contienen proteínas estructurales incluyendo epítopes de mas de un serotipo de virus del dengue (2, 3, o 4) pueden usarse en la invención. En un ejemplo, quimeras pueden hacerse usando tecnología de revoltura, la cual involucra ciclos de fragmentación, reunión, y selección de secuencias que están siendo revueltas (ver, v.gr., Locher y colaboradores, DNA Cell Biol . 24(4) :256-263, 2005) . Así, en el caso presente, secuencias codificando proteínas de cápsula y/o pre-membrana a partir de un sub-conjunto deseado de serotipos del dengue (o todos los serotipos del dengue) puede procesarse en esta manera para generar secuencias de cápsula y/o pre-membrana revueltas, las cuales se usan entonces para sustituir las secuencias correspon-dientes de un esqueleto de virus de fiebre amarilla como se describe en la presente (v.gr., YF17D) . Tal un revolvente YF/Denl-4 quimérico (asumiendo que las secuencias revueltas incluyen epítopes de todos los cuatro serotipos) pueden producirse mediante, por ejemplo, transfección de células Vero con transcripciones de ARN quimérico y recuperación de virus vivo del sobrenadante como se describe previamente (Guirakhoo y colaboradores, J. Virol . 75 (16) :7290-7304, 2001) y mencionado en otros puntos en la presente. Estas quimeras revueltas pueden usarse en la invención en regímenes de vacunación involucrando administra-ción de la quimera revuelta siguiendo vacunación de fiebre amarilla (v.gr., YF17D) , o en cualquiera de los métodos de combinación descritos en otros puntos en la presente. Los virus quiméricos descritos anteriormente se pueden hacer usando métodos estándar en la materia. Por ejemplo, una molécula de ARN correspondiente al genoma de un virus puede introducirse en células primarias, embriones de pollo, o líneas de células diploides, a partir de las cuales (o los sobrenadantes de los cuales) virus de progenie pueden purificarse entonces. Otros métodos que se pueden usar para producir los virus emplean células heteroploides, tales como células Vero (Yasumura y colaboradores, Nihon Rinsho 21:1201-1215, 1963) . En un ejemplo de tales métodos, una molécula de ácido nucleico (v.gr., una molécula de ARN) correspondiente al genoma de un virus se introduce en las células heteroploides, virus se cosecha a partir del medio en el cual las células se han cultivado, virus cosechados se tratan con una nucleasa (v.gr., una endonucleasa que degrada tanto ADN y ARN, tal como Benzonase; patente US 5,173,418), el virus tratado con nucleasa se concentra (v.gr., por uso de ultrafiltración usando un filtro teniendo un corte de pesos moleculares de, v.gr., 500 kDa), y el virus concentrado se formula para propósitos de vacunación. Detalles de este método se proporcionan en WO 03/060088 A2 , la cual se incorpora en la presente por referencia. Además, métodos para producir virus quiméricos se describen en los documentos citados anteriormente en referencia a la construcción de construcciones de virus quiméricos . Formulación de los virus quiméricos usados en los métodos de la invención puede llevarse a cabo usando métodos que son estándar en la materia. Numerosas soluciones farmacéuticamen-te aceptables para uso en preparación de vacuna son bien conocidas y fácilmente se pueden adaptar para uso en la presente invención por los técnicos en la materia (ver, v.gr., Remington ' s Pharmaceutical Sciences (18va. edición), editor A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co . , Easton, Pennsylvania, Estados Unidos). En dos ejemplos específicos, los virus se formulan en Medio Esencial Mínimo de Sal de Earle (MEME) conteniendo 7.5% de lactosa y 2.5% albúmina de suero humana o MEME conteniendo 10% de sorbitol. Sin embargo, los flavivirus quiméricos pueden diluirse simplemente en una solución fisiológicamente aceptable, tal como solución salina estéril o solución salina amortiguada estéril. En otro ejemplo, los virus pueden administrarse y formularse, por ejemplo, en la misma manera como la vacuna de fiebre amarilla 17D, v.gr., como una suspensión clarificada de tejido de embrión de pollo infectado o un fluido cosechado a partir de cultivos celulares infectado con un virus quimérico. Las vacunas de flavivirus quimérico de la invención se almacenan de manera clásica ya sea en la forma de una composición líquida congelada o en la forma de un producto liofilizado. Para ese propósito, los flavivirus quiméricos se pueden mezclar con un diluyente de manera clásica una solución acuosa amortiguada comprendiendo compuestos crioprotectores tales como alcohol de azúcar y estabilizante. Antes del uso, el producto liofilizado se mezcla con un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable tal como una solución estéril de NaCl al 4% para reconstituir una vacuna de flavivirus quimérico inyectable líquida.

En el método de la invención, la vacuna de flavivirus quimérico puede ser una vacuna monovalente, bivalente, trivalente o tetravalente. De acuerdo con una forma de realización, la vacuna de flavivirus quimérico es una vacuna monovalente en la cual el virus quimérico se compone de un esqueleto de YF17D-204 en el cual las secuencias que codifican las proteínas de pre-membrana y de cápsula del virus de fiebre amarilla se reemplazan las proteínas de pre-membrana y de cápsula de virus del dengue 2 PUO-218. De acuerdo con otra forma de realización, la vacuna de flavivirus quimérico es una vacuna tetravalente, es decir, una vacuna comprendiendo virus quiméricos que expresan antígenos de los cuatro serotipos de virus del dengue (1 a 4) . En una forma de realización particular, esta vacuna tetravalente incluye ventajosamente cuatro flavivirus quiméricos compuestos respectivamente de un esqueleto YF17D-204 en el cual las secuencias que codifican proteínas de pre-membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla se reemplazan con secuencias que codifican las proteínas de pre-membrana y cápsula de virus del dengue 1 PUO-359 (YF/dengue 1) , virus del dengue 2 PUO-218 (YF/dengue 2) , virus del dengue 3 PaH-881/88 (YF/dengue 3) , o virus del dengue 4 1228 (YF/dengue 4) . Esta vacuna tetravalente específica es llamada en el ejemplo 2 siguiente ChimeriVax-DEN tetravalente. Ejemplos de vacunas de flavivirus quimérico tetravalen- te apropiadas para usarse en el método de la invención se describen también en detalle en WO 03/101397, el contenido de las cuales se integra en la presente por referencia. Vacunas multivalentes pueden obtenerse mediante combinar vacunas del dengue monovalentes individuales. Los virus quiméricos de la invención se pueden administrar usando métodos que son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, los virus se pueden formular como soluciones acuosas estériles conteniendo entre 102 y 107, v.gr., conteniendo entre 103 y 106, tal como 104, 105, o 106 unidades infecciosas (v.gr., unidades formadoras de placas o dosis infecciosas en cultivo de tejido) por serotipo en un volumen de dosis de 0.1 a 1.0 mL, para ser administrados mediante, por ejemplo, rutas subcutáneas, intramusculares, o intradérmicas . En una forma de realización, -la vacuna de flavivirus quimérico es una vacuna monovalente, bivalente, trivalente, o tetravalente que comprende ventajosamente 105 ufp por serotipo, por dosis, y se administra de manera subcutánea. Además, debido a que los flavivirus pueden ser capaces de infectar un hospedero humano mediante rutas mucosales, tales como la ruta oral (Gresikova y colaboradores, "Tick-borne Encephalitis" en The Arboviruses, Ecology and Epide iology, Monath (editor) , CRC Press, Boca Ratón, Florida, Estados Unidos, 1988, volumen IV, 177-203), una administración por rutas mucosales (v.gr., orales) también se podría contemplar. Opcionalmente, adyuvantes que son conocidos por los técnicos en la materia se pueden usar en la administración de los virus usados en la invención. Adyuvantes que se pueden usar para acrecentar la inmunogenicidad de los flavivirus quiméricos incluyen, por ejemplo, agonistas y antagonistas de receptores tipo Toll (TLRs) . Métodos de Inmunización Como se menciona anteriormente, la invención generalmente involucra administración de una cepa de vacuna de fiebre amarilla (v.gr., una cepa YF17D, como se menciona anteriormente) , seguida por administración de uno o mas flavivirus quiméricos, en cada uno de los cuales las proteínas de pre-membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con las proteínas correspondientes de un virus del dengue (serotipo 1, 2, 3, o 4) . La vacuna del virus de fiebre amarilla se administra usando métodos estándar (v.gr., por inyección subcutánea, intramuscular, o intradérmica, o por administración percutánea empleando un dispositivo que entrega virus a la piel superficial) , en cantidades variando de, por ejemplo, 2-5 (v.gr., 3 o 4) log10 unidades formadoras de placa (UFP) por dosis, la cual es típicamente un volumen de alrededor de 0.5 mL para inyección subcutánea, 0.1 mL para inyección intradérmica, o 0.002-0.02 mL para administración percutánea. Para permitir un tiempo suficiente para reposo de la respuesta inmune innata inducida por la vacuna de fiebre amarilla, la vacuna de flavivirus quimérico se administra por lo menos entre 30 días y 10 años, en particular entre 30 días y 5 años, tal como entre 30 días y 1 a 3 años, ventajosamente, 30, 60, o 90 días, después de la vacuna de fiebre amarilla, usando métodos estándar y en cantidades variando de 102 y 107, v.gr., de 103 y 106, tal como 104, 105, o 106 unidades infecciosas (expresadas como ufp o dosis de infección en cultivo de tejido) por serotipo por dosis. Además, en el caso de administración de formulaciones bi-, tri-, o tetra-valentes (ver mas adelante), en general, las cantidades de cada quimera en tal una vacuna son equivalentes, aunque el uso de cantidades diferentes de cada quimera también se incluye en la invención. Los métodos de la invención pueden así involucrar, por ejemplo, administración de una vacuna de virus de fiebre amarilla en el Día 0 y administración de una quimera YF/dengue- 1, YF/dengue-2, YF/dengue-3, y/o YF/dengue-4 en el Día 30 (o en un momento posterior, como se menciona anteriormente) . La quimera se puede administrar como una vacuna monovalente (es decir, una vacuna incluyendo solamente uno de los siguientes virus quiméricos: YF/dengue- 1, YF/dengue-2, YF/dengue-3, o YF/dengue-4) , una formulación bivalente (v.gr., una vacuna incluyendo dos de las quimeras enlistadas anteriormente, v.gr., incluyendo ventajosamente YF/dengue-2 y YF/dengue-4, o YF/dengue-2 y YF/dengue-3, o YF/dengue-2 y YF/dengue-1) , una vacuna trivalente (v.gr., una vacuna incluyendo tres de las quimeras enlistadas anteriormente, ventajosamente, una vacuna comprendiendo YF/dengue-2, YF/dengue- 1, y YF/dengue-4, o YF/dengue-2, YF/dengue-3, y YF/dengue-4) , o una vacuna tetravalente. El método de la invención lleva a una seroconversión (es decir, inducción de una respuesta inmune neutralizante) para cuatro serotipos de dengue después de solamente una dosis de la vacuna de flavivirus quimérico. Aunque dosis adicionales de la vacuna de flavivirus quimérico no se necesitan para alcanzar la seroconversión deseada y respuesta inmune de neutralización cruzada de largo plazo, administración de dosis de refuerzo de la vacuna de flavivirus quimérico se contemplan en la presente invención. Las dosis de refuerzo de la vacuna quimérica de la invención pueden ser necesarias para sostener la respuesta inmune de neutralización cruzada por un periodo de tiempo mas largo y se pueden administrar entre 6 meses y 5 a 10 años después de la primera dosis de vacuna del dengue quimérica, v.gr., 6 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años, o 5 años, o aun 10 años después de la primera dosis de vacuna de flavivirus quimérico. La vacuna de flavivirus quimérico de refuerzo puede ser diferente o ventajosamente idéntica a la primera vacuna de flavivirus quimérico administrada. La descripción dada anteriormente con relación a la vacuna de flavivirus quimérico para ser administrada en el método de la invención aplica mutatis mutandis a la vacuna de refuerzo de flavivirus quimérico. El refuerzo puede ser así una vacuna monovalente, bivalente, trivalente, o tetravalente, con respecto a los serotipos del dengue presentes en la vacuna. Así, un ej emplo de un método de la invención puede involucrar administración de una dosis de vacuna de fiebre amarilla, seguida por una dosis de una vacuna de flavivirus quimérico monovalente (dengue 1, 2, 3, o 4, ventajosamente, dengue 2), la cual es entonces seguida por administración de (i) una vacuna de flavivirus quimérico monovalente del mismo o diferente serotipo como la quimera administrada inicialmente (ventajosamente del serotipo 4), (ii) una vacuna de flavivirus quimérico bivalente, la cual puede o no incluir el mismo serotipo como la quimera inicial (v.gr., ventajosamente dengue 1 y 2 seguido por dengue 3 y 4), (iii) una vacuna de flavivirus quimérico trivalente, la cual puede o no incluir el mismo serotipo como la quimera inicial, o (iv) una vacuna de flavivirus quimérico tetravalente. La vacuna de flavivirus quimérico de refuerzo es ventajosamente idéntica a la primera vacuna de flavivirus quimérico con respecto a su composición de antígenos. La invención así también se refiere a una composición para inducir en un paciente una respuesta inmune de neutralización cruzada, de largo plazo, al virus del dengue incluyendo (i) una vacuna de virus de fiebre amarilla y (ii) una vacuna de flavivirus quimérico para una administración secuencial, en la cual la vacuna de fiebre amarilla quimérica se administra por lo menos 30 días y hasta 10 años después de administración de la vacuna de virus de fiebre amarilla. La invención también incluye kits que incluyen una vacuna de virus de fiebre amarilla y/o una o mas vacunas de flavivirus quimérico, como se describe en la presente. Los kits de la invención también pueden incluir instrucciones para usar los kits en los métodos de vacunación descritos en la presente. Estas instrucciones pueden incluir, por ejemplo, indicaciones acerca de las cantidades de vacuna a administrar y/o información de cuando se deben administrar las vacunas. Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en esta especificación son incorporadas en la presente por referencia como si cada publicación individual o solicitud de patente se indicara específicamente e individualmente para incorporarse por referencia. La invención se basa, en parte, en los resultados experimentales descritos en los siguientes ejemplos. Ejemplos En los ejemplos expresados a continuación, experimentos y estudios clínicos se describen los cuales muestran los efectos de inmunidad previa a virus de fiebre amarilla en vacunación subsecuente con una vacuna de YF/dengue-2 quimérica (ejemplo 1) o una vacuna tetravalente (YF/dengue-1 , YF/dengue-2, YF/dengue-3, y YF/dengue-4) (ejemplo 2) . Estos estudios incluyen análisis de anticuerpos neutralizantes, seroconversión, viremia, y respuestas de células T. Ejemplo 1: ChimeriVax-Den2 Vacuna YF17D comercial (YF-VAX) se adquirió de Aventis- Pasteur, Swiftwater, Pennsylvania, Estados Unidos. ChimeriVax-Den2 es un virus diseñado genéticamente, atenuado, vivo, en el cual las secuencias que codifican dos proteínas estructurales (prM y E) del virus de vacuna YF17D se reemplazan con las secuencias correspondientes del virus DEN2 (cepa PUO-218 aislada de un caso de fiebre de dengue clásica, Bangkok, Tailandia) . La construcción genética de un genoma viral quimérico se logra usando ácido desoxirribonucleico clonado circular (cADN) . cADN de longitud completa se transcribe a ácido ribonucleico (ARN) y el ARN se usa para transfectar cultivos celulares, los cuales producen virus vivo (Guirakhoo y colaboradores, J". Virol . 75:7290-7304, 2001) . El virus de vacuna se produjo de acuerdo con Buena Práctica de Fabricación (cGMP) . El virus se hizo crecer en células Vero (riñon de mono verde africano) a partir de bancos de células que han sido probados para agentes adventicios, de acuerdo con los lineamientos de la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos (Food and Drug Administration, FDA) para productos derivados de cultivos celulares de mamíferos. Fluido sobrenadante a partir de cultivos de células Vero conteniendo virus de vacuna se cosechan, clarifican a partir de desecho celular por filtración, y se tratan con una nucleasa (Benzonase) para digerir moléculas de ácido nucleico derivadas de células hospederas. El virus en volumen tratado con nucleasa entonces e concentra por ultrafiltración y se purifica por diafiltración. La vacuna es formulada con Albúmina de Suero Humano (HSA) USP (2.5%) y lactosa USP (7.5%) . La vacuna se mostró siendo estéril y libre de micoplasma, retrovirus [por Transcrip-tasa Inversa Acrecentada por Producto (PERT) ] , y virus adventi-cios por pruebas in vi tro e in vivo . El frasco final de vacuna se prueba para esterilidad, potencia, identidad, pH, apariencia, osmolaridad, HSA, lactosa, endotoxina, seguridad (seguridad general modificada en ratones y cochinillos de Indias) , y neurovirulencia en ratones. Estudios preclínicos en monos mostraron que ChimeriVax- DEN2 es altamente inmunógena y bien tolerada después de inoculación de dosis variando de 2 a 5 log10 UFP (Guirakhoo y colaboradores, J". Virol . 74(12) : 5477-5485, 2000) . Una viremia de bajo grado ocurrió durante la primera semana después de vacunación en monos, similar a aquella inducida por vacuna de fiebre amarilla 17D. Una sola inyección subcutánea de 2 log10 UFP de vacuna (la dosis probada mínima) indujo anticuerpos neutralizantes después de 15-30 días, los cuales protegieron contra reto con virus DEN2 de tipo salvaje. Estudio clínico con vacuna ChimeriVax-DEN2 monovalente Un estudio de paciente de salida de un solo centro, doble ciego, aleatorio, se llevó a cabo. Después de seleccionar, sujetos susceptibles a fiebre amarilla (YF) elegibles se aleatorizaron a una sola vacunación con una dosis baja o alta de ChimeriVax-DEN2 (3.0 o 5.0 log10 unidades formadoras de placas) o YF-VAX. También hubo un componente abierto en el cual la respuesta de anticuerpos a vacunación de ChimeriVax-DEN2 de alta dosis se evaluó en sujetos inmunes a YF. Sujetos se siguieron en los Días 1-11, 21, y 31 para respuesta de anticuerpos y evalua-ciones de seguridad, y la durabilidad de la respuesta de anticuerpos se evaluó en 6 y 12 meses post -vacunación. Después de seleccionar, 42 sujetos susceptibles a YF elegibles se aleatorizaron equivalentemente en 3 grupos (dosis alta o baja de ChimeriVax-DEN2 o YF-VAX) . En el Día 1, 14 sujetos recibieron una sola vacunación subcutánea (SC) con ChimeriVax-DEN2 (dosis alta o baja) o YF-VAX. 14 sujetos adicionales que fueron inmunes a YF (de vacunación contra YF previa hecha 6 meses a 5 años antes de la administración de vacuna del dengue quimérica) recibieron ChimeriVax-DEN2 de alta dosis. Los sujetos regresaron a la clínica en los Días 2-11, 21, y 31. Evaluaciones de seguridad se llevaron a cabo en puntos de tiempo específicos durante los Días 1-31. Las respuestas de anticuerpo a cepas de vacuna homologas y cepas de tipo salvaje de DEN2 , y anticuerpos neutralizantes a YF17D y cepas prototipo de DEN 1-4, se midieron en los Días 1 (pre-vacunación) y 31. El estudio se puso a la vista después de terminación del periodo de tratamiento, y los sujetos se evaluaron en 6 y 12 meses post -vacunación para la durabilidad de respuesta de anticuerpos. La proporción de sujetos que desarrollaron anticuerpos neutralizantes en un nivel > 1:10 a cepas diferentes representan- do los cuatro serotipos de dengue se determinó. El efecto de inmunización previa con YF en la tasa de seroconversión de DEN2 en los grupos inmunes a YF y susceptibles a YF recibiendo dosis alta de ChimeriVax-DEN2 se analizó. La media geométrica de títulos de anticuerpos neutralizantes en cada grupo de tratamiento y para todos los cuatro serotipos de dengue se midió en varios intervalos de tiempo después de vacunación, hasta 12 meses. Viremia Virus circulando en la sangre (viremia) es una medida de replicación de las diferentes vacunas atenuadas, vivas, usadas en el estudio. La viremia se ensayó por un ensayo de placas en células Vero. El número de sujetos que desarrolló viremia en los 11 días después de vacunación se muestra por el día de la visita en la Tabla 1. Mas sujetos susceptibles a YF vacunados con ChimeriVax-DEN2 que YF-VAX desarrollaron viremia en uno o mas días de estudio: 8 (57%) en el grupo ChimeriVax-DEN2 log10 5.0 UFP y 9 (64%) en el grupo ChimeriVax-DEN2 log10 3.0 UFP, comparados con 2 (14%) en el grupo YF-VAX. Números ligeramente mayores de sujetos inmunes a YF, comparados con sujetos susceptibles a YF, desarrollaron viremia después de vacunación con ChimeriVax-DEN2 5.0 log10 UFP (11/14 [79%] en sujetos inmunes a YF vs . 8/14 [57%] en sujetos susceptibles a YF) , pero la diferencia no fue estadísticamente significativa (p=0.4724). La mayoría de los sujetos desarrollaron viremia entre los días 5-7. Las medidas de viremia cuantitativas (pico medio, duración media, AUC) también fueron mayores en el grupo inmune a YF, pero de nuevo las diferencias no fueron estadísticamente significativas y de manera importante no se observó impacto en el perfil de seguridad. Tabla 1. Resumen de medidas de viremia UFP . unidades formadoras de placa medidas en cultivos de células Vero 1 Área ajo la curva r Comparación en pares de Ch?mepVax-DEN2 5 0 loglO en sujetos susceptibles a YF contra inmunes Anticuerpos neutralizantes Tres cepas diferentes de tipo salvaje de dengue tipo 2 (16681, JAH, y PR-159), así como la cepa de vacuna homologa (ChimeriVax-DEN2 ) , se usaron en pruebas de neutralización. Cepas de tipo salvaje de serotipos heterólogos del dengue 1 (16007) , 3 (16562), y 4 (1036) también se usaron para medir la amplitud de la respuesta de anticuerpos neutralizantes. La proporción de sujetos seroconvirtiendo (demostrando un título de anticuerpos neutralizantes por lo menos superior o igual a 1:10 entre el Día 1 y el Día 30) se determinó. Además, la media geométrica de títulos de anticuerpos neutralizantes se midió. La Prueba de Neutralización de Reducción de Placas (PRNT50) usada para CVD2 , PR-159, y JAH comprende los siguientes pasos : Suero desactivado con calor se diluyó en serie dos veces y se mezcló con un volumen equivalente de virus para lograr 30-50 ufp/pozo. Las mezclas suero-virus se incubaron a 4°C por 18 +/- 2 horas, luego se añadieron a monocapas de células Vero en placas de cultivo de 12 pozos. Después de 60 +/- 10 minutos de incubación, las monocapas se cubrieron con 0.84% de carboximetilcelulosa en medio de cultivo. Las placas entonces se incubaron a 37°C bajo 5% de C02 por 3-5 días. Monocapas se fijaron con 7.4% de formalina, luego se bloquearon y permeabilizaron con 2.5% de leche seca descremada en PBS-Tween 20 mas 0.5% de Tritón X-100. Anticuerpo primario antidengue 2 (3H5, 1:5,000) se incubó 60 +/- 10 minutos, seguido por fosfatasa alcalina de cabra anti-IgG de ratón (1:500) . Después de 60 +/- 10 minutos de incubación, sustrato, BCIP-NBT conteniendo levimasola 0.36 mM se añadió. La reacción se detuvo después de que suficiente manchado había ocurrido. Las placas se contaron y los títulos PRNT50 se contaron. Los títulos PRNT50 se definen como la primera dilución de suero en la cual el conteo de placas es igual a o menor que 50% el conteo de placas de control negativo. Un suero se considera siendo positivo para la presencia de anticuerpos neutralizantes cuando el título de anticuerpo neutralizante así determinado es por lo menos superior o igual a 1:10. Para las otras cepas, el ensayo PRNT50 ha sido llevado a cabo en otro laboratorio de acuerdo con el siguiente protocolo descrito por Russell y colaboradores ( J. Im unol . 99:285-290, 1967) . El conteo de placas se determinó mediante usar la técnica de una sola cubierta de ensayo de placas LLC-MK2. Sueros se descongelan, diluyen, y desactivan con calor por incubación a 56°C por 30 minutos. Diluciones en serie, 4 veces, de suero se hacen (1:5, 1:10, 1:40, 1:160, y 1:640). Un volumen equivalente de virus de dengue diluido para contener alrededor de 40-60 ufp se añade a cada tubo de dilución de suero. Siguiendo incubación a 37°C por 60 minutos, 0.2 mL se remueven de cada tubo y se inoculan sobre pozos triplicados de LLC-MK2 confluente en una placa de 6 pozos. Cada pozo se incuba a 37°C por 90 minutos y las monocapas son así cubiertas con 4 mL de 1% Carboxi Metil Celulosa/Medio de Earle Modificado. Las placas se incuban por 7 días a 37°C bajo C02 al 5%. Placas entonces se cuentan, y la PRNT50 se determina mediante usar papel probit logarítmico. El porcentaje de reducción de placas en cada nivel de dilución se traza para determinar el título de 50% de reducción: puntos de reducción de placas entre 15% y 85% se usan. Los resultados se expresan como recíprocos de dilución. Un suero se considera siendo positivo para la presencia de anticuerpos neutralizantes cuando el título de anticuerpos neutralizantes así determinado es por lo menos superior o igual a 1:10. Respuesta 30 días después de vacunación En el Día 31, tasas de seroconversión fueron altas contra virus del dengue tipo 2 en todos los grupos vacunados con ChimeriVax-DEN2. Bajas tasas de seroconversión a serotipos DEN 1, 3, y 4 heterólogos se observaron en sujetos susceptibles a YF inoculados con ChimeriVax-DEN2 a alta o baja dosis. Tasas de seroconversión a DEN1 fueron 23% y 23% en los grupos de dosis de 5.0 y 3.0 log10 UFP, respectivamente (Tabla 2); a DEN3 15% y 23%, respectivamente; y a DEN4 0% y 0%, respectivamente. En contraste, 100% de los sujetos inmunes a YF inoculados con ChimeriVax-DEN2 seroconvirtieron a todos los serotipos de DEN heterólogos. Vacuna ChimeriVax-DEN2 indujo títulos de anticuerpos de neutralización cruzada muy bajos a los serotipos heterólogos 1, 3, y 4 en sujetos susceptibles a YF (Tabla 3) . La media geométrica de títulos de anticuerpos neutralizantes contra serotipos de dengue heterólogos en el Día 31 fueron significativamente mayores en sujetos inmunes a YF vacunados con ChimeriVax-DEN2 que en sujetos susceptibles a YF . Para DEN1 , la media geométrica de títulos de anticuerpo en sujetos inmunes a YF y en sujetos susceptibles a YF vacunados con ya sea 5.0 o 3.0 log10 UFP de ChimeriVax-DEN2 fueron 79 contra 10 y 12, respectivamente (p < 0.0001). Similarmente, para DEN3 , títulos fueron 73 contra 13 y 12 (p < 0.0001) (Tabla 3) . Ninguno de los sujetos susceptibles a YF seroconvirtió a DEN4. La media geométrica de título de anticuerpos neutralizante a DEN4 en sujetos inmunes a YF fue 57.

Tabla 2 . Tasa de seroconversión ( %) por grupo de tratamiento, día 31 Tabla 3 . Media geométrica de título de anticuerpo por grupo de tratamiento, día 31 Respuesta 6 meses después de vacunación La respuesta a 6 meses después de vacunación es dada en las Tablas 4 y 5 , siguientes . A 6 meses , tasas de seropositividad bajas a serotipos DEN heterólogos 1, 3, y 4 fueron observadas en sujetos susceptibles a YF inoculados con ChimeriVax-DEN2 a dosis alta o baja. Tasas de seroconversión a DEN1 fueron 23% y 31% en los grupos de dosis de 5.0 y 3.0 log10 UFP, respectivamente (Tabla 4) ; a DEN3 15% y 23%, respectivamente; y a DEN4 8% y 8%, respectivamente. En contraste, 100% de los sujetos inmunes a YF inoculados con ChimeriVax-DEN2 fueron seropositivos a DEN1 y 3, Y 64% a DEN4. Vacuna ChimeriVax-DEN2 indujo títulos de anticuerpos neutralizantes de reactividad cruzada bajos a los serotipos heterólogos 1, 3, y 4 en sujetos susceptibles a YF (Tabla 5) . La media geométrica de títulos de anticuerpos neutralizantes contra serotipos heterólogos del dengue a 6 meses fueron mayores en sujetos inmunes a YF vacunados con ChimeriVax-DEN2 que en sujetos susceptibles a YF . Para DEN1 , la media geométrica de títulos de anticuerpos en sujetos inmunes a YF y en sujetos susceptibles a YF vacunados con ya sea 5.0 o 3.0 loglO UFP de ChimeriVax-DEN2 , fueron 285 contra <10 y 14, respectivamente. Similarmente, para DEN3, títulos fueron 268 contra <10 y <10 (Tabla 5).

Tabla 4 . Proporción seropositiva ( %) por grupo de tratamiento, 6 meses Tabla 5 . Media geométrica de título de anticuerpo por grupo de tratamiento, 6 meses Respuesta 1 año después de vacunación En 12 meses , las tasas de seropositividad fueron las mas altas contra virus de dengue tipo 2 en el grupo inmune a YF vacunado con ChimeriVax-DEN2. Esto fue particularmente evidente cuando las dos cepas de DEN2 PR-159 y JAH se consideraron. Estas dos cepas son de las Américas y pertenecen a dos grupos variantes distintos (América I y II, respectivamente) . Bajas tasas de seropositividad a serotipos heterólogos de DEN 1, 3, y 4 se observaron en sujetos susceptibles a YF inoculados con ChimeriVax-DEN2 a alta o baja dosis. Tasas de seroconversión a DEN1 fueron 23% y 31% en los grupos de dosis de 5.0 y 3.0 log10 UFP, respectivamente (Tabla 6); a DEN3 8% y 23%, respectivamente; y a DEN4 8% y 0%, respectivamente. En contraste, 100% de sujetos inmunes a YF inoculados con ChimeriVax-DEN2 fueron seropositivos a DEN1 y 3, y 29% a DEN4. Vacuna ChimeriVax-DEN2 indujo títulos de anticuerpos neutralizantes de reactividad cruzada bajos a los serotipos heterólogos 1, 3, y 4 en sujetos susceptibles a YF (Tabla 7) . La media geométrica de títulos de anticuerpos neutralizantes contra serotipos heterólogos del dengue a 12 meses fueron significativamente mayores en sujetos inmunes a YF vacunados con ChimeriVax-DEN2 que en sujetos susceptibles a YF . Para DEN1 , la media geométrica de títulos de anticuerpos en sujetos inmunes a YF y en sujetos susceptibles a YF vacunados con ya sea 5.0 o 3.0 loglO UFP de ChimeriVax-DEN2 , fueron 89 contra 10 y 13, respectivamente (p < 0.0001) . Similarmente, para DEN3 , títulos fueron 72 contra <10 y <10 (p < 0.0001) (Tabla 7).

Tabla 6. Proporción seropositiva (%) por grupo de tratamiento, 12 meses Tabla 7. Media geométrica de título de anticuerpo por grupo de tratamiento, 12 meses Respuesta de anticuerpos de fiebre amarilla Sorprendentemente, de los 14 sujetos inmunes a YF que * se inocularon con ChimeriVax-DEN2 , solamente 2 (14%) tuvieron un refuerzo en el anticuerpo de YF . Así, mientras que inmunidad a YF preexistente refuerza la respuesta a serotipos de dengue 1-4 después de vacunación con ChimeriVax, lo recíproco no fue verdadero (es decir, ChimeriVax-DEN2 no reforzó anticuerpos al virus de fiebre amarilla) . Este resultado es inesperado, dado que el mecanismo subyacente a la respuesta de anticuerpos ampliada a dengue en pacientes inmunes a fiebre amarilla que recibieron ChimeriVax-DEN2 (epítopes compartidos entre proteínas de cápsula de fiebre amarilla y dengue) habrían sido esperados a resultar en un refuerzo en anticuerpos de fiebre amarilla después de ChimeriVax-D2. Los resultados ilustran la impredecibilidad de respuestas inmunes de protección cruzada a flavivirus y subrayan la novedad de la presente invención. Respuestas a células T Respuestas de células T se evaluaron por producción de IFN? en respuesta a antígeno viral en sobrenadantes de cultivo. Sujetos se seleccionaron con lisado de células virales desactivado, el cual se ha mostrado generando principalmente respuestas a células T CD4+ a la vacuna, pero algunas células CD8+ también se producen (Mangada y colaboradores, J. Immunol . Methods 284:89-97, 2004) . Materiales y Procedimientos Experimentales La respuesta de células T se evaluó en los Días 1 y 31 mediante medir la producción de IFN? por PBMC estimuladas en cultivo con antígeno de virus desactivado. Glóbulos blancos se recolectaron en los Días 1 y 31 en tubos de preparación de células Vacutainer (CPT, BDBiosciences) y se envió a Acambis, Inc. para aislamiento y crioconservación de PBMC. Células se lavaron en RPMI 1640, se crioconservaron en suero AB humano desactivado con calor (SeraCare, Oceanside, California, Estados Unidos) conteniendo 10% de DMSO, almacenado en nitrógeno líquido, y descongelado inmediatamente antes de probar. Para medir la producción de IFN?, PBMC se cultivaron en placas de fondo plano de 96 pozos a 1.5 x 105 células por pozo por 7 días a 37°C con 3 antígenos de células de virus desactivados con glutaraldehído: (1) virus ChimeriVax-DEN2 (crecido en células Vero) , (2) virus cepa PU0218 de dengue 2 (virus de dengue 2 de tipo salvaje crecido en células C6/36) , y (3) virus YF (crecido en células Vero) . Controles consistieron de células Vero o C6/36 infectadas de control desactivadas. Antígeno viral desactivado o antígeno de células de control se añaden a una concentración de 1:100 (15) . PBMC también se estimularon con 1 µg/ml de ConA como un control positivo de ensayo. Producción de IFNy se determinó por ELISA usando sobrenadantes recolectados en el Día 7. ELISA de IFN? Sobrenadantes de cultivo se analizaron para contenido de IFN? por un ensayo ELISA indirecto (Kit de IFNy humana OptEIA, BDBiosciences-Pharmingen, número de catálogo 555142) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Producción de ci tocina de IFN? La producción de citocina de IFN? se comparó en el Día 1 y el Día 31 del estudio (antes de vacunación y en Día 30 después de vacunación) mediante probar la respuesta a antígenos de virus desactivados. La vacuna administrada (Ch?mer?Vax-DEN2 ) , el virus de dengue 2 tipo salvaje padre (PU0218) , y el virus de control administrado (YF-VAX) se probaron. Ch?menVax-DEN2 crecido en células Vero tuvo fondo muy bajo en el Día 0, mientras que el virus de dengue 2 crecido en células C6/36 produjo respuestas en algunos de los sujetos. Sin embargo, ambos de estos antígenos incrementaron la producción de IFN? en cada uno de los cuatro grupos de vacunas. El YF-VAX desactivado no fue muy inmunógeno en ninguno de los sujetos, pero si mostró un incremento en el Día 31 con relación al Día 1, especialmente en los sujetos vacunados con YF . Comparaciones entre grupos de vacunación se hicieron usando la diferencia entre valores en el Día 31 y el Día 1 (figura 1) . Todos los grupos respondieron a cada uno de los antígenos desactivados. Sujetos que recibieron 103 o 105 UFP de vacuna Ch?mer?Vax-DEN2 tuvieron niveles de IFN? equivalentes. En el ensayo ELISA de IFN?, sujetos vacunados con Ch?mer?Vax-DEN2 tuvieron ligeramente mayores respuestas que sujetos vacunados con YF (no significativo) (figura 1) . Sujetos que fuero pre-inmunes a YF tuvieron un incremento en el número de respuesta y un incremento en el nivel de IFN? medio (figura 1) . La Tabla 8 resume los resultados mostrando el número de respuestas como una fracción del total . Alrededor de 65% de los sujetos vacunados con Ch?mepVax-DEN2 y YF tuvieron una respuesta de IFN? positiva a la vacuna administrada como antígeno de prueba, mientras que aproximadamente 90% de sujetos pre-inmunes a YF vacunados con Ch?mer?Vax-DEN2 tuvieron una respuesta positiva (Tabla 8) . Tabla 8. Número de Sujetos que respondieron a vacuna con base en respuesta de IFN? Grupo de Inmunización CVD2 Dßn2 PU0218 YF CVD2 103 9/14 8/14 2/14 CVD2 105 9/14 7/14 1/14 YF 105 9/14 4/14 3/14 YF-CVD2 105 13/14 7/14 0/14 Respuesta positiva definida como 5 veces el fondo, o = 50 pg/ml en el día 30 si el día 1 es menor que 10 pg/ml (por debajo de sensibilidad) Los resultados de este estudio muestran que aproximadamente 65% de los sujetos vacunados con Ch?mer?Vax-DEN2 y YF tienen una respuesta de células T positiva a la vacuna administrada como antígeno de prueba, mientras que -90% de sujetos pre-inmunes vacunados con Ch?mer?Vax-DEN2 tuvieron respuestas positivas (definidas por una respuesta de IFN?) . La producción de IFN? fue la mayor en respuesta a virus de vacuna Ch?mer?Vax-DEN2. Las respuestas de células T en esta prueba clínica fueron consistentes con las respuestas de anticuerpo neutralizan-te, en tanto dosis de vacuna estimulada similares a respuestas inmunes de células T, e inmunidad previa a virus de fiebre amarilla no inhibió la respuesta de células T a ChimeriVax-DEN2. Las respuestas de IFN? fueron virtualmente las mismas para las 2 dosis de ChimeriVax-DEN2 (103 y 105 ufp) . La respuesta de IFN? a ChimeriVax-DEN2 no se disminuyó por vacunación previa con virus de fiebre amarilla y aun números mayores de respuestas se observaron, sugiriendo una tendencia para inmunidad de células T acrecentada en sujetos pre- inmunes a YF . El antígeno desactivado usado en el ensayo identificó las respuestas mas fuertes pero no determinó las proteínas específicas contra las cuales se generó la respuesta inmune. En tanto que un antígeno de dengue desactivado se haya usado, es probable que principalmente respuestas de CD4+ sean medidas. Ejemplo 2: Vacuna Tetravalente del Dengue Diseño y Métodos de Estudio En este ejemplo, se evalúa en sujetos humanos la respuesta inmune a inmunización secuencial con vacuna de fiebre amarilla 17D seguido por administración de una mezcla de cuatro (4) virus de fiebre amarilla quiméricos que comprenden cada uno proteínas de membrana y cápsula de serotipos del dengue que son diferentes entre sí (ChimeriVax-DEN tetravalente) . La primera etapa del estudio fue evaluar la seguridad, tolerancia, e inmunogenicidad de la vacuna ChimeriVax-DEN tetravalente conteniendo los serotipos DEN 1, 2, 3, y 4 en comparación con una vacuna de fiebre amarilla (YF) (YF-VAX) y un placebo. La segunda etapa de la prueba evaluó la seguridad e inmunogenicidad de administración secuencial de YF-VAX/ChimeriVax-DEN tetravalente contra dos dosis de ChimeriVax-DEN tetravalente dadas en un intervalo de 5-9 meses. El estudio consistió de un periodo de selección de 3 a 21 días antes de la primera vacunación, un periodo de tratamiento ciego doble después de la primera vacunación de 1 mes, y un segundo periodo de selección de 3 a 21 días, antes de un periodo de tratamiento de marbete abierto de 30 días comenzando 5 a 9 meses después de vacunación. Una visita de seguimiento en 12 meses se planeó. En la primera etapa del estudio, 3 grupos de 33 sujetos macho y hembra adultos saludables recibieron una vacunación de ChimeriVax-DEN tetravalente (grupo 1) , YF-VAX (grupo 2) , o placebo (diluyente de YF-VAX -grupo 3) , para un total de 99 sujetos. Previo a conducir algún procedimiento relacionado con estudio, los sujetos proporcionaron consentimiento informado escrito. Durante la selección, elegibilidad se evaluó por un historial médico, una examinación física, signos vitales, química clínica, hematología y serología (incluyendo suero de embarazo en sujetos hembra), y una muestra de orina para uroanálisis. En el Día 1, los sujetos recibieron una vacunación subcutánea ciega doble en el área deltoide y luego asistieron a la clínica en los Días 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, y 21 para entrevista AE y recolección de muestra de sangre para viremia. Además, en los Días 5, 9, 11, y 15, los sujetos proporcionaron una muestra de sangre para evaluaciones clínicas de laboratorio. En los Días 11 y 31, y en 5-9 meses, lo sujetos proporcionaron una muestra de sangre para análisis de anticuerpos. A los 5 a 9 meses, elegibilidad continua se evaluó y se registró una historia médica interna. Sujetos elegibles recibieron una segunda vacunación (vacuna ChimepVax-DEN tetravalente) subcutáneamente en el área deltoide. Sujetos asistieron a la clínica en los días 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, y 20 después para entrevista AE y recolección de muestra de sangre para viremia. Las muestras de sangre para pruebas de anticuerpos se obtuvieron 10 y 30 días después de esta segunda vacunación. Todos los sujetos regresaron a la clínica 12 meses después de la vacunación inicial (3-7 meses después de la segunda vacunación) para pruebas de anticuerpos. El diseño del estudio se muestra en las Tablas 9 y 10. Tabla 9. Tratamientos a ser administrados en el Día 1 Tabla 10. Tratamientos a ser administrados en 5 a 9 meses La dosis de ChimeriVax-DEN tetravalente precisa por serotipo se determina por ensayo TCID50 como siendo 3 7/3 1/3 8/3 2 TCID50 para los serotipos 1, 2, 3, y 4 respectivamente Los criterios de evaluación para respuestas inmunes fueron como sigue: El punto final primario para mmunogenicidad es la tasa de seroconversión a serotipos 1-4 del dengue en el Día 31, usando la prueba de neutralización de reducción de placas al 50% (PRNT50) de dilución de suero, a virus constante, llevada a cabo como se describe en el ejemplo 1. Este análisis define las tasas de seroconversión de todos los cuatro serotipos de dengue y de cada serotipo individual. Sujetos que son seronegativos en línea de base (<1:10) requerirán un título de PRNT50 de >1:10 para cumplir los criterios para seroconversión. Puntos finales secundarios incluyeron el análisis de la media geométrica del título de anticuerpo neutralizante para cada serotipo de dengue y tasa de seroconversión 5 a 9 meses después de la primera vacunación y 12 meses después de la primera vacunación (es decir, 3-7 meses después de la segunda vacunación, de refuerzo) . Estas respuestas serológicas se comparan para sujetos que recibieron (a) una sola dosis de ChimeriVax-DEN tetravalente; (b) dos dosis de ChimeriVax-DEN tetravalente, o (c) una dosis de vacuna de fiebre amarilla 17D (YF-VAX) seguida por 1 dosis de ChimeriVax-DEN tetravalente administrada 5-9 meses después . Resultados El objetivo del estudio fue evaluar la amplitud de la respuesta inmune a través de todos los 4 serotipos del dengue siguiendo diferentes regímenes de inmunización. La meta de inmunizar sujetos humanos contra la enfermedad del virus del dengue es lograr una respuesta de anticuerpos neutralizantes cruzados tan amplia como sea posible. Las respuestas inmunes de todos los sujetos (los cuales fueron susceptibles a dengue y fiebre amarilla en línea de base) 30 días después de la segunda dosis de medicamento de estudio se muestran en la Tabla 11 (resultados contra cepas de tipo salvaje) . 54 sujetos (los cuales fueron susceptibles a dengue y fiebre amarilla en línea de base) recibieron una sola dosis de ChimeriVax-DEN tetravalente en el Día 1 o placebo en el Día 1 seguido por una sola dosis de ChimeriVax-DEN tetravalente en 5-9 meses. Las respuestas del anticuerpo neutralizante 30 días después de la recepción de la vacuna activa en estos grupos es combinada y se muestra en la columna mas a la derecha de la Tabla 11. Una minoría de los sujetos que recibieron una sola inoculación de ChimeriVax-DEN tetravalente tuvo respuesta inmune de reacción cruzada a 3 o 4 serotipos de dengue. Solamente 43% y 17% de los sujetos que recibieron una dosis de ChimeriVax-DEN tetravalente desarrollaron anticuerpos neutralizantes a por lo menos 3 o 4 serotipos de dengue, respectivamente. 27 sujetos (los cuales fueron susceptibles a dengue y fiebre amarilla en línea de base) recibieron 2 dosis de ChimeriVax-DEN tetravalente en el Día 1 y en 5-9 meses (Grupo 1) . Las respuestas de anticuerpo neutralizante se muestran en la Tabla 11. La amplitud de la respuesta de anticuerpo neutralizante en el Grupo 1 fue mayor que en sujetos que recibieron solamente una dosis de ChimeriVax-DEN tetravalente. 55.6% y 40.7% de los sujetos recibiendo dos dosis de ChimeriVax-DEN tetravalente desarrollaron anticuerpos neutralizantes a 3 o 4 serotipos del dengue, respectivamente. 26 sujetos (los cuales fueron susceptibles a dengue y fiebre amarilla en línea de base) recibieron vacuna de fiebre amarilla (YF-VAX) en el Día 1 seguida por una dosis de ChimeriVax-DEN tetravalente en 5-9 meses (Grupo 2) . Las respuestas de anticuerpo neutralizante en el Grupo 2 se muestran en la Tabla 11. La amplitud de la respuesta de anticuerpo neutralizante en el Grupo 2 fue mayor que en los sujetos que recibieron ya sea 1 dosis de ChimeriVax-DEN tetravalente o dos dosis de ChimeriVax-DEN tetravalente separadas por 5-9 meses. 92% y 65% de los sujetos recibiendo inmunización secuencial con vacuna de fiebre amarilla y vacuna ChimeriVax-DEN tetravalente desarrollaron anticuerpos neutralizantes a por lo menos 3 o 4 serotipos del dengue, respectivamente. Los resultados claramente muestran que un régimen de inmunización secuencial en el cual vacuna de fiebre amarilla es dada antes de una vacuna ChimeriVax-DEN tetravalente resulta en respuesta inmune superior al dengue con reactividad cruzada amplia a través de los serotipos del dengue, que lo que se puede lograr con una o dos dosis de vacuna ChimeriVax-DEN tetravalente probada sola. Aunque la anterior invención ha sido descrita en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será fácilmente aparente para los técnicos en la materia a la luz de las enseñanzas de esta invención que ciertos cambios y modificaciones se pueden hacer a la misma sin salir del espíritu o alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las referencias citadas anteriormente se incorporan en la presente por referencia.

Tabla 11. Periodo de Tratamiento de Marbete Abierto Respuesta de Anticuerpo Antes de Vacunación y a 10 y 30 Días Después de segunda vacunación (administrada 5-9 meses después de la dosis primaria) Contra por lo Menos un Serotipo, por lo Menos Tres Serotipos y a los Cuatro Serotipos de Cepas de Dengue (tipos 1-4) , por Grupo de Tratamiento Tiempo Seropositivo Grupo 1 Grupo 2 Una Sola Dosis Después de [2] ChimeriVax-DEN -» YF '-VAX ? Combinada de Vacunación ChimeriVaX-DEN Ch meriVax-DEN ChimeriVax-DEN [1] (N=27) (N=26) (N=54) Al menos un serotipo 0 días Si 26 (96 3%) 6 (23 1%) 7 (13 0%) No 1 (3 7%) 20 (76 9%) 47 (87 0%) Faltante 0 (0 0%) 0 (0 0%) 0 (0 0%) 10 días Si 24 (88 9%) 14 (53 8%) 9 (16 7%) No 1 (3 7%) 10 (38 5%) 43 (79 6%) Faltante 2 (7 4%) 2 (7 7%) 2 (3 7%) 30 días Si 27 (100 0%) 25 (96 2%) 52 (96 3%) No 0 (0 0%) 1 (3 8%) 2 (3 7%) Faltante 0 (0 0%) 0 (0 0%) 0 8(0 0%) Al menos dos serotipos 00 ddííaass Si 18 (66 7%) 3 (11 5%) 1 (1 9%) No 9 (33 3%) 23 (88 5%) 53 (98 1%) Faltante 0 (0 0%) 0 (0 0%) 0 (0 0%) 10 días Si 21 (77 8%) 3 (11 5%) 4 (7 4%) No 4 (14 8%) 21 (80 8%) 48 (88 9%) Faltante 2 (7 4%) 2 (7 7%) 2 (3 7%) 30 días Si 23 (85 2%) 24 (92 3%) 42 (77 8%) No 4 (14 8%) 2 (7 7%) 12 (22 2%) Faltante 0 (0 0%) 0 (0 0%) 0 (0 0%) Al menos tres serotipos 0 días Si 8 (29 6%) 1 (3 8%) 0 (0 0%) No 19 (70 4%) 25 (96 2%) 54 (100 0%) Faltante 0 (0 0%) 0 (0 0%) 0 (0 0%) 10 días Si 15 (55 6%) 2 (7 7%) 1 (1 9%) No 10 (37 0%) 22 (84 6%) 51 (94 4%) Faltante 2 (7 4%) 2 (7 7%) 2 (3 7%) 30 días S 15 (55 6%) 24 (92 3%) 23 (42 6%) No 12 (44 4%) 2 (7 7%) 31 (57 4%) Faltante 0 (0 0%) 0 (0 0%) 0 (0 0%) Todos los 4 serotipos 0 días Si 4 (14 8%) 0 (0 0%) 0 (0 0%) No 23 (85 2%) 26 (100 0%) 54 (100 0%) Faltante 0 (0 0%) 0 (0 0%) 0 (0 0%) 10 días Si 7 (25 9%) 1 (3 8%) 0 (0 0%) No 18 (66 7%) 23 (88 5%) 52 (96 3%) Faltante 2 (7 4%) 2 (7 7%) 2 (3 7%) 30 días S 11 (40 7%) 17 (65 4%) 9 (16 7%) No 16 (59 3%) 9 (34 6%) 45 (83 3%) Faltante 0 (0 0%) 0 (0 0%) 0 (0 0%) [1] Día 0 es el día en el cual la segunda vacunación se administró en 5-9 meses El anticuerpo medido en este punto del tiempo es el resultado de la primera vacunación 5-9 meses antes [2] Título de anticuerpo neutralizante = 10

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para inducir una respuesta inmune de neutralización cruzada, de larga duración, a los virus del dengue en un paciente, el método comprendiendo administrar al paciente: (i) una dosis de una vacuna del virus de fiebre amarilla, y (ii) una dosis de una vacuna de flavivirus quimérico que comprende por lo menos un flavivirus quimérico comprendiendo un esqueleto de virus de fiebre amarilla en la cual las secuen-cias que codifican la proteína de cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con secuencias que codifican la proteína de cápsula de un virus del dengue, donde la vacuna de flavivirus quimérico se administra por lo menos 30 días y hasta 10 años después de la administración de la vacuna de fiebre amarilla.
2. 2. El método de la reivindicación 1, donde el flavivirus quimérico comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un virus del dengue.
3. 3. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, donde las proteínas de cápsula de dengue y/o de membrana de dengue son proteínas revueltas.
4. 4. El método de la reivindicación 1, donde la vacuna de flavivirus quimérico se administra al paciente 30, 60, o 90 días después de la administración de la vacuna de fiebre amarilla .
5. 5. El método de la reivindicación 1, donde el flavivirus quimérico se compone de un esqueleto del virus YF17D.
6. 6. El método de la reivindicación 1, donde la vacuna del virus de fiebre amarilla comprende una cepa de vacuna YF17D 17D-204, 17D-213, o 17DD.
7. 7. El método de la reivindicación 1, donde un flavivirus quimérico comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un serotipo 1 del virus del dengue.
8. 8. El método de la reivindicación 1, donde un flavivirus quimérico comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un serotipo 2 del virus del dengue.
9. 9. El método de la reivindicación 1, donde un flavivirus quimérico comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un serotipo 3 del virus del dengue.
10. 10. El método de la reivindicación 1, donde un flavivirus quimérico comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un serotipo 4 del virus del dengue.
11. 11. El método de la reivindicación 1, donde la vacuna de flavivirus quimérico es una vacuna monovalente.
12. 12. El método de la reivindicación 1, donde la vacuna de flavivirus quimérico es una vacuna tetravalente.
13. 13. El método de la reivindicación 1, comprendiendo además administración de una dosis de refuerzo de una vacuna de flavivirus quimérico, como se define en (ii) de la reivindicación 1/ 6 meses a 10 años después de la primera dosis de la vacuna de flavivirus quimérico.
14. 14. Un kit comprendiendo: (i) una vacuna de virus de fiebre amarilla, y (ii) una vacuna de flavivirus quimérico que comprende por lo menos un flavivirus quimérico que comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual la secuencia que codifica la proteína de cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con la secuencia que codifica la proteína de cápsula de un virus del dengue.
15. 15. El kit de la reivindicación 14, donde el flaviví- rus quimérico comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un virus del dengue.
16. 16. El kit de la reivindicación 14 o de la reivindicación 15, donde las proteínas de cápsula de dengue y/o de membrana de dengue son proteínas revueltas.
17. 17. El kit de la reivindicación 14, donde la vacuna de virus de fiebre amarilla comprende una cepa YF17D.
18. 18. El kit de la reivindicación 14, donde el flavivirus quimérico se compone de un esqueleto de virus YF17D.
19. 19. El kit de la reivindicación 14, donde la vacuna de flavivirus quimérico comprende un flavivirus quimérico que comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un serotipo 1 del virus del dengue.
20. 20. El kit de la reivindicación 14, donde la vacuna de flavivirus quimérico comprende un flavivirus quimérico que comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un serotipo 2 del virus del dengue.
21. 21. El kit de la reivindicación 14, donde la vacuna de flavivirus quimérico comprende un flavivirus quimérico que comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un serotipo 3 del virus del dengue.
22. 22. El kit de la reivindicación 14, donde la vacuna de flavivirus quimérico comprende un flavivirus quimérico que comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un serotipo 4 del virus del dengue.
23. 23. El kit de la reivindicación 14, comprendiendo además por lo menos una dosis de refuerzo de una vacuna de flavivirus quimérico.
24. 24. El uso de (i) una dosis de una vacuna de virus de fiebre amarilla, y (ii) una dosis de una vacuna de flavivirus quimérico que comprende por lo menos un flavivirus quimérico que comprende un esqueleto de virus de fiebre amarilla en el cual las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula del virus de fiebre amarilla han sido reemplazadas con las secuencias que codifican las proteínas de membrana y cápsula de un virus del dengue, en inducir una respuesta inmune de neutralización cruzada, de largo plazo, a virus del dengue en un paciente, donde la vacuna de flavivirus quimérico se administra por lo menos 30 días y hasta 10 años después de la administración de la vacuna de fiebre amarilla.