MX2008001710A - Uso de celulas estromaticas de tejido adiposo en fusion espinal - Google Patents

Abstract

La presente invención comprende métodos y composiciones para tratar una condición de los huesos;la célula estoma aislada derivada del tejido adiposo de la invención y los productos relacionados con la misma tienen muchos usos, incluyendo, pero no limitados a la investigación, el diagnóstico y aplicaciones terapéuticas como en procedimientos de fusión espinal.

Description

USO DE CELULAS ESTROMATICAS DERIVADAS DE TEJIDO ADIPOSO EN FUSION ESPINAL ANTECEDENTES DE LA INVENCION Existen generalmente dos tipos de condiciones óseas: 1 ) condiciones óseas no metabólicas, tales como fracturas de huesos, deformación de huesos/espina dorsal, osteosarcoma, mieloma, displasia ósea y escoliosis, y 2) condiciones óseas metabólicas, tales como osteoporosis, osteomalacia, raquitismo, osteítis fibrosa, distrofia ósea renal y enfermedad ósea de Paget. La osteoporosis, una condición ósea metabólica, es una enfermedad sistémica caracterizada por fragilidad y fracturabilidad ósea incrementada debido a masa ósea disminuida y cambio en la estructura fina del tejido óseo, sus síntomas clínicos principales incluyendo cifosis espinal, y fracturas de huesos dorsolumbares, centros vertebrales, cuellos femorales, extremo inferior del radio, costillas, extremo superior del húmero, y otros. En el tejido óseo, ocurre constantemente formación y destrucción de hueso debido a resorción ósea. Después del deterioro del equilibrio entre la formación de hueso y la destrucción de hueso debidas a la resorción ósea, ocurre una reducción cuantitativa en el hueso. Tradicionalmente, supresores de la resorción ósea, tales como estrógenos, calcitonina y bisfosfonatos, se han usado principalmente para tratar la osteoporosis. Con respecto a las condiciones óseas/espinales, más de 75% de la población norteamericana sufre de dolor de espalda alguna vez en su vida. Enfermedades médicas subyacentes pueden contribuir al dolor de espalda. Estas incluyen escoliosis, estenosis espinal, enfermedad degenerativa de los discos intervertebrales, procesos infecciosos, tumores y trauma. La reparación de grandes defectos de segmentos en el hueso diafisario, es un problema significativo enfrentado hoy en día por los cirujanos ortopédicos. Aunque dicha pérdida de hueso puede ocurrir como resultado de lesión aguda, estos defectos masivos se presentan comúnmente secundarios a malformaciones congénitas, tumores benignos y malignos, infección ósea y falta de unión en fracturas. El uso de material de injerto de hueso autólogo fresco se ha considerado como el estándar de tratamiento histórico, pero está asociado con morbilidad sustancial que incluye infección, malformación, dolor y pérdida de función (Kahn et al., 1995, Clin. Orthop. Reí. Res. 313: 69-75). Las complicaciones que resultan de la cosecha de injertos, en combinación con su suministro limitado, han inspirado el desarrollo de estrategias alternativas para la reparación de defectos óseos clínicamente significativos. El procedimiento primario para este problema se ha enfocado en el desarrollo de materiales de implante de hueso efectivos. Tres clases generales de implantes de hueso han emergido de estos esfuerzos de investigación, y estas clases pueden agruparse como osteoconductivas, osteoinductivas o directamente osteogénicas. El hueso de aloinjerto es probablemente el tipo mejor conocido de implante osteoconductivo. Aunque ampliamente usado por muchos años, el riesgo de transmisión de enfermedades, el rechazo por el hospedero y la falta de osteoinducción, compromete su conveniencia (Leads, 1988, JAMA 260: 2487-2488). Los implantes osteoconductivos sintéticos incluyen fibras metálicas de titanio y cerámicas compuestas de hidroxiapatita y/o fosfato tricálcico. La naturaleza favorablemente porosa de estos implantes facilita el crecimiento óseo hacia dentro, pero su falta de potencial osteoinductivo limita su utilidad. Se ha estudiado también una variedad de compuestos osteoinductivos, que incluyen la matriz ósea desmineralizada, que se sabe contiene proteínas morfogénicas óseas (BMP). Desde el descubrimiento original de las BMPs, otros han caracterizado, clonado, expresado e implantado BMPs purificadas o recombinantes en sitios ortotópicos para la reparación de grandes defectos óseos (Gerhart et al., 1993, Clin. Orthop. Reí. Res. 293: 317-326; Stevenson et al., 1994, J. Bone Joint Surg. 76: 1676-1687; Wozney et al. , 1988 Science 242: 1528-1534). El éxito de este procedimiento dependió de la presencia de células mesenquimáticas capaces de responder a la señal inductiva provista por la BMP (Lañe et al., 1994, en Primera Conferencia Internacional sobre Proteínas Morfogénicas Oseas). Son estos progenitores mesenquimáticos que sufren diferenciación osteogénica, y son finalmente responsables de la síntesis de nuevo hueso en el sitio quirúrgico. Una alternativa al procedimiento osteoinductivo, es la implantación de células vivas que son directamente osteogénicas. Puesto que se ha mostrado que la médula ósea contiene una población de células que poseen potencial osteogénico, algunos han diseñado terapias experimentales basadas en la implantación de médula singénica o autóloga fresca en sitios que necesitan de reparación del esqueleto (Grundel et al., 1991 , Clin. Orthop. Reí. Res. 266: 244-258; Werntz et al., 1996, J. Orthop. Res. 14: 85-93; Wolff et al., 1994, J. Orthop. Res. 12: 439-446). Aunque profunda en principio, la viabilidad de obtener suficiente médula ósea con el número requerido de células osteoprogenitoras, es limitativa. El campo emergente de la medicina regenerativa busca combinar biomateriales, factores de crecimiento y células como terapéutica novedosa para reparar tejidos y órganos dañados. Conforme esta especialidad crece, existe una demanda de una fuente confiable, segura y efectiva de células madre adultas humanas que sirvan en aplicaciones de ingeniería de tejidos. Para propósitos reglamentarios, estas células deben definirse mediante medidas de pureza cuantificables. Para propósitos prácticos al nivel clínico, estas células deben estar disponibles como un producto "de fabricación normalizada", inmediatamente disponibles tras la demanda en el punto de cuidado. Desde un punto de vista comercial, la capacidad de usar células madre adultas alogénicas, opuestamente a células madre adultas autólogas para trasplante, tendría un impacto positivo significativo sobre el desarrollo de productos. Bajo estas circunstancias, un sólo lote de células derivadas de un donador podría ser trasplantado a mamíferos múltiples, reduciendo los costos de control de calidad y garantía de calidad. Los estudios han demostrado la existencia de células madre adultas en sitios de tejidos múltiples. Células derivadas de médula ósea, conocidas como células madre mesenquimáticas (MSC) o células estromáticas de médula ósea (BMSC), han sido caracterizadas extensivamente (Castro-Malaspina er a/., 980, Blood 56: 289-30125; Piersma et al., 1985, Exp. Hematol 13: 237-243; Simmons et al., 1991 , Blood 78: 55-62; Beresford et al., 1992, J. Cell. Sci. 102: 341 -351 ; Liesveld et al., 1989, Blood 73: 1794-1800; Liesveld et al., Exp. Hematol 19: 63-70; Bennett et al., 1991 , J. Cell. Sci. 99: 131 -139). Estudios recientes han demostrado que MSCs derivadas de médula ósea alogénicas pueden ser trasplantadas (Bartholomew et al., 2002, Exp. Hematol. 30: 42-8), y usadas para reparar un defecto ortopédico de tamaño crítico en un modelo de canino (Arinzeh et al., 2003, J. Bone Joint Surg. Am. 85-A: 1927-35). Sin embargo, las MSCs representan aproximadamente 1 de cada 10,000 a 100,000 células de médula ósea nucleadas o aproximadamente 200 células por mi del aspirado de médula ósea (Bruder er al., 2000, Principies of Tissue Engineering, 2a. edición, Academic Press). Para obtener números suficientes de MSCs para aplicaciones de ingeniería de tejidos, es necesario expandir las MSCs derivadas de médula ósea a través de pasajes múltiples in vitro. En contraste con la médula ósea, el tejido adiposo es fácilmente accesible para cosecha quirúrgica y abundante en el norteamericano adulto promedio. Recientemente, se ha demostrado que el tejido adiposo puede servir como una fuente de células madre (conocidas como células madre adultas derivadas de tejido adiposo o células ADAS). Estas células son capaces de mostrar diferenciación a lo largo de vías de linaje múltiples. En respuesta a químicos, hormonas y/o citocinas específicos, las células ADAS de humano y de roedor expresan características bioquímicas e histológicas consistentes con células neuronales y de músculo, cartílago, hueso y tejido adiposo. En un estudio reciente, células ADAS de murino aceleraron la reparación de un defecto de la tapa del cráneo de tamaño crítico (Cowan et al., 2004, Nat. Biotechnol. 22: 560-7). El injerto de hueso se usa con frecuencia para el tratamiento de condiciones óseas. Por supuesto, más de 1.4 millones de procedimientos de injerto de hueso se realizan anualmente en el mundo. El éxito o la falla del injerto de hueso, depende de muchos factores que incluyen la vitalidad del sitio del injerto, el procesamiento del injerto y la compatibilidad inmunológica del tejido injertado. En vista de la prevalencia de las condiciones óseas, existe la necesidad de fuentes novedosas de hueso para usos terapéuticos, de diagnóstico y de investigación. La presente invención satisface esta necesidad.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención incluye un método para mejorar la fusión de hueso después de un procedimiento de fusión espinal en un mamífero, que comprende administrar una célula estromática adulta derivada de tejido adiposo (ADAS) aislada en la espina dorsal del mamífero, en donde la célula ADAS se diferencia in vivo en una célula que expresa por lo menos una característica de una célula ósea. La invención incluye también un método para realizar una o más fusiones espinales en un mamífero, que comprende administrar una célula ADAS en la espina dorsal del mamífero para facilitar una fusión espinal de nivel individual o múltiple. De preferencia, después de la administración de la célula ADAS en la espina dorsal del mamífero, la célula ADAS se diferencia in vivo en una célula que expresa por lo menos una característica de una célula ósea. En un aspecto, la célula ADAS es cultivada in vitro por un período sin que sea inducida para diferenciarse antes de la administración de la célula al mamífero. En otro aspecto, la célula ADAS es alogénica con respecto al mamífero. En otro aspecto, la célula ADAS induce la formación de hueso por fusión espinal de cuerpos intervertebrales. En otro aspecto, la célula ADAS induce la formación de hueso por fusión espinal de procesos intertransversos. En un aspecto, la célula ADAS comprende además una matriz biocompatible. De preferencia, la matriz biocompatible se selecciona del grupo que consiste de alginato de calcio, agarosa, fibrina, colágena, laminina, fibronectina, glucosaminoglucano, ácido hialurónico, sulfato de heparina, sulfato de condroitina A, sulfato de dermatán y gelatina de matriz ósea.

En otro aspecto, la célula ADAS es genéticamente modificada. En otro aspecto, la célula ADAS se administra en uno o más espacios intercuerpos en la espina dorsal del mamífero. En otro aspecto, la fusión espinal es en un segmento de la espina dorsal seleccionado del grupo que consiste de articulación cervical, torácica, lumbar, lumbosacra y sacro-ilíaca (SI). En otro aspecto, la célula ADAS se administra en uno o más espacios intercuerpos mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de un procedimiento posterior, un procedimiento posterolateral, un procedimiento anterior, un procedimiento anterolateral y un procedimiento lateral. En otro aspecto, el mamífero es un humano.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Con el propósito de ilustrar la invención, se describen en los dibujos ciertas modalidades de la invención. Sin embargo, la invención no se limita a las disposiciones y medios precisos de las modalidades descritas en los dibujos. Las figuras 1A-1 D son una imagen que describe un procedimiento de fusión espinal. La figura 1A describe el espacio ¡ntervertebral en la espina dorsal lumbar. Las figuras 1 B y 1C demuestran la introducción de un dispositivo mecánico e injertos de hueso que estabilizan el espacio, respectivamente. La figura 1 D es una imagen que describe la espina dorsal. La figura 2 es una imagen que describe el potencial de las células ADAS para diferenciarse a lo largo de vías de linaje múltiples. En respuesta a cocteles específicos de químicos y factores de crecimiento, las células ADAS de humano pueden diferenciarse en condrocitos, osteoblastos, adipocitos y células tipo células gliales y neuronales in vitro. Las figuras 3A-3D son una imagen que describe la osteogénesis de células ADAS de humano. La figura 4 es un diagrama que describe la expresión de aldehido fosfatasa en células ADAS durante la diferenciación adipogénica y osteogénica. Las figuras 5A y 5B son una imagen que demuestra que las células ADAS forman hueso in vivo.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención abarca métodos y composiciones para tratar una enfermedad ósea. En una modalidad preferida, se usa una célula estromática adulta derivada de tejido adiposo (ADAS) aislada de la invención, para mejorar la fusión de hueso después de un procedimiento de fusión espinal en un mamífero.

Definiciones Como se usa en la presente, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado con el mismo en esta sección. Los artículos "un" y "una" se usan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento. El término "aproximadamente" será entendido por los expertos en la técnica, y vanará hasta cierto grado en el contexto en el cual se use. El término "célula derivada de tejido adiposo" se refiere a una célula que se origina de tejido adiposo. La población de células inicial aislada de tejido adiposo es una población de células heterogéneas que incluye, pero no está limitada a, células de la fracción vascular estromática (SVF). Como se usa en la presente, el término "células estromáticas derivadas de tejido adiposo", "células estromáticas adultas derivadas de tejido adiposo (ADAS)" o "células madre derivadas de tejido adiposo (ASCs)" se usa recíprocamente, y se refiere a células estromáticas que se originan de tejido adiposo que puede servir como precursores tipo célula madre para una variedad de diferentes tipos de células tales como, pero no limitadas a, adipocitos, osteocitos, condrocitos y linajes de células gliales/neuronales y de músculo. El término "adiposo" se refiere a cualquier tejido de grasa. El tejido adiposo puede ser tejido adiposo pardo o blanco. De preferencia, el tejido adiposo es tejido adiposo blanco subcutáneo. Dichas células pueden comprender un cultivo de células primario o una línea de células inmortalizadas. El tejido adiposo puede ser de cualquier organismo que tenga tejido de grasa. De preferencia, el tejido adiposo es de mamífero, más preferiblemente el tejido adiposo es de humano. Una fuente conveniente de tejido adiposo de humano, es aquella que se deriva de la cirugía de liposucción. Sin embargo, la fuente de tejido adiposo o el método de aislamiento de tejido adiposo, no es crítico para la invención. El término "alogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal diferente de la misma especie. Como se usa en la presente, el término "autólogo" se usa para referirse a cualquier material derivado del mismo individuo al cual después será reintroducído en el individuo. El término "xenogénico" se refiere a un injerto derivado de un mamífero de una especie diferente. Como se usa en la presente, el término "red biocompatible" se usa para referirse a un substrato que puede facilitar la formación en estructuras tridimensionales que conducen al desarrollo de tejidos. De esta manera, por ejemplo, las células pueden cultivarse o sembrarse en dicha red biocompatible, tal como una que incluya material de matriz extracelular, polímeros sintéticos, citocinas, factores de crecimiento, etc. La red puede moldearse en formas deseadas para facilitar el desarrollo de tipos de tejido. Asimismo, por lo menos en una etapa temprana durante el cultivo de las células, el medio y/o substrato es complementado con factores (por ejemplo, factores de crecimiento, citocinas, material de matriz extracelular, etc.) que facilitan el desarrollo de estructuras y tipos de tejido adecuados. Como se usa en la presente, el término "condición (o lesión o enfermedad ósea)" se refiere a trastornos o enfermedades del hueso que incluyen, pero no están limitados a, condiciones agudas, crónicas, metabólicas y no metabólicas del hueso. El término abarca condiciones causadas por enfermedad, trauma o falla del tejido para desarrollarse normalmente. Ejemplos de condiciones óseas incluyen, pero no están limitados a, una fractura de hueso, una deformación de huesos/espina dorsal, osteosarcoma, mieloma, displasia ósea, escoliosis, osteoporosis, osteomalacia, raquitismo, osteítis fibrosa, distrofia ósea renal y enfermedad ósea de Paget. El término "medio de diferenciación" se usa en la presente para referirse a un medio de cultivo de células que comprende un aditivo o una falta de un aditivo tal como una célula madre, célula estromática adulta derivada de tejido adiposo o alguna otra de dichas células progenitoras, que no está completamente diferenciada cuando se incuba en el medio, y se desarrolla en una célula con todas las características de una célula diferenciada, o algunas de las mismas. El término "ampliabilidad" se usa en la presente para referirse a la capacidad de una célula para proliferar, por ejemplo, para expandirse en número, o en el caso de una población de células, para sufrir duplicaciones de la población. El término "injerto" se refiere a una célula, tejido, órgano o de otra manera cualquier red compatible biológica para trasplante. Por "factores de crecimiento", se entienden los siguientes factores específicos que incluyen, pero no están limitados a, hormona de crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, interleucina 3, interleucina 6, interleucina 7, factor de estimulación de colonias de macrófagos, factor de células madre/ligando c-kit, ligando de osteoprotegerina, insulina, factores de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico ciliar, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y proteína morfogenética ósea a concentraciones de niveles entre picogramos/ml a miligramos/ml. Como se usa en la presente, el término "medio de crecimiento" se usa para referirse a un medio de cultivo que promueve el crecimiento de células. Un medio de crecimiento contendrá en general suero animal. En algunos casos, el medio de crecimiento puede no contener suero animal. Una "célula aislada" se refiere a una célula que ha sido separada de otros componentes y/o células que acompañan en forma natural a la célula aislada en un tejido o mamífero. Como se usa en la presente, el término "multipotencial" o "multipotencialidad" se usa para referirse a la capacidad de una célula madre del sistema nervioso central para diferenciarse en más de un tipo de célula.

Como se usa en la presente, el término "modular" se usa para referirse a cualquier cambio en el estado biológico, es decir, aumento, disminución, y similares. Como se usa en la presente, el término "no ¡nmunógeno" se usa para referirse al descubrimiento de que las células ADAS no inducen la proliferación de células T en una MLR. Sin embargo, el término no inmunógeno no debe limitarse a la proliferación de células T en una MLR, sino más bien debe aplicarse también a células ADAS que no inducen la proliferación de células T in vivo. El término "proliferación" se usa en la presente para referirse a la reproducción o multiplicación de formas similares, especialmente de células. Es decir, el término proliferación abarca la producción de un mayor número de células, y puede medirse, entre otras cosas, simplemente contando el número de células, midiendo la incorporación de timidina tritiada en la célula, y similares. El término "progresión de o a través del ciclo celular" se usa en la presente para referirse al proceso por el cual una célula se prepara para la mitosis y/o meiosis y/o entra en las mismas. La progresión a través del ciclo celular incluye la progresión a través de la fase G1 , la fase S, la fase G2 y la fase M. Los términos "célula precursora", "célula progenitora" y "célula madre" se usan recíprocamente en la técnica y en la presente, y se refieren a una célula progenitora pluripotente o de linaje no comprometido, que es potencialmente capaz de mostrar un número ¡limitado de divisiones mitóticas para renovarse a sí misma, o para producir células de la progenie que se diferenciarán en el tipo de célula deseado. A diferencia de las células madre pluripotentes, se considera en general que las células progenitoras de linaje comprometido son incapaces de dar lugar a numerosos tipos de células que fenotípicamente difieren entre sí. Más bien, las células progenitoras dan lugar a un tipo de célula o posiblemente dos tipos de célula de linaje comprometido. El término "medio de células estromáticas", como se usa en la presente, se refiere a un medio útil para el cultivo de células ADAS. Un ejemplo no limitativo de un medio de células estromáticas, es un medio que comprende DMEM/medio F12 de Ham, suero de bovino fetal a 10%, 00 U de penicilina/100 pg de estreptomicina/0.25 pg de fungizona. Típicamente, el medio de células estromáticas comprende un medio usado como base, suero y un antibiótico/antimicótico. Sin embargo, las células ADAS pueden cultivarse con medio de células estromáticas sin un antibiótico/antimicótico y complementado con por lo menos un factor de crecimiento. De preferencia, el factor de crecimiento es factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF). La concentración preferida de hEGF es de aproximadamente 1 -50 ng/ml, más preferiblemente la concentración es de aproximadamente 5 ng/ml. El medio base preferido es DMEM/F12 de Ham (1 :1 ). El suero preferido es suero de bovino fetal (FBS), pero pueden usarse otros sueros que incluyen suero de caballo o suero humano. De preferencia, se añadirá hasta 20% de FBS al medio anterior para sustentar el crecimiento de células estromáticas. Sin embargo, podría usarse un medio definido si los factores de crecimiento, citocinas y hormonas necesarios en el FBS para el crecimiento de células estromáticas se identifican y se proveen a concentraciones adecuadas en el medio de crecimiento. Se reconoce además que pueden añadirse componentes adicionales al medio de cultivo. Dichos componentes incluyen, pero no están limitados a, antibióticos, antimicóticos, albúmina, factores de crecimiento, aminoácidos y otros componentes conocidos en la técnica para el cultivo de células. Antibióticos que pueden añadirse en el medio incluyen, pero no están limitados a, penicilina y estreptomicina. La concentración de penicilina en el medio de cultivo es de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 unidades por mi. La concentración de estreptomicina en el medio de cultivo es de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 pg/ml. Sin embargo, de ninguna manera debe considerarse que la invención se limita a algún medio para el cultivo de células estromáticas. Más bien, puede usarse cualquier medio capaz de sustentar células estromáticas en cultivo de tejidos. El término "vehículo (o medio) farmacéuticamente aceptable", que puede usarse recíprocamente con el término medio o vehículo biológicamente compatible, se refiere a reactivos, células, compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que están, dentro del alcance de ser adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales, sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica, u otra complicación en proporción con una relación razonable de beneficio/riesgo. Un "espacio intercuerpos adecuado", como el término se usa en la presente, significa el espacio entre vértebras adyacentes en donde un disco reside en una espina dorsal sana, pero que carece por lo menos parcialmente de material del disco debido a desgaste y rotura en la columna vertebral, o ha sido preparado usando técnicas conocidas en la materia para crear quirúrgicamente un hueco en el espacio del disco. Como se usa en la presente, una "cantidad terapéuticamente efectiva" es la cantidad de células ADAS suficiente para proveer un efecto benéfico al sujeto al cual las células se administran. El término "tratamiento (o tratamiento de)", se refiere a la mejora de los efectos de, o demora de, curación o reversión del progreso de, o demora o prevención del inicio de, una condición ósea. Como se usa en la presente, el término "endógeno" se refiere a cualquier material de un organismo, célula o sistema, o producido dentro del mismo. El término "exógeno" se refiere a cualquier material introducido de un organismo, célula o sistema, o producido fuera del mismo. El término "codificante" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, que sirven como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm), o una secuencia definida de aminoácidos, y las propiedades biológicas que resultan de las mismas. De esta manera, un gen codifica para una proteína si la transcripción y traducción del ARN mensajero que corresponde a ese gen, produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Puede referirse que tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARN mensajero y está usualmente provista en listados de secuencia, como la cadena no codificante, usada como el molde para la transcripción de un gen o ADNc, codifican para la proteína u otro producto de ese gen o ADNc. A menos que se especifique de otra manera, una "secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí, y que codifican para la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas y ARN pueden incluir intrones. Un "ácido nucleico aislado" se refiere a un segmento o fragmento de ácido nucleico que ha sido separado de secuencias que lo flanquean en un estado de ocurrencia natural, es decir, un fragmento de ADN que ha sido removido de las secuencias que están normalmente adyacentes al fragmento, es decir, las secuencias adyacentes al fragmento en un genoma en el cual ocurre naturalmente. El término se aplica también a ácidos nucleicos que han sido purificados sustancialmente de otros componentes que acompañan naturalmente al ácido nucleico, es decir, ARN o ADN o proteínas, que lo acompañan naturalmente en la célula. El término incluye por lo tanto, por ejemplo, un ADN recombinante que es incorporado en un vector, en un virus o plásmido de replicador» autónoma, o en el ADN genómico de un procarionte o eucarionte, o que existe como una molécula separada (es decir, como un ADNc o un fragmento genómico o de ADNc producido mediante PCR o digestión con enzimas de restricción), independiente de otras secuencias. Incluye también un ARN recombinante que forma parte de un gen híbrido que codifica para secuencias de polipéptidos adicionales. En el contexto de la presente invención, se usan las siguientes abreviaturas para las bases de ácido nucleico que ocurren comúnmente. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a citosina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina y "U" se refiere a uridina. La frase "bajo el control de la transcripción" o "enlazado operativamente", como se usa en la presente, significa que el promotor está en la ubicación y orientación correctas con relación a los polinucleótidos que controlan el inicio y la expresión de los polinucleótidos por la ARN polimerasa. Como se usa en la presente, el término "secuencia de promotor/regulador", significa una secuencia de ácido nucleico que se requiere para la expresión de un producto génico enlazado operablemente a la secuencia de promotor/regulador. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia de promotor central y, en otros casos, esta secuencia puede incluir también una secuencia de intensificador y otros elementos reguladores que se requieren para la expresión del producto génico. La secuencia de promotor/regulador puede ser, por ejemplo, una que exprese el producto génico en una forma específica de tejidos.

Un promotor "constitutivo" es una secuencia de nucleótidos que, cuando es enlazada operablemente con un polinucleótido que codifica para un producto génico o especifica el mismo, hace que el producto génico sea producido en una célula bajo todas las condiciones fisiológicas de la célula, o la mayoría de las mismas. Un promotor "inducible" es una secuencia de nucleótidos que, cuando es enlazada operablemente con un polinucleótido que codifica para un producto génico o especifica el mismo, hace que el producto génico sea producido en una célula sustancialmente sólo cuando un inductor que corresponda al promotor está presente en la célula. Un promotor "específico de tejidos" es una secuencia de nucleótidos que, cuando es enlazada operablemente con un polinucleótido que codifica para un producto génico o especifica el mismo, hace que el producto génico sea producido en una célula sustancialmente sólo si la célula es una célula del tipo de tejido que corresponde al promotor. Un "vector" es una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que puede usarse para suministrar el ácido nucleico aislado hacia el interior de una célula. Numerosos vectores se conocen en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, polinucleotidos lineales, polinucleotidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. De esta manera, el término "vector" incluye un virus o un plásmído de replicación autónoma. Debe considerarse también que el término incluye compuestos no de plásmido y no vírales que facilitan la transferencia de un ácido nucleico en células tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas, y similares. Ejemplos de vectores virales incluyen, pero no están limitados a, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovirales, y similares. El término "vector de expresión" se refiere a vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión enlazadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que será expresada. Un vector de expresión comprende elementos de acción cis suficientes para expresión; otros elementos para la expresión pueden ser provistos por la célula hospedera o en un sistema de expresión in vitro. Vectores de expresión incluyen todos aquellos conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (es decir, desnudos o contenidos en liposomas) y virus que incorporan al polinucleótido recombinante.

Descripción La presente invención se refiere al descubrimiento de que células estromáticas adultas derivadas de tejido adiposo (ADAS), pueden diferenciarse en una variedad de diferentes tipos de células que incluyen, pero no están limitados a, adipocitos, osteocitos, condrocitos, y linajes de células gliales/neuronales y de músculo. En particular, la invención se refiere a la observación de que las células ADAS pueden diferenciarse a lo largo del linaje osteogénico in vivo. Con base en la presente descripción, una célula ADAS puede usarse exitosamente en terapia celular y/o terapia génica para propósitos experimentales/terapéuticos. Por ejemplo, las células pueden usare en el tratamiento de enfermedades óseas. De preferencia, las células se usan para mejorar la fusión de hueso después de un procedimiento de fusión espinal. La fusión espinal es un procedimiento ortopédico y neuroquirúrgico común usado para tratar dolór de espalda en mamíferos que sufren de enfermedad degenerativa de los discos intervertebrales, estenosis espinal, escoliosis, fractura de espina dorsal, tumor, y similares.

Aislamiento y cultivo de células ADAS Las células ADAS útiles en los métodos de la presente invención, pueden aislarse mediante una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, dichos métodos se describen en la patente de E.U No. 6,153,432, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. En un método preferido, las células ADAS se aislan de un sujeto mamífero, de preferencia un sujeto humano. En humanos, las células ADAS se aislan típicamente de material de liposucción. Si las células de la invención serán trasplantadas en un sujeto humano, se prefiere que las células ADAS sean aisladas de ese mismo sujeto para proveer un trasplante autólogo. En otro aspecto de la invención, las células ADAS administradas pueden ser alogénicas con respecto al receptor. Las células ADAS alogénicas se aislan de un donador que sea un individuo diferente de la misma especie que el receptor. Después del aislamiento, las células se cultivan usando los métodos descritos en la presente para obtener un producto alogénico. La invención abarca también células ADAS que son xenogénicas con respecto al receptor. Sin que se limite la invención en todo caso, pueden aislarse células estromáticas de tejido adiposo usando los métodos descritos en la presente. En resumen, tejido adiposo humano de depósitos subcutáneos, se remueve mediante cirugía de liposucción. El tejido adiposo es transferido entonces de la copa de liposucción en un vaso de precipitado estéril de 500 mi, y se deja que se asiente por aproximadamente 10 minutos. La sangre precipitada se remueve mediante succión. Aproximadamente un volumen de 1 25 mi (o menos) del tejido es transferido a un tubo de centrífuga de 250 mi, y el tubo se llena entonces con regulador de pH de Krebs-Ringer. El tejido y el regulador de pH se deja que se asienten por aproximadamente tres minutos, o hasta que se logre una separación clara, y entonces el regulador de pH se remueve mediante aspiración. El tejido puede lavarse con regulador de pH de Krebs-Ringer por otras cuatro a cinco veces, o hasta que el tejido llegue a ser de color amarillo-anaranjado, y hasta que el regulador de pH llegue a ser de color canela claro. Las células estromáticas del tejido adiposo pueden disociarse usando tratamiento con colagenasa. En resumen, el regulador de pH es removido del tejido y reemplazado con aproximadamente 2 mg de solución de colagenasa/ml de regulador de pH de Krebs (Worthington, ME), a una relación de 1 mi de solución de colagenasa/ml de tejido. Los tubos se incuban en un baño de agua a 37°C con agitación intermitente por aproximadamente 30 a 35 minutos. Las células estromáticas se aislan de otros componentes del tejido adiposo mediante centrifugación por 5 minutos a 500 X g a temperatura ambiente. El aceite y la capa de adipocitos se remueven mediante aspiración. La fracción restante puede resuspenderse en aproximadamente 100 mi de solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) mediante acción de remolino vigorosa, y puede dividirse en tubos de 50 mi y centrifugarse por cinco minutos a 500 Xg. El regulador de pH se remueve mediante aspiración, dejando las células estromáticas. Las células estromáticas se resuspenden entonces en medio de células estromáticas, y se siembran a una densidad de células adecuada y se incuban a 37°C en C02 a 5% durante la noche. Una vez unidas al matraz o a la placa de cultivo de tejidos, las células estromáticas cultivadas pueden usarse de inmediato, o pueden mantenerse en cultivo por un período o un número de pasajes antes del uso de las células de conformidad con los métodos descritos en la presente. Sin embargo, de ninguna manera debe considerarse que la invención se limita a algún método de aislamiento de células estromáticas. Más bien, cualquier método para aislar células ADAS debe ser abarcado por la presente invención. Cualquier medio capaz de sustentar fibroblastos en cultivo de células, puede usarse para cultivar las células ADAS. Formulaciones de medios que sustentan el crecimiento de fibroblastos incluyen, pero no están limitadas a, medio mínimo esencial de Eagle, ADC-1 , LPM (libre de albúmina de suero de bovino), F10 (HAM), F12 (HAM), DCCMI, DCCM2, RPMI 1640, medio BGJ (con y sin modificación de Fitton-Jackson), medio basal de Eagle (BME-con la adición de base de sal de Earle), medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM-sin suero), Yamane, IMEM-20, medio de Eagle con modificación de Glasgow (GMEM), medio L-15 de Leibovitz, medio 5A de McCoy, medio M199 (M199E-con base de sal de Earle), medio M199 (M199H-con base de sal de Hank), medio mínimo esencial de Eagle (MEM-E-con base de sal de Earle), medio mínimo esencial de Eagle (MEM-H-con base de sal de Hank), y medio mínimo esencial de Eagle (MEM-NAA con aminoácidos no esenciales), y similares. Un medio preferido para el cultivo de células ADAS es DMEM, más preferiblemente DMEM/F 2 (1 :1 ). Otros ejemplos no limitativos de medios útiles en los métodos de la invención, pueden contener suero fetal de bovino u otra especie a una concentración de por lo menos 1 % a aproximadamente 30%, de preferencia de por lo menos aproximadamente 5% a 15%, más preferiblemente de aproximadamente 10%. Extracto embrionario de pollo u otra especie puede estar presente a una concentración de aproximadamente 1 % a 30%, de preferencia por lo menos aproximadamente 5% a 15%, más preferiblemente aproximadamente 10%. Después del aislamiento, las células ADAS se incuban en medio de células estromáticas en un aparato de cultivo por un período o hasta que las células alcancen la confluencia antes del paso de las células a otro aparato de cultivo. El aparato de cultivo puede ser cualquier aparato de cultivo usado comúnmente en el cultivo de células in vitro. De preferencia, el nivel de confluencia es mayor de 70% antes del paso de las células a otro aparato de cultivo. Más preferiblemente, el nivel de confluencia es mayor de 90%. Un período puede ser cualquier tiempo adecuado para el cultivo de células in vitro. El medio de células estromáticas puede reemplazarse durante el cultivo de las células ADAS en cualquier momento. De preferencia, el medio de células estromáticas se reemplaza cada 3 a 4 días. Las células ADAS se cosechan entonces del aparato de cultivo, después de lo cual las células ADAS pueden usarse de inmediato, o pueden ser criopreservadas para ser almacenadas para su uso en un tiempo posterior. Las células ADAS pueden cosecharse mediante tripsinización, tratamiento con EDTA, o cualquier otro procedimiento usado para cosechar células de un aparato de cultivo. Varios términos se usan para describir células en cultivo. El cultivo de células se refiere generalmente a células tomadas de un organismo vivo, y desarrolladas bajo condición controlada. Un cultivo de células primario es un cultivo de células, tejidos u órganos tomados directamente de un organismo y antes del primer subcultivo. Las células se expanden en cultivo cuando se ponen en un medio de crecimiento bajo condiciones que faciliten el crecimiento y/o la división de las células, resultando en una población más grande de las células. Cuando las células se expanden en cultivo, la velocidad de proliferación de las células se mide típicamente por la cantidad de tiempo que se requiere para que las células dupliquen su número, conocido de otra manera como el tiempo de duplicación. Cada ronda de subcultivo es referido como un pasaje. Cuando las células son subcultivadas, se refiere que han sufrido un pasaje. Una población específica de células, o una línea de células, es referida a veces o caracterizada por el número de veces que ha sufrido un pasaje. Por ejemplo, una población de células cultivadas que ha sufrido un pasaje diez veces, puede ser referida como un cultivo P10. El cultivo primario, es decir, el primer cultivo después del aislamiento de las células del tejido, se designa como PO. Después del primer subcultivo, las células se describen como un cultivo secundario (P1 o pasaje 1 ). Después del segundo subcultivo, las células llegan a ser un cultivo terciario (P2 o pasaje 2), etc. Los expertos en la técnica entenderán que puede haber muchas duplicaciones de la población durante el período de paso por un pasaje; por lo tanto, el número de duplicaciones de la población de un cultivo es mayor que el número de pasajes. La expansión de células (es decir, el número de duplicaciones de la población) durante el período entre el paso por un pasaje depende de muchos factores que incluyen, pero no están limitados a, la densidad de siembra, el substrato, el medio y el tiempo entre el paso por un pasaje.

Modificación genética Las células de la presente invención pueden usarse también para expresar una proteína o molécula extraña para un propósito terapéutico, o en un método de rastreo de la asimilación de la célula y/o su diferenciación en el receptor. De esta manera, la invención abarca vectores de expresión y métodos para la introducción de ADN exógeno en células ADAS con expresión concomitante del ADN exógeno en las células ADAS. Métodos para introducir y expresar ADN en una célula son bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen los descritos, por ejemplo, en Sambrook et al. (2001 , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), y en Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). El ácido nucleico aislado puede codificar para una molécula usada para rastrear la migración, asimilación y supervivencia de células ADAS una vez que se introducen en el receptor. Proteínas útiles para rastrear una célula incluyen, pero no están limitadas a, proteína fluorescente verde (GFP), cualquiera de las otras proteínas fluorescentes (por ejemplo, proteínas fluorescentes verde, cian, amarilla, azul y roja mejoradas; Clontech Palo Alto, CA), u otras proteínas marcadoras (por ejemplo, LacZ, FLAG-tag, Myc, His6, y similares). El rastreo de la migración, asimilación y/o diferenciación de una célula ADAS de la presente invención, no se limita al uso de moléculas detectables expresadas por un vector o virus. La migración, asimilación y/o diferenciación de una célula puede evaluarse también usando una serie de sondas que facilitan la localización de las células ADAS trasplantadas dentro de un mamífero. El rastreo de un trasplante de células ADAS puede lograrse además usando anticuerpos o sondas de ácido nucleico para marcadores específicos de células detallados en otra parte en la presente. El término "modificación genética", como se usa en la presente, se refiere a la alteración estable o transitoria del genotipo de una célula ADAS mediante la introducción intencional de ADN exógeno. El ADN puede ser sintético, o derivado en forma natural, y puede contener genes, porciones de genes, u otras secuencias de ADN útiles. No se pretende que el término "modificación genética", como se usa en la presente, incluya alteraciones de ocurrencia natural, tales como aquellas que ocurren a través de actividad viral natural, recombinación genética natural, o similares. Puede introducirse ADN exógeno en una célula ADAS, usando vectores virales (retrovirus, virus del herpes modificados, virus del herpes, adenovirus, virus adenoasociados, vectores lentivirales, y similares), o mediante transfección directa de ADN (lipofección, transfección con fosfato de calcio, DEAE-dextrán, electroporación, y similares). Cuando el propósito de la modificación genética de la célula sea la producción de una sustancia biológicamente activa, la sustancia será en general una que sea útil para el tratamiento de un trastorno determinado. Por ejemplo, puede desearse modificar genéticamente las células, de modo que secreten un cierto producto del factor de crecimiento asociado con la formación de hueso. Las células de la presente invención pueden ser genéticamente modificadas teniendo material genético exógeno introducido en las células, para producir una molécula tal como un factor trófico, un factor de crecimiento, una citocina, y similares, que sea benéfico para el cultivo de las células. Además, al tener las células genéticamente modificadas para producir dicha molécula, la célula puede proveer un efecto terapéutico adicional al mamífero cuando es trasplantada en un mamífero que necesita de la misma. Por ejemplo, la célula genéticamente modificada puede secretar una molécula que sea benéfica para células vecinas en el mamífero. Como se usa en la presente, el término "producto de factor de crecimiento" se refiere a una proteína, péptido, mitógeno u otra molécula que tenga un efecto de crecimiento, proliferativo, de diferenciación o trófico en una célula. Por ejemplo, productos de factor de crecimiento útiles en el tratamiento de trastornos óseos incluyen, pero no están limitados a, FGF, TGF-ß, factor de crecimiento tipo insulina y proteína morfogenética ósea. De conformidad con la presente invención, construcciones de genes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas heterólogas, son introducidas en las células ADAS. Es decir, las células son genéticamente alteradas para introducir un gen cuya expresión tenga un efecto terapéutico en el mamífero. De conformidad con algunos aspectos de la invención, las células ADAS del mamífero que será tratado o de otro mamífero, pueden ser alteradas genéticamente para reemplazar un gen defectuoso, y/o para introducir un gen cuya expresión tenga un efecto terapéutico en el mamífero que está siendo tratado. En todos los casos en los cuales una construcción de genes es transfectada en una célula, el gen heterologo es enlazado operablemente a secuencias reguladoras requeridas para lograr la expresión del gen en la célula. Dichas secuencias reguladoras incluyen típicamente un promotor y una señal de poliadenilación. La construcción de genes se provee de preferencia como un vector de expresión que incluye la secuencia codificante para una proteína heteróloga enlazada operablemente a secuencias reguladoras esenciales, de modo que cuando el vector es transfectado en la célula, la secuencia codificante será expresada por la célula. La secuencia codificante es enlazada operablemente a los elementos reguladores necesarios para la expresión de esa secuencia en las células. La secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína puede ser ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado o un híbrido de los mismos, o una molécula de ARN tal como ARN mensajero. La construcción de genes incluye la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína benéfica enlazada operablemente a los elementos reguladores, y puede continuar estando presente en la célula como una molécula citoplásmica funcional, una molécula episómica funcional, o puede integrarse en el ADN cromosómico de la célula. Puede introducirse en las células material genético exógeno, en donde permanece como material genético separado en la forma de un plásmido. En forma alternativa, puede introducirse en la célula ADN lineal que puede integrarse en el cromosoma. Cuando se introduce ADN en la célula, pueden añadirse reactivos que promuevan la integración del ADN en los cromosomas. Secuencias de ADN que son útiles para promover la integración pueden incluirse también en la molécula de ADN. En forma alternativa, puede introducirse ARN en la célula. Los elementos reguladores para la expresión génica incluyen: un promotor, un codón de inicio, un codón de detención y una señal de poliadenilacion. Se prefiere que estos elementos sean operables en las células de la presente invención. Además, se prefiere que estos elementos sean enlazados operablemente a la secuencia de nucleotidos que codifica para la proteína, de modo que la secuencia de nucleotidos pueda ser expresada en las células, y de esta manera la proteína pueda ser producida. Se considera en general que los codones de inicio y los codones de detención son parte de una secuencia de nucleotidos que codifica para la proteína. Sin embargo, se prefiere que estos elementos sean funcionales en las células. Asimismo, los promotores y las señales de poliadenilacion usados deben ser funcionales dentro de las células de la presente invención. Ejemplos de promotores útiles para poner en práctica la presente invención incluyen, pero no están limitados a, promotores que son activos en muchas células, tales como el promotor de citomegalovirus, los promotores del SV40 y promotores retrovirales. Otros ejemplos de promotores útiles para poner en práctica la presente invención incluyen, pero no están limitados a, promotores específicos de tejidos, es decir, promotores que funcionan en algunos tejidos pero no en otros; asimismo, promotores de genes expresados normalmente en las células, con o sin secuencias de intensificador específicas o generales. En algunas modalidades, se usan promotores que expresen constitutivamente genes en las células, con o sin secuencias de intensificador. Se proveen secuencias de intensificador en dichas modalidades cuando es adecuado o deseable. Las células de la presente invención pueden ser transfectadas usando técnicas bien conocidas fácilmente disponibles para los expertos en la técnica. Pueden introducirse genes exógenos en las células usando métodos estándar, en donde la célula expresa la proteína codificada por el gen. En algunas modalidades, las células son transfectadas mediante transfeccion por precipitación con fosfato de calcio, transfeccion por DEAE-dextrán, electroporación, microinyección, transferencia mediada por liposomas, transferencia mediada por químicos, transferencia mediada por ligandos o transferencia por vectores virales recombinantes. En algunas modalidades, se usan vectores de adenovirus recombinantes para introducir ADN con secuencias deseadas en la célula. En algunas modalidades, se usan vectores de retrovirus recombinantes para introducir ADN con secuencias deseadas en las células. En algunas modalidades, se usan técnicas de transfeccion estándar mediada por CaP04, DEAE-dextrán o vehículos de lípidos, para incorporar el ADN deseado en células en división. Pueden usarse técnicas de selección estándar de resistencia a antibióticos para identificar y seleccionar células transfectadas. En algunas modalidades, se introduce ADN directamente en las células mediante microinyección. Asimismo, pueden usarse técnicas de bombardeo de partículas o electroporación bien conocidas para introducir ADN extraño en las células. Un segundo gen es usualmente co-transfectado o enlazado al gen terapéutico. El segundo gen es con frecuencia un gen de resistencia a antibióticos seleccionable. Pueden seleccionarse células transfectadas desarrollando las células en un antibiótico que destruirá las células que no absorben el gen seleccionable. En la mayoría de los casos, en donde los dos genes son no enlazados y co-transfectados, las células que sobreviven al tratamiento con antibióticos tienen ambos genes en ellas, y expresan los mismos. Debe entenderse que los métodos descritos en la presente pueden llevarse a cabo de muchas formas, y con varias modificaciones y permutaciones de las mismas que son bien conocidas en la técnica. Puede apreciarse también que de ninguna manera debe considerarse que cualquier teoría expuesta para los modos de acción o interacciones entre los tipos de células limita esta invención, pero se presentan de modo que los métodos de la invención puedan entenderse más enteramente.

Uso terapéutico de las células ADAS Además del hecho de que las células ADAS pueden diferenciarse a lo largo de diferentes linajes de células, la invención se refiere también al descubrimiento de que las células ADAS carecen de características inmunógenas con respecto a la inducción de proliferación de células T. Esta característica es una indicación de que existe una probabilidad reducida de un rechazo inmune por las células inmunes del receptor. Además, se ha mostrado que las células ADAS no estimulan PBMCs alogénicas en una reacción mixta de linfocitos. En algunas modalidades de la invención, puede no ser necesario o deseable inmunosuprimir a un mamífero antes del inicio de la terapia celular/génica con células ADAS. Por consiguiente, se incluye en la invención el trasplante con células ADAS alogénicas o incluso xenogénicas. El uso de células ADAS para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o una condición del hueso provee una ventaja adicional, porque las células ADAS pueden introducirse en un receptor sin el requisito de un agente ¡nmunosupresor. Se cree que el trasplante exitoso de una célula requiere el injerto permanente de la célula del donador sin que induzca una respuesta inmune de rechazo del injerto generada por el receptor. Típicamente, para prevenir una respuesta de rechazo del injerto, se usan agentes inmunosupresores no específicos, tales como ciclosporina, metotrexato, esteroides y FK506. Estos agentes se administran sobre una base diaria, y si se interrumpe la administración, usualmente resulta rechazo del injerto. Sin embargo, una consecuencia no deseable en el uso de agentes inmunosupresores no específicos, es que funcionan suprimiendo todos los aspectos de la respuesta inmune (supresión inmune general), incrementando de esta manera ampliamente la susceptibilidad de un receptor a la infección y otras enfermedades. La presente invención provee un método para tratar una enfermedad, trastorno o condición del hueso, introduciendo células ADAS no diferenciadas o diferenciadas en el receptor, sin el requisito de agentes inmunosupresores. Existe por lo tanto una susceptibilidad reducida por el receptor, de la célula ADAS trasplantada para incurrir en infección y otras enfermedades que incluyen condiciones relacionadas con el cáncer, que se asocia con la terapia de inmunosupresión. La presente invención incluye la administración de una célula ADAS alogénica o una célula ADAS xenogénica, o de otra manera una célula ADAS que sea genéticamente diferente del receptor, en un receptor, para proveer un beneficio para el receptor. La presente invención provee un método de uso de células ADAS para tratar una enfermedad, trastorno o condición de hueso, sin el requisito del uso de agentes inmunosupresores cuando se administran las células a un receptor. En otra modalidad, la célula ADAS usada en la presente invención puede aislarse, de tejido adiposo de cualquier especie de mamífero que incluye, pero no está limitado a, humano, ratón, rata, simio, gibón y bovino. De preferencia, la célula ADAS se aisla de un humano, un ratón o una rata. Más preferiblemente, la célula ADAS se aisla de un humano. La célula ADAS puede administrarse a un mamífero después de un período de cultivo in vitro. La célula ADAS puede cultivarse en una forma que induzca a que la célula ADAS se diferencie in vitro. Sin embargo, se prefiere que la célula ADAS sea implantada en el receptor en un estado no diferenciado, y que la célula ADAS implantada se diferencie para expresar por lo menos una característica de una célula ósea in vivo. Las células ADAS de esta invención pueden trasplantarse en un mamífero usando técnicas conocidas en la materia tales como, por ejemplo, las descritas en las patentes de E.U.A. Nos. 5,082,670 y 5,618,531 , cada una incorporada en la presente como referencia, o en cualquier otro sitio adecuado en el cuerpo. El trasplante de las células de la presente invención puede lograrse usando técnicas bien conocidas en la materia, así como las descritas en la presente o como se desarrollarán en el futuro. La presente invención comprende un método para trasplantar, injertar, infundir, o de otra manera introducir las células en un mamífero, de preferencia, un humano. El número de células ADAS administradas a un mamífero puede relacionarse con, por ejemplo, el rendimiento de células después del procesamiento del tejido adiposo. Una porción del número total de células puede retenerse para uso posterior, o pueden ser criopreservada. Además, la dosis suministrada depende de la vía de suministro de las células al mamífero. La dosificación de las células ADAS varía dentro de amplios límites, y puede ajustarse a los requisitos individuales en cada caso particular. El número de células usadas depende del peso y la condición del receptor, el número y/o la frecuencia de las administraciones, y otras variables conocidas por los expertos en la técnica. Este número puede ajustarse por órdenes de magnitud para lograr el efecto terapéutico deseado. Entre aproximadamente 105 y aproximadamente 1013 células ADAS por 100 kg de peso corporal pueden administrarse al individuo. En algunas modalidades, se administran entre aproximadamente 1.5 x 106 y aproximadamente 1.5 x 1012 células por 100 kg de peso corporal. En algunas modalidades, se administran entre aproximadamente 1 x 109 y aproximadamente 5 x 1011 células por 100 kg de peso corporal. En otras modalidades, se administran entre aproximadamente 4 x 109 y aproximadamente 2 x 1011 células por 100 kg de peso corporal. En otras modalidades, se administran entre aproximadamente 5 x 108 células y aproximadamente 1 x 1010 células por 100 kg de peso corporal. Las células ADAS pueden suspenderse en un diluyente adecuado, a una concentración de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5 x 106 células/ml. Excipientes adecuados para soluciones de inyección, son aquellos que sean biológicamente y fisiológicamente compatibles con las células ADAS y con el receptor, tal como solución salina regulada en su pH u otros excipientes adecuados. La composición para administración puede formularse, producirse y almacenarse de acuerdo a métodos estándar que cumplan con la esterilidad y estabilidad adecuadas. Las células pueden también encapsularse y usarse para suministrar moléculas biológicamente activas, de acuerdo a tecnologías de encapsulación conocidas, que incluyen microencapsulación (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,352,883; 4,353,888; y 5,084,350, incorporadas en la presente como referencia) o macroencapsulación (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,284,761 ; 5,158,881 ; 4,976,859; y 4,968,733; y la publicación internacional WO 92/19195 y WO 95/05452, todas las cuales se incorporan en la presente como referencia). Para la macroencapsulación, el número de células en los dispositivos puede hacerse variar; de preferencia, cada dispositivo contiene entre 103-109 células, más preferiblemente aproximadamente 105 a 107 células. Varios dispositivos de macroencapsulación pueden implantarse en el mamífero. Métodos para la macroencapsulación e implantación de células son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. 6,498,018. El modo de administración de las células de la invención al mamífero puede variar, dependiendo de varios factores que incluyen el tipo de enfermedad que está siendo tratada, la edad del mamífero, si las células están diferenciadas o no, si las células tienen ADN heterólogo introducido en las mismas, y similares. Las células pueden introducirse en el sitio deseado mediante inyección directa, o mediante cualquier otro medio usado en la técnica para la introducción de compuestos administrados a un mamífero que sufra de una enfermedad o trastorno particular del hueso. Las células ADAS pueden administrarse en un hospedero en una amplia variedad de formas. Modos de administración incluyen, pero no están limitados a, intravascular, intracerebral, parenteral, intraperitoneal, intravenoso, epidural, intraespinal, intraesternal, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, intra-arterial, intracardiaco o intramuscular. De preferencia, las células se usan en procedimientos de fusión espinal.

Composición La invención provee también una matriz para implantación en un mamífero, en donde la matriz comprende una célula ADAS de la invención. La matriz puede incluir también, pero no está limitada a, una célula ADAS, un lisado de células ADAS, un medio acondicionado de células ADAS, y una matriz extracelular producida por una célula ADAS. La matriz puede contener también, o puede tratarse con, uno o más factores bioactivos que incluyen, pero no están limitados a, un agente antiapoptótico (es decir, eritropoyetina, trombopoyetina, factor de crecimiento I tipo insulina y factor de crecimiento II tipo insulina, factor de crecimiento de hepatocitos, inhibidores de caspasa); un agente antiinflamatorio (es decir, p38, inhibidores de MAPK, inhibidores del TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 e IL-1 , y fármacos antiinflamatorios no esteroidales); un agente inmunosupresor/inmunomodulador; un inhibidor de mTOR; un agente antiproliferativo; un corticosteroide (es decir, prednisolona, hidrocortisona); un agente antitrombogénico; y un antioxidante. La presencia de un factor bioactivo puede contribuir a la proliferación y/o diferenciación de las células ADAS. La invención provee además en algunos aspectos, métodos para regenerar tejido óseo en un mamífero que necesita del mismo, administrando una composición que comprenda una célula ADAS, una matriz, un lisado de células ADAS, un producto de células ADAS de la invención (es decir, moléculas secretadas por la célula ADAS), o cualquier combinación de los mismos en un mamífero. Como tal, la invención abarca una composición farmacéutica, en donde la composición puede usarse en el tratamiento de una condición ósea. Por ejemplo, la condición ósea incluye, pero no está limitada a, una fractura de hueso, una deformación de huesos/espina dorsal, osteosarcoma, mieloma, displasia ósea, escoliosis, osteoporosis, osteomalacia, raquitismo, osteítis fibrosa, distrofia ósea renal y enfermedad ósea de Paget. De preferencia, la invención provee composiciones y métodos para mejorar la fusión de hueso después de un procedimiento de fusión espinal. En una modalidad no limitativa, una formulación que comprenda las células de la invención se prepara para administración directamente al sitio en donde se desee la producción de nuevo tejido óseo. Por ejemplo, las células de la invención pueden suspenderse en una solución de hidrogel para inyección. En forma alternativa, puede dejarse que la solución de hidrogel que contiene a las células se endurezca, por ejemplo, en un molde, para formar una matriz que tenga células dispersas en la misma antes de la implantación, o una vez que la matriz se ha endurecido, las formaciones de células puedan cultivarse de modo que las células sean expandidas mitóticamente antes de la implantación. El hidrogel es un polímero orgánico (natural o sintético) que es entrelazado por medio de enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno, que crean una estructura de red abierta tridimensional que atrapa moléculas de agua para formar un gel. Ejemplos de materiales que pueden usarse para formar un hidrogel, incluyen polisacáridos tales como alginato y sales del mismo, péptidos, polifosfazinas y poliacrilatos, los cuales son entrelazados iónicamente, o polímeros de bloque tales como copolímeros de bloque de óxido de polietileno-polipropilenglicol, los cuales son entrelazados mediante el uso de temperatura o pH, respectivamente. En algunas modalidades, los polímeros son por lo menos parcialmente solubles en soluciones acuosas, tales como agua, soluciones salinas reguladas en su pH, o soluciones alcohólicas acuosas, las cuales tienen grupos laterales cargados, o una sal iónica monovalente de las mismas. Ejemplos de polímeros con grupos laterales ácidos que pueden hacerse reaccionar con cationes son poli(fosfazenos), ácidos poli(acrílicos), ácidos poli(metacrílicos), copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, acetato de poli(vinilo) y polímeros sulfonados, tales como poliestireno sulfonado. Pueden usarse también copolímeros que tengan grupos laterales ácidos formados por la reacción de ácido acrílico o metacrílico y monómeros o polímeros de éter vinílico. Ejemplos de grupos ácidos son grupos ácido carboxílico, grupos ácido sulfónico, grupos alcohol halogenado (de preferencia fluorado), grupos OH fenólicos y grupos OH ácidos. Ejemplos de polímeros con grupos laterales básicos que pueden hacerse reaccionar con aniones son poli(vinil aminas), poli(vinil piridina), poli(vinil imidazol), y algunos polifosfazenos sustituidos con ¡mino. La sal cuaternaria o de amonio de los polímeros puede formarse también de nitrógenos de la estructura de base o grupos amino pendientes. Ejemplos de grupos laterales básicos son grupos amino e imíno. Otros ejemplos de polímeros incluyen, pero no están limitados a, poli-alfahidroxiésteres, polidíoxanona, fumarato de propileno, poli-etilenglicol, poli-ortoésteres, polianhídridos y poliuretanos, ácido polí-L-láctico, ácido poli- glicólico y copolímero de ácido poliláctico-acido poliglicólico.

Trasplante de células ADAS usando andamios Las células de la invención pueden sembrarse sobre o en un andamio tridimensional, y pueden implantarse in vivo, en donde las células sembradas proliferan en la estructura y forman un tejido de reemplazo in vivo en cooperación con las células del mamífero. En algunos aspectos de la invención, el andamio comprende matriz extracelular, lisado de células (por ejemplo, fracciones de células solubles), o combinaciones de los mismos, de las células ADAS. En algunas modalidades, el andamio comprende una proteína de matriz extracelular secretada por las células de la invención. En forma alternativa, la matriz extracelular es un material exógeno seleccionado del grupo que consiste de alginato de calcio, agarosa, fibrina, colágena, laminina, fibronectina, glucosaminoglucano, ácido hialurónico, sulfato de heparina, sulfato de condroitina A, sulfato de dermatán y gelatina de matriz ósea. En algunos aspectos, la matriz comprende polímeros naturales o sintéticos. La invención incluye andamios biocompatibles, redes, estructuras de autoensamble, y similares, ya sea biodegradables o no, líquidos o sólidos. Dichos andamios se conocen en las técnicas de terapia basada en células, reconstrucción quirúrgica, ingeniería de tejidos y curación de heridas. De preferencia, los andamios son pretratados (por ejemplo, sembrados, inoculados, puestos en contacto) con las células, matriz extracelular, medio acondicionado, lisado de células, o combinación de los mismos. En algunos aspectos de la invención, las células se adhieren al andamio. El andamio sembrado puede introducirse en el cuerpo de un mamífero en cualquier forma conocida en la técnica que incluye, pero no está limitada a, implantación, inyección, fijación quirúrgica, trasplante con otro tejido, inyección, y similares. El andamio de la invención puede ser configurado a la forma y/o el tamaño de un tejido u órgano in vivo. Por ejemplo, pero no a manera de limitación, el andamio puede diseñarse de modo que la estructura del andamio soporte las células sembradas sin degradación subsiguiente; soporte las células del momento de la siembra hasta que el trasplante de tejido sea remodelado por el tejido del hospedero; y permita que las células sembradas se unan, proliferen y se desarrollen en una estructura de tejido que tenga suficiente integridad mecánica para sostenerse por sí misma. Pueden administrarse andamios de la invención en combinación con cualquiera de uno o más factores de crecimiento, células, fármacos u otros componentes descritos en otra parte en la presente, que estimulen la formación de tejido o de otra manera intensifiquen o mejoren la práctica de la invención. Las células ADAS que se sembrarán en los andamios pueden ser diseñadas genéticamente para expresar factores de crecimiento o fármacos. En otra modalidad preferida, las células de la invención se siembran sobre un andamio, en donde el material exhibe propiedades físicas especificadas de porosidad y resistencia biomecánica que imita las características del hueso verdadero, promoviendo de esta manera la estabilidad de la estructura final y el acceso y egreso de metabolitos y nutrientes celulares. Es decir, el material debe proveer soporte estructural, y puede formar un andamiaje en el cual pueda ocurrir vascularización y migración de células del hospedero. En la modalidad preferida, las células ADAS se mezclan primero con un material de vehículo antes de la aplicación a un andamio. Vehículos adecuados incluyen, pero no están limitados a, alginato de calcio, agarosa, tipos I, II, IV u otra isoforma de colágena, fibrina, ácido poliláctico/ácido poliglicólico, derivados de hialuronato, gelatina, laminina, fibronectina, almidón, polisacáridos, sacáridos, proteoglucanos, polímeros sintéticos, fosfato de calcio y materiales cerámicos (es decir, hidroxiapatita, fosfato tricálcico). Las superficies externas de la estructura tridimensional pueden ser modificadas para mejorar la unión o el crecimiento de las células y la diferenciación de tejido, tal como mediante plasma que recubre la estructura, o la adición de una o más proteínas (por ejemplo, colágenas, fibras elásticas, fibras reticulares), glucoproteínas, glucosaminoglucanos (por ejemplo, sulfato de heparina, 4-sulfato de condroitina, 6-sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, sulfato de queratina), una matriz celular y/u otros materiales tales como, pero no limitados a, gelatina, alginatos, agar y agarosa. En algunas modalidades, es importante recrear en cultivo el microambiente celular presente in vivo, tal como el grado al cual las células de la invención se desarrollan antes de la implantación in vivo. Además, pueden añadirse factores de crecimiento, agentes inductores osteogénicos y factores angiogénicos al medio de cultivo antes de, durante, o subsiguiente a, la inoculación de las células para desencadenar la diferenciación y formación de tejido por las células ADAS después de la implantación en el mamífero.

Aplicaciones terapéuticas de las células ADAS La presente invención abarca métodos para administrar una célula ADAS a un mamífero, incluyendo un humano, para tratar una enfermedad en donde la introducción de las células ADAS provee un alivio terapéutico. Las células de la invención pueden administrarse solas o como mezclas con otras células y/o un factor bioactivo, como se discutió en otra parte en la presente. Una célula que puede administrarse en conjunto con células ADAS de la invención incluye, pero no está limitada a, otras células multipotentes o pluripotentes, un osteocito, un osteoblasto, un osteoclasto, una célula de revestimiento óseo, una célula madre y una célula de médula ósea. Los diferentes tipos de células pueden mezclarse con las células ADAS inmediatamente o poco después de la administración a un mamífero, o pueden co-cultivarse juntas por un período antes de su administración a un mamífero. El experto en la técnica entenderá fácilmente que las células ADAS pueden ser trasplantadas en un mamífero, y después de que reciben señales e indicaciones del ambiente circundante, las células se diferencian en células maduras in vivo por efecto del ambiente celular vecino. De preferencia, las células ADAS se diferencian en una célula que exhibe por lo menos una característica dé una célula ósea. En forma alternativa, las células ADAS pueden diferenciarse in vitro en un tipo de célula deseado, y la célula diferenciada puede administrarse a un mamífero que necesita de la misma. La invención abarca también el injerto de células ADAS en combinación con otros procedimientos terapéuticos para tratar enfermedades del hueso. De preferencia, las células son útiles para mejorar la fusión de hueso después de un procedimiento de fusión espinal. Las células ADAS pueden ser co-injertadas con otras células, tanto células genéticamente modificadas como células no genéticamente modificadas que ejerzan efectos benéficos en el mamífero. Por lo tanto, los métodos descritos en la presente pueden combinarse con otros procedimientos terapéuticos como lo entenderían los expertos en la técnica, una vez provistos con las enseñanzas provistas en la presente. Las células ADAS pueden administrarse con otros fármacos o moléculas biológicas benéficos (factores de crecimiento, factores tróficos). Cuando las células ADAS se administran con otros agentes, pueden administrarse en conjunto en una composición farmacéutica individual, o en composiciones farmacéuticas separadas, simultáneamente o secuencialmente con los otros agentes (ya sea antes o después de la administración de los otros agentes). Factores bioactivos que pueden co-administrarse incluyen, pero no están limitados a, un agente antiapoptótico (es decir, eritropoyetina, trombopoyetina, factor de crecimiento I tipo insulina y factor de crecimiento II tipo insulina, factor de crecimiento de hepatocitos, inhibidores de caspasa); un agente antiinflamatorio (es decir, p38, inhibidores de MAPK, inhibidores del TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 e IL-1 , y fármacos antiinflamatorios no esteroidales); un agente inmunosupresor/inmunomodulador; un inhibidor de mTOR; un agente antiproliferativo (es decir, azatioprina, micofenolato mofetil); un corticosteroide (es decir, prednisolona, hidrocortisona); un agente antitrombogénico; y un antioxidante. La invención abarca la administración de células ADAS a un mamífero como células no diferenciadas, es decir, como cultivadas en medio de crecimiento. En forma alternativa, pueden administrarse células ADAS después de la exposición en cultivo a condiciones que estimulen la diferenciación hacia un fenotipo deseado, por ejemplo, un fenotipo osteogénico. Las células de la invención pueden ser quirúrgicamente implantadas, inyectadas, suministradas (por ejemplo, por medio de un catéter o jeringa), o administradas de otra manera directamente o indirectamente al sitio que necesita de reconstrucción o aumento. Las células pueden administrarse por medio de una matriz (por ejemplo, un andamio tridimensional). Las células pueden administrarse con vehículos farmacéuticamente aceptables convencionales. Vías de administración de las células de la invención o componentes (por ejemplo, matriz extracelular, lisado de células, medio acondicionado) de las mismas, incluyen administración intramuscular, oftálmica, parenteral (incluyendo intravenosa), intraarterial, subcutánea, oral y nasal. Vías particulares de administración parenteral incluyen, pero no están limitadas a, las vías de administración intramuscular, subcutánea, ¡ntraperitoneal, intracerebral, intraventricular, intracerebroventricular, intratecal, intraclstemal, intraespinal y/o periespinal. De preferencia, las células se usan en procedimientos de fusión espinal. Las células de la Invención pueden ser introducidas solas o en mezcla con una composición útil en la reconstrucción de heridas y defectos óseos. Dichas composiciones incluyen, pero no están limitadas a, proteínas morfogenéticas óseas, partículas de hidroxiapatita/fosfato tricálcico (HA/TCP), gelatina, poll-L-llsina y colágena. Por ejemplo, las células de la invención pueden combinarse con matriz ósea desmineralizada (DBM) u otras matrices que forman el material mixto osteogénlco (que forma hueso como tal) así como osteoinductivo. Para mejorar la diferenciación, supervivencia o actividad de las células implantadas, pueden añadirse factores bioactivos adicionales como se discutió en otra parte en la presente. Por ejemplo, un factor bioactivo puede incluir, pero no está limitado a, una proteína morfogenética ósea, factor de crecimiento endotelial vascular, factores de crecimiento de fibroblastos y otras citocinas que tengan capacidad osteoconductiva y/o osteoinductiva. Para mejorar la vascularización y la supervivencia del tejido óseo trasplantado, pueden añadirse factores angiogénlcos tales como VEGF, PDGF o bFGF, ya sea solos o en combinación con células endoteliales o sus precursores. En forma alternativa, las células ADAS que serán trasplantadas pueden ser diseñadas genéticamente para expresar dichos factores de crecimiento, antioxidantes, agentes antiapoptóticos, agentes antiinflamatorios o factores angiogénicos.

Composiciones farmacéuticas También abarcados dentro del alcance de la invención, son productos de células ADAS que incluyen, pero no están limitados a, matrices extracelulares secretadas por las células ADAS mismas, lisados de células (por ejemplo, fracciones de células solubles) de células ADAS y medio acondicionado de células ADAS. Como tal, en términos de la administración de una composición que comprende una célula ADAS, la invención incluye una composición farmacéutica que comprende por lo menos uno de los siguientes: una célula ADAS, una matriz extracelular producida por la misma, un lisado celular de la misma, o un medio acondicionado de células ADAS. La composición farmacéutica de la invención incluye de preferencia un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica se usa de preferencia para el tratamiento de condiciones óseas como se define en la presente. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender poblaciones homogéneas o heterogéneas de células ADAS, matriz extracelular o lisado de células de las mismas, o medio acondicionado de las mismas, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Vehículos farmacéuticamente aceptables para las células de la invención, incluyen sustancias de vehículo orgánicas o inorgánicas adecuadas que no reaccionen perjudicialmente con las células de la invención o composiciones o componentes de las mismas. Al punto que sean biocompatibles, vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen agua, solución salina (tal como solución de Ringer), alcoholes, aceites, gelatinas y carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidón, ésteres de ácido graso, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidina. Dichas preparaciones pueden esterilizarse, y si se desea, pueden mezclarse con agentes auxiliares tales como lubricantes, conservadores, estabilizadores, agentes mojantes, emulsionantes, sales que influyen sobre la presión osmótica, reguladores de pH y agentes colorantes. Vehículos farmacéuticos adecuados para su uso en la presente invención se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Pharmaceutical Sciences (decimoséptima edición, Mack Pub. Co., Easton, Pa.) y en el documento WO 96/05309, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia. Como otro ejemplo pero no a manera de limitación, las células de la invención pueden administrarse solas, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, o pueden sembrarse sobre o en una matriz como se describió en otra parte en la presente, pueden usarse para reconstruir o reemplazar tejido óseo dañado o destruido, para aumentar tejido óseo existente, para introducir tejido nuevo o alterado, o para modificar prótesis artificiales. Cuando se administran células en dispositivos semisólidos o sólidos, la implantación quirúrgica en un sitio preciso en el cuerpo es típicamente un medio de administración adecuado. En el caso en donde las células se administran en la forma de un líquido o composición farmacéutica fluida, las células pueden administrarse hacia un sitio más general (es decir, por toda un área difusamente afectada), desde la cual migran hacia un sitio particular (es decir, respondiendo a señales químicas). Otras modalidades abarcan métodos de tratamiento, administrando composiciones farmacéuticas que comprenden componentes celulares de células ADAS (por ejemplo, lisados de células o componentes de las mismas) o productos (por ejemplo, matriz extracelular, factores tróficos y otros factores biológicos producidos naturalmente por células ADAS o a través de modificación genética, medio acondicionado de cultivo de células ADAS). De nuevo, estos métodos pueden comprender además administrar otros agentes activos como se describió en otra parte en la presente. Las células ADAS pueden aplicarse también con aditivos para mejorar, controlar o de otra manera dirigir, el efecto terapéutico deseado. Asimismo, las células pueden aplicarse con una matriz biocompatible que facilite la ingeniería de tejidos in vivo sustentando y/o dirigiendo el destino de las células implantadas. Antes de la administración de las células ADAS en un mamífero, las células pueden ser establemente o transitoriamente transfectadas o transducidas con un ácido nucleico de interés, usando una estrategia de vector de plásmido, viral o alternativo. Las células pueden administrarse después de la manipulación genética, de modo que expresen productos génicos que estén destinados para promover las respuestas terapéuticas provistas por las células. Las células ADAS de la invención pueden usarse para tratar mamíferos que requieren la reparación o el reemplazo de tejido óseo que resulta de enfermedad o trauma o falla del tejido para desarrollarse normalmente. El tratamiento puede entrañar el uso de las células de la invención para producir nuevo tejido óseo. Por ejemplo, las células de la invención no diferenciadas u osteogénicas inducidas por la diferenciación, pueden usarse para tratar condiciones óseas que incluyen enfermedades óseas metabólicas y no metabólicas. Ejemplos de una condición ósea incluyen, pero no están limitados a, una fractura de hueso, una deformación de huesos/espina dorsal, osteosarcoma, mieloma, displasia ósea, escoliosis, osteoporosis, osteomalacia, raquitismo, osteítis fibrosa, distrofia ósea renal y enfermedad ósea de Paget.

Fusión espinal Como se expone en la presente, el dolor de espalda continúa siendo un problema de salud pública importante, especialmente entre las personas de edad avanzada. El dolor de espalda severo y persistente, causa con frecuencia debilidad e incapacidad. Este dolor está asociado estrechamente con anormalidades de los discos intervertebrales de la espina dorsal. Con base en la presente descripción, pueden tratarse discos degenerados restaurando los tejidos dañados dentro del disco. Las células ADAS de la invención pueden usarse para estimular el desarrollo de hueso, y restaurar de esta manera los discos intervertebrales en varias etapas de degeneración. Sin embargo, con frecuencia es necesario remover por lo menos una porción del componente de la espalda dañado y/o con mal funcionamiento. Por ejemplo, cuando un disco llega a ser fracturado, puede realizarse un procedimiento quirúrgico de discotomía para remover el disco fracturado, y fusionar las dos vértebras en conjunto entre el disco removido. La fusión espinal es un procedimiento por el cual dos o más de las vértebras que constituyen la columna vertebral son fusionadas juntas con injertos de hueso y dispositivos internos (tales como varillas) que sanan en un hueso sólido individual. La fusión espinal puede eliminar el movimiento no natural entre las vértebras y, a su vez, puede reducir la presión sobre las terminaciones nerviosas. Además, puede usarse la fusión espinal para tratar, por ejemplo, lesiones de vértebras espinales causadas por trauma; protrusión y degeneración del disco de amortiguamiento entre las vértebras (llamado a veces disco intervertebral luxado o disco herniado); curvaturas anormales (tales como escoliosis o cifosis); y espina dorsal débil o inestable causada por infecciones o tumores. La presente invención abarca composiciones y métodos para mejorar los índices de éxito de procedimientos de fusión espinal. Puesto que se ha mostrado que las células ADAS de la presente invención forman hueso in vivo, las células ADAS pueden usarse en lugar de injertos de hueso usados convencionalmente en cirugías de fusión espinal. Específicamente, las células ADAS pueden usarse para estimular la formación de hueso entre dos vértebras adyacentes (dentro del cuerpo vertebral), así como entre procesos transversos adyacentes (dentro de los espacios del proceso intertransverso en cualquier lado de la espina dorsal). Las células ADAS de la presente invención tienen numerosas aplicaciones en el tratamiento de trastornos de la espina dorsal, incluyendo la promoción de la producción de matriz rica en proteoglucanos en la reparación de discos intervertebrales, la producción de hueso para el cuerpo intervertebral en la fusión espinal del proceso intertransverso, y la producción de hueso para la curación de fracturas de huesos largos. La presente invención se basa en el descubrimiento de que las células ADAS pueden usarse para facilitar la fusión de hueso en un procedimiento de fusión espinal. Cuando un disco llega a ser fracturado, puede realizarse un procedimiento quirúrgico de discotomía que remueve el disco fracturado, y que fusiona las dos vértebras entre el disco removido. Detalles respecto a implementaciones típicas de métodos para la fusión de vértebras, se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 6,033,438 y 5,015,247, cuyo contenido se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. La degeneración de los discos intervertebrales se trata comúnmente con una fusión de segmentos, por la cual los elementos de espina dorsal anterior y posterior del espacio intercuerpos son fusionados. Es importante considerar las tensiones mecánicas impuestas sobre los elementos anterior y posterior cuando se considere una técnica de fusión. Los elementos del segmento de movimiento anterior (cuerpos y disco vertebrales) poseen aproximadamente 80% de la fuerza de compresión a ese nivel determinado en la espina dorsal. El 1/3 posterior del cuerpo y disco vertebrales representa el punto central para la compresión axial en la espina dorsal. Estas mecánicas son críticas para evaluar qué tipo de fusión tendrá el mejor resultado clínico para una patología determinada. La invención provee un procedimiento de fusión espinal en el cual se usan células ADAS como una fuente de un sustituto de hueso. En una modalidad, la invención incluye métodos para realizar una o más fusiones espinales en un mamífero, que comprenden introducir una cantidad efectiva de células ADAS en uno o más espacios intercuerpos adecuados en el mamífero, mediante la inyección de las células a través de una jeringa, catéter o cánula que facilita la fusión espinal a nivel individual o múltiple. Las células ADAS se establecerán bajo condiciones fisiológicas, es decir, in vivo con el tiempo, en donde las células se diferencian y forman hueso. La presencia de las células ADAS mejora la fusión de hueso en un procedimiento de fusión espinal. En otra modalidad, la invención incluye métodos para realizar una o más fusiones espinales en un mamífero, que comprende poner en la porción posterior de por lo menos un espacio intercuerpos adecuado, un implante metálico seleccionado de varillas y tornillos pedunculados o placas y tornillos pedunculados por unión de los mismos a las vértebras adyacentes; inyectar en la porción anterior del espacio intercuerpos una cantidad efectiva de células ADAS; y dejar que las células ADAS se diferencien en una célula que exhiba por lo menos una característica de una célula ósea, y formar de esta manera hueso in vivo. La invención incluye métodos para realizar fusiones espinales usando un procedimiento anterior, posterior o posterolateral hacia el espacio intercuerpos. El procedimiento posterolateral (unilateral o bilateral) reduce la morbilidad quirúrgica sobre un procedimiento anterior, pero se requiere tener cuidado mientras se trabaja alrededor de la cola equina y raíces nerviosas salientes en el conducto espinal. El acceso posterior y la visualización del espacio intercuerpos es más limitado que con el procedimiento anterior, pero muchos cirujanos espinales están capacitados en cómo tratar esas circunstancias. Como se discutió en otra parte en la presente, las células ADAS pueden comprender también una cantidad de uno o más agentes bioactivos activos adecuados para promover el crecimiento óseo, tal como un factor de crecimiento, una proteína morfogenética ósea, o un vehículo farmacéutico para los mismos. Un mecanismo por el cual las células ADAS pueden proveer un beneficio terapéutico o estructural, es incorporando las mismas o su progenie en tejidos o componentes de tejido recién generados, existentes o reconstruidos. Por ejemplo, las células ADAS y/o su progenie pueden incorporar en hueso recién generado, otro tejido estructural o funcional, y causar de esta manera una mejora terapéutica o estructural, o contribuir a la misma. Otro mecanismo por el cual las células ADAS pueden proveer un beneficio terapéutico o estructural, es expresando y/o secretando moléculas, por ejemplo, factores de crecimiento, que promueven la creación, retención, restauración y/o regeneración de la estructura o función de un tejido o componente de tejido determinado. Las células ADAS pueden usarse también en combinación con otras células o dispositivos tales como andamios sintéticos o biológicos, materiales o dispositivos que suministren factores, fármacos, químicos u otros agentes que modifican o mejoran las características relevantes de las células como se describe además en la presente. De conformidad con la invención descrita en la presente, las células ADAS pueden ser suministradas al mamífero poco después de la cosecha del tejido adiposo del mamífero. Por ejemplo, las células pueden administrarse inmediatamente después del procesamiento del tejido adiposo y la obtención de una composición de células ADAS. Por último, la regulación del suministro dependerá de la disponibilidad del mamífero y el tiempo de procesamiento requerido para procesar el tejido adiposo. En otra modalidad, la regulación para el suministro puede ser relativamente más larga, si las células que serán reinfundidas en el mamífero son sometidas a modificación, purificación, estimulación u otra manipulación adicional, como se discute en la presente. El número de células administradas a un mamífero puede relacionarse con, por ejemplo, el rendimiento de células después del procesamiento del tejido adiposo. Una porción del número total de células puede retenerse para uso posterior, o puede criopreservarse. Los siguientes ejemplos ilustran además aspectos de la presente invención. Sin embargo, de ninguna manera son una limitación de las enseñanzas o la descripción de la presente invención como se expone en la presente.

EJEMPLOS La invención se describe ahora con relación a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proveen sólo con el propósito de ilustración, y la invención no se limita a estos ejemplos, sino más bien abarca todas las variaciones que son evidentes como resultado de las enseñanzas provistas en la presente. Los siguientes experimentos se realizaron para determinar la función de las células ADAS sobre el resultado de un procedimiento de fusión espinal. Por ejemplo, el efecto de células ADAS singénicas o alogénicas sobre procedimientos de fusión espinal. Los resultados de la presente demuestran que las células ADAS son osteogénicas, y contribuyen a la mejora en la fusión espinal. Con base en la presente descripción, pueden usarse células ADAS para tratar mamíferos que incluyen, pero no están limitados a, víctimas de trauma, mamíferos osteoporoticos que carezcan de números adecuados de células osteogénicas, y mamíferos con fracturas sin unión.

EJEMPLO 1 Alternativas para el hueso de autoinjerto en la cirugía de fusión espinal Más de 75% de la población de Norteamérica sufre de dolor de espalda. En algunos casos, enfermedades médicas subyacentes pueden contribuir al dolor de espalda. Estas incluyen escoliosis, estenosis espinal, enfermedad degenerativa de los discos intervertebrales, procesos infecciosos, tumores y trauma. Para el 1 % de la población, el dolor de espalda es tan severo que son forzados a sufrir incapacidad durante el curso de su vida; un 1 % adicional de la población sufre incapacidad por el dolor de espalda por un período limitado. La mayoría de los mamíferos con dolor de espalda son tratados con terapias conservativas; sin embargo, cuando modalidades tales como el reposo en cama y la medicación fallan, los médicos recomiendan con frecuencia la cirugía de fusión espinal. El propósito de esta operación es formar hueso ectópico entre dos o más vértebras adyacentes, "fusionándolas" en una estructura sólida. La inmovilización de la articulación vertebral reduce la presión sobre las raíces nerviosas que salen de la médula espinal, y la sensación dolorosa resultante. Los cirujanos usan un procedimiento posterolateral para la espina dorsal lumbar, introduciendo un injerto de hueso o material osteoinductivo con un soporte mecánico entre los cuerpos vertebrales que forman hueso ectópico (figuras 1A-1 D).

Sin que se desee que sea limitado por una teoría en particular, se cree que el material de injerto "ideal" para una fusión espinal proveería las siguientes propiedades: soporte mecánico (el material estabiliza el sitio quirúrgico/de la espina dorsal durante el período de recuperación); osteoconductiva (el material facilita el crecimiento hacia dentro y la integración de hueso adyacente sobre sí mismo); osteoinductiva (el material recluta y estimula la formación y el crecimiento de hueso a partir de células que pueden no naturalmente hacerlo); y osteogénica (el material contiene células que por sí mismas son capaces de formar nuevo hueso). En la actualidad, el "estándar de oro" para la reconstrucción por fusión espinal es el hueso autólogo, usualmente cosechado de la cresta ilíaca del individuo. Los cirujanos trasplantan el hueso propio del mamífero hacia el sitio que necesita del mismo. Sin embargo, esto está lejos de ser una solución perfecta. En 30% de los mamíferos, el sitio donador llega a ser infectado, magullado, fracturado o doloroso después de la cirugía. Por supuesto, cuando un mamífero requiere hueso de autoinjerto para fusiones espinales múltiples, la cresta ilíaca puede no proveer material suficiente. La salud subyacente del mamífero influye además sobre el resultado de la cirugía de fusión espinal. Los mamíferos con osteoporosis o insuficiencia vascular debida a diabetes, el fumar o la edad, exhiben formación reducida de nuevo hueso y falta de unión en el sitio de la fusión espinal (Whang, et al., 2003, Spine J. 3: 155-65). De esta manera, existe la necesidad de alternativas para el hueso de autoinjerto en la cirugía de fusión espinal.

Mientras que existen materiales alternativos disponibles, todos enfrentan una limitación común: ninguno exhibe capacidad osteogénica. El hueso de aloinjerto de cadáveres puede ser utilizado, almacenado y usado en el quirófano, según sea necesario. Estos materiales pueden ser preconfigurados para uso específico, o pulverizados, permitiéndoles que sean aplicados como una pasta en el sitio quirúrgico; sin embargo, los aloinjertos pueden causar inflamación, pueden inducir una respuesta inmune y han sido una fuente infecciosa en un número limitado de casos (Whang et al., 2003, Spine J. 3: 155-65). Debido a que el hueso de aloinjerto es esterilizado, deja de contener células nativas viables que forman hueso (osteoblastos, osteocitos), y carecen de propiedades osteogénicas. En pruebas clínicas, el hueso de aloinjerto es inferior al hueso de autoinjerto en fusiones espinales de niveles múltiples (Whang et al., 2003, Spine J. 3: 155-65). Materiales cerámicos tales como la hidroxiapatita y el fosfato tricálcico (HA/TCP) son osteoconductivos, y promueven la nueva formación de hueso. Sin embargo, carecen de propiedades osteogénicas y osteoinductivas, limitando su utilidad. Mientras que factores de crecimiento osteoinductivos tales como las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) están disponibles comercialmente (Infuse™ de Sofamor/Medtronics), requieren la presencia de células osteogénicas dentro del sitio de la fusión espinal para promover la nueva formación de hueso (Whang et al., 2003, Spine J. 3: 155-65). El desarrollo de una célula osteogénica tiene el potencial de mejorar el resultado con cualquiera de estos materiales de fusión espinal alternativos.

Muchas especies animales han servido como modelos en pruebas preclínicas de fusión espinal. Estos incluyen rata, conejo, perro, oveja, cabra y primate no humano (Khan et al., 2004, Biomaterials 25: 1475-85; Liebschner er al., 2004, Biomaterials 25: 1697-714; Sandhu er al., 2001 , Eur. Spine J. 10: S 122-31 ). De estos, la rata (Boden et al., 1998, Spine 23: 2486-92; Cui et al., 2001 , Spine 26: 2305-10; Wang er al., 2003, J. Bone Joint Surg. Am. 85-A: 90511 ) y el conejo (Khan et al., 2004, Biomaterials 25: 1475-85; Kruyt er al., 2004, Biomaterials 25: 1463-73) se han usado para estudios de "prueba de concepto" debido al tamaño y costo del animal. En cada especie, los cirujanos pueden usar un procedimiento posterolateral para la espina dorsal lumbar, similar al usado para tratar otros mamíferos. El conejo se usa más comúnmente para estudios de viabilidad de la fusión espinal (Khan et al., 2004, Biomaterials 25: 475-85), debido en parte al tamaño del animal y la observación confirmada de que la velocidad de la fusión espinal en el conejo es similar a la observada en un humano. Sin embargo, el conejo presenta ciertas desventajas en comparación con el modelo de rata. A diferencia de las ratas, en donde están disponibles cepas endógamas bien caracterizadas, los conejos de laboratorio no exhiben haplotipos singénicos o congénicos. De esta manera, puede no ser posible trasplantar habitualmente células de un conejo a otro sin el riesgo de rechazo. El modelo de fusión espinal posterolateral de rata se ha usado exitosamente para demostrar el efecto osteoinductivo de la proteína morfogenética ósea 7 cuando se presenta en un andamio de colágena (Salamon er al., 2003, J. Spinal Disord. Tech. 16: 90-5). Varios grupos han usado exitosamente el modelo de rata para evaluar el efecto osteogénico de las células estromáticas de médula ósea en la fusión espinal (Boden et al., 1998, Spine 23: 2486-92; Cui et al., 2001 , Spine 26: 2305-10; Wang er a/., 2003, J. Bone Joint Surg. Am. 85-A: 905-1 1 ). Lograron mejoras estadísticamente significativas en la fusión espinal dentro de 4 a 9 semanas después de la implantación de células estromáticas de médula ósea, en comparación con andamio solo. Cada estudio usó grupos de n = 4 a 8 animales. Los siguientes experimentos están diseñados para evaluar la función de las células ADAS en procedimientos de fusión espinal.

Aislamiento de células ADAS Se cosecha tejido adiposo subcutáneo de ratas Fischer machos (de 8 a 10 semanas de edad, n = 25, dando aproximadamente 3 gramos de tejido por rata). Se preparan células ADAS de acuerdo a metodologías publicadas (Aust et al., 2004, Cytotherapy 6: 7-14; Halvorsen et al., 2001 , Metabolism 50: 407-413; Sen et al., 2001 , Journal of Cellular Biochemistry 81 : 312-319). En resumen, tejido adiposo es desmenuzado, lavado y suspendido en un volumen igual de solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene albúmina de suero de bovino a 1 % y colagenasa tipo I a 0.1 % (Worthington Biochemical, Lakewood NJ). Después de una digestión por 60 minutos a 37°C con agitación (50 rpm), la suspensión se centrifuga a 1200 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente, y las células estromáticas de la fracción vascular son transformadas a pellas. Las células vasculares estromáticas se siembran a una densidad de 0.1 gramos de digesta de tejido por cm2 en "medio de células estromáticas" (DMEM/medio F-12 de Ham complementado con suero de bovino fetal a 10% (Hyclone, Logan UT), y antibiótico a 1 %/antimicótico. Las células se incuban por 3 a 6 días en una incubadora humidificada de CO2 a 5% hasta que alcancen 75% de confluencia. Esto da aproximadamente 25-30 X 104 células/cm2. En ese tiempo, las células ADAS se cosechan mediante digestión con tripsina/EDTA, y se hacen pasar por un pasaje a una densidad de siembra de 5 X 103 células/cm2. Las células se expanden por hasta 2 pasajes para obtener más de 60 millones de células (cuadro 1 ). Las células se evalúan in vitro por su capacidad osteogénica y adipogénica usando pruebas estándar durante un período inductivo de 1 a 3 semanas como se describe en Halvorsen et al., 2001 , Tissue Eng. 7: 729-41 ; Hicok et al., 2004, Tissue Engineering 10: 371 -380). Las células pueden criopreservarse en nitrógeno líquido antes de su uso. Para rastrear las células histológicamente, las células se marcan durante el pasaje inicial con un vector retroviral que posea el gen LacZ que expresa ß-galactosidasa para proveer un marcador rastreable. La integración estable de vectores retrovirales reduce el riesgo de que el marcador se pierda durante el tiempo de implantación. Este método se ha usado habitualmente para rastrear células implantadas.

CUADRO 1 Expansión y rendimiento estimado de células ADAS EJEMPLO 2 Osteoqénesis de células ADAS in vitro Se ha demostrado que las células ADAS humanas exhiben un fenotipo osteogénico in vitro cuando se cultivan en presencia de ascorbato, ß-glicerofosfato, dexametasona y 1 ,25 dihidroxivitamina D3 (Halvorsen et al., 2001 , Tissue Eng. 7: 729-41 ). Bajo estas condiciones, las células ADAS mineralizan su matriz extracelular según se demuestra mediante tinción positiva con rojo de alizarina o von Kossa por deposición de fosfato de calcio (figuras 3A-3D). Se observó que la osteogénesis de células ADAS humanas durante un período de 10 días, fue acompañada por un incremento en actividad de la fosfatasa alcalina. Al final del período de cultivo, las células osteogénicas (mineralizadas) exhibieron un nivel 3 veces mayor de fosfatasa alcalina respecto a células mantenidas bajo condiciones control (figura 4). Asimismo, hubo un incremento dependiente del tiempo en niveles secretados de proteína osteocalcina bajo condiciones osteogénicas. Las células ADAS expresaron un número de marcadores de genes consistente con un fenotipo de osteoblasto, incluyendo osteocalcina, osteopontina, proteínas morfogenéticas óseas (BMP) 2 y 4 y los receptores de BMP IA, IB y II. Se ha demostrado también que las células ADAS tienen el potencial de diferenciarse a lo largo de vías de linaje múltiples. En respuesta a cocteles específicos de químicos y factores de crecimiento, las células ADAS pueden diferenciarse en condrocitos, osteoblastos, adipocitos y células tipo células gliales y neuronales in vitro (figura 2).

EJEMPLO 3 Las células ADAS son osteogénicas in vivo Para extender los hallazgos in vitro, las células ADAS humanas fueron trasplantadas en ratones SCID inmunodeficientes. Las células ADAS fueron cargadas en cubos de 3 cm3 de andamio de hidroxiapatita/fosfato tricálcico (HA/TCP), e implantadas subcutáneamente. Después de un período de 6 semanas, los implantes fueron cosechados, fijados, descalcificados y teñidos con hematoxilina/eosina o con anticuerpos específicos de antígenos nucleares humanos (figuras 5A y 5B). Con base en la tinción con hematoxilina y eosina, se observó que nuevo hueso se formó adyacente al andamio de hidroxiapatita/fosfato tricálcico en presencia de las células ADAS humanas. Las células humanas fueron identificadas dentro del hueso con base en un análisis de inmunofluorescencia con el anticuerpo específico de antígenos humanos. En presencia del andamio solo (sin células) nuevo hueso no se formó, y no se detectaron células humanas. Estos estudios demuestran que las células ADAS son capaces de exhibir osteogénesis in vivo.

EJEMPLO 4 Las células ADAS pueden ser trasplantadas alogénicamente Los siguientes experimentos sirven para proveer prueba de concepto respecto al trasplante alogénico de células ADAS en el modelo de fusión espinal. Se ha demostrado que las células ADAS no pueden inducir una respuesta proliferativa a partir de linfocitos alogénicos en una reacción mixta de linfocitos. Sin que se desee que sea limitado por alguna teoría en particular, se cree que las células ADAS liberan un factor que inhibe la respuesta inmune de los linfocitos a los antígenos alogénicos. La presencia de células ADAS prolongó la supervivencia del injerto de piel en el modelo de babuino, e indica por lo tanto que las células madre adultas pueden ser trasplantadas alogénicamente para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Mediante el uso de un modelo de canino, puede crearse un defecto de segmento de tamaño crítico en la diáfisis femoral de perros. Los defectos pueden repararse con andamios de hidroxiapatita/fosfato tricálcico solos o en combinación con células ADAS autólogas o alogénicas; las células alogénicas son deshermanadas para los antígenos HLA-1 y HLA-2 (cuadro 2). Los receptores de trasplante no reciben terapia inmunosupresora alguna. Se sacrifica a los animales 16 semanas después, y el grado de reparación del hueso observado en presencia de las células ADAS puede compararse con el trasplante de andamio solo (sin células ADAS). Sin que se desee que sea limitado por alguna teoría en particular, se cree que no habrá diferencia significativa observable entre la reparación obtenida con células ADAS autólogas contra células ADAS alogénicas, ni habrá evidencia de alguna respuesta inmune a las células alogénicas. Estos experimentos sirven para demostrar el hecho de que el trasplante alogénico de células madre adultas en una construcción de tejido diseñada es factible, y en algunos casos no requiere terapia inmunosupresora.

CUADRO 2 Análisis histomorfométrico de hueso y cerámica en defectos de segmento de canino** **EI por ciento de cerámica fue el porcentaje del área total del implante ocupado por la cerámica, y el por ciento de hueso fue el porcentaje del espacio poroso ocupado por hueso. Los valores se dan como la media ± desviación estándar.

En comparación con los implantes libres de células, la diferencia fue significativa (p<0.05) (Arinzeh et al., 2003, J. Bone Joint Surg. Am. 85-A: 1927-35).

EJEMPLO 5 Células ADAS singénicas en fusión espinal Los siguientes experimentos sirven para consignar la hipótesis de que las células ADAS son osteogénicas in vivo y, en combinación con un vehículo de biomaterial adecuado, pueden mejorar y acelerar la fusión espinal en modelos animales. El cuadro 3 resume el diseño experimental. Los estudios iniciales se llevan a cabo con células ADAS singénicas (células de la misma cepa de rata), que imitan las condiciones existentes en un trasplante de células autólogas humanas. Mediante la remoción de problemas relacionados con la respuesta y el rechazo inmunes, estos experimentos se enfocan en la capacidad osteogénica de las células ADAS para la fusión espinal. Estos experimentos que usan la rata como un modelo de fusión espinal, se comparan con métodos conocidos en la técnica (Boden et al., 995, Spine 20: 412-20; Wang et al., 2003, J. Bone Joint Surg. Am. 85-A: 905-1 1 ; Cui et al., 2001 , Spine 26: 2305-10; Sandhu et al., 2001 , Eur. Spine J. 10 Supl. 2: S122-31 ; Wang et al., 2003, Spine J. 3: 155-65).

Procedimiento quirúrgico y eutanasia Se realiza una artrodesis espinal intertransversa de nivel individual (L4-L5) en 96 ratas Fischer hembras, como es descrito por Cui (Cui et al., 2001 , Spine 26: 2305-10). Los animales son anestesiados con cetamina (80 mg/kg) y xilazina (7 mg/kg), afeitados, envueltos, y su piel desinfectada con Betadine y etanol a 70%. Se hace una incisión longitudinal posterior en la línea media de L3 a L5. El periostio es elevado a lo largo de la lámina y los procesos espinosos hacia el aspecto lateral de las facetas. Las facetas son removidas usando un rongeur, y la herida es irrigada con solución salina. Los animales son distribuidos al azar en grupos de n = 32. El grupo A no recibe tratamiento. El grupo B recibe la implantación de andamio de hidroxiapatita/fosfato tricálcico (40 mg) solo en el lecho de fusión. El grupo C recibe implantación de andamio de hidroxiapatita/fosfato tricálcico (40 mg) en combinación con 2 X 106 células ADAS derivadas del tejido adiposo subcutáneo de ratas Fischer (células singénicas) en el lecho de fusión. Después de la colocación del implante, la fascia profunda y las incisiones de la piel son cerradas. Los animales que reciben clorhidrato de buprenorfina (0.1 mg/kg) para analgesia post-operatoria, son monitoreados para recuperación de morbilidad y función por hasta 24 horas después del procedimiento. Grupos de 16 animales de cada grupo son sacrificados mediante asfixia con C02 6 y 12 semanas después del procedimiento quirúrgico. En ese tiempo, muestras de suero y la espina dorsal lumbar se colectan para análisis.

Tratamiento complementario radiográfico Se somete a los animales a radiografías posteroanterior y lateral de la espina lumbosacra, después de la cirugía y a intervalos de 6 semanas después de la cirugía. El análisis radiográfico sirve para detectar la formación de hueso ectópico y la formación de callo en la espina dorsal lumbar en el sitio quirúrgico. Se realiza tomografía microcomputarizada (micro-CT) en las muestras disectadas después del sacrificio. Puede determinarse la estructura y el volumen de la nueva formación de hueso usando métodos conocidos en la técnica (Mankani et al., 2004, Radiology 230: 369-76).

Palpación manual de la fusión espinal Al momento del sacrificio de los animales, se disecta la espina dorsal lumbar en L3-L5 de los animales. Las muestras se palpan por extensión y flexión en L3-4 y L4-5. Las muestras se clasifican para la presencia o ausencia de algún movimiento. Aquellas muestras con movimiento en cualquier dirección reciben una puntuación de "0", mientras que aquellas sin movimiento en ninguna dimensión se consideran como "fusionadas" con una puntuación de "1 " (Cui et al., 2001 , Spine 26: 2305-10; Grauer et al., 2004, Spine J. 4: 281 -6).

Prueba biomecánica de la fusión espinal Antes de la prueba, todo el músculo es despejado, y el disco intervertebral en L4-L5 es dividido, de modo que sólo la masa de fusión esté conectando las dos vértebras. Se ponen pasadores de alambre k de acero (3.2 mm) en una dirección anteroposterior en los cuerpos vertebrales. Se realizan pruebas de tracción uniaxial a una velocidad de desplazamiento de 0.5 cm/minuto con la carga aplicada a través del alambre k. Los desplazamientos se miden usando extensómetros, y las cargas se miden usando una célula de carga. La carga pico a la falla se mide a partir de una gráfica de desplazamiento de carga generada por computadora. Se determina la rigidez como la pendiente de la línea entre dos puntos (a 50% y 75% de carga a la falla) en la curva de desplazamiento de carga. El segmento adyacente en L3-4 se pone a prueba en forma similar.

Análisis histológico Las muestras de espina lumbar (n = 8 en cada punto de tiempo para cada grupo) son fijadas en formalina por 48 horas, descalcificadas en ácido etilendiaminotetraacético 0.25 M en solución salina regulada en su pH con fosfato por 2 semanas a 4°C, e incubadas por 16 horas en una solución de X-gal (1 mg/ml) a 37°C. La muestra es incluida en parafina, seccionada transversalmente (5 pm) y teñida con hematoxilina y eosina. Diez secciones de cada muestra se analizan usando el software Medivue (Nikon) para cuantificar el porcentaje medio (± desviación estándar) de cada implante ocupado por hueso ectópico. Sin que se desee que sea limitado por alguna teoría en particular, se cree que las células ADAS son exitosas para la fusión espinal si se logran los siguientes resultados: 1 ) se observa evidencia mínima de fusión (puntuación de fusión de 0 por manipulación manual en 90% de los animales, sin evidencia radiográfica de hueso ectópico, y menos de 5% del área del sitio quirúrgico ocupado por matriz ósea en 10 secciones por muestra con base en histología y análisis por CT) en el grupo A (sin tratamiento) en los puntos de tiempo de 6 y 12 semanas; 2) detección del andamio de HA/TCP en el análisis histológico de animales en los grupos B y C en los puntos de tiempo de 6 y 12 semanas; 3) evidencia mínima de fusión (puntuación de fusión de 0 por manipulación manual en 90% de los animales, sin evidencia radiográfica de hueso ectópico, y menos de 5% del área del sitio quirúrgico ocupado por matriz ósea en 10 secciones por muestra con base en histología y análisis por CT) en el grupo B (HA/TCP solo) en los puntos de tiempo de 6 y 12 semanas; 4) detección de células ADAS trasplantadas en los grupos C por 6 semanas después de la cirugía con base en la actividad de la enzima ß-galactosidasa o inmunodetección en el análisis histológico; y 5) fusión espinal superior en presencia de células ADAS (grupos C) (puntuación de fusión de "1 " por manipulación manual en 90% de los animales, evidencia radiográfica de hueso ectópico en el sitio quirúrgico, y más de 30% del área del implante de HA/TCP ocupado por matriz ósea en 10 secciones por muestra con base en histología y análisis por CT) respecto al andamio solo (grupo B) o controles de lesión faltos (grupo A) en los puntos de tiempo de 6 y 12 semanas. Los experimentos expuestos en este ejemplo sirven para consignar la utilidad de las células ADAS para acelerar y mejorar la fusión espinal lumbar en un modelo de rata.

CUADRO 3 Esbozo del diseño experimental EJEMPLO 6 Células ADAS alogénicas en fusión espinal Los siguientes experimentos sirven para consignar la hipótesis de que las células ADAS pueden ser trasplantadas alogénicamente con un andamio de biomaterial para lograr una fusión espinal superior en comparación con un andamio de biomaterial solo. El cuadro 4 resume el diseño experimental. Se ha mostrado que es posible trasplantar MSCs derivadas de médula ósea para reparar defectos óseos sin evidencia de rechazo inmune significativo (Arinzeh et al., 2003, J. Bone Joint Surg. Am. 85-A: 1927-35). Los experimentos descritos en la presente demuestran la utilidad de las células ADAS alogénicas en un modelo de fusión espinal lumbar. Se seleccionan cepas de ratas endógamas Fischer y ACI para los siguientes experimentos, con base en estudios previos en la literatura (Akahane et al., 1999, J. Bone Miner Res. 14: 561 -8; Yoshikawa et al., 2000, J. Bone Miner Res. 15: 1147-57). Estos animales exhiben un mal acoplamiento de los antígenos de histocompatibilidad y rechazo de trasplantes de tejido osteogénico, a menos que se dé terapia inmunosupresora (Akahane et al., 1999, J. Bone Miner Res. 14: 561 -8; Yoshikawa et al., 2000, J. Bone Miner Res. 15: 1 147-57). Se usan células ADAS alogénicas aisladas de ratas ACI para implantación en la fusión espinal lumbar de ratas Fischer. Los experimentos de la presente pueden llevarse a cabo en paralelo con los experimentos relacionados con las células ADAS autólogas singénicas, permitiendo de esta manera un análisis comparativo. La ausencia o presencia de una respuesta inmune a las células ADAS alogénicas puede evaluarse con base en reacciones mixtas de linfocitos unidireccionales y análisis citométrico de flujo de muestras de suero obtenidas de los grupos.

CUADRO 4 Esbozo del diseño experimental Se cosecha tejido adiposo subcutáneo de ratas ACI machos (8 a 1 0 semanas de edad, n = 25, dando aproximadamente 3 gramos de tejido por rata), como se discutió en otra parte en la presente. El número de células obtenido con cada pasaje sigue las estimaciones esbozadas en el cuadro 1. Las células ADAS de las ratas ACI son sometidas a los mismos análisis in vitro que se usaron para las células ADAS de las ratas Fischer. Los procedimientos de tratamiento complementario y quirúrgico (es decir, tratamiento complementario radiográfico, palpación manual de la fusión espinal) se realizan como se describe en otra parte en la presente. Los implantes de HA/TCP pueden contener aproximadamente 2 X 106 células en un volumen de 100 µ?. Para el análisis histológico, muestras de espina lumbar son fijadas en formalina por 48 horas, descalcificadas en ácido etilendiaminotetraacético 0.25 M en solución salina regulada en su pH con fosfato por 2 semanas a 4°C, e incubadas por 16 horas en una solución de X-gal (1 mg/ml) a 37°C. Las muestras son incluidas en parafina, seccionadas transversalmente (5 pm) y teñidas con hematoxilina y eosina. Diez secciones de cada muestra se analizan usando el software Medivue (Nikon) para cuantificar el porcentaje medio (± desviación estándar) de cada implante ocupado por hueso ectópico. Se evalúan secciones para la presencia o ausencia de linfocitos infiltrantes. Sin que se desee que sea limitado por alguna teoría en particular, un anticuerpo contra el anticuerpo panhematopoyético (anti-CD45) puede usarse para la tinción inmunohistoquímica de las células para identificar cualquier célula inmune dentro o alrededor de los implantes. El número de linfocitos infiltrantes puede determinarse en 10 secciones por muestra, y puede cuantificarse usando el software del programa Medivue.

Respuesta inmune del suero La unión de anticuerpos del suero a las células ADAS de la cepa ACI, se evalúa mediante citometría de flujo. Células ADAS de ratas ACI se descongelan rápidamente del almacenamiento en nitrógeno líquido, y se ponen en cultivo por 5 días para facilitar el máximo de viabilidad y expresión de antígenos de superficie. Las células se cosechan mediante tripsinización, se lavan en regulador de pH de tinción (1x DPBS, FBS a 5%, BSA a 0.5%, azida de sodio a 0.1 %), y se resuspenden a 5 x 106 células/ml. 90 µ? de células (5 x 105 células) se distribuyen en alícuotas en tubos Eppendorf de 2 mi. 10 µ? de suero de rata sin diluir, o suero diluido 1 : 10 en regulador de pH de tinción, se añaden a cada tubo para dar diluciones efectivas de suero que son de 1 :10 y 1 :100. Todos los tubos se incuban en hielo por 30 minutos, se lavan con regulador de pH de lavado (1X DPBS, BSA a 0.5% y azida de sodio a 0.1%), y entonces se resuspenden en 100 µ? de regulador de pH de tinción. Se añade anticuerpo secundario marcado con FITC anti-rata de cabra (IgG/lgM) a todos los tubos a una dilución final de 1 :100. Tubos control reciben células ADAS ACI sólo con anticuerpo secundario (control negativo), o con un suero de rata anti-ACI de Fischer de control positivo que se produce mediante inmunización repetida de ratas Fischer con células ADAS ACI. Las suspensiones se incuban en la oscuridad en hielo por 15 minutos, y se lavan dos veces con regulador de pH de lavado como se discutió en otra parte en la presente. Las células son entonces fijadas en 200 µ? de paraformaldehído a 1 %, y se deja que se incuben en hielo, en fijador por cuando menos 15 minutos antes de la adquisición. Se adquieren 20,000 eventos para el análisis de la citometría de flujo. Los resultados se expresan como el porcentaje de células ACI teñidas con el anticuerpo secundario con base en la intensidad de fluorescencia media incrementada respecto al anticuerpo secundario solo como control negativo.

Reacción mixta de linfocitos (MLR) unidireccional Esta prueba se basa en la siguiente razón fundamental. Si las células T son cebadas in vivo para aloantígenos de ACI, responderán a la reestimulación in vitro con una cinética más rápida. La activación de células T de rata receptoras a células ADAS de la cepa ACI alogénicas, puede evaluarse mediante la prueba de MLR. Se realizan pruebas de MLR en ratas individuales usando células LN mesentéricas positivas cervicales agrupadas como células respondedoras. Se evalúan ocho animales por grupo de 3 grupos: Sin tratamiento (grupo A); andamio sólo (grupo B); andamio + células alogénicas (grupo D) (cuadro 5). La prueba se establece cultivando las células respondedoras en medio, con células estimuladoras de bazo de Fischer singénicas irradiadas (5000R), o con células estimuladores de bazo ACI alogénicas irradiadas. La proliferación de células T en respuesta a medio o a células de bazo singénicas, representa respuestas de fondo; la respuesta singénica se resta típicamente de la respuesta a las células alogénicas para evaluar la proliferación verdadera. Como controles positivo y negativo, se establecen pruebas con linfocitos de Fischer ACI alogénicos irradiados (positivos) y singénicos (negativos); su expresión de antígenos HLA 1 y 2 alogénicos contra singénicos asegura una respuesta proliferativa vigorosa por el respondedor, linfocitos derivados de Fischer, o ausencia de respuesta. La prueba de MLR se realiza en placa de 96 cavidades usando cavidades por triplicado por tratamiento. Las células respondedoras se siembran a 4 x 105 células/cavidad, y los estimuladores de células de bazo se siembran a 1 x 105 células/cavidad. El medio de cultivo usado es medio de Dulbecco modificado de Iscove + FBS a 10% (Hyclone) complementado con aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, 2-mercaptoetanol y antibióticos/antimicóticos. Se prepararon placas de cultivo como réplica para cosecha en los días 3 y 7 de cultivo. Los cultivos se pulsan en los días 2 ó 6 con timidina tritiada (1 pCi/cavidad), y las células se cosechan aproximadamente 16 horas después para conteo de escintilación. Los resultados se reportan como conteos por minuto (cpm) que reflejan el grado de proliferación de células T en las cavidades de cultivo.

CUADRO 5 Reacción mixta de linfocitos unidireccional que se desee que sea limitado por alguna teoría particular, se cree que las células ADAS alogénicas son exitosas para la fusión espinal si se logran los siguientes resultados: se observa evidencia mínima de fusión (puntuación de fusión de 0 por manipulación manual en 90% de los animales, sin evidencia radiográfica de hueso ectópico, y menos de 5% del área del sitio quirúrgico ocupado por matriz ósea en 10 secciones por muestra con base en histología y análisis por CT) en el grupo A (sin tratamiento) en los puntos de tiempo de 6 y 12 semanas; detección del andamio de HA/TCP en el análisis histológico de todos los animales en los grupos B y D en los puntos de tiempo de 6 y 12 semanas; evidencia mínima de fusión (puntuación de fusión de 0 por manipulación manual en 90% de los animales, sin evidencia radiográfica de hueso ectópico, y menos de 5% del área del sitio quirúrgico ocupado por matriz ósea en 10 secciones por muestra con base en histología y análisis por CT) en el grupo B (HA/TCP solo) en los puntos de tiempo de 6 y 12 semanas; evidencia mínima de fusión (puntuación de fusión de 0 por manipulación manual en 90% de los animales, sin evidencia radiográfica de hueso ectópico, y menos de 5% del área del sitio quirúrgico ocupado por matriz ósea en 10 secciones por muestra con base en histología y análisis por CT) en el grupo B (HA/TCP solo) en los puntos de tiempo de 6 y 12 semanas; detección de células ADAS trasplantadas en los grupos D por hasta 6 semanas después de la cirugía con base en la actividad de la enzima ß-galactosidasa en el análisis histológico; fusión espinal superior en presencia de células ADAS (grupos D) (puntuación de fusión de "1 " por manipulación manual en 90% de los animales, evidencia radiográfica de hueso ectópico en el sitio quirúrgico, y más de 30% del área del implante de HA/TCP ocupado por matriz ósea en 10 secciones por muestra con base en histología y análisis por CT) respecto al andamio solo (grupo B) o controles de lesión faltos (grupo A) en los puntos de tiempo de 6 y 12 semanas; menos de un incremento de 1.5 veces en el nivel de anticuerpos anti-ADAS en los grupos C y D (implantes de células ADAS) respecto a los grupos A y B (sin tratamiento de células); y sin evidencia de proliferación mejorada de células respondedoras estimulada por células de bazo derivadas de células alogénicas en comparación con medio solo o células de bazo derivadas de células singénicas en la reacción mixta de linfocitos unidireccional cuando se comparan los grupos A, B y D. Los controles positivos de la reacción mixta de linfocitos exhibirán una respuesta de proliferación de por lo menos 10,000 cpm.

EJEMPLO 7 Comparación y contraste de la eficacia relativa de células ADAS singénicas y alogénicas en un modelo de fusión espinal La descripción presentada en la presente provee datos que permiten la determinación de si células ADAS alogénicas (mal adaptadas para HLA) y singénicas (compatibles con HLA), exhiben función igual en el logro de una fusión espinal. El diseño experimental se resume en el cuadro 6. Sin que se desee que sea limitado por alguna teoría en particular, se cree que las dos poblaciones de células son equivalentes, con base en los estudios previos que lograron una reparación exitosa de un defecto óseo de tamaño crítico en perros usando MSCs alogénicas (Arinzeh et al., 2003, J. Bone Joint Surg. Am. 85-A: 1927-35). La comparación de células ADAS singénicas y alogénicas provee implicaciones médicas y comerciales significativas. La descripción presentada en la presente provee el uso de células ADAS alogénicas para la terapia de regeneración de tejidos.

CUADRO 6 Comparación de la fusión espinal con células ADAS alogénicas contra singénicas Sin que se desee que sea limitado por alguna teoría en particular, se cree que las células ADAS alogénicas son comparables a las células ADAS singénicas en cuanto a éxito en la fusión espinal, si todos los parámetros del cuadro 6 no muestran una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos de células ADAS alogénicas y singénicas (p > 0.05, de preferencia p > 0.30). Las descripciones de cada una y cualquier patente, solicitud de patente y publicación citada en la presente, se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Mientras que esta invención se ha descrito con relación a modalidades específicas, es evidente que otras modalidades y variaciones de esta invención puedan ser concebidas por los expertos en la técnica sin que se aparten del espíritu y alcance reales de la invención. Se pretende que se considere que las reivindicaciones anexas incluyen dichas modalidades y variaciones equivalentes.

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 .- El uso de una célula estromática adulta derivada de tejido adiposo (ADAS) aislada en la elaboración de un medicamento útil para mejorar la fusión de hueso después de un procedimiento de fusión espinal en un mamífero, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en la espina dorsal de dicho mamífero, y en donde dicha células ADAS se diferencia in vivo en una célula que expresa por lo menos una característica de una célula ósea.

2.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicha célula ADAS es cultivada in vitro por un período sin que sea inducida para que se diferencie antes de la administración de dicha célula al mamífero.

3.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicha célula ADAS es alogénica con respecto a dicho mamífero.

4.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento es útil para inducir la formación de hueso por fusión espinal de cuerpos intervertebrales.

5.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento es útil para inducir la formación de hueso por fusión espinal de procesos intertransversos.

6.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicha célula ADAS comprende además una matriz biocompatible.

7. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicha matriz biocompatible se selecciona del grupo que consiste de alginato de calcio, agarosa, fibrina, colágena, laminina, fibronectina, glucosaminoglucano, ácido hialurónico, sulfato de heparina, sulfato de condroitina A, sulfato de dermatán y gelatina de matriz ósea.

8. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicha célula ADAS es genéticamente modificada.

9. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en uno o más espacios intercuerpos en la espina dorsal del mamífero.

10. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la fusión espinal es en un segmento de la espina dorsal seleccionado del grupo que consiste de articulación cervical, torácica, lumbar, lumbosacra y sacro-ilíaca (SI).

11. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en uno o más espacios intercuerpos mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de un procedimiento posterior, un procedimiento posterolateral, un procedimiento anterior, un procedimiento anterolateral y un procedimiento lateral.

12. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho mamífero es un humano.

13. - El uso de una célula estromática adulta derivada de tejido adiposo (ADAS) aislada en la elaboración de un medicamento útil para realizar una o más fusiones espinales en un mamífero, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en la espina dorsal de dicho mamífero para facilitar una fusión espinal de nivel individual o múltiple.

14. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde dicha célula ADAS se diferencia in vivo en una célula que expresa por lo menos una característica de una célula ósea.

15. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde dicha célula ADAS es cultivada in vitro por un período sin que sea inducida para que se diferencie antes de la administración de dicha célula a dicho mamífero.

16. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde dicha célula ADAS es alogénica con respecto al mamífero.

17.- El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde el medicamento es útil para inducir la formación de hueso por fusión espinal de cuerpos intervertebrales.

18. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde el medicamento es útil para inducir la formación de hueso por fusión espinal de procesos intertransversos.

19. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde dicha célula ADAS comprende además una matriz biocompatible.

20. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde dicha matriz biocompatible se selecciona del grupo que consiste de alginato de calcio, agarosa, fibrina, colágena, laminina, fibronectina, glucosaminoglucano, ácido hialurónico, sulfato de heparina, sulfato de condroitina A, sulfato de dermatán y gelatina de matriz ósea.

21. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde dicha célula ADAS es genéticamente modificada.

22. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en uno o más espacios intercuerpos en la espina dorsal de dicho mamífero.

23. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde la fusión espinal es en un segmento de la espina dorsal seleccionado del grupo que consiste de articulación cervical, torácica, lumbar, lumbosacra y sacro-ilíaca (SI).

24. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en uno o más espacios intercuerpos mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de un procedimiento posterior, un procedimiento posterolateral, un procedimiento anterior, un procedimiento anterolateral y un procedimiento lateral.

25. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde dicho mamífero es un humano.