MX2008001326A - Procedimientos de administracion de vacunas, nuevos calicivirus felinos, y tratamientos para inmunizar animales contra paraovirus felino y herpes virus felino. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a una vacuna para inmunizar un gato contra virus felinos. La presente invencion tambien se refiere a un clon de acido nucleico que codifica la proteina de la capsula del calicivirus felino aislado. La presente invencion ademas se refiere a una vacuna viva o muerta, que comprende el calicivirus felino aislado, una vacuna de subunidad que comprende la proteina de la capsida del calicivirus felino aislado, una vacuna de acido nucleico que comprende un clon de acido nucleico del calicivirus felino aislado, y una vacuna de vector de virus recombinante que comprende acido nucleico que codifica la proteina de la capsida del calicivirus felino aislado. La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento para identificar un calicivirus felino util para producir una composicion de vacuna y para ensayos para diagnosticar gatos infectados con calicivirus felino. Tambien se describe un procedimiento para inmunizar animales, especialmente gatos, contra una enfermedad, en particular contra calicivirus felino (FCV). El procedimiento incluye administrar a un gato cantidades terapeuticamente eficaces de primera y segunda vacunas de FCV. La primera vacuna se administra por via oral o parenteral (por ejemplo, por via subcutanea, por via intramuscular, y similares). La segunda vacuna se administra por via oral u oronasal N dias despues de la administracion de la primera vacuna, en el que N es un numero entero de 3 a 120, ambos inclusive. Tambien puede darse una tercera administracion de vacuna. La presente invencion tambien describe procedimientos y materiales para tratar e inmunizar animales con vacuna, y en particular gatos contra FPV o Parvovirus Felino, que tambien se denomina Panleucopenia o FPL y contra otra enfermedad, FHV o Herpesvirus Felino, que tambien se denomina Virus de la Rinotraqueitis Felina.

Description

PROCEDIMIENTOS DE ADMINISTRACIÓN DE VACUNAS. NUEVOS CALICIVIRUS FELINOS. Y TRATAMIENTOS PARA INMUNIZAR ANIMALES CONTRA PARAOVIRUS FELINO Y HERPES VIRUS FELINO CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a proporcionar nuevas vías para administrar diversas vacunas a diversos animales. Describe varios calicivirus felinos aislados (FCV). Describe nuevos procedimientos para presentar vacunas de FCV a gatos. La presente invención también se refiere a clones de ácidos nucleicos que codifican calicivirus felinos. Se refiere a proteinas de la cápsida de FCV, vacunas vivas o muertas, una vacuna de subunidad que comprende la proteína de la cápsida, una vacuna de ácido nucleico, y una vacuna de vector de virus recombinante que comprende ácidos nucleicos que codifican la proteína de la cápsida del calicivirus felino aislado. La presente invención también se refiere a un procedimiento para identificar un calicivirus felino útil para producir una composición de vacuna y ensayos para diagnosticar gatos infectados con calicivirus felino. La presente invención también proporciona nuevas vías para administrar vacunas de FCV nuevas y antiguas a felinos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se informa que los calicivirus son una importante causa de enfermedades en gatos. Se observan una amplia diversidad de síntomas tales como fiebre, rinitis, estornudos, conjuntivitis leve, descarga ocular, vesículas en los orificios nasales externos, mucosa oral o en la lengua, neumonía, bronquitis traqueal, diarrea, dolores musculares, paso rígido, e hiperestesia. Las infecciones bacterianas oportunistas acompañan a menudo a las infecciones por FCV, lo que complica el tratamiento y la recuperación. Las infecciones por FCV graves pueden conducir a la muerte, especialmente en crías de gato. Se debe observar que dichos síntomas, aunque considerados comunes en casos naturales, no siempre son prominentes en las infecciones experimentales. Podría parecer que diversas cepas de campo de calicivirus felino (FCV) difieren en su potencial para causar enfermedad, o que la infección concurrente con otros agentes influye en los síntomas de la enfermedad. Las vacunas contra calicivirus felino han estado disponibles durante más de dos décadas. Aunque existen numerosos serotipos de FCV, ciertas cepas, tales como F9, se descubrieron como inductoras de anticuerpos contra una amplia variedad de cepas de FCV. Véase J. L. Bittie y W.J. Rubic, Am. J. Vet. Res. 37:275-78 (1976). Como resultado, las primeras vacunas contra calicivirus felino emplearon una versión modificada o atenuada de la cepa FCV-F9. Véase Patente de Estados Unidos N° 3,937,812 de J. L. Bittie y W.J. Rubic, que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Aunque las vacunas de FCV-F9 y otras vacunas disponibles en el mercado proporcionan protección contra muchos aislados de campo, no es verdad que estas vacunas eviten la infección por todas las cepas. Es más, a medida que el FCV sigue evolucionando, la vacuna basada en FCV-F9 proporciona protección contra cada vez menos aislados de campo (Lauritzen y col., 1997, Vet Microbiology, 56:55-63). Además, los veterinarios han expresado su preocupación sobre la eficacia de las vacunas basadas en un único serotipo. De hecho, los estudios de campo sugieren que las vacunas obtenidas de la cepa FCV-F9 proporcionan inmunidad insuficiente contra muchas cepas de calicivirus felino. Véase, por ejemplo, N.C. Pederson y col., Feline Pract. 13(1):26-35 (1983); S. Dawson y col., Vet. Rec. 132:346-50 (1993). Los veterinarios también han planteado su preocupación acerca de la administración de un virus vivo modificado que puede, en algunas circunstancias, causar la enfermedad en animales de otra manera sanos. Los investigadores han informado que la dosificación oral inadvertida de una vacuna de FCV administrada por vía subcutánea dio como resultado una enfermedad aguda. Véase R.C. Povey, Feline Pract. 7(5): 12-16 (1977). Hay, por lo tanto, un interés continuo en desarrollar una vacuna, que por sí misma o en combinación con otras vacunas, pudiera proporcionar la protección deseada después de la vacunación de un gato. Se describen varios aislados en este documento, que se han aislado de gatos y que proporcionan un medio para proporcionar amplia protección en gatos inmunizados.

DESCRIPCIÓN DE LA INFORMACIÓN Documentos de patentes de Estados Unidos 3937812 febrero/1976 Bittie y col., 3944469 marzo/1976 Bittie y col. 4486530 diciembre/1984 David y col., 4786589 noviembre/1988 Rounds y col. 5169789 diciembre/1992 Bemstein y col., 5229293 julio/1993 Matsuura y col. 5266313 noviembre/1993 Esposito y col., 5338683 agosto/1994 Paoletti y col. 5494807 febrero/1996 Paoletti y col., 5559041 septiembre/1996 Kang y col. 5561064 octubre/1996 Marquet y col., 5580859 diciembre/1996 Felgner 5585100 diciembre/1996 Mond y col., 5589384 diciembre/1996 Liscombe 5589466 diciembre/1996 Felgner, 5620845 abril/1997 Gould y col. 5656448 agosto/1997 Kang y col., 5693761 diciembre/1997 Queen y col. 5693762 diciembre/1997 Queen y col., 5695928 diciembre/1997 Stewart y col. 5703055 diciembre/1997 Felgner, 5716784 febrero/1998 DiCesare 5716822 febrero/1998 Wardley, 57 8901 febrero/1998 Wardley 5725863 marzo/1998 Daniels y col., 5728587 marzo/1998 Kang y col. 5800821 septiembre/1998 Acheson y col., 5977322 noviembre/1999 Marks y col. 6010703 enero/2000 Maes y col., 6355246 marzo/2002 Kruger y col.; 6,534,066 B 1 marzo/2003 Poulet y col. DOCUMENTOS DE PATENTES EXTRANJERAS 0484382 marzo/1995 EP, WO2004/083390 OTRAS PUBLICACIONES Burroughs, J.N y Brown, F., J. Gen. Virol., 22, pp. 281-285 (1974). Clarke y Lambden en J. Gen. Virol. 78: 291-301 (1997). Griest, N.R., 1979, Diagnostic methods in clinical virology (3a ed.), páginas. 84-85, Blackwell J. L. Bittie y W. J. Rubic, Am. J. Vet. Res. 37:275-78 (1976). Lauritzen y col., Vet Microbiology 56: 55-63 (1997).

Maky, Brian W J. y Kangro, Hillar O. 1996, Virology methods manual, pp. 35-37, Academic Press, New York. Motin y col., Infect. Immun. 64: 4313-4318 (1996). N. C. Pederson y col., Feline Pract. 13(1):26-35 (1983). Oglesby, A.S., y col., Virology 44, páginas. 329-341 (1971). Poulet y col., Veterinary Microbiology 106: 17-31 (2005). Poulet y col., Archives of Virology 145: 243-261 (2000). R. C. Povey, Feline Pract. 7(5):12-16 (1977). S. Dawson y col., Vet. Rec. 132:346-50 (1993). Scientific Publishers, Oxford, UK. Soergel, M.E., y col., Intervirology, 5, páginas 239-244 (1975). Yokoyama, N., y col., Vaccine, vol. 14, No. 17/18, pp. 1657-1663 (1996).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona nuevas cepas de y se refiere a, varios calicivirus felinos aislados (FCV). También describe nuevos procedimientos para presentar vacunas a animales y particularmente, vacunas de FCV a gatos. La presente invención también se refiere a clones de ácidos nucleicos que codifican calicivirus felinos. Se refiere a proteínas de la cápsida de FCV, vacunas vivas o muertas, una vacuna de subunidad que comprende la proteína de la cápsida, una vacuna de ácido nucleico, y una vacuna de vector de virus recombinante que comprende ácidos nucleicos que codifican la proteina de la cápsida del calicivirus felino aislado. La presente invención también se refiere a un procedimiento para identificar un calicivirus felino útil para producir una composición de vacuna y ensayos para diagnosticar gatos infectados con calicivirus felino. La presente invención también proporciona nuevas vías para administrar vacunas de FCV nuevas y antiguas a felinos. En este documento también se describen procedimientos y materiales para tratar e inmunizar animales con vacuna, y en particular gatos, contra FPV o Parvovirus Felino, que también se han denominado Panleucopenia o FPL y contra otra enfermedad, FHV o Herpesvirus Felino, que también se denomina Virus de la Rinotraqueítis Felina. Más adelante se describen nuevas combinaciones de vacunas, que cuando se presentan a un felino de la forma descrita permiten administraciones eficaces oral/oral y sube/oral de vacunas contra FPV y/o FHV. En particular, la presente invención describe las siguientes vacunas para inmunizar gatos contra calicivirus felino. Una proteína de la cápsida de FCV-21 o una proteína de la cápsida de FCV-21 aislada (SEC ID N°: 13) y secuencias que tienen al menos aproximadamente el 91.2%, 95% y el 99% de identidad. Una vacuna de ADN que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de la cápsida de FCV-21 o una proteína de la cápsida de FCV-21 aislada en la que dicho ADN comprende una secuencia (SEC ID N°: 12) y secuencias que tienen al menos aproximadamente 78.7% y 79.2% de identidad de secuencia y que permiten sustituciones conservativas. Una vacuna que comprende una proteína de la cápsida de FCV-49, o una proteína de la cápsida de FCV-49 aislada en la que dicha proteína de la cápsida comprende una secuencia de proteína de la cepa FCV-49 (SEC ID N°: 15) y secuencias que tienen al menos aproximadamente 92.7%, 95% y 99% de identidad; en la que dicha proteina de la cápsida se proporciona en una cantidad eficaz. Una vacuna de ADN que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de la cápsida de FCV-49 o una proteína de la cápsida de FCV-49 aislada en la que dicho ADN comprende una secuencia (SEC ID N°: 14) y secuencias que tienen al menos aproximadamente 78.9%, en concreto, 79.4% (78.9 + 0.5) de identidad de secuencia y que permiten sustituciones conservativas. Una vacuna que comprende una proteína de la cápsida de FCV-26391-4, o una proteína de la cápsida de FCV-26391-4 aislada, en la que dicha proteína de la cápsida comprende secuencias de proteínas de la cepa FCV-26391-4. Una vacuna que comprende una proteína de la cápsida de FCV-26391-4 en la que dicha proteina de la cápsida comprende una secuencia de proteína (SEC ID N°: 17) y secuencias que tienen al menos aproximadamente 91.8%, 95% y 99% de identidad. Una vacuna de ADN que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican una proteina de la cápsida de FCV-26391-4 o una proteina de la cápsida de FCV-26391-4 aislada en la que dicho ADN comprende una secuencia (SEC ID N°: 16) y secuencias que tienen al menos aproximadamente 78.4%, en concreto 78.9% (78.4 + 0.5) de identidad de secuencia. Una vacuna donde el polinucleótido se selecciona entre el grupo constituido esencialmente por SEC ID N°: 12, 14, 16. Las vacunas pueden estar solas o en cualquier combinación de las siguientes: donde contenga un adyuvante, en la que el componente de FCV esté vivo, en la que el componente de FCV esté atenuado, en la que el componente de FCV esté inactivado, que puede incluir al menos una cepa de calicivirus felino diferente seleccionada entre el grupo constituido por FCV-F9, FCV-LLK, FCV-M8, FCV-255 y FCV-2280. Una vacuna para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende una secuencia de nucleótidos de una proteína de la cápsida de FCV seleccionada entre el grupo constituido por un polipéptido que tiene 93% o más identidad con SEC ID N°: 13, 15 ó 17, en la que el FCV aislado no es la cepa 213-95, y en la que la secuencia de ácido nucleico se une de forma operativa a una secuencia promotora heteróloga, en cantidad eficaz para producir una respuesta inmune, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una vacuna para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende una secuencia de nucleótidos de una proteína de la cápsida de FCV seleccionada entre el grupo constituido esencialmente por SEC ID N°: 12, 14 y 16. Una vacuna en la que la secuencia de nucleótidos está en cualquiera de los siguientes: un plásmido, un vector de virus recombinante, o cualquier otro vector de nucleótidos. Una vacuna en la que el vector de virus recombinante se selecciona entre el grupo constituido por herpesvirus felino, poxvirus de mapache, poxvirus de canario, adenovirus, virus Semliki Forest, virus Sindbis y virus vaccinia. También hay descripciones de composiciones inmunogénicas que comprenden un vehículo o excipiente veterinariamente aceptable y una cepa aislada de FCV, que se une a un anticuerpo monoclonal seleccionado de los anticuerpos monoclonales descritos en este documento como 23, 26, 41 , 44 y 56. En algunas versiones de la invención la composición inmunogénica que comprende un vehículo o excipiente veterinariamente aceptable y una cepa aislada de FCV, se une de forma selectiva a un anticuerpo monoclonal seleccionado de los anticuerpos monoclonales descritos en este documento como 23, 26, 41 , 44 y 56. Estas composiciones inmunogénicas incluyen composiciones donde la cepa de FCV está inactivada, donde dicha cepa de FCV es una vacuna, y donde la composición comprende un adyuvante. Las vacunas descritas en este documento pueden incluir al menos un patógeno felino distinto, seleccionado entre el grupo constituido por herpesvirus felino, virus de la leucemia felina, virus de la inmunodeficiencia felina, Chlamydia pssittaci, y parvovirus felino, virus de la rabia y Bordetella bronchiseptica. La vacuna puede también comprender adicionalmente o puede administrarse con un adyuvante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un régimen de vacunación que reduce de forma significativa la mortalidad asociada con calicivirus felino (FCV) y potencia el perfil de seguridad de las vacunas de FCV. Además, el régimen de vacunación reivindicado induce un perfil de neutralización cruzada en suero más amplio que los protocolos de vacuna de FCV-F9 existentes, que debe proporcionar mejor inmunidad a través de diferentes cepas de calicivirus felino. Un aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para inmunizar animales con vacunas, en particular, un gato contra calicivirus felino. Otras dos enfermedades felinas, FPV y FHV, también tienen nuevos tratamientos descritos en este documento. El procedimiento comprende administrar al gato cantidades terapéuticamente eficaces de una primera vacuna, una segunda vacuna y, opcionalmente una tercera vacuna que pueden también darse dentro de 120 dias como anteriormente, o más a menudo, después de aproximadamente 1 año como un refuerzo anual. La primera vacuna se administra por vía parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, por vía intramuscular, etc.). La segunda vacuna se administra por via oral o por vía oronasal aproximadamente N días después de la administración de la primera vacuna, y la tercera vacuna se administra por vía parenteral, por vía oral, o por vía oronasal aproximadamente M días después de la administración de la primera o la segunda vacunas. En este documento, N y M son números enteros independientes de 3 a 120, ambos inclusive. También se prefiere cuando N es aproximadamente 3 semanas y aproximadamente 2-4 semanas. Además, se presenta un aspecto de la invención en el que ciertas vacunas identificadas pueden administrarse en forma de dos dosis orales, sin necesidad de una primera administración parenteral. Se aconsejan también refuerzos anuales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA LISTA DE SECUENCIAS SEC ID N°: 1 SEC ID N°: 10 Ollgonucleótido cebador DEL-653 Ollgonucleótido cebador FCV-SR C4 SEC ID N°: 2 SEC ID N°: 11 Ollgonucleótido cebador DEL-651 Ollgonucleótido cebador FCV-SR C8 SEC ID N°: 3 SEC ID N°: 12 Ollgonucleótido cebador FCV-SR N2 Secuencia de ADN del gen de la cápsida de FCV-21 SEC ID N°: 4 SEC ID N°: 13 Ollgonucleótido cebador FCV-SR N3 Secuencia de aminoácidos codificada del gen de la cápsida de FCV-21 SEC ID N°: 5 SEC ID N°: 14 Ollgonucleótido cebador FCV-SR N4 Secuencia de ADN del gen de la cápsida de FCV-49 SEC ID N°: 6 SEC ID N°: 15 Ollgonucleótido cebador FCV-SR N5 Secuencia de aminoácidos codificada del gen de la cápsida de FCV-49 SEC ID N°: 7 SEC ID N°: 16 Ollgonucleótido cebador FCV-SR N6 Secuencia de ADN del gen de la cápsida de FCV-26391-4 SEC ID N°: 8 SEC ID N°: 17 Ollgonucleótido cebador FCV-SR N9 Secuencia de aminoácidos codificada del gen de la cápsida de FCV-26391-4 SEC ID N°: 9 Ollgonucleótido cebador cebador 2 DEFINICIONES Y ABREVIATURAS "Aproximadamente", cuando se usa con respecto a una variable numérica medible, se refiere al valor indicado de la variable y a todos los valores de la variable que están dentro del error experimental del valor indicado (por ejemplo, dentro del intervalo de confianza del 95% para la media) o dentro del 10 por ciento del valor indicado, cualquiera de los dos que sea mayor, a menos que se use aproximadamente con respecto a los intervalos de tiempo en semanas donde "aproximadamente 3 semanas," es 17-25 días, y aproximadamente 2-4 semanas es 10-40 dias. "Inmunidad activa" incluye la inmunidad humoral y/o la inmunidad mediada por células contra virus felinos inducida vacunando a un gato con la vacuna de la presente invención. "Anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina que puede unirse a un antígeno específico como resultado de una respuesta inmune a este antígeno. Las inmunoglobulinas son proteínas del suero compuestas de cadenas de polipéptidos "ligeras" y "pesadas" que tienen regiones "constantes" y "variables" y se dividen en clases (por ejemplo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) en base a la composición de las regiones constantes. Un anticuerpo que es "específico" para un antigeno dado indica que las regiones variables del anticuerpo reconocen y se unen exclusivamente a un antígeno específico - por ejemplo, el anticuerpo es capaz de distinguir una proteína particular de la cápsida de otras proteínas conocidas en virtud de diferencias medibles en la afinidad de unión, a pesar de la existencia de una identidad de secuencia localizada, homología, o similitud entre proteínas de la cápsida y otros polipéptidos. Los anticuerpos específicos pueden también interaccionar con otras proteínas (por ejemplo, la proteína A de Staphylococcus aureus u otros anticuerpos en técnicas de ELISA), a través de interacciones con secuencias fuera de la región variable de los anticuerpos, y, en particular, en las regiones constantes de la molécula. Se conocen bien ensayos de selección para determinar la especificidad de unión de un anticuerpo. Para una descripción exhaustiva de dichos ensayos, véase, Harlow y col., (ed.) Antibodies: A Laboratory Manual Capitulo 6 (1988). Los anticuerpos pueden también reconocer y unirse a fragmentos de proteinas de la cápsida de FCV, con la condición de que los anticuerpos sean específicos para proteinas de la cápsida de FCV. Los anticuerpos pueden producirse usando procedimientos conocidos en la técnica. "Antígeno" o "inmunógeno", se refiere a una molécula que contiene uno o más epitopes (lineal, conformacional o ambos), que después de la exposición a un sujeto inducirá una respuesta inmune que es específica para ese antígeno. Un epítope es el sitio específico del antígeno que se une al receptor de células T o al anticuerpo específico, y típicamente comprende de aproximadamente 3 restos de aminoácido a aproximadamente 20 restos de aminoácido. El término antígeno se refiere a subunidades de antígenos -antígenos discretos y separados de un organismo completo con el que se asocia el antígeno en la naturaleza - así como bacterias, virus, hongos, parásitos u otros microbios muertos, atenuados o inactivados. El término antígeno también se refiere a anticuerpos, tales como anticuerpos anti-idiotipo o fragmentos de los mismos, y a mimótopes sintéticos de péptidos que pueden imitar a un antígeno o a un determinante antigénico (epítope). El término antígeno también se refiere a un oligonucleótido o polinucleótido que expresa un antígeno o determinante antigénico in vivo, tales como en aplicaciones de inmunización con ADN. "Excipiente" se refiere a cualquier componente de una vacuna que no es un antígeno. FELOCELL 3 es FELOCELL 4 sin Chlamydia psittaci. FELOCELL 4 contiene el virus de la rinotraqueitis felina vivo modificado [FHV], calicivirus [FCV-F9], virus de la panleucopenia [FPV] y Chlamydia psittaci [FCp]. FELOCELL 4A contiene el virus de la rinotraqueitis felina vivo modificado [FHV], calicivirus [FCV-F21], virus de la panleucopenia [FPV] y Chlamydia psittaci [FCp]. FELOCELL 4 A es FELOCELL 4 sin FCV-F9, pero con FCV-21. FELOCELL 3 A es FELOCELL 3 sin FCV-F9, pero con FCV-21. Felocell® 4, Felocell 4 o FELOCELL 4 o estas palabras seguidas por los números "3" ó "4" son vacunas en las que cualquier variación del nombre Felocell es propiedad de Pfizer. "Primera vacuna", "segunda vacuna", "tercera vacuna" y similares, se refieren a vacunas administrables de forma independiente, que pueden ser la misma o diferentes, y que en general pueden administrarse en cualquier orden. Por tanto, una tercera vacuna puede administrarse a un sujeto antes o después de una segunda vacuna. "Identidad" con respecto al porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a polipéptidos se define en este documento como el porcentaje de restos de aminoácido en la secuencia candidata que son idénticos a los restos en las secuencias diana después de alinear ambas secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia. El porcentaje de identidad de secuencia se determina mediante procedimientos convencionales. En resumen, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar los valores de alineamiento usando el algoritmo ClustalW (Thompson y col., Nuc. Ac. Res. 22:4673-4680; 1994) y la matriz de peso PAM250 (Dayhoff y col., "Atlas of Proteín Sequence and Structure.", National Biomedical Research Foundation. Washington, DC 5:345-358 (1978) y los parámetros por defecto como se proporcionan por el programa MegAlign (DNASTAR, Inc.; Madison, Wl). El cuadro de la matriz de peso PAM250 se presenta como CUADRO 1-1 (los aminoácidos se indican mediante los códigos convencionales de una letra).

CUADRO 1-1 El porcentaje de identidad se calcula entonces como: Número total de coincidencias idénticas x 100 [longitud de la secuencia más larga + el número de huecos introducidos en la secuencia más larga para alinear las dos secuencias] "Respuesta inmune" en un sujeto se refiere al desarrollo de una respuesta inmune humoral, una respuesta inmune celular, o una respuesta inmune humoral y una celular a un antígeno. Una "respuesta inmune humoral" se refiere a una que está mediada por anticuerpos. Una "respuesta inmune celular" es una mediada por linfocitos T u otros glóbulos blancos o ambos, e incluye la producción de citoquinas, quimioquinas y moléculas similares producidas por células T activadas, glóbulos blancos, o ambos. Las respuestas inmunes pueden determinarse usando inmunoensayos convencionales y ensayos de neutralización, que se conocen en la técnica. "Cantidad inmunológicamente protectora" o "cantidad eficaz para producir una respuesta inmune", de un antígeno es una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunogénica en el receptor que sea adecuada para evitar o mejorar signos o síntomas de enfermedad, incluyendo efectos adversos para la salud o complicaciones de los mismos, causados por infección con el agente de la enfermedad y en particular con calicivirus felino. Puede inducirse inmunidad humoral o inmunidad mediada por células o ambas. La respuesta inmunogénica de un animal a una composición de vacuna puede evaluarse, por ejemplo, indirectamente a través de la medición de los títulos de anticuerpo, ensayos de proliferación de linfocitos, o directamente controlando los signos y síntomas después de la exposición con la cepa de tipo silvestre. La inmunidad protectora conferida por una vacuna puede evaluarse midiendo, por ejemplo, la reducción en los signos clínicos tales como mortalidad, morbilidad, temperatura y estado físico general, y estado de salud general y actuación del sujeto. La respuesta inmune puede comprender, sin limitación, la inducción de inmunidad celular y/o humoral. La cantidad de una vacuna que es terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo del virus particular usado, o del estado del gato, y puede determinarse por el veterinario. Administración "intranasal" se refiere a la introducción de una sustancia, tal como una vacuna, en el cuerpo de un sujeto a través o mediante la nariz, e implica el transporte de la sustancia principalmente a través de la mucosa nasal. "Aislado", cuando se usa para describir cualquier sustancia definida particularmente, tal como un polinucleótido o un polipéptido, se refiere a la sustancia separada del entorno celular original en el que la sustancia tal como un polipéptido o un ácido nucleico se encuentra normalmente. Como se usa en este documento, por lo tanto, a modo de ejemplo únicamente, una línea celular recombinante construida con un polinucleótido de la invención hace uso del ácido nucleico "aislado". Como alternativa, la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico puede usarse como tal o como una vacuna y por tanto puede considerarse como aislado puesto que ha sido identificado, separado y hasta cierto punto purificado en comparación a cómo puede existir en la naturaleza. Si la proteína de la cápsida o un fragmento específico inmunogénico de la misma se produce en una bacteria recombinante o en un vector de expresión eucariota que produce el antígeno, se considera que existe como una proteina o ácido nucleico aislado. Por ejemplo, una linea celular recombinante construida con un polinucleótido hace uso de un ácido nucleico "aislado". "Anticuerpo monoclonal" se refiere a anticuerpos producidos por una única línea de células de hibridoma, todas dirigidas hacia un epítope de un antígeno particular. El antígeno usado para fabricar el anticuerpo monoclonal puede proporcionarse como proteína aislada del patógeno o el patógeno completo. Un hibridoma es una línea celular clonal que está constituida por células híbridas formadas mediante la fusión de una célula de mieloma y una célula productora de anticuerpo específica. En general, los anticuerpos monoclonales son de origen de ratón; sin embargo, anticuerpo monoclonal también se refiere a una población clonal de un anticuerpo fabricado contra un epítope particular de un antigeno producido por tecnología de exposición en fago o un procedimiento que sea equivalente a la exposición en fago, o células híbridas de origen no de ratón. "N días", el intervalo o periodo de tiempo "N" o "M días" después de un suceso, se refiere, respectivamente, a cualquier momento en el enésimo o emésimo día después del suceso. Por ejemplo, vacunar a un sujeto con una segunda vacuna 3 días después de la administración de una primera vacuna significa que la segunda vacuna se administra en cualquier momento del tercer dia después de la primera vacuna. Esta descripción suele aplicarse al intervalo entre la primera y segunda vacunación. Típicamente el intervalo N preferido es de aproximadamente 3 semanas, o 17-25 días, aunque también es común aproximadamente 2-4 semanas o 10-40 días, y las invenciones de este documento son eficaces con el periodo de tiempo "N" de entre 3 y 120 días. Administración "oral" o "peroral" se refiere a la introducción de una sustancia, tal como una vacuna, en el cuerpo de un sujeto a través o mediante la boca e implica ingestión o transporte a través de la mucosa oral (por ejemplo, absorción sublingual o bucal) o ambas. Administración "oronasal" se refiere a la introducción de una sustancia, tal y como una vacuna, en el cuerpo de un sujeto a través o mediante la nariz y la boca, como podria producirse, por ejemplo, colocando una o más gotas en la nariz. La administración oronasal implica procesos de transporte asociados con administración oral e intranasal. "Administración parenteral" se refiere a la introducción de una sustancia, tal como una vacuna, en el cuerpo de un sujeto a través o mediante una vía que no incluya el tracto digestivo. Administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intramuscular, administración transcutánea, administración intradérmica, administración intraperitoneal, administración infraocular, y administración intravenosa. Para los propósitos de esta descripción, la administración parenteral excluye vías de administración que implican principalmente el transporte de la sustancia a través del tejido de la mucosa en la boca, nariz, tráquea y pulmones. "Inmunidad pasiva" se refiere a la protección contra calicivirus felino proporcionada a un gato como resultado de vacunar al gato con una vacuna que comprende anticuerpos contra la cepa FCV o un componente inmunogénico o fragmento de un componente de la misma. "Farmacéuticamente aceptable" se refiere a sustancias, que están dentro del alcance del juicio médico, adecuadas para uso en contacto con los tejidos de sujetos sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica y similares, que se corresponden con una proporción razonable beneficio -riesgo, y eficaces para el uso pretendido. "Anticuerpo policlonal" se refiere a una población mezclada de anticuerpos fabricada contra un patógeno o antígeno particular. En general, la población contiene una diversidad de grupos de anticuerpos, cada grupo dirigido contra un epítope particular del patógeno o antígeno. Para fabricar anticuerpos policlonales, el patógeno completo o un antígeno aislado se introduce por inoculación o infección en un huésped, lo que induce al huésped a fabricar anticuerpos contra el patógeno o antígeno. Administración "por vía respiratoria" se refiere a la introducción de una sustancia, tal como una vacuna, en el cuerpo de un sujeto a través o mediante inhalación de una sustancia nebulizada (atomizada). En administración por vía respiratoria el principal mecanismo de transporte implica la absorción de la sustancia atomizada a través de la mucosa en la tráquea, bronquios, y pulmones y es por lo tanto diferente de la administración intranasal o peroral. "Dosificación de administración única" significa administrada el o aproximadamente el mismo día, es decir, todos los componentes administrados en aproximadamente 1 día. Los componentes pueden o no estar en un único recipiente. "Específico para", cuando se usa para describir anticuerpos de la invención, indica que las regiones variables de los anticuerpos de la invención reconocen y se unen a una cepa específica de virus exclusivamente (es decir son capaces de distinguir una proteina de la cápsida de FCV particular de otras proteínas conocidas en virtud a diferencias medibles en la afinidad de unión, a pesar de la existencia de identidad de secuencia localizada, homología o similitud entre proteínas de la cápsida de FCV y dichos polipéptidos). Se entenderá que anticuerpos específicos pueden también interaccionar con otras proteínas (por ejemplo, proteína A de S. aureus u otros anticuerpos en técnicas de ELISA) a través de interacción con secuencias fuera de la región variable de los anticuerpos, y, en particular, en la región constante de la molécula. Ensayos de selección para determinar la especificidad de unión de un anticuerpo de la invención se conocen bien y se practican de forma rutinaria en la técnica. Para una descripción exhaustiva de dichos ensayos, véase Harlow y col., (Eds.), Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Capítulo 6. Los anticuerpos que reconocen y se unen a fragmentos de las proteínas de la cápsida de FCV de la invención también se contemplan, siempre que los anticuerpos sean específicos para proteínas de la cápsida de FCV. Los anticuerpos de la invención pueden producirse usando cualquier procedimiento bien conocido y practicado de forma rutinaria en la técnica. "Fragmento inmunogénico específico" se entiende como una parte de una secuencia que es reconocible por un anticuerpo que es específico para la secuencia, como se define en detalle a continuación. "Sujeto" se refiere a cualquier animal que tiene un sistema inmune, lo que incluye mamíferos tales como gatos. "Vacuna de subunidad" se refiere a un tipo de vacuna que incluye uno o más antígenos, pero no todos los antigenos, que se obtienen de o son homólogos a, antígenos de un patógeno de interés, tal como un virus, bacteria, parásito u hongo. Dicha composición está sustancialmente libre de células de patógenos intactas o partículas patogénicas, o el lisado de dichas células o partículas. Por tanto, una vacuna de subunidad puede prepararse a partir de polipéptidos inmunogénicos del patógeno o sus análogos, al menos parcialmente purificados o sustancialmente purificados. Los procedimientos para obtener un antígeno o antígenos en la vacuna de subunidad incluyen técnicas de purificación convencionales, producción de recombinantes, o síntesis química. "TCID50" se refiere a "dosis infecciosa de cultivo tisular" y se define como la dilución de un virus requerida para infectar el 50% de un lote dado de cultivos celulares inoculados. Se pueden usar diversos procedimientos para calcular TCID50, incluyendo el procedimiento de Spearman-Karber que se utiliza a lo largo de esta memoria descriptiva. Para una descripción del procedimiento de Spearman-Karber, véase B.W. Mahy y H. O. Kangro, Virology Methods Manual 25-46 (1996). "Cantidad terapéuticamente eficaz", en el contexto de esta descripción, se refiere a una cantidad de un antígeno o vacuna que podria inducir una respuesta inmune en un sujeto (por ejemplo, un gato) que recibe el antígeno o la vacuna que es adecuado para evitar o mejorar signos o síntomas de enfermedad, incluyendo, efectos adversos para la salud o complicaciones de los mismos, causados por infección con un patógeno, tal como un virus (por ejemplo FCV), bacteria, parásito u hongo. Puede inducirse inmunidad humoral o inmunidad mediada por células o inmunidad humoral y mediada por células. La respuesta inmunogénica de un animal a una vacuna puede evaluarse, por ejemplo indirectamente a través de la medición de los títulos de anticuerpo, ensayos de proliferación de linfocitos, o directamente a través del control de los signos y síntomas después de la exposición con la cepa de tipo silvestre. La inmunidad protectora conferida por una vacuna puede evaluarse midiendo, por ejemplo, la reducción en los signos clínicos tales como la mortalidad, morbilidad, temperatura y estado físico general, y estado de salud general y actuación del sujeto. La cantidad de una vacuna que es terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo del virus particular usado, del estado del sujeto, y puede determinarse por un veterinario. "Tratar" se refiere a invertir, aliviar, inhibir el progreso de, o evitar un trastorno, o afección o enfermedad al que se aplica dicho término, o para evitar uno o más síntomas de dicho trastorno, afección o enfermedad. "Tratamiento" se refiere al acto de "tratar" como se ha definido inmediatamente anteriormente. "Vacuna" se refiere a una composición que incluye un antígeno y abarca las llamadas "vacunas de subunidad" como se definen a continuación. La administración de la vacuna a un sujeto da como resultado una respuesta inmune. La vacuna puede introducirse directamente en el sujeto por cualquier vía de administración conocida, incluyendo vía parenteral, vía peroral, y similares.

Parte I Vacunas, cepas de virus, proteínas de la cápsida, y anticuerpos de la invención La presente invención proporciona vacunas que se basan en cepas de FCV vivas o muertas seleccionadas entre el grupo constituido por FCV-21 , FCV-49 y FCV26391-4. La invención además proporciona vacunas de ácido nucleico que codifican una proteina de la cápsida de FCV de las cepas de FCV de la invención o fragmentos inmunogénicos específicos de la misma. La invención proporciona adicionalmente proteínas de la cápsida aisladas obtenidas de las cepas de FCV de la invención o fragmentos inmunogénicos específicos de las mismas.

Para cepas de FCV, se induce una buena respuesta inmune mediante un determinante antigénico que surge de la proteína de la cápsida. En este documento se describen y reivindican varias cepas de FCV que incluyen proteínas de la cápsida estrechamente relacionadas y variantes de las mismas. Específicamente, se describe la cepa FCV-21 y la secuencia de proteína (SEC ID N°: 13) y secuencias que tienen 91.2%, 95% y 99% o más identidad; la cepa FCV-49 y la secuencia de proteína (SEC ID N°: 15) y secuencias que tienen 92.7%, 95% y 99% o más identidad; la cepa FCV-26391-4 y la secuencia de proteína (SEC ID N°: 17) y secuencias que tienen 91.8%, 95% y 99% o más identidad. La vacuna de la presente invención generalmente pretende ser un tratamiento profiláctico que inmunice gatos contra enfermedad causada por cepas virulentas de calicivirus felino. Sin embargo, la vacuna también pretende el tratamiento terapéutico de gatos ya infectados con una cepa virulenta de calicivirus felino. Por ejemplo, una vacuna que comprende anticuerpos producidos inmunizando un huésped heterólogo con cápsida de FCV o componente inmunogénico de la misma, se usa para el tratamiento terapéutico de un gato infectado con calicivirus felino. Sin embargo, incluso las vacunas que proporcionan inmunidad activa, es decir, vacunas que comprenden cepas de FCV seleccionadas entre el grupo constituido por FCV-21 , FCV-49 y FCV 26391-4, o mutantes de las mismas, o proteínas de la cápsida obtenidas de las cepas de FCV de la invención, o un fragmento inmunogénico específico de sus proteinas de la cápsida, puede esperarse que sean eficaces cuando se dan como un tratamiento terapéutico contra diversas enfermedades. Por tanto, la inmunidad que se proporciona por la presente invención puede ser inmunidad activa o inmunidad pasiva, y el uso pretendido de la vacuna puede ser profiláctico o terapéutico. La vía de administración para una cualquiera de las realizaciones de la vacuna de la presente invención incluye, aunque sin limitación, oronasal, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intraocular, y oral así como transdérmica o por inhalación o supositorio. Las vías preferidas de administración incluyen oronasal, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica e inyección subcutánea. La vacuna puede administrarse por cualquier medio que incluya, aunque sin limitación, jeringuillas, nebulizadores, pulverizadores, dispositivos de inyección sin aguja, o pistolas génicas de bombardeo de microproyectiles (bombardeo por biobalística). La vacuna para una cualquiera de las realizaciones de la presente invención se formula en un vehículo farmacéuticamente aceptado de acuerdo con el modo de administración a usar. Un especialista en la técnica puede fácilmente formular una vacuna que comprende un FCV-21 , FCV-49 o FCV 26391-4 vivo o muerto, una proteina de la cápsida obtenida de cualquiera de las cepas de FCV de la invención, o un fragmento inmunogénico de la misma, un vector de virus recombinante que codifica la proteína de la cápsida de FCV-21 , FCV-49 o FCV 26391-4 o un fragmento inmunogénico específico de la misma, o una molécula de ADN que codifica la proteína de la cápsida obtenida de FCV-21 , FCV-49 o FCV-26391-4 o un fragmento inmunogénico especifico de la misma. En casos en que se prefiere la inyección intramuscular, se prefiere una formulación isotónica. Generalmente, los aditivos para isotonicidad pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En casos particulares, se prefieren las soluciones isotónicas tales como solución salina tamponada con fosfato. Las formulaciones pueden proporcionar además estabilizantes tales como gelatina y albúmina. En algunas realizaciones, se añade un agente vasoconstrictor a la formulación. Las preparaciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se proporcionan estériles y libres de pirógenos. Sin embargo, los especialistas en la técnica saben bien que las formulaciones preferidas para el vehículo farmacéuticamente aceptado que comprenden las vacunas de la presente invención son los vehículos farmacéuticos aprobados en las normativas promulgadas por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, o su agencia gubernamental equivalente en un país extranjero tal como Canadá o México o una cualquiera de las naciones Europeas, para vacunas de calicivirus felino vivo, vacunas de calicivirus felino muerto, vacunas de subunidad de polipéptidos (antigeno), vacunas de vector de virus recombinante, vacunas de anticuerpos, y vacunas de ADN. Por lo tanto, el vehículo farmacéuticamente aceptado para la producción comercial de la vacuna de la presente invención es un vehículo que ya está aprobado o que será aprobado por la agencia gubernamental apropiada en los Estados Unidos de América o País Extranjero. La vacuna puede mezclarse además con un adyuvante que es farmacéuticamente aceptable. En ciertas formulaciones de la vacuna de la presente invención, la vacuna se combina con otras vacunas felinas para producir un producto de vacuna polivalente que puede proteger a los gatos contra una amplia diversidad de enfermedades causadas por otros patógenos felinos. Actualmente, los fabricantes comerciales de vacunas felinas, asi como los usuarios finales, prefieren productos de vacuna polivalente. Por lo tanto, en una realización preferida, la presente invención proporciona una vacuna polivalente que inmuniza gatos contra calicivirus felino y al menos otro patógeno felino, preferiblemente seleccionado entre el grupo constituido por herpesvirus felino, virus de la leucemia felina, virus de la inmunodeficiencia felina, Chlamydia felina, y virus de la panleucopenia felina. La inoculación de un gato es preferiblemente mediante una única vacunación que produce una completa, amplia respuesta inmunogénica. En otra realización de la presente invención, el gato se somete a una serie de vacunaciones para producir una completa, amplia respuesta inmune. Cuando las vacunaciones se proporcionan en una serie, las vacunaciones pueden proporcionarse separadas entre aproximadamente un día hasta cuatro semanas o más. En realizaciones particulares, el gato se vacuna en diferentes sitios simultáneamente. Los detalles adicionales acerca de la vía y administración se encuentran a continuación en la sección titulada "Procedimientos para Inmunizar Gatos contra Calicivirus". Las composiciones de vacuna pueden incluir opcionalmente diluyentes líquidos, semi-sólidos o sólidos farmacéuticamente aceptables (es decir, estériles y no tóxicos) compatibles con vacunas que sirven como vehículos farmacéuticos, excipientes, o medios. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol, y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol, y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina entre otros. Cualquier adyuvante conocido en la técnica puede usarse en la composición de vacuna, incluyendo adyuvantes basados en aceite tales como el Adyuvante Completo de Freund y Adyuvante Incompleto de Freund, adyuvantes basados en micolato (por ejemplo, dimicolato de trehalosa), lipopolisacáridos bacterianos (LPS), peptidoglicanos (es decir, mureinas, mucopéptidos, o glicoproteinas tales como N-Opaca, muramil dipéptido [MDP], o análogos de MDP), proteoglicanos (por ejemplo, extraídos de Klebsiella pneumoniae), preparaciones de estreptococos (por ejemplo OK432), Biostim™ (por ejemplo 01 K2), los "Iscoms" de la Patente Europea 109 942, Patente Europea 180 564 y Patente Europea 231 039, hidróxido de aluminio, saponina, DEAE-dextrano, aceites neutros (tales como migliol), aceites vegetales (tales como aceite de cacahuete), liposomas, polioles de Pluronic®. Los adyuvantes incluyen, aunque sin limitación, el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc.), alumbre, hidróxido de aluminio en gel, colesterol, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, tales como por ejemplo, adyuvantes completo e incompleto de Freund, Copolímero en bloque (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), adyuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galénica Pharmaceuticals, Inc. Birmingham, AL) u otras fracciones de saponina, monofosforil lípido A, adyuvante amina-lípido Avridina, enterotoxina lábil al calor de E. coli (recombinante o de otra manera), toxina del cólera, o muramil dipéptido, entre muchos otros. Las composiciones inmunogénicas pueden además incluir uno o más de otros agentes inmunomoduladores tales como interleuquínas, interferones u otras citoquinas. Las composiciones inmunogénicas pueden incluir también gentamicina y Mertiolato. Aunque las cantidades y concentraciones de adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente invención pueden determinarse fácilmente por el especialista en la técnica, la presente invención contempla composiciones que comprenden desde aproximadamente 50 µg hasta aproximadamente 2000 µg de adyuvante y preferiblemente aproximadamente 500 µg/2 ml de dosis de la composición de vacuna. En otra realización preferida, la presente invención contempla composiciones de vacuna que comprenden de aproximadamente 1 µg/ml a aproximadamente 60 µg/ml de antibiótico, y más preferiblemente menos de aproximadamente 30 µg/ml de antibiótico. Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden fabricarse en diversas formas dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, las composiciones inmunogénicas pueden fabricarse en forma de soluciones acuosas estériles o dispersiones adecuadas para uso inyectable, o fabricarse en formas liofilizadas usando técnicas de liofilización. Las composiciones inmunogénicas liofilizadas se mantienen típicamente a aproximadamente 4°C, y pueden reconstituirse en una solución estabilizante, por ejemplo solución salina y/o HEPES, con o sin adyuvante. Además, las composiciones inmunogénicas y vacunas de la presente invención pueden incluir uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Como se usa en este documento "un vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardantes de la adsorción, y similares. Los vehículos deben ser "aceptables" en el sentido de que sean compatibles con los componentes de la invención y no perjudiciales para el sujeto a inmunizar. Típicamente, los vehículos serán estériles y libres de pirógenos.

Vacunas vivas En una realización de la vacuna de la presente invención, la vacuna comprende una vacuna de FCV vivo, en la que el componente de FCV se selecciona entre el grupo constituido por FCV-21 , FCV-49 y FCV-26391-4. Puesto que estas cepas se aislaron en forma no virulenta se prefieren particularmente para la preparación de una vacuna viva que estimula el sistema inmune del gato sin causar enfermedad. Se conocen bien en la técnica procedimientos para atenuar adicionalmente los virus, e incluyen procedimientos tales como paso en serie en cultivo celular sobre una línea celular adecuada, o mutagénesis por ultravioleta o química.

Vacunas inactivadas En otra realización de la presente invención, la vacuna comprende una vacuna de FCV inactivado o muerto que comprende una cepa de FCV seleccionada entre el grupo constituido por FCV-21 , FCV-49 y FCV 26391-4. La vacuna inactivada se fabrica mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, una vez que el virus se propaga hasta títulos elevados, sería fácilmente evidente para los especialistas en la técnica que la masa antigénica del virus pudiera obtenerse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la masa antigénica del virus puede obtenerse por dilución, concentración, o extracción. Todos estos procedimientos se han empleado para obtener masa antigénica viral apropiada para producir vacunas. El calicivirus se inactiva mediante tratamiento con formalina, betapropriolactona (BPL), o etilenimina binaria (BEI), u otros procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica. La inactivación por formalina se realiza mezclando la suspensión de calicivirus con formaldehído al 37% para una concentración final de formaldehido del 0.05%. La mezcla calicivirus-formaldehído se mezcla mediante agitado constante durante aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente. La mezcla de calicivirus inactivado se ensaya después para virus vivos residuales ensayando para crecimiento sobre una linea celular felina adecuada tal como células CRFK.

La inactivación mediante BEI se realiza mezclando la suspensión de calicivirus de la presente invención con BEI 0.1 M (2-bromo-etilamina en NaOH 0.175 N) hasta una concentración final de BEI de 1 mM. La mezcla calicivirus-BEl se mezcla mediante agitado constante durante aproximadamente 48 horas a temperatura ambiente, seguida de la adición de tiosulfato sódico 1.0 M hasta una concentración final de 0.1 mM. El mezclado se continúa durante dos horas adicionales. La mezcla de calicivirus inactivado se ensaya para calicivirus vivo residual ensayando para el crecimiento sobre una linea celular felina adecuada tal como células NLFK. El calicivirus inactivado de la presente invención mencionado anteriormente se mezcla con uno cualquiera de los vehículos farmacéuticos para formular vacunas de virus inactivado hasta el nivel de dosificación apropiado. La vacuna inactivada puede además incluir, además del componente de FCV seleccionado entre el. grupo constituido por FCV-21 , FCV-49 y FCV 26391-4 al menos una cepa de calicivirus felino diferente, preferiblemente seleccionado entre el grupo constituido por FCV-F9, FCV-M8, FCV-255, y FCV-2280. En una realización preferida, la vacuna incluye además una vacuna para inmunizar a un gato contra uno o más patógenos felinos diferentes, preferiblemente seleccionados entre el grupo constituido por herpesvirus felino, virus de la leucemia felina, virus de la inmunodeficiencia felina, Chlamydia felina, y virus de la panleucopenia felina.

Vacunas recombinantes En una realización adicional de la presente invención, la vacuna comprende un vector de virus recombinante que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína de la cápsida de FCV descrita en este documento o un fragmento inmunogénico especifico de la misma. En una realización particular, el vector de virus recombinante es un herpesvirus felino que inmuniza un gato contra el calicivirus felino y el herpesvirus felino. En otra realización, el vector de virus recombinante comprende uno o más antígenos seleccionados preferiblemente entre el grupo constituido por herpesvirus felino, virus de la leucemia felina, virus de la inmunodeficiencia felina, Chlamydia felina, y virus de la panleucopenia felina, virus de la rabia y Bordetella bronchiseptica. Para fabricar un vector de virus recombinante que exprese una proteina de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico especifico de la misma, se inserta un ADNc que codifica la proteína de la cápsida o un fragmento inmunogénico específico de la misma, en el genoma de un vector de virus tal como herpesvirus, poxvirus o adenovirus. La Patente de Estados Unidos N° 5,716,822 de Wardley y col. describe un procedimiento para insertar ADN que codifica la proteína de la cápsida de la cepa calicivirus felino CFI-68 FIV en el gen de timidina quinasa del herpesvirus felino. Otras vacunas de vector de virus recombinante abarcadas por la presente invención, incluyen aunque sin limitación, adenovirus, virus adeno-asociados, parvovirus, y diversos vectores de poxvirus, para expresar la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma. En particular, la presente invención incluye vacunas de vector de poxvirus recombinante que expresan la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma, fabricados de acuerdo con los procedimientos mostrados en una cualquiera de las Patentes de Estados Unidos N° 5,338,683 y 5,494,807 de Paoletti y col., que muestran vacunas de virus recombinante constituidas por virus vaccinia o poxvirus de canario que expresan antígenos extraños; la Patente de Estados Unidos N° 5,266,313 de Esposito y col., que muestra vectores de poxvirus de mapaches recombinantes que expresan antígenos del virus de la rabia; y la Patente de Estados Unidos N° 6,010,703 de Maes y col, que muestra vectores de poxvirus de mapache recombinantes que expresan los antígenos gD o gB del herpesvirus felino. Para cualquiera de los vectores de virus recombinante mencionados anteriormente, el ADNc que codifica la proteina de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma, está unido de forma operativa a un promotor eucariota en el extremo 5' del ADNc que codifica el antígeno y una señal de terminación eucariota y una señal de poli (A) en el extremo 3' del ADNc que codifica el antígeno. Como se usa en este documento, la expresión "unido de forma operativa" significa que el polinucleótido de la presente invención (en forma de una molécula de ADNc) y un polinucleótido (ADN) que contiene una secuencia de control de expresión, por ejemplo, un promotor de la transcripción y secuencias de terminación, se sitúan en un vector o célula tal que la expresión del antígeno codificado por el ADNc se regula mediante la secuencia de control de expresión. Los procedimientos para clonar ADN tal como el ADNc que codifica la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma, y para unir de forma operativa el ADN que contiene las secuencias de control de expresión al mismo se conocen bien en la técnica. Son ejemplos de promotores adecuados para expresar la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma en los vectores de virus recombinante, el promotor inmediato temprano del citomegalovirus (CMV), el promotor de repeticiones terminales largas del virus del sarcoma de Rous (RSV-LTR), el promotor inmediato temprano del virus 40 de simios (SV40), y promotores inducibles tales como el promotor de la metalotioneína. Un ejemplo de un ADN que tiene una señal de terminación y una señal de poli (A) es la región tardía de poli (A) de SV 40. Otros ejemplo de un sistema de expresión viral adecuado para producir el antígeno es el sistema de expresión de Sindbis disponible de Invitrogen. El uso de estos vectores y sistemas de expresión disponibles en el mercado se conoce bien en la técnica.

Vacuna de molécula de ADN o ácido nucleico En otra realización más de la presente invención, la vacuna se proporciona en forma de vacuna de molécula de ADN o ácido nucleico que provoca una respuesta inmune activa en el gato. La vacuna de molécula de ADN está constituida por ADN que tiene una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de la cápsida o un fragmento inmunogénico especifico de la misma de una proteina de la cápsida de FCV descrita en este documento. En una realización preferida, la vacuna de molécula de ADN comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID N°: 12, 14 ó 16, o un fragmento de la misma que codifica SEC ID N°: 13, 15 ó 17, o un fragmento inmunogénico específico de SEC ID N°: 13, 15 ó 17. El ácido nucleico que codifica la proteína de la cápsida o un fragmento inmunogénico específico de la misma se une de forma operativa a o cerca de un promotor transcripcional. Esto permite la transcripción de la proteina de la cápsida, o un fragmento inmunogénico específico de la misma, a partir del ácido nucleico cuando el ácido nucleico se inocula en las células del gato. Preferiblemente la molécula de ADN es un plásmido. Los promotores que son útiles para vacunas de ADN se conocen bien en la técnica e incluyen aunque sin limitación, el promotor RSV LTR, el promotor inmediato temprano de CMV, y el promotor del antígeno T de SV40. Se prefiere además que el ácido nucleico esté unido de forma operativa, en o cerca del codón de terminación de la secuencia que codifica la proteina de la cápsida o un fragmento inmunogénico específico de la misma, a un fragmento de ácido nucleico que comprende una señal de terminación de la transcripción y una señal de reconocimiento de poli (A). La vacuna de ADN se proporciona al gato en un vehículo farmacéuticamente aceptado, o en un vehículo de liposoma o de lípido similar a los descritos en la Patente de Estados Unidos N° 5,703,055 de Felgner. La vacuna de ADN puede proporcionarse al gato mediante una diversidad de procedimientos tales como inyección intramuscular, inyección Intrajet, o bombardeo por biobalística. La fabricación de vacunas de ADN y los procedimientos para su uso se proporcionan en las Patentes de Estados Unidos N° 5,589,466 y 5,580,859 ambas de Felgner. Finalmente, un procedimiento para producir plásmidos de ADN de calidad farmacéutica se muestra en la Patente de Estados Unidos N° 5,561 ,064 de Marquet y col. Por lo tanto, usando los procedimientos mencionados anteriormente, las vacunas de ADN que expresan la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma, se usan para inmunizar gatos contra calicivirus felino virulento. La ventaja de la vacuna de ADN es que la molécula de ADN se propaga convenientemente en forma de plásmido que es un medio sencillo y barato para producir una vacuna, y puesto que la vacuna no está viva, muchos de los problemas regulatorios asociados con las vacunas de vectores de virus recombinantes vivos no son problemas con las vacunas de ADN. Un especialista en la técnica podría apreciar que la vacuna de ADN de la presente invención puede comprender ácidos nucleicos producidos de forma sintética que se fabrican mediante procedimientos de síntesis química bien conocidos en la técnica.

Proteina de la cápsida de FCV aislada y purificada En otra realización más de la presente invención, la vacuna está constituida por la proteína de la cápsida de FCV aislada y purificada o un fragmento inmunogénico específico de la misma. En particular, una vacuna en la que la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 13, 15, 17. Preferiblemente, la proteína de la cápsida o un fragmento inmunogénico específico de la misma se produce en una bacteria recombinante o un vector de expresión eucariota que produce el antígeno que puede aislarse y purificarse para fabricar la vacuna. Por ejemplo, la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma se produce en un microorganismo tal como bacterias, levaduras, u hongos, en una célula eucariota tal como una célula de mamífero o de insecto, o mediante un vector de virus recombinante tal como adenovirus, poxvirus, herpesvirus, virus Semliki Forest, baculovirus, bacteriófago, virus Sindbis, o virus Sendai. Las bacterias adecuadas para producir la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, o cualquier otra bacteria que sea capaz de expresar polipéptidos heterólogos. Tipos de levadura adecuados para expresar la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida o cualquier otra levadura capaz de expresar polipéptidos heterólogos. Procedimientos para usar las bacterias, células eucariotas o vectores de virus recombinantes anteriormente mencionados para producir antígenos para vacunas se conocen bien en la técnica. Para producir la vacuna constituida por la proteína de la cápsida o un fragmento inmunogénico específico de la misma, el ácido nucleico que codifica la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico especifico de la misma, se clona en un plásmido, y el ácido nucleico se une de forma operativa a un promotor que efectúa la expresión de la proteina de la cápsida o de un fragmento inmunogénico especifico de la misma en un microorganismo. Promotores adecuados incluyen, aunque sin limitación, el promotor del fago T7, el promotor del fago T3, el promotor de ß-galactosidasa, y el promotor del fago Sp6. La expresión de la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma en un microorganismo permite a la proteína de la cápsida producirse usando tecnologías de fermentación que se usan comercialmente para producir grandes cantidades de polipéptidos antigénicos recombinantes. Los procedimientos para aislar y purificar antígeno se conocen bien en la técnica e incluyen procedimientos tales como filtración en gel, cromatografia de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, o centrifugado. Para facilitar el aislamiento de la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma, se fabrica un polipéptido de fusión en el que la proteína de la cápsida o un fragmento inmunogénico específico de la misma se une a otro polipéptido que permite el aislamiento por cromatografía de afinidad. Preferiblemente, un polipéptido de fusión se fabrica usando uno de los sistemas de expresión que se muestran a continuación. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico ADNc que codifica la proteína de la cápsída de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma se une en el extremo 5' o en el extremo 3' a un ácido nucleico que codifica un polipéptido. Los ácidos nucleicos se unen en el marco de lectura del codón apropiado para permitir la producción de un polipéptido de fusión en el que el extremo amino y/o carboxilo de la proteína de la cápsida o parte de la misma se fusiona a un polipéptido que permite la recuperación simplificada del antígeno en forma de polipéptído de fusión. El polipéptído de fusión puede también evitar la degradación del antigeno durante la purificación. Aunque una vacuna que comprende el polipéptido de fusión es eficaz, en algunos casos puede ser deseable retirar el segundo polipéptido después de la purificación. Por lo tanto, también se contempla que el polipéptido de fusión contenga un sitio de escisión en la unión entre el antígeno y el polipéptido. El sitio de escisión está constituido por una secuencia de aminoácidos que se escinde con una enzima específica para la secuencia de aminoácidos en el sitio. Ejemplos de dichos sitios de escisión que se contemplan, incluyen el sitio de escisión por enteroquinasa que se escinde mediante enteroquinasa, el sitio de escisión por factor Xa que se escinde mediante el factor Xa, y el sitio de escisión por GENENASE que se escinde mediante GENENASE (GENENASE es una marca comercial de New England Biolabs, Beverly, Mass). Los siguientes son procedimientos para producir la proteína de la cápsida o un fragmento inmunogénico especifico de la misma en forma de polipéptido de fusión o en forma de un antígeno aislado libre del polipéptido. Un ejemplo de un sistema de expresión procariota para producir la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma en forma de polipéptido de fusión para uso en vacunas, es el Sistema de Fusión de Genes de Glutation S-transferasa (GST) disponible de Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J., que usa el plásmido del vector de expresión pGEX-4T-1. El ADNc que codifica la proteína de la cápsida o un fragmento inmunogénico específico de la misma, se fusiona en el marco de lectura de codón apropiado con el ADN que codifica GST. La parte de GST del polipéptido de fusión permite la purificación rápida del polipéptido de fusión usando cromatografía de afinidad a glutation Sefarosa 4B. Después de la purificación, la parte de GST del polipéptido de fusión puede retirarse mediante escisión con una proteasa específica de sitio tal como trombina o factor Xa para producir un antígeno libre del polipéptido GST. La proteína de la cápsida o un fragmento inmunogénico específico de la misma, libre del polipéptido GST, se produce mediante un segundo turno de cromatografia de afinidad a glutation Sefarosa 4B. Otro procedimiento para producir una vacuna que comprende la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma, es un procedimiento que une en fase el ADNc que codifica el antigeno y codones de ADN que codifican polihistidina. La polihistidina preferiblemente comprende seis restos de histidina que permiten la purificación del polipéptido de fusión por cromatografía de afinidad a metal, preferiblemente cromatografia de afinidad a níquel. Para producir la proteína de la cápsida o un fragmento inmunogénico específico de la misma libre de la polihistidina, se fusiona un sitio de escisión tal como un sitio de escisión por enteroquinasa en el marco de lectura apropiado entre los codones que codifican la polihistidína y los codones que codifican el antígeno. El antígeno se libera de la polihistidina mediante escisión con enteroquinasa, seguida de un segundo turno de cromatografia de afinidad a metal que une la polihistidina libre. Este procedimiento demostró ser útil para preparar el antígeno LcrV de Y. pestis, que se describe en Motin y col. (Infect. Immun. 64: 4313-4318 (1996)). El Sistema Xpress disponible en Invitrogen, Carisbad, California, es un ejemplo de un kit comercial que está disponible para fabricar y después aislar proteínas de fusión polipéptido-polihistidina. Otro procedimiento más para producir una vacuna que comprende la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma, usa un procedimiento descrito por Motin y col., Infect. Immun. 64: 3021-3029 (1995). Motin y col., describieron un ADN que codifica un polipéptido de fusión constituido por el ADN que codifica un antígeno unido a un ADN que codifica una parte de proteína A en la que el ADN que codifica un sitio de escisión por enteroquinasa se interpone en el marco de lectura del codón apropiado entre el ADN que codifica la proteína A y el antígeno. La proteina A permite al polipéptido de fusión aislarse mediante cromatografía de afinidad a IgG, y la proteína de la cápsida, libre de la proteína A se produce mediante escisión con enteroquinasa. La proteína A se retira después mediante un segundo turno de cromatografía de afinidad a IgG. Otro procedimiento para producir una vacuna que comprende la proteina de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico especifico de la misma se basa en procedimientos descritos en la Patente de Estados Unidos N° 5,725,863 de Daniels y col., que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. El procedimiento de Daniels y col., puede usarse para fabricar la vacuna de proteína de la cápsida de FCV que está constituida por una molécula de enterotoxina en la que cada molécula tiene insertada en la misma más de 100 restos de aminoácidos de la proteína de la cápsida de FCV. Otros procedimientos para fabricar vacunas de polipéptido de fusión que pueden usarse para fabricar las vacunas de la presente invención se describen en Patente de Estados Unidos N° 5,585,100 de Mond y col., y Patente de Estados Unidos N° 5,589,384 de Liscombe. Finalmente, el Sistema de Fusión y Purificación pMAL disponible en New England Biolabs es otro ejemplo de un procedimiento para fabricar un polipéptido de fusión en el que una proteína de unión a maltosa se fusiona a la proteina de la cápsida o un fragmento inmunogéníco especifico de la misma. La proteína de unión a maltosa facilita el aislamiento del polipéptido de fusión por cromatografía de afinidad a amilosa. La proteína de unión a maltosa puede unirse al antigeno mediante uno de los sitios de escisión mencionados anteriormente lo que permite al antígeno fabricarse libre de la proteína de unión a maltosa. Aunque los procedimientos bacterianos se usan para producir proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma para vacunas, puede ser deseable producir la proteína de la cápsida o un fragmento inmunogénico específico de la misma en un sistema de expresión eucariota. Un sistema particularmente útil es el sistema de expresión de baculovirus que se describe en Patente de Estados Unidos N° 5,229,293 de Matsuura y col., que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Vectores de expresión de baculovirus adecuados para producir la proteína de cápsida o un fragmento inmunogénico específico de la misma son los vectores pPbac y pMbac de Stratagene; y el vector Bac-N-Blue, el vector pBlueBac4.5, pBlueBacHis2-A,B,C, y el pMelBac disponibles en Invitrogen, Carisbad, Calif. Otro sistema eucariota útil para expresar la proteina de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma para vacunas, es un sistema de expresión en levadura tal como el Sistema de Expresión y Purificación de Proteínas en levadura ESP disponible en Stratagene. Otro sistema de expresión en levadura es uno cualquiera de los sistemas de expresión basados en Pichia de Invitrogen. La presente invención también abarca sistemas de expresión en mamíferos. Ejemplos de sistemas de expresión en mamíferos son el sistema LacSwitch II, el fagémido pBK, el sistema del vector pXT1 , y el sistema del vector pSG5 de Stratagene; el sistema del vector de expresión de mamíferos pTargeT, el vector de expresión de mamíferos pSI, el vector de expresión de mamíferos pCl, y los vectores pAdVantage disponibles de Promega Corporation, Madison, Wis.; y el Sistema de Expresión en Mamíferos inducible por Ecdisona, pCDM8, pcDNA1.1 y pcDNA1.1/Amp disponibles en Invitrogen. La presente invención incluye además una realización constituida por vacunas que comprenden la proteina de la cápsida de FCV o epítopes particulares de la proteína de la cápsida como componentes de un sistema de liberación de esporas estable al calor fabricado de acuerdo con el procedimiento mostrado en la Patente de Estados Unidos N° 5,800,821 de Acheson y col., que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Por lo tanto, la presente invención proporciona una célula bacteriana manipulada genéticamente que contiene un ácido nucleico que codifica la proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma. Cuando la vacuna de esporas bacterianas recombinantes se administra por via oral al gato, las esporas germinan en el tracto gastrointestinal del gato y las bacterias expresan la proteína de la cápsida o un fragmento inmunogénico específico de la misma, que se pone en contacto con el sistema inmune del gato y provoca una respuesta inmune. La vacuna tiene la ventaja de ser estable al calor; por lo tanto puede almacenarse a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo indefinido.

Vacunas de inmunidad pasiva Aunque las realizaciones anteriores de la presente invención proporcionan inmunidad activa contra calicivirus felino, la presente invención comprende además, vacunas que proporcionan inmunidad pasiva para calicivirus felino. Una vacuna que provoca inmunidad pasiva contra calicivirus felino está constituida por anticuerpos policlonales o monoclonales que son contra la proteína de la cápsida de FCV, un fragmento inmunogénico específico de la misma o el virus FCV completo. Para fabricar una vacuna de inmunidad pasiva que comprende anticuerpos policlonales, la proteína de la cápsida FCV de la misma, o un fragmento ¡nmunogénico específico de la misma se inyecta en un huésped adecuado para preparar los anticuerpos, preferiblemente el huésped es un caballo, cerdo, conejo, oveja o cabra. Procedimientos para producir vacunas de anticuerpos policlonales a partir de estos huéspedes se conocen bien en la técnica. A modo de ejemplo, la proteína de la cápsida o un fragmento inmunogénico específico de la misma o la cápsida del calicívirus FCV completo se mezcla con un adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund o el menos tóxico TiterMax disponible en CytRx Corp., Norcross, Ga., que después se administra al huésped mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. La producción de anticuerpos se controla, y cuando se ha producido suficiente anticuerpo, se retira el suero del huésped y se recupera preferiblemente el anticuerpo del suero. La vacuna de inmunidad pasiva puede comprender uno o más anticuerpos monoclonales contra 1 o más epitopes de la proteína de la cápsida de FCV o el virus FCV completo. Procedimientos e hibridomas para producir anticuerpos monoclonales se conocen bien en la técnica. Aunque los anticuerpos monoclonales pueden fabricarse usando tecnologías de hibridoma bien conocidas en la técnica, los anticuerpos monoclonales contra el antígeno pueden también fabricarse de acuerdo con los procedimientos de exposición en fago tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos N° 5,977,322 de Marks y col., que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Anticuerpos felinizados contra la proteína de la cápsida o parte de la misma pueden fabricarse de acuerdo con procedimientos que se han usado para humanizar anticuerpos, tales como los descritos en las Patentes de Estados Unidos N° 5,693,762 y 5,693,761 ambas de Queen y col., que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Un kit de exposición en fago que es útil para fabricar anticuerpos monoclonales es el Sistema de Anticuerpos en Fago Recombinante disponible de Amersham Pharmacia Biotech.

Anticuerpos, policlonales y monoclonales La invención también comprende, describe y reivindica varios anticuerpos monoclonales muy importantes. Estos anticuerpos se han desarrollado en este documento para identificar rápidamente y, en algunos casos, definir las cepas virales descritas en este documento. Ejemplos particulares de anticuerpos monoclonales y sus descripciones pueden encontrarse en los siguientes ejemplos. En particular, véase EJEMPLO 1-2 y CUADRO 1 -2 y especialmente EJEMPLO 1-8, CUADRO 1 -4. Los siguientes ejemplos pretenden promover, pero no limitar una mayor comprensión de la presente invención PARTE 1 EJEMPLOS EJEMPLO 1-1 Aislamiento y cultivo de FCV-21 Calicivirus felino (FCV) de la cepa 21 (FCV-21) se recogió en junio de 1993 de una exposición de gatos en Ann Arbor, Michigan. Se diluyó en microtubos de 96 pocilios que contenían medio al 1 % y se hicieron diluciones 1 :10. Se añadieron 100 µl de la muestra diluida a 100 µl de células CRFK en una placa de 96 pocilios. El virus FCV-21 se purificó tres veces mediante dilución limitada en placas de 96 pocilios. El sobrenadante viral de la purificación final se retiró y se usó para infectar células CRFK cultivadas hasta una confluencia del 75% en un matraz T25. Cuando se observó el 100% de CPE, la suspensión se congeló/ descongeló tres veces y se trasladó en alícuotas a viales de congelación (1 ml/vial). El título de esta solución madre viral se determinó como 1.5 x 108 TCID50/ml. FCV-21 se depositó con la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110, Estados Unidos, y se le asignó el número de acceso de la ATCC PTA- .

EJEMPLO 1-2 Inmunofluorescencia y ELISA de FCV-21 usando diversos anticuerpos monoclonales comerciales o pre-existentes Para el ensayo de inmunofluorescencia (IFA), se usó una solución madre viral de FCV-21 para infectar una placa de 24 pocilios sembrada con células NLFK cultivadas hasta una confluencia de aproximadamente el 90%. Aproximadamente 20 horas después de la infección, se lavó la placa 2 veces con PBS x 1 y se fijó con acetona al 80%. Se diluyeron diversos anticuerpos monoclonales hasta aproximadamente 2 µg/µl y se añadieron a pocilios individuales de la placa (0.2 ml/pocillo). Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente (TA) con agitación, cada pocilio se lavó dos veces con PBS x 1 , y se añadió un anticuerpo secundario (anti-ratón marcado con FITC, 10 µg/ml). Después de cubrir la placa con papel de aluminio e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación, cada pocilio se lavó dos veces con PBS 1 x y se secó al aire. Cada pocilio se observó después con un microscopio de fluorescencia para ver su intensidad de tinción con FITC. Para el ensayo ELISA, se revistió una placa de ELISA de 96 pocilios con 200 µl de un anticuerpo policlonal anti-FCV de conejo (Pfizer n° 16), diluido a 1 :1500 en tampón carbonato de sodio (1.59 g de Na2C03 y 2.93 g de NaHC03 dísueltos en 1 litro de agua). La placa se incubó a 4°C durante una noche. La placa se lavó tres veces con PBS x 1 (pH 7.4) que contenia un 0.05% de Tween-20 (PBST), después se bloqueó con 200 µl de caseína al 1 % en PBST durante una hora a 37°C. Se diluyeron diversos anticuerpos monoclonales hasta aproximadamente 0.1 µg/ml y se añadieron a pocilios individuales (100 µl/pocillo). Cada muestra se hizo por triplicado. Después de la incubación a 37°C durante una hora, cada pocilio se lavó 3 veces con PBST, y se incubó con 100 µl de inmunoglobulina IgG (H+L) Anti-Ratón de Cabra AffiniPure conjugada con peroxidasa diluida al 1 :200 (Jackson ImmunoResearch, cat. N° 715-035-150) durante 1 hora a 37°C. Cada pocilio se lavó después tres veces con PBST, seguido de la adición de 100 µl de sustrato de peroxidasa ABTS (KPL, Gaithersburg, Maryland, cat. N° 50-66-18) a cada pocilio. Después de aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente, la placa se leyó a 405-490 nm (longitud de onda dual) con un lector de ELISA. La actividad específica se calculó en base a la proporción señal/ruido. Los conjuntos de datos a partir de los ensayos de IFA y ELISA correlacionaban bien entre ellos (CUADRO 1-2), e indicaban que el FCV-21 es inmunológícamente distinto del F9, una cepa de vacuna de FCV usada comúnmente. Dos anticuerpos monoclonales (FCV 1-43 y MAB791 P) reaccionaron con F9, pero no con FCV-21 (CUADRO 1-2).

CUADRO 1-2 Sumario de afinidades de diversos anticuerpos monoclonales para cepas de FCV F9 y FCV-21 EJEMPLO 1-3 Análisis de la secuencia de la cápsida de FCV-21 Se aisló ARN total del sobrenadante de un cultivo celular infectado con FCV-21 usando el reactivo TRIzol (Invitrogen; Carisbad, CA). Una preparación de ADNc de "primera cadena" se sintetizó usando cebadores aleatorios y transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen). La reacción de PCR se realizó usando la polimerasa XL rTth (Applied Biosystems: Foster City, CA) y cebadores de oligonucleótidos DEL-653 (SEC ID N°: 1) y DEL-651 (SEC ID N°: 2). El producto de PCR resultante se secuenció usando química BigDye y un Analizador Genético ABI377. La secuencia de la cápsida completa se enumera como SEC ID N°: 12 para secuencia de nucleótidos y SEC ID N°: 13 para la secuencia de aminoácidos codificada.

EJEMPLO 1-4 Aislamiento y cultivo de FCV-49 El calicivirus felino (FCV) cepa 49 (FCV-49, también llamado PHA-49) se recogió en 1993 de una exposición de gatos de Philadelphia, PA. La muestra se diluyó en microtubos de 96 pocilios que contenían medio al 1 %, y se hicieron diluciones 1 :10. Se añadieron 100 µl de la muestra diluida a 100 µl de células CRFK en una placa de 96 pocilios. El virus FCV-49 se purificó 3 veces mediante dilución limitada en placas de 96 pocilios. El sobrenadante viral de la purificación final se retiró y se usó para infectar células CRFK cultivadas hasta una confluencia del 75% en un matraz T25. Cuando se observó un 100% de CPE, la suspensión se congeló/descongeló 3 veces y se trasladó en forma de alícuotas a viales de congelación (1 ml/vial). El titulo de esta solución madre viral se determinó como 6.8 x 107 TCID50/ml. FCV-49 se depositó con la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110, Estados Unidos, y se le asignó el número de acceso de la ATCC PTA- .

EJEMPLO 1-5 Análisis de la secuencia de la cápsida de FCV-49 Se aisló ARN total del sobrenadante de un cultivo celular infectado con FCV-49 usando reactivo TRIzol (Invitrogen, Carisbad, CA). Una preparación de ADNc de "primera cadena" se sintetizó usando cebadores aleatorios y la transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen). La reacción de PCR se realizó usando la polimerasa XL rTth (Applied Biosystems; Foster City, CA) y cebadores de oligonucleótidos DEL-653 (SEC ID N°: 1) y DEL-651 (SEC ID N°: 2). El producto de PCR resultante se secuenció usando química BigDye y un Analizador Genético ABI377. La secuencia de la cápsida completa se muestra como SEC ID N°: 14 para la secuencia de nucleótídos y SEC ID N° 15 para la secuencia de aminoácidos codificada.

EJEMPLO 1-6 Aislamiento y cultivo de FCV-26391-4 El calicivirus felino (FCV) cepa 26391-4 (FCV-26391-4) se recogió en 2003 de la Humane Society of Bay County (Panamá City, Florida). Se purificó una vez mediante dilución limitada en una placa de 96 pocilios que contenía medio DMEM (Invitrogen) con suero fetal bovino al 2%. El virus purificado se usó después para infectar un matraz T150 que contenía células NLFK (Norden Lab Feline Kídney). Una vez que se alcanzó un 100% de CPE, la suspensión se congeló/descongeló una vez y se trasladó en forma de alícuotas a viales de congelación (0.85 ml/vial). El título de esta solución madre viral se determinó como 5.6 x 107 TCID50/ml. FCV-26391-4 se depositó con la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110, Estados Unidos, y se le asignó el número de acceso de la ATCC PTA- EJEMPLO 1-7 Análisis de la secuencia de la cápsida de FCV-26391-4 Se aisló ARN total del sobrenadante de un cultivo celular infectado con FCV26391-4 usando un kit QlAamp de aislamiento de ARN Viral. (Qiagen; Valencia, CA). Se usó aproximadamente 1 µg de ARN viral en RT-PCR (RT-PCR SuperScript de una etapa con Taq de Platino; de Invitrogen). Las condiciones de reacción fueron: 30 min a 50°C; 2 min a 94°C; seguido de 40 ciclos de 15 seg. a 94°C; 30 seg. a 55°C, y 2 min a 70°C; seguidos de una incubación final a 72°C durante 10 min, y almacenamiento a 4°C. Los cebadores usados fueron FCV-N2 (SEC ID N°: 3) y FCV-cebador 2 (SEC ID N°: 9). El producto de PCR se secuenció después usando diversos cebadores de oligonucleótidos (SEC ID N°: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11). La secuencia de la cápsida completa para FCV 26391-4 se muestra como SEC ID N°: 16 para la secuencia de nucleótidos y SEC ID N°: 17 para la secuencia de aminoácidos codificada. Las secuencias de aminoácidos de los genes de la cápsida de FCV-21 , FCV-49 y FCV-26391-4 se alinearon con todas las secuencias de las cápsidas de FCV de longitud completa disponibles en GenBank. El alineamiento se creó usando el algoritmo ClustalW (Thompson y col., 1994), la matriz de peso PAM250 (Dayhoff y col., 1978) y parámetros del programa por defecto (MegAlign; DNASTAR, Inc; Madison, Wl). La identidad entre las secuencias de la proteína de la cápsida de FCV-21 y FCV-213-95, la más alta entre todas las entradas en el GenBank es del 90.7%. Las secuencias de la cápsida de FCV-49 y FCV-213-95 son idénticas en un 92.2%. Las secuencias de la cápsida de FCV-26391-4 y FCV CFI-68 son idénticas entre si en un 91.3%. Se presenta una única secuencia de la cápsida para FCV-21 , FCV-49, y FCV-26391-4, y se basa en la secuenciación directa de los productos de PCR obtenidos. Sin embargo, cada una de estas secuencias representa la secuencia media, o secuencia consenso, entre una población de cuasiespecies virales, que se sabe que existen dentro de las poblaciones de ARN viral (para una revisión, véase Domingo y col., Virus Res. 82:39-44; 2002). Las cuasiespecies son un resultado directo de errores que se producen durante la replicación del genoma de ARN, generando progenie que tiene mutaciones dentro de su genoma. Por lo tanto, se espera que existan de forma natural variantes menores de las secuencias de la cápsida para estas y otras secuencias de genes de la cápsida de FCV. Sin embargo, la distribución de mutaciones dentro de cada uno es tal que tienen poco/ningún efecto en la identidad general entre cepas, incluyendo FCV-21 , FCV-49, y FCV-26391-4.

EJEMPLOS 1-8 Generación de anticuerpos monoclonales específicos para FCV-21 A.Purificación de FCV-21. Se centrifugaron aproximadamente 200 ml de sobrenadante del cultivo celular de células NLFK infectadas con FCV-21 a 3,000 rpm durante 30 minutos a 10°C. 25 ml del sobrenadante se transfirieron a tubos de centrífuga Beckman Ultraclear, y 10 ml de una solución de sacarosa al 10% se colocaron en el fondo del tubo. Los tubos se centrifugaron después a 27,000 rpm durante 2 horas a 15°C. Después del centrifugado, los sobrenadantes se retiraron y se descartaron, y los sedimentos se resuspendieron en 250 µl de agua estéril. La concentración de proteína se determinó como 7 mg/ml usando el Kit de Ensayo de Proteínas Micro BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL).

Inmunización de ratones y generación de clones de células de hibridoma Se inyectaron aproximadamente 100 µg de proteína de virus FCV-21 purificada a cada ratón junto con adyuvante de Freund. Se vacunaron ocho ratones. Se realizaron dos inmunizaciones de refuerzo con 100 µg de FCV-21 purificado con adyuvante RIBI en un intervalo de 4 semanas. Se determinó que las respuestas inmunes para los ocho ratones tenían un título de 31.250 o superior en ELISA usando FCV-21 purificado. La fusión de células se realizó para crear clones de hibridoma. 68 de dichos clones celulares se cultivaron y el sobrenadante se ensayó para su reactividad con FCV-21. Para este ELISA, una placa de ELISA de 96 pocilios se revistió con 100 µl de FCV purificado a una concentración de 5 µg/ml, diluido en PBS x 1. La placa se secó a 37°C durante una noche sin estar cubierta en una incubadora no humidificada. El virus en la placa se fijó aplicando 0.1 ml de metanol e incubando a temperatura ambiente durante 5 minutos. La placa se lavó después 8 veces con agua destilada, después se bloqueó con 200 µl de suero de fabricación propia al 10% en PBS x 1 durante una noche a 4°C. La placa se lavó de nuevo 8 veces con agua destilada. Se añadieron diversas diluciones de muestras de suero de ratón a pocilios individuales (100 µl/pocillo). Cada muestra se hizo por triplicado. Después de la incubación a 37°C durante 1 h, cada pocilio se lavó 3 veces con PBST, y se incubó con 100 µl de IgG (H+L) anti-Ratón de Cabra AffiniPure conjugada con peroxidasa, diluida a 1 :200 (Jackson ImmunoResearch, cat. N° 715-035-150) durante 1 hora a 37°C. Cada pocilio se lavó después 3 veces con PBST, seguido de la adición de 100 µl de sustrato de peroxidasa ABTS (KPL, Gaithersburg, Maryland, cat N° 50-66-18) a cada pocilio. Después de aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente, la placa se leyó a 405-490 nm (longitud de onda dual) con un lector de ELISA. La actividad específica se calculó en base a la proporción señal/ruido.

Reactividad de anticuerpos monoclonales específicos de FCV-21 Los sobrenadantes de los clones de células de hibridoma anteriores se usaron para ensayar su reactividad para FCV-21 asi como para F9 en ensayo de ELISA sandwich. En resumen, una placa de ELISA de 96 pocilios se revistió con 200 µl de un anticuerpo policlonal anti-FCV de conejo (Pfizer N° 16), diluido en tampón carbonato de sodio 1 :1.500 (1.59 g de Na2CO3 y 2.93 g de NaHCO3 dísueltos en 1 litro de agua). La placa se incubó a 4°C durante una noche. La placa se lavó 3 veces con PBS x1 (pH 7.4) que contenía un 0.05% de Tween-20 (PBST), después se bloqueó con 200 µl de caseína al 1 % en PBST durante una hora a 37°C. Los sobrenadantes de FCV-21 y F-9 se añadieron a cada pocilio a una dilución de 1 :10. Después de la incubación a 37°C durante 1 hora, las placas se lavaron y se añadieron diversos sobrenadantes de hibridoma y sus diversas diluciones a pocilios individuales (100 µl/pocillo) por triplicado. Las placas se incubaron después a 37°C durante 1 hora, se lavaron 3 veces con PBST, y se incubaron con 100 µl de IgG (H+L) anti-Ratón de Cabra AffiniPure conjugado con peroxidasa, diluida a 1 :200 (Jackson ImmunoResearch, Cat. N° 715-035-150) durante 1 hora a 37°C. Después de lavar, se añadieron 100 µl de sustrato de peroxidasa ABTS (KPL, Gaithersburg, Maryland, Cat N° 50-66-18) a cada pocilio. Después de aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente, la placa se leyó a 405-490 nm (longitud de onda dual) con un lector de ELISA. La actividad específica se calculó en base a la proporción señal/ruido.

CUADRO 1-3 Exploración de ELISA de diversos sobrenadantes de células de hibridoma para su reactividad especifica para FCV-21 frente a F9 B.Anticuerpos monoclonales específicos para FCV-21 y no para otras cepas de FCV Se eligieron dieciocho clones de células de hibridoma (3, 7, 17, 23, 27, 29, 30, 36, 37, 40, 41 , 42, 44, 53, 56, 59, 60 y 61) para ensayar adicionalmente su especificidad para FCV-21. Se usaron once virus FCV en el ensayo (FCV-21 , 49, 26391-4, F9, CFI-68, 33585, 89391 , 255, J-1 , 2280 y H).

De nuevo se usó ELISA sandwich, como se ha descrito anteriormente. Los resultados se resumen en el Cuadro 1-4.

CUADRO 1-4 Como se ha demostrado anteriormente, las líneas celulares de hibridoma 23, 41 , 44, y 56 son específicas para FCV-21 , y ningún otro FCV ensayado. Por lo tanto, estos anticuerpos monoclonales pueden usarse como herramienta de diagnóstico para FCV-21. Es más, el hibridoma 36 parece reaccionar solamente con cepas FCV de vacuna (FCV-21 , 49, 26391-4) y con ninguna otra cepa de FCV.

Todas las líneas celulares de hibridoma 23, 36, 41 , 44 y 56 se depositaron con la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110, Estados Unidos, y se les asignó los números de acceso de la ATCC: PTA-7349(23) PTA-7350(36) PTA-7353(41) PTA-7351(44) PTA-7352(56) EJEMPLO 1-9 Análisis de neutralización cruzada de suero de sueros de FCV-21 y FCV- 49 contra virus de FCV aislados en 1993 A.Titulación de antisuero homólogo Se provocó antisuero de fase convaleciente contra doce FCV aislados en gatos específicos libres de patógeno (SPF), y se recogieron después de una inoculación primaria y secundaria. El inoculo del virus variaba de acuerdo con los títulos de solución madre, en un intervalo de 104 a 108 TCID50/gato. Los gatos se inocularon inicialmente, se les reforzó tres semanas después, y después se les extrajo sangre para el suero 2 semanas después del refuerzo. Los doce aislados incluían F9, CFI-68, LSO-12, JOK63, JOK92 y aislados de campo 18, 21 , 49, 50, 54, 27, y 11. Los aislados de campo se seleccionaron en base a análisis filogenéticos de las secuencias de la región hipervariable de la secuencia de proteína de la cápsida de cada cepa. Se eligieron para el estudio los aislados más divergentes. Los sueros se inactivaron por calor a 56°C durante 30 minutos, y se titularon contra sus virus homólogos usando una técnica convencional de virus constante-suero variable (Griest 1979, Mahy 1996). En resumen, se añadió medio (100-150 µl) a cada pocilio de una placa de cultivo tisular de 96 pocilios. Se añadió suero (100-150 µl) a cada pocilio de la fila superior (dilución inicial de suero 1 :2 o 1 :4; F9 y LS012 a 1 :4), y se transfirieron 100 µl hacia abajo en la placa después de mezclar (diluciones 1 :2) con un pipeteador multicanal. Los últimos 100 µl se descartaron. Se añadieron 50 µl de virus homólogo titulado (diluido a 200 TCID50/50 µl) a cada pocilio, y las placas se incubaron durante 2 h a 37°C en una incubadora de C02. Después de la incubación, se añadieron 50 µl de una dilución 1 :10 de células CRFK en suspensión a cada pocilio. Se preparó una placa de título de virus usando el virus diluido para asegurar que se añadía un inoculo apropiado a cada pocilio. Se usaron 50 µl de virus en la fila superior que contenía 150 µl de medio; el resto de la placa contenia 180 µl/pocillo, y se realizaron diluciones de 10 veces hacia abajo en la placa con 20 µl. Las placas se incubaron durante 4 días, y se usó la fórmula de Kárber para calcular tanto los títulos del suero como los virales (en el caso de los títulos del suero, la proporción de pocilios protegidos frente a los no protegidos se usó en la ecuación). Cuando se titulaba el suero, se definió el TCID50 como la dilución punto final de neutralización al 50% (Griest 1979). Una unidad de anticuerpo (AU) se definió como la dilución más alta de ese antisuero capaz de neutralizar 32-320 TCID50 del virus homólogo en el 50% de los cultivos de ensayo. Por lo tanto, el TCID50 obtenido es igual a 1 AU. Las neutralizaciones cruzadas de virus se realizaron contra concentraciones de suero de 2.5, 5, 10 y 20 U.

B. Ensayo de neutralización cruzada de virus Cada aislado de campo viral, asi como las cepas F9, LS012, JOK63, JOK92, SA113 y CFI-68, se ensayó contra cada uno de los doce antisueros de FCV en un ensayo de neutralización cruzada. Cada virus requirió 5 placas de 96 pocilios. Cada suero se diluyó a 2.5, 5, 10 y 20 AU y se colocó en las placas en réplicas de ocho hacia abajo en las placas (tres sueros/placa para un total de cuatro placas) y una placa de titulo de virus (preparada de la misma manera que para las titulaciones de suero). Las diluciones antisueros se prepararon en DMEM diluyendo primero el suero a 20 AU, y después realizando diluciones de 2 veces hacia abajo hasta 2.5 AU. Se añadió después una alícuota de cada dilución (100 µl) a cada columna de pocilios en la placa. Los virus se descongelaron rápidamente a 37°C, se colocaron en hielo, y se diluyeron a 200 TCID50/pocillo (se mantuvieron en hielo). Para mantener la consistencia, se usó un procedimiento de dilución de tres etapas para la mayoría de las soluciones madre virales, nunca llegando más arriba de 1 :100 en cada etapa. La solución madre de virus diluida (50 µl) se añadió a todos los pocilios de las placas de suero y se titularon como se ha descrito previamente. Las placas se incubaron a 37°C en una incubadora de C02 durante 2 horas, después de lo que se añadieron 50 µl de una dilución 1 :10 de suspensión de células CRFK previamente cultivada hasta confluencia, a cada pocilio. Se cambiaron las puntas de pipeta y las cubetas de reserva después de cada serie de 5 placas. Las placas se valoraron después de 4 días. En algunos casos se usó virus pre-titulado, y pre-diluido.

CUADRO 1-5 Resultados de la neutralización cruzada de suero *2.5, 5, 10, 20 unidades de anticuerpo usadas en la neutralización de suero n = 4-7/8 pocilios protegidos blanco = suero insuficiente/no hecho N = 8/8 pocilios protegidos - = 0-3/8 pocilios protegidos CUADRO 1-5 (continuación) *2.5, 5, 10, 20 unidades de anticuerpo usadas en la neutralización de suero n = 4-7/8 pocilios protegidos blanco = suero insuficiente/no hecho N = 8/8 pocilios protegidos - = 0-3/8 pocilios protegidos Los datos de neutralización cruzada se resumen en el CUADRO 1-5. Cada punto de los datos representa ocho réplicas de pocilios ensayadas.

"N", "n", o "-" representan la proporción de pocilios protegidos frente a no protegidos, que es una indicación del alcance de la neutralización cruzada. Los resultados de neutralización de suero correspondientes a cada suero monoespecífico ensayado contra su virus homólogo se destacan en el CUADRO. Estos sueros deberían neutralizar completamente; en su mayor parte así lo hacen. Las pocas excepciones, más notablemente JOK63, JOK92 y 11 , muestran neutralización completa a valores de AU más altos, pero no a 2.5 AU. Esto probablemente sea debido a errores de dilución. El resultado más significativo de esta serie de datos es el alto grado de neutralización cruzada exhibido por los sueros de FCV-21 y FCV-49, particularmente éste último. Los patrones de neutralización cruzada de estos sueros parecen ser similares a los de F9 (nótese que la serie de datos para F9, y para FCV-21 y FCV-49 a 20 AU es incompleta debida a cantidades insuficientes de sueros). Aunque hay algunas diferencias en los patrones de neutralización entre estos tres sueros (FCV-21 , FCV-49, y F9), los aislados 11 , 38 y 39 no se neutralizaron consistentemente por ninguno de los tres.

EJEMPLO 1-10 Análisis de neutralización cruzada de antisueros de FCV-21 y FCV-49 contra virus FCV aislados en 2003 Los antisueros de FCV en este estudio se generaron inoculando de 105 a 106 de TCID50/ml de FCV por via intranasal a gatos (4-5 gatos/grupo).

Se realizó una inoculación de refuerzo 3 semanas después usando la misma cantidad de virus. Los sueros se recogieron dos semanas después del refuerzo y se trataron con calor a 56°C durante 30 minutos. Se usaron muestras de suero de cada uno de los gatos vacunados en el ensayo de neutralización de suero contra cada una de las 26 cepas de FCV (CUADRO 1-6). Las muestras de suero se diluyeron a 1 :8 y seguidas de diluciones seriadas de 2 veces hasta 1 :16384 (12 diluciones en total) en un volumen de 600 µl. Se mezclaron FCV con un intervalo de título entre 50-500 TCID50/ml en 600 µl, con muestras de suero diluido conjuntamente y se incubaron a temperatura ambiente durante 45 minutos. Después se transfirieron 200 µl de muestra a cada pocilio de placas de 96 pocilios sembradas con células CRFK por cuadruplicado. Las placas se incubaron a 37°C con CO2 al 5% durante 6 días y se determinó el titulo de punto final de neutralización. Tanto el título de neutralización del suero (SN) como el retro-título de exposición al virus se calcularon por el procedimiento de Spearman-Karber (Spearman C, 1908, Brit J Psychol 2:227-242; Karber G, 1931 , Arch exp Path Pharmak 162: 480-487). Los datos de neutralización de suero se analizaron con títulos de punto de corte de >23 y >15 y >10. Los resultados se muestran en el CUADRO 1-7. Los datos sugieren que FCV-21 , FCV-49 y FCV-26391-4 tienen perfiles de neutralización cruzada más amplios, y son por lo tanto mejores candidatos a vacuna que la cepa de vacuna de FCV actual, F9.

CUADRO 1-6 26 cepas de FCV usadas en los estudios de neutralización cruzada CUADRO 1-7 Análisis de neutralización cruzada de FCV-21, FCV-49 y FCV-26391-4 en comparación con F9 EJEMPLO 1-11 Mortalidad y valores clínicos para gatos vacunados con componentes de felocell 4 con y sin FCV-21 Se vacunaron gatos domésticos de pelo corto, de aproximadamente 8 semanas de edad, con componentes de FELOCELL® 4 que contienen virus de la rinotraqueítis felina vivo modificado [FHV], calicivirus [FCV-F9], virus de la panleucopenia [FP] y Chlamydia psittaci, con o sin otra cepa de FCV, FCV-21. Los regímenes de vacunación evaluados incluían: una vacunación subcutánea inicial seguida de refuerzos subcutáneos en los dias 21 (SC/SC); una vacunación subcutánea inicial seguida de una inmunización de refuerzo oral en el día 21 (SC/Oral); o una vacunación inicial oral seguida de una segunda vacunación oral en el día 21. Las vacunaciones orales se consiguieron mediante administración de la vacuna dentro de la boca. En el día 42, todos los gatos se expusieron con aproximadamente 1 ml de FCV- 33585 sistémico virulento (3 log de TCID50/ml). Todos los gatos se controlaron para los síntomas clínicos (temperatura, conjuntivitis con descarga de suero, conjuntivitis con descarga mucopurulenta, rinitis con descarga serosa, rinitis con descarga mucopurulenta, estornudos, respiración sibilante, toses, respiración por la boca abierta, anorexia, deshidratación, una úlcera oral < 4 mm, múltiples úlceras orales, úlceras orales > 4 mm, salivación, úlcera externa no sangrante, úlceras externas sangrantes) de enfermedad durante 14 días después de la exposición. Los gatos que exhibían síntomas clínicos graves después de la exposición que eran consecuentes con patogénesis por calicivirus se sacrificaron. Como se muestra en el CUADRO 1-8, la adición de la nueva cepa FCV-21 aumenta significativamente la eficacia de FELOCELL 4, con o sin la presencia de FCV-F9. Tanto la vacunación SC/SC como la vacunación SC/Oral parecen ser eficaces para evitar la infección por FCV. Es más, se ha demostrado eficacia contra la infección por FCV incluso con vacunación oral/oral con adición de FCV-21 y ausencia de F9 en FELOCELL 4 y FELOCELL 3. (FELOCELL 3 es FELOCELL 4 sin Chlamydia psittaci). Para el CUADRO 1-9, los regímenes de vacunación evaluados incluían una vacunación subcutánea inicial seguida de dos inmunizaciones de refuerzo orales, en el día 21 y en el día 42 (SC/Oral/Oral). Se ha demostrado que la adición de FCV-21 , con o sin FCV-F9 en FELOCELL 4, disminuye significativamente tanto la mortalidad como los valores clínicos.

•FELOCELL 4A FELOCELL 4 sin FCV-F9, pero con FCV-21 "FELOCELL 3A FELOCELL 3 sin FCV-F9, pero con FCV-21 elocell 4A: Felocell 4 sin FCV-F9 "Felocell 3A: Felocell 3 sin FCV-F9 o.

EJEMPLO 1-12 Análisis de neutralización cruzada de sueros de gatos vacunados con componentes de felocell 4 con y sin FCV-21 Se recogieron muestras de suero de cada gato en el estudio descrito en el EJEMPLO 1-11 después de la segunda vacunación, pero antes de la exposición 85. Las muestras se trataron con calor a 56°C durante 30 minutos, y se evaluaron en el ensayo de neutralización de suero contra cada una de las 26 cepas de FCV como se ha descrito previamente en el EJEMPLO 1-10 (CUADRO 1-6). Los datos de neutralización de suero se analizaron con títulos de puntos de corte de >23 y >15, y se calculó una media de los dos títulos de puntos de corte (Med.). Los resultados se muestran en el CUADRO 1-10. Los datos indican que todas las formulaciones de vacuna que contenían FCV-21 tenían perfiles de neutralización cruzada más amplios que las vacunas que contenían la cepa FCV-F9 tradicional (~ 60% frente al 40%). Esto dio como resultado un aumento aproximado del 50% en el número de las cepas de FCV neutralizadas. 00 ELOCELL 4A: FELOCELL 4 sin FCV-F9, pero con FCV-21 "FELOCELL 3A FELOCELL 3 sin FCV-F9, pero con FCV-21 Como también se muestra en el CUADRO 1-10, la adición de la nueva cepa de FCV-21 aumentó significativamente el perfil de neutralización cruzada de FELOCELL 4, con o sin la presencia de FCV-F9. Se observaron perfiles de neutralización cruzada más amplios tanto con vacunación SC/SC como con vacunación SC/Oral. Además, se han demostrado perfiles de neutralización cruzada potenciados con vacunación Oral/Oral con la presencia de FCV-21 , pero no F9, en FELOCELL 4 y FELLOCEL 3. En el CUADRO 1-11 , las regímenes de vacunación evaluados incluyeron una vacunación subcutánea inicial seguida de dos inmunizaciones de refuerzo orales el día 21 y el día 42 (SC/Oral/Oral). Los resultados indican que la adición de FCV-21 , con o sin FCV-F9 en FELOCELL 4, dio como resultado perfiles de neutralización cruzada significativamente más anchos (un aumento de aproximadamente el 40%).

DESCRIPCIÓN NUMERADA DE LA INVENCIÓN.

Descripción adicional de las invenciones y ejemplos. 1. Una vacuna para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende una proteína de la cápsida de FCV-21 o una proteína de la cápsida de FCV-21 aislada. 2. Una vacuna para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende una proteína de la cápsida de FCV-21 o una proteina de cápsida de FCV-21 aislada, en la que dicha proteína de la cápsida comprende la secuencia de proteínas (SEC ID 13) y secuencias que tienen al menos aproximadamente el 91.2%, 95% y el 99% de identidad; en la que dicha proteína de la cápsida se proporciona en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmune, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 3. Una vacuna de ADN para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican una proteina de la cápsida de FCV-21 o una proteína de la cápsida de FCV-21 aislada, en la que dicho ADN comprende una secuencia (SEC ID 12) y secuencias que tienen al menos aproximadamente el 78.7%, y el 79.2% de identidad de secuencia y que permiten sustituciones conservativas. 4. Una vacuna para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende una proteina de la cápsida de FCV-49 o una proteína de la cápsida de FCV-49 aislada en la que dicha proteína de la cápsida comprende una secuencia de proteínas de la cepa FCV-49. 5. Una vacuna para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende una proteína de la cápsída de FCV-49, o una proteína de la cápsida de FCV-49 aislada en la que dicha proteína de la cápsida comprende la secuencia de proteínas (SEC ID 15) y secuencias que tienen al menos aproximadamente el 92.7%, el 95% y el 99% de identidad; en la que dicha proteína de la cápsida se proporciona en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmune, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 6. Una vacuna de ADN para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de la cápsida de FCV-49 o una proteína de la cápsida de FCV-49 aislada en la que dicho ADN comprende una secuencia (SEC. ID 14) y secuencias que tienen al menos aproximadamente el 78.9%, en concreto 79.4% (78.9 + 0.5) de identidad de secuencia y que permiten sustituciones conservativas. 7. Una vacuna para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende una proteína de la cápsida de FCV-26391-4, o una proteína de la cápsida de FCV-26391-4 aislada, en la que dicha proteína de la cápsida comprende secuencias de proteínas de la cepa FCV-26391-4. 8. Una vacuna para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende una proteína de la cápsida de FCV-26391-4, en la que dicha proteína de la cápsida comprende la secuencia de proteinas (SEC ID 17) y secuencias que tienen al menos aproximadamente el 91.8%, el 95% y el 99% de identidad, en la que dicha proteína de la cápsida se proporciona en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmune y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 9. Una vacuna de ADN para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de la cápsida de FCV-26391-4 o una proteína de la cápsida de FCV-26391-4 aislada en la que dicho ADN comprende una secuencia (SEC. ID 16) y secuencias que tienen al menos aproximadamente el 78.4%, en concreto 78.9% (78.4 + 0.5) de identidad de secuencia. 10. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el polinucleótido se selecciona entre el grupo constituido esencialmente por las SEC ID N° 12, 14, 16. 11. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además sólo o en cualquier combinación lo siguiente: donde contiene un adyuvante, en la que el componente de FCV está vivo, en la que el componente de FCV está atenuado, en la que el componente de FCV está inactivado, que puede incluir al menos una cepa diferente de calicivirus felino seleccionada entre el grupo constituido por FCV-F9, FCV-LLK, FCV-M8, FCV-255, y FCV-2280. 12. La vacuna de las reivindicaciones 1 , 4, y 7, en la que la vacuna incluye al menos un patógeno felino diferente, seleccionado entre el grupo constituido por herpesvirus felino, virus de leucemia felina, virus de inmunodeficiencia felina, Chlamydia pssittaci, y parvovirus felino, virus de la rabia y Bordetella bronchiseptica. 13. Una vacuna para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende una secuencia de nucleótidos de una proteína de la cápsida de FCV seleccionada entre el grupo constituido por un polipéptido que tiene el 93% o más de identidad con SEC ID N° 13, 15, ó 17, en la que el FCV aislado no es la cepa 213-95, y en la que la secuencia de ácido nucleico se une de forma operativa a una secuencia promotora heteróloga, en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmune, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 14. La vacuna de la reivindicación 13, en la que la secuencia de nucleótidos se selecciona entre el grupo constituido esencialmente por las SEC ID N° 12, 14 y 16. 15. La vacuna de la reivindicación 13, en la que la secuencia de nucleótidos está en cualquiera de los siguientes: un plásmido, un vector de virus recombinante. 16. La vacuna de la reivindicación 13, en la que el vector de virus recombinante se selecciona entre el grupo constituido por herpesvirus felino, poxvirus de mapache, poxvirus de canario, adenovirus, virus Semliki Forest, virus de Sindbis y virus vaccinia. 17. Una composición inmunogénica que comprende un vehículo de excipiente veterinariamente aceptable y una cepa aislada de FCV que se une a un anticuerpo monoclonal seleccionado entre los anticuerpos monoclonales descritos en este documento como 23, 26, 41 , 44 y 56. 18. Una composición inmunogénica que comprende un vehículo de excipiente veterinariamente aceptable y una cepa aislada de FCV que se une de forma selectiva a un anticuerpo monoclonal seleccionado entre los anticuerpos monoclonales descritos en este documento como 23, 26, 41 , 44 y 56. 19. Las composiciones inmunogénicas de las reivindicaciones 17 y 18 en las que la cepa de FCV está inactivada, donde dicha cepa de FCV es una vacuna y donde la composición comprende un adyuvante. 20. Un procedimiento para inmunizar un gato contra calicivirus felino que comprende: administrar al gato una dosis eficaz de una vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la que la vacuna comprende adicionalmente un adyuvante.

Parte 2 Esta sección a continuación proporciona información detallada sobre los procedimientos para inmunizar animales contra virus y en particular gatos contra calicivirus. A no ser que se indique otra cosa, las descripciones a continuación usan las definiciones proporcionadas anteriormente y a continuación. Se describen en este documento procedimientos y materiales para tratar e inmunizar animales con vacuna y en particular gatos contra calicivirus felino (FCV). Los procedimientos incluyen administrar al gato cantidades terapéuticamente eficaces de primeras y segundas vacunas que son capaces de inducir una respuesta inmune, y en particular en el gato contra FCV. La primera vacuna se administra típicamente por vía parenteral, pero en algunas situaciones puede administrarse por vía oral, mientras que la segunda vacuna se administra por vía oral u oronasal N días después de la administración de la primera vacuna. Estas vacunas se administran típicamente por vía parenteral primero porque típicamente causan lesiones orales si se administran inicialmente por vía oral. Curiosamente, en este documento se describen cepas FCV-21 , FCV-49 y FCV-26391-4, que son tan seguras y eficaces que pueden administrarse en forma de una primera administración oral seguida de una segunda administración oral. En este documento, N es un número entero de 3 a 120, ambos inclusive, pero es típicamente un número entero de 7 a 42, ambos inclusive, o de 14 a 28, ambos inclusive, se prefieren aproximadamente 3 semanas y también aproximadamente 2-4 semanas. Como alternativa, la segunda vacuna puede administrarse después de que el gato ha desarrollado un titulo de neutralización de suero de FCV de aproximadamente 1 :6, 1 :9, 1 :12, 1 :15, 1 :18 o mayor. El procedimiento puede también incluir una o más administraciones parenterales, orales u oronasales adicionales de una vacuna de FCV M días después de la administración de la primera vacuna o de la segunda vacuna, donde M es un número entero de 1 a 120, ambos inclusive. Por tanto, los regímenes de vacunación representativos incluyen (1) administración subcutánea de una primera vacuna de FCV, seguida de administración oral de una segunda vacuna de FCV; (2) administraciones subcutáneas sucesivas de primera y tercera vacunas de FCV, seguidas por la administración oral de una segunda vacuna de FCV; y (3) administración subcutánea de una primera vacuna de FCV, seguida de administraciones orales sucesivas de una segunda y tercera vacunas de FCV. Como se ha descrito anteriormente, la primera vacuna se administra por vía parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea). La segunda vacuna se administra por vía oral u oronasal, y una tercera vacuna opcional puede administrarse por vía parenteral, oral u oronasal. Cualquier dispositivo puede usarse para administrar las vacunas, incluyendo jeringuillas, dispensadores de gotas, dispositivos de inyección sin aguja, y similares. Para la administración oronasal, puede usarse una jeringa dotada con una cánula para colocar gotas de la vacuna en la nariz y boca del gato. El procedimiento puede emplear cualquier vacuna que sea capaz de inducir una respuesta inmune en el gato contra FCV, siempre que la primera vacuna esté adaptada para administrarse por via parenteral y la segunda vacuna esté adaptada para administrarse por vía oral u oronasal. Como se ha indicado anteriormente, la tercera vacuna opcional está adaptada para administrarse por vía parenteral, por vía peroral o por vía oronasal. Las vacunas primera, segunda, y tercera opcional, pueden ser las mismas o diferentes y cada una comprende, por separado, un antígeno o antígenos obtenidos de una o más cepas de FCV. Las vacunas útiles por tanto incluyen vacunas de virus vivo, vacunas de virus vivo modificado y vacunas de virus inactivado. Vacunas de virus de FCV vivo modificado y vivo contienen cepas de FCV que no causan la enfermedad en gatos y que se han aislado en forma no virulenta o se han atenuado usando procedimientos bien conocidos, incluyendo paso en serie en una línea celular adecuada o exposición a luz ultravioleta o a un mutágeno químico. Vacunas de FCV muerto o inactivado contienen cepas de FCV que han sido inactivadas mediante procedimientos conocidos, incluyendo tratamientos con formalina, betapropriolactona, etilenimina binaria y similares. Vacunas ejemplares incluyen las que contienen cepas no virulentas seleccionadas de FCV-F9, FCV-M8, FCV-255, FCV-2280, FCV-21 , FCV-49, FCV 26391-4, etc., solas o en combinación. Otras vacunas útiles obtenidas de una o más cepas de FCV incluyen vacunas recombinantes y vacunas de ADN (es decir, vacunas de subunidad). Las vacunas recombinantes incluyen vectores de virus recombinante, cada una conteniendo un ácido nucleico que codifica un antigeno obtenido de una cepa de FCV. Dichos vectores pueden prepararse insertando un ADNc que codifica un antigeno obtenido de una cepa de FCV (por ejemplo, una proteína de la cápsida) en el genoma de un virus no virulento, incluyendo cepas de herpesvirus, poxvirus, adenovirus y similares. Para vectores de virus, el ADNc está unido de forma operativa a un promotor de transcripción eucariota en el extremo 5' de la secuencia que codifica el antígeno y está unido de forma operativa a una señal de terminación eucariota y una señal poli(A) en el extremo 3' de la secuencia que codifica al antígeno, de modo que el promotor de la transcripción y las secuencias de terminación regulan la expresión del antígeno. Los promotores de transcripción útiles incluyen el promotor de repeticiones terminales largas del virus del sarcoma de Rous (RSV-LTR), el promotor inmediato temprano principal de Citomegalovirus (CMV), el promotor del antígeno T de virus vacuolizante de simio 40 (SV40) y promotores inducibles, tales como el promotor de metalotioneína. Para una descripción de vacunas de FCV recombinantes, véase Patente de Estados Unidos N° 5,716,822 de Wardley y col., que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Las vacunas de ADN incluyen moléculas de ADN (por ejemplo plásmidos) que tienen una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno de FCV, tal como una proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico específico de la misma, que provoca una respuesta inmune en el gato contra FCV. La secuencia que codifica el ácido nucleico se une de forma operativa a un promotor transcripcional que permite la expresión del ADN cuando está inoculado en las células del gato. Promotores útiles incluyen el promotor RSV-LTR, el promotor inmediato temprano principal de CMV, y el promotor de antígeno T de SV40. Adicionalmente, el ácido nucleico puede unirse de forma operativa, en o cerca del codón de terminación de la secuencia que codifica el antígeno de FCV, a un fragmento de ácido nucleico que comprende una señal de terminación de la transcripción y una señal de reconocimiento de poli(A). Para una descripción de vacunas de ADN véase Patente de Estados Unidos N° 5,580,859, Patente de Estados Unidos N° 5,589,466, y Patente de Estados Unidos N° 5,703,055 de Felgner y col. Otras vacunas útiles incluyen las que contienen uno o más antígenos de subunidad, tales como una proteína de la cápsida de FCV o un fragmento inmunogénico de la proteina de la cápsida, que se ha aislado y purificado. El antígeno de subunidad puede producirse en un vector de expresión recombinante que produce el antigeno in vitro usando procedimientos descritos anteriormente. El antígeno resultante se aisla y purifica posteriormente. Los vectores de expresión útiles incluyen diversos microorganismos, incluyendo bacterias, levaduras y hongos, así como eucariotas, tales como células de mamíferos y de insectos. Otros vectores de expresión útiles incluyen virus, tales como adenovirus, poxvirus, herpesvirus, virus Semliki Forest, baculovirus, bacteriófagos, virus Sindbis, virus Sendai, y similares. La expresión del antígeno de subunidad de FCV en un microorganismo permite la producción de la proteina antigénica usando tecnologías de fermentación a escala comercial. Diversos procedimientos pueden usarse para aislar y purificar los antígenos, incluyendo filtración en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, centrifugado, y similares. Una o más de las vacunas pueden también contener antígenos para inmunizar gatos contra uno o más patógenos además de FCV, incluyendo herpesvirus felino, virus de la leucemia felina, virus de la inmunodeficiencia felina, virus de la panleucopenia felina, y Chlamydia felina. Otros componentes de vacunas pueden incluir excipientes farmacéuticamente aceptables incluyendo vehículos, disolventes, diluyentes, agentes isotónicos, agentes tamponantes, estabilizantes, conservantes, agentes inmunomoduladores (por ejemplo, interleuquinas, interferones y otras citoquinas), agentes vasoconstrictores, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, y similares. Vehículos, disolventes y diluyentes típicos incluyen agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol, y similares. Agentes isotónicos representativos incluyen cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol, lactosa y similares. Estabilizantes útiles incluyen gelatina, albúmina y similares. Las vacunas pueden también incluir uno o más adyuvantes que aumentan la respuesta inmune al antigeno. Adyuvantes representativos ¡ncluyen adyuvante basados en aceite, tales como el Adyuvante Completo de Freund, y el Adyuvante Incompleto de Freund, adyuvantes basados en micolato (por ejemplo, dímicolato de trehalosa), lipopolisacáridos bacterianos, peptidoglicanos (es decir, mureinas, mucopéptidos, o glicoproteínas tales como N-Opaca, muramil dipéptido o análogos de los mismos), proteoglicanos (por ejemplo, extractos de Klebsiella pneumoniae), preparaciones de estreptococos (por ejemplo, OK432), BIOSTIM® (por ejemplo, 01 K2), Iscoms (por ejemplo, véase solicitudes de Patente Europea N° Patente Europea 109942, Patente Europea 180564 y Patente Europea 231039), hidróxido de aluminio, saponina, dietilaminoetil dextrano, aceites neutros (por ejemplo, migliol), aceites vegetales (por ejemplo, aceite de cacahuetes), liposomas, polioles PLURONIC®. Otros adyuvantes incluyen el sistema de adyuvante RIBI, alumbre, gel de hidróxido de aluminio, colesterol, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, copolímeros de bloque (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), adyuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galénica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL) u otras fracciones de saponina, monofosforil lípido A, adyuvante amina-lipido Avridina, enterotoxina lábil al calor de Escherichia coli (recombinante o de otra manera), toxina del cólera, o muramil dipéptido, entre otros. Los tamaños de dosis de las vacunas de FCV típicamente varían desde aproximadamente 1 ml a aproximadamente 2 ml, ambos inclusive. Cada dosis contiene una cantidad terapéuticamente eficaz del antigeno de FCV o antígenos que pueden variar dependiendo de la edad y estado general del gato, la vía de administración, la naturaleza del antigeno de FCV, y otros factores. Para las vacunas que contienen virus vivos modificados o virus atenuados, una dosis terapéuticamente eficaz generalmente varia de aproximadamente 106 TCID50 a aproximadamente 108 TCID50, ambas inclusive. Para vacunas que contienen antígenos de subunidad, tales como proteínas de la cápsida de FCV, una dosis terapéuticamente eficaz generalmente varía de aproximadamente 10 µg a aproximadamente 100 µg, ambos inclusive. Los otros componentes de las vacunas pueden ajustarse para modificar las propiedades físicas y químicas de las vacunas. Por ejemplo, los adyuvantes comprenden típicamente de aproximadamente 25 µg a aproximadamente 1000 µg, ambos inclusive, de una dosis de 1 ml. De forma similar, los antibióticos comprenden típicamente de aproximadamente 1 µg a aproximadamente 60 µg, ambos inclusive, de una dosis de 1 ml. Las vacunas de FCV se proporcionan en diversas formas dependiendo de la vía de administración, requisitos de almacenamiento, y similares. Por ejemplo, las vacunas se pueden preparar en forma de soluciones acuosas, o dispersiones adecuadas para su uso en jeringas, dispensadores de gotas, etc. o pueden prepararse en forma de polvos liofilizados, que se reconstituyen en solución salina, tampón HEPES, y similares, antes de usar.

Parte 2 EJEMPLOS Y CUADROS Los siguientes ejemplos pretenden ser ilustrativos y no limitantes, y representan varias realizaciones especificas de la presente invención.

EJEMPLO 2-1 Régimen de vacunación subcutáneo/oral con FELOCELL® 4 y FEL-O- VAX® Se vacunaron gatos domésticos de pelo corto, de 4-5 meses de edad, con FELOCELL® 4 (Pfizer Inc.; virus de la rinotraqueítis felina vivo modificado [FHV], calicivirus [FCV], virus de la panleucopenia [FP] y Chlamydia psittaci), con FEL-O-VAX® (Fort Dodge; FHV, FCV, FP, y C. psittaci muertos), o con diluyente estéril (grupo de control). Los regímenes de vacunación evaluados incluían: una vacunación subcutánea inicial seguida de refuerzos subcutáneos en los días 21 y 42 (SC/SC/SC); una vacunación subcutánea inicial seguida por dos inmunizaciones de refuerzo orales en los días 21 y 42 (SC/Oral/Oral); o una vacunación subcutánea inicial seguida por una segunda vacunación subcutánea en el día 21 , y un refuerzo oral en el día 42. Todas las dosis fueron de 1 ml. La vacunación oral se consiguió por administración de la vacuna dentro de la boca. En el día 99, todos los gatos se expusieron con aproximadamente 3.5 ml de FCV-33585 sistémico virulento (4.8 log de TCID 0/ml). La exposición se realizó administrando aproximadamente 3 ml de la dosis en comida enlatada para gatos, y 0.05 ml mediante instilación nasal. Todos los gatos se controlaron para los síntomas clínicos de enfermedad durante 14 días después de la exposición. Los gatos que exhibían síntomas clínicos graves después de la exposición que eran consecuentes con patogénesis por calicivirus se sacrificaron. Como se muestra en el CUADRO 2-1, el grupo vacunado mediante el régimen SC/Oral/Oral tenía una tasa de mortalidad de solamente el 10%, mientras que el grupo de control tenía una tasa de mortalidad del 90%. El grupo vacunado mediante el régimen SC/SC/SC tenía una tasa de mortalidad del 50%, mientras que el grupo vacunado mediante el régimen SC/SC/Oral tenía una tasa de mortalidad del 20%. Estos resultados sugieren que la vacunación SC seguida por un refuerzo oral potencia significativamente la eficacia de la vacunación con FELOCELL® 4 contra exposición a FCV virulento. No sólo disminuyeron las tasas de mortalidad del 50% (SC/SC/SC) al 10% (SC/Oral/Oral) o 20% (SC/SC/Oral) cuando la vacunación oral formaba parte del régimen, sino que, como se muestra en el CUADRO 2-2, la gravedad de los síntomas clínicos tales como lesiones cutáneas (SL), inapetencia (IA), depresión (DP), úlceras orales (OU), cojera (LN), estornudos (SZ), descarga nasal (ND) y ojos acuosos (WE), también disminuyeron.

CUADRO 2-1 Mortalidad de gatos expuestos con FCV-33585 virulento después de la vacunación (eiemplo 2-1) CUADRO 2-1 Vacunación Exposición N° N° Mortalidad Grupo Tratamiento Animales Via Animales % T1 Control 10 SC/SC/SC 10 90 T2 FELOCELL® 4 5 SC/SC/SC 4 50 T3 FELOCELL® 4 10 SC/SC/Oral 10 20 T4 FELOCELL® 4 10 SC/Oral/Oral 10 10 T5 FEL-O-VAX® 5 SC/SC/SC 5 60 CUADRO 2-2 Sintomas clínicos (% de animales) después de la vacunación y la posterior exposición a FCV-33585 (eiemplo 2-1) CUADRO 2-2 EJEMPLO 2-2 Títulos medios de neutralización de suero de FCV después de vacunación sc/oral Las muestras de sangre tomadas de los gatos del EJEMPLO 2-1 se recogieron en los días de estudio 0, 21 , 42, 63, 98 y 113, y se evaluaron en un ensayo de neutralización de suero (SN) para su capacidad para neutralizar FCV Las muestras de suero se diluyeron a 1 8, seguido de diluciones seriadas de 2 veces hasta 1 :16384 (12 diluciones en total) en volúmenes de 600 µl. Los calicivirus felinos con un título de 50-500 TCID50/ml en 600 µl se mezclaron con las muestras de suero diluidas y se incubaron a temperatura ambiente durante 45 min. Después, 200 µl de cada muestra diluida se transfirieron a pocilios diferentes de placas de 96 pocilios sembradas con células Renales Felinas Crandel (CrFK) por cuadruplicado. Las placas se incubaron a 37°C, en CO2 al 5% durante 6 días, momento en que se determinaron los títulos de neutralización de punto final. Tanto el título de neutralización de suero (SN) como el retro-título de exposición al virus se calcularon usando el procedimiento de Spearman-Karber Véase, C. Spearman, Brit. J. Psychol. 2:227-242 (1908) y G. Karber, Arch. Exp.Path. Pharmak. 162:480-487 (1931). Como se muestra en el CUADRO 2-3, FELOCELL® 4 administrado mediante los regímenes de vacunación SC/Oral/Oral o SC/SC/Oral tuvo títulos de SN de FCV significativamente más altos. Estos datos están en relación con la reducción significativa de las tasas de mortalidad descritas en el EJEMPLO 2-1.

CUADRO 2-3 Títulos medios de sn (neutralización de suero) de FCV en diversos dias de estudio (ejemplo 2-2) CUADRO 2-3 Títulos medios de SN de FCV* N° Via de Grupo Animales Vacunación 0 21 42 63 98 113 dia 1 13 T1 SC/SC/SC 3 2 4 3 4 7340 1 T2 SC/SC/SC 3 18 17 24 29 5986 2 T3 SC/SC/Oral 3 27 36 310 1032 5783 8 T4 SC/Oral/Oral 3 18 431 877 1980 5787 9 T5 SC/SC/SC 4 3 6 8 15 3563 2 Medidos en el dia 0, día 21 , dia 42, dia 63, dia 98 y dia 133 después de la vacunación EJEMPLO 2-3 Eficacia de la administración SC/oral de FELOCELL® 4 y FEL-O-VAX® contra virus de la panleucopenia felina Las muestras de suero de los gatos del EJEMPLO 2-1 se ensayaron también para sus títulos de FP medios. Como se muestra en la CUADRO 2-4, todos los gatos eran seronegativos al comienzo del estudio. Posteriormente, los títulos medios del grupo de control permanecieron en 1 a lo largo de la duración de los intervalos de muestreo (días 21 y 42). Sin embargo, los títulos medios de los otros cuatro grupos de vacunación aumentaron de forma significativa.

CUADRO 2-4 Títulos medios de anticuerpos de suero para el virus de la panleucopenia felina (ejemplo 2-3) CUADRO 2-4 Vía de Título medio de suero de FP* Grupo Vacunación 0 21 42 T1 SC/SC/SC 1 1 T2 SC/SC/SC 5782 5782 T3 SC/SC/Oral 5595 5793 T4 SC/Oral/Oral 5499 5693 T5 SC/SC/SC 2360 4887 * Medidos en el día 0, dia 21 , y dia 42 después de la vacunación.

EJEMPLO 2-4 Síntomas clínicos para gatos vacunados con FELOCELL® 4 mediante diversas vías de administración La administración oronasal (ON) de FELOCELL® 4 se consiguió mediante instilación de gotas en los orificios nasales del animal. Como se indica en el CUADRO 2-5, grupos de 10 gatos (T1 , T2, T3), de 6-7 meses de edad, se vacunaron y se reforzaron en el día 21 de acuerdo con los regímenes mostrados en el CUADRO 2-5: Vacunación y refuerzo subcutáneos (SC/SC); vacunación subcutánea y refuerzo oronasal (SC/ON); o vacunación y refuerzo oronasal (ON/ON). La vacuna se administró por vía subcutánea en la parte derecha del cuello (1 ml); la administración oronasal fue mediante el suministro de 0.5 ml de vacuna en cada orificio nasal. Comenzando el día 1 , todos los gatos se observaron diariamente para el estado de salud general.

CUADRO 2-5 Síntomas clínicos para gatos vacunados con FELOCELL® 4 mediante diferentes vías de administración (ejemplo 2-4) CUADRO 2-5 Grupo Via de Síntomas clínicos, % vacunación NU OU SZ ND WE IA T1 SC/SC 0 0 0 0 0 50 T2 SC/ON 0 0 20 0 0 20 T3 ON/ON 10 30 90 50 60 20 Como se muestra en el CUADRO 2-5, los gatos que recibían ambas vacunaciones por vía oronasal tenían niveles altos de síntomas clínicos, incluyendo úlceras nasales (NU), úlceras orales (OU), estornudos persistentes (SZ), descarga nasal (ND), ojos acuosos (WE), e inapetencia transitoria (IA). Los gatos vacunados mediante el régimen SC/ON, sin embargo, mostraron menos síntomas clínicos que los gatos vacunados con ON/ON, sin indicios de úlceras nasales, úlceras orales, descarga nasal u ojos acuosos. Además, los sujetos en el grupo SC/ON, exhibieron menos estornudos que los gatos en el grupo ON/ON. El perfil de seguridad del grupo SC/ON era similar al del grupo SC/SC.

EJEMPLO 2-5 El efecto de diferentes vias de vacunación sobre respuestas serológicas a antígenos de FELOCELL® 4 Muestras de suero de gatos inscritos en el estudio descrito en el EJEMPLO 2-4 se ensayaron para reactividad serológica a diversos antígenos virales presentes en la vacuna FELOCELL® 4. Los títulos medios de anticuerpos de neutralización de suero para FCV, FHV y FP se determinaron para los días de estudio 0, 21 y 42. Como se muestra en el CUADRO 2-6, los tres regímenes de vacunación dieron como resultado una fuerte respuesta inmune a FP. La respuesta inmune a FHV, era apenas detectable debido a dificultades con el ensayo. Sin embargo, los títulos de neutralización de suero contra FCV fueron significativamente más altos en los grupos ON/ON y SC/ON, en comparación con el grupo SC/SC. Estos resultados sugieren que los gatos en los grupos ON/ON y SC/ON estarían protegidos contra la exposición a un FCV virulento, pero que el grupo SC/SC puede no estarlo.

CUADRO 2-6 "Medido en el dia 0. día 21 v día 42 desDués de la vacunación.

EJEMPLO 2-6 Títulos de neutralización de suero contra FCV-F9 administrado mediante una via SC U ON Se vacunaron seis gatos por grupo con el antigeno de FCV-F9 presente en la vacuna FELOCELL® 4, por vía subcutánea u oronasal. Tres semanas después de la vacunación inicial, se reforzaron todos los gatos con el mismo antígeno mediante la misma vía que previamente. Todas las dosis fueron de 1 ml. Las muestras de suero se recogieron tres semanas después de la inmunización de refuerzo. Como se muestra en el CUADRO 2-7, los títulos de neutralización de suero se determinaron para estas muestras contra un panel de 26 cepas de FCV. Las cepas de FCV elegidas para el panel se seleccionaron en base a su diversidad genética (como se determina por la secuencia de la región hipervariable de su cápsida), así como por su distribución geográfica. Además, el fenotipo de virulencia de cada cepa se consideró también. Las muestras de suero de gatos vacunados por via oronasal con F9 neutralizaron más cepas de FCV en el panel de 26 miembros, en comparación con las muestras de gatos vacunados por vía subcutánea. Usando 23 como el valor de corte para los títulos de neutralización, la vacunación por vía oronasal dio como resultado títulos en o por encima del valor de corte en el 26% de los miembros del panel, mientras que la vacunación por vía subcutánea dio como resultado solamente un 16% satisfaciendo los criterios. Para un valor de corte de título de 15, la vacunación oronasal proporcionó un 32% de miembros del panel en o por encima del valor de corte; la subcutánea produjo solamente el 17%.

CUADRO 2-7 Títulos de neutralización cruzada de suero para suero generado por via subcutánea frente a vía oronasal para FCV-F9 frente a un panel viral de 26 FCV (eiemplo 2-6) CUADRO 2-7 FCV-F9 % Pos. (>23*) % Pos. (>15*) Inoculación SC 16 17 Inoculación ON 26 32 ON sobre SC (%) 163 188 SC sobre ON (%) 62 53 *Título de neutralización = 23 como valor de corte; o titulo de neutralización > 15 como valor de corte. EJEMPLO 2-7 Mortalidad y valores clínicos para gatos vacunados con dos dosis de componentes FELOCELL® 4 o FELOCELL® 3 y un FCV-21 vivo modificado A gatos domésticos de pelo corto, de aproximadamente 8 semanas de edad, se administraron vacunas que contenían virus de la rinotraqueítis felina vivo modificado (FHV), virus de la panleucopenia (FP), Chlamydia psittaci, y (1) FCV-F9 (FELOCELL® 4 o FELOCELL® 3), (2) FCV-F9 y FCV-21 (FELOCELL® 4 más FCV-21 o FELOCELL® 3 más FCV-21) o (3) FCV-21 (FELOCELL® 4A o FELOCELL® 3A). Los regímenes de vacunación incluían: una vacunación subcutánea inicial seguida de refuerzos subcutáneos en el día 21 (SC/SC); una vacunación subcutánea inicial seguida de una inmunización de refuerzo oral en el día 21 (SC/Oral); o una vacunación oral inicial seguida de una segunda vacunación oral en el día 21 (Oral/Oral). Cada gato en los diferentes regímenes de dosificación (grupos T1 a T10, 10 gatos por grupo) recibió 1 ml de vacuna. La vacunación oral se consiguió mediante la administración de la vacuna dentro de la boca. En el día 42, todos los gatos se expusieron con aproximadamente 1 ml de FCV-33585 sistémico virulento (3 log de TCID50/ml). Durante 14 días después de la exposición, todos los gatos se controlaron para los síntomas clínicos de enfermedad, incluyendo temperatura elevada, conjuntivitis con descarga serosa, conjuntivitis con descarga mucopurulenta, rinitis con descarga serosa, rinitis con descarga mucopurulenta, estornudos, respiración sibilante, toses, respiración por la boca abierta, anorexia, deshidratación, una úlcera oral < 4 mm, múltiples úlceras orales, úlceras orales > 4 mm, salivación, úlcera externa no sangrante y úlceras externas sangrantes. Los gatos que mostraban síntomas clínicos graves después de la exposición que eran consecuentes con la patogénesis por calicivirus se sacrificaron. Como se muestra en el CUADRO 2-8, cuando se compara con la vacunación SC/SC, un régimen de vacunación SC/Oral disminuyó la mortalidad del 44% al 10%, y mejoró el valor clínico mediano de 12 a 5.5 para gatos vacunados con FELOCELL® 4. Además, añadir la cepa FCV-21 a FELOCELL® 3 y a FELOCELL® 4 dio como resultado la ausencia de mortalidad después de la exposición. Reemplazar la cepa FCV-F9 de FELOCELL® 3 y FELOCELL® 4 con cepa FCV-21 dio como resultado una eficacia similar a las vacunas que contienen tanto FCV-F9 como FCV-21 , incluso para un régimen de vacunación Oral/Oral CUADRO 2-8 Mortalidad de gatos expuestos a FCV-33585 virulento después de vacunación de dos dosis con FELOCELL® 3 o 4 y con o sin FCV-f9 y/o FCV-f21 (eiemplo 2-7) CUADRO 2-8 Vacunación Exposición Valor clínico Grupo N° Mortalidad Tratamiento Via Mediano Min Máx Animales % T1 Control SC/SC 9 78 24 2 35 T2 FELOCELL 4 SC/SC 9 44 12 3 38 T3 FELOCELL 4 SC/Oral 10 10 5 5 0 30 FELOCELL 4 T4 SC/SC 10 0 1 ,5 0 13 + FCV-21 FELOCELL 4 T5 SC/Oral 10 0 3,5 0 13 + FCV-21 FELOCELL T6 SC/SC 10 0 2,5 0 11 4A FELOCELL T7 SC/Oral 10 10 5 1 22 4A FELOCELL T8 Oral/Oral 10 0 3 0 10 4A FELOCELL 3 T9 SC/SC 10 0 2 0 8 + FCV-21 FELOCELL 3 T10 SC/Oral 10 0 4 0 10 + FCV-21 FELOCELL T11 Oral/Oral 10 0 5 1 18 3A FELOCELL 4A: FELOCELL 4 sin FCV-F9, pero con FCV-21 FELOCELL 3A: FELOCELL 3 sin FCV-F9, pero con FCV-21 EJEMPLO 2-8 Mortalidad y valores clínicos para gatos vacunados con tres dosis de componentes de FELOCELL® 4 y FCV-21 vivo modificado A gatos domésticos de pelo corto, de aproximadamente 8 semanas de edad, se les administraron vacunas que contenían virus de la rinotraqueítis felina vivo modificado (FHV), virus de la panleucopenia (FP), Chlamydia psittaci y (1) FCV-F9 (FELOCELL® 4), (2) FCV-F9 y FCV-21 (FELOCELL® 4A) o (3) FCV-21 (FELOCELL® 4B). En cada caso, a los gatos se les administró una vacunación subcutánea inicial seguida de administraciones orales sucesivas en los dias 21 y 42 (SC/Oral/Oral). Cada gato en los diferentes regímenes de dosificación (grupos T1 a T4, 10 gatos por grupo) recibió 1 ml de vacuna. La vacunación oral se consiguió mediante la administración de la vacuna dentro de la boca. En el día 63, todos los gatos se expusieron con aproximadamente 1 ml de FCV-33585 sistémico virulento (3 log de TCID5o/ml). Durante 14 días después de la exposición, todos los gatos se controlaron para síntomas clínicos de enfermedad como en el EJEMPLO 2-7. Los gatos que mostraron síntomas clínicos graves después de la exposición que eran consecuentes con patogénesis por calicivirus se sacrificaron. Como se muestra en el CUADRO 2-9, la eficacia del régimen de dosis triple, según lo medido mediante mortalidad y valores clínicos después de la exposición, es comparable a la eficacia del régimen de dosis doble descrito en el EJEMPLO 2-7.

CUADRO 2-9 Mortalidad de gatos expuestos con fcv-33585 virulento después de vacunación de tres dosis con fcv-f9 y/o fcv-f21 (ejemplo 2-8) CUADRO 2-9 Vacunación Exposición Valor clínico Grupo N° Tratamiento Vía Mortalidad Mediano Min Máx Animales T1 Control SC/Oral/Oral 10 100% 25 21 31 Felocell 4 T2 SC/Oral/Oral 10 0% 5 5 0 17 FCV-21 T3 Felocell 4A SC/Oral/Oral 9 0% 4 0 10 T4 Felocell 4 SC/Oral/Oral 10 30% 10 5 1 30 FELOCELL 4A FELOCELL 4 sin FCV-F9, pero con FCV-21 EJEMPLO 2-9 Análisis de neutralización cruzada de sueros de gatos vacunados con componentes de FELOCELL 4 con y sin FCV-21 Se recogieron muestras de suero de cada gato en el estudio descrito en el EJEMPLO 2-7 después de la segunda vacunación, pero antes de la exposición. Las muestras se trataron con calor a 56°C durante 30 minutos, y se evaluaron en el ensayo de neutralización de suero contra cada una de las 26 cepas de FCV como se ha descrito previamente en el EJEMPLO 1-10 (CUADRO 1-6). Los datos de neutralización de suero se analizaron con títulos de puntos de corte de >23 y >15, y se calculó una media de los dos títulos de puntos de corte (Med.). Los resultados se muestran en el CUADRO 2-10. Los datos indican que el perfil de neutralización cruzada de FELOCELL 4 (que contiene FCV-F9) permanece constante independientemente de si la via de administración es SC/SC o SC/Oral. Sin embargo, con la adición de FCV-21 , el perfil de neutralización cruzada se potencia mucho cuando la vacuna se administra por SC/SC o SC/Oral. Además, para FELOCELL 4A (que contiene FCV-21 , pero no FCV-F9), el perfil de neutralización cruzada se potencia para las vías de vacunación SC/SC, SC/Oral e incluso Oral/Oral. o -o *FELOCELL 4A: FELOCELL 4 sin FCV-F9, pero con FCV-21 "FELOCELL 3A: FELOCELL 3 sin FCV-F9, pero con FCV-21 En el CUADRO 2-11, los regímenes de vacunación evaluados incluyeron una vacunación inicial subcutánea seguida de dos inmunizaciones de refuerzo orales en el día 21 y en el día 42 (SC/Oral/Oral). Los resultados indican que la adición de FCV-21 , con o sin FCV-F9 en FELOCELL 4, dieron como resultado perfiles de neutralización cruzada significativamente más amplios (un aumento de aproximadamente el 40%). o *FELOCELL 4A: FELOCELL 4 sin FCV-F9, pero con FCV-21 También se describe el descubrimiento de que con las vacunas descritas en este documento como péptidos, proteínas y ADN relacionadas con cepas de FCV FCV-21 , FCV-49 y FCV-26391-4, la administración oral u oronasal (ON) puede realizarse en el primer momento seguido de una segunda administración oral u oronasal sin los efectos secundarios previamente descritos mencionados anteriormente en el EJEMPLO 2-4 y en la CUADRO 2-5 Se debe observar que, como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, los artículos singulares tales como "un", "uno", y "el", pueden referirse a un objeto o a una pluralidad de objetos a menos que el contexto indique claramente otra cosa. De esta forma, por ejemplo, la referencia a una composición que contiene "un compuesto" puede incluir un único compuesto o dos o más compuestos. Se entenderá que los ejemplos y descripciones anteriores pretenden ser ilustrativos y no restrictivos. Muchas realizaciones serán evidentes para los especialistas en la técnica después de leer la descripción anterior. El alcance de la invención debe determinarse, por lo tanto, con respecto a las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance completo de equivalentes a los que tales reivindicaciones hacen referencia. Las descripciones de todos los articulos y referencias, incluyendo patentes, solicitudes de patente y publicaciones, se incorporan en este documento como referencia en su totalidad y para todos los propósitos.

En los CUADROS 2-1 hasta la 2-9, Felocell® 4, Felocell 4, o FELOCELL 4, o estas palabras seguidas por el número "3" son vacunas donde cualquier variación del nombre Felocell es propiedad de Pfizer. La referencia a Felocell 4 A es Felocell 4 sin FCV-F9, la referencia a Felocell 3 A es Felocell 3 sin FCV-F9. Nota, los verdaderos antígenos usados en este estudio no procedieron del producto comercial sino que los antígenos se prepararon en pequeños lotes sólo para fines de investigación, pero de la misma manera que el producto comercial. Todas las composiciones y/o procedimientos descritos y reivindicados en este documento pueden realizarse y ejecutarse sin experimentación excesiva a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y procedimientos de esta invención se han descrito en cuanto a realizaciones preferidas, será evidente para los especialistas en la técnica que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y/o procedimientos y en las etapas o en la secuencia de etapas del procedimiento descrito en este documento sin alejarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que los agentes descritos en este documento pueden sustituirse por ciertos agentes que están tanto química como fisiológicamente relacionados mientras se consigan los mismos o similares resultados. Dichos sustitutos similares y modificaciones evidentes para los especialistas en la técnica se consideran dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Descripción Numerada de la Invención. Descripciones y ejemplos adicionales. 1. Un procedimiento para inmunizar gatos contra calicivirus felino (FCV), comprendiendo el procedimiento administrar a un gato cantidades terapéuticamente eficaces de primera y segunda vacunas, en el que la primera y segunda vacuna se adaptan para inducir una respuesta inmune en el gato contra FCV, la primera vacuna se administra por vía parenteral, y la segunda vacuna se administra por via oral u oronasal, y la segunda vacuna se administra N días después de la administración de la primera vacuna, en la que N es un número entero de 3 a 120 días, ambos inclusive, también se describe N de aproximadamente 3 semanas y aproximadamente 2-4 semanas. 2. El procedimiento de la reivindicación 1 , en el que las vacunas comprenden independientemente una vacuna de virus vivo, una vacuna de virus vivo modificado, una vacuna de virus inactivado, una vacuna recombinante, una vacuna de ADN, o una vacuna de antígeno de subunidad, sola o en combinación. 3. El procedimiento de la reivindicación 1 , en el que al menos una de las vacunas incluye una o más cepas de FCV. 4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dichas una o más cepas de FCV comprenden F9 o FCV-21 o F9 y FCV-21. 5. El procedimiento de la reivindicación 1 , en el que las vacunas son iguales. 6. El procedimiento de la reivindicación 1 , en el que al menos una de las vacunas también se adapta para inducir una respuesta inmune contra uno o más patógenos seleccionados entre herpesvirus felino, virus de la leucemia felina, virus de inmunodeficiencia felina, virus de panleucopenia felina y Chlamydia felina. 7.

El procedimiento de la reivindicación 1 , en el que la primera vacuna se administra por vía subcutánea. 8. El procedimiento de la reivindicación 1 , en el que la segunda vacuna se administra por vía peroral o por vía oronasal. 9. El procedimiento de la reivindicación 1 , en el que la segunda vacuna o una vacuna posterior se administra después de que el gato haya desarrollado un titulo de neutralización de suero de FCV de aproximadamente 1 :6 o mayor. 10. Un procedimiento como en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además administrar al gato una cantidad terapéuticamente eficaz de una tercera vacuna, en el que la tercera vacuna se adapta para inducir una respuesta inmune en el gato contra FCV y se administra por via parenteral, por vía oral, o por vía oronasal M días después de la administración de la primera o segunda vacuna, donde M es un número entero de 1 a 120 días, ambos inclusive. 11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la tercera vacuna se administra por vía subcutánea. 12. Un procedimiento para inmunizar gatos contra calicivirus felino (FCV), comprendiendo el procedimiento administrar a un gato cantidades terapéuticamente eficaces de primera y segunda vacunas, en el que la primera y segunda vacunas se adaptan para inducir una respuesta inmune en el gato contra FCV, en el que la primera vacuna se administra por vía oral o por vía oronasal, y la segunda vacuna se administra por vía oral o por vía oronasal, y la segunda vacuna se administra N dias después de la administración de la primera vacuna, donde N es un número entero de 3 a 120 días, ambos inclusive, también se especifica N de aproximadamente 3 semanas y aproximadamente 2-4 semanas. 13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la cepa de FCV se selecciona entre el grupo constituido por FCV-21 , FCV-49, FCV 26391-4. 14. Un procedimiento para inmunizar animales que comprende administrar a un animal una cantidad terapéuticamente eficaz de una primera y segunda vacunas, con una tercera vacuna opcional, en el que la primera, la segunda y la tercera vacuna opcional se adaptan para inducir una respuesta inmune y la primera vacuna se administra por vía parenteral o por vía oral, la segunda vacuna se administra por vía oral o por vía oronasal, y la segunda y tercera vacuna opcional se administran N días después de la administración de la primera vacuna, donde N es un número entero de 3 a 120 dias, ambos inclusive, también se especifica N de aproximadamente 3 semanas y aproximadamente 2-4 semanas y el procedimiento puede incluir administraciones de refuerzo anuales opcionales de la vacuna, incluyendo un periodo M de aproximadamente un año.

Parte 3 Esta parte proporciona procedimientos y composiciones para inmunizar animales contra parvovirus felino (FPV) y herpesvirus felino (FHV). En este documento se describen procedimientos y materiales para tratar e inmunizar animales con vacuna, y en particular gatos contra enfermedades respiratorias felinas causadas por calicivirus felino (FCV), panleucopenia felina causada por Parvovírus Felino (FPV), rinotraqueítís viral felina causada por herpesvirus felino (FHV), que también se ha denominado virus de la rinotraqueítis felina. A continuación se describen nuevas combinaciones de vacunas, que cuando se presentan a un felino de la manera descrita permiten suministros eficaces orales únicos y orales/orales y subcutáneos/orales de vacunas tanto contra FPV como contra FHV. Oral único significa un único suministro oral que confiere protección eficaz a un animal vacunado. Por oral/oral se entiende un suministro oral dado dos veces, similar a la descripción anterior en la Parte 2, es decir, oral seguido por algún periodo de tiempo y después se da otra dosis mediante la vía oral, y sube/oral es una prímera dosis dada por vía subcutánea seguida por un periodo de tiempo y después se da otra dosis mediante la vía oral. Lo que se describe en este documento es el suministro de la combinación de FPV vivo modificado y/o FHV vivo modificado en combinación con una vacuna de Chlamydia vivo modificado, o cualquier componente de la vacuna de Chlamydia vivo modificado, por ejemplo, medio de cultivo, lisado de células o células enteras, o cualquier componente del propio Chlamydia. Chlamydia también se denomina como Chlamydia Felino, o Chlamydia psittaci Felino o FCp. Cuando se da FPV vivo modificado solo o en combinación con FCV vivo modificado, o vacunas de FHV vivo modificado, el FPV no es eficaz cuando se suministra de manera oral/oral, y muestra un título de neutralización de suero disminuido con la vía de administración SC/oral. De forma similar, cuando FHV vivo modificado se da solo o en combinación con FCV vivo modificado, o con vacuna de FPV vivo modificado, el FHV no es eficaz cuando se suministra de manera oral/oral, y muestra una eficacia disminuida con la vía de administración SC/oral. Sólo cuando FPV y/o FHV se dan en combinación con una vacuna de Chlamydia vivo modificado, se proporciona una protección adecuada contra FPV y/o FHV, cuando el suministro de las vacunas de combinación es a través de una via sube/oral u oral/oral. De acuerdo con lo anterior, se proporcionan los siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos pretender ser ilustrativos y no limitantes, y representan algunas realizaciones específicas de la presente invención.

EJEMPLO 3-1 (teórico). RÉGIMEN DE VACUNACIÓN SUBC/ORAL CON FPV Y CHLAMYDIA. FPV y Chlamydia (o cualquier componente de vacuna de Chlamydia vivo modificado) se proporciona en una vacuna de combinación con o sin otros componentes. Las vacunas vivas modificadas pueden suministrarse por via subcutánea/oral.

EJEMPLO 3-2 (teórico). RÉGIMEN DE VACUNACIÓN ORAL/ORAL CON FPV Y CHLAMYDIA. FPV y Chlamydia (o cualquier componente de vacuna de Chlamydia vivo modificado) se proporcionan en una vacuna de combinación con o sin otros componentes. Las vacunas vivas modificadas pueden suministrarse por via oral/oral.

EJEMPLO 3-3 (teórico). RÉGIMEN DE VACUNACIÓN SUBC/ORAL CON FPV, FHV Y CHLAMYDIA. FPV, FHV y Chlamydia (o cualquier componente de vacuna de Chlamydia vivo modificado) se proporcionan en una vacuna de combinación con o sin otros componentes. Las vacunas vivas modificadas pueden suministrarse por vía subcutánea/oral.

EJEMPLO 3-4 (teórico). RÉGIMEN DE VACUNACIÓN ORAL/ORAL CON FPV, FHV Y CHLAMYDIA. FPV, FHV y Chlamydia (o cualquier componente de vacuna de Chlamydia vivo modificado) se proporcionan en una vacuna de combinación con o sin otros componentes. Las vacunas vivas modificadas pueden suministrarse por vía oral/oral.

EJEMPLO 3-5 (real). RÉGIMEN DE VACUNACIÓN SUBC/ORAL CON FPV, FHV, FCV Y CHLAMYDIA. FPV, FHV, FCV y Chlamydia (o cualquier componente de vacuna de Chlamydia vivo modificado) se proporcionan en una vacuna de combinación con o sin otros componentes. Las vacunas vivas modificadas pueden suministrarse por via oral/oral (Cuadro 3-1).

EJEMPLO 3-6 (real). RÉGIMEN DE VACUNACIÓN ORAL/ORAL CON FPV, FHV, FCV Y CHLAMYDIA. FPV, FHV, FCV y Chlamydia (o cualquier componente de vacuna de Chlamydia vivo modificado) se proporcionan en una vacuna de combinación con o sin otros componentes. Las vacunas vivas modificadas pueden suministrarse por vía oral/oral. Véase el Cuadro 3-1. Se vacunaron gatos domésticos de pelo corto, de aproximadamente 8 semanas de edad, con componentes de FELOCELL 4A y 3A que contienen virus de rinotraqueitis felina vivo modificado [FHV], calicivirus [FCV-21], virus de panleucopenia [FPV] y Chlamydia psittaci [FCp]. Los regímenes de vacunación evaluados incluían: una vacunación inicial subcutánea seguida de refuerzos subcutáneos en los días 21 , (SC/SC); una vacunación inicial subcutánea seguida de una inmunización de refuerzo oral en el día 21 (SC/Oral); o una vacunación inicial oral seguida de una segunda vacunación oral en el día 21. La vacunación oral se consiguió mediante la administración de la vacuna en la boca. Las muestras de suero de cada gato se recogieron después de la segunda vacunación, y se trataron con calor a 56°C durante 30 minutos. Las muestras se evaluaron en el ensayo de neutralización de suero contra FPV.

FELOCELL 4A: FPV/FHV/FCV-21/ FCp FELOCELL 3A: FPV/FHV/FCV-21 Los resultados del CUADRO 3-1 sugieren que los gatos respondieron mínimamente al antígeno FPV, como se había indicado previamente en la bibliografía. (Absence of an immune response after oral administration of attenuated feline panleukopenia virus. Schults RD, Scott FW, Infect Immun. 1973, 7 de abril (4): 547-9). Con la presencia de Chlamydia, sin embargo, o cualquier componente asociado con una vacuna de Chlamydia, los títulos de neutralización de suero de FPV fueron mucho más altos, sugiriendo eficacia in vivo contra la exposición a FPV. Además, se ha observado inmunogenicidad contra FPV potenciada no solamente con SC/SC, SC/Oral, sino también con un grupo Oral/Oral.

EJEMPLO 3-7 (real). RÉGIMEN DE VACUNACIÓN ORAL/ORAL CON FPV, FHV, FCV. FPV, FHV, y FCV se proporcionan en una vacuna de combinación con o sin otros componentes. Las vacunas vivas modificadas pueden suministrarse por vía oral/oral. Véase el Cuadro 3-2. Se vacunaron gatos domésticos de pelo corto, de aproximadamente 8 semanas de edad, con FELOCELL 3A que contiene virus de rinotraqueitis felina vivo modificado [FHV], calicivirus [FCV-21], y virus de panleucopenia [FPV]. Los regímenes de vacunación evaluados incluían: una vacunación inicial subcutánea seguida de refuerzos subcutáneos en los días 21, (SC/SC); una vacunación inicial subcutánea seguida de una inmunización de refuerzo oral en el día 21 (SC/Oral); o una vacunación inicial oral seguida de una segunda vacunación oral en el día 21. La vacunación oral se consiguió mediante la administración de la vacuna en la boca. Se recogieron muestras de suero de cada gato después de la primera y segunda vacunación, y se trataron con calor a 56°C durante 30 minutos. Las muestras se analizaron en el ensayo de neutralización de suero contra FPV.

Los resultados del CUADRO 3-2 sugieren que el antígeno FPV presente en la vacuna FELOCELL 3A indujo una respuesta inmune mínima cuando se dio por vía Ora/Oral (coherente con los resultados del CUADRO 3- 1). Sin embargo, cuando las vacunas se dieron por via SC/SC o SC/Oral, se observaron títulos de neutralización de suero de FPV altos, un indicio de eficacia in vivo.

DESCRIPCIÓN NUMERADA DE LA INVENCIÓN 1. Una composición inmunogénica que comprende tanto FPV vivo modificado como Chlamydia vivo modificado administrados en una única dosificación de administración. 2. Una vacuna, que comprende FPV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado suministrada a un felino en dos dosificaciones de administración única separadas, las dosificaciones de administración única se suministran ambas por vías oral u oronasal, y están separadas en el tiempo por un periodo de 3 a 120 días, o aproximadamente 3 semanas, o aproximadamente 2 semanas. 3. Un procedimiento para inmunizar gatos contra FPV, comprendiendo el procedimiento administrar a un gato cantidades terapéuticamente eficaces de primera y segunda vacunas, en el que la primera y segunda vacuna se adaptan para inducir una respuesta inmune en el gato contra FPV, la primera vacuna se administra por vía oral o por vía oronasal y la segunda vacuna se administra por vía oral o por vía oronasal, la segunda vacuna se administra N días después de la administración de la primera vacuna, donde N es un número entero de 3 a 120, ambos incluidos, o donde N es aproximadamente 3 semanas o donde N es aproximadamente 2 semanas, en el que dicha primera y segunda vacuna comprenden tanto FPV vivo modificado como Chlamydia vivo modificado. 4. Una composición inmunogénica, que comprende tanto FHV vivo modificado como Chlamydia vivo modificado administrada en una dosificación de administración única. 5. Una vacuna, que comprende FHV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado, suministrada a un felino en dos dosificaciones de administración única separadas, las dosificaciones de administración única se suministran ambas por las vias oral u oronasal y están separadas en el tiempo por un periodo de 3 a 120 días, o aproximadamente 3 semanas o aproximadamente 2 semanas. 6. Un procedimiento para inmunizar gatos contra FHV, comprendiendo el procedimiento administrar a un gato cantidades terapéuticamente eficaces de primera y segunda vacunas, en el que la primera y segunda vacuna se adaptan para inducir una respuesta inmune en el gato contra FHV, la primera vacuna se administra por vía oral o por via oronasal y la segunda vacuna se administra por vía oral o por vía oronasal, la segunda vacuna se administra N días después de la administración de la primera vacuna, donde N es un número entero de 3 a 120, ambos incluidos, o donde N es aproximadamente 3 semanas o donde N es aproximadamente 2 semanas, en el que dicha primera y segunda vacuna comprenden tanto FHV vivo modificado como Chlamydia vivo modificado. 7. Una composición inmunogénica, que comprende tanto FCV vivo modificado como Chlamydia vivo modificado administrada en una única dosificación de administración. 8. Una vacuna, que comprende FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado, suministrada a un felino en dos dosificaciones de administración única separadas, las dosificaciones de administración única se suministran ambas por las vías oral u oronasal y están separadas en el tiempo por un período de 3 a 120 días, o aproximadamente 3 semanas o aproximadamente 2 semanas. 9. Un procedimiento para inmunizar gatos contra FCV, comprendiendo el procedimiento administrar a un gato cantidades terapéuticamente eficaces de primera y segunda vacunas, en el que la primera y segunda vacunas se adaptan para inducir una respuesta inmune en el gato contra FCV, la primera vacuna se administra por via oral o por vía oronasal y la segunda vacuna se administra por vía oral o por via oronasal, la segunda vacuna se administra N días después de la administración de la primera vacuna, donde ?/ es un número entero de 3 a 120, ambos incluidos, o donde N es aproximadamente 3 semanas o donde N es aproximadamente 2 semanas, en el que dicha primera y segunda vacuna comprenden tanto FCV vivo modificado como Chlamydia vivo modificado. 10. Una composición inmunogéníca, que comprende FPV vivo modificado, FHV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado administrada en una dosificación de administración única. 11. Una vacuna, que comprende FPV vivo modificado, FHV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado, suministrada a un felino en dos dosificaciones de administración única separadas, las dosificaciones de administración única se suministran ambas por las vias oral u oronasal y están separadas en el tiempo por un periodo de 3 a 120 dias, o aproximadamente 3 semanas o aproximadamente 2 semanas. 12. Un procedimiento para inmunizar simultáneamente gatos contra FPV y FHV, comprendiendo el procedimiento administrar a un gato cantidades terapéuticamente eficaces de primera y segunda vacunas, en el que la primera y segunda vacuna se adaptan para inducir una respuesta inmune en el gato contra FPV y FHV, la primera vacuna se administra por via oral o por vía oronasal y la segunda vacuna se administra por vía oral o por via oronasal, la segunda vacuna se administra N días después de la administración de la primera vacuna, donde N es un número entero de 3 a 120, ambos incluidos, o donde N es aproximadamente 3 semanas o donde N es aproximadamente 2 semanas, en el que dicha primera y segunda vacuna están comprendidas por FPV vivo modificado, FHV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado. 13. Una composición inmunogénica, que comprende FPV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado administrada en una dosificación de administración única. 14. Una vacuna, que comprende FPV vivo modificado, FCV vivo modificado, y Chlamydia vivo modificado, suministrada a un felino en dos dosificaciones de administración única separadas, las dosificaciones de administración única se suministran ambas por las vías oral u oronasal y están separadas en el tiempo por un periodo de 3 a 120 días, o aproximadamente 3 semanas o aproximadamente 2 semanas. 15. Un procedimiento para inmunizar simultáneamente gatos contra FPV y FCV, comprendiendo el procedimiento administrar a un gato cantidades terapéuticamente eficaces de primera y segunda vacunas, en el que la primera y segunda vacunas se adaptan para inducir una respuesta inmune en el gato contra FPV y FHV, la primera vacuna se administra por vía oral o por vía oronasal y la segunda vacuna se administra por vía oral o por vía oronasal, la segunda vacuna se administra N días después de la administración de la primera vacuna, donde N es un número entero de 3 a 120, ambos inclusive o donde N es aproximadamente 3 semanas o donde N es aproximadamente 2 semanas, en el que dicha primera y segunda vacunas comprenden FPV vivo modificado, FHV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado. 16. Una composición inmunogénica, que comprende FHV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado administrada en una dosificación de administración única. 17. Una vacuna, que comprende FHV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado, suministrada a un felino en dos dosificaciones de administración única separadas, las dosificaciones de administración única se suministran ambas por las vías oral u oronasal y están separadas en el tiempo por un periodo de 3 a 120 días, o aproximadamente 3 semanas o aproximadamente 2 semanas. 18. Un procedimiento para inmunizar simultáneamente gatos contra FHV y FCV, comprendiendo el procedimiento administrar a un gato cantidades terapéuticamente eficaces de primera y segunda vacunas, en el que la primera y segunda vacuna se adaptan para inducir una respuesta inmune en el gato contra FHV y FCV, la primera vacuna se administra por via oral o por vía oronasal y la segunda vacuna se administra por vía oral o por vía oronasal, la segunda vacuna se administra N días después de la administración de la primera vacuna, donde N es un número entero de 3 a 120, ambos incluidos, o donde N es aproximadamente 3 semanas o donde N es aproximadamente 2 semanas, en el que dicha prímera y segunda vacuna comprenden FHV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado. 19. Una composición inmunogénica, que comprende FPV vivo modificado, FHV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado administrada en una dosificación de administración única. 20. Una vacuna, que comprende FPV vivo modificado, FHV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado, suministrada a un felino en dos dosificaciones de administración única separadas, las dosificaciones de administración única se suministran ambas por las vias oral u oronasal y están separadas en el tiempo por un periodo de 3 a 120 días, o aproximadamente 3 semanas o aproximadamente 2 semanas. 21. Un procedimiento para inmunizar simultáneamente gatos contra FPV, FHV y FCV, comprendiendo el procedimiento administrar a un gato cantidades terapéuticamente eficaces de primera y segunda vacunas, en el que la primera y segunda vacunas se adaptan para inducir una respuesta inmune en el gato contra FPV, la primera vacuna se administra por vía oral o por vía oronasal y la segunda vacuna se administra por vía oral o por vía oronasal, la segunda vacuna se administra N dias después de la administración de la primera vacuna, donde N es un número entero de 1 a 120, ambos incluidos, o donde N es aproximadamente 3 semanas o donde N es aproximadamente 2 semanas, en el que dicha primera y segunda vacuna comprende FPV vivo modificado, FHV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado.

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una vacuna para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende una proteína de la cápsida de FCV-21 o una proteína de la cápsida de FCV-21 aislada.

2. Una vacuna para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende una proteína de la cápsida de FCV-21 o una proteína de la cápsida de FCV-21 aislada, en la que dicha proteína de la cápsida comprende la secuencia de proteína (SEC ID N°: 13) y secuencias que tienen al menos aproximadamente 91.2%, 95% y 99% de identidad; en la que dicha proteína de la cápsida se proporciona en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmune, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. Una vacuna de ADN para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican una proteina de la cápsida de FCV-21 o una proteína de la cápsida de FCV-21 aislada, en la que dicho ADN comprende una secuencia (SEC ID N°: 12) y secuencias que tienen al menos aproximadamente 78.7%, y 79.2% de identidad de secuencia y que permiten sustituciones conservativas.

4. Una vacuna para inmunizar gatos contra calicívirus felino que comprende una proteína de la cápsida de FCV-49 o una proteína de la cápsida de FCV-49 aislada, en la que dicha proteína de la cápsida comprende una secuencia de proteína de la cepa FCV-49.

5. Una vacuna para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende una proteína de la cápsida de FCV-49 o una proteína de la cápsida de FCV-49 aislada, en la que dicha proteína de la cápsida comprende la secuencia de proteina (SEC ID N°: 15) y secuencias que tienen al menos aproximadamente 92.7%, 95% y 99% de identidad; en la que dicha proteína de la cápsida se proporciona en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmune, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Una vacuna de ADN para inmunizar gatos contra calicivirus felino que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de la cápsida de FCV-49 o una proteína de la cápsida de FCV-49 aislada, en la que dicho ADN comprende una secuencia (SEC ID N°: 14) y secuencias que tienen al menos aproximadamente 78.9%, en concreto 79.4% (78.9 + 0.5) de identidad de secuencia y que permiten sustituciones conservativas.

7. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada además porque comprende además solo o en cualquier combinación lo siguiente: cuando contiene un adyuvante, en el que el componente de FCV está vivo, en el que el componente de FCV está atenuado, en el que el componente de FCV está inactivado, que puede incluir al menos una cepa de calicivirus felino diferente seleccionada entre el grupo constituido por FCV-F9, FCV-LLK, FCV-M8, FCV-255, y FCV-2280.

8. Una composición inmunogénica, que comprende tanto FPV vivo modificado como Chlamydia vivo modificado, y o que comprende tanto FHV vivo modificado como Chlamydia vivo modificado y o que comprende tanto FCV vivo modificado como Chlamydia vivo modificado y o que comprende FPV vivo modificado, FHV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado y o que comprende FPV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado y o que comprende FHV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado y o que comprende FPV vivo modificado, FHV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado administrada en una única dosis de administración.

9. Una vacuna que comprende tanto FPV vivo modificado como Chlamydia vivo modificado, y o que comprende tanto FHV vivo modificado como Chlamydia vivo modificado y o que comprende tanto FCV vivo modificado como Chlamydia vivo modificado y o que comprende FPV vivo modificado, FHV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado y o que comprende FPV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado y o que comprende FHV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado y o que comprende FPV vivo modificado, FHV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado adminsitrada a un felino en dos dosificaciones administrativas únicas por separado, las dosificaciones administrativas únicas administradas ambas por las vías oral u oral-nasal y separadas en el tiempo por un periodo de 3 a 120 días.

10. El uso de una composición: a) que comprende tanto FPV vivo modificado como Chlamydia vivo modificado; y o b) que comprende tanto FHV vivo modificado como Chlamydia vivo modificado; y o c) que comprende tanto FCV vivo modificado como Chlamydia vivo modificado; y o d) que comprende FPV vivo modificado, FHV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado; y o e) que comprende FPV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado; y o f) que comprende FHV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado; y o g) que comprende FPV vivo modificado, FHV vivo modificado, FCV vivo modificado y Chlamydia vivo modificado, o cualquier combinación de los mismos, para preparar una primera y una segunda vacuna útil para inmunizar gatos contra FPV, FCV y o FHV, en el que las primera y segunda vacunas se adaptan para inducir una respuesta inmune en el gato contra FPV, y o FCV y o FHV, la primera vacuna está adaptada para ser administrable por vía oral u oronasal y la segunda vacuna es administrable por vía oral u oronasal, la segunda vacuna está adaptada para ser administrable N días tras la administración de la primera vacuna, donde N es un número entero de 3 a 120, ambos inclusive. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una vacuna para inmunizar un gato contra virus felinos. La presente invención también se refiere a un clon de ácido nucleico que codifica la proteína de la cápsida del calicivirus felino aislado. La presente invención además se refiere a una vacuna viva o muerta, que comprende el calicivirus felino aislado, una vacuna de subunidad que comprende la proteina de la cápsida del calicivirus felino aislado, una vacuna de ácido nucleico que comprende un clon de ácido nucleico del calicivirus felino aislado, y una vacuna de vector de virus recombinante que comprende ácido nucleico que codifica la proteína de la cápsida del calicivirus felino aislado. La presente invención también se refiere a un procedimiento para identificar un calicivirus felino útil para producir una composición de vacuna y para ensayos para diagnosticar gatos infectados con calicivirus felino. También se describe un procedimiento para inmunizar animales, especialmente gatos, contra una enfermedad, en particular contra calicivirus felino (FCV). El procedimiento incluye administrar a un gato cantidades terapéuticamente eficaces de primera y segunda vacunas de FCV. La primera vacuna se administra por vía oral o parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, por vía intramuscular, y similares). La segunda vacuna se administra por vía oral u oronasal N días después de la administración de la primera vacuna, en el que N es un número entero de 3 a 120, ambos inclusive. También puede darse una tercera administración de vacuna. La presente invención también describe procedimientos y materiales para tratar e inmunizar animales con vacuna, y en particular gatos contra FPV o Parvovirus Felino, que también se denomina Panleucopenia o FPL y contra otra enfermedad, FHV o Herpesvirus Felino, que también se denomina Virus de la Rinotraqueitis Felina. PFIZER P07/2364F