MX2008000374A

MX2008000374A - Amilasa modificada de pseudomonas saccharophilia.

Info

Publication number: MX2008000374A
Application number: MX2008000374A
Authority: MX
Inventors: Karsten Matthias Kragh; Bo Spange Sorensen; Casper Tune Berg; Carol Fioresi; Gijsbert Gerritse; Wei Liu; Andrew Shaw; Charlotte Refdahl Thoudahl; Patrick Maria Franciscus Derkx; Anja Hemmingen Kellet-Smith
Original assignee: Danisco
Priority date: 2005-07-07
Filing date: 2006-07-07
Publication date: 2008-03-07
Also published as: AU2006268418A1; RU2008104637A; WO2007007053A1; JP2008544751A; KR20080023746A; CN101238210A; US20080292747A1; BRPI0612288A2; EP1907538A1; US20070141693A1; CA2614274A1

Abstract

Los inventores de la presente describen un polipeptido de variante de PS4 derivable de un polipeptido progenitor que tiene actividad de amilasa seleccionada del grupo que consiste de: (a) un polipeptido que comprende una mutacion de aminoacido en cada una de las posiciones 33, 34, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307, 309 y 334; (b) un polipeptido que comprende una mutacion de aminoacido en cada una de las posiciones 33, 34, 121, 134, 141, 145, 146, 157, 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307 y 334; (c) un polipeptido que comprende una mutacion de aminoacido en cada una de las posiciones 33, 34, 121, 134, 141, 146, 157, 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307, 309 y 334; y (d) un polipeptido que comprende una mutacion de aminoacido en cada una de las posiciones 3, 33, 34, 70, 121, 134, 141, 146, 157, 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307, 309 y 334; con referencia a la numeracion de posicion de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1, usos de dicho polipeptido como un alimento o aditivo de alimento, y acidos nucleicos que codifican el mismo.

Description

A ILASA MODgFnCAOA DE PSEUDTMONAS SACCNAROPHBUA SQL TUDES RELACIONADAS Se hace referencia a las solicitudes provisionales de E.U.A. con números de serie 60/485,413, 60/485,539 y 60/485,616 presentadas el 7 de julio de 2003. También se hace referencia a las solicitudes iníernacionales PCT/US2004/021723 y PCT/US2004/021739 presentadas el 7 de julio de 2004 y que designa a E.U.A. (solicitante: Genencor International, Inc). También se hace referencia a las solicitudes de utilidad de E.U.A. con números de serie 10/886,905 y 10/866,903 todas las cuales se presentaron el 7 de julio de 2004. También se hace referencia a la solicitud provisional de E.U.A. con número de serie 60/608,919 (presentada como soliciíud de uíilidad de E.U.A. con número de serie 10/887,056 el 7 de julio de 2004 pero convertida a una soliciíud provisional el 15 de sepliembre de 2004). También se hace referencia a la soliciíud provisional de E.U.A. con número de serie 60/612,407 que se presentó el 22 de sepíiembre de 2004. Además se hace referencia a la solicitud de E.U.A. con número de serie 60/485,539 presentada el 7 de julio de 2003. También se hace referencia a la solicitud internacional PCT/IB2004/002487 presentada el 7 de julio de 2004 y que designa a E.U.A. (solicitante: Danisco A/S). También se hace referencia a la solicitud de utilidad de E.U.A. con número de serie 10/886,023 presentada el 7 de julio de 2004. También se hace referencia a las solicitudes de utilidad de E.U.A. con números de serie 10/886,505, 10/886,527 Y 10/886,504, íodas las cuales se preseníaron el 7 de julio de 7, 2004. También se hace referencia a la solicitud de utilidad de E.U.A. con número de serie 10/947,612 presentada el 22 de septiembre de 2004. También se hace referencia a la soliciíud de patente internacional con número de serie PCT/GB2005/002675 presentada el 7 de julio de 2005 y que designa a E.U.A. (solícitaníes: Danisco A S y Genencor International, Inc, D Young & Co Attorney Reference: P020161WO). También se hace referencia a la solicitud provisional de E.U.A. con número de serie 60/697,302 presentada el 7 de julio de 2005. Las solicitudes anteriores, y cada documenío iado o referenciado en cada una de las presentes y anteriores solicitudes, incluyendo durante el proceso de cada una de las solicitudes aníeriores ("solicitud y documenfos diados en artículos"), y cualesquiera instrucciones del fabricante o catálogos para cualesquiera productos citados o mencionados en cada una de las solicitudes anteriores y artículos y en cualquiera de los documentos citados de solicitud y artículos, por lo tanto se incorporan aquí por referencia. Además, lodos los documentos citados en este texto y todos los documentos citados o referenciados en documentos citados en este texto, y cualesquiera instrucciones del fabricante o catálogos para cualesquiera productos citados o mencionados en este texto o en cualquier documento incorporado por lo íanío en este texto, se incorporan aquí por referencia. Los documentos incorporados por referencia en este texío o cualesquiera enseñanzas en los mismos se pueden usar en la prácíica de esta invención. Los documentos incorporados por referencia en este lexto no se admiten como técnica anterior.

CAMPO DE LA I VENCSOW Esta invención se refiere a polipéptidos, específicamente polipéptidos de amílasa y ácidos nucleicos que codifican éstos, y sus usos como exoamilasas no maltogénicas en la producción de producios alimeníícios. Las amilasas de la presente invención se han manipulado por ingeniería genética para tener más cualidades benéficas. De manera específica, las amilasas de la presente invención muestran una especificidad alterada y/o íermoesíabilidad alíerada. En particular, los polipéptidos se derivan de polipépíidos que íienen actividad de exoamilasa no maltogénica, en particular, aclividad de glucano 1 ,4-alfa-maltoteírahidrolasa (EC 3.2.1.60).

ECEDENTES DE Las amílasas mejoradas pueden superar los problemas inherenles en ciertos procedimientos, tales como horneado. La cristalización de amilopectina tiene lugar en granulos de almidón días después del horneado, lo que conduce a firmeza incrementada del pan y causa rancidez del pan. Cuando el pan se enrancia, el pan pierde suavidad de migajón y humedad de migajón. Como resultado, los migajones se hacen menos elásticos, y el pan desarrolla y una costra correosa. La hidrólisis enzimática (por amilasas, por ejemplo) de cadenas laterales de amilopectina puede reducir la cristalización e incrementa la antirancidez. La cristalización depende de la longitud de las cadenas laterales de amilopecíina: mienlras más largas son las cadenas laterales, mayor será la cristalización. La mayoría de los granulos de almidón esíán compuesíos de una mezcla de dos polímeros: amilopectina y amilosa, de la cual aproximadamente 75% es amilopeclína. La amilopectina es una molécula ramificada muy grande que consiste de cadenas de unidades de a-D-glucopiranosilo unidas por enlaces (1-4), en donde las cadenas son unidas por enlaces a-D-(1-6) para formar ramas. La amilosa es una cadena lineal de unidades de a-D-glucopiranosílo (1-4) enlazadas que tienen ramas a-D-(1-6). El horneado de productos de pan harináceos tales co o pan blanco, pan hecho de harina de centeno y harina de trigo y roles se logra horneado la masa de pan a temperaturas de horno en el iníervalo de 180 a 250°C duraníe aproximadamenle 15 a 60 minutos. Durante el procedimiento de horneado un gradiente de íemperalura inclinado (200 -» 120°C) prevalece sobre las capas de masa exíernas en donde la coslra del producto horneado se desarrolla. Sin embargo, debido a vapor, la temperalura en el migajón es sólo de aproximadamente 100°C al final del procedimienío de horneado. Por arriba de íemperaturas de aproximadamente 85°C, la inactivación de enzima puede tener lugar y la enzima no tendrá propiedades anti-rancidez. Sólo las amílasas termoestables, por lo tanto, son capaces de modificar el almidón eficientemente durante el horneado. La aclividad de la endoamilasa puede afectar negativamente la calidad del producto de pan final al producir un migajón pegajoso o gomoso debido a la acumulación de dextrinas ramificadas. La actividad de la exoamilasa es preferida, porque logra la modificación de almidón deseada que conduce a retraso de rancidez, con menos de los efectos negativos asociados con actividad de endo-amilasa. La reducción de la actividad de la endoamilasa puede conducir a mayor exoespecificídad, que puede reducir dexírinas ramificadas y producir un pan de mejor calidad.

BREVE DESCRIPCBTN DE LA DNVENCOQN Los inventores de la presente proveen, de conformidad con la invención, un polipéptido de variante de PS4 como se expone en las reivindicaciones. Además, proveen el uso de dicho polipéptido de variante de PS4, incluyendo en y como adiíivos de alimentos, productos alimenticios, producios horneados, composiciones mejoradoras, producios de aumentos incluyendo alimentos para animales, etc., como se expone en las reivindicaciones. Proveen ácidos nucleicos que codifican y que se refieren a polipéptidos de variante de PS4, como se expone en las reivindicaciones. Los métodos para producir dichos polipéptídos de varianíe de PS4, así como otros aspectos de la invención, íambién se exponen en las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LQS D.BU1JQI La figura 1 muesíra un ejemplo de una curva de un analizador de lextura. La figura 2 muestra un efecto de firmeza mejorado, es decir firmeza más baja, de pan tratado con pSac-pMD229 versus pan tratado con pSac-D34 durante el íiempo de almacenamienío después del horneado. La figura muesíra los resullados de un ensayo de horneado en el cual la firmeza del pan tratado con pSac- pMD229, pSac-D34 y el pan no íraiado se prueban. El eje de X mueslra el número de días, mientras que el eje de Y muestra firmeza expresada como hPa. Diamante: 40,000 unidades Betamyl /kg de pSac-D34. Cuadro: 40,000 unidades Beíamyl/kg de pSac-pMD229. Cruz: Control (sin enzima). La figura 3 muestra un efecto de elasticidad mejorado, es decir elasticidad más alta, de pan tratado con pSac-pMD229 versus pan tratado con pSac-D34 durante el tiempo de almacenamiento después del horneado. La figura 3 muestra los resultados de un ensayo de horneado en el cual la elasticidad del pan íraiado con pSac-pMD229, pSac-D34 y el pan no tratado se probaron. El eje de X muestra el número de días, mientras que el eje de Y muestra la elasíicidad expresada como unidades de elasticidad. Diamante: 40,000 unidades Betamyl/kg de pSac-D34. Cuadro: 40,000 unidades Beíamyl/kg de pSac-pMD229. Cruz: Conírol (sin enzima). La figura 4 mueslra un efecto de cohesividad mejorado, es decir cohesividad más alta, del pan tratado con pSac-pMD229 versus pan tratado con pSac-D34 durante el tiempo de almacenamiento después del horneado. La figura 4 muestra los resultados de un ensayo de horneado en el cual la cohesivídad del pan tratado con pSac-pMD229, pSac-D34 y pan no tratado se prueban. El eje de X muestra el número de días, mientras que el eje de Y muesíra cohesivídad expresada como unidades de cohesividad. Diamante: 40,000 Beíamyl/kg de pSac-D34. Cuadro: 40,000 Beiamyl/kg de pSac-pMD229. Cruz: Conírol (sin enzima).

Lisiado de secuencias SEQ ID NO: 1 muestra una secuencia de referencia de PS4, derivada de secuencia de aminoácidos de maltoteirahidrolasa de Pseudomonas saccharophila. SEQ ID NO: 2 muesíra una secuencia de pSac-D34; secuencia de aminoácidos de maltoíeírahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 11 susliíuciones y deleción del dominio de unión a a?mídón. SEQ ID NO: 3 muesíra una secuencia de pSac-D20; secuencia de aminoácidos de malíoietrahídrolasa de Pseudomonas saccharophila con 13 sustituciones y deleción del dominio de unión a almidón. SEQ ID NO: 4 muestra una secuencia de pSac-D14; secuencia de aminoácidos de malíoieírahidrolasa de Pseudomonas saccharophila con 14 susíííuciones y deleción del dominio de unión a almidón. SEQ ID NO: 5 muesíra el precursor de glucano 1 ,4-alfa-maltotetrahidrolasa de Pseudomonas saccharophila (EC 3.2.1.60) (G4-amilasa) (amilasa formadora de altoíeíraosa) (Exo-maltoíetraohídrolasa) (exo-amilasa formadora de malíoíeiraosa). número de acceso a SWISS-PROT P22963. SEQ ID NO: 6 muesíra un gen mía de P. saccharophila que codifica mallotetraohidrolasa (número de EC = 3.2.1.60). número de acceso a GenBank XI 6732. SEQ ID NO:7 muesíra una secuencia de referencia de PS4, derivada de secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de Pseudomonas stutzeri. SEQ ID NO: 8 muestra una secuencia de PStu-D34; Secuencia de aminoácidos de malíoteírahidrolasa de Pseudomonas stutzerí con 9 sustituciones. SEQ ID NO: 9 muesíra una secuencia de PStu-D20; secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa de secuencia de aminoácidos de maltotetrahidrolasa con 11 sustituciones. SEQ ID NO: 10 muestra una secuencia de PStu-D14; secuencia de aminoácidos de mallotetrahidralosa de Pseudomonas stutzeri con 12 sustituciones. SEQ ID NO: 11 muesíra & Precursor de Glucano 4-alfa-malíoíeírahidrolasa de Pseudomonas stutzeri (Pseudomonas perfectomarina). 1 (EC 3.2.1.60) (G4-amilasa) (amilasa formadora de maltoíeíraosa) (E?o-maltoíeíraohidrolasa)(exo-amilasa formadora de malíoíeíraosa). número de acceso a SWISS-PROT P13507. SEQ ID NO: 12 muesira un gen de amilasa formadora de malíoíreíraosa (amyP) de P. stutzeri, número de acceso a GenBank M24516 cds. completo. SEQ ID NO: 13 muestra una secuencia de aminoácidos de pSac-pMD229 que tiene mutaciones en 33Y, 34N, 121 F, 134R, 141 P, 146G5 157L, 161 A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P. SEQ ID NO: 14 mueslra una secuencia de ácidos nucleicos de pSac-pMD229. SEQ ID NO: 15 muestra secuencia de aminoácidos de apSac-pMD248 que tiene mutaciones en 33 Y, 34N, 121 F, 134R, 141 P, 145D, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L y 334P. SEQ ID NO: 16 muestra una secuencia de ácidos nucleicos de pSac-pMD248. SEQ ID NO: 17 muesíra una secuencia de ácidos nucleicos de pSac-pMD253 que tiene mutaciones en 33Y, 34N, 121 D, 134R, 141 P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P. SEQ ID NO: 18 muestra una secuencia de ácidos nucleicos de apSac-pMD253. SEQ ID NO: 19 muesíra una secuencia de aminoácidos de pSac-pMD271 que tiene mutaciones en 3S, 33Y, 34N, 70D, 121 D, 134R, 141 P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P. SEQ ID NO: 20 muestra una secuencia de ácidos nucleicos de apSac-pMD271.

DESCRiPCSON DETALLADA DE LA 0NVENC0OI.

En la siguiente descripción y ejemplos, a menos que el contexto determine otra cosa, las dosis de polipéptidos de variante de PS4 se dan en partes por millón (microgramos por gramo) de harina. Por ejemplo, "1 D34" indica 1 parte por millón de pSac-D34 basado en peso por peso. Preferiblemeníe, las caníidades o montos de enzima se determinan con base en pruebas de actividad como equivalentes de proteína de enzima pura medida con albúmina de suero de bovino (BSA) como un estándar, usando la prueba descriia en Bradford (1976, A rapid and sensiíive meíhod for íhe quanííficaíion of microgram quanliíies of proíeín ulilizing the principie of proíein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254). Al describir el diferenle polipéptido de variante de PS4 variantes producidas o que se contempla que son abarcadas por este documento, la siguiente nomenclatura será adoptada para facilidad de referencia: (i) en donde la sustitución incluye un número y una letra, v.gr., 141 P, entonces esto se refiere a la posición de acuerdo con el sistema de numeración/aminoácido sustituido]. Por consiguiente, por ejemplo, la sustitución de un aminoácido a prolina en la posición 141 se designa como 141 P; (ü) en donde la sustilucíón incluye una leíra, un número y una letra, v.gr., A141P, entonces esto se refiere a [aminoácido original/posición de acuerdo con el sislema de numeración/aminoácido sustiíuido]. Por consiguienie, por ejemplo, la sustitución de alanina con prolina en la posición 141 se designa como A141P. En donde dos o más posibles sustituyentes son posible en una posición particular, ésla será designada por letras contiguas, que opcionalmente pueden ser separadas por diagonales 7", v.gr., G303ED o G303E/D. En donde el aminoácido pertinente en una posición puede ser sustituido por cualquier aminoácido, éste es designado por [posición de acuerdo con el sistema de numeración/X], v.gr., 121X.

Mutaciones múltiples se pueden designar como separadas por diagonales 7", v.gr. A141P/G223A o comas ",", v.gr., A141 P, G223A que representan mutaciones en la posición 141 y 223 sustituyendo la alanina con prolina y glicina con alanina respectivameníe. A menos que se defina de otra manera aquí, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que es comúnmente entendido por un experto en la técnica al cual está dirigida esta invención. Singleton, et al, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wíley and Sons, New York (1994), y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BiOLOGY, Harper Perennial, NY (1991 ) proveen a un experto en la técnica un diccionario general de cualquiera de los términos usados en esta invención. Aunque cualesquiera méíodos y maíeriales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí se pueden usar en la práctica o prueba de la presente invención, se describen los métodos y materiales preferidos. Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen los intervalos. A menos que se indique otra cosa, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxi, respecíívamente. La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que esíán deníro de las capacidades de un experto en la técnica. Dichas técnicas se explican en la literatura. Véase, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Friísch, y T. Maniaíis, 1989, Molecular Cloning: A Laboraíory Manual, segunda edición, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 y suplementos periódicos; Current Prolocols ¡n Molecular Bíology, capítulo 9, 13, y 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, y A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridízaíion: Principies and Pracíice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesís: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Strucíure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Aníibodies : A Laboraíory Manual : Portable Protocol NO. I de Edward Harlow, David Lañe, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lañe (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboraíory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, Lars-lnge Larsson "Immuno cyiochemistry: Theory and Practice", CRC Press ¡nc, Boca Ratón, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1 , John D. Pound (ed); "Immunochemical Protocols, vol 80", en la serie: "Methods in Molecular Biology", Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screeníng, edilado por Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001 , New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); y Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams y Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3. Cada uno de esíos textos generales se incorpora aquí por referencia. Todas las pateníes y publicaciones, incluyendo íodas las secuencias descriías deníro de dichas patentes y publicaciones, referidas aquí se incorporan expresamente por referencia.

Polipéptidos de variante de PS4 Los inventores de la presente proveen un polipépíido que tiene una sustiíución en una o más posiciones que afectan una propiedad alíerada, preferiblemente exospecificidad alterada o termoesíabilidad alíerada, o ambas, en relación con la enzima progeniíora. Dichos polipépíidos de variante se refieren en este documento para conveniencia como "polipéptidos de variante de PS4". Los polipéptidos de variante de PS4 preferiblemente presentan actividad de enzima. Muy preferiblemente, los polipéptidos de variante de PS4 comprenden actividad de amílasa, preferiblemeníe acíividad de exoamilasa.

En modalidades alíamente preferidas, los polipépíídos de variante de PS4 presenían actividad de exoamilasa no maltogénica. Además, proveen composiciones, incluyendo adiíivos de alimentos, producios alimenlicios, productos de panadería, composiciones mejoradoras, productos alimenticios incluyendo alimeníos para animales, ele, que comprenden dichos polipépíidos alterados de variante de PS4, preferiblemeníe aquellos que ííenen actividad de exoamilasa no maltogénica, así como métodos para hacer y usar dichos polipéptidos y las composiciones. Como se indicó anteriormeníe, los polípéptidos de variante de PS4 pueden comprender una o más propiedades de manipulación mejoradas, preferiblemente propiedades de horneado mejoradas. Por lo tanto, los polípéptidos de variante de PS4 son tales que los productos alimenticios así traíados tienen uno o más de (preferiblemente todos) una firmeza más baja, una elasticidad más alta o una cohesivídad más alta. Dichas propiedades de manejo u horneado mejoradas presentadas por los polípépíidos de variante de PS4 se describen con deíalle más adelaníe. Proveen el tratamiento de producios alimenticios, particularlmenle masas y productos de panadería con dichos polipéptidos, y de tal manera que los productos alimenticios presenten las cualidades deseadas expuestas anteriormente. Proveen otros usos de dichas composiciones tal como en la preparación de detergentes, como edulcorantes, jarabes, eíc. Las composiciones incluyen el polipépíido junio con por lo menos otro componente. En particular, proveen alimento o aditivos de alimento que comprenden los polipéptidos. Dichos polipéptídos y ácidos nucleicos varían de sus secuencias progenitoras al incluir un número de mutaciones. En otras palabras, la secuencia del polipéplido de variante de PS4 o ácido nucleico es diferente de la de su progenitor en un número de posiciones o residuos. En modalidades preferidas, las mutaciones comprenden sustituciones de aminoácidos, es decir, un cambio de un residuo de aminoácido por otro. Por lo íanto, los polipépíidos de variante de PS4 comprenden un número de cambios en la naturaleza del residuo de aminoácido en una o más posiciones de la secuencia progenitora. Como se usa aquí, el término "variante" significa una molécula que es derivable de una molécula progenitora. Las variantes incluyen polipéptidos así como ácidos nucleicos. Las variantes incluyen deleciones, inserciones y sustiíuciones en el nivel de aminoácido y íransversiones, íransiciones e inversiones en el nivel de ácido nucleico enire oirás cosas, en uno o más lugares. Las varianíes lambién incluyen truncacíones. Las variantes ¡ncluyen derivados homólogos y funcionales de moléculas progenitoras. Las variantes ¡ncluyen secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridar a las secuencias de nucleótido presentadas aquí.

Ubicación de mutaciones en polipéptidos de variante de PS4 Los inventores déla presente proveen polipéptidos de variante de PS4 con alteraciones de secuencia que comprenden susíiíuciones de aminoácidos en una secuencia de amílasa, preferiblemente una acíivídad de exoamilasa, muy preferiblemente una secuencia de exoamilasa no maliogénica. De manera específica, proveen un polipépíido de variante de PS4 derivable de un polipépíido progenitor que liene actividad de exoamilasa no maltogénica que comprende una mutación de aminoácido en cada una de las posiciones 33, 34, 121 , 134, 141 , 146, 157, 161 , 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307, 309 y 334 con referencia a la numeración de posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: ! Además proveen un polipéptído de variante de PS4 derivable de un polipéptído progenitor que tiene actividad de exoamilasa no maltogénica que comprende una mutación de aminoácido en cada una de las posiciones 33, 34, 121 , 134, 141 , 145, 146, 157, 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307 y 334 con referencia a la numeración de posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1. También proveen un polipéptido de variante de PS4 derivable de un polipéptido progenitor que tiene acíividad de exoamílasa no mallogénica que comprende una mutación de aminoácido en cada una de las posiciones 33, 34, 121 , 134, 141 , 146, 157, 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307, 309 y 334 con referencia a la numeración de posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1. Finalmente, proveen un polipéptido de variante de PS4 derivable de un polipépíido progenitor que tiene actividad de exoamilasa no malíogénica que comprende una muíación de aminoácido en cada una de las posiciones 3, 33, 34, 70, 121 , 134, 141 , 146, 157, 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307, 309 y 334 con referencia a la numeración de posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mosírada como SEQ ID NO: 1.

En modalidades preferidas cada una de las muíaciones de aminoácido en esíos polipéplidos se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: 3S , 33Y, 34N, 70D, 121 D, 121 F, 134R, 141 P, 145D, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P. En dichas modalidades preferidas, cada una de las muíaciones de aminoácido en eslos polipéptídos son preferiblemente seleccionadas independientemente del grupo de sustituciones que consisten de: A3S, N33Y, D34N, G70D, G121 D, G121 F, G134R, A141 P, N145D, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H272Q, G303E, H307L, A309P y S334P. En modalidades altamente preferidas, el polipéptido de variante de PS4 comprende la secuencia pSac-pMD229 (SEQ ID NO: 13), pSac-pMD248 (SEQ ID NO: 15), pSac- 285 pMD253 (SEQ ID NO: 17) o pSac-pMD271 (SEQ ID NO: 19). Los polipépíídos de varianíe de PS4 pueden comprender muíacíones en oíros silíos, como se describe con deíalle adicional más adelante. Dichos polipéptidos de variante, y oíros como se describe en esíe documento, se refieren en esíe documenío como "polipépíidos de variante de PS4". Ácidos nucleicos que codifican dichos polipépíidos de varianíe lambién se describen y se referirán para conveniencia como "ácidos nucleicos de variante de PS4". Los polipéptidos de variante de PS4 y ácidos nucleicos se describirán con detalle adicional más adelante. Las secuencias "progeniloras", es decir, las secuencias sobre las cuales se basan los polipéptidos y ácidos nucleicos de variante de PS4, preferiblemente son polipéptidos que tienen actividad de exoamilasa no maltogénica. Los íérminos "enzimas progenitoras" y "polípéptidos progenitores" se deben interpretar de acuerdo con ellos, y significan las enzimas y polipéptídos en los cuales se basan los polípéptidos de varianíe de PS4. Se describen con deíalle adicional más adelante. Las mutaciones y cambios de aminoácidos se pueden hacer sobre cualquier estructura de base o fondo de polipéptido adecuada, tipo silvestre o mulada, como se describe con detalle adicional más adelante. En modalidades particularmente preferidas, las secuencias progeniíoras son enzimas exoamilasa no maltogénica, preferiblemente enzimas exoamilasa bacteriana no maltogénica. En modalidades altamente preferidas, la secuencia progenitora comprende una glucano 1 ,4-alfa-maltotetrahidrolasa (EC 3.2.1.60). Preferiblemeníe, la secuencia progeniíora es derivable de especies de Pseudomonas, por ejemplo Pseudomonas saccharophilia o Pseudomonas stutzeri. En algunas modalidades, el polipéplído progenitor comprende, o es homólogo a, una secuencia de exoamilasa de íipo silvestre no malíogénica, v.gr., de Pseudomonas spp. Por lo íanío, el polipéptido progenitor puede comprender una exoamilasa no maltogénica Pseudomonas saccharophilia que íiene una secuencia mostrada con SEQ ID NO: 1. En otras modalidades preferidas, el polipéptído progenitor comprende una exoamilasa no maltogénica de 110 Pseudomonas stutzeri que tiene una secuencia mostrada como SEQ ID NO: 11 , o exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas stutzerí que tiene número de acceso a SWISS-PROT Pl 3507. Por otra parte, el polipéptido progenitor puede ser una variante de cualquiera de las secuencias de tipo silvestre, es decir, el polipéptido progenitor puede ser manipulado por ingeniería genética, o comprende un polipéptido de variante de PS4. En modalidades preferidas, las muíaciones y cambios se hacen sobre una secuencia de PS4 que ya es mulada, preferiblemente pSac-D34 (v.gr., SEQ ID NO: 2). Sin embargo, estará claro para un experto en la técnica que aunque los polipéptídos de variante de PS4 se pueden derivar mutando secuencias ya mutadas, es posible construir dichos polipépíidos de varianíe empezando a partir de una secuencia de tipo silvestre (o de hecho cualquier secuencia adecuada), identificando las diferencias entre la secuencia de partida y la variante deseada, e introduciendo las mutaciones requeridas en la secuencia de partida para lograr la varianíe deseada. Proteínas y ácidos nucleicos relacionados, que tienen preferiblemente secuencia u homología funcional con secuencia de exoamílasa no maltogénica Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1 o exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas stutzerí que tiene una secuencia mostrada como SEQ ID NO: 11 se refieren en este documento como miembros de la "familia de PS4". Ejemplos de enzimas de exoamilasa no malíogénica de la "familia de PS4" adecuadas para usarse en la generación de los polipéptídos y ácidos nucleicos de varianíe de PS4 se describen con deíalle adicional más adelante. Los polipéptidos de variante de PS4 descritos en este documento preferiblemente retienen las caracterísíicas de los polipéptidos progenitores, y además preferiblemente tienen propiedades adicionales benéficas, por ejemplo, aclividad o íermoestabilidad incrementada, o resistencia al pH, o cualquier combinación (preferiblemeníe íodas). Esta se describe con detalle adicional más adelante. Los mutantes de sustitución de PS4 descritos aquí se pueden usar para cualquier propósito adecuado. Preferiblemente se pueden usar para propósitos para los cuales la enzima progenitora es adecuada. En particular, se pueden usar en cualquier aplicación para la cual se usa exo-maltotetraohidrolasa. En modalidades altamente preferidas, íienen la veníaja adicional de lermoeslabilidad más alia, o acíividad de exoamilasa más alia pH estabilidad al pH más alta, o cualquier combinación. Ejemplos de usos adecuados para los polipépíidos ácidos nucleicos de variante de PS4 y incluyen producción de alimeníos, en particular horneado, así como producción de maíeriales alimeníicios; ejemplos adicionales se exponen con deíalle más adelante. Los polipéptídos de variante de PS4 pueden comprender una o más mutaciones adicionales además de aquellas posiciones expuestas aníeriormente. Puede haber una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más muíaciones preferiblemeníe susíitucíones además de aquellas ya expuestas. Otras mutaciones, tales como deleciones, inserciones y susíiíucíones en el nivel de aminoácidos y transversiones, transiciones e inversiones en el nivel de ácido nucleico, un uno o más de otros lugares, íambién se pueden incluir, como se describe más adelante. Además, las varianíes de PS4 no necesiían tener todas las sustituciones en las posiciones lisiadas. De hecho, pueden íener una, dos, íres, cuatro o cinco sustituciones fallantes, es decir, el residuo de aminoácido de tipo silvestre está presente en dichas posiciones.

Sustituciones preferidas La sustilución en la posición 3, en donde está presente, puede comprender 3S, preferiblemente, A3S. La sustitución en la posición 33, en donde está presente, puede comprender 33 Y, preferiblemente, N33Y. La sustiíucíón en la posición 34 puede comprender cualquiera de 34N, 34G, 34A, 34S o 34T, preferiblemeníe 34N, D34G, D34A, D34S o D34T. En modalidades aliameníe preferidas, la susííiución en la posición 34 comprende 34N, preferiblemeníe D34N. La susíitución en la posición 70, en donde esiá preseníe, puede comprender 70D, preferiblemente, G70D. La sustitución en la posición 121 puede comprender cualquiera de 121 F, 121 Y, 121 W, 121 H, 121A, 121 M, 121G, 121S, 121T, 121 D, 121 E, 121 L, 121 K, 121V, preferiblemente G 121 F, G121Y, G121W, G121 H, G121A, G121M, G121G, G121S, G121T, G121 D, G121E, G121L, G121K, G121 V. En modalidades aliamente preferidas, la susííiución en la posición 121 comprende 121 D o 121 F, preferiblemente G121 D o G121 F. La sustitución en la posición 134 puede comprender 134R, preferiblemente Gl 34R. La sustitución en la posición 141 puede comprender 141 P, preferiblemente A141 P. La sustitución en la posición 145, en donde está presente, puede comprender 145D, preferiblemente N145D. La susíítución en la posición 146 puede comprender cualquiera de 146M, 146G, preferiblemente Y146M, Y146G. En modalidades alíamente preferidas, la sustitución en la posición 146 comprende 146G, preferiblemente Yl 46G. La susíiíución en la posición 157 puede comprender cualquiera de 157L, 57M, 157V, 157N, 157L, preferiblemeníe I157L, I157M, I157V, I157N, I157L. En modalidades allameníe preferidas, la susíííución en la posición 157 comprende 157L, preferiblemeníe I157L. La suslilución en la posición 161 , en donde esíá preseníe, puede comprender 161 A, preferiblemenle S161A. La susíitución en la posición 178 puede comprender 178F, preferiblemente L178F. La sustitución en la posición 179 puede comprender cualquiera de 179T, 179V, preferiblemente A179T, Al 79V. En modalidades altamente preferidas, la susíiíución en la posición 179 comprende 179T, preferiblemente Al 79T. La suslitución en la posición 223 puede comprender cualquiera de 223 A, 223 E, 223K, G223L, 2231 , 223S, 223T, 223V, 223R, 223P, 223D, preferiblemente G223A, G223E, G223K, G223L, G223I, G223S, G223T, G223V, G223R, G223P, G223D. En modalidades altamente preferidas, la sustitución en la posición 223 comprende 223E, preferiblemente G223E. La susliíución en la posición 229 puede comprender 229P, preferiblemeníe S229P. La susíiíución en la posición 272 puede comprender 272Q, preferiblemeníe H272Q. La susliíución en la posición 303 puede comprender cuaiquiera de 303E, 303D G303E, G303D. En modalidades alíameníe preferidas, la susíitución en la posición 303 comprende 303E, preferiblemente G303E. La suslitución en la posición 307 puede comprender 307L, preferiblemente H307L. La sustitución en la posición 309, en donde está presente, puede comprender 309P, preferiblemente A309P. La sustitución en la posición 334 puede comprender 334P, preferiblemente S334P.

Sustituciones adicionales Una mutación en 160 también puede estar presente, preferiblemente 160D, muy preferiblemente E160D. Una o más de oirás mutaciones como se expone en el siguiente cuadro además pueden estar presentes.

Otras secuencias de polipéptido de variante de PS4 Los inventores de la presente específicamente proveen un polipépíido de varianíe de PS4 derivable de un polípépíido progenitor que íiene acíividad de exoamilasa no maliogénica, en el cual el polipépíido de variante de PS4 comprende una mutación en cada una de las siguientes posiciones 33, 34, 121 , 134, 141 , 146, 157, 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307 y 334, con referencia a la numeración de posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mosírada como SEQ ID NO: 1. La mutación de la posición 33 puede comprender 33Y, preferiblemente N33Y. La mutación de la posición 34 puede comprender 34N, preferiblemente D34N. La muíación de la posición 121 puede comprender 121 F, preferiblemente G121 F. La mutación de la posición 134 puede comprender 134R, preferiblemeníe G134R. La muíación de la posición 141 puede comprender 141 P, preferiblemeníe A141 P. La muíación de la posición 146 puede comprender 146G, preferiblemeníe Y146G. La muíación de la posición 157 puede comprender 157L, preferiblemeníe I157L. La muíación de la posición 178 puede comprender 178F, preferiblemeníe L178F. La muíación de la posición 179 puede comprender 179T, preferiblemeníe A179T. La mulación de la posición 223 puede comprender 223E, preferiblemeníe G223E. La mulación de la posición 229 puede comprender 229P, preferiblemente S229P. La mulación de la posición 272 puede comprender 272Q, preferiblemeníe H272Q. La muíacíón de la posición 303 puede comprender 303 E, preferiblemente G303E. La mutación de la posición 307 puede comprender 307L, preferiblemente H307L. La muíación de la posición 334 puede comprender 334P, preferiblemeníe S334P. Preferiblemente, el polipépíído de varianíe de PS4 comprende cada una de las siguientes susíiíuciones 33Y, 34N, 121 F, 134R, 141 P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L y 334P, preferiblemente N33Y, D34N, G121 F, G134R, A141 P, Y146G, I157L, L178F, A179T, G223E, S229P, H272Q, G303E, H307L yS334P. En una modalidad preferida, el polipépíido de varianíe de PS4 comprende mulaciones adicionales en las posiciones 161 y 309. La muíación de la posición 161 puede comprender 161 A, preferiblemente S161 A. Además, la muíación de la posición 309 puede comprender 309P, preferiblemeníe A309P. Preferiblemente," el polipéplido de varianíe de PS4 comprende la secuencia pSac-pMD229 (SEQ ID NO: 13). En olra modalidad preferida, el polipéplido de varianíe de PS4 comprende una mulación adicional en la posición 145. La mutación de la posición 145 puede comprender 145D, preferiblemente N145D. Preferiblemente, el polipéptido de variante de PS4 comprende la secuencia pSac-pMD248 (SEQ ID NO: 15). En una modalidad preferida adicional, el polipéptído de variante de PS4 comprende una mutación adicional en la posición 309. La mutación en la posición 309 puede comprender 309P, preferiblemente A309P. Preferiblemente, el polipéptido de variante de PS4 comprende la secuencia pSac-pMD253 (SEQ ID NO: 17). En una modalidad preferida adicional, los polipéptidos de variante de PS4 comprenden mutaciones adicionales en las posiciones 3, 70 y 309. La mutación en la posición 3 puede comprender 3S, preferiblemente A3 S. La mutación en la posición 70 puede comprender 70D, preferiblemente G70D. La mutación en la posición 309 puede comprender 309P, preferiblemente A309P. Preferiblemente, el polipéplido de variante de PS4 comprende la secuencia pSac-pMD271 (SEQ ID NO: 19). Ácidos nucleicos de la variante de PS4 Los inventores de la presente también describen ácidos nucleicos de PS4 que tienen secuencias que corresponden a o codifican las alteraciones en el polipéplido de variante de secuencias de PS4, para usarse en la producción de dichos polipéptídos para los propósitos descrilos aquí. Por lo tanto, los inventores proveen ácidos nucleicos capaces de codificar cualquiera de las secuencias de polipéptido expuestas en este documento. El experto en la técnica se percatará de la relación eníre secuencia de ácido nucleico y secuencia de polipépíido, en particular, el código genético y la degeneración de este código, y podrá construir dichos ácidos nucleicos de PS4 sin dificultad. Por ejemplo, se percatará de que para cada sustilución de aminoácido en la secuencia de polipéptido de varianíe de PS4, puede haber uno o más codones que codifiquen el aminoácido susíiíuto. Por consiguiente, será evidente que, dependiendo de la degeneración del código genético con respecto a ese residuo de aminoácido particular, una o más secuencias de ácido nucleicos de PS4 se puede generar correspondiendo a esa secuencia de polipéptído de variante de PS4. Además, en donde el polipéptido de varianíe de PS4 comprende más de una susíiíución, por ejemplo A141 P/G223A, los ácidos nucleicos PS4 correspondientes pueden comprender combinaciones en pares de los codones que codifican respeciivameníe los dos cambios de aminoácidos. Las secuencias de ácido nucleico de varianíe de PS4 se pueden derivar de ácidos nucleicos progenitores que codifican cualquiera de los polipéptidos progenitores anteriormente descritos. En particular, los ácidos nucleicos progenitores pueden comprender secuencias de íipo silvestre, v.gr., SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12. Los ácidos nucleicos de variante de PS4 por lo tanto pueden comprender ácidos nucleicos que codifican exoamilasas no maltogénicas de íipo silveslre, pero que codifican oíro aminoácido en la posición relevante en lugar del residuo de aminoácido de íipo silvesíre. Las secuencias de ácido nucleico de variante de PS4 también pueden comprender secuencias de tipo silvestre con una o más mutaciones, v.gr., que codifican polipéptidos progenitores anteriormente descritos bajo "Combinaciones". Se entenderá que secuencias de ácido nucleico que no son idénticas a las secuencias de ácido nucleico de variante de PS4 particulares, pero que esíán relacionadas con éslas, lambién serán úíiles para los métodos y composiciones descritos aquí, tales como una variante, homólogo, derivado o fragmento de una secuencia de ácido nucleico de variante de PS4, o un complemento o una secuencia capaz de hibridar las mismas. A menos que el contexto determine olra cosa, el término "ácido nucleico de variante de PS4" debe tomarse para incluir cada una de eslas eníidades listadas anteriormente. Las mutaciones en la secuencia de aminoácidos y secuencia de ácido nucleico se pueden hacer por cualquiera de un número de íécnicas, como se conoce en la íécnica. Las secuencias de varianíe se pueden hacer fácilmente usando cualquiera de las técnicas de muíagénesis conocidas, por ejemplo, mulagénesis dirigida al sitio usando PCR con iniciadores de oligonucleótído apropiados, muíagénesis de adición 5', muíagénesis de iniciador no coincideníes, eíc. Allemaíivameníe, o además, las secuencias de ácido nucleico de varianíe de PS4 se pueden hacer de novo. En modalidades particularmente preferidas, las mutaciones son introducidas en secuencias progenííoras por medio de PCR (reacción de cadena de polimerasa) usando iniciadores apropiados, como se ilusíra en los ejemplos. Por lo íanío, es posible alterar la secuencia de un polipépíido al iníroducir cualesquiera susliluciones de aminoácidos adecuadas en un polipéplído progenitor, que tiene preferiblemente aciívidad de exoamilasa no maltogénica, tal como en una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia o Pseudomonas stutzeri al nivel de aminoácido o ácido nucleico, como se describe. Los inventores de la preseníe describen un méíodo en el cual la secuencia de una exoamilasa no malíogénica es alterada alterando la secuencia de un ácido nucleico que codifica la exoamilasa no maltogénica. Sin embargo, desde luego se apreciará que el polipépíido de varianíe de PS4 de hecho no necesite ser realmente derivado de una secuencia de polipépíido o ácido nucleico de íipo silvesíre, por ejemplo, por muíación paso a paso. Más bien, una vez que la secuencia del polipéptido de varianíe de PS4 se esíablece, el experto en la íécnica puede hacer fácilmente esa secuencia del lípo silveslre con íodas las mulacíones, por medios conocidos en la técnica, por ejemplo, usando iniciadores de oligonucieótido apropiados y PCR. De hecho, el polipéptído de varianíe de PS4 se puede hacer de novo con íodas sus mulaciones, por ejemplo, a íravés de metodología de síntesis de péptidos. En general, sin embargo, los polipépíidos de varianíe de PS4 y/o ácidos nucleicos se derivan o se pueden derivar de una secuencia "precursora". El término "precursor" como se usa aquí significa una enzima que precede la enzima que es modificada de conformidad con los méíodos y composiciones descritos aquí. Un precursor por lo íanío incluye una enzima usada para producir una enzima modifdicada. Por lo lanío, el precursor puede ser una enzima que es modificada por mulagénesis como se describe en otra parte en este documento. Asimismo, el precursor puede ser una enzima de tipo silvestre, una enzima de variante de tipo silvestre o una enzima ya mutada. Los polipéptídos y ácidos nucleicos de variante de PS4 pueden ser producidos por cualesquiera medios conocidos en la íécnica. De manera específica, se pueden expresar a partir de sistemas de expresión, que pueden ser in vitro o in vivo en naturaleza. De manera específica, los inventores describen plásmídos y vectores de expresión que comprenden secuencias de ácido nucleico de PS4, preferiblemente capaces de expresar polipépíitíos de variante de PS4. Las células y células hospedero que comprenden y son preferiblemente transformadas con dichos ácidos nucleicos de PS4, plásmidos y vectores también se describen, y se debe aclarar que éstos también son abarcados en esíe documenío. En modalidades preferidas, la secuencia de polipéptido de variante de PS4 se usa como un aditivo alimenticio en forma aislada. El término "aislado" significa que la secuencia es por lo menos sustancialmeníe libre de por lo menos otro componente con el cual la secuencia está naturalmente asociado en la naturaleza y como se encuentra en la naturaleza. En un aspecto, preferiblemente la secuencia está en forma purificada. El término "purificado" significa que la secuencia está en estado relativamente puro - v.gr., por lo menos aproximadamente 90% puro, o por lo menos aproximadamente 95% puro o por lo menos aproximadameníe 98% puro. Los polipéplidos de variante de PS4 por ejemplo se pueden hacer usando mutagénesis dirigida al sitio usando PCR con iniciadores de oligonucleótido apropiados, mutagénesis de adición 5', mutagénesis de iniciador no acoplado, etc., como se describe en los ejemplos. Para producir los polipéptidos de variante de PS4 con las mutaciones relevantes, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico correspondiente a una secuencia de pSac-D34 (SEQ ID NO: 2) se puede hacer y pueden introducirse los cambios relevantes. El experto en la técnica se percatará, sin embargo, que se puede usar cualquier secuencia de partida adecuada, y de hecho que es posible empezar a partir de una secuencia de exoamilasa de tipo silvestre para obtener el polipéptido de variante deseado ya sea en un solo paso, o mediante otras secuencias intermedias. En modalidades alíameníe preferidas, la secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia de pSac-pMD229 (SEQ ID NO: 14), pSac-pMD248 (SEQ ID NO: 16), pSac- pMD253 (SEQ ID NO: 18) o pSac-pMD271 (SEQ ID NO: 20).

Numeración de posición Todas las posiciones referidas en el preseníe documento por numeración se refieren a la numeración de una secuencia de referencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mosírada a coníínuación (SEQ ID NO: 1): 1 DQAGK.SPAGV SYHGGD?IIL QGFHWNWRE APNPWY -O-R QQASTIAADG FSA?WMPVFW 61 RDFSS TDT3 KSGGGEGYFW HDFNKNGRYG SDAQI.RQAAG ALGGAGVKVL YU PNHMKTR 121 GYPDKE?Nl-P AGQGFWRNDC ¿DPGNYPNDC DDGDRFIGGE SDUSJTGHPQI YGMFRDBIJAN 181 LKSGYGAGG7 RFDFVRGYAP BRVDS MSDS ADSSFCVGEL WKßPSEYPSW DWR?3TASWQQ 241 IIKDWSDRÁK CFVFDFALKE R QNGSV-SDW KHGLNGNPDP RWKEVAVTFV DNHD GYSPG 301 QNGGQHH AL QDSJIRQAYA YILTSPGTPV VY SHMTOWG YGDF3-RQLIQ VRRTAGVKAD 361 SAISFHSGYS GLVA VSGSQ QTLWAI-NSD I-ANPGQVAST SFSEAVKASW GQVRVWRSGS 421 GDGGGNÜGGE GGLVNVKFRC DNGVTQMGDS VYAVGNVSQI- GKP?SPASAVR TDTSSYPT 81 KGSIALPDGQ VElifKC IKN EADATLVRQW QSGt3?3NC!VßA AAGAS SGSF La secuencia de referencia se deriva de la secuencia de Pseudomonas saccharophilia que íiene número de acceso a SWISS-PROT P22963, pero sin la secuencia de señal MSHILRAAVLAAVLLPFPALA. El dominio C-íerminal de unión a almidón EGGLVNVNFR CDNGVTQMGD SVYAVGNVSQ LGNWSPASAV RLTDTSSYPT WKGSIALPDG QNVEWKCLIR NEADATLVRQ WQSGGNNQVQ AAAGASTSGS F opcionalmenle puede ser deleíado u omitido. Alternativamente, se puede incluir en la secuencia de polipéptido de variante de PS4. En el contexto de la presente descripción se utiliza una numeración específica de posiciones de residuo de aminoácido en enzimas de exoamilasa de PS4. A este respecto, al alinear las secuencias de aminoácidos de varias exoamilasas conocidas es posible asignar de manera no ambigua un número de posición de aminoácido de exoamilasa a cualquier posición de residuo de aminoácido en cualquier enzima de exoamilasa, cuya secuencia de aminoácidos se conoce. Usando este sistema de numeración que se origina por ejemplo a partir de la secuencia de aminoácidos de la exoamilasa obtenida de Pseudomonas saccharophilia, alineada con secuencias de aminoácidos de un número de otra exoamilasa conocida, es posible indicar la posición de un residuo de aminoácido en una exoamilasa de manera no ambigua. Por lo tanto, el sistema de numeración, aun cuando puede usar una secuencia específica como un punto de referencia de base, también es aplicable a íodas las secuencias homologas relevantes. Por ejemplo, la numeración de posición se puede aplicar a secuencias homologas de otra especie de Pseudomonas, o secuencias homologas de otra bacteria. Preferiblemente, dichas homologas tienen 60% o mayor homología, por ejemplo 70% o más, 80% o más, 90% o más o 95% o más homología, con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 1 anterior, o las secuencias que tienen número de acceso a SWISS-PROTs P22963 o P13507, preferiblemente con íodas esías secuencias. La homología de secuencia entre proteínas se puede lograr usando programas de alineación bien conocidos y íécnicas de hibridación descriías aquí. Dichas secuencias homologas, así como los equivalentes funcionales descritos más adelante, se referirán en este documento como la "familia de PS4 ". Además, y como se indicó antes, el sistema de numeración usado en este documento hace referencia a una secuencia de referencia SEQ ID NO: 1 , que se deriva de la secuencia de Pseudomonas saccharophilia que tiene el número de acceso a SWISS-PROT P22963, pero sin la secuencia de señal MSHILRAAVLAAVLLPFPALA. Esta secuencia de señal se localiza N- terminal de la secuencia de referencia y consisíe de 21 residuos de aminoácido. Por consiguiente, será írivial ideníificar los residuos particulares que han de ser muíados o susíituidos en secuencias correspondieníes que comprenden la secuencia de señal, o de hecho, secuencias correspondientes que comprenden cualesquiera otras extensiones o deleciones N- o C-íerminales. En relación con las adiciones o deleciones N-terminales, todo lo que se requiere es desfasar la numeración de la posición por el número de residuos insertados o deletados. Por ejemplo, la posición 1 en SEQ ID NO: 1 corresponde a la posición 22 en una secuencia con la secuencia de señal.

Enzima/polipéptido progenitores Los polipéptidos de variante de PS4 se derivan de, o son variantes de, otra secuencia, conocida como una "enzima progenitora", un "polipépíido progenitor" o una "secuencia progeniíora". El término "enzima progenitora" como se usa en esíe documento significa la enzima que liene una estructura cercana, preferiblemente la estructura química más cercana a la variante resultante, es decir, el polipéptido de variante de PS4 o ácido nucleico. La enzima progenitora puede ser una enzima precursora (es decir, la enzima que es realmente mulada) o se puede preparar de novo. La enzima progeniíora puede ser una enzima de lipo silvesíre, o puede ser una enzima de íipo silvesíre que comprende una o más muíaciones.

El término "precursor" como se usa aquí significa una enzima que precede a la enzima que es modificada para producir la enzima. Por lo tanto, el precursor puede ser una enzima que es modificada por mutagénesis.

Asimismo, el precursor puede ser una enzima de tipo silvestre, una enzima de variante de tipo silvestre o una enzima ya mutada. El término "tipo silvestre" es un término de la técnica entendido por los expertos y significa un fenotipo que es característico de la mayoría de los miembros de una especie que aparece naturalmente y que contrasta con el fenotipo de un mutante. Por lo tanto, en el presente contexto, la enzima de íipo silvesíre es una forma de la enzima naluralmeníe enconírada en la mayoría de los miembros de la especie relevaníe. Generalmente, la enzima de íipo silveslre relevaníe en relación con los polipéplidos de varianíe descritos aquí es la enzima tipo silvestre correspondiente más estrechamente relacionada de en términos de homología de secuencia. Sin embargo, en donde una secuencia de tipo silvestre particular se ha usado como la base para producir un polipéptido de PS4 de variante como se describe aquí, ésta será la secuencia de tipo sílveslre correspondiente independientemente de la existencia de oíra secuencia de lipo silvestre que está más estrechamente relacionada en términos de homología de secuencia de aminoácidos. La enzima o polipéptído progenitor puede ser cualquier polipéptido de partida adecuado. Preferiblemente puede tener alguna actividad enzimática. Preferiblemente, esía actividad enzimática es una actividad de amilasa. Muy preferiblemente, el polipéptído progenitor comprende actividad de exoamilasa. La enzima progenitora es preferiblemente un polipéptido que preferiblemente présenla actividad de exoamilasa no malíogénica. Preferiblemeníe, la enzima progeniíora es una exoamilasa no malíogénica como tal. Por ejemplo, la enzima progenítora puede ser una exoamilasa no maltogénica Pseudomonas saccharophila, tal como un polipéptído que tiene número de acceso a SWISS-PROT P22963, o exoamilasa no malíogénica de Pseudomonas stutzeri, tal como un polipéptido que tiene número de acceso a SWISS-PROT P13507. Otros miembros de la familia de PS4 se puede usar como enzimas progenitoras; dichos "miembros de la familia de PS4" generalmente serán similares a, homólogos a, o funcionalmenie equivalentes a cualquiera de estas dos enzimas, y pueden ser identificados por métodos estándares, tales como determinación selectiva de hibridación de una genoteca adecuada usando sondas, o por análisis de secuencia de genoma. En particular, equivalentes funcionales de cualquiera de estas dos enzimas, así como otros miembros de la "familia de PS4" también se pueden usar como puntos de partida o polipéptidos progenitores para la generación de polipéptídos de variante de PS4 como se describe aquí. Un "equivalente funcional" de una proteína significa algo que comparte una o más, preferiblemente sustancialmente todas, las funciones de esa proíeína. Preferiblemeníe, dichas funciones son funciones biológicas, preferiblemenle funciones enzimáticas, tales como actividad de amilasa, preferiblemente actividad de exoamilasa no malíogénica. Dichas funciones pueden incluir cualquier propiedad de la proíeína, incluyendo exo-especificidad, lermoesíabilidad, y manipulación mejorada íal como firmeza, elasticidad y cohesividad (como se describe más adelante). En relación con una enzima progenitora, el íérmino "equivalente funcional" preferiblemente significa una molécula que tiene función similar o idéntica a una molécula progenitora. La molécula progenilora puede ser una exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas saccharophila o exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas stutzeri o un polipéptido obtenido de otras fuentes. El término "equivalente funcional" en relación con una enzima progenitora que es una exoamilasa no mallogéníca de Pseudomonas saccharophila, tal como un polipéptido que tiene número de acceso a SWISSPROT P22963, o una exoamilasa no malíogénica de Pseudomonas stutzeri, íal como un polipépíido que íiene número de acceso a SWfSS-PROT P13507 significa que el equivaleníe funcional se podría obíener de oirás fuentes. La enzima funcionalmente equivalente puede tener una secuencia de aminoácidos diferente pero tendrá acíividad de exoamilasa no maltogénica. Ejemplos de pruebas para deíerminar funcionalidad se describen aquí y son conocidas por un experto en la íécnica. En modalidades alíamente preferidas, el equivalente funcional tendrá homología de secuencia con exoamilasas no maltogénicas de Pseudomonas saccharophila y Pseudomonas stutzeri antes mencionadas, preferiblemente ambas. El equivalente funcional íambién puede íener homología de secuencia con cualquiera de las secuencias expuestos como SEQ ID NOs: 1 a 14, preferiblemente SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7 o ambas. La homología de secuencia eníre dichas secuencias es preferiblemeníe por lo menos 60%, preferiblemeníe 65% o más, preferiblemeníe 75% o más, preferiblemeníe 80% o más, preferiblemeníe 85% o más, preferiblemente 90% o más, preferiblemenle 95% o más. Dichas homologías de secuencia pueden ser generadas por cualquiera de un número de programas de computadora conocidos en la íécnica, por ejemplo BLAST o FASTA, etc. Un programa de computadora adecuado para llevar a cabo dicha alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, E.U.A.; Devereux et a!, 1984, Nucleic Adds Research 12:387). Ejemplos de oíro software que pueden realizar comparaciones de secuencia incluyen, pero no se limitan al paquete BLAST (véase Ausubel et al, 1999 ibid - capítulo 18), FASTA (Atschu! et al, 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y el juego de herramientas de comparación GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsqueda fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al, 1999 ¡bid, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, se prefiere usar el programa GCG Besífií. En oirás modalidades, los equivalentes funcionales serán capaces de hibridar específicamente a cualquiera de las secuencias expuestas aníeriormeníe. Los méíodos para deíerminar si una secuencia es capaz de hibridar a oíra se conocen en la íécnica, y por ejemplo se describen en Sambrook, el al (supra) y Ausubel, F. M. el al. (supra). En modaüdades altamente preferidas, los equivalentes funcionales serán capaces de hibridar bajo condiciones astringentes, v.gr., 65°C y 0.1 x SSC {1 x SSC = NaC! 0.15 M, ciírato de Na3 0.015 M, pH 7.0}. Por ejemplo, equivalentes funcionales que íienen homología de secuencia a exoamilasas no mallogénicas de Pseudomonas saccharophila y Pseudomonas stutzeri son adecuados para usarse como enzimas progenitoras. Dichas secuencias pueden diferir de la secuencia de Pseudomonas saccharophila en cualquiera o más posiciones. Además, las exoamilasas no maltogénicas de oirás cepas de Pseudomonas spp, tales como ATCCI 7686, también se pueden usar como un polipéptido progenitor. Los residuos de polipéptido de varianíe de PS4 pueden ser insertados en cualquiera de estas secuencias progenítoras para generar las secuencias de polipéptido de variante de PS4. Se entenderá que en donde se desea que los polipéptidos de variante de PS4 comprendan adicionalmente una o más muíaciones, como se expuso aníes, se pueden hacer mutaciones correspondientes en la secuencia de ácido nucleicos de los equivalentes funcionales de exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas spp, así como otros miembros de la "familia de PS4", de modo que puedan ser usados como puntos de partida o polipéptidos progenitores para la generación de polipépíidos de variante de PS4 co o se describe aquí. De manera específica, incluidos deníro del íérmino "polipéptídos de variante de PS4" son los polipéptidos descritos en los documentos: US 60/485,413, 60/485,539 y 60/485,616; PCT/US2004/021723 y PCT/US2004/021739; US 10/886,905 y 10/866,903; US 60/608,919; US 60/612,407; 670 US 60/485,539; PCT/IB2004/002487; US 10/886,023; US 10/886,505, US 10/886,527 y US 10/886,504; US 10/947,612. Estos documentos, sin embargo, no se admiten como técnica aníerior. Dichos polipéplidos son adecuados para usarse en las solicitudes descritas aquí, en particular, como aditivos de alimentos, para íraíar almidón, para preparar un producto alimenticio, para hacer un producto de panadería, para la formulación de composiciones mejoradoras, para la formulación de combinaciones, etc.

Modificación de secuencias proqenitoras Las enzimas progenitoras pueden ser modificadas en el nivel de aminoácido o el nivel de ácido nucleico para generar la secuencia de variante de PS4 como se describe aquí. Por lo tanto, los inventores de la presente proveen la generación de polipéptídos de variante de PS4 al introducir uno o más cambios de codón correspondieníes en la secuencia e nucleótidos que codifica un polípéptido de exoamilasa no malíogénica. La numeración de ácido nucleico preferiblemeníe debe ser con referencia a la numeración de posición de una secuencia de nucleótidos de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mosírada como SEQ ID NO: 6.

Alternativamente, o además, se puede hacer referencia a la secuencia con el número de acceso a GenBank XI 6732. En modalidades preferidas, la numeración de ácido nucleico debe ser con referencia a la secuencia de nucleóíidos moslrada como SEQ ID NO: 6. Sin embargo, como con la numeración de residuos de aminoácidos, la numeración de residuos de esía secuencia se debe usar sólo para propósiíos de referencia únicamente. En particular, se apreciará que los cambios de codones anteriores se pueden hacer en cualquier secuencia de ácido nucleico de la familia de PS4. Por ejemplo, los cambios en la secuencia se pueden hacer a una secuencia de ácido nucleico de exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas saccharophila o Pseudomonas stutzeri (v. gr., X16732, SEQ ID NO: 6 o M24516, SEQ ID NO: 12). La enzima progenitora puede comprender la enzima "completa", es decir, en su longitud entera como ocurre en la naturaleza (o co o es mutada), o puede comprender una forma truncada de la misma. La varianíe de PS4 derivada de ella por consiguiente puede ser íruncada, o puede ser de "longiíud compleía". La íruncación puede ser en el exíremo N-terminal, o el exlremo C-íerminal, preferiblemenle el exlremo C-terminal. La enzima progenitora o varianíe de PS4 puede carecer de una o más porciones, tales como subsecuencias, secuencias de señal, dominios o poricones, ya sea activos o no, etc. Por ejemplo, la enzima progenííora o el polipépíido de varianíe de PS4 puede carecer de una secuencia de señal, como se describió aníes. Alíernaíivamenle, o además, la enzima progenílora o la varianíe de PS4 puede carecer de uno o más dominios calalííicos o de unión. En modalidades allamenle preferidas, la enzima progenitora o variante de PS4 varianíe puede carecer de uno o más de los dominios preseníes en las exoamilasas no mallogénícas, íales como el dominio de unión a almidón. Por ejemplo, los polipépíidos de PS4 pueden tener únicamente secuencias hasía la posición 429, en relación con la numeración de una exoamilasa no malíogénica de Pseudomonas saccharophilia mosírada como SEQ ID NO: 1. Cabe noíar que este es el caso para las variantes de PS4, pSac- d34, pSac-D20 y pSac-D14. En otras modalidades, la enzima progenitora o varianíe de PS4 puede comprender una enzima "compleía", es decir, en su longiíud entera como ocurre en la naluraleza (o como es muíada), junio con una o más secuencias de aminoácidos adicionales en el N-íerminal o C-terminal. Por ejemplo, la enzima progenitora o polípéptído de variante de PS4 puede comprender un residuo de aminoácido adicional individual en el C-terminal o N-terminal, v.gr., M, A, G, etc. Preferiblemeníe, el residuo de aminoácido adicional eslá presente en el N-termínal. En donde se incluye uno o más residuos adicionales, la numeración de posición será desfasado por la longitud de la adición.

Amilasa Los polipéptidos de variante de PS4 generalmeníe comprenden acíividad de amilasa. El término "amilasa" se usa en su sentido normal - v.gr., una enzima que inter alia es capaz de catalizar la degradación de almidón. En particular, son hidrolasas que son capaces de digerir enlaces glicosídicos a-D-(1- 4) en almidón. Las amilasas son enzimas degradadoras de almidón, clasificadas como hidrolasas, que digieren enlaces glicosídicos a-D-(1?4) en almidón. Generalmente, las a-amilasas (E.C.3.2.1.1 , a-D-(1?4)-glucano glucanohidrolasa) se definen como enzimas de endo-acción que digieren enlaces O-glicosídicos a-D-(1?4) dentro de la molécula de almidón de una manera aleatoria. Por el conlrario, las enzimas amilolííicas de exo-acción, íales como ß-amilasas (E.C.3.2.1.2, a-D-(1?4)-glucano malíohidrolasa), y algunas amilasas específicas de producío como alfa-amilasa malíogénica (E.C.3.2.1.133) digieren la molécula de almidón del exíremo no reductor del susíraío, ß-amilasas, a-glucosídasas (E.C.3.2.1.20, a-D-glucósido glucohidrolasa), glucoamilasa (E.C.3.2.1.3, a-D-(1-»4)-glucano glucohídrolasa), y amilasas específicas de producío pueden producir malío-oligosacáridos de una longiíud especifica del almidón.

Exoamilasa no maliogénica Los polípépíídos de varianíe de PS4 descriíos en esíe documento se derivan de (o variantes de) polipépíidos que preferiblemente presenían acíívidad de exoamilasa no mallogénica. Preferiblemeníe, estas enzimas progenitoras son exoamilasas no maltogénicas como tales. Los polipéptidos de variante de PS4 como tales en modalidades altamente preferidas también presentan exoactivídad de amilasa no maltogénica.

En modalidades alíamente preferidas, el íérmino "enzima exoamilasa no maltogénica" como se usa en esíe documenío significa que la enzima no degrada inicialmeníe almidón a caníidades susíanciales de maltosa como se analiza de acuerdo con el procedimienío de deíerminación de producío como se describe en esíe documenío. En modalidades allamenle preferidas, la exoamilasa no mallogénica comprende una exo-malíotelraohidrolasa. Exo-maltotetraohidrolasa (E.C.3.2.1.60) es más formalmente conocida como glucano 1 ,4-alfa-maltotetrahidrolasa. Esta enzima hidroliza enlaces 1 ,4-alfa-D-glucosídícos en polisacáridos amiláceos para remover residuos de maltotetraosa sucesivos de los extremos de cadena no reductores. Las exoamilasas no maltogénicas se describen con deíalle en la patente de E.U.A. número 6,667,065, incorporada aquí por referencia.

Pruebas para acíividad de exoamilasa no malíoqéníca El siguieníe sistema se usa para caracterizar polipépíidos que iienen acíívidad de exoamilasa no mallogénica que son adecuados para usarse de acuerdo con los méíodos y composiciones descritos aquí. Este sistema se puede usar, por ejemplo, para caracterizar los polipéptidos progenitores o de variante de PS4 descritos aquí. A manera de información de antecedentes inicial, la amilopecíina de maíz ceroso (obtenible como WAXILYS 200 de Roqueíte, Francia) es un almidón con un contenido de amilopectína muy alio (por arriba de 90%). 20 mg/ml de almidón de maíz ceroso se hierve durante 3 minutos en un regulador de pH, 50 mM de 755 MES (ácido 2-(N-morfolino)etansulfónico), 2 M de cloruro de calcio, pH 6.0 y se incubó subsecuentemente a 50°C y se usó dentro de media hora. Una unidad de la exoamilasa no maltogénica se define como la cantidad de enzima que libera productos de hidrólisis equivalentes a 1 µmol de azúcar reductor por minuto cuando se incuba a 50°C en un tubo de ensayo con 4 ml de 10 mg/ml de almidón de maíz ceroso en 50 mM de MES, 2 M de cloruro de calcio, pH 6.0 preparado como se describe aníeriormente. Los azúcares reducíores se miden usando maltosa como estándar y usando el método de ácido dinitrosalicílico de Bernfeld, Methods Enzymol, (1954), 1 , 149-158 u otro método conocido en la técnica para cuantificar azúcares reductores. El patrón de producto de hidrólisis de la exoamilasa no maltogénica se determina incubando 0.7 unidades de exoamilasa no maltogénica durante 15 o 300 minutos a 50°C en un íubo de ensayo con 4 ml de 10 mg/ml de almidón de maíz ceroso en el regulador de pH preparado como se describió aníes. La reacción se deíiene sumergiendo el íubo de ensayo durante 3 minutos en un baño de agua hirviente. Los productos de hidrólisis se analizan y cuantifican por CLAR de intercambio de aniones usando una columna Díonex PA 100 con acetato de sodio, hidróxido de sodio y agua como eluyentes, con detección amperométrica pulsada y con maltooligosacáridos lineales conocidos de glucosa a malloheptaosa como eslándares. El facíor de respuesía usado para maltoocíaosa a maltodecaosa es el facíor de respuesía enconlrado para malíohepíaosa. Preferiblemeníe, los polipéplídos de varianíe de PS4 tienen aclividad de exoamilasa no mallogénica de tal manera que si una cantidad de 0.7 unidades de dicha exoamílasa no maltogénica se incubara durante 15 minutos a una temperatura de 50°C a pH 6.0 en 4 ml de una solución acuosa de 10 mg de almidón de maíz ceroso preherbido por ml de solución regulada en su pH que contiene 50 mM de ácido 2-(N-morfolino)eíansulfónico y 2 mM de cloruro de calcio, eníonces la enzima daría producío(s) de hidrólisis que consisíirían de uno o más mallo-oligosacáridos lineales de dos a diez unidades de D-glucopiranosilo y opcionalmeníe glucosa; de íal manera que por lo menos 60%, preferiblemeníe por lo menos 70%, muy preferiblemeníe por lo menos 80% y muy preferiblemeníe aún por lo menos 85% en peso de dichos producios de hidrólisis consisíiría de malloolígosacáridos lineales de íres a diez unidades D-glucopiranosilo, preferiblemente de malloolígosacáridos lineales que consisten de cuatro a ocho unidades de D-glucopirasonilo. Para facilidad de referencia, y para los preseníes propósitos, la caracterísíica de incubar una cantidad de 0.7 unidades de la exoamilasa no maltogénica durante 15 minutos a una lemperalura de 50°C a pH 6.0 en 4 ml de una solución acuosa de 10 mg de almidón de maíz ceroso prehervido por ml de solución regulada en su pH que coníiene 50 mM de ácido 2-(N- morfolino)eíansulfónico y 2 mM de cloruro de calcio, puede referirse como la "prueba de incubación de almidón de maíz ceroso". Por lo íanío, alíernaíívameníe expresados los polipépíidos de varianíe de PS4 preferidos que son exoamilasas no malíogénicas se caracterizan como que lienen la capacidad en la prueba de incubación de almidón de maíz ceroso para dar producío(s) de hidrólisis que consistiría de uno o más malto-oligosacáridos lineales de dos a diez unidades D-glucopirasonilo y opcionalmente glucosa; de tal manera que por lo menos 60%, preferiblemente por lo menos 70%, muy preferiblemente por lo menos 80% y muy preferiblemente por lo menos 85% en peso de dicho producío(s) de hidrólisis consisliría de maltooligosacáridos lineales de tres a diez unidades D-glucopirasonilo, preferiblemente de maltooligosacáridos lineales que consisten de cuatro a ocho unidades D-glucopirasonilo. Los productos de hidrólisis en la prueba de incubación de almidón de maíz ceroso pueden incluir uno o más malto-oligosacáridos lineales de dos a diez unidades D-glucopirasonilo y opcionalmeníe glucosa. Los producios de hidrólisis en la prueba de incubación de almidón de maíz ceroso también puede incluir otros productos hidrolíticos. Sin embargo, las cantidades en % en peso de maltooligosacáridos lineales de tres a diez unidades D-glucopirasonilo se basan en la cantidad del producto de hidrólisis que consiste de uno o más maltooligosacáridos lineales de dos a diez unidades D-glucopirasonilo y opcionalmeníe glucosa. En oirás palabras, las caníidades en por ciento en peso de maltooligosacáridos lineales de tres a diez unidades D-glucopirasonilo no se basan en la caníidad de producios de hidrólisis distintos a uno o más malto-oligosacáridos lineales de dos a diez unidades D-glucopirasonilo y glucosa. Los productos de hidrólisis se pueden analizar por cualesquiera medios adecuados. Por ejemplo, los productos de hidrólisis pueden ser analizados por CLAR de intercambio de aniones usando una columna Dionex PA 100 810 con detección amperométrica pulsada y, por ejemplo, con maltooligosacáridos lineales conocidos de glucosa a malíohepíaosa como eslándares. Para facilidad de referencia, y para los preseníes propósiíos, la característica de analizar el producto(s) de hidrólisis usando CLAR de intercambio de aniones usando una columna Dionex PA 100 con detección amperométrica pulsada y con maltooligosacáridos lineales conocidos de glucosa a maltoheptaosa usados como estándares, se pueden referir como "análisis por intercambio de aniones". Desde luego, y como se acaba de indicar, otras técnicas analíticas serían suficientes, así como otras técnicas de intercambio de aniones específicas. Por lo íanío, alternativamente expresado, un polipéptido de varianíe de PS4 preferido es uno que íiene exoamilasa no malíogénica de íal manera que iiene la capacidad en una prueba de incubación de almidón de maíz ceroso para dar producío(s) de hidrólisis que consisíiría de uno o más maltoolígosacáridos lineales de dos a diez unidades D-glucopirasonilo y opcionalmeníe glucosa, dichos producios de hidrólisis siendo capaces de ser analizados por intercambio de aniones; de tal manera que por lo menos 60%, preferiblemente por lo menos 70%, muy preferiblemente por lo menos 80% y muy preferiblemeníe aún por lo menos 85% en peso de dicho producío(s) de hidrólisis consisíiría de malíooligosacáridos lineales de íres a diez unidades D-glucopirasonílo, preferiblemeníe de malíooligosacáridos lineales que consisíen de cuatro a ocho unidades D-glucopirasonílo. Como se usa aquí, el íérmino "malío-oligosacárido lineal" se usa en el sentido normal como que significa 2-10 unidades de a-D-glucopiranosa enlazada por un enlace a-D-(1-»4). En modalidades altamente preferidas, los polipéptidos de PS4 descritos aquí tienen exoacíividad de amilasa mejorada, preferiblemenle acíividad de exoamilasa no mallogénica, cuando se compara con el polipéptido progenitor, preferiblemente cuando se prueba bajo las mismas condiciones, en particular, en modalidades altamente preferidas, los polipépíidos de variante de PS4 tienen 10% o más, preferiblemente 20% o más, preferiblemente 50% o más, exoactividad de amilasa comparada con sus progenitores, preferiblemente cuando se miden en una prueba de almidón de maíz ceroso. Los productos de hidrólisis se pueden analizar por cualesquiera medios adecuados. Por ejemplo, los productos de hidrólisis pueden ser analizados por CLAR de intercambio de aniones usando una columna Dionex PA 100 con detección amperoméírica pulsada y, por ejemplo, con maltoollgosacárídos lineales conocidos de glucosa a maltoheptaosa como eslándares. Como se usa aquí, el termino "malío-oligosacárido lineal" se usa en el seníido normal como que significa 2-20 unidades de a-D-glucopiranosa enlazada por un enlace a-D-(1-»4).

Propiedades de manipulación meioradas Las varianíes de PS4 descritas aquí preferiblemente tienen propiedades mejoradas cuando se comparan con sus enzimas progenitoras, íales como cualquiera o más de íermoeslabílidad mejorada, estabilidad al pH mejorada, o exo-especificidad mejorada. Las varianíes de PS4 descriías aquí preferiblemente también íienen propiedades de manipulación mejoradas, de íal manera que un producío alimeníicio íraíado con el polípépíido de variante de PS4 íiene cualquiera o todas de firmeza más baja, elasíicidad más alia o cohesividad más alia comparado con un producto alimeníicio que ha sido iraíado con un polipéplido progenitor o un polipéptido de tipo silvestre. Sin desear estar limitado por alguna teoría en paríicular, los inventores de la presente creen que las mutaciones en las posiciones particulares tienen efectos individuales y acumulativos sobre las propiedades de un polipépíido que comprende dichas mulacíones.

Termoestabilidad y estabilidad el pH Preferiblemente, el polipéptído de varianíe de PS4 es íermoesíable; preferiblemente, tiene una lermoesíabilidad mayor que su enzima progenilora. En el trigo y otros cereales las cadenas laterales externas en amilopectína esíán en el iníervalo de DP 12-19. Por lo lanío, la hidrólisis enzimática de las cadenas laterales de amilopectina, por ejemplo, por polipéptidos de variante de PS4 como se describe que tienen actividad de exoamilasa no maltogénica, pueden reducir marcadamente sus tendencias de cristalización. El almidón en el trigo y otros cereales usado para propósiíos de horneado está presente en forma de granulos de almidón que generalmente son resistentes a ataque enzimátíco por amilasas. Por lo tanto, la modificación de almidón es principalmente limitada a almidón dañado y progresa muy lentamente durante el procesamienío de la masa y horneado inicial hasía que la gelaíínización empieza a aproximadameníe 60°C. Como una consecuencia de esío sólo las amilasas con un alio grado de íermoestabilidad son capaces de modificar el almidón eficientemente durante el horneado. Y generalmente la eficiencia de las amilasas se incrementa al incrementarse la termoestabilidad. Esto se debe a que mientras más íermoesíable es la enzima mayor es el íiempo que puede eslar activa duraníe el horneado y por lo lanío se proveerá más efecto anti-rancídez. Por consiguiente, el uso de polipéptídos de variante de PS4 como se describe aquí cuando se añade al almidón en cualquier etapa de su procesamiento a un producto final, v.gr., antes, duraníe o después del horneado a un pan puede relardar o impedir o hacer lenta la retrogradación.

Dicho us se describe con detalle adicional más adelante. Como se usa aquí, el término "termoestable" se refiere a la capacidad de la enzima para retener actividad después de exponerse a temperaturas elevadas. Preferiblemente, el polipéptido de variante de PS4 es capaz de degradar el almidón a temperaturas de aproximadamente 55°C a aproximadamente 80°C o más. De manera adecuada, la enzima retiene su actividad después de exponerse a temperaturas de hasta aproximadamente 95°C. La íermoeslabilidad de una enzima íal como una exoamilasa no malíogénica se mide por su vida media. Por lo lanío, los polípéplidos de variante de PS4 descritos aquí tienen vidas medias prolongadas en relación con la enzima progenitora preferiblemenle por 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 880 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o más, preferiblemente a temperaturas elevadas de 55°C a aproximadamente 95°C o más, preferiblemente a aproximadamente 80°C. Como se usa aquí, la vida media (t1/2) es el tiempo (en minutos) durante el cual la miíad de la aclivídad de la enzima es inactivada bajo condiciones de calor definidas. En modalidades preferidas, la vida media se prueba a 80°C. Preferiblemente, la muestra se calienta duraníe 1-10 minutos a 80°C o más. El valor de la vida media se calcula después midiendo la acíividad de amilasa residual, por cualquiera de los méíodos descriíos aquí. Preferiblemeníe, una prueba de vida media se conduce como se describe con más delalle en los ejemplos.

Preferiblemente, las variantes de PS4 descriías aquí son acíivas duraníe el horneado e hidrolizan el almidón durante y después de la gelaíinización de los granulos de almidón que empieza a íemperaíuras de aproximadamenle 55°C. Mientras más termoestable es la exoamilasa no maltogénica es mayor el tiempo que puede estar activa y por lo lanío se proveerá un mayor efecto manti-rancidez. Sin embargo, durante el horneado por arriba de temperaturas de aproximadamente 85°C, puede íener lugar la inacíivación de la enzima. Si esto sucede, la exoamilasa no maltogénica puede ser gradualmente inactivada de modo que susíancialmeníe no hay acíivídad después del proceso de horneado en el pan final. Por lo íanío, preferencíalmente la exoamilasa no maltogénicas adecuada para usarse como se describe íiene una temperaíura ópíima por arriba de 50°C y por abajo de 98°C. La íermoesíabilidad de las PS4 varianíes descriías aquí se pueden mejorar usando ingeniería de proleína para volverse más lermoestable y por lo tanto mejor adecuada para los usos descritos aquí; por lo tanto, los inventores abarcan el uso de variantes de PS4 modificadas para hacerse más termoestables por ingeniería de proteína. Preferiblemente, el polipéptido de variante de PS4 es estable al pH; muy preferiblemente, tiene una eslabílidad al pH mayor que su polipéptído progenitor cognado. Como se usa aquí, el término "estable al pH" se refiere a la capacidad de la enzima a retener actividad en un amplio intervalo de pHs. Preferiblemente, el polipéptido de variante de PS4 es capaz de degradar almidón a un pH de aproximadameníe 5 a aproximadameníe 10.5. En una modalidad, el grado de pH esíabilidad puede ser probado midiendo la vida media de la enzima en condiciones de pH específicas. En olra modalidad, el grado de eslabilidad al pH puede ser probada midiendo la actividad o actividad específica de la enzima en condiciones de pH específicas. Las condiciones de pH específicas pueden ser cualquier pH de pH 5 a pH 10.5. Por lo tanto, el polipéptido de variante de PS4 puede tener una vida media más larga, o una aclivídad mayor (dependiendo de la prueba) cuando se compara con el polipépíido progenitor bajo condiciones idénticas. Los polípéptidos de variante de PS4 pueden tener 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o más de vida media cuando se comparan con sus polipéptidos progenitores bajo condiciones de pH idéníícas. Alíernaíivameníe, o además, pueden íener dicha acíividad más alia cuando se compara con el polipépíido progenitor bajo condiciones de pH idénlicas.

Exo-especificidad Se sabe que algunas exoamilasas no mallogénica pueden tener algún grado de endoactividad de amilasa. En algunos casos, este íipo de actividad puede necesitar ser reducido o eliminado ya que la endoactividad de amilasa posiblemente puede afectar negativamente la calidad del producto de pan final al producir una migaja pegajosa o gomosa debido a la acumulación de dextrinas ramificadas. La exo-especifícidad se puede medir de manera útil determinando la relación de aclividad loíal de amilasa a la endoaciividad toíal de amilasa. Esta relación se refiere en este documento como un " índice de exo-especificidad". En modalidades preferidas, una enzima se considera una exoamilasa si íiene un índice de exo-especificidad de 20 o más, es decir, su acíivídad loíal de amilasa (incluyendo exo-aclividad de amilasa) es 20 veces o más mayor que su endoactividad de amilasa. En modalidades altamente preferidas, el índice de exo-especificidad de exoamilasas es 30 o más, 40 o más, 50 o más, 60 o más, 70 o más, 80 o más, 90 o más, o 100 o más. En modalidades altamente preferidas, el índice de exo-especificidad es 150 o más, 200 o más, 300 o más, 400 o más, 500 o más o 600 o más. La actividad total de amilasa y la endoactívidad de amílasa puede ser medida por cualesquiera medios conocidos en la lécnica. Por ejemplo, la actividad total de amilasa puede ser medida probando el número total de extremos reductores liberados de un susíraío de almidón. Alternativamente, el uso de una prueba de Betamyl se describe con deíalle adicional en los ejemplos, y para conveniencia, la aclivídad de amilasa como se prueba en los ejemplos se describe en términos de "unidades Betamyl" en los cuadros. La endoactividad de amilasa puede ser probada mediante el uso de un equipo Phadebas (Pharmacia y Upjohn). Esto hace uso de un almidón entrelazado con mareaje azul (marcado con un colorante azo); sólo cortes internos en la molécula de almidón molécula liberan el mareaje, mientras que los cortes externos no lo hacen. La liberación de colorante se puede medir por espectrofotometría. Por consiguiente, el equipo Phadebas mide endoactividad de amilasa, y para conveniencia, los resultados de dicha prueba (descrita en los ejemplos) se refiere en este documento como " unidades Phadebas ". En una modalidad altamente preferida, por lo tanto, el índice de exo-especificidad se expresa en términos de unidades Betamyl/unidades Phadebas, también referido como "B/Phad". La exo-específicidad también se puede probar de conformidad con los métodos descritos en la técnica anterior, por ejemplo, en la publicación de pateníe internacional de los inventores de la preseníe número WO99/50399. Esía mide la exo-especificidad por medio de una relación eníre la endoacíividad de amílasa a la exoacíividad de amilasa. Por lo íanío, en un aspeclo preferido, las variantes de PS4 descritas aquí tendrán menos de 0.5 unidades endoamilasa (EAU) por unidad de exoacíivídad de amilasa. Preferiblemente las exoamilasas no malíogénicas que son adecuadas para usarse de conformidad con la presente invención íienen menos de 0.05 EAU por unidad de exoaclividad de amilasa y muy preferiblemeníe menos de 0.01 EAU por unidad de exoaclividad de amílasa. Las variantes de PS4 descritas aquí preferiblemente tendrán exoespeciflcídad, por ejemplo, medida por índices de exo-especificidad, como se describió anteriormente, consistentes con sus exoamilasas. Más aún, preferiblemente tienen exoespeciflcidad más alta o incrementada cuando se compara con las enzimas o polipéptídos progenitores de los cuales se derivan.

Por lo íanío, por ejemplo, los polipépíídos de varianíe de PS4 pueden tener 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o mayor índice de exo-especificidad cuando se comparan con sus polipépíidos progenitores, preferiblemeníe bajo condiciones idéníicas. Pueden íener 1.5x o mayor, 2x o mayor, 5 x o mayor, 10 x o mayor, 50 x o mayor, 100 x o mayor, cuando se comparan con sus polipépíidos progenitores, preferiblemente bajo condiciones idénlicas.

Propiedades de manipulación meioradas Las variantes de PS4 descriías aquí preferiblemente comprenden una o más propiedades de manipulación mejoradas comparadas con un polipéptido progenitor o un polipéplido de íipo silvestre. Las propiedades de manipulación mejoradas en modalidades preferidas pueden comprender propiedades de horneado mejoradas. Por lo tanto, las variantes de PS4 son íales que un producío alimeníicio íraíado con el polipépíído de varianíe de PS4 íiene una propiedad de manipulación o preferiblemenle horneado mejorada cuando se compara con un produelo alimenticio que ha sido tratado con un polipéptido progenitor o un polípépíido de íipo silvesíre. La propiedad de manipulación u horneado se puede seleccionar del grupo que consisíe de: firmeza, elasíicídad y cohesívidad. Esías propiedades de manipulación se puede probar por cualquier medio conocido en la íécnica. Por ejemplo, la firmeza, elasíícidad y cohesividad se pueden determinar analizando rebanadas de pan por análisis de perfil de texíura usando, por ejemplo, un analizador de textura, como se describe en los ejemplos.

Firmeza Las variantes de PS4 descriías aquí son preferiblemeníe íales que un producío alimenticio tratado con el polipépíido de varianíe de PS4 tienen firmeza más baja comparada con un producto alimeníicio que ha sido íratado con un polipéptído progenitor o un polipépíido de íipo silvesíre. La firmeza en modalidades preferidas esíá inversamente correlacionada con la suavidad del producto alimenticio; por lo tanto, una suavidad más alta puede reflejar una firmeza más baja, y viceversa. La firmeza es preferiblemenle medida por el "proíocolo de evaluación de firmeza" expuesto en el ejemplo 12. Por lo tanto, las variantes de PS4 descriías aquí son preferiblemenle tales que un producto alimenticio tratado con el polipéptido de variante de PS4 tiene un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o más de firmeza más baja comparado con un producto alimenticio que ha sido tratado con un polipéptido progenitor o un polipépíido de lipo silvestre. Un producto alimenticio tratado con el polipéptido de variante de PS4 puede tener un 1.1x, 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8?, 9x, 10x o más de firmeza más baja comparado con un producto alimenticio que ha sido tratado con un polipéptído progenitor o un polipéptido de tipo silvesíre.

Elasticidad Las variantes de PS4 descritas aquí son preferiblemeníe lales que un produelo alimeníicío tratado con el polipéptído de variante de PS4 tiene elasticidad más alta comparado con un producto alimenticio que ha sido tratado con un polipéplido progenitor o un polipéptido de tipo silvestre. La elasíicidad es preferiblemente medida por el "protocolo de evaluación de elasticidad" expuesto en el ejemplo 13. Por lo tanto, las variantes de PS4 descritas aquí son preferiblemente íales que un producío alimeníicio íraíado con el polipéptido de varianíe de PS4 liene un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o más de elaslicidad más alta comparado con un producto alimenticio que ha sido traíado con un polipéplido progenitor o un polipépíido de íipo sílveslre. Un producío alimenticio tratado con el polipéptido de variante de PS4 puede tener un 1.1x, 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x o más de elaslícidad más alia comparado con un producío alimeniicio que ha sido íralado con un polipéptido progenitor o un polípéptido de tipo silvestre.

Cohesividad Las variantes de PS4 descritas aquí son preferiblemeníe lales que un producío alímeníicio íralado con el polipéptido de variante de PS4 tiene cohesivídad más alta comparado con un producto alimenticio que ha sido tratado con un polipéptído progenitor o un polipéptido de tipo sílvesíre. La cohesivídad es preferiblemeníe medida por el "proíocolo de evaluación de cohesivídad" expuesto en el ejemplo 14. Por lo tanto, las variantes de PS4 descriías aquá son preferiblemente lales que un produelo alimenticio tratado con el polipéptido de variante de PS4 tiene un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o más de cohesividad más alta comparado con un producto alimenticio que ha sido íratado con un polipéptido progenitor o un polipéptido de tipo silvesíre. Un produelo alimenticio tratado con el polipéptido de variante de PS4 puede tener un 1.1 x, 1.5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x o más de cohesívidad más alta comparado con un producto alimenticio que ha sido tratado con un polipéptido progenitor o un polipéptido de lipo silvesíre.

Usos de polipéptidos y ácidos nucleicos de variante PS4 Los polipéptidos de variante de PS4, ácidos nucleicos, células hospedero, vectores de expresión, etc., se pueden usar en cualquier aplicación para la cual se puede usar una amilasa. En particular, se pueden usar para sustituir a cualquier exoamilasa no maltogénica. Se pueden usar para amilasa de complemento o actividad de exoamilasa no maltogénica, ya sea sola o en combinación con otras amilasas o exoamilasas no maltogénícas conocidas. Las secuencias de variante de PS4 como se describe aquí se pueden usar en varias aplicaciones en la industria de alimentos - tales como en productos de panadería y bebidas, también se puede usar en otras aplicaciones tales como una composición farmacéutica, o incluso en la indusíria química. En particular, los polipéptidos de variante de PS4 y ácidos nucleicos son úíiles para varías aplicaciones indusíriales incluyendo horneado (como se describe en WO 99/50399) y esíandardización de harina (incremenío y mejora de volumen). Se pueden usar para producir malíoleíraosa a partir de almidón y otros sustratos. Por lo íanío, los inventores de la presente describen un método para preparar un producto alimenlicio, el méíodo comprende: (a) obíener una exoamilasa no malíogénica; (b) iníroducír una muíación en cualquiera o más de las posiciones de la exoamilasa no maltogénica como se expone en esíe documenío; (c) mezclar el polipépíido resulíante con un ingrediente alimeníicio. Los polipépíidos de variante de PS4 se pueden usar para incremeniar el volume de producios de panadería íales como pan. Aunque no se desea esíar limiíado por alguna íeoría en particular, los inventores de la preseníe creen que eslos resulíados de la reducción en viscosidad de la masa duranie el calentamiento (tal como horneado) como resultado de la exoamilasa que acortan las moléculas de amilosa. Esto permite que el dióxido de carbono generado por fermentación incremente el tamaño del pan con menos impedimento. Por lo tanto, productos alimenticios que comprenden o tratados con polipéptídos de variante de PS4 se expanden en volumen cuando se comparan con productos que no han sido íraíados, o íraíados con polipépiidos progenitores. En oirás palabras, los producios alimenticios tienen un volumen más grande de aire por volumen de producío alímeníicio. Alternativamente, o además, los productos alimeníicíos íraíados con polipépíidos de varianíe de PS4 íienen una densidad más baja, o peso (o masa) por relación de volumen. En modalidades particularmente preferidas, los polípépíidos de varianíe de PS4 se usan para incremeniar el volumen de pan. El incremenío o expansión de volumen es benéfico porque reduce la cualidad de goma o de almidón de los alimeníos. Los alimentos ligeros son preferidos por los consumidores, y la experiencia del consumidor se incrementa. En modalidades preferidas, el uso de polipéptidos de variante de PS4 incremente el volumen en 10%, 20%, 30% 40%, 50% o más. El uso de polípépíidos de varianíe de PS4 para incremeníar el volumen de los alimeníos se describe con deíalle en los ejemplos.

Usos en alimeníos Los polipépíidos de varianíe de PS4 y ácidos nucleicos descritos aquí pueden ser usados como - o, en la preparación de - un alimento. En particular, se pueden añadir a un alimento, es decir, como un adilivo alimeníicio. Se pretende que el término "alimento" incluya tanto alimento preparado, como un ingrediente para un alimento, tal como una harina. En un aspecto preferido, el alimento es para consumo humano. El alimento puede esíar en forma de una solución o como un sólido - dependiendo del uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de adminisíración. Los polipéptidos de variante de PS4 y ácidos nucleicos se pueden usar como un ingrediente de alimenío. Como se usa aquí, el término "ingredieníe de alimenío" incluye una formulación, que es o se puede añadir a alimentos maíeriales alimeníicios funcionales o se incluyen formulaciones que se pueden usar a niveles bajos en una amplia variedad de producios que requieren, por ejemplo, acidificación o emulsionamienío. El ingredieníe de alimenio puede estar en forma de una solución o como un sólido -dependiendo del uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración. Los polipépíidos y ácidos nucleicos de variante de PS4 descritos aquí pueden ser - o puede añadirse a - complementos alimeniicios. Los polípéptídos y ácidos nucleicos de variante de PS4 descriíos aquí pueden ser — o se pueden añadir a - alimentos funcionales. Como se usa aquí, el término "alimenío funcional" significa alimenío que es capaz de proveer no sólo un efecto nutricional y/o una satisfacción de gusto, sino también capaz de suministrar un efecto benéfico adicional al consumidor. Aunque no hay una definición legal de un alimento funcional, la mayoría de las partes con un interés en esía área concuerdan que son alimeníos comercializados como que lienen efectos de salud específicos. Los polipépíidos de variante de PS4 íambién se pueden usar en la fabricación de un producío alimenticio o un maíerial alimeníicio. Materiales alimeníicios lípicos ¡ncluyen productos lácteos, producios cárnicos, producios de aves de corral, producios de pescado y producios de masa. El producío de masa puede ser cualquier produelo de masa procesado, incluyendo masas freídas, freídas por inmersión, asadas, horneadas, al vapor y hervidas, tales como pan y tortas de arroz al vapor. En modalidades altamente preferidas, el producto alimenticio es un producto de panadería. Preferiblemente, el material alimenticio es un producto de panadería. Los productos de repostería (horneados) típicos incluyen pan -íales como pan de caja, roles, bollos, bases para pizza, eíc, pastelillos, pretzels, tortillas, pasteles, galletas, bísquetes, galleías saladas, eíc. Los producios alimenticios preferiblemente se benefician de una o más de las propiedades de manipulación u horneado mejoradas de los polipéptídos de variante de PS4 descrilos aquí. Las propiedades de manipulación u horneado mejoradas se pueden seleccionar del grupo que consiste de: firmeza mejorada, elasticidad mejorada y cohesividad mejorada. Por lo tanto, los inventores de la presente describen un método para modificar un aditivo alimenticio que comprende una exoamilasa no malíogénica, el método comprende iníroducir una muíación en cualquiera de una o más de las posiciones de la exoamilasa no malíogénica como se expone en esíe documento. El mismo método se puede usar para modificar un ingrediente de alimento, o un complemento alimeníicio, un producío alimenlício, o un maíerial alimeníício.

Retrogradación/Rancidez Los inventores de la presente describen el uso de proteínas de varianíe PS4 que son capaces de reiardar la rancidez del medio de almidón, tal como geles de almidón. Los polipéptídos de variante de PS4 son especialmente capaces de retardar la retrogradación perjudicial del almidón. La mayoría de los granulos de almidón están compuestos de una mezcla de dos polímeros: una amilasa esencialmente lineal y una amilopectina altamente ramificada. La amilopectina es una molécula ramificada muy grande, que consiste de cadenas de unidades a-D-glucopirasonilo unidas por enlaces (1-4), en donde dichas cadenas son unidas por enlaces a-D-(1-6) para formar ramas. La amilopectina está presente en todos los almidones naturales, que conslituyen aproximadamente 75% de la mayoría de los almidones comunes. La amilosa es esencialmente una cadena lineal de unidades a-D-glucopirasonilo (1-4) enlazadas que íienen algunas ramas de a-D-(1-6). La mayoría de los almidones coníienen aproximadamente 25% de amilosa. Los granulos de almidón caleniados en presencia de agua sufren íransicíón de fase de orden-desorden llamada gelaíinización, en donde el líquido es tomado por los granulos hinchables. Las temperaíuras de gelatinización varían para diferentes almidones. Al enfriarse el pan recién horneado, la fracción de amílosa, dentro de horas, retrocede para desarrollar una red. Esíe proceso es benéfico porque crea una esírucíura de migajón deseable con un grado bajo de firmeza y propiedades de rebanado mejoradas. Muy gradualmeníe la crisíalízación de amilopecíína ííene lugar dentro de los granulos de almidón gelaiínizados duranie los días después del horneado. En esíe proceso, se cree que la amilopecíína refuerza la red de amílosa en la cual los granulos de almidón son embebidos. Este refuerzo conduce a firmeza incrementada del migajón de pan. Este refuerzo es una de las principales causas de rancidez del pan. Se sabe que la calidad de los producios horneados gradualmeníe se deíeriora duraníe el almacenamiento. Como consecuencia de la recristalización del almidón (lambién llamada reírogradación), la capacidad de retención de agua del migajón se cambia con implicaciones importantes sobre las propiedades organolépticas y dietéticas. El migajón pierde suavidad y elasticidad y se vuelve firme y grumosa. El ¡ncremento en la firmeza del mígajón a menudo se usa como una medición del proceso de rancidez del pan. La tasa de relrogradación perjudicial de amilopectina depende de la longitud de las cadenas laterales de amilopectina. Por lo tanto, la hidrólisis enzimática de las cadenas laterales de amilopectina, por ejemplo, por polipéptidos de variante de PS4 que tienen aciividad de exoamilasa no maltogénica, pueden reducir marcadamente sus tendencias de crisíalización. Por consiguiente, el uso de polipéptidos de variante de PS4, como se describe aquí, cuando se añaden al almidón en cualquier eíapa de su procesamienío en un producío alimeniicio, v.gr., antes, durante y después del horneado en pan pueden retardar o impedir o hacer lenta la retrogradación. El uso se describe con deíalle adicional más adelante. Por lo lanío, los inventores de la presente describen un método para mejorar la capacidad de una exoamilasa no maltogénica para prevenir rancidez, preferiblemente retrogradación perjudicial, de un producto de masa, el método comprende introducir una mutación en cualquiera o más de las posiciones de la exoamilasa no malíogénica como se expone en este documento.

Pruebas para la medición de retrogradación (incluyendo rancidez) Para evaluación del efecto anti-rancídez de los polipéptldos de variante de PS4 que tienen actividad de exoamilasa no maltogénica descritos aquí, la firmeza del migajón se puede medir 1 , 3 y 7 días después del horneado por medio de un analizador de textura de alimentos universal Instron 4301 Universal Food Texture Analyzer o equipo similar conocido en la técnica. Oíro méíodo usado íradicionalmeníe en la íécnica y que se usa para evaluar el efecto sobre reírog rad ación de almidón de un polipéptido de varianíe de PS4 que íiene acíividad de exoamilasa no malíogénica se basa en DSC (calorimetría de escudriñamiento diferencial). Aquí, se mide la entalpia de fusión de amilopectina reírograduada en migajón de pan o migajón de una masa de sisíema de modelo horneado con o sin enzimas (conírol). El equipo de DSC aplicado en los ejemplos descriíos es un Meííler-Toledo DSC 820 que opera con un gradiente de temperatura de 10°C por minuío de 20 a 95°C. Para la preparación de las muesiras 10-20 mg de migajón se pesan y se transfieren a charolas de aluminio Metíler-Toledo que después se sellan herméíícamente. Las masas de sislema de modelo usadas en los ejemplos descriíos coníienen harina de trigo estándar y canlidades ópíimas de agua o regulador de pH con o sin la exoamilasa no malíogénica de varianíe de PS4. Se mezclan en un harinógrafo Brabender de 10 ó 50 g duraníe 6 ó 7 minuíos, respecíivameníe. Muesíras de las masas se colocan en íubos de ensayo de vidrio (15*0.8 cm) con una íapa. Estos tubos de ensayo se someten a un procedimiento de horneado en un baño de agua que empieza con 30 minutos de incubación a 33°C seguido por calentamiento de 33 a 95°C con un gradiente de 1.1 °C por minuto y finalmente 5 minuíos de incubación a 95°C. Subsecuentemente, los íubos se almacenan en un íermosíaío a 20°C aníes del análisis de DSC. En modalidades preferidas, las variantes de PS4 descriías aquí íienen una eníalpia de fusión reducida, comparada con el conírol, en modalidades alíameníe preferidas, las variantes de PS4 íienen 10% o más de eníalpia de fusión reducida. Preferiblemeníe, íienen 20% o más, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de eníalpía de fusión reducida cuando se compara con el control.

CUADRO 2 El cuadro 2 anterior muestra valores de DSC de sistemas de masa de modelo preparados con diferentes dosis de pSac-D34 después de 7 días de almacenamienío. 0.5, 1 y 2 partes por millón (o micrograrno por gramo) se harina se prueban.

Preparación de producios de almidón Los inventores de la preseníe proveen el uso de polípépiidos de varianíe de PS4 en la preparación de producios alimeníicios, en particular, productos de almidón. El método comprende formar el producto de almidón al añadir una enzima exoamilasa no maltogénica tal como un polípépíido de varianíe de PS4, a un medio de almidón. Si el medio de almidón es una masa, eníonces la masa se prepara mezclando eníre sí harina, agua, la exoamilasa no mallogénica que es un polípéptido de variante de PS4 y opcionalmente otros posibles ingredientes y adilivos. El término "almidón" significa almidón per se o un componente del mismo, especialmente amilopectina. El término "medio de almidón" significa cualquier medio adecuado que comprende almidón. El íérmino "produelo de almidón" significa cualquier producto que contiene o se basa en o se deriva de almidón. Preferiblemente, el producto de almidón contiene o se basa en o se deriva de almidón obtenido de harina de trigo. El término "harina" como se usa aquí es un sinónimo para la harina de trigo u otro grano finamente molida. Preferiblemente, sin embargo, el término significa harina obtenida de trigo per se y no de otro grano. Por lo tanto, y a menos que se exprese de otra manera, referencias a "harina de trigo" como se usa aquí preferiblemente significan referencias a harina de írigo per se así como a harina de trigo cuando está presente en un medio, tal como una masa. Una harina preferida es harina de trigo o harina de centeno o mezclas de harina de trigo y centeno. Sin embargo, la masa que comprende harina derivada de otros tipos de cereales tales como por ejemplo de arroz, maíz, cebada, y maíz de Guinea también se contemplan. Preferiblemente, el producto de almidón es un producío para hornear. Muy preferiblemente, el producío de almidón es un produelo para pan. Muy preferiblemeníe aún, el producío de almidón es un producto para pan harináceo horneado. El término " producto para pan harináceo horneado" se refiere a cualquier producto horneado basado en una masa obtenible mezclando harina, agua, y un agente de elevación bajo condiciones formadoras de masa. Componentes adicionales desde luego se pueden añadir a la mezcla de masa. Por lo tanto, si el producto de almidón es un producto para pan harináceo horneado, entonces el procedimienío comprende mezclar - en cualquier orden adecuado - harina, agua, y un agente de elevación bajo condiciones de formación de masa y añadir después un polípéptido de varianíe de PS4, opcionalmente en forma de una premezcla. El agente de elevación puede ser un ageníe de elevación químico íal como bicarbonato de sodio o cualquier cepa de Saccharomyces cerevisiae (levadura para hornear). La exoamilasa no maltogénica de varianíe de PS4 se puede añadir junio con cualquier ingredienle de masa incluyendo el agua o mezcla de ingrediente de masa o con cualquier adiíivo o mezcla de adiíivos. La masa se puede preparar por cualquier mélodo de preparación de masa convencional común en la industria de horneado o en cualquier otra industria para hacer productos basados en masa de harina. El horneado de productos de pan harináceos tales como, por ejemplo, pan blanco, pan hecho de harina de centro y harina de trigo cribada, roles y similares se logra íípicameníe medíanle horneado de la masa de pan a temperaturas de horno en el intervalo de 180 a 250°C durante aproximadamente 15 a 60 minuíos. Durante el procedimiento de horneado un gradiente de temperatura más abrupto (200 ? 120°C) prevalece en las capas de masa externas en donde la costra caracterísííca del producto horneado se desarrolla. Sin embargo, debido al consumo de calor debido a la generación de vapor, la temperatura en el migajón es sólo cercana a 100°C al final del procedimiento de horneado. Por lo tanto, los inventores de la presente describen un procedimiento para hacer un producto de pan que comprende: (a) proveer un medio de almidón; (b) añadir al medio de almidón un polipéptido de variante de PS4 como se describe en este documento; y (c) aplicar calor al medio de almidón durante o después del paso (b) para producir un producto de pan. Los inventores íambién describen un procedimienío para hacer un producto de pan que comprende añadir a un medio de almidón un polipépíido de variante de PS4 como se describe. La exoamilasa no mallogénica de polipéptído de variante de PS4 se puede añadir como una preparación líquida o como una composición pulverulenta seca que comprende ya sea la enzima como el único componente acíivo o en mezcla con uno o más ingredientes de masa adicionales o adilivo de masa.

Composición mejoradora Los inventores describen composiciones mejoradoras, que incluyen composiciones mejoradoras de pan y composiciones mejoradoras de masa. Estas comprenden un polipéptído de variante de PS4, opcionalmenle junto con un ingredienle adicional, o una enzima adicional, o ambas. También proveen el uso de dichas composiciones mejoradoras de pan y masa en horneado. En un aspecío adicional, proveen un producto o masa horneado obtenido de la composición mejoradora de pan o composición mejoradora de masa. En otro aspecto, describen un producto o masa horneado obtenido a partir del uso de una composición mejoradora de pan o una composición mejoradora de masa.

Preparación de masa Una masa se puede preparar mezclando harina, agua, una composición mejoradora de masa que comprende polipéptido de varianíe de PS4 (como se describió antes) y opcionalmente otros ingredientes y aditivos. La composición mejoradora de masa se puede añadir junto con cualquier ingrediente de masa incluyendo la harina, agua u otros ingredientes o aditivos opcionales. La composición mejoradora de masa se puede añadir antes de la harina o agua u otros ingredientes o aditivos opcionales. La composición mejoradora de masa se puede añadir después de la harina o agua, u otros ingredientes o aditivos opcionales. La masa se puede preparar por cualquier método de preparación de masa convencional común en la indusíria de horneado o en cualquier oíra indusíria para hacer producios basados en masa de harina. La composición mejoradora de masa se puede añadir como una preparación líquida o en forma de una composición de polvo seco ya sea que comprende la composición como el único componente acíivo o en mezcla con uno o más ingredientes de masa adicionales o adilívo de masa. La canlidad del polipépíido de exoamilasa no mallogénica de variante de PS4 que se añade está normalmente en una caníidad que da por resulíado la presencia en la masa acabada de 50 a 100,000 unidades por kg de harina, preferiblemeníe 100 a 50,000 unidades por kg de harina. Preferiblemeníe, la caníidad esíá en el intervalo de 200 a 20,000 unidades por kg de harina. Alternativamente, la exoamilasa no maltogénica de polipéptído de variante de PS4 se añade en una cantidad que da por resulíado la presencia en la masa acabada de 0.02 - 50 ppm de enzima basada en harina (0.02 - 50 mg de enzima por kg de harina), preferiblemente 0.2 - 10 ppm. En el preseníe contexto, 1 unidad de la exoamilasa no maltogénica se define como la cantidad de enzima que libera productos de hidrólisis equivalentes a 1 µmol de azúcar reductor por minuto cuando se incuba a 50°C en un tubo de ensayo con 4 ml de 10 mg/ml de almidón de maíz ceroso en 50 mM de MES, 2 mM de cloruro de calcio, pH 6.0 como se describe aquí más adelante. La masa como se describe aquí generalmente comprende harina de írigo o harina de írigo finamente molida y/u otros tipos de harina, harina finamente molida o almidón tal como harina de maíz, almidón de maíz, harina de maíz, harina de arroz, harina de centeno, harina de centeno finamente molida, harina de avena finamente molida, harina de avena, harina de soya, harina de sorgo, harina de sorgo finamente molida, harina de papa, harina de papa finamente molida o almidón de papa. La masa puede ser fresca, congelada, o parcialmeníe horneada. La masa puede ser una masa elevada o una masa para ser somelida a elevación. La masa puede ser elevada de varias maneras, íal como añadiendo ageníes de elevación químicos, v.gr., bicarbonato de sodio o añadiendo una susíancia de elevación (masa de fermeníación), pero se prefiere elevar la masa añadiendo un culíivo de levadura adecuado, íal como un culíivo de Saccharomyces cerevisiae (levadura para hornear), v.gr., una cepa comercialmenle disponible de S. cerevisiae. La masa puede comprender grasa lal como grasa granulada o manteca vegetal. La masa puede comprender además un emulsionante adicional lal como mono- o diglicéridos, esteres de azúcar de ácidos grasos, esteres de poliglicerol de ácidos grasos, esteres de ácido láctico de monoglicéridos, esteres de ácido acético de monoglicéridos, estearatos de polioxetileno, o lisolecitina. Los inventores de la presente también describen una premezcla que comprende harina junio con la combinación como se describe aquí. La premezcla puede conlener otros aditivos mejoradotes de masa y/o mejoradoíes de pan, v.gr., cualquiera de los adiíivos, incluyendo enzimas, mencionadas aquí.

Adiíivos o ingredieníes de masa adicional A fin de mejorar adicionalmeníe las propiedades del producto horneado de impartir cualidades distintivas del producto horneado se pueden incorporar a la masa ingredientes de masa y/o adiíivos de masa adicionales. Típicameníe, dichos componentes adicionales añadidos pueden incluir ingredieníes de masa íales como sal, granos, grasa y aceites, azúcar o edulcorante, fibras díeíélicas, fueníes de proleína íales como polvo de leche, soya de gluten o huevos y aditivos de masa tales como emulsionantes, oirás enzimas, hidrocoloides, agentes saborizantes, agentes oxidaníes, minerales y viíaminas. Los emulsionantes son úííles como fortificantes de masa y suavizantes de migajón. Como fortificantes de masa, los emulsionantes pueden proveer tolerancia con respecto al íiempo de reposo y íolerancia al impacto duranie la prueba. Además, los fortificantes de masa mejorarán la tolerancia de una masa dada a variaciones en el tiempo de fermentación. La mayoría de los fortificantes de masa también mejoran a elevación en horno lo que significa el incremento en volumen de los productos probados a los productos horneados. Por último, los fortificantes de masa emulsionarán cualesquiera grasa presentes en la mezcla de la receta. Los emulsionantes adecuados ¡ncluyen lecitina, estearato de polioxietileno, mono- y díglicéridos de ácidos grasos comesíibles, esteres de ácido acético de mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles, esteres de ácido láctico de mono- y diglícéridos de ácidos grasos comestibles, esteres de ácido cítrico de mono- y diglícéridos de ácidos grasos comestibles, esteres de ácido diacetiltartárico de mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles, esteres de sacarosa de ácidos grasos comestibles, estearoil-2-lactilato de sodio y estearoil-2-lactilato de calcio. El aditivo o ingrediente de masa adicional se puede añadir junto con cualquier ingrediente de masa incluyendo la harina, agua y oíros ingredieníes o adiíivos opcionales, o la composición mejoradora de masa. El adilivo o ingredienle de masa adicional se puede añadir antes de la harina, agua, otros ingredientes y aditivos opcionales o la composición mejoradora de masa. El aditivo o ingredieníe de masa se puede añadir después de la harina, agua, otros ingredientes y aditivos opcionales o la composición mejoradora de masa. El aditivo o ingrediente de masa adicional convenientemente puede ser una preparación líquida, sin embargo, el aditivo o ingrediente de masa adicional convenientemente puede estar en forma de una composición seca. Preferiblemente, el aditivo o ingrediente de masa adicional es por lo menos 1% el peso del componente de harina de la masa. Muy preferiblemente, el aditivo o ingrediente de masa adicional es por lo menos 2%, preferiblemente por lo menos 3%, preferiblemente por lo menos 4%, preferiblemente por lo menos 5%, preferiblemente por lo menos 6%. Si el aditivo es una grasa, entonces típicamente la grasa puede estar presente en una cantidad de 1 a 5%, típicamente de 1 a 3%, muy típicamente de 2%.

Enzima adicional Además de los polipéptidos de variante de PS4, una o más enzimas adicionales se pueden usar, por ejemplo añadidas al alimento, preparación de masa, maierial alimenticio o composición de almidón. Las enzimas adicionales que se pueden añadir a la masa incluyen oxidoreductasas, hidrolasas, tales como lípasas y esíerasas así como glicosidasas como a-amilasa, pululanasa y xílanasa. Las oxidoreducíasas tales como por ejemplo glucosaoxidasa y hexosaoxidasa, se pueden usar para fortificación de la masa y control de volumen de los productos horneados y las xilanasas y otras hemicelulasas se pueden añadir para mejorar las propiedades de manejo de la masa, firmeza de migajón y volumen del pan. Las lipasas son útiles como fortificantes de masa y suavizantes de migajón y las a-amilasas y otras enzimas amilolíticas se pueden incorporar en la masa para controlar el volumen del pan y reducir adicionalmente la firmeza del migajón. Enzimas adicionales que se pueden usar se pueden seleccionar del grupo que consiste de una celulasa, una hemicelulasa, una enzima degradadora de almidón, una proteasa, una lipoxigenasa. Ejemplos de oxidoreductasa útiles incluyen oxidasas tales como enzima oxidante de maltosa, una glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4), carbohidrato oxidasa, glicerol oxidasa, piranosa oxidasa, galactosa oxidasa (EC 1.1.3.10) y hexosa oxidasa (EC 1.1.3.5). Entre las enzimas degradadoras de almidón, las amilasas son particularmente útiles como aditivos mejoradores de masa. La a-amilasa descompone en almidón en dexírinas que posteriormente son descompuestos por ß-amilasa a maltosa. Oirás enzimas degradadoras de almidón útiles que se pueden añadir a una composición de masa incluyen glucoamilasas y pululanasas. Preferiblemente, la enzima adicional es por lo menos una xilanasa y/o por lo menos una amilasa. El término "xilanasa" como se usa aquí se refiere a xilanasas (EC 3.2.1.32) que hidrolizan enlaces xilosidicos. También se puede añadir una lípasa. El término "amilasa" como se usa aquí se refiere a amílasas tales como a-amilasas (EC 3.2.1.1 ), ß-amílasas (EC 3.2.1.2) y ?-amilasas (EC 3.2.1.3), La enzima adicional se puede añadir junto con cualquier ingredieníe de masa incluyendo la harina, agua u oíros ingredieníes o adiíivos opcionales, o la composición mejoradora de masa. La enzima adicional se puede añadir aníes de la harina, agua y opcionalmeníe oíros ingredientes y adiíívos o la composición mejoradora de masa. La enzima adicional se puede añadir después de la harina, agua y opcionalmeníe de oíros ingredientes o adilivos o la composición mejoradora de masa. La enzima adicional convenientemente puede ser una preparación líquida. Sin embargo, la composición convenientemente puede estar en forma de una composición seca. Algunas enzimas de la composición mejoradora de masa son capaces de interacluar unas con oirás bajo las condiciones de masa a un grado en donde el efecío sobre la mejora de las propiedades reológicas y/o manejo con máquina de una masa de harina y/o la calidad del producío hecho a partir de la masa por las enzimas no es sólo adiíivo, sino que el efecío es sínergíslico. En relación con la mejora del producío hecho a partir de la masa (producto acabado), se puede encontrar que la combinación da por resulíado un efecío sinergíslíco sustancial con respecto a la estrucíura del migajón. También, con respecío al volumen específico del producto horneado se puede encontrar un efecto sinergíslico. La enzima adicional puede ser una lipasa (EC 3.1.1) capaz de hidrolizar enlaces de éster carboxílico para liberar carboxilato. Ejemplos de lipasas incluyen pero no se limitan a triacilglicerol lipasa (EC 3.1.1.3), galacíolipasa (EC 3.1.1.26), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32, fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4) y lipoproíeína lipasa A2 (EC 3.1.1.34).

Oíros usos Las variantes de PS4 son adecuadas para la producción de maltosa y jarabes con alto contenido de maltosa. Dichos producios son de interés considerable en la producción de ciertas confiterías debido a Da baja higroscopicidad, baja viscosidad, buena estabilidad al calor y sabor suave, no demasiado dulce de la maltosa. El proceso industrial de producir jarabes de maltosa comprende licuar almidón, después sacarificación con una enzima productora de maltosa y opcíonalmente con una enzima que digiere los puntos 1 ,6-ram ¡ficantes en amilopectina, por ejemplo una alfa-1 ,6-amiloglucosidasa. Las variantes de PS4 descritas aquí se pueden añadir y por lo tanto ser un componente de una composición detergente. La composición detergente se puede formular por ejemplo como una composición detergente para lavandería manual o de máquina incluyendo una composición aditiva para lavandería adecuada para pretratamíento de telas teñidas y una composición suavizante de íelas añadida al enjuague, o se puede formular como una composición detergente para usarse en operaciones de limpieza de superficies duras domésticas generales, o se puede formular para operaciones de lavado de vajilla manual o en máquina. En un aspecío específico, los inventores de la presente describen un adiíivo de deíergeníe que comprende la variante de PS4. El adiíívo de deíergeníe así como la composición detergente puede comprender una o más de otras enzimas íales como una proíeasa, una lípasa, una cuíinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pecíinasa, una mananasa, una arabinasa, una galacíanasa, una xilanasa, una oxidasa, v.gr., una lacasa, y/o una peroxidasa. En general, las propiedades de la enzima(s) escogida pueden ser compaíibles con el detergente seleccionado (es decir, pH ópíimo, compaíibilidad con oíros ingredientes enzimáíicos y no enzimáíícos, eíc), y la enzíma(s) debe esíar preseníe en caníídades efeclívas. La variante de PS4 íambién se puede usar en la producción de maíeriales lignocelulósícos iales como pulpa, papel y cartón, de papel y cartón de desecho reforzado con almidón, especialmente en donde ocurre reformación de pulpa a un pH por arriba de 7 y en donde las amilasas pueden faciliíar la desintegración del maíerial de desecho a iravés de la degradación del almidón de refuerzo. Las variantes de PS4 pueden ser especialmente útiles en un procedimienío para producir una pulpa de fabricación de papel a partir de papel impreso revesíido con almidón. El procedimienío se puede realizar como se describe en el documento WO 95/14807, que comprende los siguieníes pasos: a) desiníegrar el papel para producir una pulpa, b) íratar con una enzima degradadora de almidón antes, durante o después del paso a), y c) separar partículas de finía de la pulpa después de los pasos a) y b). La varianíe de PS4 íambién puede ser muy úíil en la modificación de almidón en donde se usa almidón enzimáíícameníe modificado en la fabricación de papel junto con llenadores alcalinos tales como carbonato de calcio, caoiina y arcillas. Con las variantes de PS4 descriías aquí es posible modificar el almidón en presencia del llenador permitiendo así un proceso integrado más simple. Una variante de PS4 también puede ser muy útil en remoción de apresto en íexíiles. En la induslria de procesamienío de iexíiles, las amilasas se usan íradicionalmenle como auxiliares en el proceso de remoción de apresto para faciliíar la remoción de apresto que coníiene almidón que ha servido como un revesíimienío protector sobre hilos de urdimbre duraníe el íramado. La remoción compleía del revesíímienío de apresto después del íramado es importante para asegurar resulíados ópíimos en los procesos subsecuentes, en lo cuales la lela es limpiada, blanqueada y teñida. La descomposición enzimálica del almidón es preferida debido a que no implica ningún efecto nocivo sobre el material de la fibra. La variante de PS4 se puede usar sola o en combinación con una celulasa cuando se remueve el apresto de la tela o textil que contiene celulosa. La varianíe de PS4 íambíén puede ser una amilasa de elección para la producción de edulcorantes a partir de almidón. Un procedimienlo "íradicional" para la conversión de almidón a jarabe de fructosa nuevamente consiste de tres procedimientos enzimáticos consecutivos, es decir, un procedimienlo de licuefacción seguido por un procedimiento de sacarificación y un procedimiento de isomerización. Durante el procedimiento de licuefacción, el almidón es degradado a dextrinas por una amílasa a valores de pH entre 5.5 y 6.2 y a temperaturas de 95-160°C, durante un periodo de aproximadamente 2 horas. A fin de asegurar una estabilidad de enzima óptima bajo estas condiciones, 1 mM de calcio se añade (40 ppm de iones de caldo libre). Después del procedimiento de licuefacción las dextrinas son convertidas a dextrosa mediante la adición de una glucoamilasa y una enzima desramificadora, íal como una isoamilasa o una pululanasa. Aníes de esíe paso, el pH es reducido a un valor por abajo de 4.5, manteniendo la íemperaíura elevada (por arriba de 95°C), y la acíividad de amilasa en la licuefacción es desnaíuralizada. La temperatura es reducida a 60°C, y la glucoamilasa y enzima desramificadora se añaden. El procedimiento de sacarificación procede durante 24-72 horas.

Producción de bioeíanol El polipépíido de varianíe de PS4 de la invención se puede usar en general para convertir almidón en azúcares que después pueden ser procesados a elanol u oíros producios de valor agregado íales como edulcorante de maíz con ato contenido de fructosa. Por lo tanto, los inventores de la presente describen el uso de polipéptídos de varianíes de PS4 en la producción de bioelanol, que en este documenío debe considerarse como cualquier etanol producido por fermentación de biomasa. El etanol así producido se pueden usar como un combustible o bebida o se puede usar en un proceso de fermeníación para producir compuesíos orgánicos, íales como ácido cííríco, ácido ascórbico, lisina, ácido gluíámico. El eíanol (o alcohol etílico) es mejor conocido como siendo la base de bebidas alcohólicas como licores, cerveza y vino. Además, el eíanol iiene muchos usos en la producción de compuestos químicos industriales, compuestos farmacéuticos y como un combusíible de íransporte.

El elano se puede producir a partir de casi cualquier material en bruto que contenga azúcar o carbohidratos. Como tal, el etanol se puede hacer a paríir de una amplia variedad de material biológico. Los 3 íipos principales de maíeriales de alimenlación de biomasa usados para producir elanol ¡ncluyen cultivos de azúcar tales como caña de azúcar; cultivos de almidón, incluyendo trigo y maíz, y maíeriales celulósicos íales como residuos de culíivo (paja, ele), y desechos forestales. La producción de etanol a partir de fuentes fácilmente disponibles de celulosa provee una fuente de combustible estable, renovable. La tecnología de procesamiento muy frecuentemente usada es la molienda de grano seco. En este proceso, el grano primer se muele a una consistencia de harina de grano. La harina es después mezclada con agua y amilasa y se hace pasar a iravés de quemadores en donde el almidón en el grano es licuado. Bajo la adición de glucoamilasa, el almidón licuado es convertido a azúcares fermeníables. La levadura después se añade a la malta para fermentar loa azúcares a etanol. Después de la fermentación, la malta pasa a través de un proceso de deslilación y deshidratacíón en donde el alcohol es removido de los sólidos y el agua. En la práctica, aproximadamente dos terceras partes de cada tonelada de grano es convertida a eíanol de combustible. Los subproductos restantes -material fino de destilado y granos húmedos de destiladores- son un elemento para ganado con alio coníenido de proíeína que es particularmente bien adecuado para animales íales como ganado vacuno u ovejas.

El elanol íambién se puede hacer a partir de fuentes que contienen celulosa, lales como pulpa de madera. Los materiales de alimentación basados en celulosa están compuestos de desechos agrícolas, pastos y madera y otras biomasa de bajo valor tal como desechos municipales (v.gr., papel reciclado, desechos de jardines, etc.). El eianol se puede producir a partir de la fermentación de cualquiera de esos materiales de alimentación celulósicos. Sin embargo, la celulosa debe ser convertida a azúcares antes de que pueda haber conversión a etanol, mediante íraíamiento con una enzima adecuada íal como celulasa. Una vez que el eíanol deja la plañía de procesamiento, teóricamente se puede usar como un combusíible para automóviles como íal o se puede mezclar con gasolina a una relación de 85 a 15 para formar [o que se llama "combusíible de eíanol neto". Sin embargo, muy comúnmente, el eíanol se mezcla con gasolina a concenlraciones de 7 a 10% en volumen. El eíanol se puede usar como un incremeníador de ocíano. El eíanol como una fueníe de combuslible es menos nociva ambienlalmenle que los producios derivados del petróleo. Se sabe que el uso del etanol mejorará la calidad del aire y posiblemente reducirá los niveles de ozono y smog locales. Más aún, la utilización de etanol en lugar de gasolina puede ser de importancia esíratégíca en amortiguar el impacto de cambios repentinos en energía no renovable y sumínislros peíroquímicos.

Aplicaciones en alimentos En una modalidad, el polipépíido de varianíe de PS4 es capaz de degradar almidón resistente. Como se usa aquí, el término "degradación" se refiere a la hidrólisis o degradación parcial o compleía de almidón resisíeníe a la glucosa y/u oligosacáridos - íal como maltosa y/o dexírinas. El polipéplido de variante de PS4 puede degradar almidón resistente residual que no ha sido degradado completamente por una amilasa de animal. A manera de ejemplo, el polipéptido de varianíe de PS4 se puede usar para ayudar a una amilasa de animal (v.gr., amilasa pancreática) a mejorar la degradación de almidón resistente. La a-amilasa pancreática es excreíada en el sisíema digesíivo por los animales. La a-amilasa pancreáíica degrada el almidón en el alimento. Sin embargo, una parte del almidón, el almidón resistente, no es degradado compleíameníe por la a-amilasa pancreáíica y por lo lanío no es absorbido en el intestino delgado (véase definición de almidón resistente). El polipépíído de varianíe de PS4 en algunas modalidades es capaz de ayudar a la a-amilasa pancreática a degradar almidón en el sistema digestivo y por lo íanlo incremeniar la utilización de almidón por el animal. La capacidad de una enzima para degradar almidón resistente puede ser analizada por ejemplo por un método desarrollado y descrito por Megazyme International Ireland Ltd. para la medición de almidón resisíeníe, almidón solubilizado y coníenido de almidón íoíal de una muesíra (procedimiento de prueba de almidón resistente, método de AOAC 2002.02, método de AACC 32-40). Por consiguiente, los polipépíidos de varianíe de PS4 pueden ser ingeridos por un animal para propósitos benéficos, y por lo íanío se pueden incorporar en alimeníos para animales. Por lo íanío, los inventores de la preseníe describen el uso de un polipépíido de variante de PS4 como un componente para usarse en un alimenío que comprende almidón, o para usarse en una composición de mejora de alimenio, en la cual el polipépíido de variante de PS4 es capaz de degradar almidón resistente. También describen un alimenio que comprende un almidón y un polipépíido de variante de PS4. Además describen un método para degradar almidón resistente en un alimenío que comprende poner en conlacío dicho almidón resistente con un polipéptido de varianíe de PS4. Además describen el uso de un polipéptido de variante de PS4 en la preparación de un alimento que comprende un almidón, para degradar almidón resistente. Además, describen el uso de un polipéptido de variante de PS4 en la preparación de un alimento para mejorar el valor calorífico he dicho alimento. Describen el uso de una enzima en la preparación de un alimento para mejorar el rendimienío del animal. En una modalidad adicional, describen un procedimienlo para preparar un alimento que comprende mezclar un almidón y una enzima de polipéptido de variante de PS4. A manera de ejemplo, el uso de un componeníe que comprende polipépíidos de varianíe de PS4 y que es capaz de degradar almidón resistente es ventajoso porque hay un incremento marcado en la degradación de almidón y/o productos de degradación de almidón en un animal. Además, dicho uso es ventajoso porque hay un incremento marcado en la capacidad de digesíión de almidón y/o producios de degradación de almidón por un animal. Además, dicho uso es veníajoso porque provee un medio para incremeníar la eficiencia de derivar energía de un alimento por un animal. Además, dicho uso es ventajoso porque un medio para incremeníar la bíodisponibilidad de almidón resistente.

Alimentos para animales Los alimentos para animales para los cuales los polípéptidos de variante de PS4 son adecuados para usarse se pueden formular de manera que satisfagan las necesidades específicas de grupos de animales particulares y provean el carbohidrato, grasa, proteína y oíros nuírieníes necesarios en una forma que pueda ser meíabolizada por el animal. Preferiblemeníe, el alimenío para animales es un alimento para cerdos o aves de corral. Como se usa aquí, el íérmino "cerdos" se refiere a omnívoros no rumiantes íales como cerdos, puercos o jabalíes. Típicamente, el alimento para cerdos incluye aproximadamente 50 por cienío de carbohidrato, aproximadamente 20 por ciento de proíeína y aproximadameníe 5 por cienío de grasa. Un ejemplo de un alimento para cerdos de alia energía se basa en maíz que a menudo se combina con complementos alimenticios, por ejemplo, proíeína, minerales, viíaminas y aminoácidos íales como lisina y íripíofano. Ejemplos de alimeníos para cerdos incluyen productos de proteína animal, producios marinos, producios lácteos, productos de granos y productos de proíeína vegeíal, todos los cuales pueden comprender además saborizantes naturales, saborizanles artificiales, micro y macrominerales, grasas animales, grasas vegelales, viíaminas, conservadores o medicameníos íales como antibióticos. Cabe entender que en donde se hace referencia en la presente especificación, incluyendo las reivindicaciones anexas, a "alimeníos para cerdos" dicha referencia incluye alimentos de "iransición" o "iniciadores" (usados para destelar cerdos jóvenes) y alimentos de "acabado" o "de crecimienío" (usados después de la etapa de transición para el crecimienío de cerdos a una edad y/o tamaño adecuados para el mercado). Como se usa aquí, el término "aves de corral" se refiere a aves tales como pollos, pollos de engorda, gallina, gallos, pollos castrados, pavos, patos, aves de caza, pollos menores de un año o gallinas pequeñas. Los alimentos para aves de corral se puede referir como alimentos "completos" porque contienen toda la proteína, energía, viíaminas, minerales y otros nutrientes necesarios para el crecimiento apropiado, producción de huevos y salud de las aves. Además, los alimentos para aves de corral además pueden comprender viiamínas, minerales o medicamentos íales como coccidiostáticos (por ejemplo Monensín sódico, Lasalocid, Amprolium, Salinomycin y Sulfaquinoxalina) y/o antibióticos (por ejemplo Penicilina, Bacitracin, Clortetraciclina y Oxitetraciclina). Los pollos jóvenes o pollos de engorda, pavos y patos mantenidos para producción de carne son alimentados de manera diferente de las gallinas menores de un año para la producción de huevos. Los pollos de engorda, patos y pavos tienen cuerpos más grades y gana peso más rápidamente que los íipos de gallinas productoras de huevo. Por lo tanto, esías aves son alimeníadas con dielas que íienen niveles de proíeína y energía más altos. Cabe entender que en donde se hace referencia en la presente especificación incluyendo las reivindicaciones anexas, a "alimento para aves de corral" dicha referencia incluye alimeníos "iniciadores" (después de la eclosión), "de acabado", "de crecimiento" o "de desarrollo" (de 6 a 8 semana de edad hasía alcanzar el lamaño de sacrificio) y alimeníos de "ponedoras" (alimenío durante la producción de huevo). Los alimentos para animales se pueden formular para satisfacer las necesidades nutricionales del animal con respecto a, por ejemplo, producción de carne, producción de leche, producción de huevos, reproducción y respuesta al esírés. Además, los alimeníos apara animales se formulan para mejorar la calidad del estiércol. En un aspecío preferido, el alimenío para animales coníiene un maíerial de partida tal como leguminosas, por ejemplo guisantes o soya o un cereal, por ejemplo írigo, maíz, centeno o cebada. De manera adecuada, el maierial de partida puede ser papa.

Materiales alimeníicios Los polipépíidos de varianíe de PS4 se pueden usar en alimeníos para consumo por animales por la aplicación indirecto o directo de los polipéplidos de variante de PS4 al alimento, ya sea solo o en combinación con otros ingredientes, tales como ingredientes de alimentos. Los ingredientes de alimentos típicos pueden incluir cualquiera o más de un aditivo lal como una grasa animal o vegetal, un sazonador natural o sintético, antioxidante, modificador de viscosidad, aceite esencial y/o sabor, colorante y/o color, vitamina, mineral, aminoácido natural y/o no natural, nutriente, enzima adicional (incluyendo enzimas genéticamente manipuladas), un agente aglutinante tal como goma guar o goma de xantano, regulador de pH, emulsionante, lubricante, adyuvante, agente de suspensión, conservador, agente de revestimiento o agente solubilizante y similares. Ejemplos de métodos de aplicación incluyen, pero no se limitan a, revestimiento del alimento en un material que comprende el polipépíido de variante de PS4, aplicación directa mezclando el polipéptido de varianíe de PS4 con el alimento, rociando el polipéptido de variante de PS4 sobre la superficie del alimento o sumergiendo el alimento en una preparación del polipéptido de variante de PS4. El polipéptido de variante de PS4 se aplica preferiblemente mezclando con un alimento o rociando sobre partículas de alimento para consumo animal. Alternativamente, el polípéptido de variante de PS4 se puede incluir en la emulsión de un alimento, o en el interior de producios sólidos por inyección o revolvimiento. El polipéptido de varianíe de PS4 se puede aplicar para esparcir, revestir y/o impregnar un alimento. Mezclas con oíros ingredieníes íambién se pueden usar y se pueden aplicar por separado, simulíáneameníe o secuencialmente. Agentes quelaíadores, ageníes aglutinantes, emulsionantes y oíros adiíivos lales como micro y macromínerales, aminoácidos, vitaminas, grasas animales, grasas vegetales, conservadores, saborizantes, colorantes, se pueden aplicar de manera similar al alimento simultáneamente (ya sea en mezcla o por separado) o aplicar secuencialmente.

Cantidad de polipéptido de variante de PS4 La cantidad óptima del polipéptido de variante de PS4 que se ha de usar dependerá del alimenío que se ha de íraíar y/o el méíodo de coníacío de alimento con el polipépíido de varianíe de PS4 y/o el uso pretendido para el mismo. La cantidad de polipéptido de variante de PS4 debe ser una caníidad suficiente para ser efectiva para degradar susíancialmeníe almidón resisíenle después de la ingestión y duranie la digesíión del alimento. Ventajosamente, el polipéptido de varianíe de PS4 permanecerá efectivo después de la ingesíión de un alimenío para consumo animal y durante la digestión del alimento hasta que se obtenga una digestión más completa del alimenío, es decir, un valor calorífico incremeníado del alimento es liberado.

Combinaciones de amilasa Los inventores de la preseníe describen combinaciones particulares de polipéptidos de varianíe de PS4 con amilasas, en particular amilasas malíogénicas. La alfa-amilasa malíogénica (glucan 1 ,4-a-mallohidrolasa, E.G. 3.2.1.133) es capaz de hídrolizar amilosa y amilopecíina a maltosa en la configuración alfa). Una alfa-amilasa mallogénica de Bacillus (EP 120 693) esíá comercialmeníe disponible bajo el nombre comercial Novamyl (Novo Nordisk A/S, Dinamarca) y se usa ampliamente en la industria de panadería como un agente de antí-rancidez debido a su capacidad para reducir la reírogradación de almidón. Novamyl se describe con deíalle en la publicación de patente internacional WO 91/04669. La alfa-amilasa maltogénica Novamyl comparte varias características con ciclodextrina glucanotransferasas (CGTasas), incluyendo homología de secuencia (Henrissat B, Bairoch A; Biochem. J., 316, 695-696 (1996)) y formación de productos de transglicosilacíón (Christophersen, C, et al, 1997, Starch, vol. 50, No. 1 , 39-45). En modalidades altamente preferidas, los inventores de la presente describen combinaciones que comprenden polipéptidos de variante de PS4 junto con Novamyl o cualquiera de sus variantes. Dichas combinaciones son útiles para la producción de alimento íal como horneado.

El Novamyl en particular puede comprender Novamyl 1500 MG. Otros documentos que describen Novamyl y sus usos incluyen Christophersen, C, Pedersen, S., y Christensen, T., (1993) Method for production of maltose an a limit dextrin, íhe limií dexírin, and use of the limit dextrin. Dinamarca, y WO 95/10627. Además se describe en la patente de E.U.A. No. 4,598,048 y patente de E.U.A. No. 4,604,355. Cada uno de esos documentos se incorpora aquí por referencia, y cualquiera de los polipéptidos Novamyl descritos en las mismas se pueden usar en combinaciones con cualesquiera de los polipéptídos de variante de PS4 descritos aquí. Variantes, homólogos y mutantes de Novamyl se pueden usar para las combinaciones, siempre que retengan actividad de alfa-amilasa. Cualquiera de las variantes de Novamyl descritas en la patente de E.U.A. número 6,162,628, cuya descripción se incorpora aquí por referencia en su totalidad, se pueden usar en combinación con los polipéptídos de variante de PS4 descritos aquí. En particular, cualquiera de los polipéptidos descriíos en ese documento, específicamente variantes de SEQ ID NO: 1 de US 6,162,628 en cualquiera o más posiciones correspondientes a Q13, 116, D17, N26, N28, P29, A30, S32, Y33, G34, L35, K40, M45, P73, V74, D76 N77, D79, N86, R95, N99, 1100, H103, Q119, N120, N131 , S141 , T142, A148, N152, A163, H169, N171 , G172, 1174, N176, N187, F188, A192, Q201 , N203, H220, N234, G236, Q247, K249, D261 , N266, L268, R272, N275, N276, V279, N280, V281 , D285, N287, F297, Q299, N305, K316, N320, L321 , N327, A341 , N342, A348, Q365, N371 , N375, M378, G397, A381 , F389, N401 , A403, K425, N436, S442, N454, N468, N474, S479, A483, A486, V487, S493, T494, S495, A496, S497, A498, Q500, N507, 1510, N513, K520, Q526, A555, A564, S573, N575, Q581 , S583, F586, K589, N595, G618, N621 , Q624, A629, F636, K645, N664 y/o T681 se pueden usar.

Secuencias de aminoácidos La invención hace uso de ácido nucleico de varianíe de PS4, y las secuencias de aminoácidos de dichos ácidos nucleicos de varianíe de PS4 son abarcados por los métodos y composiciones aquí descritos. Como se usa aquí, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "polipéptido" y/o el íérmino "proleína". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "pépíido" En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del íérmino "enzima". La secuencia de aminoácidos se puede preparar/aislar a partir de una fuenie adecuada, o se puede hacer sintéticamente o se puede preparar mediante el uso de técnicas de ADN recombinante. La enzima de variante de PS4 descrita aquí se puede usar junto con otras enzimas. Por lo tanio, los inventores de la presente describen además una combinación de enzimas en donde la combinación comprende una enzima de polipéptido de variante de PS4 descrita aquí y otra enzima, que como tal puede ser otra enzima de polipéptido de varianíe de PS4.

Secuencia de nucleótidos de varianíe de PS4 Como se indicó anteriormente, los inventores de la presente describen secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas de varianíe de PS4 que íienen las propiedades específicas descritas. El término "secuencia de nucleótidos" o "secuencia de ácido nucleico" como se usa aquí se refiere a una secuencia de oligonucleótido o secuencia de polínucleótido, y variantes, homólogos, fragmentos y derivados de la misma (tales como porciones de la misma). Las secuencia de nucleótidos pueden ser de origen genómico o sintético o recombinante, que pueden ser de doble cadena o de una sola cadena ya sea que representen I cadena de sentido o antisentido. El término "secuencia de nucleótidos" como se usa en este documento incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintético y ARN. Preferiblemente, significa secuencia de ADN, muy preferiblemente secuencia de ADNc que codifica para un polipéptido de variante de PS4. Típicamente, la secuencia de nucleótidos de variante de PS4 se prepara usando técnicas de ADN recombinante (es decir ADN recombinaníe). Sin embargo, en una modalidad alternativa, la secuencia de nucleótidos puede ser sintetizada, en su totalidad o en parte, usando métodos químicos bien conocidos en la técnica (véase Caruthers MH et al, (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 y Hom T et al, (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).

Preparación de secuencias de ácido nucleico Una secuencia de nucleóíidos que codifica ya sea una enzima que íiene as propiedades específicas como se describe aquí (v.gr., un polipépíido de varianíe de PS4) o una enzima que es adecuada para modificación, íal como una enzima progenííora, puede ser identificada y/o aislada y/o purificada a partir de cualquier célula u organismo que produzca dicha enzima. Varios mélodos son bien conocidos denlro de la íécnica para identificación y/o aislamiento y/o purificación de secuencia de nucleóíidos. A manera de ejemplo, las íécnicas de amplificación de PCR para preparar más de una secuencia se pueden usar una vez que una secuencia adecuada ha sido identificada y/o aislada y/o purificada. A manera de ejemplo adicional, una genoíeca de ADN genómico y/o ADNc se puede consíruír usando un ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la enzima. Si la secuencia de aminoácidos de la enzima o parte de la secuencia de aminoácidos de la enzima se conoce, se pueden siníeíizar y usar sondas de oligonucleóíidos marcados para identificar clones que codifican enzima de la genoíeca genómica preparada a paríir del organismo. Alíernaíivameníe, una sonda de oligonucleóíido marcado que coníiene secuencias homologas a oíro gen de enzima conocido se podría usar para ideníificar clones que codifican enzima. En el úlíimo caso, las condiciones de hibridación y lavado de baja asíringencia se usan. Alternativamente, se podrían identificar clones que codifican enzima insertando fragmentos de ADN genómico en un vecíor de expresión, íal como un plásmido, que transforma bacterias enzima-negativas con la genoteca de ADN genómico resulíaníe y después colocando en placas las bacíerias írasformadas sobre placas de agar que coníienen un susírato para la enzima (es decir, maltosa), permiíiendo así que los clones expresen la enzima que ha de ser identificada. En una alternativa adicional, la secuencia de nucleóíidos que codifica la enzima se puede preparar sintéticamente medianíe métodos esíándares esíablecidos, v.gr., el méíodo de fosforoamidiía descrito por Beucage S.L. et al, (1981 ) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869, o el método descrito por Matthes et al, (1984) EMBO J. 3, p 801-805. En el méíodo de fosforoamidiía, se sintetizan oligonucleótidos, v.gr., en un sintetizador de ADN automático, se purifican, se templan, se ligan y se clonan en vectores apropiados. La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico y sintético mixtos, origen sintético y ADNc mixtos o de origen genómíco y ADNc mixto, preparados ligando fragmentos de origen sintético, genómíco o ADNc (según sea apropiado) de conformidad con íécnicas eslándares. Cada fragmento ligado corresponde a varias partes de la secuencia de nucleóíidos entera. La secuencia de ADN íambíén se puede preparar por reacción de cadena de polimerasa (PCR) usando iniciadores específicos, por ejemplo como se describe en US 4,683,202 o en Saikí R K et al, (Science (1988) 239, pp 487-491 ).

Varianíes/homólogos/derivados Los inventores de la presente describen el uso de varianíes, homólogos y derivados de cualquier secuencia de aminoácidos de una enzima o de cualquier secuencia de nucleóíidos que codifica dicha enzima, tal como un polipépíido de varianíe de PS4 o un ácido nucleico de variante de PS4. A menos que el conlexto determine lo contrario, el término "ácido nucleico de variante de PS4" debe tomarse para incluir cada una de las entidades de ácido nucleico descritas más adelante, y el íérmino "polipépíido de variante de PS4" asimismo debe tomarse para incluir cada una de las eníidades de polipépíido o aminoácido descriías más adelaníe. Aquí, el término "homólogo" significa una eníidad que íiene una cierta homología con las secuencias de aminoácidos de la preseníe y las secuencias de nucleótidos de la présenle. Aquí, el íérmino "homología" puede ser equiparado con "identidad". En el presente contexto, una secuencia homologa se to a para incluir una secuencia de aminoácidos que puede ser por lo menos 75, 80, 85 ó 90% idéntica, preferiblemente por lo menos 95, 96, 97, 98 ó 99% idéntica a la secuencia de la presente. Típicamente, los homólogos comprenderán los mismos sitios aclivos, etc., que la secuencia de aminoácidos de la presente. Aunque homología también se puede considerar en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de este documento se prefiere expresar homología en términos de identidad de secuencia. En el preseníe coníexto, una secuencia homologa se toma para incluir una secuencia de nucleótidos que puede ser por lo menos 75, 80, 85 ó 90% idéntica, preferiblemente por lo menos 95, 96, 97, 98 ó 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos que codifica una enzima de polipéptido de variante de PS4 (íal como un ácido nucleico de varianíe de PS4). Típicamente, los homólogos comprenderán las mismas secuencias que codifican los siíios aclivos, ele, que la secuencia de la presente. Aunque homología íambién se puede considerar en términos de similiíud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de esíe documenío se prefiere expresar homología en términos de ideníidad de secuencia. Comparaciones de homología se pueden conducir a simple visía, o de manera más usual, con la ayuda de programas de comparación de secuencia fácilmeníe disponibles. Esíos programas de computadora comercialmenle disponibles pueden calcular % de homología eníre dos o más secuencias. % de homología se puede calcular sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia es alineada con la oíra secuencia y cada aminoácido en una secuencia es comparado direcíameníe con el aminoácido correspondiente en la olra secuencia, un residuo a la vez. Esto se denomina una alineación "sin espacio". Típicameníe, dichas alineaciones sin espacio se realizan únicamente sobre un número de residuos relativamente corto. Aunque esíe es un mélodo muy simple y consisíeníe, no considera que, por ejemplo, en un par de secuencias de otra manera idénticas, una inserción o deleción hará que los residuos de aminoácidos siguientes sean puestos fuera de alineación, dando así por resulíado poíencialmeníe una reducción grande en % de homología cuando se realiza una alineación global. Consecuentemente, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias esíán diseñados para producir alineaciones óptimas que consideren posibles inserciones y deleciones sin sancionar indebidamente la puníuación de homología global. Esío se logra al insertar "espacios" en la alineación de secuencia para íraíar de aumeníar al máximo la homología local. Sin embargo, esíos méíodos más complejos asignan "sanciones de espacio" a cada espacio que aparece en la alineación por lo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de secuencia con ían pocos espacios como es posible - reflejando relación más alia eníre las dos secuencias comparadas - logrará una punluación más alia que una con muchos espacios. Tíoicameníe se usan "oslos de espacio afines" que cargan un costo relativamente alto para la existencia de un espacio y una sanción menor para cada residuo subsecuenteen el espacio. Este es elsistema de puntuación de espacio más comúnmente usado. Sanciones de espacio altas desde luego producirán alineaciones optimizadas con menos espacios. La mayoría de los espacios de alineación permiíen que sean modificadas las sanciones de epacio. Sin embargo, se prefiere usar los valores por omisión cuando se usa dicho sofíware para comparaciones de secuencia. Por ejemplo, cuando se usa el paquete GCG Wísconsin Besífií la sanción de espacio por omisión para secuencias de aminoácidos es -12 para un espacio y -4 para cada exíensión. El cálculo de % de homología alta por lo tanto requiere primero la producción de una alineación óptima, tomando en consideración sanciones de espacio. Un programa de compuladora adecuado para llevar a cabo dicha alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit package (Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). Ejemplos de otro software que puede realizar comparaciones de secuencias ¡ncluyen, pero no se limitan al paquete BLAST package (véase Ausubel et al, 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed - capítulo 18), FASTA (Altschul eí al, 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y el conjunío de herramientas de comparación GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsqueda fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al, 1999, Short Protocols in Molecular Biology, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere usar el programa GCG Besífií. Una nueva herramienía, llamada BLAST 2 Se?uences también está disponible para comparar secuencias de proteína y nucleótidos (véase FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1 ): 187-8 y iaiiana@ncbi.nlm.nih.gov). Aunque el % de homología final se puede medir en términos de identidad, el proceso de alineación mismo típicameníe no se basa en una comparación de pares lodo o nada. En vez de ello, generalmeníe se usa una maíriz de puníuación de similutud en escala que asigna puntuaciones a cada comparación de pares basada en similitud química o disíancia evolutiva. Un ejemplo de dicha mairiz comúnmente usada es la matriz BLOSUM62 - la matriz por omisión para el conjunto de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin generalmente usan ya sea los valores por omisión públicos o una tabla de comparación de símbolos de costumbre si se suministra (véase manual del usuario para detalles adicionales). Para algunas aplicaciones, se prefiere usar los valores por omisión públicos para el paquete GCG, o en el caso de oiro software, la matriz por omisión, tal como BLOSUM62. Alternativamente, el porcentaje de homologías se puede calcular usando la característica de alineación múltiple en DNASIS™ (Hitachi Software), basada en un algoritmo, análogos a 740 CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1 ), 237-244). Una vez que el software ha producido una alineación óptima, es posible calcular el % de homología, preferiblemeníe % de ideníidad de secuencia. El sofíware lípicamente hace esto como parte de la comparación de secuencia y genera un resulíado numérico. Las secuencias también pueden tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y dan por resultado una sustancia funcionalmenie equivaleníe. Sustituciones de aminoácidos deliberadas se pueden hacer sobre la base de similitud en propiedades de aminoácidos (tales como polaridad, carga, solubilidad, carácter hidrofobia), carácter hidrofílico, y/o la naíuraleza anfifáíica de los residuos) y por lo lanío es útil agrupar los aminoácidos eníre sí en grupos funcionales. Los aminoácidos se pueden agrupar enire sí con base en las propiedades de su cadena lateral sola. Sin embargo, es más útil incluir daíos de muíación íambién. Los conjuntos de aminoácidos así derivados probablemeníe son conservados por razones esíructurales. Estos conjuntos se pueden describir en forma de un diagrama de Venn (Lívingsíone CD. y Baríon GJ. (1993) "Proiein secuencia alígnmenís: a síraíegy for íhe hierarchical analysis of residue conservaííon" Comput. Appl Biosci. 9: 745-756)(Taylor W.R. (1986) "The classification of aminoacid conservation" J. Theor. Biol. 119; 205-218). Se pueden hacer susíiíuciones conservativas, por ejemplo, de acuerdo con el cuadro abajo del cual describe una agrupación de aminoácidos por diagrama de Venn generalmente acepíado.

Los inventores de la preseníe además describen secuencias que comprenden susíiíución homologa (susíííución y reemplazo se usan ambas aquí para dar a entender el intercambio de un residuo de aminoácido existente, con un residuo alternativo) que puede aparecer, es decir, sustitución de igual por igual tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. También puede aparecer sustilucíón no homologa, es decir, de una clase de residuo a oíra o alíernaíivameníe que implique la inclusión de aminoácidos no nalurales íales como ornitina (de aquí en adelaníe referida como Z), ornitina de ácido diaminobutírico (de aquí en adelaníe referido como B), ornilina de norleucina (de aquí en adelante referida como O), piríilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina. Las secuencias de aminoácidos de la variante pueden incluir grupos separadores adecuados que pueden ser insertados eníre cualesquiuera dos residuos de aminoácido de la secuencia incluyendo grupos alquilo íales como grupos melilo, eíilo o propilo además de separadores de aminoácidos íales como residuos de glicina o ß-alanina. Una forma adicional de variación, que implica la presencia de uno o más residuos de aminoácido en forma pepíoide, la entenderán los expertos en la técnica. Para que no haya duda, "la forma pepto.de" se usa para referirse a residuos de aminoácido de variante en donde el grupo susiituyente de a-carbono está en el áíomo de nilrógeno del residue y no en el a-carbono. Los procedimientos para preparar péptidos en la forma peptoide se conocen en la íécnica, por ejemplo, Simón RJ eí al, PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trenes Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134. Las secuencias de nucleótidos, como se describen aquí, y adecuadas para usarse en los métodos y composiciones descritos aquí (íales como ácidos nucleicos de variante de PS4) pueden incluir dentro de ellos nucleótidos sintéíicos o modificados. Un número de diferentes íipos de modificación a oligonucleótidos se conocen en la técnica. Estos incluyen esírucíuras de base de meíilfosfonaío y fosforoíioaío y/o la addición de cadenas de acridina o polilisina en los exiremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los propósiíos de este documento, cabe entender que la secuencia de nucleótidos como se describe aquí puede ser modificada por cualquier método disponible en la lécnica. Dichas modificaciones se pueden llevar a cabo para incremeníar la actividad in vivo o duración de vida de las secuencias de nucleótidos. Se describe el uso de secuencias de nucleótidos que son complemenlarias a las secuencias presentadas aquí, o cualquier derivado, fragmento o derivado de las mismas. Si la secuencia es complemeníaria a un fragmento de la miasma, entonces esa secuencia se puede usar como una sonda para identificar secuencias de codificación similares en oíros organismos, eíc. Los polinucleóíidos que no son 100% homólogos a las secuencias de varianíe de PS4 se pueden obíener en un número de formas. Oirás variantes de la secuencia como se describe aquí se puede obtener, por ejemplo, al sondear genoíecas de ADN hechas de una gama de individuos, por ejemplo, individuos de diferentes poblaciones. Además, se pueden obtener otros homólogos y dichos homólogos y fragmentos del mismo en general serán capaces de hibridar selectivamente a las secuencias mostradas en las secuencias aquí lisiada, dichas secuencias se pueden obíener sondeando enolecasde ADNc hechas de, o genotecas de ADN genóimco de otras especies, y sondeando dichas genotecas con sondas que comprenden todas o parte de cualquiera de las secuencias en los lisiados de secuencia anexos bajo condiciones de astringencia mediana o alta. Consideraciones similares se aplican a la obtención de especies homologas y varianíes alélicas de la secuencia de polípéptido o nucleótidos como se describe aquí. Homólogos de varianíes y cepas/especies íambién se pueden obíener usando PCR degenerada que usará iniciadores diseñados para dirigir secuencias denlro de las varianíes y homólogos que codifican secuencias de aminoácidos conservadas. Las secuencias conservadas se pueden predecir, por ejemplo, alineando las secuencias de aminoácidos de varias variantes/homólogos. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar usando software de computadora conocido en la técnica. Por ejemplo, el programa GCG Wisconsin PileUp se usa ampliamente. Los iniciadores usados en PCR degenerada contendrán una o más posiciones degeneradas y se usarán en condiciones de astringencia menor que aquellas usadas para clonar secuencias con iniciadores de secuencia individuales coníra secuencias conocidas. Alíernaíivameníe, dichos polinucleóíidos se pueden obíener por muíagénesís dirigida al sitio de secuencias caracterizadas. Esto puede ser útil en donde por ejemplo se requieren cambios de secuencia de codon silenciosas para optimizar preferencias de codones para una célula hospedero particular en la cual las secuencias de polinucleótido están siendo expresadas. Otros cambios de secuencia se pueden desear para iníroducir sitios de reconocimieto de resíricción enzima, o alíerar la propiedad o función de los polipépíidos codificados por los polinucleótidos. Los polinucleótidos (secuencias de nucleótidos) íales co o los ácidos nucleicos de varianíe de PS4 descrilos en este documenío se pueden usar para producir un iniciador, v.gr., un iniciador de PCR, un iniciador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda, v.gr., marcada con un marcador de revelado por medios convencionales usando marcadores radioactivos o no radioactivos, o los polinucleótidos se pueden clonar en vectores. Dichos iniciadores, sondas y oíros fragmentos serán por lo menos 15, preferiblemeníe por lo menos 20, por ejemplo por lo menos 25, 30 ó 40 nucleótidos de longllud, y íambién son abarcados por el término polinucleóíidos. Los polinucleótidos íales como polínucleóíidos de ADN y sondas puede se pueden producir recombínaníemeníe, siníéíícalmeníe, o por cualquier medio disponible para los expertos en la íécnica. También se pueden clonar medianle técnicas estándares, en general, los iniciadores se producirán por medios sintéticos, que implican una fabricación por pasos de la secuencia de ácido nucleico deseada, un nucleóíido a la vez. Las técnicas para lograr esío usando íécnicas automatizadas esíán fácilmeníe disponibles en la lécnica. Generalmente se producirán polinucleótidos más largos usando medios recombínantes, por ejemplo usando técnicas de clonación por PCR (reacción de cadena de polímerasa). Los iniciadores pueden ser diseñados para contener sitios de reconocimiento de enzimas de resíricción adecuados de modo que el ADN amplificado puede ser clonado en un vecíor de clonación adecuado. Preferiblemeníe, las secuencias de varianíe, eíc, son por lo menos ían biológicamente acíivas como las secuencias presenladas aquí.

Como se usa aquí, "biológicamente acíivas" se refiere a una secuencia que íiene una función eslruclural similar (pero no necesariamente al mismo grado), y/o función reguladora similar (pero no necesariamente al mismo grado), y/o función bioquímica similar (pero no necesariamente al mismo grado) de la secuencia que ocurre naíuralmeníe.

Hibridación Además se describen secuencias que son complemeníarias a la secuencia de ácido nucleicos de varianíes de PS4 o secuencias que son capaces de hibridar ya sea a las secuencias de variante de PS4 o a secuencias que son complemenlarias a la misma. El íérmino "hidrídación" como se usa aquí incluirán "el proceso por el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complemeníaria a íravés de apareamiento de bases" así como el proceso de amplificación como se lleva a cabo en tecnologías de reacción de cadena de polímerasa (PCR). Por lo tanto, se describe el uso de secuencias de nucleótido que son capaces de hibridar a las secuencias que son complementarias a las secuencias presentadas aquí, o cualquier derivado, fragmento o derivado de las mismas. El término "variante" también abarca secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridar a las secuencias de nucleótidos presenladas aquí. Preferiblemente, el término "variante" abarca secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridar bajo condiciones astringentes (v.gr., 50°C y 0.2xSSC {1xSSC = NaCI 0.15 M, citrato de Na3 0.015 M, pH 7.0}) a las secuencias de nucleótido presentadas aquí. Muy preferiblemente, el término "variante" abarca secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridar bajo condiciones astringentes altas (v.gr. 65°C y O.lxSSC {1xSSC = NaCI 0.15 M, citrato de Na3 0.015 M, pH 7.0}) a las secuencias de nucleótidos presentadas aquí. Además se describen secuencias de nucleóíidos que pueden hibridar a las secuencias de nucleóíidos de varianíes de PS4 (inciuyendo secuencias complemenlarias de aquellas presentadas aquí), así como secuencias de nucleótidos que son complementarias a secuencias que pueden hibridar a las secuencias de nucleótidos de variantes de PS4 (incluyendo secuencias complementarias de aquellas presentadas aquí). Los inventores de la presente describen además secuencias de polinucleótidos que son capaces de hibridar a las secuencias de nucleótidos presentadas aquí bajo condiciones de astringencia intermedia a máxima. En un aspecto preferido, se describen secuencias de nucleótidos que pueden hibridar a la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico de variante de PS4, o el complemento del mismo, bajo condiciones astringentes (v.gr., 50°C y 0.2xSSC). Muy preferiblemente, las secuencias de nucleóíidos pueden hibridar a la secuencia de nucleótidos de una variante de PS4, o el complemento de la misma, bajo condiciones astringentes alias (v.gr. 65°C y 0. IxSSC).

Mutaqénesis dirigida al sitio Una vez que una secuencia de nucleótidos codificadora de enzima ha sido aislada, o una secuencia de nucleóíidos puíaíiva codificadora de enzima ha sido identificada, puede ser deseable muíar la secuencia para preparar una enzima. Por consiguienie, una secuencia de varianíe de PS4 se puede preparar a partir de una secuencia progenitora. Las mutaciones pueden ser introducidas usando oligonucleótidos siníéíicos. Esíos olígonucleóíidos coníienen secuencias de nucleóíidos que flanquean los siíios de muíación deseados. Un mélodo adecuado se describe en Morinaga eí al, {Biotechnology (1984) 2, p646-649). Oíro mélodo para introducir mutaciones en secuencias de nucleótidos codificadoras de enzima se describe en Nelson y Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147- 151 ). Un método adicional se describe en Sarkar y Sommer (Biotechniques (1990), 8, p404-407 - "The megaprimer method of site directed mutagenesis"). En un aspecío, la secuencia para usarse en los méíodos y composiciones descrilos aquí es una secuencia recombinanle - es decir una secuencia que se ha preparado usando técnicas de ADN recombinaníe. Esías íécnicas de ADN recombinante están dentro de las capacidades de un experto en la técnica. Dichas técnicas se explican en la literatura, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. En un aspecto, la secuencia para usarse en los méíodos y composiciones descritos aquí es una secuencia sintética - es decir una secuencia que se ha preparado por síntesis química o enzimática in vitro. Incluye, pero no se limita a, secuencias hechas con uso de codón óptimo para organismos hospederos - tales como las levadoras metilotróficas Pichia y Hansenula. La secuencia de nucleótidos para usarse en los métodos y composiciones descritos aquí se puede incorporar en un vector replicable recombinaníe. El vecíor se puede usar para replicar y expresar la secuencia de nucleóíidos, en forma de enzima, en y/o a partir de una célula hospedero compatible. La expresión puede ser conírolada usando secuencias de conírol, v.gr., secuencias reguladoras. La enzima producida por una célula hospedero recombinanle por expresión de la secuencia de nucleóíidos puede ser secrelada o puede ser contenida ¡ntracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. Las secuencias codificadoras pueden ser diseñadas con secuencias de señal que dirigen la secreción de las secuencias codificadoras de sustancia a través de una membrana células procariótica o eucariótica particular.

Expresión de ácidos nucleicos y polipéptidos de PS4 Los polinucleótidos y ácidos nucleicos de PS4 pueden incluir ADN y ARN de origen sintético y natural cuyo ADN o ARN puede contener desoxi- o didesoxí-nucleótidos o ribonucleótidos modificados o no modificados o análogos de los mismos. El ácido nucleico de PS4 puede existir como ADN o ARN de cadena individual o doble, un heterodúplex de ARN/ADM o un copolímero de ARN/ADN, en donde el término "copolímero" se refiere a una cadena de ácido nucleico individual que comprende ribonucleóíidos y desoxirribonucleótidos. El ácido nucleico de PS4 incluso puede ser opíimizado en codón para ¡ncremeníar adicionalmenle la expresión. El término "sintético", como se usa aquí, se define como aquel que es producido por síntesis química o enzímática in vitro. Incluye pero no se limito a ácidos nucleicos de PS4 hechos con uso de codón óptimo para organismos hospederos tales como las levaduras meíiloíróficas Pichia y Hansenula. Los polinucleólidos, por ejemplo, polinucleótidos de varianíe de PS4 descrilos aquí, se pueden incorporar en un veclor replicable recombinante. El vector se puede usar para replicar el ácido nucleico en una célula hospedero compatible. El vector que comprende la secuencia de polinucleótidos puede ser transformado a una célula hospedero adecuada. Los hospederos adecuados pueden incluir células bacterianas, de levadura, insecto y hongos. El término "célula transformada" incluye células que han sido íransformadas medianle el uso de técnicas de ADN recombinante. La transformación típicameníe ocurre por inserción de una o más secuencias de nucleóíidos en una célula que ha de ser íransformada. La secuencia de nucleólidos insertada puede ser una secuencia de nucleóíídos heteróloga (es decir, es una secuencia que no es natural para la célula que ha de ser transformada). Además, o en la alternaíiva, la secuencia de nucleótidos insertada puede ser una secuencia de nucleótidos homologa (es decir, es una secuencia que es natural para la célula que ha de ser transformada) - por lo que la célula recibe una o más copias adicionales de una secuencia de nucleótidos ya presentes en la misma. Por lo tanto, en una modalidad adicional, los inventores de la presente proveen un método para hacer polipéptidos y polinucleótidos de variante de PS4 al introducir un polinucleótido en un vecíor replicable, inlroducíendo el vector en una célula hospedero compatible, y haciendo crecer la célula hospedero bajo condiciones que conllevan aproximadamente replícación del vector. El vector puede ser recuperado de la célula hospedero.

Consírucciones de expresión El ácido nucleico de PS4 puede ser operativamente enlazado a elemeníos reguladores íranscripcíonales y íraduccíonales activos en una célula hospedero de inferes. El ácido nucleico de PS4 íambién puede codificar una proleína de fusión que comprende secuencias de señal iales co o, por ejemplo, aquellas derivadas del gen de glucoamilasa de Schwanniomyces occidentalis, gen de lipo coincidente de a-factor de Saccharomyces cerevisiae y la TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae. Alternaíivameníe, el ácido nucleico de PS4 puede codificar una proíeína de fusión que comprende un dominio de unión a membrana.

Vector de expresión El ácido nucleico de PS4 se puede expresar a los niveles deseados en un organismo hospedero usando un vector de expresión. Un vecior de expresión que comprende un ácido nucleico de PS4 puede ser cualquier vecíor que es capaz de expresar el gen que codifica ácido nucleico de PS4 en el organismo hospedero seleccionado, y la elección del vecior dependerá de la célula hospedero en la cual se ha de introducir. Por lo tanto, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad episomal, cuya replicación es independiente de replicación cromosómica, tal como, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago o un elemento episomal, un minícromoso a o un cromosoma artificial. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando es introducido en una célula hospedero, es integrado en el genoma de la célula hospedero y replicado junio con el cromosoma.

Los componentes del vector de expresión El vector de expresión típicameníe incluye los componentes de un vector de clonación, tal como, por ejemplo, un elemenío que permiíe la replicación autónoma del vecíor en el organismo sopero seleccionado y uno o más marcadores fenoíípicamente detectables para propósitos de selección. El vector de expresión normalmente comprende secuencias de nucleótidos de control que codifican un promotor, operador, sitio de unión a ribosoma, señal de inicio de traducción y opcionalmente, un gen represor o uno o más genes activadores. Además, el veclor de expresión puede comprender una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos capaz de dirigir el polipéptido de variante de PS4 a un organelo de célula hospedero tal como un peroxisoma o a un compartimiento de célula hospedero particular. Dicha secuencia de dirección incluye pero no se limita a la secuencia SKL. En el presente contexto, el término 'señal de expresión" incluye cualquiera de las secuencias de control anteriores, secuencias represoras o activadoras. Para expresión bajo la dirección de secuencias de control, la secuencia de ácido nucleico del polipéptido de variante de PS4 es operablemente enlazada a las secuencias de control de manera apropiada con respecto a la expresión. Preferiblemente, un polinucleótido en un vector es operablemente enlazado a una secuencia de control que es capaz de proveer la expresión de la secuencia codificadora por la célula hospedero, es decir el vector es un vecíor de expresión. El término "operablemente enlazado" significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de su manera pretendida. Una secuencia reguladora "operablemente enlazada" a una secuencia codificadora es ligada de íal manera que la expresión de la secuencia codificadora se logra bajo una condición compatible con las secuencias de control. Las secuencias de control pueden ser modificadas, por ejemplo, mediante la adición de elemeníos reguladores írnscripcionales adicionales para hacer que el nivel de íranscripción dirigida por las secuencias de conírol respondan más a moduladores íranscripcíonales. Las secuencias de conírol en particular pueden comprender promotores.

Promoíor En el vecíor, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipépíido de varianíe de PS4 es operablemente combinada con una secuencia de promotor adecuada. El promoíor puede ser cualquier secuencia de ADN que íenga acíividad de íranscripción en el organismo hospedero de elección y se puede derivar de genes que son homólogos o heterólogos al organismo hospedero.

Promoíores bacterianos Ejemplos de promoíores adecuados para dirigir la íranscripción de la secuencia de nucleóíidos modificada, íal como ácidos nucleicos de PS4, en un hospedero bacteriano ¡ncluyen el promoíor del operón lac de E. coli, los promotores dagA del gen de agarasa de Streptomyces coelicolor, los promoíores del gen de a-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), los promotores del gen de amilasa malíogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), los promotores del gen de a-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), los promotores de los genes xylA y xylB de K, el promoíor del gen de aprE de Bacillus subtilis y un promoíor derivado de Lactococcus sp. incluyendo el promoíor de P170. Cuando el gen que codifica el polipéptido de variante de PS4 se expresa en una especie bacíeriana íal como E. coli, un promoíor adecuado se puede seleccionar, por ejemplo, de un promotor de bacteriófago incluyendo un promoíor de T7 y un promoíor de fago lambda.

Promotores fúngales Para íranscripción en una especie fungal, ejemplos de promoíores úíiles son aquellos derivados de los genes que codifican la amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, proíeinasa aspártica de Rhizomucor miehei, a-amilasa neuíra de Aspergillus niger, a-amilasa esíable al ácido de A. niger, glucoamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, íriosa fosfaío isomerasa de Aspergillus oryzae o aceíamidas de Aspergillus nidulans.

Promoíores de levadura Ejemplos de promotores adecuados para la expresión en una especie de levadura incluyen pero no se limiían a los promoíores Gal 1 y Gal 10 de Saccharomyces cerevisiae y los promoíores Pichia pastoris AOXI o AOX2.

Organismos hospederos (I) Organismos hospederos bacíerianos Ejemplos de organismos hospederos bacíerianos adecuados son especies de bacíerias Gram-posílivas lales como Bacillaceae incluyendo Bacillus clausii, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium y Bacillus thuringiensis, Especies de Streptomyces tales como Streptomyces murínus, especies bacterianas de ácido láctico incluyendo Lactococcus spp. tales como Lactococcus lactis, Lactobacillus spp. incluyendo Lactobacillus reuterí, Leuconostoc spp., Pediococcus spp. y Streptococcus spp. Alternativamente, cepas de una especie de bacteria Gram-negativa que pertenece a Enterobacteriaceae incluyendo E. coli, o a Pseudomonadaceae se pueden seleccionar como el organismo hospedero.

(II) Organismos hospederos de levaduras Un organismos hospedero de levadura adecuado se puede seleccionar de las especies de levaduras biotecnológica mente relevantes tales como pero sin limitarse a especies de levaduras tales como Pichia sp., Hansenula sp o Kluyveromyces, especie de Yarrowinia o una especie de Saccharomyces incluyendo Saccharomyces cerevisiae o una especie que pertenece a Schizosaccharomyce lal como, por ejemplo, especie de S. Pombe. Preferiblemente una cepa de la especie de levadura metilotrófica Pichia pastoris se usa como el organismo hospedero. Preferiblemente el organismo hospedero es una especie de Hansenula. (lll) Organismos hospederos fúngales Organismos hospederos adecuados entre hongos filamentosos incluyen especies de Aspergillus, v.gr. Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamorí o Aspergillus nidulans. Alternativamente, cepas de una especie de Fusaríum, v.gr., Fusarium oxysporum o de una especie de Rhizomucor tal como Rhizomucor miehei se puede usar como el organismo hospedero. Otras cepas adecuadas incluyen especies de Thermomyces y Mucor. Los organismos hospederos fúngales adecuados íambién pueden incluir Trichoderma spp (especialmente Trichoderma reesei aníeriormeníe Trichoderma longibrachiatum; íambién conocida como Hypocrea jecorina).

Expresión y purificación de proleína Las células hospedero que comprenden polinucleóíidos se pueden usar para expresar polípéptidos, tales como polipéptidos de variante de PS4, fragmentos, homólogos, variantes o derivados de los mismos. Las células hospedero se pueden cultivar bajo condiciones adecuadas que permiten la expresión de las proteínas. La expresión de los polipéptidos puede ser constiíutiva, de tal manera que son continuamente producidos, o inducible, que requiere un estímulo para iniciar la expresión. En el caso de expresión inducible, la producción de proteína se puede iniciar cuando es requerido, por ejemplo, por la adición de una sustancia inductora al medio de culíivo, por ejemplo, dexamelasona o IPTG. Los polipépíidos se pueden exíraer de células hospedero por una variedad de técnicas conocidas en la lécnica, incluyendo lisis enzimáíica, química y/u osmóíica y perturbación física. Los polipéptidos íambién se pueden producir recombinaníemeníe en un sislema libre de células in vitro, íal como el sistema e reticulocitos de conejo TnT™ (Promega).

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Clopa óipi de PS4 La clonación de exoamilasa no maltogénica PS4 de Pseudomonas sacharophila y la generación de plásmidos pCSmta y pCSmta-SBD se describe en el documento WO 2005/003339, particularmente el ejemplo 1. La mutagénesis dirigida al sitio (SDM) puede ser conducida usando los métodos descritos en el documento WO 2005/003339, particularmente en el ejemplo 2 de ese documento.

EJE? Las variantes de PS4 se generaron usando un equipo de mutagénesis dirigida a sitios múltiples QuikChange® (Stratagene) de conformidad con el protocolo del fabricante con algunas modificaciones como se describe.

Paso 1 : Reacción se síníesis de cadena muíante (PCR) Inocular 3 ml de LB (22g/l Lennox L Broíh Base, Sigma) + antibióticos (0,05 µg/ml de canamicina, Sigma) en un íubo Falcon de 10 ml Incubar a 37°C, aprox. 200 rpm. - Hacer girar las células por cenírifugación (5000 rpm/5 min) Vaciar al medio Preparar una plantilla de ds-ADN usando proíocolo de minipurificación de plásmido QIAGEN 1. La reacción de síníesis de cadena muíante para ci ización térmica se preparó como sigue: Mezcla de PCR: 2.5 µl de regulador de pH de mulíi-reacción 10X QuickChange® 0.75 µl de QuickSoluíion X µl de iniciadores Longilud de iniciador 28-35 pb ? 10 pmoles Longitud de iniciador 24-27 pb -> 7 pmoles Longitud de iniciador 20-23 pb ? 7 5 pmoles 1 µl de mezcla de dNTP X µl de plantilla de ds-ADN (200 ng) 1 µl de mezcla de multienzima QuickChange® (2,5 U/µl) (PfuTurbo® ADN polimerasa) X µl de dH20 (a un volumen final de 25 µl) Mezclar iodos los componeníes medianíe pipeto y hacer girar brevemente las mezclas de reacción. 2. Ciclar las reacciones usando los siguientes parámetros: 35 ciclos de desnaturalización (96°C/1 min) templado de iniciador (62,8°C/1 min) alargamiento (65°C/15 min) después se mantiene a 4°C Precaleníar la íapa de la máquina de PCR a 105°C y la placa a 95°C aníes de que los íubos de PCR sean colocados en la máquina (ciclador térmico Eppendorf).

Paso 2: Digestión de Dpn I 1. Añadir 2 µl de resíricción enzima Dpn I (10 U/µl) a cada reacción de amplificación, mezclas mediante pipeta y hacer girar la mezcla. 2. Incubar a 37°C durante ~3 hr.

Paso 3: Transformación de células uliracompeieníes XLIO-Gold® 1. Descongelar células XLl 0-Gold en hielo. Formar alícuotas de 45 µl células por reacción de mulagénesis a íubos Falcon preenfríados. 2. Encender el baño de agua (42°C) y colocar un íubo con caldo NZY+ en el baño para precaleníar. 3. Añadir 2 µl de mezcla de ß-mercapíoeíanol a cada íubo.

Mover con acción de remolino y golpear ligerameníe e incubar 10 minutos sobre hielo, moviendo con acción de remolino cada 2 minuíos. 4. Añadir 1.5 µl de ADN íralado con Dpn I a cada alícuoía de células, mover con acción de remolino para mezclar e incubar sobre hielo durante 30 minutos. 5. Pulsar con calor los lubos en un baño de agua de 42°C duraníe 30 segundos y colocar sobre hielo duranie 2 minuíos. 6. Añadir 0.5 ml de caldo de NZY+ precalentado a cada tubo e incubar a 37°C durante 1 hr con agitación a 225-250 rpm. 7. Colocar 200 µl de cada reacción de transformación en placas LB (33,6 g/1 de agar Lennox L Agar, Sigma) que contiene 1 % de almidón y 0,05 µg/ml de canamicína. 8. Incubar las placas de transformación a 37°C duranie la noche. Se pueden usar iniciadores "SDM" para modificar las posiciones especificadas usando un método descrito en el ejemplo 2 del documento WO 2005/003339. Los iniciadores "MSDM" se pueden usar con el método descrito en el ejemplo 3 en la presente.

EJEMPLO 3 Tirapsfoirmiac-óin en Bacillus subtslss {Transfogroa óim die r@to .gi ' Bacillus subtilis (cepa DB104A; Smíth eí al. 1988; Gene 70, 351-361) es íransformada con los plásmidos muíados de conformidad con el siguieníe proíocolo.

A. Medio para formación de proíoplasío y íransformación 2 x SMM: por liiro: 342 g de sacarosa (1 M); 4.72 g de ¡maléalo de sodio (0.04 M); 8:12 g de MgCI2l 6H20 (0.04 M); pH 6.5 con NaOH concenlrado. Distribuir en porciones de 50 ml y colocar en autoclave durante 10 min. 4 x YT (1/2 NaCI): 2 g de extracto de levadura + 3.2 g de triptona + 0.5 g NaCI por 100 ml. Volúmenes ¡guales de mezcla de SMMP de 2 ? SMM y 4 x YT.

PEG 10 g de polieíileneglícol 6000 (BDH) o 8000 (Sigma) en 25 ml 1 x SMM (auíoclave duraníe 10 min.).

B. Medio para colocar en placas/regeneración Agar 4% de agar mínimo Dífco. Colocar en auíoclave durante 15 minutos succinaío de sodio 270 g/1 (1 M), pH 7.3, HCl conc. colocar en autoclave duranie 15 minutos.

Regulador de pH de fosfaío 3.5 g K2HP04 + 1.5 g KH2P04 por 100 ml. Colocar en auíoclave duranie 15 minutos. MgCI2 20.3 g MgCI2, 6H20 por 100 ml (1 M). Solución al 5% (p/v) de casaminoácidos. Colocar en autoclave durante 15 minutos. Extracto de levadura 10 g por 100 ml, Colocar en autoclave durante 15 minutos. Solución al 20% (p/v) de glucosa. Colocar en autoclave durante 10 minutos. Medio de regeneración de DM3: mezclar a 60°C (baño de agua; 500-ml de botella): 250 ml de succinato de sodio 50 ml de casaminoácidos 25 ml de extracto de levadura 50 ml de regulador de pH de fosfato 15 ml de glucosa 10 ml de MgCI2 100 ml de agar fundido Añadir aníibióticos apropiados: cloranfenicol y íeiraciclina, 5 ug/ml; eriíromicina, 1 ug/ ml. La selección sobre canamicina es problemáíica en medio DM3: concenlraciones de 250 ug/ml se pueden requerir.

C. Preparación de proíoplasíos 1. Usar maierial de plástico o vidrio libre de detergente. 2. Inocular 10 ml de medio 2 x YT en un matraz de 100 ml de una sola colonia. Hacer crecer durante la noche el cultivo a 25-30°C en un agitador (200 rev/mín). 3. Diluir el culíivo duraníe la noche 20 veces en 100 ml de medio 2 ? YT fresco (maíraz de 250 ml) y hacer crecer hasía una D06oo = 0.4-0.5 (apro?. 2 hr) a 37°C en un agitador (200-250 rev/min). 4. Cosechar las células por centrifugación (9000 g, 20 min, 4°C). 5. Remover el sobrenadante con pipeta y resuspender las células en 5 ml de SMMP + 5 mg de lisozima, filírado en forma estéril. 6. Incubar a 37°C en un agitador de baño de agua (100 rev/min). Después de 30 minutos y posíeriormeníe a intervalos de 15 minutos, examinar muesíras de 25 ul por microscopia. Continuar la incubación hasía que 99% de las células se forman en proíoplasíos (apariencia globular). Cosechar los proloplaslos por cenírifugación (4000 g, 20 min, RT) y se aplicó con pipeto el sobrenadanle. Resuspender la pastilla suavemenie en 1-2 ml de SMMP. Los proloplaslos ahora están listos para usarse. (Porciones (v.gr. 0.15 ml) se pueden congelar a -80°C para uso futuro (no se requiere adición de glicerol). Aunque esto puede dar por resultado alguna reducción de transformabílidad, 106 transformantes por ug de ADN se pueden obtener con protoplastos congelados).

D. Transformación 1. Transferir 450 ul de PEG a un microtubo. 2. Mezclar 1-10 ul de ADN (0.2 ug) con 150 ul de protoplasíos y añadir la mezcla al microlubo con PEG. Mezclar inmediatamente, pero suavemente. 3. Dejar durante 2 minutos a temperaíura ambienle, y después añadir 1.5 ml de SMMP y mezclar 4. Cosechar los protoplastos por microcentrifugacíón (10 mín, 13.000 rev/mín (10-12.000 g)) y vaciar el sobrenadaníe. Remover las gotas restantes con papel seda. Añadir 300 ul de SMMP (no someter a acción de remolino) e incubar durante 60-90 minutos a 37°C en un agitador de baño de agua (100 rev/min) para permitir la expresión de marcadores de resistencia a antibióticos. (Los protoplastos se resuspenden suficientemente a través de la acción de agitación del baño de agua). Hacer diluciones apropiadas en 1 x SSM y colocar 0.1 ml en placas de DM3.

EJEMPLO 4. F©?pm)@ntac8Ó?p? de vanantes de PS4 en roaftiraees ©m a sita éim El sustrato del matraz en agitación se prepara como sigue: El susíralo se ajusto a pH 6.8 con ácido sulfúrico 4N o hidróxido de sodio antes de colocarlo en autoclave. 100 ml de susíraio se colocan en un maíraz de 500 ml con un defleclor y se coloca en auíoclave durante 30 minutos. Subsecueníemeníe, se añaden 6 ml de jarabe de dexírosa estéril. El jarabe de dexírosa se prepara mezclando un volumen de 50% p/v de dexírosa con un volumen de agua seguido por auíoclave duraníe 20 minuíos. Los malraces con agiíador son inoculados con las variantes y se incuban durante 24 horas a 35°C/180 rpm en una incubadora. Después de la incubación, las células se separan del caldo por centrifugación (10.000 x g en 10 minutos) y finalmente, el sobrenadante se hace libre de células por microfiltración a 0.2 µm. El sobrenadante libre de células se usa para pruebas y pruebas e aplicación.

EJEMPLO 5 Prueba de Beíamyl Una unidad Beíamyl se define como acíividad que degrada 0.0351 mmoles duraníe 1 minuío de melalopeníaosa acoplada a PNP de modo que 0.0351 mmoles de PNP por 1 minuto pueden ser liberados por un exceso de a-glucosidasa en la mezcla de prueba. Esía mezcla de prueba coníiene 50 ul de cífralo de Na 50 mM, 5 mM de CaCI2> pH 6,5 con 25 ul de muesíra de enzima y 25 ul de sustrato Beíamyl (Glc5-PNP y 205 a-glucosidasa) de Megazyme, Irlanda (1 vial disuelío en 10 ml de agua). La mezcla de prueba se incuba duranie 30 minutos a 40°C y después se deíiene añadiendo 150 ul de Tris al 4%. La absorbancia a 420 nm se mide usando un lecíor de ELISA y la actividad de Betamyl se calcula con base en Actividad = A420 * d en unidades Betamyl/ml de muestra de enzima probada.

Prueba de endo-amilasa La prueba de endo-amilasa es idéntica a la prueba Phadebas realizada según el fabricante (Pharmacia & Upjohn Diagnosíics AB).

Exo-especificidad La relación de exo-acíividad de amilasa a acíividad de Phadebas se usó para evaluar exo-especificídad.

Acíividad específica Para las variantes pSac-D14, pSac-D20 y pSac-D34 los inventores de acíividad específica promedio de 10 unidades de Beiamyl por microgramo de proíeína purificada medida de conformidad con Bradford (1976; Anal. Biochem. 72, 248). Esía actividad específica se usa basada en acíividad para calcular las dosis usadas en los ensayos de aplicación.

EJEMPLO 6 oipiac.oipi tl/2 se define como el tiempo (en minutos) durante el cual la mitad de la actividad de la enzima es inactivada bajo condiciones de calor definidas. Para determinar la vida medía de la enzima, la muestra se caliento durante 1-40 minutos a temperaluras constantes de 60°C a 90°C. La vida media se calcula basada en la prueba de Beíamyl residual. Procedimienío: En un vial Eppendorf, 1000 µl de regulador de pH se precalienía por lo menos durante 10 minutos a 60°C o más. El íratamienío con calor de la mueslra se empieza con la adición de 100 µl de la muesíra al regulador de pH precaleníado bajo mezclado continuo (800 rpm) del vial Eppendorf en una incubadora calentada (Termomixer comfort de Eppendorf). Después de 0, 2, 4, 6, 8 y 9 minutos de incubación, el tratamiento se detiene transfiriendo 45 µl de la muesíra a 1000 µl del regulador de pH equilibrado a 20°C e incubando durante un minuto a 1500 rpm y a 20°C. La actividad residual se mide con la prueba de Betamyl. Cálculo: El cálculo de íl/2 se basa en la pendiente de !og10 (el logarilmo de base 10) de la aclividad de Belamyl residual versus el tiempo de incubación, tl/2 se calcula como la pendiente/0.301=11/2.

EJEMPLO 7 Las masas se hacen en el harinógrafo a 30.0°C. 10.00 g de harina reformada se pesan y se añaden al harinógrafo; después de 1 minuto la mezcla de la referencia/muesíra (referencia = regulador de pH o agua, muesíra = enzima+ regulador de pH o agua) se añade con una pipeto estéril a íravés de los agujeros de la tina de amasado. Después de 30 segundos, la harina es raspada de los bordes - íambién a íravés de los agujeros de Ea tina de amasado. La muesíra se amasa duraníe 7 minuíos. Una prueba con regulador de pH o agua se lleva a cabo en el harinógrafo antes de que la referencia final se lleve a cabo. FU debe ser 400 en la referencia, si no lo es, ésto se debe ajusfar, por ejemplo, con la caníidad de líquido. La referencia/muesíra es removida con una espáíula y colocada en la mano (con un guaníe desechable), aníes de llenar íubos de vidrio pequeños (de apro?. 4.5 cm de longilud) que se ponen en íubos de RMN y topados. Se hacen 7 íubos por masa. Cuando íodas las muesíras se han preparado, los tubos se colocan en un baño de agua (programable) a 33°C (sin tapa) durante 25 minuíos y posteriormente el baño de agua se deja reposar duraníe 5 minutos a 33°C, después se calienía a 98°C duraníe 56 minuto (1.1 °C por minuío) y finalmente se deja reposar duraníe 5 minuíos a 96°C. Los íubos se almacenan a 20.0°C en una íabla íérmica. El contenido de sólidos del migajón se midió por RMN de protones usando un analizador de RMN Bruker NMS 120 Minispec el día 1 , 3 y 7 como se muesíra para mueslras de migajón preparadas con 0, 05, 1 y 2 ppm de pSac- D34 en la figura 2. El incremento más bajo en el contenido de sólidos con e] tiempo représenla la reducción en relrogradación de amílopectina. Después de 7 días de aimacenamíento a 20.0°C en una labia lérmica, muestras de migajón de 10-20 mg se pesaron y colocaron en 40 µl de cápsulas de DSC estándares de aluminio y se mantuvieron a 20°C. Las cápsulas se usan para calorimetría de escudriñamiento diferencial en un instrumento Metíler Toledo DSC 820. como parámetros se usan un ciclo de calenlamienlo de 20-95°C con 10°C por minuto de calenlamienlo y Gas/flujo: N2/80 ml por minuto. Los resulíados se analizan y la enlalpia para fusión de la amílopectina relrograduada se calcula en EJEMPLO 8 Se preparan migajones de pan de modelo y se miden de acuerdo con el ejemplo 7. Las varianíes de PS4 muesíran una fuerte reducción de la relrogradación de amilopectina después del horneado como se mide por calorimeíría de escudriñamiento diferencial en comparación con el conlrol. Las variantes de PS4 muesíran un efecto de dosis claro.

EJEMPLQ 9 Los ensayos de horneado se llevaron a cabo con una receto de esponja y masa de pan blanco esíándar para íosíada US. La masa de esponja se prepara a paríir de 1400 g de harina "Gold Medal" de General Mills, E.U.A., 800 g de agua, 40 g de aceiíe de semilla de colza, 7,5 g de GRINDSTED™ SSL P55 Veg, 10 g de emulsionante DIMOD AN™ PH200 y 60 g de levadura comprimida. La esponja se mezcla duraníe 1 minuío a baja velocidad y subsecuentemente 3 minutos a velocidad 2 en un mezclador espiral Hobart. La esponja es subsecuentemente fermentada duraníe 3 horas a 25°C, 85% RH. Posteriormente, 600 g de harina "Gold Medal", 18 g de levadura comprimida, 5 g de propionalo de calcio, 160 g de sacarosa, 5 g de propionalo de calcio, 432 g de agua y ácido ascórbíco (60 ppm de concenlración final) y ADA (azodicarbonamida; 40 ppm de conceníración final) se añaden a la esponja. La masa resulíaníe se mezcla duranie 1 minuío a baja velocidad y después 2 minutos a alta velocidad en un mezclador Díosna. Después 30 g de sal se añade a la masa. La masa se deja reposar durante 5 minuíos a temperatura ambiente, y después piezas de masa de 550 g se pesan en balanza, se moldean en moldes de Glimek con los valores 1 :4, 2:4, 3:15, 4:12 y 8 de anchura en ambos lados y se íransfieren a una forma horneada. Después de 65 minuíos probando a 43°C a 95% de RH, las masas se hornean durante 26 minuíos a 200°C en un horno MIWE.

EJE! Se preparan roles daneses a partir de una masa basada en 2000 g de harina de reformación de roles daneses (de Cerealia), 120 g de levadura comprimida, 32 g de sal, y 32 g de sacarosa. Se añade agua a la masa de acuerdo con opíímización de agua previa. La masa se mezcla en un mezclador Diosna (2 minutos a baja velocidad y 5 minutos a alia velocidad). La lemperalura de la masa después del mezclado se mantiene a 26°C. 1350 g de masa se pesan en la báscula y se dejan reposar duranie 10 minuíos en un gabinete de calentamiento a 30°C. Los roles daneses se moldean en un molde Fortuna y se prueban duraníe 45 min. a 34°C y a 85% de humedad relaíiva. subsecueníemeníe los roles daneses se hornean en un horno Bago 2 duraníe 18 minuíos a 250°C con vapor en los primeros 13 segundos. Después el horneado, los roles daneses se enfrían duranie 25 minutos antes de pesar y medir el volumen. Los roles daneses se evalúan con respecto a la apariencia de la cosíra, homogeneidad del migajón, cobertura de la costra, ausbund y volumen específico (medición del volumen con el método de desplazamiento de semilla de colza).

Con base en estos criterios, se encuenira que las variantes de PS4 incrementen el volumen específico y mejoran los parámeíros de calidad de roles daneses. Por lo íanío, las varianíes de PS4 son capaces de conírolar el volumen de los producios horneados.

EJEMPLQ n Protocolo para 8a eva.yacnón de firmeza, e-acst-c-dad y c hesñvn ad Análisis de perfil de íexíura del pan La firmeza, elasticidad y cohesividad se determinan analizando rebanadas de pan por análisis de perfil de textura usando un analizador de texíura de Stable Micro Systems, R.U.. El cálculo de la firmeza y elasticidad se hace de conformidad con el esíándar prefijado suminisírado por Síable Micro Sysíem, R.U.. La sonda usada es aluminio de 50 mm redondo. El pan se rebana con la anchura de 12.5 mm. Las rebanadas se estampan a una pieza circular con un diámeíro de 45 mm y se miden individualmente. Se usan los siguientes valores: Velocidad de pre-prueba: 2 mm/seg Velocidad de prueba: 2 mm/seg Velocidad de post-prueba: 10 mm/seg Dislancia de prueba de ruptura: 1 % Distancia: 40% Fuerza: 0.098 N Tiempo: 5.00 seg Conteo: 5 Células cargadas: 5 kg Tipo de disparo: Auto - 0.01 N El modo de compresión es una modificación a la usada en el método estándar AACC 74-09. La muestra es comprimida dos veces en la prueba. La figura 1 muestra un ejemplo de una curva del analizador de íexíura.

EJEMPLO 12 Protocolo para evalua órn) de fnirmeza La firmeza se deíermina a 40% de compresión duraníe la primera compresión. La figura 1 es la fuerza necesaria para comprimir la rebanada a 40% del espesor total. Mientras más bajo es el valor, más suave es el pan. La firmeza se expresa como un a presión, por ejemplo, en hPa. Esta prueba puede ser referida como el "protocolo de evaluación de firmeza".

EJEMPLQ 13 El área debajo de la curva es una medida de irabajo aplicada durante la prueba. El área debajo de la curve en la parte de compresión (Al) y la parte de retracción (A2) duranie la primera compresión se muesíran en la figura 1. La relación eníre A1 y A2 se define como la elasticidad de la muesíra, y se expresa como unidades de elasticidad. El maíerial elásíico verdadero dará una curva siméírica, ya que la fuerza aplicada duraníe la primera paríe será igual a la fuerza en la segunda paríe. Para pan y maíerial similar al pan, A2 es normalmenle similar a A2 debido a la perturbación de la eslrucíura durante la compresión. Por lo tanto, la elasticidad es siempre menor que 1. Esta prueba puede ser referida como el "protocolo de evaluación de elasticidad ".

EJEMPLO U Protocolo para evaluación de e@lhesuvSdg.di La cohesividad se define como la relación entre el área debajo de la segunda compresión al área debajo de la primera compresión (A3/A1+A2), y se expresa como unidades de cohesividad. Es una medición de la descomposición de la muesíra duraníe la compresión. Mieníras más alia es la capacidad de la muesíra a volver a ganar su forma después de la primera compresión, más cercano será el valor a 1. Para pan y maíerial similar al pan la cohesivídad siempre es menor que 1. Esía prueba puede ser referida como el "prolocolo de evaluación de cohesivídad".

EJEMPLO 15 Exo-especiflcidad Incrementada de pofllpéptod© de vart.g.p.te de PS con mutación 272© Un polipépiido de variante de PS4 designado pMD229 que tiene mutaciones de aminoácido en N33Y D34N G121 F G134R A141 P Y146G 1157L S161A L178F A179T G223E S229P H272Q G303E H307L A309P S334P se prueba para exo-especificídad. Este polípéptido despliega exo-especificídad mejorada como se muestra en el siguiente cuadro.

La vida media t'/2-85 se determina de conformidad con el ejemplo 6, después de filtración en gel de las muestras con columnas PD-10 (de Amersham Bioscíences) usando 50 mM de ciíraío de sodio, 5 mM de CaCb, regulador de pH de pH 6.5.

EJEf Efectos de foirprieza de pMD229, 248, 253 y 271 en ensayos de Dnopp)@ado Se llevan a cabo pruebas de horneado con una receta de esponja y masa de pan blanco estándar para tostada US como se describe en el ejemplo 10. Muestras de pMD229, 248, 253 y 271 se aplicaron en dosis del intervalo de 0.1 a 20 mg/kg de harina. Las muestras de enzima se añaden a la masa después de la fermentación de la esponja junto con los ingredientes restantes. Las mediciones de firmeza muestran que las enzimas reducen significativamente el desarrollo de firmeza del día 1 al día 7 y muestran un alto efecto con dosis de enzima cada vez mayores.

EJEMPLO 17 Propiedades de aneño mejoradas de productos aB?ment-Scios t-ra&adlos con pollpéptldos de variante de PS4: Fopppieza Se hornea pan con 40,000 unidades Betamyl/kg de pSac-pMD229 y la firmeza del pan se prueba de acuerdo con el proíocolo expuesto en el ejemplo 12 en varios tiempos después del horneado. El pan ía bíén se hornea con 40,000 unidades Beíamyl/kg de pSac-D34 / pMD3 (SEQ ED NO: 2). La firmeza del pan se prueba. Como un conirol, íambién se mide la firmeza del pan horneado sin enzima alguna. La figura 2 muesíra los resulíados de un ensayo de horneado en el cual la firmeza de pan íraíado con pSac-pMD229 se compara con la firmeza de pan Iraíado con pSac-D34.

EJEMPLQ 18 Propiedades de manejo mejoradas de productos ai-mpieipit-Bcios totod s con polipéptidos de variante de S4: Elasticidad Se hornea pan con 40,000 unidades Beiamyl/kg de pSac-pMD229 y la elasticidad del pan se prueba de acuerdo con el protocolo expuesto en el ejemplo 13 en varios tiempos después del horneado. El pan íambién se hornea con 40,000 unidades Beíamyl/kg de pSac-D34/pMD3 (SEQ ID NO: 2) . La elasticidad del pan se prueba. Como un conírol, lambién se mide la elasticidad del pan horneado sin enzima alguna. La figura 3 muesíra los resultados de un ensayo de horneado en el cual la elasticidad de pan traiado con pSac-pMD229 se compara con la elasticidad de pan traíado con pSac-D34.

EJEMPLQ 19 Propiedades de manejo mejoradas de productos alliment-icios traba os con poli pépti os de varia? Se hornea pan con 40,000 unidades Beíamyl/kg de pSac-pMD229 y la cohesividad del pan se prueba de acuerdo con el protocolo expuesto en el ejemplo 14 en varios tiempos después del horneado. El pan íambién se hornea con 40,000 unidades Beiamyl/kg de pSac-D34 / pMD3 (SEQ ID NO: 2). La cohesividad del pan se prueba. Como un conírol, también se mide la cohesividad del pan horneado sin enzima alguna. La figura 4 muestra los resultados de un ensayo de horneado en el cual cohesividad de pan íraíado con pSac-pMD229 se compara con la cohesividad de pan íralado con pSac-D34.

Referencias Penninga, D., van der Veen, B.A., Knegíel, R.M., van Hijum, S.A., Rozeboom, HJ., Kalk, K.H., Dijksíra, B.W., Dijkhuizen, L. (1996). The raw strach bindíng domain of cyclodexírín glycosylíransferase from Bacillus circulans sírain 251. J.Biol. Chem. 271 , 32777-32784. Sambrook J, F.E.M.T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed. Cold Spring Harbor Laboraíory, Cold Spring Harbor NY. Zhou.J.H., Baba.T., Takano.T., Kobayashi, S., Arai.Y. (1989). Nucleoíide sequence of íhe malíoíeíraohydrolase gene from Pseutíomonas saccharophila. FEBS Letl. 255, 37- 41. Cada una de las aplicaciones y paíeníes mencionadas en esíe documento, y cada documenío diado o referencíado en cada una de las aplicaciones y paíeníes aníeriores, incluyendo duraníe el proceso de las aplicaciones y patentes ("documentos citados en la soliciíud") y cualesquiera inslrucciones del fabricante o catálogos para cualesquiera producios citados o mencionados en cada una de las aplicaciones y patentes y en cualquiera de los documentos citados en la solicitud, se incorporan aquí por referencia. Además, todos los documentos citados en este texto, y todos los documentos citados o referencíados en documentos citados en este texto, y cualesquiera instrucciones del fabricante o catálogos para cualesquiera productos citados o mencionados en este texío, se incorporan aquí por referencia. Varias modificaciones y variaciones de los méíodos y sistema descritos de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito en cone?íón con modalidades preferidas específicas, cabe entender que la invención como se reivindica no debe limitarse a dichas modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos "para llevara cabo la invención que son obvios para los e?pertos en biología molecular o campos relacionados se preíende que esíén deníro del alcance de las reivindicaciones.

Claims

IQVEDAD DE LA DS EG E

1.- Un polipépíido de variante de PS4 derivable de un polipépíido progenitor que iiene acíividad de amilasa seleccionada del grupo que consisíe de: (a) un polipéptido que comprende una muíación de aminoácido en cada una de las posiciones 33, 34, 121 , 134, 141 , 146, 157, 161 , 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307, 309 y 334; (b) un polipéptido que comprende una muíación de aminoácido en cada una de las posiciones 33, 34, 121 , 134, 141 , 145, 146, 157, 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307 y 334; (c) un polípéptido que comprende una mutación de aminoácido en cada una de las posiciones 33, 34, 121 , 134, 141 , 146, 157, 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307, 309 y 334; (d) un polipéptido que comprende una mutación de aminoácido en cada una de las posiciones 3, 33, 34, 70, 121 , 134, 141 , 146, 157, 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307, 309 y 334; con referencia a la numeración de posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mosírada como SEQ ID NO: 1.

2.- El polipéplido de varianíe de PS4 de conformidad con la reivindicación 1 , caracíerizado además porque cada una de las muíaciones de aminoácidos en el polipéptido (a) se selecciona independieníemeníe del grupo que consisíe de: 33Y, 34N, 121 F, 134R, 141 P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P, preferiblemeníe N33Y, D34N, G121 F, G134R, A141 P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H272Q, G303E, H307L, A309P y S334P.

3.- El polipépíido de variante de PS4 de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque comprende la secuencia pSac-pMD229 (SEQ ID NO: 13).

4.- El polipéptido de variante de PS4 de conformidad con la reivindicación 1 , caracíerizado además porque cada una de las muíaciones de aminoácido en el polipéptido (b) se selecciona independientemente del grupo que consiste de: 33Y, 34N, 121 F, 134R, 141 P, 145D, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L y 334P, preferiblemeníe N33Y, D34N, G121 F, G134R, A141 P, N145D, Y146G, I157L, L178F, A179T, G223E, S229P, H272Q, G303E, H307L y S334P.

5.- El polipépíido de varianíe de PS4 de conformidad con la reivindicación 1 ó 4, caracíerizado además porque comprende la secuencia pSac-pMD248 (SEQ ID NO: 15).

6.- El polipéptido de varianíe de PS4 de conformidad con la reivindicación 1 , caracíerizado además porque cada una de las muíaciones de aminoácido en el polípéptido (c) se selecciona independientemente del grupo que consisíe de: 33Y, 34N, 121 D, 134R, 141 P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P, preferiblemente N33Y, D34N, G121 D, G134R, A141 P, Y146G, 1157L, L178F, AI79T, G223E, S229P, H272Q, G303E, H307L, A309P y S334P.

7.- El polipéptido de variante de PS4 de conformidad con la reivindicación 1 ó 6, caraclerizado además porque comprende la secuencia pSac-pMD253 (SEQ ID NO: 17).

8.- El polipéptido de variante de PS4 de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque cada una de las mutaciones de aminoácido en el polipépíido (d) se selecciona independientemente del grupo que consisíe de: 3S, 33Y, 34N, 70D, 121 D, 134R, 141 P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P, preferiblemente A3S, N33Y, D34N, G70D, G121 D, G134R, A141 P, Y146G, 1157L, L178F, A179T, G223E, S229P, H272Q, G303E, H307L, A309P y S334P.

9.- El polipéptido de variante de PS4 de conformidad con la reivindicación 1 u 8, caracíerizado además porque comprende la secuencia pSac-pMD271 (SEQ ID NO: 19).

10.- El polipépíido de variante de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones aníeriores, caracíerizado además porque el polipépíido progeniíor comprende exoacíividad de amilasa, preferiblemente una exoamilasa no mallogéníca, muy preferiblemeníe una glucano 1 ,4-alfa-malioieírahidrolasa (EC 3.2.1.60).

11.- El polipépíido de variante de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el polípépíido progenitor es o es derivable de especies de Pseudomonas, preferiblemeníe Pseudomonas saccharophilia o Pseudomonas stutzerí.

12.- El polipépíido de varianíe de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones aníeriores, caracíerizado además porque el polipéplido progenitor es una exoamilasa no malíogénica de e?oami-asa de Pseudomonas saccharophilia que tiene una secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 5.

13.- El polipéptido de variante de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque comprende mutaciones de aminoácidos en cada una de las posiciones expuestas en (a), (b), (c) o (d) de la reivindicación 1 , y que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a SEQ ¡D NO: 1 o SEQ ID NO: 5.

14.- El polipéptido de variante de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además porque el polipéptido progenitor es una exoamilasa no maltogénica de Pseudomonas stutzeri que íiene una secuencia moslrada como SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 11.

15.- El polipéptido de variante de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 ó 14, caracterizado además porque comprende muíaciones de aminoácidos en cada una de las posiciones expuestos en (a), (b), (c) o (d) de la reivindicación 1 , y que íiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 11.

16.- El polipéptido de variante de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el polípéptido de variante de PS4 tiene una termoestabilidad superior comparada con el polipépiido progenitor o un polipéptido de íipo silvestre cuando se prueba bajo las mismas condiciones.

17.- El polipéptido de variante de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracíerizado además porque la vida media (tl/2), preferiblemente a 60°C, se incrementa por 15% o más, preferiblemente 50% o más, muy preferiblemeníe aún 100% o más, en relación con el polipéptido progenitor o el polipéptido de tipo silvestre.

18.- El polipéptido de variante de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracíerizado además porque el polipépíido de varianíe de PS4 íiene una e?o-especificidad más alia comparada con el polipéplido progenitor o un polípéptido de íipo silvesire cuando se prueba bajo las mismas condiciones.

19.- El polipéptido de varianíe de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones aníeriores, caracterizado además porque el polipépíido de variante de PS4 tiene 10% o más, preferiblemente 20% o más, preferiblemeníe 50% o más, e?o-especificidad comparado con el polípéptido progenitor o el polipéptido de tipo silveslre.

20.- El polípéptido de varianíe de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque un producto alimenticio traíado con el polipéplido de varianíe de PS4 tiene cualquiera o más, preferiblemenle todas las siguieníes propiedades: (a) firmeza más baja; (b) elasticidad más alta; y (c) cohesividad más alta comparado con un producto alimenticio que ha sido íraíado con un polipéplido progenitor o un polipéptido de tipo silvestre.

21.- El polipéptido de variante de PS4 de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la elasticidad o cohesividad del producto alimenticio se incrementa independientemeníe por 15% o más, preferiblemenle 50% o más, muy preferiblemeníe aún 100% o más, en relación con un producto alimenticio que ha sido íraíado con un polipépíido progenitor o un polipépíido de íipo silveslre.

22.- El polipépíido de varianíe de PS4 de conformidad con la reivindicación 20 ó 21 , caracíerizado además porque cada una de elasticidad y cohesívidad de un producto alimenticio traíado con el polipépíido de varianíe de PS4 se incremento comparado con un producío alímeníicio que ha sido Iraíado con un polipépíido progeniíor o un polipépíido de íipo silveslre.

23.- El polipépíído de variante de PS4 de conformidad con la reivindicación 20, caracíerizado además porque la firmeza del producío alimenticio es disminuida independientemente por 15% o más, preferiblemenle 50% o más, muy preferiblemente aún 100% o más, en relación con un producto alimenticio que ha sido íraíado con un polipéptido progenitor o un polípéptido de íipo sílvesíre.

24.- El polipéptido de variante de PS4 de conformidad con la reivindicación 20 ó 23, caracterizado además porque la firmeza de un producto alimenticio tratado con el polipéptido de varianíe de PS4 es incremenlada comparado con un producto alimeníicio que ha sido íraíado con un polipépíido progeniíor o un polipéplido de tipo silvestre.

25.- Un polipéplido que comprende un fragmento de por lo menos 20 residuos de un polipéptído de variante de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el polipéptido tiene actividad de amilasa de exoamilasa no maltogénica.

26.- El uso de un polipépíido como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones anteriores como un alimento o aditivo de alimento.

27.- Un procedimiento para tratar un almidón que comprende poner en contacto el almidón con un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 y permitir que el polipéptido genere a partir del almidón uno o más productos lineales.

28.- El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 en la preparación de un alimenío o producío de alimento.

29.- Un procedimiento para preparar un alimento o producío de alimenío que comprende mezclar un polipépíido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 con un alimenío o ingredieníe de alimento.

30.- El uso como se reclama en la reivindicación 28, o un procedimiento de conformidad con la reivindicación 29, en donde el producío de alimento comprende una masa o un producío de masa, preferiblemente un produelo de masa procesado.

31.- El uso o procedimienío de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, en donde el producío alimenticio es un producto de panadería.

32.- Un procedimienío para hacer un producío de panadería que comprende: (a) proveer un medio de almidón; (b) añadir al medio de almidón un polipépíido como se expone en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24; y (c) aplicar calor al medio de almidón duraníe o después del paso (b) para producir un produelo de panadería.

33.- Un producto alimenticio, producto de alimento, producto de masa o un producto de panadería obtenido u obtenible por un procedimienlo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 32.

34.- Una composición mejoradora para una masa, en la cual la composición mejoradora comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, y por lo menos un ingrediente de masa o aditivo de masa adicional.

35.- Una composición que comprende una harina y un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.

36.- El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en un producto de masa para retardar o reducir la rancidez, preferiblemenle retrogradación perjudicial, del producto de masa.

37.- El uso de un polípéptido de variante de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en un producto de masa para mejorar cualquiera o más de firmeza, elasticidad o cohesividad del producto de masa.

38.- Una combinación de un polipéptido de variante de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, junto con Novamyl, o una variante, homólogo o mutantes de los mismos que tiene aclividad de alfa-amilasa malíogénica.

39.- El uso de una combinación de conformidad con la reivindicación 38 para una aplicación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

40.- Un alimento o producto de alimento producido por tratamiento con una combinación de conformidad con la reivindicación 38.

41.- Un ácido nucleico capaz de codificar un polipépíido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.

42.- El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque codifica un polipéptido que comprende mutaciones de ácido nucleico en cada una de las posiciones expuestas en (a), (b), (c) o (d) de la reivindicación 1 , y que tiene una secuencia de ácido nucleico que es por lo menos 75% idéntica a SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12.

43.- Un ácido nucleico que comprende un fragmento de por lo menos 60 residuos de un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 41 ó 42 que es capaz de codificar un polipéptido que íiene actividad de exoamilasa no maltogénica.

44.- Una secuencia de ácido nucleico derivable de una secuencia progenítora, la secuencia progenitora capaz de codificar una amilasa, dicha secuencia de ácido nucleico comprende una sustitución en uno o más residuos de tal manera que el ácido nucleico codifica una o más de las siguientes mulaciones en las posiciones especificadas: (a) 33Y, 34N, 121 F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161 A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P; (b) 33Y, 34N, 121 F, 134R, 141 P, 145D, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L y 334P (c) 33Y, 34N, 121 D, 134R, 141 P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P; (d) 3S, 33Y, 34N, 70D, 121 D, 134R, 141 P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P; con referencia a la numeración de posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mosírada como SEQ ID NO: 1.

45.- Una secuencia de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44, que es derivada de una secuencia progenítora que codifica una exoamilasa no maltogénica por sustiíución de uno o más residuos de nucleótido.

46.- Una secuencia de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 45, seleccionada del grupo que consiste de: pSac-pMD229 (SEQ ID NO: 14), pSac-pMD248 (SEQ ID NO: 16), pSac-pMD253 (SEQ ID NO: 18) y pSac-pMD271 (SEQ ID NO: 20).

47.- Un plásmido que comprende un ácido nucleico de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 46.

48.- Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de PS4 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 47, o capaz de expresar un polipépíido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.

49.- Una célula hospedero que comprende, preferiblemente íransformada con, un plásmido de conformidad con la reivindicación 47 o un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 48.

50.- Una célula capaz de expresar un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.

51.- Una célula hospedero de conformidad con la reivindicación 49, o una célula de conformidad con la reivindicación 50, que es una célula bacteriana, fungal o de levadura.

52.- Un método de expresión de un polipéptido de varianíe de PS4, el méíodo comprende obíener una célula hospedero o una célula de conformidad con la reivindicación 49, 50 ó 51 y que expresa el polipépíido de la célula o célula hospedero, y purificando opcíonalmeníe el polipépíido.

53.- Un méíodo para alíerar la secuencia de un polipéptido al iníroducir una susíilución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: (a) 33Y, 34N, 121 F, 134R, 141 P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P; (b) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141 P, 145D, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L y 334P (c) 33Y, 34N, 121 D, 134R, 141 P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P; (d) 3S, 33Y, 34N, 70D, 121 D, 134R, 141 P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P (con referencia a la numeración de posición de una secuencia de e?oamilasa de Pseudomonas saccharophilia mosírada como SEQ ID NO: 1 ), en un polipépíido progeniíor que íiene actividad de amilasa.

54.- Un méíodo para alíerar la secuencia de una exoamilasa no mallogénica al inlroducir una sustitución seleccionada del grupo que consiste de: (a) 33Y, 34N, 121 F, 134R, 141 P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P; (b) 33Y, 34N, 121 F, 134R, 141P, 145D, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L y 334P (c) 33Y, 34N, 121 D, 134R, 141 P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P; (d) 3S, 33Y, 34N, 70D, 121 D, 134R, 141P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P con referencia a la numeración de posición de una secuencia de e?oamüasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1.

55.- El mélodo de conformidad con la reivindicación 53 ó 54, caraclerizado además porque la secuencia de la exoamilasa no maltogénica es alterada al alterar la secuencia de un ácido nucleico que codifican la exoamilasa no maltogénica.

56.- Un método para producir una variante de polipéptido de PS4, el método comprende introducir una sustitución de aminoácido en un polipéptido progenitor que tiene aclividad de amilasa, la sustitución de aminoácido siendo seleccionada del grupo que consiste de: (a) 33Y, 34N, 121 F, 134R, 141 P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P; (b) 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 145D, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L y 334P (c) 33Y, 34N, 121 D, 134R, 141 P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P; (d) 3S, 33Y, 34N, 70D, 121 D, 134R, 141 P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P con referencia a la numeración de posición de una secuencia de e?oamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1.

57.- El método de conformidad con la reivindicación 53 ó 54, caracterizado además porque la secuencia de un ácido nucleico que codifica el polipéptido progenitor es alterada para introducir la sustitución de aminoácido.

58.- Un método para alterar la secuencia de un ácido nucleico que codifica una exoamilasa no maltogénica, el método comprende introducir en la secuencia un codon que codifican un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de: (a) 33Y, 34N, 121 F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161 A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P; (b) 33Y, 34N, 121 F, 134R, 141 P, 145D, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L y 334P (c) 33Y, 34N, 121D, 134R, 141P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 2990 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P; (d) 3S, 33Y, 34N, 70D, 121 D, 134R, 141 P, 146G, 157L, 178F, 179T, 223E, 229P, 272Q, 303E, 307L, 309P y 334P, con referencia a la numeración de posición de una secuencia de exoamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1.

59.- Un método para incrementar la termoestabílidad, o la exo-especificidad, o ambas, de un polipépíido, el mélodo que comprende los pasos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 53 a 58.

60.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 53 a 59, caracterizado además porque el polipépíido es aislado o purificado, o ambos.

61.- Un polipéptido obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 53 a 60.

62.- Un polipéptido obtenido por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 53 a 60. RESOÍV.EN DE LA INVENCOOM Los inventores de la presente describen un polípéptido de variante de PS4 derivable de un polípéptido progeniíor que tiene actividad de amílasa seleccionada del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que comprende una mutación de aminoácido en cada una de las posiciones 33, 34, 121 , 134, 141 , 146, 157, 161 , 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307, 309 y 334; (b) un polipéptido que comprende una mutación de aminoácido en cada una de las posiciones 33, 34, 121 , 134, 141 , 145, 146, 157, 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307 y 334; (c) un polipéptido que comprende una mutación de aminoácido en cada una de las posiciones 33, 34, 121 , 134, 141 , 146, 157, 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307, 309 y 334; y (d) un polipéptido que comprende una mutación de aminoácido en cada una de las posiciones 3, 33, 34, 70, 121 , 134, 141 , 146, 157, 178, 179, 223, 229, 272, 303, 307, 309 y 334; con referencia a la numeración de posición de una secuencia de e?oamilasa de Pseudomonas saccharophilia mostrada como SEQ ID NO: 1, usos de dicho polipéptido como un alimento o aditivo de alimento, y ácidos nucleicos que codifican el mismo. 9B P07/2281 F