MX2008000215A - Metodo de uso de antagonistas de zonulina para evitar la perdida de o para regenerar celulas pancreaticas - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona materiales y métodos para el tratamiento de la diabetes. Utilizando los materiales y métodos de la invención, se puede retardar y/o prevenir la perdida de células ? pancreáticas. Además, los materiales y métodos de la invención pueden ser utilizados para regenerar células ? pancreáticas.

Description

MÉTODO DE USO DE ANTAGONISTAS DE ZONULINA PARA EVITAR LA PÉRDIDAi DE O PARA REGENERAR CÉLULAS PANCREÁTICAS El desarrollo de la presente invención fue apoyado por la University of Maryland, Baltimore, Maryland La invención descrita en la presente fue apoyada mediante fondos de National Institutes of Health (DK 66630 and DK 48373) El Gobierno tiene ciertos derechos CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona materiales y métodos para evitar o desacelerar la pérdida de células ß pancreáticas Además, la presente invención proporciona también materiales y métodos para regenerar células, en particular, células ß pancreáticas En algunos aspectos, los antagonistas de zonulina (por ejemplo, antagonistas de péptido) pueden ser utilizados en la práctica de la invención ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN I Función y Regulación de Uniones Estrechas Intestinales El epitelio intestinal representa la interfaz más grande (más de 2,000,000 cm2) entre el ambiente externo y el ambiente interno El mantenimiento de la competencia de las uniones estrechas intracelulares ("unión estrecha") evita movimientos de factores ambientales potencialmente nocivos, tales como las bacteria, virus, toxinas, alérgenos alimenticios, y macromoléculas a través de la barrera intestinal Esta competencia es puesta en riesgo de manera significativa en una variedad de condiciones clínicas que afectan el tracto gastrointestinal, incluyendo alergias por alimentos, infecciones entéricas, síndromes de mala absorción, y enfermedades intestinales inflamatorias Los tj de zonula occludens (en los sucesivo "ZO") son una de las marcas de los epitelios absorbentes y secretores (Madara, J Clin Invest , 83 1089-1094 (1989), and Madara, Textboo of Secretory Diarrhea, Eds Lebenthal et al, Capitulo 11, páginas 125-138 (1990)) Como una barrera entre los compartimientos apical y basolateral, regulan de manera selectiva la difusión pasiva de iones y solutos solubles en agua a través la trayectoria paracelular (Gumbmer, Am J Physiol, 253 (Cell Physiol 22) C749-C758 (1987)) Esta barrera mantiene cualquier gradiente generado por la actividad de las trayectorias asociadas con la ruta transcelular (Diamond, Physiologist, 20 10-18 (1977)) Las variaciones en conductancia transepitelial pueden ser atribuidas de manera usual a cambios en la permeabilidad de la trayectoria paracelular, ya que la resistencia de las membranas de plasma de enterocito son relativamente elevadas (Madara (1989, 1990), supra) El ZO representa la mayor barrera en esta trayectoria paracelular, y la resistencia eléctrica de los tejidos epiteliales parece depender del número de cadenas de proteína de transmembrana, y su complejidad en el ZO, como se observó mediante un microscopio electrónico de fractura por congelación (Madara et al, J. Cell Biol. 101:2124- 2133 (1985)). Existe una abundante evidencia de que ZO, una vez considerado como estructuras estáticas, de hecho son dinámicos y se adaptan con facilidad a una variedad de circunstancias de desarrollo (Magnuson et al, Dev. Biol, 67:214-224 (1978); Revei et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi, 40:443-455 (1976); y Schneeberger et al, J. Cell. Sci. 32:307-324 (1978)), fisiológicas (GiMa et al, Dev. Biol, 50:142-168 (1976); Madara et al, J. Membr. Biol, 100:149-164 (1987); Mazariegos et al, J. Cell Biol, 98:1865-1877 (1984); y Sardet et al, J. Cell Biol, 80:96-117 (1979)), y patológicas (Miiks et al, J. Cell Biol, 103:2729-2738 (1986), Nash et al, Lab. Invest., 59:531-537 (1988); y Shasby et al., Am. J. Physiol, 255 {Cell Physiol, 24:C781-C788 (1988)). Los mecanismos reguladores que están detrás de esta adaptación aún no son completamente comprendidos. Sin embargo, es evidente que, en presencia de Ca2 + , el ensamble del ZO es el resultado de interacciones celulares que activan una compleja cascada de eventos bioquímicos que finalmente conducen a eventos químicos que finalmente conllevan a la formación y modulación de una red organizada de elementos ZO, la composición de la cual solamente ha sido caracterizada de manera parcial (Diamond, Physiologist, 20:10-18 (1977)). Un candidato para cadenas de proteína de transmembrana, occluden, ha sido identificado de forma reciente (Furuse et al., J. Membr. Biol, 87:141-150 (1985)). Se han identificado seis proteínas en una placa submembranosa citoplásmica subyacente a los contactos de membrana, aunque su función está por establecerse (Diamond, supra). ZO-1 y ZO-2 existen como un heterodímero (Gumbiner et al, Proc. Nati. Acad. Sel, USA, 88:3460-3464 (1991)) en complejo detergente-estable con una proteína 130 kD no caracterizada (ZO-3). La mayoría de los estudios microscópicos inmunoelectrónicos han localizado ZO-1 precisamente debajo de los contactos de membrana (Stevenson et al, Molec. Cell Biochem., 83:129- 145 (1988)). Otras dos proteínas, cingulin (Citi et al, Nature (London), 333:272-275 (1988)) y el antígeno 7H6 (Zhong et al, J. Cell Biol, 120:477- 483 (1993)) están localizados más allá de la membrana y aún no han sido clonados. Rab 13, una pequeña proteína de enlace GTP también ha sido localizada recientemente para la región de unión (Zahraoui et a/., J CelIBiol, 124:101-115 (1994)). Se sabe que otras pequeñas proteínas de enlace GTP regulan el citoesqueleto cortical, es decir, no regula la unión de actina-membrana en contactos focales (Ridley et al, Cell, 70:389-399 (1992)), y rae regula el desdoblamiento de membrana inducido por factor de crecimiento (Ridley et al, Cell, 70:401-410 (1992)). En base a la analogía con las funciones conocidas de las proteínas de placa en las uniones celulares mejor caracterizadas, los contactos focales (Guan et al, Nature, 358:690-692 (1992)), y uniones adherentes (Tsukita et al, J. CelIBiol, 123:1049-1053 (1993)), se ha hipotetizado que las proteínas de placa tj-asociadas están involucradas en las señales de transducción en ambas direcciones a través de la membrana celular, t en la regulación de los enlaces al citoesqueleto de actina cortical. Para acometer los muy diversos retos fisiológicos y patológicos a los cuales están sometidos los epitelios, el ZO debe ser capaz de respuestas rápidas y coordinadas que requieren la presencia de un sistema regulador complejo. La caracterización precisa de los mecanismos involucrados en el ensamble y regulación del ZO es un área de activa investigación actual. Hay ahora evidencia suficiente de que existen enlaces estructurales y funcionales tj entre el citoesqueleto de actina y el complejo tj de células absorbentes (Gumbiner et al, supra; Madara et al supra; y Drenchahn et al, J. Cell Biol, 107:1037-1048 (1988)). El citoesqueleto de actina está compuesto de una complicada malla de microfilamentos cuya geometría precisa es regulada por medio de un gran grupo de proteínas de unión a actina. Un ejemplo de como el estado fosforilación de una proteína actina-enlazada debe regular el enlace de citoesqueleto para las membranas de plasma celular es el substrato de cinasa C rico en alanina miristoilada (en lo sucesivo "MARCKS"). MARCKS es un sustrato de cinasa C de proteína específica (en lo sucesivo "PKC") que está asociado con la cara citoplásmica de la membrana de plasma (Aderem, Elsevier Sci. Pub. (UK), páginas 438-443 (1992)). En su forma no-fosforilada, MARCKS se entrelaza a la actina de membrana. Por tanto, es probable que la malla de actina asociada con la membrana a través de MARCKS sea relativamente rígida (Hartwig et al, Nature, 356:618- 622 (1992)). Fosoforilatos PKC activados MARCKS, que son liberados desde la membrana (Rosen et al, J. Exp. Med, 172:1211-1215 (1990); y Thelen et al, Nature, 351: 320-322 (1991)). Es probable que la actina enlazada a MARCKS esté espacialmente separada desde la membrana y sea más plástica. Cuando MARCKS es desfosforilado, regresa a la membrana en donde una vez más se entrelaza a la actina (Hartwig et ah, supra; and Thelen et al. supra). Estos datos sugieren que la red de F-actina puede ser reacomodada por medio de un proceso de fosforilación PKC-dependiente que involucra proteínas actina-enlazadas (siendo una de ellas MARCKS). Se ha demostrado que una variedad de mediadores intracelulares altera la función y/o estructura tj de uniones estrechas de vesicular biliar de anfibio (Duffey et al, Nature, 204:451-452 (1981)), y de intestino de carpa dorada (Bakker et al, Am. J. Physiol, 246:G213-G217 (1984)) y de lenguado (Krasney et al, Fed. Proc, 42:1100 (1983)), exhibe resistencia mejorada al flujo iónico pasivo a medida que se eleva cAMP intracelular. Asimismo, la exposición de la vesicular biliar al ionóforo Ca2+ parece mejorar la resistencia tj resistencia, e induce alteraciones en la estructura tj (Palant et al, Am. J. Physiol, 245:C203-C212 (1983)). Además, la activación de PKC por medio de esteres de forbol incrementa la permeabilidad paracelular de líneas celulares epiteliales tanto renales (Ellis et al, C. Am. J. Physiol, 263 {Renal Fluid Electrolyte Physiol. 52):F293-F3OO (1992)), como intestinales (Stenson et al, C. Am. J. Physiol, 265 (Gastrointest Liver Physiol , 28) G955-G962 (1993)) II Toxina de Zonula Occludens SE QUEDA IGUAL La mayoría de los candidatos de vacuna de Vibrio cholerae construidos mediante la eliminación de la toxina de cólera que codifica al gen ctxA (CT) son capaces de brindar respuestas de anticuerpo elevadas, aunque más de la mitad de las vacunas desarrollar aún diarrea moderada (Levine et al, Infect Immun , 56(1) 161-167 (1988)) Dada la magnitud de la diarrea inducida en ausencia de CT, se formó la hipótesis de que V cholerae produce otros factores enterotoxigénicos, que aún están presentes en sepas eliminadas de la secuencia ctxA (Levine et al, supra) Como resultado, se descubrió una segunda toxina, la toxina de zonula occludens (en los sucesivo "ZOT") elaborada por medio de V cholerae y que contribuye a la diarrea residual, (Fasano et al, Proc Nati Acad Sel, USA, 88 5242-5246 (1991)) El gen zot está ubicado inmediatamente adyacente a los genes ctx La concurrencia de alto porcentaje del gen zot con los genes ctx entre cepas V cholerae (Johnson et al, J Clin Microb , 31(3) 732-733 (1993), y Karasawa et al, FEBS Microbiology Letters, 106 143-146 (1993)) sugiere un posible rol sinergístico de ZOT en el origen de diarrea de deshidratación aguda típica del cólera Recientemente, el gen zot ha sido identificado también en otros patógenos entéricos específicos (Tschape, 2nd Asian-Pacific Symposium on Typhoíd fever and other Salomellosis, Al (Abstr ) (1994)) Se ha encontrado de manera previa que cuando se pruebaen mucosa ileal de conejo, la ZOT incrementa la permeabilidad intestinal al modular la estructura de tj intercelular (Fasano et al, supra) Se ha encontrado que como consecuencia de la modificación de la trayectoria paracelular, la mucosa intestinal se vuelve más permeable Se ha encontrado también que la ZOT no afecta el transporte activo acoplado a Na + -glucosa, no es citotóxica, y no elimina por completo la resistencia transepitehal (Fasano et al, supra) De manera más reciente, se ha encontrado que la ZOT es capaz de abrir de manera reversible tj en la mucosa intestinal, y por tanto la ZOT, cuando es co-admimstrada con una agente terapéutico, por ejemplo, insulina, es capaz de efectuar el suministro intestinal del agente terapéutico, cuando se emplea en una composición de dosis oral para suministro de fármaco intestinal, por ejemplo, en el tratamiento de la diabetes (WO 96/37196, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,827,534, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,665,389, y Fasano et al, J Clin Invest, 99 1158-1164 (1997) cada una de las cuales está incorporada a la presente mediante referencia en su totalidad) Se ha encontrado también que la ZOT es capaz de abrir de manera reversible tj en la mucosa nasal, y por tanto la ZOT, cuando es co-administrada con un agente terapéutico, es capaz de mejorar la absorción nasal de un agente terapéutico (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,908,825, la cual esta incorporada a la presente mediante referencia en su totalidad) En la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,864,014; la cual está incorporada a la presente mediante referencia en su totalidad, se ha identificado un receptor ZOT y purificado a partir de una línea celular intestinal, es decir, las células CaCo2. Además, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,912,323; la cual está incorporada a la presente mediante referencia en su totalidad, se han identificado y purificado los receptores ZOT a partir de tejido intestinal, de corazón y de cerebro humano. Los receptores ZOT representan la primera etapa de la trayectoria paracelular involucrado en la regulación de la permeabilidad intestinal y nasal. lll. Zonulina En las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica 5,945,510 y 5,948,629, las cuales están incorporadas mediante referencia en la presente en su totalidad, se han identificado y purificado proteínas de mamífero que están inmunológica y funcionalmente relacionadas con la ZOT, y que funcionan como el modulador fisiológico de uniones estrechas de mamífero. Estas proteínas de mamífero, referidas como "zonulinaa", son útiles para mejorar la absorción de agentes terapéuticos a través de tj de la mucosa intestinal y nasal, así como a través de tj de la barrera cerebral sanguínea.

IV. Antagonistas de Péptido de zonulinaa Los antagonistas de péptido de zonulinaa fueron identificados y descritos por primera vez en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. de Serie 09/127,815 pendiente, presentada el 3 de agosto de 1998, la cual está incorporada a la presente mediante referencia en su totalidad, la cual corresponde a WO 00/07609. Los antagonistas de péptido de zonulinaa pueden unirse al receptor ZOT, aunque no funcionan para modular fisiológicamente la apertura de las uniones estrechas de mamífero. Los antagonistas de péptido inhiben de manera competitiva la unión de ZOT y zonulinaa para el receptor ZOT, inhibiendo de esta manera la habilidad de ZOT y zonulinaa para modular fisiológicamente la apertura de uniones estrechas de mamífero.

V. Diabetes La diabetes mellitus Tipo I (TIDM), referida de manera común como diabetes insulina-dependiente o diabetes juvenil, es un padecimiento autoinmune del páncreas. Los pacientes producen una respuesta inmune a las células ß del páncreas, las células responsables de la producción de insulina. Como un resultado de la destrucción de las células ß, el páncreas ya no puede producir la hormona insulina. La morbilidad y mortalidad asociadas con la diabetes son devastadoras El número total de individuos diabéticos en los Estados Unidos de Norteamérica es de 157 millones De éstos, 100% de los individuos diabéticos del tipo I y 40% de individuos diabéticos del tipo II dependen de la administración parenteral de insulina En una base anual, los costos médicos directos asociados con la diabetes exceden 40 mil millones de dólares 14 mil millones de dólares adicionales están asociados con la incapacidad, pérdida laboral y mortalidad prematura Aunque las estrategias de suministro de fármaco de insulina oral han sido el enfoque de muchos esfuerzos de investigación, en gran medida no han sido exitosos debido a que la naturaleza fisiológico del intestino delgado evita la absorción de las macromoléculas, tal como la insulina Recientemente, la Publicación de Patente de los Estados unidos de Norteamérica 2005/0067074 A1 describió el uso de antagonistas de péptido de zonulinaa para evitar o retardar el inicio de la diabetes Esta publicación sugiere que una etapa crítica e inicial en la progresión de la enfermedad radica en las alteraciones en la permeabilidad paracelular y que es necesario un incremento de la permeabilidad paracelular para la progresión hacia la diabetes Se mostró que los antagonistas de péptido de zonuhnaa, que bloquean esta trayectoria endógena, previenen la progresión hacia la diabetes A pesar de la descripción de esta publicación, existe todavía una necesidad en la técnica para invertir el curso de la enfermedad, por ejemplo, al regenerar las células ß productoras de insulina Esta necesidad y otras son cubiertas por medio de la presente invención BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para retardar la pérdida de células ß pancreáticas en un sujeto que necesita de las mismas Dichos métodos pueden comprender el administrar a un sujeto una composición que comprende un antagonista de zonuhnaa Un antagonista de zonu naa puede ser un péptido, por ejemplo, un péptido que comprende la secuencia Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly (NO ID SEC 15) Las composiciones para uso en los métodos de retardo de pérdida de células ß pancreáticas pueden comprender uno o más componentes además de un antagonista de zonulmaa Por ejemplo, las composiciones pueden comprender uno o más factores que mejoran el crecimiento celular Los factores adecuados incluyen, aunque no se limitan a, factores de crecimiento Ejemplos de factores de crecimiento adecuados incluyen, aunque no se limitan a, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor-2 de crecimiento de fibroblasto básico (BFGF-2), factor de crecimiento de queratinocito (KGF), factor de crecimiento de hepatocito/factor de dispersión (HGF/SF), péptido-1 de tipo glucagon (GLP-1), exend?na-4, caja homeót?ca-1 de isleta/duodeno (IDX-I), ß-celulina, activina A, factor de crecimiento de transformación-a (TGF-a), factor de crecimiento de transformación-ß (TGF-ß), gastpna, y combinaciones de los mismos En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para regenerar células ß pancreáticas en un sujeto en necesidad de las mismas. Dichos métodos pueden comprender el administrar a un sujeto un antagonista de zonulinaa y una célula. Un antagonista de zonulinaa puede ser un péptido, por ejemplo, un péptido que comprende la secuencia Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly (NO. ID. SEC: 15). Se puede utilizar cualquier tipo de célula que puede facilitar la regeneración de células ß. En algunas modalidades, la célula puede ser una célula que secreta factores de crecimiento. En algunas modalidades, la célula puede ser una célula de isleta, por ejemplo una célula ß. En algunas modalidades, la célula puede ser una célula progenitora, por ejemplo una célula madre. La sincronización de la administración del antagonista y la célula puede ser optimizada utilizando técnicas ya conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. En algunas modalidades, el antagonista y la célula pueden ser administrados de manera simultánea en tanto que en otras modalidades, el antagonista y la célula no son administrados de forma simultánea, es decir el antagonista pude ser administrado antes o después de que la célula es administrada. En una modalidad, el antagonista es administrado tanto antes como después de la célula. Los métodos para regenerar las células ß pancreáticas en un sujeto que necesita de las mismas que comprenden el administrar al sujeto un antagonista de zonulinaa y una célula pueden comprender además administrar un factor que mejora el crecimiento celular. Los factores adecuados incluyen, aunque no están limitados a, factores de crecimiento. Ejemplos de factores de crecimiento adecuados incluyen, pero no se limitan a, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor-2 de crecimiento de fibroblasto básico (BFGF -2), factor de crecimiento de queratinocito (KGF), factor de crecimiento de hepatocito/factor de dispersión (HGF/SF), péptido-1 de tipo glucagon (GLP-1), exendina-4, caja homeótica-1 de isleta/duodeno (IDX-I), ß-celulina, activina A, factor de crecimiento de transformación-a (TGF-a), factor de crecimiento de transformación-ß (TGF- ß), gastrina y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para regenerar células ß pancreáticas en un sujeto que necesita de las mismas, que comprende el administrar al sujeto un antagonista de zonulinaa bajo condiciones que permiten la reproducción de las células ß. Un antagonista de zonulinaa puede ser un péptido, por ejemplo, un péptido que comprende la secuencia Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly (NO. ID. SEC: 15). Dichos métodos pueden comprender además la administración de un factor que mejora el crecimiento celular. Los factores adecuados incluyen, aunque no están limitados a, factores de crecimiento. Ejemplos de factores de crecimiento adecuados incluyen, pero no se limitan a, factor de crecimiento epidérmico(EGF), factor-2 de crecimiento de fibroblasto básico (BFGF-2), factor de crecimiento de queratinocito (KGF), factor de crecimiento de hepatocito/ factor de dispersión (HGF/SF), péptido-1 de tipo glucagon (GLP-1), exendina-4, caja homeótica-1 de isleta/duodeno (IDX-I), ß-celulina, activina A, factor de crecimiento de transformación-a (TGF-a), factor de crecimiento de transformación-ß (TGF-ß), gastrina y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para regenerar células ß pancreáticas en un sujeto que necesita de las mismas que comprende el administrar al sujeto un antagonista de zonulinaa e implantar células en el sujeto. Un antagonista de zonulinaa puede ser un péptido, por ejemplo, un péptido que comprende la secuencia Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly (NO. ID. SEC: 15). Se puede implantar y utilizar cualquier tipo de célula y que facilite la regeneración de células ß. En algunas modalidades, las células pueden comprender células que secretan factores de crecimiento. En algunas modalidades, las células pueden ser células de isleta, por ejemplo, las células pueden comprender células ß. En algunas modalidades, las células pueden comprender células progenitoras, por ejemplo, células madre. La temporización de la administración del antagonista y la implantación de las células se puede optimizar utilizando técnicas ya conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. En algunas modalidades, el antagonista puede ser administrado y las células implantadas de manera simultánea en tanto que en otras modalidades, el antagonista no es administrado de manera simultánea con la implantación de las células, es decir, el antagonista puede ser administrado antes o después de que se implanten las células. En una modalidad, el antagonista es administrado antes o después de que se implanten las células En algunas modalidades, un método para regenerar las células ß pancreáticas en un sujeto que necesita de las mismas que comprende el administrar al sujeto un antagonista de zonulinaa e implantar las células en el sujeto puede comprender además la administración de un factor que mejora el crecimiento celular Los factores adecuados incluyen, aunque no se limitan a, factores de crecimiento Ejemplos de factores de crecimiento adecuados incluyen, pero no se limitan a, factor de crecimiento ep?dérm?co(EGF), factor-2 de crecimiento de fibroblasto básico (BFGF-2), factor de crecimiento de queratinocito (KGF), factor de crecimiento de hepatocito/ factor de dispersión (HGF/SF), pépt?do-1 de tipo glucagon (GLP-1), exend?na-4, caja homeót?ca-1 de isleta/duodeno (IDX-I), ß-celuhna, activina A, factor ae crecimiento de transformación-a (TGF-a), factor de crecimiento de transformación-ß (TGF-ß), gastpna y combinaciones de los mismos En algunas modalidades, el factor puede ser administrado y las células implantadas de manera simultánea en tanto que en otras modalidades, el factor no es administrado de manera simultánea con la implantación de las células, es decir, el factor puede ser administrado antes o después de que se implanten las células En una modalidad, el factor es administrado antes y después de que se implantan las células La presente invención proporciona un método para tratar una enfermedad autoinmune por medio de la administración de un compuesto que previene un incremento en la permeabilidad de una barrera anatómica. Un compuesto que previene un incremento en la permeabilidad de una barrera anatómica puede ser un antagonista de un compuesto fisiológico normal que incrementa la permeabilidad de la barrera anatómica. Un ejemplo de un compuesto adecuado para el tratamiento de enfermedades autoinmunes es un antagonista de zonulinaa. Ejemplos de enfermedad autoinmune que puede ser tratada con un compuesto que previene un incremento en la permeabilidad de una barrera anatómica incluyen, aunque no se limitan a, enfermedad celiaca, cirrosis biliar primaria, nefropatía IgA, granulomatosis de Wegener, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo 1, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso, tiroiditis de Hashimoto (tiroide subactiva), enfermedad de Graves (tiroide sobreactiva), hepatitis autoinmune, enfermedad del oído interno autoinmune, penfigoide boloso, síndrome de Devic, síndrome de Goodpasture, síndrome miastenico de Lambert-Eaton (LEMS), síndrome I i nfoprol iterativo autoinmune (ALPS), síndromes paraneoplásticos, síndromes autoinmunes poiiglandulares (PGA), y alopecia areata. Estos y oros objetos de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción detallada de la invención proporcionada a continuación en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra una comparación de secuencias N-terminal de zonulina purificada a partir de varios tejidos humanos y cadena pesada IgM con la secuencia N-terminal del fragmento biológicamente activo (amino ácidos 288-399) de ZOT. La Figura 2 muestra el efecto de ZOT, zonulina, zonulina ya sea sola (barras cerradas), o en combinación con el antagonista de péptido FZI/O (barras abiertas) o en combinación con FZI/1 (barras sombreadas), en comparación al control negativo, en la resistencia de tejido (Rt) de íleo de conejo montado en cámaras Ussing. N igual a 3-5; y * igual a p<0.01. La Figura 3 muestra las concentraciones (ng/ml) de zonulina intraluminal tanto en ratas propensas a la diabetes como resistentes a la diabetes, que fueron determinadas utilizando una prueba ELISA de intercalación. Las muestras se obtuvieron mediante lavado intestinal en solución salina normal. La primera barra en cada caso representa ratas resistentes a la diabetes (DR). La segunda barra representa animales propensos a la diabetes (DP), y la tercera barra representas ratas con diabetes crónica (CD). <9% de las ratas propensas a la diabetes no se vuelven diabéticas, y ~ 9 % de las ratas resistentes a la diabetes desarrollaron la diabetes. La Figura 4 muestra el porcentaje de ratas usadas en el estudio que progresaron hasta la diabetes. La Figura 5 muestra las concentraciones (ng/ml) de zonulina intraluminal en ratas diabéticas, que fueron determinadas utilizando una prueba ELISA de intercalación. La Figura 6 muestra la permeabilidad intestinal ex vivo en ratas resistentes a la diabetes (DR), ratas propensas a la diabetes no tratadas (DP-no tratadas; segunda barra) determinada en cámaras Ussing, ratas propensas a la diabetes tratadas con el antagonista de péptido de zonulina (DP-tratadas; tercera barra). * igual a p<0.05; ** igual a p<0.05, y p 0.0001 en comparación con DP-tratadas. La Figura 7 muestra la permeabilidad intestinal ex vivo en los intestinos delgados de ratas propensas a la diabetes no tratadas que desarrollaron o no diabetes. * igual a p<04. La Figura 8 es una representación esquemática de un modelo de como la permeabilidad aberrante de las uniones estrechas juega un rol en el desarrollo y progresión de la diabetes Tipo I. La Figura 9 muestra secciones teñidas de hematoxilina y eosina de pancreata de ratas BBDP ya sea tratadas o no tratadas con el inhibidor de zonulina AT1001. El análisis histológico de pancreata aislada a partir de ratas no tratadas que desarrollaron diabetes Tipo I (TID) (paneles superiores) y ratas tratadas con AT1001 que no desarrollaron TID (paneles inferiores). Las isletas indicadas por las fleches en los paneles izquierdos (amplificación 10X), se muestran en mayor amplificación (40X) en los paneles derechos. Los animales no tratados revelaron el daño de isleta de etapa final común para la TID, en tanto que los animales tratados mostraron evidencia de inflamación perivascular sin insulitis. La Figura 10 muestra la tinción de isleta pancreática de ratas BBDP ya sea tratadas o no tratadas con ei inhibidor de zonulina AT1001. La inmunohistologia de pancreata aislada de las ratas BBDP no tratadas que desarrollaron TID (paneles superiores) y ratas tratadas con AT1001 que no desarrollaron TID (paneles inferiores). Las isletas de ratas que desarrollaron TID mostraron el aspecto colapsado típico sin tinción de insulina (A) y agrupamientos de células delta productoras de glucagon preservadas (B). A la inversa, los animales tratados con AT1001 mostraron isletas preservadas con células beta productoras de insulina detectables (C) en el núcleo de la isleta y células delta productoras de glucagon en su borde (D). Sin embargo, la tinción de célula delta pareció no uniforme y de manera ocasional múltiples capas celulares (ver flecha). Amplificación 10X. La Figura 11 muestra la inmunohistoquímico de la pancreata aislada a partir de ratas BBDP no tratadas que desarrollaron TID (paneles A y B) y ratas tratadas con AT1001 que no desarrollaron TID (paneles C-F). Las isletas de las ratas que desarrollaron TID mostraron el aspecto colapsado común sin tinción de insulina (A) y agrupamientos de células delta productoras de glucagon preservadas (B). A la inversa, los animales tratados con AT 1001 mostraron isletas que permanecieron sin daño (C y D) o mostraron signos de recuperación a partir dei ataque de ¡nsulitis caracterizado por las irregularidades en los límites entre las células productoras de insulina y glucagon (E y F). Estos hallazgos son compatibles con el aborto de una insulitis en curso. Amplificación de 10X. La Figura 12 muestra la inmunohistoquímica de la pancreata aislada a partir de ratas tratadas con AT1001 que no desarrollaron TID. Esta isleta pareció distorsionada por la cicatrización de intra- y peri-isleta que revela un contorno irregular. El signo de recuperación a partir de un ataque de insulitis fue visible y estuvo caracterizado por las irregularidades en los límites entre las células productoras de insulina (A y C) y glucagon (B y D) (E y F). Estos hallazgos son compatibles con el aborto de una insulitis en curso. La Figura 13 muestra los resultados de un estudio de tratamiento de diabetes autoinmune con AT-1001. La Figura 13 es una gráfica de sobrevivencia libre de diabetes graficada como porcentaje de animales no-diabéticos como una función del tiempo comparando los animales no tratados (•) contra los animales tratados (..). Se utilizaron ratas BB/ o DP y la terapia se inició después de la ceroconversión. 60% de las ratas no tratadas desarrollaron TID, en tanto que sólo el 35% de los animales tratados con AT 1001 avanzaron hasta TID. La edad promedio de inicio de la TID fue 85.4±10.4 días en el grupo de placebo y 86.0±10.3 días en el grupo tratado. El periodo del estudio inicial es designado TO, a partir del dia 120 es designado TI. Las Figuras 14A y 14B muestran los resultados de un estudio de tratamiento de enfermedad autoinmune con AT-1001. Las Figuras 14A y 14B son gráficas de barras que muestran los cambios en auto-anticuerpos durante el tratamiento. La Figura 14A muestra anticuerpos de descarboxilasa de ácido anti-glutámico (GAD) en animales que desarrollaron TID. La Figura 14 B muestra anticuerpos anti-GAD en animales que desarrollaron TID. Las Figuras 15A y 15B muestran los resultados de un estudio de tratamiento de enfermedad autoinmune con AT-1001. Las Figuras 15A y 15B son gráficas de barras que muestran los cambios en ios niveles de zonulina del suero durante el tratamiento. La Figura.15A muestra los niveles de zonulina en animales que desarrollaron TID. La Figura 15B muestra los niveles de zonulina en animales que desarrollaron TID.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se describió con anterioridad, en varias modalidades, la presente invención proporciona materiales y métodos para retardar la pérdida de células ß pancreáticas, prevenir la pérdida de células ß pancreáticas, y/o regenerar células ß pancreáticas en un sujeto que necesita de las mismas, por medio de, entre otros, la administración a un sujeto que necesita de dicho retardo, prevención y/o regeneración, de una cantidad farmacéuticamente efectiva de un antagonista de zonulina. De manera común, los antagonistas adecuados para uso en la presente invención se unen al receptor de toxina zonula occludens (ZOT), aunque no modulan fisiológicamente la apertura de uniones estrechas de mamífero. En algunas modalidades, los antagonistas de zonulina pueden ser péptidos. El término "antagonista" es definido como un compuesto que evita, inhibe, reduce o invierte la respuesta activada por un agonista (es decir, zonulina). En una modalidad, la presente invención proporciona materiales y métodos para retardar la pérdida de células ß pancreáticas, prevenir la perdida de células ß pancreáticas, y/o regenerar células ß pancreáticas en un sujeto que necesita de las mismas a través de, entre otros, administrar a un sujeto que necesita de dicho retardo, prevención y/o regeneración, una cantidad farmacéuticamente efectiva de un antagonista de zonulina en donde el antagonista se une al receptor de toxina zonula occludens (ZOT), aunque no modulan fisiológicamente la apertura de uniones estrechas de mamífero. La regeneración de células ß pancreáticas como se utiliza en la presente representa incrementar el número de células ß pancreáticas. La regeneración puede permitir la introducción (por ejemplo, implantación) de una o más células dentro de un sujeto. La implantación de células (por ejemplo, las células ß, células madre, etc.) es conocida en la técnica. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica no. 6,703,017 (la cual está específicamente incorporada a la presente mediante referencia, en particular los Ejemplos 1-3) describe la implantación de células madre de producción de isleta, células progenitoras de isleta y estructuras similares a isleta. Soon-Shiong, et al. (Proc Nati Acad Sci USA. 90(12) 5843-7, (1993)) describe la inversión a largo plazo de la diabetes mediante la inyección de isletas inmunoprotegidas. El aislamiento de células madre es conocido en la técnica. Por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Application 20030082155 (la cual está específicamente incorporada a la presente mediante referencia, en particular los Ejemplos 1-4) describe el aislamiento de células madre de las isletas de Langerhans y su uso en el tratamiento de diabetes mellitus. La regeneración de células ß pancreáticas también pude incluir el proporcionar condiciones bajo las cuales se puedan reproducir las células ß ya presentes en el páncreas. Por ejemplo, se ha demostrado que las células ß pancreáticas adultas retienen una capacidad significativa para proliferar in vivo, por tanto, las células ß pancreáticas pueden ser regeneradas al proporcionar condiciones que faciliten esta proliferación. (Dor et ah, Nature, 429:41 -46 (2002)) Como se usa en la presente, un sujeto es cualquier animal, por ejemplo, mamífero, que recibe un antagonista de la invención. Los sujetos incluyen, aunque no se limitan a, seres humanos. Los presentes experimentos han demostrado que el desarrollo de una enfermedad autoinmune, por ejemplo, diabetes Tipo I, se basa en tres factores 1) predisposición genética; 2) barrera anatómica con pérdidas; y 3) agresión ambiental repetida. Utilizando los materiales y métodos de la presente invención es posible tratar enfermedades autoinmunes por medio de la administración de uno o más compuestos que reducen la permeabilidad de una o más barreras anatómicas. Como se muestra a continuación, la administración de un compuesto que antagoniza la actividad del compuesto fisiológico normal que mejora la permeabilidad de una barra anatómica pude ser utilizado para tratar enfermedades autoinmunes. Por ejemplo, la zonulina es un compuesto fisiológico normal que mejora la permeabilidad de una barrera anatómica, el epitelio intestinal. Al administrar un antagonista de zonulina se mantiene o disminuye la permeabilidad de una barrera anatómica, previniendo o tratando de esta manera la enfermedad autoinmune diabetes Tipo I. Un ejemplo de una enfermedad autoinmune en la cual una barrera anatómica con pérdidas contribuye al desarrollo de la enfermedad es la diabetes Tipo I. Sin desear enlazarse a teoría, se considera que la permeabilidad intestinal aberrante desempeña un rol principal en la patogénesis de la Diabetes Tipo I. Con referencia a la Figura 8, no-auto antígenos (cuadrados y triángulos) están presentes en el lumen intestinal (1) y atraviesan las barreras tj en sujetos con desregulación del sistema de zonulina (círculos = zonulina, estructuras en forma de T en la célula son receptores de zonulina) (2-3). Los péptidos de antígeno se unen a los receptores HLA presentes en la superficie de APC (4). A su vez, estos péptidos son presentados para linfocitos T (5). En individuos genéticamente susceptibles, una respuesta inmune aberrante (tanto humoral como mediada por célula) (6) conduce al proceso autoinmune que dirige principalmente las isletas de Langherans con la con la subsecuente deficiencia de insulina típica de la diabetes Tipo I (7). La evidencia presentada a continuación demuestra que al controlar la permeabilidad de la barrera anatómica, es posible invertir el curso de la enfermedad y regenerar las isletas dañadas.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para tratar una enfermedad autoinmune mediante la administración de un compuesto que evita un incremento en la permeabilidad de una barrera anatómica. Un compuesto que evita un incremento en la permeabilidad de una barrera anatómica puede ser un antagonista de un compuesto fisiológico normal que incrementa la permeabilidad de la barrera anatómica. Un ejemplo de un compuesto adecuado para tratar las enfermedades autoinmunes es un antagonista de zonulina.

Cualquier antagonista de zonulina pude ser utilizado en la práctica de la presente invención. Como se utiliza en la presente un antagonista de zonulina es cualquier compuesto que se une al receptor de zonulina y que evita, inhibe, reduce o invierte la respuesta activada por zonulina. Por ejemplo, los antagonistas de la invención pueden comprender antagonistas de péptido de zonulina. Ejemplos de antagonistas de péptido incluyen, aunque no se limitan a, péptidos que comprenden una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que comprende Gly Arg Val Cys Val Gln Pro Gly (NO. ID. SEC:1), Gly Arg Val Cys Val Gln Asp Gly (NO. ID. SEC:2), Gly Arg Val Leu Val Gln Pro Gly (NO. ID. SEC:3), Gly Arg Val Leu Val Gln Asp Gly (NO. ID. SEC:4), Gly Arg Leu Cys Val Gln Pro Gly (NO. ID. SEC:5), Gly Arg Leu Cys Val Gln Asp Gly (NO. ID. SEC:6), Gly Arg Leu Leu Val Gln Pro Gly (NO. ID. SEC:7), G ly Arg Leu Leu Val Gln Asp Gly (NO. ID. SEC:8), G ly Arg Gly Cys Val Gln Pro Gly (NO. ID. SEC:9), G ly Arg Gly Cys Val Gln Asp Gly (SEQ IDNO: 10), G ly Arg Gly Leu Val Gln Pro Gly (SEQ IDNO: 11), G ly Arg Gly Leu Val Gln Asp Gly (SEQ IDNO: 12), G ly Gly Val Cys Val Gln. Pro Gly (NO. ID. SEC:13), G ly Gly Val Cys Val Gln Asp Gly (NO. ID. SEC: 14), G ly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly (NO. ID. SEC: 15), G ly Gly Val Leu Val Gln Asp Gly (NO. ID. SEC: 16), G ly Gly Leu Cys Val Gln Pro Gly (NO. ID. SEC: 17), G ly Gly Leu Cys Val Gln Asp Gly (NO. ID. SEC: 18), G ly Gly Leu Leu Val Gln Pro Gly (NO. ID. SEC: 19), G ly Gly Leu Leu Val Gln Asp Gly (NO. ID. SEC:20), G ly Gly Gly Cys Val Gln Pro Gly (NO. ID. SEC:21), G ly Gly Gly Cys Val Gln Asp Gly (NO. ID. SEC:22), G ly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly (NO. ID. SEC:23), and G ly Gly Gly Leu Val Gln Asp Gly (NO. ID. SEC:24) Cuando el antagonista es un péptido, se puede utilizar cualquier longitud de péptido. De manera general, el tamaño del antagonista de péptido variará desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 90, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 80, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 70, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 60, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 50, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 40, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 30, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 25, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 20, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 15, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 14, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 13, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 12, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 11 , desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 10, desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 9, o desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 8 amino ácidos de longitud Los antagon istas de péptido de la invención pueden ser desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 90, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 80, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 70, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 60, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 50, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 40, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 30, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 25, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 20, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 15, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 14, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 13, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 12, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 11, o desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 10 amino ácidos de longitud. Los antagonistas de péptido de la invención pueden ser desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 90, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 80, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 70, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 60, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 40, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 25, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 20, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 15, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 14, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 13, o desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 12 amino ácidos de longitud. Los antagonistas de péptido de la invención pueden ser desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 90, desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 80, desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 70, desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 60, desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 50, desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 40, desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 30, desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 25, desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 20, desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 15, o desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 14 amino ácidos de longitud. Los antagonistas de péptido de la invención pueden ser desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 90, desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 80, desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 70, desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 60, desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 50, desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 40, desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30, desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 25, desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 20, desde aproximadamente 19 hasta aproximadamente 15, desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 18, o desde aproximadamente 17 hasta aproximadamente 15 amino ácidos de longitud. Los antagonistas de péptido pueden ser sintetizados y purificados químicamente empleando técnicas bien conocidas, tales como las descritas en High Performance Liquid Chromatography of Péptidos and Proteins Separation Analysis and Conformation, Eds Mant et ah, C R C Press (1991), y un sintetizador péptido, tal como Symphony (Protein Technologies, Inc), o a través del uso de técnicas de ADN recombinante, es decir, donde la secuencia de nucleótido que codifica el péptido es insertada en un vector de expresión adecuado, por ejemplo, un vector de expresión E coh o levadura, expresado en la célula huésped respectiva y purificado a partir de la misma utilizando técnicas bien conocidas El antagonista (por ejemplo, antagonistas de péptido pueden ser administrados como composiciones de dosis oral para suministro en el intestino delgado Dichas composiciones de dosis oral para suministro en el intestino Delgado son bien conocidas en la técnica, y de manera general comprenden tabletas o cápsulas gastroresistentes {Remington 's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed , Eds Osol, Mack Publishing Co , Chapter 89 (1980), Digenis et al, J Pharm Sci , 83 915-921 (1994), Vantini et al, Clínica Terapéutica, 145445-451 (1993), Yoshitomi et al, Chem Pharm Bull, 40 1902-1905 (1992), Thoma et al, Pharmazie, 46 331-336 (1991), Mopshita et al, Drug Design and Delivery, 7 309-319 (1991), and Lin et al, Pharmaceutical Res , 8919-924 (1991)), cada una de las cuales está incorporada a la presente mediante referencia en su totalidad) Las tabletas o cápsulas gastroresistentes de la invención se disuelven de manera preferible en los fluidos intestinales Las tabletas se hacen gastroresistententes por medio de la adición de, por ejemplo, ya sea acetato ftalato de celulosa o acetato tereftalato de celulosa. El término "gastroresistente" se refiere a una composición que libera menos del 30% en peso del efector de zonulina total en la composición en el fluido gástrico con un pH de menos de 5 o fluido gástrico simulado con un pH de menos de 5 en sesenta minutos. Las cápsulas son formas de dosis sólidas en las cuales el antagonista (por ejemplo, antagonista péptido) es encerrado en un recipiente soluble, duro o suave o capa de gelatina. La gelatina usada en la elaboración de cápsulas se obtiene a partir de material de colágeno por medio de hidrólisis. Hay dos tipos de gelatina. El Tipo A, derivado a partir de pieles de cerdo mediante procesamiento con ácido, y el Tipo B, obtenido a partir de huesos y pieles de animal mediante procesamiento alcalino. El uso de cápsulas de gelatina dura permite una selección en la prescripción de un antagonista simple (por ejemplo, antagonista péptido) o una combinación de los mismos en el nivel de dosis exacto mejor considerado para el sujeto individual. La cápsula de gelatina dura consiste de dos secciones, una deslizante sobre la otra, circundando por tanto completamente al antagonista (por ejemplo, antagonista péptido). Estas cápsulas son llenadas al introducir el antagonista (por ejemplo, antagonista péptido), o lechos gastroresistentes que contienen el antagonista (por ejemplo, antagonista péptido), en el extremo más largo de la cápsula, y después de desliza sobre la tapa. Las cápsulas de gelatina dura están hechas en su mayor parte de gelatina, colorantes FD&C, y en ocasiones un agente de opacificación, tal como dióxido de titanio El USP permite que la gelatina para este propósito contenga 0 15% (p/v) de dióxido de azufre para evitar la descomposición durante la manufactura En el contexto de la presente invención, las composiciones de dosis oral para suministro en el intestino delgado incluyen también composiciones líquidas que contienen agentes de regulación de pH acuosos que evitan que el antagonista (por ejemplo, antagonista péptido) sea significativamente desactivado por los fluidos gástricos en el estómago, permitiendo de este modo que el antagonista (por ejemplo, antagonista péptido) llegue el intestino delgado en una forma activa Los ejemplos de dichos agentes de regulación de pH acuosos que se pueden emplear en la presente invención incluyen regulador de pH de bicarbonato (pH 5 5 hasta 8 7, de preferencia de aproximadamente pH 7 4) Cuando la composición de dosis oral es una composición líquida, es preferible que la composición sea preparada justo antes de la administración a fin de reducir al mínimo los problemas de estabilidad En este caso, la composición líquida puede ser preparada al disolver el antagonista 11 of 11 izad o (por ejemplo, antagonista péptido) en el agente de regulación de pH acuoso De manera común, las composiciones que comprenden un antagonista (por ejemplo, antagonista péptido) de zonulina como se utiliza en la presente comprenden una cantidad farmacéuticamente efectiva del antagonista La cantidad farmacéuticamente efectiva de antagonista (por ejemplo, antagonista péptido) empleada puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo. Los regímenes de dosis pueden ser ajustados a fin de proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se puede administrar un bolo simple, varias dosis divididas pueden ser administradas en el transcurso dei tiempo o la dosis puede ser reducida o incrementada de manera proporcional según sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosis para facilidad de administración y uniformidad de la dosis. La forma de unidad de dosis como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos que van a ser tratados; cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación par alas formas de unidad de dosis de la invención está determinada por y depende de manera directa de (a) que se logren las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formación de compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad de los individuos. De manera general, la cantidad de un compuesto antagonista empleado en la presente invención (por ejemplo, para retardar la pérdida de células ß pancreáticas, para evitar la pérdida de células ß pancreáticas y/o para regenerar células ß pancreáticas) está en el rango de aproximadamente 7.5 µM hasta 7.5 niM, de preferencia desde aproximadamente 7.5 µM hasta 0.75 mM. Para lograr dicha concentración final, por ejemplo, en los intestinos o la sangre, la cantidad de antagonista (por ejemplo, antagonista péptido) en una composición de dosis individual de la presente invención será de manera general desde aproximadamente 50 ng hasta aproximadamente 10 µg, desde aproximadamente 250 ng hasta aproximadamente 10 µg, desde aproximadamente 500 ng hasta aproximadamente 10 µg, desde aproximadamente 1 µg hasta aproximadamente 10 µg, desde aproximadamente 2 µg hasta aproximadamente 10 µg, desde aproximadamente 3 µg hasta aproximadamente 10 µg, desde aproximadamente 4 µg hasta aproximadamente 10 µg, desde aproximadamente 5 µg hasta aproximadamente 10 µg, desde aproximadamente 50 ng hasta aproximadamente 5 µg, desde aproximadamente 250 ng hasta aproximadamente 5 µg, desde aproximadamente 500 ng hasta aproximadamente 5 µg, desde aproximadamente 1 µg hasta aproximadamente 5 µg, desde aproximadamente 2 µg hasta aproximadamente 5 µg, desde aproximadamente 3 µg hasta aproximadamente 5 µg, desde aproximadamente 4 µg hasta aproximadamente 5 µg, desde aproximadamente 50 ng hasta aproximadamente 3 µg, desde aproximadamente 250 ng hasta aproximadamente 3 µg, desde aproximadamente 500 ng hasta aproximadamente 3 µg, desde aproximadamente 1 µg hasta aproximadamente 3 µg, o desde aproximadamente 2 µg hasta aproximadamente 3 µg por kilogramo de peso corporal del sujeto. Las composiciones de la invención pueden comprender uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Como se utiliza en la presente "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacteriales y antifungales, agentes de retardo isotónico y de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. En una modalidad, el vehículo es adecuado para administración parenteral. Un vehículo puede ser adecuado para administración dentro del sistema nervioso central (por ejemplo, por vía intraespinal o intracerebral). De forma alternativa, el vehículo puede ser adecuado para administración intravenosa, intraperitoneal o intramuscular. En otra modalidad, el vehículo es adecuado para administración oral. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, está considerado el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. Se pueden incorporar también compuestos activos complementarios en ias composiciones. Los ejemplos siguientes se proporcionan solo para fines ilustrativos, y en ninguna forma pretenden limitar el alcance de la presente invención.

EJEMPLO 1 Antagonistas de péptido de zonulina Dada que la ZOT, zonulina intestinal humana (zonulina;) y la zonulina de corazón humano (zonulinah) actúan todas en tj intestinal (Fasano et al, Gastroenterology, 112:839 (1997); Fasano et al, J. Clin. Invest. 96:710 (1995), y endotelial y que las tres poseen un efecto regional similar (Fasano et al., (1997)), que coincide con la distribución del receptor ZOT dentro del intestino (Fasano et al, (1997), supra; and Fasano et al, (1995), supra), se postuló en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. de Serie 09/127,815, presentada el 3 de agosto de 1998, que estas tres moléculas interactúan con el mismo sitio de unión de receptor. Una comparación de la estructura de amino ácido primario de ZOT y las zonulinas humanas se ejecutó entonces a fin de proporcionar discernimientos de los requerimientos estructurales absolutos de la interacción receptor-ligando implicada en la regulación de tj intestinal. El análisis de los terminales N de estas moléculas reveló el siguiente motivo común (residuos de amino ácido 8-15 agrupados en la Figura 1): non-polar (Gly para intestino, Val para cerebro), variable, non-polar, variable, non- polar, polar, variable, polar (Gly). Gly en posición 8, Val en posición 12 y Gln en posición 13, son altamente conservados en ZOT, zonulina; and zonulinah (véase la Figura 1), lo cual se considera que es crítico para la función de unión de receptor dentro del intestino. Para verificar esto, se sintetizó químicamente el octapéptido sintético Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly (NO. ID. SEC: 15) (nombrado FZI/O, y que corresponde a residuos de amino ácido 8-15 de zonulina fetal humana). A continuación, íleo de conejo montado en cámaras Ussing como se describió a continuación, se expuso a 100 µg of FZI/O (NO. ID. SEC:15), 100 µg de FZI/1 (NO. ID. SEC:29), 1.0 µg de 6xHis-ZOT (obtenido como se describió en el Ejemplo 1 de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número de Serie 09/127,815, presentada el 3 de agosto de 1998), 1.0 µg de zonulina; (obtenida como se describió en el Ejemplo 3 de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica de Número de Serie 09/127,815, presentada el 3 de agosto de 1998), o 1.0 µg de zonulinah (obtenida como se describió en el Ejemplo 3 de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica de Número de Serie 09/127,815, presentada el 3 de agosto de 1998), sola; o pre-expuesta durante 20 minutos a 100 µg de FZI/O o FZI/1, en cuyo tiempo se agregó 1.0 µg de 6xHis-ZOT, 1.0 µg de zonulina, o 1.0 µg de zonulinah. Se calculó ?Rt como Rt= PD/lSc en donde PD diferencia potencial y ls0= corriente de corto circuito. Los resultados se muestran en la Figura 2. Como se muestra en la Figura 2, FZI/O no induce ningún cambio significativo en Rt (0.5% en comparación con el control negativo) (véase barra cerrada) Por el contrario, el pre-tratamiento durante 20 minutos con FZI/O disminuyó el efecto de ZOT, zonulina,, y zonul?nah en Rt en un 75%, 97%, y 100%, respectivamente (véase barra abierta) Asimismo como se muestra en la Figura 2, este efecto inhibidor fue completamente retirado cuando se utilizó un segundo péptido sintético (FZI/1, SEQ ID NO 29) que fue sintetizado químicamente mediante carga del Gly en la posición 8, el Val en la posición 12, y el Gln en la posición 13 (como se refiere a la zonulina,) con los residuos de amino ácidos correspondientes de zonul?nab (Val, Gly, y Arg, respectivamente, véase SEQ ID NO 30) (ver barra sombreada) Los resultados anteriores demuestran que hay una región que abarca entre el residuo 8 y 15 del extremo N-terminal de ZOT y la familia de zonu na que es crucial para la unión al receptor de objetivo, y que los residuos de amino ácido en la posición 8, 12 y 13 determina la especificidad de tejido de esta unión EJEMPLO 2 Modelo de Rata Diabética Las alteraciones en la permeabilidad intestinal han sido demostradas para ser uno de los cambios fisiológicos precedentes asociados con el inicio de la diabetes (Meddings, Am J Physiol, 276 G951-957 (1999)) El transporte paracelular y la permeabilidad intestinal so regulados por medio de tj ¡ntracelular a través de mecanismos que no han sido completamente dilucidados. La zonulina y su análogo procaríótico, ZOT, alteran la permeabilidad intestinal al modular tj. En este ejemplo, se ha demostrado por primera vez que el deterioro relacionado con zonulina de tj está involucrado en la patogénesis de la diabetes, y que se puede evitar la diabetes, o retrasar el inicio, mediante la administración de un antagonista péptido de zonulina. Inicialmente, dos razas genéticas, es decir, ratas BB/Wor propensas a la diabetes (DP) y resistentes a la diabetes (DR) (Haber et al., J. Clin. Invest., 95832-837 (1993)), fueron evaluadas para determinar si exhibieron o no cambios significativos en la secreción intraluminal de zonulina y permeabilidad intestinal. De forma más específica, se sacrificaron ratas DP y DR de edades coincidentes (20, 50, 75, y >100 días de edad). Después de que las ratas fueron sacrificadas, se colocó una aguja 25G dentro del lumen del íleo y se efectuó un lavado intestinal con solución de Ringer para determinar la presencia de zonulina intraluminal. Se evaluó la concentración de zonulina utilizando un ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzima intercalado (ELISA) como sigue. Placas de microtitulación plásticas (Costar, Cambridge, MA) fueron recubiertas con anticuerpos anti-ZOT de conejo policlonales (obtenidos como se describió en el Ejemplo 2 de la Solicitud de los Estados Unidos de Norteamérica No. de Serie 09/127,815 presentada el 3 de agosto de 1998) (dilución 1:100) durante la noche a 4°C, lavadas tres veces con PBS que contiene 0.05% (v/v) Tween 20, bloqueadas después mediante incubación con 300 µl de PBS que contiene 0.1% (v/v) Tween 20, durante 15 min a temperatura ambiente. A continuación, la zonulina intestinal humana purificada (obtenida como se describió en el Ejemplo 3 de la Solicitud de los Estados Unidos de Norteamérica No. de Serie 09/127,815 presentada el 3 de agosto de 1998) fue recubierta en las placas. Se obtuvo una curva estándar mediante la dilución de zonulina en PBS que contiene 0.05% (v/v) Tween 20 a diferentes concentraciones: 0.78 ng/ml, 1.56 ng/ml, 3.125 ng/ml, 6.25 ng/ml, 12.5 ng/ml, 25 ng/ml y 50 ng/ml. 100 µl de cada concentración estándar o 100 µl de muestra de lavado intestinal fueron suministrados por medio de pipeta dentro de los pozos, e incubada durante 1 hr a temperatura ambiente, utilizando un agitador de placa. La zonulina no ligada fue lavada utilizando PBS, y los pozos fueron incubados con 100 µl de anticuerpos anti-ZOT conjugados con fosfato alcalino durante 1 hr a temperatura ambiente con agitación. El conjugado no enlazado fue lavado con PBS, y se desarrolló una reacción de color al agregar primero 100 µl de Extra-Avidin (SIGMA, St. Louis, MO) diluyendo 1/20000 en 0.1 M Tris-HCl (pH 7.3), 1.0 mM MgCI2, 1.0% (w/v) BSA durante 15 min, e incubando después cada pozo durante 30 minutos a 37°C con 100 µl de una solución que contiene 1.0 mg/ml de sustrato de p-nitrofenil-fosfato (SIGMA, St Louis, MO). Se leyó la absorbencia en un lector de inmunoensayo de enzima a 405 nm. A fin de evaluar la precisión intra- e inter-ensayo del método de intercalación ELISA, se calculó la variación de coeficiente (CV) usando tres elementos repetitivos a partir de las dos muestras con diferentes concentraciones de zonulina, en tres días consecutivos. La prueba de inter-ensayo del método de intercalación ELISA produjo valores CV de 9.8%. El CV de la prueba intra-ensayo fue 4.2% en el día 1, 3.3% en el día 2 y 2.9% en el día 3. La concentración de zonulina se expresó como ng/mg de proteína detectada en los lavados intestinales y normalizados por el área de superficie expuesta (en mm2). Los resultados se muestran en la Figura 3. Como se muestra en la Figura 3, se observe primero un incremento de 4 veces en la zonulina intraluminal en ratas propensas a la diabetes (edad 50 días) (segunda barra). Se encontró que el incremento en la zonulina intraluminal se correlaciona con un incremento en la permeabilidad intestinal. El incremento en la zonulina intraluminal se mantiene elevado en estas ratas propensas a la diabetes, y se encontró que se correlaciona con la progresión hacia la diabetes terminal. De manera notable, la rata propensa a la diabetes (edad, 100 días) no tuvo un incremento en la zonulina intraluminal. Esto es notorio, ya que esta rata no tiene avance hacia la diabetes. La glucosa en sangre para esta rata fue normal. Por lo tanto, la zonulina es responsable de los cambios de permeabilidad asociados con la patogénesis de la diabetes Tipo I. El incremento en la secreción de zonulina está relacionado con la edad, y avanza hacia el inicio de la diabetes.

A continuación, con la finalidad de demostrar que se puede prevenir la diabetes por medio de la administración de un antagonista péptido de zonulina, se obtuvieron ratas BB/Wor (edades 21-26 días), a partir de Biomedical Research Models, Inc. (Rutland, MA), y fueron aleatorizadas en dos grupos (n = 5 por grupo), es decir, un grupo tratado y un grupo de control. Ambos grupos se mantuvieron en una dieta estándar de comida para rata (Harían Teklab Diet #7012). Todo el alimento y agua fueron tratados en autoclave de manera previa. Todos los días de midió la ingesta diaria de agua y se proporcionaron 100 ml de agua fresca. El grupo tratado recibió 10 µg/ml del antagonista péptido de zonulina (SEQ ID NO: 15) suministrado en el agua potable. Las ratas fueron alojadas en jaulas de hepa-filtro. La diabetes en las ratas se diagnosticó como sigue: Las ratas fueron pesadas dos veces por semana. La glucosa en sangre se determinó semanalmente utilizando el sistema de monitoreo de glucosa OneTouch® (Johnson & Johnson). Cada semana, se utilizaron tiras reactivas para análisis de orina a fin de monitorear la glucosa (Diastix®) y cetonas (Ketositx®) (Bayer). Las ratas con glucosa en sangre >250 mg/dl fueron sometidas a ayuno durante la noche, y los niveles de glucosa en sangre de >200 mg/dl se consideraron diabéticos. Estas guías están de conformidad con los datos suministrados por Biomedical Research Models, Inc. Los resultados se muestran en la Figura 4. Como se muestra en la Figura 4, 80% de las ratas de control (4/5) y 40% de las ratas tratadas con el antagonista péptido de zonulina (2/5) desarrollaron diabetes a los 80 días de edad. Las alteraciones en la secreción de zonulina se compararon al inicio de la diabetes. Después de la demostración clínica de la diabetes, las ratas fueron sacrificadas como sigue: las ratas fueron anestesiadas utilizando anestesia de quetamina y se hizo una incisión de línea media permitiendo el acceso al corazón. Se colocó una aguja 18G dentro del corazón y la muerte ocurrió por desangramientos. Después se condujeron los ensayos de zonulina como se describió con anterioridad. Para aquellas ratas que no presentaron diabetes, el punto terminal del estudio fue a los 80 días de edad. De acuerdo con Biomedical Research Models, Inc., el 80% de las ratas propensas a la diabetes presentaron diabetes a los 80 días de edad. Los resultados de los ensayos de zonulina se muestran en la Figura 5. Como se muestra en la Figura 5, se observó que las ratas diabéticas que no fueron tratadas con el antagonista péptido de zonulina tienen un incremento en la zonulina intraluminal, lo cual fue compatible con los resultados mostrados en la Figura 3. Además, la zonulina intraluminal se incrementó de 2 a 4-veces en ratas diabéticas (DR), en comparación con las ratas propensas a la diabetes que no desarrollaron diabetes (DP-tratadas) y las ratas de control (DP-no tratadas). Las ratas de control no diabéticas que no desarrollaron diabetes tuvieron niveles insignificantes de zonulina, compatibles con los niveles de zonulina mostrados en la Figura 3.

Además, dos ratas propensas a la diabetes que desarrollaron diabetes a pesar del tratamiento con el antagonista péptido de zonulina mostraron niveles de zonulina intraluminal que fueron significativamente superiores a aquellos de las ratas tratadas con éxito, y las ratas de control no tratadas. Los niveles de zonulina fueron suficientes para iniciar los cambios de permeabilidad necesarios para avanzar hacia la diabetes, aunque los ZOT/receptores de zonulina fueron bloqueados de manera eficiente por medio del antagonista péptido. Asimismo, después de la demostración clínica de la diabetes, los tejidos intestinales de las ratas sacrificadas fueron montados en la cámara Ussing para determinar los cambios ex vivo en la permeabilidad. De manera más específica, las secciones de yeyuno e íleo fueron aisladas a partir de las ratas sacrificadas, y enjuagadas libres de contenidos intestinales. Seis secciones de cada segmento intestinal fueron preparadas y montadas en cámaras Lucite Ussing (0.33 cm2 abertura), conectadas a un aparato de sujeción de voltaje (EVC 4000; World Precisión Instruments, Saratosa, FL), y colocadas en baño con regulador de pH recién preparado que comprende 53 mM NaCI, 5.0 mM KCl, 30.5 mM Na2SO4, 30.5 mM manitol, 1.69 mM Na2PO4, 0.3 mM NaHPO4, 1.25 mM CaCI2, 1.1 mM MgCI2, y 25 mM NaHCO3 (pH 7.4). La solución de baño se mantuvo a 37°C con recipientes con camisa de agua conectados a una bomba de circulación de temperatura constante y gasificadas con 95% O2 y 5% CO2. Se midió la diferencia potencial y la corriente de corto circuito y se calculó la resistencia de tejido como lo describe Fasano et al, Proc. Nati. Acad. Sel, USA, 88:5242-5246 (1991). Los resultados se muestran en las Figuras 6-7. Como se demostró en los estudios de permeabilidad de cámara Ussing ex vivo, y se muestra en la Figura 6, todas las ratas que tuvieron progresión hacia la diabetes tuvieron un incremento en su permeabilidad intestinal. Las ratas resistentes a la diabetes (DR) no tuvieron alteraciones apreciables en la permeabilidad paracelular (primera barra). Las ratas propensas a la diabetes no tratadas (DP-no tratadas; segunda barra) tuvieron un incremento significativo en la permeabilidad paracelular del yeyuno e íleo. De forma más importante, las ratas propensas a la diabetes tratadas con el antagonista péptido de zonulina (DP-tratadas; tercera barra) tuvieron un incremento significativo en la permeabilidad paracelular del intestino delgado restringida al yeyuno. Sin embargo, como se muestra en la Figura 6, el pre-tratamiento con el antagonista péptído de zonulina evitó esos cambios en el íleo distal. En consecuencia, las alteraciones en la permeabilidad paracelular asociada con la patogénesis están restringida al íleo. Asimismo, como se muestra en la Figura 6, no hay cambios significativos en la permeabilidad del colon, lo cual coincide con la distribución regional de la distribución del receptor de zonulina. Estos resultados fueron validados de manera adicional mediante una comparación de la permeabilidad intestinal ex vivo en los intestinos delgados de ratas propensas a la diabetes no tratadas que desarrollaron (DP-D) o no desarrollaron (DP-N) diabetes (Figura 7). En tanto que no hay cambios significativos en Rt yeyunal en donde se observaron entre ratas DP-D DP-N, se observó un Rt menor significativo de la mucosa ¡leal de ratas DP-D en comparación con las ratas DP-N (Figura 7). Por lo tanto, se pueden hacer las siguientes conclusiones: (1) el antagonista de péptido fue capaz desbloquear de manera efectiva los cambios de permeabilidad requeridos para el desarrollo de la diabetes; y (2) en aquellas ratas tratadas con el antagonista péptido, los niveles de zonulina intraluminal son 3-veces superiores a aquellos de las ratas tratadas que no desarrollaron diabetes. En esta población de ratas tratadas que desarrollaron diabetes, la cantidad de antagonista péptido puede no haber sido suficiente para bloquear un número suficiente de ZOT/receptores de zonulina necesarios para evitar la diabetes. 60% de las ratas tratadas no desarrollaron diabetes. En esta población de ratas, el antagonista péptido de zonulina previno de manera efectiva el incremento de la permeabilidad intestinal necesaria para el inicio de la diabetes. Como se muestra en la Figura 5, las ratas tratadas tuvieron niveles de zonulina intraluminal comparables con los controles no tratados, aunque debido a la presencia del antagonista péptido de zonulina, la permeabilidad general del intestino delgado no fue alterada lo suficiente para iniciar los cambios patofisiológicos necesarios para la progresión hacia la diabetes. De manera interesante, como se muestra en la Figura 5, el único animal de control que no desarrolló diabetes tuvo niveles insignificantes de zonulina, soportando además el rol de la zonulina en la patogénesis de la diabetes. En consecuencia, un evento inicial en la patogénesis de la diabetes en ratas BB/Wor involucra cambios en la permeabilidad paracelular mediada por zonulina. Además, la inhibición del sistema de señalización de zonulina con el uso de antagonistas péptido de zonulina previene, o por lo menos retarda, el inicio de la diabetes.

EJEMPLO 3 Regeneración de células ß Un grupo de prueba de ratas propensas a la diabetes de 52-54 días de edad fueron tratadas con un antagonista péptido de zonulina AT1001 (NO. ID. SEC: 15) en tanto que un grupo de control de edades coincidentes no recibió tratamiento. El antagonista fue administrado en este momento debido a que a los 40 días estas ratas mostraron un incremento en los niveles de zonulina y a los 50 dias se pudieron detectar anticuerpos autoinmunes. Por lo tanto, el tratamiento fue iniciado después del inicio de la diabetes. Animales BBDP con una edad de 52-54 días fueron divididos en dos grupos. El Grupo 1 (n = 20) recibió AT-1001 diariamente en agua potable + HCO3. El Grupo 2 (n = 10) recibió agua potable + HC03. Los animales fueron aleatorizados para recibir placebo o tratamiento con el inhibidor péptido de zonulina sintético AT-1001 (NO. ID. SEC: 15) en su suministro de agua de una modo ciego durante el tratamiento TO. En el punto terminal de la enfermedad (glucosa en sangre en ayuno > 250 mg/dl), las ratas BBDP que desarrollaron TID (60% de incidencia en el grupo de placebo, edad promedio 110 días) fueron sacrificadas y se recolectaron muestras de sangre y tejido. Las ratas tratadas con AT1001 que no desarrollaron TID fueron aleatorizadas nuevamente a la edad de 120 días en 2 grupos, a) sección de eliminación de fármaco y b) tratamiento continuado con AT-1001; tuvieron seguimiento durante 100 días adicionales durante el tratamiento de la sección TI. Se monitorearon los niveles de zonulina en suero y de autoanticuerpo al inicio del estudio y en su punto terminal. Se monitoreo diariamente la ingesta de agua, en tanto que la ganancia de peso y los niveles de glucosa en suero fueron verificados de forma semanal. Las ratas con glucosa en sangre en ayuno > 250 mg/dl fueron consideradas diabéticas y fueron sacrificadas a las 24 horas de alcanzar el status de diabéticas. En el grupo de control no tratado, 6 de las 10 ratas desarrollaron diabetes mientras que en el grupo tratado solamente 7 de las 20 desarrollaron diabetes (Figura 13). Después de 120 días, se le retiro el tratamiento a la mitad del grupo tratado que no había desarrollado diabetes. 1/3 de los animales a los que se les retiró el tratamiento desarrollaron diabetes en tanto que ninguno de los animales que continuaron el tratamiento desarrolló diabetes.

Se tomaron y examinaron muestras del páncreas de los animales que habían sido tratados iniciando en el día 50-54. Los resultados de la examinación histológica se muestran en la Figura 9 y los resultados de la examinación inmunohistológica se muestran en la Figura 10. En los animales que desarrollaron diabetes, la examinacíón histológica reveló que las células ß habían sido destruidas (la Figura 9, paneles superiores). En contraste, las muestras de los animales que no desarrollaron diabetes contenían células ß y se observó evidencia de la regeneración de las células ß (Figura 9, paneles inferiores). Para verificar las identidades de las células observadas en el análisis histológico, se condujo la examinación inmunohistológica. La pancreata fue teñida de manera secuencial con anticuerpo anti-glucagon, que es específico para células delta glucon-productoras, o con anticuerpos anti-insulina, que es específica para células ß productoras de insulina. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 10. Cuando el páncreas no tratado es teñido con anticuerpos anti-insulina, ni se detecta señal. Esto es compatible con la destrucción de las células ß en TID. La tinción de estas células con anticuerpos anti-glucagon identifica las células delta glucagon productoras. Las isletas normales tienen una estructura en forma de rebanada con el exterior de las células delta que contienen isleta y el interior de las células ß que contiene la isleta. El patrón de tinción de las células delta indica que la isleta se ha colapsado como un resultado de la destrucción de las células ß (Figura 10 A & B). En contraste, el páncreas de los animales tratados mostró la presencia de células productoras de insulina (Figura 10C). La estructura de las isletas fue más normal como se indica mediante el patrón de tinción con anticuerpos anti-glucagon de la Figura 10D. Las Figuras 11 y 12 proporcionan evidencia de la regeneración de células ß. La Figura 11 muestra los resultados del análisis inmunohistoquímico de la pancreata aislada a partir de rata BBDP no tratadas que desarrollaron TID (paneles A y B) y ratas tratadas con AT1001 que no desarrollaron TID (paneles C-F). Las isletas de ratas que desarrollaron TID mostraron el aspecto colapsado común sin tinción de insulina (A) y agrupamientos de células delta glucagon-productoras preservadas (B). A la inversa, los animales tratados con AT1001 mostraron isletas que no tuvieron daño (C y D) o mostraron signos de recuperación a partir de un ataque de insulitis caracterizado por irregularidades en los límites entre las células productoras de insulina y glucagon (E y F). La Figura 12 muestra la mayor amplificación de los paneles 1 IE y 1 IF. La infiltración de las células delta dentro de la isleta (Figura 12D) se presenta como un resultado de la regeneración de las células ß después del ataque. El bloqueo de la trayectoria de zonulina en ratas BBDP en su etapa autoinmune preclíníca redujo de manera significativa la progresión a TID hasta una edad de 205 días (150 días posttratamiento). Esta incidencia disminuida de TID estuvo asociada con una reducción significativa de los anticuerpos de ácido anti-glutámico descarboxilasa (GAD) después del tratamiento con AT1001 (Figura 14). El tratamiento con AT1001 no afecta los niveles de zonulina en suero durante el estudio (Figura 15). La remoción del tratamiento con AT1001 fue seguida por el inicio de TID en 33% de los animales. Las ratas BBDP tratadas con AT1001 mostraron histología de isleta normal o ísleta que muestra signos de recuperación a partir de la insulitis en comparación con ratas no tratadas que mostraron daño de isleta de etapa final típico de la TID. Combinados juntos, estos datos sugieren que AT1001 fue capaz de abortar y revertir el ataque de isleta en ratas BBDP incluso si ya se inició el proceso autoinmune. En tanto que se ha descrito a detalle la invención, y con referencia a modalidades específicas de la misma, será evidente para alguien con experiencia ordinaria en la técnica que se pueden hacer varios cambios y modificaciones en la misma sin apartarse del espíritu y alcance de la misma.

Claims (35)

REIVINDICACIONES

1. Un método para retardar la pérdida de células ß pancreáticas en un sujeto que necesita de las mismas, que comprende: administrar al sujeto una composición que comprende un antagonista de zonulina.

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la . composición comprende además un factor que mejora el crecimiento celular.

3. Un método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el factor es un factor de crecimiento.

4. Un método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el factor es seleccionado a partir del grupo que consta de factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor-2 de crecimiento de fibroblasto básico (BFGF-2), factor de crecimiento de queratinocito (KGF), factor de crecimiento de hepatocito/factor de dispersión (HGF/SF), péptido- 1 de tipo glucagon (GLP-1), exendina-4, caja homeótica-1 de isleta/duodeno (IDX-I), ß-celulina, activina A, factor de crecimiento de transformación-a (TGF-a), factor de crecimiento de transformación-ß (TGF-ß), gastrina, y combinaciones de los mismos.

5. Un método para regenerar células ß pancreáticas en un sujeto que necesita de las mismas, que comprende: administrar al sujeto un antagonista de zonulina y una célula.

6. Un método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la célula es una célula de isleta.

7. Un método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la célula es una célula ß.

8. Un método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la célula es una célula madre.

9. Un método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el antagonista y la célula son administrados de manera simultánea.

10. Un método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el antagonista y la célula no son administrados de manera simultánea.

11. Un método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque, que comprende además administrar un factor que mejora el crecimiento celular.

12. Un método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el factor es un factor de crecimiento.

13. Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el factor es seleccionado a partir del grupo que comprende factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor-2 de crecimiento de fibroblasto básico (BFGF-2), factor de crecimiento de queratinocito (KGF), factor de crecimiento de hepatocito/factor de dispersión (HGF/SF), péptido- 1 de tipo glucagon (GLP-1), exendina-4, caja homeótica-1 de isleta/duodeno (IDX-I), ß-celulina, activina A, factor de crecimiento de transformación-a (TGF-a), factor de crecimiento de transformación-ß (TGF-ß), gastrina, y combinaciones de los mismos.

14. Un método para regenerar las células ß pancreáticas en un sujeto que necesita de las mismas, que comprende: administrar al sujeto un antagonista de zonulina bajo condiciones que permiten la reproducción de las células ß.

15. Un método de conformidad con la reivindicación 14, que comprende además administrar un factor que mejora el crecimiento celular.

16. Un método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el factor es un factor de crecimiento.

17. Un método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el factor es seleccionado a partir del grupo que consta de factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor-2 de crecimiento de fibroblasto básico (BFGF-2), factor de crecimiento de queratinocito (KGF), factor de crecimiento de hepatocito/factor de dispersión (HGF/SF), péptido- 1 de tipo glucagon (GLP-1), exendina-4, caja homeótica-1 de isleta/duodeno (IDX-I), ß-celulina, activina A, factor de crecimiento de transformación-a (TGF-a), factor de crecimiento de transformación-ß (TGF-ß), gastrina, y combinaciones de los mismos.

18. Un método para regenerar células ß pancreáticas en un sujeto que necesita de las mismas, que comprende: administrar al sujeto un antagonista de zonulina; e implantar células en el sujeto.

19. Un método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque las células son células de isleta.

20. Un método de conformidad con la reivindicación, caracterizado porque las células son células ß.

21. Un método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque las células son células madre.

22. Un método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el antagonista es administrado al sujeto antes que se implanten las células.

23. Un método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el antagonista es administrado al sujeto después de que se implantan las células.

24. Un método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el antagonista es administrado ai sujeto tanto antes como después de que se implantan las células.

25. Un método de conformidad con la reivindicación 18, que comprende además administrar un factor que mejora el crecimiento celular.

26. Un método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el factor es un factor de crecimiento.

27. Un método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el factor es seleccionado a partir de un grupo que consta de factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor-2 de crecimiento de fibroblasto básico (BFGF-2), factor de crecimiento de queratinocito (KGF), factor de crecimiento de hepatocito/factor de dispersión (HGF/SF), péptido-1 de tipo glucagon (GLP-1), exendina-4, caja homeótica-1 de isleta/duodeno (IDX-I), ß-celulina, activina A, factor de crecimiento de transformación-a (TGF-a), factor de crecimiento de transformación-ß (TGF-ß), gastrina, y combinaciones de los mismos.

28. Un método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el factor es administrado al sujeto antes de que se implanten las células.

29. Un método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el factor es administrado al sujeto después de que se implanten las células.

30. Un método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el factor es administrado al sujeto tanto antes como después de que se implantan las células.

31. Un método para tratar una enfermedad autoinmune, que comprende: administrar un compuesto que previene un incremento en la permeabilidad de una barrera anatómica.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el compuesto que previene un incremento en la permeabilidad de una barrera anatómica es un antagonista de un compuesto fisiológico normal que incrementa la permeabilidad de la barrera anatómica.

33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el compuesto es un antagonista de zonulina.

34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el antagonista de zonulina comprende SEQ ID N 0 : 15.

35. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el compuesto es seleccionado a partir del grupo que comprende IDs SEC 1-24.