MX2008000027A

MX2008000027A - Aumento de rendimiento en plantas con sobreexpresion de los genes mtp.

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Publication number: MX2008000027A
Application number: MX2008000027A
Authority: MX
Inventors: Damian Allen; Bryan Mckersie; Rodrigo Sarria-Millan; Eric R Garr; Jamie Haertel
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2005-07-19
Filing date: 2006-07-13
Publication date: 2008-03-24
Also published as: AU2006270193A1; ZA200801545B; BRPI0613399A2; WO2007011771A3; AR054173A1; CA2615458A1; EP1910546A2; CN101228279A; WO2007011771A2; US20110154531A1

Abstract

Una planta de cultivo transgenica transformada por un acido nucleico que codifica un polipeptido relacionado con el estres simil transportador de membrana (MTP), en donde la expresion de la secuencia del acido nucleico en la planta de cultivo da por resultado el aumento de crecimiento de la raiz de la planta, y/o aumento del rendimiento, y/o aumento de tolerancia a estres ambienta, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta. Tambien se proveen productos agricolas, incluso semillas, producidas por las plantas de cultivo transgenicas.

Description

AUMENTO DEL RENDIMIENTO EN PLANTAS CON SOBREEXPRESIÓN DE LOS GENES MTP ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención La presente invención se refiere en general a secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos asociados con desarrollo radicular, que contribuyen al crecimiento de las plantas y, en última instancia, afectan la producción de la planta (es decir, el rendimiento) en condiciones de estrés abiótico y sin estrés. En particular, la presente invención se refiere secuencias aisladas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que confieren a la planta aumento del crecimiento de la raíz, aumento del rendimiento y/o aumento de tolerancia a sequía, frío y/o salinidad, y el uso de dichos ácidos nucleicos aislados. Antecedentes en el arte El rendimiento de las plantas de cultivo es central para el bienestar de los humanos y se ve afectado directamente por el crecimiento de plantas en el ambiente físico. Los estreses abióticos ambientales, tales como estrés por sequía, estrés por salinidad, estrés por calor, y estrés por frío, son importantes factores limitantes del crecimiento y la productividad de las plantas. Las pérdidas de cultivos y las pérdidas en el rendimiento de los cultivos principales tales como poroto de soja, arroz, maíz, algodón y trigo causadas por estos estreses representan un importante factor económico y político y contribuyen a la escasez de alimentos de muchos países subdesarrollados. La biomasa de una planta es el rendimiento total de cultivos forrajeros tales como alfalfa, maíz de ensilado y heno. Se han usado muchos reemplazantes de rendimiento en los cultivos de grano. Entre ellos, los más importantes son las estimaciones de tamaño de la planta. El tamaño de la planta se puede medir de muchas maneras, según la especie y el estadio de desarrollo, pero incluye peso seco total de la planta, peso seco sobre el suelo, peso húmedo sobre el suelo, superficie de las hojas, volumen del tallo, altura de la planta, diámetro de la roseta, longitud de la hoja, longitud de la raíz, masa de la raíz, cantidad de retoños y cantidad de hojas. Muchas especies mantienen una relación conservadora entre el tamaño de las diferentes partes de la planta en determinado estadio de desarrollo. Estas relaciones alométricas se usan para extrapolar de una a otra de estas medidas tamaño. El tamaño de una planta en un estadio temprano de desarrollo generalmente se correlaciona con el tamaño de la planta más tarde en el desarrollo. Una planta grande, con mayor superficie de hoja generalmente puede absorber más luz y dióxido de carbono que una planta pequeña y en consecuencia es probable que gane mayor cantidad de peso durante el mismo periodo. A esto se agrega la posible continuación de la ventaja microambiental o genética que tenía la planta para adquirir el mayor tamaño en principio. Hay un fuerte componente genético en el tamaño y la velocidad de crecimiento de una planta, y si lo mismo ocurre con un rango de diversos genotipos de tamaño vegetal en una condición ambiental es probable que se correlacionen con el tamaño en otra. De esta manera, se usa un ambiente estándar como representación de los diversos ambientes dinámicos que encuentran los cultivos en distintas ubicaciones y tiempos en el campo. El índice de cosecha, la relación entre rendimiento de semilla y peso seco sobre el suelo, es relativamente estable en muchas condiciones ambientales, por lo que a menudo se puede obtener una fuerte correlación entre tamaño de planta y rendimiento del grano. Estos procesos están ligados intrínsecamente, dado que la mayor parte de ¡a biomasa del grano depende de la productividad fotosintética actual o almacenada por las hojas y los tallos de la planta. En consecuencia, se ha usado la selección por tamaño de la planta, incluso en los estadios tempranos de desarrollo, como indicador de potenciales futuros. Cuando se analiza el impacto de las diferencias genéticas sobre la tolerancia al estrés, la capacidad para estandarizar las propiedades del suelo, la temperatura, la disponibilidad de agua y nutrientes, y la intensidad de luz, es una ventaja intrínseca de los invernaderos o los ambientes con cámaras de crecimiento de plantas, comparado con el campo. Sin embargo, las limitaciones artificiales sobre el rendimiento debido a una mala polinización por ausencia de viento o insectos, o el espacio insuficiente para la maduración de la raíz o el crecimiento de los brotes pueden restringir el uso de estos ambientes controlados al análisis de diferencias en el rendimiento. En consecuencia, La medición del tamaño de una planta en el desarrollo temprano, en condiciones estandarizadas en una cámara de crecimiento o invernadero, son prácticas estándar para proveer la indicación de posibles ventajas genéticas de rendimiento. Durante el ciclo vital, las plantas generalmente están expuestas a condiciones de reducido contenido de agua ambiental. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse contra estas condiciones de sequedad. Sin embargo, si la severidad y la duración de las condiciones de sequía son demasiado grandes, los efectos sobre el desarrollo, el crecimiento, el tamaño de la planta y el rendimiento de la mayoría de las plantas de cultivo son profundos. La exposición continua a condiciones de sequía causa alteraciones importantes en el metabolismo vegetal, que en última instancia conducen a la muerte celular, y las consecuentes pérdidas de rendimiento. El desarrollo de plantas tolerantes al estrés es, en consecuencia, una estrategia que permite solucionar o mediar al menos algunos de estos problemas. Sin embargo, las estrategias tradicionales de cultivo de plantas tendientes a desarrollar nuevas líneas de plantas con resistencia y/o tolerancia a estos tipos de estrés son relativamente lentas y requieren líneas resistentes específicas para el cruzamiento con la línea deseada. Los limitados recursos de germoplasma para tolerancia al estrés y la incompatibilidad en los cruzamientos entre especies vegetales con relaciones distantes representan significativos problemas que se encuentran en el cultivo convencional. Además, los procesos celulares que conducen a la tolerancia a sequía, frío, y salinidad en plantas modelo de tolerancia a sequía, frío y/o salinidad son de naturaleza compleja e incluyen múltiples mecanismos de adaptación celular y numerosas vías metabólicas. Esta naturaleza multicomponente de la tolerancia al estrés no solo ha tenido como consecuencia que el cultivo tendiente a lograr tolerancia sea en gran medida ineficaz, además ha limitado la capacidad para obtener plantas tolerantes al estrés mediante procesos de ingeniería genética mediante métodos biotecnológicos. En consecuencia, es necesaria la identificación de los genes y proteínas que intervienen en estos procesos multicomponentes que conducen al aumento del crecimiento y/o al incremento de la tolerancia al estrés. La dilucidación de la función de los genes expresados en las plantas tolerantes al estrés no solo adelantará nuestro conocimiento sobre la adaptación y la tolerancia de las plantas a los estreses ambientales, además puede proporcionar información importante para el diseño de nuevas estrategias de mejoramiento de los cultivos. Las raíces son un órgano importante de las plantas superiores. Los sistemas radiculares de las plantas son fundamentales para el correcto crecimiento y desarrollo de todas las especies vegetales terrestres. Además de captar agua y nutrientes, y de proveer soporte físico, las raíces median un intercambio de comunicación complejo y poco conocido entre los microorganismos del suelo y otras plantas. En sistemas agronómicos, la producción recibe el impacto de la disponibilidad de agua y nutrientes en el suelo: el crecimiento de las raíces influye en forma directa o indirecta sobre el crecimiento y el rendimiento de órganos aéreos, en particular en condiciones de limitación de nutrientes. Las raíces también son importantes para la obtención de productos vegetales secundarios, tales como compuestos de defensa y hormonas vegetales. El establecimiento de una adecuada arquitectura radicular es un factor importante para el uso efectivo por la planta del agua y los nutrientes disponibles en el ambiente, y para maximizar el crecimiento y la producción de plantas. Además, en condiciones de sequía, las raíces se pueden adaptar para continuar con el crecimiento, al mismo tiempo que produce y envía señales de alarma tempranas a los brotes, que inhiben el crecimiento de la planta sobre el suelo. Además, el incremento del crecimiento de la raíz de las plantas de cultivo mejora la competitividad con las malezas y mejora el crecimiento en zonas áridas, al incrementar el acceso y la captación de agua. El crecimiento mejorado de la raíz también es importante para los fines ecológicos, tales como la aplicación de remedios biológicos y la prevención/detención de la erosión del suelo. Las raíces más largas no solo alivian los efectos de la falta de agua en el suelo, además mejoran el anclaje y la postura de las plantas, lo cual facilita el asentamiento. Además, las raíces más largas permiten cubrir un mayor volumen de suelo y mejorar la captación de nutrientes. En consecuencia, la alteración de la biomasa radicular, y en particular el incremento de la longitud de la raíz, mejorará el crecimiento de la planta, además de aumentar el rendimiento del cultivo. Las raíces también son órganos de almacenamiento en varios cultivos comerciales importantes, por ejemplo, remolacha azucarera, papa, mandioca, ñame y batata. Las raíces también son un órgano importante para el consumo, en numerosos vegetales (p. ej., zanahorias, rabanito), hierbas (p. ej., jengibre, cúrcuma) y plantas medicinales (p. ej., ginseng). Además, algunos de los productos vegetales secundarios hallados en raíces tienen importancia económica en la industria química y farmacológica, por ejemplo, las moléculas básicas para la síntesis de hormonas esteroides se encuentran en el ñame, y las raíces de Lithospermum erythrorhizon producen shiconina, de amplio uso debido a sus propiedades antiinflamatorias, antitumorales y de cicatrización de heridas. La arquitectura de la raíz es un área que ha permanecido en gran medida inexplorada en el cultivo clásico, debido a las dificultades para evaluar este rasgo en el campo. En consecuencia, la biotecnología podría tener significativo impacto sobre el mejoramiento de este rasgo. La estructura de los sistemas de raíces resultan de una combinación de predisposición genética y medio ambiente físico. Muchas mutantes de raíz fueron aisladas de la planta modelo Arabidopsis thaliana y muchas especies de cultivos han echado cierta luz en el crecimiento y el desarrollo de la raíz. La mutante agrl de Arabidopsis se identificó en un control de plantas con respuesta alterada a la gravedad. Las mutantes eran insensibles a las hormonas del crecimiento vegetal etileno y auxina endógena, lo cual sugiere que AtAGRI está implicado en el transporte de auxina (Bell and Maher, 1990, Mol. Gen. Genet. 220:289-293). Eir1, wavß y pin2 son mutaciones alélicas de agrl. Después de aislar AtAGRI por clonación posicional, se determinó que AtAGRI se expresa solamente en la raíz y es un miembro de una familia de genes vegetales con similitudes con transportadores de membrana bacteriana (Luschnig, 1998, Genes & Development 12:2175-2187). También se determinó que AtAGRI codifica un portador de eflujo de auxina basipetal (Chen et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:15112-15117). Más aún, las hibridaciones in-situ demostraron que AtAGRI se expresa en las zonas de elongación distal y central de la punta de la raíz (Muller et al., 1998, The EMBO Journal 17:6903-6911). Aunque se han caracterizado algunos genes que intervienen en las respuestas a estrés en plantas, la caracterización y la clonación de genes vegetales que confieren tolerancia a estrés aun es en gran medida incompleta y fragmentada. Por ejemplo, ciertos estudios indican que el estrés por sequía y salino en algunas plantas se puede deber a efectos génicos aditivos, en contraste con otras investigaciones, que indican la activación de la transcripción de genes específicos en ei tejido s vegetativo de las plantas sometidas a condiciones de estrés osmótico. Si bien generalmente se presupone que las proteínas inducidas por estrés tienen un papel importante en la tolerancia, aun se carece de evidencias directas, y se desconocen las funciones de muchos genes que responden al estrés. En consecuencia, queda la necesidad de identificar otros genes expresados en plantas tolerantes a estrés con capacidad para conferir aumento del crecimiento de ña raíz y/o mayor rendimiento y/o tolerancia al estrés de la planta huésped y otras especies vegetales. Las plantas tolerantes a estrés recién generadas tendrán muchas ventajas, tales como aumento del rango de cultivo de las plantas de cultivo, por ejemplo, al reducir los requerimientos de agua de las especies vegetales. SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a ácidos nucleicos aislados que codifican polipéptidos capaces de modular el crecimiento de la raíz, y/o el crecimiento y/o el rendimiento de la planta, y/o la tolerancia a estrés en condiciones normales o de estrés, comparadas con una variedad de tipo de la planta. En particular, la invención se refiere al uso de los ácidos nucleicos aislados que codifican polipéptidos relacionados con la proteína de estrés símil transportadores de membrana (MTP), de importancia en la modulación del crecimiento, el rendimiento, y/o la respuesta a un estrés ambiental de la raíz de una planta. Más particularmente, la sobreexpresión de estos MTP que codifican ácidos nucleicos en una planta de cultivo da por resultado el aumento del crecimiento de la raíz y/o aumento del rendimiento en condiciones normales o de estrés, y/o aumento de tolerancia a un estrés ambiental. En consecuencia, en una primera forma de realización, la invención se refiere a una planta de cultivo transgénica transformada por un ácido nucleico aislado, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO, tal como se provee en la Columna N.° 3 de la tabla 1 ; b) un polinucleótido que codifica un polipéptido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO, tal como se provee en la Columna N.° 4 de la tabla 1 ; c) un polinucleótido con al menos 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO, tal como se provee en la Columna N.° 3 de la tabla 1; d) un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 70% de identidad de secuencia con un polipéptido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO, tal como se provee en la Columna N.° 4 de la tabla 1; y e) un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas al complemento de cualquiera de los polinucleótidos a) a d) anteriores. De preferencia, la planta de cultivo transgénica expresa dicho ácido nucleico aislado, para que de preferencia altere el fenotipo de las plantas en relación con las plantas de tipo salvaje no transformadas. En particular, las plantas de cultivo transgénicas exhiben crecimiento modulado de- la raíz (de preferencia, aumento del crecimiento de la raíz), y/o del crecimiento y/o rendimiento de la planta, y/o tolerancia a estrés en condiciones normales o de estrés, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta. De preferencia, el MTP proviene de Arabidopsis thaliana, cañóla, soja, arroz, girasol, cebada, trigo, linaza o maíz. A saber, se describen en la presente los genes AtAGRI de Arabidopsis thaliana (AtAGRI , AtAGR1-2, AtAGR1-3, AtAGR1-4 y AtAGR1-5) y sus homólogos en cañóla, soja, arroz, girasol, cebada, trigo, linaza y maíz. En otra forma de realización, la invención se refiere a plantas de cultivo transgénicas que sobreexpresan el MTP que codifica el ácido nucleico y demuestran un aumento del crecimiento de la raíz, y con mayor preferencia, demuestran un aumento de la longitud de la raíz en condiciones normales o de estrés, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta. En otra forma de realización, la sobreexpresión del MTP que codifica el ácido nucleico en la planta de cultivo demuestra un aumento de tolerancia a un estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la. En otra forma de realización, la sobreexpresión del MTP que codifica el ácido nucleico en la planta de cultivo demuestra aumento del rendimiento, comparado con una variedad de tipo salvaje de la planta. Se entiende que el estrés ambiental puede ser estrés por salinidad, sequía, temperatura, metal, agente químico, agente patógeno y agente oxidativo, o sus combinaciones. De preferencia, el estrés ambiental es estrés por sequía. En aun otra forma de realización, la invención se refiere a una semilla producida por una planta de cultivo transgénica transformada por un MTP que codifica un ácido nucleico, en donde la planta es un cultivo verdadero, para aumentar el crecimiento de la raíz, y/o aumentar el rendimiento, y/o aumentar la tolerancia a estrés ambiental, comparado con una variedad de tipo salvaje de la planta. En otra forma de realización, la invención se refiere a un método para crecer una planta de cultivo como en el sitio agrícola, en donde el método comprende obtener la antes mencionada planta de cultivo transgénica y hacer crecer la planta en un sitio agrícola. En aun otro aspecto, la invención se refiere a un producto obtenido a partir de las plantas de cultivo transgénicas, partes de estas plantas, o sus semillas, tales como alimentos, nutrientes suplementos alimenticios, suplementos de nutrientes, cosméticos o compuestos farmacéuticos. En otra forma de realización, la invención se refiere a un método para aumentar el crecimiento de la raíz y/o el rendimiento, y/o aumentar la tolerancia a estrés por un estrés ambiental de una planta de cultivo en condiciones normales o de estrés, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta, en donde el método comprende obtener La antes mencionada planta de cultivo transgénica y cultivar la planta en la condición en que se exprese el ácido nucleico aislado. En aun otra forma de realización, la invención se refiere a un método para producir la antes mencionada planta de cultivo transgénica, en donde el método comprende (a) la transformación de una célula vegetal con un vector de expresión que comprende un MTP que codifica el ácido nucleico, y (b) la generación, a partir de una célula vegetal, de la planta de cultivo transgénica que expresa el polipéptido codificado. De preferencia, el polinucleótido está ligado operativamente a una o más secuencias reguladoras, y la expresión del polinucleótido en la planta da por resultado el aumento de crecimiento de la raíz, y/o aumento del rendimiento, y/o aumento de tolerancia a estrés ambiental en condiciones normales o de estrés, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta.

De preferencia, la una o más secuencias reguladoras ¡ncluyen un promotor. Con mayor preferencia, el promotor es un promotor específico de tejido o regulado por el desarrollo.

En aun otra forma de realización, la invención se refiere a un método para identificar un nuevo MTP, que comprende (a) generar una respuesta específica de anticuerpo contra un MTP, o su fragmento, tal como se describe más adelante; (b) analizar el posible material de MTP con el anticuerpo, en donde la fijación específica del anticuerpo al material indica la presencia de un MTP potencial nuevo; y (c) identificar a partir del material fijado un nuevo MTP en comparación con el MTP conocido.

Alternativamente, la hibridación con sondas de ácido nucleico tal como se describe más adelante se puede usar para identificar nuevos ácidos nucleicos de MTP. En otra forma de realización, la invención también se refiere a métodos para modificar el crecimiento de la raíz, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia a estrés de una planta que comprende modificar la expresión de un MTP que codifica el ácido nucleico en la planta. De preferencia, dicha modificación da por resultado un aumento o disminución del crecimiento de \a raíz, y/o del rendimiento, y/o de ia tolerancia a estrés, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta. De preferencia, el crecimiento de la raíz, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia a estrés es aumento en una planta a través del incremento de la expresión de un MTP que codifica el ácido nucleico. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos del gen AtAGRI (SEQ ID NO:1; At4g37580) usada para la transformación de Arabidopsis, que tiene 1246 bp de longitud. La región codificadora del gen tiene 1941 bp de longitud. La Figura 2 muestra la secuencia prevista de 647 aminoácidos del gen AtAGRI (SEQ ID NO:2) usada para la transformación de Arabidopsis. La Figura 3 muestra un esquema del T-ADN de vector binario usado para transformar el gen AtAGRI (SEQ ID NO:1). LB: borde izquierdo; pAHAS, promotor AHAS de Arabidopsis-, 3'AHAS, señal de terminación AHAS; SP, superpromotor; AtAGRI , cADN de AtAGRI; 3'NOS, señal de terminación; RB, borde derecho. Las Figuras 4A y 4B muestran un análisis de placa de las plantas transgénicas de Arabidopsis AtAGRI (SEQ ID NO:1). 4A demuestra que todas las líneas muestran un aumento fenotipo de longitud de raíz. Las líneas 5, 7, 9, 10 y 11 mostraron un aumento de longitud de raíz más significativo, comparado con los controles de tipo salvaje. 4B muestra el análisis a nivel génico de las plantas transgénicas AtAGRI, lo cual confirma que las plantas AtAGRI exhibían un fenotipo de aumento de longitud de raíz. En base a este análisis, las plantas transgénicas AGR1 exhibían un incremento del 29% en la longitud de raíz. En 4A y 4B, las tablas adjuntas muestran los valores medios reales usados para generar los gráficos de barras. La Figura 5 muestra el análisis en suelo de raíces de las plantas AtAGRI (SEQ ID NO:1 ), en donde se midió la longitud de raíz de las líneas AtAGRI de Arabidopsis. La Figura 6 muestra el nivel génico de análisis ANOVA de las plantas transgénicas AtAGRI (SEQ ID NO:1 ). Los datos del análisis de todas las líneas transgénicas se combinaron para determinar la actividad génica global. La Figura 7 muestra el nivel génico de análisis ANOVA de los pesos secos de las rosetas en las plantas transgénicas AtAGRI (SEQ ID NO:1 ). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se comprende más fácilmente en referencia a la siguiente descripción detallada de las formas de realización preferidas de la invención y los Ejemplos incluidos en la presente. Sin embargo, antes de divulgar y describir los presentes compuestos, composiciones y métodos, se debe entender que la presente invención no se limita a ácidos nucleicos específicos, polipépttdos específicos, tipos celulares específicos, células huésped específicas, condiciones específicas, o métodos específicos, etc., dado que estos obviamente pueden variar, y las numerosas modificaciones y variaciones en ellos serán aparentes a los expertos en el arte. También se debe entender que la terminología usada en la presente solo tiene por finalidad describir específicas formas de realización y no pretende ser limitantes. En particular, la designación de las secuencias de aminoácidos como polipéptido "polipéptidos relacionados con estrés símil transportadores de membrana" (MTP), de ninguna manera limita la funcionalidad de dichas secuencias. La presente Invención se refiere a MTP, y MTP que codifican ácidos nucleicos de importancia para aumentar el crecimiento de la raíz de una planta, y/o ei rendimiento, y/o para modular la respuesta de una planta a un estrés ambiental. Más particularmente, la sobreexpresión de estos MTP que codifican ácidos nucleicos en una planta de cultivo da por resultado la modulación (aumento o disminución, de preferencia aumento) del crecimiento de la raíz, y/o aumento del rendimiento, y/o aumento de la tolerancia a un estrés ambiental. Los miembros representativos del género MTP son AtAGRI , AtAGR1-2, AtAGR1-3, AtAGR1-4, AtAGR1-5 aislados de Arabidopsis thaliana, y los homólogos de longitud total aislados de cañóla, soja, girasol, maíz, arroz, linaza y cebada. En una forma de realización de preferencia, todos los miembros del género son transportadores de membrana biológicamente activos. En consecuencia, la presente invención abarca una planta de cultivo transgénica que comprende secuencias de polinucleótido y polipéptido de MTP, y un método para producir dicha planta transgénica de cultivo, en donde la expresión del polipéptido MTP en la planta da por resultado el aumento de crecimiento de la raíz, y/o del rendimiento, y/o de la tolerancia a un estrés ambiental. En una forma de realización, las secuencias MTP provienen de una planta, de preferencia una planta de Arabidopsis, una planta de cañóla, una planta de soja, una planta de arroz, una planta de girasol, una planta de cebada, una planta de linaza o una planta de maíz. En otra forma de realización, las secuencias MTP son los genes resumidos en la Tabla 1. De preferencia, las secuencias MTP descritas tienen significativa identidad de secuencia con los transportadores de membrana conocidos. Tabla 1. Genes MTP, su origen, secuencia de nucleótidos y correspondiente secuencia de aminoácidos, y su porcentaje de identidad compartido con AtAGRI (SEQ ID NO:2) en el nivel de los aminoácidos (algoritmo de Needleman-Wunsch para alineación global de secuencias, J. Mol. Biol. 48(3):443-53; matriz: Blosum 62; penalidad de apertura de brecha: 10,0; penalidad de extensión de brecha: 2,0).

La presente invención provee una planta de cultivo transgénica transformada por un MTP que codifica un ácido nucleico, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta de cultivo da por resultado un aumento de crecimiento de la raíz, y/o aumento del rendimiento, y/o aumento de tolerancia a un estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta. En particular, el aumento de crecimiento de la raíz es un incremento de la longitud de las raíces. El término "planta", tal como se usa en la presente y según el contexto, se puede entender como referencia a plantas enteras, células vegetales, y partes de plantas, incluso semillas. La palabra "planta" también se refiere a cualquier planta, particularmente a plantas con semillas, y puede incluir, sin limitaciones, plantas de cultivo. Las partes de plantas incluyen, sin limitaciones, tallos, raíces, óvulos, estambres, hojas, embriones, regiones meristemáticas, tejidos de callo, gametofitos, esporofitos, polen, microsporas, y similares. En una forma de realización, la planta transgénica es masculina estéril. También se provee una semilla vegetal producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica MTP, en donde la semilla contiene el ácido nucleico que codifica MTP, y en donde la planta es cultivo verdadero para el aumento de crecimiento de la raíz, y/o el aumento del rendimiento, y/o el aumento de tolerancia a estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta. La invención también provee una semilla producida por una planta transgénica que expresa un MTP, en donde la semilla contiene el MTP, y en donde la planta es cultivo verdadero para el aumento de crecimiento de la raíz, y/o el aumento del rendimiento, y/o el aumento de tolerancia a estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta. La invención también provee un producto producido por o a partir de las plantas transgénicas que expresan el ácido nucleico que codifica MTP, sus partes vegetales, o sus semillas. El producto se puede obtener por diversos métodos bien conocidos en el arte. Tal como se usa en la presente, la palabra "producto" incluye, sin limitaciones, un alimento, nutriente, un suplemento alimenticio, un suplemento de nutriente, cosmético o compuesto farmacéutico. Los alimentos se consideran composiciones usadas para la nutrición. Estos también incluyen composiciones para suplementar la nutrición. Los nutrientes animales y los suplementos de alimentos para animales, en particular, se consideran alimentos. La invención también provee un producto agrícola producido por cualquiera de las plantas transgénicas, partes de plantas, y semillas de plantas. Productos agrícolas incluyen, sin limitaciones, extractos vegetales, proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono, grasas, aceites, polímeros, vitaminas, y similares. Tal como se usa en la presente, el término "variedad" se refiere a un grupo de plantas en una especie que comparte caracteres constantes que las separa de la forma típica y de otras posibles variedades dentro de dichas especies. Mientras posee al menos un rasgo distintivo, una variedad también se caracteriza por cierta variación entre individuos dentro de la variedad, basada principalmente en la segregación mendeliana de rasgos entre la progenie de generaciones sucesivas. Una variedad se considera "cultivo verdadero" para un rasgo particular si es genéticamente homocigoto para ese rasgo hasta el grado en que, cuando se autopoliniza la variedad de cultivo verdadero, no se observa significativa cantidad de segregación independiente del rasgo entre la progenie. En la presente invención, el rasgo se origina en la expresión transgénica de una o más secuencias de ADN introducidas en una variedad vegetal. Se entiende que la planta de cultivo de acuerdo con la invención incluye plantas de cultivo dicotiledóneas tales como, por ejemplo, las provenientes de las familias de Leguminosae tales como arveja, alfalfa y poroto de soja; la familia Umbelliferae, particularmente el género Daucus (muy particularmente las especies (zanahoria)) y Apium (muy particularmente la especie graveolens var. dulce (apio)) y muchas otras; la familia Solanaceae, particularmente el género Lycopersicon, muy particularmente la especie esculentum (tomate) y el género Solanum, muy particularmente la especie tuberosum (papa) y melongena (berenjena), tobacco y muchas otras; y el género Capsicum, muy particularmente la especie annum (pimiento) y muchas otras; la familia Leguminosae, particularmente el género Glycine, muy particularmente la especie max (poroto de soja) y muchas otras; y ia familia Cruciferae, particularmente el género Brassica, muy particularmente la especie napus (semilla oleaginosa de nabo), campestris (remolacha), olerácea cv Tastie (repollo), olerácea cv Snowball Y (coliflor) y olerácea cv Emperor (brócoli); y el género Arabidopsis, muy particularmente la especie thaliana y muchas otras; la familia Compositae, particularmente el género Lactuca, muy particularmente la especie sativa (lechuga) y muchas otras; y la familia Malvaceae, particularmente el género Gossypium, muy particularmente la especie conocida como algodón; y la familia Fabaceae, particularmente el género Arachis, muy particularmente la especie hipogaea (maní). Las plantas de cultivo de acuerdo con la invención también incluyen plantas de cultivo monocotiledóneas tales como, por ejemplo, cereales tales como, cebada, sorgo y mijo, centeno, triticale, maíz, arroz o avena, y caña de azúcar. También se prefieren árboles tales como manzano, peral, membrillo, ciruelo, cerezo, duraznero, mandarino, damasco, papaya, mango, y otras especies leñosas tales como coniferas y árboles de hojas deciduas tales como álamo, pino, sequoia, cedro, roble, etc. Especialmente se prefiere Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, semilla oleaginosa de nabo, poroto de soja, maíz, trigo, semilla de lino, papa y tagetes. La presente invención describe por primera vez que MTP es útil para aumentar el crecimiento de la raíz de una planta de cultivo, y/o su rendimiento, y/o su tolerancia a estrés ambiental. Tal como se usa en la presente, el término polipéptido se refiere a una cadena de al menos cuatro aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. La cadena puede ser lineal, ramificada, circular, o sus combinaciones. En consecuencia, la presente invención el uso en plantas de cultivo de MTP aislados seleccionados de cualquiera de los organismos provistos en la Columna N.° 2 de la tabla 1. En formas de realización de preferencia, el MTP se selecciona de: 1) cualquier polipéptido MTP de los que se proveen en la Columna N.° 4 de la tabla 1 ; y 2) sus homólogos y ortólogos. Los homólogos y ortólogos de las secuencias de aminoácidos son tal como se define a continuación. Los MTP de la presente invención de preferencia se producen mediante técnicas de ADN recombinantes. Por ejemplo, se clona una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido en un vector de expresión (como se describe más adelante), el vector de expresión se introduce en una célula huésped (como se describe más adelante) y el MTP se expresa en la célula huésped. Luego se puede aislar el MTP de las células mediante un adecuado esquema de purificación mediante técnicas estándar de purificación de polipéptidos. A los fines de la invención, el término "polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que ha sido alterado, reorganizado, o modificado mediante ingeniería genética. Los ejemplos incluyen cualquier polinucleótido clonado, y los polinucleótidos ligados o unidos a secuencias heterólogas. El término "recombinante" no se refiere a alteraciones de polinucleótidos que son el resultado de eventos naturales, tales como mutaciones espontáneas. Como alternativa a la expresión recombinante, un MTP, o su péptido, puede ser sintetizado químicamente mediante técnicas estándar de síntesis de péptidos. Además, se puede aislar MTP nativo a partir de células (p. ej., células de Arabidopsis thaliana), por ejemplo medíante un anticuerpo anti-HSRP, que puede ser producido por técnicas estándar que utilizan un MTP o su fragmento. Tal como se usa en la presente, el término "estrés ambiental" se refiere a condiciones subóptimas asociadas con estrés por salinidad, sequía, temperatura, metal, agente químico, agente patógeno y agente oxidativo, o sus combinaciones. En formas de realización preferidas, el estrés ambiental puede ser seleccionado de uno o más del grupo que consiste en salinidad, sequía, o temperatura, o sus combinaciones, y en particular, puede ser seleccionado de uno o más del grupo que consiste en alta salinidad, bajo contenido de agua (sequía), o baja temperatura. En una forma de realización de preferencia, el estrés ambiental es estrés por sequía. Tal como también se usa en la presente, el término "eficiencia de uso de agua" se refiere a la cantidad de materia orgánica producida por una planta, dividido por la cantidad de agua usada por la planta para producirla, es decir el peso seco de una planta en relación con el uso de agua por la planta. Tal como se usa en la presente, el término "peso seco" se refiere a todo lo contenido por la planta menos agua, e ¡ncluye, por ejemplo, hidratos de carbono, proteínas, aceites, y nutrientes minerales. También se entiende que tal como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "un" o "una" puede significar uno o más, según el contexto en el cual se usa. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que se puede utilizar al menos una célula. Tal como también se usa en la presente, el término "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refiere a ARN o ADN lineal o ramificado, monocatenario o bicatenario, o uno de sus híbridos. El término también abarca híbridos ARN/ADN. Estos términos también abarcan secuencias no traducidas ubicadas en los extremos 3' y 5' de la región codificadora del gen: al menos aproximadamente 1000 nucleótidos de secuencia corriente arriba desde el extremo 5' de la región codificadora y al menos aproximadamente 200 nucleótidos de la secuencia corriente abajo desde el extremo 3' de la región codificadora del gen. Bases menos comunes, tales como inosina, 5-metilcítosina, 6-metiladenina, hipoxantina, y otras también se pueden usar para apareamiento antisentido, dsARN, y de ribozima. Por ejemplo, se ha demostrado que los polinucleótidos que contienen análogos C-5 propino de uridina y citidina fijan ARN con gran afinidad y son potentes inhibidores antisentido de la expresión génica. También se pueden hacer otras modificaciones, tales como la modificación del esqueleto fosfodiéster, o el 2'-hidroxi en el grupo ribosa del ARN. Los polinucleótidos antisentido y las ribozimas pueden consistir totalmente por ribonucleótidos, o pueden contener mezclas de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. Los polinucleótidos de la invención se pueden producir por cualquier medio, ¡ncluso preparaciones genómicas, preparaciones de cADN, síntesis in vitro, RT-PCR, y transcripción in vitro o in vivo. Una molécula "aislada" de ácido nucleico es la que está sustancialmente separada de otras moléculas de ácidos nucleicos que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico (es decir, secuencias que codifican otros polipéptidos). De preferencia, un ácido nucleico "aislado" está libre de algunas de las secuencias que naturalmente flanquean el ácido nucleico (es decir secuencias ubicadas en los exíremos 5' y 3' del ácido nucleico) en su replicón natural. Por ejemplo, un ácido nucleico clonado se considera aislado. En diversas formas de realización, la molécula de ácido nucleico aislada MTP puede coníener menos de aproximadameníe 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, o 0,1 kb de la secuencia de nucleóíidos que naíuralmeníe flanquea la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula de la cual deriva el ácido nucleico (p. ej., una célula de Arabidopsis thaliana). Un ácido nucleico íambién se considera aislado si ha sido alíerado por iníervención humana, o ubicada en un siíio o ubicación que no es su sitio natural, o si ha sido introducida en una célula por agroinfección. Además, una molécula "aislada" de ácido nucleico, tal como una molécula de cADN, puede estar libre de parte del resto del material celular con el que se asocia naíuralmeníe, o de medio de culíivo cuando se produce por íécnicas recombinaníes, o precursores químicos u oíros compuestos químicos cuando es sintetizado químicamente. Se excluye específicamente de la definición de "ácidos nucleicos aislados": cromosomas naturales (tales como extendidos de cromosomas), bibliotecas de cromosomas artificiales, bibliotecas genómicas, y bibliotecas de cADN que existen como preparación in vitro de ácido nucleico o como preparación transfecíada/íransformada de células huésped, en donde las células huésped son una preparación heíerogénea in vitro o plaqueadas como una población heíerogénea de colonas únicas. También se excluyen específicameníe las biblioíecas aníeriores, en donde un ácido nucleico especificado représenla menos del 5% de la caníidad de inserciones de ácido nucleico en las moléculas vecíor. También esíán específicameníe excluidas las preparaciones de ADN genómico de célula eníera o ARN de célula eníera (incluso preparaciones de células enteras extendidas mecánicamente o enzimáticamente digeridas). Aun más específicamente se excluyen las preparaciones de células enteras que se encuentran en una preparación in vitro o como una mezcla heíerogénea separada por elecíroforesis, en donde el ácido nucleico de la invención no ha sido también separado de los ácidos nucleicos heterólogos en el medio de electroforesis (p. ej., íambién separa por excisión una única banda de una población de bandas heíerogéneas en gel de agarosa o bloí de nailon). Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, p. ej., una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla, o una de sus porciones, se puede aislar mediante íécnicas biológicas moleculares estándar y la información de secuencia provista en la preseníe. Por ejemplo, se puede aislar un cADN de MTP de cualquier biblioteca de cultivos con todos o una porción de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 3 de Tabla. Además, se puede aislar una molécula de ácido nucleico que abarca la totalidad o una porción de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla medianíe la reacción de cadena de polimerasa medianíe cebadores de oligonucleóíido diseñados en base a esta secuencia. Por ejemplo, se puede aislar mARN de células vegetales (p. ej., por el procedimiento de extracción de tiocianato de guanidinio de Chirgwin eí al., 1979, Biochemisíry 18:5294-5299), y se puede preparar cADN medianíe íranscripíasa inversa (p. ej., íranscripíasa inversa Moloney MLV, disponible de Gibco/BRL, Befhesda, MD; o íranscripíasa inversa AMV, disponible de Seikagaku America, Inc., Sí. Peíersburg, FL). Los cebadores siníéficos de oligonucleótidos para amplificación por reacción en cadena de pollmerasa se pueden diseñar en base a la secuencia de nucleótidos establecida en cualquiera de las secuencias mostradas en la Columna N.° 3 de la Tabla. Una molécula de ácido nucleico de la invención se puede amplificar con cADN o, altemaíivameníe, ADN genómico como molde y adecuados cebadores de oligonucleóíido de acuerdo con fécnicas esíándar de amplificación por PCR. La molécula de ácido nucleico así amplificada se puede clonar en un vector apropiado y caracterizar medianfe análisis de secuencia de ADN. Además, los oligonucleóíidos correspondienfes a una secuencia de nucleóíidos MTP se pueden preparar por fécnicas esíándar de síníesis, p. ej., medianíe un sintetizador automático de ADN. En una forma de realización de preferencia, una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la invención comprende las secuencias de nucleótidos íal como se esíablece en cualquiera de las secuencias moslradas en la Columna N.° 3 de la Tabla 1. Esíos cADN pueden comprender las secuencias que codifican los MTP (es decir, la "región codificadora"), además de secuencias 5' no traducidas y secuencias 3' no traducidas. Alíemaíivameníe, las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con la preseníe invención pueden comprender solo la región codificadora de cualquiera de las secuencias provisías en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 , o pueden coníener fragmeníos genómicos aislados eníeros del ADN genómico. La preseníe invención también incluye MTP que codifica ácidos nucleicos codificadores de MTP tal como se describe en la presente. Se prefiere un ácido nucleico que codifica MTP codificador de SHSPR tal como se muestra en cualquiera de SEQ ID NOS provisto en la Columna N.° 4 de la Tabla 1. Además, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede comprender una porción de la región codificadora de cualquiera de las secuencias provisías en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 , por ejemplo, un fragmenío que se puede usar como sonda o cebador, o un fragmenío que codifica una porción biológicameníe acíiva de un MTP. Las secuencias de nucleóíidos determinadas a partir de la donación del gen MTP proveniente de cualquiera de los organismos provisíos en la Tabla 1 permiíen la generación de sondas y cebadores diseñados para su uso en ia ideníificación y/o clonación de homólogos de MTP en oíros íipos celulares y organismos, además de homólogos de MTP provenieníes de plañías de culíivo y especies relacionadas. La porción de la región codificadora íambién puede codificar un fragmenío biológicamente activo de un MTP. Tal como se usa en la presente, el término "porción biológicameníe acíiva de" un MTP preíende incluir una porción, p. ej., un dominio/moíivo, de un MTP que participa de la modulación del crecimiento de la raíz y/o rendimienío y/o la íolerancia a esírés en una planta, y con mayor preferencia, tolerancia a sequía. A los fines de la presente invención, la modulación del crecimiento de la raíz y/o rendimiento y/o tolerancia a estrés se refiere al menos a un 10% de aumento o disminución del crecimienío de las raíces y/o rendimiento y/o la íolerancia a esírés de una plañía transgénica que comprende un cásete de expresión de MTP (o vector de expresión), comparado con el crecimienío de la raíz y/o rendimiento y/o la tolerancia a estrés de una planta control no transgénica. Los métodos para cuantificar el crecimiento y/o rendimiento y/o la tolerancia a estrés se proveen al menos en los Ejemplos 5, 6, y 17-19 más adelante. En una forma de realización de preferencia, la porción biológicameníe acfiva de un MTP aumenía el crecimienío de la raíz de una plañía, de preferencia al incremeníar la longiíud de raíz. Las porciones biológicamente activas de un MTP incluyen pépíidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de un MTP, p. ej., una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los SEQ ID NOS provistos en la Columna N.° 4 de la Tabla 1 , o la secuencia de aminoácidos de un polipépíido idéníico a un MTP, que incluye menos aminoácidos que un MTP de longiíud total o el polipéptido de longitud toíal que es idénííco a un MTP, y exhibe al menos una acílvidad de un MTP. Generalmeníe, las porciones biológicameníe aclivas (p. ej., péptidos que tienen, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100, o más aminoácidos de longitud) comprenden un dominio o moíivo con al menos una actividad de un MTP. Además, se pueden preparar otras porciones biológicamente activas, en las cuales se eliminan otras regiones del polipéptido, mediante técnicas recombinantes, y evaluar una o más de las actividades descriías en la preseníe. De preferencia, la porción biológicameníe acfiva de un MTP ¡ncluye uno o más dominios/motivos seleccionado o sus porciones que tienen una actividad de íransportadores de membrana. En una forma de realización, la porción biológicamente activa de un MTP comprende al menos uno de los siguientes motivos conservados. El primer motivo es PLYVAMILAY (SEQ ID NO: 123). El segundo motivo es INRFVAXFAVPLLSFHFI (SEQ ID NO:124), en donde X se selecciona de un grupo que consiste en residuos de aminoácidos de valina, glicina, alanina, leucina, isoleucina y prolina. El tercer motivo es FSLSTLPNTLVMGIPLL (SEQ ID NO: 125). En otra forma de realización, el primer motivo está presente en una posición entre las posiciones de aminoácido 16 y 25 del polipéptido, el segundo moílvo esíá preseníe en una posición eníre las posiciones de aminoácido 42 y 59 del polipépíido, y el íercer moíivo esíá preseníe en una posición enlre las posiciones del aminoácido 105 y 121 del polipépíido. La invención íambién provee polipépíidos MTP quiméricos o de fusión. Tal como se usa en la preseníe, un "polipépíido MTP quimérico" o "polipépíido MTP de fusión" comprende un MTP ligado operaíivameníe a un no MTP. Un MTP se refiere a un polipépíido con una secuencia de aminoácidos correspondieníe a un MTP, mientras que un no MTP se refiere a un polipéptido con' una secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido que no es sustancialmenle idéníico al MTP, p. ej., un polipéptido diferente de MTP y derivado de un organismo igual o diferente. Respecto del polipéptido de fusión, el término "ligado operaíivameníe" prefende indicar que el MTP y el no MTP se fusionan eníre sí de manera íal que ambas secuencias cumplen la función propuesía aíribuida a la secuencia usada. El no MTP se puede fusionar al N íerminal o C íerminal del MTP. Por ejemplo, en una forma de realización, el polípépíido de fusión es un polipéptido de fusión GST-MTP en el cual las secuencias MTP se fusionan a C terminal de las secuencias GST. Dichos polipéptidos de fusión pueden facilitar la purificación de ios MTP recombinantes. En una forma de realización, el polipéptido de fusión es un MTP que contiene una secuencia señal heteróloga en su N-terminal. En ciertas células huésped (p. ej., células huésped de mamíferos), la expresión y/o la secreción de un MTP pueden aumeníar mediante el uso de una secuencia señal heteróloga. De preferencia, un polipéptido MTP quimérico o de fusión de la invención se produce medianíe técnicas estándar de ADN recombinaníes. Por ejemplo, los fragmeníos de ADN que codifican las disfinías secuencias de polipépíido esíán ligadas en el marco de acuerdo con las íécnicas convencionales, por ejemplo al emplear íerminales con exíremos romos o escalonados para la ligadura, digesíión con enzimas de resíricción para proveer las íerminales adecuadas, rellenar los exíremos cohesivos según corresponda, íraíamienío con fosfaíasa alcalina para eviíar la unión no deseada y la ligadura enzimáíica. En oíra forma de realización, el gen de fusión se puede siníeíizar por lécnicas convencionales incluso siníeíizadores automáticos de ADN. Altemalivamente, la amplificación por PCR de fragmentos génicos se puede llevar a cabo mediante el uso de cebadores de anclaje que dan origen a superposiciones csmplemeníarias entre dos fragmentos génicos consecutivos que luego se pueden fusionar y reamplificar para generar una secuencia de gen quimérico (Ver, por ejemplo, Currení Proíocols ¡n Molecular Biology, Eds. Ausubel eí al. John Wiley & Sons: 1992). Además, muchos vecíores de expresión disponibles en el comercio ya codifican un residuo de fusión (p. ej., un polipéptido GST). Un ácido nucleico que codifica MTP se puede clonar a dicho vector de expresión de manera tal que el residuo de fusión se liga dentro del marco con el MTP.

Además de los fragmentos y polipépíidos de fusión de los MTP descriíos en la preseníe, la presente invención incluye homólogos y análogos de MTP naturales y MTP que codifican ácidos nucleicos en una planta. Los "homólogos" se definen en la preseníe como dos ácidos nucleicos o polipépíidos con similares o "idénticos" nucleótido o secuencias de aminoácidos, respectivamente. Los homólogos incluyen variantes alélicas, ortólogos, paralogos, agonistas, y antagonistas de MTP tal como se definen más adelante. El término "homólogo" lambién abarca moléculas de ácidos nucleicos que difieren de la secuencia de nucleótidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS íal como se provee en la Columna N.° 3 de Tabla 1 (y sus porciones) debido a la degeneración del código genéíico, y en consecuencia codifican el mismo MTP que el codificado por la correspondiente secuencia de nucleóíidos establecida en tales SEQ ID NO según se provee en la Columna N.° 3 de' la Tabla 1. Tal como se usa en la presente, un MTP "natural" se refiere a una secuencia de aminoácidos MTP que aparece en la naturaleza. De preferencia, un MTP naíural comprende una secuencia de aminoácidos de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1. Un agonista de MTP puede retener susíancialmeníe la misma, o un subíipo de las actividades biológicas de MTP. Un antagonisía de MTP puede inhibir una o más de las acíividades de la forma natural del MTP. Las moléculas de ácidos nucleicos correspondientes a variantes alélicas naturales y análogos, ortólogos, y paralogos de un cADN MTP se pueden aislar sobre la base de su Identidad con los ácidos nucleicos MTP descritos en la presente medianíe cADN de MTP, o una de sus porciones, como sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar de hibridación en condiciones de hibridación rigurosas. En una forma de realización altemaíiva, los homólogos de MTP se pueden identificar mediante el análisis combinado de bibliotecas de mulantes, p. ej., mutantes de truncación de MTP para la actividad de agonistas o antagonistas de MTP. En una forma de realización, se genera una biblioteca variada de variantes de MTP por mutagénesis combinatoria a nivel del ácido nucleico y se codifica mediante una biblioteca variada de gen. Una biblioteca variada de variantes MTP se puede producir, por ejemplo, por ligadura enzimática que liga una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas tales que se expresa un conjunto degenerado de posibles secuencias MTP como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de polipéptidos de función más grandes (p. ej., para la disposición del fago) que coníiene el conjunto de secuencias MTP. Existen diversos métodos que se pueden usar para producir bibliotecas de posibles homólogos de MTP provenientes de una secuencia degenerada de oligonucleótidos. La síntesis química de una secuencia génica degenerada se puede realizar en un sinletizador automático de ADN, y luego se liga el gen sintético en un adecuado vector de expresión. El uso de un conjunto degenerado de genes permite proveer, en una mezcla, la íoíalidad de las secuencias que codifican el conjunto deseado de posibles secuencias MTP. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados se conocen en el arte. Además, se pueden usar las bibliotecas de fragmentos de regiones que codifican MTP para generar una variada población de fragmentos MTP para la detección y la posíerior selección de homólogos de un MTP. En una forma de realización, se puede generar una biblioteca de fragmeníos de secuencias codificadoras al íratar un fragmento blcatenario de PCR de una secuencia codificadora de MTP con una nucleasa en condiciones en las cuales se producen muescas solo aproximadamente una vez por molécula, se desnaturaliza el ADN bicaíenario, se renaturaliza el ADN para formar ADN bicatenario, que puede incluir pares de sentido/antisentido desde distintos productos con muescas, exíraer porciones monocaíenarias a partir de dobletes reformados por tratamienío con S1 nucleasa, y ligadura de la biblioteca de fragmentos obtenida en un vector de expresión. Por este método se puede derivar una biblioteca de expresión que codifica fragmentos N terminal, C terminal, y fragmentos internos de diversos tamaños de MTP. Se conocen varias técnicas en el arte para detecfar productos génicos de bibliotecas combinatorias preparadas mediante muíaciones puntuales o truncacíón, y para analizar bibliotecas de cADN para detectar productos génicos con una propiedad seleccionada. Dichas técnicas son adapíable al análisis rápido de las bibliotecas génicas generadas por mutagénesis combinatoria de homólogos MTP. Las técnicas más ampliamente usadas, pasibles de análisis de alto resultado para detecíar grandes bibliotecas génicas generalmente incluyen la clonación de la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, para transformar adecuadas células con biblioteca de vecíores resultante, y expresar los genes combinatorios en condiciones en las cuales la detección de una acfividad buscada faciliía el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se delecta. La mutagénesis de ensamblado recursivo (REM), una técnica que incrementa la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, se puede usar en combinación con los ensayos de deíección para ideníificar homólogos de MTP (Arkin y Yourvan, 1992, PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al., 1993, Polypeptide Engineering 6(3):327-331). En otra forma de realización, los ensayos basados en células pueden ser utilizados para analizar una variada biblioteca de MTP, mediante el uso de méíodos bien conocidos en el arte. La preseníe invención fambién provee un méíodo para ideníificar un nuevo MTP, que comprende (a) generar una respuesía específica de aníicuerpo coníra un MTP, o uno de sus fragmentos, tal como se describe en la presente; (b) analizar el posible material MTP con el anticuerpo, en donde ia fijación específica del aníicuerpo al material indica la presencia de un nuevo MTP posible; y (c) analizar el material fijado en comparación con el MTP conocido, a fin de determinar su novedad. Tal como se estableció con anlerioridad, la presenie invención se refiere a MTP y sus homólogos. Para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de dos secuencias de aminoácidos (p. ej., la secuencia de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1 , y una de sus formas mutaníes), las secuencias se alinean a fin de lograr la comparación óptima (p. ej., se pueden introducir brechas en la secuencia de un polipéptido para el alineamiento óptimo con el otro polipéptido o ácido nucleico). Luego se comparan los residuos de aminoácidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos. Cuando una posición en una secuencia (p. ej., la secuencia de cualquier SEQ ID NOS provisto en la Columna N.° 4 de la Tabla 1) es ocupado por los mismos residuos de aminoácido que la correspondieníe posición en la otra secuencia (p. ej., la secuencia de una forma muíanle del correspondiente SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1), entonces las moléculas son idénticas en dicha posición. Se puede hacer el mismo tipo de comparación entre dos secuencias de ácidos nucleicos. El porcentaje de identidad de secuencia entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad de secuencia = cantidad de posiciones idénticas/cantidad total de posiciones x 100). De preferencia, los homólogos de aminoácidos aislados incluidos en la presente invención son al menos aproximadamente 50-60%, de preferencia al menos aproximadamente 60-70%, y con mayor preferencia al menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95%, y con máxima preferencia al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99%, o más de identidad de toda una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1. En aun otra forma de realización, los homólogos de aminoácidos aislados incluidos en la presente invención are al menos aproximadamente 50-60%, de preferencia al menos aproximadamente 60-70%, y con mayor preferencia al menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95%, y con máxima preferencia al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99%, o más de identidad de toda una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1. En una forma de realización, el homólogo de aminoácido aislado comprende al menos uno de los siguientes tres moíivos conservados. El primer motivo es PLYVAMILAY (SEQ ID NO:123). El segundo motivo es INRFVAXFAVPLLSFHFI (SEQ ID NO:124), en donde X se selecciona de un grupo que consiste en residuos de aminoácidos de vallna, glicina, alanina, leucina, isoieucina y prolina. El tercer motivo es FSLSTLPNTLVMGIPLL (SEQ ID NO: 125). En otra forma de realización, el primer motivo está presente en una posición entre las posiciones de aminoácido 16 y 25 del polipéptido, el segundo motivo está presente en una posición entre las posiciones de aminoácido 42 y 59 del polipéptído, y el tercer motivo está presente en una posición entre las posiciones del aminoácido 105 y 121 del polipéptido. En otra forma de realización de preferencia, un homólogo aislado de ácidos nucleicos de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 40-60%, de preferencia al menos aproximadamente 60-70%, con mayor preferencia al menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95%, y con aun mayor preferencia al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más de identidad con una secuencia de nucleótidos mostrada en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 , o con una porción que comprende al menos 60 de sus nucleótidos consecutivos. La longitud de comparación de secuencia de preferencia para los ácidos nucleicos es al menos de 75 nucleótidos, con mayor preferencia al menos de 100 nucleótidos, y con mayor preferencia toda la longitud de la región codificadora. Es aun más preferible que los homólogos de ácido nucleico codifican proteínas con homología con cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1. También se prefiere que el homólogo aislado de ácido nucleico de la invención codifica un MTP, o una de sus porciones, que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1 , y que funciona como modulador de crecimiento de la raíz, y/o rendimiento, y/o una respuesta de estrés ambiental en una planta. En una forma de realización de mayor preferencia, la sobreexpresión del homólogo de ácido nucleico en una plañía aumenía el crecimienío de la raíz de la plañía, y/o el rendimienío, y/o la íolerancia de la plañía a un esírés ambieníal. En una forma de realización de mayor preferencia, el homólogo de ácido nucleico codifica un MTP que funciona como un transportador de membrana. A los fines de la invención, el porcentaje de identidad de secuencia eníre dos secuencias de ácidos nucleicos o polipépfidos se determina mediante el algoriímo de alineación global de Needleman-Wunsch (J. Mol. Biol. 48(3):443-53) implemeníado en el European Molecular Biology Open Sofíware Suiíe (EMBOSS). A los fines de una alineación múlflple (algoriímo Clusíal W), la penalidad de apertura de brecha es 10, y la penalidad de extensión de brecha es 0,05 con matriz blosum62. Se debe entender que a los fines de determinar la ideníidad de secuencia al comparar una secuencia ADN con una secuencia ARN, un nucleóíido de íimidina es equivalenle a un nucleóíido de uracilo.

En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que se hibrida al polinucleóíido de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 en condiciones rigurosas. Más particularmente, una molécula de ácido nucleico aislado de acuerdo con la invención tiene al menos 15 nucleótidos de longitud y se hibrida en condiciones rigurosas a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1. En otras formas de realización, el ácido nucleico tiene al menos 30, 50, 100, 250, o más nucleótidos de longitud. De preferencia, un homólogo de ácido nucleico aislado de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones muy rigurosas a la secuencia de nucleótidos que se muestra en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 y funciona como modulador del crecimiento de la raíz, y/o rendimienío, y/o íolerancia a esírés en una plañía. En iros forma de realización de preferencia, la sobreexpresión del homólogo aislado del ácido nucleico en una plañía aumenía el crecimiento de la raíz de la plañía, y/o rendimienío, y/o íolerancia a un estrés ambiental. En una forma de realización de aun mayor preferencia, el homólogo aislado del ácido nucleico codifica un MTP que funciona como un íransportador de membrana. Tal como se usa en la presenie respeclo de la hibridación de ADN a un ADN blot, el término "condiciones rigurosas" se puede referir a hibridación durante la noche a 60°C en 10X de solución de Denhart, 6X de SSC, 0,5% de SDS, y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los blot se lavan en secuencia a 62°C durante 30 minutos cada vez en 3X de SSC/0,1% de SDS, seguido de 1X de SSC/0,1% de SDS, y finalmente 0,1X de SSC/0,1 % de SDS. En una forma de realización de preferencia, la frase "condiciones rigurosas" se refiere a la hibridación en una solución 6X de SSC a 65°C. Tal como también se usa en la presente, "condiciones muy rigurosas" se refiere a una hibridación durante la noche a 65°C en 10X de solución de Denhart, 6X de SSC, 0,5% de SDS, y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los blot se lavan en secuencia a 65°C durante 30 minutos cada vez en 3X de SSC/0,1% de SDS, seguido de 1X de SSC/0,1% de SDS, y finalmente 0,1X de SSC/0,1% de SDS. Los métodos para la hibridización de ácido nucleico se describen en Meinkoth y Wahl, 1984, Anal. Biochem. 138:267-284; Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel et al. Eds., Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York, 1995; y Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hibridation with nucleic acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, Nueva York, 1993. De preferencia, una molécula de ácido nucleico aislado de la invención que se hibrida en condiciones rigurosas o muy rigurosas a una secuencia de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 corresponde a una molécula natural de ácido nucleico. Tal como se usa en la presente, una molécula "naíural" de ácido nucleico se refiere a una molécula de ARN o ADN con una secuencia de nucleóíidos que aparece en la naíuraleza (p. ej., codifica un polipéptido natural). En una forma de realización, el ácido nucleico codifica un MTP natural. Mediante los métodos antes descritos, y otros conocidos por los experíos en el arte, un experto en el arte puede aislar homólogos de los MTP que comprenden secuencias de aminoácidos mostrados en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1. Un subtipo de estos homólogos son las variantes alélicas. Tal como se usa en la presente, el término "variante alélica" se refiere a una secuencia de nucleótidos que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de un MTP y que exisíen dentro de una población natural (p. ej., una especie o variedad vegetal). Dichas variaciones alélicas naturales generalmente dan por resultado un 1-5% de varianza en un ácido nucleico MTP. Las variantes alélicas se pueden identificar al determinar la secuencia del ácido nucleico de interés en numerosas plantas diferentes, que se puede realizar con facilidad al usar sondas de hibridación para identificar el mismo siíio génico MTP en esas plantas. Todas y cada una de estas variaciones de ácidos nucleicos y los resullantes polimorfismos o variaciones de aminoácidos en un MTP, que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de un MTP, pretenden estar dentro del alcance de la invención. Además, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican MTP de la misma especie o de otras especies, íales como análogos, ortólogos, y paralogos, pretenden esfar denfro del alcance de la preseníe invención. Tal como se usa en la preseníe, el íérmino "análogos" se refiere a dos ácidos nucleicos que íiene la misma función, o una similar, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. Tal como se usa en la preseníe, el íérmino "ortólogos" se refiere a dos ácidos nucleicos de difereníes especies, pero que han evolucionado desde un gen ancesíral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipépíidos con la misma función, o una similar. Tal como íambién se usa en la presente, el íérmino "paralogos" se refiere a dos ácidos nucleicos relacionados por duplicación deníro de un genoma. Por lo general, los paralogos íienen difereníes funciones, pero esías funciones pueden esíar relacionadas (Taíusov, R.L. eí al., 1997, Science 278(5338):631-637). Los análogos, ortólogos, y paralogos de un MTP natural pueden diferir del MTP natural por modificaciones posteriores a la traducción, por diferencias en las secuencias de aminoácidos, o por ambos. Las modificaciones posteriores a la traducción incluyen derivación química in vivo e in vitro de polipéptidos, p. ej., acetilación, carboxilación, fosforilación, o glucosilación, y dichas modificaciones pueden ocurrir durante la síntesis o el procesamiento del polipéptido o después del traíamienío con enzimas aisladas modificadas. En particular, los ortólogos de la invención generalmente exhiben al menos 80-85%, con mayor preferencia, 85-90% o 90-95%, y con máxima preferencia 95%, 96%, 97%, 98%, o incluso 99% de Identidad, o 100% de identidad de secuencia, con la foíalidad o parte de una secuencia de aminoácidos naíural de MTP, y exhibirá una función similar a un MTP. De preferencia, un ortólogo de MTP de la preseníe invención funciona como modulador del crecimiento de raíz y/o una respuesfa al esírés ambienfal en una plañía y/o funciona como un transportador de membrana. Con mayor preferencia, un ortólogo de MTP aumenía el crecimiento de raíz y/o tolerancia a estrés de una plañía. En una forma de realización, los ortólogos de MTP funcionan como un transportador de membrana. Además de las variantes naíurales de una secuencia de MTP que pueden existir en la población, el experto en el arte íambién apreciará que se pueden iníroducir cambios por muíación en una secuencia de nucleótidos de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1 , lo cual conduce a cambios en la secuencia de aminoácidos del MTP codificado, sin alterar la actividad funcional del MTP. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de nucleótido que conducen a sustiíuciones de aminoácidos en residuos "no esenciales" de aminoácidos en una secuencia de cualquier SEQ ID NOS íal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1. Un residuo "no esencial" de aminoácido es un residuo que se puede alterar respecto de la secuencia de íipo salvaje de uno de los MTP sin alterar la acíividad de dicho MTP, mieníras que se requiere un residuo "esencial" de aminoácido para la acíividad de MTP. Oíros residuos de aminoácido, sin embargo, (p. ej., los no conservados o solo semiconservados en el dominio con acfivldad MTP) pueden no ser esenciales para la acíividad y en consecuencia es probable que se pueda alíerar sin que se altere la actividad de MTP. En consecuencia, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican MTP que contiene cambios de los residuos de aminoácido que no son esenciales para la actividad MTP. Dichos MTP difieren en secuencia de aminoácidos respecto de una secuencia contenida en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1 , y reíiene al menos una de las actividades MTP descritas en la presente. En una forma de realización, la molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 50-60% de identidad con la secuencia de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de ia Tabla 1 , con mayor preferencia al menos aproximadamenle 60-70% de ideníidad con la secuencia de cualquier SEQ ID NOS íal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1 , con aun mayor preferencia al menos aproximadamenle 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95% de identidad con la secuencia de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1 , y con máxima preferencia al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1. Los homólogos de MTP de preferencia de la presente invención de preferencia participan en el crecimiento de la raíz de una planta y/o rendimiento y/o en la respuesía de tolerancia a estrés en una planta, o más particularmente, funcionan como un transportador de membrana. Se puede crear una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un MTP con identidad de secuencia con una secuencia de polipéptido de cualquier SEQ ID NOS, tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1, al introducir una o más sustituciones, adiciones, o deleciones de nucleótido en una secuencia de nucleóíidos de cualquier SEQ ID NOS íal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 , dichas una o más susfituciones, adiciones, o deleciones de aminoácidos se introducen en el polipépíido codificado. Las muíaciones se pueden iníroducir en la secuencia de cualquier SEQ ID NOS íal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 medianíe técnicas estándar, tales como muíagénesís dirigida a silio y mulagénesis mediada por PCR. De preferencia, se hacen sustituciones de aminoácidos conservadoras en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales previstos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido con cadena laíeral similar. Las familias de residuos de aminoácidos con cadenas laterales similares han sido definidas en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, gluíamina, serina, íreonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, meíionina, íripíófano), cadenas laterales con ramificación beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina), y cadenas laterales aromáíicas (p. ej., íirosina, fenilalanina, íripíófano, hisíidina). En consecuencia, de preferencia un residuo de aminoácido previsto no esencial en MTP se reemplaza por oíro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena laíeral. Alternativamente, en otra forma de realización, se pueden introducir mutaciones al azar a lo largo de la totalidad o parte de una secuencia que codifica MTP, por ejemplo mutagénesis por saturación, y se analiza en los mutantes obtenidos la actividad MTP descrita en la presente, para detectar mutantes que retienen la actividad MTP. Después de la mutagénesis de la secuencia de cualquiera SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 , el polipéptido codificado se puede expresar en forma recombinante y determinar la actividad del polipéptido por análisis del crecimiento de la raíz de una planta, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia a estrés de una plañía que expresa el polipéptido tal como se describe al menos en los Ejemplos 5, 6, y 17-19. Además, se pueden crear ácidos nucleicos de MTP optimizados. De preferencia, un ácido nucleico de MTP optimizado codifica un MTP que modula el crecimienío de la raíz de una plañía, y/o el rendimiento, y/o la íolerancia a un esfrés ambiepfal, y con mayor preferencia aumenía el crecimienío de la raíz de una plañía, y/o el rendimienío, y/o la íolerancia a un esfrés ambiental tras su sobreexpresión en la planta. Tal como se usa en la presente, "optimizado" se refiere a un ácido nucleico sometido a ingeniería genética para incrementar su expresión en determinada planta o animal. Para proveer ácidos nucleicos de MTP optimizados vegetales, la secuencia de ADN del gen se puede modificar para 1) comprender codones preferidos por genes vegetales altamente expresados; 2) comprender un contenido de A+T en la composición de bases de nucleótidos tal como el sustancialmente hallado en las plantas; 3) formar una secuencia de iniciación; o 4) eliminar las secuencias que causan desestabilización, poliadenilación inadecuada, degradación y terminación de ARN, o que forma horquillas de estructura secundaria o sitios de empalme de ARN. El aumento de expresión de los ácidos nucleicos MTP en plañías se puede lograr mediante la uíilización de la frecuencia de disíribución de uso de codones en plañías en general o en una plañía particular. Los méíodos para optimizar la expresión de ácidos nucleicos en plantas se pueden hallar en EPA 0359472; EPA 0385962; solicitud de PCT N.° WO 91/16432; paíeníe de los Esíados Unidos N.° 5.380.831; patente de los Estados Unidos N.° 5.436.391; Perlack et al., 1991 , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:3324-3328; y Murray et al., 989, Nucleic Acid Res. 17:477-498. Tal como se usa en la preseníe, "frecuencia de uso de codón de preferencia" se refiere a la preferencia exhibida por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleóíidos para especificar deíerminados aminoácidos. A fin de determinar la frecuencia de uso de un codón particular en un gen, la caníidad de apariciones de dicho codón en el gen se divide por la caníidad íoíal de apariciones de iodos los codones que especifican el mismo aminoácido en el gen. De modo similar, la frecuencia de uso de codones preferidos exhibida por una célula huésped se puede calcular por promedio de la frecuencia de uso de codón de preferencia en una gran caníidad de genes expresados por la célula huésped. Se prefiere limiíar esíe análisis a los genes alíameníe expresados por la célula huésped. La desviación porceníual de la frecuencia de uso de codones preferidos para un gen siníéíico respecío del empleado por una célula huésped se calcula primero por determinación de la desviación porcentual de la frecuencia de uso de un codón único respecto del de la célula huésped, seguido de la obtención de la desviación promedio para iodos los codones. Tal como se define en la preseníe, este cálculo incluye codones únicos (es decir, ATG y TGG). En términos generales, la desviación promedio global del uso de codón en un gen opíimizado respecto del de una célula huésped se calcula mediante la ecuación 1A = n = 1 Z Xn - Yn Xn por 100 Z, en donde Xn = frecuencia de uso de codón n en la célula huésped; Yn = frecuencia de uso de codón n en el gen sintético; n representa un codón individual que especifica un aminoácido; y la cantidad total de codones es Z. La desviación global de la frecuencia de uso de codón A para todos los aminoácidos de preferencia debería ser de aproximadamenfe 25%, y con mayor preferencia menos de aproximadameníe 10%. En consecuencia, un ácido nucleico MTP se puede opíimizar de manera íal que su frecuencia de disfribución de uso de codón se desvíe, de preferencia, no más del 25% respecto de los genes vegetales altamente expresados y, con mayor preferencia, no más de aproximadamente 10%. Además, se considera el porceníaje de contenido de G+C de la tercera base degenerada (las monocotiledóneas parecen preferir G+C en esta posición a diferencia de las dicoíiledóneas). También se reconoce que el nucleóíido XCG (en donde X es A, T, C, o G) es el codón menos preferido en dicofiledóneas mientras que se evita el codón XTA en monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ácidos nucleicos MTP optimizados de la presenie invención de preferencia íambién tienen índices de evitación del doblete CG y TA muy aproximados de los de la planta huésped elegida (p. ej., Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, etc.). Con mayor preferencia, estos índices se desvían respecío de los del huésped en no más de aproximadameníe 10-15%. Además de las moléculas de ácidos nucleicos que codifican los MTP antes descritos, otro aspecto de la invención se refiere a las moléculas aisladas de ácidos nucleicos que son antiseníido respecío de ellas. Se cree que los polinucleótidos antiseníido inhiben la expresión génica de un polinucleótido blanco al fijar específicamente el polinucleótido blanco e interferir en la transcripción, el empalme, el transporte, la traducción, y/o la estabilidad del polinucleótido blanco. Se describen métodos en el arte previo para dirigir el polinucleóíido antisentido hacia el ADN cromosómico, a una transcripción de ARN primario, o a un mARN procesado. De preferencia, esías regiones blanco ¡ncluyen sitios de empalme, codones de iniciación de la traducción, codones de terminación de la traducción, y otras secuencias dentro del marco de lectura abierto. El término "aníisentido" a los fines de la invención, se refiere a un ácido nucleico que comprende un polinucleótido suficientemente complementario a todos o una porción de un gen, transcripción primaria, o mARN procesado, a fin de interferir en la expresión del gen endógeno. Los polinucieótidos "complementarios" son los con capacidad de apareamiento de bases de acuerdo con las normas estándar de complementariedad de Watson-Crick. Específicamente, las purinas aparean sus bases con pirimidinas para formar una combinación de guanina apareada con citosina (G:C) y adenina apareada con timina (A.T) en el caso de ADN, o adenina apareada con uracilo (A:U) en el caso de ARN. Se entiende que dos polinucleótidos se pueden hibridar entre sí aun si no son compleíameníe complemeníarios eníre sí, siempre que cada uno tenga al menos una región que es susíancialmente complementaria con el otro. El término "ácido nucleico aníiseníido" incluye ARN monocaíenario además de casefes de expresión de ADN bicaíenario que se pueden íranscribir para obtener un ARN aníiseníido. Los ácidos nucleicos aníiseníido "acíivos" con moléculas de ARN anliseníido capaces de híbridarse seleclivamente con una íranscripción primaria o mARN que codifica un polipépíido con al menos 80% de ideníidad de secuencia con el polipépíido de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1. El ácido nucleico antiseníido puede ser complementario a foda una cadena codificadora de MTP, o solo a una de sus porciones. En una forma de realización, una molécula aníiseníido de ácido nucleico es aníisentido a una "región codificadora" de la cadena codificadora de una secuencia de nucleólidos que codifica un MTP. El íérmino "región codificadora" se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones traducidos en residuos de aminoácido. En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico aníisentido es antisentido a una "región no codificadora" de la cadena codificadora de una secuencia de nucleótidos que codifica un MTP. El término "región no codificadora" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificadora no traducida en aminoácidos (es decir, íambién referida como regiones 5' y 3' no íraducidas). La molécula aníiseníido de ácido nucleico puede ser complemeníaria a foda la región codificadora de mARN de MTP, pero con mayor preferencia es un oligonucleótido antisentido solo a una porción de la región que codifica o que no codifica del mARN de MTP. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción de mARN de MTP. Un oligonucleótido antiseníido puede íener, por ejemplo, aproximadameníe 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 nucleóíidos de longiíud. Generalmeníe, las moléculas aníiseníido de la presente invención comprenden un ARN con 60-100% de identidad de secuencia con al menos 14 nucleótidos consecutivos de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 o un polinucleótido que codifica un polipéptido de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1. De preferencia, la identidad de secuencia será al menos del 70%, con mayor preferencia al menos del 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 98%, y con máxima preferencia del 99%. Un ácido nucleico antiseníido de la invención se puede construir por reacciones de síntesis química y ligadura enzimáíica, mediante procedimientos conocidos en el arte. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (p. ej., un oligonucleóíido aníiseníido) se puede sintetizar químicamente con nucleóíldos naturales o diversos nucleótidos modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del doblete formado entre los ácidos nucleicos con seníido y aníisentido, p. ej., se pueden usar nucleóíidos susíituidos con derivados de fosforotioaío y acridina. Los ejemplos de nucleóíidos modificados que se pueden usar para generar el ácido nucleico aníiseníido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouraciloi, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxaníina, xaníina, 4-acelilciíosina, 5-(carboxihidroxilmeíil)uracilo, 5-carboximeíilaminomeíil-2-íiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beía-D-galacíosilqueosina, inosina, N6-isopeníeniladenina, 1-mefilguanína. 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenlna, 2-meíilguanina, 3-meíilciíosina, 5-meíilciíosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometÍluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-meíoxicarboximefiluraciIo, 5-mefoxiuracilo, 2-meíiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacéíico (v), wibuíoxosina, seudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-meíil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-íiouracilo, 5-meíiluracilo, ésíer metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5- oxiacéíico (v), 5-meíil-2-íiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Alíemaíivameníe, el ácido nucleico antisentido se puede producir biológicamente mediante un vecíor de expresión en el cual se ha subclonado un ácido nucleico en orieníación anfiseníido (es decir, el ARN transcrito desde el ácido nucleico insertado tendrá oríeníación aníisentido respecto de un ácido nucleico blanco de iníerés, descrito íambién en la siguiente subsección). En aun otra forma de realización, la molécula antisentido de ácido nucleico de la invención es una molécula de ácido nucleico a-anomérica. Una molécula de ácido nucleico a-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en el cual, en conírario d las unidades ß habiíuales, las cadenas son paralelas eníre sí (Gaultier et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). Las moléculas de ácidos nucleicos antiseníido también pueden comprender un 2'-0-meíilribonucIeóíido (Inoue eí al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo ARN-ADN (Inoue eí al., 1987, FEBS Leíl. 215:327-330). Las moléculas de ácidos nucleicos aníiseníido de la invención generalmente se adminisfran a una célula o se generan in situ de manera tal que se hibridan o fijan un mARN celular y/o ADN genómico que codifica un MTP para así inhibir la expresión del polipéptido, p. ej., al inhibir la transcripción y/o la traducción. La hibridación puede ser por complemeníariedad convencional de nucleóíido para formar un doblete estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se une a dobletes de ADN, medianíe interacciones específicas en la cavidad mayor de la doble hélice. La molécula anf ¡seníido se puede modificar de manera íal que se fija específicameníe a un recepíor o un aníígeno expresado en una superficie celular seleccionada, p. ej., por ligadura de la molécula de ácido nucleico aníiseníido con un pépíido o un anticuerpo que se fija a una receptor de superficie celular o antígeno. La molécula de ácido nucleico antiseníido íambién se puede proveer a células con los vectores descritos en la preseníe. A fin de lograr conceníraciones infracelulares suficientes de las moléculas aníiseníido, se prefieren consírucciones de vecíores en las cuales la molécula de ácido nucleico aníiseníido se coloca bajo el conírol de un promoíor fuerte procarioníe, viral, o eucarionte (incluso vegetal). Como alternativa a los polinucleótidos antisentido, se pueden usar ribozimas, polinucleótidos con seníido, o ARN bicatenario (dsARN) para reducir la expresión de un polipépfido MTP. Tal como se usa en la presente, el término "ribozima" se refiere a una enzima catalííica basada en ARN con actividad de ribonucleasa, que es capaz de escindir un ácido nucleico monocaíenarios, por ejemplo mARN, con el cual tiene una región complementaria. Las ribozimas (p. ej., ribozimas de cabeza de martillo descritas en Haselhoff y Gerlach, 1988, Nature 334:585-591) se pueden usar para escindir catalílicamenfe las íranscripciones de mARN de MTP y así inhibir la íraducción de mARN de MTP. Se puede diseñar una ribozima con especificidad por un ácido nucleico codificador de MTP en base de la secuencia de nucleótidos de cADN de un MTP, tal como se describe en la preseníe (es decir, cualquier SEQ ID NOS íal como se provee en la Columna N.° 3 de Tabla 1) o en base a una secuencia heíeróloga que se aisla de acuerdo con méíodos enseñados en la presente invención. Por ejemplo, se puede construir un derivado de ARN de Tetrahimena L-19 IVS en el cual la secuencia de nucleóíidos del slíio acíivo es complementario de la secuencia de nucleóíidos que se escinde en' un mARN codificador de MTP. Ver, p. ej., de pateníe de los Esíados Unidos N.° 4.987.071 y 5.116.742 de Cech et al. Alternaíivameníe, se puede usar mARN de MTP para seleccionar un ARN caíalííico con actividad específica de ribonucleasa de un pool de moléculas ARN. Ver, p. ej., Bartel, D. y Szosíak, J.W., 1993, Science 261:1411-1418. En formas de realización de preferencia, la ribozima coníendrá una porción con al menos 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 nucleóíldos, y con mayor preferencia 7 u 8 nucleóíidos, con 100% de complemeníariedad con una porción del ARN blanco. Los méíodos para preparar ribozimas son conocidos por los expertos en el arte. Ver, p. ej., patentes de los Esíados Unidos N.° 6.025.167; 5.773.260; y 5.496.698. El íérmino "dsARN," íal como se usa en la presente, se refiere a híbridos de ARN que comprenden dos cadenas de ARN. Los dsARNs pueden íener esírucíura lineal o circular. En una forma de realización de preferencia, dsARN es específico de un polinucleóíido que codifica el polipépíido de cualquier SEQ ID NOS íal como se provee en ia Columna N.° 4 de la Tabla 1 o un polipépíido con al menos 80% de identidad de secuencia con un polipéptido de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de ia Tabla 1. Los ARN que se hibridan pueden tener complementariedad sustancial o completa. Por "complemeníariedad sustancial" se entiende que cuando los del ARN hibridados se alinean en forma óptima mediante el programa BLAST antes descrito, las porciones hibridazas íienen al menos 95% de complementariedad. De preferencia, el dsARN tendrá al menos 100 pares de bases de longitud. Generalmente, los ARN hibridados RNAs tienen idéntica longiíud, sin extremos 5' o 3' sobrantes y sin brechas. Sin embargo, se pueden usar dsARNA con sobrantes 5' o 3' de hasta 100 nucleótidos en los métodos de la invención.

El dsARN puede comprender ribonucleótidos, análogos de ribonucleótidos tales como residuos 2'-0-metilribosilo, o sus combinaciones. Ver, p. ej., las patentes de los Estados Unidos N.° 4.130.641 y 4.024.222. Se describe un dsARN de ácido polirriboinosínico:ácido polirribocitidílicoen la patente de los Estados Unidos N.° 4.283.393. Los métodos para preparar y usar dsARN se conocen en el arte. Un méíodo comprende la íranscripción simulíánea de dos cadenas complementarias de ADN, in vivo, o en una única mezcla de reacción in vitro. Ver, p. ej., la paíeníe de los Estados Unidos N.° 5J95J15. En una forma de realización, se puede ¡nfroducir dsARN en una plañía o célula vegetal directamente medianíe procedimienlos de fransformación estándar. Alternaíivamente, se puede expresar dsARN en una célula vegetal al transcribir dos ARNs complementarios. Oíros méíodos para la inhibición de la expresión de un gen endógeno, por ejemplo la formación de una hélice triple (Moser et al., 1987, Science 238:645-650 y Cooney et al., 1988, Science 241:456-459) y cosupresión (Napoli et al., 1990, The Plant Cell 2:279-289) son conocidos en el arte. Se han usado cADN de longiíud parcial y íoíal para la cosupresión de genes endógenos vegeíales. Ver, p. ej., las patentes de los Esíados Unidos N.° 4.801.340, 5.034.323, 5.231.020, y 5.283.184; Van der Kroll eí al., 1990, The Plañí Cell 2:291-299; Smilh eí al., 1990, Mol. Gen. Geneíics 224:477-481; y Napoll eí al., 1990, The Plañí Cell 2:279-289. Para la supresión con senlído se cree que la iníroducción de un polinucleóíldo con seníido bloquea la íranscripción del correspondiente gen blanco. El polinucleóíido con seníido tendrá al menos 65% de idenfidad de secuencia con el gen vegetal blanco o ARN. De preferencia, el porceníaje de identidad es al menos 80%, 90%, 95%, o más. El polinucleótido con seníido iníroducido no necesiía tener la longitud total respecto del gen blanco o íranscripción. De preferencia, el polinucleólido con senlido tendrá al menos 65% de identidad de secuencia con al menos 100 nucleótidos consecutivos de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1. Las regiones de identidad pueden comprender intrones y/o exones y reglones no traducidas. El polinucleótido con sentido introducido puede esíar preseníe en la célula vegetal en forma transitoria, o se puede integrar en forma estable en un cromosoma vegetal o replicón extracromosómico.

Alternaíivameníe, se puede inhibir la expresión génica de MTP al dirigir la secuencia de nucleóíidos complementaria a la región reguladora de una secuencia de nucleóíidos MTP (p. ej., un promotor y/o mejorados de MTP) para formar esíructuras de hélices triples que impiden la íranscripción de un gen MTP en células blanco. Ver en general, Helene, O, 1991 , Aníicancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. eí al., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher, L. J., 1992, Bioassays 14(12):807-15. Además de los ácidos nucleicos y polipépíidos de MTP antes descriíos, la preseníe invención abarca esíos ácidos nucleicos y polipéptidos adosados a un residuo. Estos residuos incluyen, sin limitaciones, residuos de detección, residuos de hibridación, residuos de purificación, residuos de provisión, residuos de reacción, residuos de fijación, y similares. Un grupo típico de ácidos nucleicos con residuos adosados son las sondas y los cebadores. Las sondas y los cebadores generalmente comprenden un oligonucleóíido sustancialmente aislado. El oligonucleótido generalmente comprende una región de la secuencia de nucleóíidos que se hibrida en condiciones rigurosas al menos a aproximadamente 12, de preferencia aproximadamente 25, con mayor preferencia aproximadameníe 40, 50 ó 75 nucleóíidos consecuíivos de una cadena con seníido de la secuencia establecida en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 ; una secuencia aníiseníido de la secuencia establecida en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 ; o sus mutantes natural. Los cebadores basados en una secuencia de nucleótidos de cualquier SEQ ID NOS íal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 se pueden usar en reacciones PCR para clonar homólogos de MTP. Las sondas en las secuencias de nucleófidos MTP se pueden usar para detectar íranscripciones o secuencias genómicas que codifican el mismo polipépíido o unos sustancialmente idéníicos. En formas de realización de preferencia, la sonda íambién comprende un grupo de róíulo adosado, p. ej., el grupo de róíulo puede ser un radioisótopo, un compuesío fluoresceníe, una enzima, o un cofacfor de enzima. Dichas sondas se pueden usar como parte de un kií de prueba para marcadores genómicos, para ideníificar células que expresan un MTP, por ejemplo por medición del nivel de un ácido nucleico que codifica MTP, en una muesíra de células, p. ej., deíecíar los niveles de mARN de MTP o determinar si un gen genómico de MTP ha sido muíado o eliminado. En particular, un méíodo úíil para asegurar el nivel de íranscripción del gen (un indicador de la caníidad de mARN disponible para la íraducción al producto génico) consiste en realizar un Northern blot (para referencias, ver, por ejemplo, Ausubel eí al., 1988, Currení Proíocols in Molecular Biology, Wiley: Nueva York). La información provenieníe del Northern bloí al menos demuesíra en parte el grado de transcripción del gen transformado. Se puede preparar el ARN celular íoíal a partir de células, tejidos, u órganos por varios métodos, iodos bien conocidos en el arte, íales como el descrito en Bormann, E. R. eí al., 1992, Mol. Microbiol. 6:317-326. Para evaluar la presencia o canfidad relativa de polipéptido traducido a partir de dicho mARN, se pueden emplear técnicas estándar, tales como Western blot. Estas técnicas son bien conocidas para los expertos en el arte. (Ver, por ejemplo, Ausubel et al., 1988, Current Protocols ¡n Molecular Biology, Wiley: Nueva York). La invención también provee un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico de MTP, en donde la expresión del vector en una célula huésped da por resultado el aumento de crecimiento de la raíz, y/o rendimiento y/o tolerancia a estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la célula huésped. Tal como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar oíro ácido nucleico al que se ha ligado. Un íipo de veclor es un "plásmldo" que se refiere a un rizo de ADN circular bicatenario ADN en el que se pueden ligar segmentos ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ADN al genoma viral. Ciertos vectores íienen capacidad para la replicación autónoma en una célula huésped, en la que son introducidos (p. ej., vectores bacterianos con un origen bacteriano de replicación y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (p. ej., vectores no episódicos de mamífero) se integran en el genoma de una célula huésped iras la infroducción en la célula huésped, y luego se replican con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que está ligado operativamente. Dichos vectores se refieren en la presente como "vectores de expresión." En general, los vectores de expresión de utilidad en las íécnicas de ADN recombinante a menudo están en la forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden usar en forma indistinta, dado que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir dichas otras formas de vector de expresión, tales como vectores virales (p. ej., reírovirus, adenovirus, y virus adenoasociados con defectos de la replicación), que cumplen funciones equivalentes. Los vectores de expresión recombinantes de la Invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo cual significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células huésped usadas para la expresión, que están ligados operaíivameníe a la secuencia de ácido nucleico expresada. Tal como se usa en la preseníe con respecío a un vecíor de expresión recombinaníe, "ligado operativamente" pretende significar que la secuencia de nucleóíidos de iníerés esíá ligada a la(s) secuenc?a(s) reguladoras de manera íal que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (p. ej., en un sisíema in vitro de transcripción/íraducción o en una célula huésped, cuando el vector se introduce en la célula huésped). El término "secuencia reguladora" preíende incluir promoíores, mejoradores, y oíros elemeníos de conlrol de expresión (p. ej., señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras se describen por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Meíhods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) y Gruber y Crosby, en: Meíhods ¡n Plañí Molecular Biology and Biotechnology, eds. Glick y Thompson, Capííulo 7, 89-108, CRC Press: Boca Ratón, Florida, incluidas sus referencias. Las secuencias reguladoras ¡ncluyen las que dirigen la expresión constiíuíiva de una secuencia de nucleóíidos en muchos lipos de células huésped y los que dirigen la expresión directa de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células huésped o en ciertas condiciones. Los expertos en el arte apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células huésped para así producir polipéptidos o péptidos, ¡ncluso polipéptidos o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como los descritos en la presente (p. ej., MTP, formas mutantes de MTP, polipéptidos de fusión, etc.). Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden diseñar para la expresión de MTP en células procariontes y eucariontes. Por ejemplo, los genes de MTP se pueden expresar en células bacterianas íales como C. glutamicum, células de insectos (con vectores de expresión de baculovirus), levaduras y otras células fúngicas (ver Romanos, M.A. et al., 1992, Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. et al., 1991 , Heterologous gene expresesion in filamentous fungí, en: More Gene Manipulations ¡n Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J., 1991 , Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. eí al., eds., p. 1-28, Cambridge Universiíy Press: Cambridge), algas (Falclatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251), ciliados de los tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahimena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Polomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmapiella, y Stilonychia, especialmente del género Stilonychia lemnae con vecíores que siguen un método de íransformación como el descrito en la solicitud de PCT N.° WO 98/01572, y células de plañías mulíicelulares (Ver Schmidf, R. y Willmitzer, L, 1988, High efficiency Agrobacterium tumefaciens-me?iaied transformation oí Arabidopsis thaliana leaf and cotiledón explanís, Plañí Cell Rep. 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raíon, Florida, capííulos 6/7, SJ1-119 (1993); F. F. Whlíe, B. Jenes eí al., Technlques for Gene Transfer, en: Transgenic plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu, 128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991 , Annu. Rev. Plañí Phisiol. Plañí Molec. Biol. 42:205-225 y sus referencias citadas allí), o células de mamífero. Las células huésped adecuadas se analizan también en Goeddel, Gene Expression Technology: Meíhods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990). Alternativamente, el vecíor de expresión recombinante se puede transcribir y íraducir in vitro, por ejemplo mediante secuencias reguladoras de promoíor T7 y T7 polimerasa. Con mayor frecuencia, la expresión de polipépíidos en procariontes se realiza con vectores que contienen promotores consíitutivos o ¡nducibles que dirigen la expresión de los polipépíidos de fusión y no de fusión. Los vecíores de fusión agregan cierta cantidad de aminoácidos a un polipéptldo codificado allí, por lo general en el íerminal amino del polipépfido recombinante, pero íambién en el C terminal, o se fusiona deníro de la región adecuado del polipépíido. Dichos vecíores de fusión generalmeníe íienen íres objeíivos: 1) aumeníar la expresión de un polipépíido recombinante; 2) aumentar la solubilidad de un polipéptido recombinaníe; y 3) faciliíar la purificación de un polipépíido recombinaníe al acíuar como ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión se iníroduce un sitio de escisión proteolífico en la unión del residuo de fusión y el polipépíido recombinaníe para permiíir la separación del polipéptido recombinante del residuo de fusión después de la purificación del polipépíido de fusión. Dichas enzimas, y sus secuencias cognadas de reconocimienío incluyen Facíor Xa, írombina, y eníeroquinasa. Los íípicos vectores de expresión de fusión ¡ncluyen pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. y Johnson, K.S., 1988, Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), y pRIT5 (Pharmacia, Piscaíaway, NJ) que fusionan gluíaíión-S-íransferasa (GST), polipépíido fijador de maltosa E, o polipépíido A, respectivamente, al polipéptido blanco recombinaníe. En una forma de realización, la secuencia codificadora de MTP se clona en un vecíor de expresión pGEX para crear un vector que codifica un polipéptido de fusión que comprende, desde ei N terminal hasta el C terminal, un polipépíido X de siíio de escisión de írombina GST. El polipépíido de fusión se puede purificar por cromatografía de afinidad con resina de glutatión-agarosa. El MTP recombinante no fusionado a GST se puede recuperar por escisión del polipépíido de fusión con trombina.

Los ejemplos de adecuados vectores de expresión inducibles no de fusión de E. coli ¡ncluyen pTrc (Amann eí al., 1988, Gene 69:301-315) y pET 11d (Síudier eí al., Gene Expression Technology: Meíhods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). La expresión del gen blanco desde el vecíor pTrc depende de la íranscripción de ARN polimerasa del huésped a partir de un promotor de fusión híbrido trp-lac. La expresión del gen blanco a partir del vector pET 11d depende de la transcripción desde un promotor de fusión T7 gn10-lac mediada por una ARN-polimerasa del huésped (T7 gnl ). Esta polimerasa viral es provista por las cepas del huésped BL21 (DE3) o HMS174(DE3) a partir de un profago residente que coníiene un gen T7 gnl bajo el conírol de íranscripción del promoíor lacUV 5. Una estrategia para maximizar la expresión de polipéptido recombinante consiste en expresar el polipépíido en una bacíeria huésped con deterioro de la capacidad para escindir proíeolííicameníe el polipépíido recombinante (Goííesman, S., Gene Expression Technology: Meíhods ¡n Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Oíra esíraíegia consisíe en alíerar la secuencia del ácido que se inserta en un vector de expresión de manera íal que cada uno de los codones para cada aminoácido se utiliza de preferencia en la bacteria elegida para la expresión, tal como C. glutamicum (Wada eí al., 1992, Nucleic Acid Res. 20:2111-2118). Dicha alíeración de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención se puede llevar a cabo mediante técnicas estándar de síntesis de ADN. En otra forma de realización, el vecíor de expresión MTP es un vecíor de expresión de levaduras. Los ejemplos de vecíores para la expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSed (Baldari, ef al., 1987, EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowiíz, 1982, Cell 30:933-943), pJRY88 (Schulíz et al., 1987, Gene 54:113-123), y pYES2 (Invltrogen Corporation, San Diego, CA). Los vectores y méíodos para la consírucción de vectores adecuados para el uso en íroos hongos, íales como hongos filamentosos, incluyen los detallados en: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Puní, P.J., 1991 , "Gene transfer systems and vector developmení for filamentous fungí," en: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge. En una forma de realización de preferencia de la presente invención, los MTP se expresan en plantas y células vegeíales lales como células vegeíales unicelulares (p. ej., algas) (Ver Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251 y sus referencias) y células vegetales provenientes de plantas superiores (p. ej., espermatofitos, tales como las plantas de cultivo). Un MTP puede ser "introducido" en una célula vegetal por cualquier medio, incluso transfección, transformación o transducción, electroporación, bombardeo de partículas, agroinfección, y similares, un méíodo de transformación conocidos por los expertos en el arte consiste en sumergir una planta con flor en una solución de Agrobacteria, en donde la Agrobacteria contiene el ácido nucleico de MTP, seguido del cultivo de los gametos ransformados. Oíros méíodos adecuados para la íransformación o íransfección de células huésped que incluyen células vegetales se pueden hallar en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboraíory Manual, lafesí ed., Cold Spring Harbor Laboraíory, Cold Spring Harbor Laboraíory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y oíros manuales de laboratorio tales como Meíhods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium proíocols, ed: Garíland y Davey, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Dado que el aumento de crecimienío y el aumento de íolerancia bióíico y abiótica a estrés son rasgos generales que se desea se transmitan por herencia en una amplia variedad de plantas íales como maíz, írigo, centeno, avena, íriíicale, arroz, cebada, sorgo, mijo, caña de azúcar, poroto de soja, maní, algodón, semilla de colza y cañóla, mandioca, pimiento, girasol y tagetes, plantas solanáceas tales como papa, íabaco, berenjena, y tomate, especie de Vicia, arveja, alfalfa, plantas arbustivas (café, cacao, íé), especies de Salix, árboles (palmera aceiíera, cocolera), pastos perennes, y cultivos forrajeros, estas plantas de cultivo íambién son plantas blanco preferidas para la ingeniería genéíica, como ofra forma de realización de la preseníe invención. Los culíivos forrajeros incluyen, sin limitaciones, Wheaígrass, Canarygrass, Bromegrass, Wildrye Grass, Bluegrass, Orchardgrass, Alfalfa, Salfoin, Birdsfooí Trefoil, trébol Alsike, trébol rojo, y írébol dulce. En una forma de realización de la presente invención, la transfección de un MTP en una planta se logra por íransferencia génica mediada por Agrobacteríum. La transformación génica mediada por Agrobacterium se puede realizar por ejemplo con cepa GV3101 (pMP90) (Koncz y Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396) o LBA4404 (Clontech) de Agrobacterium tumefaciens. La transformación se puede realizar mediante técnicas estándar de íransformación y regeneración (Deblaere et al., 1994, Nucí. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Staníon B. y Schilperoort, Robert A, Plañí Molecular Biology Manual, 2pd Ed. - Dordrechí: Kluwer Academic Publ., 1995. - en Secí., Ringbuc Zenírale Signaíur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Meíhods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Ratón: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por ejemplo, las semillas de nabo se pueden transformar por transformación de cotiledón o hipocotilo (Moloney eí al., 1989, Plañí Cell Report 8:238-242; De Block et al., 1989, Plant Physio). 91 :694-701). El uso de antibióticos para Agrobacterium y la selección vegeíal depende del vecíor binario y la cepa de Agrobacterium usada para la fransformación. La selección de semilla de colza generalmeníe se realiza con canamicina como marcador vegeíal selecclonable. La íransferencia génica mediada por Agrobacterium a lino se puede realizar, por ejemplo, medianíe una íécnica descrita por Mlynarova eí al., 1994, Plañí Cell Reporí 13:282-285. Además, la íransformación de poroto de soja se puede realizar, por ejemplo, mediante una técnica descrita en la patente europea N.° 0424 047, la patente de los Estados Unidos N.° 5.322.783, la patente europea N.° 0397 687, la patente de los Esíados Unidos N.° 5.376.543, o la patente de los Estados Unidos N.° 5.169.770. La transformación de maíz se puede lograr medianíe bombardeo de partículas, captación de ADN mediada por polieíilenglicol, o por la íécnica de fibra de carburo de silicio (Ver, por ejemplo, Freeling y Walbof "The maize handbook" Springer Verlag: Nueva York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Un ejemplo específico de íransformación de maíz se encueníra en la patente de los Estados Unidos N.° 5.990.387, y un ejemplo específico de transformación de trigo se puede encontrar en la soliciíud de PCT N.° WO 93/07256. De acuerdo con la preseníe invención, el MTP iníroducido se puede mantener en forma estable en la célula vegeíal sí se Incorpora en un replicón autónomo no cromosómico o integrado en el cromosoma vegetal. Alternativamente, el MTP iníroducido puede esíar preseníe en un vector no replicante exíracromosómico y puede ser expresado en forma íransiloria o tener acíividad transitoria. En una forma de realización, se puede crear un microorganismo homólogo recombinante en donde el MTP se Integra al cromosoma, se prepara un vecíor que coníiene al menos una porción de un gen de MTP en el cual se ha infroducido una deleción, adición, o sustiíución para así alíerar, p. ej., funcionalmeníe alterar el gen MTP. De preferencia, el gen MTP es cualquiera de los genes MTP tal como se provee en la Tabla 1 , pero puede ser un homólogo de una planta relacionada o levadura, o incluso de una fuente de mamífero o insecto. En una forma de realización, el vector se diseña de manera lal que iras la recombinación homologa, el gen endógeno MTP está funcionalmente alterado (es decir, ya no codifica un polipéptido funcional; también se denomina vector knock-out). Alternativamente, se puede diseñar el vector de manera tal que tras la recombinación homologa, el gen endógeno MTP está mutado o de otra manera alterado, pero aun codifica un polipéptido funcional (p. ej., se puede "alterar la región reguladora corriente arriba para así alterar la expresión del MTP endógeno). Para crear una mutación puntual a íravés de la recombinación homologa se pueden usar híbridos de ADN-ARN en una técnica denominada quimeroplastia (Cole-Strauss et al., 1999, Nucleic Acid Research 27(5): 1323-1330 y Kmiec, 1999, Gene Therapy American Scientisl 87(3):240-247). Los procedimientos de recombinación homologa en Arabiodopsis thaliana, por ejemplo, son bien conocidos en el arte y se considera su uso en la presente. En el vector de recombinación homólogo, la porción alterada del gen MTP está flanqueado en sus extremos 5' y 3' por una molécula adicional de ácido nucleico del gen MTP para permitir que ocurra la recombinación homologa eníre el gen exógeno MTP íransportado por el vecíor y un gen endógeno de MTP, en un microorganismo o planta. La molécula adicional flanqueadora de de ácido nucleico de MTP tiene longitud suficiente para que ocurra la recombinación homologa con el gen endógeno. Generalmente, se incluyen varios cientos de pares de bases, hasta kilobases, de ADN flanqueador (en ambos exíremos 5' y 3') en el vecíor (Ver p. ej., Thomas, K.R., y Capecchi, M.R., 1987, Cell 51 :503 para una descripción de vecíores de recombinación homólogos). El vecíor se iníroduce en un microorganismo o célula vegetal (p. ej., a través de ADN mediado por polietilenglicol), y células en las cuales el gen MTP introducido recombinado en forma homologa con el gen endógeno MTP se ha seleccionado mediante técnicas conocidas en el arte. En otra forma de realización, se pueden producir microorganismos recombinanfes que contienen sisíemas seleccionados que permiten la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen MTP en un vector al colocarlo bajo el control del operón lac permite la expresión del gen MTP solo en presencia de IPTG. Dichos sistemas reguladores son bien conocidos en el arte. Cuando esíá preseníe en un vecíor no replicante exíracromosómico vecíor o un vecíor integrado en un cromosoma, el polinucleótido de preferencia MTP reside en un cásete de expresión vegetal. Un cásete de expresión de preferencia contiene secuencias reguladoras capaces de dirigir la expresión del gen en células vegetales ligado operativamente de manera tal que cada secuencia puede cumplir esta función, por ejemplo, la terminación de la íranscripción de señales de poliadenilación. Las señales de poliadenilación de preferencia son las originadas a paríir de T-ADN Agrobacterium tumefaciens íales como el gen 3 conocido como ocíopinasintetasa de Ti-plásmido pTiACHd (Gielen eí al., 1984, EMBO J. 3:835) o sus equivalentes funcionales, y íambién son adecuados iodos los demás íerminadores funcionalmeníe activos en plantas. Dado que la expresión génica vegetal a menudo no se limite a los niveles de transcripción, un cásete de expresión vegetal de preferencia coníiene oirás secuencias ligadas operativamente como mejoradores de la traducción teles como la secuencia de sobredirección que contiene la secuencia guía no traducida 5' proveniente del virus de mosaico de íabaco que mejora la relación polipépíido por ARN (Gallie et al., 1987, Nucí. Acids Research 15:8693-8711 ). Los ejemplos de vectores de expresión vegetales ¡ncluyen los detallados en: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. y Masterson, R., 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the lefí border, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; y Bevan, M.W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucí. Acid. Res. 12:8711-8721 ; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, eds.: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. La expresión génica vegetal debe estar ligada operativamente a un promotor adecuado que confiere la expresión génica en forma oportuna, específica de célula o específica de tejido. Los promotores úíiles en los casetes de expresión de la invención incluyen cualquier promotor capaz de iniciar la transcripción en una célula vegetal. Dichos promoíores ¡ncluyen, sin limiíaciones, los que se pueden obtener de plañías, virus vegeíales, y bacíerias que contienen genes expresados en plantes, fales como Agrobacterium y Rhizobium. El promoíor puede ser consíiíuíivo, inducible, con preferencia por estadio de desarrollo, con preferencia por tipo celular, con preferencia por tejido, o con preferencia de órgano. Los promotores consíifuíivos acfúan en la mayoría de las condiciones. Los ejemplos de promoíores consíiíuíivos incluyen los promoíores CaMV 19S y 35S (Odell eí al., 1985, Naíure 313:810-812), el promotor sX CaMV 35S (Kay et al., 1987, Science 236:1299-1302), el promotor Sep1 , el promotor de actina de arroz (McEIroy et al., 1990, Plant Cell 2:163-171), el promoíor de acíina de Arabidopsis, el promotor de ubicuifano (Christensen et al., 1989, Plant Molec. Biol. 18:675-689), pEmu (Lasf eí al., 1991, Theor. Appl. Geneí. 81 :581-588), el promotor de virus de mosaico de escrofularia 35S, el promotor Smas (Velíen eí al., 1984, EMBO J 3:2723-2730), el superpromotor (patente de los Estados Unidos N.° 5.955.646), el promoíor GRP1-8, el promoíor cinnamilalcoholdeshldrogenasa (patente de los Estados Unidos N.° 5.683.439), los promoíores de T-ADN de Agrobacterium, tales como manopinasinteíasa, nopalinasiníeíasa, y ocíopinasintetasa, el promotor de la subunidad menor de ribulosbifosfatocarboxilasa (ssuRUBISCO), y similares. De preferencia los promotores inducibles son activos en ciertas condiciones ambientales, íales como la presencia o ausencia de un nuírieníe o meíaboliío, calor o frío, luz, ataque de agente patógeno, condiciones anaerobias, y similares. Por ejemplo, el promoíor hsp80 de Brassica es inducido por shock de calor; el promoíor PPDK es inducido por luz; los promoíores PR-1 provenientes de tabaco, Arabidopsis, y maíz son inducibles por infección con un agente patógenon; y el promotor Adhl es Inducido por hipoxia y estrés por frío. La expresión génica vegetal también se ve facilitada por un promotor inducible (Para una revisión, ver Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Los promotores químicamente inducibles son especialmente adecuados si se desea que la expresión génica ocurra en forma específica de tiempo. Los ejemplos de dichos promotores son un promotor inducible por ácido salicílico (solicitud de PCT N.° WO 95/19443), un promotor inducible por teíraciclinas (Gaíz eí al., 1992, Plañí J. 2:397^104), y un promoíor inducible por efanol (solicifud de PCT N.° WO 93/21334). En una forma de realización de preferencia de la presente invención, el promotor inducible es un promotor inducible por estrés. A los fines de la presente invención, los promotores inducibles por estrés de preferencia son activos en uno o más de los siguientes esíreses: condiciones subópíimas asociadas con esíreses por salinidad, sequía, íemperaíura, meíal, ageníe químico, agente patógeno, y agenle oxidalivo. Los promotores inducibles por estrés ¡ncluyen, sin limitaciones, Cor78 (Chak et al., 2000, Planta 210:875-883; Hovath el al., 1993, Plant Phisiol. 103:1047-1053), Cor15a (Artus et al., 1996, PNAS 93(23): 13404-09), Rci2A (Medina et al., 2001 , Plant Phisiol. 125:1655-66; Nilander eí a!., 2001 , Plañí Mol. Biol. 45:341-52; Navarre y Goffeau, 2000, EMBO J. 19:2515-24; Capel eí al., 1997, Plañí Phisiol. 115:569-76), Rd22 (Xiong et al., 2001, Plant Cell 13:2063-83; Abe et al., 1997, Plant Cell 9:1859-68; Iwasaki et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 247:391-8), cDet? (Lang y Palve, 1992, Plañí Mol. Biol. 20:951-62), ADH1 (Hoeren et al., 1998, Genetics 149:479-90), KAT1 (Nakamura et al., 1995, Plant Phisiol. 109:371-4), KST1 (Müller-Róber et al., 1995, EMBO 14:2409-16), Rha1 (Terryn et al., 1993, Plant Cell 5:1761-9; Terryn et al., 1992, FEBS Letí. 299(3):287-90), ARSK1 (Aíkinson eí al., 1997, N.° de acceso a GenBank L22302, y soliciíud de PCT N.° WO 97/20057), PfxA (Plesch et al., N.° de acceso a GenBank X67427), SbHRGP3 (Ahn et al., 1996, Plant Cell 8:1477-90), GH3 (Liu et al., 1994, Plant Cell 6:645-57), el promotor de PRP1 inducible por agentes patógenos (Ward et al., 1993, Plant. Mol. Biol. 22:361-366), el promotor ¡nducible por calor hspdO de tomate (patente de los Estados Unidos N.° 5187267), el promotor inducible por alfa amilcasa de papa (solicitud de PCT N.° WO 96/12814), o el promotor inducible por heridas pinll (patente europea N.° 375091). Para otros ejemplos de promotores inducibles por sequía, frío, y salinidad, tales como el promotor RD29A, ver Yamaguchi-Shinozalei et al., 1993, Mol. Gen. Genet. 236:331-340. Los promoíores con preferencia por estedio de desarrollo se expresan de preferencia en ciertos estadios de desarrollo. Los promotores con preferencia por íejido y órgano ¡ncluyen ios que se expresan de preferencia en ciertos tejidos u órganos, tales como hojas, raíces, semillas, o xilema. Los ejemplos de promotores con preferencia de tejido y con preferencia por órgano ¡ncluyen, sin limitaciones preferencia por fruta, preferencia por óvulo, preferencia por tejido masculino, preferencia por semilla, preferencia por tegumento, preferencia por tubérculo, preferencia por tallo, preferencia por pericarpio, y preferencia por hoja, preferencia por estigma, preferencia por polen, preferencia por anteras, preferencia por pétalo, preferencia por sépalo, preferencia por pedicelo, preferencia por silique, preferencia por pecíolo, preferencia por raíz y similares. Los promotores con preferencia por semilla de preferencia se expresan durante el desarrollo y/o la germinación de la semilla. Por ejemplo, los promotores con preferencia por semilla pueden tener preferencia por embrión, preferencia por endosperma, y preferencia por cubierta de semilla. Ver Thompson et al., 1989, BioEssays 10:108. Los ejemplos de promotores con preferencia por semilla incluyen, sin limitaciones, celulosa sintetasa (celA), Cim1 , gamma-zeína, globuiina-1 , zeína de maíz 19 kD (cZ19B1), y similares. Otros promotores adecuados con preferencia por tejido o con preferencia por órgano incluyen el promotor de gen de napina proveniente de semilla de colza (patente de los Estados Unidos N.° 5.608.152), el promotor USP proveniente de Vicia faba (Baeumlein et al., 1991 , Mol. Gen. Genet. 225(3):459-67), el promotor de oleosina proveniente de Arabidopsis (solicitud de PCT N.° WO 98/45461 ), el promotor faseolina proveniente de Phaseolus vulgaris (patente de los Estados Unidos N.° 5.504.200), el promotor Bce4 proveniente de Brassica (solicitud de PCT N.° WO 91/13980), o el promotor de legumina B4 (LeB4; Baeurrilein et al., 1992, Plant Journal, 2(2):233-9), además de promotores que confieren expresión específica de semilla a plantas monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Cabe destacar promotores adecuados tales como los promotores de genes Ipt2 o Ipt1 provenientes de cebada (solicitud de PCT N.° WO 95/15389 y solicitud de PCT N.° WO 95/23230) o los descriíos en la soliciíud de PCT N.° WO 99/16890 (promotores del gen de hordeína provenientes de cebada, el gen glutelina de arroz, el gen origina de arroz, el gen prolamina de arroz, el gen gliadina de trigo, el gen gluíelina de írigo, el gen gluíelina de avena, el gen casirina de sorgo, y el gen secalina de centeno). Oíros promoíores de utilidad en los casetes de expresión de la invención incluyen, sin limiíaciones, el promoíor de proteína fijadora principal de clorofila a/b, promotores de histona, el promotor de Ap3, el promotor de ?-congIicina, el promotor de napina, el promotor de lectina de poroío de soja, ei promoíor de zeína de maíz 15kD, el promotor de zeína 22kD, el promotor de zeína 27kD, el promotor de g-zeína, los promotores ceroso, encogido 1 , encogido 2, y bronce, el promotor Zm13 (patente de los Estados Unidos N.° 5.086.169), los promotores poligalacíuronasa de maíz (PG) (patentes de los Estados Unidos N.° 5.412.085 y 5.545.546), y el promoíor SGB6 (paíeníe de los Esíados Unidos N.° 5.470.359), además de promoíores sintéticos u oíros nalurales. Se puede obíener flexibilidad adicional en el control de la expresión de genes heterólogos en plantas al usar dominios fijadores de ADN y elementos de respuesta provenientes de fuentes heíerólogas (es decir, dominios fijadores de ADN provenientes de fuentes no vegetales). Un ejemplo de dicho dominio fijador de ADN heterólogo es el dominio de fijación de ADN LexA (Brent y Ptashne, 1985, Cell 43:729-736). La Invención también provee un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de MTP de la invención clonada en el vector de expresión en orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN se liga operativamente a una secuencia reguladora de manera tal que permite la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido respecto de un mARN de MTP. De las secuencias reguladoras ligadas operativamente a una molécula de ácido nucleico clonada en la orientación antisentido se pueden elegir las que dirigen la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en diversos tipos celulares. Por ejemplo, se pueden elegir promotores y/o mejoradores virales, o secuencias reguladoras que dirijan la expresión constitutiva, específica de tejido, o específica de tipo celular del ARN antiseníido. El vector de expresión antisentido puede estar en la forma de un plásmido recombinaníe, fagémido, o virus atenuado en donde se producen ácidos nucleicos aníiseníido bajo el control de una región reguladora con alta eficiencia. La actividad de la región reguladora se puede determinar por el íipo celular en el que se introduce el vector. Para el análisis de la regulación de la expresión génica mediante el uso de genes antiseníido, ver Weintraub, H. et al., 1986, Antisense RNA as a molecular fool for geneíic analysis, Reviews - Trends in Geneíics, Vol. 1 (1), y Mol eí al., 1990, FEBS Leííers 268:427-430. Ofro aspecto de la invención se refiere a células huésped en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan en forma intercambiable en ia presente. Se entiende que dicho término se refiere no solo a la célula objeto particular, sino íambién se aplica a la progenie o posible progenie de dicha célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas, debido a muíación o la influencia ambiental, de hecho dicha progenie puede no ser idéníica a la célula progeniíora, pero aun así se incluye en el alcance del término tal como se usa en la presente. Una célula huésped puede ser cualquier célula procarionte o eucarionte. Por ejemplo, un MTP se puede expresar en células bacterianas íales como C. glutamicum, células de insecto, células fúngicas, o células de mamífero (íales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas, ciliados, células vegetales, hongos, o otros microorganismos tales como C. glutamicum. Otras células huésped adecuadas son conocidas por los expertos en el arte. Una célula huésped de la invención, por ejemplo una célula huésped procarionte o eucarionte en cultivo, se puede usar para producir (es decir, expresar) un MTP. En consecuencia, la invención también provee méíodos para producir MTP mediante las células huésped de la invención. En una forma de realización, el método comprende cultivar la célula huésped de la invención (en la que se ha introducido un veclor de expresión recombinante que codifica un MTP, o en cuyo genoma se introdujo un gen que codifica un MTP de fipo salvaje o alterado) en un medio adecuado, hasta la producción de MTP. En otra forma de realización, el mélodo también comprende el aislamiento de MTP del medio o la célula huésped. Otro aspecto de la invención se refiere a MTP aislados, y sus porciones biológicamente activas. Un polipéptido "aislado" o "purificado" o su porción biológicamente activa está libre de parte del material celular cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante, o de precursores químicos y otros compuestos químicos cuando se sintetiza químicamente. El término "susíancialmeníe libre de material celular" incluye preparaciones de MTP en las cuales el polipéptido se separa de parte de los componentes celulares de las células en las cuales se produce en forma natural o recombinante. En una forma de realización, el término "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un MTP con menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de material distinto de MTP (también denominado en la presente "polipéptido contaminante"), con mayor preferencia menos de aproximadamente 20% de material distinto de MTP, con aun mayor preferencia menos de aproximadamente 10% de material distinto de MTP, y con máxima preferencia menos de aproximadameníe 5% de material distinto de MTP. Las moléculas de ácido nucleicos, polipéptidos, homólogos de polipéptido, polipéptidos de fusión, cebadores, vectores, y células huésped descriías en la preseníe se pueden usar en uno o más de los siguientes métodos: identificación de cualquiera de los organismos íal como se provee en la Columna N.° 2 de la Tabla 1 y organismos relacionados; mapeo de genomas de organismos relacionados con cualquiera de los organismos tal como se provee en la Columna N.° 2 de la Tabla 1; identificación y localización de las secuencias de interés de cualquiera de los organismos tal como se provee en la Columna N.° 2 de la Tabla 1 ; esíudios evolutivos; determinación de regiones de MTP requeridas para la función; modulación de una actividad MTP; modulación del metabolismo de una o más funciones celulares; modulación del íransporte transmembrana de uno o más compuestos; modulación de resistencia a estrés; y modulación de la expresión de ácidos nucleicos MTP. En una forma de realización de estos métodos, el MTP funciona como un íransportador de membrana. Las moléculas de ácido nucleico de MTP de acuerdo con la invención tiene diversos usos. Más importante, el ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos de la presente invención se pueden usar parra transformar plantas, particularmente plañías de culíivo, por lo que se induce a estreses tales como sequía, alta salinidad, y frío. La presente invención en consecuencia provee una planta transgénica transformada por un ácido nucleico MTP, en donde la expresión d.e la secuencia de ácido nucleico en la planta da por resultado un aumento de crecimiento de la raíz y/o tolerancia a estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta. La planta transgénica puede ser una monocotiledónea o una dicotiledónea. La invención también provee que la plañía íransgénica se seleccione de maíz, írigo, centeno, avena, íriíicale, arroz, cebada, sorgo, mijo, caña de azúcar, poroío de soja, maní, algodón, semilla de colza, cañóla, mandioca, pimienío, girasol, tagetes, plantas solanáceas, papa, tabaco, berenjena, lómale, especies de Vicia, arveja, alfalfa, café, cacao, té, especies de Salix, palmera aceitera, coco, pastos perennes, y cultivos de forraje, por ejemplo.

En particular, la presente invención describe el uso de la expresión del ácido nucleico que codifica MTP para someter a ingeniería plantas con aumento de crecimiento de la raíz, y/o aumento del rendimiento, y/o que son tolerantes a sequía, a salinidad, y/o a frío. Esta estrategia se ha demostrado en la presente mediante AtAGRI (SEQ ID NO:1) en Arabidopsis thaliana y maíz, pero su aplicación no está restringida a este gen o a estas plantas. En consecuencia, la invención provee una planta de cultivo transgénica que contiene un MTP tal como se define en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1 , en donde la planta tiene aumento de crecimiento de la raíz, y/o aumento del rendimiento, y/o aumento de tolerancia a un estrés ambiental seleccionado de uno o más del grupo que consiste en sequía, aumento de salinidad, o disminución o aumento de íemperatura. En unas formas de realización de preferencia, el estrés ambiental es sequía. En oirás formas de realización de preferencia, el aumento de crecimiento de la raíz es un aumenío de la longitud de la raíz, de preferencia en condiciones de limitación de agua. La invención también provee un método para producir una planta de cultivo transgénica que coníiene un ácido nucleico que codifica MTP, en donde la expresión del ácido nucleico en la plante da por resultado un aumenío de crecimienío de la raíz y/o aumento del rendimienío, y/o aumento de tolerancia a estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta que comprende: (a) introducir en la célula vegetal un vector de expresión que comprende un ácido nucleico MTP, y (b) la generación por o a paríir de una célula vegetal de una planta transgénica con aumento de crecimiento de la raíz, y/o aumento del rendimiento, y/o aumenío de tolerancia a estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta. La célula vegetal incluye, sin limitaciones, un protoplaslo, una célula productora de gametos, y una célula que se regenera en una planta entera. Tal como se usa en la presente, el término "íransgénico" se refiere a cualquier plante, célula vegetal, callo, tejido vegetal, o parte de planta que contiene la totalidad o parte de al menos un polinucleótido recombinante. En muchos casos, la totalidad o parte del polinucleótido recombinante se integra en forma estable en un cromosoma o elemento extracromosómico estable, para que se pueda pasar a las generaciones sucesivas. En formas de realización de preferencia, el ácido nucleico de MTP codifica una proteína que comprende el polipéptido de cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1. La presente invención íambién provee un méíodo para modular el crecimienío de la raíz de una planta, y/o el rendimienío, y/o la tolerancia a un estrés ambiental que comprende modificar la expresión de un ácido nucleico que codifica MTP en la planta. El crecimiento de la raíz de una planta, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia al estrés ambiental pueden ser aumento o disminución, según se logre al aumentar o disminuir la expresión de un MTP, respectivameníe. De preferencia, el crecimiento de la raíz de una planta, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia al esírés ambiental es aumento al incrementar la expresión de un MTP. La expresión de un MTP se puede modificar por cualquier méíodo conocido por los expertos en el arte. Se pueden usar métodos para incrementar la expresión de MTP cuando la planta es transgénica o no transgénica. En los casos en que la planta es transgénica, la planta puede ser transformada por un vector que contiene cualquiera de los antes descritos ácidos nucleicos que codifican MTP, o la planta puede ser transformada por un promotor que dirige la expresión de MTP nativo en la planta, por ejemplo. La Invención provee que dicho promotor sea con preferencia por tejido, regulado por el desarrollo, inducible por estrés, o una de sus combinaciones. Alternativamente, las plantas no transgénicas pueden tener expresión de MTP nativo modificado por la inducción de un promotor nativo. La expresión de MTP tal como se define en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1 en plantas blanco se puede lograr, sin limitaciones, mediante uno de los siguientes ejemplos: (a) promotor constiíufivo, (b) promotor ¡nducible por estrés, (c) promotor inducido por agentes químicos, y (d) sobreexpresión por promotor sometido a ingeniería, por ejemplo, con factores de transcripción derivados de dedos de zinc (Greisman y Pabo, 1997, Science 275:657). En una forma de realización de preferencia, la transcripción del MTP es modulada mediante factores de íranscripción derivados de dedos de zinc (ZFP) lal como se describe en Greisman y Pabo, 1997, Science 275:657 y se manufacíura en Sangamo Biosclences, Inc. Estos ZFP comprenden un dominio de reconocimiento de ADN y un dominio funcional que genera la activación o represión de un ácido nucleico blanco tal como un ácido nucleico MTP. En consecuencia, los ZEP de acíivación y represión se pueden crear para reconocer específicameníe los promotores MTP antes descriíos y se usan para aumentar o disminuir la expresión de MTP en una planta, por lo que modulan el rendimiento y/o la tolerancia a esírés de la planta. La presente invención también incluye identificación de los homólogos de ácidos nucleicos que codifican MTP tal como se definen en cualquier SEQ ID NOS tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 en una planta blanco, además de un promotor del homólogo. La invención también provee un método para aumentar la expresión de un gen de interés dentro de una célula huésped, comparado con la variedad de íipo salvaje de la célula huésped, en donde el gene de interés se transcribe en respuesfa a un MTP, que comprende: (a) transformar la célula huésped con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica MTP, y (b) expresar el MTP dentro de la célula huésped, por lo que se incrementa la expresión del transcripto en respuesta al MTP, comparado con la variedad de íipo salvaje de la célula huésped. Además, para iníroducir las secuencias de ácidos nucleicos MTP en las plantes transgénicas, estas secuencias también se pueden usar para identificar un organismo como parte de los organismos íal como se provee en la Columna N.° 2 de la Tabla 1 , o uno muy relacionado. Además, se pueden usar para ideníificar la presencia de cualquiera de los organismos íal como se provee en la Columna N.° 2 de la Tabla 1 , o una relacionada en una población mixta de organismos. La invención se refiere a ias secuencias de ácidos nucleicos de numerosos genes provenientes de cualquiera de los íal como se provee en la Columna N.° 2 de la Tabla 1 ; al sondar el ADN genómico exíraído de un cultivo de una población singular o mixta de organismos en condiciones rigurosas con una sonda que abarca una región de un gen particular que es singular respecto del correspondiente organismo de acuerdo con la Tabla 1 , se puede asegurar si dicho organismo esfá presente. Además, las moléculas de ácido nucleico y polipéptido de acuerdo con la invención pueden acfuar como marcadores para regiones específicas del genoma. Esío es de utilidad no solo para mapear el genoma, íambién en esludios funcionales de los polipépíidos codificados por dicho genoma. Por ejemplo, para identificar la región del genoma al que se fija un polipéptido de fijación a ADN particular de un organismo, se puede digerir el genoma del organismo, y los fragmentos se incuban con el polipéptido fijador de ADN. Dichos fragmentos fijadores de polipéptido además se pueden sondar con la molécula de ácido nucleicos de la Invención, de preferencia con róíulos fácilmente detectables. La fijación de dicha molécula de ácido nucleico al fragmento del genoma permite la localización del fragmento en el mapa del genoma de dicho organismo, y cuando se realiza muchas veces con diferentes enzimas, facilita la rápida determinación de la secuencia de ácido nucleico a la que se fija el polipéptido. Además, la molécula de ácido nucleicos de la invención puede íener suficieníe identidad con las secuencias de las especies relacionadas para que esías moléculas de ácido nucleicos pueden servir como marcadores para la construcción de un mapa gen?mico en plantas relacionadas. Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención MTP también son útiles para los esíudios evolutivos y eslrucíurales de polipéptido. Los procesos de transportadores de membrana en los cuales participan las moléculas de la invención son utilizados por una amplia variedad de células procarioníes y eucariontes; por comparación de las secuencias de las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención con las que codifican enzimas similares provenientes de oíros organismos es posible evaluar la relación evolutiva entre los organismos. De modo similar, dicha comparación permite evaluar cuáles de las regiones de la secuencia se conservan y cuáles no, cuáles pueden contribuir en la determinación de las regiones del polipépíido que son esenciales para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación es valioso para los estudios de ingeniería del polipépíido y pueden dar una indicación de lo que puede tolerar el polipéptido en términos de mutagénesis. sin perder función. La manipulación de las moléculas de ácidos nucleicos MTP de la invención puede dar por resultado la producción de MTP con diferencias funcionales con los MTP de tipo salvaje. Estos polipéptidos se pueden mejorar en eficiencia o actividad, pueden estar presentes en mayor número en la célula que lo usual, o pueden estar disminuidos en eficiencia o actividad. Hay numerosos mecanismos por los cuales la alteración de un MTP de la invención puede afectar directamente el crecimiento de la raíz, y/o el rendimiento, y/o una respuesta a estrés y/o tolerancia a esírés. En el caso de las plantes que expresan MTP íal como AGR1 , AGR1 puede actuar como una proteína portadora de eflujo de auxina en oirás células además de células corticales y epidérmicas de la zona de elongación de la raíz, mejorando así la eficacia del íransporte de auxina, en especial en la raíz, lo que conduce a un incremento de la longitud de la raíz y una mejora de la eficiencia de uso de agua por la planta. El efecto de la modificación genética en plantas, C. glutamicum, hongos, algas, o ciliados sobre el crecimiento de la raíz y/o la tolerancia a estrés pueden ser evaluadas al dejar crecer el microorganismo modificado o planta en condiciones menos adecuadas y luego analizar las características de crecimiento y/o el metabolismo de la planta. Dichas técnicas de análisis son bien conocidas por los experíos en el arte, e incluyen peso seco, peso húmedo, síntesis de polipépíidos, síníesis de hidratos de carbono, síníesis de lípidos, lasas de evaporaci?n/íranspiración, rendimienío general de la planta y/o el cultivo, floración, reproducción, fijación de la semilla, crecimiento de la raíz, tasas de respiración, tasas de fotosíntesis, etc. (Applications of HPLC in Biochemistry en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, vol. 3, Chapter lll: Producí recovery and purification, página 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al., 1988, Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley y Sons; Kennedy, J.F. y Cabral, J.M.S., 1992, Recovery processes for biological materials, John Wiley y Sons; Shaeiwitz, J.A. y Henry, J.D., 1988, Separaciones bioquímicas, en: Ulmann's Encyclopedia of Indusírial Chemistry, vol. B3, Capítulo 11, página 1-27, VCH: Weinheim; y Dechow, F.J., 1989, Separation and purification íechniques in bioíechnology, Noyes Publications). Por ejemplo, los vectores de expresión de levadura que comprenden los ácidos nucleicos descritos en la presente, o sus fragmentos, se pueden construir y transformar en Saccharomyces cerevisiae mediante protocolos esíándar. Las células íransgénicas obtenidas luego se pueden analizar para determinar fallas o alteraciones del aumento de crecimiento y/o la íolerancia estreses por sequía, salinidad, y temperaíura. De modo similar, los vectores de expresión vegetales que comprenden los ácidos nucleicos divulgados en la presente, o sus fragmentos, se pueden consíruir y íransformar en una célula vegetal adecuada tal como Arabidopsis, soja, nabo, maíz, írigo, Medicago truncatula, etc., mediante protocolos esíándar. Las células y/o plañías íransgénicas obtenidas así derivadas luego se pueden analizar para determinar fallas o alteraciones del aumento de crecimiento y/o la tolerancia estreses por sequía, salinidad, y temperatura. Además, las secuencias divulgadas en la presente, o sus fragmentos, se pueden usar para generar mutaciones knockout en los genomas de diversos organismos, tales como bacíerias, células de mamífero, células de levaduras y células vegetales (Girke, T., 1998, The Plañí Journal 15:39-48). Las células knockouf obtenidas luego se pueden evaluar por su capacidad o habilidad para tolerar diversas condiciones de esírés, su respuesta a diversas condiciones de esírés y el efecto sobre el fenotipo y/o el genotipo de la mutación. Para oíros méíodos de inactivación génica, ver la pateníe de los Estados Unidos N.° 6.004.804 "Non-Chimeric Mutational Vectors" y Puftaraju et al., 1999, Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene íherapy, Naíure Biotechnology 17:246-252. Las estrategias de mutagénesis antes mencionadas para MTP que dan por resultado el aumento de crecimiento de la raíz, y/o el rendimiento, y/o la tolerancia a estrés no pretenden ser limiíaníes; las variaciones de estas estrategias serán rápidamente aparentes para los expertos en el arte. Al usar dichas estrategias, e incorporar los mecanismos descritos en la preseníe, las moléculas de ácidos nucleicos y polipépfidos de la invención se pueden utilizar para generar algas, ciliados, plantas, hongos, u otros microorganismos tales como C. glutamicum, que expresan moléculas muíadas de ácido nucleico y polipéptido de MTP que mejoran el crecimiento de la raíz y/o la tolerancia a esírés. La presente Invención también provee anticuerpos que se fijan específicamente a un MTP, o una de sus porciones, como se codifica con un ácido nucleico descrito en la presente. Los anticuerpos se pueden preparar mediante muchos métodos bien conocidos (ver, p. ej., Harlow y Lañe, "Antibodies; A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1988)). Brevemente, se puede inyectar antígeno purificado en un animal en una cantidad y por intervalos suficientes para desencadenar una respuesta inmune. Los anticuerpos se pueden purificar directamente, o las células del bazo se pueden obíener del animal. Las células luego se pueden fusionar con una línea de células Inmortales y analizar para la secreción de aníicuerpo. Los anticuerpos se pueden usar para analizar bibliotecas de clones de ácido nucleico para células que secretan el antígeno. En estos clones positivos luego se puede determinar la secuencia (Ver, por ejemplo, Kelly et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167; Bebbington eí al., 1992, Bio/Technology 10:169-175). Las frases "fijación selectiva" y "fijación específica" con el polipéptido se refieren a una reacción de fijación que determina la presencia del polipéptido en una población heterogénea de polipéptidos y otros ageníes biológicos. En consecuencia, en condiciones diseñadas de inmunoensayos, los anticuerpos especificados unidos a un polipéptido particular no se unen en cantidad significativa a oíros polipépíidos presentes en la muesíra. La fijación selectiva de un aníicuerpo en dichas condiciones puede requerir un aníicuerpo que se selecciona por su especificidad para un polipéptido paríicular. Se pueden usar diversos formatos de inmunoensayos para seleccionar aníicuerpos que se fijan selectivamente con un polipéptído particular. Por ejemplo, de rutina se usan inmunoensayos de ELISA de fase sólida para seleccionar anticuerpos selectivameníe inmunorreacíivos con un polipéptido. Ver Harlow y Lañe, "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, (1988), para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que se podrían usar para determinar la fijación selectiva. En algunos casos, es deseable preparar aníicuerpos monoclonales provenientes de varios huéspedes. Se puede hallar una descripción de técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales en Síiíes et al., eds., "Basic and Clinical Immunology," (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., cuarta edición) y sus referencias citadas, y en Harlow y Lañe "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publicaíions, Nueva York, 1988. En toda la presente memoria descriptiva se hace referencia a diversas publicaciones. Las divulgaciones de íodas esías publicaciones y sus referencias citadas dentro de dichas publicaciones en su totalidad por la presente se incorporan como referencia en la presente solicitud, a fin de describir mejor el estado del arte al cual pertenece la presente invención. También se debe entender que lo anterior se refiere a formas de realización de preferencia de la presente Invención y que se pueden hacer numerosos cambios sin apartarse del alcance de la invención. La invención también se ilustra mediante los siguientes ejemplos, que de ninguna manera se deben interpretar como limitaciones impuesías sobre su alcance. Por el conírario, se debe entender con claridad que se puede recurrir a diversas oirás formas de realización, modificaciones, y sus equivalentes, que después de leer la descripción de la presente, pueden sugerirse a los expertos en el arte, sin apartarse del espíritu de la presente invención y/o el alcance de las reivindicaciones adjuntas. EJEMPLOS Ejemplo 1 Aislamiento de ADN total a partir del material vegetal Los detalles sobre el aislamiento de ADN total se refiere a la elaboración a partir de un gramo de peso fresco de material vegetal. Los materiales usados incluyen los siguieníes buffers: CTAB buffer: 2% (p/v) de bromuro de N-cetil-N,N,N-trimefilamonio (CTAB); 100 mM de Tris HCl pH 8,0; 1 ,4 M de NaCI; 20 mM de EDTA; buffer de N-laurilsarcosina: 10% (p/v) de N-Iaurilsarcoslna; 100 mM de Tris HCl pH 8,0; y 20 mM de EDTA. El material vegeíal se íriluró bajo niírógeno líquido en un mortero y se íransfirió a íubos de Eppendorf de 2 ml. El material vegetal congelado luego se cubrió con una capa de 1 ml de buffer de descomposición (1 ml de buffer CTAB, 100 µl de buffer de N-laurilsarcosina, 20 µl de ?-mercaptoetanol, y 10 µl de solución de proíeinasa K, 10 mg/ml) y se incubó a 60 °C durante hora con agitación continua. El homogenado obtenido se distribuyó en dos íubos de Eppendorf (2 ml) y se extrajo dos veces por agitación con el mismo volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Para al separación de fases se centrifugó a 8000 x g y temperatura ambiente durante 15 minutos eb cada caso. El ADN luego se precipitó a -70 °C durante 30 minutos con isopropanol helado. El ADN precipitado se sedimentó a 4 °C y 10.000 g durante 30 minutos y se resuspendió en 180 µl de buffer TE (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Para la ulterior purificación se trató el ADN con NaCI (1,2 M de concentración final) y se volvió a precipitar a -70 °C durante 30 minuíos con el doble de volumen de etanol absoluto. Después del paso de lavado con 70% de etanol, se secó el ADN y luego se recuperó en 50 µl de H2O + ARNsa (50 mg/ml de concentración final). El ADN se disolvió durante la noche a 4 °C, y luego se realizó la digestión con ARNasa a 37 °C durante 1 hora. El ADN se almacenó a 4 °C. Ejemplo 2 Aislamiento de ARN total y cADN de material vegetal de Arabidopsis Se aisló AtAGRI al preparar ARN de hojas de Arabidopsis con un equipo de miniaislamiento de ARN (Qiagen kit) según las recomendaciones del fabricante. Más adelante se describen reacciones de transcripción inversa y amplificación del cADN. 1. El uso de 2 µl de una preparación de ARN (0,5 - 2,0 µg ) en una mezcla de reacción con 10 µl de ADNasa, se mueve el íubo a 37 °C duraníe 15 minutos, se agrega 1 µl de 25 mM de EDTA, y luego se hizo reaccionar al calor hasta 65 °C durante 15 minutos. a. Buffer (10X: 200 mM de Tris, 500 M de KCl, 20 mM de MgCI2) - 1 µl b. ARN - 2 µl c. ADNasa (10 U/µl)- 1 µl d. H2O - 6 µl 2. Se usó 1 µl de la mezcla de reacción en una reacción a íemperatura ambiente, y se calentó a 65 °C duraníe 5 minutos. a. ARN sometido a acción de ADNasa (0,025-0,1 µg según la caníidad de inicio)- 1 µl b. 10 mM de dNTP - 1 µl c. Cebador (10 µM)- 1 µl d. H2O - hasía 10 µl 3. Se preparó una mezcla de reacción con esíos reacíivos en olro íubo a. Buffer SuperScripí II RT (10X)- 2 µl b. 25 mM de MgCI2- 4 µl c. DTT (0,1 M) - 2 µl d. Inhibidor de ARNasa para eliminar ARNasa (40 U/µl)- 1 µl 4. Se agregó 9 µl de la mezcla de reacción a la solución de ARN desnaíuralizada, y se mantuvo a 42 °C durante 2 minutos. 5. Se agregó 1 µl de SuperScriptlI RT (50 U/µl), y se incubó a 42 °C durante 50 minutos. 6. Se terminó la reacción a 70 °C durante 15 minutos. 7. Opcional: agregar 1 µl de ARNsaH a la mezcla de reacción para extraer ARN. 8. Se realizó PCR como se haría con 1-2 µl del nuevo cADN. Se cosechó el tejido, se aisló ARN. y se consíruvó la biblioteca cADN Las plantas de culíivos se cultivaron en diversas condiciones y íraíamientos, y se cosecharon difereníes tejidos en disíiníos esíadios de desarrollo. El crecimiento de la planta y la cosecha se realizaron en forma estratégica a fin de maximizar la probabilidad de cosechar todos los genes expresables en al menos uno o más de las bibliotecas obtenidas. El mARN se aisló íal como se describió con anterioridad a partir de cada una de las muesiras cosechadas, y se construyeron bibliotecas de cADN. No se usaron etapas de amplificación en el proceso de producción de la biblioteca, a fin de minimizar la redundancia de genes en la muestra y retener la ¡nformación de la expresión. Todas las bibliotecas eran generadas de 3' a partir de mARN purificado en columnas de oligodT.

Las colonias obtenidas de la transformación de la biblioteca de cADN en E. coli se juntaron al azar y se colocaron en placas de microtilulación. Amplificación por PCR de inserciones de cADN y manchas Las inserciones de cADN provenientes de cada clon de las placas de microtifulación se amplificaron por PCR. El ADN plásmido se aisló de colonias de E. co//y luego se mancharon sobre membranas. No fue necesario el paso de purificación antes de ubicar las manchas sobre membranas de nailon. Ejemplo 3 Clonación de AtAGRI Se usó el cADN aislado íal como se describe en Ejemplo 2 para clonar el gen AIAGR1 por RT-PCR. Se usaron los siguientes cebadores: El cebador hacia adelante era 5'-GGGGTCGACCAAAATGATCACCGGCAAAGAC-3' (SEQ ID NO:126). El cebador de reversa era 5 -GGGTTAATTAACTTAAAGCCCCAAAAGAACGTA-3' (SEQ ID NO: 127). Las reacciones por PCR para la amplificación incluyeron: 1x de buffer PCR, 0,2 mM de dNTP, 100 ng de ADN de Arabidopsis thaliana, 25 pmol de cebador de reversa, 2,5 u de Pfu o ADN Herculasa pollmerasa. Se realizó PCR de acuerdo con condiciones estándar y los protocolos del fabricante (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2o Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Biometra T3 Thermocycler). Los parámefros para la reacción eran: 1 ciclo durante 3 minutos a 94 °C; seguido de 25 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C, y 1 ,5 minutos a 72 °C. Los fragmentos amplificados luego se extrajeron con gel de agarosa con un kit de exíracción de gel QIAquick (Qiagen) y se ligó al vecíor TOPO pCR 2.1 (Inviírogen) según las instrucciones del fabricante. Los vectores recombinanles se íransformaron en células Top10 (Invitrogen) en condiciones estándar (Sambrook eí al. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2o Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Las células transformadas se seleccionaron en agar LB que contenía 100 µg/ml de carbenicilina, 0,8 mg X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactósido) y 0,8 mg IPTG (isopropilílo-ß-D-galactósido) cultivado duraníe la noche a 37 °C. Se seleccionaron las colonias blancas y ser usaron para inocular 3 ml de LB líquido que contenía 100 µg/ml de ampicilina y se cultivó duraníe la noche a 37 °C. El ADN plásmido se exírajo con QIAprep Spin Miniprep Kií (Qíagen) según las instrucciones del fabricante. Se realizó el análisis de los clones posteriores y el mapeo de restricción de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboraíory Manual, 2o Edición, Cold Spring Harbor Laboraíory Press, Cold Spring Harbor, NY). En los clones se determinó la secuencia, que confirmó que la identidad del gen clonado era idéníico a la secuencia depositada en la base de datos de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:1). La secuencia de aminoácidos deducida de A1AGR1 se muesíra en SEQ ID NO:2. Luego se clonó el gen AtAGRI en un vecíor binario y se expresó con el Superpromoíor (Figura 3). El Superpromolor es consliíulivo, pero con preferencia por la raíz (patente de los Estados Unidos N.° 5.428.147 y 5.217.903). Ejemplo 4 Transformación de planta de Arabidopsis Se generaron plantas íransgénicas de Arabidopsis thaliana (Col) por el método de infiltración por inmersión (Bechtold et al., 1993, "In plañí Agrobacíerium-mediaíed gene íransfer by infilíraílon of adult Arabidopsis thallana plants," C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sci. 316:1194-1199). Los vecíores binarios se fransformaron en una cepa de Agrobacteria C58C1 o pMP90 mediante elecíroporación. Se dejó crecer el culíivo de la Agrobacteria íransformada y se resuspendieron las bacterias en medio de infiltración por inmersión (1/2 MS, 5% de sacarosa, 0,5 mg/ml de MES, pH 5J y con agregado de 200 ppm Silweí L-77 (Lehle Seeds).) Cada cultivo se usó para íransformar 3 potes de plantes ColO de Arabidopsis de aproximadameníe 5 semanas de edad, 5 minuíos cada uno en culíivos resuspendidos de Agrobacterium. Las plantas luego se cultivaron hasta obíener semilla en condiciones esíándar para Arabidopsis (23 °C día/20 °C noche, 18 horas día y 65% humedad). Las semillas T1 se analizaron en placas MS con 100 nM de Pursuií (BASF). Análisis de Plantas Transformadas Las semillas T1 se esterilizaron de acuerdo con protocolos esfándar (Xiong eí al., 1999, Plañí Molecular Biology Repórter 17:159-170). Las semillas se seleccionaron en medio Vá Murashige y Skoog (MS) (Sigma-Aldrich), 0,6% de agar y suplemeníado con 1% de sacarosa, y 2 µg/ml de benomilo (Sigma-Aldrich). Las semillas de las placas se vernalizaron duraníe cuaíro días a 4°C. Las semillas se germinaron en una cámara climatizada con temperaíura del aire de 22 °C e intensidad de luz de 40 micromoles-'' m2 (luz blanca; íubo fluorescente Philips TL 65W/25) y ciclo de longiíud de día de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Las semillas germinadas íransformadas se seleccionaron después de 14 días y se transfirieron a V? MS suplementado con 0,6% de agar, 1% de sacarosa, y se dejó recuperar durante cinco a siete días. Las semillas de la generación T2 se usaron para el análisis de raíz de plañía en suelo e in vitro. Ejemplo 5 Análisis de raíz in vitro de plantas transformadas de Arabidopsis Para el análisis in vitro de la raíz de plantes íransformadas se usaron placas cuadradas que medían 12 cm x 12 cm. Para cada placa se usó 52 ml de medio MS (0,5X de sales MS, 0,5% de sacarosa, 0,5 g/L de buffer MES, 1% Phyíagar) sin selección. Las placas se dejaron secar en la campana esíéril duraníe una hora, as fin de reducir la fuíura condensación. Se esterilizaron alícuotas en viales de vidrio con eíanol duraníe 5 minuíos, se exírajo eíanol, y las semillas se dejaron secar en la campana esíéril duraníe una hora. Las semillas se colocaron en las placas con el Vacuseed Device (Lehle). En el diseño experimental, cada placa contenía el tipo salvaje y AfAGRI de plantas íransgénicas. En consecuencia, cada línea se comparó siempre a los coníroles cultivados en la misma placa para justificar la variación del microambieníe. Después de colocar las semillas en las placas, las placas se envolvieron en Veníwrap y se colocaron verticales en hileras en la oscuridad a 4 °C duraníe cuatro días para estratificar las semillas durante cuatro días para estratificar las semillas. Las placas se transfirieron a una Cámara de Crecimiento C5 Percival y se colocaron verticales durante 14 días. Las condiciones de la cámara de crecimiento eran 23 °C día/21 °C noche y 16 horas de día/8 horas de noche. Para la reunión de datos se usó un escaneo de lecho plano de alta resolución. El análisis de las raíces se hizo con el paquete de sofíware WinRhizo. Para análisis in vitro, se midieron las raíces en cuanto a la longitud de la raíz primaria a los 14 días de la germinación. Esto corresponde a un estadio de 4 a 6 hojas en Arabidopsis ecotipo Columbia. Cualquier diferencia observada podría indicar una diferencia en el crecimienío de la raíz, pero íambién podría reflejar el crecimienío final de la raíz. El resulíado de estos experimentos también se analizó a nivel génico. Para ello, se promediaron las longitudes de raíz de íodas las plantas para todas las líneas transgénicas y se compararon contra el promedio de las plantas de tipo salvaje.- La presencia del transgén y el número de coplas de los eventos se determinó al dirigir el terminador NOS con PCR de tiempo real. Los cebadores NOS usados en el análisis fueron: cebador hacia adelante - 5 -TCCCCGATCGTTCAAACATT-3' (SEQ ID NO: 28) y cebador de reversa -5 -CCATCTCATAAATAACGTCATGCAT-3' (SEQ ID NO: 129). Las reacciones se corrieron en una placa ópíica de 96 cavidades (Applied Biosystems, 4314320), y se corrieron simulíáneameníe las mezclas de reacción del conírol endógeno y el gen de iníerés en la misma placa. Se preparó una mezcla maestra para ambos conjuntos de cebadores. Las mezclas maestro y la placa de ensayo de 96 cavidades se deben mantener sobre hielo. Se incluyeron los cálculos para 52 reacciones, lo cual es adecuado APRA la mitad de la placa con el uso de un pipeteador de canales múltiples. Se usó el kit Eurogentec, (cat#RTSNRT032X-1 ), y se prepararon mezclas de reacción según las recomendaciones del fabricante. Se usó un GeneAmp 5700 para correr las reacciones y juníar los daíos. Resulíado Nuestros resultados demuesíran que las plantas transgénicas AtAGRI evaluadas en las placas fienen un fenoíipo de raíz más larga. La Figura 4A muesíra el resulíado de las plantas cultivadas en placas verticales en base a las líneas. La mayoría de las líneas íransgénicas AÍAGR1 analizadas exhibieron un fenotipo de raíz más larga, comparado con raíces de plantas conírol de íipo salvaje. El fenoíipo se observó más claramente en las líneas 5, 7, 9, 10 y 11. El análisis del nivel génico de las plantas íransgénicas AÍAGR1 , íal como se ven en la Figura 4B, confirmó que las plañías AÍAGR1 exhibieron un fenotipo de aumento de longitud de raíz. En base a este análisis, las plantes íransgénicas de Arabidopsis AGR1 exhibieron un aumenío del 29,3% de la longiíud de raíz. Ejemplo 6 Análisis de raíz en suelo de plantas transformadas de Arabidopsis Para el análisis de raíz en suelo, las semillas se sumergieron a 4°C duraníe 2 días en agua y se plantaron directamente en suelo sin selección. Se usaron macetas (Hummert D40) con un sedimento saturado de piedras (Jiffy 727) en la base y llenas con Meíromix saíurado con agua. Después de la siembra se cubrieron las macetas con plástico para impedir el secado. Las plantas se cultivaron solo con el agua preseníe en el medio de preparación, dado que el agua en el suelo de esías grandes macetas es suficieníe para 3 semanas de crecimienío, y estimula el rápido crecimiento de la raíz. La envolíura plástica de las macetas se retiró después de 12 días y se documentaron los daíos morfológicos. El día 17 se cosecharon las partes aéreas de la planta, se secaron a 65°C durante 2 días y se midió el peso seco. Para examinar las raíces se empujó el sedimento de piedras hacia la parte superior de la maceta para retirar la tierra y las raíces como una unidad. Luego se separó la fierra de las raíces en una bandeja y se midió la longiíud máxima de la raíz. Para determinar el impacto del fenotipo de la raíz en los íejidos sobre el suelo de las plantas íransgénicas, se midió el peso seco de la roseta y se comparó coníra la de las plantas de íipo salvaje. Resultados También se evaluaron las raíces de las líneas AIAGR1 en tierra, íal como se describió antes. El resulíado indicó que las plantas transgénicas exhibieron un fenotipo de raíz más larga cuando las plantas se cultivan en fierra (Figuras 5 y 6). En general, íodas las líneas AÍAGR1 analizaron exhibieron aumenío de crecimiento en el ensayo basado en tierra. Las líneas 4, 7, 8, 9, 10 y 11 mostraron el mayor incremento de la longlíud de raíz (Figura 5). La Figura 6 muesíra el ANOVA del rendimienío global del gen AÍAGR1 , lo cual demuesíra que las plañías íransgénicas A1AGR1 se desempeñaron significativamente mejor que los controles de tipo salvaje. Se midió el peso seco de la roseta, y el resultado del análisis ANOVA se muestra en la Figura 7. No se observaron diferencias significativas eníre las plantas íransgénicas y los coníroles de tipo salvaje. En consecuencia, la biomasa de la roseta no parece verse afecíado por la sobreexpresión del gen AÍAGR1. Ejemplo 7 Identificación de homólogos de AtAGRI Los algoritmos usados en la preseníe invención incluyen: FASTA (base de datos de secuencia muy sensible que estima la significancia esíadísíica; Pearson, 1990, comparación de secuencia rápida y sensible con FASTP y FASTA, Meíhods Enzymol. 183:63-98); BLAST (base de daíos de secuencia muy sensible que estima la significancia esíadísíica; Alfschul eí al., Basic local alignment search tool, Journal of Molecular Biology 215:403-10); PREDATOR (predicción de estrucfura secundaria de alta precisión de secuencia única y múltiple; Frishman y Argos, 1997, 75% de precisión en la predicción de la estructura secundaria proteica. Proteins 27:329-335); CLUSTALW (alineación de secuencias múltiple; Thompson et al., 1994, CLUSTAL W (mejora de la sensibilidad de la alineación de secuencias múltiples a íravés de los valores relaíivos de las secuencias, penalidades de brecha específicas de la posición y selección de la matriz de peso), Nucleic Acid Research 22:4673-4680); TMAP (predicción de la región transmembrana a partir de secuencias varias veces alineadas; Persson y Argos, 1994, Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing múltiple sequence alignments, J. Mol. Biol. 237:182-192); ALOM2 (predicción de la región íransmembrana a paríir de secuencias individuales; Klein eí al., Predicfion of protein function from sequence properties: A discrimínate analysis of a datábase. Biochim. Biophys. Acta 787:221-226 (1984). Versión 2 de Dr. K. Nakai); PROSEARCH (detección de pafrones de secuencias proteicas PROSITE; Kolakowski et al., 1992, ProSearch: fast searching of protein sequences wiíh regular expression patferns related to protein structure and function. Biotechniques 13, 919-921); BLIMPS (búsquedas de similitud según la base de datos de bloques sin brecha, Wallace y Henikoff, 1992); PATMAT (un programa de búsqueda y extracción para cuestiones de secuencias, patrones y bloques y bases de daíos, CABIOS 8:249-254. Escrito por Bill Alford). Los homólogos del gen AtAGRI se hallaron en las bases de daíos públicos y de propiedad. Esíos homólogos se evaluaron para determinar el nivel de relación con AÍAGR1. El programa íblasín de la familia BLAST de algoriímos se usó para comparar la secuencia de proíeínas AÍAGR1 contra las bases de datos de propiedad de culfivos íraducidas en los seis marcos de lectura. Las secuencias con homología significativa se hallaron en cada biblioteca de cultivo. El porcentaje de identidad de secuencia al nivel de aminoácidos de cada secuencia en comparación con AtAGRI se muestra en la Columna N.° 5 de la Tabla 1. Ejemplo 8 Ingeniería de plantas de poroto de soja con sobreexpresión del gen AGR1 Las semillas de poroío de soja se esterilizan en superficie con etanol al 70% duraníe 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido de 20% (v/v) de CLOROX suplementado con 0,05% (v/v) de TWEEN durante 20 minutos con agiíación continua. Luego se enjuagaron las semillas 4 veces con agua destilada y se colocaron sobre papel de filtro estéril húmedo en una placa de Petri a temperaíura ambiente durante 6 a 39 horas. Las cascaras de semilla se pelaron, y los cotiledones se separaron del eje del embrión. El eje del embrión se analiza parea tener la certeza de que la región meristemáíica no esíá dañada. Los ejes del embrión extraído se junten en una placa de Peíri esíéril semiabierta y se secaron al aire hasía íener un contenido de humedad inferior a 20% (peso fresco) en una placa de Peíri sellada hasía el uso posterior. Se prepara el culíivo de Agrobacterium tumefaciens a partir de una única colonia de medio sólido LB más los adecuados agentes de selección, seguido de crecimiento de la única colonia en medio líquido LB hasta íener una densidad óptica a 600 nm de 0,8. Luego se sedimentó el cultivo bacteriano a 7000 rpm duraníe 7 minutos a temperatura ambiente, y se resuspendió en medio MS suplementado con 100 µM de acetosiringona. Los cultivos bacterianos se incubaron en esíe medio preinducción duraníe 2 horas a íemperatura ambiente antes del uso. El eje de embriones de semillas cigóticas de poroto de soja con un contenido de humedad de aproximadamente 15% se sumergieron durante 2 horas a temperaíura ambieníe con el cultivo en suspensión de Agrobacterium preinducido. Los embriones se retiran del cultivo de imbibición y se íransfieren a placas de Petri que contienen medio MS sólido suplemenlado con 2% de sacarosa y se incubaron durante 2 días en la oscuridad a temperaíura ambiente. Alternaíivameníe, los embriones se colocaron sobre papel de filíros esíéril humedecido (medio líquido MS) en una placa de Petri y se incubaron en las mismas condiciones antes descriías. Después de este periodo, los embriones se transfirieron a medio MS sólido o líquido suplemenfado con 500 mg/L de carbenicilina o 300 mg/L de cefoíaxima para matar la Agrobacteria. El medio líquido se utilizó para humedecer el papel de filtro estéril. Los embriones se incubaron durante 4 semanas a 25°C, con una intensidad de luz de 150 µmol m_2sec~1 y un fotoperíodo de 12 horas. Una vez que las semillas germinadas produjeron raíces, se transfirieron a tierra metromix esíéril. El medio de las plantas in vitro se quita por lavado antes de transferir las plantas al suelo. Las plantas se mantienen bajo una cubierta plástica duraníe 1 semana para favorecer el proceso de aclimatación. Cuando las plantas se transfirieron a una habitación de crecimiento donde se incubaron a 25°C, con 150 µmol rrf2sec_1 de intensidad de luz y 12 horas de foíoperíodo durante aproximadameníe 80 días. Las plantas íransgénicas se analizan por su mejor crecimienío de la raíz y/o tolerancia a esírés, lo cual demuesíra que la expresión de íransgén confiere aumenío del crecimienío de la raíz, íolerancia a esírés y/o aumenío de eficiencia de uso de agua. Ejemplo 9 Plantas de ingeniería de colza /cañóla con sobreexpresión del gen AGR1 El méíodo de íransformación vegeíal descrito en la preseníe es aplicable a Brassica y oíros cultivos. Las semillas de cañóla se esterilizan en superficie con etanol al 70% durante 4 minutos a lemperaíura ambienie con agitación continua, seguido de 20% (v/v) de CLOROX suplementado con 0,05 % (v/v) de TWEEN durante 20 minutos, a temperatura ambiente con agitación continua. Luego se enjuagaron las semillas 4 veces con agua destilada y se colocaron sobre papel de filtro estéril humedecido en una placa de Peíri a temperaíura ambiente durante 18 horas. Luego se retiraron las cubiertas de la semilla, y las semillas se secaron al aire durante la noche en una placa de Petri estéril semiabierta. durante este periodo, las semillas pierden aproximadamente el 85% de su contenido de agua. Las semillas luego se almacenaron a íemperatura ambiente en una placa de Peíri sellada hasta su uso ulterior. Las construcciones de ADN y la imbibición del embrión fueron como se describió en el Ejemplo 10. Las muesíras de las plantas transgénicas primarias (T0) se analizaron por PCR para confirmar la presencia de T— ADN. Estos resulíados se confirmaron por hibridación Southern, donde el ADN se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se transfirió a una membrana de nailon con carga posiíiva (Roche Diagnostics). Se usó el PCR DIG Probé Synthesis Kit (Roche Diagnostics) para preparar una sonda con rótulo de digoxigenina por PCR, y se usó según las recomendaciones del fabricante. Las plañías transgénicas se analizaron para determinar su mejor crecimiento de la raíz y/o tolerancia a estrés, lo cual demuestra que la expresión del transgén confiere aumento de crecimiento de la raíz, tolerancia a esírés, y/o aumenío de eficiencia del uso de agua. Ejemplo 10 Ingeniería de plantas de maíz con sobreexpresión del gen AGR1 La íransformación de maíz (Zea Mays L.) con el gen de iníerés se realizó con el méíodo descrito por Ishida eí al., 1996, Naíure Biotech. 14745-50. Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens portador de vectores "superbinarios", y las plantas transgénicas se recuperaron mediante organogénesis. Este procedimiento provee una eficiencia de transformación de entre 2,5% y 20%. En las plantas transgénicas se analizan el mejor crecimiento de la raíz y/o la tolerancia a esírés, lo cual demuesíra que la expresión del íransgén confiere aumento de crecimienío de la ' raíz, tolerancia al estrés y/o aumento de la eficiencia de uso de agua. Ejemplo 11 Ingeniería de plantas de arroz con sobreexpresión del gen AGR1 La transformación de arroz con el gen de interés se puede realizar mediante técnicas de transferencia directa de genes que utilizan protoplastos o bombardeo de partículas. La íransformación mediada por protoplastos fue descrita para los tipos Japónica e Indica (Zhang et al., Plant Cell Rep 7: 379-384 (1988); Shimamoío eí al. Naíure 338: 274-277 (1989); Daíta et al. Biotechnology 8: 736-740, (1990)). Ambos tipos también son íransformables en forma rutinaria medianíe bombardeo de partículas (Chrisíou ef al. Bioíechnology 9: 957-962 (1991 )). Las plañías transgénicas se analizan para determinar su mejor crecimienío y/o tolerancia a esírés, lo cual demuesíra que la expresión transgénica confiere aumento de crecimiento de la raíz, tolerancia al estrés y/o aumenío de la eficiencia de uso de agua. Ejemplo 12 Identificación de genes homólogos y heterólogos Las secuencias génicas se pueden usar para ideníificar genes homólogos o heterólogos de las bibliotecas de cADN o genómicas. Los genes homólogos (p. ej. clones de cADN de longlíud toíal) se pueden aislar mediante hibridación de ácidos nucleicos al usar por ejemplo bibliotecas de cADN. Según la abundancia del gen de interés, de 100.000 a 1.000.000 bacteriófagos de interés se siembran en placas y se transfieren a membranas de nailon. Tras la desnaturalización con álcali, el ADN se inmovilizó sobre la membrana, p. ej., por formación de enlaces cruzados por UV. La hibridación se realizó en condiciones de alta rigurosidad. En solución acuosa se realizó la hibridación y el lavado con una fuerza iónica de 1 M de NaCI y una temperatura de 68 °C. Las sondas de hibridación se generaron, p. ej., por rotulado de íranscripción radioactivo (32P) puníual (High Prime, Roche, Mannheim, Alemania). Las señales se detecten por auíorradiografía.

Los genes parcialmente homólogos o helerólogos relacionados pero no idéníicos se pueden identificar de manera análoga al procedimiento antes descrito, mediante condiciones de hibridación y lavado de baja rigurosidad. Para la hibridación acuosa, la fuerza iónica normalmente se mantiene a 1 M de NaCI mieníras que la temperaíura se reduce progresivamente de 68 a 42 °C. El aislamiento de las secuencias génicas con homologías (o de identidad/similitud de secuencia) solo en dominios diferenciados (por ejemplo 10-20 aminoácidos) se puede realizar mediante sondas de oligonucleótido siníéíico con marca radiactiva. Los oligonucleóíidos con marca radiactiva se preparan por fosforilación del extremo 5' de dos oligonucleótidos complementarios con T4-polinucleotidoquinasa. Los oligonucleóíidos complementarios se fusionan y se ligan para formar concaíómeros. Los concaíómeros bicatenarios luego se adosan a marca radiactiva, por ejemplo, por transcripción del nick. La hibridación normalmente se realiza en condiciones de baja rigurosidad con altas concentraciones de oligonucleótido. Solución de hibridación de oligonucleótido: 6 SSC 0,01 M de fosfato de sodio 1 mM de EDTA (pH 8) 0,5 % de SDS 100 µg/ml de ADN d esperma de salmón desnaíuralizado 0,1 % de leche descremanda en polvo Duraníe la hibridación, la íemperaíura se redujo gradualmente a 5-10 °C por debajo de la Tm estimada del oligonucleótido, o menor que la temperaíura ambiente, seguido de pasos de lavado y autorradiografía. El lavado se realizó con baja rigurosidad, al igual que los 3 pasos de lavado con 4 x SSC. Otros detalles se describe en Sambrook, J. et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboraíory Manual", Cold Spring Harbor Laboraíory Press o Ausubel, F.M. eí al., 1994, "Currení Proíocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons. Ejemplo 13 Identificación de genes homólogos al analizar las bibliotecas de expresión con anticuerpos Los clones de c-DNA se pueden usar para obtener proíeínas recombinaníes, por ejemplo en E. coli (p. ej., el sisíema Qiagen QIAexpress pQE). Las proíeínas recombínaníes luego se purificaron por afinidad mediante cromatografía de afinidad Ni- NTA (Qiagen). Las proíeínas recombínaníes luego se usaron para producir aníicuerpos específicos, por ejemplo al usar técnicas estándar para la inmunización de conejos. Los anticuerpos se purificaron por afinidad con una columna estándar de Ni-NTA saturada con el antígeno recombínante tal como se describe en Gu et al., 1994, BioTechniques 17:257-262. El aníicuerpo se puede usar para analizar las bibliotecas de expresión de cADN a fin de identificar los genes homólogos o heterólogos mediante análisis inmunológico (Sambrook, J. et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboraíory Manual", Cold Spring Harbor Laboraíory Press o Ausubel, F.M. eí al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons). Ejemplo 14 Mutagénesis in vivo La mutagénesis in vivo de microorganismos se puede realizar por pasaje de ADN plásmido (u oíro vector) por E. coli u oíros microorganismos (p. ej., Bacillus spp. o levaduras íales como Saccharomyces cerevisiae) que íienen deíeriorada la capacidad para mantener la integridad de su información genéíica. Las típicas cepas mutadoras íienen mutaciones en los genes para el sisíema de reparación de ADN (p. ej., muíHLS, muíD, muíT, etc.; para referencia, ver Rupp, W.D., 1996, ADN repair mechanisms, en: Escherichia coli and Salmonella, p. 2277-2294, ASM: Washington.) Dichas cepas son bien conocidas por los expertos en el arte. El uso de dichas cepas se ilusíra, por ejemplo, en Greener, A. y Callahan, M., 1994, Síraíegies 7:32-34. La íransferencia de moléculas de ADN mutadas en plantas de preferencia se realiza tras la selección y el análisis en microorganismos. Las plantas íransgénicas se generan de acuerdo con diversos ejemplos dentro de la ejemplificación del presente documento. Ejemplo 15 Análisis in vitro de la función de los genes de Arabidopsis en organismos transgénicos La determinación de las actividades y los parámefros cinéíicos de las enzimas esíá bien esíablecida en el arfe. Los experimentos para determinar la actividad de cualquier enzima alterada dada deben ser ajusfados según la actividad específica de la enzima de tipo salvaje, lo cual es parte de la capacidad de los expertos en el arte. Se pueden hallar generalidades sobre las enzimas en general, además de detalles específicos referidos a esírucíura, cinefica, principios, méíodos, aplicaciones, y ejemplos para la determinación de muchas actividades enzimáíicas, por ejemplo, en las siguientes referencias: Dixon, M., y Webb, E.C., 1979, Enzymes. Longmans: London; Fersht, 1985, Enzyme Strucfure and Mechanism. Freeman: Nueva York; Walsh, 1979, Enzymaíic Reacfion Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L., 1982, Fundameníals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D., ed., 1983, The Enzymes, 3o ed. Academic Press: Nueva York; Bisswanger, H., 1994, Enzymkineíik, 2nd ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Gralil, M., eds., 1983-1986, Mefhods of Enzymatic Analysis, 3o ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; y Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 1987, vol. A9, Enzymes. VCH: Weinheim, p. 352-363. La actividad de las proteínas que se fijan a ADN se puede medir mediante varios métodos bien establecidos, íales como los ensayos de modificación de banda de ADN (íambién denominados ensayos de retardación en gel). El efecto de dichas proteínas sobre la expresión de otras moléculas se puede medir mediante ensayos de genes informadores (tales como el descrito en Kolmar, H. et al., 1995, EMBO J. 14: 3895-3904 y sus referencias). Los sisíemas de pruebas de gen informador son bien conocidos y esíablecidos para aplicaciones en células procarioníes y eucariontes, con enzimas tales como ?-galactosidasa, proteína fluorescente verde, y varios oíros. La determinación de la acíividad de las proteínas de transporte de membrana se puede realizar de acuerdo con técnicas íales como las descriías en Gennis, R.B., 1989, Pores, Channels and Transporters, en Biomembranes, Molecular Sfructure and Funtion, pp. 85-137, 199-234 y 270-322, Springer: Heídelberg. Ejemplo 16 Purificación del producto deseado a partir de organismos transformados La recuperación del producío deseado a partir de material vegeíal, hongos, algas, ciliados, células de C. glutamicum, u oirás células bacíerianas íransformadas por las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la preseníe, o el sobrenadaníe de los cultivos antes descrito se puede realizar por diversos méíodos bien conocidos en el arte. Si el producío deseado no se secreta por las células, se pueden cosechar las células del culíivo por cenírifugaclón a baja velocidad, y se pueden lisar por técnicas estándar tales como fuerza mecánica o sonicación. Los órganos de ias plantas se pueden separar por medios mecánicos de oíros lejidos y órganos. Tras la homogenización se retiran los restos celulares por centrifugación, y la fracción sobrenadante que contiene las proteínas solubles se mantiene para la ulterior purificación del compuesío deseado. Si el producío es secretado de las células deseadas, entonces las células se exíraen del culíivo por cenírifugación a baja velocidad, y la fracción sobrenadaníe se retiene para la ulterior purificación. La fracción sobrenadaníe de cualquier méíodo de purificación se sometió a cromaíografía con una resina adecuada, en donde la molécula deseada es retenida en una resina de cromaíografía, mientras que muchas de las impurezas de la muestra no lo son, o cuando las impurezas son retenidas, pero la muesfra no lo es. Dichos pasos de cromaíografía se pueden repetir según necesidad, mediante las mismas resinas de cromatografía u otras diferentes. Un experto en el arte esíá versado en la selección de adecuadas resinas de cromaíografía y en su aplicación más eficaz para purificar una molécula particular. El producto purificado se puede concentrar por filtración o ultrafilfración, y almacenar a una femperaíura en la cual se maximiza la estabilidad del producto. Exisíe una amplia variedad de méíodos de purificación conocidos en ei arte y el méíodo precedente de purificación no pretende ser limitante. Dichas téncias de purificación se describen, por ejemplo, en Bailey, J.E. & Ollis, 1986, D.F. Biochemical Engineering Fundamentáis, McGraw-Hill: New York. Además, se pueden evaluar la identidad y la pureza de los compuestos aislados por técnicas estándar en el arte. Estas incluyen cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), métodos especíroscópicos, méíodos de tinción, cromatografía en capa fina, NIRS, ensayo enzimático, o microbiológicamente. Dichos métodos de análisis se revisan en: Patek et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al., 1996, Biotekhnologiya 1 :27-32; y Schmidt eí al., 1998, Bioprocess Engineer. 19:67-70; Ulmann's Encyclopedia of Indusírial Chemisíry, 1996, vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p. 540-547, p. 559-566, 575-581 , y p. 581-587; Michal, G., 1999, Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley y Sons; Fallón, A. et al., 1987, Applications of HPLC in Biochemisíry en: Laboratory Techniques in Biochemlstry and Molecular Biology, vol. 17. Ejemplo 17 Análisis de tolerancia salina Pruebas salinas en placa de MS Las semillas germinadas se transfieren a papel de filtro empapado en Y2 MS y se colocan en /2 MS 0,6% de agar suplementado con 2 ug/ml de benomilo la noche antes del análisis de esírés. Para el análisis de estrés se desplaza el papel de filtro con las semillas germinadas a pilas de papel de filtro estéril, empapado en 50 mM de NaCI, en una placa de Peíri. Después de dos horas, el papel de filíro con las semillas germinadas se mueven a pilas de papel de filtro, empapadas en 200 mM de NaCI, en una placa de Petri. Tras dos horas, el papel de filtro con las semillas germinadas se mueve a pilas de papel de filtro estéril empapadas en 600 mM de NaCI, en una placa de Petri. Después de 10 horas, se mueve la semilla germinada a placas de Petri que contienen Vz MS 0,6% de agar suplementado con 2 ug/ml de benomilo. Las semillas germinadas se califican después de 5 días, lo cual demuesíra que la expresión transgénica confiere tolerancia salina. Prueba en tierra de íolerancia salina Las semillas de las plantas a analizar se esterilizaron (100% de blanqueador, 0,1 % de TrifonX duraníe cinco minuíos dos veces y se enjuagaron cinco veces con ddH2O). Las semillas se sembraron en placa en medio no selectivo (1/2 MS, 0,6% de Phyagar, 0,5 g/L de MES, 1 % de sacarosa, 2 µg/ml de benamilo). Las semillas se dejaron germinar durante aproximadameníe diez días. En el estadio de 4-5 hojas, las plantas transgénicas se sembraron en macetas de 5,5 cm de diámetro llenos de fierra suelía (Metromix 360, Scotts) humedecida con 1 g/L 20-20-20 de fertilizante (Peíers Professional, Scoíís). Se dejaron crecer las plañías (22°C, luz continua) durante aproximadamente siete días, con riego según necesidad. Cuando las plantas estaban por brotar se retiró el agua de la bandeja y se Inició el ensayo. Para comenzar con el ensayo se agregaron tres litros de 100 mM de NaCI y 1/8 MS a la bandeja debajo de las macetas. En la bandeja que contenía las plantas confrol se agregaron íres lifros de 1/8 MS. Después de 10 días, las plantes íraíadas con NaCI y las plañías conírol recibieron agua. Luego de diez días se fotografiaron las plantas. Ejemplo 18 Análisis de la tolerancia a sequía Semillas germinadas T1 y T2 se íransfirieron a papel de filtro seco estéril en una placa de Petri y se dejaron secar durante dos horas a 80% RH (humedad relativa) en un gabinete de crecimienío Sanyo MLR-350H, micromols-'' m2 (luz blanca; íubo fluorescente Philips TL 65W/25). Luego se redujo RH al 60% y las semillas se secaron durante otras ocho horas, las semillas luego se retiraron y se colocaron en placas de agar Vz MS 0,6% suplementadas con 2 µg/ml de benomllo se calificaron después de cinco días. Las plantas transgénicas se analizaron por su mejor tolerancia a la sequía, lo cual demuestra que la expresión transgénica confiere tolerancia a sequía. Ejemplo 19 Análisis de la tolerancia a la congelación Las semillas germinadas se llevan a placas de Petri que contienen Vz MS de 0,6% de agar suplementado con 2% de sacarosa y 2 ug/ml de benomilo. Después de cuaíro días, las semillas se incubaron a +4°C durante 1 hora y luego se cubrieron con hielo picado. Las semillas germinadas luego se colocaron en la cámara ambiental Specialist ES2000 y se incubaron durante 3,5 horas comenzando con-1 ,0°C y con descensos de-1°C hora. Las semillas germinadas luego se incubaron a -5,0°C duraníe 24 horas y luego se descongelaron a +5°C duraníe 12 horas. El agua se vuelca y las semillas germinadas se calificaron iras 5 días. Las plantas transgénicas se analizan para determinar su mayor tolerancia al frío, lo cual demuestra que la expresión del transgén confiere tolerancia al frío..

Claims

REIVINDICACIONES . Una planta de cultivo transgénica transformada por un ácido nucleico aislado, caracterizada porque el ácido nucleico comprende un polínucleótido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido con una secuencia como la esíablecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 ; b) un polinucleótido que codifica un polipéptido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO íal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1 ; c) un polinucleóíido con al menos 70% de identidad de secuencia con un polinucleóíido con una secuencia como la esíablecida en cualquiera de las SEQ ID NO íal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 ; d) un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 70% de ideníidad de secuencia con un polipépíido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1 ; y e) un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas al complemento de cualquiera de los polinucieótldos de a) a d) anteriores.
2. La plante de cultivo transgénica de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque la expresión del polinucleófido en la plante da por resulíado un aumento del rendimiento en condiciones normales o de estrés, comparado con la variedad de tipo salvaje de la plante.
3. La plante de cultivo íransgénica de acuerdo con la reivindicación , caracterizada porque la expresión del pollnucleóíido en la plañía da por resulíado un aumenío de íolerancia a esírés ante un estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta.
4. La planta de cultivo transgénica de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque la expresión de I pollnucleótido en la planta da por resultado u aumenío de crecimiento de la raíz en condiciones normales o de estrés, comparado con la variedad de tipo salvaje de la plañía.
5. La planta de cultivo transgénica de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque la planta es una monocotiledónea.
6. La planta de cultivo transgénica de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque la planta es una dicotiledónea.
7. La planta de culíivo íransgénica de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque la plante se selecciona del grupo que consiste en maíz, írigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, sorgo, mijo, caña de azúcar, poroío de soja, maní, algodón, colza, cañóla, mandioca, pimienío, girasol, íageíes, plantas solanáceas, papa, tabaco, berenjena, tomate, especies Vicia, arveja, alfalfa, café, cacao, té, especies de Salix, palmera aceitera, coco, pastos perennes y una planta de cultivo de forraje.
8. La planta de cultivo transgénica de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque la plañía es una plante eníera, una célula vegeíal, una paríe de planta, o una semilla vegetal.
9. Una semilla de planta de cultivo producida por la planta de cultivo transgénica de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque la semilla comprende el ácido nucleico aislado.
10. La semilla de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada porque la semilla es culíivo verdadero para el aumenío del rendimiento en condiciones normales o de estrés, comparado con la variedad de tipo salvaje de la semilla.
11. La semilla de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada porque la semilla es cultivo verdadero para el aumenío de íolerancia a esírés con un estrés ambiental, comparado con la variedad de tipo salvaje de la semilla.
12. La semilla de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada porque la semilla es cultivo verdadero para un aumento de crecimienío de la raíz en condiciones normales o de estrés, comparado con la variedad de tipo salvaje de la semilla.
13. Un méíodo para producir una plañía de culíivo íransgénica que coníiene un ácido nucleico aislado que codifica un polipépíido, caracterizado porque comprende los pasos de la íransformación de una célula vegetal con un vecíor de expresión que comprende el ácido nucleico, y la generación a partir de una célula vegetal de la planta transgénica que expresa ei polipéptido, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consisíe en: f) un polinucleóíido con una secuencia como la esíablecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1; g) un polinucleóíido que codifica un polipépíido con una secuencia como la esíablecida en cualquiera de las SEQ ID NO fal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1 ; h) un polinucleóíido con al menos 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido con una secuencia como la esíablecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1 ; i) un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 70% de identidad de secuencia con un polipéptido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1 ; y j) un pollnucleótldo que se hibrida en condiciones rigurosas al complemento de cualquiera de los polinucleóíidos de sequía de a) a d) anteriores.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque la expresión del polinucleótido en la plante da por resulfado un aumenío del rendimienío en condiciones normales o de estrés comparado con la variedad de tipo salvaje de la plante.
15. El méíodo de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque la expresión del polinucleóíido en la planta da por resulíado aumenío de íolerancia a esírés ante un estrés ambiental comparado con la variedad de tipo salvaje de la planta.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque la expresión del polinucleótido en la planta da por resultado un aumento de crecimiento de la raíz en condiciones normales o de estrés, comparado con la variedad de íipo salvaje de la plante.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque la planta de cultivo es una monocoíiledónea.
18. El méíodo de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque la planta de cultivo una dicotiledónea.
19. El méíodo de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque la plañía de cultivo es seleccionada del grupo que consiste en maíz, trigo, centeno, avena, triíicale, arroz, cebada, sorgo, mijo, caña de azúcar, poroto de soja, maní, algodón, colza, cañóla, mandioca, pimiento, girasol, íageíes, plantas solanáceas, papa, labaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, arveja, alfalfa, café, cacao, té, especies de Salix, aceite de palma, coco, pastos perennes y una planta de cultivo forrajera.
20. El método de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque el ácido nucleico comprende un polinucleótido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1.
21. El método de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque el ácido nucleico comprende un polinucleótido con al menos 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1.
22. El método de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N.° 3 de la Tabla 1.
23. El método de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque el ácido nucleico comprende un pollnucleótldo que codifica un polipéptido con al menos 70% de idenlidad de secuencia con un polipéptido con una secuencia como la establecida en cualquiera de las SEQ ID NO tal como se provee en la Columna N.° 4 de la Tabla 1.
24. El método de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque el ácido nucleico esíá ligado operativamente a una o más secuencias reguladoras.
25. El méíodo de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizado porque la secuencia reguladora es un promoíor. 26 El méíodo de acuerdo con la reivindicación 25, caracterizado porque el promotor es específico de íejido. 27. El méíodo de acuerdo con la reivindicación 25, caracterizado porque el promoíor esíá regulado por el desarrollo.