MX2008000001A

MX2008000001A - Empleo de celulas madre del estroma derivadas de tejido adiposo en el tratamiento de la fistula

Info

Publication number: MX2008000001A
Application number: MX/A/2008/000001A
Authority: MX
Inventors: Gema Fernandez Miguel Maria; Angel Gonzalez De La Pena Manuel; Ana Garcia Castro Rosa; Garcia Arranz Mariano; Garcia Olmo Damian
Original assignee: Cellerix Sl
Priority date: 2005-06-24
Filing date: 2007-12-19
Publication date: 2008-09-02

Abstract

Se proveen métodos y composiciones para el empleo de células madre del estroma derivadas de tejido adiposo en el tratamiento de la fístula.

Description

EMPLEO DE CÉLULAS MADRE DEL ESTROMA DERIVADAS DE TEJIDO ADIPOSO EN EL TRATAMIENTO DE LA FÍSTULA DESCRIPCIÓN Referencia cruzada con solicitudes relacionadas Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente estadounidense número 11/065.461 , presentada el 25 de febrero de 2005, y una continuación en parte de la solicitud de patente estadounidense número 11/056.241 , presentada el 14 de febrero de 2005, incorporándose específicamente en el presente documento el contenido de dichas solicitudes mediante referencia en su totalidad.

Antecedentes de la invención Generalmente, una fístula es una conexión o conducto anómalo entre órganos o vasos que normalmente no están conectados. Pueden desarrollarse fístulas en diversas partes del cuerpo. Por ejemplo, tipos de fístulas, nombradas por las zonas del cuerpo en las que se producen, incluyen fístula anorrectal o fístula del ano o fístula fecal (entre el recto u otra zona anorrectal y la superficie de la piel), fístula arteriovenosa o fístula A-V (entre una arteria y una vena), fístula biliar (entre las vías biliares con la superficie de la piel, a menudo provocada por cirugía de la vesícula biliar), fístula del cuello uterino (abertura anómala del cuello uterino), fístula craniosinus (entre el espacio intracraneal y un seno paranasal), fístula enteroentérica (entre dos partes del intestino), fístula enterocutánea (entre el intestino y la superficie de la piel, concretamente desde el duodeno o el yeyuno o el íleo), fístula enterovaginal (entre el intestino y la vagina), fístula gástrica (entre el estómago con la superficie de la piel), fístula metroperitoneal (entre el útero y la cavidad peritoneal), fístula perilinfática (un desgarro entre las membranas entre los oídos medio e interno), fístula arteriovenosa pulmonar (entre una arteria y una vena de los pulmones, que da como resultado una derivación de la sangre), fístula rectovaginal (entre el recto y la vagina), fístula umbilical (entre el umbilicus y el intestino), fístula traqueoesofágica (entre las vías respiratorias y alimenticias) y fístula vesicovaginal (entre la vejiga y la vagina). Las causas de las fístulas incluyen traumatismo, complicaciones por tratamiento médico y enfermedad. El tratamiento para fístulas varía dependiendo de la causa y el grado de la fístula, pero generalmente implica la intervención quirúrgica. Comúnmente se usan diversos procedimientos quirúrgicos, lo más comúnmente fistulotomía, colocación de un sedal (un cordón que se hace pasar a través del conducto de la fístula para mantenerlo abierto para drenarlo), o un procedimiento del colgajo endorrectal (en el que se extrae tejido sano del lado interno de la fístula evitar que las heces u otro material reinfecte el canal). La cirugía para fístulas anorrectales no carece de efectos secundarios, incluyendo recaída, reinfección e incontinencia. Las enfermedades inflamatorias del intestino, tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, son las principales causas de fístulas anorrectal, enteroentérica y enterocutánea. La incidencia notificada de fístula en la enfermedad de Crohn oscila desde el 17% hasta el 50%. El tratamiento de fístulas en pacientes con enfermedad de Crohn sigue presentando un problema extremadamente complejo ya que muchas de tales fístulas no responden a los tratamientos disponibles. Tales fístulas y su recaída son una complicación muy angustiosa que reduce significativamente la calidad de vida de los pacientes afectados. Recientes mejoras en el tratamiento médico (por ejemplo, tratamiento con Infliximab®) y el tratamiento quirúrgico experto han reducido la necesidad de cirugía complicada. Sin embargo, muchos pacientes no se curan. El fracaso en la curación de fístulas se debe probablemente a la calidad inferior a la óptima de los tejidos que se han visto afectados por la enfermedad de Crohn. De hecho, las fístulas por enfermedad de Crohn proporcionan un sistema modelo para la cicatrización de heridas en algunas de las peores condiciones posibles. Otra causa principal de las fístulas es el traumatismo, por ejemplo por violación, o por lesiones experimentadas durante el parto, en los tejidos de la vagina y la vejiga y/o el recto que conducen a fístula rectovaginal y fístula vesicovaginal. Cada año aproximadamente 100.000 en los países en vías de desarrollo experimentan tales fístulas (también conocidas como fístulas obstétricas) durante el parto obstruido. Durante el parto obstruido, la presión de la cabeza del bebé contra la pelvis de la madre corta el suministro de sangre a tejidos delicados de la zona. El tejido muerto se cae y la mujer se queda con una fístula vesicovaginal y a veces una fístula rectovaginal. Este orificio da como resultado incontinencia permanente de orina y/o heces. El Fondo de Población de las Naciones Unidas (UNFPA) estima la población mundial de personas que padecen fístula obstétrica en más de dos millones. Este cálculo puede ser una subestimación significativa. Las tasas de éxito para la curación quirúrgica primaria oscilan desde el 88 hasta el 93 por ciento pero disminuyen con intentos sucesivos. Por tanto, un porcentaje significativo de mujeres tienen fístulas obstétricas que no pueden curarse mediante cirugía. Se necesitan nuevas terapias para las fístulas.

Sumario de la invención En el presente documento se proporcionan, entre otras cosas, composiciones novedosas que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo. Las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo descritas en el presente documento tienen un fenotipo diferenciado y muestran una mayor homogeneidad de fenotipo que las composiciones de células madre del estroma derivadas de tejido adiposo previamente descritas, haciéndolas así más adecuadas para su uso en el tratamiento de fístulas y heridas que las composiciones previamente descritas. Las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo pueden formularse con disoluciones u otras sustancias para servir como productos farmacéuticos o dispositivos médicos, por ejemplo, como suturas o adhesivos. Además, se proporcionan métodos novedosos de tratamiento de fístulas y heridas usando células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, así como kits para la puesta en práctica de los mismos. Estas realizaciones de la presente invención, otras realizaciones, y sus rasgos y características resultarán evidentes a partir de la descripción, los dibujos y las reivindicaciones que siguen.

Breve descripción de las figuras La figura 1 representa los resultados de la caracterización de células aisladas mediante los métodos del ejemplo 1 mediante tinción con inmunofluorescencia. La frecuencia de células inmunopositivas se indica tal como sigue: -, menos del 5%; +/-, 6-15%; +, 16-50%; ++, 51-85%; y +++, 86-100%. P, número de pase. La figura 2 representa la caracterización por inmunofluorescencia indirecta de células madre del estroma derivadas de tejido adiposo. Las células del paciente n° 001 se hicieron pasar 6 células después del implante no. 6. El color azul indica núcleos teñidos con DAPI. (A) CD90; (B) c-Kit; y (C) vimentina. La figura 3 resume los resultados clínicos obtenidos usando ciertos métodos y composiciones de la invención. M, mujer; H, hombre; NI, ningún implante; NA, no analizado. La figura 4 representa curvas de crecimiento de células derivadas de lipoaspirado a diferentes concentraciones de FBS (0,5, 2,5 y 10%, según se indica). Se cultivaron fibroblastos sinoviales humanos en presencia o bien del 5% o bien del 10% de FBS. Se muestran los números de células ± DE en términos de absorbancia a 595 nm. Los datos son de un experimento representativo con pocilios por triplicado. La figura 5 representa la ampolla en la mucosa rectal tras haber inyectado las células cerca de la abertura interna cerrada con sutura. La figura 6 representa fotografías de una fístula antes (A) y ocho semanas después (B) de la inyección de células. La figura 7A representa histogramas de inmunocitometría de fluorescencia correspondientes al perfil de marcadores de superficie (CD3, CD9, CD10, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD28, CD29, CD31 , CD34, CD36, CD38, CD44, CD45, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e y CD49f) obtenidos a partir de células aisladas a partir de muestras de liposucción de un paciente que participa en el estudio, en el pase 6. La figura 7B representa histogramas de inmunocitometría de fluorescencia correspondientes al perfil de marcadores de superficie (CD50 CD51 , CD54, CD55, CD56, CD58, CD59, CD61 , CD62E, CD62L, CD62P, CD90, CD95, CD102, CD104, CD105, CD106, CD133, CD166, glicoforina, ß2 microglobulina, HLA I, HLA II y NGFR) obtenidos a partir de células aisladas a partir de muestras de liposucción de un paciente que participa en el estudio, en el pase 6.

Descripción detallada de la invención 1. Definiciones: Tal como se usa en el presente documento, los siguientes términos y frases tendrán los significados expuestos a continuación. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

Los artículos "un" y "una" se refieren a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento. Por "tejido adiposo" se quiere decir cualquier tejido graso. El tejido adiposo puede ser tejido adiposo marrón o blanco, derivado de sitio de tejido adiposo subcutáneo, omental/visceral, mamario, gonadal u otro. Preferiblemente, el tejido adiposo es tejido adiposo blanco subcutáneo. Tales células pueden comprender un cultivo celular primario o una línea celular inmortalizada. El tejido adiposo puede ser de cualquier organismo que tenga tejido graso. Preferiblemente, el tejido adiposo es de mamífero, lo más preferiblemente el tejido adiposo es humano. Una fuente conveniente de tejido adiposo es de cirugía por liposucción, sin embargo, la fuente de tejido adiposo o el método de aislamiento de tejido adiposo no es crítico para la invención. Si se desean células del estroma para el trasplante autólogo en un sujeto, el tejido adiposo se aislará de ese sujeto. "Células madre del estroma derivadas de tejido adiposo" se refiere a células madre mesenquimatosas que se originan a partir del tejido adiposo. El término "adhesivo" se refiere a cualquier sustancia que une o conecta superficies juntas; por ejemplo, una cola. El término "composición de células" se refiere a una preparación de células, preparación que puede incluir, además de las células, componentes no celulares tales como medio de cultivo celular, por ejemplo proteínas, aminoácidos, ácidos nucleicos, nucleótidos, coenzimas, antioxidantes, metales y similares. Además, la composición de células puede tener componentes que no afectan al crecimiento o viabilidad del componente celular, pero que se usan para proporcionar las células en un formato particular, por ejemplo, como matriz polimérica para encapsulación o una preparación farmacéutica.

El término "cultivo" se refiere a cualquier crecimiento de células, organismos, entidades multicelulares o tejido en un medio. El término "cultivar" se refiere a cualquier método para lograr tal crecimiento, y puede comprender múltiples etapas. El término "cultivar adicionalmente" se refiere a cultivar una célula, organismo, entidad multicelular o tejido hasta una cierta fase de crecimiento, usando entonces otro método de cultivo para llevar dicha célula, organismo, entidad multicelular o tejido a otra fase de crecimiento. Un "cultivo celular" se refiere a un crecimiento de células in vitro. En un cultivo de este tipo, las células proliferan, pero no se organizan en un tejido en sí. Un "cultivo tisular" se refiere al mantenimiento o crecimiento de tejido, por ejemplo, explantes de órgano primordial o de un órgano adulto in vitro de manera que se conserva su arquitectura y función. Un "cultivo en monocapa" se refiere a un cultivo en el que las células se multiplican en un medio adecuado mientras están principalmente unidas entre sí y a un sustrato. Además, un "cultivo en suspensión" se refiere a un cultivo en el que las células se multiplican mientras están suspendidas en un medio adecuado. Igualmente, un "cultivo en flujo continuo" se refiere al cultivo de células o explantes en un flujo continuo de medio fresco para mantener el crecimiento celular, por ejemplo, la viabilidad. El término "medios condicionados" se refiere al sobrenadante, por ejemplo libre de las células/tejido cultivados, que resulta tras un periodo de tiempo en contacto con las células cultivadas de tal manera que los medios se han alterado para incluir ciertos factores de paracrina y/o autocrina producidos por las células y secretados en el cultivo. Un "cultivo confluente" es un cultivo celular en el que todas las células están en contacto y por tanto toda la superficie del vaso de cultivo está cubierta, e implica que las células también han alcanzado su densidad máxima, aunque la confluencia no significa necesariamente que la división dejará de ocurrir o que el tamaño de la población no crecerá.

El término "medio de cultivo" o "medio" se reconoce en la técnica, y generalmente se refiere a cualquier sustancia o preparación usada para el cultivo de células vivas. El término "medio", según se usa con referencia a un cultivo celular, incluye los componentes del entorno que rodea a las células. Los medios pueden ser sólidos, líquidos, gaseosos o una mezcla de fases y materiales. Los medios incluyen medios de crecimiento líquidos así como medios líquidos que no mantienen el crecimiento celular. Los medios también incluyen medios gelatinosos tales como matrices de agar, agarosa, gelatina y colágeno. Los medios gaseosos a modo de ejemplo incluyen la fase gaseosa a la que se exponen células que crecen en una placa petri u otro soporte sólido o semisólido. El término "medio" también se refiere al material previsto para su uso en un cultivo celular, aunque aún no se haya puesto en contacto con las células. En otras palabras, un líquido rico en nutrientes preparado para el cultivo bacteriano es un medio. De manera similar, una mezcla en polvo que cuando se mezcla con agua u otro líquido se vuelve adecuada para el cultivo celular, puede denominarse "medio en polvo". El "medio definido" se refiere a medios que están compuestos por componentes químicamente definidos (habitualmente purificados). Los "medios definidos" no contienen extractos biológicos mal caracterizados tales como extracto de levadura y caldo de ternera. El "medio rico" incluye medios que están diseñados para soportar el crecimiento de la mayor parte o todas las formas viables de una especie particular. Los medios ricos incluyen a menudo extractos biológicos complejos. Un "medio adecuado para el crecimiento de un cultivo de alta densidad" es cualquier medio que permite que un cultivo celular alcance una DO600 de 3 o más cuando otras condiciones (tales como temperatura y velocidad de transferencia de oxígeno) permiten tal crecimiento. El término "medio basal" se refiere a un medio que favorece el crecimiento de muchos tipos de microorganismos que no requieren ningún complemento de nutrientes especial. La mayor parte de los medios básales están generalmente compuestos por cuatro grupos químicos básicos: aminoácidos, hidratos de carbono, sales inorgánicas y vitaminas. Un medio basal sirve generalmente como base para un medio más complejo, al que se añaden complementos tales como suero, tampones, factores de crecimiento, lípidos y similares. Ejemplos de medios básales incluyen, pero no se limitan a, medio basal de Eagle, medio mínimo esencial, medio de Eagle modificado por Dulbecco, medio 199, mezclas de nutrientes F-10 de Ham y F-12 de Ham, 5A de Me Coy, MEM de Dulbecco/F-I 2, RPMI 1640 y medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM). Los términos "comprende" y "que comprende" se usan en el sentido abierto, inclusivo, lo que significa que pueden incluirse elementos adicionales. El término "diferenciación" se refiere a la formación de células que expresan marcadores que se sabe que están asociados con células que están más especializadas y más próximas a convertirse en células diferenciadas de manera terminal incapaces de diferenciación o división adicional. Por ejemplo, en un contexto pancreático, puede observarse diferenciación en la producción de agrupaciones de células de tipo islote que contienen una proporción aumentada de células epiteliales beta que producen cantidades aumentadas de insulina. Los términos diferenciación "adicional" o "mayor" se refieren a células que están más especializadas y más próximas a convertirse en células diferenciadas de manera terminal incapaces de diferenciación o división adicional que las células a partir de las cuales se cultivaron. El término "diferenciación final" se refiere a células que se han convertido en células diferenciadas de manera terminal incapaces de diferenciación o división adicional. El término "fístula" se refiere a cualquier conducto o comunicación o conexión anómala, habitualmente entre dos órganos internos o que conduce desde un órgano interno hasta la superficie del cuerpo. Ejemplos de fístulas incluyen, pero no se limitan a, fístula anorrectal o fístula del ano o fístula fecal, fístula arteriovenosa o fístula A-V, fístula biliar, fístula del cuello uterino, fístula craniosinus, fístula enteroentérica, fístula enterocutánea, fístula enterovaginal, fístula gástrica, fístula metroperitoneal, fístula peri linfática, fístula arteriovenosa pulmonar, fístula rectovaginal, fístula umbilical, fístula traqueoesofágica y fístula vesicovaginal. El término "incluyendo" se usa en el presente documento para referirse a "incluyendo pero sin limitarse a". "Incluyendo" o "incluyendo pero sin limitarse a" se usan de manera intercambiable. "Marcador" se refiere a una molécula biológica cuya presencia, concentración, actividad o estado de fosforilación puede detectarse y usarse para identificar el fenotipo de una célula. Un "parche" es un aposito o cobertura aplicado para cubrir y proteger una herida u otra llaga. Un "paciente", "sujeto" o "huésped" que va a tratarse por el método objeto puede significar o bien un ser humano o bien un animal no humano. La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que, dentro del alcance del criterio médico sensato, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una razón de beneficio/riesgo razonable. La frase "vehículo farmacéuticamente aceptable" según se usa en el presente documento significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente o disolvente que encapsula el material, que participa en llevar o transportar el compuesto objeto desde un órgano, o parte del cuerpo, a otro órgano o parte del cuerpo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la formulación y no provocar lesiones al paciente. El término "fenotipo" se refiere a las características observables de una célula, tales como tamaño, morfología, expresión de proteínas, etc. El término "célula progenitora" se refiere a una célula que tiene la capacidad de crear una progenie que está más diferenciada que ella misma. Por ejemplo, el término puede referirse a una célula sin diferenciar o una célula diferenciada en un grado pequeño de diferenciación final que puede proliferar y dar lugar a más células progenitoras que tienen la capacidad de generar un gran número de células madre que a su vez pueden dar lugar a células hija diferenciadas o diferenciables. En una realización preferida, el término célula progenitora se refiere a una célula madre generalizada cuyos descendientes (progenie) se especializan, a menudo en direcciones diferentes, mediante diferenciación, por ejemplo, adquiriendo caracteres completamente individuales, tal como ocurre en la diversificación progresiva de tejidos y células embrionarios. La diferenciación celular es un proceso complejo que se produce normalmente a través de muchas divisiones celulares. Una célula diferenciada puede derivar de una célula multipotente que se deriva ella misma de una célula multipotente, etcétera. Aunque cada una de estas células multipotentes puede considerarse célula madre, el intervalo de tipos celulares al que puede dar lugar cada una puede variar considerablemente. Algunas células diferenciadas también pueden tener la capacidad de dar lugar a células con mayor potencial de desarrollo. Tal capacidad puede ser natural o puede inducirse artificialmente con el tratamiento con diversos factores. Mediante esta definición, las células madre también pueden ser células progenitoras, así como los precursores más inmediatos de células diferenciadas de manera terminal.

La "proliferación" se refiere a un aumento en el número de células. "Que prolifera" y "proliferación" se refiere a células que experimentan mitosis. Tal como se usa en el presente documento, el término "disolución" incluye un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en el que las células de la invención siguen siendo viables. El término "sustancialmente puro", con respecto a poblaciones de células madre derivadas de tejido adiposo, se refiere a una población de células madre derivadas de tejido adiposo que es pura en al menos aproximadamente el 75%, preferiblemente al menos aproximadamente el 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, con respecto a células madre del estroma derivadas de tejido adiposo que constituyen una población celular total. Reestructurando, el término "sustancialmente puro" se refiere a una población de células madre del estroma derivadas de tejido adiposo de la presente invención que contiene menos de aproximadamente el 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, lo más preferiblemente menos de aproximadamente el 5%, de células dirigidas a un linaje en la población original aislada y sin amplificar antes del posterior cultivo y amplificación.

"Soporte" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier dispositivo o material que puede servir como base o matriz para el crecimiento de células madre del estroma derivadas de tejido adiposo.

El término "sutura" se refiere a hilo o fibra u otro material de sujeción que puede usarse para coser una herida. El término "tratar" tal como se usa en el presente documento se refiere a reparar una fístula o herida, así como evitar que una fístula o herida empeore o recaiga. "Agente terapéutico" o "compuesto terapéutico" se refiere a un agente que puede tener un efecto biológico deseado en un huésped. Los agentes quimioterapéuticos y genotóxicos son ejemplos de agentes terapéuticos que se sabe generalmente que son de origen químico, como opuesto al biológico, o que provocan un efecto terapéutico mediante un mecanismo de acción particular, respectivamente. Ejemplos de agentes terapéuticos de origen biológico incluyen factores de crecimiento, hormonas y citocinas. En la técnica se conoce una variedad de agentes terapéuticos y pueden identificarse por sus efectos. Ciertos agentes terapéuticos pueden regular la proliferación y diferenciación celular. Los ejemplos incluyen nucleótidos, fármacos, hormonas, proteínas no específicas (no anticuerpos), oligonucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido que se unen a una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencia de ARNm)), péptidos y peptidomiméticos quimioterapéuticos. Una "herida" es una lesión o daño al tejido, provocada por medios físicos, que provoca la alteración de la continuidad normal del tejido. 2. Composiciones novedosas que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo En un aspecto, la invención se refiere a composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo con ciertas características, tales como un fenotipo particular. Por ejemplo, las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo en una composición de células de la invención pueden caracterizarse por la expresión de marcador de superficie celular, tamaño, consumo de glucosa, producción de lactato y rendimiento/viabilidad celular. Aún otro aspecto de la presente invención se refiere a composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo que incluyen, como componente celular, preparaciones sustancialmente puras de células madre del estroma derivadas de tejido adiposo que tienen un fenotipo particular, o la progenie de las mismas. Las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo de la presente invención incluyen no sólo poblaciones sustancialmente puras de las células progenitoras, sino que también pueden incluir componentes de cultivo celular, por ejemplo, medios de cultivo que incluyen aminoácidos, metales, factores de coenzimas, así como pequeñas poblaciones de otras células del estroma, por ejemplo, algunas de las cuales pueden surgir mediante la diferenciación posterior de las células de la invención. Además, otros componentes no celulares pueden incluir los que hacen que el componente celular sea adecuado para el soporte en circunstancias particulares, por ejemplo, implantación, por ejemplo, cultivo continuo, o adecuado para su uso como biomaterial o composición farmacéutica. En ciertas realizaciones, las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo se producen mediante los métodos de cultivo descritos en la sección 4 y los ejemplos. En una realización, se proporciona una composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, en la que al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% o preferiblemente al menos aproximadamente el 96%, 97%, 98% o el 99% de las células madre expresan los marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51 , CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y/o CD105. En ciertas realizaciones de las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, menos de aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 5% y de manera preferible aproximadamente el 4%, 3%, 2% o el 1% de las células madre expresan los marcadores CD34, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31 , CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y/o CD133.

En otra realización, se proporciona una composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, en la que al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% o preferiblemente al menos aproximadamente el 96%, 97%, 98% o el 99% de las células madre expresan los marcadores c-Kit, vimentina y/o CD90. En ciertas realizaciones de las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, menos de aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 5% y de manera preferible aproximadamente el 4%, 3%, 2% o el 1% de las células madre expresan los marcadores CD34, factor VIII, alfa-actina, desmina, S-100 y/o queratina. También se proporciona una población de células madre del estroma derivadas de tejido adiposo que expresan los marcadores c-Kit, vimentina y CD90 y que no expresan los marcadores CD34, factor VIII, alfa-actina, desmina, S-100 y queratina. La caracterización fenotípica de una población de células mediante marcadores de superficie puede realizarse o bien mediante tinción individual de las células (citometría de flujo) o preparando cortes histológicos de la población in situ, realizado de acuerdo con métodos normales. La determinación del perfil de expresión de los marcadores de superficie por anticuerpos, caracterización de inmunofenotipo, puede ser directa, usando un anticuerpo marcado, o indirecta, usando un segundo anticuerpo marcado frente al anticuerpo específico primario del marcador celular, logrando así una amplificación de la señal. Por otra parte, la presencia o ausencia de la unión al anticuerpo puede determinarse mediante métodos diferentes que incluyen, pero no se limitan a, microscopía de inmunofluorescencia y radiografía. De manera similar, es posible llevar a cabo la monitorización de los niveles de unión del anticuerpo mediante citometría de flujo, una técnica que permite correlacionar los niveles de fluorocromo con la cantidad de antígenos presente en la superficie de la célula unidos específicamente a los anticuerpos marcados. La expresión diferencial de una serie de marcadores de superficie en una población de células proporciona un método para la identificación y aislamiento de dicha población. En ciertas realizaciones, las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo son suspensiones de células madre del estroma derivadas de tejido adiposo en diversas disoluciones o materiales, por ejemplo para su uso como productos farmacéuticos o biomateriales, tal como se describe con mayor detalle a continuación. En una realización, la composición objeto de células comprende una suspensión de las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo en disolución de Ringer y HSA. En otra realización, la composición de células comprende una suspensión de las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo objeto en un material, tal como un polímero, cola, gel, etc. Tales suspensiones pueden prepararse, por ejemplo, separando mediante sedimentación las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo objeto del medio de cultivo y volviendo a suspenderlas en la disolución o material deseado. Las células pueden separarse mediante sedimentación y/o cambio del medio de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación, filtración, ultrafiltración, etc.

La concentración de las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo objeto en las composiciones objeto que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo puede ser de al menos aproximadamente 5 x 106 células/ml, al menos aproximadamente 10 x 106 células/ml, al menos aproximadamente 20 x 106 células/ml, al menos aproximadamente 30 x 106 células/ml o al menos aproximadamente 40 x 106 células/ml.

En consecuencia, otro aspecto de la presente invención se refiere a la progenie de las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo objeto, por ejemplo aquellas células que se han derivado de las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo. Tal progenie puede incluir generaciones posteriores de células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, así como células dirigidas al linaje generadas induciendo la diferenciación de las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo objeto tras su aislamiento a partir del explante, por ejemplo, inducida in vitro. En ciertas realizaciones, las células de la progenie se obtienen tras aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9 o aproximadamente 10 pases a partir de la población original. Sin embargo, las células de la progenie pueden obtenerse tras cualquier número de pases a partir de la población original. En ciertas realizaciones, las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo de la invención se proporcionarán como parte de una preparación farmacéutica, por ejemplo, una preparación estéril, libre de la presencia de virus, bacterias y otros patógenos no deseados, así como libre de pirógenos. Es decir, para la administración a seres humanos, las composiciones objeto deben cumplir normas de esterilidad, pirogenicidad, así como de pureza y seguridad general requeridas por las normas de la Oficina de Productos Biológicos de la FDA. En ciertas realizaciones, tales composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo pueden usarse para el trasplante en animales, preferiblemente mamíferos, e incluso más preferiblemente seres humanos. Las células pueden ser preferiblemente autólogas, pero también alogénicas o xenogénicas con respecto al huésped del trasplante. Debido a dificultades para obtener suficientes células madre autólogas, las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo de donantes alogénicos pueden constituir una fuente alternativa valiosa de células madre para uso terapéutico. En la técnica se sabe que las células madre del estroma de médula ósea y células del estroma derivadas de tejido adiposo no provocan una respuesta de linfocitos alogénicos in vitro y en consecuencia, las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo alogénicas derivadas de un donante pueden usarse teóricamente para cualquier paciente, independientemente de la incompatibilidad de MHC. Métodos de administración de las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo a sujetos, particularmente sujetos humanos, que se describen en detalle en el presente documento, incluyen inyección o implantación de las células en sitios diana en los sujetos, las células pueden insertarse en un dispositivo de administración que facilita la introducción, mediante inyección o implantación, de las células en los sujetos. Tales dispositivos de administración incluyen tubos, por ejemplo, catéteres, para inyectar células y fluidos en el cuerpo de un sujeto receptor. En una realización preferida, los tubos tienen adicionalmente una aguja, por ejemplo, una jeringuilla, mediante la cual pueden introducirse las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo en el sujeto en una ubicación deseada. Las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo pueden insertarse en un dispositivo de administración de este tipo, por ejemplo, una jeringuilla, de diferentes formas. Por ejemplo, las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo incluyen composiciones de células madre del estroma derivadas de tejido adiposo que se suspenden en una disolución o se incrustan en una matriz de soporte cuando están contenidas en un dispositivo de administración de este tipo.

- - Vehículos y diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina, disoluciones tampón acuosas, disolventes y/o medios de dispersión. El uso de tales vehículos y diluyentes se conoce bien en la técnica. La disolución es preferiblemente estéril y fluida en la medida en que existe fácil jeringabilidad. Preferiblemente, la disolución es estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se protege frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos mediante el uso de, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. Pueden prepararse disoluciones que son composiciones de células madre del estroma derivadas de tejido adiposo de la invención incorporando células madre del estroma derivadas de tejido adiposo tal cómo se describen en el presente documento en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y, según se requiera, otros componentes enumerados anteriormente, seguido por una esterilización por filtración. Algunos ejemplos de materiales y disoluciones que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptable incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa, y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de semilla de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) esteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) disolución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) disoluciones con pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas. En ciertas realizaciones, las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo comprenden además un adhesivo. En ciertas realizaciones, el adhesivo es un adhesivo a base de fibrina, tal como un gel de fibrina o cola de fibrina o adhesivo o polímero a base de fibrina, u otro adhesivo de tejido o cola quirúrgica, tal como, por ejemplo, cianoacrilato, colágeno, trombina y polietilenglicol. Otros materiales que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, alginato de calcio, agarosa, tipos I, II, IV u otras isoformas de colágeno, poli(ácido láctico)/poli(ácido glicólico), derivados de hialuronato u otros materiales (Perka C. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:305-311 ; Sechriest VF. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:534-541 ; Chu CR ef al. (1995) J. Biomed. Mater. Res. 29:1147-1154; Hendrickson DA et al. (1994) Orthop. Res. 12:485-497). En otras realizaciones, el adhesivo es un vendaje líquido, en el que las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo del método se mezclan con el material de vendaje líquido. Un "vendaje líquido" es una disolución que comprende un compuesto, por ejemplo un material polimérico, que se aplica a una herida con un pulverizador o un cepillo, seguido por la eliminación del disolvente mediante evaporación para proporcionar una capa protectora sobre la herida. En el presente documento también se proporcionan métodos para preparar composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo que comprenden compuestos o materiales para su uso en la reparación de fístulas o heridas. En una realización, un método de preparación de tales materiales comprende suspender las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo de una composición objeto de células con el material. En una realización, las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo se separan mediante sedimentación del medio de cultivo y se resuspenden en un gel o cola de fibrina. Las colas y geles de fibrina y otros adhesivos y polímeros a base de fibrina se conocen bien en la técnica y están comercialmente disponibles. Por ejemplo, un kit de cola de fibrina comercialmente disponible es Tissucol® Dúo 2.0, y otros sellantes de fibrina comercialmente disponibles incluyen Crosseal®, TISSEEL VH Fibrin Sealant®, y similares. Las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo de la invención también pueden usarse para recubrir un soporte, por ejemplo un dispositivo médico. Por ejemplo, el soporte puede ser una sutura, hilo, dispositivo de reparación de meniscos, remache, tachuela, grapa, tornillo, placa ósea, sistema de placas óseas, malla quirúrgica, parche, por ejemplo un parche de reparación, parche cardiovascular o parche pericardíaco, cabestrillo, clavo ortopédico, barrera de adhesión, endoprótesis, dispositivo de reparación/regeneración de tejido guiado, dispositivo de reparación de cartílago articular, guía nerviosa, dispositivo de reparación de tendones, dispositivo de reparación de defectos de tabique auricular, agente de relleno o carga, válvula de la vena, estructura de médula ósea, dispositivo de regeneración del menisco, injerto de ligamento y tendón, implante de células oculares, jaula de fusión espinal, sustituto cutáneo, sustituto dural, sustituto de injerto óseo, clavija ósea, aposito para heridas, cola, polímero o pinza hemostática. Los soportes en los que las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo pueden incorporarse o incrustarse o sobre los que las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo pueden recubrirse incluyen matrices que son compatibles con el receptor y que se degradan para dar productos que no son perjudiciales para el receptor. Matrices biodegradables naturales y/o sintéticas son ejemplos de tales matrices.

Matrices biodegradables naturales incluyen coágulos plasmáticos, por ejemplo, derivados de un mamífero, y matrices de colágeno. Matrices biodegradables sintéticas incluyen polímeros sintéticos tales como polianhídridos, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Otros ejemplos de polímeros sintéticos y métodos de incorporación o incrustación de células en esas matrices se conocen en la técnica. Véase por ejemplo, la patente estadounidense número 4.298.002 y la patente estadounidense número 5.308.701. Estas matrices proporcionan soporte y protección para las células frágiles in vivo. El soporte puede recubrirse con células de cualquier manera tal como conoce un experto en la técnica, por ejemplo, mediante empapado, pulverización, pintado, impresión, etc. En una realización, el soporte es una sutura, grapa, hilo absorbible, hilo no absorbible, hilo natural, hilo sintético, hilo monofilamentoso o hilo multifilamentoso (también denominado trencillas). Métodos preferidos de preparación de suturas y otros soportes usados para cerrar heridas recubiertas con células madre del estroma derivadas de tejido adiposo se dan a conocer en la solicitud de patente estadounidense número 11/056.241 "Biomaterial for Suturing", presentada el 14 de febrero de 2005, solicitud que se incorpora por referencia en su totalidad. Las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo dadas a conocer en el presente documento representan composiciones novedosas que pueden usarse con los métodos dados a conocer en la solicitud de patente estadounidense número 11/056.241. Además, en cualquiera de las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, puede incorporarse al menos un agente terapéutico en la composición. Por ejemplo, una composición puede contener un analgésico, para ayudar a tratar la inflamación o el dolor en el sitio de la fístula o herida, o un agente antiinfeccioso para evitar la infección del sitio tratado con la composición.

Más específicamente, ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos útiles incluyen las siguientes categorías terapéuticas: analgésicos, tales como fármacos antiinflamatorios no esteroideos, agonistas opiáceos y salicilatos; agentes antiinfecciosos, tales como antihelmínticos, antianaeróbicos, antibióticos, antibióticos de aminoglucósido, antibióticos antifúngicos, antibióticos de cefalosporina, antibióticos de macrolido, antibióticos de ß-lactama diversos, antibióticos de penicilina, antibióticos de quinolona, antibióticos de sulfonamida, antibióticos de tetraciclina, antimicobacterianos, antimicobacterianos antituberculosis, antiprotozoarios, antiprotozoarios antimalaria, agentes antivirales, agentes antirretrovirales, escabicidas, agentes antiinflamatorios, agentes antiinflamatorios de corticoesteroides, antipruríticos/anestésicos locales, antiinfecciosos tópicos, antiinfecciosos tópicos antifúngicos, anti infecciosos tópicos antivirales; agentes electrolíticos y renales, tales como agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, diuréticos, diuréticos inhibidores de la anhidrasa carbónica, diuréticos de bucle, diuréticos osmóticos, diuréticos ahorradores de potasio, diuréticos de tiazida, renovaciones de electrolitos, y agentes uricosúricos; enzimas, tales como enzimas pancreáticas y enzimas trombolíticas; agentes gastrointestinales, tales como antidiarreicos, antieméticos, agentes antiinflamatorios gastrointestinales, agentes antiinflamatorios gastrointestinales de salicilato, agentes antiulcerosos antiácidos, agentes antiulcerosos inhibidores de la bomba de ácido gástrico, agentes antiulcerosos de la mucosa gástrica, agentes antiulcerosos bloqueadores de H2, agentes colelitolíticos, digestivos, eméticos, laxantes y ablandadores de materia fecal, y agentes procinéticos; anestésicos generales, tales como anestésicos por inhalación, anestésicos por inhalación halogenados, anestésicos intravenosos, anestésicos intravenosos de barbiturato, anestésicos intravenosos de benzodiazepina, y anestésicos intravenosos de agonistas opiáceos; hormonas y modificadores de hormonas, tales como productos abortivos, agentes suprarrenales, agentes suprarrenales de corticoesteroides, andrógenos, antiandrógenos, agentes inmunobiológicos, tales como inmunoglobulinas, inmunosupresores, toxoides y vacunas; anestésicos locales, tales como anestésicos locales de amida y anestésicos locales de éster; agentes musculoesqueléticos, tales como agentes antiinflamatorios antigota, agentes antiinflamatorios de corticoesteroides, agentes antiinflamatorios de compuesto de oro, agentes antiinflamatorios inmunosupresores, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), agentes antiinflamatorios de salicilato, minerales; y vitaminas, tales como vitamina A, vitamina B, vitamina C, vitamina D, vitamina E y vitamina K. Clases preferidas de agentes terapéuticos útiles de las categorías anteriores incluyen: (1) analgésicos en general, tales como lidocaína o derivados de la misma, y analgésicos de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), incluyendo diclofenac, ibuprofeno, ketoprofeno, y naproxeno; (2) analgésicos de agonistas opiáceos, tales como codeína, fentanilo, hidromorfona y morfina; (3) analgésicos de salicilato, tales como aspirina (AAS) (AAS recubierto entérico); (4) antihistamínicos bloqueantes de H-i, tales como clemastina y terfenadina; (5) agentes antiinfecciosos, tales como mupirocina; (6) antiinfecciosos antianaeróbicos, tales como cloramfenicol y clindamicina; (7) antiinfecciosos antibióticos antifúngicos, tales como anfotericina b, clotrimazol, fluconazol y ketoconazol; (8) antiinfecciosos antibióticos de macrolido, tales como azitromicina y eritromicina; (9) antiinfecciosos antibióticos de ß-lactama diversos, tales como aztreonam e imipenem; (10) antiinfecciosos antibióticos de penicilina, tales como nafcilina, oxacilina, penicilina G y penicilina V; (11) antiinfecciosos antibióticos de quinolona, tales como ciprofloxacino y norfloxacino; (12) antiinfecciosos antibióticos de tetraciclina, tales como doxiciclina, minociclina y tetraciclina; (13) antiinfecciosos antimicobacterianos antituberculosis tales como isoniazida (INH) y rifampina; (14) antiinfecciosos antiprotozoarios, tales como atovacuona y dapsona; (15) antiinfecciosos antiprotozoarios antimalaria, tales como cloroquina y pirimetamina; (16) antiinfecciosos antirretrovirales, tales como ritonavir y zidovudina; (17) agentes antiinfecciosos antivirales, tales como aciclovir, ganciclovir, interferón alfa y rimantadina; (18) antiinfecciosos tópicos antifúngicos, tales como anfotericina B, clotrimazol, miconazol y nistatina; (19) antiinfecciosos tópicos antivirales, tales como aciclovir; (20) agentes electrolíticos y renales, tales como lactulosa; (21) diuréticos de bucle, tales como furosemida; (22) diuréticos ahorradores de potasio, tales como triamtereno; (23) diuréticos de tiazida, tales como hidroclorotiazida (HCTZ); (24) agentes uricosúricos, tales como probenecid; (25) enzimas tales como ARNasa y ADNasa; (26) antieméticos, tales como proclorperazina; (27) agentes antiinflamatorios gastrointestinales de salicilato, tales como sulfasalazina; (28) agentes antiulcerosos inhibidores de la bomba de ácido gástrico, tales como omeprazol; (29) agentes antiulcerosos bloqueadores de H2, tales como cimetidina, famotidina, nizatidina y ranitidina; (30) digestivos, tales como pancrelipasa; (31) agentes procinéticos, tales como eritromicina; (32) anestésicos locales de éster, tales como benzocaína y procaína; (33) agentes antiinflamatorios de corticoesteroides musculoesqueléticos, tales como beclometasona, betametasona, cortisona, dexametasona, hidrocortisona y prednisona; (34) inmunosupresores antiinflamatorios musculoesqueléticos, tales como azatioprina, ciclofosfamida y metotrexato; (35) fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) musculoesqueléticos, tales como diclofenac, ibuprofeno, ketoprofeno, ketorolaco y naproxeno; (36) minerales, tales como hierro, calcio y magnesio; (37) compuestos de vitamina B, tales como cianocobalamina (vitamina B12) y niacina (vitamina B3); (38) compuestos de vitamina C, - - tales como ácido ascórbico; y (39) compuestos de vitamina D, tales como calcitriol. En ciertas realizaciones, el agente terapéutico puede ser un factor de crecimiento u otra molécula que afecta a la diferenciación y/o proliferación celular. En la técnica se conocen bien factores de crecimiento que inducen estados de diferenciación final, y pueden seleccionarse de cualquiera de tales factores que se ha mostrado que inducen un estado de diferenciación final. Los factores de crecimiento para su uso en métodos descritos en el presente documento pueden ser, en ciertas realizaciones, variantes o fragmentos de un factor de crecimiento que se produce de manera natural. Por ejemplo, una variante puede generarse realizando cambios de aminoácidos conservadores y sometiendo a prueba la variante resultante en uno de los ensayos funcionales descritos anteriormente u otro ensayo funcional conocido en la técnica. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren a la capacidad de poder intercambiar residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas-hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptofano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Grupos de sustitución de aminoácidos conservadora son: valina-leucina-¡soleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina. Tal como apreciarán los expertos en la técnica, pueden generarse variantes o fragmentos de factores de crecimiento polipeptídicos usando - - técnicas convencionales, tales como mutagénesis, incluyendo crear mutación/mutaciones puntual(es) diferenciada(s), o mediante truncamiento. Por ejemplo, la mutación puede dar lugar a variantes que conservan sustancialmente la misma, o simplemente un conjunto de la, actividad biológica de un factor de crecimiento polipeptídico del que se derivan. 3. Métodos de preparación de composiciones novedosas que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo También se proporcionan métodos de preparación de las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo que constituyen las composiciones descritas anteriormente que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo. En una realización, un método comprende: (a) recoger tejido adiposo de un sujeto; (b) obtener una suspensión celular mediante digestión enzimática; (c) sedimentar la suspensión celular y resuspender las células en un medio de cultivo; (d) cultivar las células durante al menos aproximadamente 10 días; y (g) expandir las células durante al menos dos pases de cultivo. Preferiblemente, las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo se aislan del tejido adiposo del sujeto en el que deben introducirse las composiciones finales que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo. Sin embargo, las células madre del estroma también pueden aislarse de cualquier organismo de la misma especie o una diferente a la del sujeto. Cualquier organismo con tejido adiposo puede ser un posible candidato. Preferiblemente, el organismo es un mamífero, lo más preferiblemente el organismo es un ser humano. En ciertas realizaciones, las células se cultivan durante al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20 días, al menos aproximadamente 25 días o al menos aproximadamente 30 días. Es preferible que las células se expandan en cultivo durante más tiempo para mejorar la homogeneidad del fenotipo celular en la población celular. En ciertas realizaciones, las células se expanden en cultivo durante al menos tres pases de cultivo o "se realiza un pase al menos tres veces". En otras realizaciones, se realiza un pase a las células al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos siete veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces o al menos diez veces. Es preferible que se realice un pase a las células más de tres veces para mejorar la homogeneidad del fenotipo celular en la población celular. De hecho, las células pueden expandirse en cultivo indefinidamente siempre que la homogeneidad del fenotipo celular mejore y se mantenga la capacidad diferencial. Las células pueden cultivarse mediante cualquier técnica conocida en la técnica para el cultivo de células madre. Puede encontrarse una discusión de las diversas técnicas de cultivo, así como su ampliación en escala, en Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4a edición, Wiley-Liss 2000. En ciertas realizaciones, las células se cultivan mediante cultivo en monocapa. En una realización, las células se cultivan y se realizan pases tal como se describe en el ejemplo 1 a continuación. Puede usarse cualquier medio que pueda soportar las células del estroma en cultivo tisular. Formulaciones de medios que soportarán el crecimiento de fibroblastos incluyen, pero no se limitan a, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo modificado alfa (.alpha. MEM) y medio del Roswell Park Memorial Institute 1640 (medio RPMI 1640) y similares. Normalmente, se añadirá del 0 al 20% de suero bovino fetal (FBS) o del 1-20% de suero de caballo a los medios anteriores con el fin de soportar el crecimiento de células del estroma y/o condrocitos. Sin embargo, puede usarse un medio definido si los factores de crecimiento, citocinas y hormonas en FBS necesarios para las células del estroma y condrocitos se identifican y proporcionan en concentraciones apropiadas en el medio de crecimiento. Los medios útiles en los métodos de la invención pueden contener uno o más compuestos de interés, incluyendo, pero sin limitarse a, compuestos diferenciativos o mitogénicos de antibióticos para células del estroma. Las células se harán crecer a temperaturas de entre 31 °C a 37°C en una incubadora humidificada. El contenido en dióxido de carbono se mantendrá entre el 2% al 10% y el contenido en oxígeno entre el 1% y el 22%. Las células pueden permanecer en este entorno durante periodos de hasta 4 semanas. Los antibióticos con los que puede complementarse el medio incluyen, pero no se limitan a, penicilina y estreptomicina. La concentración de penicilina en el medio de cultivo químicamente definido es de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 unidades por ml. La concentración de estreptomicina en el medio de cultivo químicamente definido es de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 Dg/ml. Las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo pueden transfectarse o transducirse de manera estable o transitoria con un ácido nucleico de interés usando una estrategia de vector de plásmido, viral o alternativo. Los ácidos nucleicos de interés incluyen, pero no se limitan a, los que codifican para productos génicos que potencian la producción de componentes de matriz extracelular encontrados en el tipo de tejido que va a repararse, por ejemplo pared intestinal o pared vaginal. La transducción de vectores virales que llevan genes reguladores en las células madre del estroma puede realizarse con vectores virales (adenovirus, retrovirus, virus adenoasociados u otro vector) purificados mediante bandeo con cloruro de cesio u otro método a una multiplicidad de infección (unidades virales:célula) de entre 10:1 y 2000:1. Se expondrán las células al virus en medio libre de suero o que contiene suero en ausencia o presencia de un detergente catiónico tal como polietilenimina o Lipofectamine TM durante un periodo de 1 hora a 24 horas (Byk T. et al. (1998) Human Gene Therapy 9:2493-2502; Sommer B. et al. (1999) Calcif. Tissue Int. 64:45-49). Otros métodos adecuados para transferir vectores o plásmidos al interior de células madre incluyen complejos de lípido/ADN, tales como los descritos en las patentes estadounidenses números 5.578.475; 5.627.175; 5.705.308; 5.744.335; 5.976.567; 6.020.202 y 6.051.429. Reactivos adecuados incluyen lipofectamine, una formulación de liposoma 3:1 (p/p) del lípido policatiónico trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA) (nombre de registro de Chemical Abstracts: trifluoroacetato de N-[2-(2,5-bis[(3-aminopropil)amino]-1-oxopentil}amino)etil]-N,N-dimetil-2,3-bis(9-octadeceniloxi)-1-propanaminio), y el lípido neutro dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE) en agua filtrada por membrana. A modo de ejemplo se proporciona la formulación Lipofectamine 2000TM (disponible de Gibco/Life Technologies n° 11668019). Otros reactivos incluyen: reactivo de transfección FuGENETM 6 (una combinación de lípidos en forma no liposomal y otros compuestos en etanol al 80%, que puede obtenerse de Roche Diagnostics Corp. n° 1814443); y reactivo de transfección LipoTAXITM (una formulación de lípidos de Invitrogen Corp., n° 204110). La transfección de células madre puede realizarse mediante electroporación, por ejemplo, tal como se describe en M.L. Roach y J.D. McNeish (2002) Methods in Mol. Biol. 185:1. Sistemas de vector viral adecuados para producir células madre con alteraciones genéticas estables pueden basarse en adenovirus y retrovirus, y pueden prepararse usando componentes de virus comercialmente disponibles. La transfección de vectores de plásmidos que llevan genes reguladores en las células madres del estroma pueden introducirse en las células en cultivos en monocapa mediante el uso de precipitación de ADN por fosfato de calcio o métodos de detergente catiónico (Lipofectamine TM., DOTAP) o en cultivos tridimensionales mediante incorporación de los vectores de ADN de plásmido directamente en el polímero biocompatible (Bonadio J. et al. (1999) Nat. Med. 5:753-759). Para el seguimiento y detección de proteínas funcionales codificadas por estos genes, los vectores de ADN viral o de plásmido contendrán un gen marcador fácilmente detectable, tal como la proteína fluorescente verde o enzima beta-galactosidasa, pudiéndose realizar un seguimiento de ambas mediante medios histoquímicos. 4. Métodos de tratamiento de fístulas y heridas Otro aspecto de la invención se refiere a un método novedoso para usar células madre del estroma derivadas de tejido adiposo en el tratamiento de fístulas y heridas. En realizaciones preferidas, las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo se derivan del tejido adiposo del sujeto que va a tratarse. En otras realizaciones preferidas, las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo constituyen una composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo descrita en el presente documento. Sin embargo, otras preparaciones de células madre del estroma derivadas de tejido adiposo pueden usarse en los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo tal como las descritas en las patentes estadounidenses números 6.777.231 y 6.555.374 y la solicitud de patente estadounidense número 11/065.461 "Identificación y aislamiento de células multipotentes a partir de tejido mesenquimatoso no osteocondral", presentada el 25 de febrero de 2005 En una realización, un método de tratamiento de una fístula en un sujeto comprende: (a) cerrar el orificio interno con una sutura y (b) administrar al menos aproximadamente 10 x 106, al menos aproximadamente 20 x 106, al menos aproximadamente 30 x 106 o al menos aproximadamente 40 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, por ejemplo, en una composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo de la invención, al orificio interno cerrado con sutura. En ciertas realizaciones, por ejemplo, en las que la primera administración de células es insuficiente, el método puede comprender además: (c) administrar una segunda dosis de al menos aproximadamente 20 x 106 células, al menos aproximadamente 30 x 106 o al menos aproximadamente 40 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, por ejemplo, en una composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo de la invención, al orificio interno cerrado con sutura. En otra realización, la composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo usada en el método es una en la que al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% o preferiblemente al menos aproximadamente el 96%, 97%, 98% o el 99% de las células madre expresan los marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51 , CD54, CD55, CD58, CD59 CD90 y/o CD105. En otra realización, la composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo usada en el método es una en la que al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% o preferiblemente al menos aproximadamente el 96%, 97%, 98% o el 99% de las células madre expresan los marcadores c-Kit, vimentina y/o CD90. Métodos comunes de administración de las células de la presente invención a sujetos, particularmente sujetos humanos, algunos de los cuales se describen con detalle en el presente documento, incluyen inyección o implantación de las células en sitios diana en los sujetos, las células de la invención pueden insertarse en un dispositivo de administración que facilita la introducción, mediante inyección o implantación, de las células en los sujetos. Tales dispositivos de administración incluyen tubos, por ejemplo, catéteres, para inyectar células y fluidos en el cuerpo de un sujeto receptor. En una realización preferida, los tubos tienen adicionalmente una aguja, por ejemplo, una jeringuilla, a través de la cual las células de la invención pueden introducirse en el sujeto en una ubicación deseada. Las células de la invención pueden insertarse en un dispositivo de administración de este tipo, por ejemplo, una jeringuilla, de diferentes formas. Por ejemplo, las células pueden suspenderse en una disolución o incrustarse en una matriz de soporte cuando están contenidas en un dispositivo de administración de este tipo. Vehículos y diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina, disoluciones de tampón acuosas, disolventes y/o medios de dispersión. El uso de tales vehículos y diluyentes se conoce bien en la técnica. La disolución es preferiblemente estéril y fluida en la medida en que exista fácil jeringabilidad. Preferiblemente, la disolución es estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conserva frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos mediante el uso, por ejemplo, de parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. Las disoluciones de la invención pueden prepararse incorporando células progenitoras tal como se describe en el presente documento en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y, según se requiera, otros componentes enumerados anteriormente, seguido por esterilización por filtración. En otras realizaciones, un método de tratamiento de una fístula en un sujeto comprende: (a) cerrar el orificio interno con una sutura que comprende células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, por - - ejemplo, de una composición objeto que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo. Tales suturas recubiertas con células en las composiciones objeto que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo se describen en detalle en la solicitud de patente estadounidense número 11/056.241 , presentada el 14 de febrero de 2005, que se incorpora en el presente documento por referencia. En algunas realizaciones, los métodos pueden comprender además: (d) raspar en profundidad al menos un canal de la fístula y (e) llenar dicho canal de la fístula con un material. En ciertas realizaciones, el método puede comprender además administrar al menos aproximadamente 10 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, por ejemplo, de una composición objeto de células, al material.

Preferiblemente, el material es un adhesivo o polímero a base de fibrina, tal como un gel o cola de fibrina. En ciertas realizaciones, la dosis de al menos aproximadamente 10 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo ya está comprendida dentro del material, por ejemplo, de tal manera que el material comprende la composición que contiene células madre derivadas de tejido adiposo. En una realización adicional, un método de tratamiento de una fístula en un sujeto comprende: (i) raspar en profundidad al menos un canal de la fístula (ii) cerrar el orificio interno del canal raspado con una sutura administrar al menos aproximadamente 10 x 106, al menos aproximadamente 20 x 106, al menos aproximadamente 30 x 106 o al menos aproximadamente 40 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo al orificio interno cerrado con sutura, por ejemplo, en una composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo de la invención.

- - En ciertas realizaciones, por ejemplo, en las que la primera administración de células es insuficiente, el método puede comprender además: (iv) administrar una segunda dosis de al menos aproximadamente 20 x 106 células, al menos aproximadamente 30 x 106 o al menos aproximadamente 40 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo al orificio interno cerrado con sutura, por ejemplo, en una composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo de la invención. La etapa (i) se lleva a cabo preferiblemente mediante el raspado en profundidad de todos los canales de la fístula que van a tratarse, por ejemplo, se introduce una aguja de legrado en el trayecto de la fístula, y se produce una hemorragia inducida raspando las paredes de la fístula con el fin de obtener fibrina natural que llenará el trayecto de la fístula.

Estudios clínicos recientes por los inventores sugieren que la fibrina natural producida por este método de raspado es una opción preferida en comparación con el uso de sellantes de fibrina artificial, por tanto, en una realización preferida del método de la invención, los trayectos fistulares que van a tratarse no se llenan con tal material. La etapa (iv) se lleva a cabo preferiblemente mediante la administración local de las células, por ejemplo una composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, mediante la inyección en las paredes de la fístula a lo largo del trayecto de la fístula. Por ejemplo, dos inyecciones de 10 millones de células a lo largo de 3 cm de trayecto de la fístula. Los métodos de la invención pueden usarse para tratar cualquier fístula, incluyendo, pero sin limitarse a, fístula anorrectal o fístula del ano o fístula fecal, fístula arteriovenosa o fístula A-V, fístula biliar, fístula del cuello uterino, fístula craniosinus, fístula enteroentérica, fístula - - enterocutánea, fístula enterovaginal, fístula gástrica, fístula metroperitoneal, fístula peri linfática, fístula arteriovenosa pulmonar, fístula rectovaginal, fístula umbilical, fístula traqueoesofágica y fístula vesicovaginal. Preferiblemente, los métodos pueden usarse para tratar fístulas intestinales, por ejemplo aquéllas que conectan el intestino consigo mismo o con otro órgano, tales como fístula rectovaginal, fístula enteroentérica, fístula enterocutánea y fístula enterovaginal. En otra realización preferida, los métodos pueden usarse para tratar fístulas vaginal o uterina, por ejemplo aquéllas que conectan la vagina o el útero consigo mismos o con otro órgano, tales como fístula del cuello uterino, fístula rectovaginal, fístula enterovaginal y fístula vesicovaginal. Puede accederse a la fístula para la reparación quirúrgica mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante incisión, catéter, etc. En otra realización, un método de tratamiento de una herida en un sujeto comprende: (a) cerrar la herida con una sutura y (b) administrar al menos aproximadamente 10 x 106, al menos aproximadamente 20 x 106, al menos aproximadamente 30 x 106 o al menos aproximadamente 40 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, por ejemplo, en una composición que contiene células madre del estroma derivadas del tejido adiposo, a la herida cerrada con sutura. En determinadas realizaciones, por ejemplo, en las que la primera administración de células es insuficiente, el método puede comprender además: (c) administrar una segunda dosis de al menos aproximadamente 20 x 106 células, al menos aproximadamente 30 x 106 o al menos aproximadamente 40 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, por ejemplo, en una composición que contiene células madre del estroma derivadas del tejido adiposo, a la herida cerrada con sutura. En otras realizaciones, la herida puede llenarse con una composición que contiene células madre del estroma derivadas del tejido adiposo de la invención, por ejemplo una dosis de al menos aproximadamente 10 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo englobadas dentro de un material, por ejemplo, tal que el material comprende la composición celular, en la que el material es, por ejemplo, un adhesivo o cola. En otras realizaciones, un método de tratamiento de una herida en un sujeto comprende: (a) cerrar la herida con una sutura que comprende células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, por ejemplo, de una composición objeto que contiene células madre del estroma derivadas del tejido adiposo. Tales suturas recubiertas con células de las composiciones objeto que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo se describen en detalle anteriormente y en la solicitud de patente estadounidense número 11/056.241 , presentada el 14 de febrero de 2005, que se incorpora al presente documento como referencia. Los métodos descritos anteriormente pueden comprender además administrar un agente terapéutico al sujeto que se está tratando, por ejemplo sistémica o localmente en el sitio de sutura. En determinadas realizaciones, las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo se formulan en una composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo que contiene un agente terapéutico, tal como se describió anteriormente. En otras realizaciones, el agente terapéutico se administra por separado, por ejemplo simultáneamente con los métodos, antes de que se realice el método, o después de que se realice el método. En algunas realizaciones, el agente terapéutico se administra al sujeto antes, durante y después de que se realicen los métodos en el sujeto. Agentes terapéuticos a modo de ejemplo se describieron anteriormente. En realizaciones preferidas, se administran al sujeto agentes terapéuticos para el tratamiento de la enfermedad de Crohn. Agentes terapéuticos para la enfermedad de Crohn a modo de ejemplo son agentes antiinflamatorios tales como agentes que comprenden mesalamina, agentes ¡nmunosupresores tales como 6-mercaptopurina y - - azatioprina; agentes biológicos tales como infliximab (Remicade®), antibióticos y agentes antidiarreicos tales como difenoxilato, loperamida y codeína. En realizaciones en las que se usan células madre alogénicas, puede requerirse un tratamiento de apoyo. Por ejemplo, pueden administrarse inmunosupresores antes, durante y/o después del tratamiento para prevenir la EICH, según métodos conocidos en la técnica. Antes de la administración, las células también pueden modificarse para suprimir una reacción inmunitaria del sujeto frente a las células o viceversa, según métodos conocidos en la técnica. La dosificación de cualquier agente terapéutico variará dependiendo de los síntomas, la edad y el peso corporal del paciente, la naturaleza y gravedad del trastorno que ha tratarse o prevenirse, la vía de administración y la forma del agente. Cualquiera de las formulaciones objeto puede administrarse en una dosis única o en dosis divididas. Las dosificaciones para los agentes terapéuticos pueden determinarse fácilmente mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica o según lo enseñado en el presente documento. Además, pueden administrarse mezclas de más de un agente terapéutico, o administrarse múltiples agentes terapéuticos en composiciones separadas. Los agentes terapéuticos pueden administrarse por vía oral, por vía parenteral, mediante pulverización de inhalación, por vía tópica, por vía rectal, por vía nasal, por vía bucal, por vía vaginal o mediante un depósito implantado. El término parenteral, tal como se usa en el presente documento, incluye técnicas de infusión o inyección subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intrasternal, intratecal, intralesional e intracraneal. El momento de administración y la cantidad precisos de cualquier agente particular que producirá el tratamiento más eficaz en un paciente dado, dependerán de la actividad, farmacocinética y biodisponibilidad de un compuesto particular, el estado fisiológico del paciente (incluyendo edad, sexo, fase y tipo de enfermedad, estado físico general, receptividad a una dosificación dada y tipo de medicación), la vía de administración y similares. Las directrices presentadas en el presente documento pueden usarse para optimizar el tratamiento, por ejemplo, determinar el momento y/o la cantidad de administración óptimos que no requerirán más que experimentación de rutina que consiste en monitorizar al sujeto y ajustar la dosificación y/o el momento. Mientras que se está tratando al sujeto, la salud del paciente puede controlarse midiendo uno o más de los índices relevantes en momentos predeterminados durante un periodo de 24 horas. El tratamiento, incluyendo suplemento, cantidades, momentos de administración y formulación, pueden optimizarse según los resultados de tal monitorización. Puede reevaluarse al paciente periódicamente para determinar el alcance de la mejora midiendo los mismos parámetros, produciéndose la primera de tales reevaluaciones normalmente al final de cuatro semanas desde el inicio del tratamiento, y produciéndose las reevaluaciones posteriores cada de cuatro a ocho semanas durante el tratamiento y luego cada tres meses a partir de entonces. El tratamiento puede continuar durante varios meses o incluso años, siendo una duración típica de tratamiento de un mínimo de un mes para seres humanos. Los ajustes a la(s) cantidad(es) de agente administrada(s) y posiblemente el momento de administración pueden realizarse basándose en estas reevaluaciones. El tratamiento puede iniciarse con dosificaciones más pequeñas que son inferiores a la dosis óptima del compuesto. Posteriormente, puede incrementarse la dosificación en incrementos pequeños, hasta que se consigue el efecto terapéutico óptimo. El uso combinado de varios agentes terapéuticos puede reducir la dosificación requerida para cualquier componente individual debido a que la aparición y duración del efecto de los diferentes componentes pueden ser complementarias. En tal tratamiento combinado, los diferentes principios activos pueden administrarse juntos o por separado, y simultáneamente o en momentos diferentes a lo largo del día. La toxicidad y eficacia terapéutica de los compuestos objeto pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 y la DE50. Se prefieren composiciones que muestran grandes índices terapéuticos. Aunque pueden usarse compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos, debe tenerse precaución al diseñar un sistema de administración que dirige los agentes al sitio deseado con el fin de reducir los efectos secundarios. Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de cualquier agente terapéutico o alternativamente de cualquier componente en los mismos, se encuentra preferiblemente en el intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE5o con poca o nada de toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración utilizada. Para los agentes de la presente invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir una concentración en plasma circulante que incluye la Cl50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que consigue una inhibición semimáxima de los síntomas) tal como se determina en cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar de manera más exacta las dosis útiles en seres humanos. Pueden medirse los niveles en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución.

. Kits En otras realizaciones, la invención considera kits que incluyen las composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo y opcionalmente instrucciones para su uso. Los kits que comprenden las composiciones farmacéuticas y biomateriales de la presente invención también están dentro del alcance de la invención. Los componentes del kit pueden envasarse para la puesta en práctica o bien manual o bien parcial o totalmente automatizada de los métodos anteriores. Tales kits pueden tener una variedad de usos, por ejemplo, tratamiento, reparación, preparación de biomateriales y otras aplicaciones.

Ejemplos La invención que se describe ahora de manera general, se entenderá más fácilmente mediante referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen sólo para fines de ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención y no pretenden limitar la invención.

Ejemplo 1: Preparación de células madre a partir de lipoaspirados con homogeneidad mejorada Se obtuvo tejido adiposo mediante liposuccíón, con anestesia local y sedación general. Se introdujo una cánula hueca de punta roma en el espacio subcutáneo a través de una pequeña incisión (menor de 0,5 cm de diámetro). Con succión suave se movió la cánula a través del compartimento de la pared abdominal de tejido adiposo para obtener la rotura mecánica del tejido graso. Se inyectaron una solución salina y la epinefrina vasoconstrictora en el compartimento de tejido adiposo para minimizar la pérdida de sangre. De esta manera se obtuvieron de cada paciente que va a tratarse de 80 a 100 ml de lipoaspirado sin tratar. Se lavó de manera exhaustiva con solución salina tamponada con fosfato (PBS; Gibco BRL, Paisley, Escocia, RU) el lipoaspirado sin tratar para eliminar células sanguíneas, solución salina y anestésico local. Se digirió la matriz extracelular con una disolución de colagenasa tipo II (0,075%; Gibco BRL) en solución salina equilibrada (5 mg/ml; Sigma, St. Louis, EE.UU.) durante 30 min. a 37°C para liberar la fracción celular. Luego se inactivo la colagenasa mediante adición de un volumen igual de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco BRL) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS; Gibco BRL). Se centrifugó la suspensión de células a 250 x g durante 10 min. Se resuspendieron las células en NH4CI 0,16 M y se dejaron reposar durante 10 min. a temperatura ambiente (TA) para la lisis de eritrocitos. Se centrifugó la mezcla a 250 x g, y se resuspendieron las células en DMEM más FBS al 10% y mezcla del 1% de ampicilina/estreptomicina (Gibco, BRL) y luego se sembraron en placas de cultivo tisular de 100 mm a una concentración de 10-30 x 103 células/cm2. Se cultivaron las células durante 24 h a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5% en aire. Luego se lavaron las placas con PBS para eliminar los fragmentos celulares y células que no se habían adherido. Se mantuvieron las células en cultivo en el mismo medio y en las mismas condiciones hasta que alcanzaron aproximadamente el 80% de confluencia, con renovación el medio de cultivo cada de 3 a 4 días. Luego se realizó un pase de las células con tripsina-EDTA (Gibco BRL) a una dilución de 1 :3 que corresponde a una densidad celular de aproximadamente alrededor de 5-6 x 103 células/cm2. Para el trasplante se usaron células entre los pases 1 y 3, prefiriéndose las células para las que se habían realizado más de dos pases con el fin de aislar una población de células con alta homogeneidad. Se realizó la caracterización celular usando células en los pases 1 a 9.

Ejemplo 2.- Caracterización de células madre a partir de lipoaspirados con homogeneidad mejorada Para caracterizar las células mediante tinción de inmunofluorescencia se sembraron en placa las células a baja densidad en DMEM más FBS al 10% sobre portaobjetos de vidrio en placas de 24 pocilios. Para los estudios de inmunohistoquímica se lavaron las células con PBS y se fijaron en acetona durante 10 min. a -20°C. Para la tinción de a-actina se fijaron las células en paraformaldehído al 4% durante 10 min. a TA. Tras el bloqueo con PBS que contenía suero de cabra al 4% y un Tritón X-100 al 0,1% se incubaron las células a 4°C durante la noche con anticuerpos primarios frente a los siguientes marcadores celulares en las diluciones indicadas [(i) alfa-actina; Dako, Glostrup, Dinamarca; 1/50; (ii) vimentina; Sigma, St. Louis, EE.UU.; 1/200; (iii) CD90; CYMBUS, Biotechnology LTD, Chandlers Ford, Hants, RU; 1/50; (iv) factor VIII; Dako; 1/100; (v) CD34; Chemicon, CA, EE.UU; 1/100; (vi) c-Kit; Chemicon; 1/100; (vii) desmina; Dako; 1/100; (viii) citoqueratina; Dako; 1/100 y (ix) S-100; Dako; 1/50]. Luego se incubaron las células con los anticuerpos secundarios apropiados conjugados a isotiocianato de fluoresceína (FITC) o conjugados a cloruro de isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) (Sigma; 1/50) durante 45 min. a TA. Para los controles negativos se omitieron los anticuerpos primarios. Se contratiñeron los núcleos con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Luego se montaron las células en Mobiglow (MoBiTec, Gottingen, Alemania) y se observaron con un microscopio de epifluorescencia Eclipse TE300 (Nikon, Tokio, Japón). En cada caso, se determinó el número de células inmunopositivas en diferentes campos y se compararon con los números de núcleos teñidos. Los campos seleccionados aleatoriamente se exportaron a un ordenador (Macintosh G3; Apple Computer Ink., Cupertino, Ca, EE.UU.) a través de una cámara Spotl (Diagnostic Instruments Inc., Tampa, FL, EE.UU.). Se usaron como controles positivos para la inmunotinción con los diversos anticuerpos células del músculo liso aórtico humanas, células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC) y fibroblastos sinoviales humanos. En el pase 1 , un alto porcentaje (90-95%) de células madre del estroma derivadas de tejido adiposo expresó vimentina, un marcador de las células mesenquimatosas del citoesqueleto (figura 1). Se mantuvo la expresión de vicentina al mismos nivel hasta e incluyendo el pase 9. Sin embargo los niveles de otros marcadores cayeron con el tiempo. Por ejemplo, a-actina, que se encontró en el 17% de las células derivadas de LPA en el pase 1 , ya no era detectable en el pase 7. El marcador de las células endoteliales, factor de von Willebrandt (factor VIII), y CD34, que también se encuentra sobre la superficie de las células endoteliales, sólo se detectaron en los pases 1 a 3 (7% y 12% de células inmunopositivas, respectivamente). Por lo contrario, la expresión de c-Kit (CD117), un marcador de la proliferación celular, aumentó con el tiempo, con el 99% de células inmunopositivas desde el pase 4 en adelante (figura 2). El marcador de fibroblastos CD90, expresado inicialmente en aproximadamente el 80% de las células derivadas de LPA, se encontró en el 99% de las células desde el pase 6 (figura 3). No se observó la expresión del marcador neuroectodérmico S100 o el marcador ectodérmico queratina en ninguna de las células derivadas de LPA en ningún momento. El cambio de los marcadores observados a medida que aumenta el número de pases indica un aumento en la homogeneidad de la preparación celular obtenida. Para cuantificar el crecimiento celular se sembraron células en placas de 24 pocilios a una concentración de 5 x 103 células/cm2.

Después de que las células se habían unido al sustrato (3 h), se sustituyó el medio de cultivo por DMEM complementado con antibióticos al 1% más FBS al 0,5%, 2%, 5% o 10%. También se cultivaron fibroblastos sinoviales humanos como controles positivos para someter a prueba cada lote de suero y se determinaron sus velocidades de crecimiento. Se remplazó el medio cada dos días. A intervalos de 24 h se fijaron las células con glutaraldehído al 1% y se determinó el número de células por pocilio, tras la tinción nuclear con violeta cristal, monitorizando la absorbancia a 595 nm. Se construyó una curva patrón para establecer la relación entre el número de células por pocilio y la absorbancia a 595 nm (1^= 0,99). Se aislaron y se cultivaron con éxito células del estroma derivadas del tejido adiposo viables a partir de los siete lipoaspirados (LPA). Se hicieron crecer estas células en cultivo y se realizaron pases a intervalos de 7 a 10 días. En algunos casos se crioconservaron las células y se descongelaron antes de la implantación. La velocidad de crecimiento de las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo (CMDA) dependió de la concentración de suero, con proliferación máxima con FBS a entre el 5% y el 10% (figura 4). El tiempo medio de la duplicación de la población a estas concentraciones de suero fue de 37,6 ± 0,6 h, que no difería significativamente del tiempo de la duplicación de la población de fibroblastos sinoviales humanos cultivados en las mismas condiciones (35,6 ± 1,4 h; p>0,05; prueba de la t; resultados de tres experimentos independientes). Con el fin de analizar las células de manera menos subjetiva y más normalizada, también se sometieron las células a un análisis de separación de células activadas por fluorescencia (FACS). En general, el análisis de citometría de flujo permite la detección de antígenos de superficie mediante anticuerpos, que se unen directamente (de manera covalente) o indirectamente (anticuerpo secundario marcado con fluorescencia) a un marcador fluorescente. Por otro lado, el análisis inmunohistoquímico descrito anteriormente requiere la permeabilización de las células y la tinción posterior con anticuerpos. Por tanto, lo último requiere un protocolo optimizado de manera individual dependiendo del anticuerpo y de la proteína diana. Además, debido a la permeabilización de la membrana celular no es posible distinguir entre proteínas - - marcadoras extracelulares e internas (no unidas a la membrana). Es decir, con un análisis inmunohistoquímico es posible saber si un marcador proteico se está expresando, pero no es posible distinguir si se está expresando en la superficie celular o intracelularmente. El protocolo usado en la inmunocitometría para la detección de antígenos de superficie está normalizado y sólo requiere controles negativos apropiados. Además, el análisis FACS permite una evaluación del porcentaje de células positivas (células que expresan el antígeno de superficie) y el nivel de expresión (pocos o muchos antígenos de superficie sobre una célula). Estas evaluaciones son sólo de naturaleza subjetiva que utiliza inmunohistoquímica y puede variar de experimento a experimento, lo que no ocurre con el análisis FACS. Tal caracterización inmunofenotípíca de las células puede realizarse en células aisladas recientemente y tras periodos de cultivo, por ejemplo en el día 7, después de 4 semanas y después de 3 meses de cultivo. El análisis de marcadores de superficie a diferentes tiempos permite la evaluación de la homogeneidad del fenotipo durante el cultivo. Ejemplos de este análisis y datos que demuestran el fenotipo obtenido de muestras obtenidas a partir de 3 donantes sanos desde cero hasta tres meses de cultivo se describen con detalle en la solicitud de patente estadounidense número 11/065.461 , presentada el 25 de febrero de 2005, que se incorpora en el presente documento por referencia. Tras el aislamiento mediante el método descrito anteriormente, se caracterizaron las células madre del estroma derivadas del tejido adiposo de uno de los pacientes en función de la presencia/ausencia de una serie de marcadores de superficie. Para realizar esto se monitorizó la expresión de los siguientes marcadores de superficie mediante citometría de flujo: Integrina: CD11b, CD18, CD29, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e, CD49f, CD51 , CD61 , CD104.

- - Marcadores hematopoyéticos: CD3, CD9, CD10, CD13, CD16, CD14, CD19, CD28, CD34, CD38, CD45, CD90, CD133, glicoforina. Receptores del factor de crecimiento: CD105, NGFR. Receptores de la matriz extracelular: CD15, CD31 , CD44, CD50, CD54, CD62E, CD62L, CD62P, CD102, CD106, CD146, CD166. Otros: CD36, CD55, CD56, CD58, CD59, CD95, HLA-I, HLA-II, ß2-microglobulina. Se recogieron las células que iban a caracterizarse mediante digestión suave con tripsina, se lavaron con PBS y se incubaron durante 30 minutos a 4°C con marcadores de anticuerpo marcados con fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) frente a cado uno de los marcadores de superficie que iban a analizarse. Se lavaron los marcadores celulares y se analizaron inmediatamente usando citómetro Epics-XL (Coulter). Como controles se usaron células teñidas con anticuerpos inespecíficos de los correspondientes isótopos marcados con FITC o PE. A partir del análisis del perfil de expresión de marcadores de superficie (figura 7A/7B), los criterios utilizados para determinar qué marcadores definen la población celular y permiten que se identifique y se diferencie con respecto a otros tipos de células son los siguientes: 1. descartar aquellos marcadores que varían de una muestra a otra o a lo largo del tiempo durante el cultivo en los experimentos realizados con células madre del estroma derivadas de tejido adiposo de donantes sanos en la solicitud de patente estadounidense número 11/065.461 , presentada el 25 de febrero de 2005, que se incorpora en el presente documento por referencia. 2. Seleccionar los marcadores como una función de su relevancia biológica, descartando marcadores característicos de tipos de células específicos (por ejemplo, CD3 es un marcador exclusivo para linfocitos). Aplicando estos criterios se caracteriza la población de células madre multipotentes como que son positivos para CD9+, CD10+, CD13+, CD29+, CD44+, CD49A+, CD51+, CD54+, CD55+, CD58+, CD59+, CD90+ y CD105+; y carecen de expresión de CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31 , CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y CD133.

Ejemplo 3: Preparaciones de células madre gue comprenden cola de fibrina para su uso en el tratamiento de fístula Para uso clínico pueden usarse las células tal como se prepararon anteriormente después de tres o menos pases (figura 3), pero se usan preferiblemente después de dos o más pases tal como se describió anteriormente para dar una preparación de células con homogeneidad superior. Se trataron con tripsina durante 3 min. a 37°C los cultivos celulares para su uso clínico. Se detuvo el tratamiento con tripsina mediante la adición de DMEM más FBS, y se centrifugó la suspensión a 110 x g durante 5 min. Se lavaron las células en PBS y se centrifugó de nuevo la suspensión a 150 x g durante 5 min. Se resuspendieron las células a entre 3 y 30 x 106 células/ml en de 1 a 2 ml de disolución de lactato de Ringer y se pusieron en una jeringuilla adecuada. Puede añadirse opcionalmente a la disolución de lactato de Ringer albúmina sérica humana (HSA). En ciertos casos se resuspendieron la mitad de las células en el componente de trombina de un kit de cola de fibrina (Tissucol® Dúo 2.0; Baxter, Madrid, España) antes de la combinación de los dos componentes del kit, en un intento de mejorar la obturación de los trayectos de las fístulas. Se conoce en la técnica el uso de cola de fibrina para llenar una abertura de fístula; sin embargo no es eficaz como un tratamiento independiente para fístula. La adición de cola de fibrina a las - - composiciones que contienen células madre del estroma derivadas de tejido adiposo descritas en el presente documento sirve para retener las células localmente, y se ha observado que las células crecen bien dentro de geles y colas de fibrina.

Ejemplo 4: Procedimiento guirúrgico mejorado para reparar fístulas usando preparaciones de células madre a partir de lipoaspirados Se realizó un ensayo clínico de fase I diseñado para someter a prueba la viabilidad y seguridad de trasplantes de células madre autólogas usando las composiciones de células madre del estroma de tejido adiposo descritas anteriormente para el tratamiento de fístulas por enfermedad de Crohn. Se aprobó el protocolo por el comité ético y de ensayos clínicos del hospital La Paz el 12 de abril de 2002, y se generó un formulario de consentimiento informado detallado para que los pacientes lo firmaran. El comité ético se mantuvo informado acerca de la evolución del estudio durante todo el ensayo clínico.

Métodos Se seleccionaron los pacientes según los siguientes criterios de inclusión: más de 18 años de edad; diagnóstico de enfermedad de Crohn al menos cinco años antes del ensayo; presencia de una o más fístulas complejas por enfermedad de Crohn (fístula enterocutánea, fístula supraesfinteriana y/o fístula rectovaginal) que no han respondido a tratamiento médico y se han tratado sin éxito mediante cirugía clásica al menos dos veces; y acuerdo para participar con la firma del formulario del consentimiento informado. Los criterios de exclusión fueron los siguientes: no cumplir los criterios de inclusión; deficiencia mental; delgadez extrema, alergia a anestésicos locales; diagnóstico anterior de cáncer; y SIDA. Se incluyeron en el estudio cinco pacientes (números 001-005). Había tres hombres y dos mujeres y la edad promedia era de 35,1 ± 2,4 años (intervalo: de 31 ,2 a 37,5 años). Se realizaron nueve implantes celulares: tres en fístulas rectovaginales; cinco en fístulas enterocutáneas (cuatro fístulas diferentes en un paciente; y uno en una fístula perianal supraesfinteriana). Todas las fístulas enterocutáneas tenían bajo flujo (inferior a 50 cc por día) y estaban ubicadas en la pared abdominal (tabla 1). No se trató a ningún paciente con nutrición parenteral total, Remicaid ni Octreotride simultáneamente con este procedimiento. Los pacientes 001 y 002 requirieron dos procedimientos de liposucción porque, tras la primera liposucción, ninguna célula madre sobrevivió a la crioconservación. Se excluyó un paciente debido a la contaminación bacteriana de células cultivadas. Se inocularon nueve fístulas en cuatro pacientes con células madre del estroma derivadas de tejido adiposo (CMDA) autólogas en el pase tres o antes. Se realizó un seguimiento semanalmente durante al menos ocho semanas de ocho fístulas inoculadas. En seis fístulas, la abertura externa se cubrió con epitelio al final de la semana 8 y, así, estas fístulas se consideraron curadas (75%). En las otras dos fístulas, sólo hubo cierre incompleto de la abertura externa con una disminución del flujo de salida (no curada; 25%). No se observaron efectos adversos en ningún paciente al final del periodo de seguimiento (al menos seis meses y no más de dos años). En el caso de fístulas enterocutáneas, se rasparon en profundidad todos los canales. En el caso de fístulas rectovaginales, se usó un acceso vaginal, con el desprendimiento de la pared vaginal posterior. Se separó completamente el hueco y se cerró la abertura rectal con 3/0 puntos de sutura absorbibles. La mucosa rectal se había dañado por la enfermedad de Crohn y era extremadamente frágil. En el caso de fístulas perianales, se ahuecó el canal principal y se cerró el orificio rectal con 3/0 puntos de sutura absorbibles a lo largo de la mucosa esclerótica.

Con el uso de una aguja, en casos de fístula enterocutánea, se inyectaron células en la pared del canal. En los casos de fístulas rectovaginales y perianales, se inyectaron células en la mucosa rectal, próxima a la abertura interna cerrada con sutura. En todos los casos, se observó una ampolla llena de fluido sobre el área de la inyección después de la inyección (figura 5). El número de células inyectadas oscilaba desde 3 hasta 30 x 106, dependiendo del crecimiento de las células cultivadas (figura 3). El tiempo desde el inicio de la preparación del inoculo hasta el final de la inyección fue inferior a 90 minutos en todos los casos. En el caso de fístulas enterocutáneas, se llenaron los canales con cola de fibrina y luego se suturó la piel. En el caso de fístulas rectovaginales, se construyó un colgajo vaginal de avance. Cuando se detectaron canales auxiliares también se llenaron con cola de fibrina. No se aplicaron vendajes de manera posoperatoria. Se inició la ingesta de líquidos doce horas después del procedimiento y después de seis horas alimento sólido. De uno a tres días después de la cirugía se dio de alta al paciente y se planificaron visitas de seguimiento en la clínica ambulatoria. Se obtuvieron dos muestras histopatológicas. Se obtuvo una muestra (paciente número 002) de la zona de una fístula enterocutánea (7 meses después del implante n° 2 y 10 días después del implante n° 3). Se obtuvo la otra muestra (paciente número 001) de la pared rectovaginal un año después del primer implante, (implante n° 1), durante el procedimiento quirúrgico asociado con el implante n° 6. Se incrustaron las muestras en parafina, se seccionaron, se tiñeron con hematoxilina y eosina, y se evaluaron. Se programó un seguimiento semanal durante ocho semanas después de la operación. Los pacientes se consideraron curados cuando fue evidente una epitelización total de la abertura externa después de - - ocho semanas, independientemente de las observaciones anteriores. Después de ocho semanas hubo un seguimiento mensual durante al menos seis meses y no más de dos años.

Resultados Se incluyeron en el estudio cinco pacientes y se realizaron siete liposucciones (figura 3). Se eliminó al paciente número 003 del ensayo durante el procedimiento de implante como resultado del descubrimiento de contaminación por bacterias Gram-positivas de las células lipoaspiradas cultivadas. Se identificaron las bacterias como Oerkovia xanthineolytica. Se eliminó del estudio una fístula enterocutánea en el paciente 002 debido a la operación abdominal de urgencia de una fístula enterovesicular nueva que había dado como resultado septicemia aguda. La laparotomía requería la resección de la zona del implante. Por tanto, en este caso no pudo cumplirse el calendario de seguimiento de ocho semanas como mínimo. Se inocularon nueve fístulas de cuatro pacientes con CMDA después de tres o menos pases (figura 3). Se consideraron adecuadas ocho fístulas para la retención en el estudio y para realizar el seguimiento durante al menos ocho semanas (figura 3). En seis fístulas, la abertura externa había epitelializado en la semana 8 y estás fístulas se consideraron curadas (75%) (figura 6). Las otras ocho tuvieron sólo el cierre incompleto de la abertura externa con una disminución del flujo de salida, tal como se notificó por los pacientes (25%; no curada; figura 3). No había relación directa entre el número de células inyectadas o tiempo de cultivo y éxito del procedimiento. Tampoco había relación directa entre la edad o el sexo del paciente y la curación. Los estudios posteriores que se han realizado indican que es adecuada una dosis inicial de 20 x 106 células. Se ha determinado que puede usarse una segunda dosis de 40 x 106 células en el caso de que falle la primera dosis. Se prefieren dosis de células superiores ya que se ha observado que números de células superiores tienen un mejor efecto terapéutico en la reparación de tejidos.

Los procedimientos quirúrgicos y de implantación se realizaron sin dificultad técnica adicional en las nueve fístulas tratadas. No se observaron en ninguno de los casos estudiados reacciones adversas inmediatas (por ejemplo, anafilaxis, reacciones alérgicas). Se obtuvieron dos muestras histopatológicas siete meses (fístula enterocutánea) y un año (fístula rectovaginal) después de la cirugía. No se detectó transformación citológica en una serie completa de secciones histopatológicas.

Discusión En un informe previo se describió el tratamiento satisfactorio a base de células de una mujer joven con una fístula rectovaginal recurrente que no había respondido al tratamiento médico. Por tanto, se diseñó el presente ensayo clínico de fase I para evaluar la viabilidad y seguridad de tal trasplante de células madre del estroma de tejido adiposo autólogas (con mejoras del protocolo original) para el tratamiento de fístulas por enfermedad de Crohn que no responden al tratamiento, así como para someter a prueba el uso de células madre del estroma de tejido adiposo en conjunción con una cola de fibrina. Se elije el tejido adiposo como fuente de células madre debido a su capacidad para la diferenciación miogénica y el hecho de que las fístulas responden bien a trasplantes musculares. Además, la grasa de liposucción está disponible en grandes cantidades y pueden recogerse con efectos adversos mínimos en el paciente. Otros grupos han utilizado células madre derivadas de la médula ósea pero, en tales casos, se requiere un procedimiento de movilización de células que puede ser peligroso para algunos pacientes, tales como aquellos con un infarto de miocardio. En este estudio, todos los procedimientos de liposucción dieron un número de células clínicamente útiles con características de células madre. Se realizó un seguimiento de los pacientes según el programa planificado y se observó una curación completa en 6 de 8 procedimientos. Es importante destacar que la enfermedad de Crohn proporciona las peores condiciones para un acceso quirúrgico a fístulas debido a la fragilidad del tejido y a los enormes problemas asociados con la curación en estos pacientes. Se eligieron los pacientes porque no habían respondido al tratamiento médico ni al menos a dos procedimientos quirúrgicos previos, pero este tratamiento parecía ser bastante eficaz. No obstante, nuevos brotes de la enfermedad de Crohn todavía pueden producir nuevas fístulas en cualquier paciente dado, que necesitará ser tratado de nuevo utilizando las células antologas crioconservadas de ese paciente. Se desconoce el mecanismo biológico que subyace al éxito terapéutico del trasplante de CMDA. Las células madre pueden diferenciarse en tejido conjuntivo, muscular o cicatricial. Alternativamente, la secreción de factores de crecimiento por las células madre puede facilitar la curación de las heridas. Se observó tejido cicatricial típico en las fístulas examinadas histopatológicamente, pero no hay modo de distinguir las células trasplantadas de las de tejido conjuntivo local. Se observó una curación completa en el 75% de los casos utilizando este tratamiento.

Bibliografía La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro del conocimiento de la técnica. Tales técnicas se explican de manera completa en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. - - por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); patente estadounidense número 4.683.195 de Mullís et al.; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D.

Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, volúmenes 154 y 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes l-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Todas las publicaciones y patentes mencionadas en el presente documento, incluyendo los artículos enumerados a continuación, se incorporan por el presente documento por referencia en su totalidad como si cada publicación o patente individual se indicara específica e individualmente para incorporarse por referencia. En caso de conflicto, la presente solicitud, incluyendo cualquier definición en el presente documento, dominará. 1. American Gastroenterological Association Medical Position Statement: Perianal Crohn's Disease. Gastroenterology (2003) 125:1503-1507. 2. Levy C, Tremaine WJ. Inflamm Bowel Dis (2002) 8(2): 106-11. - - 3. Pennincke F, D'Hoore A, Filez L. Acta Gastroenterol Belg (2001) 64(2):223-226. 4. Rius J, Nessim A, Nogueras JJ, Wexner SD. Eur J Surg (2000) 166(3):218-222. 5. Mizuno H, Zuk PA, Zhu M, Lorenz HP, Benhaim P, Hedrick MH.

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Equivalentes La presente invención proporciona, entre otras cosas, métodos y composiciones para tratar y prevenir fístulas. Aunque se han tratado realizaciones específicas de la invención objeto, la memoria descriptiva anterior es ilustrativa y no restrictiva. Muchas variaciones de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica en la revisión de esta - - memoria descriptiva. Las reivindicaciones adjuntas no pretenden reivindicar todas de tales realizaciones y variaciones, y debe determinarse el alcance completo de la invención por referencia a las reivindicaciones, con su alcance completo de equivalentes, y la memoria descriptiva con tales variaciones.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo, en la que al menos aproximadamente el 50% de las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo que comprenden la composición expresan los marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44,
CD49A, CD51 , CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y CD105. 2. Composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo según la reivindicación 1 , en la que al menos aproximadamente el 85% de las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo que comprenden la composición expresan los marcadores
CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51 , CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y CD105. 3. Composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo según la reivindicación 2, en la que al menos aproximadamente el 95% de las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo que comprenden la composición expresan los marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51 , CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y CD105.
4. Composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo según la reivindicación 3, en la que al menos aproximadamente el 99% de las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo que comprenden la composición expresan los marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51 , CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y CD105.
5. Composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo según la reivindicación 4, en la que menos de aproximadamente el 5% de las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo que comprende la composición expresan los marcadores CD34 CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31 , CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y/o CD133. - -
6. Composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo según la reivindicación 1 , que comprende además disolución de Ringer y HSA.
7. Composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo según la reivindicación 6, en la que la concentración de las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo que comprenden la composición es de al menos aproximadamente 10 x 106 células/ml.
8. Composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo según la reivindicación 7, en la que la concentración de las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo que constituyen la composición es de al menos aproximadamente 20 x 106 células/ml.
9. Composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo según la reivindicación 1 , que comprende además un adhesivo.
10. Composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo según la reivindicación 9, en la que dicho adhesivo es un gel o cola de fibrina.
11. Soporte que comprende una composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo según la reivindicación 1.
12. Soporte según la reivindicación 11 , en el que dicho soporte es una sutura.
13. Soporte según la reivindicación 11 , en el que dicho soporte es un parche.
14. Método de preparación de una composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo según la reivindicación 1 , que comprende: (a) recoger tejido adiposo de un sujeto; (b) obtener una suspensión celular mediante digestión enzimática; (c) sedimentar la suspensión celular y resuspender las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo en un medio de cultivo; (d) cultivar las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo durante al menos aproximadamente 10 días; y (g) hacer pasar las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo al menos dos veces.
15. Método según la reivindicación 14, en el que las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo se cultivan durante al menos 20 días.
16. Método según la reivindicación 14, que comprende hacer pasar las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo al menos tres veces.
17. Método de preparación de un adhesivo para la reparación de la fístula, que comprende suspender una composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo según la reivindicación 1 con un polímero a base de fibrina.
18. Método de tratamiento de una fístula en un sujeto, que comprende: (a) cerrar el orificio interno con una sutura y (b) administrar al menos aproximadamente 10 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo al orificio interno cerrado con sutura.
19. Método según la reivindicación 18, en el que las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo comprenden una composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo según la reivindicación 1.
20. Método según la reivindicación 18, que comprende además: (d) raspar en profundidad al menos un canal de la fístula; (e) llenar dicho canal de la fístula con un adhesivo.
21. Método según la reivindicación 20, que comprende además: (f) administrar al menos aproximadamente 10 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo al adhesivo.
22. Método según la reivindicación 20, en el que dicho adhesivo es un gel o cola de fibrina.
23. Método según la reivindicación 21 , en el que dicho adhesivo comprende además una composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo según la reivindicación 1.
24. Método según la reivindicación 18, en el que dicho método comprende además: (c) administrar una segunda dosis de al menos aproximadamente 20 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo.
25. Método según la reivindicación 18, en el que dicho método comprende administrar al menos aproximadamente 20 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo.
26. Método según la reivindicación 25, en el que dicho método comprende además: (c) administrar una segunda dosis de al menos aproximadamente 40 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo.
27. Método según la reivindicación 18, en el que las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo se derivan del tejido adiposo del sujeto.
28. Método según la reivindicación 18, en el que la fístula es una fístula anorrectal, enteroentérica, enterocutánea, rectovaginal o vesicovaginal.
29. Método según la reivindicación 18, que comprende además administrar un agente terapéutico a dicho sujeto.
30. Método según la reivindicación 29, en el que dicho agente terapéutico se administra localmente al orificio interno cerrado con sutura.
31. Método según la reivindicación 30, en el que dicho agente terapéutico se administra sístémicamente a dicho sujeto.
32. Método de tratamiento de una herida en un sujeto, que comprende: (a) cerrar la herida con una sutura y (b) administrar al menos aproximadamente 10 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo a la herida cerrada con sutura.
33. Método según la reivindicación 23, en el que las células madre del estroma derivadas de tejido adiposo comprenden una composición de células según la reivindicación 1.
34. Célula madre del estroma derivada de tejido adiposo que expresa los marcadores c-Kit, vimentina y CD90 y no expresa los marcadores CD34, factor VIII, alfa-actina, desmina, S-100 y queratina.
35. Célula madre del estroma derivada de tejido adiposo que expresa los marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51 , CD54, CD55, CD58, CD59 CD90 y CD105 y no expresa los marcadores CD34, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31 , CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y/o CD133.
36. Uso de células madre del estroma derivadas de tejido adiposo en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar una fístula en un sujeto.
37. Uso según la reivindicación 36, en el que dichas células madre del estroma derivadas de tejido adiposo se derivan del tejido adiposo del sujeto que va a tratarse.
38. Uso según la reivindicación 36, en el que dichas células madre del estroma derivadas de tejido adiposo comprenden una composición que contiene células madre del estroma derivadas de tejido adiposo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, 34 ó 35.
39. Uso según la reivindicación 36, en el que dicha composición farmacéutica comprende al menos aproximadamente 10 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo.
40. Uso según la reivindicación 36, en el que dicha composición farmacéutica se administra como una primera dosis al orificio interno cerrado del trayecto de la fístula tras cerrar el orificio interno con una sutura.
41. Uso según la reivindicación 36, en el que dicha composición farmacéutica se administra como una primera dosis a uno o más sitios en - - las paredes del trayecto de la fístula tras cerrar el orificio interno del trayecto de la fístula con una sutura.
42. Uso según la reivindicación 40 ó 41 , en el que dicha composición farmacéutica comprende al menos aproximadamente 10 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo.
43. Uso según la reivindicación 40 ó 41 , en el que se administra una segunda dosis de dicha composición farmacéutica al orificio interno cerrado con sutura o uno o más sitios en las paredes del trayecto de la fístula tras dicha primera dosis de dicha composición farmacéutica.
44. Uso según la reivindicación 43, en el que la segunda dosis de dicha composición farmacéutica comprende al menos aproximadamente 20 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo.
45. Uso según la reivindicación 36, en el que dichas células madre del estroma derivadas de tejido adiposo están comprendidas en una sutura.
46. Uso según la reivindicación 36, en el que dichas células madre del estroma derivadas de tejido adiposo se administran a un material para llenar el canal de la fístula.
47. Uso según la reivindicación 46, en el que dicho material es un polímero a base de fibrina o un adhesivo, tal como un gel o cola de fibrina.
48. Uso según la reivindicación 36, en el que la fístula es una fístula anorrectal, fístula del ano, fístula fecal, fístula arteriovenosa, fístula biliar, fístula de cuello uterino, fístula craniosinus, fístula enteroentérica, fístula enterocutánea, fístula enterovaginal, fístula gástrica, fístula metroperitoneal, fístula perílinfática, fístula arteriovenosa pulmonar, fístula rectovaginal, fístula umbilical, fístula traqueoesofágica o fístula vesicovaginal.
49. Uso según la reivindicación 48, en el que la fístula es una fístula anorrectal, enterorectal, enterocutánea, rectovaginal o vesicovaginal.
50. Uso según la reivindicación 36, en el que dicha composición farmacéutica se administra en combinación con un agente terapéutico al sujeto al que se está tratando.
51. Uso según la reivindicación 50, en el que dicho agente terapéutico se administra sistémica o localmente al sitio de la sutura.
52. Uso según la reivindicación 51, en el que dicha composición farmacéutica comprende dicho agente terapéutico.
53. Uso según la reivindicación 50, en el que dicho agente terapéutico se administra por separado con respecto a dicha composición farmacéutica que comprende dichas células madre del estroma derivadas de tejido adiposo.
54. Uso según la reivindicación 50, en el que dicho agente terapéutico es un agente antiinflamatorio, un agente inmunosupresor, un agente biológico, un antibiótico o un agente antidiarreico.
55. Método de tratamiento de una fístula en un sujeto que comprende las etapas de: (i) raspar en profundidad al menos un canal de la fístula (ii) cerrar el orificio interno del canal raspado con una sutura (iii) administrar al menos aproximadamente 10 x 106 células madre del estroma derivadas de tejido adiposo al orificio interno cerrado con sutura.