MX2007016165A

MX2007016165A - Vacunas para tuberculosis que comprenden antigenos expresados durante la fase de infeccion latente.

Info

Publication number: MX2007016165A
Application number: MX2007016165A
Authority: MX
Inventors: Claus Aagaard; Carina Vingsbo-Lundberg; Peter Andersen
Original assignee: Statens Seruminstitut
Priority date: 2005-06-23
Filing date: 2006-06-20
Publication date: 2008-03-14
Also published as: CN102836425A; EP2380590A3; BRPI0612833A2; HK1124071A1; EP2163255A1; HK1179855A1; CA2612900A1; ES2647070T3; KR101035053B1; KR20100122130A; US7968105B2; EP2163255B1; KR101188045B1; IL222915A0; KR20080027877A; EP1910409A2; CN102836425B; JP2008543890A; AU2006261445A1; CA2836319A1

Abstract

La invencion se refiere a una composicion inmunogena, vacuna o composicion farmaceutica para prevenir, fortalecer o tratar una infeccion causada por una especie del complejo de tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. Africanum, M. Microti). La composicion inmunogena, vacuna o composicion farmaceutica comprende un polipeptido de fusion, el cual comprende uno o mas antigenos de inanicion de M. tuberculosis, las unidades del polipeptido de fusion son antigeno de M. Tuberculosis. Ademas, la invencion se refiere al uso de una vacuna que comprende una secuencia de polipeptido de fusion o secuencia de acido nucleico de la invencion administrada al mismo tiempo que BCG, ya sea mezclada con BCG o administrada por separado en diferentes sitios o rutas para preparar la composicion inmunogena, vacuna o composicion farmaceutica.

Description

VACUNAS PARA TUBERCULOSIS QUE COMPRENDEN ANTIGENOS EXPRESADOS DURANTE LA FASE DE INFECCIÓN LATENTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención da a conocer antigenos inducidos durante la inanición o nuevos polipéptidos de fusión de polipéptidos inmunógenos basados en polipéptidos derivados de Mycobacterium tuberculosis inducidos durante la inanición, el uso de uno o más de los polipéptidos de fusión o antígenos inducidos durante la inanición de la invención para la preparación de una composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica para utilizarse para la administración a una persona/animal y las composiciones inmunógenas, vacunas o composiciones farmacéuticas como tales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La tuberculosis humana causada por Mycojbacterium tuberculosis (M. tuberculosis) es un grave problema de salud mundial, responsable de aproximadamente 3 millones de muertes al año, de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud. La incidencia a nivel mundial de nuevos casos de tuberculosis (TB) había estado descendiendo durante las décadas de 1960 y 1970 pero durante años recientes esta tendencia ha cambiado marcadamente debido en parte a la llegada del SIDA y la aparición de cepas resistentes a múltiples fármacos de M. tuberculosis . La única vacuna actualmente disponible para uso clínico es BCG, una vacuna cuya eficacia permanece siendo un tema de controversia. La BCG induce generalmente un alto nivel de resistencia adquirida en modelos animales de TB y en humanos es protectora contra las formas diseminadas de tuberculosis tales como meningitis y tuberculosis miliar. Cuando se administra a niños jóvenes, es protectora contra la tuberculosis durante varios años pero luego la eficacia se desvanece. Una comparación de varias pruebas controladas reveló que la eficacia de protección de la BCG en adultos varió dramáticamente con un intervalo de eficacia desde la ineficacia hasta 80% de protección. Esto hace que el desarrollo de una vacuna nueva y mejorada contra M. tuberculosis sea un tema urgente, al cual la Organización Mundial de la Salud le ha dado una prioridad muy alta. Se han hecho muchos intentos para definir sustancias micobacterianas protectoras y diferentes investigadores han reportado una resistencia incrementada después de la vacunación experimental. La M. tuberculosis mantiene, así como también secreta, varias proteínas de relevancia potencial para la generación de una nueva vacuna contra la M. tuberculosis . La búsqueda de moléculas candidatas se ha enfocado principalmente en proteínas liberadas de la división de bacterias. A pesar de la caracterización de un gran número de estas proteínas solo se ha demostrado que algunas de éstas inducen una respuesta inmune protectora como vacunas de subunidades en modelos animales, más notablemente ESAT-6 y Ag85B (Brandt y colaboradores 2000) . Sin embargo, la demostración de una respuesta inmune, protectora, específica a largo plazo con la potencia de la BCG o la capacidad de refuerzo en una persona que se vacuna con la BCG todavía no se ha logrado. En el mejor de los casos, el refuerzo de la BCG con la BCG no tiene efecto [Colditz, 1994] . El refuerzo de la BCG se ha realizado con Ag85a (Brooks y colaboradores IAI 2001; O0204018) en una cepa endogámica de ratón conduciendo a alguna protección, aunque en comparación con la BCG sola no fue significativamente mejor. Puesto que la BCG necesita dividir y secretar proteínas a fin de inducir una respuesta inmune protectora, la carencia de un efecto de refuerzo es principalmente debido a ya sea la sensibilización con micobacterias ambientales o una respuesta inmune residual de la vacunación primaria con la BCG. Ambos eventos conducen a una respuesta inmune rápida contra la BCG y por lo tanto una inhibición rápida del crecimiento y la eliminación de la BCG. El curso de una infección con M. tuberculosis pasa esencialmente a través de 3 fases. Durante la fase aguda, las bacterias proliferan en los órganos, hasta que se incrementa la respuesta inmune. Los linfocitos CD4 T sensibilizados específicamente median el control de la infección y la molécula mediadora mucho más importante parece ser interferón gamma (IFN-gamma) . Las cargas bacterianas comienzan a descender y se establece una fase latente donde la carga bacteriana se mantiene estable a un nivel bajo. En esta fase, la M. tuberculosis va de una multiplicación activa a un letargo, no reproduciéndose esencialmente y permaneciendo dentro del granuloma. En algunos casos, la infección va a la fase de reactivación, donde las bacterias letárgicas comienzan la reproducción nuevamente. Se ha sugerido que la transición de M. tuberculosis de la infección primaria a la latencia es realizada por cambios en la expresión de genes (Honer zu Bentrup, 2001) . También es probable que ocurran cambios en la especificidad hacia antígenos de la respuesta inmune, ya que las bacterias modulan la expresión de genes durante su transición de una reproducción activa al letargo. El carácter completo de la respuesta inmune que controla la infección latente y los factores que conducen a la reactivación se desconocen en su mayor parte. Sin embargo, existe alguna evidencia para un cambio en los tipos de células dominantes responsables . Puesto que las células CD4 T son esenciales y suficientes para controlar la infección durante la fase aguda, los estudios sugieren que las respuestas de las células CD8 T son más importantes en la fase latente. En 1998, Colé y colaboradores publicaron la secuencia completa del genoma de M. tuberculosis y predijeron la presencia de aproximadamente 4000 marcos de lectura abiertos (Colé y colaboradores 1998) dando a conocer secuencias de nucleótidos y secuencias de proteínas putativas. Sin embargo, es importante destacar que esta información de secuencias no puede utilizarse para predecir si el ADN es traducido o expresado como proteínas in vivo. Se sabe que algunos genes de M. tuberculosis son regulados por incremento bajo condiciones que imitan una latencia. Sin embargo, éstos son un subconjunto limitado de la expresión de genes total durante la infección latente. Además, como una persona experta en el campo apreciará fácilmente, la expresión de un gen no es suficiente para hacerlo un buen candidato para vacuna. La única manera para determinar si una proteína es reconocida por el sistema inmune durante una infección latente con M. tuberculosis es producir una proteína dada y someterla a prueba en un ensayo apropiado como se describe en este documento. Una variedad de proteínas son de importancia particular y tienen potencial para ser antígenos tardíos (antígenos reconocidos durante la infección latente) puesto que son expresados principalmente en un tiempo relativamente prolongado después de la infección donde el sistema inmune ha montado la primera defensa adaptable y el ambiente se ha tornado más hostil para las micobacterias . Las condiciones hipóxicas del cultivo in vitro, las cuales imitan las condiciones de baja tensión de oxígeno han sido sugeridas previamente como relevantes en este respecto y se han utilizado para analizar los cambios en la expresión de genes. Se ha descubierto que una variedad de antígenos son inducidos o regulados por incremento marcadamente bajo estas condiciones por ejemplo el antígeno de 16 kDa a-crystalin (Sherman 2001) , Rv2660c y Rv2659c (Betts, 2002) (solicitud propia) . Otro estímulo ambiental el cual puede ser de interés particular es la inanición diseñada para reflejar qué nutrientes son restringidos en el granuloma (la ubicación de la infección latente) y por lo tanto qué productos expresados por genes regulados por incremento bajo inanición pueden ser de interés particular como objetivos de antígenos durante la etapa latente de la infección. De más de 200 mil antígenos que se sabe que son expresados durante la infección primaria y que se sometieron a prueba como vacunas, menos de media docena tienen un potencial significativo demostrado. Hasta ahora se ha mostrado que solo un antígeno tiene algún potencial como vacuna terapéutica (Lowrie, 1999) . Sin embargo, esta vacuna solo funciona si es administrada como una vacuna de ADN y ha probado ser controversial, con otros grupos que reclaman que la vacunación utilizando este protocolo induce ya sea la protección no específica o empeora aún la enfermedad (Turner, 2000) . En contraste, los polipéptidos de fusión descritos en la invención pueden incorporarse en una vacuna que utiliza una tecnología de vacunación bien reconocida, como se demuestra en los ejemplos proporcionados. Además, puesto que las vacunas contra la TB no dan por resultado una inmunidad esterilizante preferiblemente que el control de la infección a un nivel subclínico (dando por resultado con lo cual el establecimiento subsecuente de una infección latente) , una vacuna de múltiples fases que combina componentes con actividad profiláctica y terapéutica se describe en esta invención. Después de la vacunación profiláctica convencional, la evasión de la respuesta inmune primaria y el desarrollo subsecuente de una enfermedad latente se debe probablemente al menos en parte al cambio en el perfil antigénico de las bacterias invasoras . De esta manera, la vacunación con antígenos asociados con la TB latente debe prevenir o reducir el establecimiento de una infección latente y por lo tanto, una vacuna que incorpora antígenos expresados por las bacterias tanto en la primera fase de crecimiento logarítmico como durante la enfermedad latente debe mejorar la inmunidad a largo plazo cuando se utiliza como una vacuna profiláctica. Obviamente, esta vacuna de múltiples fases también será eficiente como una vacuna terapéutica atendiendo con lo cual el problema referente a que la mayoría de la población en el tercer mundo quien recibiría en e futuro una vacuna contra la TB ya estaría infectada de manera latente .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a una composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica para prevenir (inclusive la vacunación de refuerzo y vacunas de múltiples fases) y/o tratar una infección causada por una especie del complejo de M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. £>ovis, M. africanum etcétera) , la composición inmunógena, la vacuna o composición farmacéutica comprenden un antígeno inducido durante la inanición o un polipéptido de fusión el cual comprende uno o más antígenos contra M. tuberculosis inducidos durante la inanición, las unidades del polipéptido de fusión son antígenos contra la M. tuberculosis. También, la invención se refiere a los polipéptidos de fusión como tales y a una secuencia de ácido nucleico que codifica este polipéptido de fusión.

Además, la invención se refiere al uso de péptido (s) solapante (s) o no solapante (s) corto (s) o largo (s) hecho (s) de manera sintética o recombinante. Además, la invención se refiere al uso de un antígeno inducido durante la inanición o una secuencia de polipéptido de fusión o secuencia de ácido nucleico de la invención para preparar la composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica y la vacuna o composición farmacéutica producida de esta manera. Además, la invención se refiere al uso de una vacuna que comprende un antígeno inducido durante la inanición o una secuencia de polipéptido de fusión o secuencia de ácido nucleico de la invención administrada al mismo tiempo que la BCG, ya sea mezclada con la BCG o administrada por separado en diferentes sitios o rutas para preparar la composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica. Además, la invención se refiere al uso de una vacuna que comprende un antígeno inducido durante la inanición o una secuencia de polipéptido de fusión o secuencia de ácido nucleico administrada como un refuerzo de la BCG. Además, al incluir antígenos que son expresados tanto temprano como tarde durante una infección natural, la vacuna conducirá a una respuesta inmune de dos pasos permitiendo que el sistema inmune combata al agente patógeno con cualquier epítopo que sea más eficiente en un cierto punto de tiempo inclusive durante la latencia.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención da a conocer composiciones inmunógenas, una vacuna o una composición farmacéutica que comprenden un antígeno inducido durante la inanición o un polipéptido de fusión que comprende uno o más antígenos inducidos durante la inanición. Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de estos antígenos inducidos durante la inanición (regulados por incremento más de 6.5 veces durante la inanición o unidos genéticamente a un gen inducido durante la inanición) aparecen en el listado de secuencias que sigue: En el presente contexto, el polipéptido inmunógeno individual basado en polipéptidos derivados de M. tuberculosis se denomina una "unidad" del polipéptido de fusión. La fusión puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o aún 10 unidades diferentes. El orden de las unidades del polipéptido de fusión puede ser cualquier combinación. En términos del orden, los polipéptidos de fusión de todos los antígenos anteriores en cualquier combinación están dentro del alcance de la presente invención. Los polipéptidos de fusión de la invención son útiles para la preparación de una composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica, en particular una vacuna reforzadora de la BCG, como será descrito detalladamente a continuación. Los polipéptidos preferidos que constituyen unidades de los polipéptidos de fusión junto con los polipéptidos inducidos durante la inanición tienen el siguiente número de identidad de Sanger y secuencias de aminoácidos: Las combinaciones preferidas de polipéptidos de fusión comprenden los siguientes polipéptidos en varias combinaciones en orden de unidades con uno o más antígenos inducidos durante la inanición. (X) : ESAT6-Ag85A-X, ESAT6-Ag85B-X, Ag8A-X, Ag85B-X, TB10-Ag85A-X, TB10-Ag85B-X donde X es cualquiera de los antígenos inducidos durante la inanición y donde el orden de las unidades de antígenos puede ser cualquier combinación por ejemplo donde el orden es invertido o X se coloca a la mitad, etcétera. Pero el polipéptido de fusión podría construirse a partir de cualquier otra combinación de uno o más antígenos inducidos durante la inanición con uno o más antígenos de M. tuberculosis. Dentro del alcance de la presente invención se encuentra un análogo de un polipéptido de fusión el cual tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencias de al menos 80% con cualquier parte de cualquiera de los polipéptidos de fusión de la invención y el cual es inmunógeno y una secuencia de ácido nucleico la cual codifica este polipéptido. Estos análogos están comprendidos dentro del término "polipéptido de la invención" o "polipéptido de fusión de la invención" , términos que se utilizan de manera intercambiable por toda la especificación y las reivindicaciones. Por el término "secuencia de ácido nucleido de la invención" se propone una secuencia de ácido nucleico que codifica este polipéptido. Además, dentro del alcance de la presente invención se encuentra el (los) péptido (s) corto (s) o largo (s) solapante (s) o no solapante (s) el (los) cual (es) tiene (n) una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencias de al menos 80% con cualquiera de los polipéptidos de fusión de la invención y el (los) cual (es) es (son) inmunógeno (s) . Una modalidad actualmente preferida de la invención es una vacuna para reforzar la inmunidad de una vacunación previa con la BCG, es decir la vacuna se administra a individuos vacunados previamente con la BCG. Este primer aspecto de la invención comprende una variante del antígeno inducido durante la inanición mencionado anteriormente o un polipéptido de fusión el cual se vuelve lípido para permitir un efecto autoadyuvante del polipéptido . La composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica de la invención se puede administrar por medio del suministro en las mucosas, por ejemplo por vía oral, nasal, bucal o tradicionalmente por vía intramuscular, intradérmica, por medio de una inyección subcutánea o por vía transdérmica o cualquier otra ruta adecuada, por ejemplo por vía rectal. En otra modalidad, la invención da a conocer el uso de un antígeno inducido durante la inanición o un polipéptido de fusión como se definió anteriormente para la preparación de una composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica que se puede utilizar para una vacunación profiláctica junto con la BCG, una vacuna reforzadora o la vacunación terapéutica contra una infección causada por una micobacteria virulenta, por ejemplo por ycohac erium tuberculosis , Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium lepra o Mycobacterium ulcerans . En un segundo aspecto, la invención da a conocer una composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno inducido durante la inanición o un polipéptido de fusión como se definiera anteriormente o comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria para el mismo que es capaz de hibridizarse con la secuencia de ácido nucleico de la invención bajo condiciones restrictivas . El fragmento de ácido nucleico es preferiblemente un fragmento de ADN. El fragmento se puede utilizar como una composición farmacéutica como se describe a continuación . En una modalidad, la invención da a conocer una composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica que comprende un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la invención, insertado opcionalmente en un vector. La vacuna da por resultado la expresión in vivo de un antígeno por un animal, inclusive un ser humano, a quien se ha administrado la vacuna, la cantidad de antígeno expresado es efectiva para conferir una resistencia sustancialmente incrementada a la tuberculosis causada por micobacterias virulentas, por ejemplo por Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium lepra o Mycobacterium ulcerans, en un animal, inclusive un ser humano . En una modalidad adicional, la invención da a conocer el uso de una composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica que comprende un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la invención para una vacunación terapéutica contra la tuberculosis causada por una micobacteria virulenta. En una modalidad aún adicional, la invención da a conocer una composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica que se puede utilizar para la vacunación profiláctica junto con la BCG o una vacuna reforzadora para una persona vacunada previamente con la BCG para inmunizar un animal, inclusive un ser humano, contra la tuberculosis causada por una micobacteria virulenta, por ejemplo por Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium lepra o Mycobacterium ulcerans, que comprende como el componente efectivo un microorganismo que no es patógeno, tal como la BCG de vaccinia, adenovirus o Mycobacterium bovis, en donde al menos una copia de un fragmento de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de fusión como se definiera anteriormente se ha incorporado en el microorganismo (por ejemplo se ha colocado en un plásmido o en el genoma) de una manera que permite que el microorganismo exprese y secrete opcionalmente el polipéptido de fusión. En otra modalidad, la invención da a conocer un vector de expresión infeccioso, tal como la BCG de vaccinia, adenovirus o Mycobacterium bovis que comprende un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la invención y una célula transformada que alberga al menos este vector. En un tercer aspecto, la invención da a conocer un método para inmunizar y reforzar la inmunidad de un animal, inclusive un ser humano, contra la tuberculosis causada por micobacterias virulentas, por ejemplo por Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium lepra o Mycobacterium ulcerans, el método comprende administrar al animal el polipéptido de fusión definido anteriormente, la composición inmunógena de acuerdo con0 la invención o la vacuna de acuerdo con la invención. En un cuarto aspecto, la invención da a conocer un método para tratar a un animal, inclusive un ser humano, que tiene tuberculosis, activa o latente, causada por micobacterias virulentas, por ejemplo por Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium lepra o Mycobacterium ulcerans, el método comprende administrar al animal la composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica como se definió anteriormente. En un quinto aspecto, la invención da a conocer el uso de un antígeno inducido durante la inanición o un polipéptido de fusión o fragmento de ácido nucleico como se definió anteriormente para la preparación de una composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica en combinación con la BCG de M. bovis, por ejemplo para una vacunación profiláctica (inclusive de refuerzo) o terapéutica contra una infección causada por una micobacteria virulenta, por ejemplo por Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium lepra o Mycobacterium ulcerans. La vacuna, composición inmunógena, vacuna y composición farmacéutica de acuerdo con la invención se pueden utilizar profilácticamente en un sujeto que no está infectado con una micobacteria virulenta o en un individuo vacunado previamente con la BCG de M. tuberculosis o terapéuticamente en un sujeto infectado con una micobacteria virulenta. Se debe entender que las modalidades del primer aspecto de la invención, tales como los polipéptidos inmunógenos descritos, también aplican a todos los otros aspectos de la invención; y viceversa. Por toda esta especificación, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprenden" o variaciones de la misma tales como "comprende" o "que comprende" implica la inclusión de un elemento establecido o número entero o grupo de elementos o números enteros pero no la exclusión de ningún otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

DEFINICIONES Inanición Por el término "inanición" se entiende como la privación de un organismo de su fuente de carbono, nitrógeno o energía, cualquier combinación de los anteriores o aún todos éstos .

Proteínas inducidas durante la inanición Por el término "proteínas inducidas durante la inanición" se entiende cualquier proteína que a nivel transcripcional o de proteínas es inducida (incrementada) al menos 6.5 veces después de la tensión de la micobacteria por la inanición.

Combinación con la BCG de M. bovis Por el término "combinación con la BCG de M. bovis" se entiende la co-administración con cualquier cepa de la BCG de M. bovis que incluye Pasteur, Phipps , Frappier, Connaught, Tice, Denmark, Glaxo, Prague, Birkhaug, Sweden, Japan, Moreau y Russia en cantidades que conducen ya sea a una respuesta inmune específica significativamente incrementada o a una protección significativa en un modelo animal o un humano ya sea junto con uno o más de los polipéptidos de fusión definidos anteriormente o con uno o más de los fragmentos de ácido nucleico que los codifican o administrada al mismo tiempo pero en sitios o rutas separadas.

Refuerzo de la BCG de M. bovis Por el término "refuerzo de la BCG de M. bovis" se entiende la administración de uno o más polipéptidos de fusión como se definió anteriormente o uno o más fragmentos de ácido nucleico que los codifican en cualquier período después de la vacunación con cualquier cepa de la BCG de M. bovis que incluye Pasteur, Phipps, Frappier, Connaught, Tice, Denmark, Glaxo, Prague, Birkhaug, Sweden, Japan, Moreau y Russia en cantidades que conducen ya sea a una respuesta inmune específica significativamente incrementada o una protección significativamente incrementada en un modelo animal o un humano.

Polipéptido Un polipéptido preferido para utilizarse como una unidad de los polipéptidos de fusión de la presente invención es un polipéptido inmunógeno de M. tuberculosis. Este polipéptido puede basarse por ejemplo en un polipéptido derivado de la célula de M. tuberculosis y/o el producto filtrado del cultivo de M. tuberculosis. El polipéptido será normalmente un polipéptido recombinante o sintético y puede consistir del polipéptido inmunógeno, una porción inmunógena del mismo o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales pueden derivarse del antígeno de M. tuberculosis nativo o pueden ser heterólogas y estas secuencias pueden ser, pero no es necesario que sean, inmunógenas . El término "polipéptido de fusión" se entiende como un orden aleatorio de dos o más polipéptidos inmunógenos de M. tuberculosis o análogos del mismo fusionados con o sin un (unos) separador (es) de aminoácido de longitud y secuencia arbitrarias. La palabra "polipéptido" en la presente invención debe tener su significado usual. Es decir, una cadena de aminoácidos de cualquier longitud, inclusive una proteína de longitud completa, oligopéptido, péptido corto y fragmento del mismo y polipéptido de fusión, en donde los residuos de aminoácidos son unidos por enlaces de péptidos covalentes . El polipéptido se puede modificar químicamente al someterse a la glicosilación, al someterse a la lipidación (por ejemplo por medio de la lipidación química con palmitoiloxi-succinimida como es descrito por Mowat y colaboradores 1991 o con cloruro de dodecanoilo como es descrito por Lustig y colaboradores 1976) , al comprender grupos prostéticos o al contener aminoácidos adicionales tales como por ejemplo una etiqueta de his o un péptido de señal . Cada polipéptido inmunógeno será caracterizado por aminoácidos específicos y será codificado por secuencias de ácido nucleico específicas. Dentro del alcance de la presente invención se encuentran estas secuencias y análogos y variantes producidos por medio de métodos recombinantes o sintéticos en donde estas secuencias de polipéptidos han sido modificadas por medio de la sustitución, inserción, adición o supresión de uno o más residuos de aminoácidos en el polipéptido recombinante mientras que aún son inmunógenas en cualquiera de los ensayos biológicos descritos en este documento. Las sustituciones son preferiblemente "conservadoras" . Éstas se definen de acuerdo con la siguiente tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna pueden sustituirse entre sí. Los aminoácidos en la tercera columna se indican en un código de una letra.

Cada polipéptido es codificado por una secuencia de ácido nucleico específica. Dentro del alcance de la presente invención se encuentran los análogos y estas secuencias de ácido nucleico las cuales han sido modificadas por medio de la sustitución, inserción, adición o supresión de uno o más ácidos nucleicos. Las sustituciones son preferiblemente sustituciones taciturnas en el uso de codones lo cual no conducirá a ningún cambio en la secuencia de aminoácidos, pero se pueden introducir para mejorar la expresión de la proteína.

Fragmento de ácido nucleico Por los términos "fragmento de ácido nucleico" y "secuencia de ácido nucleico" se entiende cualquier molécula de ácido nucleico que incluya ADN, ARN, ANB (ácidos nucleicos bloqueados) , ANP, ARN, AR?dc e híbridos de AR?-AD?. También están incluidas las moléculas de ácido nucleico que comprenden nucleósidos que no son de origen natural. El término incluye moléculas de ácido nucleico de cualquier longitud por ejemplo de 10 a 10000 nucleótidos, dependiendo del uso. Cuando la molécula de ácido nucleico es para el uso como un producto farmacéutico, por ejemplo en la terapia de AD?, o para el uso en un método para producir un polipéptido de acuerdo con la invención, se utiliza preferiblemente una molécula que codifica al menos un epítopo, que tiene una longitud de aproximadamente 18 a aproximadamente 1000 nucleótidos, la molécula es insertada opcionalmente en un vector. Cuando la molécula de ácido nucleico se utiliza como una sonda, como un cebador o en una terapia antisentido, se utiliza preferiblemente una molécula que tiene una longitud de 10-100. De acuerdo con la invención, se pueden utilizar otras longitudes de molécula, por ejemplo una molécula que tiene al menos 12, 15, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 o 1000 nucleótidos (o derivados de nucleótidos), o una molécula que tiene como máximo 10000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 700, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30 o 20 nucleótidos (o derivados de nucleótidos) . El término "restrictivo" cuando se utiliza en conjunto con las condiciones de hibridación es como se define en el campo, es decir la hibridación se realiza a una temperatura no mayor de 15-20°C bajo el punto de fusión Tm, véase Sambrook y colaboradores, 1989, páginas 11.45-11.49. Preferiblemente, las condiciones son "sumamente restrictivas", es decir 5-10°C bajo el punto de fusión Tm. Identidad de secuencias El término "identidad de secuencias" indica una medida cuantitativa del grado de homología entre dos secuencias de aminoácidos de una longitud sustancialmente igual o entre dos secuencias de ácido nucleico de una longitud sustancialmente igual. Las dos secuencias a ser comparadas deben alinearse para el mejor ajuste posible con la inserción de espacios o alternativamente el truncamiento en los extremos de las secuencias de proteínas. La identidad de secuencias se puede calcular como rM<>jfi— en donde Ndlf es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en donde Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por lo tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencias de 75% con la secuencia AATCAATC (Ndif=2 y Nref=8) . Un espacio se cuenta como falta de identidad del(los) residuo(s) específico (s) , es decir la secuencia de ADN AGTGTC tendrá una identidad de secuencias de 75% con la secuencia de ADN AGTCAGTC (Ndif=2 y Nrßf=8) . La identidad de secuencias puede calcularse alternativamente por medio del programa BLAST por ejemplo el programa BLASTP (Pearson W.R y D.J. Lipman (1988) ) (www. ncbi . nlm.nih. gov/cgi-bin/BLAST) . En una modalidad de la invención, el alineamiento se realiza con el método de alineamiento de secuencias ClustalW con parámetros por omisión como es descrito por Thompson J. y colaboradores 1994, disponible en http: //www2. ebi . ac .uk/clustalw/ . Un porcentaje mínimo preferido de identidad de secuencias es al menos 80%, tal como al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% y al menos 99.5%. Preferiblemente, los números de sustituciones, inserciones, adiciones o supresiones de uno o más residuos de aminoácidos en el polipéptido de fusión están limitados, es decir no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 sustituciones, no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 inserciones, no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 adiciones y no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 supresiones en comparación con las unidades de polipéptidos inmunógenos en base a los polipéptidos derivados de M. tuberculosis.

Porción inmunógena El polipéptido de la invención comprende una porción inmunógena, tal como un epitopo para una célula B o una célula T. La porción inmunógena de un polipéptido inmunógeno es la parte del polipéptido, la cual produce una respuesta inmune en un animal o un ser humano y/o en una muestra biológica determinada por cualquiera de los ensayos biológicos descritos en este documento. La porción inmunógena de un polipéptido puede ser un epítopo de células T o un epítopo de células B. Las porciones inmunógenas pueden estar relacionadas con una o algunas partes relativamente pequeñas del polipéptido, pueden estar esparcidas por toda la secuencia del polipéptido o pueden estar situadas en partes específicas del polipéptido. Para algunos polipéptidos, se ha demostrado aún que los epítopos están esparcidos por todo el polipéptido cubriendo la secuencia completa (Ravn y colaboradores 1999) . A fin de identificar los epítopos de células T relevantes que son reconocidos durante una respuesta inmune, es posible utilizar un método de "fuerza bruta": puesto que los epítopos de células T son lineales, los mutantes de supresión del polipéptido, si son construidos sistemáticamente, revelarán qué regiones del polipéptido son esenciales en el reconocimiento inmune, por ejemplo al sujetar estos mutantes de supresión por ejemplo al ensayo de IFN- (descrito en este documento) . Otro método utiliza oligopéptidos solapantes para la detección de los epítopos de MHC clase II, preferiblemente sintéticos, que tienen una longitud de por ejemplo 20 residuos de aminoácidos derivados del polipéptido. Estos péptidos pueden someterse a prueba en ensayos biológicos (por ejemplo en el ensayo de IFN- (descrito en este documento) y algunos de éstos tendrán una respuesta positiva (y por lo cual serán inmunógenos) como es evidenciado por la presencia de un epítopo de célula T en el péptido. Para la detección de los epítopos de MHC clase I, es posible predecir los péptidos que se enlazarán (Stryhn y colaboradores 1996) y por lo tanto producirán sintéticamente estos péptidos y someterlos a prueba en ensayos biológicos relevantes por ejemplo el ensayo de IFN- (como es descrito en este documento) . Los péptidos que tienen preferiblemente una longitud de por ejemplo 8 a 11 residuos de aminoácidos derivados del polipéptido. Los epítopos de células B se pueden determinar por medio del análisis del reconocimiento de células B para péptidos solapantes que cubren el polipéptido de interés como es descrito por ejemplo en Harboe y colaboradores 1998. Las porciones inmunógenas de polipéptidos pueden ser reconocidas por una parte amplia (alta frecuencia) o por una parte menor (baja frecuencia) de la población humana genéticamente heterogénica. Además, algunas porciones inmunógenas inducen altas respuestas inmunológicas (dominantes) , mientras que otras inducen respuestas más bajas, pero aún significativas (subdominantes) . La alta frecuencia >< baja frecuencia puede relacionarse con la porción inmunógena que se enlaza a las moléculas de MHC ampliamente distribuidas (tipo HLA) o aún por las múltiples moléculas de MHC (Kilgus y colaboradores 1991, Sinigaglia y colaboradores 1988).

Análogos Una característica común de los polipéptidos de fusión de la invención es su capacidad para inducir una respuesta inmunológica como se ilustra en los ejemplos. Se entiende que dentro del alcance de la presente invención se encuentran los análogos de un polipéptido de fusión de la invención producido por medio de la sustitución, inserción, adición o supresión que también es inmunógeno como se determina por medio de cualquiera de los ensayos descritos en este documento.

Sustancialmente puro En el presente contexto, el término "polipéptido sustancialmente puro" significa una preparación de polipéptido que contiene a lo sumo 5% en peso de otro material de polipéptido con el cual está asociado de manera natural o durante una producción recombinante o sintética (se prefieren porcentajes más bajos de otro material de polipéptido, por ejemplo a lo sumo 4%, a lo sumo 3%, a lo sumo 2%, a lo sumo 1% y a lo sumo 14%) . Se prefiere que el polipéptido sustancialmente puro sea al menos 96% puro, es decir que el polipéptido constituya al menos 96% en peso del material de polipéptido total presente en la preparación y se prefieren porcentajes más altos, tal como al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99.25%, al menos 99.5% y al menos 99.75%. Se prefiere especialmente que el polipéptido esté en "forma esencialmente pura", es decir que el polipéptido esté esencialmente libre de cualquier otro antígeno con el cual está asociado de manera natural, es decir que esté libre de cualquier otro antígeno de bacterias que pertenecen al complejo de tuberculosis o una micobacteria virulenta. Esto se puede realizar al preparar el polipéptido por medio de métodos recombinantes en una célula hospedante que no es micobacteriana como será descrito en detalle posteriormente o al sintetizar el polipéptido por medio de los métodos bien conocidos de síntesis de péptidos en fase sólida o líquida, por ejemplo por medio del método descrito por Merrifield o variantes del mismo y al utilizar procedimientos de purificación apropiados que son bien conocidos para la persona de experiencia ordinaria en el campo.

Micobacteria virulenta individual infectada actualmente e individual inmune Por el término "micobacteria virulenta" se entiende una bacteria capaz de causar la enfermedad de tuberculosis en un animal o en un ser humano. Los ejemplos de las micobacterias virulentas son Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium lepra o Mycobacterium ulcerans . Los ejemplos de animales relevantes son ganado bovino, zarigüeyas, tejones, búfalos, leones, kurus y canguros. Por "un animal o humano infectado actualmente con una bacteria virulenta" se entiende un individuo con una infección probada por medio de cultivo o microscópicamente con micobacterias virulentas y/o un individuo diagnosticado clínicamente con TB y quien es sensible a una quimioterapia anti-TB. Las diagnosis por medio de cultivo, microscopio y clínicas de TB son bien conocidas por cualquier persona experta en el campo. Un individuo inmune se define como una persona o un animal el cual se ha librado de o ha controlado una infección con una micobacteria virulenta o ha recibido una vacunación con la BCG de M. bovis.

Inmunógeno Un polipéptido inmunógeno se define como un polipéptido que induce una respuesta inmune. La respuesta inmune puede ser supervisada por medio de uno de los siguientes métodos: Una respuesta celular in vitro se determina por la liberación de una citocina relevante tal como IFN- ( , de linfocitos retirados de un animal o humano infectado actualmente o previamente con micobacterias virulentas o por la detección de la proliferación de estas células T. La inducción se realiza por la adición del polipéptido o la porción inmunógena a una suspensión que comprende de 1x105 células a 3x105 células por pocilio. Las células se aislan de ya sea la sangre, el bazo, el hígado o el pulmón y la adición del polipéptido o la porción inmunógena del polipéptido da por resultado una concentración no mayor que 20 g por ml de suspensión y la estimulación se realiza de dos a cinco días. Para supervisar la proliferación celular, las células son impulsadas con Timidina con etiqueta radioactiva y después de 16-22 horas de incubación, la proliferación es detectada por medio del conteo de centelleo líquido. Una respuesta positiva es una respuesta mayor que el fondo más dos desviaciones estándar. La liberación de IFN- ( se puede determinar por medio del método ELISA, el cual es bien conocido para una persona experta en el campo. Una respuesta positiva es una respuesta mayor que el fondo más dos desviaciones estándar. Otras citocinas diferentes de IFN- ( podrían ser relevantes cuando se supervisa una respuesta inmunológica para el polipéptido, tal como IL-12, TNF-(, IL-4, IL-5, IL-10, IL-6, TGF- ( . Un método diferente y más sensible para determinar la presencia de una citocina (por ejemplo IFN-0 es el método ELISPOT donde las células aisladas de ya sea la sangre, el bazo, el hígado o el pulmón se diluyen a una concentración preferible de 1 a 4 x 106 células/ml y se incuban durante 18-22 horas en presencia del polipéptido o la porción inmunógena del polipéptido dando por resultado una concentración no mayor que 20 g por ml . Las suspensiones de células son diluidas en el futuro de 1 a 2 x 106/ml y son transferidas a placas Maxisorp revestidas con anti-IFN- ( y son incubadas preferiblemente de 4 a 16 horas. Las células que producen IFN- (son determinadas por el uso de un anticuerpo anti-IFN secundario etiquetado y un substrato relevante que da origen a manchas, las cuales pueden ser enumeradas utilizando un microscopio de disección. También es una posibilidad el determinar la presencia del ARNm que codifica la citocina relevante por medio del uso de la técnica de PCR. Usualmente, una o más citocinas serán medidas utilizando por ejemplo las técnicas de PCR, ELISPOT o ELISA. Será apreciado por una persona experta en el campo que un incremento significativo o una disminución significativa en la cantidad de cualquiera de estas citocinas inducidos por un polipéptido específico se pueden utilizar en la evaluación de la actividad inmunológica del polipéptido. Una respuesta celular in vitro también puede ser determinada por medio del uso de líneas de células T derivadas de un individuo inmune o una persona infectada con M. tuberculosis donde las líneas de células T han sido conducidas ya sea con micobacterias vivas, extractos de la célula bacteriana o filtrado de cultivo durante 10 a 20 días con la adición de IL-2. La inducción se realiza por la adición de no más de 20 g de polipéptido por ml de suspensión a las líneas de células T que contienen de 1x105 células a 3x105 células por pocilio y la incubación se realiza de dos a seis días. La inducción de IFN- ( o la liberación de otra citocina relevante es detectada por el ensayo ELISA. La estimulación de células T también se puede supervisar al detectar la proliferación de células utilizando Timidina etiquetada de manera radioactiva como se describiera anteriormente. Para ambos ensayos, una respuesta positiva es una respuesta mayor que el fondo más dos desviaciones estándar. Una respuesta celular in vivo puede determinarse como una respuesta positiva de DTH después de la inyección intradérmica o un parche de aplicación local de a lo sumo 100 g del polipéptido o la porción inmunógena a un individuo quien está infectado clínica o subclínicamente con una Micobacteria virulenta, una respuesta positiva que tiene un diámetro de al menos 5 mm 72-96 horas después de la inyección o aplicación. Una respuesta humoral in vitro es determinada por una respuesta específica de anticuerpos en un individuo inmune o infectado. La presencia de anticuerpos se puede determinar por medio de una técnica de ELISA o una inmunotransferencia Western donde el polipéptido o la porción inmunógena es absorbido a ya sea una membrana de nitrocelulosa o una superficie de poliestireno. El suero se diluye preferiblemente en PBS de 1:10 a 1:100 y se agrega al polipéptido absorbido y la incubación se realiza de 1 a 12 horas. Por medio del uso de los anticuerpos secundarios etiquetados, se puede determinar la presencia de anticuerpos específicos al medir la presencia o ausencia de una etiqueta específica por ejemplo por medio del ensayo ELISA donde una respuesta positiva es una respuesta de más del fondo más dos desviaciones estándar o alternativamente una respuesta visual en una inmnotransferencia Western. Otro parámetro relevante es la medición de la protección en modelos animales inducida después de la vacunación con el polipéptido en un adyuvante o después de la vacunación de ADN. Los modelos animales adecuados incluyen primates, cobayos o ratones, los cuales son sometidos a un reto con una infección de una Micobacteria virulenta. La lectura para la protección inducida podría ser una disminución de la carga bacteriana en órganos objetivo en comparación con los animales no vacunados, tiempos de supervivencia prolongados en comparación con los animales no vacunados y pérdida de peso o patología disminuida en comparación con los animales no vacunados.

Métodos de preparación En general, los polipéptidos de fusión de la invención y las secuencias de ADN que codifican estos polipéptidos de fusión se pueden preparar por medio del uso de cualquiera de una variedad de procedimientos . El polipéptido de fusión puede producirse de manera recombinante utilizando una secuencia de ADN que codifica el polipéptido, que se ha insertado en un vector de expresión y se ha expresado en un hospedante apropiado.

Los ejemplos de células hospedantes son E. coli. También se pueden producir sintéticamente los polipéptidos de fusión que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos y generalmente menos de 50 aminoácidos y se pueden generar utilizando técnicas bien conocidas para aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo, tales como las técnicas en fase sólida comercialmente disponibles donde los aminoácidos se agregan secuencialmente a cadenas crecientes de aminoácidos. Los polipéptidos de fusión también se pueden producir con un compañero de fusión adicional, métodos por medio de los cuales se pueden lograr características superiores del polipéptido de la invención. Por ejemplo, los compañeros de fusión que facilitan la exportación del polipéptido cuando se producen de manera recombinante, los compañeros de fusión que facilitan la purificación del polipéptido y los compañeros de fusión que mejoran la inmunogenicidad del polipéptido de la invención son todos de interés . La invención pertenece en particular a un polipéptido de fusión que comprende fusiones de dos o más polipéptidos inmunógenos basados en polipéptidos derivados de M. tuberculosis. Otros compañeros de fusión, los cuales podrían mejorar la inmunogenicidad del producto, son las linfocinas tales como IFN-?, IL-2 e IL-12. A fin de facilitar la expresión y/o purificación, el compañero de fusión puede ser por ejemplo una proteína fimbrial bacteriana, por ejemplo los componentes de pilus pilina y papA; proteína A; el péptido ZZ (las fusiones ZZ son comercializadas por Pharmacia en Suecia) ; la proteína de enlace a maltosa; glutationa S-transferasa; (-galactosidasa; o polihistidina. Las proteínas de fusión se pueden producir de manera recombinante en una célula hospedante, la cual podría ser E. coli y es una posibilidad para inducir una región conectora entre los diferentes compañeros de fusión. La región conectora entre por ejemplo las unidades de polipéptidos inmunógenas individuales pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o l0 aminoácidos. Los polipéptidos de fusión interesantes son los polipéptidos de la invención, los cuales se someten a la lipidación de manera que el polipéptido inmunógeno es presentado de manera adecuada al sistema inmune. Este efecto es conocido por ejemplo a partir de vacunas basadas en el polipéptido Borrelia burgdorferi OspA como se describe por ejemplo en el documento WO 96/40718 A o vacunas basadas en la lipoproteína Pseudomonas aeruginosa Oprl y (Cote-Sierra J 1998) . Otra posibilidad es la fusión N-terminal de una secuencia de señal conocida y una cisteína N-terminal, al polipéptido inmunógeno. Esta fusión da por resultado la lipidación del polipéptido de fusión inmunógeno en la cisteína N-terminal cuando se produce en un hospedante de producción adecuado.

Vacuna Un aspecto importante de la invención pertenece a una composición de vacuna que comprende un polipéptido de fusión de acuerdo con la invención. A fin de asegurar el desempeño óptimo de esta composición de vacuna se prefiere que comprenda un portador, vehículo o adyuvante inmunológico y farmacéuticamente aceptable. Una vacuna efectiva, en donde un polipéptido de fusión de la invención es reconocido por el animal, en un modelo animal será capaz de disminuir la carga bacteriana en órganos objetivo, prolongar los tiempos de supervivencia y/o disminuir la pérdida de peso o patología después del reto con una Micobacteria virulenta, en comparación con los animales no vacunados. Los portadores adecuados se seleccionan del grupo que consiste de un polímero al cual se enlaza (n) el (los) polipéptido (s) por medio de una interacción hidrófoba que no es covalente, tal como un plástico por ejemplo poliestireno o- un polímero al cual el(los) polipéptido (s) se enlaza (n) covalentemente, tal como un polisacárido o un polipéptido por ejemplo albúmina de suero bovino, ovalbúmina o hemocianina de lapa californiana. Los vehículos adecuados se seleccionan del grupo que consiste de un diluyente y un agente de suspensión. El adyuvante se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de bromuro de dimetiloctadecilamonio (DDA) , bromuro de dimetiloctadecenilamonio (DODAC) , Quil A, poli I:C, hidróxido de aluminio, adyuvante incompleto de Freund, IFN-(, IL-2, IL-12, lípido de monofosforilo A (MPL), Dimicolato de Trehalosa (TDM) , dibehenato de Trehalosa y dipéptido de muramilo (MDP) o extracto de lípido micobacteriano, en particular extractos de lípidos apolares como se da a conocer en el documento PCT/DK2004/000488. La preparación de vacunas las cuales contienen polipéptidos como ingredientes activos es generalmente bien entendida en el campo, como se ejemplifica por las Patentes Norteamericanas Nos. 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231 y 4,599,230, todas incorporadas en este documento a manera de referencia. Otros métodos para lograr un efecto adyuvante para la vacuna incluyen el uso de agentes tales como hidróxido o fosfato de aluminio (alumbre) , polímeros sintéticos de azúcares (CarbopolMR) , agregación de la proteína en la vacuna por medio del tratamiento térmico, agregación por medio de la reactivación con anticuerpos tratados con pepsina (Fab) a albúmina, una mezcla con células bacterianas tales como C. parvum o endotoxinas o componentes de lipopolisacáridos de bacterias gram-negativas, emulsión en vehículos oleosos fisiológicamente aceptables tales como mono-oleato de manida (Aracel AMR) o emulsión con solución al 20 por ciento de un perfluorocarburo (Fluosol-DAMR) utilizado como un sustituto de bloque también se pueden emplear. Otras posibilidades implican el uso de sustancias moduladoras inmunes . tales como citocinas o inductores sintéticos de IFN-gamma tales como poli I:C en combinación con los adyuvantes mencionados anteriormente. Otra posibilidad interesante para lograr un efecto adyuvante es emplear la técnica descrita en Gosselin y colaboradores, 1992 (que se incorpora por este acto a manera de referencia en este documento) . En resumen, un antígeno relevante tal como un antígeno de la presente invención se puede conjugar con un anticuerpo (o un fragmento de anticuerpo de enlace a antígenos) contra los receptores Fc en los monocitos/macrófagos . Para mejorar la vacuna BCG, uno o más antígenos relevantes tales como uno o más polipéptidos de fusión de la presente invención se pueden mezclar con una vacuna BCG antes de la administración y se pueden inyectar junto con la vacuna BCG obteniendo con lo cual un efecto sinérgico que conduce a una mejor protección. Otra posibilidad interesante para lograr un efecto sinérgico es mantener la vacuna BCG y el (los) polipéptido (s) de fusión de la presente invención separados pero utilizarlos al mismo tiempo y administrarlos en diferentes sitios o a través de diferentes rutas. Para reforzar las vacunas BCG utilizadas actualmente, un antígeno relevante tal como uno o más de los polipéptidos de fusión de la presente invención se puede administrar en el momento donde las vacunas BCG comienzan a menguar típicamente o aún antes, tal como 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65 o 70 años después de la vacunación con la BCG. Posteriormente se podría administrar en intervalos regulares, tales como 1, 2, 3, 4, 5 o 10 años, por hasta 5 veces. Las vacunas se administran de manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que serán profilácticas o terapéuticamente efectivas e inmunógenas. La cantidad a administrarse depende del sujeto que es tratado, inclusive por ejemplo la capacidad del sistema inmune del individuo para montar una respuesta inmune y el grado de protección deseado. Los intervalos de dosificación adecuados están en el orden de varios cientos de microgramos del polipéptido de fusión de la invención por vacunación con un intervalo preferido de aproximadamente 0.1 µg a 1000 µg, tal como en el intervalo de aproximadamente 1 µg a 300 µg y especialmente en el intervalo de aproximadamente 10 µg a 100 µg. Los regímenes adecuados para la administración inicial e inyecciones de refuerzo también son variables pero se caracterizan por una administración inicial seguida por inoculaciones subsecuentes u otras administraciones . La forma de aplicación se puede variar ampliamente. Cualquiera de los métodos convencionales para la administración de una vacuna son aplicables. Éstos incluyen la aplicación oral, nasal o a la mucosa en ya sea una forma sólida que contiene los ingredientes activos (tal como una pildora, supositorio o cápsula) o en una dispersión fisiológicamente aceptable, tal como una pulverización, polvo o líquido o por vía parenteral, por medio de una inyección, por ejemplo, aplicada por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular o transdérmica. La dosificación de la vacuna dependerá de la ruta de administración y variará de acuerdo con la edad de la persona que es vacunada y, en un grado menor, el tamaño de la persona que es vacunada. Actualmente, la mayoría de vacunas son administradas por vía intramuscular por medio de una inyección con aguja y esto es probablemente para continuar como la ruta estándar. Sin embargo, se han desarrollado formulaciones de vacuna las cuales inducen una inmunidad mucosa, típicamente por medio del suministro oral o nasal. Uno de los sistemas de suministro más ampliamente estudiados para la inducción de la inmunidad mucosa contiene la toxina del cólera (CT, por sus siglas en inglés) o su subunidad B. Esta proteína mejora las respuestas inmunes de las mucosas e induce la producción de IgA cuando se administra en formulaciones de vacunas. Una ventaja es la facilidad de suministro para vacunas orales o nasales. Las toxinas modificadas de otras especies microbianas, las cuales tienen toxicidad reducida pero una capacidad inmunoestimuladora retenida, tal como la toxina modificada lábil al calor de bacterias Gram-negativas o enterotoxinas de estafilococos también se pueden utilizar para generar un efecto similar. Estas moléculas son particularmente adecuadas para la administración a las mucosas . Las vacunas se administran convencionalmente por vía parenteral, por medio de la inyección, por ejemplo, ya sea por vía subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para supositorios, las sustancias aglutinantes y portadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles y triglicéridos; estos supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0.5% a 10%, preferiblemente 1-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes empleados normalmente tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen ventajosamente 10-95% de ingrediente activo, preferiblemente 25-70%. En muchos casos, será necesario tener múltiples administraciones de la vacuna. Especialmente, las vacunas se pueden administrar para prevenir una infección con micobacterias virulentas y/o para tratar una infección micobacteriana establecida o para reforzar a una persona vacunada previamente con la BCG. Cuando se administra para prevenir una infección, la vacuna se proporciona profilácticamente, antes de que estén presentes los signos clínicos o síntomas definitivos de una infección. Debido a la variación genética, diferentes individuos pueden reaccionar con respuestas inmunes de resistencia variante al mismo polipéptido. Por lo tanto, la vacuna de acuerdo con la invención puede comprender varios polipéptidos de fusión y/o polipéptidos diferentes a fin de incrementar la respuesta inmune. La vacuna puede comprender dos o más polipéptidos de fusión o polipéptidos inducidos durante la inanición o porciones inmonógenas de los mismos, donde todos los antígenos inducidos durante la inanición o polipéptidos de fusión son como se definió anteriormente o algunos pero no todos los polipéptidos pueden derivarse de micobacterias virulentas. En el último ejemplo, los polipéptidos que no satisfacen necesariamente los criterios expuestos anteriormente para los polipéptidos de fusión pueden actuar ya sea debido a su inmunogenicidad propia o pueden actuar solamente como adyuvantes . La vacuna puede comprender 1-20, tal como 2-20 o aún 3-20 diferentes polipéptidos o polipéptidos de fusión, tal como 3-10 diferentes polipéptidos o polipéptidos de fusión. La invención también pertenece a un método para inmunizar un animal, inclusive un ser humano, contra la TB causada por micobacterias virulentas, que comprende administrar al animal el polipéptido de fusión de la invención o una composición de vacuna de la invención como se describió anteriormente o una vacuna viva descrita anteriormente. En una modalidad actualmente preferida, el animal o humano es un individuo inmune como se describió anteriormente. La invención también pertenece a un método para producir una composición inmunógena de acuerdo con la invención, el método comprende preparar, sintetizar o aislar un polipéptido de fusión de acuerdo con la invención y solubilizar o dispersar el polipéptido de fusión en un medio para una vacuna y agregar opcionalmente otros antígenos de M. tuberculosis y/o un portador, vehículo y/o sustancia adyuvante. Los fragmentos de ácido nucleico de la invención se pueden utilizar para efectuar la expresión in vivo de polipéptidos inmunógenos, es decir los fragmentos de ácido nucleico se pueden utilizar en las comúnmente llamadas vacunas de ADN como se revisa en Ulmer y colaboradores 1993, el cual se incorpora a manera de referencia. En la construcción y preparación de ADN plásmido que codifica un polipéptido de fusión a utilizarse definido por la vacunación de ADN se puede utilizar una cepa hospedante tal como E. coli. El ADN plásmido entonces se puede preparar a partir de cultivos durante toda la noche de la cepa hospedante que lleva el plásmido de interés y se puede purificar utilizando por ejemplo el equipo de columna Qiagen Giga-PlasmidMR (Qiagen, Santa Clarita, CA, EUA) que incluye un paso de remoción de endotoxinas. Es esencial que el ADN plásmido utilizado para la vacunación de ADN esté libre de endotoxinas. Por lo tanto, la invención también se refiere a una vacuna que comprende un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la invención, la vacuna efectúa la expresión in vivo del polipéptido inmunógeno por un animal, inclusive un ser humano, a quien se ha administrado la vacuna, la cantidad de polipéptido expresado es efectiva para conferir una resistencia sustancialmente incrementada a infecciones causadas por micobacterias virulentas en un animal, inclusive un ser humano. La eficacia de esta vacuna de ADN puede mejorarse posiblemente por medio de la administración del gen que codifica el producto de expresión junto con un fragmento de ADN que codifica un polipéptido el cual tiene la capacidad de modular una respuesta inmune. Una posibilidad para activar de manera efectiva una respuesta inmune celular se puede lograr por medio de la expresión del polipéptido inmunógeno relevante en un microorganismo o virus que no es patógeno. Los ejemplos bien conocidos de estos microorganismos son la BCG de Mycobacterium bovis, Salmonella y Pseudomona y los ejemplos de virus son el virus Vaccinia y el Adenovirus . Por lo tanto, otro aspecto importante de la presente invención es un mejoramiento de la vacuna BCG viva actualmente disponible, en donde una o más copias de una secuencia de ADN que codifica uno o más polipéptidos de fusión como se definió anteriormente se han incorporado en el genoma del microorganismo de una manera que permite que el microorganismo exprese y secrete el polipéptido de • fusión. La incorporación de más de una copia de una secuencia de ácido nucleico de la invención está contemplada para mejorar la respuesta inmune. Otra posibilidad es integrar el ADN que codifica el polipéptido de fusión de acuerdo con la invención en un virus atenuado tal como el virus vaccinia o Adenovirus (Rolph y colaboradores 1997) . El virus vaccinia recombinante es capaz de entrar en el citoplasma o el núcleo de la célula hospedante infectada y por lo tanto el polipéptido de fusión de interés puede inducir una respuesta inmune, la cual está contemplada para inducir una protección contra la TB . La invención también se refiere al uso de un polipéptido de fusión o ácido nucleico de la invención para el uso como vacunas terapéuticas como se ha descrito en la bibliografía ejemplificada por D. Lowry (Lowry y colaboradores 1999) . Los antígenos con propiedades terapéuticas se pueden identificar basándose en su capacidad para disminuir la gravedad de la infección con M. tuberculosis en animales experimentales o para prevenir la reactivación de una infección previa, cuando se administran como una vacuna. La composición utilizada para vacunas terapéuticas se puede preparar como se describió anteriormente para las vacunas .

LEYENDAS DE LAS FIGURAS Figura 1: Respuestas de anticuerpos a Rv2660c para pacientes con TB VIH-negativos (TB+/VIH-) y VIH-positivos (TB+/VIH+) de Uganda y controles saludables de Dinamarca (Controles) . El corte se basó en el análisis de curva de ROC con un nivel de especificidad del 97%. La sensibilidad observada se muestra sobre la presentación gráfica de los datos .

Figura 2: Inmunogenicidad de Rv2659c Los grupos de ratones Fl (Balb/cxC57BL/6) se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con Rv2659c en DDA/MPL. Una semana después de la vacunación final, las PBMCs se analizaron por medio de un ensayo ELISA por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con 5 microgramos/ml de Rv2659c.

Figura 3 : El antígeno Rv2659c induce una protección contra la infección con M. tuberculosis Los grupos de ratones Balb/c-C57BL/6 se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con el antígeno Rv2659c y la eficacia de protección se evaluó por medio de la reducción en conteos de CFU en pulmones y se comparó con ratones no inmunizados e inmunizados con la BCG 12 semanas después de la vacunación. Los resultados se expresan como log10 de unidades formadoras de colonias (CFU) en los pulmones y son resultado promedio de 6 ratones por grupo experimental .

Figuras 4A-C: Inmunogenicidad del antígeno Rv2660c Los ratones Fl (Balb/cxC57BL/6) se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con la proteína recombinante de Rv2660c en DDA/MPL. FIG 4A: Una semana después de la vacunación final, las PBMCs se analizaron por medio del ensayo ELISA por la liberación de IFN-gamma después de la estimulación con 0.2, 1 o 5 microgramos/ml del antígeno Rv2660c. Tres semanas después de la vacunación final, las células de bazo FIG. 4B se analizaron por medio del ensayo ELISA por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con 0.2, 1 o 5 microgramos/ml de Rv2660c recombinante y las PBMCs FIG. 4C se analizaron por las respuestas proliferativas después de la estimulación con 0.2, 1 o 5 microgramos/ml del antígeno Rv2660c recombinante.

Figura 5 : Protección contra la infección con ycobacterium tuberculosis inducida por el antígeno Rv2660c Los grupos de ratones Balb/c-C57BL/6 se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con Rv2660c y la eficacia de protección se evaluó por medio de conteos de CFU en los pulmones y se comparó con ratones no inmunizados e inmunizados con la BCG 6 semanas después de la infección por aerosol. Los resultados se expresan como logio de unidades formadoras de colonias (CFU) en los pulmones y son resultados promedio de 6 ratones por grupo experimental. Como control positivo, una dosis individual de BCG Danish 1331MR (5xl04 bacilos/ratón) se inyectó s.c. en la base de la cola al mismo tiempo que la primera vacunación de subunidad; no se administraron inyecciones de refuerzo .

Figuras 6A-E: Inmunogenicidad de Hybrid56, HyVac21 e HyVac28 Los grupos de ratones Fl (Balb/cxC57BL/6) se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con 5 microgramos de Ag85b-ESAT6-Rv2660c (H56) , Ag85a-TB10.4-Rv2660c (H21) o Ag85b-TB10.4-Rv2660c (H28) en DDA/TDB (LipoVac) . Una semana después de la vacunación final, las PBMCs se analizaron por medio del ensayo ELISA por la liberación de IFN-gamma después de la estimulación con 1 microgramo/ml de la proteína de fusión utilizada para la inmunización, Ag85b, TB10.4 o Rv2660c (figuras 6A-6C) . Tres semanas después de la vacunación final con Ag85b-ESAT6-Rv2660c, las células de bazo FIG. 6D se analizaron por medio del ensayo ELISA por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con 0.2, 1 o 5 microgramos/ml de Ag85B, ESAT6 o Rv2660c recombinante y las PBMCs FIG. 6E se analizaron por las respuestas proliferativas contra los mismos antígenos a 1 microgramo/ml .

Figuras 7A-B: Protección fuerte contra la infección con M. tuberculosis después de la inmunización con Hybrid56 FIG. 7A: Los grupos de ratones Balb/c-C57BL/6 se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con Ag85B-ESAT6-Rv2660c (Hybrid56) y la eficacia de protección se evaluó por medio de conteos de CFU en los pulmones y se comparó con ratones no inmunizados e inmunizados con la BCG 2, 6, 12 y 24 semanas después de la infección por aerosol. FIG. 7B: Los grupos de ratones B6 se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con ya sea Ag85b-ESAT6 (Hybridl) o Ag85b-ESAT6-Rv2031c (Hybrid32) y la eficacia de protección se evaluó por medio de conteos de CFU en los pulmones y se comparó con ratones no inmunizados e inmunizados con la BCG 7, 13, 24, 35 y 44 semanas después de la infección por aerosol. Los resultados son expresados como unidades formadoras de colonias log?0 (CFU) en los pulmones y son resultados promedio de 6 ratones por grupo experimental. Como control positivo, una dosis individual de BCG Danish 1331MR (5xl04 bacilos/ratón) se inyectó s.c. en la base de la cola al mismo tiempo que la primera vacunación de subunidad; no se administraron inyecciones de refuerzo.

Figura 8.: Curvas de supervivencia Kaplan-Meier (n = 7). La inmunización de cobayos con la proteína de fusión Ag85b-ESAT6-Rv2660c prolonga el tiempo de supervivencia al nivel de los animales inmunizados con la BCG después del reto con M. tuberculosis en aerosol en dosis bajas.

Figuras 9A-B: El antígeno Hybrid56 (Ag85b-ESAT6-Rv2660c) indujo inmunogenicidad y protección. Los ratones Fl (Balb/cxC57BL/6) se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con Ag85b-ESAT6-Rv2660c (Hybrid56) en DDA/MPL. Diez semanas después de la vacunación final, las células del bazo se analizaron por medio del ensayo ELISA por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con 0.2, 1 o 5 ug/ml de Ag85B, ESAT6 o Rv2660c (como se observó anteriormente en la figura 9A) . La eficacia de protección se evaluó por la reducción en conteos de CFU en los pulmones en comparación con ratones inmunizados con un control adyuvante diez semanas después de la vacunación. Los resultados se expresan como logio de unidades formadoras de colonias (CFU) en los pulmones de 12 ratones por grupo experimental (figura 9B) .

EJEMPLOS Materiales y métodos Animales Los ratones hembra C57BL/6xBalb/C Fl o C57BL/6 libres de agentes patógenos específicos, de 8 a 16 semanas de edad, obtenidos de Bomholtegaard, Dinamarca se utilizaron para el análisis de respuestas inmunes y estudios de protección evaluados por el análisis de CFU. Los estudios de infección se realizaron en las instalaciones BSL3 en Statens Serum Institute. Los animales se alojaron en jaulas aisladoras y se alimentaron con agua y alimento estéril ad libi tum. Se permitió a todos los animales un período de descanso de una semana antes del inicio de los experimentos .

Preparaciones de Antígenos Recombinantes El antígeno recombinante Ag85B-ESAT6 (Hybridl) se produjo como se describió previamente (Olsen, van Pinxteren y colaboradores, 2001) . En resumen, esta proteína etiquetada con His se expresó en Escherichia coli XL-1 Blue y se purificó en una columna TalonMR seguido por la cromatografía de intercambio iónico de proteínas utilizando una columna HiTrap QMR (Pharmacia, Uppsala, Suecia) . La muestra se dializó contra amortiguador de HEPES 25 mM (pH 8.0)-NaCl 0.15 M-glicerol al 10%-Tween 20 al 0.01% antes de la dilución y el almacenamiento. El antígeno Rv2660c recombinante se produjo por medio del mismo procedimiento descrito previamente para otra proteína micobacteriana pequeña (Skjot, Oettinger y colaboradores, 2000) . En resumen, el gen de Rv2660c de longitud completa se amplificó por medio de la PCR de ADN geonómico de M. tuberculosis y se subclonó en el plásmido de expresión pDestl7. La proteína recombinante se produjo en Escherichia coli B121 blue y se purificó por medio de la cromatografía de afinidad con iones metálicos en una columna de Ni+ en esencia como se describiera previamente (Theisen, Vuust y colaboradores, 1995) pero con amortiguadores de fosfato que contenían urea 8 M, la cual se retiró después de la purificación. Las proteínas de fusión Hybrid56 (Ag85B-ESAT6- Rv2660c) , Hybrid32 (Ag85b-ESAT6-Rv2031c) , HyVac21 (Ag85a-TB10.4-Rv2660c) y HyVac28 (Ag85b-TB10.4-Rv2660c) se clonaron en el vector de expresión pDestl7 (Invitrogen) por medio de la recombinación de un sitio específico de acuerdo con el fabricante. Las proteínas de fusión se expresaron en la cepa de E.coli BL21 después de la inducción por medio de IPTG. Las cuatro proteínas de fusión recombinantes se recolectaron como cuerpos de- inclusión después de la alteración de las células por detergente suave (B-PER, Sigma) y sonicación. Los cuerpos de inclusión lavados se disolvieron en NaOAc 20 mM + urea 8 M a pH 4.9 y se pasaron sobre una columna Q sepharoseMR para capturar la endotoxina. La práctica recolectada se diluyó en amortiguador de bis-tris + urea 8 M pH 6.5 y el pH se ajustó pH 6.5. La proteína entonces se pasó sobre CM sepharoseMR para capturar las impurezas y luego se capturó en una columna Q sepharoseMR. La columna se lavó con amortiguador de bis-tris pH 6.5 + urea 3 M. Las proteínas enlazadas se eluyeron con NaCl. La proteína entonces se intercambió con amortiguador en una columna af SephadexMR a tris-HCl 25 mM pH 8 y glicerol al 10%.

Reconocimiento humano - serología Todos los sueros se empobrecieron en anticuerpos de reacción cruzada antes del uso en un ensayo ELISA por la adición de 20 µl de extracto de E. coli (S3761, Promega, Madison, Wl) a 200 µl de muestra de suero seguido por la incubación durante 4 horas a temperatura ambiente mientras se mezclaba. Después de la centrifugación (10.000 x g, 10 minutos), se agregó azida de sodio 0.05% al sobrenadante. El ensayo ELISA se realizó como sigue, las placas de microtítulo MaxisorpMR de 96 pocilios (Nunc, Roskilde, Dinamarca) se revistieron durante toda la noche a 4°C con un antígeno a 1.0 µg/ml (100 µl por pocilio) en amortiguador de carbonato-bicarbonato (pH 9.6). Las placas entonces se lavaron 3 veces con PBS que ' contenía Tween 20MR al 0.05% (PBS-T) . Las muestras de suero se diluyeron 1:100 en PBS que contenía Tween 20MR al 0.2% y albúmina de suero bovino al 1.0% (peso/volumen) (amortiguador de dilución) y se agregó 0.1 ml de suero diluido a los pocilios por duplicado y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Después de los lavados 3 x con PBS-T, las placas se incubaron durante una hora con 100 ul de Ig antihumano de conejo conjugada con Peroxidasa (P212, DAKO, Glostrup, Dinamarca) diluida 1:8000 en amortiguador de dilución. Las placas se lavaron 3 veces con PBS-T y se incubaron con substrato de Tetrametilbenzidina (TMB plus, Kem-En-Tec, ***, Dinamarca) durante 30 minutos y el desarrollo se detuvo por la adición de H2S04 1 M. Entonces se midió la densidad óptica a 405 nm (OD40s) .

Preparación de vacunas y procedimiento de inmunización Los ratones se inmunizaron con 5 micro g de vacuna recombinante (ya sea Rv2659c, Rv2660c, Hybrid56, HyVac21, HyVac28 o Hybrid32) suministrados en 25 µg de lípido A de monofosforilo (MPL, Corixa, WA, EUA) emulsionado en bromuro de dioctadecilamonio (DDA, 250 µg/dosis, Eastman Kodak, Inc., Rochester, N.Y.) en un volumen total de 200 µl, como se describió recientemente (Olsen, van Pinxteren y colaboradores, 2001) . Las vacunas (0.2 ml/ratón) se inyectaron tres veces por vía subcutánea (s.c.) en la espalda con intervalos de dos semanas. Una dosis individual de BCG Danish 1331MR (5 x 104 bacilos/ratón) se inyectó s.c. en la base de la cola al mismo tiempo que la primera vacunación de subunidad; no se administraron inyecciones de refuerzo. La inmunidad previa al reto se evaluó típicamente con linfocitos sanguíneos 5 y 7 semanas después de la primera vacunación y esplenocitos 7 semanas después de la primera vacunación.

Infecciones experimentales y enumeración bacteriana en órganos Para evaluar el nivel de protección, los ratones se sometieron a un reto 10 semanas después de la primera inmunización ya sea por la ruta del aerosol en un sistema de exposición por inhalación Glas-Col, calibrado para suministrar aproximadamente 100 CFU de M. tuberculosis Erdman por pulmón. Los ratones se sacrificaron 2, 6, 12 o 24 semanas después (Hybrid56) o 7, 13, 24, 35 o 44 semanas después (Hybrid32) y los pulmones y los bazos se retiraron para la enumeración bacteriana. Los órganos se homogeneizaron por separado en solución salina estéril y las diluciones en serie se colocaron en agar Middlebrook 7H11MR complementado con 2 mg de hidrazida de ácido 2-tiofen-carboxílico por ml para inhibir selectivamente el crecimiento de BCG residual en los órganos de prueba. Las colonias se contaron después de 2 a 3 semanas de incubación a 37°C.

Cultivos de Linfocitos Los órganos se homogeneizaron por medio de maceración a través de un tamiz de acero inoxidable de malla fina en RPMl completo (GIBCO, Grand Island, NY, que incluía glutamina 2 mM, 100 U/ml de cada uno de penicilina 6-potásica y sulfato de estreptomicina, FCS al 10% y 2-ME 50 mM) . Los linfocitos sanguíneos se purificaron en un gradiente de densidad LympholyteMR (Cedarlane, Hornby, Ontario, Canadá) . Las células se acumularon de cinco ratones en cada grupo y se cultivaron por triplicado en pocilios de microtítulo de fondo redondo (96 pocilios; Nunc, Roskilde, Dinamarca) que contenían 2xl05 células en un volumen de 200 microlitros de medio RPMl 1640 complementado con 2 -mercaptoetanoi 5xl0"5 M, glutamina 1 mM, penicilina-estreptomicina 5% (vol/vol) suero bovino fetal. Los antígenos micobacterianos se utilizaron en concentraciones que variaban de 5 a 0.2 mg/ml. Los cultivos se incubaron a 37°C en C02 al 10% durante 3 días, antes de la remoción de 100 µl de sobrenadante para interferón gamma (determinación de IFN-gamma por medio de un ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) como se describe a continuación.

Ensayo Inmunoabsorbente Unido a Enzimas (ELISA) para IFN-gamma Un método de ELISA de doble emparedado se utilizó para cuantificar los niveles de IFN-gamma en titulaciones por duplicado de sobrenadantes de cultivo, utilizando un equipo comercial para el ensayo de IFN-gamma, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Mabtech, AB . Suecia) . Las concentraciones de IFN-gamma en las muestras se calcularon utilizando una curva estándar generada a partir de IFN-gamma recombinante (Life Technologies) y los resultados se expresan en pg/ml. La diferencia entre los pozos por duplicado fue consistentemente menor que 10% del promedio .

Infección experimental y evaluación de eficacia de las vacunas en el modelo de cobayo A los cobayos hembra Hartley no consanguíneos adquiridos de Charles River Laboratories (North Wilmington, Mass.) se les administró ya sea la BCG por vía intradérmica en una dosis de 103 CFU una vez o 20 µg de ya sea Ag85b-ESAT6 o Ag85b-ESAT6-Rv2660c emulsionado en DDA/MPL tres veces con un período de descanso de 3 semanas entre las inmunizaciones. Seis semanas después de la tercera inmunización se administró un reto de MTB en aerosol utilizando un dispositivo (Glas-Col, Terre Haute, Ind.) calibrado para suministrar aproximadamente 20 bacilos en cada pulmón de los cobayos. Los tiempos de supervivencia para los cobayos infectados se determinaron al observar los animales en una base diaria por los cambios en el consumo de alimentos, evidencia de respiración dificultosa y cambios de comportamiento. Además, los animales se pesaron en una base semanal hasta que se observó una caída de peso sostenida durante varios días, indicando una enfermedad.

Ejemplo 1 Reconocimiento humano de un antígeno inducido durante la inanición El antígeno Rv2660c se evaluó para el reconocimiento humano en un panel de pacientes con TB pulmonar de Uganda proporcionado por el Banco de Especímenes de Tuberculosis WHO. Ambos pacientes con un estado positivo y negativo de infección por VIH se incluyeron (N=94 y N=73, respectivamente). El grupo de control consistió en cien donadores saludables residentes en Dinamarca con una cobertura calculada de BCG de >90%. Las placas de microtítulo se revistieron con 1.0 µg/ml (100 µl por pozo) de proteína de Rv2660c incubada con 100 x muestras de suero diluido y se desarrollaron utilizando Ig antihumano de conejo conjugada con peroxidasa y tetrametilbenzidina como substrato (resultados en la Figura 1) .

Conclusión En este estudio, se sometió a prueba el reconocimiento de una proteína inducida durante la inanición. Basándose en un corte determinado a partir del grupo de control utilizando una sensibilidad de 97% si era posible confirmar la infección de TB en 45% de los casos con VIH- y 61% de los casos con VIH+ . Indicando claramente que la proteína de RV2660c es expresada y reconocida por el sistema inmune durante una infección con MTB.

Ejemplo 2 Inmunogenicidad y prevención de la reactivación por medio de la administración posterior a la exposición de un antígeno inducido durante la inanición (Rv2659c) Los ratones se infectaron con M. tuberculosis y se trataron con antibióticos para reducir la carga bacteriana y entrar a una etapa de infección latente con una carga bacteriana cercana al nivel de detección. Durante la etapa latente de la infección, los ratones se vacunaron tres veces en intervalos de dos semanas con Rv2659c en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL) . Una semana después de la vacunación final, las células sanguíneas se analizaron por medio del ensayo ELISA por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con Rv2659c (figura 2) .

Capacidad de la proteína inducida durante la inanición Rv2659c para inducir la protección contra la reactivación de M. tuberculosis Los grupos de ratones con M. tuberculosis latente se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con Rv2659c formulado en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL) y la eficacia de protección se evaluó por medio de la reducción en unidades formadoras de colonias (CFU) de los pulmones y bazos cuando se compararon con ratones no vacunados (infectados de manera latente) . La protección contra la reactivación se avaluó tres meses después de la vacunación. El antígeno Rv2659c indujo una reducción de 3 a 90 veces los niveles bacterianos en los pulmones en comparación con los ratones infectados de manera latente, no inmunizados, reactivados (figura 3) . Para evaluar la influencia de la vacunación con Rv2659c sobre el posible desarrollo de una patología en los ratones infectados de manera latente, se tomó tejido pulmonar de ratones vacunados, infectados de manera latente para el examen histopatológico. No se detectó necrosis caseosa, fibrosis o mineralización significativas en las lesiones y no se observó una infiltración aumentada de células inflamatorias .

Conclusión En este estudio, se sometió a prueba el potencial de una proteína inducida durante la inanición, Rv2659c como una vacuna terapéutica. Cuando la proteína de Rv2659c se administró a ratones en combinación de adyuvantes de bromuro de dimetildioctadecilamonio- lípido de monofosforilo A, se indujo/reforzó una respuesta inmune fuerte. La inmunización dio por resultado una reducción logarítmica de 0.5-1.0 en la carga bacteriana en los pulmones. De esta manera, los estudios sugieren que la vacunación posterior a la exposición reduce o retarda la reactivación de M. Tuberculosis sin desencadenar una inmunopatología pulmonar.

Ejemplo 3 Inmunogenicidad y protección contra la infección por aerosol de M. tuberculosis por el antígeno inducido durante la inanición Rv2660c Los ratones se vacunaron tres veces en intervalos de dos semanas con Rv2660c en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL) . Una semana después de la vacunación final, las células sanguíneas se analizaron por medio del ensayo ELISA por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con Rv2660c (figura 4A) . Tres semanas después de la vacunación final, las células del bazo se analizaron por la secreción de IFN-gamma después de la estimulación con Rv2660c (figura 4B) y las células sanguíneas se analizaron por las respuestas proliferativas específicas de antígenos (figura 4C) . Los grupos de ratones vacunados por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con Rv2660c formulado en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL) se sometieron a un reto por medio de la infección por aerosol con M. tuberculosis y la eficacia de protección se evaluó por medio de la reducción en unidades formadoras de colonias (CFU) aisladas de los pulmones en comparación con ratones no vacunados. La protección se evaluó 12 semanas después de la vacunación. El antígeno Rv2660c indujo una reducción logarítmica (10) de 1 en los niveles bacterianos de los pulmones en comparación con ratones infectados no inmunizados (figura 5) .

Conclusión En este estudio, se sometió a prueba el potencial de una proteína inducida durante la inanición Rv2660c como un antígeno de vacuna. Cuando la proteína Rv2660c se administró a ratones en combinación de adyuvantes de bromuro de dimetildioctadecilamonio- lípido de monofosforilo A, se indujo una respuesta inmune fuerte. La inmunización dio por resultado una reducción logarítmica (10) de aproximadamente 0.5 en la carga bacteriana en los pulmones.

Ejemplo 4 Fusión de antígenos inducidos durante la inanición con vacunas preventivas (Vacuna de múltiples fases) Respuestas inmunológicas después de la inmunización con proteínas de fusión triples Los grupos de ratones se vacunaron por vía subcutánea dos veces en intervalos de dos semanas con los polipéptidos de fusión Hybrid56, HyVac21 o HyVac28 en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL) . Una semana después de la vacunación final, las células sanguíneas se analizan por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con 1 microgramo/ml de proteína de fusión de inmunización o los componentes individuales en las proteínas de fusión (figuras 6A-6C) . Tres semanas después de la vacunación final con Hybrid56, las células de bazo se analizan por medio del ensayo ELISA por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con 0.2, 1 o 5 microgramos/ml de los componentes individuales en la proteína de fusión (figura 6D) . Las células sanguíneas se analizan por las respuestas proliferativas específicas de antígenos tres semanas después de la vacunación final (Figura 6E) , La capacidad de tres polipéptidos de fusión para inducir la protección contra la infección con M. tuberculosis en ratones Los grupos de ratones se vacunan por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con los polipéptidos de fusión Hybridl, Hybrid56 y Hybrid32 en adyuvante (DDA/MPL) y la eficacia de protección se evalúa por medio de la reducción en unidades formadoras de colonias (CFU) de los pulmones y bazos en comparación con ratones naturales (no vacunados) después de la infección por aerosol. Como un control positivo para la protección, una dosis individual de BCG Danish 1331MR (5x104 bacilos/ratón) se inyectó s.c. en la base de la cola al mismo tiempo que la primera vacunación de subunidad (Figuras 7A y 7B) .

Capacidad de protección del polipéptido Hybrid56 (Ag85b-ESAT6-Rv2660c) contra una infección por aerosol de M. tuberculosis en cobayos Los grupos de cobayos se vacunan por vía subcutánea tres veces en intervalos de tres semanas con el polipéptido de fusión en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL) y la eficacia de protección se evalúa principalmente al medir cada peso de los animales en una base semanal . Como un control positivo para la protección, una dosis individual de BCG Danish 1331MR (5x104 bacilos/ratón) se inyecta i.d. al mismo tiempo que la primera vacunación de subunidad. Los resultados se presentan como curvas de supervivencia en la figura 8.

Conclusión En este estudio, se investigó el potencial inmunológico de tres proteínas de fusión (Hybrid56, HyVac21 y HyVac28). Cuando las proteínas de fusión se administraron a ratones en la combinación de adyuvantes de bromuro de dimetildioctadecilamonio-lípido de monofosforilo A, se indujo una fuerte respuesta inmune dependiente de la dosis en los tres componentes de proteínas individuales indicando su potencial como una vacuna de múltiples fases. Seleccionando a Hybrid56 como un ejemplo, las respuestas inmunes inducidas estuvieron acompañadas por altos niveles de inmunidad de protección que incrementan con el tiempo, alcanzando un nivel que fue claramente superior al nivel de protección alcanzado con la BCG de Mycobacterium bovis, la vacuna clásica contra la MTB. Además, una proteína de fusión triple similar que contenía el antígeno clásico de latencia de MTB Rv2031c (Ag85b-ESAT6-Rv2031c) reemplazando Rv2660c, no mostró una protección mejorada a través del tiempo. Finalmente, el alto nivel de protección para Hybrid56 se confirmó en el modelo de cobayo mucho más susceptible .

Ejemplo 5 Actividad de una fusión de un antígeno inducido durante la inanición y una vacuna preventiva (vacuna de múltiples fases) administrada después de la exposición (terapéuticamente) . Los ratones se infectaron con M. tuberculosis y se trataron con antibióticos para reducir la carga bacteriana y para entrar a una etapa de infección latente con una carga bacteriana baja. Durante la etapa latente de infección, los ratones se vacunaron tres veces en intervalos de dos semanas con el polipéptido de fusión en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL) . Quince semanas después de la vacunación final, las células sanguíneas se analizan por medio del ensayo ELISA por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con 0.2, 1 o 5 ug/ml de componentes individuales de la proteína de fusión (figura 9A) .

La capacidad del polipéptido de fusión para inducir la protección contra la reactivación de M. tuberculosis Los grupos de ratones con M. tuberculosis latente se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con el polipéptido de fusión formulado en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL) y la eficacia de protección se evaluó por medio de la reducción erí unidades formadoras de colonias (CFU) de los pulmones en comparación con ratones no vacunados (infectados de manera latente) . La protección contra la reactivación se evaluó tres meses después de la vacunación. El polipéptido de fusión indujo una reducción significativa de la reactivación dando por resultado niveles bacterianos pulmonares reducidos en comparación con los ratones infectados de manera latente, no inmunizados, reactivados (figura 9B) .

Conclusión En este estudio, se investigó el potencial de una vacuna de subunidad de tuberculosis basada en una proteína de fusión de los antígenos Rv2660c, ESAT6 (Rv3875) y el antígeno 85B (Rvl886c) como una vacuna terapéutica. Cuando la proteína de fusión se administró a ratones en la combinación de adyuvantes de bromuro de dimetildioctadecilamonio- lípido de monofosforilo A, se indujo/reforzó una respuesta inmune fuerte. La inmunización dio por resultado una reducción en la carga bacteriana en los pulmones durante la reactivación de la infección latente. De esta manera, los estudios sugieren que la vacunación después de la exposición con una fusión de un antígeno inducido durante la inanición y una vacuna preventiva (Vacuna de múltiples fases) reduce o retarda la reactivación de M. tuberculosis .

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Claims

REIVINDICACIONES 1. Una composición inmunógena, una vacuna o una composición farmacéutica caracterizada porque comprende: (i) un polipéptido de fusión que comprende uno o más antígenos inducidos durante la inanición seleccionados del grupo que consiste de; SEC ID NO. 12, 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 y 86 o (ii) uno o más fragmentos de los polipéptidos.
2. La composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica que comprende un polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los polipéptidos inducidos durante la inanición o fragmentos de polipéptidos se fusionan con ESAT6, Ag85B, TB10.4 y/o Ag85A, o análogos de los mismos y en cualquier combinación y orden de posición.
3. La composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para el uso profiláctico, uso terapéutico, una vacuna de múltiples fases o para utilizarse para reforzar la inmunidad de la vacunación previa con la BCG.
4. La composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque se debe administrar por vía intradérmica, transdérmica, subcutánea, intramuscular o mucosa.
5. La composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el polipéptido de fusión comprende 2 diferentes polipéptidos inmunógenos o análogos de los mismos.
6. La composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el polipéptido de fusión comprende 3 diferentes polipéptidos inmunógenos o análogos de los mismos .
7. La composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el polipéptido de fusión comprende 4 diferentes polipéptidos inmunógenos o análogos de los mismos .
8. La composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende polipéptidos de fusión con combinaciones de ESAT6-Ag85A-X, ESAT6-Ag85B-X, Ag8A-X, Ag85B-X, TB10-Ag85A-X, TB10-Ag85B-X en donde X es cualquiera de los antígenos inducidos durante la inanición y donde el orden de las unidades de antígenos puede ser cualquier combinación por ejemplo donde el orden está invertido o X está colocado a la mitad.
9. La composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos que codifican los siguientes polipéptidos de fusión: Ag85B-ESAT6-Rv2660c; Ag85B-ESAT6-Rv2659c; Ag85B-TB10.4-Rv2660c; Ag85B-TB10.4-Rv2659c ; Ag85B-Rv2660c ; Ag85B-Rv2659c; Ag85A-Rv2660c ; Ag85A-Rv2659c ; Ag85A-ESAT6-Rv2660c; Ag85A-ESAT6-Rv2659c ; Ag85A-TB10.4-Rv2660c ; Ag85A-TB10.4-RV2659C; Rv2660c-Rv2659c ; Ag85B-ESAT6-Rv2660c-Rv2659c; en cualquier orden de las unidades de polipéptidos o análogos de los mismos .
10. Un polipéptido de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
11. Una vacuna o composición farmacéutica que comprende un fragmento de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
12. La vacuna o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 para el uso profiláctico, uso terapéutico o ambos, una vacuna de múltiples fases o para utilizarse para reforzar la inmunidad de la vacunación previa con la BCG.
13. Una composición inmunógena, una vacuna o una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende: i) uno o más antígenos inducidos durante la inanición seleccionados del grupo que consiste de; SEC ID NO 12, 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 y 86 o (ii) uno o más fragmentos de los antígenos.
14. Una composición inmunógena, una vacuna o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13, para el uso profiláctico, uso terapéutico, una vacuna de múltiples fases o para utilizarse para reforzar la inmunidad de la vacunación previa con la BCG.
15. Una composición inmunógena, una vacuna o una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-14, caracterizada porque se debe administrar por vía intradérmica, transdérmica, subcutánea, intramuscular o mucosa.
16. Una vacuna o composición farmacéutica que comprende un fragmento de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno inducido durante la inanición o un fragmento del mismo.
17. La composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para el uso en el tratamiento de un animal que tiene tuberculosis activa o latente causada por una micobacteria virulenta o para el uso en el refuerzo de la inmunidad de la vacunación previa con la BCG.
18. La composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para el uso en la profilaxis contra una infección por una micobacteria virulenta.
19. La composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17 o 18, caracterizada porque la micobacteria se selecciona de M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, mycobacterium lepra o mycobacterium ulcerans.
20. El uso de la composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la manufactura de una composición para la administración mucosa, transdérmica, intradérmica, subcutánea o intramuscular.
21. El uso de la composición inmunógena, vacuna o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la manufactura de una composición para la vacunación profiláctica, vacunación de refuerzo, vacuna de múltiples fases o vacunación terapéutica contra una micobacteria.
22. El uso en donde la micobacteria se selecciona de mycobacterium tuberculosis, mycobacterium africanum, mycobacterium Bovis, mycobacterium lepra o mycobacterium ulcerans .