MX2007016004A - Cepas de virus de viruela altamente atenuadas, metodo para la produccion de las mismas y el uso de las mismas como inductoras de parainmunidad o para producir vacunas del vector. - Google Patents
Cepas de virus de viruela altamente atenuadas, metodo para la produccion de las mismas y el uso de las mismas como inductoras de parainmunidad o para producir vacunas del vector.Info
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Abstract
La presente invencion se refiere a cepas virales de viruela animal altamente atenuadas y al uso de las mismas, como inductores de parainmunidad o para producir vacunas de vector. Como un resultado del proceso de alta atenuacion, las cepas de viruela animal reivindicadas, pierden sus propiedades virulentas e inmunizantes. La invencion tambien se refiere a un metodo para producir tales cepas de virus de viruela altamente atenuadas y al uso de las mismas para inducir parainmunidad, es decir, para activar el sistema inmune no especifico en mamiferos y humanos, o para producir vacunas de vectores para inmunizacion especifica con los efectos colaterales positivos de parainmunizacion. Los virus de viruela animal altamente atenuados reivindicaos, de este modo, son adecuados para prevenir y tratar enfermedades asociadas con una deficiencia inmune. Modalidades preferidas se refieren a cepas virales orthopox (por ejemplo, virus de viruela de camello), leporipox (por ejemplo, virus mixoma), avipox, parapox y otros orthopox, tales como MVA, los cuales tienen excelentes propiedades de parainmunizacion y en los cuales, se han perdido las propiedades inmuizantes.
Description
CEPAS DE VIRUS DE VIRUELA ALTAMENTE ATENUADAS, M TODO PAR LA I
PRODUCCIÓN DE LAS MISMAS Y EL USO ÜE LAS MIS S COMO
INDUCTORAS DE PARAINMUNIDAD O PARA PRODUCIR VACUNAS DEL VECTOR
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a virus de viruela
animal altamente atenuados, a inductores de parainmunidad
producidos de este y a vacunas del vector basadas en cepas de virus de viruela animal altamente atenuadas. Los virus de viruela animal altamente atenuados de la invención poseen, propio del proceso altamente atenuante, cualesquiera de las I propiedades no virulentas y de inmunización. Un aspecto i adicional de la invención, se refiere a métodos para producir tales cepas de virus de viruela animal altamente atenuadas y al uso del mismo como inductores ide parainmunidad para inducir parainmunidad, es decir, para activar el sistema inmune no específico (paraespecífico) ien humanos y animales o como vacuna del vector para inmunizai- un mamífero o humano.
Los virus de viruela animal altamente atenuados de la invención son además adecuados para la profilaxis y tratamiento de trastornos usualmente crónicos, multifactoriales . Modalidades preferidas de la invención se refieren a cepas de virus de viruela animal altamente atenuadas de todos los géneros de la familia poxviridae, I dichas cepas se han aislado de animales afectados y altamente atenuados por pasos seriales. Las cepas de viruela animal de la invención tienen excelentes propiedades de parainmunización, las propiedades inmunizantes y virulentas se han perdido propiamente con el método altamente atenuante de la invención.
ANTECEDENTES DE LA INy?NCIÓN I i El sistema inmune endógeno ' de mamíferos se puede dividir en una parte específica a'l antígeno y una no específica al antígeno (paraespecífica) . La parte específica al antígeno del sistep? inmune incluye por ejemplo, anticuerpos o células inmune específicas. Los mecanismos específicos al antígeno son responsables para establecer una inmunidad específica, mientras las no específicas al antígeno son responsables de la acumulación de parainmunidad. Las actividades paraespecíficas del sistema inmune no específico al antígeno (o "sistema inmune innato") que incluye elementos protectores solubles y celulares no selectivos, tales cómo, por ejemplo, el sistema de lisozima complemento y la cascada citocina regulatoria, y elementos protectores celulares tales como, por ejemplo, granulocitos, micro- y macrófagos, linfocitos citolíticos naturales, linfocitos T condicionados no al antígeno, células dendríticas y otras. i Parainmunidad significa el estado del sistema de defensa no específico que funciona óptimamente y está bien regulado, el cual otorga en el organismo una protección incrementada, limitada de tiempo, rápidamente en desarrollo, de un número amplio de -diferentes patógenos, antígenos y otras noxas. Actividades paraespecíficas son detectadas en el organismo relevante inmediatamente después del contacto con noxas, es decir, sustancias dañinas endógenas o exógenas, y células endógenas transformadas, después de aproximadamente 2 a 6 horas, mientras los efectos del sistema inmune específico al antígeno aparecen únicamente después de 5-8 días (inmunidad específica celular) aún después de semanas (anticuerpos) . Se logra tiempo adicional en esta manera, para acumular reacciones de defensa específica contra los antígenos, los cuáles no pueden ser neutralizados por las actividades dje parainmunización. Las I defensas paraespecíficas por lo tanto, hacen posible al organismo auto defenderse inmediatamente, es decir, sin i pérdida de tiempo, en confrontación ' con una amplia variedad de materiales extraños, patógenos infecciosos, toxinas y células endógenas transformadas (Antón Mayr, "Paramunisierung: Enpirie oder Wisjsenschaft", Biol. Med., edición 26(6) : 256-261, 1997). La defensa inmune par específica es así un proceso fisiológico y se puede ' definir como "barrera primaria" en una confrontación con un ambiente que contiene I sustancia dañina. Esta forma de defensa es irremplazable no i solamente para los organismos inferiores, sino en particular, también para las formajs de vida altamente
desarrolladas y más altamente desarrolladas. Así, surge que los defectos congénitos primarios en este sistema de defensa biológico pueden conducir1 a situaciones que I amenazan la vida. Un ejemplo el| cual es para ser mencionado, el "síndrome Chediak-St'einbrinck-Higashi" en humanos, el cual se caracteriza! por defectos del
granulocito y disfunciones de los linfocitos citolíticos naturales (células NK) y en muchos casos conduce a la muerte del paciente al cumplir los 10' años de vida. La condición de parainmunidad se caracteriza por una relación incrementada de fagqcitosis, una función incrementada de citotoxicidad mediada por la célula espontánea (células NK) y una actividad incrementada de otras células linforeticulares específicas no al antígeno. Al mismo tiempo, existe una liberación de citotoxinas particulares las cuales tienen efectios de estimulación y/o supresión (por ejemplo, vía mecanismos represores), es decir, tienen efectos reguladores óptimos, tanto con los elementos celulares como con algún otro. Este sistema biológico responde por etapas y estrechamente ligadas de parainmunidad con sus varias células! aceptoras, efectoras y objetivo, y los mensajeros moleculares que transmiten la señal (citocinas), sin embargo, están completamente conectados a sistemas hormonales y nerviosos, y en muchos casos aún con los sistemas vasculares y metabólicos. De este modo, es un componente importante de comunicación, interacción y regulación de la red de' defensa, la cual está naturalmente presente en cada organismo del nacimiento en adelante. La naturaleza así, ha proporcionado a todos los organismos con protección adecuada desde el principio. Durante la filogénesis, hubo inicialmente desarrollo solamente del sistema de defensa parbespecífico, es decir, no específico. Solamente durante el último curso de evolución, el sistema inmune específico se desarrolla por etapas . La parainmunidad se induce médicamente por parainmunización con los así llamados inductores de parainmunidad. La parainmunización médica se logra activando los elementos celulares de la parte paraespecífica del sistema inmune y :la formación, ligada a este, de citocinas, con la ayuda de disfunciones de eliminación, incrementa rápidamente la protección no específica al patógeno y antígeno de un individuo (bioregulación óptima) , eliminando una inmunosupresión o inmunodeficiencia la cual se ha originado como un resultado de estrés o en otras formas (por ejemplo, farmacológicamente) , reparando déficits y/o actuando como
un regulador entre los sistemas inmune, hormonal y nervioso
(Antón Mayr, "Paramunisierung : Empirie order Wissenschaft",
Biol. Med., edición 26(6): 256-261, 1977). Esto significa que ciertos procesos de defensa endógenos no específicos se pueden incrementar, suplementar o deprimir más, dependiendo
del tipo de parainmunización y la capacidad de respuesta, tal como, por ejemplo, el estado de defensa del paciente. El inductor de parainmun-¡_dad per se, es una i proteína, es decir, no es comparable ,ya sea a un anticuerpo o a un químico, un antibiótico, vitamina u hormona. Por el contrario, se activa igual a un¡ catalizador por un mecanismo por etapas del sistema inmune paraespecífico, de manera que el último, moviliza suficientemente los mecanismos de defensa humoral y celular. Los inductores de parainmunidad en este caso, tienen efectos tanto reguladores como reparadores en las defensas inmunes. Con respecto al modo de acción de inductores de parainmunidad, se conoce que se toman por células fagocíticas (células aceptoras) , las cuales son así activadas y liberadas por mediadores, tales como por ejemplo,! citocinas, las cuales I en cambio movilizan las células efectoras. Se describen inductores de parainmunidad basados en combinaciones de dos o más componentes de virus de viruela animal convencionalmente atenuados, los cuales se derivan de cepas de virus de viruela de diferentes animales con propiedades parainmunizantes, en 'la Patente Europea EP 0 669 133 Bl. Las cepas de virus de viruela animal en las cuales estos inductores de parainmuni<iiad se basan, han sido atenuadas en una forma convencional, es decir, están en una condición reducida en la cual las propiedades virulentas y en particular, de inmunización del virus, se han debilitado pero no completamente perdido. La presente invención pres nta por primera vez, un método nuevo el cual completamente' elimina la virulencia e inmunogenicidad de cepas virus de viruela animal simplemente atenuadas. Esto se refiere, en este documento posteriormente, como un método "altamente atenuado". Tal atenuación elevada de virus de viruela se muestra en la presente invención por primera vez, en base al virus de la viruela del camello de Orthopoxvirus
(Orthopoxvirus cameli) y virus ectjromelia (Orthopoxvirus muris), el virus de mixomatosiß de leporipoxvirus (Leporipoxvirus myxomatosis) , el virus de viruela aviar avipoxvirus (Avipoxvirus gallinae) y virus canarypoxvirus (Parapoxvirus ovis) . Modalidades ejemplares de la invención se refieren a la alta atenuación de cepa h-M 27 del virus de la viruela del camello de la cepa orthopoxvirus y la cepa h-M 2 del virus mixomatosis de cepa 'leporipoxvirus . Ni la
atenuación ni una alta atenuación hasta la fecha, se ha llevado a cabo o descrito para estás cepas de virus de viruela. Otras modalidades preferidas se relacionan con cepas de orthopoxvirus adicionales, y a cepas de ! parapoxvirus y avipoxvirus (véase aba^o) . Una atenuación convencional ' simple se ha mostrado
para el género Orthopoxvirus en el Caso del vacciniavirus ankara MVA por A. Mayr, H. Stickl, H.f. Müller, K. Danner y H. Singer, 1978: "Der Pockenimpfstamr MVA", Zbl . Bakt . Hyg. ,
I. Abt. Orig.B 167, 375-390; Mayr, A., 1999: i "Geschichtlicher überblick über die Menschenpocken
(Varióla) , die Eradikation von Variól und den attenuierten
Pockenstamm MVA", Berl .Münch. TierarztlWschr . 112, 322- 328; para el género avipoxvirus HP1 y |HP1 por A. Mayr, F. Hartwig, y I. Bayr, 1965 Entwicklung éines Impfstoffes gegen die Kanarienpocken auf der Basis eines attenuierten Kanarienpockenkulturvirus", Zbl .Vet .Med. B 12, 41-49; A. Mayr y K. Malicki, 1966: "Attenuie^ung von virulentem Hühnerpockenvirus in Zellkulturen ijind Eigenschaften des attenuierten Virus", Zbl. Vet. Med. B 13, 1-13; y para el género parapoxvirus ORF-1701 por A. Mayr y M. Büttner, 1990: "Ecthyma (ORF) virus": In: Z. Dinter ¡und B. Morein (Hrsg.): Virus infections of vertebrates, vol. '3; Virus infections of ruminants, Elsevier Science Publishers B.V. Amsterdam.
Algunas de las cepas de virus de viruela animal altamente atenuadas por el método tie la invención, son explicadas en más detalle abajo:
Virus de viruela del camello La viruela del camello son los patógenos de una enfermedad viral peligrosa de camellos, los cuales tienen un curso de sistema cíclico y están caracterizados por un exantema preferencialmente de la piel y membrana mucosa en la región de la cabeza, cuello y garganta, y las extremidades y la región inguinal (Mühz, E., 1999: "Pox and pox-like diseases in camels", Proc.lft Int. Camel Conf. 1, 43-46) . Las enfermedades ocurren cíclicamente cada 2 a 3 años si está disponible una población suficientemente frande sensible. Dos géneros (llama y camello) de la familia Camelidae, son preferencialménte afectados por los virus de la viruela del camello (Mayr:, A. and Czerny C. P., 1990: "Camelpox virus", In: Dintér Z. und Morein B. (Hrsg.): "Virus infections of vertetírates" , vol. 3: Virus infections of ruminants. Elsevie- Science Publishers B.V. Amsterdam) . El género Camelus incluye al dromedario de una jiba ( Camelus dromedari us) y el camello Bractrian de dos jibas ( Camel us ferus bactrianus) . Los camellos dromedarios y bactrian se originan ¡principalmente en los países así llamados del "viejo mundí>" (desiertos, estepas de África del Norte, Arabia, Mongoliaj) , mientras el habitat preferido de la llama es en América del Sur. El virus de la viruela del camello ( Orthopoxvirus cameli ) es una enfermedad particularícente cercana relativa al virus de la viruela, el patógeno de la viruela en humanos (Varióla) . El virus de la viruela del camello no es patogénico para humanos. El virus de la viruela del camello es, como todos los virus poxvirus clásicos, en forma de tabique y tienen proteínas de superficie características, las cuales son responsables de las propiedades de inmunización y parainmunizantes , del virus o sus constituyentes. El tamaño promedio es, dependiendo del género y la cepa, de 280 nm en la dirección longitudinal y aproximadamente 180 nm en la dirección transversal (Otterbein, CK. , 1994: "Pháno- und genotypische Untersuchungen zweier Kamelpockenvirqs-Isolate vor und nach Attenuierung durch Zellkulturpassagen" , Vet .Med. Diss . München) . El genoma del virus de la viruela del camello consiste de un ADN de doble hebra lineal. Las dos hebras ADN son covalentemente unidas en conjunto a los extremos del genoma, de manera que el ADN del virus forma una cadena de polinucleótido continua.
Virus Mixomatosis Los virus mixomatosis son los patógenos de mixomatosis, una enfermedad viral sistémica contagiosa de conejos domésticos y silvestres, la dual progresa en ciclos y es caracterizada por edemas subcutájneos generalizados, en algunos casos hemorrágicos, en la cabeza y sobre el cuerpo completo, con preferencia para la región anal, la vulva y el tubo, distinto de cualquiera de otras enfermedades infecciosas. La introducción de mi omatosis en un país previamente libre de la enfermedad, resulta en un progreso rápido y fatal. Después el virus llega a ser endémico, el carácter de la enfermedad cambia hasjta que las infecciones son clínicamente no aparentes (M yr A. : Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre, 7th edición, Erike- Verlag, Stuttgart, 2002). La enfermedad es ampliamente distribuida entre conejos de colas de algodón, Americanos, del género Sylvilagus, el cual ocupa exclusivamente el nuevo mundo. Estos conejos silvestres forman sollámente el reservorio natural de la enfermedad. La infección toma una forma media en ella. Por el contrario, la enfermedad tiene una mortalidad de casi el 100% en conejos domésticos y silvestres Europeos del género Oryct lagus, los cuales son también naturalizados en Australia, i cuando el patógeno es introducido. El intervalo de hospedero natura del mioxavirus (género Leporipoxvirus) , tiene limites estrechos. En general, el virus se replica solamente en conejos de cola de algodón Americanos, y en conejos silvestres y domésticos Europeos. Sin embargo, algunas infecciones en liebres silvestres Europeas, también han sido observadas. La transmisión intentada con otras i especies animales a humanos, ha resultado negativa. !
Avipoxyirus Las infecciones causadajs por avipoxvirus, especialmente virus de viruela aviar y virus canarypox, progresan en una forma similar. El virus de la viruela aviar se deriva de Asia y ha sido conocidos por cientos de años. Son distribuidos alrededor del mundo y son muy resistentes. La transmisión toma ligera entrando a través de las heridas de la piel. Los piquetes de insectos también pueden estar involucrados en la transmisión. El tiempo de incubación para la enfermedad es 4 a 14 días. Existen dos I formas, se hace una distinción entré Ia forma así llamada subcutánea y la forma mucosal. La forma cutánea está caracterizada por ampollas o nodulos costrosos en la cabeza, cresta, cuello y pie. La ¡ forma mucosal exhibe depósitos blanco amarillentos en la; lengua, las membranas mucosas del pico, de la laringe, de la tráquea y los ojos. El tiempo de incubación en la infección con el virus canarypox es 3 a 16 días. Después q?|?e la enfermedad se ha interrumpido, la mayoría de la población muere dentro de solamente algunas horas. Las aves infectadas muestran nodulos en las partes corneales y er} los ángulos del pico. Ocurren deterioros respiratorios masivos, y las aves rápidamente se sofocan de los depósitos caseosos en las vías respiratorias causadas por el virus. Las cepas atenuadas de avipoxvirus, se han obtenido por pasos sucesivos en cultivos de células de fibroblastos embriónicos de pollos, y han sido empleadas para vacunación de pollos. La cepa más investigada y disponible es la cepa HP-1 (A. Mayr und K. Malicki, 1966: "Attenuierung von virulentem ?ühnerpockenvirus in Zellkulturen und Eigenschaften des attenuierten Virus", Zbl. Vet. ed. B 13, 1-13). Más de 200 pasos en fibroblastos de embriones de pollo conducen a un ¡virus atenuado pero el cual es todavía capaz de replicación y retiene la patogenicidad para pollos en la administración intravenosa o aerosol. Los virus que pasan mjás de 400 veces, son considerados como patogénicos y son considerados como vectores eficientes y extremadamente seguros para uso en mamíferos. Fue posible lograr (jjue tomara lugar la inmunización sin replicación productiva completa del virus. Las cepas de virus de vihuela animal las cuales han sido debilitadas a la fecha por ¡atenuación convencional conduciendo a un incremento en propiedades parainmunizantes y a una reducción en las propiedades virulentas e inmunizantes del virus y sus constituyentes. Sin embargo, no todas las propiedades virulentas ( e inmunizantes de las cepas de viruela animal se pierden en atenuación convencional. Las respuestas inmunes están todavía presentes en mamíferos con cepaf de viruela animal I I simplemente atenuadas. Esto está relacionado presumiblemente, con una simple atenuación que tiene también poca estabilidad o la atenuación esta siendo también baja en el caso de virus de viruela animal simplemente atenuados. La presente invención por ? tanto, se basa en el objeto de proporcionar cepas de viruela animal, las cuales son estables, exhiben un alto grado de atenuación y en las cuales, los virus de la viruela son modificados, en tal forma que han i perdido completamente sus propiedades virulentas e inmunizantes y de este modo, pueden ser usadas como inductores de parainmunidad inofensivos y vacunas i de vectores. Este objeto se logra dé conformidad con la invención, por las materias sujeto de las reivindicaciones adjuntas . Se ha encontrado sorprendentemente que, las cepas de viruela animal simplemente atenuadas, son modificadas por etapas de atenuación adicional I sin pasos de dilución terminal de placa de continuidad, en cultivos celulares permisivos seleccionados en tal forma que pierden completamente su capacidad inmunizante y virulencia, sin su capacidad para replicarse siendo deteriorada . Las cepas de viruela animal de la invención, también son además, restringidas en su intervalo hospedero. Las supresiones que resultan de la alta atenuación en el genoma viral, adicionalmente hacen posible introdu?ir antígenos extraños. La pérdida, causada por la alta atenuación, de las proteínas inmunizantes, hace a las proteínas activas I parainmunizantes adicionales, y con ello, reduce en una manera significante, la actividad párainmunizante de estas cepas. De esta forma, se obtienen inductores de parainmunidad inofensivos y altamente activos y no causan algunas alergias u otros efectos colaterales inmunopatogénicos aún, si se repiten las administraciones en corto término y son frecuentes. Las cepas de viruela animal, las cuales son altamente atenuadas por el método dé la invención, son por lo tanto, extraordinariamente adecuadas como inductores de parainmunidad o para producir vacunas de vectores.
SUMARIO DE LA INVEN I CIÓN
I La invención se refiere a cepas de virus de viruela animal altamente atenuadas y¡ al uso de las mismas, como inductores de parainmunidad o para producir vectores de vacunas. Modalidades particulares dé las cepas de viruela animal altamente atenuadas, son cepas del virus mixomatosis I y del virus de viruela del camello. Se da referencia i particular a la cepa h-M 27 del virus de viruela del i camello, con el número de depósito 0J5040602 y la Cepa h-M 2 del virus mixomatosis, con el númercj de depósito 05040601.
Los virus fueron depositados en la institución depositaría del Servicio de Laboratorio de Salud, Pública (PHLS) , Centro para Microbiología e Investigación Aplicada (CAMR) , Colección Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC) ; Portón Down, Salisbury, Wiltshire^ Reino Unido. Otras modalidades de la invención se refieren a la alta atenuación del virus canarypox (Avipoxvirus serinae) , preferiblemente de la cepa KP1, j del virus ectromelia (Orthopoxvirus muris), preferiblemente de la cepa Mü 1 y del virus de la viruela aviar (Kvipoxvirus gallinae) , preferiblemente de la cepa HPl ,y del virus parapox (Parapoxvirus ovis) . En la alta atenuación de ¡Las cepas del virus de viruela animal, descubierta de j conformidad con la invención, la virulencia de las ¡ cepas virales y sus
propiedades inmunizantes, son completamente perdida, en comparación con las cepas I de viruela animal convencionalmente atenuadas. Los virus de viruela animal altamente atenuados de la invención, por lo tanto, no tienen ampliamente alguna virulencia u inmunogenicidad residual. Las cepas de viruela animal altamente atenuadas son por lo tanto, particularmente adecuadas para uso como inductores de parainmunidad o para producir vacunas de vectores . La invención además, se refiere a métodos para producir las cepas de virus de viruela altamente atenuadas de la invención. Las cepas de virus ¡de viruela preferidas, son cepas las cuales pertenecen al género orthopoxvirus, avipoxvirus, leporipoxvirus y parapo^virus . La alta atenuación de las cepas del virus de viruela se logra de conformidad con la invención, por pasos de dilución terminal de placa adicional (es decir, transferencia y continuación) de cepas virales convencionalmente atenuadas en ¡ líneas de células permanentes, seleccionadas, optimizadas (por ejemplo, células VERO) , en cultivos de células primarias (por ejemplo, en cultivos de células1 de fibroblastos de embriones de pollo (FHE), huevos del pollo incubados o en animales experimentados. Se ha encontrado sorprendentemente que, la virulencia o inmunogenicidad de los virus de viruela animal y sus constituyentes, se pierde en i comparación con cepas convencionalmente atenuadas, a través de sus pasos adicionales. El pasó en los sistemas de células seleccionadas o cultivos, to a lugar hasta que se logran las propiedades deseadas, es, decir, hasta que los virus de viruela animal no tienen ampliamente alguna virulencia o inmunogenicidad y en su lugar, muestran una
actividad incrementada del sistema inmune no específico
(parainmunidad) . Esto no se puede lograr normalmente, por
al menos, 200-500 pasos en sistemas celulares optimizados, tales como los cultivos celulares de pasos de células VERO
(ATCC CCL-81, WHO, American Type Cultjure Collection) . Tales sistemas de células optimizadas proporcionan los tituladores necesariamente altos. Las propiedades biológicas, genéticas e ¡inmunológicas deseadas adicionales, que resultan de una alta atenuación de cepas de viruela animal, se listan en la tabla 3. El método de la invención ¿ara producir virus de viruela animal altamente atenuadas, pueden ser en general, definidos por las siguientes etapas: ; (a) adaptación de la viruela animal a un sistema i de célula permisiva por ejemplo, que consiste de la membrana corioalantoica de embriones de pollo de 10 días de edad (CAM), o cultivos celulares, por ejemplo, cultivos de células de riñon de cordero; (b) transferencia y continuación de los virus de viruela animal para atenuación por p¡asos de largo término en varios sistemas de células permisivas las cuales hacen posible los tituladores infecciosos óptimos, especialmente
células AVIVER o VERO; (c) transferencia y continuación de los virus de viruela animal por atenuación en ¡un sistema de célula óptima por aproximadamente 100-300, ¡por ejemplo, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 2¿5, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240 245, 250, 255, 260, 26¡5, 270, 275, 280, 285, 290, 295 o 300 pasos, preferiblemente en células VERO, AVIVER o MA, siendo preferido el sistema de células usado en (c) para diferir del sistema celular usado en (b) ; (d) transferencia y continuación de los virus de viruela animal en células VERO por al menos, 90, por ejemplo, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 2|40 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 o más pasos, I preferiblemente, pasos de dilución terminal de placa. En una modalidad particularmente preferida, la cepa orthopoxvirus altamente atenuada, es un virus de viruela de camello altamente atenuado ( Orthopoxvirus carne 1 i ) , especialmente de la cep^ h-M 27. Un método preferido para virus de viruela de camello altamente atenuantes incluye, las siguientes etapas:
(a) cultivar el virus de viruela de camello aislado por aproximadamente 2 hasta ?4 pasos en cultivos de
células de riñon de cordero;
(b) transferir y cultivar! del virus de viruela
animal por aproximadamente 5 a 10 pasos en pasos de células
VERO (ATCC CCL-81, WHO, American Typé Culture Collection); ¡ (c) transferir y cultivar de los virus de
viruela animal, por aproximadamente 114 hasta
aproximadamente 150 pasos en células MA;
(d) transferir y cultivar¡ del virus de viruela
animal por aproximadamente unas 267 adicionales o más, por
ejemplo, 270, 275, 280, 285, 290, 29¡5, 300, 305, 310, 315,
320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400 o más pa¡sos en células VERO,
preferiblemente, pasos de dilución t rminal de placa.
Los virus de viruela animal generados de esta
forma, pueden ser empleados para producir inductores de
parainmunidad y vacunas de vectores. ¡Para la producción, se
usa el virus colectado capaz de replicación.
Una modalidad adicional de ¡la presente invención, I se refiere a los virus de mixfmatosis de cepa de
leporipoxvirus altamente atenuada ( Leporipoxvirus myxoma tosis) , cepa h-M 2. Un método altamente preferido para alta
atenuación tal como una cepa dei virus mixomatosis,
preferiblemente la cepa h-M 2, incluye las siguientes etapas : (a) aislamiento de animales enfermos vía la membrana corioalantoica de embriones ¡de pollo de 10 días de edad (CAM) y una continuación en este sistema por al menos, 2 o más, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más pasos; (b) transferencia y continuación de los virus de viruela animal aislados por al menos, 120 o más, por ejemplo, 125, 130, 135, 140, 145, 1$0, 155, 160, 165, 170, 175, 180 o más pasos en cultivos de ¡ células VERO; (c) transferencia y continuación de virus de viruela animal en células AVIVER por al menos, 24 o más, por ejemplo, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más pasos; (d) transferencia y continuación de los virus de viruela animal en células VERO por al menos, 157 hasta 200 pasos; (e) transferencia y continuación de los virus de viruela animal en células MA por al menos 114 a 150 pasos; (f) transferencia y continuación de los virus de viruela animal en células VERO por ¿1 menos, 179 pasos. Los virus colectados son inactivados por tratamiento con beta-propiolactona para producir inductores de parainmunidad. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas las cuales comprenden uno o más de las cepas de viruela altamente apropiada dei origen diferente en combinación, y en las cuales, un pojrtador farmacéutico se agrega en donde sea apropiado. Un aspecto adicional de la invención por lo tanto, se refiere al uso de una o más de las cepas de viruela animal altamente atenuadas de la invención (por ejemplo, en combinación) o constituyentes de las cepas de viruela de animal altamente atenuajdas, para activar el sistema inmune paraespecífico en un mamífero o en un humano para profilaxis y terapia. En un aspecto adicional de ¡la presente invención, se emplean virus de viruela animal altamente atenuados, para producir vacunas de vectores; los virus colectados capaz de replicación, son usados para este propósito. Un ácido nucleico que codifica para un 'antígeno extraño es en este caso, incorporado en una de las supresiones, que resultan de la alta atenuación, del ácido nucleico del vector (virus de viruela animal), de manera que el gen extraño puede ser expresado por el vector. Las proteínas extrañas que resultan en esta forma,' proporcionan epítopes inmunizantes y de este modo, estjimulan el sistema de defensa específico endógeno. '
DEFINICIONES El término "atenuación" ! (atenuar: debilitar, mitigar) , de un patógeno infeccioso; (por ejemplo, virus, bacterias, hongos), significa en principio, la reducción de i sus propiedades virulentas e inmunizantes. En particular, dependiendo del grado de atenuación, en términos de tecnología, aquí es una reducción en el peso molecular y de este modo, un acortamiento de su ácido nucleico, asociado con la incidencia de supresiones, en términos biológicos, aquí existe una reducción o pérdida de sus propiedades i patogénicas con relación a la virulencia y contagiosidad, en términos inmunológicos, exis¡te una pérdida de actividades inmunogénicas y un increir-ento en las potencias paraespecíficas y en términos clínicos, existe una restricción en el intervalo hospedero y una actividad incrementada de reacciones de defensa paraespecíficas del hospedero. "Alta atenuación", significa la reducción adicional de simplemente atenuado, pero todavía patógenos parcialmente virulentos e inmunogenjizantes, hasta que la virulencia y la inmunización potencial son completamente perdidas, la alta atenuación que resµlta en una limitación I extrema del intervalo hospedero. La alta atenuación, incrementa mayormente el potencial! parainmunizante . Con relación a la reactivación de sus propiedades inmunizantes y virulentas perdidas, los virus ¡de viruela altamente atenuados, son más estables que las cepas convencionalmente I atenuadas, es decir, es imposible la conversión posterior.
Las cepas de viruela animal altamente atenuadas, difieren de las cepas de viruela ariimal convencionalmente atenuadas, en términos de tecnología del gen por un decremento adicional en el peso molecular del ácido nucleico viral y un incremento en supresiones en el ácido nucleico; en términos biológicos, por pérdida completa de virulencia y contagiosidad, e¡stas cepas logran simultáneamente un titulador infeccioso óptimo, el cual es alto en comparación con cepas conve?cionalmente atenuadas, en el sistema hospedero permisivo; en términos biológicos, por pérdida total de inmunogenicidad, y en términos de biología molecular, por pérdida de receptores de citocina, por ejemplo, receptores para interferona y ciertas interleucinas . Los términos "virulencia" y "propiedades virulentas", son usados sinónimamente en la presente invención. Virulencia se refiere al grado de propiedades que causan la enfermedad de una cierta cepa de especies patogénicas en un hospedero particular, bajo condiciones de infección definidas. El grado de virulencia puede variar ampliamente dentro de las cepas de uña especie. Se hace una distinción entre las cepas altameijite, débilmente y no virulentas (avirulentas) . Un cambió en las condiciones ambientales y hospederas también puedje conducir a un cambio en la virulencia de la cepa, pero puede también permanecer sin cambio. De este modo, las defensas del hospedero, las circunstancias anatómicas y fisiológicas de la flora del hospedero, la temperatura ambiental, la humedad, etc., pueden actuar sinergísticamente o antagonísticamente. Cada especie intrínsecamente patogénica ocurre en la naturaleza en un número de cepas que difierjen en virulencia. La j presencia de virulencia o la pérdida de virulencia puede ser evaluada en sistemas de prueba, los cuales se conocen i por el experto en la técnica y es rjelevante para el virus i de viruela animal respectivo. El virijis de viruela animal de I la presente invención, no muestra en i particular, virulencia I alguna en hospederos humanos. El término "patogenicidad"1 (patos = que sufre) , se refiere a la propiedad de un ¡patógeno infeccioso o parásito metazoico de ser capaz, desp Iués de la penetración, I adhesión y replicación idéntica en uiji hospedero, a conducir i a una ubicación o deterioro general] de la capacidad para funcionar (funcionamiento) y caiusar una enfermedad infecciosa. Puesto que el desarrollo de una enfermedad infecciosa depende del patógeno y ¡hospedero, el término patogenicidad se refiere al sistema j de patógeno-hospedero, i no solo al patógeno. La patogenicidad se refiere a las especies de un patógeno, no a una valíante, una cepa o una colonia. Es una propiedad básica, ¡una energía, la cual puede, pero no necesita, actuar. Una¡ especie patogénica no puede, con relación a un sistema de patógeno hospedero particular, llegar a ser apatogénica en naturaleza debido a que esta capacidad básica de una especie completa no se pierde . Los términos "inmunogenicidad" y "propiedades inmunizantes", son usados sinónimamente en la presente invención. La inmunogenicidad de un virus de viruela animal se refiere a la capacidad del virus de viruela animal para inducir en un vertebrado, preferibl mente en la naturaleza hospedera del virus o en un humanoj una respuesta inmune humoral y/o específica celular, por ejemplo, para estimular la proliferación de células T y/o la generación de anticuerpos. La pérdida de la inmunogenicidad de las cepas de viruela animal altamente atenuadas de la presente invención, está asociada con la pérdida de su capacidad. La inmunogenicidad o la pérdida del mismo, puede ser investigada en sistemas de prueba, los cuales se conocen por los trabajadores expertos. "Vacunas de vector" (vacunas recombinantes, vacunas híbridas), significan vacunas las cuales consisten de dos componentes: un portador mifrobiano (vector) y un antígeno inmunizante cuyo ácido nucleico codificante es incorporado en el vector. Los portadores microbianos adecuados y preferidos son, debido a sus numerosas supresiones de ácido nucleico y sus propiedades parainmunizantes, virus de viruela animal (altamente)
atenuados. El ácido nucleico de gen ^xtraño introducido, se
lleva a expresión por el vector en 1$ vacuna, conduciendo a la formación de reacciones inmunizantes específicas. "Inductores de paraínmunidad" (vacunas paraespecíficas) , se refiere a los productos bioregulatorios compuestos de virus de viruela animal atenuados, avirulentos e inactivados, los cuales, I dependiendo del grado de atenuación, ahora comprenden solamente residuos de propiedades inmunizantes
(convencionalmente atenuados) o no (altamente atenuados), y están propuestos para ser usados para parainmunización en humanos y animales. Son producidos como vacunas específicas convencionales y también parecen ser funcionalmente, pero con la diferencia de que activan ¡ predominantemente los mecanismos de defensa paraespecíficios (no específicos) y sin embargo, conducen a través ; de sus propiedades bioreguladoras, a los sistemas de defensa homeodinámicos .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN i General ' Esta invención se basa ;en el descubrimiento sorprendente de que las propiedades inmunizantes y virulencia de cepas de virus de viruela animal convencionalmente atenuadas, pueden ser reducidas tan pronto como completan la pérdida por pasos de dilución terminal de placa adicional erí cultivos celulares permisivos, huevos de pollo incubados o animales experimentales. Las cepas altamente atenuadas en esta forma, son estables a una reactivación potencial de estas propiedades. Este proceso, el cual va más allá de una atenuación convencional, simple, es referido en la presente í invención como "alta atenuación". Estas cepas de virus de viruela animal altamente atenuadajs, son distintamente mejoradas sobre patógenos convencioríalmente atenuados. En particular, las cepas de viruela animal altamente atenuadas, difieren, como se resume fn la tabla 3, a partir de las cepas de viruela animal conveijicionalmente atenuadas, en términos de tecnología de gen, a 'través de la reducción en el peso molecular del ácido 'nucleico viral y el incremento en supresiones en el acid? nucleico; en términos biológicos, a través de la pérd|ida de virulencia y contagiosidad; en términos inmunológicos, a través de la pérdida de inmunogenicidad, y en ' términos de biología molecular, a través de la pérdida de receptores de citocina. Se ha descubierto de manera inesperada, que todas las cepas de viruela animal atenuadas probadas, de la familia de poxviridae, irrespectiv? del género al cual pertenecen, pueden ser convenciorualmente atenuadas y después, además debilitadas con al¡ta estabilidad (véase tablas 1 y 2). Tal atenuación elevalda se muestra en esta i invención por medio del ejemplo con 'representativos de los
géneros orthopoxvirues, leporipoxviruses y avipoxviruses, pero no son considerados como confinados a estos géneros.
La presente invención también describe por primera vez, alta atenuación con virus de mixomatosis y un virus de viruela de camello. La capacidad de patógenos infecciosos para cambiar para adaptarse a los cam ios ambientales, por
ejemplo, que crecen en cultivos celulares o en sistemas de hospederos no naturales, puede ser utilizado experimentalmente para reducir marcadamente, el tiempo necesario para alta atenuación. Esto toma lugar preferiblemente, por pasos de termino prolongado en particular, sistemas de hospederos pejrmisivos los cuales no pertenecen normalmente, al intervalo de hospedero natural
(por ejemplo, animales experimentales, cultivos celulares, medio nutriente) . La alta atenuación ;de las cepas del virus de viruela toma ordinariamente, 15 a '30 años. Cepas de virus de viruela' altamente atenuadas, también pierden sus capacidades inmunizantes específicas, mientras su actividad paraespecífica es especialmente mejorada, por el método altamente atenuado descrito en detalle abajo. Las cepas de virus de viruela altamente atenuadas son por lo tanto, adecuacjas como inductores de parainmunidad o para producir vacunas de vectores. El mejoramiento de las propiedades paraespecíficas es presumiblemente atribuido a la interferencia mutua de proteírjias inmunizantes y parainmunizantes del virus de viruela animal. La pérdida, causada por la alta atenuación ' de las propiedades inmunizantes, hace activas a las proteínas parainmunizantes adicionales, y con ello, incrementa en una manera significante la actividad parainmunízante de estas cepas. De esta forma, los inductores de parainmunidad nocivos y altamente activos, se obtienen y no qausan algunas alergias u otros efectos colaterales inmunop togénicos aún si las administraciones son repetidas en el término corto y son frecuentes. Ordinariamente, la atenuación simple, convencional, conduce a una reducción en la virulencia y contagiosidad y a una limitación del intervalo del I hospedero y a pequeños cambios en el genoma del patógeno con un decremento simultáneo en el peso molecular y la incidencia de supresiones en las regiones terminales del genoma viral. Además, existe un decremento en las actividades específicamente inmunizantes y un incremento en la actividad paraespecífica . Sin ¡ embargo, una alta atenuación mejora estos efectos drásticamente, de manera que los virus altamente atenuados resultantes, son superiores el términos de su estabilidad, su especificidad hospedera, la carencia de virulencia y la inmunogenicidad a virus convencionalmente atenuados (tablas 3 y 4).
Virus de viruela animal altamente atenuados En un primer aspecto, la ¡presente invención se refiere a un virus de viruela anim l altamente atenuado, basado en una cepa de virus de viruela animal de la familia poxiviridae, caracterizado porque 'el virus de viruela animal no tiene ampliamente algunas propiedades inmunizantes y virulentas, y los virus de viruela animal altamente atenuados, exhiben un peso molecular inferior del ácido nucleico viral, más frecuente, supresiones en la región terminal y una pérdida incrementada de receptores de citocina en comparación con las cepas de viruela animal convencionalmente atenuadas. Los vitus de viruela animal atenuados conocidos, tienen entre 0 y.3 supresiones, en una o ambas regiones terminales del genoma viral. El número de supresiones en varias cepas de virus de viruela animal meramente atenuadas varía, sin embargo, de manera que los virus de viruela animal altamente atenuados de la presente invención, en conjunto, exhiben entile 1, 2,3 4, 5 ó más supresiones en las regiones terminales del genoma viral, que aquellas en virus de viruela animal meramente atenuadas. En una modalidad preferida de la invención, el virus de viruela animal altamente atenuado de la presente i invención, exhibe en total, 5, 6 7, 8, 9 10 ó más supresiones en las regiones terminales. Exhiben preferiblemente, supresiones ? más frecuentes, preferiblemente al menos, 2 supresiones en la región derecha y al menos, 2 supresiones en la región izquierda. En una modalidad preferida del virus de viruela I animal altamente atenuado de la presente invención, el genoma viral muestra una pérdida de receptores de citocina
para interferona o¡ y ?. Es particularmente preferido para
el virus de viruela animal adicionalm Iente, mostrar también una pérdida de los receptores para células IL-1 ß y/o TH 1. En una modalidad preferida, el genoma viral del virus de viruela animal es 16%,, 17%, 18%, 19% y particularmente, preferiblemente aproximadamente 20% más pequeña que el genoma viral del tipo nativo. Las supresiones son preferiblemente localizadas en una o ambas regiones terminales del genoma del virus de viruela anima. En una modalidad preferida,' el virus de viruela animal altamente atenuado de la presente invención, es obtenible por el siguiente método: (a) adaptación de la viíuela animal en un sistema de célula permisible o cultivos celulares, en particular, células CAM o células de riñon de cordero.
(b) transferencia y continuación de los virus de viruela animal por atenuación por paéos de largo término en varios sistemas de células permisivas, las cuales hacen posible los tituladores infecciosos , óptimos, por ejemplo, en células VERO, en particular, se llevan a cabo aproximadamente 5 a 10 pasos; en el caso de virus de • mixomatosis; preferiblemente al menos 100, preferiblemente al menos 110, al menos 120, al menos 130 o más pasos de células VERO, seguido por al menos 20, preferiblemente al menos, 24 pasos intermediarios en , cultivos de células AVIVER y pasos de células VERO adicionales: (c) transferencia y continuación de los virus de viruela animal para atenuación en un sistema de células óptimas por aproximadamente 100-300 pjasos, por ejemplo, en células MA-104, células VERO o células AVIVER, en particular por 200 a 300 pasos; y (d) transferencia y continuación de los virus de viruela animal en células VERO por; al menos 90 pasos, preferiblemente por al menos, 100, 11Q, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 2301, 240, 250, 260, 270,
280, 290, 300 o más pasos. Los pasos purificados de placa, son preferiblemente llevados a cabo en una o más etapas (b) ,
(c) y (d) .
Método altamente atenuante Una atenuación convencional (así como también las primeras etapas de la alta atenuación) , parte con la adaptación de virus de viruela animal aislados en sistemas I de células permisivas homologas u he¡terólogas, tales como, I I por ejemplo, cultivos celulares, huevos de pollos incubados o en animales experimentales. Esto es seguido por atenuación por pasos de largo término, en varios sistemas de células permisivas. Los sistemas de células permisivas apropiados para cada cepa viral, son específicamente seleccionados para cada una de las especies de virus de viruela animal. La selección depende del titulador infeccioso de los virus en el sistema de células particular. Sin embargo, el sistema, celular seleccionado para el paso, proporcionará el titulador infeccioso más alto para las especies particulares de virus. Tal sistema celular, en particular línea celular, ; puede ser determinado por el experto en la técnica, por medios conocidos en la técnica anterior. Esto también corresponde al mismo tiempo, con el titulador de virus óptimo;. La atenuación es continuada, continuando los virus dé viruela animal por aproximadamente 100-300, en particular 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 o 300 pasos, en estos! sistemas de células óptimas. Esto es seguido por una fase terminal, caracterizada por 3-5 pasos de dilución terminal de placa.
Este material puede ser además, procesado de conformidad con el uso adicional. Todos los representativo^ descritos en este documento de orthopox-, lepor pox-, parapox-, y avipoxvirus, pueden ser atenuados en una forma convencional. La atenuación elevada ¡subsecuente toma lugar continuando los pasos de la cepa de virus simplemente, i convencionalmente atenuada en ¡ sistemas hospederos permisivos homólogos o heterólogos. La elección del sistema hospedero en cambio, depende de las especies de viruela animal y se selecciona de conformidad con los aspectos mencionados anteriormente (titulado^ infeccioso) . La alta atenuación toma lugar por ejemplo, continuando los I orthopoxvirus simplemente atenuados ¡en células VERO o los avipoxvirus simplemente atenuados en cultivos de células de ¡ fibroblastos embriónicos (FHE) de pollo embriónico. Los poxvirus (por ejemplo, virus ectrome'lia, virus de viruela de camello) , son preferiblemente altamente atenuados por al menos, 60 hasta 300 pasos, dependiendo de la cepa de virus particular, en cultivos de células VERO (por ejemplo, 150 ó
260 pasos) . La cepa de leporipoxvirus myxomatosis, es I altamente atenuada por aproximadamente al menos, unos 150 hasta 300 pasos adicionales en cultivos celulares MA y VERO, preferiblemente por 98 pasos, n cultivos de células FHE. La cepa de parapoxvirus es altamente atenuada por unas 100 a 160 pasos adicionales, preferiblemente por 164 (tablas 3 y 4). Se prefiere usar el método de dilución terminal de la así llamada placa (es decir, en la transferencia e inoculación) . En general, los cultivos de fibroblasto embriónico de pollos primarios (FHE), se usan para atenuar altamente los genes avipoxvirus, y las células de riñon de mono MA-104 permanentes (en corto: células MA) o pasos de células VERO (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection) y muchas otras, son usadas para todos los otros géneros, tales como orthopoxvirus, leporipoxvirus y parapoxvirus. Un medio completamente sintético es preferiblemente empleado para cultivar los cultivos de células MA o VERO, con particular preferencia para el medio MEM ("medio esencial mínimo"), el cual comprende 5% hasta 20%, preferiblemente 10% de BMS (medio sustituto de suero) y 5% hasta 20%, preferiblemente 10% de hidrolizado de lactalbúmina. Después del intercambio con el medio de cultivo, el medio de virus preferiblemente usado es medio MEM con 5% hasta 20%, preferiblemente con 10% de hidrolizado de lactalbúmina, sin BM'S y sin suero bovino fetal y sin antibióticos. Todos los ¡métodos de producción son preferiblemente llevados a cabo a valores de pH desde 7.0 hasta 8.0, preferiblemente, a un1 valor de pH de 7.25.
Los virus colectados con titulador de 105 hasta 108 TCID50/ml, preferiblemente de al menos 107'5 TCIDso/ml, son preferidos como material de partida para producir las cepas de viruela animal altamente atenuadas. La replicación de los virus, de viruela en células
VERO, conduce a un efecto citopático típico, el cual conduce a la destrucción de las células infectadas (lisis) . Con una dosis de inoculación inicial de aproximadamente 10 MOI ("multiplicidad de infección"), una breve fase de redondeo (1-2 días) se sigue por estructuras de células reticuladas por aproximadamente 3 días y por lisis de las i células después de aproximadamente 5 días. Los virus colectados obtenidos a partir del último paso, pueden ser además, apropiadamente procesados para su uso. Por ejemplo, los ácidos nucleicos presentes en los virus pueden ser clonados rpcombinantemente para producir vacunas vectoras. O los virus altamente atenuados colectados, pueden ser liofilizados ¡y ser almacenados por ejemplo, como inductores de parainmunidad. Para indicaciones médicas y terapéuticas,, el liofilizado puede ser verificado por su actividad e inocuidad. i
Orthopoxyirus altamente atenuados ; En una modalidad preferida, se describe el siguiente método altamente atenuante por medio del ejemplo, con virus de viruela de camello que pueden ser usados para orthopoxvirus :
Orthopoxyirus cameli, h-M 27 Los virus de viruela de camello, aislados del material pustular de animales enfermes, tales como la cepa M 27, son cultivados en cultivos df células de riñon de cordero embriónico por aproximadamente 2 pasos. Los virus de viruela animal cultivados de esta forma, son transferidos por un método adecuado, preferiblemente por el método de dilución terminal de placa, en células VERO y i continuados por aproximadamente 5 pasos. Después de pasar en un cultivo de células VERO, el último paso de cultivo de células es adaptado a las células MA (células de riñon de mono MA-104) y continuadas por aproximadamente 114 pasos.
El 121avo. Paso de MA purificada de placa obtenido en esta I forma (total de 284 pasos), ha probado ser simplemente j atenuado. Es posible en aislados de este paso, es decir, con una atenuación simple, ya obserivar un decline en la virulencia del hospedero homólogo, ; una restricción del intervalo hospedero, un incremento en el titulador infecciosos, un decremento en las células gigantes en el efecto citopático en cultivos celuliares y un decremento menor en las actividades inmunogénicas específicas. Debido a las propiedades inmunizantes, las: cuales están todavía presentes después de una atenuación simple de los virus de viruela animal, los virus de viruela de camello simplemente atenuados, también son adecuados para vacunación parenteral contra viruela humana o como vacunas contra la viruela de camello. (O.-R. Kaaden, A. Walz, CP. Czerny and U. Wernery, 1992: "Progress in the development o|f a camelpox Vaccine", Proc.lth Int.Camel Conf, 1, 47-49). La cepa del virus de viruela de camello M27, puede ser altamente atenuado continuando la cepa atenuada en células VERO. Para este propósito, es necesario llevar a cabo al menos, 50-150 pasos adicionales, preferiblemente, 100 pasos VERO purificados de placa. ¡Un virus de viruela de camello altamente atenuado h-M 27 (h = altamente atenuado) , obtenido de esta forma, prueba ser extremadamente estable. En total, por lo tanto, aproximadamente 384 pasos de cultivos celulares son necesarios para producir el virus de viruela de camello altamente atenuado de la invención. El número exacto de pasos es, sin embajrgo, no propuesto para i ser considerado como restrictivo en esta conexión. El trabajador experto apreciará que las; modificaciones de los métodos descritos en este documento y de los parámetros usados, especialmente del número de ' pasos de células o de la línea celular para atenuar altamente una cepa de virus i de viruela animal, están dentro ¡ del alcance de la invención.
El virus de viruela de camello altamente I atenuado, cepa h-M 27, obtenido por el método de la invención, exhibe una pérdida total de virulencia y contagiosidad para el hospedero horriólogo y un titulador alto infeccioso en células VERO (107' 25 CID5o/ml) . Es por lo tanto, particularmente adecuado p&ra uso como vacuna paraespecífica (inductor de parainmupidad) . Sin embargo, es posible para el inductor de parainmunidad basado en virus de viruela animal altamente atenuados, ser usados tanto en una forma capaz de replicación, , como en una forma inactivada. En la forma inactivada,! los virus altamente atenuados son tratados como se describe abajo con beta-propiolactona (V. Fachinger, T. Sc'hlapp, W. Strube, N. i Schmeer and A. Saalmuller, 2000: "Pox-virus-induced immunostimulating effects on porcine leukocytes",
J. Virology 74, 7943-7951; R. Forster G. Wolf und A. Mayr,
(Paramunitatsinducer) : "Eine neue Art von Impfstoff, arztezschr. Naturheilverf . 40, 550-J557; Mayr, A., 2000: "Paraspezifische Vaccine - Eine neuje Art von Impfstoffen zur Regulation von Dysfunktioneln in verschiedenen I Korpersystemen", Erfahrungsheilkunde I (EHK) 49, 591-598). Con una atenuación simple, la longitud del genoma del virus es ya marcadamente reducida a través de la incidencia de supresiones. La longitud del genoma del virus inicial (tipo nativo) , es aproximadamente 193 900 pb, mientras la longitud del genoma de la cepa atenuada M27 es de aproximadamente 172 400 pb. La atenuación convencional de este modo, resulta en una pérdida marcada de nucleótidos en el ADN. La digestión de restricción con la enzima de restricción HindIII, muestra que e? el genoma de cuatro fragmentos de restricción, algunos ¡están presentes en el análisis de gel (Otterbein CK., 1994, Vet . ed. Diss . München) . En este caso, existen dos supresiones en las supresiones derechas y dos en el segmento terminal izquierdo del genoma viral. La región conservada central, del genoma viral, permanece sin cambio (C. Gubser, S. Hue, P. Kellam and G.L. Smith, 2004: "Poxvirus genomes: a phylogenetic analysis", J.Gen. Vir l. 85, 105-117). La longitud del genoma viral fue ademásj, acortada por la alta atenuación desde 172 400 pb (virus ajtenuado) hasta 160 300 pb. El número de supresiones se elevó de 4 a 5 (dos en el segmento terminal izquierdo y 3 en el derecho del genoma) , con la región conservada central, del genoma viral permaneciendo estable. La alta atenuación, además conduce a pérdida de receptores interferona ¡ a y ? y receptores interleucina adicionales y, sorprerj-dentemente, también a activación de las células troncales -Hematopoyéticas .
Virus de mixomatosis h-M2 de Leporipo¡xyirus myxomatosis
En una modalidad adicional de la invención, la
alta atenuación se lleva a cabo con la cepa M2 de virus de
mixomatosis. Una vez nuevamente, hubo pasos en células CAM, i seguido por varios pasos de células VERO y AVIVER y
finalmente, pasos adicionales en células VERO.
En una modalidad preferida, el método para
producir inductores de parainmunidajd de virus de mixoma
altamente atenuados incluye las etapajs de:
(a) aislamiento de animales enfermos vía la
membrana corioalantoica de embriones de pollo de 10 días de
edad (CAM) y continuación en este sisjtema por al menos 2, o
más, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9¡, 10 ó más pasos;
(b) transferencia y continµación de los virus de
viruela animal aislados por al mehos, 120 o más, por
ejemplo, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170,
175, 180, o más pasos en cultivos de ¡células VERO; (c) transferencia y continuación del virus de
viruela animal en células AVIVER poí al menos, 24 o más,
por ejemplo, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ¡55, 60 o más pasos;
(d) transferencia y continuación del virus de j viruela animal en células VERO por a menos, 157 hasta 200
pasos; (e) transferencia y continµación de los virus de
viruela animal en células MA por al¡ menos, 114 hasta 150 pasos; (f) transferencia y continuación del virus de viruela animal en células VERO por al| menos, 179 pasos. En una modalidad adicional, los virus de i mixomatosis usados para la atenuación de la subcutícula edematosa (oreja izquierda) de un conejo silvestre Europeo
(género Oryctolagus) que sufre, en1 una forma típica de mixomatosis del virus de mixoma, sé aisló cultivando la membrana corioalantoica (CAM) de hupvos de pollo (huevos VALO) , incubados por 10 días, y adaptados tres veces en el CAM en pasos por el método de Herrlich A., Mayr A. and Munz E.: "Die Pocken", 2da. Edición, Georg Thierme Verlag Suttgart, 1967). El tercer paso CjAM se adaptó en una primera etapa a las células VERO sobré 120 pasos (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection), replicado en una 2da. Etapa por 24 pasos intermediarios en cultivos de células AVIVER, y además, cultivado en la 3era. Fase en células VERO. En total, aproximadamente 300 pasos se llevaron a cabo con la ayuda de atenuación. Después de estos pasos de dilución terminal continua, los virus de mixoma originalmente virulentos, fueron atenuados. La cepa de virus de mixoma altamente atenuada M2 , se obtiene continuando con la cepa atenuada en células VERO. Para este propósito, es necesfrio llevar a cabo al menos, un paso adicional de 250 a 350, preferiblemente 300 pasos purificados de placa en células VERO. La cepa de virus de mixoma h-M2 (h = altamente atenuada) , obtenida en esta forma, fue aprobada, como la cepa de virus de camello altamente atenuada, por ser altamente estable. Del mismo modo, exhibe una pérdida total de virulencia y contagiosidad por el hospedero homólogo, un titulador alto infeccioso 106'75 CID50) , la pérdida completa de inmunogenicidad, incrementa e¡n la actividad I parainmunizante, restricciones adicionales del intervalo hospedero, supresiones adicionales en el genoma y pérdida de varios receptores de interleucina e interferona.
Propiedades de los orthopoxyirus altamente atenuados Las cepas de viruela animal altamente atenuadas de la invención, son caracterizadas c<mo sigue: 1. estabilidad biológica incrementada; 2. pérdida de virulencia • y contagiosidad, aún para ratones bebé de 2-3 días (parenteral, intraperitoneal) ; 3. pérdida de inmunogenicidad específica después de la administración parenterál e intraperitoneal; 4. completa restricción del intervalo hospedero; 5. incremento en el tituilador infeccioso del virus atenuado en células VERO; ' 6. fuerte actividad parajinmunizante (capaz de replicación e inactivación) ;
7. acortamiento de la longitud del genoma de los virus de viruela animal atenuados; que corresponde a un decremento en el peso molecular; 8. incremento en el número de supresiones en la región terminal; I 9. pérdida del receptor a y ? interferona y
otros receptores de interleucina; 10. activación de células troncales hematopoyéticas. El número de pasos celulares y los tipos de células necesarias para atenuación convencional, comparadas con alta atenuación, son compilados en la tabla 3. I Ordinariamente, más de 100 hasta aproximadamente 300 pasos en varios sistemas hospederos permisivos son necesarios para la alta atenuación. Un periodo cjie aproximadamente 15- i 30 años es necesario para la atenuacipn completa. Las Tablas 3 y 4 muestran! una revisión de las diferencias tecnológicas del gen y ¡biológicas entre una atenuación convencional y una alta atenuación de la I invención, por ejemplo, de virus va¡ccinia, cepa MVA. De este modo, ocurren supresiones fr¡ecuentemente en las regiones terminales del genoma viral: (repetición terminal I invertida) , y el peso molecular se reduce propiamente a algunos pares base. En el caso de virus de viruela animal
altamente atenuados, aproximadamente 20$ del genoma original se pierde (el cual también los hace atractivos como vacunas de vectores, véase abajo) . También se encuentra por existir una pérdida! de receptores, por ejemplo, para células IL-lß y THl, y un incremento de la
activación de células NK y de la ' formación de células troncales hematopoyéticas, y una restricción adicional del intervalo hospedero en cultivos celµlares . Existe además,
un mejoramiento de interferona a y ?,, IL-1, 2, 6, 12 y GM- CSA, TNF. Finalmente, las cepas ¡de virus de animal altamente atenuadas, no tienen inmunógenicidad específica, pero tienen una actividad incrementada del sistema inmune no específico (parainmunidad) . Existe una ausencia completa de virulencia para humanos o animales.
Procesamiento adicional de parapoxyirús altamente atenuados a inductores de parainmunidad ¡ En la producción de inductores de parainmunidad de cepas de virus de viruela altamente atenuados, es posible llevar a cabo una inactivación por tratamiento químico con beta-propiolactona a una concentración de i 0.01%-1% de beta-propiolactona. Una concentración de 0.05% de beta-propiolactona, es particularmente preferida en esta conexión. Idealmente, la inactivación con beta-propiolactona se lleva a cabo a un pH de 7.8 y a 4°C por aproximadamente 1 hora, mientras se agita y subsecuentemente se incuba a 37 °C por aproximadamente 4 horas y durante la noche a +4°C. La inactivación con beta-propiolactona conduce a una pérdida completa de las propiedades inmunizantes con una eleyación simultáneamente grande en la actividad paraespecífica L En la producción de inductores de parainmunidad, las partículas de virus altamente atenuados son preferiblemente purificadas por centrifugación a bajas revoluciones (por ejemplo, 1000 r,pm) . Después de la centrifugación, es posible agregar , 0.5-10% de gelatina succinilada (por ejemplo, poligelina, obtenible de por ejemplo, Hausmann, St . Gallen, Suiza)¡, preferiblemente, 5% de gelatina succinilada. La mezcla resultante puede entonces, ser liofilizada en porciones de por ejemplo, 1.5 ml en viales de vidrio estériles apropiados, o ampolletas y ser disueltos en agua estéril como se: requiera. Un volumen de 0.5-2 ml, preferiblemente de 1.0¡ ml, del liofilizado disuelto en agua estéril, corresponde ¡a una dosis de vacuna para humanos en administración intramuscular (véase también (Mayr A. und Mayr. B.: „Von der EmpirfLe zur Wissenschaft" , Tierárztl. Umschau, Aufl. 57: 583-587, 2002). El producto liofilizado puede ser almacenado establemente por un tiempo ilimitado a temperaturas de aproximadamente +4°C hasta +8°C o a temperaturas inferiores (por ejemp1lo, -60°C) .
Uso de virus de viruela animal alta!mente atenua.dos como inductores de parainmunidad Un aspecto adicional de la invención, se refiere al uso de cepas de virus de viruela animal altamente atenuados o, de constituyentes de cepas de viruela animal altamente atenuadas, o combinaciones como inductores de parainmunidad. Ejemplos son virus, de viruela animal recientemente aislados, los cuales son capaces del replicación o inactivación, de virus de viruela animal recombinante, y los cuales se derivan de virus de viruela animal recientemente aislados, cubiertas de virus, cubiertas desprendidas y productos desdoblados y formas aberrantes de estas cubiertas, polijpéptidos o proteínas recombinantes o nativas únicas, especialmente receptores de la superficie y membrana, los cuales ocurren en virus de viruela animal aislada o son expresa'dos recombinantemente por un virus de viruela genéticameijite modificado o una parte de su información genética. Un aspecto adicional de la presente invención es por lo tanto, combinar varias cepas de virus altamente atenuadas del mismo u otros genes para uso como inductores de parainmunidad. Debido a sus propiedades parainmunizantes óptimas, los virus de viruela animal altamente atenuados, son adecuados para las siguientes indicaciones terapéuticas o profilácticas en humanos y animales,: enfermedades del ' factor infeccioso multifactorial e infecciones combinadas, manifestaciones crónicas de procesos infecciosos, infecciones obstinadamente recurrentes, e infeaciones bacterianas y virales resistentes a quimioterapia; - debilidad de defensa y desregulaciones en el sistema de defensa del organismo; - tratamiento de infección neonata; terapia adyuvante para ciertas enfermedades neoplasias, por ejemplo, prevención de metástasis, reducción en efectos colaterales de quimio y radioterapia; - mejoramiento en la cicatrización de heridas, evitación de infecciones secundarias después de los procedimientos quirúrgicos o a través ¡de lesiones; - regulación de la homeostasis entre los sistemas hormonales, circulatorios, metabólícos, vasculares y nerviosos. Los virus de viruela animal altamente atenuados, a través del comienzo inmediato del efecto parainmunizante, promueven la inocuidad con relación ¡ a los patógenos, de este modo, neutralizando los síntomas de estrés, infecciones latentes, fiebre, unai condición general reducida y otros factores, los cuáles pueden afligir la i inmunización. i Los inductores de parainmunidad de la invención, basados en cepas de viruela animal altamente atenuados, son de este modo, adecuados para indu ir el sistema inmune paraespecífico y/o para la profilaxis o tratamiento de i deficiencias o enfermedades infecciosas multicausales .
Ejemplos de tales enfermedades son disfunciones del sistema I inmune, inmunosupresión, trastornos ¡ de inmunodeficiencia, disfunciones de la homeostasis , entre los sistemas hormonales, circulatorio, metabplico y nervioso, i tratamiento de infección neonatal, enfermedad neoplásica, enfermedades virales, enfermedades bacterianas, enfermedades del factor infeccioso resistentes a terapia, infecciones bacterianas y virales combinadas, manifestaciones crónicas de procesos infecciosos, enfermedades hepáticas de varios orígenes, enfermedades crónicas de la piel, enfermedades ¡herpéticas, hepatitis crónica, infecciones de la influenza, daño por endotoxina, i mejoramiento en cicatrización de heridas con prevención de infecciones secundarias. La administración de cepa's de viruela animal altamente atenuadas descritas en e¡ste documento, puede tomar lugar localmente o parenteralmeríte. La administración i local de inductores de parainmunidad, específicamente estimula los mecanismos de defensa , paraespecíficos en las membranas mucosas y en la piel. Sin ?embargo, existe también un cierto efecto sistémico. Por otro lado, las parainmunizaciones aplicadas parenteralmente, apenas
influencian los mecanismos de defensa local en la piel y I mucosa. Se da preferencia en este contexto, a una I composición farmacéutica la cual incluye una o más de las cepas de viruela altamente atenuada^ de la invención y, en donde sea apropiado, un portador farmacéuticamente i aceptable Ejemplos de tal portador o aditivo son i polietilenglicol, dextrosa, sorbitol, manitol, polivinilpirrolidona, gelatina, estearato de magnesio, carboxilpolimetileno, carboxilmetilcelulosa, ftalato acetato de celulosa o polivinilacetato.
Uso de virus de viruela animal altamente atenuados como vacunas de vectores Un aspecto adicional de lá invención, se refiere al uso de las cepas de virus de viruela altamente atenuadas para producir vacunas de vectores (revisión: Pastoret, P. -P. und Vanderplasschen, A., 2003v). Comparadas con cepas convencionalmente atenuadas, las cepas de virus de viruela animal altamente atenuadas, son aún más adecuadas como vectores para producir vacunas de vectores, debido a que han perdido completamente sus propiedades inmunizantes a través de la alta atenuación. Puesto que los virus se pasan en base a sus tituladores infecciosos, las supresiones están localizadas en regiones las cuales son innecesarias para la replicación viral. Propio be las supresiones que ocurren en las regiones terminales del genoma viral siendo aún mayores en comparación con la atenuación convencional, los virus de viruela animal , altamente atenuados, proporcionan suficiente espacio p^ra insertar un ácido nucleico extraño (ADN) a ser expresado, o un inmunógeno extraño. ¡ El ácido nucleico extraño, puede codificar para un péptido o proteína, la cual1 proporciona epítopes inmunizantes. Sin embargo, la invención no está propuesta para ser restringida a un péptido o ¡proteína particular. El experto en la técnica apreciará que los genes extraños pueden ser clonados de conformidad con su tamaño en la región de supresión apropiada del virus. La expresión del péptido o proteína introducido pu^de ser controlada por elementos de control tales como, un promotor y, si es necesario, por elementos intensificádores . La incorporación de un ácido nucleico extraño el ¡cual codifica para un péptido o proteína, puede inducir una propiedad inmunoestimulante específica, fuerte, contra el péptido o proteína. Este puede ser utilizado por ejemplo, lonando en el constructo de vector, una secuencia de ácido nucleico viral cuya expresión induce una rjespuesta inmune en el I hospedero de transferencia. La clonación de los vi^us de viruela animal recombinantes como vacunas de vectores, toma lugar después del último paso de dilución terminal de placa. Para la clonación, el ácido nucleico viral puede ser desdoblado con endonucleasas de restricción adecuadas y ser ligado a las secuencias de ácido nucleico ^xtraño por métodos de ligación estándares. Comparados con vacunas convencionales o vacunas I de vectores, para los cuales son | usados otros vectores microbianos, las vacunas de vectores de la invención, tienen la ventaja de que no tiene efecto alérgico y proporcionan un sistema inmune óptimamente regulado al antígeno específico eluado, lo cual contribuye a un resultado de inoculación óptimo. Las vacunas de vectores de la invención, también están libre ¡de efectos colaterales negativos locales o sistémicos. tuesto que utilizan el intervalo inmunológico hasta que desarrollan completamente inmunidad, son adecuados en particular, para inoculaciones de emergencia (por ejemplo, en el caso de riesgo agudo de infección, antes de los viajes inesperados). La observación de que el resultado de inoculación y la inocuidad de las vacunas, puede ser considerablemente incrementado a través de la excelente actividad paraespecífica en la parte del viruá de viruela animal del vector, es nueva y hace a las Cepas atractivas para producir las vacunas del vector. Las vacunas del vector basadas en cepas de viruela animal altamente atenuadas, son por lo tanto, superiores en térmiíjios de su actividad e inocuidad a vacunas de vectores convencionales.
LISTA DE TABLAS Tabla 1: Miembros de la familia Poxv^' ridae . Tabla 2: Clasificación de orthopoxvirus (género
Orthopoxvirus, OPV) . Tabla 3: Diferencias entre atenuación convencional y alta atenuación. Tabla 4: Número de pasos en una atenuación convencional comparado con una alta atenuación. Tabla 5: Régimen de administración para tratamiento con inductor de parainmunidad. ' Tabla 6: Indicaciones para parainmunización con el virus mixoma h-M2 altamente atenuado.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son modalidades preferidas y sirven para explicar la invención adicionalmente, pero la última no está propuesta para ser restringida a esta.
Ejemplo 1
Un material de partida para producir inductores I de parainmunidad de mixoma (h-PIND-Mixo) , mixomavirus M2 convencionalmente atenuado (3 pasos pAM, 277 pasos VERO, 24 pasos AVIVER = 304 pasos) , fueron pasados además, por 114 pasos MA adicionales y 179 pasos VERO (total de 597 pasos) y de este modo, altamente atenuado-j (véase tabla 4). Los virus VERO colectados de Lepor^ipoxvirus myxoma tosis altamente atenuados h-M2, tiene un titulador de al menos, 106-75 CID50/ml. Los leporipoxvirus altameríte atenuados obtenidos en esta forma, no muestran propiedades virulentas o inmunizantes en todas y fueron además, procesados con el inductor de parainmunidad en la siguiente forma: Los virus colectados fueron incubados con beta-propiolactona 0.05% (pH 7.8, 1 ho¡ra a +4°C (agitado)), agitados a una temperatura de +37°C¡ a un pH de 7.8 por 4 horas (monitoreado hasta que el pH se ha ajustado a pH 7.8 si es necesario), incubados durante ¡la noche (estacionario a una temperatura de +4°C por aproximadamente 12 horas), y después purificados por centrifugación de baja velocidad (15 minutos, aproximadamente 4000 g)1. Se agregó poligelina (pH 7.8) al material de virus ( inactivado para una concentración total de gelatina de 2.5%. El material de virus preparado en esta forma, fué dispensado en viales estériles de 1.5 ml y liofilizados. tos liofilizados fueron almacenados a una temperatura de +4°C. Antes del uso, los lifolilizados fueron disueltos en 1 ml de agua estéril diluida por inyección y administrados por inyección intramuscular profunda. Las secuencias de administración e indicaciones médicas, están listadas en la taróla 5. El inductor de parainmunidad de mixoma es adecuado por ejemplo, para tratamiento de apoyo de herpes 'zoster (modo 4) por parainmunización. En este caso, el tratamiento conduce a i cicatrización de las pústulas las cuales son típicas de la enfermedad después de 3-4 días. En el caso de infecciones de pre-influenza, en uso de los inductores de parainmunidad de la invención, se observa por haber una desaparición completa de los síntomas (fiebre,! lasitud, dolores de cabeza y dolor en las extremidades) . En pacientes con lesiones de heridas (por ejemplo, después de operaciones) , una cicatrización de heridas inusualmente rápida, sin infecciones secundarias, se observa ' con el h-PIND-mixo. En casos de estomatitis y lesiones asociadas con una visita al dentista, el frotamiento en el liofílizado se siguió por la desaparición de la aftae y lesiones después de 1-2 horas.
Ejemplo 2
El virus de viruela de camello convencionalmente atenuado M27 (véase sección de descripción) , fue altamente I atenuado por 263 pasos adicionales en células VERO (total de 384 pasos) . Los virus colectados durante 107'0 CID50/ml sirvieron como el material de partida para producir inductores de parainmunidad. Con > este fin, los virus colectados fueron inactivados, centrifugados y liofilizados en una manera análoga al ejemplo 1. El modo de administración, así como también las indicaciones, son
análogas para aquellos del ejemplo |1. Los virus obtenidos no mostraron propiedades virulentas o inmunizantes en todos propios en la alta atenuación.
Ejemplo 3
Virus canarypox conveniionalmente atenuados (Avipox serinae, KP1, 535avo. paso ;FHE) , fueron altamente atenuados por unos 67 pasos adicionales en FHE (véase tabla 4). El 602avo. paso FHE sirvió en 'una manera análoga al Ejemplo 1 y 2, como virus canarypox altamente atenuado para producir inductores de parainmunidad. Los virus obtenidos no mostraron propiedades inmunizantes o virulentas en todos propios en alta atenuación.
Ejemplo 4
Virus de viruela aviar conyencionalmente atenuados
(Avipoxvirus gallinum, HPl, 444avo. paso FHE) , fueron
altamente atenuados por unos 98 pasps adicionales en FHE. i Después del 542avo. paso FHE, el viruß de viruela aviar HPl, probó ser altamente atenuado y se usó én una manera análoga al
Ejemplo 1, para producir inductores de parainmunidad. Los i virus obtenidos no mostraron propiedades inmunizantes o virulentas en todos propios en alta atenuación.
Ejemplo 5
Los inductores de parainmunidad basados en mioxavirus (OPV muris) , y parapoxvirus, fueron también producidos en analogía con los métodos descritos en los ejemplos precedentes.
Ejemplo 6
Se usaron cepas de viruela animal altamente atenuadas, para producir vectores ¡ de vacunas. En la producción de las vacunas de vector, se debe prestar particular atención a monitorear el pH después de cada etapa de producción individual.. El pH debe ser aproximadamente 7.8. La atenuación y ¡alta atenuación de los virus usados para producir vectores!, toma lugar como se describe en el Ejemplo 1. Es posible ¡en este contexto, usar todos los métodos de tecnología de gen para insertar segmentos de ácido nucleico los cuales codifican para antígenos específicos en los cuales, una reacción de inoculación específica, es decir, desarrollo de inmunidad, se logra. El gen extraño es rutinariamente incorporado por medio de enzimas de restricción adecuadas en las regiones de ácido nucleico suprimidas, las cua¡les han sido generadas por la alta atenuación en las cepas d!e viruela animal de la invención. Se usan en este contexto, técnicas de clonación y digestiones de restricción estándares. Es posible usar para qonstructos de virus recombinantes aislados, cualquiera (selección) de los genes marcadores o casetes de selección, tales como, por ejemplo, el gen ß-galactosidasa, los cuales están bajo el control de secuencias adecuadas. I Otros métodos para producir tales vectores a partir de cepas de viruela animal, se describen en el documento WO
00/69455. La descripción de esta public :ación y las enseñanzas contenidas aquí, en la producción de v&cunas de vector, está con ello, expresamente incorporada por i referencia. Del mismo modo, todas las otras publicaciones citadas en este i documento, están incorporadas por refer ncia.
Encuesta Tabular
Tabla 1 Miembros de la Familia Poxlvlridae
Tabla 2: Clasificación de orthopoxvirus (género Orthopoaevirus , OVP)
(actualizado del "7mo. Reporte del Comité Internacional de Taxonomía de Virus, 2000)
Especies Hospederos susceptibles
Virus de la viruela Humano (viruela OPV) Virus vaccinia (OPV común) Todos los mamíferos Virus Coxpox (OPV bovis) Todos ¡Los mamíferos Virus Ektromelia ÍOPV Ratón,, zorro, visón muris) Virus de viruela de camello Camello (experimentalmente (OPV cameli) posibl mente monos, ratones, conejos), los humanos no son susceptibles
Virus de viruela de mono Monos, | humanos (OPV simiae) Especies no clasificadas: Raccoop, Volé, roedores, Virus Raccoonpox, virus de liebres, ranas volepox California, virus taterapox
Nota: De conformidad con esta nomenclatura todavía incompleta, se suprimen las siguientes especies previamente incluidas: OPV bubali (búfalo), OPV elephant (elefante), OPV equi (caballo), OPV cuniculi (conejo).
Tabla 3 Diferencias entre cepas MVA altamente atenuadas y convencionalmente atenuadas (MVA = virus Ankara de Vaccinia Modificada) MVA original (572avo. paso en cultivos de fibroblasto embriónico de pollo primario) y VERO-MVA (182 pasos adicionales en cultivos de células VERO permanentes ( HO-ATCC, CCL 81)) .
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Tabla 4: Ejemplos de números de pasos en varios cultivos celulares seleccionados en atenuación convencional, comparado con alta atenuación de varias cepas de viruela animal
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Tabla 5: Régimen de administración para tratamiento con inductor de parainmunidad Modo de administración ¡Procedimiento de : administración Modo 1 2 inyecciones a intervalos
(profilaxis, término corto) de 24 ¡horas, 1-3 dias antes de la ' exposición Modo 2 2-3 inyecciones a
(Profilaxis, término largo) intervalos de 24 horas; "cursos" a intervalos mensuales Modo 3 2 inyecciones a intervalos
(profilaxis, tratamiento de 24 horas; una vez por adyuvante de tumores y mes ¡por meses o años, otros trastornos crónicos) posiblemente también más frecuentemente Modo 4 1-2 ihyecciones/dia por 3-4
(terapia parenteral de dias o hasta que los infecciones agudas) sintonías desaparecen; adicionalmente 1 inyección/dia hasta la recup ración Modo 5 AdminjLstrar liofilizado no
Profilaxis terapia disuelto profundo en la nasal/oral nariz; o bolsas de la mejilla -por trastornos al menos¡ dos veces por dia; -solamente para trastornos de la^ membrana raucosa- (apli^ación profiláctica como pe requiera) Modo 6 Disoljver inductor en un
(administración cutánea) poco tie ungüento (nota pH) ; la me,zcla de ungüento debe ser ¡siempre recientemente preparada -solamente para trastornos crónicos de la piel Tabla 6: Indicaciones para parainmunización con el mixomavirus altamente atenuado h-M 2 (b-PIND-MYXO) (cases de ejemplos de la familia)
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Claims (1)
- NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la prejsente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONÉS 1. Un virus de viru la animal altamente atenuado, basado en la cepa de virus de viruela animal de la familia poxviridae, caracterizado porque el virus de viruela animal no tiene ampliamente alguna propiedad inmunizante y virulenta, y el virus de viruela animal altamente atenuado, tiene un peso hiolecular inferior del ácido nucleico viral, supresiones 'más frecuentes en la región terminal y pérdida incrementada de receptores de citocina por comparación con cepas de viruela animal convencionalmente atenuadas. 2. El virus de viruela animal altamente atenuado, como se reivindica de> conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue el virus de viruela animal exhibe una pérdida de receptores de citocina por interfernona a y ?. : 3. El virus de viruela animal altamente atenuado, como se reivindica de1 conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el genoma viral del virus de viruela animal es aproximadamente 20% más pequeño que el genoma viral del tipo nativo. . El virus de viruela animal altamente atenuado, como se reivindica de1 conformidad con la i reivindicación 1, caracterizado porque la cepa de virus de viruela es una cepa de virus de viruela de camello. 5. El virus de viruela animal altamente i atenuado, como se reivindica de' conformidad con la I reivindicación 4, caracterizado porq?e la cepa del virus de viruela de camello es la cepa h-M 27 con el número de depósito 05040602 (ECACC) . 6. El virus de viruejla animal altamente atenuado, como se reivindica de ¡ conformidad con la i reivindicación 1, caracterizado porque la cepa del virus de viruela es una cepa de virus mixoma. 7. El virus de viruejla animal altamente atenuado, como se reivindica de , conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la cepa del virus mixoma es la cepa h-M 2 con el numeró de depósito 05040601 (ECACC) . , 8. El virus de viruejla animal altamente atenuado, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cepa del virus de viruela altamente atenuada es la cepa de viruela aviar h-HPl. 9. El virus de viruela animal altamente I atenuado, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cepa del virus de viruela altamente atenuada es la cepa ectromelia h-Mül. 10. El virus de viruela animal altamente atenuado, como se reivindica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cepa del virus de viruela altamente atenuada se puede obtener por el siguiente método: (a) adaptación de la viruela animal a un sistema celular permisivo o cultivos celulares; (b) transferencia y continuación de los virus de viruela animal para atenuación por pasos de largo término en varios sistemas de células permisivos, los cuales hacen posible tituladores infecciosos óptimos; (c) transferencia y continuación del virus de viruela animal para atenuación en un sistema de células óptimo por aproximadamente 100-300 pasos; (d) transferencia y contiguación del virus de viruela animal en células VERO por al menos, 30 pasos. 11. Un inductor de parainmunidad basado en las cepas del virus de viruela animal de la familia poxviridae, caracterizado porque las cepas de virus de viruela son altamente atenuadas y no tienen ampliamente algunas propiedades virulentas e inmunizantes. 12. El inductor de parainmunidad como se reivindica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque se basa en una cepa de virus de viruela animal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10. 13. Un método para producir inductores de parainmunidad a partir de virus de viruela animal altamente i atenuados, caracterizado porque comprende: (a) adaptación de la viruela animal a un sistema celular permisivo o cultivos celulares; (b) transferencia y continuación del virus de viruela animal por atenuación por paáos de largo término en varios sistemas celulares permisivos, los cuales hacen posible tituladores infecciosos óptinjios; (c) transferencia y continuación del virus de viruela animal por atenuación en un sistema de células óptimo por aproximadamente 100-300 pasos; (d) transferencia y continuación del virus de viruela animal en células VERO por al menos, 90 pasos. 14. Un método para producir inductores de parainmunidad a partir de virus de mixoma altamente atenuado, caracterizado porque comprende: (a) aislamiento de virus de viruela animal a partir de animales enfermos via la membrana corioalantoica de embriones de pollo de 10 díias de edad (CAM) y continuación en este sistema celular] por al menos, 2 pasos; I (b) transferencia y continuación del virus de viruela animal aislado por al menos, 300 pasos en cultivos de células AVIVER y VERO a partir 'de embriones de pollo incubados por 10 dias (FHE) ; (c) transferencia y continuación del virus de viruela animal en células MA por al -fíenos, 100 pasos; (d) transferencia y continuación del virus de viruela animal en células VERO por aí menos 170 pasos. 15. El método como se reivindica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el virus de i mixoma altamente atenuado generado1, tiene un titulador infecciosos de 106"75 CID50/ l. 16. El método como se rei'vindica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque loa virus de mixoma son la cepa de virus de mixoma h-M2 con el número de depósito 050540601 (ECACC) . 17. Un método para producir inductor de parainmunidad a partir de virus dje viruela de camello altamente atenuados, caracterizado pqrque comprende (a) aislamiento de virus ' de viruela animal a partir de animales enfermos, culti?ando via la membrana corioalantoica (CAM) , embriones de ipollos de 10 dias de edad y continuación del virus de viruela de camello aislado por aproximadamente 2 pasos en el CAM; (b) transferencia y continuación del virus de viruela animal por aproximadamente 1120 pasos en pasos de células VERO (ATCC CCL-81, WHO, .American Type Culture Collection) ; (c) transferencia y continuación del virus de viruela animal por aproximadamente 24 pasos en células AVIVER; (d) transferencia y continuación del virus de viruela animal por aproximadamente 157 pasos adicionales en células VERO. (e) transferencia y continuación del virus de viruela animal por 114 pasos adicionales en células MA; (f) transferencia y continuación del virus de viruela animal por 179 pasos adicionales en células VERO. 18. El método como se reivindica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque los virus de viruela de camello altamente atenuados, tienen un titulador infeccioso de aproximadamente 107 CID50/ml. 19. El método como se reivindica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque los virus de viruela de camello son la cepa de viruela de camello h-M 27 con el número de depósito 05040602 (frCACC) . 20. Una vacuna de vector, caracterizada porque comprende el ácido nucleico suprimido de un virus de viruela animal no inmunizante, no virulento, altamente atenuado, como se reivindica eh cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y secuenciajs de ácido nucleico, insertadas en supresiones del mismo para expresión, de un péptido o proteina inmunizante. 21. La vacuna de vector como se reivindica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el ácido nucleico suprimido de virus de viruela animal no inmunizante, no virulento, altarrjente atenuado y las secuencias de ácido nucleico del ¡ péptido inmunizante o proteina, están presentes en un plásmido. 22. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende uno o más inductores de parainmunidad, como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12. 23. La composición farm céutica, caracterizada porque es como se reivindica en la; reivindicación 22 para administración local o parenteral. 24. La composición farmacéutica como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 22 a 23, caracterizada porque además comprende un portador farmacéuticamente aceptable. 25. El uso de un inductor de parainmunidad como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12 para activación del sistema inmune paraespecifico en un mamífero o en un humano. 26. El uso de un inductor, de parainmunidad como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12 para producir una composición farmacéutica para la profilaxis y/o tratamiento de un trastorno asociado con la inmunodeficiencia . 27. El uso como se reivindica de conformidad con I la reivindicación 26, en donde el traistorno asociado con la inmunodeficiencia, se selecciona del! grupo que consiste de disfunciones del sistema inmune, inmunosupresión, trastornos de inmunodeficiencia, : disfunciones de la hemodinámica entre los sistemas hormonales, circulatorio, metabólico y nervioso, tratamiento tie infección neonatal, enfermedades neoplásicas, enfermedades virales, enfermedades bacterianas, enfermedades del factor infeccioso resistente a al terapia, infecciones bacterianas y virales combinadas, manifestacionéis crónicas de procesos infecciosos, enfermedades hepáticas1 de origen variante, enfermedades crónicas de la piel, enfermedades herpéticas, hepatitis crónica, infecciones de influenza, daño por endotoxina . 28. El uso como se reivindica de conformidad con la reivindicación 26, en donde! los inductores de parainmunidad altamente atenuados, , son empleados en la composición farmacéutica para asisti|r en la cicatrización de heridas, prevenir las infecciones! secundarias después de procedimientos quirúrgicos o lesionen. 29. El uso de una vacuha de vector como se reivindica en cualquiera de las reivjindicaciones 20-21 para inducir una respuesta inmune especifica y paraespecifica en un mamífero o en un humano. 30. Un método para producir virus de viruela animal altamente atenuados, caracterizado porque comprende las etapas: (a) adaptación de la iruela animal en un sistema de célula permisiva o cultivps celulares; I (b) transferencia y continuación de los virus de viruela animal por atenuación por pa os de largo término en varios sistemas de células permisivas, los cuales hacen posible tituladores infecciosos óptimos; I (c) transferencia y continuación del virus de viruela animal para atenuación en ;un sistema de células óptimas por aproximadamente 100-300 pasos; (d) transferencia y continuación del virus de viruela animal en células VERO por al menos, 90 pasos.
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