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MX2007015370A - Transfeccion estable libre de suero y produccion de proteinas humanas recombinantes en lineas de celulas humanas. - Google Patents

Transfeccion estable libre de suero y produccion de proteinas humanas recombinantes en lineas de celulas humanas.

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Publication number
MX2007015370A
MX2007015370A MX2007015370A MX2007015370A MX2007015370A MX 2007015370 A MX2007015370 A MX 2007015370A MX 2007015370 A MX2007015370 A MX 2007015370A MX 2007015370 A MX2007015370 A MX 2007015370A MX 2007015370 A MX2007015370 A MX 2007015370A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
human
cells
sequence
protein
vector
Prior art date
Application number
MX2007015370A
Other languages
English (en)
Inventor
Carola Schroder
Cathleen Wegmann
Haiyan Ding
Original Assignee
Octapharma Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=35427852&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MX2007015370(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Octapharma Ag filed Critical Octapharma Ag
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Abstract

La presente invencion se relaciona con un metodo mejorado para la produccion libre de suero de una linea de celulas humanas inmortalizadas transfectadas de manera estable bajo condiciones libre de suero con un vector especifico que presenta el gen que codifica para la proteina de interes. Ademas, la invencion se relaciona con la produccion de una linea de celulas que se obtiene por dicho metodo, un metodo de produccion para dicha proteina de interes utilizando la linea de celulas de produccion y el vector especifico que presente el gen de interes mismo.

Description

TRANSFECCION ESTABLE LIBRE DE SUERO Y PRODUCCIÓN DE PROTI HOMAHAS RECOMBINANTES EN LXE3EAS DE C LULAS HUM S CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método mejorado para la producción libre de suero de una línea de células humanas inmortalizadas transfectadas establemente bajo condiciones libre de suero con un vector específico que presenta el gen que codifica para la proteína de interés. Además la invención se relaciona con una línea celular de producción qt?e se obtiene por dicho método, un método de producción para dicha proteína de interés utilizando la línea de células de producción y el vector específico que presenta el gen de interés mismo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La producción recombinante de proteínas humanas generalmente se realiza por cultivo de líneas de células eucarióticas y preferiblemente de mamífero transfectadas de manera estable y aislamiento de la proteína del caldo de cultivo. En el caso de proteínas recombinantes se diseñan para aplicaciones farmacéuticas, durante mucho tiempo ha sido una práctica general utilizar líneas de células no humanas con el fin de excluir el riesgo de purificar conjuntamente agentes infecciosos los cuales pueden estar albergados y REFo §188178 expresarse en células humanas . En la producción de algunas proteínas humanas, tales como el factor VIII de la coagulación sanguínea humana, se encuentra que las líneas de células no humanas implican ciertas desventajas, por ejemplo niveles de secreción no satisfactorios de la proteína expresada al medio. Se considera que esto se debe a ligeras diferencias dentro de los diferentes tipos de célula de mamífero respecto a las vías intracelulares de traducción y modificación de las proteínas, lo cual también puede tener un efecto sobre la actividad biológica del polipéptido expresado. Además de esto, existen preocupaciones de que las proteínas terapéuticas purificadas a partir de sistemas de expresión diferentes al humano se contaminan con componentes celulares los cuales puedan generar reacciones antigénicas en los pacientes. También existe la preocupación del patrón de glucosilación no humano que se encuentran en proteínas humanas producidas de manera recombinante en sistemas de expresión diferentes al humano. Se considera que esto incrementa la probabilidad de reacciones antigénicas en el paciente. Además, la estabilidad biológica y la eficacia de las proteínas de la sangre tales como los factores de coagulación son afectados sustancialmente por su patrón de N-glucosilación. Son importantes especialmente los monosacáridos periféricos y terminales, debido a que son detectados por receptores específicos de las células los cuales son los responsables de su degradación. Los factores de coagulación por ejemplo, presentan residuos de ácido siálico como monosacáridos terminales. La modificación de la composición de ácidos siálicos en la antenas de las glucoproteínas puede resultar en patrones heterogéneos de glucosilación. Por lo tanto, la estabilidad y eficacia biológica están involucradas crucialmente cuando se producen modificaciones. Por lo tanto, es una consideración importante la producción de factores de coagulación recombinantes evaluar la influencia de la glucosilación a partir de líneas de células de producción diferentes a las humanas en comparación con las líneas de células humanas. Por otra parte, se han vuelto disponibles (por ejemplo la Patente de E.U.A. No. 5,712,119). Métodos generales para un alto nivel de expresión de proteínas de un gen deseado que comprende líneas de células de mamífero inmortalizadas y transfectadas de manera estable que expresan proteínas de activador de transcripción viral. Estas líneas de células se pueden transformar con una construcción (plásmido recombinante) de vector en donde el promotor de transcripción viral adecuado está asociado operativamente con una secuencia de ADN que define un gen de interés, las proteínas activadoras de transcripción proporcionadas por las líneas de células activan el promotor de transcripción viral y por lo tanto inicia la expresión del gen de interés. La línea de células es tan importante como el vector utilizado para la introducción del gen recombinante en una línea de células de producción inmovilizadas. Se utilizan una amplia variedad de vectores para traducción de proteínas de mamífero (por ejemplo, Witsch-Baumgartner, M et al. Am. J. Genet (2000). 66, 402-412 clonó el ADNc para DHCR7 en el vector de expresión de mamífero pCI-neo y lo expresó en células HEK 293; McGarvey, T. W. et . al. Oncogene (2001) 20, 1041-1051 clonó el gen para TEREl en el vector de expresión de mamífero pTARGET y lo expresó en carcinoma de células transcripcionales de vejiga humana; y Lin Lin et . al. J Biol. Chem (2002) 277(44) 41872-8 clonó el gen AchR en el vector de expresión de células de mamífero pEF6/myc-His y lo expresó en células 293). Un vector muy potente desarrollado recientemente, el cual ha demostrado ser capaz de sobreexpresión de proteínas recombinantes es el denominado vector pcONAm3 . 1 de Invitrogen. Li . J. et al., Life Sci. 2004 16 de abril; 74 (22) : 2693-705 han sobreexpresado con éxito histona desacetilasas utilizando pcDNA 3:1 en células HEK 293. Las células se transfectan de manera estable y se cultivan en presencia de suero. Yuan-Gen Fu. et al . , World J Gastroenterol 2003 han producido Caspasa-3 recombinante utilizando pcDNA 3.1(+) en base en un vector eucariótico sobre la línea de célula de cáncer gástrico SGC7901 transfectadas transitoriamente con dicho vector y se han cultivado en presencia de suero. Ma H. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 diciembre; 41 (13 ): 4232-9 examinaron la carencia de proteína estable y la pérdida de actividad enzimática que expresa Lp82 y proteínas relacionadas con Lp82 subclonadas en el vector pcDNA3.1 utilizando COS-7 como la línea de células. Las células se transfectan transitoriamente y se cultivan en presencia de suero en el medio. La sobreexpresión de tiorredoxina evita la reducción inducida por NO de la actividad de NO sintasa en células endoteliales de pulmón. Zhang J. et al . , Am J Physiol. 1998 agosto; 275(2 Pt 1) : L288-93 describe la sobreexpresión del gen para tiorredoxina en células endoteliales de la arteria pulmonar porcina cultivadas mediante transfección transitoria de estas células con el vector pCDNA 3.1. Las células transfectadas se cultivan en medio suplementado con suero. Shin i T. et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 1997 25 de noviembre; 94 (24) : 12920-5 compararon un .ADNc de longitud completa del citocromo P450 mitocondrial de riñon de rata con función oxidasa mixta, 25-hidroxivitamina D3-l -hidroxilasa con ADNc de riñon de rata deficiente en vitamina D y lo subclonaron en el vector de expresión de mamífero pcDNA 3.1 (+) y transfectaron de manera transitoria el vector en células de riñon de mono transformadas COS-7. Las células transfectadas se cultivaron en medio suplementado con suero. Zhang et al., Acta Biochimica et Biophysica Sínica 2004, 36(10): 707-712 describen la tranfección de células 293 renales embriónicas humanas con pcDNA que contiene un gen que codifica para la proteína de fusión humanizada anticuerpo Fv cadena sencilla 520C9/interleucina-2 humana. El sobrenadante se toma después de haber cultivado las células durante tres días en medio SFM II libre de suero. La proteína de fusión resultante posee especificidad de unión contra pl85 (un objetivo promisorio para tratamiento con anticuerpos y cáncer de mama) y retiene las actividades inmunoestimuladoras importante de IL-2. Chen, J.Z. et al., Int J Biochem Cell Biol. 2004 agosto; 36 (8) : 1554-61 sobreexpresan proteínas Bim, las cuales son factores esenciales para apoptosis, utilizando células HEK 293 transfectadas con pcDNA-Bim 3 alta. Una medida adicional para incrementar la seguridad de proteínas recombinantes para aplicaciones farmacéuticas es el uso de medio libre de suero en el procedimiento de cultivo, dado que el uso de suero representa un peligro para la seguridad así como una fuente de contaminaciones no deseadas. El cultivo libre de suero tiene el inconveniente de que los rendimientos del procedimiento de producción generalmente se reducen de manera significativa. Una preocupación de seguridad adicional es el uso de suero cuando se transfectan las células hospedadoras como una manera regulada en la práctica, dado que el uso de suero en el procedimiento de transacción puede generar que se integre en las células material biológico no deseado el cual posteriormente contamina el producto expresado por las células en el procedimiento de producción. Aunque algunos de los métodos disponibles para la producción de proteínas recombinantes (que incluyen a las mencionadas antes) permiten el cultivo libre de suero, no se conoce la transacción estable libre de suero de células humanas. En el 19h ESACT Meeting, Arrógate, 5h-8th junio 2005, se sugiere la transfección libre de suero de células CHO por Kuchenbecker et al . Por lo tanto, resulta deseable desarrollar un método eficaz y seguro para producir proteínas recombinantes humanas .
SUMARIO DE LA INVENCIÓN De manera sorprendente, se ha encontrado que se puede obtener con buen rendimiento una proteína humana no contaminada (es decir, una preparación de proteína libre de productos secundarios de proteína no deseados) a partir de líneas de células humanas inmortalizadas transfectadas de manera estable, bajo condiciones libres de suero, en donde el gen codifica para la proteína de interés. Con mayor detalle la presente invención proporciona: (1) un método para preparar una línea de células humanas inmortalizadas transfectadas de manera estable con una secuencia de ácido nucleico que comprende un gen que codifica para una proteína objetivo humana o un derivado o mutante del mismo, un promotor y una señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina (poliA) , el promotor y la señal poliA se enlazan al extremo 5' y 3' del gen que codifica para la proteína objetivo humana, respectivamente, método el cual comprende transfectar una línea de células hospedadoras humanas inmortalizadas bajo condiciones libre de suero con un vector de transfección que comprende dicha secuencia de ácido nucleico y un origen de replicación; (2) el método del inciso (1) anterior, en donde el vector de transfección se deriva del vector pcDNA 3.1 que tiene la secuencia de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4 ó 5; (3) el método de los incisos (1) o (2) anteriores, en donde la línea de células humanas es una célula renal embriónica humana que se selecciona de células 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305), células FreeStyle 293 (a continuación células n293F"; Invitrogen R79007) y células 293T (ATCC CRL 11268; DSM ACC 2494) ; (4) el método de los incisos (1) a (3) anteriores, en donde la proteína humana es el factor IX de coagulación sanguínea (por ejemplo como •' se codifica por los pares de bases 939 a 2324 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1), -1-antitripsina (a continuación "AlAT"; por ejemplo como se codifica por los pares de bases 913 a 2259 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2), factor VIII de coagulación sanguínea (que incluye factor VIII wt, como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 8 o mutante del factor VIII con el dominio B suprimido, como se codifica por los pares de bases 783 a 5162 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3), factor VlI/VIIa (que incluye la forma A y B del mismo, codificado por las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13 y 14), G-CSF (que incluye a G-CSF formas a, b y c que se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 15, 16 y 17, respectivamente) o factor de von Willebrand (vWF) ; (5) un vector de transfección que comprende un origen de replicación y un gen que codifica para una proteína humana como se define en los incisos (1) y (2) anteriores, preferiblemente dicho vector de transfección es un vector pcDNA3.1 que comprende el gen para una proteína humana como se define en el inciso (4) anterior; (6) una línea de células humanas inmortalizadas que se puede obtener por el método como se define en los incisos (1) a (5) anteriores, preferiblemente, dicha línea de células humanas es como se define en los incisos (3) o (4) anteriores; y (7) un método para la producción recombinante de una proteína objetivo humana o un derivado o mutante del mismo el cual comprende cultivar una línea de células humanas inmortalizadas como se define en el inciso (6) anterior, preferiblemente bajo condiciones libres de suero.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Proteína del factor IX (FIX) de coagulación humano natural. Una figura esquemática del gen FIX con su región 5' no traducida (5' UTR) y su región 3' UTR. Los ocho dominios en la proteína de 461 aminoácidos no procedas indican: S: péptido señal; P: propéptido; dominio Gla: dominio ?-carboxiglutamilo; dominio H: secuencia hidrofógica; dominio EGF: dominio similar al factor de crecimiento epidérmico; L: secuencia enlazante; AP: péptido de activación; dominio catalítico. La proteína madura FIX tiene una longitud de 415 aminoácidos y un peso molecular aproximado de 55 kDa. Figura 2 : El vector pcDNA3.1-FIX. El vector de ADN circular comprende 6,960 pares de bases, la secuencia exacta de las mismas se proporciona en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 1. En la figura esquemática, se indican el promotor CMV (CMV) , el gen FIX humano (hFIX) , el origen fl (fl) , el gen de higromicina (Hyg) bajo el control del promotor SV40 (SV40) , la región poli A (SV40 poli A), el origen pUC y el gen de resistencia a ampicilina (Amp) así como numerosos sitios de restricción. Este vector se deriva del vector de pcDNA 3.1 resecuenciado, pcDNA3.lHygro (+) -zz de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5. Figura 3 : El vector pcDNA3.1-A1AT. El vector de ADN circular comprende 6,914 pares de bases, la secuencia exacta de las mismas está proporcionado en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2. En la figura esquemática, se indican el promotor mejorador CMV, ADNc para AlAT, la señal de poliadenilación (poliA) de la hormona del crecimiento bovina que incluye una secuencia de terminación de transcripción para estabilidad aumentada de ARNm, el origen fl (fl) , el gen de higromicina (Hyg) bajo el control del promotor SV40 (SV40), la región poli A SV40 (SV40 poli A), el origen pUC y el gen de resistencia a ampicilina (Amp) , así como numerosos sitios de restricción. Este vector se deriva del vector pcDNA3. lHygro (+) -zz de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5. Figura 4 : Transfección transitoria de células renales embriónicas humanas diferentes con vectores que codifican para a-1-antitripsina. Se muestra una comparación de líneas celulares en estudios de transfección transitoria. Se muestra la cantidad (%) de -1-antitripsina (AlAT) expresada por 106 células para células 293, 293T y 293F. La cantidad de AlAT expresada en células 293F transfectadas transitoriamente con pcDNA3.1-AlAT se establece como 100%. Figura 5 : Transfección transitoria de la línea de células 293F con vectores diferentes que codifican para a-1-antitripsina. Se muestra una comparación de las concentraciones A1AT expresadas a partir de vectores diferentes utilizando la línea de células freestyle 293F transfectadas transitoriamente. El nivel de expresión de AlAT pcDNA3.1-A1AT se ha establecido como 100%. También se prueban diversos vectores adicionales que presentan el gen AlAT: un vector del laboratorio pTGl-AlAT (un vector del laboratorio para producir AlAT recombinante humana, como se muestra en la figura 10) , pCMV Script AlAT (Stratagene) y pcl neo-AlAT (Promega) se comparan contra pcDNA3.1-AlAT (pcDNA3.1). Ninguno de los otros vectores se acerca a los niveles de alta expresión que se observa con pcDNA3.1-AlAT. Figuras 6A y 6B: Pruebas SDS-PAGE y Western blot de sobrenadante de cultivo celular. Las alícuotas del sobrenadante de células freestyle 293F se transfectan transitoriamente con pcDNA3.1-AlAT (carriles 1-3 y 6-8) o con un plásmido control que expresa GFP (carriles 4 y 8) se analizan tanto por SDS-PAGE como por Western blot. El carril 1 contiene un marcador de tamaño, y un carril 5 está vacío. La banda para AlAt se marca con una flecha. También es visible la banda de 27 kDa que corresponde a GFP en los carriles 4 y 8. La figura 7 muestra el vector pcDNA 3.1-F. VIII. El vector comprende 9,975 pares de bases, la secuencia exacta de las mismas se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3. La proteína de factor VIII codificada por los pares de bases 783 a 5,162 es un mutante de factor VIII al que se le ha suprimido el dominio B, como se describe en el documento WO 01/70968. Nuevamente, este vector se deriva del vector pcDNA 3.1 Hygro(+)-zz de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5. Figura 8 : comparación de la cantidad promedio del factor VIII producido de los tres mejores clones transfectados de manera estable, que transfectan células 293 y 293F con pcDNA3.1-FVIII y el vector de laboratorio pTGF8-2hyg-s , la secuencia exacta del mismo se proporciona en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 7. Figura 9 , se muestra el vector pTGl-AlAT. El vector comprende 5,610 pares de bases, la secuencia exacta del mismo se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6. Figura 10, se muestra el vector pCR2. ld2-GCSFb. El vector comprende 4,542 pares de bases, la secuencia exacta del mismo se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 21. Figura 11, se muestra el vector pDNA3.1-GCSFb. El vector comprende 6,237 pares de bases, la secuencia exacta del mismo se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 22. Figura 12, se muestra el vector pCINneo-GCSFb. El vector comprende 6,101 pares de bases, la secuencia exacta del mismo se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 23. Figura 13, se muestra el vector pCMVScript-GCSFb. El vector comprende 4,920 pares de bases, la secuencia exacta del mismo se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 2 . Figura 14, se muestra el vector pTG2-GCSFb. El vector comprende 6,917 pares de bases, la secuencia exacta del mismo se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 25. Figura 15, se compara la cantidad de rhG-CSF producida por diferentes construcciones de expresión de acuerdo con el ejemplo 9. Figura 16 , se muestra una western blot de rhG-CSF producido de acuerdo con el ejemplo 9.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método mejorado para la transfección y producción de proteínas recombinantes humanas en líneas de células inmortalizadas humanas completamente bajo condiciones libre de suero y libre de proteína. Permite la transfección y producción de proteínas humanas libre de suero. El método puede incluir una o más etapas de purificación que incluyen procedimientos de inactivación viral, lo que reduce el riesgo de contaminación de la proteína recombinante con patógenos humanos . Dado que las proteínas recombinantes humanas producidas en líneas de células humanas presentan un patrón de glucosilación humano, también son menos susceptibles a degradación en comparación con proteínas humanas que carecen de su patrón de glucosilación natural. En resumen, el método de la invención proporciona diversas ventajas con respecto a la técnica anterior. En particular, el método de la modalidad (7) de la invención proporciona un sistema eficaz para producir factores de coagulación sanguínea recombinantes humanos inocuos y altamente activos, por ejemplo factores IX y FVIII para aplicación terapéutica para hemofilia B y A en humanos. El método es adecuado para la expresión de aquellas proteínas naturales, pero también se puede utilizar para mutantes de estas proteínas, por ejemplo factor VIII, las cuales son excepcionalmente estables contra inactivación proteolítica y por lo tanto permiten que se sometan a protocolos de inactivación de virus vigorosos . Un modo preferido del método de la modalidad (7) de la invención comprende cultivar de formalibre de suero una línea de células inmortalizada que tiene un vector que tiene un enlace promotor en el extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica para dicha proteína sanguínea humana. El extremo 3 ' de la secuencia de ADN que codifica para dicha proteína sanguínea humana está unido funcionalmente a una señal poliA de hormona del crecimiento bovina. De acuerdo con la invención, la línea de célula humana inmortalizada es transfectada de manera estable con el vector. Para detectar transfección estable, el vector debe comprender además, además del gen para la proteína sanguínea humana, por lo menos un gen para un sistema marcador de selección el cual esté unido funcionalmente a un promotor. Los promotores adecuados incluyen promotores virales, promotores de genes constitutivos, promotores específicos de tejido, etcétera. En caso de que el promotor sea un promotor viral, la línea de células no comprende la proteína activadora de transcripción viral coincidente para dicho promotor. No obstante, la célula puede comprende una proteína activadora de transcripción viral tal como el antígeno T el cual complementa a otro promotor viral que no está unido funcionalmente al gen que codifica para la proteína sanguínea humana. Preferiblemente, el promotor es un promotor SV40, un promotor CMV, un promotor EF-la, un promotor HSV TK, etcétera, de manera más preferible, el promotor es un promotor CMV, es decir, un promotor temprano intermedio principal constitutivo de citomegalovirus. Las expresiones "transfección" o "transfectado" se refieren a la introducción de un ácido nucleico en una célula bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína. En general el ácido nucleico es una secuencia de ADN, en particular un vector un plásmido que presenta un gen de interés bajo un promotor adecuado, cuya expresión es controlada por dicho promotor. No obstante, el término transfección también comprende una transfección por ARN. Una persona experta en la técnica está familiarizado con los diversos métodos de transfección tales como aquellos que utilizan moléculas portadoras como lípidos catiónicos tales como DOTAP (Roche) , DOSPER (Roche) , Fugene (Roche) , TransfectamME (Promega) , TransFast1® (Promega) y Tfx1^ (Promega) , Lipofectamine (Invitrogen) y 293fectinMR (Invitrogen) o fosfato de calcio y DEAE dextrano. También estará familiarizado con técnicas de transfección de fuerza bruta. Estas incluyen, electroporación, bombardeo con partículas portadoras recubiertas con ácido nucleico (pistola de genes) y microinyección. Finalmente, una persona experta en la técnica también está familiarizada con transfección de ácido nucleico utilizando vectores virales. Los términos "transfectados transitoriamente" o "transfección transitoria" se refieren a una expresión transitoria, es decir, no permanente del gen de interés debido a la naturaleza episómica del ácido nucleico introducido. Por su naturaleza propia, la transfección por AUN o los virus citolíticos únicamente se pueden utilizar por expresión transitoria. Los ácidos nucleicos episómicos, que incluyen ADN (plásmidos o vectores) se degradan por las células después de dos a cuatro días y por lo tanto la expresión del gen de interés cesa después. Los términos "transfectados de manera estable" o "transfección estable" se refieren a la expresión permanente de gen de interés debido a la integración de ADN transfectado en el genoma de la célula. La mayor parte, no todas las células tienen el potencial para incorporar ADN episómico en su genoma aunque a una velocidad muy lenta. No obstante, se utilizan estrategias de selección sofisticadas para expandir aquellas células que tienen integrado el ADN transfectado. Para eso, el vector debe contener por lo menos un gen para un marcador de selección tal como, por ejemplo higromicina. El término "transfección estable" o "transfectado de manera estable" en la presente también se utilizan para referirse a células que presentan plásmidos que se puedan replicar de manera autónoma y por lo tanto se pueden utilizar para expresión a largo plazo de genes extraños . Un sistema de transferencia de genes particularmente aplicable para células " ue se transfectan de manera estable" se basa en retrovirus recombinante. Dado que la integración del ADN proviral es una etapa obligatoria durante el ciclo de replicación retroviral, la infección de células con retrovirus recombinante generará una proporción muy alta de células que tengan integrado el gen de interés y por lo tanto que estén transfectadas de manera estable. El término "cultivar" se refiere al mantenimiento de células/líneas de célula in vitro en recipientes con medio que soporte su proliferación y la expresión del gen. De esta manera, el cultivo provoca acumulación de las proteínas secretables expresadas en el medio de cultivo. El medio normalmente contiene suplementos que estabilizan el pH así como aminoácidos, lípidos, elementos en trazas, vitaminas y otros componentes que incrementan al crecimiento. Los términos "libre de suero", "transfección libre de suero" o "cultivo libre de suero" se refiere a la transfección y cultivo de células en un medio que contiene suplementos adecuados excepto cualquier clase de suero. Los suplementos se seleccionan de aminoácidos, lípidos, elementos en trazas, vitaminas y otros componentes que mejoran el crecimiento. Con frecuencia, las condiciones de cultivo "libre de suero" son incluso más rigurosas y, si no se agregan proteínas hexógenas o si ya se han incluido e " el medio, el medio se denomina "libre de proteínas". El término "línea de células humanas inmortalizadas" se refiere a células humanas que no son células primarias tomadas directamente de un organismo. En particular, se refiere a un cultivo de células establecido de manera permanente que proliferará indefinidamente dado el medio fresco apropiado y el espacio y por lo tanto habrá escapado al límite Hayflick. El término "concentración" se refiere a la concentración de la proteína recombinante producida del medio de cultivo. Indirectamente, también resulta en una concentración de la proteína. Una persona experta en la técnica está familiarizada con las técnicas de concentración tales como filtración, que incluyen ultrafiltración, centrifugación, precipitación, etcétera. La concentración no necesariamente resulta en una proteína pura, y la proteína aislada aún puede contener contaminantes no proteínicos y proteínicos. Las etapas de purificación adicionales se requieren con frecuencia. El término "purificación" se refiere a las etapas aplicadas a la proteína aislada con el fin de obtener proteína humana recombinante sustancialmente pura (por lo menos 60% pura, de manera preferible por lo menos 75% pura, de manera más preferible más de 90% pura y de manera mucho más preferible más de 99.9% pura). La pureza se puede medir por un método apropiado. La persona experta en la técnica está familiarizado con técnicas utilizables para la purificación de una proteína recombinante tal como cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de afinidad, precipitación de proteína, intercambio de amortiguador, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía con exclusión de tamaño y electroforesis. Además, la purificación puede comprender una etapa de inactivación de virus tal como tratamiento con calor y/o tratamiento con detergente solvente (SD) ya sea en estado seco o líquido en presencia o sin sustancias químicas que incluyen inhibidores de proteasa. Además, la purificación puede incluir una o más etapas de eliminación de priones tal como precipitación de proteínas, filtración, etapas de cromatografía, en particular etapas de cromatografía de afinidad (véase, por ejemplo "Partitioning of TSE infectivity during etanol fractionation of human plasma", Gregori, L. et al., Biologicals 32 1-10; 2 (2004); y "Removal of TSE agents from blood products", Foster, P.R., Vax Sanguinis 87 (Suppl. 2), S7-S10 (2004)). Después de inactivación de virus una etapa de purificación adicional seleccionada de cualquiera de las mencionadas antes puede ser necesaria para eliminación de las sustancias químicas utilizadas para inactivación de virus. El término "vector" se refiere a cualquier construcción genética tal como plásmido, fago, cósmido, etcétera, el cual sea capaz de aplicación cuando se asocia con los elementos de control apropiados, fragmentos de ADN los cuales se pueden insertar o clonar. Un vector comprende sitios de restricción únicos y puede ser aceptable para replicación autónoma en una célula hospedadora. El término incluye vehículos de clonación y expresión. El "vector" puede presentar adicionalmente uno o más elementos reguladores, dichos elementos reguladores preferiblemente se seleccionan de sitios de empalme, sitios de recombinación, sitios poli A, mejoradores, sitio de multiclonación y secuencias plasmídicas procarióticas. El término "unido funcionalmente" se refiere a la configuración del vector en donde el promotor se localiza dentro del vector de manera tal que puede estimular la transcripción de la secuencia de ADN que codifica para la proteína de interés, en particular para la proteína de sangre humana . El término "maduro" se refiere a la estructura molecular de una proteína dada de la proteína procesada, es decir, una proteína la cual carece de la señal de exportación en la parte N terminal. El término "promotor" se refiere a una región de una secuencia de AD? reguladora unida por ARN polimerasa y factores de transcripción durante el inicio de la transcripción . El término "mejorador" se refiere a una secuencia que actúa cis que incrementa la utilización de un promotor eucariótico y que puede funcionar en cualquier orientación y en cualquier ubicación (hacia el extremo 5' o hacia el extremo 3') en relación al promotor. El término "señal de poliadenilación (poliA) " se refiere a una secuencia de terminación especializada. Señala la adición de una "cola" de adeninas al extremo del ARNm que permite la exportación del AR?m al citoplasma. Al llegar al citoplasma, la cola poli A del AR?m se mantiene durante la traducción de la proteína y estabiliza al ARNm durante la expresión de la proteína. El término "codifica" o "codificantes" se refiere a una propiedad de la secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir (en el caso de AD?) o traducir (en el caso de AR?m) en un polipéptido (proteína) in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de una secuencia reguladora apropiada. Para el propósito de la presente solicitud, el término "expresa", "que expresa" o "expresión" se refiere a la transcripción y traducción de un gen que codifica para una proteína. Las "proteínas humanas" de la invención incluyen, pero no se limitan a proteínas humanas, polipéptidos, mutaciones y modificaciones de las mismas. En particular, las proteínas humanas incluyen proteínas plasmáticas recombinantes, por ejemplo factores de coagulación sanguínea (tales como factor VIII, factor VII/Vlla, factor V, factor IX, factor XI, factor de von Willebrand, etcétera) , factores de crecimiento (tal como eritropoyetina, etcétera) , factores estimuladores de colonias (CSF) (tal como factor estimulador de granulocito (G-CSF) , CSF de macrófagos (M-CSF) , CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , citocinas (tales como interleucinas que incluye a interleucina 3, etcétera), inhibidores de proteasa (tal como a-l-antitripsina (AlAt) , quimiotripsina, etcétera) , proteínas de transporte (tales como hormonas, etcétera), proteínas de acción inhibidora o reguladora y similares. Además se incluyen mutaciones y modificaciones de esas proteínas o polipéptidos, especialmente mutaciones o modificaciones que proporcionan una mejor estabilidad de la proteína recombinante, una vida media a prolongada o una mejor recuperación y que incluyen mutantes por supresión, sustitución o inserción y mutaciones químicas de grupos funcionales, respectivamente. Las proteínas particularmente preferidas las cuales se pueden producir por el método de la invención de la solicitud son factor VIII humano (que incluye el dominio B suprimido o natural), factor IX humano, G-CSF humano, AlAT humana, factor VlI/VIIa humano y factor de von Willebrand. La producción recombinante del factor VIII y IX se conocen en la técnica (EP-A-160457 ; WO-A-86/01961 , patentes de E.U.A. 4,770,999, 5 , 521 , 070 y 5, 521 , 070) . En el caso del factor VIII, la expresión recombinante de las subunidades para la producción de complejos que muestran actividad coagulante se conoce en la técnica (por ejemplo a partir de los documentos EP-A-150735, EP-A-232112, EP-A-0500734 , WO-91/07490, WO-95/13300 Patentes de E.U.A. 5,045,455 y 5,789,203). Además, la expresión de versiones de ADNc truncadas que carece parcial o completamente de la secuencia que codifica para el dominio B altamente glucosilado se han descrito (por ejemplo en WO-86/06101, WO-87/04187, WO-87/07144, WO-88/00381, EP-A-251843, EP-A-253455, EP-A-254076, patente de E.U.A. 4,868,112 y 4,980,456, EP-A-294910, EP-A-265778, EP-A-303540 y WO-91/09122) . Un mutante del factor VIII particular en el cual el dominio B entre las posiciones Arg740 y glul649 ha sido sustituido por un péptido enlazante rico en Arg que tiene por lo menos 3 residuos Arg y que comprende 10 a 25 residuos aminoácidos (en donde dicha numeración del factor Vlll es en relación a la secuencia del factor VIII natural maduro que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 9) se describe en WO 01/70968 la cual se incorpora en la presente en su totalidad. En particular, el péptido enlazante rico en Arg tiene 14 a 20 residuos aminoácidos, mientras que el enlazante comprende: son las que se prefieren particularmente. Dicha muteína de factor Vlll del dominio B es codificada por los nucleótidos 183 a 5,162 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 3. G-CSF es una molécula pequeña, específica de línea en sangre humana que estimula la producción de un tipo de leucocito desde la médula ósea, conocidos como neutrófilos. Los neutrófilos juegan un papel central en el sistema inmunológico del cuerpo y defienden contra las infecciones . Se produce de manera natural G-CSF (secuencias de ADNc particulares de las formas a, b y c de las mismas se proporcionan en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 15, 16 y 17, respectivamente; la proteína de la forma b de G-CSF (a continuación proteína "G-CSFb") se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 27) por los monocitos, fibroblastos y células endoteliales. Normalmente, la concentración en sangre es de aproximadamente 40 pg/ml en personas sanas. En el plasma de pacientes, la concentración de G-CSF puede descender más de 10 veces. G-CSF también se produce en líneas de células cancerosas como las células 5637 las cuales secretan aproximadamente 70 ng/ml. Para tratamiento, G-CSF humana recombinante se produce en E. coli como una forma no glucosilada metilada en la parte N terminal por Amgen Inc. (FiIgrastim/Neupogen1®) , la cual está también disponible como un producto pegilado (Pegfilgrastim/Neulasta10) . Otro medicamento se produce en células CHO por Chugai Pharmaceuticals Co. lo que resulta en un producto glucosilado (Lenograstim/Granocyte^) . Se utiliza G-CSF como un medicamento para tratar neutropenia ya sea heredada o causada por quimioterapia (cáncer) , SIDA o transplante de médula ósea. Para esto, una dosis típica es de 5 µg/kg al día. Una secuencia de ADNc para AlAT particular adecuada con la invención de la presente solicitud se proporciona en los pares de bases 973 a 2,259 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2. Las secuencias de ADNc particulares para el factor VII/Vlla se proporcionan en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13 y 14 que corresponden a las formas a y b de las mismas. Un ADNc particular para vWF se proporciona en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 18. El sistema marcador de selección incluye resistencia a higromicina, resistencia a puromicina, resistencia a neomicina, resistencia a adenosina desaminasa (ADA) , resistencia a aminoglucósido fosfotransferasa (neo, G418, APH), resistencia a bleomicina (fleo, bleo, zeocina), resistencia a citosina desaminasa (CDA, CD) , resistencia a citocina desaminasa (CDA, CD) , resistencia a dihidrofolato reductasa (DHFR) , resistencia a histidinol deshidrogenasa (hisD) , resistencia a higromicina-B-fosfotransferasa (HPH) , resistencia a puromicina-N-acetiltransferasa (PAC, puro) , resistencia a timidina cinasa (TK) y resistencia a xantina-guanina fosforribosiltransferasa (XGPRT, gpt) . Se prefiere particularmente el gen de resistencia a higromicina. Además, el gen para el marcador de selección se puede unir funcionalmente con una señal poli A tal como aquella derivada de la hormona del crecimiento bovino (BGH) y la señal de poliadenilación SV40. Las células transfectadas son expuestas constantemente en su medio de cultivo a la proteína del sistema marcador de selección tal como higromicina durante la fase de selección, lo que resulta en una supervivencia de sólo aquellas células que presentan el vector. Una persona experta en la técnica está familiarizada con marcadores de selección alternativos adecuados para el establecimiento de células transfectadas de manera estable, así como las concentraciones de los agentes selectivos seleccionados los cuales necesitan aplicarse. Un vector particularmente preferido de la invención presenta un promotor CMV, un gen para higromicina, una secuencia poli A y el gen de interés, y preferiblemente es el vector pcDNA3.1 de Invitrogen que tiene la secuencia de SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4 en donde el resecuenciado del vector se ha encontrado que de hecho tiene la secuencia que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 5. Las líneas de células inmortalizadas adecuadas por el método de la invención se seleccionan del grupo de células renales, de vejiga, hepáticas, pulmonares, de músculo cardíaco, músculo liso, ovario o gastrointestinales. Dichas células pueden presentar en su genoma secuencias de ADN adenoviral, en particular los primeros 4,344 nucleótidos de las secuencias Ad5. Se prefieren las células renales fetales humanas (HEK) que se seleccionan del grupo que consiste de células 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305; ECACC ref.: 85120602), células 293T (DSM ACC 2494; ECACC: tsa201, ref. 96121229), y células Freestyle 293 (células 293F; Invitrogen R79007) . Las más preferidas son las células 293F. Dichas líneas de células inmortalizadas que presentan dicho vector se cultivan bajo condiciones que permiten la expresión del gen recombinante. Esencialmente aquellas que son condiciones de cultivo estándar conocidas por una persona experta en la técnica, no obstante, en el caso de células que presenten el gen para el factor IX humano, la vitamina K debe incluirse en el medio.
Una modalidad particular de la presente invención es la producción libre de suero de la proteína recombinante en cultivo libre de suero de células inmortalizadas de manera estable, las cuales son transfectadas bajo condiciones libres de suero. Para cualquiera de las líneas de células humanas inmortalizadas descritas en lo anterior, preferiblemente la línea de células 293F se transfectan y cultivan bajo condiciones libres de suero. Las células se transfectan de manera estable en cultivo de suspensión en ausencia de suero y después se adaptan a crecimiento celular adherente para selección de clones de células solas . Una vez que se obtienen los clones individuales, se expanden de manera adherente. Después de la selección de los clones que son mejores productores se transfectan las células a cultivo de suspensión. Durante la totalidad del procedimiento de las líneas de células estables y durante el incremento adicional para la producción, las células se hacen crecer en medio libre de suero y nunca están en contacto con suero o con proteínas humanas o animales . La proteína de sangre recombinante tal como aquella de los factores de coagulación sanguínea o como un inhibidor de proteasa tal como AlAT o factores de crecimiento (tales como G-CSF y GM-CSF) se aislan del caldo de cultivo y las etapas de purificación estándar que siguen. Con mayor detalle, una modalidad particular de la producción libre de suero de la proteína sanguínea humana recombinante, en particular el factor VIII humano o el factor IX o AlAT o G-CSFb comprende las siguientes etapas: (1) Transfección de células inmortalizadas humanas, preferiblemente, células 293F en cultivo de suspensión libre de suero. Las células se cultivan en matraces Erlenmeyer de policarbonato estériles y desechables. Las células se transfectan con una densidad, por ejemplo de 1 x 106 células viables por ml con un agente de transfección, preferiblemente un agente de transfección catiónico, de manera más preferible el reactivo lipofectamine 2000 CD (Invitrogen) o un reactivo para el método de transfección, con fosfato de calcio) ; un vector se transfecta codificando para la proteína de sangre humana, preferiblemente el vector es pcDNA3.1-FIX, pcDNA3.1-FVIII, pcDNA3.1-AlAT o pcDNA3.1-GCSFb; (2) de 24 a 120 horas, preferiblemente 36-96 horas, de manera más preferible 48 horas después de la transfección se transfieren un número adecuado de células (103 a 1010; preferiblemente 105 a 108, de manera más preferible 106 células) a una caja de cultivo plano para sedimentación con el fin de establecer crecimiento adherente. Preferiblemente, la caja de cultivo es una caja de 10 cm y las células se cultivan en un medio libre de suero y libre de proteínas, preferiblemente el medio de expresión FreeStyle 293 (12338-018, Invitrogen) o un medio casero libre de suero (Octapharma Stockholm) . (3) Se inicia la presión de selección a las 2 a 50 horas, preferiblemente a las 48 horas después de la transferencia en una caja de cultivo plana. El medio se suplementa con un agente selectivo adecuado que se selecciona del grupo que consiste de marcadores de selección, por ejemplo higromicina, neomicina, G418 y zeocina. El agente selectivo preferido es higromicina con una concentración de 10 a 300 µg/ml. Preferiblemente 50 a 200 µg/ml y de manera más preferible 50 µg/ml. Se mantiene la presión durante por lo menos 10 a 20 días, preferiblemente durante 14 días, por lo ue el medio suplementado con higromicina se intercambia cada tercer día. Únicamente las células transfectadas de manera estable sobreviven a estas condiciones de selección y forman clones de células adherentes los cuales pueden ser tomados individualmente. De manera adicional se puede utilizar un factor de unión con el fin de adherir las células a la caja y evitar que las células floten de un clon a otro clon celular. Estos factores de unión pueden ser, por ejemplo, poli-D-lisina, suplementos sintéticos de medio libre de proteínas humanas o animales u otras sustancias. De manera alternativa, se puede utilizar anillos de clonación para la toma de clones . (4) Los clones de células individuales se toman y transfieren en recipientes de cultivos separados para expansión de células libre de suero (incremento de escala) mientras se suprime la presión selectiva. Es adecuado cualquier recipiente de cultivo, pero preferiblemente los clones individuales se transfieren primero en placas de 96 pozos con una cantidad suficiente de medio y después a placas de 48 a 24, a 12 y a 6 pozos y después a tubos de centrífuga. En la etapa de tubo de centrífuga, se cultivan las células en medio libre de suero agitando suavemente con el fin de colocar a las células nuevamente en crecimiento en suspensión. Una vez que las células han alcanzado la placa de 6 pozos celulares o la etapa de tubo de centrífuga, es opcional seleccionar los mejores clones celulares de acuerdo con algún criterio de selección, por ejemplo la velocidad de crecimiento de las células, se prefieren las células que crecen más rápido y la cantidad de proteína recombinante que producen. No obstante, dicha selección también se puede llevar a cabo en una etapa posterior. (5) Las células que se obtienen a partir del cultivo de tubo de centrífuga se siembran en recipientes de cultivo Erlenmeyer con una cantidad suficiente de medio libre de suero. Los criterios de selección adicionales para el incremento de escala, en clones de células que crecen en suspensión libre de suero y libre de proteínas son los siguientes: viabilidad, morfología celular, carencia de agregación, robustez respecto a la centrifugación y carencia de residuos celulares.
El método de la presente invención funciona particularmente bien si el vector es pcDNA3.1-hygro (+) -zz . Se prefiere que el gen que codifica para la proteína humana, en particular FIX humano, FVIII, AlAT o G-CSFb se inserta de manera tal que está bajo el control del promotor CMV como se muestra en las figuras 2, 3, 7 y 11, respectivamente. Preferiblemente, las secuencias de tipo silvestre de los genes se insertan de manera que la proteína expresada de manera recombinante se encuentran sin mutación alguna y es estructuralmente idéntica a la proteína natural aislada de plasma sanguíneo. En la figura 1 se muestra un dibujo esquemático del factor IX humano natural, las secuencias de identificación números 1, 2, 3 y 22 proporcionan la secuencia de ácido nucleico para pcDNA3.1-FIX, pcDNA3.1-A1AT, pcDNA3.1-FVIII y pcDNA3.1-GCSFb, respectivamente. Las proteínas respectivas son codificadas por los nucleótidos 939 a 2224, 913 a 2259, 679 a 5055 y 970 a 1584, respectivamente. La presente invención por lo tanto proporciona un método para la producción recombinante de factor IX, AlAT, factor VIII y G-CSFb clonado en pcDNA3. lm lo que da lugar a pcDNA3.1-FIX, pcDNA3.1-AlAT, pcDNA3.1-FVIII y pcDNA3.1-GCSFb, respectivamente, los cuales se integran en el genoma de células humanas inmortalizadas, preferiblemente células renales embriónicas humanas tales como células 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305; ECACC ref.: 85120602), células Freestyle 293 (células 293F; Invitrogen T79007) o células 293T (DSM ACC 2494; ECACC: tsa201, ref. 96121229). Aquellas células que presenten pcDNA3.1-FIX, PCDNA3.1-AlAT, pcDNA3.1-FVIII y pcDNA3.1-GCSFb, respectivamente se cultivan en medio bajo condiciones estándar que permiten la expresión del gen o alternativamente se cultivan bajo condiciones libre de suero para minimizar el riesgo de contaminación con patógenos humanos. Se pueden incluir una o más etapas de eliminación de priones, tales como precipitación de proteína, filtración, etapas de cromatografía, en particular etapas de cromatografía de afinidad. De manera alternativa/adicional, se puede utilizar como célula de expresión una línea de células en donde se bloqueen priones. Esto se puede obtener mediante bloqueo genómico completo o tecnología antisentido. En el caso de producción de factor IX, las células preferiblemente se cultivan en presencia de vitamina K. La proteína sanguínea humana se aisla del sobrenadante de cultivo y se somete a etapas de purificación subsecuentes conocidas en la técnica para maximizar el rendimiento de un producto puro, estable y altamente activo y se seleccionan a partir de cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de exclusión de tamaño, etc., y combinaciones de los mismos. Se pueden adaptar fácilmente a los requerimientos específicos necesarios para aislar factor IX recombinante, G-CSFb o AlAT. La cantidad y actividad de la proteína purificada durante y después del procedimiento de purificación se pueden monitorear por ELISA y/o análisis de tiempo de coagulación de una etapa (APTT) . Para resolver los problemas de posibles contaminaciones infecciosas en las muestras de proteína purificadas o en el producto obtenido directamente del sobrenadante de cultivo celular que contiene la proteína de elección recombinante secretada, el sobrenadante de cultivo se debe de tratar con procedimientos para inactivación de virus que incluyen tratamiento con calor y/o tratamiento SD (en estado seco o líquido, con o sin la adición de sustancias químicas que incluyen inhibidores de proteasa) . Una persona experta en la técnica está familiarizada con los procedimientos de purificación. Por ejemplo, el aislamiento y purificación y recuperación de factor VIII inactivado por virus, de alta pureza a partir de plasma por cromatografía de intercambio aniónico ha sido descrito I (WO93/15105) . Además, varios procedimientos para la producción de factores de coagulación no infecciosos, de alta pureza a partir de plasma sanguíneo u otras fuentes biológicas han sido reportados. Los virus recubiertos con lípido se inactivan eficazmente al tratar el material potencialmente infeccioso con una base hidrofóbica que forma un sistema bifásico a partir del cual la parte insoluble se elimina subsecuentemente. Una ventaja adicional se ha demostrado que es el complemento del tratamiento de la fase hidrofóbica simultánea o secuencialmente con un tratamiento con detergentes biocompatibles no iónicos y fosfatos de dialquilo o trialquilo (WO 96/36369, EP 0131740, US 6,007,979). Los virus recubiertos no lipidíeos requieren protocolos de inactivación que consisten del tratamiento con detergentes no iónicos seguido por una etapa de calentamiento (60-65°C) durante varias horas (WO 94/17834) . Después de la inactivación del virus puede ser necesario una etapa de purificación adicional para eliminar las sustancias químicas . La presente invención proporciona un método de producción de proteínas eficaz que se basa en una línea de células humanas unidas a métodos aprobados de purificación de proteínas y para inactivación de agentes infecciosos potencialmente peligrosos. Un sistema seguro y fácil de utilizar para la producción de proteínas recombinantes, por ejemplo el factor IX de coagulación sanguínea, u Vlll AlAT y G-CSFb se ha establecido. Se puede examinar con pruebas estándar la actividad de las proteínas producidas de manera recombinante. En el caso del factor IX humano, por ejemplo, con un análisis de tiempo de tromboplastina parcial utilizando la activación de Dapptin TC (Kaolin/Sulfatid-Phospholipid Cat. No. 5035090, Technoclone GmbH) con un instrumento de coagulación manual. Finalmente, las proteínas recombinantes obtenidas, tal como la proteína sanguínea descrita en lo anterior, en particular el factor IX humano se puede utilizar en una composición farmacéutica. La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos. No obstante, dichos ejemplos no deben considerarse como limitantes de la invención.
Ejemplos Materiales y Métodos Líneas de células humanas para expresión de proteína: Las líneas de células preferidas son HEK293 (ECACC Ref. 85120602), FreeStyle 293 (293F; Invitrogen R79007) y 293T (tsA201, ECACC Ref. 96121229), la cual es una línea de células renales humanas embriónicas transformadas que expresan de manera estable un antígeno T sensible a temperatura de SV40. Estas líneas de células similares a las epiteliales se han utilizado en una diversidad de análisis de presión funcionales y se ha reportado que producen altas concentraciones de proteína recombinante. La línea de células 293F (Invitrogen) la cual se deriva de la línea de células 293 se utiliza preferiblemente en los ejemplos siguientes. La línea 293 de células de origen es una línea permanente establecida a partir de riñon humano embrionario primario transformado con ADN de adenovirus tipo 5 humano compartido (Graham er al., 1977; Harrison et al., 1977). La línea de células 293F es una variante de la línea de células 293 que se ha adaptado para crecimiento en suspensión en medio de expresión FreeStyle 293 (293F) (12338-018, Invitrogen) . La línea de células 293F se obtiene de Robert Horlick en Pharmacopeia. La línea de células 293F originalmente se prepara a partir de cultivos blancos de células maestras de pasaje bajo derivadas de células 293F de origen que se reclonan por dilución limitante. Las células se han hecho crecer constantemente en el medio de expresión FreeStyle 293 libre de suero o un medio libre de suero (Octapharma Stockholm) con buena viabilidad y buena morfología durante más de un año durante el desarrollo de la presente invención. Para la producción eficaz de factor IX, el medio se puede modificar por la adición de vitamina K. Estas líneas de células son capaces de ser cultivadas en medios libre de suero y/o libre de proteína que contengan suplementos adecuados .
Determinación y medición de las proteínas objetivo Determinación de la concentración del factor IX por ELISA: Las concentraciones del factor IX recombinante humano en el sobrenadante se determinan por ELISA utilizando anticuerpo anti-FIX humano de chivo (GAFIX-AP, Affinity Biologicals) como anticuerpo de retención de acuerdo con un procedimiento estándar. Todas las incubaciones se realizan en una cámara húmeda a temperatura ambiente. Se utilizan ambos estándares, octanine (FIX derivado de plasma, Octapharma) y BeneFlX (FIX recombinante, Genetics Institute) . El anticuerpo de detección es un anticuerpo de chivo anti-FIX humano conjugado con peroxidasa (GAFIX-APHRP, Affinity Biologicals) . Se agrega a cada pozo como sustrato ABTS (Catálogo número 1682008, Roche Diagnostics), se detecta reacción colorimétrica a 405 nm en 15 minutos. Los resultados se calculan por regresión lineal de concentración estándar versus absorbancia estándar.
Detección de la actividad del factor IX de coagulación humano : Se determina como sigue la actividad de coagulación del factor IX recombinante en sobrenadantes. Se realiza un análisis de la actividad de coagulación en base en el análisis de tiempo parcial de tromboplastina activada utilizando la activación de Dapptin TC (Kaolin/Sulfatid-Phospholipid Cat. No. 5035090, Technoclone GmbH) con un instrumento de coagulación manual (Amelung KC 4A micro, Amelung GmbH) . Para el estudio se incuban durante 2 minitos a 37°C 50 µl de sobrenadante a partir de células transfectadas, 50 µl de plasma deficiente en FIX (Progen) y 50 µl de Dapptin TC. Se inicia la coagulación al agregar 50 µl de CaCl2 (Catálogo Número 84687-22F, Instrumentation Laboratory) . Se compara el tiempo de coagulación de la muestra tanto con octanine y/o BeneFlX.
Determinación de BDDrhFVIII con el análisis CQAMATIC:FVIII (Chromogenix) : El kit de análisis cromogénico comefcial COAMATIC:FVIII (Chromogenic , cat. No. 82 25 85) contiene FIX, FX y un cromogen el cual se vuelve en un colorante hidrosoluble amarillo por separación de FXa. Las muestras que contienen FVIII completan este sistema: FVIII activa FIX mediante la formación de un complejo, este complejo activa FX por separación proteolítica para volverse FXa. FXa vuelve al cromógeno en un colorante el cual posteriormente se determina fotométricamente a 405 nm. Esta prueba se diseña para la determinación de FVIII a partir de plasmas de paciente. Se establece en siguiente procedimiento con el fin de volver esta prueba aplicable para la medición del factor VIII en medio de cultivo diluido. Como estándares control se utilizan el factor VIII de coagulación humano recombinante de longitud completa (NIBSC, orden número 57814F) y plasma control normal (Instrumentation Laboratory Company) . Preparación de la muestra: Se diluyen las muestras con amortiguadores de dilución suministrado con reactivos COAMATIC hasta una actividad FVIII final prospectiva entre 2 y 20 mUI/ml y se comparan con una curva estándar WHO No. 6. Método: En una distribución de 96 pozos colocada en un bloque térmico, tanto los estándares como las muestras se miden por triplicado.
Determinación de la actividad de AlAT con la prueba de actividad de elastasa: Después de transfección de ADNc para AlAT, se expresa A1AT y se secreta en el medio de cultivo de células. Después de la separación de las células por centrifugación (5 minutos, 1000 rpm), se mide la actividad de AlAT en sobrenadante de cultivo. En esta prueba de actividad se determina la actividad de AlAT por su efecto inhibidor sobre elastasa. Elastasa separa a pNA del sustrato N- succinil- (Ala) 3-pNA. Se mide la liberación de pNA fotométricamente a 405 nm. Por comparación con muestras estándar con actividad AlAT definida, se determina la actividad de las muestras respectivas. Como se demuestra en otros experimentos, la prueba es válida en medio Freestyle libre de suero. Para confirmar el hecho de que el medio Freestyle no tiene influencia sobre la prueba, se preparan dos curvas estándar: se diluye plasma humano estándar en amortiguador T+ en medio Freestyle. Dilución de muestras: Todas las muestras se prueban no diluidas, diluidas: 1:10 Y 1:50 en medio Freestyle y se comparan con diluciones estándar de plasma humano. Método: Se pipetean 50 µl de cada dilución estándar y dilución de muestra, respectivamente, en un pozo de una placa de microtitulación de 96 pozos. Después de agregar 150 µl de solución de trabajo de elastasa a cada pozo, la placa de 96 pozos se agita durante 1 minuto en un lector ELISA y se incuba durante 30 minutos a 37°C. Se agregan a cada pozo con una multipipeta 100 µl de solución de trabajo de sustrato. Se mide la absorción a 405 nm inmediatamente después de la adición de la solución de sustrato y después de 7 minutos de incubación a 37°C en la oscuridad. El primer valor representa la absorción base sin reacción catalizada por elastasa y se resta de la segunda la cual representa la absorción después de pNA separada de elastasa del sustrato. Utilizando el resultado después de la resta, se calculan las actividades de AlAT de las muestras de acuerdo con una curva estándar.
Determinación de actividad de G-CSF por ELISA: Se determinan por ELISA las concentraciones de G-CSF recombinante humano en sobrenadantes de cultivo celular utilizando anticuerpo de ratón anti-GSF humano (MAB-214, R&D Systems) como anticuerpos de retención, de acuerdo con un procedimiento estándar. Todas las incubaciones se realizan en una cámara húmeda a temperatura ambiente. Se utiliza el estándar G-SCF (hG-CSF recombinante, E. coli , 214-CS-025, R&D Systems) . El anticuerpo de detección es un anticuerpo de chivo anti-G-CSF humano biotinado (BAF-214, R&D Systems) . La estreptavidina se conjuga a peroxidasa de rábano (DY998, R&D Systems) unida al anticuerpo de detección. Se agrega el sustrato de peroxidasa fluorogénica QuantaBlu^ (15169, Pierce) a cada pozo como sustrato, se detecta la reacción fluorométrica a extinción a 320 nm/emisión 420 nm dentro de los siguientes 60 min. Se calculan los resultados por regresión lineal de la concentración estándar versus unidades de fluorescencia relativas (RFU, por sus siglas en inglés), estándar.
Ej emplo 1 : Clonación de las proteínas obj etivo A_. Clonación del factor IX humano : A partir del vector pTG36 como se describe en WO01 /70968 , se recorta un fragmento de 1 . 4 kb que contiene el marco de lectura abierto del factor IX de coagulación humano mediante digestión doble con HindIII y Notl . Este fragmento se liga a un fragmento de 5 . 6 kb de un vector pcDNA3 . lHygro ( + ) -zz digerido doblemente con HindIII y Notl (derivado de B870-20, Invitrogen) , . lo que resulta en el vector pcE3SIA3 .1-FIX que se muestra en la figura 2 . La secuencia de ADN de pcü© .1-FIX se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN N MERO 1. Se encuentran tres inserciones nucleotídicas adicionales en la estructura principal del vector en el vector pcDNA3 . lHygro (+) -zz (véase SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5) en cspparación con la secuencia publicada por Invitrogen (como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4) . En vector pcDNA3 .1-FIX contiene un cásete de gen de resistencia a higromicina para permitir un método de selección para un clon celular transfectado de manera estable (véanse las figuras 2 , 3 y 7) . El vector permite el establecimiento de líneas de células que se expresan de manera estable por transfección con fosfato de calcio u otros, y una selección subsecuente resistentes a higromicina.
B_. Clonación del factor VIII humano : Se aisla un ADNc para FVIII de 4380 pares de bases que contiene el marco de lectura abierto de un factor VIII de coagulación humano al que se le ha suprimido el dominio B a partir del vector pTGF8-2hyg-s (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 7; cuya producción se describe en el documento WO01/70968) con digestión con Notl+Xhol y se liga con pcDNA3. lHygro (+) -zz, el cual se linealiza con XhoI+PspOMI lo que resulta en el vector pcDNA3.1-FVIII que se muestra en la figura 7.
C_. Clonación de AlAT humana: Se aisla ARNm para A1AT directamente de células HepG-2 (DSMZ# ACC 180) utilizando el kit de minipreparación ARNm (Sigma, Cat# MRN-10) . En la siguiente etapa se retiene AR?m en esferas oligo (dT) . Posteriormente, el ARNm se transcribirá en AD?c de cadena doble con trasnscriptasa inversa de virus de mieloblastosis aviar (AMV RT, Promega, Cat# M5101) después de RT-PCR (transcripción inversa-reacción en cadena de polimerasa) . Se amplifica el AD?c para AlAT por reacción con PCR. Se carga el producto de PCR en gel de agarosa. La banda de AD? apropiada se aisla y posteriormente se purifica con el kit de extracción en gel Qiaquik (Qiagen Cat# 28704) . Después del fragmento AlAT se subclona en el vector comercial (TOPO"11 Invitrogen, Cat# K4650-01) . Para clonación de pCMV-Script: se digiere PCR II TOPO-A1AT con EcoRI, se liga el fragmento de 1370 pares de bases de AlAT con pCMV-Script linealizado con ECOri . Para la clonación de pCI-neo-AlAT se digiere TOPO-A1AT PCR II con EcoRI , el fragmento de 1370 pares de bases de AlAT se liga con pCI-neo linealizado con EcoRI . Para clonación de pCDNA3.1-FVIII se aisla AlAT de 1370 pares de bases con PCR II TOPO AlAT digerido con XhoI+HindlII y se liga con pcDNA3.1 linealizado con Xhol+HindIII . El vector resultante se muestra en la figura 3. Para clonación de pTGl-AlAT, se digiere PCR II TOPO-A1AT con HindIII y Notl. El fragmento de 1370 pares de bases de A1AT se liga con pTGl (sin PRE) , se linealiza con HindIIl y Notl. El vector resultante se muestra en la figura 9. p_. Clonación del ADNc para G-CSF humano: Se aisla ARN total directamente de células de carcinoma de vejiga urinaria humanas 5637 naturales con el kit mino RNeasy (QIAGE?, cat. ?o . 74104) . Posteriormente, el ARN total aislado se incuba con D?asa I para digerir AD? genómico posiblemente mezclado de células 5637. Para obtener AR? total libre de D?asa, la mezcla de reacción se trata con el kit de limpieza R?easy (QIAGE?, cat. ?o . 74204). La RT-PCR con AR? total como plantilla se realiza con un cebador oligo (dT) 12-18 (Invitrogen Cat. ?o. 18418-012) y transcriptsa inversa H- RNasa II Superscript™ (Invitrogen Cat. ?o. 18064-022) en presencia de inhibidor de RNasa (Roche, catálogo número 799- 017) para sintetizar un acumulado de AD?c de cadena doble a partir de células 5637. El AD?c para G-CSF se amplifica después por reacción con PCR. El ADNc para G-CSF se aisla de gel de agarosa con el kit de extracción en gel QIA quick (QIAGEN, catálogo número 28704) y se secuencia com ambos de los siguientes cebadores de PCR para G-CSF: -G-CSF directo: 5 ' -ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC - 3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 19) -G-CSF inverso: 5 * -TCA GGG CTG GGC AAG GTG GCG TAG-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 20) La secuencia del ADN sintetizado a partir de células 5637 se confirma por análisis de secuencia el cual es la forma b de GCSF (que tiene la secuencia que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26) . El ADN de la forma b de GCSF aislada como se describe en lo anterior después de liga directamente en el vector comercial pCR2.1 (Invitrogen). El plásmido resultante se denomina pCR2. Id2-GCSFb y se muestra en la figura 10. Se digiere pCR2.ld2-GCSFb con HindIII y Notl, el fragmento de ADNc para GCSFb de 705 pares de bases se aisla y liga en el vector pcDNA3. lHygro (+) -zz, el cual se linealiza con HindIII y Notl. El vector pDNA3.1-GCSFb resultante se muestra en la figura 11. Se digiere PCR2.ld2-GCSFb con EcoRI, el fragmento de ADNc de GCSFb de 629 pares de bases se aisla y liga dentro del vector pCINeo, el cual se linealiza con EcoRI . El vector pCINeo-CCSFb resultante se muestra en la figura 12.
Se digiere PCR2. Id2-GCSFb con BamHl y Xhol, el fragmento de ADNc GCSFb de 693 pares de bases se aisla y liga dentro del vector pCMVScript, el cual se linealiza con BamHl y Xhol. El vector pcMVScriptGCSFb se muestra en la figura 13. Se digiere PCR2.1d2-GCSFb con HindIII y Notl, el fragmento de AE?c de GCSFb de 705 pares de bases se aisla y liga en el vector pTG2-hyg-as, el cual se linealiza con HindIII y ?otl. El vector pTG2-GCSFb-hyg-as se muestra en la figura 14.
Ejemplo 2: Expresión de las proteínas objetivo en diferentes líneas de células y vectores diferentes: Cuando se optimiza el presente método para la producción de proteína recombinante se prueba la capacidad para altos niveles de expresión de diferentes líneas de células - todas presentan un vector que comprende el gen recombinante para a-1-antitripsina (AlAT) . Se encuentra que las células CHO, BHK y otras líneas de células producen menos proteína recombinante en análisis de transfección transitoria en comparación con la línea de células 293T. Por lo tanto, se examinan otros derivados de línea de células renales embriónicas humanas. Los resultados se muestran en las figuras 4 a 6.
Ejemplo 3: Transfección transitoria de células 293T y 293 en suero que contiene medio como comparación para células 293F, las cuales se transfectan y cultivan bajo condiciones libre de suero: Se colocan en placas, de 6 pozos 0.1-0.2 x 105 células viables de células 293T o 293. Al día siguiente las células se transfectan utilizando el método de fosfato de calcio (Biotechniques 6:7 632-638 (1988)): se diluyen 4 µg de ADN plasmídico en 0.1 x amortiguador TE (se agregan 200 µl de mezcla de transfección) , se mezcla suavemente, se agregan a la muestra de transfección 20 µl de CaCl2 2.5 M y 100 µl de HBX 2x. La muestra de transfección se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de 6 horas se intercambia el medio de incubación y las células después se incuban durante 48 horas.
Ejemplo 4: Transfección libre de suero y expresión de proteínas objetivo en células 293F en medio libre de suero: Se preparan 28 ml de cultivo de suspensión con una densidad celular de 106 células 293F viables (en el mismo día del experimento de transfección) . Se prepara un complejo de lípido-ADN al diluir 30 µg del ADN plasmídico en Opti-MEM1* I (Invitrogen) a un volumen total de 1 ml y se diluyen 40 µl de 293fectinMR en Opti-MEN^ I hasta un volumen total de 1 ml .
Después de 5 min de incubación a temperatura ambiente, el ADN diluido se agrega a 293 fectin*1 para obtener un volumen total de 2 ml . Las muestras transfectadas de han incubado durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Se agregan 2 ml de mezcla de transfección a los 28 ml de cultivo de suspensión 293F (densidad celular final de 1 x 106 células/ml) . Las células 293F transfectadas se incuban a 37°C/atmósfera humidificada de C02 8% en aire sobre un agitador orbital que gira a 125 rpm durante 72 horas.
A: Transfección y expresión de AlAT: Los resultados de estos experimentos que comparan células 293F con 293 y 293T se muestran en la figura 4. En todos los experimentos se transfecta una cantidad definida de células (106 células) con pcDNA3.1-AlAT. La cantidad de AlAT expresada en estas líneas de células diferentes es lo que se compara. La cantidad expresada de AlAT en células 293F se establece como 100%. Como se puede ver de la figura 4, las células 293 y 293E producen solo 12-13% de la cantidad de AlAT en comparación con las células 293F. Además, se prueba si estructuras principales de vector diferentes influyen en la cantidad de proteína recombinante producida en células 293F. La secuencia codificante para a-1-antitripsina (AlAT) humana se inserta en pTG (vectores internos) , pCMB Script™ (Stratagene) , pcl neo (Promega) así como dentro del vector pcDN S.l™1. El nivel de expresión de AlAT a partir de pcDNA3.1- AlAT se establece como 100%. Ninguno de los otros vectores se acerca a la elevada expresión que se observa con pCDNA^.l-AlAT. Se encuentra que pcDNA3.1-AlAT produce la cantidad más grande de AlAT como se detecta con la prueba de ELISA (véase la figura 5) . El vector interno expresa solo una cantidad de 20% y los otros vectores comerciales muestran un intervalo de 15-30% en comparación con la cantidad de AlAT expresado a partir de pcDNA3.1. Por lo tanto, se selecciona a pcDNA 3.1 para todos los experimentos adicionales . Resumiendo, las diferentes líneas de células han sido transfectadas transitoriamente con pcDNAS.l que presenta el gen para AlAT. Se ha demostrado que la línea de células 293F libre de suero expresa 7 veces más AlAT por 106 células en comparación con las células 293T y 293. Por lo tanto se selecciona la línea de células 293F freestyle para los experimentos de transfección estable. En la figura 6 se muestran los resultados de los experimentos de transfección transitoria. La parte superior (A) muestra el análisis por SDS-PAGE del sobrenadante de 6 ensayos de transfección diferentes utilizando diferentes vectores de transfección. Derivado del análisis de las figuras se puede concluir que la a-1-antitripsina presente en los sobrenadantes de cultivo celular analizados es de buena calidad y se puede deducir de la relación de actividad de antígeno que es 1 (datos no mostrados) . Se puede deducir la validez de los resultados de prueba a partir del hecho de que el control negativo no muestra actividad de -1-antitripsina ni antígeno . La distribución de peso molecular analizado por SDS-PAGE muestra imágenes bien claras para las muestras que contienen las tres l-antitripsina. En el control negativo, además de la carencia en la banda que representa al-antitripsina, es visible una banda adicional con un peso molecular de 27 kD, como se esperaba. Mediante el análisis utilizando Western blotting (utilizando un anticuerpo primario anti oíl-antitripsina humana) se puede identificar la proteína en la región de peso molecular esperado bajo condiciones recuctoras. No son visibles productos divididos. La flecha negra indica la banda prominente la cual corresponde a una proteína recombinante de 52 kDa de al-antitripsina. También es visible una banda que corresponde a la proteína GFP de 27 kDa en los carriles 4 y 8, la cual se expresa transitoriamente como control en las células 293F de FreeStyle de la línea celular. Las bandas adicionales en los carriles 1, 2, 3 y 5, 6 y 7 son proteínas de la célula hospedadora (de las células 293F freestyle) . El panel inferior (B) muestra en análisis Western Blot. Los resultados son idénticos excepto que debido a la mayor rigurosidad del análisis, los resultados presenten una apariencia más limpia y únicamente es visible la banda que corresponde a AlAT. B Transfección y expresión de FVIII: En la figura 8 se muestra la cantidad promedio de factor VIII de los mejores tres clones transfectados de manera estable. La cantidad promedio de factor VIII de los tres mejores clones expresados con el vector pcDNA-FVIH se establece como 100% de productividad. Una comparación con el vector interno pTGF8-2hyg-s muestra una productividad casi tres veces mayor del factor VIII con el vector pcDNA3.1-FVIII en células 293F.
C Transfección y expresión de FIX: En céluls 293F transfectadas de manera estable utilizando pcDNA3.1-FIX y un vector basado en pUC 19 /X pTGF36 (véase el documento WO 01/70968) que expresa el factor IX, se puede demostrar una productividad casi tres veces mayor con el uso del vector pcDNA3.1 en células 293F que el que se puede observar en la siguiente tabla 1. Tabla 1: Productividad de FIX en células 293 y 293F después de transfección estable con pcDNA3.1 y pTG2.
Ejemplo 5 Producción de G-CSFb A. Transfección de células 293F en medio libre de suero, transfección transitoria: Se prepara el mismo día del experimento de transfección 28 ml de cultivo de suspensión de células 293F con una densidad celular de 1.1 x 106 células 293F viables por ml . Se prepara un complejo de lípido-ADN al diluir 30 µg del ADN plasmídico (pcDNA3-l-G-CSFb) en Opti-MEM™ I (Invitrogen) hasta un volumen total de 1 ml y se diluyen 30 µl de Lipofectamine 2000 CD en Opti-MEM1^ I hasta un volumen total de 1 ml . Después de 5 min de incubación a temperatura ambiente, se agrega ADN diluido a Lipofectamine 2000 CD para obtener un volumen total de 2 ml . Las muestras de transfección se incuban durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Se agregan 2 ml de mezcla de transfección a 28 ml de cultivo de suspensión 293F (densidad celular final de 1 x 106 células por ml) . Las células 293F transfectadas se incuban a 37°C/atmósfera humidificada de C02 8% en aire en un agitador orbital que gira a 125 rpm durante 72 h.
B_. Transfección estable: 72 horas después de la transfección transitoria como se establece en el inciso A anterior, se transfiere un número adecuado de células (105 y 106 células) a una caja plana para sedimentación con el fin de establecer crecimiento adherente. La presión de selección se inicia después de 2 a 50 horas, preferiblemente a las 48 horas después de la transferencia a la caja plana. El agente selectivo preferido es higromicina con una concentración de 75 µg/ml. Se mantiene la presión durante por lo menos 10 a 20 días, preferiblemente durante 14 días, por lo que el medio suplementado con higromicina se intercambia 2 a 3 días .
C_. Selección de los mejores clones productores de G-CSF utilizando el análisis y la toma con el robot ClonePixFL (Genetix) : Las céluls 293F FreeStyle transfectadas de manera estable como se describe en el inciso B anterior se siembran en medio basado en metilcelulosas semisólidas que se mantienen en un antibiótico apropiado para selección de clones después de aproximadamente 2 días y un anticuerpo marcado para detección de los clones productores más altos vía fluorescencia. Los números grandes (miles) de clones se analizan utilizando ClonePixFL (Genetix) con respecto al número de células y a la secreción de G-CSF con el fin de posteriormente tomar solo algunos cientos de clones mejores productores de G-CSF. En contraste con otros métodos conocidos, en donde clones no productores y clones mixtos se toman aleatoriamente también, el uso de ClonePixFL permite la toma de clones de crecimiento rápido, los cuales son altos productores únicamente, que se originan de una sola célula. Las células tomadas se expanden en placas de microtitulación y después en tubos de centrífuga, matraces de cultivo de células y fermentadores bajo condiciones libres de suero para el procedimiento completo. Aq í, así como en el procedimiento de transfección estable completo se generan bajo condiciones libre de suero. Adicionalmente, durante la totalidad de la siguiente expansión y procedimiento de cultivo celular, las células no tienen contacto alguno con el suero o con proteínas derivadas de animal. Durante la expansión, se seleccionan los mejores clones con respecto a la robustez, alta velocidad de crecimiento, viabilidad y producción de G-CSF activo, medido en el formato ELISA. Después de esta fase de selección, los clones tomados se cultivan bajo condiciones libre de suero, sin suplementos de antibióticos. Las células 293F se cultivan completamente libre de suero durante todo el procedimiento, se intercambia el medio cada tercer día. El incremento de escala de las células se realiza bajo condiciones completamente libre de suero desde matraces Erlenmeyer en agitadores Kühner a volúmenes más altos en reactor Wave (Wave Biotech Europe) . Durante esta selección se reduce el número nuevamente a solo algunos clones productores . La secuencia de ADNc correcta, el contenido de ARNm y el comportamiento en la fermentación son criterios para identificar los mejores clones para subclonación. Para esto, las células de los clones seleccionados se siembran en placa, se analizan y se toman con ClonePixFL y después se expanden y seleccionan como se describe en lo anterior. La subclonación es una etapa esencial con el fin de seleccionar nuevamente los mejores clones productores para eliminar posibles variaciones genéticas en la subpoblación sembrada en placa del clon. Después de la subclonación, uno o varios de los clones seleccionados se siembran en grupos nuevamente bajo condiciones libre de suero. La proteína G-CSF humana recombinante expresada se caracteriza bioquímicamente con mayor detalle. D. Determinación de la concentración de G-CSF humano por ELISA: Se determina la cantidad de rhG-CSF expresado por las líneas de células 293F FreeStyle mediante ELISA, se compara el rendimiento de proteína obtenida con células transfectadas con vectores diferentes (véase la figura 15) . Como se espera de los experimentos de expresión con FIX y AlAT descritos en los ejemplos 2 y 3, aquí nuevamente una combinación de el vector pcDNA 3.1-GCSFb con la línea de células 293F muestra la productividad más alta y por lo tanto se utiliza para producción de G-CSFb humano recombinante. E . Western blot de rhG-CSF en SDS-PAGE reductor: Se analizan 10 µg de G-CSF producido en sobrenadantes de células HEK293 y HEK293F en SDS PAGE 15% y Western blot. La detección de G-CSF se realiza vía BAF214-bio/SA-HRP/DAB (véase la figura 16). La flecha indica la banda monomérica de rhG-CSF de la masa molecular correcta.
LISTADO DE SECUENCIAS,, TEXTO LIBRE SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1: pcDNA3.1-FIX, Molécula: 6960 pares de bases ADN, circular Tipo Inicio Fin Nombre/Descripción REGIÓN 209 863 promotor CMV REGIÓN 895 911 MCS" GEN 939 2324 hFIX GEN 2328 2339 SV40'/SV40 poliA + intron REGIÓN 2340 2370 ^MCS REGIÓN 2381 2595 BGH pA REGIÓN 2658 3071 origen fl REGIÓN 3136 3460 promotor SV40 GEN 3478 4501 HygR REGIÓN 4514 4886 SV40 pA REGIÓN 5819 5146 origen C PUC GEN 6824 5964 C AmpR (cadena complementaria SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 2 : pcDNA3.1-AlAT Molécula: 6914 pares de bases ADN, circular Tipo Inicio Fin Nombre/Descripción REGIÓN 209 863 promotor CMV GEN 913 2259 AlAT GEN 2328 2339 SV40'/SV40 poliA + intron REGIÓN 2335 2549 BGH pA REGIÓN 2612 3025 origen fl REGIÓN 3090 3414 promotor SV40 GEN 3432 4455 HygR REGIÓN 4468 4840 SV40 pA REGIÓN 5773 5100 origen C PUC GEN 6778 5918 C AmpR (cadena complementaria SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 3 : pcDNA3.1-FVIII Molécula: 9975 pares de bases ADN Tipo Inicio Fin Nombre/Descripción REGIÓN 1 655 promotor CMV GEN 783 3082 dominios Al y A2 de FVIII humano GEN 3083 3104 resto del dominio B y nucleótidos agregados GEN 3105 5162 dominios A3 , Cl y C2 del factor FVIII humano REGIÓN 5188 5402 BGH pA REGIÓN 5465 5878 origen fl REGIÓN 5943 6267 promotor SV40 GEN 6285 7308 HygR REGIÓN 7321 7693 SV40 pA REGIÓN 8626 7953 origen C PUC GEN 9631 8771 C AmpR (cadena complementaria SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4: pcDNA3.1 secuencia publicada por Invitrogen Molécula: 5597 pares de bases ADN, circular Tipo Inicio Fin Nombre/Descripción REGIÓN 209 863 promotor CMV REGIÓN 895 1010 MCS REGIÓN 1021 1235 BGH pA REGIÓN 1298 1711 origen fl REGIÓN 1776 2100 promotor SV40 GEN 2118 3141 HygR REGIÓN 3154 3526 SV40 pA REGIÓN 4456 3786 origen C PUC GEN 5461 4601 C AmpR (cadena complementaria SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5: pcDNA3. lHygro (+) -zz , que tiene 3 nucleótidos adicionales "GGT" en la posición 4380 en comparación con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4 Molécula: 5600 pares de bases ADN, circular Tipo Inicio Fin Nombre/Descripción REGIÓN 209 863 promotor CMV REGIÓN 895 1010 MCS REGIÓN 1021 1235 BGH pA REGIÓN 1298 1711 origen fl REGIÓN 1776 2100 promotor SV40 GEN 2118 3141 HygR REGIÓN 3154 3526 SV40 pA REGIÓN 4459 3786 origen C PUC GEN 5464 4604 C AmpR (cadena complementaria SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6: vector pTGl-AlAT SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 7 : vector pFGF8-hyg-s Molécula: 10705 pares de bases ADN, circular Tipo Inicio Fin Nombre/Descripción REGIÓN 1 586 promotor CMV GEN 676 2975 dominios Al y A2 de hFVIII GEN 2976 2997 bisagra remanente del dominio y nucleótidos agregados GEN 2998 5055 dominios A3 , Cl y C2 de hFVIII REGIÓN 5067 5916 Intron poliA y sitio poliA de SV40 GEN 5928 7910 Resistencia a higromicina REGIÓN 8346 8423 Elemento sensible a progesterona GEN 8681 9469 Resistencia a ampicilina SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 8: ADNc del factor VIII natural humano SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 9 : factor VIII natural humano SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 10-12: péptidos enlazantes SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 13: ADN de la forma a de hFVII SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 14: AD?c de la forma b de hFVII SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 15: AD?c de la forma a de GCSF humano, CDS: 41-661 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 16: ADNc de la forma b de GCSF humano, CDS: 41-652 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 17: ADNc de la forma c de GCSF humano, CDS: 229-828 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 18: ADNc de hvWF SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 19 y 20: cebador directo o inverso de G-CSF SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 21: vector PCR2. Id2-GCSFb Molécula: 4542 pares de bases ADN, circuí Inicio Fin característica/nombre 293 907 GCSFb 1159 1596 origen fl 1930 2724 KanR 2742 3602 AmpR 3747 4420 origen pUC SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 22: vector pcDNA3.1-hyg (+) -GCSFb Molécula: 6237 pares de bases ADN, circular inicio Fin característica/nombre 209 863 promotor CMV 970 1584 GCSFb 1658 1872 BGH pA 1935 2348 origen fl 2413 2737 promotor SV40 2755 3778 HygR 3791 4163 SV40 pA 5096 4423C origen PUC 6101 5241 C AmpR SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 23: vector pCINeo-•GCSFb Molécul .a: 6101 pares de bases ADN, circular Inicio Fin característica/nombre 1 1022 promotor CMV/Intron 1106 1720 GCSFb 1796 2017 SV40 poli A 2112 2567 origen fl 2629 3047 mejorador/promotor SV40 3092 3886 NeoR 3950 3998 Poli A 4409 5269 AmpR SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 24: vector pCMVScript_GCSFb, Molécula: 4920 pares de bases ADN, circular Inicio Fin característica/nombre 1 602 promotor CMV 728 1342 GCSFb 1453 1836 SV40 poli A 1974 2280 origen fl 2449 2787 promotor SV40 2822 3613 NeoR 3614 4063 HSV-TK poli A SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 25: vector pTG2-GCSFb-hyg-as Molécula: 6917 pares de bases ADN, circular Inicio Fin caracteristica/noi 5 591 promotor CMV 722 1336 GCSFb 1383 2228 SV40 intron+pA 2767 2255 C HSV TK poli A 3782 2745 C HygR 4044 3796 promotor C HSV TK 4916 5704 AmpR SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 26: ADNc de la forma b de GCSF humano SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 27: proteína de la forma b de GCSF humano Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un método para preparar una línea de células humanas inmortalizadas transfectadas de manera estable con una secuencia de ácido nucleico que comprende un gen que codifica para una proteína objetivo humana o un derivado o mutante de la misma, un promotor y una señal de poliadenilación (poli A) de hormona del crecimiento bovina, el promotor y la señal poli A están enlazadas al extremo 5' y 3' del gen que codifica para la proteína objetivo humana, respectivamente, caracterizado porque comprende transfectar una línea de células hospedadoras humanas inmortalizadas bajo condiciones libre de suero con un vector de transfección que comprende la secuencia de ácido nucleico y un origen de replicación. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína objetivo humana es una proteína de plasma humano que se selecciona del grupo de factores de la coagulación sanguínea tal como el factor IX, factor VIII (natural y dominio B suprimido) , factor VlI/VIIa y factor de von Willebranda (vWF) , factores del crecimiento tales como eritropoyetina, factores estimuladores de colonia
(CSF) tal como el factor estimulante de granulocitos (G-CSF) , CSF de macrófagos (M-CSF) y CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), citocinas tales como interleucinas, inhibidores de proteasa tal como a-1-antitripsina (AlAT) y quimiotripsina, proteínas de transporte tal como hormonas, proteínas de acción inhibidora o reguladora y derivados y mutantes de los mismos, preferiblemente la proteína humana se selecciona de factor IX, factor VIII que incluye factor VIII natural y factor VIII sin dominio B, factor VlI-VIIa, G-CSF, wWF y AlAT, de manera más preferible la proteína humana es el factor IX de coagulación sanguínea codificado por los pares de bases 939 a 2,324 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1; AlAT humano como se codifica por los pares de bases 973 a 2,259 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2, factor VIII wt como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 9; factor VIII humano sin el dominio B como se codifica por los pares de bases 783 a 5,162 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3, factor VH/VHa codificado por las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 13 y 14, G-CSF codificado por las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 15, 16 y 17 o vWF codificado por la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 18.
3. El método conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque en el vector de transfección: (i) el promotor se selecciona de promotores virales, promotores de genes constitutivos y promotores específicos de tejido, preferiblemente promotores o promotor CMV con o sin el promotor CV40 de intrón A, el promotor EF-la, el promotor HSV TK, etcétera, de manera más preferible, el promotor es un promotor CMV; y/o (ii) el origen de replicación permite la replicación y amplificación del plásmido en bacterias; (iii) el vector tiene adicionalmente por lo menos un gen para un marcador de selección, que preferiblemente se selecciona de resistencia a higromicina, resistencia a neomicina, resistencia a aminoglucósido fosfotransferasa (neo, G418, APH) , resistencia a bleomicina (fleo, bleo, zeocina) y resistencia a xantina-guanina fosforribosiltransferas (XGPRT, gpt) y/o que está bajo el control de un promotor como se define en el inciso (i) anterior; y/o (iv) el vector presenta adicionalmente uno o más elementos reguladores adicionales, los elementos reguladores preferiblemente se seleccionan de sitios de empalme, sitios de recombinación, sitios poli A, mejoradores, sitios de clonación múltiple y secuencias plasmídicas procarióticas.
4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el vector de transfección presenta un promotor CMV, un gen para higromicina, una secuencia poli A y el gen de interés, y preferiblemente se deriva del vector pcDNA3.1 que tiene la secuencia de SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4 ó 5.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la línea de células humanas inmortalizadas: (i) es capaz de ser transfectada y de ser cultivada bajo condiciones libre de suero; y/o (ii) tiene secuencias adenovirales integradas en su genoma; y/o (iii) se selecciona del grupo de células renales, de vejiga, hepáticas, pulmonares, de músculo cardíaco, de músculo liso, de ovario y grastrointestíñales, preferiblemente es una línea de células renales humanas; y/o (iv) no es capaz de expresar proteína priónica humana,
6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque las células renales son células renales fetales humanas, preferiblemente células renales humanas fetales seleccionadas de células 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305), células 293T (DSM ACC 2494), células 283 FreeStyle (293F) (células 293F; Invitrogen R79007) , preferiblemente son células 293F (Invitrogen R79007) .
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la línea de células es 293F y el vector de transfección se deriva de pcDNA3.1, el vector preferiblemente codifica para factor IX de coagulación sanguínea humana como se muestra por los pares de base 939 a 2324 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1, AlAT humano como se codifica por los pares de bases 973 a 2259 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2, factor VIII humano wt, como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 9, o factor VIII humano sin dominio B, como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3, FVII/FVIIa, G-CSF que incluye G-CSFb que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 27 o factor de von Willebrand.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la transfección libre de suero se lleva a cabo en cultivo de suspensión libre de suero con un agente de transfección catiónico o fosfato de calcio, preferiblemente reactivo lipofectamine 2000 CD (Invitrogen) .
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende además selección para células transfectadas de manera estable, de manera preferible por productividad, actividad y calidad de producto de la proteína recombinante producida.
10. Una línea de células humanas inmortalizadas transfectadas de manera estable, caracterizada porque se puede obtener por el método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9.
11. La línea de células de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque se puede obtener por el método de conformidad con las reivindicaciones 4 a 9, preferiblemente la línea de células es 293F y el vector de transfección se deriva de pcDNA3.1.
12. Un método para la producción recombinante de una proteína objetivo humana o un derivado o un mutante de la misma, caracterizado porque comprende cultivar una línea de células humanas inmortalizadas de conformidad con la reivindicación 10 u 11.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la proteína objetivo humana es factor XI de coagulación de sangre humana como se muestra por los pares de bases 939 a 2324 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1, AlAT humano como se codifica por los pares de bases 973 a 2259 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 2, factor VIII humano wt, como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 9, o factor VIII humano sin dominio B como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3, FVII/FVIIa, G-CSF que incluye G-CSFb que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 27 o factor de von Willebrand.
14. El método de conformidad con la reivindicación 12 ó 13 caracterizado porque comprende además las etapas de concentrar la proteína humana recombinante a partir del caldo de cultivo y/o purificar la proteína y/o eliminación de priones .
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque la producción de la proteína humana se realiza bajo condiciones libre de suero.
16. Un vector de transfección caracterizado porque comprende un origen de replicación y una secuencia de ácido nucleico que comprende un gen que codifica para una proteína objetivo humana o un derivado o un mutante de la misma, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4.
17. El vector de transfección de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque es un vector pcDNA3.1 , que comprende el gen que codifica para una proteína objetivo que se selecciona del grupo que consiste del factor IX de la coagulación de la sangre de la proteína humana, AlAT humano, factor VIII de coagulación sanguínea humano que incluye al tipo natural y a los mutantes sin dominio B del mismo, G-CSF que incluye las formas a, b y c del mismo, FVII/VIIa que incluye las formas a y b del mismo y vWF, preferiblemente dicho vector de transfección tiene la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1, 2, 3 ó 22.
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