MX2007014674A - Proceso que comprende la optimizacion del codon para la produccion de la proteina c humana, activada, recombinante para el tratamiento de sepsis. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo recombinante de produccion de Proteina C activada. La invencion se refiere a un metodo de construccion, transformacion, expresion, purificacion y produccion de Proteina C humana activada recombinante. Se muestran constructos de ADN que comprenden elementos de control con el gen de interes. La secuencia de acido nucleico de interes ha sido el codon optimizado para permitir la expresion en las celulas hospederas del mamifero apropiado.

Description

PROCESO QUE COMPRENDE LA OPTIMIZACION DEL CODON PARA LA PRODUCCIÓN DE LA PROTEINA C HUMANA, ACTIVADA, RECOMBINANTE PARA EL TRATAMIENTO DE SEPSIS Campo de la Invención La presente invención se refiere a un método recombinante de producción de la Proteína C activada. La invención se refiere a un método de construcción, transformación, expresión, purificación y producción de la proteína C activada recombinante humana. Los constructos de ADN que comprenden los elementos de control asociados con el gen de interés han sido descritos. La secuencia de ácido nucleico de interés, se ha optimizado en un codón para permitir la expresión en las células hospedadoras mamíferas convenientes. Antecedentes de la Invención Xigris (Drotrecogina alfa) es una forma recombinante de la Proteína C Activada humana. Ésta es una proteasa serina con la misma secuencia de aminoácido que la derivada del plasma humano. La Proteína C Activada es un importante modulador del sistema de respuesta a las propiedades antiinflamatorias, profibrinolíticas, anti-trombóticas e infecciosas. La Drotrecogina alfa (activada) es una glicoproteína de aproximadamente 55 kD en peso molecular. La forma precursora de la Proteína C contiene un prepropéptido principal (ausente en la proteína madura), un dominio de ácido carboxiglutámico - y (Gla) de 9 residuos Gla, un bloque de aminoácido hidrofóbico helicoidal corto, dominios similares (EGF) del factor de crecimiento epidérmico dos, un péptido que liga entre la cadena pesada y ligera, un péptido de activación, y una tripsina - como el dominio SP en donde la tríada catalítica está situada en His-211, Asp-257 y Ser-360. La función principal del dominio EGF es proporcionar interacciones de la proteína-proteína o proteína-celular. Los residuos presentes en el motivo EGF fueron también mostrados para interactuar funcionalmente con los diferentes activadores y sustratos.

Además, la hélice que conecta tiene residuos que participan en la coordinación del enlace del ion de calcio al dominio EGF-I que está conceptualizado para desempeñar un papel neuroprotectivo.

Las modificaciones después de la translación retiran el di-péptido Lys-156-Arg-157, de modo que la forma de la cadena sola se convierte en una molécula de dos cadenas ligadas por un enlace de disulfuro. El 80 % del PC cimógeno está en esta forma. También los residuos de ácido glutámico de carboxilación en el dominio Gla amino terminal, la hidroxilación de un residuo ASP en el dominio EGF-I y la glicosilación son otros eventos después de la translación. El RhAPC y APC derivados del plasma humano tiene los mismos sitios de la glicosilación, aunque existen algunas variaciones en las estructuras de la glicosilación. El APC humano tiene cuatro sitios de N-glicosilación ligados a asparagina. Éste tiene un ácido siálico cinco veces superior comparado a otras proteínas del plasma. El APC humano tiene cuatro sitios de N-glicosilación ligados a asparagina. Éste tiene una fucosa cinco veces superior y un ácido siálico dos veces superior comparado a otras proteínas del plasma. La Proteína C activada ejerce por inhibición el Factor Va y VIII a. Los datos Invitro indican que la Proteína C Activada tiene actividad profibrinolítica indirecta a través de su capacidad para inhibir al inhibidor-1 activador plasminógeno (PAI-I) y limitar la generación del inhibidor de fibrinolisis activable por la trombina activada. Adicionalmente, los datos in vitro indican que la Proteína C Activada puede ejercer un efecto antiinflamatorio que inhibe la producción del factor de necrosis humano del tumor por monocitos, bloqueando la adherencia de leucocitos a las selectinas, y limitando las respuestas inflamatorias inducidas por trombina dentro del endotelio microvascular. Varios métodos se han descrito por la expresión de las proteínas recombinantes en sistemas eucarióticos superiores. Los sistemas de expresión celular CHO-Kl, HEK293 (y variantes) se han ahora establecido como sistemas predominantes de opción para la expresión de la proteína mamífera. El procedimiento detallado es conveniente para la transfección de la secuencia del ácido nucleico sintetizado denovo que codifica la Drotrecogina alfa humana recombinante en hospedadores mamíferos convenientes para la expresión. El procedimiento detallado abajo, es conveniente para la producción de la Proteína C Activada recombinante humana soluble, recombinante, bioactiva. Los protocolos actuales hacen uso de una línea celular humana establecida, que posee el ADN complementario por el cimógeno de la Proteína C humana inactiva, que secreta la proteína en el medio de la fermentación.

La Proteína C Humana es activada enzimáticamente por la división del activador de factor X del veneno de víbora Russell tripsina, alfa-trombina o una mezcla de trombina y trombomodulina para obtener la proteína C activada y purificada posteriormente. Sin embargo, estos procedimientos de activación implican el riesgo de la contaminación y costos de producción más altos. Esta investigación tiene como objetivo la producción de la proteína C activada directamente desde las células recombinantes por la incorporación de la proteasa asociada con las células. Tales proteasas podrían situarse en los organelos celulares o citoplasma o en las membranas celulares que pueden dividir proteínas durante o inmediatamente en la secreción. Por consiguiente, la estrategia se ha usado para la producción de la proteína C activada recombinante directamente en la secreción de una célula hospedadora eucariótica es decir HEK293. La enzima recombinante será indicada para uso en la reducción de la mortalidad en los pacientes adultos con sepsis severo (es decir, sepsis asociado con daño de órgano agudo) que tienen un alto riesgo de muerte.

Descripción de las Figuras Anexas Figura 1. Alineación conocida de la secuencia en pares de las versiones del codón optimizado y no optimizado de la secuencia nucleótida de ADN que codifica la Drotrecogina alfa o Xigris. Figura 2. Fragmentos en gel digeridos-restringidos purificados de DROT ADNc, y pcADN3.1 D/V5-His Figura 3. Análisis de digestión restringida de los clones AVCIPpcADN3.1D/V5-His/Xigris Figura 4. Análisis de digestión restringida de los clones AVCIPpcDNAS.ID/VS-His/Xigris que usan enzimas que dividen pcDNA3.1-DROT cADN internamente. Figura 5. Alineación de la secuencia de pcDNA3.1 -DROT sintetizado novo (syntheticXigris) con la secuencia establecida del gen Xigris. Figura 6. Alineación de la secuencia de pcDNA3.1 -DROT-Opt sintetizado novo (synthetic_Xigris-Opt) con la secuencia establecida del gen Xigris-Opt Figura 7. Alineación de la secuencia del clon # 4 pcDNA3.1 DROT-/V5-His/Xigris cADN con la secuencia establecida del gen Xigris Figura 8. Mapa del Constructo: pcADN3.1 -DROT-D/V5-His/Xigris.

LISTADO DE SECUENCIAS: SEC ID NO 1: Secuencia del nucleótido de la Proteína C Activada SEC ID No 2: Secuencia de codón optimizada de la Proteína Activada Breve descripción de la Invención Se han descrito los constructos de ADN que comprenden los elementos de control asociados con el gen de interés que permiten la expresión del gen de interés. Aún otro aspecto de la invención es la optimización del codón del ácido nucleico sintetizado denovo para permitir la expresión de las mismas células mamíferas. La secuencia optimizada del codón se transforma en las líneas de la célula mamífera convenientes por la expresión. Descripción Detallada de la Invención EJEMPLO I: El diseño del vector de expresión mamífera para la expresión de la proteína C recombinante humana (activada) ha sido modificado para colocar cuatro sitios de glicosilación ligados a N y están basados en uno de los vectores disponibles comercialmente (EX: pcADN o pIRES de Invitrogen o BD Biosciences respectivamente), modificados para incluir las siguientes características: (a) Un sitio de clonación múltiple del ADN de la proteína C humana que incluye su péptido de señal natural. (b) El diseño del vector de expresión, también coloca (bi- cistrónico) una co-expresión independiente mediada IRES de la proteína fluorescente verde, que permitiría el análisis de transfectantes de alta expresión que usan el almacenamiento celular asistido fluorescente. SÍNTESIS DEL CONSTRUCTO DE FUSIÓN Método de novo: Un método de novo en términos de síntesis de las regiones de codificación del constructo rhAPC-ADNc se ha perseguido para permitir una optimización mejor del codón con respecto a la célula mamífera particular que es utilizada. El diseño del constructo sintético del ADNc también incluye características tales como: - Una secuencia de consenso de Kozak (GCCACC) seguida por un codón de iniciación (ATG) para asegurar la traslación eficiente deseada. - Sitios de restricción convenientes en el extremo 5' y 3' del ADNc para clonar en el vector de expresión deseada. La proteína C activada humana de las secuencias del nucleótido se ha representado en la SEC ID: 1. Los codones en la codificación de la secuencia del ADN de rhAPC que se han alterado como parte del proceso de optimización del codón, aseguran la expresión de la proteína recombinante óptima en las líneas celulares mamíferas, tales como CHO K1 y HEK 293. La secuencia optimizada del codón de ácido nucleico se ha representado en la SEC ID NO:2 Se ha representado la secuencia optimizada de la secuencia de ácido nucleico en la identificación SEC ID: 2. Se ha representado en la figura 1, la alineación de la secuencia en pares de la optimización del codón posterior y del no optimizado, y de las versiones de codón optimizado de la secuencia nucleótida de ADN que codifica la Drotrecogin alfa o Xigris. EJEMPLO 2: SUB-CLONACION DE ADNc DE DROTRECOGINA ALFA (DROT) EN EL VECTOR DE EXPRESIÓN ESPECÍFICO CELULAR MAMÍFERO DE PCADN3.1 D/V5-HIS. Posterior a la verificación de la autenticidad de las moléculas sintetizadas de ADNc novo de (DROT y DROT-Opt) por la secuencia automatizada de ADN según lo mostrado arriba, DROT fue sub-clonado en el vector de expresión específica celular mamífera pcADN3.1 D/V5-His para generar los constructos de transfección listos. Los detalles de los procedimientos usados se dan abajo: A. Reactivos v enzimas: 1. Kit de purificación de PCR y kit de extracción de gel QIAGEN 2. Vector ADN de pcADN 3.1 D/V5-His (Invitrogen) B. Digestión restringida del vector y del inserto: • Procedimiento Las siguientes muestras de ADN y enzimas de restricción fueron utilizadas: • Reacción de la digestión de la enzima restringida La reacción fue mezclada, girándola e incubándola por 2 horas a 37°C. La digestión restringida fue analizada por electroforesis de gel agarosa. El patrón de digestión prevista fue considerado. Un fragmento del gen disminuido de ~ 1400 bp (por Rxn # 2) y un fragmento de la columna vector ~ 5.5kb por el Vector (Rxn # 1) fue considerado. Los insertos -1400 bp del fragmento pcADN3.1 D/V5-His digerido de DROT & ~ 5.5kb fueron purificados por la extracción de gel que usa el kit de extracción en gel de QIAGEN. Se comprobó 1 µl del inserto purificado y en un 1% fragmento vector de gel de agarosa. Se han representado en la figura 2 los fragmentos digeridos restringidos purificados en gel DROT ADNc y pcADN3, 1D/V5-His.

EJEMPLO 3. C. Ligadura de la columna pcADN3.1 D/V5-His con DROTcADN: La concentración de ADN de los fragmentos insertos y vector purificado y digerido fue estimada (ref. figura 7 arriba) y la ligadura fue fijada de la siguiente manera: Las reacciones fueron mezcladas suavemente, giradas e incubadas en R.T, de 2-3 horas. Las células competentes de DHIO fueron transformadas con las reacciones de la ligadura. Las colonias obtenidas en las placas agar L.B. que contienen ampicilina fueron analizadas y confirmadas por el análisis de digestión restringida del ADN plasmídico aislado.

EJEMPLO 4: D. Análisis de digestión restringida de clones putativos de pcADN3.1DROT-/V5-His/Xigris, El ADN plasmídico fue purificado individualmente de las colonias obtenidas en las placas agar L.B que contienen ampicilina y la presencia deseada del inserto de ADNc fue confirmada por el análisis realizado de digestión restringida de ADN plasmídico aislado. Se ha representado en la figura, el análisis de digestión restringida de los clones putativos de AVCIPpcADN3, iD/v5-His/Xigris. De acuerdo con los resultados obtenidos después de la digestión restringida de varios clones putativos que contienen el pcADN3.1-DROT - D/V5-His/Xigris, algunos de los clones, los cuales mostraron el patrón de restricción deseado, fueron seleccionados por el análisis de digestión restringido adicional que usan enzimas de restricción que dividen el AVCIP-Xigris ADNc internamente, para generar fragmentos clasificados variables según lo mostrado abajo en la figura 9. El análisis de Digestión Restringida de los clones AVCiPpcADN3, iD/V5-His/Xigris que usan enzimas que dividen pcADN3.1-DROT ADNc internamente. La mayoría de los clones de pcADN3.1 -DROT D/V5-His / Xigris seleccionados por el análisis de la cartografía de restricción rindió los tamaños del fragmento previstos, basados en la ocurrencia de los sitios de restricción internos conocidos y por lo tanto, éstos clones fueron adicionalmente verificados por el análisis de la secuencia de ADN . EJ EMPLO 5: Verificación de la autenticidad de las molécu las sintetizadas de ADNc novo La verificación de la autenticidad de las moléculas de ADNc sintetizadas novo, mientras fue suministrada por el proveedor de servicio comercial, fue hecha por la secuencia automatizada de ADN . E. Verificación de los clones selecciondos de pcADN3.1 -DROT D/V5-H is/Xigris por la secuenciación del ADN Los clones seleccionados de pcADN3.1 -DROT D/V5-H is/Xig ris como un resultado del análisis de la cartografía de restricción , fueron verificados adicionalmente por la secuenciación automatizada de ADN .

Los clones de pcADN3.1 -DROTD/V5-His/Xígris mostraron identidad con la plantilla de la secuencia . El mapa del DROT está representado g ráficamente en el constructo de expresión recombinante de la figura 8 hecho usando el pcADN3.1 - sintetizado novo EJEMPLO 6 Mantenimiento y propagación del constructo de fusión rhAPC : El mantenimiento y propagación del constructo de ADNc que codifica el rhAPC se hicieron en una línea celular bacteriana estándar tal como Top 10 (Invitrogen). EJEMPLO 7. 5. Expresión de la proteína recombinante transitoria/estable en las células HEK293 y producción de supernadantes: a) La expresión transitoria/estable del constructo de rhAPC fue hecha usando células de Riñon Embrionarias humanas (HEK293), transformadas por el tipo de ADN 5 (AD 5) de adenovirus humano compartido que es una línea celular mamífera principal que está aprobaba por la FDA para aplicaciones industriales. La expresión transitoria es útil para comprobar la expresión de un constructo y para obtener rápidamente cantidades pequeñas de una proteína recombinante. b) Alternativamente, un protocolo que permitió la selección de la población grande de células que exhibió rápidamente la expresión alta, sin tener que obtener clones individuales. Posteriormente, las células HEK293 que exhibieron una expresión estable y alta de la proteína deseada rhAPC fueron desarrolladas usando procedimientos estándares. Las técnicas de cultivo mejoradas que usan medios de cultivo definidos químicamente (Sigma Aldrich) en comparación con los medios que contienen suero fueron utilizadas durante el procedimiento completo en conformidad con los requerimientos de la FDA.

EJEM PLO 8. Optimización de los procedimientos de purificación : Posterior al establecimiento de la bioactividad reprod uctiva de acuerdo con los ensayos funcionales/u nión recomendados mencionados arriba, los esfuerzos serán hechos para optimizar los procedimientos de purificación de modo que maximiza la producción .

Por consiguiente, el proceso de purificación comprendería la siguiente serie descendente. a. Clarificación y concentración inicial que usan procedimientos de filtración de flujo normal y tangencial b. Ultra filtración / Filtración de diálisis (basada en la filtración de flujo tangencial) c. Etapa Cromo - I : Cromatografía de afinidad q ue usa el anticuerpo monoclonal en el sitio de activación en la cadena pesada de la Proteína C Activada o un anticuerpo dependiente de calcio dirigido a la gama del domin io del ácido glutámico carboxi de cadena ligera de la proteína C humana. d . Etapa Cromo - I I : Cromatografía de intercambio de aniones que usa fractogel EM D. e. Etapa Cromo - l l l : I ntercambiadores de anión basados a través del flujo, tal como el sulfato cellufine para el retiro del ADN y de las proteínas celu lares hospedadoras. f. Retiro del virus y formulación estéril g . Retiro de la endotoxina h . Formulación

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Proceso para la preparación de un producto de la proteína C activada humana, activa biológicamente in vivo, que comprende las etapas de transformar una célula hospedadora con una secuencia sintetizada de ADN que codifica la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID.2 y que aisla el producto desde la célula hospedadora o del medio de su crecimiento

2. Método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la secuencia del ácido nucleico optimizada del codón que codifica la proteína C activada humana se ha representado en la SEC ID:

3. 3. Proceso de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células hospedadoras son células mamíferas.

4. Proceso de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células hospedadoras son seleccionadas preferiblemente de la cepa HEK293.

5. Proceso para la preparación de un producto de la proteína C activada recombinante humana, activa biológicamente in vivo, que comprende las etapas de transformar una célula hospedadora con un constructo de vector de la Figura No. 8 y que aisla el producto desde la célula hospedadora o del medio de su crecimiento.

6. Proceso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el vector, es un vector de expresión específica de la célula mamífera y más preferiblemente el vector como es representado en la figura 8.