ANTICUERPOS DE P-CADERINA
Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de EE UU n° 60/675 311 , presentada el 26 de abril de 2005, que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a anticuerpos y a porciones de unión a antígeno de los mismos que se unen a P-cadepna La invención se refiere también a moléculas de ácido nucleico que codifican dichos anticuerpos y porciones de unión a antígeno, a procedimientos de preparación de anticuerpos de P-cadepna y porciones de unión a antígeno, a composiciones que comprenden estos anticuerpos y porciones de unión a antígeno y a procedimientos de uso de los anticuerpos, porciones de unión a antígeno y composiciones
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las cadepnas son una superfamilia de ghcoproteinas transmembrana que regulan la adhesión célula-célula durante el desarrollo y la homeostasis de tejido (Gumbiner, J Cell Biol , 148 399-404 (2000), Yagí, e/ a/ , Genes Dev , 14 1169-1180 (2000)) Los dominios intracelulares de las
cadepnas interaccionan con proteínas citoplasmáticas tales como cateninas y p120, que forman la base de la unión de cadepna al citoesqueleto de actina Las cadepnas tienen cinco dominios de unión a Ca2- extracelular y un dominio citoplasmático pequeño que está altamente conservado entre las cadennas clásicas Los miembros clásicos de la familia de cadepna incluyen P-cadepna, E-cadepna y N-cadepna Se considera que las moléculas de adhesión celular tales como las cadepnas desempeñan un papel significativo en las conexiones celulares de cáncer y células metastáticas (Furukawa, et al , Microscopy Res Technique 38 (4) 343-352 (1997)) La expresión de P-cadepna en tejidos adultos normales es baja y esta limitada principalmente a células mioepiteliales y a las capas básales de epitelio estratificado (Shimoyama, et al , Cáncer Res , 49 2128-2133 (1989)) La P-cadepna está regulada positivamente en enfermedades intestinales inflamatorias tales como enfermedad de Crohn y colitis (Hardy, et al , Gut 50 513-519 (2002)) Un gran cuerpo de evidencias revela ahora también que la expresión aberrante de P-cadepna está asociada a la proliferación celular y a tumores de colon, mama, pulmón, tiroides y cuello de la matriz (Gamallo, Modern Patholoqy, 14 650-654 (2001 ), y Stefansson, et al , J Clin Oncol 22(7) 1242-1252 (2004)) Se ha reseñado que la P-cadepna humana es el antígeno reconocido por el anticuerpo monoclonal NCC-CAD-299 creado contra un carcinoma epidermoide vulvar (Shimoyama, ef a/ , Cáncer Res , 49 2128-2133 (1989)) La modulación de la adhesión y señalización intracelular mediadas por P-cadepna se espera que dé como resultado una proliferación y supervivencia
reducidas de células tumorales in vivo En consecuencia, a la vista del papel clave que la P-cadepna parece poseer en la proliferación celular y la progresión de tumores sólidos, es deseable generar anticuerpos contra P-cadepna que puedan proporcionar un beneficio terapéutico a pacientes con una variedad de cánceres
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Es un aspecto de la presente invención un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antigeno del mismo en el que el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo tiene al menos una de las varias propiedades funcionales descritas a continuación de A) a K) A) Por ejemplo, en una modalidad, los anticuerpos o porciones de unión a antigeno de los mismos tienen una mayor afinidad de unión por P-cadepna (KD(P)) que por E-cadepna (KD(E)) En una modalidad, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la presente invención tienen una KQ(E)/KD(P) que es mayor o igual a 1 5 En una modalidad adicional, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la presente invención tienen una KD(E)/KD(P) que es mayor o igual a 2, mayor o igual a 3, mayor o igual a 5, mayor o igual a 10, mayor o igual a 20, mayor o igual a 50, mayor o igual a 100, mayor o igual a 200, mayor o igual a 500, mayor o igual a 1 000 Típicamente, no hay límite superior para el valor de KD(E)/KD(P) debido a que el valor de KD(E) puede ser muy pequeño,
tal como 0 Sin embargo, con fines prácticos, un limite superior de KD(E)/KD(P) puede ser 1 x 106 Dichos valores de KD tanto para P-cadepna como para E-cadepna pueden medirse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica tal como mediante ELISA, RÍA, citometría de flujo o resonancia de plasmón superficial tal como BIACORE™ B) En otra modalidad, el anticuerpo o porción del mismo se une a P-cadepna con una KD de 1 000 nM o menor, medida mediante resonancia de plasmón superficial En una modalidad adicional, el anticuerpo o porción se une a P-cadepna con una KD de menos de 500 nM, menos de 100 nM, menos de 50 nM, menos de 20 nM, menos de 10 nM, menos de 1 nM, menos de 500 pM o menos de 100 pM, medida mediante resonancia de plasmón superficial Típicamente, no hay limite inferior para el valor de KD Sin embargo, con fines prácticos, puede suponerse que el limite inferior es de aproximadamente 1 pM C) En otra modalidad, el anticuerpo o porción del mismo tiene una velocidad de disociación (k0«) para P-cadepna menor o igual a 0 01s 1 , medida mediante resonancia de plasmon superficial Por ejemplo, en ciertas modalidades, el anticuerpo o porción tiene una k0ff para P-cadepna menor de 0 005 s 1 , menor de 0 004 s 1 , menor de 0 003 s menor de 0 002 s 1 o menor de 0 001 s 1 Típicamente, no hay limite inferior para el valor de koff Sin embargo, con fines prácticos, puede suponerse que el límite inferior es de aproximadamente 1 x 10 7 s 1 D) En otra modalidad, el anticuerpo de P-cadepna o porción del
mismo tiene una CI50 de 100 nM o menos, medida mediante un ensayo de adhesión celular dependiente de P-cadepna En una modalidad adicional, dicha CI50 es menor de 50 nM, menor de 40 nM, menor de 20 nM, menor de 10 nM, menor de 1 nM, menor de 500 pM, menor de 200 pM, menor de 100 pM o menor de 10 pM, medida mediante un ensayo de adhesión celular dependiente de P-cadepna Típicamente, no hay limite inferior para el valor de CI50 medida mediante un ensayo de adhesión celular dependiente de P-cadepna Sin embargo, con fines prácticos, puede suponerse que el limite inferior es de aproximadamente 1 pM E) En otra modalidad, el anticuerpo de P-cadepna o porción del mismo tiene una Cl50 de 100 nM o menor, medida mediante un ensayo de agregación celular dependiente de P-cadepna En una modalidad adicional, dicha CI50 es menor de 50 nM, menor de 40 nM, menor de 20 nM, menor de 10 nM, menor de 1 nM, menor de 500 pM, menor de 200 pM, menor de 100 pM o menor de 1 pM, medida mediante un ensayo de agregación celular dependiente de P-cadepna Típicamente, no hay límite inferior para el valor de CI50 medida mediante un ensayo de agregación celular dependiente de P-cadepna Sin embargo, con fines prácticos, puede suponerse que el límite inferior es de aproximadamente 1 pM F) En otra modalidad, el anticuerpo de P-cadepna o porción del mismo aumenta la desestabilización de esferoide en un ensayo de desestabihzación de esferoide dependiente de P-cadepna por un factor de al menos 2, comparado con una muestra control sin IgG presente E n una
modalidad adicional, el anticuerpo de P-cadepna o porción del mismo aumenta la desestabilización de esferoide en un ensayo de desestabihzación de esferoide dependiente de P-cadepna por un factor de al menos 3, al menos 4, al menos 6, al menos 10 o al menos 15, comparado con una muestra control sin IgG presente G) En otra modalidad, el anticuerpo de P-cadepna o porción del mismo compite por la unión a P-cadepna con un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por 194-e06, 194-a02, 194-b09, 195-e1 1 , 194-g09, 196-h02, 194-e01 , 196-d10, 196-g03, 196-e06, 195-a09, 198-a09, 200-h06, g-194-b09, g-194-g09, g-196-g03, g-196-h02, g-194-e01 , gJ 94-e06, 129-1 c4 y g-129-1 c4 H) En otra modalidad, el anticuerpo de P-cadepna o porción del mismo compite de forma cruzada por la unión a P-cadepna con un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por 194-e06, 194-a02, 194-b09, 195-e1 1 , 194-g09, 196-h02, 194-e01 , 196-d10, 196-g03, 196-e06, 195-a09, 198-a09, 200-h06, g-194-b09, g-194-g09, g-196-g03, g-196-h02, g-194-e01 , g-194-e06, 129J-c4 y g-129-1 c4 I) En otra modalidad, el anticuerpo de P-cadepna o porción del mismo se une al mismo epitope de P-cadepna que un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por 194-e06, 194-a02, 194-b09, 195-e1 1 , 194-g09, 196-h02, 194-e01 , 196-d10, 196-g03, 196-e06, 195-a09, 198-a09, 200-h06, g-194-b09, gJ 94-g09, g-196-g03, gJ 96-h02, gJ 94-e01 , g-194-e06, 129J c y gJ 29J c4
J) En otra modalidad, el anticuerpo de P-cadepna o porción del mismo se une a P-cadepna sustanclalmente con la misma KD que un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por 194-e06, 194-a02, 194-b09, 195-e1 1 , 194-g09, 196-h02, 194-e01 , 196-d10, 196-g03, 196-e06, 195-a09, 198-a09, 200-h06, g-194-b09, g-194-g09, g-196-g03, g-196-h02, g-194-e01 , g-194-e06, 129-1 c4 y g-129-1 c4 K) En otra modalidad, el anticuerpo de P-cadepna o porción del mismo se une a P-cadepna sustanclalmente con la misma kof( que un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por 194-e06, 194-a02, 194-b09, 195-e1 1 , 194-g09, 196-h02, 194-e01 , 196-dl O, 196-g03, 196-e06, 195-a09, 198-a09, 200-h06, g-194-b09, g-194-g09, g-196-g03, g-196-h02, g-194-e01 , g-194-e06, 129-1 c4 y g-129-1 c4 Es un aspecto adicional de la presente invención un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo con al menos una de las propiedades funcionales descritas anteriormente en A) a K), que comprende un dominio VH que es al menos un 90% idéntico en la secuencia aminoacidica a una cualquiera de las SEC N° ID 1 a 13 y 320 a 325 En una modalidad, dicho dominio VH es al menos un 91 %, al menos un 93%, al menos un 95%, al menos un 97%, al menos un 99% o un 100% idéntico en la secuencia ammoacídica a una cualquiera de las SEC N° ID 1 a 12 y 320 a 325 En una modalidad adicional, el anticuerpo o porción del mismo tiene al menos una de las propiedades funcionales descritas anteriormente en A) a K), que comprende un dominio VH que es una cualquiera de las SEC N°
ID 1 a 13 y 320 a 325, o difiere de una cualquiera de las SEC N° ID 1 a 13 y 320 a 325 por tener al menos una sustitución ammoacídica conservativa Por ejemplo, el dominio VH puede diferir en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones aminoacídicas conservativas a partir de una cualquiera de las SEC N° ID 1 a 13 y 320 a 325 En una modalidad adicional, cualquiera de estas sustituciones aminoacidicas conservativas puede aparecer en las regiones CDR1 , CDR2 y/o CDR3 Es un aspecto adicional de la presente invención un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo con al menos una de las propiedades funcionales descritas anteriormente en A) a K), que comprende un dominio V que es al menos un 90% idéntico a la secuencia aminoacídica de una cualquiera de las SEC N° ID 14 a 23 y 326 a 331 En una modalidad, dicho dominio V es al menos un 91 %, al menos un 93%, al menos un 95%, al menos un 97%, al menos un 99% o un 100% idéntico en la secuencia aminoacídica a una cualquiera de las SEC N° ID 14 a 23 y 326 a 331 En una modalidad adicional, el anticuerpo o porción del mismo tiene al menos una de las propiedades funcionales descritas anteriormente en A) a K), y comprende un dominio VL que es una cualquiera de las SEC N° ID 14 a 23 y 326 a 331 , o difiere de una cualquiera de las SEC N° ID 14 a 23 y 326 a 331 por tener al menos una sustitución aminoacídica conservativa Por ejemplo, el dominio VL puede diferir en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones aminoacídicas conservativas a partir de una cualquiera de las SEC N° ID 14 a 23 y 326 a 331 En una modalidad adicional, cualquiera de
estas sustituciones aminoacidicas conservativas puede aparecer en las regiones CDR1 , CDR2 y/o CDR3 Es otro aspecto de la presente invención un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo con al menos una de las propiedades funcionales descritas anteriormente en A) a K), en el que los dominios V y VH son cada uno de ellos al menos un 90% idénticos en la secuencia aminoacídica a los dominios VL y VH, respectivamente, de uno cualquiera de los anticuerpos 194-e06, 194-a02, 194-b09, 195-e11 , 194-g09, 196-h02, 194-e01 , 196-d10, 196-g03, 196-e06, 195-a09, 198-a09, 200-h06, g-194-b09, g-194-g09, g-196-g03, g-196-h02, g-194-e01 , g-194-e06, 129-1c4 y g-129-1 c4 Por ejemplo, los dominios VL y VH son cada uno al menos un 91 %, 93%, 95%, 97%, 99% ó 100% idénticos en las secuencias aminoacidicas a los dominios VL y VH, respectivamente, de uno cualquiera de los anticuerpos 194-e06, 194-a02, 194-b09, 195-e1 1 , 194-g09, 196-h02, 194-e01 , 196-d10, 196-g03, 196-e06, 195-a09, 198-a09, 200-h06, g-194-b09, g-194-g09, g-196-g03, g-196-h02, g-194-e01 , g-194-e06, 129-1 c4 y g-129-1 c4 Es otro aspecto de la presente invención un anticuerpo o porción de unión a antigeno del mismo que se selecciona del grupo constituido por a) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 1 y un dominio V como se indica en la SEC N° ID 14, b) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 2 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 14, c) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se
indica en la SEC N° ID 2 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 15, d) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 3 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 16, e) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 4 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 17, f) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 4 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 23, g) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 5 y un dominio V como se indica en la SEC N° ID 18, h) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 6 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 23, i) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 7 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 23, j) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 8 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 23, k) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 9 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 23, I) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 10 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 19, m) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio V como se indica en la SEC N° ID 1 1 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 20, n) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 12 y un dominio V como se indica en la SEC N° ID 21 ,
o) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 13 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 22, p) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 320 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 326, q) un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 321 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 327, r) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 322 y un dominio V como se indica en la SEC N° ID 328, s) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 323 y un dominio V como se indica en la SEC N° ID 329, t) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 324 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 330 y u) un anticuerpo o porción del mismo que comprende un dominio VH como se indica en la SEC N° ID 325 y un dominio VL como se indica en la SEC N° ID 331 En una modalidad adicional, para cualquiera de los anticuerpos o porciones del mismo descritos anteriormente en los grupos a) a u), los dominios VH y/o VL pueden diferir de las SEC N° ID indicadas en la presente memoria en al menos una sustitución aminoacídica conservativa Por ejemplo, los dominios VH y/o VL pueden diferir de las SEC N° ID citadas en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones aminoacídicas conservativas En una modalidad adicional, cualquiera de estas sustituciones aminoacídicas conservativas puede aparecer en las regiones CDR1 , CDR2 y/o CDR3
En otra modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo o porción de unión a antigeno del mismo con al menos una de las propiedades funcionales descritas anteriormente en A) a K), que comprende un dominio VH que se selecciona independientemente de una cualquiera de las SEC N° ID 1 a 13 y 320 a 325, o una secuencia que difiere de una cualquiera de las SEC N° ID 1 a 13 y 320 a 325 en al menos una sustitución aminoacídica conservativa, y que comprende adicionalmente un dominio VL que se selecciona independientemente de una cualquiera de las SEC N° ID 14 a 23 y 326 a 331 , o una secuencia que difiere de una cualquiera de las SEC N° ID 14 a 23 y 326 a 331 en al menos una sustitución aminoacídica conservativa Por ejemplo, los dominios V y VL pueden diferir independientemente cada uno de una cualquiera de las SEC N° ID 1 a 1 3, 320 a 325, 14 a 23 y 326 a 331 en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones aminoacídicas conservativas En una modalidad adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo con al menos una de las propiedades funcionales descritas anteriormente en A) a K), en la que dicho anticuerpo o porción comprende una CDR3 de VH seleccionada de una cualquiera de las SEC N° ID 26 a 37 y 91 a 256, o una secuencia que difiere de una cualquiera de las SEC N° ID 26 a 37 y 91 a 256 en al menos una sustitución aminoacidica conservativa Por ejemplo, la CDR3 de VH puede diferir de una cualquiera de las SEC N° ID 26 a 37 y 91 a 256 en 1 , 2, 3 ó 4 sustituciones aminoacidicas conservativas
En una modalidad adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo con al menos una de las propiedades funcionales descritas anteriormente en A) a K), en la que dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno comprende una CDR3 de VL seleccionada de una cualquiera de las SEC N° ID 40 a 47 y 257 a 319, o una secuencia que difiere de una cualquiera de las SEC N° ID 40 a 47 y 257 a 319 en al menos una sustitución aminoacídica conservativa Por ejemplo, la CDR3 de VL puede diferir de una cualquiera de las SEC N° ID 40 a 47 y 257 a 319 en 1 , 2, 3, 4 ó 5 sustituciones aminoacídicas conservativas En una modalidad adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo en la que dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno comprende una CDR1 de VH como se indica en la SEC N° ID 24, o una secuencia que difiere de la SEC N° ID 24 en al menos una sustitución aminoacidica conservativa, una CDR2 de VH como se indica en la SEC N° ID 25 o una secuencia que difiere de la SEC N° ID 25 en al menos una sustitución aminoacídica conservativa, una CDR3 de VH que se selecciona independientemente de una cualquiera de las SEC N° ID 26 a 37 y 91 a 256, o una secuencia que difiere de una cualquiera de las SEC N° ID 26 a 37 y 91 a 256 en al menos una sustitución aminoacidica conservativa Por ejemplo, las secuencias CDR1 , CDR2 y CDR3 de VH citadas anteriormente pueden diferir cada una independientemente de las SEC N° ID citadas respectivas en 1 , 2, 3, 4 ó 5 sustituciones aminoacídicas conservativas
En otra modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo en la que dicho anticuerpo o porción de unión a antigeno comprende una CDR1 de V como se indica en la SEC N° ID 38, o una secuencia que difiere de la SEC N° ID 38 en al menos una sustitución aminoacidica conservativa, una CDR2 de VL como se indica en la SEC N° ID 39 o una secuencia que difiere de la SEC N° ID 39 en al menos una sustitución aminoacidica conservativa, una CDR3 de V que se selecciona independientemente de una cualquiera de las SEC N° ID 40 a 47 y 257 a 319, o una secuencia que difiere de una cualquiera de las SEC N° ID 40 a 47 y 257 a 319 en al menos una sustitución aminoacídica conservativa Por ejemplo, las secuencias CDR1 , CDR2 y CDR3 de VL citadas anteriormente pueden diferir cada una independientemente de las SEC N° ID citadas respectivas en 1 , 2, 3, 4 ó 5 sustituciones aminoacidicas conservativas La presente invención proporciona adicionalmente un anticuerpo o porción de unión a antigeno del mismo en el que dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno comprende una CDR1 de VH como se indica en la SEC N° ID 24, una CDR2 de VH como se indica en la SEC N° ID 25, una CDR3 de VH seleccionada de una cualquiera de las SEC N° ID 26 a 37 y 91 a 256, una CDR1 de VL como se indica en la SEC N° ID 38, una CDR2 de VL como se indica en la SEC N° ID 39 y una CDR3 de V seleccionada de una cualquiera de las SEC N° ID 40 a 47 y 257 a 319 En una modalidad adicional, las secuencias CDR1 , CDR2 y CDR3 de VH y VL citadas pueden diferir
independientemente también cada una de las SEC N° ID especificas indicadas anteriormente en al menos una sustitución aminoacidica conservativa Por ejemplo, las secuencias CDR1 , CDR2 y CDR3 pueden diferir cada una independientemente en 1 , 2, 3, 4 ó 5 sustituciones aminoacidicas conservativas de las SEC N° ID específicas respectivas indicadas anteriormente La presente invención proporciona adicionalmente un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo en el que dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno comprende las CDR1 de VH y V , las CDR2 de VH y VL y las CDR3 de VH y VL como se encuentran en cualquiera de los anticuerpos 194-e06, 194-a02, 194-b09, 195-e1 1 , 194-g09, 196-h02, 194-e01 , 196-d10, 196-g03, 196-e06, 195-a09, 198-a09, 200-h06, g-194-b09, g-194-g09, g-196-g03, g-196-h02, g-194-e01 , g-194-e06, 129JC4 y g-129-1c4 La presente invención proporciona adicionalmente un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio VH seleccionado de una cualquiera de las SEC N° ID 1 a 13 y 320 a 325, o que difiere de una cualquiera de las SEC N° ID 1 a 13 y 320 a 325 en 1 a 10 sustituciones aminoacidicas conservativas La presente invención proporciona adicionalmente un anticuerpo o porción de unión a antigeno del mismo que comprende un dominio V seleccionado de una cualquiera de las SEC N° ID 14 a 23 y 326 a 331 , o que difiere de una cualquiera de las SEC N° ID 14 a 23 y 326 a 331 en 1 a 10 sustituciones aminoacídicas conservativas
La presente invención proporciona adicionalmente un anticuerpo o porción de unión a antigeno del mismo que comprende un dominio VH que se selecciona independientemente de una cualquiera de las SEC N° ID 1 a 13 y 320 a 325, o una secuencia que difiere de una cualquiera de las SEC N° ID 1 a 13 y 320 a 325 en 1 a 10 sustituciones aminoacídicas conservativas, y que comprende adicionalmente un dominio VL que se selecciona independientemente de una cualquiera de las SEC N° ID 14 a 23 y 326 a 331 , o una secuencia que difiere de una cualquiera de las SEC N° ID 14 a 23 y 326 a 331 en 1 a 10 sustituciones aminoacídicas conservativas La presente invención proporciona adicionalmente un anticuerpo o porción de unión a antigeno del mismo en el que dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno comprende una CDR1 de V como se indica en la SEC N° ID 24 o una secuencia que difiere de la SEC N° ID 24 en 1 a 4 sustituciones aminoacídicas conservativas, una CDR2 de VH como se indica en la SEC N° ID 25 o una secuencia que difiere de la SEC N° ID 25 en 1 a 4 sustituciones aminoacídicas conservativas, y una CDR3 de VH que se selecciona de una cualquiera de las SEC N° ID 26 a 37 y 91 a 256 o una secuencia que difiere de una cualquiera de las SEC N° ID 26 a 37 y 91 a 256 en 1 a 4 sustituciones aminoacídicas conservativas La presente invención proporciona adicionalmente un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo en el que dicho anticuerpo o porción de unión a antigeno comprende una CDR1 de VL como se indica en la SEC N° ID 38 o una secuencia que difiere de la SEC N° ID 38 en 1 a 4
sustituciones aminoacidicas conservativas, una CDR2 de V como se indica en la SEC N° ID 39 o una secuencia que difiere de la SEC N° ID 39 en 1 a 4 sustituciones aminoacidicas conservativas, y una CDR3 de VL que se selecciona de una cualquiera de las SEC N° ID 40 a 47 y 257 a 319 o una secuencia que difiere de una cualquiera de las SEC N° ID 40 a 47 y 257 a 319 en 1 a 4 sustituciones aminoacidicas conservativas La presente invención proporciona adicionalmente un anticuerpo o porción de unión a antigeno del mismo con al menos una de las propiedades funcionales descritas anteriormente en A) a K), en el que dicho anticuerpo o porción de unión a antigeno comprende una FR1 de VH como se indica en la SEC N° ID 48, una FR2 de VH como se indica en la SEC N° ID 49, una FR3 de VH seleccionada de una cualquiera de las SEC N° ID 50 a 55, una FR4 de V seleccionada de una cualquiera de las SEC N° ID 56 y 57, una FR1 de V seleccionada de una cualquiera de las SEC N° ID 58 y 59, una FR2 de VL seleccionada de una cualquiera de las SEC N° ID 60 a 62, una FR3 de V seleccionada de una cualquiera de las SEC N° ID 63 a 66 y una FR4 de VL como se indica en la SEC N° ID 67 En una modalidad adicional, las secuencias FR1 , FR2, FR3 y FR4 de VH y V citadas pueden diferir también independientemente cada una de las SEC N° ID específicas indicadas anteriormente en al menos una sustitución aminoacídica conservativa Por ejemplo, las secuencias FR1 , FR2, FR3 y FR4 pueden diferir cada una independientemente en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones ammoacidicas conservativas de las respectivas SEC N° ID especificas
indicadas anteriormente En una modalidad adicional mas, cualquiera de las secuencias FR1 , FR2, FR3 y FR4 puede mutarse cada una independientemente para equipararse con la secuencia marco conservada de linea germinal respectiva Es una modalidad adicional de la presente invención cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente memoria en la que el anticuerpo es una molécula de IgG, IgM, IgE, IgA o IgD, o deriva de las mismas Por ejemplo, el anticuerpo puede ser una IgG-i o lgG2 Por ejemplo, en una modalidad IgG es IgGi en la que la región constante de cadena pesada comprende la SEC N° ID 344 y en la que la región constante de cadena ligera comprende la SEC N° ID 345, con la condición de que el residuo de lisina C-terminal de la SEC N° ID 344 está opcionalmente escindido Otra modalidad proporciona cualquiera de los anticuerpos o porciones de unión a antigeno descritos anteriormente, que es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento Fv monocatenapo, un fragmento VH monocatenapo, un fragmento V monocatenapo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo biespecífico
Es una modalidad adicional un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo depvatizado que comprende cualquiera de los anticuerpos o porciones de los mismos descritos en la presente memoria y al menos una entidad molecular adicional Por ejemplo, la al menos una entidad molecular adicional puede ser otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o diacuerpo), un agente de detección, un mareaje, un agente citotóxico, un
agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que puede mediar la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región núcleo de estreptavidina o un marcador de pohhistidina) Por ejemplo, los agentes de detección útiles con los que puede depvatizarse un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la invención incluyen compuestos fluorescentes, incluyendo fluoresceína, fluoresceina isotiocianato, rodamina, cloruro de 5-d?met?lam?no-1-naftalenosulfon?lo, ficoeptpna, fosforolantánidos y similares Un anticuerpo puede marcarse también con enzimas que son útiles para la detección tales como peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares En una modalidad adicional, los anticuerpos o porciones de los mismos de la presente invención pueden marcarse también con biotma o con un epítope po peptidico predeterminado reconocido por un informador secundario (por ejemplo, secuencias de par cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, marcadores epitópicos) En una modalidad adicional más de la presente invención, puede depvatizarse también cualquiera de los anticuerpos o porciones de los mismos con un grupo químico tal como pohetileng col (PEG), un grupo metilo o etilo o un grupo carbohidrato En algunas modalidades, los anticuerpos de P-cadepna o porciones de unión a antigeno dados a conocer en la presente memoria están unidos a un soporte sólido En algunas modalidades, la lisma C-terminal de la cadena
pesada de cualquiera de los anticuerpos de P-cadepna de la invención está escindida En diversas modalidades de la invención, las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de P-cadepna pueden incluir opcionalmente una secuencia señal N-terminal Por ejemplo, la secuencia señal de cadena pesada puede ser la SEC N° ID 346, y la secuencia señal de cadena ligera puede ser la SEC N° ID 347 En una modalidad adicional, la presente invención se refiere a cualquiera de los anticuerpos o porciones de unión a antigeno de los mismos como se describen en la presente memoria, en la que los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos son de origen humano La presente invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos o porciones de unión a antigeno de los mismos como se describen anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable En otra modalidad, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica cualquiera de los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos como se describen en la presente memoria Es una modalidad particular una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica como se indica en una cualquiera de las SEC N° ID 68 a 90 y 332 a 343 La invención se refiere adicionalmente a un vector que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria, en el que el vector comprende opcionalmente una
secuencia de control de la expresión ligada operativamente a la molécula de ácido nucleico Otra modalidad proporciona una célula huésped que comprende uno cualquiera de los vectores descritos en la presente memoria o que comprende una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria La presente invención proporciona también una línea celular aislada que produce cualquiera de los anticuerpos o porciones de unión a antígeno como se describen en la presente memoria, o que produce la cadena pesada o la cadena ligera de cualquiera de dichos anticuerpos o dichas porciones de unión a antigeno En otra modalidad, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende cultivar cualquiera de las células huésped o líneas celulares descritas en la presente memoria en condiciones adecuadas y recuperar dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno La presente invención se refiere también a un animal transgénico no humano o planta transgénica que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria, en el que el animal transgénico no humano o planta transgénica expresa dicho ácido nucleico La presente invención proporciona adicionalmente un procedimiento para aislar un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une a P-cadepna, que comprende la etapa de aislamiento del anticuerpo a partir del animal transgénico no humano o planta transgenica
como se describe en la presente memoria La presente invención proporciona también un procedimiento para tratar crecimiento celular anormal en un mamífero necesitado de ello, que comprende la etapa de administrar a dicho mamífero cualquiera de los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, o cualquiera de las composiciones farmacéuticas, como se describen en la presente memoria La presente invención proporciona adicionalmente un procedimiento para tratar crecimiento celular anormal en un mamífero necesitado de ello con un anticuerpo o porción de unión a antigeno del mismo que se une a P-cadepna, que comprende las etapas de administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria en condiciones adecuadas para permitir la expresión de dichas moléculas de ácido nucleico En otra modalidad, el procedimiento de tratar crecimiento celular anormal comprende adicionalmente administrar una cantidad de una o más sustancias seleccionadas de agentes antitumorales, agentes antiangiogénesis, inhibidores de la transducción de señal y agentes antipro ferativos, siendo dichas cantidades eficaces conjuntamente para tratar dicho crecimiento celular anormal En modalidades particulares, dicho crecimiento celular anormal es canceroso La presente invención proporciona adicionalmente un procedimiento para reducir la agregación celular dependiente de P-cadepna que comprende poner en contacto las células con cualquiera de los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos descritos en la
presente memoria, o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria Es otro aspecto de la presente invención un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que comprende una secuencia aminoacídica de región variable de cadena pesada que utiliza un gen de la familia VH-3 humana En una modalidad, por ejemplo, el gen de la familia VH-3 humana es
VH-3-23 Otro aspecto de la presente invención proporciona cualquiera de los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos como se describen en la presente memoria, siendo dicho anticuerpo o porción de unión a antigeno un anticuerpo humano En un aspecto adicional, dicho anticuerpo o porción de unión a antigeno es un anticuerpo recombinante humano La invención proporciona también un procedimiento para producir un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antigeno del mismo, que comprende las etapas de sintetizar una biblioteca de anticuerpos humanos en fago, examinar la biblioteca con P-cadepna o una porción antigénica de la misma, aislar el fago que se une a P-cadepna y obtener el anticuerpo a partir del fago
Definiciones y técnicas generales A menos que se defina otra cosa en la presente memoria, los términos científicos y técnicos utilizados con respecto a la presente invención deberán tener los significados que se entienden habitualmente por los
expertos en la técnica Además, a menos que se requiera otra cosa por el contexto, los términos singulares deberán incluir pluralidades y los términos plurales deberán incluir los singulares Generalmente, la nomenclatura utilizada con respecto a, y técnicas de, cultivo celular y de tejido, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en la presente memoria es la bien conocida y utilizada habitualmente en la técnica Los procedimientos y técnicas de la presente invención se realizan generalmente según procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en diversas referencias generales y más especificas que se citan y se discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indica otra cosa Véanse, por ejemplo, Sambrook ef al , "Molecular Cloning A Laboratory Manual", 3a ed , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2000), Ausubel, ef al , "Short Protocols m Molecular Biology A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, John & Sons , Ine (2002), Harlow y Lañe, "Using Antibodies A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998), y Coligan, et al , "Short Protocols in Protein Science", Wiley, John & Sons, Ine (2003), cuyas descripciones se incorporan a la presente memoria como referencia Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante, como se efectúa habitualmente en la técnica o como se describe en la presente memoria La nomenclatura utilizada con
respecto a, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritos en la presente memoria es aquella bien conocida y utilizada habitualmente en la técnica Se utilizan técnicas estándar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación, suministro farmacéuticos y tratamiento de pacientes La unidad estructural básica del anticuerpo es conocida por comprender un tetrámero Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada para una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa) La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 120 o más aminoácidos responsable principalmente del reconocimiento de antigeno La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora Las cadenas ligeras humanas se clasifican en cadenas ligeras kappa y lambda Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente En las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 3 o más aminoácidos Véase, en general "Fundamental Immunology", cap 7 (Paul, W , Ed , 2a ed , Raven Press, NY ( 1 989)) (incorporada a la presente memoria como referencia en su totalidad con
cualquier fin) Las regiones variables de cada par cadena pesada/ligera (VH y VL) forman el sitio de unión de anticuerpo Por tanto, un anticuerpo IgG intacto tiene, por ejemplo, dos sitios de unión Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecificos, los dos sitios de unión son iguales Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras exhiben la misma estructura general de regiones marco conservadas relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervapables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR El termino ' variable" designa el hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en la secuencia entre anticuerpos, y se utilizan en la unión a y la especificidad por su antigeno particular de cada anticuerpo particular Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a lo largo de los dominios variables de anticuerpos, sino que se concentra en las CDR, que están separadas por las FR más altamente conservadas Las CDR de las dos cadenas de cada par están alineadas por las FR, posibilitando la unión a un epitope especifico Desde el extremo N-terminal al C-terminal, ambas cadenas ligera y pesada comprenden los dominios FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 La asignación de aminoácidos a cada dominio esta de acuerdo con las definiciones de "Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest" (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 y 1991 )) o Chothia y Lesk, J , Mol Biol , 196 901 -917 (1987), Chothia et al , Nature 342 878-883 (1989), cuyas descripciones se incorporan a la presente memoria como referencia
Los siguientes términos, a menos que se indique otra cosa, debe entenderse que tienen los siguientes significados: A menos que se indique específicamente otra cosa, el término "P-caderina" designa P-caderina humana, que es una proteína de membrana integral y un miembro de la familia de caderina clásica de glicoproteinas transmembrana que regulan la adhesión célula-célula. Se han reseñado la clonación y secuenciación de la P-caderina humana, por ejemplo, en Shimoyama ef al , J. Cell. Biol., 109 (4 Pt. 1), 1787-1794 (1989), cuya descripción se incorpora a la presente memoria como referencia. El término P-caderina se pretende que incluya P-caderina humana recombinante y formas quiméricas recombinantes de P-caderina, que pueden prepararse mediante procedimientos de expresión recombinante estándar o adquirirse comercialmente (R&D Systems 861-PC-100). A menos que se indique específicamente otra cosa, como se utiliza en la presente memoria el término "E-caderina" designa E-caderina humana, que es una proteína de membrana integral y un miembro de la familia de caderina clásica de glicoproteinas de transmembrana que regulan la adhesión célula-célula. La E-caderina se describe, por ejemplo, en Takeichi, Science, 251 : 1451-1455 (1991), cuya descripción se incorpora a la presente memoria como referencia. El término E-caderina se pretende que incluya E-caderina humana recombinante y formas quiméricas recombinantes de E-caderina, que pueden prepararse mediante procedimientos de expresión recombinante estándar o adquirirse comercialmente (R&D 648-EC-100).
El término "polipeptido" abarca proteínas nativas o artificiales, fragmentos de proteína y análogos po peptidicos de una secuencia proteica Un polipéptido puede ser monomepco o polimérico El término "protema aislada", "po péptido aislado" o "anticuerpo aislado" es una proteína, polipeptido o anticuerpo que en virtud de su origen o fuente de derivación (1 ) no esta asociado a los componentes asociados naturalmente que lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente o (4) no aparece en la naturaleza Por tanto, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula de la que se origina naturalmente estará "aislado" de sus componentes asociados naturalmente Una proteína puede volverse también sustanclalmente libre de componentes asociados naturalmente mediante aislamiento, utilizando técnicas de purificación de proteína bien conocidas en la técnica Los ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo de P-cadepna que se ha purificado por afinidad utilizando P-cadepna y un anticuerpo de P-cadepna que se ha sintetizado mediante una línea celular m vitro Una protema o po péptido es "sustanclalmente puro",
"sustanclalmente homogéneo" o "sustanclalmente purificado" cuando al menos aproximadamente 60 a 75% de una muestra exhibe una sola especie de polipéptido El po peptido o proteina puede ser monomérico o multimérico
Un polipéptido o proteina sustanclalmente puro puede comprender típicamente aproximadamente un 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% p/p de una muestra de proteína, más habitualmente aproximadamente un 95%, y preferiblemente puede ser más de un 99% puro La pureza u homogeneidad de la proteína puede indicarse mediante una serie de medios bien conocidos en la técnica tales como electroforesis en gel de poliacplamida de una muestra de proteína, seguido de visualización de una banda polipeptídica única tras tinción del gel con un tinte bien conocido en la técnica Para ciertos fines, puede proporcionarse una resolución mayor utilizando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica para purificación El termino "fragmento pohpeptídico", como se utiliza en la presente memoria, designa un po péptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero en el que la secuencia aminoacídica restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural En algunas modalidades, los fragmentos son de al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud En otras modalidades, los fragmentos son de al menos 14, al menos 20, al menos 50 o al menos 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud El término "análogo" o "análogo polipeptídico", como se utiliza en la presente memoria, designa un pohpéptido que comprende un segmento que tiene identidad sustancial con algunas secuencias aminoacídicas de referencia y que tiene sustanclalmente la misma función o actividad que la secuencia aminoacidica de referencia Típicamente, los análogos
polipeptídicos comprenden una sustitución ammoacídica conservativa (o inserción o deleción) con respecto a la secuencia de referencia Los análogos pueden ser de al menos 20 o 25 aminoácidos de longitud, o pueden ser de al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoácidos de longitud o más, y a menudo pueden ser tan largos como el polipéptido completo Algunas modalidades de la invención incluyen fragmentos pohpeptídicos o anticuerpos análogos polipeptidicos con 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16 ó 17 sustituciones de la secuencia aminoacídica de linea germinal Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de mmunoglobulina pueden prepararse fácilmente por los expertos en la técnica siguiendo las enseñanzas de esta memoria descriptiva En ciertas modalidades, las sustituciones aminoacídicas de un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antigeno del mismo son aquellas que (1 ) reducen la susceptibilidad a la proteó sis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos, pero siguen reteniendo la unión especifica a P-cadepna Los análogos pueden incluir diversas sustituciones a la secuencia peptídica que aparece normalmente Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones aminoacídicas únicas o múltiples, preferiblemente sustituciones aminoacídicas conservativas, en la secuencia que aparece normalmente, por ejemplo en la porción del polipéptido fuera del(de los) dom?n?o(s) que forma(n) los contactos intermoleculares Pueden
hacerse también sustituciones aminoacídicas en el(los) dom?n?o(s) que forma(n) los contactos intermoleculares que pueden mejorar la actividad del po péptido Una sustitución aminoacidica conservativa no debería cambiar sustanclalmente las características estructurales de la secuencia original por ejemplo, una sustitución aminoacídica no debería alterar la lámina ß antiparalela que constituye el dominio de unión de inmunoglobulina que aparece en la secuencia original, o desestabihzar otros tipos de estructura secundaria que caracterizan la secuencia original En general, la glicina y la pro na no se usarían en una lámina ß antiparalela Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias pohpeptídicas reconocidas en la técnica en "Proteins, Structures and Molecular Principies", (Creighton, Ed , W H Freeman and Company, Nueva York (1984)), "Introduction to Protein Structure" (C Branden y J Tooze, eds , Garland Publishing, Nueva York, NY, (1991 )), y Thornton ef al , Nature, 354 105 (1991 ), incorporados a la presente memoria como referencia Como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo" es sinónimo de inmunoglobu na y ha de entenderse como es conocido habitualmente en la técnica En particular, el término anticuerpo no está limitado a ningún procedimiento particular de producción de anticuerpo Por ejemplo, el término anticuerpo incluye, sin limitación, anticuerpos recombinantes, anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales El termino "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo") como se utiliza en la presente memoria,
designa uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antigeno (por ejemplo, P-cadepna) Se ha mostrado que la función de unión a antigeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo completo Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados en el termino "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente constituido por los dominios VL VH, C y CH1 , (??) un fragmento F(ab')2, un fragmento divalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región de bisagra, (ni) un fragmento Fd constituido por los dominios VH y CH 1 , (IV) un fragmento Fv constituido por los dominios V y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward ef al , Nature, (1989) 341 544-546), que consiste en un dominio VH, y (vi) una región determinante de la complementapedad (CDR) aislada Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse utilizando procedimientos recombinantes mediante un engarce sintético que posibilita prepararlos en forma de una cadena proteica única en la que las regiones V y VH se aparean formando moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenapo (scFV)), véanse, por ejemplo, Bird ef al , Science (1988) 242 423-426 y Huston ef al , Proc Nati Acad Sci USA, 85 5879-5883 (1988)) Dichos anticuerpos monocatenapos se pretende también que estén abarcados en el termino "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo Otras formas de anticuerpos monocatenapos, tales como diacuerpos, están también abarcadas Los diacuerpos son
anticuerpos divalentes biespecificos en los que los dominios VH y VL se expresan en una cadena po peptídica única, pero utilizando un engarce que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena, forzando asi a los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (véanse, por ejemplo, Holliger ef al , Proc Nati Acad Sci USA, 90 6444-6448 ( 1993), Poljak, ef al , Structure 2 1 121-1 123 (1994)) Es más, un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede ser parte de moléculas de inmunoadhesión mayores, formadas mediante asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos Los ejemplos de dichas moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región núcleo de estreptavidina para preparar una molécula de scFv tetramépca (Kippyanov, ef al , "Human Antibodies and Hybpdomas", 6 93-101 (1995)) y el uso de un resto de cisteina, un péptido marcador y un mareaje de polihistidina C-terminal para preparar moléculas de scFv divalentes y biotiniladas (Kippyanov, ef al , Mol Immunol , 31 1047-1058 (1994)) Otros ejemplos incluyen cuando una o más CDR de un anticuerpo se incorporan a una molécula covalente o no covalentemente para convertirla en una inmunoadhesina que se une específicamente a un antígeno de interés tal como P-cadepna En dichas modalidades, las CDR pueden incorporarse como parte de una cadena polipeptídica mayor, pueden ligarse covalentemente a otra cadena polipeptídica o pueden incorporarse no covalentemente Las porciones de
anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, pueden prepararse a partir de anticuerpos completos utilizando técnicas convencionales tales como digestión con papaina o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos Además, los anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión pueden obtenerse utilizando técnicas de ADN recombmante estándar, como se describen en la presente memoria Cuando se designa un "anticuerpo" en la presente memoria con respecto a la presente invención, debe entenderse que puede utilizarse también una porción de unión a antígeno del mismo Una porción de unión a antígeno compite con el anticuerpo intacto por la unión específica Véase, en general, "Fundamental Immunology'J cap 7 (Paul, W , 2a ed , Raven Press, NY (1989)) (incorporado como referencia en su totalidad con cualquier fin) Las porciones de unión a antigeno pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos En algunas modalidades, las porciones de unión a antígeno incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb y fragmentos de región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenapos (scFV), anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de un anticuerpo que es suficiente para conferir unión a antigeno específica al pohpéptido En modalidades que tienen uno o más sitios de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes Como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo humano" significa cualquier anticuerpo en el que las secuencias de dominio
variable y constante son secuencias humanas El término abarca anticuerpos con secuencias derivadas de genes humanos pero que se han cambiado, por ejemplo para reducir la posible inmunogenicidad, aumentar la afinidad, eliminar cisternas que podrían causar plegamiento indeseable, etc El término abarca también aquellos anticuerpos producidos recombinantemente en células no humanas que podrían conferir g cosilación no típica de células humanas Estos anticuerpos pueden prepararse de una variedad de modos, como se describe a continuación El término "anticuerpo quimérico", como se utiliza en la presente memoria, significa un anticuerpo que comprende regiones de dos o más anticuerpos diferentes, incluyendo anticuerpos de especies diferentes Por ejemplo, una o más de las CDR de un anticuerpo quimérico pueden derivar de un anticuerpo de P-cadepna humano En un ejemplo, las CDR de un anticuerpo humano pueden combinarse con CDR de un anticuerpo no humano tales como de ratón o rata En otro ejemplo, todas las CDR pueden derivar de anticuerpos de P-cadepna humana En otro ejemplo, las CDR de más de un anticuerpo de P-cadepna humana pueden combinarse en un anticuerpo quimérico Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo de P-cadepna humana, una CDR2 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo de P-cadepna humana y una CDR3 de la cadena ligera de un tercer anticuerpo de P-cadepna humana, y las CDR de la cadena pesada pueden derivar de uno o más anticuerpos de P-cadepna distintos Además, las regiones marco
conservadas pueden derivar de uno de los anticuerpos de P-cadepna de los que se toman una o más de las CDR, o de uno o más anticuerpos humanos diferentes Además, el término "anticuerpo quimérico" se pretende que abarque cualquiera de las combinaciones anteriormente citadas en las que las combinaciones implicaban anticuerpos humanos y no humanos Como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo humanizado" designa anticuerpos de origen no humano en los que los restos ammoacídicos que son característicos de secuencias de anticuerpo de la especie no humana se reemplazan por restos encontrados en las posiciones correspondientes de anticuerpos humanos Este proceso de "humanización" se cree que reduce la inmunogenicidad en seres humanos del anticuerpo resultante Se apreciará que los anticuerpos de origen no humano pueden humanizase utilizando técnicas bien conocidas en la técnica Véase, por ejemplo, Winter ef a/ , Immunol Today, 14 43-46 (1993) El anticuerpo de interés puede prepararse por ingeniería genética mediante técnicas de ADN recombinante para sustituir los dominios CH1 , CH2, CH3, de bisagra y/o el dominio marco conservado por la correspondiente secuencia humana Véanse, por ejemplo, el documento WO 92/02190 y las patentes de EE UU n° 5,530,101 , 5,585,089, 5,693,761 , 5,693,792, 5,714,350 y 5,777,085) El término "anticuerpo humanizado", como se utiliza en la presente memoria, incluye en su significado anticuerpos humanos quiméricos y anticuerpos injertados en CDR Los anticuerpos humanos quiméricos de la invención incluyen los dominios VH y VL de un anticuerpo de una especie no humana y
los dominios CH y CL de un anticuerpo humano Los anticuerpos transplantados en CDR de la invención son el resultado del reemplazo por CDR de VH y VL de un anticuerpo humano de las de VH y V , respectivamente, de un anticuerpo de un animal distinto de un ser humano Como se utiliza en la presente memoria, el término "ELISA" designa un ensayo de inmunosorción ligado a enzima Este ensayo es bien conocido por los expertos en la técnica Pueden encontrarse ejemplos de este ensayo en Vaughan, T J , ef al , Nat Biotech , 14 309-314 (1996), asi como en el ejemplo 7 de la presente solicitud El término "resonancia de plasmón superficial", como se utiliza en la presente memoria, designa un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteína en una matriz biosensora, por ejemplo, utilizando el sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N J ) Para descripciones adicionales, véanse Jonsson ef a/ , Ann Biol Clin , 51 19-26 (1993), Jonsson et al , Biotechniques, 1 1 620-627 (1991 ), Jonsson et al , J Mol Recoqnit , 8 125-131 (1995), y Johnsson, ef al , Anal Biochem , 198 268-277 (1991 ) El término "KD" designa la constante de equilibrio de afinidad de unión de una interacción anticuerpo-antígeno particular Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la KD es = 1 mM, preferiblemente = 100 nM y lo más preferiblemente = 10 nM Puede medirse una constante de afinidad de unión KD mediante resonancia de plasmón
superficial, por ejemplo utilizando el sistema BIACORE ™ como se discute en el ejemplo 6 El término "k0«" designa la constante de la velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular Puede medirse una constante de velocidad de disociación Kotf mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo utilizando el sistema BIACORE™ como se discute en el ejemplo 6 Como se utiliza en la presente memoria, el término "ensayo de adhesión celular dependiente de P-cadepna" designa un ensayo utilizado para medir la capacidad de un anticuerpo de P-cadepna de bloquear la adhesión de células a un receptor de P-cadepna que se ha inmovilizado sobre un soporte sólido Este tipo de ensayo puede llevarse a cabo, por ejemplo, inmovilizando P-cadepna sobre un soporte sólido tal como plástico Se permite entonces a las células que sobreexpresan P-cadepna adherirse al soporte sólido mediante interacciones P-cadepna-P-cadepna El nivel de adhesión puede cuantificarse después con y sin un anticuerpo de P-cadepna La adhesión en función de la concentración de anticuerpo puede utilizarse entonces para determinar el valor de Cl50 El ejemplo 3 proporciona detalles adicionales de un ensayo de adhesión celular dependiente de P-cadepna que se utilizó para medir los valores de Cl50 para anticuerpos de P-cadepna Como se utiliza en la presente memoria, el término "ensayo de agregación celular dependiente de P-cadepna" designa un ensayo para medir la capacidad de un anticuerpo de P-cadepna de bloquear la agregación de
células que expresan P-cadepna sobre sus superficies Por ejemplo, este tipo de ensayo puede utilizar una linea celular que sobreexpresa P-cadepna en la que las células se disponen en suspensión y se permite que formen agregados dependientes de P-cadepna Se utiliza entonces el ensayo de agregación para cuantificar la capacidad de un anticuerpo de P-cadepna para evitar esta agregación midiendo el tamaño de los agregados celulares resultantes con y sin anticuerpo El tamaño de agregado celular en función de la concentración de anticuerpo de P-cadepna puede utilizarse entonces para medir el valor de CI50 El ejemplo 4 proporciona detalles adicionales de un ensayo de agregación dependiente de P-cadepna que se utilizó para medir los valores de Cl50 para varios anticuerpos de P-cadepna Como se utiliza en la presente memoria, el término "ensayo de desestabilización de esferoide dependiente de P-cadepna" designa un ensayo para medir la capacidad de un anticuerpo de P-cadepna de desestabi zar las agregaciones celulares dependientes de P-cadepna preformadas Midiendo la reducción de tamaño de los agregados en función de la concentración de anticuerpo, puede determinarse un valor de CI50 El ejemplo 5 proporciona detalles adicionales de un ensayo de desestabi zación de esferoide dependiente de P-cadepna que se utilizó para medir los valores de CI50 para anticuerpos de P-cadepna Como se utiliza en la presente memoria, el término "selectividad molecular" designa la afinidad de unión de un anticuerpo por un antígeno específico cuando es mayor que para un antigeno relacionado Por ejemplo,
los anticuerpos de la presente invención pueden ser selectivos por P-cadepna frente a E-cadepna, lo que significa que la afinidad de unión del anticuerpo por P-cadepna es al menos 2 veces mayor, por ejemplo 4 veces, o 10 veces, o 50 veces, o 100 veces o más, que por E-cadepna Dichas afinidades de unión pueden medirse utilizando técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica El termino "epitope" incluye cualquier determinante proteico capaz de unión específica a una inmunoglobu na o receptor de células T o de interaccionar de otro modo con una molécula Los determinantes epitópicos consisten generalmente en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activa tales como aminoácidos o carbohidratos o cadenas laterales de azúcar, y generalmente tienen características estructurales tridimensionales especificas, asi como características de carga específicas Un epítope puede ser "lineal" o "conformacional" En un epítope lineal, todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula de interacción (tal como un anticuerpo) aparecen linealmente a lo largo de la secuencia aminoacídica primaria de la proteína En un epítope conformacional, los puntos de interacción aparecen a lo largo de restos aminoacídicos en la proteína que están separados entre sí Una vez se determina un epítope deseado en un antígeno, es posible generar anticuerpos contra ese epítope, por ejemplo, utilizando las técnicas descritas en la presente invención Como alternativa, durante el proceso de descubrimiento, la generación y caracterización de anticuerpos puede elucidar información sobre epítopes
deseables A partir de esta información, es entonces posible examinar competitivamente en anticuerpos la unión al mismo epítopo Un enfoque para conseguir esto es realizar estudios de competición cruzada para encontrar anticuerpos que se unan competitivamente entre si, concretamente, los anticuerpos compiten por la unión al antigeno Se describe un proceso de alto rendimiento para "almacenar" anticuerpos basándose en su competición cruzada en la publicación de patente internacional n° WO 03/48731 El término "competir", como se utiliza en la presente memoria con respecto a un anticuerpo, significa que un primer anticuerpo, o una porción de unión a antigeno del mismo, compite por la unión con un segundo anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, en el que la unión del primer anticuerpo con su epítope relacionado se reduce detectablemente en presencia del segundo anticuerpo en comparación con la unión del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo Puede darse el caso contrario, cuando la unión del segundo anticuerpo a su epitope se reduce también detectablemente en presencia del primer anticuerpo, pero no es necesario Es decir, un primer anticuerpo puede inhibir la unión de un segundo anticuerpo a su epitope sin que ese segundo anticuerpo inhiba la unión del primer anticuerpo a su epítope respectivo Sin embargo, cuando cada anticuerpo inhibe detectablemente la unión del otro anticuerpo con su epitope o ligando relacionado, ya sea en la misma, mayor o menor extensión, se dice que los anticuerpos "compiten de forma cruzada" entre sí por la unión a su(s) ep?tope(s) respect?vo(s) Tanto los anticuerpos competitivos como
competitivos cruzados están abarcados por la presente invención Independientemente del mecanismo mediante el que ocurra dicha competición o competición cruzada (por ejemplo, impedimento estérico, cambio conformacional o unión a un epítope común o porción del mismo, o similar), el experto apreciará, basándose en las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria, que dichos anticuerpos competitivos y/o competitivos cruzados están abarcados y pueden ser útiles para los procedimientos dados a conocer en la presente memoria Como se utiliza en la presente memoria, el término "utiliza" con referencia a un gen particular significa que la secuencia aminoacídica de una región particular en un anticuerpo derivaba en ultima instancia de ese gen durante la maduración de células B Por ejemplo, la frase "una secuencia aminoacidica de región variable de cadena pesada que utiliza un gen de la familia VH-3 humana" designa la situación en la que la región VH del anticuerpo derivaba de la familia VH3 de segmentos génicos durante la maduración de células B En las células B humanas, hay más de 30 genes variables de cadena pesada funcionales distintos con los que generar anticuerpos Por lo tanto, el uso de un gen variable de cadena pesada particular es indicativo de un motivo de unión preferido de la interacción anticuerpo-antígeno con respecto a las propiedades combinadas de unión al antígeno y actividad funcional Como se apreciará, el análisis de utilización de gen proporciona sólo una visión limitada de la estructura del anticuerpo A medida que las células B humanas generan estocásticamente transcriptos de
cadena pesada V-D-J o ligera kappa V-J, hay una serie de procesos secundarios que aparecen incluyendo, sin limitación, hipermutación somática, n-adiciones y extensiones de CDR3 Véase, por ejemplo, Méndez ef al , Nature Genetics, 15 146-156 (1997) Como se utiliza en la presente memoria, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional Véase "Immunology-A Synthesis" (2a edición, E S Golub y D R Gren, eds , Sinauer Associates, Sunderland, Mass (1991 )), incorporado a la presente memoria como referencia El término "pohnucleótido", como se designa en la presente memoria, significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, tanto ribonucleótidos como desoxirpbonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido El término incluye formas mono- y bicatenapas El término "polmucleótido aislado", como se utiliza en la presente memoria, significa un po nucleótido de ADNc genómico o de origen sintético o alguna combinación de los mismos que, en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado" (1 ) no está asociado a todos o una parte de los polmucleótidos con los que se encuentra el "polinucleótido aislado" en la naturaleza, (2) está ligado operativamente a un polinucleótido al que no está ligado en la naturaleza, o (3) no aparece en la naturaleza como parte de una secuencia mayor El término "nucleótidos de origen natural", como se utiliza en la
presente memoria, incluye desoxirpbonucleótidos y ribonucleótidos El término "nucleótidos modificados", como se utiliza en la presente memoria, incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y similares El término "enlaces o gonucleotidicos" designado en la presente memoria incluye enlaces o gonucleotidicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato y similares Véanse, por ejemplo, LaPlanche, ef al , Nucí Acids Res , 14 9081 (1986), Stec, ef al , J Am Chem Soc , 106 6077 (1984), Stein et al , Nucí Acids Res 16 3209 (1988), Zon, ef al , Anti-Cancer Druq Desiqn, 6 539 (1991 ), Zon ef al , "Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach'J pág 87-108 (F Eckstein, Ed , Oxford University Press, Oxford, England (1991 )), patente de EE UU n° 5, 151 ,510, Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews, 90 543 (1990), cuyas descripciones se incorporan a la presente memoria como referencia Un ohgonucleótido puede incluir un mareaje para detección, si se desea Secuencias "ligadas operativamente" incluyen tanto secuencias de control de expresión que están contiguas al gen de interés como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés El término "secuencia de control de expresión", como se utiliza en la presente memoria, significa secuencias pohnucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias de codificación a las que están ligadas Las secuencias de control de expresión
incluyen secuencias de iniciación, terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción apropiadas, señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de ayuste y pohadenilación, secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático, secuencias que potencian la eficacia de la traducción (concretamente, secuencias consenso Kozak), secuencias que potencian la estabilidad de proteína y, cuando se desean, secuencias que potencian la secreción de proteína La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped en procariotas, dichas secuencias de control incluyen generalmente promotor, sitio de unión ribosomal y secuencias de terminación de la transcripción, en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencias de terminación de la transcripción El término "secuencias de control" se pretende que incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia sea esencial para expresión y procesamiento, y puede incluir también componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias guia y secuencias de pareja de fusión El término "vector", como se utiliza en la presente memoria, significa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado En algunas modalidades, el vector es un plásmido, concretamente, un trozo de ADN bicatenapo circular al que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales En algunas modalidades, el vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales al genoma viral En algunas modalidades, los vectores son capaces de
replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores mamíferos episomales) En otras modalidades, los vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras introducción en la célula huésped, y así se replican junto con el genoma huésped Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están ligados operativamente Dichos vectores se designan en la presente memoria como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente "vectores de expresión") El término "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped"), como se utiliza en la presente memoria, significa una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombmante Debe entenderse que "célula huésped recombinante" y "célula huésped" significan no sólo la célula en cuestión particular, sino también la progenie de dicha célula Debido a que pueden aparecer ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie, de hecho, puede no ser idéntica a la célula original, pero sigue estando incluida dentro del alcance del término "célula huésped" como se utiliza en la presente memoria Como se utiliza en la presente memoria, el término "linea germinal" designa las secuencias nucleotídicas de los genes y segmentos génicos de anticuerpo a medida que pasan de los progenitores a los descendientes mediante las células germinales Esta secuencia de línea germinal se distingue de las secuencias nucleotídicas que codifican
anticuerpos en células B maduras que se han alterado mediante eventos de recombinación e hipermutacion durante el transcurso de la maduración de células B El término "porcentaje de identidad de secuencia" en el contexto de secuencias de ácido nucleico significa los restos de dos secuencias que son iguales cuando se alinean para máxima correspondencia La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser sobre una extensión de al menos aproximadamente 9 nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos, mas habitualmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 32 nucleótidos, y preferiblemente al menos aproximadamente 36, 48 o más nucleótidos Existe una sene de diferentes algoritmos conocidos en la técnica que pueden utilizarse para medir la identidad de secuencia nucleotidica Por ejemplo, las secuencias polmucleotídicas pueden compararse utilizando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas del Wisconsin Package versión 10 0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, proporciona alineamientos y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones de mejor superposición entre las secuencias de consulta y búsqueda (Pearson, Methods Enzvmol , 183 63-98 (1990), Pearson, Methods Mol Biol , 132 185-219 (2000), Pearson, Methods Enzvmol . 266 227-258 (1996), Pearson, J Mol Biol 276 71-84 (1998), incorporados a la presente memoria como referencia) A menos
que se especifique otra cosa, se utilizan los parámetros por defecto para un programa o algoritmo particular Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de acido nucleico puede determinarse utilizando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) o utilizando Gap con sus parámetros por defecto como se proporcionan en GCG versión 6 1 , incorporado a la presente memoria como referencia Una referencia a una secuencia nucleotídica abarca su complementaria a menos que se especifique otra cosa Por tanto, una referencia a un acido nucleico que tiene una secuencia particular debe entenderse que abarca su cadena complementaria, con su secuencia complementaria El término "similitud sustancial" o "similitud de secuencia sustancial", cuando se designa un acido nucleico o fragmento del mismo, significa que cuando se alinea óptimamente con inserciones o deleciones nucleotídicas apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), hay identidad de secuencia nucleotídica en al menos aproximadamente un 85%, preferiblemente al menos aproximadamente un 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las bases nucleotídicas, medida mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia tal como FASTA, BLAST o Gap, como se discutió anteriormente El término "porcentaje de identidad de secuencia" en el contexto
de secuencias aminoacidicas significa los restos en dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser a lo largo de una extensión de al menos aproximadamente 5 aminoácidos, habitualmente al menos aproximadamente 20 aminoácidos, más habitualmente al menos aproximadamente 30 aminoácidos, típicamente al menos aproximadamente 50 aminoácidos, más típicamente al menos aproximadamente 100 aminoácidos, y aún más típicamente aproximadamente 150, 200 o más aminoácidos Existe una sene de algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden utilizarse para medir la identidad de secuencia ammoacídica Por ejemplo, las secuencias aminoacídicas pueden compararse utilizando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas del Wisconsin Package versión 10 0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsm Aplicado a po péptidos, el termino "identidad sustancial" o "similitud sustancial" significa que dos secuencias aminoacídicas, cuando se alinean óptimamente tal como mediante los programas GAP o BESTFIT, utilizando los pesos de hueco por defecto suministrados por los programas, comparten al menos un 70%, 75% o 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 90% o 95% de identidad de secuencia, y más preferiblemente al menos un 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia En ciertas modalidades, las posiciones de restos que no son idénticas difieren en sustituciones ammoacídicas conservativas Como se utiliza el termino en la presente memoria, una
"sustitución aminoacidica conservativa" es aquella en la que se sustituye un resto aminoacidico por otro resto aminoacidico que tiene un grupo R en la cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) En general, una sustitución ammoacídica conservativa no cambiara sustanclalmente las propiedades funcionales de una proteina En casos en que dos o mas secuencias aminoacídicas difieran entre si en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica Véase, por ejemplo, Pearson, Methods Mol Biol , 243 307-331 (1994) Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1 ) cadenas laterales alifaticas glicina, alanma, valina, leucina e isoleucina, 2) cadenas laterales hidroxil alifáticas sepna y treonina, 3) cadenas laterales que contienen amida asparagina y glutamina, 4) cadenas laterales aromáticas fenilalanina, tirosina y tpptófano, 5) cadenas laterales básicas lisina, arginina e histidma, 6) cadenas laterales acidas acido aspartico y ácido glutámico y 7) cadenas laterales que contienen azufre cisteína y metionina Por ejemplo, los grupos de sustitución aminoacidica conservativa pueden ser va na-leucina-isoleucma, fenilalanina-tirosina, lisina-argmina, alanina-va na, glutamato-aspartato y asparagma-glutamina Como alternativa, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica
PAM250 dada a conocer en Gonnet ef al , Science 256 1443-1445 ( 1992), incorporada a la presente memoria como referencia Un reemplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 La identidad de secuencia para polipéptidos se mide típicamente utilizando software de análisis de secuencia El software de análisis de proteína equipara secuencias utilizando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones aminoacídicas conservativas Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" y Bestfit" que pueden utilizarse con los parámetros por defecto como se especifican por los programas para determinar la homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados tales como po péptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo salvaje y un análogo de la misma Véase, por ejemplo, CGC versión 6 1 (Universidad de Wisconsin, Wl) Las secuencias polipeptídicas pueden compararse también utilizando FASTA utilizando los parámetros por defecto o recomendados, véase GCG versión 6 1 FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones de mejor superposición entre las secuencias de consulta y búsqueda (Pearson, Methods Enzvmol , 183 63-98 (1990), Pearson, Methods Mol Biol , 132 185-219 (2000)) Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran
número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente blastp o tblastn, utilizando parámetros por defecto como los suministrados con los programas Véanse, por ejemplo, Altschul, ef al , J Mol Biol , 215 403-410 (1990), Altschul, ef al , Nucleic Acids Res . 25 3389-3402 (1997) La longitud de las secuencias polipeptídicas comparadas para homología será generalmente de al menos aproximadamente 16 restos aminoacídicos, habitualmente al menos aproximadamente 20 restos, más habitualmente al menos aproximadamente 24 restos, típicamente al menos aproximadamente 28 restos, y preferiblemente más de aproximadamente 35 restos Cuando se busca en una base de datos que contiene secuencias de un gran número de organismos diferentes, es preferible comparar secuencias aminoacídicas Como se utiliza en la presente memoria, "mareaje" o "marcado" designa la incorporación de otra molécula al anticuerpo En una modalidad, el mareaje es un marcador detectable, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un po péptido de restos de biotinilo que puede detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante procedimientos ópticos o colorimétricos) En otra modalidad, el mareaje o marcador puede ser terapéutico, por ejemplo, un conjugado de fármaco o toxina Son conocidos en la técnica diversos procedimientos de mareaje de polipéptidos y g eoproteinas, y pueden
utilizarse Los ejemplos de mareajes para polipéptidos incluyen, pero sin limitación, los siguientes radioisótopos o radionucleidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N 35S 9o? 99Tc pi|n 125, 131^ marcajes fluorescentes (por ejemplo, FITC,
rodamma, fosforolantánidos), marcajes enzimaticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotmilo, epítopes po peptídicos predeterminados reconocidos por un informador secundario (por ejemplo, secuencias de par cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, marcadores epitópicos), agentes magnéticos tales como quelatos de gadolinio, toxinas tales como toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopóstdo, vincpstina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1 -deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, docaina, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos En algunas modalidades, los marcajes se unen mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial "Cantidad terapéuticamente eficaz" designa la cantidad del agente terapéutico que se administra que aliviará en cierta medida uno o más de los síntomas del trastorno que se está tratando Con referencia al tratamiento del cáncer, una cantidad terapéuticamente eficaz designa aquella cantidad que tiene al menos uno de los siguientes efectos reducir el tamaño del tumor, inhibir (es decir, retardar en cierta medida, preferiblemente detener)
la metástasis tumoral, inhibir en cierta medida (es decir, retardar en cierta medida, preferiblemente detener) el crecimiento tumoral, y aliviar en cierta medida (o preferiblemente eliminar) uno o más síntomas asociados al cáncer "Tratar", "tratando" y "tratamiento" designan un procedimiento de alivio o anulación de un trastorno biológico y/o sus síntomas acompañantes Con respecto al cáncer, estos términos significan simplemente que la esperanza de vida de un individuo aquejado de un cáncer aumentará, o que uno o más de los síntomas de la enfermedad se reducirán "Poner en contacto" designa poner juntos un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la presente invención y una P-cadepna diana, o epitope de la misma, de tal manera que el anticuerpo pueda afectar a la actividad biológica de la P-cadepna Dicha "puesta en contacto" puede efectuarse in vitro, concretamente en un tubo de ensayo, una placa petp o similar En un tubo de ensayo, la puesta en contacto puede implicar sólo un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo y P-cadepna o epítope de la misma, o puede implicar células enteras Las células pueden mantenerse o hacerse crecer también en placas de cultivo celular y ponerse en contacto con anticuerpos o porciones de unión a antigeno de los mismos en ese entorno En este contexto, la capacidad de un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo particular de afectar a un trastorno relacionado con P-cadepna, concretamente la CI50 del anticuerpo, puede determinarse antes de intentar el uso del anticuerpo in vivo con organismos vivos más complejos Para células fuera del organismo, existen múltiples
procedimientos, y son bien conocidos por los expertos en la técnica , para poner en contacto P-cadepna con los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos "Crecimiento celular anormal", como se utiliza en la presente memoria, a menos que se indique otra cosa, designa el crecimiento celular que es independiente de los mecanismos regulatopos normales (por ejemplo, pérdida de inhibición por contacto), incluyendo el crecimiento anormal de células normales y el crecimiento de células anormales Esto incluye, pero sin limitación, el crecimiento anormal de células tumorales (tumores) que pro feran expresando una tirosina quinasa mutada o la sobreexpresión de un receptor tirosina quinasa, células benignas y malignas de otras enfermedades pro ferativas en las que aparece la activación de tirosina quinasa aberrante, cualquier tumor que prolifere por receptores tirosma quinasa, cualquier tumor que prolifere por activación aberrante de sepna/treonina quinasa, células benignas y malignas de otras enfermedades proliferativas en las que aparece activación aberrante de sepna/treonina quinasa, tumores, tanto benignos como malignos, que expresan un oncogén Ras activado, células tumorales, tanto benignas como malignas, en las que la proteína Ras se activa como resultado de mutación oncogénica en otro gen, células benignas y malignas de otras enfermedades proliferativas en las que aparece activación aberrante de Ras Son ejemplos de dichas enfermedades proliferativas benignas psoriasis, hipertrofia prostática benigna, papilomavirus humano (HPV) y restmosis "Crecimiento celular anormal" designa también e incluye el
crecimiento anormal de células, tanto benignas como malignas, resultante de la actividad de la enzima farnesil proteina transferasa Los términos "crecimiento celular anormal" y "trastorno hiperprohferativo" se utilizan intercambiablemente en esta solicitud "In vitro" designa procedimientos realizados en un entorno artificial tal como, por ejemplo, sin limitación, en un tubo de ensayo o medio de cultivo "In vivo" designa procedimientos realizados dentro de un organismo vivo tal como, sin limitación, un ratón, rata o conejo El cuadro A muestra las secuencias aminoacídicas y de ácido nucleico de las SEC N° ID 1 -343
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DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LÁ INVENCDON
Anticuerpos de P-cadepna humanos Esta invención se refiere a anticuerpos humanos aislados, o porciones de unión a antigeno de los mismos, que se unen a P-cadepna humana Preferiblemente, los anticuerpos humanos son anticuerpos de P-cadepna humanos recombinantes que tienen mayor afinidad por P-cadepna que por E-cadepna Diversos aspectos de la invención se refieren a dichos anticuerpos y porciones de unión a antigeno y a composiciones farmacéuticas de los mismos, asi como a ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante y células huésped para preparar dichos anticuerpos y porciones de unión a antígeno Los procedimientos de uso de los anticuerpos y porciones de unión a antigeno de la presente invención para detectar P-cadepna humana o para inhibir la actividad P-cadepna humana, m vitro o in vivo, están también abarcados por la presente invención Son conocidas las secuencias aminoacídica y nucleotidica de la P-cadepna de varias especies, incluyendo la humana (véase, por ejemplo, el n° de acceso NM 001793 3) La P-cadepna humana, o porciones antigénicas de la misma, puede prepararse según procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, o puede adquirirse de proveedores comerciales (por ejemplo, R&D Systems 861 -PC-100) En ciertas modalidades, los anticuerpos de la presente invención son IgG designadas como 194-e06, 194-a02, 194-b09, 195-e1 1 , 194-g09,
196-h02, 194-eOJ , 196-d10, 196-g03, 196-e06, 195-a09, 198-a09, 200-h06, g-194-b09, g-194-g09, g-196-g03, g-196-h02, g-194-e01 , g-194-e06, 129- 1 c4 y g-129-1c4 Como se discute con más detalle en el ejemplo 1 , se utilizó el examen de alto rendimiento de una biblioteca de contenido en fago de scFv para identificar el scFv de 129-1c4, que se convirtió posteriormente en una IgG 129-1 c4 representa el anticuerpo guía identificado durante el examen de contenido en fago inicial y es el anticuerpo original de un linaje del que se derivaron otros varios anticuerpos de la presente invención Varios de los anticuerpos derivados se designan como 194-e06, 194-a02, 194-b09, 195-e1 1 , 194-g09, 196-h02, 194-eOJ , 196-d10, 196-g03, 196-e06, 195-a09, 198-a09 y 200-h06, y representan anticuerpos optimizados dentro del linaje original de 129-1 c4 El anticuerpo g-129-1 c4 es la versión de linea germinal del anticuerpo original 129-1c4 en que ciertos aminoácidos en las regiones marco conservadas de los dominios VH y VL se mutaron para equipararse con aquellos de las regiones marco conservadas de la línea germinal Cualquiera de los anticuerpos citados anteriormente puede adaptarse también a línea germinal, de modo que las secuencias de la región marco conservada sean idénticas a las secuencias de la región marco conservada de la línea germinal como en g-129-1 c4 Por ejemplo, en una modalidad de la presente invención, los anticuerpos g-194-b09, g-194-g09, g-196-g03, g-196-h02, g-194-e01 , g-195-e1 1 , g-200-h06 y g-194-e06 son las versiones de línea germinal de 194-b09, 194-g09, 196-g03, 196-h02, 194-eOJ , 195-e1 1 , 200-h06 y 194-e06, respectivamente Los aminoácidos específicos que se mutaron para llegar a
las versiones de linea germinal son evidentes para los expertos en la técnica comparando las secuencias de un anticuerpo de linea germinal frente a un anticuerpo de línea no germinal Como se discute a continuación, las secuencias aminoacidicas específicas de los anticuerpos de la presente invención se describen en los cuadros 1 -3 y en el cuadro A Los anticuerpos de la presente invención se generaron con un fuerte sesgo hacia la utilización de la familia del gen VH3 de las regiones variables de cadena pesada En particular, el anticuerpo original 129-1 c4 derivaba del segmento génico variable VH3-23 En células B humanas, hay más de 30 genes variables de cadena pesada funcionales distintos con los que generar anticuerpos Por lo tanto, el sesgo es indicativo de un motivo de unión preferido de la interacción anticuerpo-antigeno con respecto a las propiedades combinadas de unión a antígeno y actividad funcional Como se apreciará, el análisis de utilización de genes proporciona sólo una visión limitada de la estructura de anticuerpo A medida que las células B humanas generan estocásticamente transcriptos de cadena pesada V-D-J o cadena ligera kappa V-J, hay una sene de procesos secundarios que aparecen incluyendo, sin limitación, hipermutación somática, n-adiciones y extensiones de CDR3 Véanse, por ejemplo, Méndez et al , Nature Genetics 15 146-156 (1997) y la solicitud de patente publicada de EE UU 2003-0070185, presentada el 19 de febrero de 2002 En consecuencia, para examinar adicionalmente la estructura de anticuerpo de la presente invención, se generaron las secuencias aminoacídicas predichas de
los anticuerpos a partir de los ADNc obtenidos a partir de los clones Además, se obtuvieron secuencias aminoacidicas N-terminales mediante secuenciación de proteínas. El cuadro A proporciona secuencias nucleotidicas y aminoacidicas de las regiones variables de cadena pesada y ligera de varios de los anticuerpos de la presente invención. Cada uno de los anticuerpos específicos citados anteriormente puede describirse mediante sus secuencias de dominio variable de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) como se indican en los cuadors 1 y 2 Las secuencias específicas designadas por estas SEC N° ID se muestran en el cuadro A. Como se indica en los Cuadros 1 y 2, se describen las secuencias aminoacídicas y de ADN de VH y V correspondientes de los anticuerpos citados anteriormente por las SEC N° ID 1-23, 68-90 y 320-343
CUADRO 1
CUADRO 2
Pueden describirse también anticuerpos y porciones de unión a antígeno adicionales de la presente invención que comprenden las diversas secuencias CDR y FR que constituyen las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos indicados en los Cuadros 1 y 2 En consecuencia, las SEC N° ID que corresponden a diversas secuencias CDR y
FR de anticuerpos de la presente invención están indicadas en el Cuadro 3 Además, se realizaron también numerosas mutaciones aleatorias en las regiones CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo original 129-1 c4, que proporcionaron una afinidad mejorada por P-cadepna en el intervalo de mejora de 10 a 417 veces medida mediante un ensayo de competición epitópica (véase el ejemplo 8) Las SEC N° ID de estas secuencias CDR3 mutadas de VH y VL (SEC N° ID 91-256 y 257-319) están también incluidas en el Cuadro 3 siguiente
CUADRO 3
Procedimientos de producción de anticuerpos
Bibliotecas de contenido en fago Los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de la presente invención pueden prepararse según varios procedimientos conocidos en la técnica Por ejemplo, pueden utilizarse técnicas de contenido en fago para proporcionar bibliotecas que contienen un repertorio de anticuerpos con afinidades variables por P-cadepna Estas bibliotecas pueden examinarse para identificar y aislar anticuerpos con la afinidad deseada por P-cadepna Por ejemplo, los anticuerpos de P-cadepna humanos recombinantes de la presente invención pueden aislarse examinando una biblioteca de anticuerpos combinatorios recombmantes Preferiblemente, la biblioteca es una biblioteca de contenido en fago de scFv, generada utilizando
ADNc de V y VH humanos preparados a partir de ARNm aislado a partir de células B humanas Los procedimientos para preparar y examinar dichas bibliotecas son conocidos en la técnica Los kits para generar bibliotecas de contenido en fago están comercialmente disponibles (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, n° de catálogo 27-9400-01 , y el kit de contenido en fago SurfZAP™ de Stratagene, n° de catalogo 240612) Existen también otros procedimientos y reactivos que pueden utilizarse para generar y examinar bibliotecas de contenido en fago (véanse, por ejemplo, la patente de EE UU n° 5,223,409, las publicaciones PCT n° WO 92/18619, WO 91/17271 , WO 92/20791 , WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047 y WO 92/09690, Fuchs et al , Bio rechnoloqy 9 1370-1372 ( 1991 ), Hay et al , Hum Antibod Hybpdomas, 3 81-85 (1992), Huse et al , Science, 246 1275-1281 (1989), McCafferty et al , Nature. 348 552-554 ( 1990), Gnffiths, et al , EMBO J , 12 725-734 (1993), Hawkins, et al , J Mol Biol , 226 889-896 (1992), Clackson, et al , Nature 352 624-628 (1991 ), Gram, eí al , Proc Nati Acad Sci USA, 89 3576-3580 (1992), Garrad, eí al , Bio/Technoloqy, 9 1373-1377 (1991 ), Hoogenboom, eí al , Nuc Acid Res , 19 4133-4137 (1991 ), Barbas, eí al , Proc Nati Acad Sci USA, 88 7978-7982 (1991 ) y Gnffiths, eí al , EMBO J , 13 3245-3260 (1994), que se incorporan todos a la presente memoria como referencia) Otro procedimiento para preparar una biblioteca de anticuerpos para uso en técnicas de contenido en fago comprende las etapas de inmunizar un animal no humano que comprende locí de inmunoglobu na
humana con P-caderina o una porción antigénica de la misma para crear una respuesta inmune, extraer células productoras de anticuerpo del animal inmunizado; aislar ARN que codifica cadenas pesada y ligera de anticuerpos de la invención a partir de las células extraídas, transcribir de forma inversa el ARN para producir ADNc, amplificar el ADNc utilizando cebadores e insertar el ADNc en un vector de contenido en fago de tal modo que los anticuerpos se expresen en el fago. Para la producción de dichos repertorios, es innecesario inmortalizar las células B del animal inmunizado. En lugar de ello, pueden utilizarse directamente las células B primarias como fuente de ADN. La mezcla de ADNc obtenidos de células B, por ejemplo, derivados de bazos, se utiliza para preparar una biblioteca de expresión, por ejemplo, una biblioteca de contenido en fago transfectada en E. coli. En última instancia, se identifican los clones de la biblioteca que producen afinidades de unión por el antígeno de una magnitud deseada y se recupera el ADN que codifica el producto responsable de dicha unión y se manipula para expresión recombinante estándar. Las bibliotecas de contenido en fago pueden construirse también utilizando secuencias nucleotídicas anteriormente manipuladas y examinarse de modo similar. En general, los ADNc que codifican las cadenas pesada y ligera se suministran independientemente o se ligan para formar análogos de Fv para producción en la biblioteca de fago. Se examinan después en la biblioteca de fago los anticuerpos con las mayores afinidades por P-caderina y se recupera el material genético a partir del clon apropiado. Rondas adicionales de examen pueden aumentar la afinidad del anticuerpo original
aislado En una modalidad, para aislar y producir anticuerpos de P-cadepna humanos con las características deseadas, se utiliza en primer lugar un anticuerpo de P-cadepna humano como se describe en la presente memoria para seleccionar secuencias de cadena pesada y cadena ligera humana que tienen una actividad de unión similar hacia P-cadepna, utilizando los procedimientos de impronta epitópica descritos en la publicación PCT n° WO 93/06213, incorporada a la presente memoria como referencia Las bibliotecas de anticuerpo utilizadas en este procedimiento son preferiblemente bibliotecas de scFv preparadas y examinadas como se describe en la publicación PCT n° WO 92/01047, McCafferty, eí al , Nature, 348 552-554 (1990), y Gpffiths, eí a/ , EMBO J , 12 725-734 (1993), todos incorporados a la presente memoria como referencia Las bibliotecas de anticuerpos scFv pueden examinarse utilizando P-cadepna humana como antígeno Se examina en la biblioteca de fago los anticuerpos con las mayores afinidades por P-cadepna y se recupera el material genético a partir del clon apropiado Rondas adicionales de examen pueden aumentar la afinidad del anticuerpo original aislado Una vez se seleccionan los dominios VL y VH humanos iniciales, pueden realizarse entonces experimentos de "mezcla y equiparación", en los que se examina en diferentes pares de los segmentos V y VH seleccionados imcialmente la unión de P-cadepna para seleccionar las combinaciones de pares de VL/VH preferidos Estos experimentos de mezcla y equiparación
pueden realizarse también después de mutar aleatoriamente los segmentos VH y VL para optimizar la unión como se describe a continuación Adicionalmente, para mejorar adicionalmente la calidad del anticuerpo, los segmentos V y VH de los pares VH/V preferidos pueden mutarse aleatoriamente, preferiblemente dentro de la región CDR3 de VH y/o VL, en un proceso análogo al proceso de mutación somática in vivo responsable de la maduración de afinidad de anticuerpos durante una respuesta inmune natural Esta maduración de afinidad in vitro puede efectuarse, por ejemplo, amplificando los dominios VH y VL utilizando cebadores de PCR complementarios de las CDR3 de VH y CDR3 de V , respectivamente, habiendo sido "punteados" dichos cebadores con una mezcla aleatoria de las cuatro bases nucleotidicas en ciertas posiciones de tal modo que los productos de PCR resultantes codifiquen segmentos VH y VL en los que se han introducido mutaciones aleatorias en las regiones CDR3 de VH y/o VL Puede reexaminarse en estos segmentos VH y V aleatoriamente mutados la unión a P-cadepna, y pueden seleccionarse las secuencias que exhiban una alta afinidad y una baja velocidad de disociación por P-cadepna Como se discute anteriormente, se indican por las SEC N° ID 91-256 y 257-319 vanas secuencias de CDR3 de VH y VL de la presente invención que se mutaron aleatoriamente y mostraron afinidad mejorada Después del examen y aislamiento de un anticuerpo de P-cadepna de la invención a partir de una biblioteca de contenido de inmunoglobuhna recombinante, pueden recuperarse ácidos nucleicos que
codifican el anticuerpo seleccionado a partir del paquete de contenido (por ejemplo, a partir del genoma de fago) y subclonarse en otros vectores de expresión mediante técnicas de ADN recombinante estándar Si se desea, el ácido nucleico puede manipularse adicionalmente para crear otras formas de anticuerpo de la invención, como se describe a continuación Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado mediante examen de una biblioteca combinatoria, se clona el ADN que codifica el anticuerpo en un vector de expresión recombinante y se introduce en una célula huésped, como se describe a continuación Inmunización En otra modalidad, pueden producirse anticuerpos de P-cadepna humana inmunizando con un antígeno de P-cadepna un animal transgénico no humano que comprende en su genoma parte o todos los locí de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobuhna humana Por ejemplo, el animal no humano puede ser un animal XENOMOUSE™ (Abgenix, Ine , Fremont, CA) Los ratones XENOMOUSE™ son cepas de ratón modificadas por ingeniería genética que comprenden grandes fragmentos de locí de cadena pesada y cadena ligera de mmunoglobulina humana y son deficientes en la producción de anticuerpo de ratón Véanse, por ejemplo, Green eí al , Nature Genetics, 7 13-21 (1994) y las patentes de EE UU 5,916,771 , 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181 , 6,091 ,001 , 6,1 14,598, 6, 130,364, 6,162,963 y 6,150,584 Véanse también los documentos WO 91/10741 , WO
94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031 , WO 99/53049, WO 00/09560 y WO 00/037504 Los procedimientos dados a conocer en estos documentos pueden modificarse como se describe en la patente de EE UU n° 5,994,619, que se incorpora a la presente memoria como referencia La patente de EE UU n° 5,994,619 describe procedimientos para producir nuevas células y líneas celulares de masa celular interna cultivada (CICM) derivadas de cerdos y vacas, y células CICM transgénicas en las que se ha insertado ADN heterólogo Las células CICM transgénicas pueden utilizarse para producir embriones, fetos y descendencia transgénica clonada La patente 5,994,619 describe también procedimientos de producción de animales transgénicos que son capaces de transmitir el ADN heterólogo a su progenie Los ejemplos de animales no humanos que pueden utilizarse con estos procedimientos incluyen ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado bovino, pollos y caballos Los ratones XENOMOUSE ™ producen un repertorio humano similar al adulto de anticuerpos completamente humanos y generan anticuerpos humanos específicos de antígeno En algunas modalidades, los ratones XENOMOUSE™ contienen aproximadamente un 80% del repertorio del gen V de anticuerpo humano mediante la introducción de fragmentos de configuración de línea germinal de un tamaño de megabases de los locí de cadena pesada y locí de cadena ligera kappa humanos en cromosoma artificial de levadura (YAC) En otras modalidades, los ratones XENOMOUSE ™ contienen adicionalmente aproximadamente todos los locí de
cadena ligera lambda humana Véase Méndez, eí al , Nature Genetics, 15 146-156 (1997), Green y Jakobovits, J Exp Med , 188 483-495 (1998) y el documento WO 98/24893, cuyas descripciones se incorporan a la presente memoria como referencia En algunas modalidades, los animales no humanos que comprenden genes de inmunoglobulina humana son animales que tienen un "minilocus" de inmunoglobu na humana En el enfoque de minilocus, se imita un locus de Ig exogeno mediante la inclusión de genes individuales del locus de Ig Por tanto, se forman uno o más genes de VH, uno o más genes de DH, uno o más genes de JH, un dominio constante mu, y un segundo dominio constante (preferiblemente un dominio constante gamma) en un constructo para inserción en un animal Este enfoque se describe en las patentes de EE UU n° 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661 ,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591 ,669, 5,612,205, 5,721 ,367, 5,789,215 y 5,643,763, incorporadas a la presente memoria como referencia Los animales no humanos como se describen anteriormente pueden inmunizarse después con un antigeno de P-cadepna como se describe a continuación en condiciones que permiten la producción de anticuerpo Las células productoras de anticuerpo se aislan a partir de los animales, y se aislan los ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de P-cadepna de interés a partir de las células productoras de anticuerpo aisladas o a partir de una línea celular inmortalizada producida a partir de dichas células Estos ácidos nucleicos se
modifican por ingeniería genética posteriormente utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica y como se describen adicionalmente a continuación para reducir la cantidad de secuencia no humana, concretamente, para humanizar el anticuerpo para reducir la respuesta inmune en seres humanos En algunas modalidades, el antígeno de P-cadepna puede ser P-cadepna aislada y/o purificada En algunas modalidades, el antigeno de P-cadepna es P-cadepna humana En otras modalidades, el antígeno de P-cadepna puede ser una célula que expresa o sobreexpresa P-cadepna En otras modalidades, el antígeno de P-cadepna es una proteina recombinante expresada a partir de levadura, células de insecto, bacterias tales como E coll u otras fuentes mediante tecnología recombinante La inmunización de animales puede ser mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, "Antibodies A Laboratory Manual", Nueva York, Cold Spring Harbor Press (1990) Los procedimientos para inmunizar animales no humanos tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado bovino y caballos son bien conocidos en la técnica Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, supra, y la patente de EE UU n° 5,994,61 9 Por ejemplo, el antígeno de P-cadepna puede administrarse con un coadyuvante para estimular la respuesta inmune Los coadyuvantes ejemplares incluyen coadyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (dipéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes) Dichos coadyuvantes pueden proteger al po péptido de la dispersión rápida mediante su secuestro en un
depósito local, o pueden contener sustancias que estimulan al huésped a secretar factores que son quimiotácticos por macrófagos y otros componentes del sistema inmune Preferiblemente, si se está administrando un polipéptido, el programa de inmunización implicará dos o más administraciones del po peptido, distribuidas durante vanas semanas Por ejemplo, después de la inmunización de un animal transgénico como se describe anteriormente con P-cadepna, pueden aislarse células primarias (por ejemplo, células B de sangre periférica o de bazo) a partir del animal transgénico inmunizado y pueden identificarse células individuales productoras de anticuerpos específicos del antígeno deseado El ARNm poliadenilado de cada célula individual se aisla después y se realiza la reacción en cadena con polimerasa de transcripción inversa (PCR-TI) utilizando cebadores con sentido que se asocian a secuencias de región variable (por ejemplo, cebadores degenerados que reconocen la mayoria o todas las regiones FR1 de genes de región variable de cadena pesada y ligera humana y cebadores sin sentido que se asocian a secuencias de región constante o de unión) Los ADNc de los dominios variables de cadena pesada y ligera se clonan después y se expresan en cualquier célula huésped adecuada, por ejemplo una célula de mieloma, en forma de anticuerpos quiméricos con las regiones constantes de inmunoglobu na respectivas tales como los dominios constantes K o ? y de cadena pesada Véase Babcook eí al , Proc Nati Acad Sci USA, 93 7843-7848 (1996), incorporado a la presente memoria como referencia Los anticuerpos de P-cadepna pueden
identificarse y aislarse después como se describe en la presente memoria
Procedimientos recombinantes de producción de anticuerpos Un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede prepararse mediante expresión recombmante de genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobu na en una célula huésped Por ejemplo, para expresar un anticuerpo recombinantemente, se transfecta una célula huésped con uno o más vectores de expresión recombinante que portan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina del anticuerpo, de tal modo que las cadenas ligera y pesada se expresan en la célula huésped y, preferiblemente, se secretan en el medio en el que se cultivan las células huésped, de cuyo medio pueden recuperarse los anticuerpos Se utilizan metodologías de ADN recombinante estándar para obtener genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo, para incorporar estos genes a vectores de expresión recombinante y para introducir los vectores en células huésped tales como las descritas en Sambrook, Fritsch y Maniatis (ed ), "Molecular Cloning A Laboratory Manual" 2a edición, Cold Spring Harbor, NY (1989), Ausubel, F M , eí al , (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates (1989) y en la patente de EE UU n° 4,816,397, cuyas descripciones se incorporan a la presente memoria como referencia
Mutaciones y modificaciones Para expresar los anticuerpos de P-cadepna de la presente invención, pueden obtenerse en primer lugar fragmentos de ADN que codifican las regiones V y VL utilizando cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente Pueden introducirse también diversas mutaciones, deleciones y/o adiciones en las secuencias de ADN utilizando procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica Por ejemplo, puede llevarse a cabo mutagenesis utilizando procedimientos estándar tales como mutagenesis mediada por PCR, en la que los nucleótidos mutados se incorporan a los cebadores de PCR de tal modo que el producto de PCR contiene las mutaciones deseadas, o mutagénesis dirigida a sitio Por ejemplo, un tipo de sustitución que puede hacerse es cambiar una o más cisternas en el anticuerpo, que pueden ser químicamente reactivas, por otro resto tal como, sin limitación, alanina o sepna Por ejemplo, puede ser una sustitución de una cisterna no canónica La sustitución puede hacerse en una CDR o región marco conservada de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo En algunas modalidades, la cisteína es canónica Los anticuerpos pueden mutarse también en los dominios variables de las cadenas pesada y/o ligera, por ejemplo, para alterar una propiedad de unión del anticuerpo Por ejemplo, puede hacerse una mutación en una o mas de las regiones CDR para aumentar o reducir la KD del anticuerpo por P-cadepna, para aumentar o reducir la koff o para alterar la especificidad de unión del anticuerpo Las técnicas de mutagénesis dirigida a
sitio son bien conocidas en la técnica Véanse, por ejemplo, Sambrook, eí al , y Ausubel, eí al , supra, que se incorporan a la presente memoria como referencia Por ejemplo, como se discute con más detalle en el ejemplo 8, se prepararon numerosas variantes de secuencias de CDR3 de V y V del original 129-1 c4 según los procedimientos discutidos anteriormente, y se indican como SEC N° ID 91 a 256 (variantes CDR3 de VH) y SEC N° ID 257 a 319 (vanantes CDR3 de V ) en el cuadro A Puede hacerse también una mutación en una región marco conservada o dominio constante para aumentar la semivida de un anticuerpo de P-cadepna Véase, por ejemplo, la publicación PCT n° WO 00/09560, incorporada a la presente memoria como referencia Puede hacerse también una mutación en una región marco conservada o dominio constante para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proporcionar un sitio para unión covalente o no covalente a otra molécula, o para alterar propiedades tales como fijación de complemento, unión de FcR y citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) Según la invención, un anticuerpo individual puede tener mutaciones en una cualquiera o más de las CDR o regiones marco conservadas del dominio variable o en el dominio constante En un proceso conocido como "adaptación a línea germinal", ciertos aminoácidos en las secuencias VH y V pueden mutarse para equipararse con aquellos encontrados naturalmente en las secuencias VH y V de línea germinal En particular, las secuencias aminoacídicas de las regiones marco conservadas en las secuencias VH y V pueden mutarse para
equipararse con las secuencias de linea germinal para reducir el nesgo de inmunogenicidad cuando se administra el anticuerpo Las secuencias de ADN de linea germinal para los genes VH y V humanos son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, la base de datos de secuencia de línea germinal humana "Vbase", véanse también Kabat, E A et al (1991 ) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a edición, U S Department of Health and Human Services, NIH Pub cation n° 91 -3242, Tomhnson, eí al (1992) J Mol Biol 227 776-798 y Cox, eí al Eur J Immunol 24 827-836 (1994), los contenidos de cada uno de los cuales están incorporados expresamente a la presente memoria como referencia) Otro tipo de sustitución aminoacidica que puede hacerse es retirar los sitios proteoliticos potenciales en el anticuerpo Dichos sitios pueden aparecer en una región CDR o marco conservada de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo La sustitución de restos de cisterna y la retirada de sitios proteoliticos puede reducir el riesgo de heterogeneidad en el producto de anticuerpo y aumentar asi su homogeneidad Otro tipo de sustitución aminoacidica es eliminar los pares asparagina-ghcma, que forman sitios de desamidacion potencial, alterando uno o ambos de los restos En otro ejemplo, puede escindirse la lisina C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo de P-cadepna de la invención En diversas modalidades de la invención, las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de P-cadepna pueden incluir opcionalmente una secuencia señal N-terminal tal como las indicadas por las SEC N° ID 346 y 347
Una vez se obtienen fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL de la presente invención, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente mediante técnicas de ADN recombinante estándar, por ejemplo, para convertir los genes de región variable en genes de cadena de anticuerpo completa, en genes de fragmento Fab o en un gen de scFv En estas manipulaciones, se liga operativamente un fragmento de ADN que codifica V o VH con otro fragmento de ADN que codifica otra proteína tal como una región constante de anticuerpo o un engarce flexible El término "ligado operativamente", como se utiliza en este contexto, se pretende que signifique que los dos fragmentos de ADN están unidos de tal modo que las secuencias aminoacídicas codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en fase El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse en un gen de cadena pesada completo ligando operativamente el ADN que codifica VH con otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH 1 , CH2 y CH3) Las secuencias de genes de región constante de cadena pesada humana son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E A et al (1991 ) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a ed , U S Department of Health and Human Services, NIH Pubhcation n° 91 -3242) y pueden obtenerse fragmentos de ADN que abarcan estas regiones mediante amplificación por PCR estándar La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4 , IgA, IgE, IgM o IgD, pero lo mas preferiblemente es una región constante de lgG1 o
lgG2 La secuencia de región constante de lgG1 puede ser cualquiera de los diversos alelos o alotipos conocidos por aparecer entre individuos diferentes tales como Gm(1 ), Gm(2), Gm(3) y Gm(17) Estos alotipos representan sustitución aminoacídica de origen natural en las regiones constantes de lgG1 Por ejemplo, la región constante de lgG1 de cadena pesada puede ser la SEC N° ID 344 Para un gen de cadena pesada de fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede ligarse operativamente a otra molécula de ADN que codifica sólo la región constante CH1 de cadena pesada La región constante de cadena pesada CH 1 puede derivar de cualquiera de los genes de cadena pesada El ADN aislado que codifica la región VL puede convertirse en un gen de cadena ligera completo (asi como un gen de cadena ligera Fab) mediante ligamiento operativo del ADN que codifica V con otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera C Las secuencias de los genes de región constante de cadena ligera humana son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E A et al (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a ed , U S Department of Health and Human Services, NIH Publication N° 91 -3242) y pueden obtenerse fragmentos de ADN que abarcan estas regiones mediante amplificación por PCR estándar La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda La región constante kappa puede ser cualquiera de los diversos alelos conocidos por aparecer entre individuos diferentes tales como lnv(1 ), lnv(2) e lnv(3) La región constante lambda puede derivar de cualquiera de los
tres genes lambda Por ejemplo, la región constante de lgG1 de cadena ligera puede ser la SEC N° ID 347 Para crear un gen scFv, se ligan operativamente los fragmentos de ADN que codifican VH y V a otro fragmento que codifica un engarce flexible, por ejemplo, que codifica una secuencia ammoacídica (Gly4-Ser)3 tal que las secuencias de VH y VL puedan expresarse en forma de una proteína monocatenapa contigua, con las regiones VH y V unidas por el engarce flexible (véanse, por ejemplo, Bird, eí al , Science 242 423-426 ( 1988), Huston, eí al , Proc Nati Acad Sci USA 85 5879-5883 (1988), McCafferty, eí al , Nature, 348 552-554 (1990)) El anticuerpo monocatenapo puede ser monovalente si se utilizan un solo VH y V , divalente si se utilizan dos VH y V , o polivalente si se utilizan más de dos VH y V Pueden generarse anticuerpos biespecíficos o polivalentes que se unen específicamente a P-cadepna y a otra molécula En otra modalidad, puede prepararse un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina que comprende todo o una porción de un anticuerpo de P-cadepna de la invención ligado a otro po péptido En otra modalidad, sólo los dominios variables del anticuerpo de P-cadepna están ligados al pohpéptido En otra modalidad, el dominio VH de un anticuerpo de P-cadepna está ligado a un primer polipéptido, mientras que el dominio V de un anticuerpo de P-cadepna está ligado a un segundo pohpéptido que se asocia con el primer polipeptido de manera tal que los dominios VH y VL puedan interaccionar entre si formando un sitio de unión a antígeno En otra modalidad preferida, el
dominio VH está separado del dominio VL por un engarce tal que los dominios VH y VL puedan interaccionar entre si El anticuerpo VH-engarce-VL se liga después al pohpéptido de interés Además, pueden crearse anticuerpos de fusión en los que se ligan entre sí dos (o más) anticuerpos monocatenapos Esto es útil si se quiere crear un anticuerpo divalente o polivalente en una cadena po peptidica única, o si se quiere crear un anticuerpo biespecífico En otras modalidades, pueden prepararse otros anticuerpos modificados utilizando moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpo de P-cadepna Por ejemplo, pueden prepararse "cuerpos kappa" (lll eí al , Protein Enq 10 949-957 (1997)), "minicuerpos" (Martin eí al, EMBO J , 13 5303-5309 (1994)), "diacuerpos" (Hol ger, eí al , Proc Nati Acad Sci USA, 90 6444-6448 (1993)), o "janusinas" (Traunecker, eí al , EMBO J , 10 3655-3659 (1991 ) y Traunecker, eí a/ , Int J Cáncer (Supl ) 7 51 -52 (1992)) utilizando técnicas de biología molecular estándar siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva Los anticuerpos biespecíficos o fragmentos de unión a antígeno pueden producirse mediante una variedad de procedimientos, incluyendo fusión de hibpdomas o ligamiento de fragmentos Fab' Véanse, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin Exp Immunol , 79 315-321 (1990), Kostelny eí al , J Immunol , 148 1547-1553 (1992) Además, pueden formarse anticuerpos biespecíficos en forma de "diacuerpos" o "janusinas" En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico se une a dos epítopes diferentes de P-cadepna En algunas modalidades, los anticuerpos modificados descritos
anteriormente se preparan utilizando uno o más de los dominios variables o regiones CDR a partir de un anticuerpo de P-cadepna humana proporcionado en la presente memoria Vectores y células huésped Para expresar los anticuerpos y porciones de unión a antígeno de la invención, se insertan ADN que codifican cadenas ligera y pesada parciales o completas, obtenidas como se describe anteriormente, en vectores de expresión de tal modo que los genes están ligados operativamente a secuencias de control transcppcional y traduccional En este contexto, el término "ligado operativamente" se pretende que signifique que un gen de anticuerpo está ligado a un vector de tal modo que las secuencias de control transcppcional y traduccional dentro del vector sirven para su función pretendida de regular la transcripción y la traducción del gen de anticuerpo El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se eligen para ser compatibles con la célula huésped de expresión utilizada Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), virus de plantas tales como virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico del tabaco, cósmidos, YAC, episomas derivados de EBV y similares El gen de anticuerpo está ligado a un vector de tal modo que las secuencias de control transcppcional y traduccional dentro del vector sirven para su función pretendida de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se eligen para ser compatibles con la célula huésped de expresión utilizada El
gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo pueden insertarse en vectores separados En una modalidad preferida, se insertan ambos genes en el mismo vector de expresión Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante procedimientos estándar (por ejemplo, ligamiento de sitios de restricción complementarios en el fragmento de gen de anticuerpo y vector, o ligamiento de extremo romo si no están presentes sitios de restricción) Un vector conveniente es aquel que codifica una secuencia de inmunoglobulma CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados introducidos por ingeniería genética de modo que cualquier secuencia VH o V pueda insertarse y expresarse fácilmente, como se describe anteriormente En dichos vectores, el ayuste se da habitualmente entre el sitio donante de ayuste en la región J insertada y el sitio aceptor de ayuste que precede al dominio C humano, y también en las regiones de ayuste que aparecen dentro de los exones de CH humano La poliadenilación y terminación de la transcripción se dan en sitios cromosómicos nativos cadena abajo de las regiones de codificación El vector de expresión recombinante puede codificar también un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo a partir de una célula huésped El gen de cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de tal modo que el péptido señal se ligue en fase a la terminación amino de la cadena de inmunoglobulina El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobuhna o un peptido señal heterólogo (concretamente, un péptido
señal de una proteína no inmunoglobulma) Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la invención portan secuencias regulatopas que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula huésped Se apreciará por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de las secuencias regulatopas, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped para transformar, el nivel de expresión de la proteína deseado y demás Las secuencias regulatopas preferidas para la expresión de células huésped mamíferas incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células mamíferas tales como promotores y/o potenciadores derivados de LTR retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/potenciador de CMV), virus de simio 40 (SV40) (tales como el promotor/potenciador SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)), promotores de po oma y de mamífero fuertes tales como inmunoglobuhna nativa y promotores de actina Para una descripción adicional de elementos regulatopos virales y secuencias de los mismos véanse, por ejemplo, la patente de EE UU n° 5, 168,062, la patente de EE UU n° 4,510,245 y la patente de EE UU n° 4,968,615 Son conocidos en la técnica procedimientos para expresar anticuerpos en plantas, incluyendo una descripción de promotores y vectores, así como la transformación de plantas Véase, por ejemplo, la patente de EE UU n° 6,517,529, incorporada a la presente memoria como referencia Los procedimientos de expresión de
po péptidos en células bacterianas o células fúngicas, por ejemplo, células de levadura, son también bien conocidos en la técnica Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias regulatopas, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales tales como secuencias que regulan la rephcación del vector en células huésped (por ejemplo, origenes de rephcación) y genes marcadores seleccionares El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las patentes de EE UU n° 4,399,216, 4,634,665 y 5, 179,017, incorporadas a la presente memoria como referencia) Por ejemplo, el gen marcador seleccionable confiere típicamente resistencia a fármacos tales como G418, higromicina o metotrexato a una célula huésped en la que se ha introducido el vector Los genes marcadores seleccionabas preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células huésped -dhfr con selección/amplificación con metotrexato), el gen de neomicina fosfotransferasa (para selección con G418) y el gen de glutamato sintetasa Las moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos de P-cadepna y los vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico pueden utilizarse para la transfección de una célula huésped de mamífero, planta, bacteria o levadura adecuada La transformación puede ser mediante cualquier procedimiento conocido para la introducción de polinucleótidos en una célula huésped Los procedimientos para introducción de polinucleótidos
heterólogos en células mamíferas son bien conocidos en la técnica, e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del(de los) pol?nucleót?do(s) en posomas y microinyección directa del ADN en los núcleos Además, las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en células mamíferas mediante vectores virales Los procedimientos de transformación de células son bien conocidos en la técnica Véanse, por ejemplo, las patentes de EE UU n° 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455, incorporadas a la presente memoria como referencia Los procedimientos de transformación de células de planta con bien conocidos en la técnica incluyendo, por ejemplo, transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolistica, inyección directa, electroporación y transformación viral Los procedimientos de transformación de células bacterianas y de levadura son también bien conocidos en la técnica Las líneas celulares mamíferas disponibles como huéspedes para expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC) Éstas incluyen, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), células NSO, células SP2, células HEK-293T, células NIH-3T3, células HeLa, células de pñón de hámster recién nacido (BHK), células de pñón de mono verde africano (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549 y una serie de otras lineas celulares Las líneas celulares particularmente preferidas se seleccionan mediante la
determinación de cuáles lineas celulares tienen altos niveles de expresión Otras líneas celulares que pueden utilizarse son líneas celulares de insecto tales como células Sf9 o Sf21 Cuando se introducen vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpo en células huésped mamíferas, se producen anticuerpos cultivando las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, mas preferiblemente, la secreción del anticuerpo al medio de cultivo en el que se hacen crecer las células huésped Los anticuerpos pueden recuperarse a partir del medio de cultivo utilizando procedimientos de purificación de proteina estándar Las células huésped de planta incluyen, por ejemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lenteja acuática, maíz, trigo, patata y demás Las células huésped bacterianas incluyen E coll y especies de Streptomyces Las células huésped de levadura incluyen Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastons Además, la expresión de anticuerpos de la invención a partir de líneas celulares de producción puede potenciarse utilizando una serie de técnicas conocidas Por ejemplo, los sistemas de expresión génica de glutamina sintetasa (el sistema GS) y DHFR son enfoques comunes para potenciar la expresión en ciertas condiciones Los clones de células de alta expresión pueden identificarse utilizando técnicas convencionales tales como clonación por dilución limitada y tecnología Microdrop El sistema GS se discute en las patentes europeas n° 0216846, 0256055, 0323997 y 0338841 Es probable que los anticuerpos expresados por diferentes
líneas celulares o en animales transgénicos tengan diferente g cosilación entre si Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria, o que comprenden las secuencias aminoacídicas proporcionadas en la presente memoria, son parte de la presente invención, independientemente de la g cosilación de los anticuerpos
Animales y plantas transgénicos Los anticuerpos de P-cadepna de la invención pueden producirse también transgénicamente mediante la generación de un mamífero o una planta que es transgénico para las secuencias de cadena pesada y ligera de inmunoglobu na de interés y la producción del anticuerpo en una forma recuperable a partir de las mismas Con respecto a la producción transgénica en mamíferos, los anticuerpos de P-cadepna pueden producirse en, y recuperarse a partir de, la leche de cabras, vacas u otros mamíferos Véanse, por ejemplo, las patentes de EE UU n° 5,827,690, 5,756,687, 5,750, 172 y 5,741 ,957, incorporadas a la presente memoria como referencia En algunas modalidades, se inmunizan animales transgénicos no humanos que comprenden locí de inmunoglobulina humana con P-cadepna o una porción inmunogénica de la misma como se describe anteriormente Se describen procedimientos para preparar anticuerpos en plantas, por ejemplo, en las patentes de EE UU 6,046,037 y 5,959, 177, incorporadas a la presente memoria como referencia
En algunas modalidades, los animales o plantas transgénicos no humanos se producen introduciendo una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo de P-cadepna, o porción de unión a antigeno del mismo, de la invención en el animal o planta mediante técnicas transgénicas estándar Véase Hogan y la patente de Estados Unidos 6,417,429, supra Las células transgénicas utilizadas para preparar el animal transgénico pueden ser células madre embrionarias o células somáticas o un huevo fertilizado Los organismos no humanos transgenicos pueden ser heterocigóticos quiméricos, no quiméricos y homocigóticos no quiméricos Véanse, por ejemplo, Hogan eí al , "Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual", 2a ed , Cold Spring Harbor Press ( 1999), Jackson, eí al , "Mouse Genetics and Transgenics A Practical Approach", Oxford University Press (2000), y Pinkert, "Trangenic Animal Technology A Laboratory Handbook", Academic Press (1999), todos incorporados a la presente memoria como referencia En algunas modalidades, los animales no humanos transgénicos tienen una desestabilización dirigida y el reemplazo por un constructo director que codifica una cadena pesada y/o cadena ligera de interés Los anticuerpos de P-cadepna pueden prepararse en cualquier animal transgénico En una modalidad preferida, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado bovino o caballos El animal transgénico no humano expresa dichos pohpéptidos codificados en sangre, leche, orina, saliva, lágrimas, moco y otros fluidos corporales
Cambio de clase La clase (por ejemplo, IgG, IgM, IgE, IgA o IgD) y subclase (por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4) de los anticuerpos de P-cadepna puede determinarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica En general, la clase y subclase de un anticuerpo pueden determinarse utilizando anticuerpos que son específicos de una clase y subclase particular de anticuerpo Dichos anticuerpos están comercialmente disponibles La clase y subclase pueden determinarse mediante ELISA o transferencia Western, asi como otras técnicas Como alternativa, la clase y la subclase pueden determinarse secuenciando todos o una porción de los dominios constantes de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos, comparando sus secuencias aminoacídicas con las secuencias aminoacídicas conocidas de diversas clases y subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y subclase de los anticuerpos Los anticuerpos de P-cadepna de la presente invención pueden ser una molécula de IgG, IgM, IgE, IgA o IgD Por ejemplo, los anticuerpos de P-cadepna pueden ser una IgG que es una subclase lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4 En una modalidad, los anticuerpos de P-cadepna pueden tener una región constante de cadena pesada indicada por la SEC N° ID 344 y una región constante de cadena ligera indicada por la SEC N° ID 345 Un aspecto de la invención proporciona un procedimiento para convertir la clase o subclase de un anticuerpo de P-cadepna en otra clase o subclase En algunas modalidades, se aisla una molécula de ácido nucleico que codifica un V o VH que no incluye secuencias que codifican CL o CH
utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica La molécula de ácido nucleico se liga operativamente después a una secuencia de ácido nucleico que codifica un CL O C de la clase o subclase de mmunoglobulina deseada Esto puede conseguirse utilizando un vector o molécula de ácido nucleico que comprende una cadena CL o C , como se describe anteriormente Por ejemplo, un anticuerpo de P-cadepna que era originalmente IgM puede cambiarse de clase a una IgG Ademas, el cambio de clase puede utilizarse para convertir una subclase de IgG en otra, por ejemplo, de lgG1 a lgG2 Otro procedimiento para producir un anticuerpo de la invención que comprende un isotipo deseado comprende las etapas de aislar un ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo de P-cadepna y un ácido nucleico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo de P-cadepna, aislar la secuencia que codifica la región VH, ligar la secuencia de VH a una secuencia que codifica un dominio constante de cadena pesada del isotipo deseado, expresar el gen de cadena ligera y el constructo de cadena pesada en una célula y recoger el anticuerpo de P-cadepna con el isotipo deseado
Anticuerpos desinmunizados En otro aspecto de la invención, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos pueden desinmunizarse para reducir su inmunogenicidad utilizando las técnicas descritas, por ejemplo, en las publicaciones PCT n° WO 98/52976 y WO 00/34317 (incorporadas a la presente memoria como referencia)
Anticuerpos depvatizados y marcados Puede depvatizarse o ligarse con otra molécula (por ejemplo, otro péptido o proteína) un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antígeno de la invención En general, los anticuerpos o porción de los mismos se depvatizan de tal modo que la unión de P-cadepna no se vea afectada adversamente por la depvatización o el mareaje En consecuencia, los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención se pretende que incluyan tanto formas intactas como modificadas de los anticuerpos de P-cadepna humanos descritos en la presente memoria Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede ligarse funcionalmente (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otro modo) a una o más entidades moleculares distintas tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecifico o un diacuerpo), un agente de detección, un mareaje, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que puede mediar la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región núcleo de estreptavidina o un marcador de polihistidina) Se produce un tipo de anticuerpo depvatizado reticulando dos o mas anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos) Los reticulantes adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos distintamente reactivos separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzotl-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncionales (por ejemplo,
suberato de disuccinimidilo) Dichos engarces están disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, IL Otro tipo de anticuerpo depvatizado es un anticuerpo marcado Los agentes de detección útiles con los que puede depvatizarse un anticuerpo o porción de unión a antígeno de la invención incluyen compuestos fluorescentes incluyendo fluoresceina, fluoresceína isotiocianato, rodamina, cloruro de 5-d?met?lam?no-1 -naftalenosulfon?lo, ficoeptpna, fosforolantánidos y similares Un anticuerpo puede marcarse también con enzimas que son útiles para detección tales como peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares Cuando un anticuerpo se marca con una enzima detectable, se detecta añadiendo reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción que puede distinguirse Por ejemplo, cuando está presente el agente peroxidasa de rábano picante, la adición de peróxido de hidrógeno y diammobencidina conduce a un producto de reacción coloreado que es detectable Un anticuerpo puede marcarse también con biotina, y detectarse mediante la medida indirecta de la unión de avidina o estreptavidina Un anticuerpo puede marcarse también con un epítope po peptídico predeterminado reconocido por un informador secundario (por ejemplo, secuencias par cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, marcadores epitópicos) En algunas modalidades, los marcajes se unen mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estepco potencial Puede
depvatizarse también un anticuerpo de P-cadepna con un grupo químico tal como po etileng col (PEG), un grupo metilo o etilo o un grupo carbohidrato Estos grupos son útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la semivida sérica
Afinidad de unión de anticuerpos de P-cadepna a P-cadenna Puede determinarse la afinidad de unión (KD) y la velocidad de disociación (k0ff) de un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antigeno del mismo a P-cadepna mediante procedimientos conocidos en la técnica La afinidad de unión puede medirse mediante ELISA, RÍA, citometria de flujo o resonancia de plasmón superficial tal como BIACORE ™ La velocidad de disociación puede medirse mediante resonancia de plasmón superficial Preferiblemente, la afinidad de unión y la velocidad de disociación se miden mediante resonancia de plasmón superficial Más preferiblemente, la afinidad de unión y la velocidad de disociación se miden utilizando BIACORE™ Puede determinarse si un anticuerpo tiene sustanclalmente la misma KD que un anticuerpo de P-cadepna utilizando procedimientos conocidos en la técnica Dichos procedimientos de determinación de KD y K0ff pueden utilizarse durante la etapa de examen inicial, así como las etapas posteriores de optimización
Identificación de epitopes de P-cadenna reconocidos por anticuerpos de P-cadepna La invención proporciona anticuerpos de P-cadepna humanos que se unen a P-cadepna y compiten o compiten de forma cruzada con y/o se unen al mismo epítope que cualquiera de los anticuerpos descritos en los Cuadros 1 ó 2 Puede determinarse si un anticuerpo se une al mismo epítope o compite de forma cruzada por la unión con un anticuerpo de P-cadepna de la presente invención utilizando procedimientos conocidos en la técnica En una modalidad, se permite al anticuerpo de P-cadepna de la invención unirse a P-cadepna en condiciones saturantes, y después se mide la capacidad del anticuerpo de ensayo de unirse a P-cadepna Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a P-cadepna al mismo tiempo que el anticuerpo de P-cadepna, entonces el anticuerpo de ensayo se une a un epítope diferente que el anticuerpo de P-cadepna Sin embargo, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse a P-cadepna al mismo tiempo, entonces el anticuerpo de ensayo se une al mismo epítope, un epítope superpuesto, o un epítope que está en estrecha proximidad al epitope unido por el anticuerpo de P-cadepna humana Este experimento puede realizarse utilizando ELISA, RÍA, BIACORE™ o citometpa de flujo En una modalidad preferida, el experimento se realiza utilizando ELISA
Inhibición de la actividad P-cadenna por anticuerpo de P-cadenna Los anticuerpos de P-cadepna que inhiben la actividad P-cadepna pueden identificarse utilizando una serie de ensayos Por ejemplo, un ensayo de agregación celular proporciona un procedimiento de medida de la agregación celular dependiente de P-cadepna Este tipo de ensayo utiliza una linea celular que sobreexpresa P-cadepna, en la que las células se disponen en suspensión y se permiten forman agregados dependientes de P-cadepna El ensayo de agregación se utiliza entonces para cuantificar la capacidad de un anticuerpo de P-cadepna de evitar esta agregación midiendo el tamaño de los agregados celulares resultantes con y sin el anticuerpo El tamaño de agregado celular en función de la concentración de anticuerpo de P-cadepna puede utilizarse entonces para determinar el valor de CI50 El ejemplo 4 proporciona detalles adicionales de un ensayo de agregación dependiente de P-cadepna que se utilizo para medir valores de Cl50 para varios anticuerpos de P-cadepna Pueden utilizarse también ensayos de adhesión celular para medir la capacidad de un anticuerpo de P-cadepna de bloquear la adhesión de células a un receptor de P-cadepna que se ha inmovilizado sobre un soporte sólido Este tipo de ensayo puede llevarse a cabo, por ejemplo, inmovilizando P-cadepna sobre un soporte sólido tal como plástico Se permite después a las células que sobreexpresan P-cadepna adherirse al soporte solido mediante interacciones P-cadepna-P-cadepna El nivel de
adhesión puede cuantificarse después con y sin un anticuerpo de P-cadepna La adhesión en función de la concentración de anticuerpo se utiliza entonces para determinar el valor de Cl50 El ejemplo 3 proporciona detalles adicionales de un ensayo de adhesión celular dependiente de P-cadepna que se utilizó para medir los valores de CI50 para anticuerpos de P-cadepna La inhibición de la actividad P-cadepna puede medirse también utilizando un ensayo de desestabi zación de esferoide dependiente de P-cadepna Este tipo de ensayo mide la capacidad de un anticuerpo de P-cadepna de desestabilizar agregaciones celulares dependientes de P-cadepna preformadas Al medir la reducción de tamaño de los agregados en función de la concentración de anticuerpo, puede determinarse un valor de Cl50 El ejemplo 5 proporciona detalles adicionales de un ensayo de desestabi zación de esferoide dependiente de P-cadepna que se utilizó para medir los valores de Cl50 para anticuerpos de P-cadepna Los procedimientos y ensayos descritos anteriormente para determinar la inhibición de la actividad P-cadepna mediante diversos anticuerpos o porciones de unión a antigeno de los mismos pueden utilizarse durante la etapa de examen inicial, así como durante las etapas de optimización posteriores
Selectividad molecular Puede determinarse la selectividad de los anticuerpos de P-cadepna de la presente invención frente a otras cadepnas tales como E-cadepna utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica Por ejemplo,
puede determinarse la selectividad utilizando transferencia Western, citometría de flujo, ELISA, mmunoprecipitación o RÍA El ejemplo 7 proporciona detalles adicionales de un ensayo ELISA que se utilizó para medir la selectividad de anticuerpos específicos de P-cadepna frente a E-cadepna Los procedimientos y ensayos descritos anteriormente para determinar la selectividad por P-cadepna de diversos anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos pueden utilizarse durante la etapa de examen inicial, así como durante las etapas de optimización posteriores
Composiciones y administración farmacéutica Esta invención se refiere también a una composición farmacéutica para el tratamiento de crecimiento celular anormal en un mamífero, incluyendo un ser humano, que comprende una cantidad de un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antígeno del mismo, como se describe en la presente memoria, que es eficaz en el tratamiento de crecimiento celular anormal, y un vehículo farmacéuticamente aceptable Los anticuerpos y porciones de unión a antígeno de la presente invención pueden incorporarse a composiciones farmacéuticas adecuadas para administración a un sujeto Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o porción de unión a antígeno de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable Como se utiliza en la presente memoria, "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibactepanos
y antifúngicos, agentes isotonicos y retardadores de la absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles Son algunos ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, g cerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, po alcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio a la composición Son ejemplos adicionales de sustancias farmacéuticamente aceptables agentes humectantes o cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o la eficacia del anticuerpo Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisóhdas y sólidas tales como soluciones liquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, pildoras, polvos, hposomas y supositorios La forma preferida depende del modo de administración pretendido y de la aplicación terapéutica Las composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones inyectables o infusibles tales como composiciones similares a las utilizadas para inmunización pasiva de seres humanos El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, mtrapeptoneal, intramuscular) En una modalidad preferida, el anticuerpo se administra mediante infusión o inyección intravenosa En otra modalidad preferida, el anticuerpo se administra
mediante inyección intramuscular o subcutánea Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, con o sin conservante añadido Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión Como alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril exenta de pirógeno, antes del uso Las composiciones terapéuticas deben ser típicamente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento La composición puede formularse en forma de una solución, microemulsión, dispersión, posoma u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármaco Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el anticuerpo de P-cadepna en la cantidad requerida a un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son secado a vacío y hofilizacion, que proporcionan un polvo del ingrediente activo, mas cualquier
ingrediente deseado adicional a partir de una solución esterilizada anteriormente por filtración del mismo La fluidez apropiada de la solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de particula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos Puede ocasionarse la absorción prolongada de composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina Los anticuerpos o porciones de anticuerpo de la presente invención pueden administrarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas la vía/modo de administración preferido es infusión subcutánea, intramuscular o intravenosa Como apreciará el experto en la técnica, la vía/modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados En ciertas modalidades, las composiciones de anticuerpo de la presente invención pueden prepararse con un vehículo que protegerá al anticuerpo frente a una liberación rápida tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados Pueden utilizarse polímeros biocompatibles biodegradables tales como etilenvinilacetato, polianhidpdos, pol?(ác?do g cólico), colágeno, po ortoésteres y pol?(ác?do láctico) Son conocidos generalmente por los expertos en la técnica muchos procedimientos para la preparación de dichas formulaciones Véase, por ejemplo, "Sustained and
Controlled Reléase Drug Delivery Systems", J R Robinson, Ed , Marcel Dekker, Ine , Nueva York, 1978, que se incorpora a la presente memoria como referencia Pueden incorporarse también compuestos activos adicionales a las composiciones En ciertas modalidades, se coformula y/o se coadministra un anticuerpo de P-cadepna inhibitorio de la invención con uno o más agentes terapéuticos adicionales Estos agentes incluyen, sin limitación, anticuerpos que se unen a otras dianas, agentes antitumorales, agentes antiangiogénesis, inhibidores de la transducción de señal, agentes antiproliferativos, agentes quimioterapéuticos o análogos peptídicos que inhiben P-cadepna Dichas terapias de combinación puede requerir dosificaciones menores del anticuerpo de P-cadepna inhibitorio, asi como los agentes coadministrados, evitando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas a las diversas monoterapias
Las composiciones de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de un anticuerpo o porción de unión a antígeno de la invención Una "cantidad terapéuticamente eficaz" designa una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o porción de unión a antígeno puede variar según factores tales como el estado patológico, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo de desencadenar una respuesta deseada en el individuo Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la
que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción de unión a antígeno está superado por los efectos beneficiosos terapéuticos Una "cantidad profilácticamente eficaz" designa una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el efecto profiláctico deseado Típicamente, puesto que se utiliza una dosis profiláctica en sujetos antes de, o en una etapa temprana de, la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz puede ser menor que la cantidad terapéuticamente eficaz Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica) Por ejemplo, puede administrarse una sola inyección intravenosa rápida, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo, o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación por la facilidad de administración y la uniformidad de dosificación La forma de unidad de dosificación como se utiliza en la presente memoria designa unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos a tratar, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehiculo farmacéutico necesario La especificación de las formas de unidad de dosificación de la invención está dictada por y es directamente dependiente de (a) las
características únicas del anticuerpo de P-cadepna o porción del mismo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de combinar dicho anticuerpo para el tratamiento de sensibilidad en individuos Un intervalo ejemplar no limitante para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es de 0 025 a 50 mg/kg, más preferiblemente de 0 1 a 50 mg/kg, más preferiblemente de 0 1 -25, 0 1 a 10 ó 0 1 a 3 mg/kg En algunas modalidades, una formulación contiene 5 mg/ml de anticuerpo en un tampón de citrato de sodio 20 mM, pH 5 5, NaCI 140 mM y pohsorbato 80 0 2 mg/ml Ha de observarse que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección a aliviar Ha de entenderse adicionalmente que, para cualquier sujeto particular, deben ajustarse regímenes de dosificación específicos a lo largo del tiempo según la necesidad individual y el JUICIO profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación indicados en la presente memoria son solo ejemplares y no se pretende que limiten el alcance o la práctica de la composición reivindicada Otro aspecto de la presente invención proporciona kits que comprenden un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antígeno de la invención o una composición que comprende dicho anticuerpo o porción Un kit puede incluir, además del anticuerpo o composición, agentes de diagnóstico o terapéuticos Un kit puede incluir también instrucciones para uso
en un procedimiento de diagnóstico o terapéutico En una modalidad preferida, el kit incluye el anticuerpo o una composición que lo comprende y un agente de diagnóstico que puede utilizarse en un procedimiento descrito a continuación En otra modalidad preferida, el kit incluye un anticuerpo o una composición que lo comprende y uno o más agentes terapéuticos que pueden utilizarse en un procedimiento descrito a continuación
Procedimientos de diagnóstico en uso Los anticuerpos de P-cadepna o porciones de unión a antígeno de los mismos pueden utilizarse en procedimientos de diagnóstico para detectar P-cadepna en una muestra biológica in vitro o in vivo Por ejemplo, los anticuerpos de P-cadepna pueden utilizarse en un inmunoensayo convencional incluyendo, sin limitación, un ELISA, un RÍA, citometría de flujo, mmunohistoquímica de tejido, transferencia Western o inmunoprecipitación Los anticuerpos de P-cadepna de la invención pueden utilizarse para detectar P-cadepna de seres humanos Los anticuerpos de P-cadepna pueden utilizarse también para detectar P-cadepna de ratones, ratas y monos Cynomolgus La invención proporciona un procedimiento para detectar P-cadepna en una muestra biológica que comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo de P-cadepna de la invención y detectar el anticuerpo unido En una modalidad, el anticuerpo de P-cadepna esta marcado directamente con un mareaje detectable En otra modalidad, el
anticuerpo de P-cadepna (el primer anticuerpo) no está marcado y un segundo anticuerpo u otra molécula que puede unirse al anticuerpo de P-cadepna está marcado Como es bien conocido por un experto en la técnica, se elige un segundo anticuerpo que sea capaz de unirse específicamente a la especie y clase particular del primer anticuerpo Por ejemplo, si el anticuerpo de P-cadepna es una IgG humana, entonces el anticuerpo secundario podría ser un anti-lgG humano Otras moléculas que pueden unirse a anticuerpos incluyen, sin limitación, proteína A y proteína G, estando ambas disponibles comercialmente, por ejemplo, en Pierce Chemical Co Los marcajes adecuados para el anticuerpo o anticuerpo secundario se han discutido anteriormente, e incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinesterasa, los ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidma/biotina, los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbehferona, fluoresceína, fluoresceína isotiocianato, rodamina, diclorotpazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeptpna, un ejemplo de material luminiscente incluye luminol, y los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 125l, 131l, 35S o 3H En otras modalidades, la P-cadepna puede ensayarse en una muestra biológica mediante un inmunoensayo competitivo utilizando patrones de P-cadepna marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo de P-
cadepna no marcado En este ensayo, se combinan la muestra biológica, los patrones de P-cadepna marcada y el anticuerpo de P-cadepna, y se determina la cantidad de patrón de P-cadepna marcada unida al anticuerpo no marcado La cantidad de P-cadepna en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de patrón de P-cadepna marcada unida al anticuerpo de P-cadepna Pueden utilizarse los inmunoensayos dados a conocer anteriormente para una serie de fines Por ejemplo, los anticuerpos de P-cadepna pueden utilizarse para detectar P-cadepna en células cultivadas En una modalidad preferida, los anticuerpos de P-cadepna se utilizan para determinar la cantidad de P-cadepna producida por células que se han tratado con diversos compuestos Este procedimiento puede utilizarse para identificar compuestos que modulan los niveles de proteina P-cadepna Según este procedimiento, se trata una muestra de células con un compuesto de ensayo durante un periodo de tiempo, mientras que otra muestra se deja sin tratar Si se ha de medir el nivel total de P-cadepna, se lisan las células y se mide el nivel de P-cadepna total utilizando uno de los inmunoensayo descritos anteriormente Se compara el nivel total de P-cadepna en las células tratadas frente a no tratadas para determinar el efecto del compuesto de ensayo Es un inmunoensayo preferido para medir los niveles de P-cadepna total la citometria de flujo o inmunohistoquimica Los procedimientos tales como ELISA, RÍA, citometpa de flujo, transferencia Western, inmunohistoquimica, mareaje de superficie celular de proteínas de membrana
integrales e inmunoprecipitacion son bien conocidos en la técnica Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, supra Además, los inmunoensayos pueden aumentarse de escala para examen de alto rendimiento para ensayar en un gran número de compuestos la activación o inhibición de la expresión de P-cadepna Los anticuerpos de P-cadepna de la invención pueden utilizarse también para determinar los niveles de P-cadepna en un tejido o en células derivadas del tejido En algunas modalidades, el tejido es un tejido enfermo En algunas modalidades del procedimiento, se extirpa un tejido o una biopsia del mismo de un paciente Se utiliza después el tejido o biopsia en un inmunoensayo para determinar, por ejemplo, los niveles de P-cadepna total o la localizacion de P-cadepna mediante los procedimientos discutidos anteriormente Los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse también in vivo para identificar tejidos y órganos que expresan P-cadepna Una ventaja de utilizar los anticuerpos de P-cadepna humana de la presente invención es que pueden utilizarse con seguridad in vivo sin desencadenar una respuesta inmune sustancial contra el anticuerpo tras la administración, al contrario que los anticuerpos de origen no humano o con anticuerpos humanizados o quiméricos El procedimiento comprende las etapas de administrar un anticuerpo de P-cadepna marcado detectablemente o una composición que los comprende a un paciente necesitado de dicho ensayo de diagnostico, y
someter al paciente a análisis de formación de imágenes para determinar la locahzación de los tejidos que expresan P-cadepna El análisis de formación de imágenes es bien conocido en la técnica médica e incluye, sin limitación, análisis de rayos X, formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) o tomografía computapzada (CT) El anticuerpo puede marcarse con cualquier agente adecuado para formación de imágenes in vivo, por ejemplo un agente de contraste tal como bario, que puede utilizarse para análisis de rayos X, o un agente de contraste magnético tal como un quelato de gadolinio, que puede utilizarse para MRI o CT Otros agentes de mareaje incluyen, sin limitación, radioisótopos tales como 99Tc En otra modalidad, el anticuerpo de P-cadepna no estará marcado y se formarán imágenes administrando un segundo anticuerpo u otra molécula que sea detectable y que pueda unirse al anticuerpo de P-cadepna En una modalidad, se obtiene una biopsia del paciente para determinar si el tejido de interés expresa P-cadepna
Procedimientos terapéuticos en uso En otra modalidad, la invención proporciona un procedimiento para inhibir la actividad P-cadepna administrando un anticuerpo de P-cadepna a un paciente necesitado de ello Cualquiera de los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos descritos en la presente memoria pueden utilizarse terapéuticamente En una modalidad preferida, el anticuerpo de P-cadepna es un anticuerpo humano, quimérico o humanizado En otra modalidad preferida, la P-cadepna es humana y el paciente es un paciente
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humano Como alternativa, el paciente puede ser un mamífero que expresa una P-cadepna con la que el anticuerpo de P-cadepna reacciona de forma cruzada El anticuerpo puede administrarse a un mamífero no humano que expresa P-cadepna con la que el anticuerpo reacciona de forma cruzada (por ejemplo, una rata, un ratón o un m mono Cynomolgus) con fines veterinarios o como modelo animal de enfermedad humana Dichos modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de anticuerpos de esta invención En otra modalidad, puede administrarse un anticuerpo de P-cadepna o porción de anticuerpo del mismo a un paciente que expresa niveles inapropiadamente altos de P-cadepna El anticuerpo puede administrarse una vez, pero se administra mas preferiblemente múltiples veces El anticuerpo puede administrarse de tres veces al dia a una vez cada seis meses o más La administración puede ser en un programa ta! como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses El anticuerpo puede administrarse también continuamente mediante una minibomba El anticuerpo puede administrarse por via mucosa, bucal, mtranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral o intratumoral El anticuerpo puede administrarse una vez, al menos dos veces o durante al menos el periodo de tiempo hasta que la afección se trate, se palie o se cure El anticuerpo se administrará generalmente durante el tiempo
mientras esté presente la afección El anticuerpo se administrará generalmente como parte de una composición farmacéutica como se describe supra La dosificación de anticuerpo estará generalmente en el intervalo de 0 1 a 100 mg/kg, más preferiblemente de 0 5 a 50 mg/kg, más preferiblemente de 1 a 20 mg/kg, y aún más preferiblemente de 1 a 10 mg/kg La concentración sérica del anticuerpo puede medirse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica Esta invención se refiere también a un procedimiento para el tratamiento de crecimiento celular anormal en un mamífero, incluyendo un ser humano, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antígeno del mismo, como se describe en la presente memoria, que sea eficaz en el tratamiento de crecimiento celular anormal En una modalidad de este procedimiento, el crecimiento celular anormal es cáncer incluyendo, pero sin limitación, mesotelioma, hepatobi ar (hepático y de conducto biliar), tumor primario o secundario del SNC, tumor cerebral primario o secundario, cáncer de pulmón (NSCLC y SCLC), cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o infraocular, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gastrointestinal (gástrico, colorrectal y duodenal), cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometpo, carcinoma de cuello del útero, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, enfermedad de Hodgkm,
cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer de sistema endocrino, cáncer de glándula tiroides, cáncer de glándula paratiroides, cáncer de glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer testicular, leucemia crónica o aguda, leucemia mieloide crónica, hnfomas linfocíticos, cáncer de vejiga, cáncer de riñon o uréter, carcinoma de célula renal, carcinoma de pelvis renal, neoplasmas del sistema nervioso central (SNC), nfoma primario del SNC, linfoma no de Hodgkm, tumores del eje espinal, ghoma de tallo cerebral, adenoma de pituitaria, cáncer adrenocortical, cáncer de vesícula biliar, mieloma múltiple, colangiocarcinoma, fibrosarcoma, neuroblastoma, retinoblastoma o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores En una modalidad preferida de la presente invención, el cáncer se selecciona de cáncer de pulmón (NSCLC y SCLC), cáncer de cabeza o cuello, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de mama, cáncer de pñón o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, neoplasmas del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, linfoma no de Hodgkm, tumores de eje espinal o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores En otra modalidad preferida de la invención, el cáncer se selecciona de cáncer de pulmón (NSCLC y SCLC), cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de la región anal o una combinación de uno o mas de los cánceres anteriores
En otra modalidad de dicho procedimiento, dicho crecimiento celular anormal es una enfermedad proliferativa benigna incluyendo, pero sin limitación, psoriasis, hipertrofia prostática benigna o restinosis Esta invención se refiere también a un procedimiento para el tratamiento de crecimiento celular anormal en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad de un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antigeno del mismo, como se describe en la presente memoria, que es eficaz para tratar crecimiento celular anormal en combinación con un agente antitumoral seleccionado del grupo constituido por inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, antimetabo tos, antibióticos intercalantes, inhibidores de factor de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, modificadores de la respuesta biológica anticuerpos, citotóxicos, antihormonas y antiandrógenos La invención se refiere también a una composición farmacéutica para el tratamiento de crecimiento celular anormal en un mamífero, incluyendo un ser humano, que comprende una cantidad de un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antígeno del mismo, como se describe en la presente memoria, que es eficaz para tratar crecimiento celular anormal en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y un agente antitumoral seleccionado del grupo constituido por inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, antimetabohtos, antibióticos intercalantes, inhibidores de factor de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, modificadores de la respuesta biológica, antihormonas y
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antiandrógenos La invención se refiere también a un procedimiento para el tratamiento de un trastorno hiperprohferativo en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antigeno del mismo, como se describe en la presente memoria, en combinación con un agente antitumoral seleccionado del grupo constituido por agentes antiproliferativos, inhibidores de quinasa, inhibidores de la angiogénesis, inhibidores de factor de crecimiento, inhibidores de COX-I, inhibidores de COX-II, inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos intercalantes, inhibidores de factor de crecimiento, radiación, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, modificadores de la respuesta biológica, anticuerpos, citotóxicos, antihormonas, estatinas y antiandrógenos En una modalidad de la presente invención, el agente antitumoral utilizado junto con un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antígeno del mismo y las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria, es un agente antiangiogénesis, inhibidor de quinasa, paninhibidor de quinasa o inhibidor de factor de crecimiento Los panmhibidores de quinasa preferidos incluyen SU-1 1248, descrito en la patente de EE UU n° 6,573,293 (Pfizer, Ine , NY, EE UU ) Los agentes antiangiogénesis incluyen, pero sin limitación, los siguientes agentes tales como inhibidors de EGF, inhibidores de EGFR, inhibidores de VEGF, inhibidores de VEGFR, inhibidores de TIE2, inhibidores
de IGF1 R, inhibidores de COX-II (ciclooxigenasa II), inhibidores de MMP-2 (metaloproteinasa de matriz 2) e inhibidores de MMP-9 (metaloproteinasa de matriz 9) Los inhibidores de VEGF preferidos incluyen, por ejemplo, avastina (bevacizumab), un anticuerpo monoclonal anti-VEGF de Genentech, Ine de South San Francisco, California Los inhibidores de VEGF adicionales incluyen CP-547 632 (Pfizer Ine , NY, EE UU ), AG13736 (Pfizer Ine ), ZD-6474 (AstraZeneca), AEE788 (Novartis), AZD-2171 , VEGF Trap (Regeneron/Aventis), Vatalanib (también conocido como PTK-787, ZK-222584 Novartis & Schenng AG), Macugen (pegaptanib octasodico, NX-1838, EYE-001 , Pfizer Ine /Gilead/Eyetech), IM862 (Cytran Ine de Kirkland, Washington, EE UU ) y angiozíma, una pbozíma sintética de Ribozyme (Boulder, Colorado) y Chiron (Emeryville, California) y combinaciones de los mismos Los inhibidores de VEGF útiles en la práctica de la presente invención se dan a conocer en las patentes de EE UU n° 6,534,524 y 6,235,764, ambas incorporadas en su totalidad con cualquier fin Los inhibidores de VEGF particularmente preferidos incluyen CP-547 632, AG13736, Vatalanib, Macugen y combinaciones de los mismos Se describen inhibidores de VEGF adicionales, por ejemplo, en el documento WO 99/24440 (publicado el 20 de mayo de 1999), la solicitud internacional PCT PCT/IB99/00797 (presentada el 3 de mayo de 1999), los documentos WO 95/21613 (publicado el 17 de agosto de 1995), WO 99/61422 (publicado el 2 de diciembre de 1999), la patente de Estados Unidos
6,534,524 (da a conocer AG13736), la patente de Estados Unidos 5,834,504 (expedida el 10 de noviembre de 1998), el documento WO 98/50356 (publicado el 12 de noviembre de 1998), la patente de Estados Unidos 5,883, 1 13 (expedida el 16 de marzo de 1999), la patente de Estados Unidos 5,886,020 (expedida el 23 de marzo de 1999), la patente de Estados Unidos 5,792,783 (expedida el 1 1 de agosto de 1998), la patente de EE UU 6,653,308 (expedida el 25 de noviembre de 2003), los documentos WO 99/10349 (publicado el 4 de marzo de 1999), WO 97/32856 (publicado el 12 de septiembre de 1997), WO 97/22596 (publicado el 26 de junio de 1997), WO 98/54093 (publicado el 3 de diciembre de 1998), WO 98/02438 (publicado el 22 de enero de 1998), WO 99/16755 (publicado el 8 de abril de 1999) y WO 98/02437 (publicado el 22 de enero de 1998), todos los cuales se incorporan como referencia en su totalidad Otros agentes antiproliferativos que pueden utilizarse con los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la presente invención incluyen inhibidores de la enzima famesil proteína transferasa e inhibidores del receptor tirosina quinasa PDGFr, incluyendo los compuestos dados a conocer y reivindicados en las siguientes solicitudes de patente de Estados Unidos 09/221946 (presentada el 28 de diciembre de 1998), 09/454058 (presentada el 2 de diciembre de 1999), 09/501 163 (presentada el 9 de febrero de 2000), 09/539930 (presentada el 31 de marzo de 2000), 09/202796 (presentada el 22 de mayo de 1997), 09/384339 (presentada el 26 de agosto de 1999) y 09/383755 (presentada el 26 de agosto de 1999), y los
compuestos dados a conocer y reivindicados en las siguientes solicitudes de patente provisional de Estados Unidos 60/168207 (presentada el 30 de noviembre de 1999), 60/1701 19 (presentada el 10 de diciembre de 1999), 60/177718 (presentada el 21 de enero de 2000), 60/168217 (presentada el 30 de noviembre de 1999) y 60/200834 (presentada el 1 de mayo de 2000) Cada una de las solicitudes de patente y solicitudes de patente provisional anteriores se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad Los inhibidores de PDGFr incluyen, pero sin limitación, los dados a conocer en los documentos WO 01/40217, publicado el 7 de julio de 2001 , y WO 2004/020431 , publicado el 1 1 de marzo de 2004, cuyos contenidos se incorporan en su totalidad con cualquier fin Los inhibidores preferidos de PDGFr incluyen CP-673 451 y CP-868 596 de Pfizer y sus sales farmacéuticamente aceptables Los inhibidores de GARF preferidos incluyen AG-2037 de Pfizer
(pehtrexol y sus sales farmacéuticamente aceptables) Los inhibidores de GARF útiles en la practica de la presente invención se dan a conocer en la patente de EE UU n° 5,608,082, que se incorpora en su totalidad con cualquier fin Los ejemplos de inhibidores de COX-II útiles que pueden utilizarse junto con un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antigeno del mismo, como se describe en la presente memoria, y las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria incluyen CELEBREX ™
(celecoxib), parecoxib, deracoxib, ABT-963, MK-663 (etopcoxib), C0X-189 (lumiracoxib), BMS 347070 RS 57067, NS-398, Bextra (valdecoxib), paracoxib, Vioxx (rofecoxib), SD-8381 , 4-met?l-2-(3,4-d?met?lfen?l)-1-(4-sulfamo?lfen?l)-1 H-pirrol, 2-(4-etox?fen?l)-4-met?l-1 -(4-sulfamo?lfen?l)-1 H-pirrol, T-614, JTE-522, S-2474, SVT-2016, CT-3, SC-58125 y Arcoxia (etopcoxib) Adicionalmente, se dan a conocer inhibidores de COX-II en las solicitudes de patente de EE UU n° 10/801 ,446 y 10/801 ,429, cuyos contenidos se incorporan en su totalidad con cualquier fin En una modalidad preferida, el agente antitumoral es celecoxib como se da a conocer en la patente de EE UU n° 5,466,823, cuyos contenidos se incorporan como referencia en su totalidad con cualquier fin La estructura de celecoxib se muestra a continuación
Celecoxib N° CAS 169590-42-5 5 466 823 C-2779 SC-58635 En una modalidad preferida, el agente antitumoral es valdecoxib como se da a conocer en la patente de EE UU 5,633,272, cuyos contenidos
se incorporan como referencia en su totalidad con cualquier fin. La estructura de valdecoxib se muestra a continuación:
Valdecoxib N° CAS 181695-72-7 5.633.272 C-2865 SC-65872 En una modalidad preferida, el agente antitumoral es parecoxib como se da a conocer en la patente de EE.UU. 5,932,598, cuyos contenidos se incorporan como referencia en su totalidad con cualquier fin. La estructura de parecoxib se muestra a continuación:
Parecoxib N° CAS 198470-84-7 5.932.598 C-2931
En una modalidad preferida, el agente antitumoral es deracoxib como se da a conocer en la patente de EE.UU. 5,521 ,207, cuyos contenidos se incorporan como referencia en su totalidad con cualquier fin. La estructura de deracoxib se muestra a continuación:
Deracoxib N° CAS 169590-41-4 5.521.207 C-2779 En una modalidad preferida, el agente antitumoral es SD-8381 como se da a conocer en la patente de EE.UU. 6,034,256, cuyos contenidos se incorporan como referencia en su totalidad con cualquier fin. La estructura de SD-8381 se muestra a continuación:
SD-8381 6.034.256 Ej. 175
En una modalidad preferida, el agente antitumoral es ABT-963 como se da a conocer en la publicación internacional número WO 2002/24719, cuyos contenidos se incorporan como referencia en su totalidad con cualquier fin. La estructura de ABT-963 se muestra a continuación:
ABT-963 WO 00/24719 En una modalidad preferida, el agente antitumoral es rofecoxib como se muestra a continuación:
Rofecoxib N° CAS 16201 1 -90-7 En una modalidad preferida, el agente antitumoral es MK-663 (etohcoxib) como se da a conocer en la publicación internacional número WO 1998/03484, cuyos contenidos se incorporan como referencia en su totalidad con cualquier fin. La estructura de etoricoxib se muestra a continuación.
MK-663, etopcoxib N° CAS 202409-33-4 WO 98/03484 SC-86218 En una modalidad preferida, el agente antitumoral es COX-189 (lumiracoxib) como se da a conocer en la publicación internacional número WO 1999/11605, cuyos contenidos se incorporan como referencia con cualquier fin. La estructura de lumiracoxib se muestra a continuación:
COX-189, lumiracoxib N° CAS 220991 -20-8 Novartis WO 99/1 1605 En una modalidad preferida, el agente antitumoral es BMS-347070 como se da a conocer en la patente de Estados Unidos n° 6,180,651 ,
cuyos contenidos se incorporan como referencia en su totalidad con cualquier fin. La estructura de BMS-347070 se muestra a continuación:
BMS 347070 N° CAS 197438-48-5 6.180.651 En una modalidad preferida, el agente antitumoral es NS-398
(CAS 123653-11 -2). La estructura de NS-398 (CAS 123653-11-2) se muestra a continuación:
NS-398 N° CAS 123653-11 -2 En una modalidad preferida, el agente antitumoral es RS 57067 (CAS 17932-91 -3). La estructura para RS-57067 (CAS 17932-91-3) se muestra a continuación:
RS 57067 N° CAS 17932-91 -3 En una modalidad preferida, el agente antítumoral es 4-metil-2-(3,4-dimetilfenil)-1-(4-sulfamoilfenil)-1 /-/-pirrol. La estructura del 4-metil-2-(3,4-dimetilfenil)-1 -(4-sulfamoilfenil)-1 /-/-pirrol se muestra a continuación:
En una modalidad preferida, el agente antítumoral es 2-(4-etoxifenil)-4-metil-1 -(4-sulfamoilfenil)-1 /-/-pirrol. La estructura del 2-(4-etoxifeníl)-4-metil-1 -(4-sulfamoílfenil)-1 /-/-pirrol se muestra a continuación:
En una modalidad preferida, el agente antitumoral es meloxicam. La estructura de meloxicam se muestra a continuación:
Meloxicam Otros inhibidores útiles como agentes antitumorales utilizados junto con anticuerpos de la presente invención y composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria incluyen aspirina y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) que inhiben la enzima que produce prostaglandinas (ciclooxigenasa I y II), dando como resultados niveles inferiores de prostaglandinas, incluyen, pero sin limitación, los siguientes: salsalato (Amígesic), diflunisal (Dolobid), ibuprofeno (Motrin), ketoprofeno (Orudis), nabumetona (Relafen), piroxicam (Feldene), naproxeno (Aleve, Naprosyn), diclofenaco (Voltaren), indometacina (Indocín), sulindaco (Clinoril), tolmetina (Tolectin), etodolac (Lodine), ketorolac (Toradol), oxaprozina (Daypro) y combinaciones de los mismos. Los ¡nhibidores de COX-I preferidos incluyen ibuprofeno (Motrin), nuprina, naproxeno (Aleve), ¡ndometacina (Indocin), nabumetona (Relafen) y combinaciones de los mismos. Los agentes dirigidos utilizados junto con un anticuerpo de P-caderina o porción de unión a antigeno del mismo, como se describen en la presente memoria, y las composiciones farmacéuticas de los mismos como se describen en la presente memoria, incluyen inhibidores de EGFr tales como Iressa (gefitinib, AstraZeneca), Tarceva (erlotinib u OSI-774, OSI
Pharmaceuticals Ine ), Erbitux (cetuximab, Imclone Pharmaceuticals, Ine ), EMD-7200 (Merck AG), ABX-EGF (Amgen Ine y Abgenix Ine ), HR3 (gobierno cubano), anticuerpos IgA (Universidad de Erlangen-Nuremberg), TP-38 (IVAX), proteína de fusión de EGFR, vacuna EGF , inmunohposomas anti-EGFr (Hermes Biosciences Ine ) y combinaciones de los mismos Los inhibidores de EGFr preferidos incluyen Iressa, Erbitux, Tarceva y combinaciones de los mismos La presente invención se refiere también a agentes antitumorales seleccionados de paninhibidores de receptor erb o inhibidores de receptor ErbB2 tales como CP-724 714 (Pfizer, Ine ), CI-1033 (canertmib, Pfizer, Ine ), Herceptm (trastuzumab, Genetech Ine ), Omitarg (2C4, pertuzumab, Genentech Ine ), TAK-165 (Takeda), GW-572016 (lonafarnib, GlaxoSmithKIine), GW-282974 (GlaxoSmithKIine), EKB-569 (Wyeth), PKI-166 (Novartis), dHER2 (vacuna HER2, Conxa y GlaxoSmithKIine), APC8024 (vacuna HER2, Dendreon), anticuerpo biespecifico ant?-HER2/neu (Decof Cáncer Center), B7 her2 lgG3 (Agensys), AS HER2 (Reserch Institute for Rad Biology & Medicine), anticuerpos biespecíficos tpfuncionales (Universidad de Munich) y mAb AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Ine ) y mAb 2B-1 (Chiron) y combinaciones de los mismos Los agentes antitumorales selectivos de erb preferidos incluyen herceptina, TAK-165, CP-724 714, ABX-EGF, HER3 y combinaciones de los mismos Los paninhibidores de receptor erbb preferidos incluyen GW572016, CI-1033, EKB-569 y Omitarg y combinaciones de los mismos
Los inhibidores de erbB2 adicionales incluyen aquellos descritos en los documentos WO 98/02434 (publicado el 22 de enero de 1998), WO 99/35146 (publicado el 15 de julio de 1999), WO 99/35132 (publicado el 15 de julio de 1999), WO 98/02437 (publicado el 22 de enero de 1998), WO 97/13760 (publicado el 17 de abril de 1997), WO 95/19970 (publicado el 27 de julio de 1995), la patente de Estados Unidos 5,587,458 (expedida el 24 de diciembre de 1996) y la patente de Estados Unidos 5,877,305 (expedida el 2 de marzo de 1999), cada uno de los cuales se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad Se describen también inhibidores de receptor ErbB2 útiles en la presente invención en las patentes de Estados Unidos n° 6,465,449 y 6,284,764, y la solicitud internacional n° WO 2001/98277, cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad Adicionalmente, pueden seleccionarse otros agentes antitumorales de los siguientes agentes BAY-43-9006 (Onyx Pharmaceuticals Ine ), Genasense (augmeroseno, Genta), Panitumumab (Abgenix/Amgen), Zeva n (Schepng), Bexxar (Copxa/GlaxoSmithKIine), Abarehx, Alimta, EPO 906 (Novartis), discodermohda (XAA-296), ABT-510 (Abbott), Neovastat (Aeterna), enzastaupna (Eli Lilly), combrestatina A4P (Oxigene), ZD-6126 (AstraZeneca), flavopipdol (Aventis), CYC-202 (Cyclacel), AVE-8062 (Aventis), DMXAA (Roche/Antisoma), Thymitaq (Eximias), Temodar (temozolomida, Schepng Plough) y Revilimd (Celegene) y combinaciones de los mismos Pueden seleccionarse otros agentes antitumorales de los
siguientes agentes CyPat (acetato de citproterona), Histerelin (acetato de histrelina), Plenaixis (depósito de abare x), Atrasentan (ABT-627), Satraplatin (JM-216), talomida (Thahdomide), Theratope, Temilifene (DPPE), ABI-007 (paclitaxel), Evista (raloxifeno), Atamestane (B?omed-777), Xyotax (poliglutamato de paclitaxel), Targetin (bexarotina) y combinaciones de los mismos Adicionalmente, pueden seleccionarse otros agentes antitumorales de los siguientes agentes Tpzaone (tirapazamina), Aposyn (exisu nd), Nevastat (AE-941 ), Ceplene (diclorhidrato de histamina), Orathecm (rubitecán), Virulizm, Gastpmmune (G17DT), DX-8951f (mesilato de exatecán), Onconase (ranpirnasa), BEC2 (mitumoab), Xcytpn (motexadma de gadolinio) y combinaciones de los mismos Pueden seleccionarse agentes antitumorales adicionales de los siguientes agentes CeaVac (CEA), NeuTrexm (glucuronato de tpmetresato) y combinaciones de los mismos Pueden seleccionarse agentes antitumorales adicionales de los siguientes agentes OvaRex (oregovomab), Osidem (IDM-1 ) y combinaciones de los mismos Pueden seleccionarse agentes antitumorales adicionales de los siguientes agentes Advexin (ING 201 ), Tirazone (tirapamina) y combinaciones de los mismos Pueden seleccionarse agentes anti-tumorales adicionales de los siguientes agentes RSR13 (efaproxiral), Cotara (1311 chTNT 1/b), NBI-3001 (IL-4) y combinaciones de los mismos Pueden seleccionarse agentes antitumorales adicionales de los siguientes agentes Canvaxin, vacuna de GMK, PEG Interon A, Taxoprexin
(DHA/paclitaxel) y combinaciones de los mismos Otros agentes antitumorales preferidos incluyen el inhibidor de MEK1/2 de Pfizer PD325901 , el inhibidor de MEK de Array Biopharm ARRY-142886, el inhibidor de CDK2 de Bristol Myers BMS-387 032, el inhibidor de CDK de Pfizer PD0332991 y AXD-5438 de AstraZeneca y combinaciones de los mismos Adicionalmente, pueden utilizarse también inhibidores de mTOR tales como CCI-779 (Wyeth) y los derivados de rapamicina RAD001 (Novartis) y AP-23573 (Apad), los inhibidores de HDAC SAHA (Merck Inc /Aton Pharmaceuticals) y combinaciones de los mismos Los agentes antitumorales adicionales incluyen el inhibidor de aurora-2 VX-680 (Vértex) y el inhibidor de Chk1/2 XL844 (Exilixis) Pueden utilizarse los siguientes agentes citotóxicos, por ejemplo uno o más seleccionados del grupo constituido por epirubicina (Ellence), docetaxel (Taxotere), paclitaxel, Zinecard (dexrazoxano), ptuximab (Rituxan), mesilato de imatinib (Gleevec) y combinaciones de los mismos, junto con un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antígeno del mismo, como se describe en la presente memoria, y composiciones farmacéuticas de los mismos, como se describen en la presente memoria La invención contempla también el uso de los anticuerpos y porciones de unión a antígeno de los mismos de la presente invención junto con terapia hormonal incluyendo, pero sin limitación, exemestano (Aromasin, Pfizer Ine ), leuprorehna (Lupron o Leuplin, TAP/Abbott/Takeda), anastrozol (Apmidex, AstraZeneca) gosrelina (Zoladex, AstraZeneca), doxercalciferol,
fadrozol, formestano, citrato de tamoxifeno (tamoxifeno, Nolvadex, AstraZeneca), Casodex (AstraZeneca), Abarelix (Praecis), Trelstar y combinaciones de los mismos La invención se refiere también a agentes de terapia hormonal tales como antiestrógenos incluyendo, pero sin limitación, fulvestrant, toremifeno, raloxifeno, lasofoxifeno, letrozol (Femara, Novartis), antiandrogenos tales como bicalutamida, flutamida, mifeppstona, nilutamida, Casodex® (4'-c?ano-3-(4-fluorofen?lsulfon?l)-2-h?drox?-2-met?l-3'- (tr?fluoromet?l)prop?onan?l?da, bicalutamida) y combinaciones de los mismos Ademas, la invención proporciona anticuerpos de la presente invención solos o en combinación con uno o más productos de cuidado paliativo, por ejemplo, un producto seleccionado del grupo constituido por Filgrastim (Neupogen), ondansetrón (Zofran), Fragmin, Procpt, Aloxi, E end o combinaciones de los mismos Los agentes citotoxicos particularmente preferidos incluyen
Camptosar, Erbitux, Iressa, Gleevec, Taxotere y combinaciones de los mismos Los siguientes inhibidores de topoisomerasa I pueden utilizarse como agentes antitumorales camptotecina, HCl de ipnotecán (Camptosar), edotecapna, oratecina (Supergen), exatecan (Danchi), BN-80915 (Roche) y combinaciones de los mismos Los inhibidores de topoisomerasa II particularmente preferidos incluyen epirubicma (Ellence) Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse con agentes
antitumorales, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos, agentes antitumorales derivados de plantas, derivados de camptotecina, inhibidores de tirosma quinasa, otros anticuerpos, interferones y/o modificadores de la respuesta biológica Los agentes alquilantes incluyen, pero sin limitación, ?/-óx?do de mostaza nitrogenada, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán, busulfán, mitobronitol, carbocuona, tiotepa, ranimustina, nimustina, temozolamida, AMD-473, altretamina, AP-5280, apazicuona, brostalicina, bendamustina, carmustina, estramustina, fotemustina, glufosfamida, ifosfamida, KW-2170, mafosfamida y mitolactol, los compuestos alquilantes coordinados con platino incluyen, pero sin limitación, cisplatino, Paraplatin (carboplatino), eptaplatino, lobaplatino, nedaplatino, Eloxatm (oxa platino, Sanofi) o satraplatino y combinaciones de los mismos Los agentes alquilantes particularmente preferidos incluyen Eloxatin (oxaliplatmo) Los antimetabo tos incluyen, pero sin limitación, metotrexato, 6-mercaptopupna pbósido, mercaptopurina, 5-fluorouracílo (5-FU) solo o en combinación con leucovopna, tegafur, UFT, doxifluridina, carmofur, citarabina, ocfosfato de citarabina, enocitabina, S-1 , Alimta (premetrexed disódico, LY231514, MTA), Gemzar (gemcitabina, Eli Lilly), fludarabina, 5-azac?t?dina, capecitibina, cladribina, clofarabma, decitabina, eflornitina, etinílcitidina, citosina arabinósido, hidroxiurea, TS-1 , melfalán, nelarabina, nolatrexed, ocfosfato, premetrexed disódico, pentostatina, pelitrexol, raltitrexed, tpapina, tpmetrexato, vidarabina, vincpstma, vinorelbma o, por ejemplo, uno de los
antimetabohtos preferidos dados a conocer en la solicitud de patente europea n° 239362 tal como ácido ?/-(5-[?/-(3,4-d?h?dro-2-met?l-4-oxoqu?nazol?n-6-?lmet?l)-?/-met?lam?no]-2-teno?l)-L-glutám?co y combinaciones de los mismos Los antibióticos incluyen antibióticos intercalantes, pero sin limitación aclarubicina, actinomicina D, amrubicina, anamicina, adpamicina, bleomicina, daunorubicina, doxorubicma, elsamitrucina, epirubicina, galarubicina, idarubicina, mitomicina C, nemorubicina, neocarzmostatina, peplomicina, pirarubicma, rebecamicina, estimalámero, estreptozocma, valrubicina, zinostatina y combinaciones de los mismos Las sustancias antitumorales derivadas de plantas incluyen, por ejemplo, las seleccionadas de inhibidores mitóticos, por ejemplo, vinblastina, docetaxel (Taxotere), pac taxel y combinaciones de las mismas Los agentes inhibidores de topoisomerasa citotóxicos incluyen uno o más agentes seleccionados de! grupo constituido por aclarubicma, amonafida, belotecán, camptotecina, 10-h?drox?camptotec?na, 9-aminocamptotecina, diflomotecán, HCl de ipnotecán (Camptosar), edotecapna, epirubicma (Ellence), etopósido, exatecán, gimatecán, lurtotecán, mitoxantrona, pirarubicina, píxantrona, rubitecán, sobuzoxano, SN-38, taflupósido, topotecán y combinaciones de los mismos Los agentes inhibidores de topoisomerasa citotóxicos preferidos incluyen uno o más agentes seleccionados del grupo constituido por camptotecina, 10-h?drox?camptotec?na, 9-am?nocamptotec?na, HCl de ipnotecán (Camptosar), edotecapna, epirubicina (Ellence), etopósido, SN-38,
topotecan y combinaciones de los mismos Los productos inmunologicos incluyen interferones y numerosos otros agentes potenciadores inmunes Los interferones incluyen mteríerón alfa, mterferón alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon beta, interferón gamma-1 a, interferon gamma-1 b (Actimmune) o mteferon gamma-n1 y combinaciones de los mismos Otros agentes incluyen filgrastim, lentmano, sizofilano, TheraCys, ubenimex WF-10, aldesleukina, alemtuzumab, BAM-002, dacarbazina, dachzumab, denileukina, gemtuzumab, ozogamicina, ibptumomab, imiquimod, lenograstim, lentinano, vacuna de melanoma (Copxa), molgramostim, OncoVAX-CL, sargramostim, tasonermina, tecleukina, timalasina, tositumomab, Virulizm, Z-100, epratuzumab, mitumomab, oregovomab, pemtumomab (Y-muHMFG1 ), Provenge (Dendreon) y combinaciones de los mismos Los modificadores de la respuesta biológica son agentes que modifican los mecanismos de defensa o las respuestas biológicas de organismos vivos tales como supervivencia, crecimiento o diferenciación de células de tejido para dirigirlas a tener actividad antitumoral Dichos agentes incluyen krestina, lentinano, sizofirano, picibanil, ubenimex y combinaciones de los mismos Otros agentes anticancerosos incluyen alitretinoina, amp gén, atrasentan, bexaroteno, bortezomib, bosentano, calcitpol, exisuhnd, finastepda, fotemustina, acido ibandronico, miltefosina, mitoxantrona, I-asparaginasa, procarbazina, dacarbazina, hidroxicarbamida, pegaspargasa,
pentostatina, tazaroteno, Telcyta (TLK-286, Tehk Ine ), Velcade (bortemazib, Millenium), tretinoina y combinaciones de los mismos Otros compuestos antiangiogénicos incluyen acitretina, fenretinida, ta domida, ácido zoledrónico, angiostatina, aplidina, cilengtida, combretastatina A-4, endostatina, halofugmona, rebimastat, removab, Rev mid, escualamina, ucraina, Vitaxin y combinaciones de los mismos Los compuestos coordinados con platino incluyen, pero sin limitación, cisplatino, carboplatino, nedaplatino, oxaliplatino y combinaciones de los mismos Los derivados de camptotecina incluyen, pero sin limitación, camptotecina, 10-h?drox?camptotec?na, 9-am?nocamptotec?na, ipnotecán, SN-38, edotecapna, topotecán y combinaciones de los mismos Otros agentes antitumorales incluyen mitoxantrona, I-asparaginasa, procarbazina, dacarbazma, hidroxicarbamida, pentostatina, tretinoina y combinaciones de los mismos Pueden utilizarse también agentes antitumorales capaces de potenciar las respuestas inmunes antitumorales tales como anticuerpos CTLA4 (antígeno 4 de linfocito citotóxico) y otros agentes capaces de bloquear CTLA4 tales como MDX-010 (Medarex) y los compuestos de CTLA4 dados a conocer en la patente de Estados Unidos n° 6,682,736, y agentes antipro ferativos tales como otros inhibidores de farnesil proteína transferasa, por ejemplo, inhibidores de farnesil proteina transferasa Los anticuerpos de CTLA4 específicos adicionales que pueden utilizarse en la presente invención
incluyen aquellos descritos en la solicitud provisional de Estados unidos 60/1 13,647 (presentada el 23 de diciembre de 1998) y la patente de Estados Unidos n° 6,682,736, ambas incorporadas a la presente memoria como referencia en su totalidad Los anticuerpos específicos de IGF1 R que pueden utilizarse en la presente invención incluyen aquellos descritos en la solicitud de patente internacional n° WO 2002/053596, que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad Los anticuerpos específicos de CD40 que pueden utilizarse en la presente invención incluyen aquellos descritos en la solicitud de patente internacional n° WO 2003/040170, que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad Pueden emplearse también agentes de terapia génica como agentes antitumorales tales como TNFerade (GeneVec), que expresa TNFalfa en respuesta a radioterapia En una modalidad de la presente invención, pueden utilizarse estatmas junto con un anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antigeno del mismo, como se describe en la presente memoria, y composiciones farmacéuticas de los mismos Las estatmas (inhibidores de HMG-CoA reductasa) pueden seleccionarse del grupo constituido por atorvastatina (Lipitor, Pfizer Ine ), provastatina (Pravachol, Bristol-Myers Squibb), lovastatina (Mevacor, Merck Ine ), simvastatma (Zocor, Merck Ine ), fluvastatina (Lescol, Novartis), cepvastatina (Baycol, Bayer), rosuvastatina (Crestor, AstraZeneca),
lovostatina y niacina (Advicor, Kos Pharmaceuticals), derivados y combinaciones de las mismas En una modalidad preferida, la estatma se selecciona del grupo constituido por atorvastatina y lovastatma, derivados y combinaciones de las mismas Otros agentes útiles como agentes antitumorales incluyen Caduet Para cualquiera de los procedimientos de tratamiento de un trastorno hiperprohferativo o crecimiento celular anormal como se describe en la presente memoria utilizando una combinación de anticuerpo de P-cadepna o porción de unión a antigeno con al menos un agente terapéutico adicional, el anticuerpo de P-cadepna puede conjugarse, o depvatizarse, con el agente terapéutico adicional El al menos un agente terapéutico adicional puede administrarse también separadamente, o de manera no depvatizada o no conjugada Cuando el al menos un agente terapéutico adicional no está depvatizado o conjugado con el anticuerpo, puede administrarse en la misma formulación farmacéutica que el anticuerpo, o puede administrarse en una formulación separada
Terapia qénica Las moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la presente invención pueden administrarse a un paciente necesitado de ello mediante terapia génica La terapia puede ser in
vivo o ex vivo En una modalidad preferida, se administran a un paciente moléculas de ácido nucleico que codifican tanto una cadena pesada como una cadena ligera En una modalidad más preferida, se administran moléculas de ácido nucleico tales que están integradas establemente en los cromosomas de células B, debido a que estas células están especializadas en la producción de anticuerpos En una modalidad preferida, las células B precursoras se transfectan o infectan ex vivo y se retransplantan a un paciente necesitado de ello En otra modalidad, las células B precursoras u otras células se infectan in vivo utilizando un virus conocido por infectar el tipo celular de interés Los vectores típicos utilizados para terapia génica incluyen posomas, plásmidos y vectores virales Son vectores virales ejemplares retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados Después de la infección in vivo o ex vivo, los niveles de expresión de anticuerpo pueden controlarse tomando una muestra del paciente tratado y utilizando cualquier inmunoensayo conocido en la técnica o discutido en la presente memoria En una modalidad preferida, el procedimiento de terapia génica comprende las etapas de administrar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada, o una porción de unión a antígeno de la misma de un anticuerpo de P-cadepna, y expresar la molécula de ácido nucleico En otra modalidad, el procedimiento de terapia génica comprende las etapas de administrar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena ligera, o una porción de unión a antigeno de la misma de un anticuerpo de P-cadepna, y expresar la molécula de acido nucleico En un procedimiento más
preferido, el procedimiento de terapia génica comprende las etapas de administrar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada, o una porción de unión a antígeno de la misma de un anticuerpo de P-cadepna de la invención, y una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena ligera, o una porción de unión a antigeno de la misma de un anticuerpo de P-cadepna de la invención, y expresar las moléculas de ácido nucleico El procedimiento de terapia génica comprende también la etapa de administrar otro agente terapéutico tal como cualquiera de los agentes discutidos anteriormente en relación con la terapia de combinación Para que esta invención pueda entenderse mejor, se indican los siguientes ejemplos Estos ejemplos son sólo con fines de ilustración, y no han de considerarse limitantes del alcance de la invención de ninguna manera
EJEMPLOS
En los siguienes ejemplos y preparaciones, "BSA" significa albúmina de suero bovino, "EDTA" significa ácido etilendiammotetraacético, "DMSO" significa dimetilsulfóxido, "MOPS" significa ácido 3-(/V-morfol?no)propanosulfón?co, "MES" significa ácido 2-(?/-morfol?no)etanosulfon?co, "PBS" significa solución salina tamponada con fosfato, "dPBS" significa solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, "HEMA" significa metacplato de 2-h?drox?et?lo, "DMEM" significa medio de
Eagle modificado por Dulbecco, "FBS" significa suero fetal bovino, "NEAA" significa aminoácidos no esenciales, "HEPES" significa ácido ?/-2-h?drox?et?lp?peraz?n-?/'-2-etanosulfon?co y "DMF" significa dimetilformamida
EJEMPL0 1 Examen de una biblioteca de contenido en fago de scFv
Se utilizó P-cadepna humana recombinante (R&D Systems 861 -PC-100) como antigeno para examinar una biblioteca de contenido en fago de scFv Se utilizaron para las selecciones grandes bibliotecas de anticuerpos humanos scFv clonados en un vector fagémido (Vaughn, T J et al , Nat Biotech , 14 309-314 (1996)) Se aislaron los scFV que reconocieron P-cadepna a partir de las bibliotecas de contenido en fagos en una serie de ciclos de selección repetidos en P-cadepna humana recombinante y monocapas confluentes de células HCT1 16 que expresaban P-cadepna En resumen, después de la incubación con la biblioteca, se recuperaron fagos unidos de la P-cadepna y los fagos no unidos se desecharon por lavado Se recuperaron después los fagos unidos como se describe en Vaughn, T J eí al , Nat Biotech , 14 309-314 (1996) y se repitió el proceso de selección Se sometió una proporción representativa de clones del resultado de las rondas de selección a ensayo de mmunosorción ligado a enzima (ELISA) de fago para ensayar la unión a P-cadepna esencialmente como se describe en Vaughn, T J eí al , Nat Biotech 14 309-314 (1996) Se utilizaron dos
antigenos diferentes en el ELISA P-cadepna humana recombinante (R&D Systems) y monocapas confluentes de células A431 que expresaban P-cadepna Los clones positivos en ELISA se sometieron a secuenciación de ADN como se describe en Vaughn, T J eí al , Nat Biotech , 14 309-314 (1996) y en Osbourn, J K eí al , Immunotechnoloqy 3 293-302 (1998) Los únicos clones positivos de ELISA se convirtieron en moléculas de IgG completas y se ensayo su capacidad de neutralizar P-cadepna en el ensayo de adhesión dependiente de P-cadepna descrito en el ejemplo 4 Basándose en los resultados de este examen, se seleccionó el anticuerpo 129-1 c4 (CI50 de 1 -3 µM en el ensayo de adhesión de A431 ) como el linaje original principal para optimización adicional
EJEMPLO 2 Optimización principal
Se crearon bibliotecas de contenido en fago derivadas de 129-1 c4 mediante mutagénesis dirigida a ohgonucleótidos de regiones CDR3 de cadena pesada variable (V ) y ligera variable (V ) del anticuerpo Se construyeron las bibliotecas utilizando técnicas de biología molecular estándar como se describen en Clackson y Lowman "Phage Display- A Practical Approach" (Oxford University Press, 2004) Se realizaron selecciones basadas en afinidad mediante las que después de la incubación con la biblioteca, se capturó la P-cadepna humana recombmante (R&D Systems) mediante perlas
paramagnéticas recubiertas con proteína G (Dynal 100 03) y se recuperaron los fagos unidos mediante separación magnética, mientras los complejos no unidos se desechaban por lavado Se repitió el proceso de selección con concentraciones decrecientes de P-cadepna humana recombinante (25 nM a 10 pM durante 4 rondas) presentes durante la selección Además, se recombinaron los resultados de la selección de las bibliotecas de CDR3 de VH y CDR3 de VL en bibliotecas de contenido en fago adicionales y se seleccionaron durante dos rondas más de selección basada en afinidad Se sometieron proporciones representativas de clones de los resultados de las rondas de selección a examen como scFv en el ensayo de competición epitópica de 129-1 c4, como se describe en el ejemplo 8
EJEMPLO 3 Ensayo de adhesión dependiente de P-caderina
Se utilizo el siguiente protocolo para determinar los valores de C o en un ensayo de adhesión dependiente de P-cadepna utilizando varios scFv optimizados que se convirtieron en IgG durante la fase de optimización del descubrimiento de anticuerpos como se describe anteriormente en el ejemplo 2 Los valores de CI50 medios medidos para estos anticuerpos se muestran a continuación en el Cuadro 4 Se reconstituyo Fc de P-cadepna humana recombinante (R&D cat 861 -PC) a una concentración de 1 mg/ml con CaCI2 2 mM en agua MilliQ
24 horas antes del uso, y se almacenó a 4°C Se cultivaron células A431 y se hicieron prepasadas del modo siguiente Se cultivaron rutinariamente células A431 (ECACC n° 85090402) en matraces triples Nunc (área 3 x 175 cm2) en medio esencial mínimo (MEM) (Invitrogen, cat 31095) que contenía 10% de suero fetal bovino (Invitrogen, cat 10100-147) y 1 % de aminoácidos no esenciales (Invitrogen, cat 1 1 140-035) Las células cultivadas eran aproximadamente un 80% confluentes en el momento de recogida para uso en el ensayo Para salvaguardar contra posibles efectos relacionados con la pasada, se utilizaron rutinariamente células entre la pasada 4 y 8 y se recogieron después de 48 ó 72 horas de cultivo Se recogieron las células A431 con 0 25% de tppsina/EDTA 1 mM (Gibco, cat 25200-056) durante justo el tiempo suficiente para que las células se disociaran (7-10 mm), y después se diluyeron inmediatamente en medios de cultivo de tejido a una densidad de aproximadamente 2 x 06 células/ml Se centrifugaron después las células A431 (1200 rpm), se resuspendieron en tampón de ensayo (solución salina equilibrada de Hanks (sin Mg2+ ni Ca2+ sin rojo fenol) (Invitrogen, cat 14175-053) suplementado hasta una concentración final de CaCI2 de 1 mM), se volvieron a centrifugar y se resuspendieron en tampón de ensayo de nuevo a una densidad final de 2 x 106 células/ml La preparación de diluciones en sene de IgG y preincubación con células A431 se realizó del modo siguiente Se suplementaron 180 µl de cada IgG de ensayo, o porción de la misma, con 20 µl de tampon de ensayo que contenía 10% de BSA (Sigma, cat A-9576) para estandarizar la
concentración de BSA al 1 % Se resuspendió micialmente un anticuerpo policlonal de referencia anti-P-cadepna mupno/humano (R&D, cat AF-761 ) en agua MilliQ, proporcionando una solución madre de 1 mg/ml Se diluyeron después adictonalmente 40 µl de esta solución madre en 140 µl de tampón de ensayo Se añadieron después 20 µl de tampón de ensayo que contenia 10% de BSA, proporcionando 200 µl a 0 2 mg/ml de anticuerpo y 0 1 % de BSA Se prepararon diluciones en sene por duplicado añadiendo en primer lugar 2 x 90 µl de anticuerpo policlonal AF-761 o IgG de ensayo a la columna 1 de una placa de dilución de polipropileno de 96 pocilios Greiner (Greiner, cat 780271 ) Se añadieron después 60 µl de tampón de ensayo a las columnas 2-1 1 Se preparó después una dilución de 30 µl en 60 µl (1 3) a lo largo de la placa de izquierda a derecha de las columnas 1-1 1 Se añadieron después 60 µl de tampón de ensayo sólo a los pocilios 12 A-D para definir la adhesión máxima Se definió la adhesión mínima mediante la adición de 60 µl de EDTA 25 mM (en tampón de ensayo) a los pocilios 12 E-H Se añadieron después 60 µl de suspensión de células A431 (2 x 106 células/ml en tampón de ensayo- preparado como se describe anteriormente) a todos los pocilios y, después de agitación, se premcubaron las placas durante 1 h a 37°C En paralelo con la preparación de las diluciones en serie de IgG de ensayo y la preincubacón con células A431 , se prepararon placas de ensayo recubiertas de P-cadepna del modo siguiente Se diluyó Fc de P-cadepna humana recombinante en tampón de recubrimiento (PBS sin Mg2+ ni Ca2J Invitrogen, cat 14190-094) a una concentración de 10 µg/ml, y se
dispenso en placas de ensayo de 96 pocilios Fluoronunc (Nunc, cat 437958) (100 µl/pocillo) Se incubaron después las placas durante 1 h 30 min a temperatura ambiente Se lavaron después las placas 3 veces con PBS utilizando un lavador de placas Tecan 96 Se añadieron después 200 µl/pocillo de tampón de ensayo para bloqueo, y se incubaron las placas durante 1 h adicional a temperatura ambiente Se lavaron después las placas 3 veces con PBS como se describe anteriormente Se transfirieron después 100 µl/pocillo de material de lgG/A431 preincubado desde las placas de dilución de 96 pocilios Greiner a las placas de ensayo recubiertas de P-cadepna En el momento de la transferencia, se mezcló el material de lgG/A431 mediante pipeteado para asegurar que las células eran homogéneas Se dejó transcurrir después el proceso de adhesión incubando las placas de ensayo a 37°C durante 30-45 minutos Al final de la incubación, se retiraron las células no adherentes mediante aspiración suave de los medios de las placas y relleno de los pocilios con tampón de lavado celular (solución salina equilibrada de Hanks (sin Mg2+ sin Ca2+ y sin rojo fenol, Invitrogen, cat 14175-053) suplementado a una concentración final de CaCI2 1 mM) Se invirtieron después las placas en un baño de tampón de lavado celular durante 15 minutos para retirar las células no adherentes residuales Al final de esta incubación, se aspiraron suavemente los contenidos de los pocilios Se realizó la cuantificación de las células adherentes del modo siguiente Se detectaron las células adherentes mediante la adición de 100
µl/pocillo de reactivo combinado de sis/deteccion de fosfatasa alcalina (tampón sustrato dietanolamina concentrado 5x (Pierce, cat 34064) diluido 1 5 con agua, después lo cual se disolvió un comprimido de 15 mg de PNPP (Sigma, cat N-2640) por 25 ml de solución 1x), seguido de incubación durante 30-60 min a 37°C Se detuvo después la reacción mediante la adición de NaOH 1 M (50 µl/pocillo), aspirando a dar un valor de DO máximo de aproximadamente 0 8 en ausencia de inhibición Se midió después la absorbancia a 405 nm utilizando un lector de placas estándar Se analizaron después los resultados del modo siguiente Tomando la columna 12, pocilios A-D como 100% de adhesión y la columna 12, pocilios E-H como 0% de adhesión, se convirtieron en primer lugar los datos brutos en valores de % de adhesión del modo siguiente % de adhes?ón= {(valor-adhesión min )/(adhes?ón máx-m?n)} x 100 Se representó después el % de adhesión frente a la concentración de inhibidor de IgG y se determinaron los valores de Cl50 utilizando software Ppsm Cuando se observó inhibición parcial, la CI50 se indica como la concentración de IgG que proporciona un 50% de inhibición real en contraposición con el punto medio de la curva Los valores de CI50 se reseñan en el Cuadro 4
CUADRO 4
Se realizaron dos ensayos de adhesión de A431 separados para investigar varias IgG optimizadas adaptadas a linea germinal a partir del linaje 129-1 c4 en comparación con sus equivalentes no adaptados a línea germinal Para estos experimentos, fue necesario cambiar a un nuevo tote de P-cadepna (CFR-134041 ), lo que parece estar asociado a valores de Cl50 ligeramente aumentados en comparación con otros datos Los datos promediados para varias IgG adaptadas a linea germinal de los dos experimentos se muestran en el Cuadro 5 Como se observó anteriormente, g-194-b09 designa la versión adaptada a línea germinal de 194-b09, y demás
CUADRO 5
EJEMPLO 4 Ensayo de agregación celular dependiente de P-caderina
Se utilizó el siguiente protocolo para determinar los valores de Cl50 en un ensayo de agregación dependiente de P-cadepna utilizando varios scFv optimizados que se convirtieron en IgG durante la fase de optimización del descubrimiento de anticuerpo como se describe anteriormente en el ejemplo 2 Debido a que las líneas celulares que sobreexpresan P-cadepna forman agregados multicelulares densos cuando se disponen en crecimiento en suspensión, puede medirse la agregación celular en presencia de anticuerpos de P-cadepna que interfieren con la agregación celular Los valores de Cl 0 medios medidos para varios anticuerpos se muestran a continuación en el Cuadro 6
Se realizó una preparación de placa del modo siguiente Se recubrió cada placa de ensayo de 96 pocilios con 50 µl de poliHEMA (12 mg/ml en 90% de etanol, 10% de metanol) y después se evaporó durante 6 h a una noche, seguido de lavado con 3 x 100 µl de H20 estéril antes del uso Se cultivaron después las células del modo siguiente Se pasaron células de la línea celular humana SW480 (que expresan establemente P-cadepna G418') en medio de crecimiento completo (cs DMEM (InVitrogen 1 1995-065), 10% de FBS (Omega Scientific, FB-02), NEAA 1 100 (InVitrogen 1 1 140-050), piruvato de sodio 1 100 (InVitrogen 1 1360-070), glutamina 1 100 (InVitrofen 25030-051 ), penicihna/estreptolisina 1 100 (InVitrogen 15070-063), geneticma 50 mg/ml (InVitrogen 10131-035)) + G418 (500 µg/ml), después se dividió en 1 3-4 dos veces por semana Se congelaron después los cultivos en medio de crecimiento + 10% de DMSO El día 1 , se sembraron las célulae SW480 pCAD y SW480 pCLNX control (vector de control estable) a 5 x 106 células/placa de 100 mm, a no más de dilución 1 3 Se hicieron crecer después las células durante 48 horas en cultivo Cada placa de 100 mm proporcionó aproximadamente 10 x 106 células, o suficiente para 2 placas de 96 pocilios El día 3, se retiró el medio, seguido de lavado con dPBS (PBS de Dulbecco (InVitrofen 14040-133)), después de lo cual se tppsinizaron las células en 3 ml/placa de 100 mm Se llevó a cabo después la neutralización tras la liberación con dos volúmenes (6 ml) de medio de crecimiento completo Se lavo después la placa tres veces utilizando una pipeta con 10 ml para
desestabilizar los aglomerados Se contaron después las células y se obtuvo un sedimento utilizando una centrífuga Beckman a 1 000 rpm durante 5 minutos Se aspiraron después los medios, se resuspendió el sedimento en primer lugar en <1 ml de medio de crecimiento completo mediante vórtex manual, después con pipeta p1000, y después se normalizó la concentración celular a 1 3 M/ml Se aseguro la dispersión de células individuales mediante microscopía Se preparó después una placa reactiva bloqueando una placa de 96 pocilios con dPBS y 5% de FBS durante 30 min Se lavó después la placa utilizando 1 x 100 µl de dPBS, seguido de aspiración y sacudidas para secar Se preparó una serie de dilución de IgG de ensayo con dPBS utilizando una concentración 4x [IgG], suficiente para 3 pocilios de placa de tratamiento en un pocilio de los 96 pocilios Se separaron en alícuotas de 40 000 células en 30 µl/pocillo a una placa de cultivo no de tejido Costar3590 recubierta con poliHEMA lavada de 96 pocilios (Corning 3590) Se transfirieron después 10 µl de reactivo a cada pocilio de la placa de 96 pocilios Se realizaron muestras por triplicado por tratamiento utilizando una pipeta de 8 canales Se realizó después la incubación a 250 rpm en un incubador agitado humidificado a 37°C, 5% de C02 durante una noche (16-18 h) El dia 4, se transfirieron 40 µl de células agitadas a una placa de
96 pocilios recubierta con polilisma (placa de 96 pocilios recubierta con po sina BioCoat BD 356516) Se aclararon después los pocilios con 60 µl de medio de crecimiento completo, se agitó la placa mediante golpecitos y se
transfirió a la placa recubierta con polilisina Si era necesario, se llevó a cabo un lavado adicional con 50 µl Siguió la incubación durante 60 minutos en un incubador humidificado a 37°C, 5% de C02 Se tuvo cuidado en esta etapa de transferir cuantitativamente todas las células, tan suavemente como fuera posible, sin pipetear en exceso Se fijaron después las células añadiendo 100 µl de solución de fijación (7 4% de formaldehído (37% p/v- Sigma F15587)) en una campana de humos, seguido de incubación durante >30 minutos a temperatura ambiente Para lavar las células, se decantó el liquido en un vaso o bandeja de recogida, se sacudió para retirar el líquido restante y se colocó suavemente sobre una toalla de papel Se aplicaron después 100 µl por pocilio de dPBS para lavar, seguido de incubación durante 15 min Se tiñeron después las células decantando como anteriormente y aplicando 100 µl de Hoescht (1 µg/ml de Hoescht en dPBS- Hoescht 10 mg/ml Molecular Probes 33342), seguido de incubación durante 30 min Se lavaron después las células dos veces, dejando los 100 µl de dPBS restantes en el pocilio para microscopía Se midió después el numero de objetos agregados por pocilio (Cellomics) y se comparó un recuento medio de objetos (con IgG de ensayo) con el de IgG (por ejemplo, Gt-anti-P-cadepna, R&D Systems AF761 ) o control con medios solo Se representó después el recuento de objetos frente a la concentración del inhibidor IgG y se determinaron los valores de Cl50 Se reseñan los valores de CI5o para varios anticuerpos de la presente invención en el Cuadro 6
CUADRO 6
EJEMPLO 5 Ensayo de desestabilización de esferoide dependiente de P-cad®?rina
El siguiente ensayo de desestabilización de esferoide es una variación del ensayo de agregación (descrito en el ejemplo 4) en el que los agregados celulares se forman durante una noche antes de la adición de P-cadepna y anticuerpos de control Se añaden después reactivos de ensayo durante 24 horas adicionales antes del análisis Se realizó la preparación de placa de la siguiente manera Se recubrió cada placa de ensayo de 96 pocilios con 50 µl de pohHEMA (12 mg/ml en 90% de etanol, 10% de metanol) y después se evaporó durante 6 h a una noche, seguido de lavado con 3 x 100 µl de H 0 estéril antes del uso Se
cultivaron después las células del modo siguiente Se pasaron células de la linea celular humana SW480 (que expresan establemente P-cadepna G418') en medio de crecimiento completo (cs DMEM (InVitrogen 1 1995-065), 10% de FBS (Omega Scientific FB-02), NEAA 1 100 (InVitrogen 1 1 140-050), piruvato de sodio 1 100 (InVitrogen 1 1360-070), glutamina 1 100 (InVitrogen 25030-051 ), penicilina/estreptolisina 1 100 (InVitrogen 15070-063), geneticina 50 mg/ml (InVitrofen 10131 -035)) + G418 (500 µg/ml), después se dividió 1 3-4 dos veces por semana Se congelaron después los cultivos en medio de crecimiento + 10% de DMSO El día 1 , se sembraron las células SW480 pCAD y SW480.pCLNX de control (vector de control estable) a 5 x 106 células/placa de 100 mm, a no más de dilución 1 3 Se hicieron crecer después las células durante 48 horas en cultivo Cada placa de 100 mm proporcionó aproximadamente 10 x 106 células o suficiente para 2 placas de 96 pocilios El día 3, se retiró el medio, seguido de lavado con dPBS (PBS de
Dulbecco, InVitrogen 14040-133), después de lo cual se tppsinizaron las células en 3 ml/placa de 100 mm Se llevó a cabo después la neutralización tras la liberación con dos volúmenes (6 ml) de medio de crecimiento completo Se lavó después la placa tres veces utilizando una pipeta con 10 ml para desestabilizar los agregados Se contaron después las células y se obtuvo un sedimento utilizando una centrífuga Beckman a 1 000 rpm durante 5 minutos Se aspiraron después los medios, se resuspendió el sedimento en primer lugar en <1 ml de medio de crecimiento completo mediante vórtex manual,
después con pipeta p1000 y después se normalizó la concentración celular a 1 0 x 106/ml Se aseguró la dispersión en células individuales mediante microscopía Se separaron en alícuotas de 40 000 células en 40 µl/pocillo a una placa de cultivo no de tejido Costar3590 recubierta con poliHEMA lavada de
96 pocilios (Corning 3590) Se realizó después la incubación a 250 rpm en un incubador agitado humidificado a 37°C, 5% de C02 durante una noche ( 16-18 h) El día 4, se preparo una placa reactiva bloqueando una placa de 96 pocilios con dPBS y 5% de FBS durante 30 min Se lavó después la placa utilizando 1 x 100 µl de dPBS, seguido de aspiración y sacudidas para secar Se preparó una sene de dilución de IgG de ensayo con dPBS utilizando una concentración 5x [IgG], suficiente para 3 pocilios de placa de tratamiento en un pocilio de la placa de 96 pocilios Se transfirieron entonces 10 µl de reactivo a cada pocilio de la placa de 96 pocilios Se realizaron muestras por triplicado por tratamiento utilizando una pipeta de 8 canales Se realizó después la incubación a 250 rpm en un incubador agitado humidificado a 37°C, 5% de C02 (20-24 h) El día 5, se transfirieron 50 µl de células agitadas a una placa de 96 pocilios recubierta con poli sina (placa de 96 pocilios recubierta con polilisina BioCoat BD 356516) Se aclararon después los pocilios con 50 µl de medio de crecimiento completo, se agito la placa mediante golpecitos y se transfirió a la placa recubierta con poh sina Si era necesario, se llevó a cabo
un lavado adicional con 50 µl Siguió una incubación durante 60 minutos en un incubador humidificado a 37°C, 5% de C02 Se tuvo cuidado en esta etapa de transferir cuantitativamente todas las células, tan suavemente como fuera posible, sin pipetear en exceso Se fijaron después las células añadiendo 100 µl de solución de fijación (7 4% de formaldehido (37% p/v- Sigma F15587)) en una campana de humos, seguido de incubación durante >30 minutos a temperatura ambiente Para lavar las células, se decantó el líquido en un vaso o bandeja de recogida, se sacudió para retirar el líquido restante y se colocó suavemente sobre una toalla de papel Se aplicaron después 100 µl por pocilio de dPBS para lavar, seguido de incubación durante 15 min Se tiñeron después las células decantando como anteriormente y aplicando 100 µl de Hoescht (1 µg/ml de Hoescht en dPBS- Hoescht 10 mg/ml Molecular Probes 33342) seguido de incubación durante 30 min Se lavaron después las células dos veces, dejando los 100 µl de dPBS restantes en el pocilio para microscopía Se midió después el número de objetos agregados por pocilio (Cellomics) y se comparó un recuento medio de objetos (con IgG de ensayo) con el de IgG (por ejemplo, Gt-anti-P-cadepna, R&D Systems AF761 ) o control con medio solo Puede representarse el recuento de objetos frente a la concentración del inhibidor IgG para determinar los valores de Cl50 Como alternativa, se expresó el recuento de objetos como desestabihzación en veces frente a control a una concentración definida como se muestra en el Cuadro 7
CUADRO 7
EJEMPLO 6 Medida de Kp y kp» de anticuerpos de P-caderina
Se realizaron medidas de afinidad (KD y n) de anticuerpos monocatenapos scFv de P-cadepna mediante resonancia de plasmón superficial utilizando el instrumento BIACORE™ 3000 del modo siguiente, utilizando los protocolos del fabricante Para realizar análisis cinéticos, se inmovilizaron proteína de fusión P-caderína humana/Fc recombinante (hCad/Fc) y proteína de fusión P-cadepna de ratón/Fc (mCad/Fc) en células de flujo separadas de un microprocesador sensor CM5 BIACORE ™ utilizando acoplamiento de amina rutinario Se prepararon las superficies utilizando tampón acetato 10 mM a pH
4 5 con CaCI2 2 0 mM como tampon de inmovilización, y se consiguieron densidades de proteina de 5 800 y 1 600 UR para las proteínas de fusión hCad/Fc y mCad/Fc, respectivamente La desactivación de esteres de N-hidroxisuccinimida no reaccionados se realizó utilizando clorhidrato de etanolamina 1 M a pH 8 5 Se utilizó una superficie blanco activada/desactivada como superficie de control Se prepararon muestras de anticuerpo ScFv en tampón de proceso a concentraciones en el intervalo de 200 a 0 78 nM (se incluyo una solución 0 nM que comprendía tampón de proceso solo como referencia cero) Se aleatopzaron las muestras y se inyectaron por triplicado durante 1 minuto cada una a través de las células de flujo utilizando HBS-P (HEPES 10 mM, pH 7 4, NaCI 150 mM, 0 005% de tensioactivo P20) con CaCI 2 0 mM como tampón de proceso Se utilizó un caudal de 25 µl/mm para determinar las constantes de afinidad Se controló la disociación del anticuerpo durante 5 minutos, se regeneró la superficie mediante una inyección de 12 segundos de glicina-HCI 10 mM, pH 1 5 (25 µl/mm) Se procesaron los datos brutos utilizando el paquete de software Scrubber (©BioLogic Software) y se analizaron utilizando el paquete de software CLAMP (©BioLogic Software) Los datos se ajustaron globalmente a un modelo de unión de Langmuir simple 1 1 El Cuadro 8 enumera las constantes de afinidad para los anticuerpos anti-P-cadepna monocatenapos de la presente invención
CUADRO 8
EJEMPLO 7 Determinación de la selectividad de anticuerpos de P-caderioa
Se utilizo el siguiente protocolo para determinar la selectividad de diversos anticuerpos contra P-cadepna frente a E-cadepna Se recubrieron P-cadepna humana recombinante (R&D Systems 861 -PCJ 00) y E-cadepna humana recombinante (R&D Systems 648-EC-100) sobre pocilios de placas inmovilizadoras de proteína Exiqon (VWR International) a 1 µg/ml en PBS + CaCI2 0 5 mM Se bloquearon las IgG de muestra en 3% de Marvel/PBS + CaCI2 0 5 mM durante 1 hora antes de valorarse desde 50 nM (7 5 µg/ml) hasta 0 64 nM (0 096 µg/ml), y se añadieron por duplicado a pocilios recubiertos con los dos antígenos diferentes Después de equilibrado de una noche a 4°C, se lavaron las placas tres veces con 1 x PBS/0 1 % de Tween + CaCI2 0 5 mM, después tres veces con 1 x PBS + CaCI2 0 5 mM Se añadieron después 50 µl de conjugado de peroxidasa de Fab anti-humano diluido 1 5 000 en 3% de Marvel/PBS + CaCI2 0 5 mM a cada pocilio, y se dejo equilibrar a temperatura ambiente durante 1
hora Se lavaron las placas tres veces con 1 x PBS/0 1 % de Tween + CaCI2 0 5 mM y tres veces con 1 x PBS + CaCI2 0 5mM Se añadieron 50 µl de 3,3',5,5'-tetramet?lbenc?d?na (TMB, Sigma) a cada pocilio y se dejaron desarrollar las reacciones durante 20 minutos antes de detenerlas mediante la adición de 25 µl/pocillo de H2S04 0 5 M Después de leer los valores de absorbancia a 450 nm, se analizaron los datos utilizando software Graphpad Ppsm para calcular los valores relativos de KD para cada anticuerpo para la unión a P-cadepna y E-cadepna Los datos resultantes se resumen en el Cuadro 9
CUADRO 9
EJEMPLO 8 Ensayo de competición epitópica
Se utilizó el siguiente protocolo para medir valores de Cl50 en un ensayo de competición epitópica para medir la capacidad de los scFv variantes dentro de un linaje original de desplazar a la IgG original de P-cadepna nativa sobre la superficie de células A431 Se detecta la cantidad de IgG original biotinilada unida en presencia de scFv inhibidor con estreptavidina de europio y cuantificación DELFIA Los valores de Cl50 medidos para vanos scFv se muestran en el Cuadro 10 Se cultivaron células A431 (ECACC n° 85090402) según procedimientos estándar, después se recogieron aproximadamente a 80% de confluencia, se sembraron a 2 5 x 104 células por pocilio en placas recubiertas con colágeno Beckton Dickenson de 96 pocilios (cat BD 6407) el dia antes del uso Se lavaron después las placas tres veces sumergiéndolas en un reservopo de tampón PBS (cat Gibco 14190-094, sin calcio, magnesio ni bicarbonato de sodio) antes de la adición de 200 µl por pocilio de tampón de bloqueo (PBS, cat Gibco 14190-094, más 3% de Marvel (Premier International Foods Ltd )) y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente Se lavaron después las placas 3 veces con PBS como anteriormente Tanto para examen de alto rendimiento como para el perfil de CI5o, se prepararon en primer lugar materiales de scFv/lgG en placas de
dilución Gremer (placas de polipropileno de 96 pocilios Gremer (cat Greiner 780271 )) en un volumen total de 60 µl de tampón de ensayo Se transfirieron después 50 µl desde la placa Greiner secundaria directamente a la placa de ensayo y se dejo proceder la reacción de unión durante 2 h 30 min a temperatura ambiente Al final de la reacción de unión, se lavaron las placas 3 veces con PBS antes de la adición de estreptavidina marcada con europio (cat Perkm Elmer 1244-360, dilución 1 1000 en tampón de ensayo DELFIA (cat Perkm Elmer 4002-0010)) y se incubó durante 1 hora adicional a temperatura ambiente Se lavaron después las placas 7 veces con tampón de lavado
DELFIA (cat Perkm Elmer 4010-0010) sumergiendo repetidamente las placas en un reservopo de tampón Finalmente, después de la adición de potenciador DELFIA (cat Perkm Elmer 4001 -0010, 100 µl/pocillo) se leyeron las placas utilizando un protocolo DELFIA estándar en un lector compatible (por ejemplo Wallac o Envision)
Configuración de la placa de dilución Greiner- HTS Se configuraron las condiciones de examen de alto rendimiento (HTS) diferentemente dependiendo de la etapa de la optimización Para HTS de resultados de la optimización de cadena de VH y V individuales, se fijó la [pep-prep] final a 12 5%, de tal modo que el scFv original proporcionara una inhibición parcial Para los HTS posteriores de resultados de las bibliotecas de recombinación VH VL, la concentración pep-prep final se redujo a 1 7%, y en
estas condiciones el scFv de referencia optimizado para VH (TOP-108-C01 ) proporcionó una inhibición parcial La optimización de la concentración de pep-prep de tal modo que el scFv de referencia relevante proporcionara inhibición parcial, dejó una ventana en la que identificar los clones mejorados Para conseguir estas concentraciones pep-prep de scFv finales, se adoptó el siguiente procedimiento i) Utilizando un instrumento Cybiwell, se transfirió el volumen necesario (véase a continuación) de material de muestra pep-prep desde una placa de muestra de pocilios profundos a una placa de dilución Greiner en las columnas 1 -1 1
[Pep-prep final] Volumen de transferencia [12 5%] 7 5 µl [1 7%] 10 0 ul (de pep-prep diluido 1 10)
(Se preparó pep-prep prediluido 1 10 tranfipendo 10 µl de pep-prep puro desde la placa de muestra a una placa de dilución Gremer que contenía 90 µl de tampón de ensayo (utilizando Cybiwell)) n) El volumen en las columnas 1 -1 1 se completó después hasta 30 µl mediante la adición de un volumen apropiado de tampón de ensayo ni) Se añadieron después 30 µl de tampón de ensayo a la
columna 12 (A-D) (pocilios de unión total) iv) Se añadieron 30 µl de IgG original no marcada en exceso (129-1 c4) en tampón de ensayo a la columna 12 (E-H) para definir la unión no específica Ésta se añadió a concentración 1 000 nM, proporcionando una concentración final 500 nM v) Se biotiniló la IgG 129-1 c4 utilizando el reactivo insoluble en agua EZ-enlace-NHS-LC-biotma (Perbio/Pierce, n° de producto 21336) Se suplemento la solución de IgG añadiendo un décimo de volumen de NaHC03 1 M y un décimo de volumen de dimetilformamida Se disolvió reactivo EZ-enlace-NHS-LC-biotma en DMF y después se añadió a un exceso molar de cinco veces frente a IgG y se dejó proceder la reacción a temperatura ambiente durante 20 minutos Se estabilizó después la IgG biotinilada mediante la adición de BSA (al 0 1 %) Se añadieron después 30 µl de la IgG 129-1 c4 original biotinilada en tampón de ensayo a todos los pocilios, proporcionando una concentración final de 1 5 nM en el volumen final de 60 µl (concretamente, IgG marcada con europio añadida a 2 x concentración final) vi) Después de mezclar los contenidos de la placa Greiner mediante agitación, se transfirieron directamente 50 µl a la placa de ensayo y se dejó proceder la reacción de unión durante 2 h 30 min a temperatura ambiente (como se describe anteriormente)
Configuración de la placa de dilución de Greiner- perfil de CI i) Se añadieron 30 µl/pocillo de tampon de ensayo a las columnas 2-1 1 y a los pocilios 12A a 12D en placas de dilución Greiner estándar n) Se añadieron 30 µl de IgG original 129-1 c4 no marcada en exceso en tampon de ensayo a la columna 12 (E-H), para definir la unión no específica Ésta debería añadirse a una concentración 1 000 nM para dar una concentración final 500 nM ni) Se añadieron 2 x 45 µl de cada scFv His-prep no diluido a la columna 1 de tal modo que pudieron configurarse 4 valoraciones duplicadas de CI50 de 1 1 puntos por placa de ensayo de 96 pocilios Se realizaron después diluciones en sene por duplicado 1 3 tomando 15 µl de la columna 1 y mezclando en la columna 2, seguido de tomar 15 µl de la columna 2 y mezclar en la columna 3 etc Después de mezclar en la columna 1 1 se retiraron 15 µl (concretamente, para dejar un volumen final de 30 µl) iv) Se añadieron después 30 µl de IgG original de 129-1 c4 biotmilado en tampon de ensayo a todos los pocilios, proporcionando una concentración final de 1 5 nM en el volumen final de 60 µl (concretamente, IgG marcada con europio añadida a una concentración final 2x) v) Después de mezclar los contenidos de la placa Greiner mediante agitación, se transfirieron directamente 50 µl a la placa de ensayo y se permitió proceder la reacción de unión durante 2 h 30 min a temperatura ambiente como se discutió anteriormente
Para HTS, se expresaron scFv en formato de 96 pocilios en forma de extracto bruto a partir de pepplasma bacteriano (scFv pep-prep) en un tampon base que contenía MOPS/EDTA/sorbitol pH 7 4 (MES pH 7 4) Para el perfil de Cl50, se expresaron scFv en una forma purificada de menor rendimiento utilizando el scFv con mareaje de His para purificación por afinidad (scFv His-prep) en un tampón base de PBS Tanto para HTS como para análisis de CI5o, se convirtieron primero los datos brutos en datos de % de unión según la siguiente ecuación % de un?on= [(valor - unión no especif?ca)/(un?ón total-unión no específica)] x 100 Los datos HTS se analizaron después adicionalmente utilizando plantillas Excel convencionales para identificar los puntos que dan una mayor inhibición de la agregación (menor % de unión) que el scFv de referencia relevante Para el análisis de CI50, se analizaron los datos de % de unión utilizando software de ajuste de curvas Ppsm versión 4 0
Los scFv son variantes de la IgG original de 129-1 c4 en las que las regiones
CDR3 de VH y V se mutaron aleatoriamente, como se describe en el ejemplo 2 Las secuencias variantes de CDR3 de VH se muestran en el cuadro A como
SEC N° ID 91 a 256 Las secuencias variantes de CDR3 de V se muestran en el cuadio A como SEC N° ID 257 a 319 Los valores de CI50 para varios scFv que mostraron una unión mejorada frente a la IgG de 129-1 c4 original se
muestran en el Cuadro 10 Cada una de las vapanes de scFv del original 129-1 c4 se identifican con dos SEC N° ID una CDR3 de VH y una CDR3 de VL Para referencia, la Cl50 de la IgG de 129-1 c4 original fue 108 3 nM
CUADRO 10
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en esta memoria descriptiva se incorporan a la presente memoria como referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara específica e individualmente que se incorpora como referencia Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad de comprensión, resultara fácilmente evidente para los expertos en la técnica a la vista de las enseñanzas de esta invención que pueden hacerse ciertos cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones adjuntas