MX2007013053A - Vacuna de toxoide de clostridium perfringens alfa. - Google Patents

Abstract

La presente invencion describe vacunas que comprenden toxoides de tipo alfa de C. perfringens, sus fragmentos antigenicos, fragmentos antigenicos inactivados de toxinas de tipo alfa de C. perfringens, o cualquiera de sus combinaciones; la presente invencion ademas describe metodos para el uso de estas vacunas en la proteccion de animales contra enfermedades clostridiales; la presente invencion describe tambien metodos para la elaboracion de estas vacunas.

Description

VACUNA DE TOXOIDE DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS ALFA INTERREFERENCiA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una solicitud no provisional que reclama prioridad conforme a 35 U S C § 119(e), de la solicitud provisional de EE UU No de serie 60/672,289, presentada el 18 de abril de 2005, cuyo contenido se incorpora aqui como referencia en su totalidad CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a vacunas que comprenden toxoides de C perfpngens de tipo alfa, sus fragmentos antigénicos, fragmentos antigénicos inactivados de toxinas alfa, y cualquiera de sus combinaciones La presente invención además se refiere a métodos para el uso de estas vacunas en la protección de animales contra enfermedades clostpdiales La presente invención también se refiere a métodos para la elaboración de estas vacunas ANTECEDENTES Clostpdium perfpngens (C perfnngens) es una bacteria anaerobia que se encuentra naturalmente en el suelo, en materia orgánica en descomposición, y como parte de la flora intestinal normal de animales, entre ellos, los seres humanos C perfnngens también es el agente etiológico de numerosas enfermedades clostpdiales halladas en animales domésticos de valor económico C perfpngens produce una cantidad de toxinas que causan efectos patógenos en animales, entre ellas la toxina alfa, la toxina beta, la toxina beta 2, la toxina épsilon, la toxina theta, la toxina mu, la toxina delta, la toxina iota, la toxina kappa y la toxina lambda Aun más, C perípngens codifica otras sustancias biológicamente activas que pueden provocar efectos patológicos, entre ellas hialuronidasa, fosfatasa acida, proteasa, colagenasa, sulfatasa y neuraminidasa Las diferentes cepas de C perfpngens se designan como los biotipos A a E, de acuerdo con el espectro de toxinas que produce la bacteria particular (Justin y col , Biochemistr?, 41 6253-6262 (2002), McDonel, Pharmacology of Bacterial Toxins, F Dorner y J Drews (eds ), Pergamon Press, Oxford (1986)) En un principio, dicha tipificación se basó en ensayos de neutralización serológicos en ratones o cobayos Más recientemente, los métodos de tipificación moleculares emplean la reacción en cadena de la po merasa (PCR) dirigida a secuencias genéticas que codifican una de las numerosas toxinas de C perípngens La clostpdiosis intestinal en caballos se ha correlacionado con altas concentraciones de C perfpngens de tipo A en el intestino Los caballos afectados sufren de abundante diarrea líquida, y tienen un alto índice de mortalidad C perfpngens de tipo A también se ha ligado a enfermedades intestinales en cerdos lechales y cebones, con síntomas tales como enteritis necrosante leve y atrofia vellosa (Songer, Clin Micro Rev , 9 (2) 216-234 (1996)) Las enfermedades clostndiales causadas por C perfnngens se caracterizan por la muerte súbita en aves bien carnosas, con lesiones fibpnonecróticas confluentes ("toalla de baño sucia") en el intestino delgado (formas intestinales), y/o hepatitis asociada a C perfpngens con colangiohepatitis, o necrosis fibpnoide en el hígado Las aves afectadas sufren un curso rápido de depresión, diarrea y deshidratación La mortalidad varía entre el 2% y el 50% La patología hepática conduce al desecho de aves en la matanza La enteritis necrótica (EN) es un ejemplo de enfermedad intestinal clostpdial causada por C perfpngens, que tiene a significativas consecuencias económicas en las aves de corral En especial, la enfermedad es común en pollos parplleros criados en suelo, de 2 a 10 semanas de edad, si bien se ha informado también la enfermedad en pavos y gallinas ponedoras huevos enjauladas La enteritis necrótica en general se manifiesta en aves de corral, ya sea como una enfermedad secundaria, ya sea en una situación en la cual la microflora intestinal normal es alterada de manera de permitir la proliferación anormal de C perípngens patógenas La incidencia de enteritis necrótica subclínica se desconoce, ya que las lesiones solo pueden observarse a través del examen post-mortem Sin embargo, los informes de la alterada conversión de alimentos y los reducidos pesos corporales se han atribuido a la enfermedad subclinica (Lovland y Kadhusdal, Avian Path , 30 73-81 (2001 )) Los factores de nesgo que conducen a la enteritis necrótica, tanto en brotes naturales como en modelos experimentales, incluyen (a) coccidiosis, (b) migración de larvas parasitarias, (c) alimentaciones con alto contenido de harina de pescado o trigo, y (d) enfermedades inmunosupresoras Además, la enteritis necrótica puede reproducirse expepmentalmente mediante (i) la provisión de alimentos para animales contaminados con C perfpngens, (n) la administración, a los animales, de cultivos vegetales por vía oral o en los cultivos, o (m) la administración intraduodenal de caldos de cultivo de toxinas crudas libres de bacterias, a los animales C perfpngens de los tipos A y C son los dos biotipos que causan enteritis necrótica en aves de corral, la toxina más común detectada es la toxina alfa (Wages y Opengart, "Necrotic Enteritis", p 781 -785, en Disease of Poultry, 1 1 a ed (eds Saif y col ), lowa State Press, Ames, IA (2003)) De hecho, más del 90% de los aislados de C perípngens obtenidos de cuarenta y dos aves infectadas con el de tipo A produjeron una toxina alfa mortal, junto con sialidasa y las toxinas theta y mu (Daube y col , AJVR, 54 496-501 (1996)) Además, la enterotoxma producida por C perípngens de tipo A se ha identificado en pollos con enteritis necrótica, y puede cumplir una función en la enfermedad intestinal (Nulo, Can J Comp Med , 42 357-363 (1978)) Recientemente, se ha informado que C perípngens de tipo A o de tipo C puede codificar el gen cpb2 (Gilbert y col , Gene, 203 56-73 (1997)) y expresar su producto, la toxina beta 2 Se ha observado una fuerte correlación entre la expresión de la toxina beta 2 y la enteritis neonatal en ganado porcino (Bueschel y col , Vet Micro , 94 121-129 (2003)) La toxina beta 2 además se ha involucrado como un factor patógeno en la enteritis de caballos y vacas Bueschel y col , mencionados con anterioridad, además informaron que el 37 2% de los tres mil veinte aislados de C perípngens que obtuvieron codificaban la toxina beta 2, y de los aislados de C perípngens de tipo A examinados, el 35 1% codificaban ia toxina beta 2 Se halló que la muestra limitada (n = 5) de aislados de campo de C perípngens de tipo A de aves era -35% positiva para el genotipo cpb2, y 40% de estos también expresaban la toxina beta 2 Además, empleando PCR, Engstrom y col {Vet Micro , 94 225-235 (2003)) hallaron que el 12% de los aislados de C perípngens de pollos con hepatitis además eran positivos para cpb2 La enterotoxina de C perípngens de tipo A también demostró ser patógena en pollos, y causar la acumulación de fluido en un modelo de anilla intestinal ligada (Nulo, Appl Micro , 28 889-891 (1974)) Los esfuerzos actuales para controlar C perípngens se basan en medidas sanitarias y en la colocación de antibióticos en la alimentación de los animales El componente clostpdial de la enfermedad responde bien a los antibióticos, y en general, es suprimido por los aditivos antibióticos del alimento y los fármacos anticoccidiales, lonóforos Sin embargo, los antibióticos son costosos, y son sujeto de crecientes preocupaciones en relación con el favorecimiento de la resistencia bacteriana La vacunación además se ha tornado una importante medida de control en animales domésticos, ya que el curso de muchas enfermedades asociadas con C perípngens es rápido, y a menudo, mortal Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No 4,292,307 define una vacuna multivalente "universal", preparada a partir de toxoides de C perínngens de tipo A, de tipo B y de tipo D, que además incluye toxoides de Cl oedematiens y toxoide de Cl septicum Adicionalmente, en el mercado pueden obtenerse vacunas que a menudo son multivalentes y consisten en células inactivadas, toxinas, o combinaciones de estas dos (ver Songer, Clin Micro Rev , 9 (2) 216-234 (1996)) La vacunación del ganado hembra además puede provocar la protección pasiva de su posterior descendencia La protección pasiva de neonatos mamíferos contra infecciones patológicas de Clostpdium se basa en la transferencia de anticuerpos específicos en forma de anticuerpos del calostro Por ejemplo, Smith y Matsuoka {Am J Vet Res , 20 91 -93 (1959)) emplearon una vacuna inactivada para inocular ovejas preñadas, e informaron la protección inducida por vía materna, de los corderos jóvenes contra la toxina épsilon de C perípngens La inmunidad pasiva de mamíferos jóvenes típicamente dura 2 a 3 semanas (Songer, Clin Micro Rev , 9 (2) 216-234 (1996)) Como contraste a los mamíferos lechales, la inmunidad pasiva en aves tiene varias desventajas obvias, la más notable de ellas es la completa falta de los anticuerpos maternos obtenidos de la leche Si bien la inmunidad pasiva es tan solo una posible explicación de la correlación observada, Heier y col {Avian Diseases, 45 724-732 (2001 )), de hecho, informaron que la supervivencia de pollos fue significativamente más alta en bandadas de pollos parplleros de Noruega con títulos más altos de anticuerpos maternos naturales específicos contra la toxina alfa de C perínngens, en comparación con aquellas bandadas que tenían bajos títulos Además, Lovland y col {Avian Pathology, 33 (1 ) 83-92 (2004)) informaron resultados consecuentes con la baja protección pasiva de la descendencia de gallinas que habían sido inoculadas con vacunas a base de toxoides de C perínngens de tipo A o Tipo C, en comparación con la descendencia de las gallinas no vacunadas Hasta la fecha, no parecía posible lograr una importante protección comercial contra C perípngens, a menos que se presentaran en el inoculo los anticuerpos maternos para la mayoría de los componentes patológicos, o para todos ellos, de las bacterias C perípngens Por ejemplo, la vacunación del animal madre con un producto que no contiene enterotoxina solo ofrece protección parcial para lechones, y el anticuerpo de toxina ant?éps//on en las cabras madres protege contra la muerte de toxemia, pero no contra la enterocolitis (Songer, Clin Micro Rev , 9 (2) 216-234 (1996)) De hecho, a pesar del registro de una importante cantidad de información con respecto a los varios biotipos de C perípngens y sus correspondientes toxinas y sustancias bioactivas nocivas, las enfermedades clostpdiales en animales productores de alimentos continúa siendo un significativo problema económico para los campesinos Por lo tanto, se necesitan medios adicionales para la protección del ganado contra los efectos patológicos de C perípngens Más en particular, continúa la necesidad de una vacuna segura y eficaz contra C perípngens en aves de corral Aun más, se necesita una vacuna simple contra C perínngens que pueda ser administrada a las hembras, en especial, a las hembias fértiles o preñadas, que proteja en forma pasiva a su descendencia La cita de cualquier referencia en esta solicitud no debe interpretarse como una admisión de que dicha referencia puede considerarse "arte previo" para la presente solicitud BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona vacunas contra C perínngens que comprenden un toxoide de C perípngens alfa, o un fragmento antigénico de un toxoide de C perínngens alfa, o un fragmento antigénico inactivo de una toxina de C perínngens alfa, o cualquier combinación de los anteriores, como un antigeno La presente invención además provee vacunas que consisten esencialmente en un toxoide de alfa C perínngens de tipo único, o un fragmento antigénico de un toxoide de alfa C perípngens, o un fragmento antigénico inactivo de una toxina alfa de C perípngens, o cualquier combinación de los anteriores, como un antígeno Preferentemente, son suficientes una a dos dosis de 0 25-0 6 ml cada una de una vacuna de la presente invención, a fin de inducir por lo menos cuatro unidades antitoxina (A U , por sus siglas en inglés) de anticuerpo antitoxina alfa, por ml de antisuero de un animal (por ejemplo, un pollo) vacunado con esta vacuna En una modalidad de este tipo, la determinación de las unidades antitoxina (A U ) de anticuerpo antitoxina alfa por ml de antisuero de un animal vacunado con la vacuna se efectúa seis a siete semanas después de la inmunización En una modalidad particular, una sola dosis de la vacuna es suficiente para inducir por lo menos cuatro unidades antitoxina (A U ) de anticuerpo antitoxina alfa, por ml de antisuero del animal vacunado, mientras que en una modalidad alternativa, son necesarias dos dosis de la vacuna En una modalidad, el antigeno tiene 2 o más unidades de Potencia de Combinación Total (TCP, por sus siglas en inglés) En una de dichas modalidades, el animal es un ave En una modalidad particular, el ave es un pollo En otra modalidad, el ave es un pavo En una modalidad, el antígeno es originado de una célula de C perínngens de tipo A, por ejemplo, un toxoide alfa de C perípngens de tipo A En otra modalidad, el antigeno se origina de una célula de C perípngens de tipo C, por ejemplo, un fragmento antigénico inactivo de una toxina alfa de C perípngens de tipo C Aun en otra modalidad, el antígeno se origina de C perípngens de tipo B Aun en otra modalidad, el antígeno se origina de C perípngens de tipo D En una modalidad mas, el antígeno se origina de C perínngens de tipo E Incluso en otra modalidad, la vacuna comprende un antígeno que se origina de un subtipo de C perípngens En una modalidad, una vacuna de la presente invención comprende un antígeno que es un antigeno de C perípngens de un solo tipo, con la condición de que se presente un solo tipo de antígeno de C perípngens en dicha vacuna En una modalidad particular de esta clase, la C perípngens es de tipo A En una modalidad relacionada, la C perípngens es de tipo C En una modalidad, el antígeno es un toxoide alfa En una modalidad particular de esta clase, el toxoide alfa esta compuesto de un sobrenadante de toxoide alfa de C perípngens En una modalidad específica, la vacuna comprende un sobrenadante de toxoide alfa de un solo tipo de C perípngens, de tipo A En una vacuna de la presente invención, el antígeno es un toxoide alfa de una toxina alfa codificada naturalmente por una célula de C perípngens En otra vacuna de la presente invención, el antígeno es un pohpéptido recombinante, es decir, un polipéptido codificado por un gen que ha sido manipulado en forma genética En una modalidad de esta clase, el pohpéptido recombinante es un toxoide alfa en el cual se han eliminado o alterado genéticamente las regiones enzimáticas de la correspondiente toxina alfa, pero se han retenido uno o más epítopes antigénicos En una modalidad particular, el antígeno se encuentra en una preparación de células enteras En otra modalidad, el antígeno se encuentra en una preparación libre de células Aun en otra modalidad, el antígeno es un toxoide alfa en un sobrenadante de toxoide alfa de C perínngens En una modalidad particular de esta clase, el sobrenadante de toxoide alfa de C perípngens también es una preparación libre de células En otro aspecto de la presente invención, una vacuna también puede contener múltiples antígenos que pueden provocar la producción de anticuerpos de una variedad de especificidades, al ser administrados a un sujeto animal No es necesario que todos estos anticuerpos sean protectores contra una enfermedad En una modalidad particular de esta clase, dichos antígenos además son de C perípngens Por lo tanto, una vacuna de la presente invención puede contener varios otros factores patógenos activos o inactivados, junto con un toxoide alfa En consecuencia, de conformidad con la presente invención, el toxoide alfa puede combinarse con otras células clostpdiales y no clostpdiales, toxoides y extractos, como así también, con fragmentos antigénicos inactivos de toxina alfa Una de dichas vacunas multivalentes de la presente invención comprende un toxoide alfa de C perípngens, o un fragmento antigénico de un toxoide alfa de C perínngens, o un fragmento antigénico inactivo de una toxina alfa de C períringens, o cualquier combinación de los anteriores, y además, comprende un antígeno viral, o un antígeno bacteriano, o un antígeno parasitario En una modalidad particular de esta clase, la fuente viral del antígeno es el virus de la enfermedad de bursitis infecciosa En otra modalidad, la fuente viral del antígeno es el virus de la bronquitis infecciosa Aun en otra modalidad, la fuente viral del antígeno es un reovirus Aun en otra modalidad, la fuente viral del antígeno es el virus de la enfermedad de Newcastle Incluso en otra modalidad, la fuente bacteriana del antígeno es E coli En una modalidad más, la fuente bacteriana del antigeno es Salmonella Aun en otra modalidad, la fuente bacteriana del antigeno es Campylobacter En otra modalidad más, la fuente parasitaria del antígeno es de Eimepa En una modalidad particular de esta clase, el antígeno empleado en la vacuna es una parte de un merozoíto de Eimepa, un ovoquiste de Eimepa o una mezcla de los anteriores En una modalidad relacionada, el huésped natural del parásito es un ave En una modalidad particular de este tipo, el parásito es Eimepa, y el huésped natural del parásito es un pollo Una vacuna multivalente de la presente invención además puede comprender uno o más de ios siguientes antigenos toxina beta de C perínngens, toxina beta 2 de C perínngens, enterotoxina de C perínngens, toxina épsilon de C perínngens, toxina iota de C perípngens, toxina kappa de C perínngens, toxina lambda de C perípngens, toxina theta de C perínngens, toxina de C sordelln hemorrágica, toxina letal de C sordelln, toxina A de C difficile, toxina B de C difficile, toxina alfa de C septicum, toxina alfa de C novyi y toxina beta de C novyi En una modalidad de la vacuna multivalente particular de la presente invención, la vacuna comprende un toxoide alfa de C perípngens, o un fragmento antigénico de un toxoide alfa de C perípngens, o un fragmento antigénico inactivo de una toxina alfa de C perínngens, o cualquier combinación de los anteriores, y además comprende uno o más antígenos virales del virus de la enfermedad de bursitis infecciosa, o del virus de la bronquitis infecciosa, o de reovirus, o del virus de la enfermedad de Newcastle, o antígenos bacterianos de E coli, o Salmonella, o Campylobacter, o un antigeno parasitario de Eimena En una modalidad alternativa, una vacuna multivalente de la presente invención consiste esencialmente en un toxoide alfa de C perípngens de tipo único, o un fragmento antigénico de un toxoide alfa de C perípngens, o un fragmento antigenico inactivo de una toxina alfa de C períringens, o cualquier combinación de los anteriores En una modalidad relacionada, la vacuna ademas contiene un antígeno viral, o un antígeno bacteriano, o un antígeno parasitario, como se proporciona en esta solicitud Una vacuna de la presente invención además puede comprender un adyuvante Un adyuvante popular para uso en animales es un adyuvante de hidróxido de aluminio Un adyuvante alternativo puede estar comprendido en una emulsión de agua en aceite junto con el antígeno En una vacuna particular de este tipo, la emulsión de agua en aceite se prepara con una fase oleosa al 70% y una fase acuosa al 30% En otra modalidad, el adyuvante no es específicamente un adyuvante de hidroxido de aluminio En una de dichas modalidades, se administra a las aves de corral la vacuna que incluye un adyuvante que no es de hidróxido de aluminio En una modalidad particular, una vacuna comprende un toxoide alfa de C perípngens, un adyuvante y uno o más antígenos protectores, recombinantes o naturales, obtenidos de un virus, una bacteria o un extracto bacteriano En otro aspecto, la presente invención provee métodos para proporcionar inmunidad activa a un ave mediante la inmunización del ave con una vacuna de la presente invención En una modalidad particular, la dosificación de la vacuna para lograr dicha inmunidad activa es de aproximadamente 0 05 ml a aproximadamente de 0 1 ml En una modalidad, el ave es un pavo En otra modalidad, el ave es un pollo Aun en otra modalidad, el ave es un faisán La presente invención además provee un método para la administración de una vacuna multivalente de la presente invención a un ave, a fin de protegerla contra múltiples enfermedades La presente invención provee también métodos para lograr la inmunidad pasiva en la descendencia de un animal hembra (por ejemplo, una hembra preñada), que comprenden la administración de una vacuna de la presente invención a la hembra (por ejemplo, la madre), antes del nacimiento de la descendencia En una modalidad, la hembra es un ave, y la vacuna se administra al ave hembra antes de poner los huevos que traerán la descendencia De esta manera, se provee inmunidad pasiva a la descendencia En una de dichas modalidades, el ave es un pollo En otra modalidad, el ave es un pavo Aun en otra modalidad, el ave es un faisán En una modalidad particular, el método provee la inmunidad pasiva contra una enfermedad clostpdial, a la descendencia del animal vacunado En uno de dichos métodos, la enfermedad clostpdial es una enfermedad intestinal clostpdial En un método particular de esta clase, la enfermedad intestinal clostpdial es enteritis necrótica En otro de dichos métodos, la enfermedad clostpdial es colangiohepatitis Aun en otra modalidad, el método provee inmunidad pasiva contra una enfermedad clostpdial, a la descendencia del animal vacunado, como así también provee protección contra dermatitis gangrenosa, septicemia y/o hepatitis En una modalidad, el método para lograr la inmunidad pasiva en la descendencia de un animal hembra comprende la administración de una vacuna multivalente al animal hembra, a fin de proteger la descendencia contra múltiples enfermedades En una modalidad particular de esta clase, el animal hembra es de la familia de las aves de corral, y la descendencia es protegida contra múltiples enfermedades de las aves de corral En una modalidad particular, la dosificación para lograr la inmunidad pasiva en la descendencia de un animal hembra es de aproximadamente 0 25 ml por dosis de la vacuna En otra modalidad, la dosificación es de aproximadamente 0 4 ml por dosis de la vacuna Aun en otra modalidad, la dosificación es de aproximadamente 0 6 ml por dosis de la vacuna En una modalidad ejemplificada a continuación, la dosificación es de alrededor de 0 5 ml por dosis de la vacuna La presente invención además provee un proceso para la elaboración de una vacuna de toxoide alfa de C períringens de la presente invención Un método de este tipo comprende el cultivo de una célula de C períringens en un medio de cultivo, a fin de producir una cantidad de células cultivadas que secretan una toxina alfa de C períringens en el medio celular El toxoide alfa de C períringens entonces se produce mediante la inactivación de la toxina alfa secretada La mayoría de las células cultivadas es eliminada del medio de cultivo, para formar un sobrenadante de toxoide alfa de C períringens En una modalidad particular del método, la concentración del sobrenadante de toxoide alfa de C períringens se ajusta de manera que es suficiente para inducir por lo menos cuatro unidades de antitoxina (A U ) de anticuerpo antitoxina alfa, por ml de antisuero de un animal (por ejemplo, un pollo) que ha sido vacunado con una o dos dosis de 0 25-0 6 ml cada una de dicha vacuna En una de dichas modalidades, el proceso de concentración incluye la diafiltración contra una solución regulada, a fin de eliminar los contaminantes de bajo peso molecular El proceso para la elaboración de una vacuna de toxoide alfa de C períringens de la presente invención además puede comprender la mezcla del sobrenadante de toxoide alfa de C períringens con un adyuvante En una de dichas modalidades, el sobrenadante de toxoide de C períringens alfa se mezcla en una emulsión de agua en aceite En una modalidad particular de esta clase, la emulsión de agua en aceite se prepara con una fase oleosa al 70% y una fase acuosa al 30% Las células de C períringens empleadas en el proceso pueden ser de un solo tipo de célula de C períringens En una modalidad particular de esta clase, el tipo de célula de C períringens único es una célula de C períringens de tipo A En una modalidad alternativa, el tipo de célula de C períringens único es una célula de C períringens de tipo C Estos y otros aspectos de la presente invención serán mejor apreciados por referencia a la siguiente Descripción Detallada DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA BNVENC8QN La presente invención proporciona vacunas de características únicas contra C períringens, que son seguras y eficaces para la prevención de enfermedades clostpdiales en animales En una modalidad particular, la administración de una vacuna de la presente invención a un sujeto animal hembra produce tanto la inmunización del animal hembra, como el desarrollo de anticuerpos que pueden ser transferidos en forma pasiva a su posterior descendencia En una modalidad, la presente invención proporciona una vacuna que comprende una cantidad mínima específica de un toxoide alfa de un tipo único de C períringens, eficaz contra infecciones nocivas de C períringens En una modalidad particular, la vacuna comprende una combinación segura e inmunológicamente eficaz de un toxoide alfa de la presente invención y un adyuvante aceptable para uso farmacéutico Las vacunas de la presente invención pueden utilizarse a fin de proteger contra cualquier afección o enfermedad donde esté implicada C períringens Dichas enfermedades incluyen enfermedades clostpdiales En una modalidad de este tipo, la enfermedad clostridial es una enfermedad intestinal clostridial Por lo tanto, en una modalidad particular, la presente invención proporciona vacunas eficaces para la prevención de la enfermedad intestinal clostpdial en aves de corral conocida como enteritis necrótica Además pueden prevenirse otros síndromes y enfermedades con las vacunas de la presente invención, entre ellos, sin limitación, hepatitis relacionada con clostpdios, colangiohepatitis y dermatitis gangrenosa La presente invención revela el hecho de que una vacuna que comprende una cantidad minima específica de toxoide alfa (esto es, que tiene TCP minima específica) obtenido de un tipo de C períringens único protege la descendencia del sujeto animal hembra vacunado, contra enfermedades clostridiales tales como enteritis necrótica, sin consideración de la expresión de cualquier toxina letal adicional por una C períringens de estímulo La presente invención además describe una vacuna que produce una respuesta mínima específica antitoxina alfa del animal hembra vacunado, que también protege la descendencia de dicho sujeto animal hembra vacunado contra enfermedades clostpdiales, sin consideración de la expresión de cualquier toxina letal adicional por una C períringens natural Las vacunas de la presente invención además pueden administrarse con un adyuvante aceptable Como se ejemplifica más adelante, la vacunación de gallinas con una vacuna derivada de un aislado de C períringens de tipo A mactivado que expresaba una toxina alfa, pero no una correspondiente toxina beta 2, condujo inesperadamente a la inmunización pasiva de los pollos de la descendencia, de tres semanas de edad, contra un estímulo de una cepa de C perípngens que expresaba tanto la toxina alfa como la toxina beta 2 Hasta la fecha, no ha habido evidencia de dicha protección cruzada contra estas dos toxinas distintas Por lo tanto, la presente invención proporciona vacunas relativamente simples, capaces de estimular una cantidad mínima específica de antitoxinas alfa, y en consecuencia, proteger contra enfermedades clostpdiales, por ejemplo, enteritis necrótica, sin consideración de la expresión de cualquier otra toxina por la cepa de estimulo de C períringens De hecho, a pesar de la cantidad de toxinas y otras proteínas biológicamente activas producidas por C períringens que han demostrado tener efectos patógenos en animales, y de las múltiples citas de la literatura acerca de las contribuciones de estas vanas toxinas y otras proteínas a la patología de la enteritis necrótica, las vacunas de características únicas descritas en esta solicitud proporcionan tanto una respuesta inmunológica sustancial para C períringens en gallinas parplleras vacunadas, como la inmunidad pasiva a su posterior descendencia Si bien la presente invención es completamente independiente de cualquier teoría o modelo, los resultados proporcionados en esta solicitud son consecuentes con el postulado de que la toxina de C períringens alfa es el componente antigénico, tanto necesario como suficiente, para la protección contra la enteritis necrotica Si bien las toxinas beta, beta 2 y enterotoxinas pueden ser decisivas para la patología de la enteritis necrotica, los resultados provistos en esta solicitud son consecuentes con la teoría de que el toxoide alfa es el único toxoide necesario en una vacuna para la enteritis necrótica Además, debido a que la producción de la toxina alfa en general es la más alta en las cepas de tipo A, las cepas de C períringens de tipo A son particularmente útiles como fuente de toxina de C perípngens alfa Sin embargo, pueden utilizarse también con éxito otros tipos de C períringens, en especial, cuando se ha empleado la modificación genética para incrementar el nivel de producción de toxina alfa en estos otros tipos Conforme a esta solicitud, los siguientes términos tendrán las definiciones que se exponen a continuación Conforme a esta invención, un "antígeno protector" es un antígeno que logra la producción de anticuerpos específicos que imparten protección contra la infección o la enfermedad, al animal vacunado con dicho antígeno, o a su descendencia Una vacuna que contiene dicho antigeno protector se denomina "inmunológicamente eficaz" Conforme a esta invención, el término "fragmento antigénico", con respecto a una proteína particular, es un fragmento de dicha proteína que es antigénico Por ejemplo, un fragmento antigénico de una toxina alfa o un toxoide alfa es un fragmento de la toxina alfa o del toxoide alfa que es antigénico Como se emplea aquí, un fragmento antigénico de una toxina alfa o de un toxoide alfa puede ser cualquier fragmento de la toxina alfa o del toxoide alfa, respectivamente, entre ellos, fragmentos grandes que les falta tan poco como un solo aminoácido de la proteína de longitud completa En una modalidad particular, un fragmento antigénico de una toxina alfa o de un toxoide alfa contiene entre 6 y 120 residuos de aminoácidos Ademas, un fragmento antigénico de una toxina alfa determinada puede obtenerse mediante una fuente biotecnológica, de una proteina aislada de fuentes naturales, o a través de la síntesis química Aun más, un fragmento antigénico puede obtenerse luego de la digestión proteolítica de una toxina alfa, un toxoide alfa, o un fragmento de los anteriores, a través de la expresión biotecnología, o alternativamente, puede generarse de novo, por ejemplo, mediante la síntesis peptídica Conforme a esta solicitud, un "fragmento antigénico inactivo" de una toxina de C períringens alfa es un fragmento antigénico de una toxina de C períringens alfa que retiene por lo menos un epitope antigénico, pero que no posee suficientes actividades catalíticas de la toxina alfa como para que sea nociva Dichos fragmentos antigénicos inactivos pueden usarse solos, o alternativamente, pueden incorporarse en proteínas de fusión Conforme a esta invención, el término "toxoide alfa" se refiere a cualquier toxina alfa inactiva (por ejemplo, una toxina alfa de longitud completa inactiva), si bien no se tiene la intención de limitar de manera alguna los medios particulares para la inactivación de una toxina alfa, a fin de producir dicho toxoide alfa Dicha metodología de inactivación incluye (1 ) métodos químicos que modifican la proteína intacta, por ejemplo, el tratamiento con formaldehído o glutaraldehído, (2) métodos físicos, tales como el calentamiento, (3) métodos enzimáticos que alteran la proteína, tales como una proteasa que disocia la toxina en fragmentos, (4) métodos biotecnológicos, tales como el diseño genético del gen de toxina alfa para eliminar o alterar regiones enzimáticas de la proteína, y retener uno o más epítopes antigénicos (ver, por ejemplo, US 5 817 317, cuyo contenido se incorpora en la presente solicitud a modo de referencia, en su totalidad), o combinaciones de cualesquiera de los anteriores, o de todos ellos De acuerdo con esta invención, un "sobrenadante de toxoide alfa" de C períringens es una solución que comprende toxina alfa de C períringens inactivada, donde por lo menos la mayoría de las células que producen la toxina se han eliminado (es decir, se elimina más del 70% de las células, y en una modalidad particular, se elimina más del 90% de las células) En una modalidad particular, la toxina alfa de C períringens inactivada ha sido secretada en el medio de cultivo por células de C períringens agregadas a dicho medio de cultivo, o cultivadas y desarrolladas en dicho medio de cultivo, y luego, ha sido inactivada En otra modalidad, la toxina alfa de C períringens inactivada incluye la toxina alfa de C períringens asociada con las células, que ha sido liberada a través de la hsis celular, y luego inactivada No se tiene intención alguna de limitar los medios para la preparación del "sobrenadante de toxoide alfa" a ningún método particular para la eliminación de las células o los restos celulares de la solución, estos medios incluyen la centrifugación, la cromatografía de columna, la ultrafiltración, etc Conforme a esta invención, una solución "libre de células" es aquella donde más del 90% de las células de un cultivo se han eliminado No se tiene intención alguna de limitar los medios para la preparación de la solución "libre de células", a ningún método particular para la eliminación de las células o los restos celulares de la solución, dichos métodos incluyen la centrifugación, la cromatografía de columna, la ultrafiltración, etc Conforme a esta invención, el término "tipo de C períringens único" se refiere a un solo tipo de C períringens, por ejemplo, de tipo A, de tipo B, de tipo C, etc , en oposición a múltiples tipos, por ejemplo, de tipo A y de tipo B y de tipo C, etc Por lo tanto, una célula, un sobrenadante, una composición, preparación, vacuna, etc que comprendan un toxoide alfa de un "tipo de C períringens único" es una célula, un sobrenadante, una composición, preparación, vacuna, etc que contiene toxoide alfa solo de ese tipo de C períringens específico, y no contiene toxoide alfa de cualquier otro tipo de C períringens Por otro lado, dichas células, dichos sobrenadantes, dichas composiciones, preparaciones, vacunas, etc pueden contener otros componentes toxoides que no son alfa, entre ellos, otros toxoides de C períringens, y adyuvantes, estimulantes inmunológicos, etc De acuerdo con esta invención, una "unidad antitoxina", o "A U ", de anticuerpo antitoxina alfa por ml de antisuero se usa de modo indistinto con la expresión "unidades de Ensayo de Neutralización Antitoxina alfa", o unidades "TNT", y se define por la capacidad del suero para neutralizar los efectos tóxicos de la toxina alfa en un bioensayo de ratón En este ensayo, una cantidad conocida de toxina alfa establecida por los estándares internacionales {EU Pharmacopoeía 5 0 01/2005 0088, p 803-804) se mezcla con diluciones en sene de suero de animales vacunados La mezcla se incuba una hora a temperatura ambiente y luego se inyecta en ratones por vía endovenosa Los ratones sobrevivirán si la toxina es neutralizada por completo por el suero, de lo contrario, morirán Las unidades antitoxina o la título se determinan como el numero recíproco de la dilución mas alta de suero que neutralizó la toxina Conforme a esta invención, el término "Potencia de Combinación Total" se abrevia "TCP", y se define según lo describe Batty { Toxin-Antitoxin Assay, Methods in Microbiology, Capítulo 8, Vol 5A (1971 ), ed J R Norris y D W Ribbons) En este ensayo, un volumen específico del sobrenadante de toxoide alfa se pone en contacto con una cantidad conocida de unidades antitoxina Después de proporcionar un periodo adecuado de incubación para permitir la unión de la antitoxina y el toxoide alfa, por ejemplo, una hora a temperatura ambiente, se agrega una cantidad conocida de la toxina alfa Entonces se permite un período adecuado para que la antitoxina libre restante se una con ia toxina alfa, por ejemplo, una hora a temperatura ambiente Luego se determina la cantidad de toxina alfa libre, agregando un sustrato a la solución a fin de medir la actividad enzimática de la toxina alfa Los sustratos apropiados comprenden glóbulos rojos (en particular, glóbulos rojos de ovejas) y lecitina El toxoide alfa entonces puede cuantificarse a través del cálculo sobre la base de la cantidad de actividad enzimática establecida Cuanto mayor es la cantidad de toxoide alfa presente en la solución de ensayo, mayor es la cantidad de actividad enzimática determinada en el ensayo Los términos "tipo" y "biotipo" se usan de manera indistinta en esta solicitud, y se refieren al fenotipo particular de una C períringens, sobre la base de la expresión de vanos genes de toxinas Clostpdium períringens se divide en tipos basados en la producción de las cuatro toxinas principales alfa, beta, épsilon e iota C períringens de tipo A produce la toxina alfa, el de tipo B produce las toxinas alfa, beta y epsilon, el de tipo C produce las toxinas alfa y beta, el de tipo D produce las toxinas alfa y épsilon, el de tipo E produce las toxinas alfa e iota Se han descrito tantas como 17 exotoxinas de C períringens Un biotipo de C períringens es una clasificación sobre la base de la producción de algunas de las toxinas clostpdiales adicionales o enzimas, o de todas ellas Por ejemplo, un patotipo enterotoxigénico de C períringens de tipo A puede producir toxinas theta y mu, además de la toxina alfa Conforme a esta solicitud, una vacuna multivalente es una vacuna que comprende dos o más antígenos diferentes En una modalidad particular de esta clase, la vacuna multivalente estimula el sistema inmunológico del receptor contra dos o más patógenos diferentes Los términos "adyuvante" y "estimulante inmunológico" se usan de manera indistinta en esta solicitud, y se definen como uno o más ingredientes que provocan la estimulación del sistema inmunológico En este contexto, un adyuvante se usa para mejorar la respuesta inmunológica a uno o más antígenos de vacuna Un adyuvante puede administrarse al animal blanco antes de la administración de la vacuna, en combinación con la vacuna, o después de dicha administración Los adyuvantes de la presente invención pueden obtenerse de cualquiera de una variedad de fuentes, entre ellas, fuentes naturales, fuentes biotecnológicas, o pueden sintetizaise en forma química, etc Ejemplos de compuestos químicos utilizados como adyuvantes incluyen, sin limitación, compuestos de aluminio, aceites metabolizables y no metabohzables, polímeros en bloque, ISCOM (complejos estimulantes inmunológicos, por sus siglas en inglés), vitaminas y minerales (entre ellos, sin limitación vitamina E, vitamina A, selenio y vitamina B12), Quil A (saponinas) y CARBOPOL® Ejemplos adicionales de adyuvantes, que en ciertas ocasiones han sido referidos específicamente como estimulantes mmunológicos, incluyen componentes de la pared celular bacteriana y fúngica (por ejemplo, lipopolisacápdos, lipoproteinas, g coproteínas, péptidos de muramilo, be.a-1 ,3/1 ,6-glucanos), vanos carbohidratos complejos derivados de plantas (por ejemplo, glicanos, acemanano), vanos péptidos y proteinas derivados de animales (por ejemplo, hormonas, atocinas, factores coestimulantes), y nuevos ácidos nucleicos derivados de virus y otras fuentes (por ejemplo, ARN de doble filamento, CpG) Además, cualquier número de combinaciones de los ingredientes mencionados puede proporcionar un efecto adyuvante, y por lo tanto, pueden formar un adyuvante de la presente invención Conforme a esta invención, una "antitoxina alfa" es un anticuerpo (monoclonal o policlonal) que se une a la toxina alfa Los anticuerpos para una toxina alfa pueden medirse por medio de un ensayo TNT, como se describe con anterioridad Alternativamente, los anticuerpos pueden detectarse por su capacidad para bloquear el efecto hemolítico de la toxina alfa En un ensayo de inhibición de hemolisis, una cantidad conocida de toxina alfa, suficiente para catalizar la hsis completa de una preparación determinada de glóbulos rojos de oveja, se mezcla con diluciones en sene de suero, y se incuba durante una hora a 36 + 2°C La mezcla luego se incuba con glóbulos rojos de oveja al 0 5% durante tres horas a 36 + 2°C Cuando el anticuerpo se une a la toxina alfa, la toxina es incapaz de hemolisar los glóbulos rojos La título se determina por medio del número recíproco de la dilución más alta de suero que no provoca la hemolisis En un ensayo similar, puede medirse la capacidad de los anticuerpos ligados a la toxina alfa para inhibir la actividad de la fosfo pasa, mediante la determinación de la dilución más alta de antisuero que bloquea la disociación enzimática de lecitina Conforme a esta invención, el término "polipéptido" se usa de modo indistinto con el término "proteína", y además, tiene la intención de comprender péptidos Por lo tanto, como se usa en esta solicitud, un polipéptido es un polímero de dos o más aminoácidos unidos por uniones peptidicas Los polipéptidos de la presente invención incluyen proteínas naturales, proteínas recombinadas, proteinas sintetizadas en forma química, fragmentos de cualquiera de las proteínas naturales, recombinadas o sintetizadas químicamente, y proteínas de fusión que comprenden cualquiera de las proteinas naturales, recombinadas o sintetizadas en forma química, y cualquiera de sus fragmentos Preferentemente, el término "po péptido" se usa para representar un polímero que comprende veinte o más residuos de aminoácidos, unidos por medio de uniones peptídicas, mientras que el término "péptido" se usa para representar un polímero que comprende dos a veinte residuos de aminoácidos, unidos por medio de uniones peptídicas Una "secuencia de nucleótidos heteróloga", conforme a esta invención, es una secuencia de nucleótidos que se agrega, por métodos de ingeniería genética, a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina de la presente invención, por ejemplo, una toxina alfa de la presente invención, o que codifica uno de sus fragmentos (por ejemplo, un fragmento antigénico inactivo), a fin de formar un ácido nucleico que no se forma en la naturaleza Dichos ácidos nucleicos pueden codificar proteínas de fusión Además, conforme a esta invención, no es necesario que una secuencia de nucleótidos heteróloga sea una secuencia de nucleótidos contiguos única, sino que puede incluir múltiples secuencias de nucleótidos no contiguos, que se han combinado con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención, o una de sus porciones Una secuencia de nucleótidos heteróloga puede comprender secuencias no codificadoras que incluyen sitios de restricción, sitios reguladores, promotores y similares Aun en otra modalidad, el nucleótido heterólogo puede funcionar como un medio para detectar una secuencia de nucle?tidos de la presente invención Esta invención proporciona secuencias de nucleótidos heterólogas que, cuando se combinan con secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de la invención, o uno de sus fragmentos, son necesarias y suficientes para codificar todas las proteínas de fusión de la presente invención Conforme a esta invención, una vacuna "que consiste esencialmente en" o "que comprende esencialmente" un toxoide alfa de C períringens de tipo único, o fragmento antigénico del toxoide alfa de C períringens, o fragmento antigénico inactivo de la correspondiente toxina alfa, es una vacuna que contiene una cantidad inmunológicamente eficaz del toxoide alfa de C períringens de tipo único, o fragmento antigénico del toxoide alfa de C perípngens, o fragmento antigénico inactivo de la correspondiente toxina alfa, a fin de proteger contra una enfermedad clostpdial, pero que no contiene una cantidad inmunológicamente eficaz de cualquier otro antígeno que se sabe protege contra una enfermedad clostpdial, tal como otro antígeno de C períringens, o una toxina alfa de C períringens de tipo alternativo, un toxoide alfa, o su fragmento Dichas vacunas además pueden incluir antígenos relacionados con otras enfermedades, tales como antígenos virales del virus de la enfermedad de bursitis infecciosa, reovirus y virus de la enfermedad de Newcastle, antigenos bacterianos de E coli, Salmonella y Campylobacter, y un antigeno parasitario, tal como un antígeno de Eimena De acuerdo con esta invención, el término "aproximadamente", utilizado en conjunto con un valor de dosificación particular, significa que el valor de dosificación se encuentra dentro del veinte por ciento del valor indicado, por ejemplo, una dosificación de aproximadamente 0 5 ml puede comprender entre 0 4 ml y 0 6 ml Aislamiento de C períringens de tipo A Los aislados de C períringens, tales como C períringens de tipo A, pueden obtenerse de muestras de materia fecal o de raspados intestinales de animales infectados Las muestras o el raspado pueden salpicarse sobre placas de ágar de sangre, incubarse en forma anaerobia a 35 + 1°C durante 24 a 48 horas, y luego, pueden recogerse individualmente las colonias que se asemejan a C períringens de tipo A Con el fin de confirmar la identidad como aislados de C períringens de tipo A, las colonias seleccionadas pueden evaluarse adicionalmente para determinar las propiedades bioquímicas características de C perípngens de tipo A, entre ellas, la conformación genética La presencia del gen de toxina alfa en el aislado puede establecerse mediante el análisis genético, por ejemplo, por PCR La expresión de la toxina alfa puede demostrarse por su actividad de lecitinasa en un ensayo usando yema de huevo, o mediante un ensayo de hemolisis empleando glóbulos rojos de oveja En una modalidad particular, los aislados de C períringens que expresan un alto nivel de toxina alfa se usan en la preparación de una vacuna de la presente invención Un aislado, o aislados de C períringens seleccionados pueden cultivarse en forma anaerobia en caldo de cultivo nutriente, durante 4 a 24 horas El cultivo puede inactivarse, por ejemplo, con formalina, concentrarse y combinarse para formar dicha vacuna Toxinas de C períringens Toxina alfa La toxina alfa es producida por todos los tipos de C períringens La toxina alfa es una fosfolipasa C multifuncional que puede dividir iecitina, para formar fosfoplcolina y un diglicépdo Cuando se administra por vía endovenosa, se ha demostrado que la toxina alfa es mortal en ratones Además, la toxina alfa es marcadamente hemolítica Sin embargo, la susceptibilidad de los glóbulos rojos puede variar en gran medida, según la especie de animal utilizada como la fuente de glóbulos rojos La toxina alfa también produce la agregación de plaquetas, la hsis de plaquetas, leucocitos y otros cuerpos celulares, y además, causa un incremento en la permeabilidad vascular Toxina beta La toxina beta es producida por C períringens tipos B y C La toxina beta es responsable de la inflamación del intestino y de la pérdida de gran cantidad de mucosa, así como también, de la inhibición del movimiento intestinal La toxina beta es una proteína que tiene un peso molecular de 35 kDa, y es mucho más susceptible a las enzimas proteolíticas, tales como tripsina, que las otras toxinas de C períringens Se ha informado que la toxina beta es mortal en animales, los ratones son los más sensibles, y los pollos son los menos sensibles Toxina beta 2 La toxina beta 2 es la más reciente de las toxinas de C períringens descubiertas A pesar de sus nombres similares, las secuencias de aminoácidos de la toxina beta 2 y de la toxina beta no muestran homología La literatura ha demostrado una fuerte asociación entre la toxina beta 2 y la enteritis necrótica en ciertos animales (Garmory y col , Epidemiol Infect , 124 61 -67 (2000), Herholz y col , J Clin Morco, feb 358-361 (1999)) La toxina beta 2 tiene un peso molecular de 28 kDa Se ha hallado que la toxina beta 2 es mortal en ratones, y citotóxica para ciertos estirpes celulares, ya que induce el redondeo de las células y la sis, sin afectar el citoesqueleto de actina (Manteca y col , Vet Microb , 86 191 -202 (2002), Schoette y col , J Vet Med B , 51 423-416 (2004), Gilbert y col , Gene, 203 65-73 (1997)) Enterotoxina La enterotoxina típicamente es producida por cepas de C perípngens de tipo A La presencia de la enterotoxma tradicionalmente se ha utilizado para distinguir cepas asociadas con enfermedades intestinales, de aquellas asociadas con gangrena gaseosa de tejido Las cepas que provocan gangrena gaseosa típicamente no tienen enterotoxina La enterotoxina es una proteina sensible al calor que tiene un peso molecular de 34 kDa La dosis mortal para ratones es de aproximadamente 10 microgramos La interacción inicial de la enterotoxina es para formar poros en la célula huésped, siguen luego la alterada permeabilidad de la célula, la inhibición de la síntesis macromolecular, la desintegración citoesquelética, y finalmente, la lisis (ver Songer, Clin Micro Rev , 9 (2) 216-234 (1996)) La enterotoxina efectúa la inversa del transporte neto en las células del intestino Toxina épsilon La toxina épsilon es producida por C perfpngens tipos B y D La toxina épsilon es secretada como una protoxina, que es convertida por tripsina endógena en una neurotoxina extremadamente potente Cuando se administra por vía endovenosa, la toxina épsilon puede ser extremadamente mortal en ratones La toxina épsilon tiene una alta afinidad para tejido neural, y posee el efecto de provocar permeabilidad vascular Además, la toxina épsilon provoca permeabilidad de la pared intestinal, para permitir que moléculas grandes, incluso la misma toxina, entren en el torrente sanguíneo La toxina epsilon entonces avanza a través del torrente sanguíneo hacia el cerebro, donde interrumpe el equilibrio osmótico Esta interrupción del equilibrio osmótico en el cerebro provoca los signos neurológicos observados antes de la muerte del animal afectado Toxina kappa La toxina kappa es una enzima hidro zante de colágeno producida por C períringens tipos A, D, E y algunos tipos de B y C La toxina kappa tiene un peso molecular de 80 kDa, y es mortal en ratones La inyección endovenosa de toxina kappa en ratones produce la muerte dentro de la hora, debido a la intensa hemorragia de los pulmones Toxina theta La mayoría de las cepas de C períringens producen toxina theta La toxina theta es una proteína de 74 kDa, responsable de las zonas claras de hemolisis observadas alrededor de las colonias en placas de ágar de sangre La toxina theta purificada es extremadamente mortal en ratones, y produce la muerte en cuestión de minutos La toxina theta es inhibida por ciertos esferoides, de los cuales el más potente inhibidor es el colesterol Inmunidad pasiva La presente invención comprende una vacuna compuesta por una preparación segura e inmunológicamente eficaz de una cantidad mínima de un antígeno de la presente invención, por ejemplo, un toxoide alfa, para la vacunación de hembras no humanas, en particular, hembras fértiles o preñadas, que luego pueden transferir el efecto de la vacuna a su descendencia Dicha transferencia de inmunidad de madre a su descendencia se denomina "inmunidad pasiva" La inmunidad pasiva puede llevarse a cabo, ínter alia, mediante la ingestión del calostro, como ocurre en mamíferos, o la absorción de anticuerpo en el torrente sanguíneo desde la yema de huevo, como ocurre en las aves de corral Además, como se describe en esta solicitud, las aves de corral pueden consumir anticuerpos in ovo, lo que produce la elevación del nivel de anticuerpos generales en circulación Como queda demostrado en esta solicitud, la transferencia pasiva de una cantidad específica de antitoxina alfa al animal neonato protege los neonatos contra un estímulo virulento de Clostndium perípngens El alcance de la protección, como se describe a continuación, fue completamente inesperado, ya que hasta la fecha, se creía que el intestino debía ser bañado con anticuerpos a fin de proteger de manera significativa contra un estímulo de C períringens de tipo A oral Asimismo, es muy sorprendente la presencia de una correlación entre la transferencia de anticuerpos maternos de inmunidad mucosal a través de la ingestión del calostro en el mamífero neonato, y la absorción de anticuerpo materno en el huevo Como se demuestra a continuación para los pollos, los anticuerpos antitoxina alfa son absorbidos en el torrente sanguíneo in ovo Ademas, la presente invención describe que la inducción de una titulo de anticuerpo antitoxina alfa mínima definida en el torrente sanguíneo de la gallina es suficiente para proteger la descendencia vacunada de esa gallina contra un desafío de C períringens de tipo A efectuado semanas después del nacimiento de dicha descendencia Inmunidad activa La presente invención abarca la vacunación de crías de pollo (por ejemplo, pollos parplleros) o pavos, a fin de proporcionar inmunidad activa contra la enteritis necrótica, dermatitis necrótica y dermatitis gangrenosa Los pollos y las aves se vacunan en los primeros días de vida, aproximadamente el primer día o poco tiempo después (dentro de la primera semana de vida), con una sola dosis o dos dosis de la vacuna Las dosificaciones de vacuna apropiadas para lograr la inmunidad activa pueden variar desde aproximadamente 0 05 ml hasta aproximadamente 0 5 ml En una modalidad particular, la dosificación de la vacuna es de aproximadamente 0 05 ml a aproximadamente 0 1 ml Cultivo de células Clostpdium períringens secreta toxina alfa en el medio durante el crecimiento Luego de la inactivación y la eliminación de por lo menos la mayoría de las células del medio de crecimiento, la solución resultante se denomina sobrenadante de toxoide alfa Las células en general se eliminan a fin de minimizar los antígenos extraños en la vacuna que podrian promover de otro modo la reactividad, y disminuir la respuesta inmunológica Sin embargo, también hay una cantidad limitada de toxina alfa asociada a las células Por lo tanto, el antígeno de toxina alfa puede derivarse de las células o del medio, en forma concentrada o no concentrada C períringens puede cultivarse en cualquier recipiente apropiado, por ejemplo, frascos, botellas, jarros o fermentadores mecánicos Las fermentaciones pueden controlarse durante el crecimiento, de manera de cosechar el fermentador cuando la producción de toxina alfa se encuentra en su pico Los métodos típicos incluyen la cromatografía de afinidad, electroforesis de gel (sistema PHAST, etc ), inmunoensayos, ensayos de actividad de lecitinasa y hemolisma El extracto celular o fluido de cultivo celular puede ser inactivado con formaldehido (0 1 -2 0%), o con una combinación de formaldehído y calor Otros agentes químicos que se usan habitualmente para la desnaturalización de proteína y que pueden ser útiles incluyen, sin limitación glutaraldehído, fenol, vanos detergentes tales como Tritón X-100, dodecilsulfato de sodio (SDS) y alcoholes Los niveles residuales de formaldehído pueden controlarse durante la inactivación de manera de mantener un nivel óptimo, sin exceder o disminuir presencia de toxoide Los métodos típicos para la medición de formaldehído libre se citan en la European Pharmacopoeía (01/2005 20418), o en 9 CFR (1 13 100) Pueden obtenerse métodos similares para medir otros tipos de inactivantes de toxinas En ciertos casos, se disminuye deliberadamente la presencia de toxoide en la toxina alfa en este punto, a fin de minimizar la desnaturalización de epitopes críticos para el desarrollo de antitoxinas, y luego, la toxina es tratada adicionalmente para la detoxificación en un punto posterior del proceso Pueden emplearse también otros agentes químicos o biológicos adecuados, capaces de inactivar la toxina, tales como glutaraldehído, fenol, vanos detergentes tales como Tritón X-100, dodecilsulfato de sodio (SDS) y alcoholes El toxoide alfa resultante puede almacenarse durante un período de tiempo antes de cualquier procesamiento adicional, sin efectos nocivos Típicamente, el almacenamiento óptimo es a entre 2 y 8°C Sin embargo, los toxoides clostpdiales inactivados son extremadamente estables, y también pueden almacenarse a temperaturas más altas Para períodos de almacenamiento de más de 6 meses y a más de 8°C de temperatura, es aconsejable evaluar nuevamente la potencia del toxoide por medio de un ensayo de Potencia de Combinación Total (TCP), u otro ensayo inmunológico similar, a fin de determinar la estabilidad inmunógena del toxoide Las células pueden eliminarse del medio de cultivo mactivado mediante centrifugación o filtración, a fin de obtener el sobrenadante de toxoide La eliminación de las células sirve para reducir la reactividad de tejido que pueda ser causada por los componentes celulares, mientras que la eliminación de los antígenos extraños de la preparación ayuda a que la respuesta inmunologica se centre en el componente toxoide de la vacuna El medio de cultivo inactivado puede concentrarse mediante cualquiera de una cantidad de medios, entre ellos, ultrafiltración (preferentemente, usando membranas de ultrafiltración de no más de 30000 de corte de peso molecular), o mediante ofilización El proceso de concentración puede comprender la diafiltración contra una solución acuosa (por ejemplo, solución salina regulada con fosfato), a fin de eliminar los contaminantes de bajo peso molecular de la preparación El fluido concentrado puede tratarse nuevamente una o más veces con formaldehído o calor, hasta que un ensayo adecuado indique que el fluido está libre de toxicidad residual Dichos ensayos incluyen un bioensayo de ratón, esto es, la inyección del fluido en ratones y la observación de su efecto en ratones, o la medición de la actividad de hemohsina o la actividad de lecitinasa, etc Es probable que el pH de la solución deba ajustarse antes de la combinación, a fin de garantizar la óptima unión a los adyuvantes, la emulsión con aceites o la estabilidad de la solución El punto isoeléctrico (pl) de la toxina alfa es aproximadamente 5 5 (Smith y col , The Pathogenic Anaerobio Bacteria (3ra Ed ), Charles Thomas Publishers, p 1 16 (1984)) El ajuste del pH de la solución de toxoide alterará la carga neta en la proteína, lo que es conveniente para el realce de la unión a ciertos adyuvantes, tales como adyuvantes de aluminio El pH también puede ajustarse a un nivel que incremente la estabilidad del toxoide alfa para el almacenamiento durante un período prolongado Por ejemplo, es más probable que las proteínas se precipiten de la solución a su pl, si bien habitualmente son estables a 1 unidad de pH por encima o por debajo de este valor Ácidos nucleicos que codifican los pohpéptidos de la presente invención Un ácido nucleico, tal como un ADNc, que codifica un pohpéptido de la presente invención puede emplearse a fin de generar células huéspedes bacterianas recombinadas que expresan una proteína o un antígeno de la presente invención, por ejemplo, la toxina alfa Dichas células huéspedes recombmadas pueden inactivarse, esto es, pueden convertirse en vacunas bacterianas, y utilizarse en composiciones inmunógenas tales como vacunas Además, la obtención y la construcción de un ácido nucleico que codifica un po péptido de la presente invención, por ejemplo, los que codifican una toxina alfa de la presente invención, o un fragmento antigénico inactivo de esta, pueden facilitar la producción de la toxina alfa, de toxoide alfa o sus fragmentos La toxina alfa, el toxoide alfa o fragmentos antigénicos de estos son útiles para la elaboración de ciertas vacunas de la presente invención En consecuencia, la presente invención comprende construcciones de ácido nucleico que permiten la expresión y el aislamiento de las proteínas o los fragmentos antigénicos de la presente invención Las secuencias para dichos ácidos nucleicos y correspondientes proteínas recombinadas de los antígenos por ser utilizados en este aspecto de la presente invención son bien conocidas por los expertos en la materia A continuación se proporciona una pequeña muestra de los antígenos que pueden usarse en las vacunas de la presente invención, junto con su número de acceso GenBank y un artículo científico que describe sus secuencias de aminoácidos EJEMPLOS DE ANTIGENOS QUE PUEDEN USARSE EN LAS VAC 1 Las secuencias proporcionadas en estos artículos se incorporan en la presente solicitud a modo de referencia Los ácidos nucleicos codificadores de antígenos de proteinas que pueden usarse en las vacunas de la presente invención además pueden contener secuencias de nucleótidos heterólogas A fin de expresar una proteína recombinada de la presente invención en una célula huésped, puede construirse un vector de expresión que comprende el correspondiente ADNc La presente invención, por lo tanto, incluye vectores de expresión que contienen ácidos nucleicos que codifican proteínas recombinadas de la presente invención, incluso sus vanantes Debido a la degeneración de las secuencias codificadoras de nucleótidos, en la práctica de la presente invención pueden usarse otras secuencias de nucleótidos que codifican sustanclalmente la misma secuencia de aminoácidos que un ácido nucleico que codifica un po péptido de la presente invención Estas incluyen, sin limitación, genes aléhcos, genes homólogos de otras cepas, y aquellas alteradas mediante la sustitución de diferentes codones que codifican el mismo residuo de aminoácido dentro de la secuencia, para producir de ese modo un cambio silente Se incluyen también las células huéspedes que comprenden los vectores de expresión de la presente invención Una célula huésped empleada con frecuencia es una célula de E coli Se han descrito los métodos generales para la clonación de ADNc y la expresión de sus correspondientes proteínas recombinadas (ver Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A laboratory Manual, 3a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor L I (2000)) Además, puede emplearse cualquier técnica para mutagénesis conocida en la materia, a fin de modificar una toxina alfa natural de la presente invención, entre ellas, sin limitación, la mutagénesis dirigida a sitio in vitro (Hutchinson y col , J Biol Chem , 253 6551 (1978), Zoller y Smith, DNA, 3: 479-488 (1984), Ohphant y col , Gene, 44 177 (1986), Hutchinson y col , Proc Natl Acad Sci U S A , 83 710 (1986), Wang y Malcolm, BioTechniques, 26 680-682 (1999), cuyos contenidos se incorporan en la presente solicitud a modo de referencia, en su totalidad) Pueden empleare también conectores TAB@ (Pharmacia), etc y técnicas de PCR para la mutagénesis dirigida a sitio (ver Higuchi, "Using PCR to Engineer DNA", en PCR Technology Principies and Applications for DNA Amplificaron, H Eriich, ed , Stockton Press, Capítulo 6, p 61 -70 (1989)) Po péptidos de la presente invención La presente invención comprende polipéptidos aislados o recombinados, entre ellos, las toxinas alfa y los toxoides alfa de la presente invención, sus cepas vanantes, sus fragmentos antigénicos inactivos y sus proteínas de fusión Además, se incluyen también en la presente invención los pohpéptidos que contienen secuencias alteradas donde los residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos natural son sustituidos con residuos de aminoácidos funcionalmente equivalentes, para lograr una sustitución de aminoácido conservadora Por ejemplo, uno o más de estos residuos de aminoácidos dentro de la secuencia pueden ser sustituidos con otro aminoácido de polaridad similar, que actúa como un equivalente funcional, para lograr una alteración silente Los sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido Por ejemplo, los aminoácidos no polares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valma, prolina, fenilalanina, tpptófano y metionina Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, sepna, treonma, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina Los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina y lisina Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y acido glutámico Los cambios de aminoácidos conservados particularmente preferidos son (a) Lys por Arg o viceversa, de manera que pueda mantenerse una carga positiva, (b) Glu por Asp o viceversa, de manera que pueda mantenerse una carga negativa, (c) Ser por Thr o viceversa, de manera que pueda mantenerse un -OH libre, (d) Gln por Asn o viceversa, de manera que pueda mantenerse un NH2 libre, y (e) lie por Leu o por Val o viceversa, como aminoácidos hidrófobos aproximadamente equivalentes Todos los polipéptidos de la presente invención, incluso los fragmentos antigénicos, pueden ser parte de una proteína de fusión En una modalidad específica, un polipéptido de fusión se expresa en una célula procariótica Dicha proteina de fusión puede usarse, por ejemplo, para mejorar la antigenicidad de un antigeno o de uno de sus fragmentos, para disminuir o eliminar su toxicidad, sin negar su antigenicidad, o para aislar un antígeno de la presente invención El aislamiento de la proteína de fusión en el último caso puede facilitarse usando una columna de afinidad específica para la proteína/el péptido fusionado al antígeno Dichas proteínas de fusión incluyen una proteína de fusión de glutationa-S-transferasa (GST), una protema de fusión de maltosa-proteína de unión (MBP), una proteína de fusión con marca FLAG, o una proteína de fusión con marca de polihistidina Las secuencias conectoras específicas tales como un conector Ser-Gly también pueden ser parte de dicha proteína de fusión De hecho, la expresión de un pohpéptido de fusión puede facilitar la expresión estable, o permitir la purificación sobre la base de las propiedades del compañero de fusión En consecuencia, la purificación de los polipéptidos recombinados de la presente invención puede simplificarse utilizando proteínas de fusión que tengan Marcas de afinidad Por ejemplo, GST une glutationa conjugada a una matriz de soporte sólido, MBP se une a una matriz de maltosa, y pohhistidina se quela a una matriz de soporte de quelación Ni (ver Hochuli y col , Biotechnology, 6 1321 -1325 (1998)) La proteina de fusión puede eluirse de la matriz específica con reguladores apropiados, o mediante el tratamiento con una proteasa específica para un sitio de disociación que se ha diseñado genéticamente entre una toxina alfa, por ejemplo, y su compañero de fusión Alternativamente, una toxina alfa puede combinarse con una proteina marcadora, tal como la proteína fluorescente verde (Waldo y col , Nature Biotech , 17 691 -695 (1999), Patente de los Estados Unidos No 5 625 048, y WO 97/26333, cuyos contenidos se incorporan en la presente solicitud a modo de referencia, en su totalidad) Además, o alternativamente, pueden usarse otras etapas de cromatografía de columna (por ejemplo, filtración de gel, intercambio iónico, cromatografía de afinidad, etc ), a fin de purificar los polipéptidos naturales o recombinados de la presente invención (ver a continuación) En muchos casos, dichas etapas de cromatografía de columna emplean la cromatografía líquida de alto rendimiento o métodos análogos, en lugar de los procedimientos más clásicos sobre la base de la gravedad Aun más, los pohpéptidos de la presente invención, incluso las toxinas alfa y sus fragmentos antigénicos inactivos, pueden sintetizarse en forma química (ver, por ejemplo, Synthetic Peptides A User's Guide, W H Freeman & Co , New York, N Y , p 382, Grant, ed (1992)) Procedimientos generales para la purificación de po péptidos En general, las etapas iniciales para la purificación de un polipéptido de la presente invención pueden comprender el salado o desalado, por ejemplo, en fraccionaciones de sulfato de amonio, fraccionaciones de exclusión de solvente, por ejemplo, una precipitación de etanol Además, puede emplearse la ultracentrifugación de alta velocidad, sola o en conjunto con otras técnicas de extracción Habitualmente, las etapas para el buen aislamiento secundario o la purificación comprenden la absorción de fase sólida usando gel de fosfato de calcio, hidroxiapatita, o la unión de fase sólida La unión de fase sólida puede efectuarse mediante el enlace iónico, con un intercambiador amónico, tal como dietilaminoetilo (DEAE) , o dietil [2-h?drox?prop?l] aminoetilo (QAE), SEPHADEX o celulosa, o con un intercambiador catiónico, tal como carboximetilo (CM) o sulfopropilo (SP), SEPHADEX o celulosa Otros medios alternativos de unión de fase solida abarcan la explotación de interacciones hidrófobas, por ejemplo, el uso de un soporte sólido tal como fenilSepharose y un regulador de alta salinidad, inmunounión de unión de afinidad, usando, por ejemplo, un anticuerpo de toxina alfa ligado a un soporte activado Otros soportes de fase sólida comprenden aquellos que contienen tintes específicos o lectinas, etc Otra técnica de soporte de fase sólida utilizada a menudo al final del procedimiento de purificación se basa en la exclusión por tamaño, tal como con los geles de SEPHAROSA y SEPHADEX Alternativamente, puede emplearse una técnica de membrana presupzada o centrífuga, usando filtros de membrana de exclusión por tamaño Con frecuencia, estos dos métodos se usan en serie Las separaciones de soporte de fase sólida en general se realizan en lotes, con centrifugación a baja velocidad, o mediante la cromatografía de columna La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), que comprende técnicas relacionadas tales como FPLC, es actualmente el medio más común para efectuar la cromatografía líquida Pueden además llevarse a cabo técnicas de exclusión por tamaño con la ayuda de la centrifugación a baja velocidad Aun más, pueden emplearse técnicas de penetración por tamaños, tales como las técnicas de electroforesis de gel Estas técnicas en general se efectúan en tubos, placas, o mediante electroforesis capilar Casi todas las etapas que suponen la purificación de po péptidos emplean una solución regulada A menos que se especifique lo contrario, se usan en general concentraciones de 25 a 100 mM de sales reguladoras Los reguladores de baja concentración habitualmente tienen concentraciones de 5 a 25 mM, mientras que los reguladores de alta concentración tienen a menudo concentraciones del agente regulador de entre 0 1 y 2 0 M Los reguladores típicos pueden obtenerse de la mayoría de los catálogos bioquímicos, e incluyen los reguladores clásicos tales como Tris, pirofosfato, monofosfato y difosfato, y los reguladores de Good, tales como Mes, Hepes, Mops, Tríeme y Ches (Good y col , Biochemistry, 5 467 (1966), Good e Izawa, Meth Enzymol , 24B 53 (1972), y Fergunson y Good, Anal Biochem , 104 300 (1980)) Los materiales para efectuar todas estas técnicas pueden obtenerse de una variedad de fuentes comerciales, tales como Sigma Chemical Company, en St Louis, Missouri Componentes de la vacuna Toxoide alfa de C perípngens En modalidades particulares, es conveniente que la vacuna para animales contenga la cantidad mínima del toxoide alfa, necesaria para la protección contra enteritis necrótica Se determinó que este nivel era de 2 unidades de Potencia de Combinación Total (TCP) por dosis, en las condiciones particulares ejemplificadas a continuación Las unidades TCP se establecen sobre la base de estándares internacionales (Batty, Toxin-Antitoxin Assay, Methods m Microbiology, Capítulo 8, Vol 5A (1971 ), ed J R Norps y D W Ribbons), y las vacunas de la presente invención pueden combinarse sin dificultad para tener la potencia deseada Pueden emplearse menos de 2 unidades TCP, aun en estas condiciones, si la vacuna además comprende estimulantes de la inmunidad En cualquier caso, es preferible que la vacuna produzca 4 o más unidades antitoxina por ml de suero del animal Cuantificación de toxoide alfa En general, es conveniente la cuantificación del toxoide alfa, a fin de garantizar la inclusión de niveles óptimos en la vacuna Un método adecuado para la cuantificación de toxoides emplea el ensayo de Potencia de Combinación Total (TCP) En este ensayo, se pone en contacto un volumen específico del sobrenadante de toxoide alfa con una cantidad conocida de unidades de antitoxina Después de proporcionar un período de incubación adecuado para permitir la unión de la antitoxina y el toxoide alfa, por ejemplo, 0 5 a 2 horas, se agrega una cantidad conocida de la toxina alfa Entonces se proporciona un período adecuado para permitir la unión de la antitoxina libre restante con la toxina alfa La cantidad de toxina alfa libre luego se determina agregando a la solución un sustrato para la actividad de fosfo pasa C de la toxina alfa Los sustratos adecuados incluyen glóbulos rojos (en particular, glóbulos rojos de oveja) y lecitina Entonces puede cuantificarse el toxoide alfa a través del cálculo, sobre la base de la cantidad de actividad de fosfolipasa C Cuanto mayor es la cantidad de toxoide alfa presente en la solución de ensayo, mayor es la cantidad de actividad de fosfolipasa C medida en el ensayo Alternativamente, la determinación puede llevarse a cabo sin la medición de la actividad de fosfo pasa C, por ejemplo, puede emplearse cualquier análisis de unión de anticuerpo competitivo, que comprende la incorporación de una etapa de cromatografía, un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA), o un análisis de unión competitiva por medio de un instrumento Biacore, o similares Antíqenos adicionales Las enfermedades clostpdiales a menudo se manifiestan como infecciones mixtas, y por lo tanto, la adición de otros toxoides clostndiales puede reducir aun mas la patología y los signos clínicos Ejemplos, sin limitación, de otros toxoides clostpdiales de organismos que se sabe provocan enteritis gástrica, incluso aquellos de C períringens, que pueden agregarse a una vacuna de la presente invención a fin de incrementar la potencia contra infecciones mixtas incluyen toxina beta, toxina beta 2, toxina theta, toxina épsilon, enterotoxina, toxina kappa, toxina lambda y toxina iota de C períringens, toxina hemorrágica (HT, por sus siglas en inglés) y toxina letal (LT, por sus siglas en inglés) de C sordelln, toxinas A y B de C difficile, toxina alfa de C septicum, y toxinas alfa (A) y beta (B) de C novyi Pueden incluirse también antigenos de otras bacterias, otros virus, hongos o parásitos, en las vacunas de la presente invención Dichos antígenos comprenden otras toxinas u otros toxoides, bacterias o extractos de bacterias, hongos o extractos de hongos, virus o proteínas virales, y parásitos o proteínas de parásitos Los antígenos virales, bacterianos y parasitarios apropiados de las fuentes provistas en esta invención son bien conocidos en el arte Ejemplos, sin limitación, de organismos bacterianos son Eschepchia coh, género Camplobacter, género Pasteurella, género Staphylococcus, género Streptococcus, género Enterococcus, Chlamydia, género Erysipelas, Pasteurella, Bordetella y Ornithobactenum Ejemplos, sin limitación, de toxinas relacionadas son lipopolisacápdo (LPS) de bacterias gram negativas, que según se sabe, mejora la respuesta inmunológica de las vacunas, y en consecuencia, mejora la producción de antitoxinas para la toxina alfa de C períringens y micotoxinas Ejemplos, sin limitación, de virus apropiados son coronavirus, rotavirus, astrovirus, virus de tipo enterovirus, torovirus, adenovirus, reovirus, birnavirus, virus del herpes, paramixovirus, picornavirus, virus de la enfermedad de Mareks, virus de la enteritis hemorrágica y virus de la enfermedad de Newcastle Ejemplos, sin limitación, de parásitos son coccidios, la especie Eimepa, por ejemplo, y criptospopdios (ver US 2004/0018215A1 , cuyos contenidos se incorporan en la presente solicitud a modo de referencia, en su totalidad) Adyuvantes Los adyuvantes además son útiles para mejorar la respuesta inmunológica, o para incrementar la estabilidad de las preparaciones de vacuna Los adyuvantes típicamente se describen como estimulantes no específicos del sistema inmunológico, aunque también pueden ser de utilidad para apuntar armas específicas del sistema inmunológico Pueden agregarse a la vacuna uno o más compuestos que tengan esta actividad Por lo tanto, las vacunas particulares de la presente invención comprenden ademas un adyuvante Ejemplos de compuestos químicos que pueden emplearse como adyuvantes incluyen, sin limitación, compuestos de aluminio (por ejemplo, hidróxido de aluminio), aceites metabolizables y no metabohzables, aceites minerales, entre ellos, derivados de oleatos de manuro (manita + anhídrido) en solución de aceite mineral (por ejemplo MONTANIDE ISA 70, de Seppic SA, Francia), y aceites minerales livianos, tales como DRAKEOL 6VR, polímeros en bloque, ISCOM (complejos estimulantes del sistema inmunológico), vitaminas y minerales (entre ellos, sin limitación vitamina E, vitamina A, selenio y vitamina B12), y CARBOPOL® Otros adyuvantes adecuados, que a veces se han referido como estimulantes inmunologicos, incluyen, sin limitación citoquinas, factores de crecimiento, quimioquinas, sobrenadantes de cultivos celulares de linfocitos, monocitos, células de órganos hnfoides, preparaciones celulares o extractos de plantas, bacterias o parásitos {Staphylococcus aureus o preparaciones de lipopo sacápdos) o mitógenos En general, se administra un adyuvante al mismo tiempo que un antígeno de la presente invención Sin embargo, o alternativamente, los adyuvantes también pueden administrarse dentro de un período de dos semanas antes de la vacunación, o durante un período después de la vacunación, es decir, siempre que el antígeno, por ejemplo, un toxoide alfa, continué en los tejidos Preparación de las vacunas Se proveen además los procesos para la elaboración de las vacunas de la presente invención En una modalidad, la vacuna comprende la mezcla de una combinación segura e inmunológicamente eficaz de un antígeno de la presente invención, por ejemplo, un sobrenadante de toxoide alfa de C períringens de tipo único, y un adyuvante aceptable para uso farmacéutico La cantidad de toxoide alfa puede ser cuantificada a fin de contener por lo menos 2 unidades de Potencia de Combinación Total (TCP) por dosis de la vacuna El sobrenadante de toxoide alfa puede concentrarse con la finalidad de minimizar el tamaño de la dosis necesaria para obtener por lo menos 4 0 unidades antitoxina (A U ) por ml de antisuero de un animal vacunado La adición de otros agentes de modulación inmunológica aceptables para uso farmacéutico puede reducir las exigencias de TCP a menos de 2 unidades por dosis, siempre que la vacunación todavía logre las 4 0 A U necesarias de anticuerpo antitoxina alfa, por ml de antisuero del animal vacunado En ciertas modalidades, el toxoide alfa de C períringens es adicionalmente purificado desde los sobrenadantes de toxoide alfa, mediante técnicas tales como, sin limitación, concentración/ultrafiltración, cromatografía y centrifugación Administración de las vacunas Las vacunas pueden administrarse como un líquido, una emulsión, un polvo seco, o en una neblina, a través de cualquier vía parenteral, vía endovenosa, vía intrapentoneal, vía intradérmica, mediante escarificación, vía subcutánea, vía intramuscular, o pueden ser inoculadas por medio de una vía mucosal, por ejemplo, la vía oral, vía mtranasal, como un aerosol, mediante gotas oculares, mediante la administración in ovo, o mediante implante como un polvo liofilizado Suietos animales El término "sujeto animal" se refiere a una especie animal capaz de ser infectado por una bacteria patógena, y en una modalidad particular, incluye seres humanos Los sujetos animales apropiados abarcan aquellos animales salvajes, ganado (por ejemplo, criado para la obtención de carnes, leche, manteca, huevos, pieles, cuero, plumas o lana), animales de carga, animales de investigación, animales de compañía, así como también, aquellos criados para zoológicos, o en zoológicos, hábitats salvajes o circos En una modalidad particular, un sujeto animal de la invención es un animal productor de alimento" Para los propósitos de la presente invención, se entenderá que el término animal "productor de alimento" incluirá todos los animales criados para consumo (por ejemplo, pavos, pollos parplleros) o para la obtención de productos consumibles (por ejemplo, vacas lecheras, gallinas para poner huevos y similares) por seres humanos u otros animales Una lista, sin limitación, de dichos animales incluye aves tales como aves de corral, es decir, pollos, pavos, gansos, patos, avestruces, etc , ganado bovino (por ejemplo, vacas, vacas lecheras, búfalo), ganado ovino (por ejemplo, ovejas y cabras), ganado porcino (por ejemplo, cerdos, cochinos o puercos), y ganado equino (por ejemplo, caballos), etc En otra modalidad, el sujeto animal es un animal de compañia Para los propósitos de la presente invención, se entenderá que el término animal de "compañía" incluirá gatos hogareños (felinos), perros (caninos), especies de conejos, caballos (equinos), roedores (por ejemplo, cobayos, ardillas, ratas, ratones, gerbos y hámsters), primates (por ejemplo, monos) y aves, tales como pajaritos, palomas, loros, pencos, guacamayos, canarios y similares Se contempla además que otros animales se beneficien con las vacunas de la invención, entre ellos, animales marsupiales (tales como canguros), reptiles (tales como tortugas de granja), aves de juego, cisnes, rátidas y otros animales domésticos de importancia económica Los siguientes ejemplos se proponen solo con propósitos de ejemplificación de la presente invención, y no deben interpretarse como un límite al alcance de la invención de manera alguna EJEMPLOS EJEMPLO 1 Eficacia de la vacuna en gallinas parr ¡lleras vacunadas por óa subcutánea Síntesis La vacunación de gallinas parplleras por vía subcutánea, usando una vacuna que comprende un toxoide alfa de C períringens de tipo único (de tipo A) logra (1 ) una respuesta inmunógena en las gallinas parhileras vacunadas, (2) significativo nivel de anticuerpos antitoxoide alfa en los huevos de las gallinas parhileras vacunadas, y (3) la protección pasiva de la posterior descendencia de las gallinas vacunadas.

Materiales Toxoide alfa de C. períringens de tipo A. Se prepara toxoide alfa de C. períringens de tipo A de la siguiente manera: se desarrolla cultivo de C. períringens de tipo A en condiciones anaerobias en un fermentador de gran escala (5000 I), a una temperatura de 37°C + 2. Durante la fermentación, se agrega hidróxido de sodio a fin de mantener un pH de 7.8 + 2. Se agrega además carbohidrato (dextrina) durante la fermentación (hasta 1 % p/v), para favorecer el crecimiento. El cultivo se deja desarrollar durante 3 a 6 horas. Al final del periodo de crecimiento, se agrega solución de formaldehido al fermentador, a un nivel final que no excede 0.5%. Las células se eliminan mediante centrifugación, y el sobrenadante resultante se filtra con un filtro de profundidad que tiene tamaños de poro en el rango de 0.25-2.0 µm. La temperatura se mantiene a 5°C + 3°C en este proceso. Luego el sobrenadante de cultivo inactivado se somete a diafiltración y se concentra 10-30 veces, usando ultrafiltración con filtros de no más de 20 000 de corte de peso molecular. El sobrenadante concentrado se almacena a 2-8°C para la futura combinación en vacunas. Antes de la combinación, el sobrenadante concentrado se somete a un ensayo para evaluar la potencia, usando el ensayo de potencia de combinación (TCP) descrito anteriormente. La potencia de cada lote de toxoide se asigna en unidades TCP por ml.

Vacuna El sobrenadante que comprende el toxoide alfa de C períringens de tipo A inactivado se combina como una emulsión de agua en aceite que contiene 4 Unidades de Potencia de Combinación (TCP) por ml La emulsión se prepara con una fase oleosa al 70% y una fase acuosa al 30% La fase oleosa se prepara de la siguiente manera Aceite mineral 89 20% Span 80 10 00% Alcohol bencílico 0 75% Tpetanolamina 0 05% La tase acuosa se prepara como se describe a continuación Toxoide de C períringens de tipo A + solución salina 88% Fween 80 33%/soluc?ón salina 12% Se agrega un total de 30% de fase acuosa, lentamente, a la fase oleosa al 70%, y se emulsiona con un homogenizador Silverson (pueden emplearse también otros homogeneizadores en línea) El tiempo de la homogenización depende del volumen de la emulsión, y se determina por la viscosidad, el tamaño de partícula y la estabilidad de la emulsión durante por lo menos tres días a 37°C Se agrega gentamicina a la fase acuosa, para proporcionar una concentración final de hasta 30 µg/ml de volumen en serie Se agrega tiomersal a la fase acuosa, para proveer una concentración final de hasta 0 01 % de volumen en sene Vacunación. Las gallinas de menos de un año {pullets) se vacunan por vía subcutánea con 0.5 ml por dosis de la vacuna combinada. La primera dosis de vacuna se administra a las 14 semanas de edad, y la segunda dosis se administra a las 20 semanas de edad. Se vacunan veinte gallinas parhileras con la vacuna combinada descrita anteriormente, que contiene 1 TCP por dosis. Un segundo grupo de veinte gallinas se vacuna con la vacuna combinada descrita con anterioridad, que contiene 2 TCP por dosis. Se usa un tercer grupo de veinte gallinas como control, que no se vacuna. Se introducen en cada grupo de gallinas un total de 2 a 3 gallos, a fin de producir huevos fertilizados.

Inmunidad pasiva Se recogen los huevos de gallinas vacunadas y de control de 32; 52; y 65 semanas de edad. Los pollos de la descendencia que salen de estos huevos se usan a fin de evaluar la protección pasiva, como se cita en el cuadro 1 .

CUADRO 1 Cantidad de pollos de ¡a descendencia usados en cada momento Edad de las Pollos de la Pollos de la descendencia gallinas descendencia en el en el grupo de control de qrupo vacunado estímulo 32 semanas 9 9 52 semanas 30 20 65 semanas 14 18 Se alimenta a los pollos con una dieta de alto contenido proteico, sin medicación, durante las primeras dos semanas, y luego se cambia la dieta a una alimentación normal durante el resto del ensayo Cada ave se estimula por vía oral con una C períringens de tipo A virulenta que expresa tanto la toxina alfa como la toxina beta 2 La dosis de estímulo contiene 6 3 X 107 a 6 3 X 108 unidades formadoras de colonias por ml, en una dosis de 3 ml Las aves se estimulan durante tres días consecutivos, comenzando a los 18 ó 19 días de edad Dos días después del ultimo día del estímulo, las aves son sacrificadas y luego examinadas para detectar lesiones de enteritis necrótica Los resultados de eficacia para los pollos de la descendencia se citan en forma individual en los cuadros 2 a 4, y representan el estado de vacunación de la madre de los pollos individuales, y el alcance de sus lesiones de enteritis necrótica, si las hay, de acuerdo con la escala de clasificación que se proporciona a continuación Ei cuadro 2 representa los pollos de la descendencia de gallinas de 32 semanas de edad El cuadro 3 representa los pollos de la descendencia de gallinas de 52 semanas de edad, y el cuadro 4 representa los pollos de la descendencia de gallinas de 65 semanas de edad El cuadro 5 muestra la mediana de clasificación para los pollos de la descendencia de gallinas vacunadas con 2 TCP por dosis Como se expone, la descendencia de las gallinas vacunadas está significativamente protegida contra el estímulo bacteriano administrado, en relación con la descendencia de las gallinas no vacunadas Escala de clasificación para lesiones de enteritis necrótica (EN) 0 = Sin grandes lesiones de enteritis necrótica en el intestino delgado, el intestino tiene elasticidad normal (se enrolla sobre sí mismo después de ser abierto) 1 = Pared intestinal delgada y flaccida (el intestino permanece plano cuando se abre, y no se enrolla nuevamente a la posición normal), exceso de moco, o moco espesado, que cubre la membrana mucosa, o enrojecimiento leve focal o multifocal de la mucosa, o congestión de los vasos serosos 2 = Área o pocas áreas multifocales de enrojecimiento e hinchazón de la pared intestinal, área o pocas áreas multifocales de ulceración o necrosis de la mucosa intestinal 3 = Grandes áreas multifocales de necrosis y ulceración de la mucosa intestinal + significativa hemorragia o capa de fibrina o restos necróticos en la superficie mucosal (apariencia de toalla de baño sucia) 4 = Animal muerto con grandes lesiones de enteritis necrótica de clasificación 2 o superior CUADRO 2 Clasificaciones de lesiones de enteritis necrótica en polDos individuales de la descendencia de gallinas de 32 semanas de edad Controles no Controles no Vacuna Vacuna vacunados, sin vacunados, con con 1 TCP con 2 TCP estímulo estímulo por dosis por • dosis 0 1 4 1 0 2 1 0 0 1 2 0 0 1 1 1 2 1 0 3 3 1 3 0 1 1 4 1 4 1 4 3 1 1 1 Media = 2.0 1.8 1.0 Mediana 2.0 1.0 1.0 CUADRO 3 Clasificaciones de lesiones de enteritis necrótica en poBlos individuales de la descendencia de gallinas de 52 semanas de edad Controles no Controles no vacunados, con Vacuna con 2 TCP vacunados, sin estímulo por dosis estímulo 0 4 0 0 3 1 0 3 1 0 1 1 0 1 0 2 1 1 2 1 1 1 1 2 0 2 0 2 0 1 0 1 1 2 2 2 0 1 1 2 0 1 0 1 0 0 2 1 0 1 0 1 0 2 0 Media = 1.7 Mediana 1.5 0.5 CUADRO 4 Clasificaciones de lesiones de enteritis necrótica en poBBos 5 nd ¡vid ya Bes de la descendencia de gallinas de 65 semanas de edad Controles no Controles no vacunados, con Vacuna con 2 vacunados, sin estímulo TCP por dosis estímulo 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 0 2 0 0 3 0 3 3 2 0 0 2 3 0 2 0 0 0 0 0 0 2 3 3 Media = 0 1.5 0.6 Mediana = 0 2.0 0.0 CUADRO 5 Mediana de clasificación en pollos de la descendencia de galBñnas vacunadas con una dosis de 2 TCP MEDIANA DE CLASIFICACIÓN DE LESIONES DE ENTERITIS NECROTICA DE LA DESCENDENCIA GRUPOS DE DE GALLINAS TRATAMIENTO 32 SEMANAS 52 SEMANAS 65 SEMANAS DE EDAD DE EDAD DE EDAD Grupo de 1 0.5 0 vacunación Grupo de 2 1.5 2 control Títulos de anticuerpo Suero: Se toman muestras de sangre de las gallinas a las 33 y 78 semanas de edad. Se deja coagular la sangre durante 2 a 4 horas a temperatura ambiente, y luego, se obtiene el suero después de la centrifugación. Se almacena el suero a -10°C o temperatura inferior, hasta el ensayo de título de anticuerpo. Se evalúa el título de anticuerpo para la toxina de C. períringens alfa mediante un ensayo de inhibición de hemolisis usando diluciones en serie y glóbulos rojos de oveja, de la siguiente manera: se realizan diluciones en serie (de dos veces) en una placa de microtítulo de base en V, para cada muestra evaluada. Se agrega una cantidad conocida de toxina alfa a cada receptáculo que contiene una dilución de la muestra. Las placas luego se incuban durante una hora a 36 + 2°C, para permitir que los anticuerpos obtenidos del suero formen complejos con la toxina alfa Después de esta incubación, se agrega a los receptáculos una solución al 0 5% de glóbulos rojos de oveja, y las placas se incuban durante tres horas a 36°C + 2°C, para permitir la lisis de la toxina alfa que no formó complejos, con los glóbulos rojos Luego las placas se controlan para verificar la ausencia de hemolisis El número reciproco de la dilución más alta de la muestra de ensayo que no exhibe hemolisis se considera el punto final Las títulos de anticuerpo se muestran en los cuadros 6 a 8 Yemas de huevo Se procesan las yemas de huevo a fin de determinar el título de anticuerpo En síntesis, se separa la yema y se mezcla con regulador de extracción comercial (Promega EGGstract System®, Promega Catálogo No G1531 y G2610, Madison, Wisconsin) Luego de la extracción, se obtiene una miniesfera IgY, que entonces se resuspende hasta el volumen original de la yema con solución salina regulada con fosfato Se reúnen los extractos de yema de huevo de por lo menos 5 huevos, y se evalúan a fin de establecer el título de anticuerpo usando un ensayo de inhibición de hemolisis (Hl, por sus siglas en inglés), como se describe con anterioridad para el suero De esta manera, las yemas de los huevos recogidos de puestas a 40, 52, y 65 semanas de edad se evalúan para la determinación del título de anticuerpo Los títulos de anticuerpo para las yemas de huevo se muestran en el cuadro 9 CUADRO 6 Título de anticuerpo para Ba toxina alfa de C. perfringens de tipo A, de suero de gallinas individuales a las 33 semanas de edad Gallinas vacunadas Gallinas de control* (2 TCP/Dosis) 1024 1 8192 2 256 1 1024 2 1024 2 256 2 256 2 1024 2 512 1 64 1 Media geo. = = 588 Media i geo. = 2 ? Q * Los valores <2 se consideraron 1 , con propósitos de calcular la media geométrica CUADRO 7 Título de anticuerpo para ia toxina alfa de C. perfringens de tipo suero de gallinas individuales a las 78 semanas de edad 15 Gallinas vacunadas Gallinas de control (2 TCP/Dosis) 512 2 32 2 128 2 512 2 128 1 16 1 1024 1 512 2 8192 2 128 4 64 2 20 512 8 64 16 1024 256 128 Media geo. = 235 Media geo. = 2 * Los valores <2 se consideraron 1 , con propósitos de calcular la media geométrica CUADRO 8 Media geométrica dei título de inhibición de hemolisis en suei? gallinas en varios momentos GRUPOS DE TITULO EN EL SUERO TRATAMIENTO (EDAD EN LA TOMA DE LA MUESTRA) 33 SEMANAS 78 SEMANAS GRUPO DE VACUNACIÓN 588 235 (2 TCP/DOSIS) GRUPO DE CONTROL <2 CUADRO 9 Título de inhibición de hemolisis en yema de huevos de galBipas, recogidos en varios momentos GRUPOS DE TITULO EN YEMA DE HUEVO TRATAMIENTO (EDAD EN EL MOMENTO DE LA RECOLECCIÓN) 40 52 65 SEMANAS SEMANAS SEMANAS GRUPO DE 515 2048 64 VACUNACIÓN GRUPO DE <2 2 <2 CONTROL EJEMPLO 2 Eficacia de la vacuna en gallinas parplleras vacunadas por intramuscular Síntesis La vacunación de gallinas parhileras por vía intramuscular, usando una vacuna que comprende un toxoide alfa de C períringens de tipo único (de tipo A) también logra (1 ) una respuesta inmunógena en las gallinas parhileras vacunadas, (2) significativo nivel de anticuerpos antitoxoide alfa en los huevos de las gai nas parplleras vacunadas, y (3) la protección pasiva de la posterior descendencia de las gallinas vacunadas Inmunidad pasiva Se vacuna un total de 14 gallinas menores que un año de edad, por vía intramuscular con dos dosis de 0 5 ml de la vacuna del ejemplo 1 anterior, que contiene 2 TCP Se usa un grupo adicional de 40 gallinas como controles Se introducen tres gallos en cada grupo de gallinas, como se describe con anterioridad La primera dosis de vacuna se administra a las 10 semanas de edad, y la segunda dosis se administra a las 23 semanas de edad Se recogen los huevos de las gallinas a las 32 semanas de edad, y se rompen para determinar la protección pasiva en los pollos de la descendencia, luego de un estímulo experimental de C perínngens El cuadro 10 muestra la incidencia de enteritis necrótica y la mediana de clasificación para sus correspondientes lesiones, según lo establecido por la escala de clasificación del ejemplo 1 anterior, para los pollos de la descendencia de gallinas vacunadas y de control El cuadro 11 muestra la mediana de clasificación para las lesiones de enteritis necrotica para los pollos de la descendencia individuales El cuadro 12 cita los títulos de anticuerpos contra la toxina alfa de C períringens de tipo A de los pollos individuales de la descendencia, mientras que los títulos de anticuerpo para las yemas de huevo de los huevos recogidos de las gallinas vacunadas y de control a las 32 semanas de edad se proporciona en el cuadro 13 CUADRO 10 Incidencia de enfermedad y lesiones de enteritis pecrótica GRUPOS DE Cantidad % Mediana de Media de TRATAMIENTO de aves Incidencia clasificación clasificación GRUPO DE 8 0 (0/8) VACUNACIÓN GRUPO DE 29 76 (22/29) 2 17 CONTROL CUADRO 11 Clasificaciones de lesiones de enteritis necrótica en pollos de la descendencia individí líales de gallinas de 32 semanas de edad Controles no Controles no vacunados, sin vacunados, con Vacuna con 2 TCP estimule i estímulo por dosis 0 1 0 0 2 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 3 0 0 0 1 0 2 2 1 3 3 3 2 2 3 1 3 0 2 0 0 3 2 4 4 Media = 0.0 1.7 0.0 Mediana = 0.0 2.0 0.0 CUADRO 12 Título de anticuerpos en suero de gallinas individuales a Bas 35 semanas de edad2 GALLINAS VACUNADAS GALLINAS DE CONTROL (2 TCP/Dosis) 128 512 65536 4096 1024 512 2048 1024 512 256 1024 128 256 256 1024 1024 2 64 32 681 2 2 1 2 1 1 2 2 2 1 2 32 1 2 1 1 2 1 1 1 Media geo = 681 < 2 Los anticuerpos para la toxina alfa de C perfnngens de tipo A se midieron por medio de un ensayo de inhibición de hemolisis descrito en el ejemplo 1 anterior 3 Los valores < 2 se consideraron 1 con el propósito de calcular la media geométrica CUADRO 13 Título de anticuerpo en yerna de huevo recogida de gaBBinas a semanas de edad TÍTULO DE GRUPOS DE INHIBICIÓN DE TRATAMIENTO HEMOLISIS GRUPO VACUNADO 512 GRUPO DE CONTROL <2 EJEMPLO 3 Serologia en gallinas de menos de un año de edad Leg hom blancas SPF, vacunadas por vía subcutánea Títulos de anticuerpos Se evalúan los títulos de anticuerpos en gallinas de menos de un año de edad Leghorn blancas SPF (libres de patógenos específicos, por sus siglas en inglés) vacunadas por vía subcutánea con la vacuna del ejemplo 1 anterior, que contiene 1 ; 2 ó 3 TCP. Las gallinas se vacunan a las 15 semanas de edad con 0.5 ml de la vacuna, y se administra una dosis de refuerzo 4 semanas después de la vacunación inicial. Se toman muestras de sangre 6 semanas después de la vacunación de refuerzo. Se evalúa el suero de cada ave individual para establecer el título de anticuerpo por medio del ensayo de inhibición de hemolisis, como se describe con anterioridad en el ejemplo 1 CUADRO 14 Título de anticuerpo para toxina alfa de C. perfrinqens de ttipo A en suero de gallinas de menos de un año de edad individuales *Los títulos de <2 se consideran 1 para determinar el título de la media geométrica Los títulos de anticuerpo en los huevos recogidos a las 25 semanas de edad de las puestas de gallinas Leghorn blancas se evalúan para establecer el título de inhibición de hemolisis Los resultados se proporcionan en el cuadro 15 CUADRO 15 Título de anticuerpo para Ba toxina alfa de C. perfringens de tipo ye a de huevo reunida Determinación del titulo de neutralización de toxina (TNT, por sus siglas en inglés) en suero reunido de gallinas leqhorn blancas Se evalúa el título de antitoxina para la toxina alfa de C períringens de tipo A en el suero reunido de las gallinas, usando ratones Los sueros reunidos se evalúan para establecer el título de antitoxina por medio de un método descrito en el Code of Federal Regulations, Animal and Plant Health Inspection Service, Department of Agnculture Los métodos empleados para medir la antitoxina son similares al actual 9 CFR § 1 13 1 1 1 (c), excepto que se usan los reactivos toxina alfa y antitoxina, en lugar de toxina beta y antitoxina Se usan los siguientes reactivos de ensayo para establecer el título de antitoxina 1 ) antitoxina alfa de C períringens de tipo A IRP 426 (obtenida del Center for Vetepnary Biologics, USDA) 2) toxina alfa de C períringens de tipo A IRP 446 (obtenida del Center for Vetepnary Biologics, USDA) En síntesis, se combinan suero o antitoxina estándares diluidos, con una cantidad conocida de toxina alfa estándar. Entonces se detecta la presencia de toxina no neutralizada, mediante la inyección de la mezcla en ratones. Luego se evalúa la comparación con los efectos de cantidades conocidas de antitoxina alfa estándar sobre la actividad de toxina, estableciendo la dilución de suero estándar o de ensayo que protege los ratones contra la muerte en un bioensayo. El título de antitoxina en el suero reunido de las gallinas menores que un año Leghorn blancas se muestra en el cuadro 16, a continuación.

CUADRO 16 Título de neutralización de toxina (TNT) en gallinas menores que un año vacunadas y de controB EJEMPLO 4 Serologia en gallinas de menos de un año de edad leghoirn blancas SPF vacunadas por via intramuscular Títulos de anticuerpos Se evalúan los títulos de anticuerpos en gallinas de menos de un año de edad Leghorn blancas SPF, vacunadas dos veces por via intramuscular con la vacuna del ejemplo 1 anterior, que contiene 1 ; 2 ó 3 TCP. Las gallinas se vacunan a las 10 semanas de edad con 0.5 ml de la vacuna, y se administra una dosis de refuerzo 4 semanas después de la vacunación inicial. Se toman muestras de sangre 7 semanas después de la vacunación de refuerzo. Se evalúa el suero de las gallinas individuales para establecer el título de anticuerpo por medio del ensayo de inhibición de hemolisis, como se describe con anterioridad en el ejemplo 1 , y los resultados se muestran en los cuadros 17 y 18 que siguen.

CUADRO 17 Titulo de anticuerpo para Ba toxina alfa de C. perfrinqens de tipo suero de gallinas de menos de un año de edad individuales * Los títulos de <2 se consideran 1 para la determinación del titulo de la media geométrica.

El título de neutralización de toxina (TNT) de los sueros reunidos se evalúa empleando el procedimiento que se describe en el ejemplo 3 anterior, y los resultados se proveen en el cuadro 18 que sigue.

CUADRO 18 Titulo de neutralización de toxina (TNT) en gallinas de menos de vacunadas y de control El título de anticuerpo en los huevos recogidos a las 25 semanas de edad de estas gallinas que ponen huevos Leghorn blancas se evalúa para establecer el título de inhibición de hemolisis, como se describe en el ejemplo 1 anterior. Los resultados se resumen en el cuadro 19 a continuación.

CUADRO 19 Título de anticuerpo para la toxina alfa de C. perírinqens de tipo A en yema de huevo reunida EJEMPLO 5 Comparación de una vacuna multivalente y una monovalente de to?oñde alfa de C. perfrinqens en ganado porcino Síntesis Se describen métodos para proporcionar la protección pasiva en cerdos neonatos, mediante la vacunación de puercas/cerdas preñadas con las vacunas de toxoide alfa de C períringens de tipo A de la presente invención Los resultados muestran una respuesta de anticuerpo en puercas, que puede transferirse a los cochinillos a través dei calostro Materiales Toxoide alfa de C períringens de tipo A Se prepara toxoide alfa de C períringens de tipo A como se describe en el ejemplo 1 anterior Vacuna Puede combinarse una vacuna de la presente invención con toxoide alfa de C períringens de tipo A mactivado que contiene >2 Unidades de Potencia de Combinación Total La vacuna puede combinarse con cualquier adyuvante descrito en esta invención, entre ellos, una emulsión de aceite en agua que contiene minerales, aceites vegetales (aceite de mani, aceite de soya), escualeno, escualeno y otros aceites metabolizables Se pueden usar también otros adyuvantes tales como Seponin, CARBOPOL® y adyuvantes que contienen aluminio (hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio) en la preparación de vacuna Ademas, la vacuna puede contener otros antigenos, entre ellos, E coli (K88, K99, 987P, Tipo 1 ), toxoides de C períringens o toxoides de otras bacterias patógenas, por ejemplo, Clostndium difficile, rotavirus y/o cpptosporidios Administración Las vacunas se administran a las puercas/cerdas preñadas antes de parir, mediante la vía intramuscular o subcutánea, a fin de proporcionar la protección pasiva en los cerdos neonatos a través de la ingestión dei calostro Resultados El estudio se conduce en cerdos de 32 semanas de edad, para comparar tres vacunas Vacuna No 1 combinada con un adyuvante de hidróxido de aluminio, que contiene 4 TCP de toxoide alfa de C períringens de tipo A en una dosis de 2 ml Vacuna No 2 combinada con 4 TCP de toxoide alfa de C períringens de tipo A, E coll K88, E coll K99, E coll 987P, E coll tipo 1 y toxoide beta de C períringens de tipo C, en una dosis de 2 ml Vacuna No 3 preparada como una vacuna placebo que no contiene toxoide alfa de C períringens de tipo A, pero contiene E coli K88, E coli K99, E coli 987P, E coll Tipo 1 y toxoide beta de C períringens de tipo C, en una dosis de 2 ml. Un grupo de diez cerdos se vacuna por vía intramuscular con 2 ml de Vacuna No. 1. Un segundo grupo de diez cerdos se vacuna por vía intramuscular con 2 ml de Vacuna No. 2. El tercer grupo de siete cerdos se vacuna con 2 ml de Vacuna No. 3. Se administra una dosis de refuerzo de 2 ml 20 días después de las vacunaciones iniciales. Se recogen las muestras de suero en el momento de la vacunación inicial (Dia 0), 20 días después de la vacunación de refuerzo (Día 40) y 41 días después de la vacunación de refuerzo (Día 61 ). Las muestras de suero entonces se evalúan para establecer el título de anticuerpo para toxina alfa mediante el ensayo de inhibición de hemolisis que se describe en el ejemplo 1 anterior. Los resultados para las tres vacunas se muestran de manera individual en los cuadros 20 a 22, respectivamente.

CUADRO 20 Vacuna monovalente de toxoide alfa de C. perfrinqens de CUADRO 21 Vacuna de combinación de toxoide alfa de C. perfrinqens de tipo A con E. coli y toxoide beta de C. perfrinqens de tipo C CUADRO 22 EJEMPLO 6 Determinación del título de neutralización de toxina en suero reunido de cerdas vacunadas Se dividen cuatro cerdas preñadas en forma pareja en dos grupos de tratamiento. Un grupo se vacuna por vía intramuscular con 2.0 ml de vacuna que contiene 4 TCP, en una dosis de 2 ml de Vacuna No. 1 del ejemplo 5 anterior. El otro grupo es el grupo de control, que no se vacuna. Las cerdas se vacunan aproximadamente 6 a 7 semanas antes de parir, y se administra una dosis de refuerzo tres semanas más tarde. Se toman muestras de sangre antes de la vacunación y en el momento antes de parir. El cuadro 23 expone la evaluación de las muestras de suero para el título de antitoxina para la toxina alfa, usando un ensayo de neutralización de toxina (TNT), como se describe en el ejemplo 3 anterior.

CUADRO 23 Título TNT No debe limitarse el alcance de la presente invención a las modalidades especificas descritas en esta solicitud De hecho, serán evidentes para los expertos en la materia, a partir de la descripción precedente, varias modificaciones de la invención además de las aquí descritas Dichas modificaciones tienen la intención de hallarse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas Debe entenderse además que todos los tamaños de bases o los tamaños de aminoácidos y todos los valores de peso molecular o de masa molecular, proporcionados para ácidos nucleicos o polipeptidos, son aproximados, y se proveen para una descripción En la presente solicitud se citan diversas publicaciones, cuyas descripciones se incorporan en la presente invención a modo de referencia, en su totalidad

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1 Una vacuna que comprende un antigeno seleccionado del grupo que consiste en un toxoide alfa de C períringens, un fragmento antigénico de un toxoide alfa de C períringens, un fragmento antigénico inactivo de una toxina alfa de C períringens, y cualquier combinación de los anteriores, en donde una a dos dosis de 0 25 a 0 6 ml cada una de la vacuna son suficientes para inducir por lo menos cuatro unidades de antitoxina (A U ) de anticuerpo antitoxina alfa, por ml de antisuero de un pollo vacunado con la vacuna 2 La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el antígeno se encuentra en una preparación libre de células 3 La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el antigeno es un toxoide alfa en un sobrenadante de toxoide alfa de C períringens 4 La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el antígeno es un polipéptido recombinante 5 La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho antigeno tiene 2 o más TCP 6 La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho antígeno se selecciona del grupo que consiste en un toxoide alfa de C períringens de tipo A y un toxoide alfa de C períringens de tipo C 7 La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende un adyuvante 8 La vacuna de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque una emulsión de agua en aceite comprende el antigeno y adyuvante 9 La vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la emulsión de agua en aceite se preparó con una fase oleosa al 70% y una fase acuosa al 30% 10 La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el antígeno es un toxoide de tipo alfa de C períringens, con la condición de que solo se presenta un toxoide alfa de C períringens de un tipo único en dicha vacuna 1 1 La vacuna de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicho toxoide alfa está comprendido por un sobrenadante de toxoide alfa de C períringens 12 La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque es una vacuna multivalente que además comprende una o más de las siguientes toxinas toxina beta de C períringens, toxina beta 2 de C períringens, enterotoxina de C períringens, toxina epsilon de C períringens, toxina iota de C períringens, toxina kappa de C perípngens, toxina lambda de C períringens, toxina theta de C períringens, toxina hemorrágica de C sordelln, toxina letal de C sordellii, toxina A de C difficile, toxina B de C difficile, toxina alfa de C septicum, toxina a//á de C povy/ y toxina beta de C novy/ 13 La vacuna de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque la vacuna multivalente además comprende uno o más antígenos virales, uno o más antígenos bacterianos y uno o más antígenos parasitarios, en donde uno o más antígenos virales son de una o más de las siguiente fuentes virus de la enfermedad de bursitis infecciosa, virus de la bronquitis infecciosa, reovirus y virus de la enfermedad de Newcastle, en donde uno o más antígenos bacterianos son de una o más de las siguientes fuentes E coli, Salmonella y Campylobacter, y en donde los antígenos parasitarios son de Eimepa 14 La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque es una vacuna multivalente que además comprende uno o más antígenos adicionales, en donde los antigenos adicionales son de una o más de las siguiente fuentes virus de la enfermedad de bursitis infecciosa, virus de la bronquitis infecciosa, reovirus, virus de la enfermedad de Newcastle, E coli, Salmonella, Campylobacter, y Eimena 15 Una vacuna que consiste esencialmente en un antígeno seleccionado del grupo que consiste en un toxoide alfa de C períringens de un tipo único, un fragmento antigénico del toxoide alfa, un fragmento antigénico inactivo de una toxina alfa de C períringens de tipo único, y cualquier combinación de los anteriores, en donde el toxoide alfa de C períringens de tipo único y el fragmento antigénico inactivo de la toxina alfa de C períringens de tipo único son del mismo tipo, y en donde una a dos dosis de 0 25 a 0 6 ml cada una de la vacuna son suficientes para inducir por lo menos cuatro unidades de antitoxina (A U ) de anticuerpo antitoxina alfa, por ml de antisuero de un pollo vacunado con la vacuna 16 El uso de la vacuna de la reivindicación 13 para preparar un producto farmacéutico útil para proporcionar la inmunidad pasiva contra múltiples enfermedades de aves de corral a la descendencia de un ave hembra, en donde la vacuna está adaptada para ser administrable al ave hembra antes de poner los huevos que contienen la descendencia 17 El uso de la vacuna de la reivindicación 1 , para preparar un producto farmacéutico útil para proporcionar la inmunidad pasiva contra una enfermedad clostpdial a la descendencia de un ave hembra, en donde la vacuna esta adaptada para ser administrable al ave hembra antes de poner los huevos que contienen la descendencia 18 El uso que se reclama en la reivindicación 17, en donde el ave es un pollo o un pavo 19 El uso que se reclama en la reivindicación 17, en donde la enfermedad clostpdial es una enfermedad intestinal clostpdial 20 El uso que se reclama en la reivindicación 19, en donde la enfermedad intestinal clostpdial es enteritis necrótica 21 El uso que se reclama en la reivindicación 17, en donde la enfermedad clostpdial se selecciona del grupo que consiste en colangiohepatitis, dermatitis gangrenosa y celuhtis 22 Un método para la elaboración de una vacuna de toxoide alfa de C períringens, que comprende (a) el cultivo de una célula de C períringens en un medio de cultivo, para producir una cantidad de células cultivadas, en donde dicha cantidad de células cultivadas secreta una toxina alfa de C períringens en el medio celular, (b) la inactivación de la toxina alfa secretada, para producir un toxoide alfa de C períringens, (c) la eliminación de la mayoría de las células cultivadas del medio de cultivo, para formar un sobrenadante de toxoide alfa de C períringens, y (d) el ajuste de la concentración del sobrenadante de toxoide alfa de C períringens, de manera que es suficiente para inducir por lo menos cuatro unidades antitoxina (A U ) de anticuerpo antitoxina alfa, por ml de antisuero de un ave que ha sido vacunada con una o dos dosis de 0 25 a 0 6 ml cada una de dicha vacuna 23 El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque comprende adicionalmente la mezcla del sobrenadante de toxoide alfa de C períringens con una emulsión de agua en aceite 24 El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la emulsión de agua en aceite se prepara con una fase oleosa al 70% y una fase acuosa al 30% 25 El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la célula de C períringens es una célula de C períringens de tipo único 26 El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicha célula de C períringens de tipo único se selecciona del grupo que consiste en una célula de C períringens de tipo A y una célula de C períringens de tipo C