MX2007012784A

MX2007012784A - Vacuna coccidial y metodos para elaborarla y usarla.

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Publication number: MX2007012784A
Application number: MX2007012784A
Authority: MX
Inventors: Larry R Mcdougald; Alberta Lorraine Fuller; Joyce Anita Pritchard
Original assignee: Univ Georgia Res Found
Priority date: 2005-04-15
Filing date: 2006-04-14
Publication date: 2008-01-11
Also published as: DK1877085T3; HK1112199A1; JP2008538364A; SI1877085T1; RU2007142203A; BRPI0607550A2

Abstract

La presente invencion se relaciona a una vacuna para la coccidiosis de los pollos preparada de tres especies de Eimeria atenuadas: E. acervulina, E. maxima y E. tenella. La vacuna es similar o superior a otros farmacos anticoccidiales en estimular inmunidad protectora contra la coccidiosis.

Description

VACUNA COCCIDIAL Y MÉTODOS PARA ELABORARLA Y USARLA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a la preparación de composiciones inmunogénicas y vacunas contra enfermedades causadas por coccidios. La presente invención también proporciona vacunas atenuadas contra coccidiosis. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La coccidiosis es una enfermedad causada por infección con una o mas de las muchas especies de coccidios que es una subdivisión del fílum Protozoa , parásitos protozoarios intracelulares del subfilum Apicomplexa y el género Eimeria . Cl género Eimepa contiene las especies de mayor importancia económica en aves domésticas, tales como pollos, patos, gansos, gallina de Guinea, pavo real, faisanes, palomas y pavos. Mientras que la coccidiosis ocurre en prácticamente todas las clases de aves, los parásitos son específicos del hospedero y cada especie ocurre en uno soJo o en un grupo limitado de hospederos relacionados. Por otra parte, los hospederos de aves se conocen que albergan más de una especie de coccid os. Las especies Eimeria que causan coccidiosis en pollos incluyen E . a cervulma , E . brunet ti , E . hagam , E . máxima , E . mi tis , E . miva ti , E . neca tpx, E . praecox y E . tenella . E . a cervul ina es una de las especies más comunes encontradas en la camilla de casas de pollos tiernos. Esta tiene un gran potencial reproductor y se considera como patogénica debido a que produce una depresión marcada en la ganancia de peso del cuerpo, más alta conversión del alimento y produce lesiones gruesas en el intestino delgado superior. Entre las aves domesticadas, los pollos son más susceptibles a pérdidas económicas significantes a partir de la coccidiosis, aunque las pérdidas también pueden ocurrir dentro de pavos, gansos, patos y gallina de Guinea. La coccidiosis también ha producido serias pérdidas en faisanes y codornices criados en cautividad. Los efectos de una infección de coccidiosis pueden tomar la forma altamente visible de mortalidad de la bandada devastante, pero otro efecto indeseable de morbidez y/o pérdida del peso que resulta de la infección. Durante el ciclo de vida, el parásito Eimeria pasa a través de un número de etapas, (ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,100,241 para una revisión). El ciclo de vida comienza cuando el pollo ingiere la etapa infecciosa, conocida como el oocisto esporulado, durante la alimentación de tierra o mediante la inhalación de polvo. La pared del oocisto esporulado es rota mediante una combinación de la acción de molienda mecánica y la acción química en la molleja y el tracto intestinal, dando por resultado la liberación de cuatro esporocistos . Los esporocistos pasan al duodeno donde se exponen a las enzimas biliares y digestivas que dan por resultado la liberación de dos esporocitos por esporocisto . Los esporozoitos son móviles y buscan las células de epitelio del hospedero adecuadas con el fin de penetrar y reproducirse en estas. Después de la infección de una célula epitelio, el parásito entra a la fase de esquizonte de su ciclo de vida, que produce de 8 a 16 a >200 merozoitos por esquizonte. Una vez liberados del esquizonte, los merozoitos son libres de infectar además las células del epitelio. Después de dos a cinco de estos ciclos de reproducción asexuales, los merozoitos intracelulares crecen en formas sexuales conocidas como la hembra o macrogametocito y el macho o microgametocito . Después de la fertilización del macrogametocito por los microgametos liberados del microgametocito, se forma un cigoto que crea una pared de quiste alrededor del mismo. El oocisto recientemente formado se pasa fuera del pollo infectado con las heces fecales. Con las condiciones ambientales correctas de temperatura y humedad y suficiente oxígeno en el aire, el oocisto esporulará en la etapa infecciosa, lista para infectar un nuevo hospedero y de esta manera difundir la enfermedad. Así, no se requiere hospedero intermediario para la transferencia del parásito de ave a ave. El resultado del parásito Eimeria que infecta el tracto digestivo de un pollo puede ser una reducción en la ganancia de peso, conversión de alimento incrementada, detención de la producción de huevos y, en algunos casos la muerte. El incremento en la producción intensiva de las aves de corral se ha acompañado por severas pérdidas debido a este parásito; en realidad, la coccidiosis ha llegado a ser una enfermedad parasítica económicamente importante. En el pasado, varios métodos se han utilizado en intentos para controlar la coccidiosis. Antes de la llegada de los agentes quimioterapéuticos , la sanitación mejorada utilizando desinfectantes, junto con la remoción mecánica de la camilla de los animales, fue principalmente empleado; oocistos suficientes, sin embargo, usualmente permanecieron para permitir la enfermedad. La introducción de agentes coccidiostáticos en la alimentación o el agua para beber, además del buen manejo, dio por resultado algo de éxito en el control de la enfermedad. Tales agentes se han encontrado que sufren de una caída en la efectividad a través de los años, debido parcialmente al desarrollo de cepas de coccidios resistentes a fármacos. Ademas, varios agentes quimioterapéuticos se han encontrado que dejan residuos en la carne, haciéndola inadecuada para el consumo. Las patentes norteamericanas Nos. 4,438,097; 4,639,372; 4,808,404; 5,055,292; 5,068,104; 5,387,414; 5,602,033; 5,614,195; 5,635,181; 5,637,487; 5,674,484; 5,677,438; 5,709,862; 5,780,289; 5,795,741; 5,814,320; ,843,722; 5,846,527; 5,885,568; 5,932,225; 6,001,363 y 6,100,241 se relacionan a vacunas de coccidiosis, incluyendo vacunas virus y recombinantes . Sin embargo, hay problemas con las vacunas de coccidiosis existentes, tal como eficacia reducida, infección cruzada con otros parásitos (por ejemplo, Clos tpdi um spp . ) y pobre desempeño del ave. Así, aun existe una necesidad por vacunas de coccidiosis eficaces con la infección cruzada reducida no existente que no afecten adversamente el desempeño del ave. La cita o identificación de cualquier documento en esta solicitud no es una admisión de que tal documento esté disponible con la técnica previa para la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención está basada en parte, sobre una vacuna de coccidiosis atenuada que es eficaz en el frente de la estimulación virulenta, infección cruzada reducida con Clostridi um spp . y tiene mejor desempeño del ave como es definido por proporciones de conversión de alimento cuando se compara con otras vacunas de coccidiosis. La invención se relaciona a una mezcla de oocistos esporulados de cepas precoces de E . a cervul ma , E . máxima y E . tenel la . Los oocistos esporulados se aislaron de un cultivo de semilla recolectado de uno o más pollos sembrados con un cultivo de una cepa precoz de E . a cervul ma , E . máxima o E . tenel la , es decir, uno o más pollos se siembran con ya sea una cepa precoz de E . a cervul ma , E . máxima o E . tenella dando por resultado tres grupos de pollos, cada una sembrado con una cepa de Eimepa diferente. Los oocistos esporulados aislados se combinaron para formular una mezcla de oocistos esporulados de cepas precoces de E . a cervulma , E . máxima y E . tenella . En una modalidad ventajosa, los pollos son pollos SPF de 2 a 8 semanas de edad. En otra modalidad ventajosa, aproximadamente 100 a aproximadamente 15,000 oocistos se siembran por pollo para generar el cultivo de semilla. En otra modalidad ventajosa, oocistos esporulados del cultivo de semilla se aislan mediante centrifugación. La presente invención también proporciona la verificación de los oocistos esporulados que son característicos de la cepa precoz de E . a cervulma , E . máxima o E . tenella . La invención se relaciona a una mezcla de oocistos esporulados de cepas precoces de E . a cervul ma , E . máxima y E. tenella , en donde la mezcla es de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E . a cervulma , aproximadamente 10 a aproximadamente 100 oocistos de E . máxima y aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E. tenella . Ventajosamente, la mezcla es de aproximadamente 500 oocistos de E . a cervulma , aproximadamente 50 a aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 a aproximadamente 500 oocistos de E. tenella. Más ventajosamente, la mezcla es de aproximadamente 500 oocistos de E. acervulma , aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 oocistos de E. tenella que son combinados. La invención también se relaciona a relaciones específicas de oocistos esporulados aislados de cepas precoces de E. acervulina, E. máxima y E. tenella , en donde la relación de E. acervulma , E. máxima, E. tenella es de aproximadamente 10:1 a 2:2 a 10 (es decir, por cada 10 esporocistos de E. acervulina, hay aproximadamente 1 a 2 esporocistos de E. máxima y aproximadamente 2 a 10 esporocistos de E. tenella) . Ventajosamente, la relación de E. acervulma: E . máxima E. teneJla es de aproximadamente 5:1:1 (es decir, 10:2:2) . La invención también se relaciona a la prueba de la eficacia de la mezcla de oocistos esporulados de las cepas precoces de E. acervulma, E. máxima y E. tenella. Ventajosamente, la prueba se relaciona a la administración de una dosis de estimulación de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 500,000 oocistos de E. acervulina y aproximadamente 10,000 a aproxa madamente 1,000,000 de oocistos de E. máxima o aproxa madamente 10,000 a aproximadamente 100,000 oocistos de E. tenella al animal. En una modalidad más ventajosa, la dosis de estimulación es de aproximadamente 200,000 oocistos de E. acervulma y aproximadamente 20,000 a aproximadamente 500,000 oocistos de E. máxima, o aproximadamente 20,000 a aproximadamente 50,000 oocistos de E. tenella. La presente invención se relaciona a la inmunización de un pollo, ventajosamente un pollo para asar. Sin embargo, los métodos para hacer la vacuna descrita en la presente se pueden extrapolar a otros animales infectados por Eimepa, en particular aves, tales como, pero no limitadas a, un pollo, pato, ganso, gallina de Guinea, pavo real, faisán, paloma, codorniz o pavo. La invención abarca una composación inmunogénica o de vacuna que comprende una mezcla de oocistos esporulados aislados de las cepas precoces de E. acervulma, E. máxima y E. tenella. En una modalidad ventajosa, la mezcla es aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de --.. acervulina, aproximadamente 10 a aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E. tenella. Ventajosamente, la mezcla es de aproximadamente 500 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 a aproxamadamente 500 oocistos of E. tenella. Más ventajosamente, la mezcla es de aproximadamente 500 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproxamadamente 100 oocistos de E. tenella que son combinados. La invención también se relaciona a una composición inmunogénica o de vacuna que comprende relaciones específicas de oocistos esporulados aislados de cepas precoces de E . acervulma , E . máxima y E . tenel la , en donde la relación de E . a cervulina : E . máxima E . tenella es aproximadamente 10:1 a 2:2 a 10 (es decir, por cada 10 esporocistos de E . a cervul ma , hay aproximadamente 1 a 2 esporocistos de E . máxima y aproximadamente 2 a 10 esporocistos de E . tenella ) . Ventajosamente, la relación de E . a cervulma : E . máxima : E . tenella es aproximadamente 5:1:1 (es decir, 10:2:2). La invención también proporciona la inducción de una respuesta inmune o la inducción de una respuesta inmunológica protectora que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición inmunogénica o de vacuna que comprende una mezcla de oocistos esporulados aislados de las cepas precoces de E . a cervul ma , E . máxima y E . tenella para provocar o inducir la respuesta en un animal. Ventajosamente, el animal es un ave, tal como, pero no limatado a, un pollo, pato, ganso, gallina de Guinea, pavo real, faisán, paloma, codorniz o pavo. En la modalidad más ventajosa, el ave es un pollo, ventajosamente un pollo para asar. El método para inducir una respuesta inmune o inducir una respuesta inmunológica también puede incluir en la administración de un adyuvante, una citoquina o ambos.

Ventajosamente, la cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune o inducir una respuesta inmunológica o protectora es aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E . a cervulina , aproximadamente 10 a aproximadamente 100 oocistos de E . máxima y aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de --.. tenella . Ventajosamente, la cantidad efectiva es aproximadamente 500 oocistos de E . a cervulina , aproximadamente 50 a aproximadamente 100 oocistos de E . máxima y aproximadamente 100 a aproximadamente 500 oocistos de E . tenella . Más ventajosamente, la cantidad efectiva es aproximadamente 500 oocistos de E . a cervulina , aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 oocistos de E . tenella que son combinados. En otra modalidad, la cantidad efectiva es suficiente para resistir una dosis de estimulación de 'aproximadamente 100,000 a aproximadamente 500,000 oocistos de E . a cervulina y aproximadamente 10,000 a aproximadamente 1,000,000 oocistos de E. máxima o aproximadamente 10,000 a aproximadamente 100,000 oocistos de E . tenella al animal. Más ventajosamente, la dosis de estimulación es aproximadamente 200,000 oocistos de E . a cervulina y aproximadamente 20,000 a aproximadamente 500,000 oocistos de E . máxima o aproximadamente 20,000 a aproximadamente 50,000 oocistos de E. tenella . La cantidad efectiva para inducir una respuesta II inmune o inducir una respuesta mmunológica o protectora también se puede expresar como relaciones de oocistos esporulados de cepas precoces de E. acervulma , E. máxima y E. tenella, en donde la relación de E. acervulma: E. máxima: E. tenella es aproximadamente 10:1 a 2:2 a 10 (es decir, por cada 10 esporocistos de E. acervulina, hay aproximadamente 1 a 2 esporocistos de E. máxima y aproximadamente 2 a 10 esporocistos de E. tenella) . Ventajosamente, la relación de E. acervullma: E. máxima: E. tenella es aproximadamente 5:1:1 (es decir, 10:2:2) . En cons deración de la prevalencia y patogenicidad de varias especies de Eimepa una vacuna de coccidiosis atenuada exitosa debe contener por lo menos un número de cepas de Eimepa suficiente para inducir una respuesta inmune o inducir una respuesta inmunológica o protectora que es no patogénica al recipiente de la vacuna. La presente relación se relaciona a una combinación de oocistos de cuatro cepas precoces específa cas de Eimepa, es decir, E. acervulma, E. máxima y E. tenella que da por resultado una vacuna eficaz y no patogénica. La adición de otras cepas de Eimeria , tales como E. brunetti, E. necatrix y 17. praecox puede ser desventajosa con respecto a la eficacia, la anfeccaón cruzada o patogenicidad de la vacuna. Puesto que E. brunetti, E. necatrix y E. praecox no son necesarios para la eficacia de la vacuna de coccidiosis divulgada en la presente, sería ventajoso excluir estas cepas de la vacuna de la presente invención . Se observa que esta descripción y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos, los términos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y los similares pueden tener el significado atribuido a éste en la ley de patente norteamericana; por ejemplo, ellos pueden significar "incluir", "incluido", "que incluye" y los similares; y aquellos términos tales como "que consiste esencialmente de" y "consiste esencialmente de" tiene el significado adscrito a estos en la ley de patente norteamericana, por ejemplo, ellos permiten elementos no explícitamente mencionados, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica previa o que afectan una característica básica o novedosa de la invención. Estas y otras modalidades se divulgan y son obvias de y comprendidas por, la siguiente Descripción Detallada. DESCRIPCIÓN DETALLADA La invención está basada, en parte, sobre una vacuna de coccidiosis atenuada que es eficaz en el frente de la estimulación virulenta, la infección cruzada reducida con Clos tridi um spp . y tiene mejor desempeño del ave como es definido por las proporciones de conversión de alimento cuando se comparan con otras vacunas de coccidiosis. La invención se relaciona a una mezcla de oocistos esporulados de cepas precoces de E . a cervulma , E . máxima y E . tenel la . Los oocistos esporulados se aislaron de un cultivo de semilla recolectado de uno o más pollos sembrados con un cultivo de una cepa precoz de E . acervulina, E. máxima or E . tenella , es decir, uno o más pollos se siembran con ya sea una cepa precoz de E . a cervulma , E . máxima o E . tenella que da por resultado tres grupos de pollos, cada uno sembrado con una diferente cepa de Eimeria . Opcionalmente, los oocistos esporulados de cepas de E . mi tis también se pueden adicionar a la mezcla de oocistos esporulados. Ventajosamente, la cepa Eimeria es una cepa precoz. Las cepas precoces se derivan de especies en el campo que no son patogénicas cuando se administran a la dosis correcta. En una modalidad ventajosa, la cepa de Eimeria es una cepa precoz del microorganismo respectivo como es descrito en Avian Pathology, 17:305-314, 1988 intitulado "Eimeria de American Chickens: Characteristics de S x Attenuated Strains Produced by Selection for Precocious Development, P.L. Long y Joyce K. Johnson, la descripción de La cual es incorporada por referencia en su totalidad. Los microorganismos pueden ser atenuados por su selección para el desarrollo precoz como es descrito en Avian Pathology, 17: 305-314, 1988 intitulado " Eimeria de American Chickens: Charactepsta cs de Six Attenuated Strains Produced by Selection for Precocious Development, P.L. Long y Joyce K. Johnson, la descripción de la cual es incorporada por referencia en su totalidad. Brevemente, los microorganismos son atenuados al seleccionar un período pre-patente más temprano, es decir, cuando los oocistos primero se muestran en las heces. Tales métodos son bien conocidos para uno de habilidad en la técnica y constituyen la experimentación de rutina. Los cultivos de extracto de las cepas de Eimepa para los cultivos de semilla incluyen, pero no están limitados a, lo siguiente. La cepa principal de la Eimepa a cervu lina , obtenida de T. K. Jeffers at Hess y Clark Laboratories m 1969, se cree haber sido aislada por el Dr . M. M. Farr en USDA, Beltsville, MD, que se derivó de un solo oocisto. El cultivo de Eimepa máxima se derivo de una mezcla de interreproducción de 10 aislados purificados obtenidos de Georgia, Delaware, Maryland, Virginia y Texas. La cepa principal de cultivo Eimeria mi tis se aisló de Gainesville, Georgia en Julao de 1978 y se purificó mediante un solo aislamiento de oocisto. La cepa principal del cultivo de Eimeria tenel la se obtuvo de un cultivo mantenido en Pennsylvania State University por el Dr. Patten desde los primeros años de 1960 y se adquirió por la Universidad de Georgia en 1982. Otras cepas de Eimeri a precoces ancluyen el aislado 809-13 de E . a cervulma precoz LS 100, y E. mitis, precoz LS, obtenido de Merck Research Laboratories, que se obtuvieron del Dr . Peter Long. Alternativamente, las líneas de Eimeria precoces atenuadas que se han depositado como esporocistos en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales ("ECACC" ) como depósitos de patentes (ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,055,292, la descripción de la cual es incorporada por referencia en su totalidad) son cultivos de extracto útiles para generar los cultivos de semilla de Eimepa descritos en la presente. Específicamente, los depósitos de E . a cervul ma (depósito No. ECACC 86072203), E . máxima (depósito Nos. ECACC 86112011 y 86112012), E . mi ti s (deposito No. ECACC 86072206) y E . tenella (deposato No. ECACC 86072201) como es descrito en la patente norteamericana No. 5,055,292 son cultivos de extractos útiles para los cultivos de semilla de la presente invención . Ventajosamente, los microorganismos son atenuados por su selección para el desarrollo precoz como es descrito en lo anterior. En otra modalidad ventajosa, el cultivo está libre de patógeno. Los cultivos de extracto descritos en lo anterior son ventajosamente mantenidos en la fase líquida o de vapor de nitrógeno líquido. Tales métodos son conocidos para uno de habilidad en la técnica. En una modalidad ventajosa, los pollos son de dos a ocho semanas de edad. Los oocistos esporulados se pasan sucesivamente, sin limitaciones al pasaje, en pollos hasta que el número de oocistos son suficientes para ser utilizados como semilla para producción. Ventajosamente, los cultivos luego no deben ser mantenidos por más de 12 meses con el fin de mantener la viabilidad/infectividad . En una modalidad ventajosa, las instalaciones dedicadas son mantenidas para cada especie de Eimeria . Ventajosamente, un volumen suficiente de oocistos esporulados (semillas) se mezclan con el alimento o alternativamente, se administra oralmente para proporcionar a cada pollo con una dosis mínima. En una modalidad ventajosa, aproximadamente 5000 a aproximadamente 15,000 oocitos son sembrados por pollo para generar el cultivo de semilla. Los oocistos esporulados del cultivo de semilla se aislan de las heces de las aves. Venta osamente por centrifugación. En una modalidad, la recolección es como sigue. Las defecaciones se homogena zan en una relación aproximada de 10% (p/v) en agua. Las partículas grandes se remueven al pasar el homogenado a través de cribas. Los sólidos se separan, por ya sea centrifugación, cribado o al sostener a 5±3°C hasta 24 horas. Si los sólidos se separan al sostener a 5±3°C, ellos se concentran adicionalmente por centrifugación. El sobrenadante se descarta, y los sólidos se resuspenden en una solución de NaC L saturada (80% p/v) en agua. La solución resultante se centrifuga. Los oocistos se recolectan (remueven) de la parte superior del líquido y se resuspenden en agua. Opcionalmente, el líquido restante se diluye a 20 - 40% en NaCl con agua y se centrifugan. La pelotilla luego se resuspende en una solución de NaCl saturada y se recentrifuga, hasta que no se recuperan oocistos adicionales. Los oocistos se lavan no más de dos veces. Los oocistos se lavan libres de sal mediante ciclos de centrifugación de resuspensión repetidos, seguido por la resuspensión en una solución al 0.5% de hipoclopto de sodio durante 10 a 15 minutos. Los oocistos luego se lavan libre de la solución de hipoclopto de sodio mediante etapas de centrifugación y resuspensión repetida (3X) . La resuspensión final se hace en una solución acuosa al 2.5% de dicromato de potasio (K2Cr07) . Los oocistos luego se transfieren a recipientes de esporulación . La esporulación se facilita al dispersar las suspensiones con aire por un período que no excede de 72 horas a 27±3°C. Después de la esporulación los oocistos se mantienen en 5±3°C hasta que se produce el producto final. En otra modalidad, los oocistos a ser utilizados de acuerdo con el presente método de vacunación se pueden preparar por cualquiera de varios métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica. Tales métodos incluyen aquellos descritos en J. F. Ryley y colaboradores, Parasitology 73:311-326, 1976, P. L. Long y colaboradores, Folia Veterinaria Lata na VI#3, 201-217, 1976, y la patente norteamericana No. 6,627,205, las descripciones de las cuales son incorporadas por referencia en su totalidad. De acuerdo con un método, los pollos para asar comerciales, de aproximadamente 2 semanas de edad, se infectan con la especie de Eimeria de interés mediante cebadura oral de una dosis apropiada de oocistos esporulados. Procedimientos bien conocidos para la recolección y purificación de oocistos de aves infectadas luego son seguidos. Para la mayoría de especies de Eimepa , las heces se recolectan de aves infectadas 5-7 días de post-mfecca ón, se mezclan y se filtran para remover los restos celulares, luego se centrifugan a una velocidad suficiente para formar la pelotilla del material fecal restante. La pelotilla se resuspende en una solución de sal saturada, en la cual los oocistos flotan y la mayoría de los restos celulares contaminantes pueden ser removidos por centrifugación. La suspensión de oocistos luego se diluye a menor concentración de sal. Los ooca stos se lavan repetidamente para remover la sal y se resuspenden en solución de dicromato de potasio (2.5% p/v) . La suspensión de oocisto se incuba a 29°C con agitación (por ejemplo, 140 rpm) durante aproximadamente 72 horas para inducir esporulación de los oocistos. Alternativamente, los oocistos se pueden tratar con hipoclorito de sodio y luego esporular. El número de oocistos esporulados /ml se determinan mediante el conteo directo utilizando o hemocitómetro o platina McMaster, y el cultivo se almacena ba o refrigeración hasta que se necesita. Para preparar los esporocistos, el dicromato de potasio se remueve de la suspensión de oocistos descrito en lo anterior mediante el lavado repetido de los oocistos, que involucra la recolección de oocistos mediante centrifugación y la resuspensaón en agua desionizada o destilada. Cuando el dicromato se ha removido como es estamado por la carencia de coloración amarillosa-naranj a, se esteriliza la suspensión de oocistos. Ventajosamente, el esterilante beta-propiolactona (BPL) . Cn una modalidad ventajosa, 97% BPL es d luido 1:10 con agua estéril, luego 10-20 mis de BPL se adiciona por litro de oocistos esporulados. En una modalidad alterna, la suspensión de oocisto se mezcla con un volumen igual de hipoclorito de sodio (blanqueador) y se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos. El blanqueador luego se remueve mediante lavados repetidos, y los oocistos se resuspenden en solución salina fisiológica o agua desionizada. Los oocistos se pueden romper para liberar esporocistos utilizando una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, los oocistos se pueden romper para liberar esporocistos al mezclar los oocistos con cuentas de vidrio de diámetro de 1-4 mm y la agitacaón manual, mezclador de vórtice o el incubador de agitacaón, o utilizando un homogena zador portátil. Los oocistos no rotos y las paredes de oocistos se pueden separar de los esporocistos liberados mediante centrifugación diferencial en PERCOLL al 50%, una suspensión coloidal de partículas de sílice recubiertas con polivinilpirrolidona (vendidos por Pharmacia Biotech) o sacarosa 1 M como es descrito en Dulski y colaboradores, Avian Diseases, 32:235-239, 1988. Los esporocistos se pueden utilizar en el presente método de vacunación ya sea mezclados con o separados de los oocistos no rotos y las paredes de oocistos. Ventajosamente, la dosis de esporocistos se separa de los oocistos y las paredes de oocistos. En una modalidad ventajosa, las especificaciones para una recolección aceptable del cultivo de semilla son conocidas. Primero, la relación de oocistos esporulados de oocistos totales se determinó. Solamente las recolecciones que cumplen o exceden >40% de esporulación se consideran aceptables. Segundo, el tamaño, la forma y apariencia de cada recolección de oocistos debe ser característica para la especie propuesta a ser producida. Por ejemplo, los parámetros que se consideran en la caracterización de la especie Eimeria incluyen pero no están limitados a, tecnologías basadas en DNA, densidad flotante de DNA, variación de enzima, especificidad del hospedero y el sitio, especificidad inmunológica, patogenicidad, periodo pre-patente y tiempo de esporulación (ver, por ejemplo, Long & Joyner, J Protozool. 1984 Nov; 31(4): 535-41 y Shirley, Acta Vet Hung. 1997; 45(3): 331-47, las descripciones de las cuales son incorporadas por referencia) . Los oocistos esporulados aaslados de los cultivos de semilla descritos en la presente se combinan para formular una mezcla de oocistos esporulados de cepas precoces de E. acervulma, E. máxima y E. tenella. Generalmente, la mezcla es aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E. acervulina, aproximadamente 10 a aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E. tenella . Ventajosamente, el antervalo de oocistos esporulados en la mezcla es de aproximadamente 125 a aproximadamente 500 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 25 a aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 25 a aprox madamente 500 oocistos de E. tenella. En una modalidad, una dosis baja es aproximadamente 125 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 25 oocistos de E. máxima y aproximadamente 25 oocistos de E. tenella. En otra modaladad, una dosis media es aproximadamente 250 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 50 oocistos de E. máxima y aproximadamente 50 oocistos de E. tenella. En todavía otra modalidad, una dosis alta es aproximadamente 500 oocistos de E. acervulina, aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 ooca stos de E. tenella . La mezcla opcionalmente puede comprender aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E. mitis, de manera ventajosamente aproximadamente 125 a aproximadamente 500 oocistos de E. mitis, aproximadamente 125 oocistos de E. mitis en una dosis baja, aproximadamente 250 oocistos de E. mitis en una dosis media y aproximadamente 500 oocistos de E. mjtis en una dosis alta. La mezcla opcionalmente puede comprender aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E. mitis, de manera ventajosa aproximadamente 125 a aproximadamente 500 oocistos de E. mitis, aproximadamente 125 oocistos de E. mitis en una dosis baja, aproximadamente 250 oocistos de E. mitis en una dosis media y aproximadamente 500 oocistos de E. mitis en una dosis alta. La invención también se relaciona a relaciones específicas de oocistos esporulados aislados de cepas precoces de E. acervulma, E. máxima y E. tenella, en donde la relación de E. acervulmaiE . máxima E. tenella es aproxamadamente 10:1 a 2:2 a 10 (es decir, por cada 10 esporocistos de E. acervulina, hay aproximadamente 1 a 2 esporocistos de E. máxima y aproximadamente 2 a 10 esporocastos de E. tenella) . Ventajosamente, la relación de E. acervuJma: E. máxima, E. tenella es aproximadamente 5:1:1 (es decir, 10 : 2:2). En una modalidad que contiene E. mitis, la relación de E. acervul ina: E. máxima: E. mitis: E. tenella es aproximadamente 10:1 a 2:10:2 a 10 (es decir, por cada 10 esporocistos de E. acervulma, y aproximadamente 1 a 2 esporocistos de E. máxima, aproximadamente 10 esporocistos de E. mitis y aproximadamente 2 a 10 esporocistos de E. tenella) . Ventajosamente, la relación de E. acervulma: E. máxima: E. itis: E. tenella es de aproximadamente 5:1:5:1 (es decir, 10: 2: 10:2) . Ventajosamente, la mezcla es de aproximadamente 500 oocistos de E. acervulina , aproximadamente 50 a aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 a aproximadamente 500 oocistos de E. tenella . En una modalidad más ventajosa, la mezcla es de aproximadamente 500 oocistos de E. acervulina, aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 oocistos de E. tenella. La mezcla opcionalmente puede contener de aproximadamente 500 oocistos de E. mitis, de manera ventajosa aproximadamente 500 oocistos de E. mitis. Ventajosamente, la oocistos se suspenden en un conservador que consiste de una solución salina regulada en fosfato 0.01 M que contiene gentamicina. En otra modalidad, los oocistos se suspenden en cualquiera variedad de conservadores o ácidos orgánicos tales como, pero no limitados a, ácido acético, ácido cítrico, dicromato de potasio o ácido propiónico. Por ejemplo, pero no por limitación, la solución salina regulada de fosfato 0.01 M estéril suficiente que contiene no más de 30 mcg/ml de gentamicina, se utiliza para producir 2 ml por botella para una presentación de 2,000 dosis, 5 ml por botella para una presentación de 5,000 dosis y 10 ml por botella para una presentación de 10,000 dosis. Ventajosamente, los oocistos se almacenan en frasquitos de vidrio de borosilicato estériles. Por ejemplo, pero no por limitación, los oocistos se rellenan asépticamente en frasquitos de vacuna con un suministrador semí automático o automático, los tapones se insertan mecánicamente o manualmente y los sel los de aluminio se colocan y se plaegan. En otra modalidad, los oocistos se suspenden en agua destilada estéril que contiene un agente de suspensión, por ejemplo un agente de suspensión de polisacárido, tal como una goma, por ejemplo, goma de xantano o goma acacia, como un derivado de celulosa, por ejemplo, carboximetil celulosa, hidroxipropil metil celulosa o celulosa microcristalma, carragenan, alginato de sodio, pectina o almidón; un agente de suspensión de polipéptido tal como gelatina; un agente de suspensión de polímero sintético tal como ácido poliacrílico, un agente de suspensión de silicato tal como aluminio silicato de magnesio (ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,055,292, la descripción de la cual es incorporada por referencia en su totalidad) . La presente invención también proporciona que la verificación de los oocistos esporulados son característicos de la cepa precoz de E. acervulma , E . máxima o E . tenella . Ventajosamente, todos los oocistos son atenuados, en que son precoces. En otra modalidad ventajosa, el tamaño, la forma y la apariencia de cada recolección de oocistos debe ser característica de la especie propuesta a ser producida. En todavía otra modalidad ventajosa, la mezcla de oocistos esporulados se prueba para pureza, patógenos extraños y/o muerte o lesiones severas de los animales de prueba, por ejemplo, pollos. Las características de las diversas especies de Eimepa son completamente expuestas por Long P. L. y Reíd W. M. (1982: A Guide for the Diagnosis de Coccidiosis m Chickens; University de Georgia Research Report 404) y Joyner L. P. (1978: Identification y Diagnosis, Avian Coccidiosis, Poultry Science Symposium No. 13, Bptish Poultry Science Ltd) , las descripciones de las cuales son incorporadas por referencia en sus totalidades. La invención también se relaciona a la prueba de eficacia de una mezcla de oocistos esporulados de las cepas precoces de E . acervulma , E . máxima y E . tenella . Ventajosamente, la prueba se relaciona a la administración de una dosis de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 500,000 oocistos de E . acervulma y aproximadamente 10,000 a aproximadamente 1,000,000 oocistos de E . máxima o aproximadamente 10,000 a aproximadamente 100,000 oocistos de E. tenella al animal. En una modalidad más ventajosa, la dosis de estimulación es de aproximadamente 200,000 oocistos de E . a cervul ma y aproximadamente 20,000 a aproximadamente 500,000 oocistos de E . máxima o aproximadamente 20,000 a aproximadamente 50,000 oocistos de E . tenel la . En una modalidad que comprende E . mi tis, como una dosis de estimulación de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 500,000 oocistos de E . mi tis, de manera ventajosa aproximadamente 200,000 oocistos de E . mi tis se puede utilizar. La invención además proporciona la determinación del desempeño del ave como es defa nido por las proporciones de conversión de alimento como un resultado de la administración de la mezcla de oocistos esporulados de las cepas precoces de E . acervul ina , E . máx ima y E . tenel la a las aves. La eficiencia de conversión de alimento se define como las libras de a imento para producir una libra de carne. Un resultado común es aproximadamente 1.90 o 2.00. Un punto en la conversión de alimento es común que es de .01, igual a aproximadamente 0.5% (la mitad de un por ciento) . Si se utiliza el sistema métrico, la conversión del alimento es Kg de alimento por Kg de carne, y es todavía proporcional al anterior . La presente invención se relaciona a la inmunización de un pollo, ventajosamente un pollo tierno para asar. Sin embargo, los métodos para hacer l a vacuna descritos en la presente se pueden extrapolar a otros animales infectados por Eimepa , en particular aves, tales como, pero no limitados a, un pollo, pato, ganso, gallina de Guinea, pavo real, faisán, paloma, codorniz o pavo, o una modalidad menos ventajosa como un conejo. La invención abarca una composación inmunogénica o de vacuna que comprende una mezcla de oocistos esporulados aislados de las cepas precoces de E. acervulma, E. máxima y E. tenella. Los oocistos esporulados aislados se combinan para formular la composición de oocistos esporulados de las cepas precoces de E. acervulma , E. máxima y E. tenella. Generalmente, la mezcla es de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 10 a aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E. tenella. Ventajosamente, el intervalo de oocistos esporulados en la composición es de aproximadamente 125 a aproximadamente 500 oocistos de E. acervulina, aproximadamente 25 a aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 25 a aproximadamente 250 oocistos de E. tenella. En una modalidad, una dosas ba a es aproximadamente 125 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 25 oocistos de E. máxima y aproximadamente 25 oocistos de E. tenella. En otra modalidad, una dosis media es aproximadamente 250 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 50 oocistos de E. máxima y aproximadamente 50 oocistos de E. tenella . En todavía otra modalidad, una dosis alta es aproximadamente 500 oocistos de E. acervulina, aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 oocistos de E. tenella. Ventajosamente, la composición es de aproximadamente 500 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 a aproximadamente 500 oocistos de E. tenella. Cn una modalidad más ventajosa, la composición es aproximadamente 500 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 oocistos de E. tenella. La mezcla opcionalmente puede comprender aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E. mitis, de manera ventajosa aproximadamente 125 a aproximadamente 500 oocistos de E. miLis, aproxamadamente 125 oocistos de E. mitis en una dosis baja, aproximadamente 250 oocistos de E. mitis en una dosis media y aproximadamente 500 oocistos de E. mi tis en una dosas alta. La a nvención también se relaciona a relaciones específicas de oocistos esporulados aislados de cepas precoces de E. acervulma, E. máxima y E. tenella , en donde la relación de E. acervulma: E . máxima E. tenella es aproxamadamente 10:1 a 2:2 a 10 (es decir, por cada 10 esporocistos de E. acervulma, hay aproximadamente 1 a 2 esporocistos de E. máxima y aproximadamente 2 a 10 esporocistos de E. tenella) . Ventajosamente, la relación de E. acervulma: E. máxima: E. tenella es aproximadamente 5:1:1 (es decir, 10:2:2) . En una modalidad que contiene E. milis, la relación de E. acervulma: E. máxima: E. mitis: E. tenella es aproximadamente 10:1 a 2:10:2 a 10 (es decir, por cada 10 esporocistos de E. acervulma , hay aproximadamente 1 a 2 esporocistos de E. máxima, aproximadamente 10 esporocistos de E. mitis y aproximadamente 2 a 10 esporocistos de E. tenella) . Ventajosamente, la relación de E. acervulma: E. máxima: E. mitis: E. tenella es aproxamadamente 5:1:5:1 (es decir, 10: 2: 10:2) . El término de "composición inmunogénica" cubre en la presente cualquier composición capaz, una vez que se ha administrado a un animal, por ejemplo, ave, de inducir una respuesta inmune protectora contra el parásito o antígeno o inmunógeno o epítope. El término de "vacuna" cubre en la presente cualquier composición capaz, una vez que se ha administrado al animal, por ejemplo, ave, para anducir una respuesta inmune protectora contra el virus, o para proteger eficazmente al animal contra la invención parasítica. Las composiciones inmunogénicas o vacunas de acuerdo con la invención también pueden incluir el patógeno o inmunógeno, antígeno o epítope del patógeno y por lo menos un inmunógeno, antígeno o epítope de otro patógeno, parásito o virus, es decir, la vacuna de coccidiosis se combina con otra vacuna de aves. Tal inmunógeno, antígeno o epítope puede ser, por ejemplo, de origen bacteriano, o parasítico o viral o una forma mactivada o atenuada del patógeno, parásito o virus. La invención también comprende equipos para preparar estas composiciones de combinación, así como métodos para hacer estas composiciones de combinación y el uso de los componentes de estas composiciones de combinación para preparar las composiciones de combinación. Por consiguiente, la invención involucra un equipo para preparar las composiciones inmunogénicas o de vacuna de combinación de la invención; por ejemplo, tal equipo que comprende (a) un organismo, patógeno o virus o antígeno o epítope del mismo (venta osamente un patógeno como se mencionó en la presente) y (b) un organ smo, patógeno o virus o inmunógeno, antígeno o epítope del mismo (ventajosamente a virus o inmunógeno, antígeno o epítope del mismo, pero otros patógenos como se menciona en la presente también son contemplados) que es diferente que (a) en recipientes separados, opcionalmente en el mismo paquete, y opcionalmente con instrucciones para mezcla y/o administración. Las composiciones inmunogénicas y/o vacunas de acuerdo con la invención pueden incluir cultivo o preparación de Eimeria (por ejemplo, Eimeria inactivada o atenuada, o un inmunógeno o antigeno o epitope del mismo) y por lo menos un inmunógeno, antigeno o epítope de otro patógeno de ave (incluyendo sin limitación el patógeno en forma mactivada o atenuada) . Para composiciones inmunogenicas multivalentes de ave y vacunas multivalentes, e (los) patógeno (s) de ave adicional (es ) en cuanto a que el (los) antígeno (s) de ave adicional (es ) o un inmunógeno ( s) para epítope (s) se incluyen en y/o se expresan por las composiciones inmunogénicas multivalentes y las vacunas mult ivalentes son virus, enfermedades o patógenos del virus de enfermedad de Marek (MDV) (por ejemplo, serotipos 1 y 2, ventajosamente 1), virus de enfermedad de Newcastle (NDV) , paramixovirus diferentes a la enfermedad de Newcastle ( PMV2 a PMV7), virus de bronquitis infecciosa (IBV), virus de anemia infecciosa o virus de anemia de pollo (CAV) , virus de lapngotraqueitis infecciosa (ILTV), virus de enfermedad bursal infecciosa (IBDV), virus de encefalomielitis o virus de encefalomielitis de ave (AEV o virus de leucosi s de ave ALV) , virus de enteritis hemorrágica de pavo (HEV) , virus de pneumovirosa s (TRTV) , virus de plaga de ave (avian influenza), virus de hidropepcarditis de pollo, reovirus de ave, coccidiosis, síndrome de caída de huevo (EDS76), fowlpox, inclusión de hepatitis del cuerpo (adenovirus), enfermedad linfopro Liferativa de pavos, reticuloendoteliosis en pollos, reticuloendoteliosis en pavos, rotavirus enteritis y rmotraqueitis de pavo, Clostridi um spp . , Eschepchia coli , Mycopla sma gallmarum , Mycoplasma ga llisepticum , Haemophil us avi um , Pa s teurella gallmarum, Pasteurella mul tocida gallicida , y mezclas de los mismos. Venta osamente, para MDV el inmunógeno es ventajosamente gB y/o gD, por ejemplo, gB y gD, para NDV el inmunógeno es ventajosamente HN y/o F, por ejemplo, HN y F; para IBDV el inmunógeno ventajosamente es VP2; para IBV el inmunógeno es ventajosamente S (más ventajosamente Sl) y/o M y/o N, por ejemplo, S (o Sl) y M y/o N; para CAV el inmunógeno es ventajosamente VP1 y/o VP2; para ILTV el inmunógeno es ventajosamente gB y/o gD; para AEV el inmunógeno venta osamente es env y/o gag/pro, por ejemplo, env y gag/pro o gag/pro; para HEV el inmunógeno es ventajosamente la proteína 100K y/o exón; para TRTV el inmunógeno es ventajosamente F y/o G, y para plaga de aves el inmunógeno es ventajosamente HA y/o N y/o NP, por ejemplo, HA y N y/o NP. Así, la invención también involucra métodos para elaborar estas composiciones, así como equipos para los mismos . Una composición inmunogénica o vacuna de acuerdo con la invención que también comprende tal componente inmunogénico adicional (inmunógeno, antígeno o epítope adicional) tiene la ventaja de que induce una respuesta inmune o protección contra varias infecciones o enfermedades o agentes causativos de las mismas al mismo tiempo. Este componente inmunogénico adicional puede ser un microorganismo atenuado o inactivado, una construcción recombmante o subunidades, por ejemplo, proteínas, glicoproteínas, polapéptidos o epitopes). Los procedimientos de determinación de epítope, tal como la generacaón de librerías de péptido sobrepuestas (Hemmer y colaboradores, Immunology Today, 1998, 19 (4), 163-168), Pepscan (Geysen H. M. y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. EUA, 1984, 81 (13), 3998-4002; Geysen H. M. y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82 (1), 178-182; Van der Zee R. y colaboradores, Eur. J. Immunol . , 1989, 19 (1), 43-47; Geysen H. M., Southeast Asían J. Trop. Med. Public Health, 1990, 21 (4), 523-533; Multipm Peptide Synthesis Kits de Chiron) y algoritmos (De Groot A. y colaboradores, Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561), se puede utilizar en la práctica de la invención, para determinar epítopes de inmunógenos, antígenos, polipéptidos, glicoproteínas y los similares, sin experimentación indebida. A partir de esa información, se pueden construir moléculas de ácido nucleico que codifican tal epitope, y a partir de ese conocimiento y el conocimiento en la técnica, se pueden construir vectores o construcciones, por ejemplo virus o vectores o plásmidos recombinantes que expresan inmunógenos, epítopes o antígenos; todos sin experimentación indebida. Los portadores o vehículos o excipientes farmacéuticamente o vetermariamente aceptables son bien conocidos para un experto en la técnica. Por ejemplo, un portador o vehículo o excipiente o farmacéuticamente aceptable puede ser una solución de NaCl al 0.9% (por ejemplo, soluc ón saLma) o una solución reguladora de fosfato. El portador o vehículo excipiente es farmacéuticamente o vetermariamente aceptable puede ser cualquier compuesto o una combinación de compuestos que facilita la administración del vector (o proteina expresada de un vector inventivo m vi tro) ; ventajosamente, el portador, vehículo o excipiente puede facilitar la transfección y/o mejorar la preservación del vector (o proteína) . Las dosis y volúmenes de dosis se discuten en la presente en la descripción general de métodos de inmunización y vacunación, y también se pueden determinar por la persona experta a parta r de esta descripción leída en conjunción con el conocimiento en la técnica, sin ninguna experimentación indebida . Las composiciones inmunogénicas y vacunas de acuerdo con la invención pueden comprender o consistir esencialmente de uno o más adyuvantes. Los adyuvantes adecuados para el uso en la práctica de la presente invención son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrilico, anhídrido maleico o polímeros derivados de alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxiribonucleótido que tienen una o más unidades CpG no metiladas (Klinman y colaboradores, Proc. Nat . Acad. Sd., USA, 1996, 93, 2879-2883; 098/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT descrita en p 147 de "Vaccine Design, The Subunit y Adjuvant Approach" publicada por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en p 183 del mismo trabajo, (4) lípidos de catión que contienen una sal de amonio cuaternaria, (5) citoquinas, (6) h dróxido de aluminio o fosfato de aluminio o (7) otros adyuvantes discutidos en cualquier documento citado e incorporado por referencia en la presente solicitud, o (8) cualquiera de las combinaciones o mezclas de los mismos. La emulsión de aceite en agua (3) , que es especialmente apropiada para vectores virales, pueden ser basadas sobre: aceite de parafina líquida ligera (tipo de farmacopea Europea), aceite isoprenoide tal como escualano, escualeno, aceite que resulta de la oligomerización de alquenos, por ejemplo, isobuteno o deceno, esteres de ácidos o alcoholes que tienen un grupo alquilo de cadena recta, tales como aceites vegetales, oleato de etilo, prop LJenglicol , di (capplato/caprato) , tri (capril ato/caprato) de glicerol y dioleato de propilenglicol o esteres de alcoholes o ácidos grasos, ramificados, especialmente esteres de ácido isosteárico. El aceite se utiliza en combinación con emulsificantes para formar una emulsión. Los emulsificantes pueden ser surfactantes no iónicos, Lales como: esteres de por una parte sorbitán, manuro (por ejemplo, oleato de anhidromanitol ) , glicerol, poliglicerol o propilenglicol y por otra parte ácidos oleico, isosteárico, pcinoleico o hidroxiesteárico, los esteres que son opcionalmente etoxilados, o bloques de copolímero de polioxipropileno-polioxietileno, tal como Pluronic, por ejemplo, L121. Entre los polímeros de adyuvantes de tipo (1), se da preferencia a los polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulado, especialmente reticulados por éteres de polialquenil o de azúcares o polialcoholes . Estos compuestos son conocidos bajo el nombre carbómero ( Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996) . Un experto en la técnica también puede referirse a la patente norteamericana No. 2,909,462, que proporciona tales polímeros acrilicos reticulados por un compuesto de pol hi droxilo que tiene por lo menos tres grupos hidroxilo, de preferencia no más de ocho de tales grupos, los átomos de hidrógeno de por lo menos tres grupos hidroxilo que son reemplazados por radicales alifáticos, msaturados que tienen por lo menos dos átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vin los, aillos y otros grupos etilénicamente msaturados. Los radicales insaturados también pueden contener otros sustituyentes, tal como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, USA) son especialmente adecuados. Ellos son reticulados por alil sacarosa o por alil pentaeptptol . Entre estos, la referencia se hace a Carbopol 974P, 934P y 971P. En cuanto a los polímeros de derivado de anhídrido maleico-alqueni lo, se da preferencia a EMA (Monsanto), que son copolímeros de etileno-anhídpdo maleico de cadena recta o reticulados y son, por ejemplo, reticulados por éter divmílico. La referencia también se hace a J. Fields y colaboradores, Nature 186: 778-780, June 4, 1960. Con respecto a la estructura, los polímeros de ácido acrílico, metacrílico y EMA de preferencia se forman por unidades básicas que tienen la siguiente formula: en la cual; Ri y R2, que pueden ser los mismos o diferentes, representan H o Cll3 - x = 0 o 1, de preferencia x = 1 y = 1 o 2 , con x + y = 2. Para EMA, x = 0 e y = 2 y para carbómeros x = y = 1. Estos polímeros son solubles en agua o solución de sal fisiológica (20 g/1 NaCl) y el pH se puede ajustar a 7.3 a 7.4, por ejemplo, mediante sosa (NaOH), para proporcionar la solución de adyuvante en la cual se puede incorporar el (los) vector (es) de expresión. La concentración de polímero en la composición de vacuna final puede variar entre 0.01 y 1.5% p/v, ventajosamente 0.05 a 1% p/v y de preferencia 0.1 a 0.4% p/v. Los lípidos catiónicos (4) que contienen una sal de amonio cuaternaria que son ventajosamente pero no exclusivamente adecuados para plásmidos, son de preferencia aquellos que tienen la siguiente fórmula: en la cual Rx es un radical alifatico de cadena recta saturado e insaturado que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que contiene 2 o 3 átomos de carbono y X es un grupo amina o hidroxilo. Entre estos lípidos cationicos, se da preferencia DMRIE (N- ( 2-h?drox?et?l ) -N, N-d?met?l-2 , 3-b?s ( tetradeciloxi) -1-propano amonio; WO96/34109), de preferencia asociado con un lípido neutro, de preferencia DOPC (dioleoil-fosfatidil-etanol amina; Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389), para formar DMRIE-DOPE. Ventajosamente, la mezcla con el adyuvante se forma extemporáneamente y de preferencia contemporáneamente con la administración de la preparación o en breve antes de la administración de la preparación; por ejemplo, en breve antes o previo a la administración, se forma la mezcla de plásmido de un adyuvante, ventajosamente para dar bastante tiempo antes de la administración para que la mezcla forme un complejo, por ejemplo entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 minutos antes de la administración, tal como aproximadamente 30 minutos antes de la administración. Cuando DOPE está presente, la relación moral DMRIE: DOPE es de preferencia de aproximadamente 95: aproximadamente 5 a aproximadamente 5: aproximadamente 95, más ventajosamente aproximadamente 1: aproximadamente 1, por ejemplo, 1:1. La relación en peso de adyuvante DMRIE o DMRIE-DOPE : plásmido puede estar entre aproximadamente 50: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 10, tal como aproximadamente 10: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 5, y de preferencia aproximadamente 1: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 2, por ejemplo, 1:1 y 1:2. La citoquina o citoquinas (5) puede estar en una forma de prote na en la composición inmunogénica o de vacuna, o se puede coexpresar en el hospedero o en el inmunógeno o inmunógenos o epítope (s) de los mismos. La preferencia se da a la co-expresión de la citoquma o citoqumas, ya sea por el mismo vector como aquel que expresa el inmunógeno o inmunogenos o epítope (s) del mismo, o por un vector separado para el mismo. La invención comprende la preparación de tales composiciones de combinación; por ejemplo administrar los componentes activos, ventajosamente de manera conjunta y con un adyuvante, portador, citoquina y/o diluyente. Las ci toquinas que pueden ser utilizadas en la presente invención, incluyen, pero no están limitadas a, el factor de estimulación de colonia de granulocitos (G-CSF) , factor de estimulación de colonia de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), interferona a (IFN o¡) , mterferona ß (IFN ß), interferona ?, (IFN ?) , interleucí na-l (IL-1 a) , ?nterleuc?na-1 ß (IL-I ß), i nterleucma-2 (IL-2), ínter! euc?na-3 (1L-3), ?nterleucma-4 (EL-4), mterleuc?na-5 (IL-5), ?nterleuc?na-6 (IL-6), ?nterleuc?na-7 (IL-7), mterleucma-8 (IL-8), ?nterleuc?na-9 (IL-9), mterleucma-10 (IL-IO), ?nterleuc?na-11 (IL-I1), i n terl euc?na-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral a (TNL" a) , factor de necrosis tumoral ß (TNF ß), y el factor de crecimiento de transformación ß (TGF ß) . Se entiende que las citoquinas pueden ser co-admmistradas y/o secuencialmente administradas con la composición inmunogénica y de vacuna de la presente invención. Así, por ejemplo, la vacuna de la presente invención también puede contener una molécula de ácido nucleico exógena que expresa m vivo una citoquina adecuada, por ejemplo, citoquina igualada a este hospedero a ser vacunado en el cual una respuesta mmunologica va a ser inducida (por ejemplo, una citoquina de ave para preparaciones que son administradas a aves) . La invención también proporciona la inducción de una respuesta inmune o inducción de una respuesta inmunologica o protectora que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición inmunogénica o de vacuna que comprende una mezcla de oocistos esporulados aislados de cepas precoces de E . a cervulma , E . máxima y E . tenella para inducir o provocar la respuesta en un animal. Ventajosamente, el animal es un ave tal como, pero no limitado a, un pollo, pato, ganso, gallina de Guinea, pavo real, faisán, paloma, codorniz o pavo. Cn la modalidad mucho más ventajosa, el ave es un pollo, ventajosamente un pollo tierno para asar. El método para inducir una respuesta inmune o inducir una respuesta inmunológica también puede incluir la administración de un adyuvante, una citoquma o ambos. La cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune o inducir una respuesta inmunologica o protectora es de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E . a cervulma , aproximadamente 10 a aproximadamente 100 oocistos de E . máxima y aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E . tenel la . Ventajosamente, la cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune o inducir una respuesta mmunológica o protectora es de aproximadamente 500 oocistos de E. acervulina , aproximadamente 50 a aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 a aproximadamente 500 oocistos de E. tenella. Más ventajosamente, la cantidad efectiva es de aproximadamente 500 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 oocistos de E. tenella. En otra modalidad, la cantidad efectiva es suficiente para resistir una dosis de estimulación de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 500,000 oocistos de E. acervulma y aproximadamente 10,000 a aproximadamente 1,000,000 oocistos de E. máxima o aproximadamente 10,000 a aproximadamente 100,000 oocistos de E. tenella del animal. Mas ventajosamente, la dosis de estimulación es de aproximadamente 200,000 oocistos de E. acervulma y aproximadamente 20,000 a aproximadamente 500,000 oocistos de E. máxima o aproximadamente 20,000 a aproximadamente 50,000 oocistos de E. tenella. La mezcla opcionalmente puede comprender aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E. mitis, de manera ventajosa aproximadamente 125 a aproximadamente 500 oocistos de E. mitis, aproximadamente 125 oocistos de E. mitis en una dosis baja, aproximadamente 250 oocistos de E. mitis en una dosis media y aproximadamente 500 oocistos de ---. mitis en una dosis alta.

La cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune e inducir una respuesta inmunológica o protectora también se relaciona a relaciones específicas de oocistos esporulados aislados de las cepas precoces de E. acervulina, E. máxima y E. tenella, en donde la relación de E. acervulma, E. máxima y E. tenella, es aproximadamente 10:1 a 2:2 a 10 (es decir, por cada 10 esporocistos de E. acervulma , hay aproximadamente 1 a 2 esporocistos de E. máxima y aproximadamente 2 a 10 de E. tenella) . Ventajosamente, la relación de E. acervulma, E. máxima y E. tenella es de aproximadamente 5:1:1 (es decir, 10:2:2). En una modalidad que contiene E. mitis, la relación de E. acervulina: E. máxima, E. milis: E. tenella es aproximadamente 10:1 a 2:10:2 a 10 (es decir, para cada 10 esporocistos de E. acervulma, hay aproximadamente 1 a 2 esporocistos de E. máxima, aproximadamente 10 esporocistos de E. mitis y aproximadamente 2 a 10 esporocistos de E. tenella) . Ventajosamente, la relación de E. acervulma: E. máxima: E. mitis: E. tenella es de aproximadamente 5:1:5:1 (es decir, 10:2: 10:2) . Otro aspecto de la presente invención es un método de inmunización o un método de vacunación usando las composiciones inmunogénicas o las composiciones de vacuna de acuerdo con la invención, respectivamente. El método incluye por lo menos una administración de un animal de una cantidad eficiente de la composición inmunogénica o vacuna de acuerdo con la invención. El animal puede ser macho o hembra. Esta administración puede ser noTablamente hecha mediante inyección intramuscular (IM), intradérmica y (ID) o subcutánea (SC) o por la vía de administración intranasal u oral, en donde la administración oral incluye pero no está limitada a administración sobre la alimentación o el agua para beber, geles o rocíos. La composición inmunogénica a la vacuna de acuerdo con la invención puede ser administrada mediante una jeringa o un aparato sin agujas (similar a por ejemplo Pigjet o Biojector (Bioject, Oregon, USA)). En una modalidad ventajosa, la administración es oral. Las composiciones de acuerdo con la invención también se pueden administrar a otros mamíferos, por ejemplo, ratones o animales de laboratorio, por ejemplo para generar anticuerpos policlonales o para preparar hibridomas para anticuerpos monoclonales. La presente invención proporciona la inmunización de animales, ventajosamente aves. Los métodos para administrar vacunas de coccidiosis son descritos en las patentes norteamericanas Nos. 4,438,097; 4,639,372; 4,808,404; 5,055,292; 5,068,104; 5,387,414; 5,602,033; 5,614,195; 5,635,181; 5,637,487; 5,674,484; 5,677,438; 5,709,862; 5,780,289; 5,795,741; 5,814,320; 5,843,722; ,846,527; 5,885,568; 5,932,225; 6,001,363 y 6,100,241, las descripciones de los cuales son incorporadas por referencia en sus totalidades. El método comprende la administración del animal de una dosis inmunizante efectiva de la vacuna de la presente invención. La vacuna puede ser administrada por cualquiera de los métodos bien conocidos para aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, subcutánea, intrapeptoneal, intravenosa, intranasalmente, oralmente, mtradérmica, mtrabursal, justo arriba de la ventilación de los pollos) , m ovo, u ocularmente. Los métodos de administración son conocidos para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,693,622; 5,589,466; 5,580,859; y 5,566,064 se incorporan en la presente por referencia en su totalidad. Las aves también pueden ser administradas con vacunas en un gabinete de rocío. Las aves también se pueden administrar en la vacuna m ovo, como es descrito en las patentes norteamericanas Nos. 4,458,630 y 6,627,205, las descripciones de las cuales son incorporadas por referencia. Ventajosamente, las aves se administran con vacunas en un gabinete de rocío, es decir, un gabinete en el cual las aves se colocan y se exponen a un vapor que contiene vacuna, o mediante rocío en curso. En otra modalidad ventajosa, la composición inmunogénica o de vacuna se administra oralmente. Alternativamente, la composición inmunogénica o de vacuna se puede administrar en el agua para beber o en el alimento. La invención abarca una composición inmunogénica o vacuna que comprende una mezcla de oocistos esporulados de cepas precoces de E. acervulma, E. máxima y E. tenella . Los oocistos esporulados de cepas precoces de E. acervulina, E. máxima y E. tenella se aislan de los cultivos de semilla descritos en la presente. Generalmente, el intervalo de dosis de oocistos esporulados en la composición es de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 10 a aprox madamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E. tenella . Ventajosamente, el intervalo de dosis de oocistos esporulados en la composición es de aproximadamente 125 a aproximadamente 500 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 25 a aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 25 a aproximadamente 500 oocistos de E. tenella . En una modalidad, una dosis baja es aproximadamente 125 oocistos de E. acervulma, o aproximadamente 25 oocistos de E. máxima y aproximadamente 25 oocistos de E. tenella . En otra modalidad, una dosis media es aproximadamente 250 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 50 oocistos de --.. máxima y aproximadamente 50 oocistos de E. tenella . En todavía otra modalidad, una dosis alta es de aproximadamente 500 oocistos de E. acervulina, aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 oocistos de E. tenella. Ventajosamente, la dosis de la composición inmunogénica o de vacuna es aproximadamente 500 oocistos de E. acervulina, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 a aproximadamente 500 oocistos de E. tenella. En una modalidad más ventajosa, la dosis es de aproximadamente 500 oocistos de E. acervulina , aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 oocistos de E. tenella . La mezcla opcionalmente puede comprender aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 oocistos de E. mitis, de manera ventajosa aproximadamente 125 a aproximadamente 500 oocistos de E. milis, aproximadamente 125 oocistos de E. mitis en una dosis ba a, aproximadamente 250 oocistos de E. mitis en una dosis media y aproximadamente 500 oocistos de E. mitis en una dosis alta. La invención también se relaciona a relaciones específicas de oocistos esporulados aislados de cepas precoces de E. acervulma, E. máxima y E. tenella en una dosis de la composición inmunogénica o de vacuna, en donde la relación de E. acervulina E. máxima E. tenella es de aproximadamente 10:1 a 2:2 a 10 (es decir, por cada 10 esporocistos de E. acervulma, hay aproximadamente 1 a 2 esporocistos de E. máxima y aproximadamente 2 a 10 esporocistos de E. tenella) . Ventajosamente, la relación de E. acervulma: E. máxima, E. tenella es aproximadamente 5:1:1 (es decir, 10:2:2) . En una modalidad que contiene E. mitis, la relación de E. acervulma: E. máxima: E. mitis: E. tenella es de aproximadamente 10:1 a 2:10:2 a 10 (es decir, por cada 10 esporocistos de E. acervulma, hay aproximadamente 1 a 2 esporocistos de E. máxima, aproximadamente 10 esporocistos de E. mitis y aproximadamente 2 a 10 esporocistos de E. tenella) . Ventajosamente, la relación de E. acervulma: --.. máxima: E. milis: E. tenella es aproximadamente 5:1:5:1 (es decir, 10: 2: 10:2) . Venta osamente, los oocistos se suspenden en un preservador que consiste de una solución salina regulada de fosfato de 0.1 M que contiene gentamicina. En otra modalidad, los oocistos se suspenden en cualquiera de una variedad de preservadores o ácidos orgánicos tales como, pero no limitados a, ácido acético, ácido cítrico, dicromato de potasio o ácido propiónico. Por ejemplo, pero no por limitación, suficiente solución salina regulada de fosfato 0.01 M estéril que no contiene mas que 30 mcg/ml de gentamicina, se utiliza para producir 2 ml por botella para una presentación de 2,000 dosis, 5 ml por botella para una presentación de 5,000 dosis y 10 ml por botella para una presentación de 10,000 dosis. Ventajosamente, los oocistos se almacenan en frasquitos de vidrio de borosilicato estéril.

Por ejemplo, pero no por limitación, los oocistos se rellenan asépticamente en frasquitos de vacuna con un suministrador semi-automático o automático, los tapones se insertan mecánicamente o manualmente y sellos de aluminio se colocan y se plegan. La vacuna se comercializa como una dosis múltiple que contiene frasquitos de 2000 dosis, frasquitos de 5000 dosis, frasquitos de 10,000 dosis o frasquitos de 20,000 dosis. La fecha de expiración del producto no excederá 13 meses desde la fecha de la iniciación de prueba de potencia. Los animales, ventajosamente aves, pueden ser vacunados en cualquiera edad adecuada, y de manera usual son aproximadamente uno a tres días de edad antes de la primera vacunación. Ventajosamente, los animales se vacunan una vez. Opcionalmente, cuando se utilizan dos dosis de vacuna, la primera normalmente se da cuando los animales tienen 3 días a una semana de edad y subsecuentemente después de 1-10 semanas adicionales dependiente del tipo de animal que es vacunado. El uso, dosificación y ruta de administración para cada especie de animal en una modalidad ventajosa es como sigue. La composición inmunogénica o de vacuna de la presente invención se utilizó para la vacunación de pollos sanos de un día de edad o más viejos, una ayuda en la prevención de la enfermedad debido a coccidiosis. Ventajosamente, la dosificación fue una dosis por pollo mediante el rocío de agua en curso de 20 ml por 100 pollos. La invención ahora será descrita adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitativos. EJEMPLOS Ejemplo 1: Producción de Cóccidos Composición del producto. Los microorganismos que pueden ser utilizados son Eimepa a cervulma , Eimepa máxima , Eimeria mi ti s y Eimeria tenella . Los orígenes de los cultivos de extracto de los microorganismos son como siguen. La cepa de origen de la Eimeria a cervul ma se obtuvo de T. K. Jeffers y colaboradores Hess y Clark Laboratories en 1969 y se cree haber sido aislada por Dr. M. Farr at USDA, Beltsville, MD, que se derivó de un solo oocisto. El cultivo de Eimepa máxima se derivó de una mezcla de interreproducción de 10 aislados purificados obtenidos de Georgia, Delaware, Maryland, Virginia y Texas. La cepa de origen del cultivo de Eimepa mi tis se aisló de Gainesville, Georgia en Julio de 1978 y se purificó mediante un solo aislamiento de oocisto. La cepa de origen del cultivo de Eimeria tenella se obtuvo de un cultivo mantenido en Pennsylvama State University por Dr . Patten desde los primeros años de 1960, y fue adquirida por la Universidad de Georgia en 1982. Cada una de las cepas de Eimeria utilizada fue una cepa precoz del microorganismo respectivo como es descrito en Avian Pathology, 17:305-314, 1988 intitulado "Eimepa de American Chickens: Charactepstics de Six Attenuated Strains Produced by Selection for Precocious Development, P.L. Long y Joyce K. Johnson, la descripción de la cual es incorporada por referencia en su totalidad. Los mecanismos se atenuaron mediante su selección para el desarrollo precoz de acuerdo con este método. Cultivos . Cada especie de Eimepa utilizada en el producto se identificó por su apariencia microscópica única, tamaño y forma, y la zona del intestino o zona cecal de pollo infectado, como es descrito en Long, P.L. y . M. Reíd, A guide for the diagnosis de cocciodiosis ín chickens. Re. Report 404 (Report 355 revised) , Athens, GA: College de Agriculture Experiment Station, Univ. de Georgia; 1982, la descripción de la cual es incorporada por referencia en su totalidad. Los microorganismos se atenuaron por su selección para el desarrollo precoz como es descrito en lo anterior. Cada cultivo fue libre de patógenos mediante la prueba utilizando los procedimientos descritos en 9 CFR 113.37. Los cultivos de extracto descritos en lo anterior se mantuvieron en la fase líquida o de vapor de nitrógeno líquido. Los pollos, de 2 a 8 semanas de edad, se utilizaron para la producción de cultivos de semilla o de siembra. La ruta de administración fue per os (es decir, oralmente) . Todas las semillas fueron oocistos esporulados y se produjeron en pollos SPF, de 2 a 8 semanas de edad. Las instalaciones dedicadas se mantuvieron para cada especie de Eimeria . Un volumen suficiente de oocistos esporulados (semilla) se mezcló con el alimento, libre de anticoccidiales, o se administró mediante cebadura oral para proporcionar a cada pollo una dosis mínima listada en la Tabla 1. Los oocistos esporulados se pasaron sucesivamente, sin limitaciones al pasaje, en pollos SPF de 2 a 8 semanas de edad hasta que el número de oocistos fueron suficientes para ser utilizados como semilla para la producción. Los cultivos no pueden ser mantenidos por más tiempo que 12 meses con el fin de mantener la viabilidad/infectividad. Tabla 1: Dosificación mínima de oocistos esporulados (semilla) Las defecaciones se recolectaron diariamente del tercer a octavo día después de la inoculación. Los pollos aleatorios se sacrificaron y se observaron para la infección característica de cada especie con excepción de mi tis . No se hizo recolección si hubo alguna evidencia de enfermedad extraña.

Los cultivos de extracto para la referencia se mantuvieron en nitrógeno líquido. Los cultivos de producción se mantuvieron a 5±3CC y se pasaron en pollos SPF de dos a ocho semanas de dad. La preparación de suspensiones para la semilla o inoculación involucró el pasaje en serie de los cultivos de semilla en Pollos SPF, de dos a ocho semanas de edad, hasta que se produjeron suficientes oocistos para la manufactura. Un volumen suficiente de oocistos esporulados (semilla) se mezcló con el alimento, libre de anticocciodiales, y se administró para proporcionar a cada pollo con la dosis mínima lista en la Tabla 1. Las defecaciones se recolectaron como un baño del tercero al octavo día después de la inoculación. Pollos aleatorios se sacrificaron y se observaron para la infección característica para cada especie con la excepción de mi ti s . No se hizo recolección si hubo alguna evidencia de enfermedad extraña. Los microorganismos se atenúan mediante su selección para el desarrollo precoz como es descrito en lo anterior. Recolección . Antes de la remoción de los microorganismos, para propósitos de producción, los pollos se alojaron en un cuarto designado para la producción de especies individuales. Los pollos se mantuvieron en una dieta libre de anticocciodiales y se dejaron con libre acceso al agua. Las defecaciones se recolectaron diariamente del tercero al octavo día después de la inoculación, y se mantuvieron a 5±3°C hasta que se procesaron. La técnica de recolección de microorganismos para propósitos de producción estos fueron recolectados como sigue. Las defecaciones se homogenizaron en una relación aproximada de 10% (p/v) en agua. Las partículas largas se removieron al pasar el homogenado a través de cribas. Los sólidos se separaron ya sea por centrifugación, cribado o al sostener 5±3°C hasta 24 horas. Si los sólidos se separaron al sostener a 5±3°C, ellos se concentraron adicionalmente mediante centrifugación. El sobrenadante se descartó, y los sólidos se resuspendieron en solución de NaCl saturada (80% p/v) en agua. La solución resultante se centrifugó. Los oocistos se recolectaron (removieron) de la parte superior del líquido, y se resuspendieron en agua. Óptimamente, el líquido restante se diluyó a NaCl al 20-40% con agua y se centrifugó. La pelotilla luego se resuspendió en una solución de NaCl saturada y se centrifugó, hasta que no se recuperaron oocistos adicionales. Los oocistos se lavaron no más de dos veces. Los oocistos se lavaron libres de sal mediante ciclos de centrifugación, resuspensión repetida seguido por la resuspensión de una solución de hipoclorito de sodio al 0.5% de 10 a 15 minutos. Los oocistos luego se lavaron libres de la solución de hipoclorito de sodio mediante la centrifugación repetida (3X) y las etapas de resuspensión. La resuspensión final se hizo en una solución acuosa al 2.5% de dicromato de potasio (K2Cr07) . Los oocistos luego se transfectaron a recipientes de esporulación. La esporulación se facilitó al dispersar las suspensiones con aire durante un período que no excede de 72 horas a 27±3°C. Después de la esporulación los oocistos se mantuvieron a 5±3°C hasta que se produjo el producto final. En una modalidad ventajosa, las especificaciones para una recolección aceptable fueron como sigue. Primero, la relación de oocistos esporulados para oocistos total es determinada. Solamente las recolecciones que cumplen o exceden esporulación >40% se consideraron aceptables. Segundo, el tamaño, la forma y la apariencia de cada recolección de oocisto debe ser característica de la especie propuesta a ser producida. El material descartado no utilizado en la producción se desechó de una manera consistente con 9 CFR 114.15. Preparación del producto. Series o subseries de producto final se juntaron con los fluidos de recolección en volumen. Todos los oocistos se atenuaron, en que son precoces, como es descrito en lo anterior. Los oocistos se resuspendieron en un preservador que consiste de una solución salina regulada de fosfato 0.01 M que contiene no más de 30.0 mcg de gentamicina, el producto se estandarizó para producir por lo menos números finales de oocistos esporulados de cada especie como es indicado en la Tabla 2. Tabla 2: Dosificación estandarizada de oocistos esporulados Una serie se ensambló como sigue. Los lotes de suspensión en volumen de cada una de las cuatro especies de Eimeria se remueven del almacenamiento a 5±3°C y se dejan calentar a temperatura ambiente mientras que se agita. Un volumen suficiente de cada lote (s) se removió asépticamente y se removió y combinó, para producir no menor que los oocistos por dosis listados en la Tabla 2 como es determinado por los cálculos basados en conteos de cada una de las suspensiones en volumen. Si es necesario, múltiples lotes de cada especie de Eimeria se combinaron para proporcionar el número requerido de oocistos esporulados. Suficiente solución salina regulada de fosfato 0.01 M estéril que contiene más de 30 mcg/ml de Gentamicina, para producir 2 ml por botella para una presentación de 2,000 dosis, 5 ml por botella se utilizó para una presentación de 5 ml dosis y 10 ml por botella para una presentación de 10,000 dosis. La serie en volumen de mantuvo bajo agitación constante.

Tabla 3: Ejemplo del volumen en serie (basado en un lote de 10,000,000 de dosis del producto de 10,000 dosis) Un promedio de la serie de 10,000 dosis varía de 20L a 40L. El volumen de llenado es 1.0 ml por 1000 dosis. Las botellas de vacuna son frasquitos de vidrio de borosilicato, estériles. El método y la técnica de llenado y sellado de los contenedores finales fueron como sigue. La vacuna se llevó asépticamente en frasquitos de vacuna con un suministrador semiautomático o automático. Los tapones se insertaron mecánicamente o manualmente. Los sellos de aluminio se colocan y se pliegan. Cada dosis contuvo no menor que la dosis listada en la Tabla 2 de oocistos esporulados, como se calcula de los conteos en volumen. Un número en serie se asignó a cada cantidad por lote y se presentó en una sola operación. Prueba . Cada serie se probó para la pureza utilizando los métodos de prueba descritos en 9CFR 113.27 (e). El conteo promedio cualquiera en condición de incubación no debe exceder 1 colonia por dosis. Si el conteo promedio en cualquier incubación excedió una colonia por dosis en la prueba inicial, una prueba de nuevo se condujo opcionalmente utilizando 20 contenedores finales no abiertos. Si el conteo promedio de cualquier condición de incubación de la prueba final de una colonia por dosis, la serie fue insatisfactoria . Sa lmonel la se mostró que es exterminada efectivamente tanto por hipoclopto de sodio como por dicromato de potasio, por lo tanto, no se condujo prueba adicional. Micoplasma se mostró que es efectivamente exterminado por hipoclorito de sodio, por lo tanto, no se condujo prueba adicional. Cada serie se probó para patógenos extraños de acuerdo con 9 CFR 113.37. Para probar la seguridad de la vacuna, cada uno de los pollos libres de patógenos específicos, de 25 días de edad se vacunó mediante la vacunación por rocío con 10 dosis de vacuna. Los pollos se observaron cada día por 21 días. Los pollos que murieron durante el período se examinaron y se determinó la causa de muerte. Si por lo menos 20 pollos no sobrevivieron al período de observación, la prueba fue mconcluyente . Si cualquier enfermedad o muerte fue directamente atpbuible a la vacuna, la serie es insatisfactopa . Las lesiones intestinales medias características de la vacuna se consideraron normales, y no se consideran una evaluación de seguridad. Si menos de 20 pollos sobrevivieron al período de observación no hubo muertes o lesiones severas atribuibles a la vacuna, la prueba se repitió opcionalmente una vez. Si la prueba no es repetida, la serie se declaró insatisfactoria . La primera serie de producto final producida de cada nuevo lote de semilla de producción será probada para la potencia. El producto será aprobado en pollos SPF o de tipo pollos tiernos para asar de 1 a 14 días de edad. Las series subsecuentes producidas de la semilla de producción serán evaluadas para la potencia utilizando conteos de preformulaciones especificados en lo anterior y en la recuperación de oocistos de aves inoculadas. Se utilizaron no más de 70 pollos. No más de 35 se vacunaron per os con una dosis en campo de vacuna. Veintiséis a treinta días después de la vacunación inicial todos los pollos se identificaron individualmente y los pesos se registraron. No más de 10 vacunados y 10 controles de cada uno de los grupos listados enseguida, se estimularon per os, con 1.0 ml de cada una de las dosis de estimulación como se muestra en la Tabla . Tabla 4. Dosis de estimulación Grupo 1 oocistos E . máxima 10,000 a 1, 000,000 oocistos Estimulación del E . mi ti s 100,000 a 500, 000 Grupo 2 oocistos Estimulación del E . tenel la 10,000 a 100, 000 Grupo 3 oocistos Las dosis de estimulación también se seleccionaron sobre la base de patogenicidad en que el nivel seleccionado dará un registro mínimo de por lo menos dos. Seis días después de la estimulación, los vacunados y los controles de cada uno de los Grupos en la Tabla 4 se sacrificaron, se pesaron y los intestinos y la zona cecal se examinaron y se registraron para las lesiones. El registro estuvo de acuerdo con el sistema de registro coccidial de Johnson y Reíd como es descrito en Experimental Papsitology, Vol. 28, p 30-36, 1970, la descripción de la cual es incorporada por referencia en su totalidad, como se muestra en la Tabla 5. Tabla 5: Registro de lesiones Etapas post-preparatorias . La vacuna se comercializa como una dosis múltiple que contiene, frasquitos de 2000 dosis, frasquitos de 5000 dosis, frasquitos de 010,000 dosis o frasquitos de 20,000 dosis. La recolección, almacenamiento y presentación de muestras representativas estuvieron de acuerdo con 9 CFR 113.3. La fecha de expiración del producto no excedió 13 meses desde la fecha de la iniciación de prueba de potencia, y se confirmó de acuerdo con 9 CFR 114.13. El uso, dosificación y ruta de administración para cada especie de animal fue como sigue. Este producto se utilizó para la vacunación de pollos sanos de 1 días de edad o más viejos, como una ayuda en la prevención de enfermedad debido a la coccidiosis. La dosificación fue una dosis por pollo mediante el rocío de agua grueso; 20 ml por 100 pollos. Ejemplo 2: Eficacia de la Vacuna Experimental que Contiene Cepas Atenuadas de Coccidios de Aves Comparados con una Vacuna de Coccidiosis Viva Comercial y Salmomicina, un Fármaco Anticoccidial en Aves Comerciales. El objetivo de este Ejemplo fue la determinación de la eficacia de la vacuna de oocistos de Eimeri a atenuada, en comparación con una vacuna de oocistos vida aprobada por la USDA (Coccivac-B) para la protección de pollos de tipo para asar de la estimulación con especies de Eimepa virulentas y para comparar el uso de la vacuna atenuada con un fármaco anticoccidial convencional, Salmomicina . Las variables objetivo fueron como sigue. La variable primaria fue los registros de lesión intestinal. Los criterios de aceptación fueron menores registros de elección coccidial intestinal de post-estimulación cuando se comparan con las aves de control estimuladas, no vacunadas. Las variables secundarias fueron (1) ganancia de peso y conversión de alimento durante una fase de crecimiento de 7 semanas y (2) mortalidad. Los criterios de aceptación incluyeron ganancia de peso igual o superior y conversión de alimento en aves vacunadas contra aves vacunadas con CoccivacB o medicadas con el fármaco anticoccidial y baja mortalidad en aves vacunadas contra aves de control no vacunadas, aves vacunadas con CoccivacB y aves tratadas con anticoccidial . Materiales . Las vacunas se describen en la Tabla 6. Tabla 6: Vacunas Tabla 7: Organismos Virulentos/Estimulación Tabla 8: Animales Los animales se manejaron de manera similar y con debido respecto a su bienestar. Los animales se manejaron de acuerdo con todos los reglamentos aplicables. Diseño experimental. El diseño experimental fue como sigue. Tabla 9: Grupos de tratamiento experimental * 20 ml suministrados por 100 pollos La línea de tiempo fue como sigue. En el Día 0, las aves se pesaron por corral. Las aves en los Grupos 1 y 2 se vacunaron como es descrito en la Tabla 9, con 1300 aves por régimen de vacuna, dividida entre 2 corrales, una en cada mitad del alojamiento. Las aves en el Grupo 3 se iniciaron en Salmomicina, 60g/ton, dividido como es descrito por los Grupos 1 y 2. Los corrales se cerraron. Hatchmates extras se retuvieron en jaulas de alambre como pollos no vacunados. En el Día 21, la alimentación del iniciador al cultivador se cambió para todas las aves. La Salinomicina se continuó en el Grupo 3. En el Día 28, las aves a ser estimuladas se movieron a jaulas de alambre. La salmomicina se descontinuó en el Grupo 3 a las aves que son estimuladas. Todas las aves y el alimento se pesaron. Las muestras fecales frescas se recolectaron de la cama de cada grupo en los corrales grandes, 20 muestras por corral. Los oocistos se cuantificaron por especie. En el Día 29, las aves en las jaulas se estimularon utilizando el número de oocistos descritos en la Tabla 7. En el Día 35, las aves de estimulación se terminaron, las lesiones se registraron y se tomaron las ganancias de peso. En el Día 42 todos los grupos se cambiaron a la alimentación terminadora no medicada y la alimentación nuevamente se pesó. En el Día 49, todas las aves y el alimento se pesaron y el experimento se terminó. Procedimientos experimentales Vacunación/Medicación. Tres tratamientos de aves identificados como Grupos 1-3 en la Tabla 9 se replicaron en mitades de casas, tres corrales por casa, 650 aves por corral, para un total de 1300 aves por tratamiento. Las aves en los Grupos 1 hasta 3 se vacunaron como es descrito en la Tabla 9. Un grupo de tratamiento adicional (4) se mantuvo por separado en jaulas limpias como controles no tratados, no vacunados para el uso en la prueba de estimulación solamente. Los Grupos de tratamiento 1, 2 y 4 se les dieron alimento no medicado. El Grupo de tratamiento 3 se le dio Salinomicina (60 g/ton) iniciando en el Día 1 hasta el día 42. Las aves en el Grupo 3 a ser estimuladas se les dio alimento no medicado después de mover a las jaulas de estimulación. El alimento iniciador se les dio hasta los 21 días, el cultivador hasta 42 días y el terminador hasta 49 días. El alimento expedido fue registrado, y cualquier alimento no consumido restante se pasó nuevamente en el tiempo de los cambios de alimentación y la terminación.

Observaciones. Las aves se pesaron por corral en 0 y 28 días y por corral y sexo en 49 días. Las aves muertas se recolectaron dos veces al día y la necropsia se realizó para determinar la causa de la muerte. Las muestras fecales recolectadas en Día 28 observaron para los oocistos viables y se cuantificaron por especies. Estimulación. En el Día 28, 3 reps de 10 aves de cada corral (total de 60 por tratamiento) se pesaron y se movieron a las jaulas de batería para la estimulación con cepas de campo de Eimeria (correspondiente a las especies usadas en la vacuna) . A todas las aves se les dio alimento no medicado en las jaulas. En el Día 29, las aves del grupo 1-4 se estimularon y luego se terminaron en el Día 35. Se registraron los registros de lesión y los pesos. Los animales se asignaron aleatoriamente a cada grupo de tratamiento al recolectarlos de manera aleatoria de las cajas de pollos antes de la vacunación. Los científicos no estuvieron ciegos a los grupos de tratamiento puesto que seguridad estricta se mantuvo entre los grupos para prevenir la contaminación cruzada. Medicaciones Concurrentes y Manejos de Eventos Adversos. Las aves vacunadas con Coccivac llegaron a estar enfermedad 14 días en el experimento. La diagnosis hecha fue enteritis necrótica. El agente responsable se identificó como Clos tridi um sordell i . Todas las aves en el experimento se administraron con Penicilina G para disminuir la contaminación, y los efectos de la misma, entre los corrales y para eliminar cualquier diferencia en los tratamientos entre los grupos que podrían presentar los resultados de coccidiosis. Análisis de Datos Criterios para la Medición. Las variables primarias para la fase del corral de piso fueron pesos vivos en 28 y 49 días y la conversión de alimento a 49 días. Para la fase de estimulación, las variables primarias se pesaron nuevamente seis días después de la estimulación, y los registros de lesión de las secciones de intestino superior, media y cecal, también en seis días después de la estimulación. Análisis Estadístico. Todos los análisis estadísticos se condujeron utilizando SAS, Gary, NC (Versión 8.2). La significancia estadística se basó en pruebas de dos extremos de la hipótesis nula que se examinaron en este estudio, dando por resultado valores en p de 0.05 o menor. Registro de Lesión Intestinal. La incidencia y severidad (registros de lesión categórica) de las lesiones coccidiales intestinales de postestimulación se analizaron utilizando un modelo logit con factores del grupo de tratamiento y el modelo de análisis de bloqueo y/o supervivencia con factores del grupo de tratamiento y bloqueo (dependiendo de la naturaleza de los datos) .

Mortalidad. Si la mortalidad relacionada con la estimulación de la especie de Eimeria virulenta ocurrió, un ANOVA (es decir, un análisis de varianza) con factores del grupo de tratamiento y bloqueo se condujo para determinar si diferencias significantes existieron entre las medias de mortalidad fetal (sin considerar el día de ocurrencia) para cada grupo de tratamiento. Ganancia de Peso y Conversión de Alimento Fase del Corral de Piso. Dentro de los grupos de tratamiento, pruebas t emparejadas (por bloqueo y como un grupo completo, sin efecto de bloqueo considerado) se condujeron para determinar si hay diferencias significantes en los pesos vivos medios dentro de cada grupo de tratamiento. Las comparaciones emparejadas incluyeron pesos del día 0 contra el Día 28 (pre estimulación) pesos del Día 28 contra el Día 49 (post-estimulación) . Las pruebas t emparejadas (por bloqueo como un grupo completo, sin considerar efecto de bloqueo) se condujeron para determinar si hay diferencias significantes en los pesos de la conversión de alimento medio dentro de cada grupo de tratamiento. Las comparaciones emparejadas incluyeron los pesos de conversión de alimento del Día 28 contra el Día 49 (post-estimulación) y pesos de conversión de alimento del Día 42 contra el Día 49 (efecto del alimento terminador no medicado) .

Entre los grupos de tratamiento, un ANOVA de mediciones repetidas con factores de grupo de tratamiento, día, bloque e interacción de grupo-día se utilizó para determinar si existieron diferentes significantes en los pesos vivos medios entre los grupos, sobre todo los pesos de los días se registraron. Fase de Estimulación. Dentro de los grupos de tratamiento, las pruebas t emparejadas (por bloqueo y como un grupo completo, sin considerar el efecto de bloqueo) se condujeron para determinar si hubo diferencias significantes en los pesos vivos medios dentro de cada grupo de tratamiento. Las comparaciones emparejadas incluyeron los pesos del Día 28 contra Día 35 (6 días post-estimulación) . Entre los grupos de tratamiento, el análisis de los pesos vivos entre los grupos de tratamiento, postestimulación, se condujeron utilizando los resultados de entre el análisis del grupo de tratamiento para la fase de corral de piso, enfocando las comparaciones en el Día 28 y Día 35. Resultados *Significa diferencias estadísticas por agrupamiento Tabla 11: Resumen del Día 49 Tabla 12. Resultados de Estimulación 60 aves de estimulación por tratamiento. *Significa diferencias estadísticas por agrupamiento. a, b, c y d son la separación de Duncan de las medias, (la prueba de Duncan es una prueba hoc estadística para separar las medias) . 1 es el registro de lesión total 2 es el registro de lesión total promedio Discusión . No hubo diferencia significante en los registros de lesión para la vacuna experimental y Coccivac para las estimulaciones con E . máxima , E . a cervulina y E . mi tis . Coccivac tuvo registros de lesiones inferiores de E. tenella como es comparado con las cepas experimentales. Es importante observar que las aves vacunadas con Coccivac llegaron a ser infectadas con Cl ostridi um sordell i . La enfermedad Clostridial se ha enlazado a una infección con coccidiosis en el campo. Aunque la infección se dispersó a los otros grupos de tratamientos, las aves vacunadas con Coccivac fueron las más afectadas mostrando 11.77% de mortalidad. Conclusiones . Las cepas de Eimeria experimentales se mostraron que son eficaces en la cara de la estimulación virulenta. Las aves vacunadas con la cepa experimental tienen mejor desempeño del ave como es definido por las proporciones de conversión de alimento cuando se compara con las aves tratadas con Coccivac y Salinomicina en 49 días que corresponde a una ventaja económica al productor de aves de corral. Ejemplo 3: Prueba de potencia m vivo para la Vacuna de Coccidiosis, Oocistos Vivos, Origen de Pollo. Este ejemplo presenta un procedimiento para demostrar la potencia del material de recolección de cada nueva semilla de producción de Eimeria , como se formula en el producto final. Los materiales para este Ejemplo incluyeron alimento de pollo, libre de anticoccidiales, SPF o pollos de tipo para asar 1-14 días de edad y el alojamiento de pollo. La primera serie de producto final producida y cada serie subsecuente producida utilizando un nuevo lote de semilla o semillas de producción se prueban para la potencia. La primera serie producida, que contiene todas las nuevas semillas de producción se estimulan con cada especie. Para series subsecuentes, que contienen una o más semillas nuevas de producción, solamente aquellos antígenos que representan las nuevas semillas se prueban para la potencia como es descrito enseguida. Un producto final se prueba en pollos tipo SPF o para asar 1-14 días de edad. Las series subsecuentes producidas de la semilla de producción se evalúan para la potencia utilizando conteos de preformulación especificados en seguida. La potencia de E . acervulina , E . máxima y E . tenella se evalúan singularmente o en combinación, en el mismo grupo de animales. Para cada cepa probada, se utilizan no más de 24 pollos. Por lo menos 10 y no más de 12 son individualmente vacunados pero con una dosis de vacuna en el campo. Diez a 12 pollos permanecerán como controles. Veintiséis a 30 días después de la vacunación inicial todos los pollos se identifican individualmente. Cada cepa de estimulación utilizada en la prueba de potencia debe tener un grupo de control de por lo menos 10 pollos . Por lo menos 10 vacunados y 10 controles del grupo aplicable listados enseguida, son individualmente estimulados per os, con 1.0 ml de estimulación o estimulaciones homologas en la dosificación listada en la Tabla 13 Tabla 13. Estimulación La dosis de estimulación también se selecciona sobre la base de la patogenicidad de Eimeria , en que el nivel seleccionado causará por lo menos 50% de los controles de estimulación no vacunados para tener un registro de lesión de dos o más alta. Ningún grupo de vacunados o controles puede tener menos de ocho animales. El registro está de acuerdo con el sistema de registro coccidial de Johnson y Reid como es descrito en Experimental Parisitology, Vol. 28, p 30-36, 1970. Tabla 14. Registro Seis días después de la estimulación, los vacunados y controles se sacrifican, y el intestino y el área cecal se examina y se registra para lesiones individuales de acuerdo con especies de Eimeria y la sección correspondiente al intestino que se correlaciona con una infección, es decir, E . a cervulina afecta el intestino superior, E . máxima infecta la sección media del intestino y E . tenella infecta la zona cecal . Los datos se analizan de modo que una diferencia significante entre los vacunados y controles se puede averiguar en el nivel de 0.05 la significancia utilizando la Prueba U de Mann-Whitney. Para cada especie de Eimeria estimulada para potencia, el total del registro de lesión individual respectivo para cada uno de los vacunados y controles. Cada ave recibe un registro para E . máxima , un registro para E . a cervulina y un registro para E . tenella . Los registros de clasificación de todos los animales del más pequeño al más grande. Para clasificaciones idénticas, la asignación al promedio de cada animal, por ejemplo, si el 5° y 6° animal tienen un registro idéntico, la asignación de una clasificación de 5.5 a cada uno. La retención de la identidad de la clasificación en cuanto así es un vacunado o control. El total de los números de clasificación del grupo de control. Llamado este total "SRc.dd" El total de los números de clasificación del grupo vacunado. Llamado este total "SRV." La determinación de la suma de las clasificaciones para el grupo de control, la Estadística U de Mann- Whitney de los controles U (Uc) se calcula utilizando la siguiente ecuación: Donde nc representa el número de animales del grupo de control y nv representa el número de animales vacunados. En la determinación de la suma de clasificaciones para el grupo vacunado, la Estadística U de Mann-Whitney de los controles (Uv) se calcula utilizando la siguiente ecuación : + nv(n, -f- l) _ ^, R u„ = nvnc En donde nc representa el número de animales del grupo de control y nv representa el número de animales vacunados . La prueba significante del nivel 0.05 si ÜJ es menor que Uv, y ÜJ es menor que o igual al valor crítico listado en la Tabla 15 para los tamaños de grupo apropiados. Tabla 15. Tabla de valores Críticos para la estadística U de Mann-Whitney (Valores 0.05 de Dos Extremos) Criterios de Validez. Para una prueba válida, por lo menos 50% de los controles de estimulación no vacunados deben tener el registro de lesión de dos o más altos. Ningún grupo de vacunados o controles puede tener menos de ocho animales. Si los animales cumplen con los requerimientos de validez y la estadística U de Mann-Whitney calculada es significativamente diferente al nivel 0.05, la serie es satisfactoria . Requerimientos de Re-prueba.- Si un grupo vacunado no logra mostrar una diferencia significante (la estadística Uc calculada es mayor que los valores críticos listados en la Tabla 15) del grupo de control, los resultados de la prueba son inconcluyentes y la serie puede ser reprobada. Para determinar si la serie no fue satisfactoria debido a una sobrestimulación, los registros de lesión de los vacunados de la primera sesión de prueba y la segunda sesión de prueba se analizan para determinar si una diferencia significante entre las sesiones se puede averiguar en e] nivel 0.05 de significado utilizando la prueba U de Mann- Whitney. Los registros de lesión individuales por cepas de los vacunados son totalizados de ambas sesiones de prueba. Los registros de clasificación de todos animales desde el más pequeño al más grande. Para clasificaciones idénticas, se asigna el promedio a cada animal, por ejemplo, si el 5° o 6° animal tiene un registro idéntico, se asigna una clasificación de 5.5 a cada uno. La detención de la identidad de la clasificación en cuanto a si es de la primera o la segunda sesión de prueba. El total de los números de clasificación de la primera sesión de prueba. Llamado este total " S RJ' El total de número de clasificación de la segunda sesión de la prueba. Llamado este total "SR2". En la determinación de la suma de las clasificaciones para los vacunados de la primera sesión de prueba, la estadística U de Mann-Whitney de la primera sesión de prueba (Ui) se calcula utilizando la siguiente ecuación: En la determinación de la suma de las clasificaciones para el grupo vacunado de la segunda sesión de prueba, la estadística U de Mann-Whitney de los controles (Uv) se calcula utilizando la siguiente ecuación: Donde ni representa el número de animales de los vacunados en la primera sección de prueba y n2 representa el número de vacunados en la segunda sesión de prueba. Interpretación de los resultados de la prueba. La prueba es significante en el nivel 0.05 si Ui es menor que U2, y U2 es menor que o igual al valor crítico listado en la Tabla 16 para los tamaños de grupo apropiado. Tabla 16. Tabla de valores Críticos para la estadística U de Mann-Whitney (Valores 0.05 de Dos Extremos) .

Si los resultados de la comparación de la primera y la segunda sesiones de prueba es significante en un nivel de a 0.05, el resultado inicial debe ser considerado una "No prueba" debido a la sobrestimulación, y los vacunados y controles serán comparados utilizando los datos generados de la segunda sesión de prueba. El análisis de datos será conducido como es resumido previamente. Si la comparación de las dos sesiones de prueba no logra mostrar significado en el nivel 0.05, los datos de ambas sesiones de prueba serán combinados, y los datos serán analizados como es resumido previamente. La prueba es significante en el nivel 0.05 si Uc es menor que Uv, y Uc es menor que o igual al valor crítico listado en la Tabla 17 para los tamaños de grupo apropiados. Tabla 17. Tabla de valores Críticos para la Estadística U de Mann-Whitney (Reprueba de la Serie) Referencia: Sheskin, David J. Handbook of Parametric and Nonparametric Statistical Procedures, 3rd ed. 2003; 423-428, 1151. * * * Habiéndose descrito de esta manera en detalle las modalidades ventajosas de la presente invención, se va a entender que la invención no va a ser limitada a los detalles particulares expuestos en la descripción anterior ya que muchas variaciones evidentes de las mismas son posibles sin apartarse del espíritu o alcance de la presente invención.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una composición inmunogénica o de vacuna para la protección contra E. acervulma, E. máxima y E. tenella, caracterizada porque comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una mezcla de oocistos esporulados aislados de cepas precoces de E. acervulma , E. máxima y E. tenella, en donde la mezcla consiste esencialmente de aproximadamente 500 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 a aproximadamente 250 oocistos de E. tenella.
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la mezcla consiste esencialmente de aproximadamente 500 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 oocistos de E. tenella.
3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la mezcla consiste esencialmente de aproximadamente 500 oocistos de E. acervulma, aproximadamente 50 oocistos de E. máxima y aproximadamente 250 oocistos de E. tenella.
4. Una composición inmunogénica o de vacuna para la protección contra E. acervulma, E. máxima y E. tenella, caracterizada porque comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una mezcla de oocistos esporulados, en donde la mezcla de oocistos esporulados consiste de oocistos esporulados aislados de cepas precoces de E. acervulina , E . máxima y E. tenella , en donde por cada 10 esporocistos de E . a cervulina , hay aproximadamente 1 a 2 esporocistos de E . máxima y aproximadamente 2 a 10 esporocistos de E . tenella .
5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque por cada 10 esporocistos de E . a cervulina , hay aproximadamente 2 esporocistos de E . máxima y aproximadamente 2 esporocistos de i-., tenella .
6. Un método para inducir una respuesta inmune, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de la composición inmunogénica o de vacuna de conformidad con la reivindicación 1 para inducir la respuesta en un pollo.
7. Un método para inducir una respuesta inmunológica o protectora, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de la composición inmunogénica o de vacuna de conformidad con la reivindicación 1 para inducir la respuesta en un pollo.
8. Un método para inducir una respuesta inmune, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de la composición inmunogénica o de vacuna de conformidad con la reivindicación 4 para inducir la respuesta en un pollo.
9. Un método para inducir una respuesta inmunológica o protectora, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de la composición inmunogénica o de vacuna de conformidad con la reivindicación 4 para inducir la respuesta en un pollo.
10. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la cantidad efectiva es de aproximadamente 500 oocistos de E . acervulina , aproximadamente 50 a aproximadamente 100 oocistos de E . máxima y aproximadamente 100 a aproximadamente 250 oocistos de E . tenella .
11. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la cantidad efectiva es de aproximadamente 500 oocistos de E. acervulina , aproximadamente 50 a aproximadamente 100 oocistos de E . máxima y aproximadamente 100 a aproximadamente 250 oocistos de E . tenella .
12. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la cantidad efectiva es de aproximadamente 500 oocistos de E . a cervulina , aproximadamente 100 oocistos de E . máxima y aproximadamente 100 oocistos de E . tenella .
13. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la cantidad efectiva es de aproximadamente 500 oocistos de E . a cervulina , aproximadamente 100 oocistos de E. máxima y aproximadamente 100 oocistos de E . tenel la .
14. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la cantidad efectiva de la mezcla de oocistos esporulados, en donde por cada 10 esporocistos de E . a cervulina , hay aproximadamente 2 esporocistos de E . máxima y aproximadamente 2 esporocistos de E. tenella en la mezcla.
15. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la cantidad efectiva de la mezcla de oocistos esporulados, en donde por cada 10 esporocistos de E. a cervulina , hay aproximadamente 2 esporocistos de E . máxima y aproximadamente 2 esporocistos de E . tenella en la mezcla.
16. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la cantidad efectiva es suficiente para resistir una dosis de estimulación de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 500,000 oocistos de E . a cervulina y aproximadamente 10,000 a aproximadamente 1,000,000 oocistos de E . máxima o aproximadamente 10,000 a aproximadamente 100,000 oocistos de E . tenella al animal.
17. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la cantidad efectiva es suficiente para resistir una dosis de estimulación de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 500,000 oocistos de E . a cervulina y aproximadamente 10,000 a aproximadamente 100,000 oocistos de E . máxima o aproximadamente 10,000 a aproximadamente 100,000 oocistos de E . tenella al animal.
18. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la cantidad efectiva es suficiente para resistir una dosis de estimulación de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 500,000 oocistos de E . a cervulina y aproximadamente 10,000 a aproximadamente 1,000,000 de oocistos de E . máxima o aproximadamente 10,000 a aproximadamente 100,000 oocistos de E . tenel la al animal.
19. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la cantidad efectiva es suficiente para resistir una dosis de estimulación de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 500,000 oocistos de --.. a cervulina y aproximadamente 10,000 a aproximadamente 1,000,000 de oocistos de E . máxima o aproximadamente 10,000 a aproximadamente 100,000 oocistos de E . tenella al animal.